BG61066B1 - Авирулентна противобясна ваксина - Google Patents
Авирулентна противобясна ваксина Download PDFInfo
- Publication number
- BG61066B1 BG61066B1 BG97964A BG9796493A BG61066B1 BG 61066 B1 BG61066 B1 BG 61066B1 BG 97964 A BG97964 A BG 97964A BG 9796493 A BG9796493 A BG 9796493A BG 61066 B1 BG61066 B1 BG 61066B1
- Authority
- BG
- Bulgaria
- Prior art keywords
- strain
- mutant
- avirulent
- mutants
- glycoprotein
- Prior art date
Links
- 229960003127 rabies vaccine Drugs 0.000 title claims description 5
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 claims abstract description 18
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims abstract description 14
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 14
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 12
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 12
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 241000711798 Rabies lyssavirus Species 0.000 claims abstract description 11
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 9
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 9
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 claims description 8
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 7
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 101000831616 Homo sapiens Protachykinin-1 Proteins 0.000 claims description 6
- 102100024304 Protachykinin-1 Human genes 0.000 claims description 6
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 claims description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 4
- 206010037742 Rabies Diseases 0.000 claims description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 2
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 claims 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 18
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 17
- 238000000034 method Methods 0.000 description 14
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 12
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 11
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 9
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 9
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 6
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 6
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 5
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 5
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 5
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 5
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 4
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 3
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 3
- 230000007505 plaque formation Effects 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 4-aminofolic acid Chemical compound C1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 2
- 241000282421 Canidae Species 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 229960003896 aminopterin Drugs 0.000 description 2
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 2
- VEZXCJBBBCKRPI-UHFFFAOYSA-N beta-propiolactone Chemical compound O=C1CCO1 VEZXCJBBBCKRPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 2
- 210000004754 hybrid cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000004071 soot Substances 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 101000838579 Homo sapiens Serine/threonine-protein kinase TAO1 Proteins 0.000 description 1
- 101000838578 Homo sapiens Serine/threonine-protein kinase TAO2 Proteins 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 231100000111 LD50 Toxicity 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100028948 Serine/threonine-protein kinase TAO1 Human genes 0.000 description 1
- 206010042566 Superinfection Diseases 0.000 description 1
- 230000010530 Virus Neutralization Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229960000380 propiolactone Drugs 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000013112 stability test Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/205—Rhabdoviridae, e.g. rabies virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/20011—Rhabdoviridae
- C12N2760/20111—Lyssavirus, e.g. rabies virus
- C12N2760/20134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Ваксината се състои от авирулентен мутант на щам sаd на вируса на бяс, гликопротеинът на който включва в позиция 333 естествено възникнала аминокиселина, чийто кодон се различава от този на аргинина най-малко с два нуклеотида.
Description
Настоящото изобретение се отнася до нова противобясна ваксина.
Вирусът на бяса е КЬаЬдоуйих, състоящ се от пет протеина, включително един външен протеин, по-точно глюкопротеин, който стимулира образуването на неутрализиращи антитела в заразени животни. Инжектирането с пречистен гликопротеин защитава животното от суперинфекция.
ПРЕДШЕСТВАЩО СЪСТОЯНИЕ НА ТЕХНИКАТА
Най-често използваните щамове на вируса на бяса, по-специално щам СУ5 и щам ЕКА, от които са получени щамовете 8АИ, такива като 5ΑΏ Вете и ΞΑϋ В19, са описани в /1/. Аминокиселинната последователност на гликопротеина на щам СУ8 е описана от Υεΐνετΐοη и др. в /2/.
Този гликопротеин има два отделни основни антигенни сайта, свързани с неутрализацията на вируса (сайт II и сайт III). Сайт III в позиция 330-340 съдържа аргинни 333, който определя вирулентността на този щам.
Аминокиселинната последователност на гликопротеина от щама δΑϋ Вете не е напълно установена. Все пак, възможно е да се определи, че антигенният сайт III на гликопротеина от щам 5Αϋ Вете е идентичен с този на гликопротеина от щам СУ5.
Противобясните ваксини, които се използват в момента са или ваксини, произведени от инактивирани вируси, или ваксини, състоящи се от вирусни щамове с атенюирана вирулентност или рекомбинантни вируси.
Вирусите могат да бъдат инактивирани с множество методи, по-специално с химически методи, такива като обработване с формалдехид илиуЗ -пропиолактон. Основният недостатък на този метод за получаване на ваксината е боравенето с вирулентни щамове, което изисква много стриктни работни условия и носи риск от заразяване на работещия персонал.
Освен това, инактивираните ваксини, когато се прилагат орално нямат защитни свойства.
Атенюирането на вирулентността на вирусните щамове е добре известно; например може да бъде осъществено чрез последователни пасажи на вирусните щамове върху различен гостоприемник, от векторен тип (например заек или мишка) или в клетъчни култури. Така се получават щамове, слабо адаптирани към изходния гостоприемник и следователно по-малко патогенни към него, като в същото време се запазва тяхната ваксинираща способност.
Щамовете 5ΑΏ, като 8Αϋ В19 и δΑϋ Вете са атенюирани щамове, които са вече тествани в Европа за ваксиниране на лисици. Те могат да се смесват със стръв за орално прилагане. Все пак тези щамове се оказват патогенни към други животински видове и към хората. Следователно има потенциален риск от заразяване, който значително намалява възможността за прилагане на тези щамове за орално ваксиниране.
Например оралното прилагане на щама 5Αϋ Вете на група от 23 диви гризачи, избрани от видовете Аройетих ПаУ1Со1их и хуШаОсих, Атсо1а 1еггех1пх, С1е1Ъпопотух с1агео1их и ΜϊηοΦχ а^гехй, причини смъртта на две животни от бяс.
Тестовете върху мишки показват, че щамът 8Αϋ Вете е патогенен също и към тези видове, както при церебрално така и при мускулно приложение, както е показано на кривите на приложените фигури 1а и 1Ь, от които:
Фигура 1а показва кривата на смъртност при възрастни мишки като функция от дозите (единица за образуване на плаки = ЕОП), приложени церебрално;
Фигура 1Ь показва кривата на смъртност при възрастни мишки като функция от дозите (единица за образуване на плаки = ЕОП), приложени мускулно.
При мишки поели орално 105ί ЕОП се наблюдава 10% смъртност.
Изходният щам δΑϋ Вете представлява опасност за дивите животни и хората, ако се използва за ваксиниране на лисици. Същото се отнася за щам 8ΑΏ В19.
Предложена е авирулентна противобясна ваксина за смекчаване на този недостатък. Ваксината, описана в /3/, се състои от авирулентен мутант на щам 5Αϋ от вируса на бяс, в който аргинин 333 от гликопротеина е заменен с аминокиселина, различна от лизин, например глицин, изолевцин или серин.
Този мутант възниква вследствие на замяна на един единствен нуклеотид в кодона на аргинин 333. За съжаление този мутант може да се върне обратно към родителския щам чрез проста реверсивна мутация. Следователно тази ваксина, използвана за орално приложение, не е изцяло безопасна спрямо другите животински видове.
ТЕХНИЧЕСКА СЪЩНОСТ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО
Настоящото изобретение се отнася до ефективна ваксина, която позволява да бъдат смекчени горните недостатъци.
Ваксината съгласно изобретението се състои от авирулентен мутант на щам 8Αϋ на вируса на бяса, в който аргинин 333 от гликопротеина е заместен с природна аминокиселина, чийто кодон се различава с два нуклеотида от този на аргинина.
Изобретението по-нататък се отнася до авирулентни мутанти на щам 8Αϋ на вируса на бяса, в който аргининът от позиция 333 на гликопротеина е заместен с аминокиселина, чийто кодон се различава от този на аргинина с два нуклеотида.
Изобретението се отнася също до метод за получаване на описаните авирулентни мутанти.
МЕТОДЪТ СЕ СЪСТОИ ОТ:
1/ селекция от щам 5Αϋ на вируса на бяса на тези мутанти, които не се неутрализират с моноклонално антитяло неутрализиращо щам 3Αϋ, но без да неутрализира щама ТАО1 определен по-долу;
2/ изолиране на мутант, имащ лизин в позиция 333, чрез секвениране на участъка на 333-та позиция от гликопротеина на мутантите селекционирани в 1;
3/ получаване на моноклонално антитяло, което неутрализира, както щам 5Αϋ, така и мутанта, получен в 2, но без да неутрализира щам ТАС1;
и
4/ втора селекция на мутантите, получени в 1, с помощта на моноклонално антитяло, получено в 3.
Моноклоналните антитела, използвани за селекция на мутантите съгласно изобретението, са получени чрез сливане на миеломни клетки с клетки, произвеждащи антивирусни антитела според хибридизационния метод, описан от КОНЬЕК. и М1Ь8ТЕШ в /4/, широко известен метод на специалистите в областта.
Този метод може да бъде използван за сливане на клетки, произхождащи от различни видове, но все пак за предпочитане е да се използват клетки от един и същи животински вид. Например за предпочитане е използването от една страна на миши миеломни клетки, от друга страна на клетки от миши далак, предварително имунизирани с щам на вируса на бяса съгласно протокола, описан по-долу.
Най-общо този хибридизационен метод, отнасящ се до миши клетки, се състои от следните операции:
1/ имунизиране на мишки с определено количество вирус, инактивиран с /3-пропиолактон;
2/ отделяне на далака на имунизираните мишки и разделяне на спленоцитите;
3/ сливане на така получените спленоцити с мишите миеломни клетки в присъствието на фузионен промотор;
4/ култивиране на хибридните клетки, получени в селективна среда, в която неслетите миеломни клетки не се развиват и в присъствието на подходящи компоненти;
и
5/ селекция на клетките, произвеждащи желаните антитела и клониране на тези клетки.
Имунизацията включва интраперитонеално инжектиране на Ва1Ь-С мишки с 100 μβ от вирус СУ 5, инактивиран с /?-пропиолактон, заедно с добавка на ΡΚΕΕΙΝϋ, усилваща действието му (аджувант) и повторна венозна доза 4 дни преди сливането, след период на почивка от 1 месец.
Спленоцитите на имунизираните мишки се отделят след оперативно премахване на далака съгласно конвенционалната процедура.
Мишите миеломни клетки, използвани за получаване на неутрализиращи моноклонални антитела, са Ва1Ь-С миши миеломни клетки, произхождащи от линията 5Р2О. Тези миеломни клетки са селекционирани за тяхната чувствителност към аминоптерина и се култивират в подходяща среда, като модифицирана Еа£1е среда на ОиЕВЕССО (Ои1Ьессо Μοάΐίϊεύ Еав1етейшт), тук означена като ϋΜΕΜ, към която се прибавя 15%-ен серум от жребче.
Миеломните клетки се сливат със спленоцитите чрез смесване на 5-107 миеломни клетки с 5-107 клетки от далак на имунизирани мишки, в присъствието на фузионен промотор, като например полиетиленгликол.
След инкубация при 37°С клетките се промиват с БМЕМ, ресуспендират се и се култивират върху селективна среда, подходяща само за израстване на хибридни клетки. Тази среда съдържа хипоксантин, аминоптерин и тимидин. 7 до 20 дни след сливането се селекционират супернатантите от културите чрез поставянето им в контакт със суспензия от СУ5 вирус и отделяне на антителата, които неутрализират горната суспензия.
Под понятието “неутрализиращи вирус антитела” се разбира антитела, които, доведени в контакт със суспензия от горния вирус, инхибират вирулентността му. Степента на неутрализация на получените моноклонални антитела се определя по добре известен на специалистите конвенционален метод. Този метод се състои в смесване на 100 μ 1 от суспензия на вируса, съдържаща 1000 ЕОП вирус с 100 μΐ от супернатантата на хибридомната култура, като с тази смес се заразява клетъчна култура и след 4-дневна инкубация се преброяват лизисните плаки в агар по метода на ΒυδδΕΕΕΑυ и др. /5/. Антитялото е неутрализиращо, ако то инхибира всяко образуване на плаки в агар при условията описани по-горе. След това се отделят тези антитела, които не неутрализират авирулентния мутант ТАС1, получен от щама СУ8, депозиран в Националната колекция за култури и микроорганизми (С.И.С.М) Институт Пастьор Франция на 12 април 1985 под № 1-433.
Получените моноклонални антитела, които неутрализират щам СУ8, но не неутрализират авирулентния мутант ТАС1, правят възможно отделянето на авирулентните мутанти от всеки щам на вируса на бяса, който се неутрализира с тези моноклонални антитела.
Така получените моноклонални антитела са антитела, които неутрализират и щам 3Αϋ на вируса на бяса, следователно те са удобни за осъществяване на първата селекция по метода съгласно изобретението.
Секвенирането на участъка на 333-та позиция от гликопротеина на мутантите, селекционирани в 1, се осъществява по известен на специалистите конвенционален метод /6/.
Това секвениране прави възможно да се изолира мутант, който съдържа лизин в позиция 333 на гликопротеина; този мутант по-нататък се означава като “8К мутант”. Кодонът (ААА) на тази аминокиселина (лизин) се отличава от този на аргинина в позиция 333 на щам 8Αϋ само по 1 нуклеотид, като кодонът на аргинина в позиция 333 на щам 5АБ е АСА.
Следва получаване на моноклонално антитяло, което неутрализира както щама 8Αϋ, така и мутанта получен по-горе.
Това моноклонално антитяло се получава чрез селекция от моноклоналните антитела, които неутрализират щама 5АБ и не неутрализират ТАС1, на това моноклонално антитяло, което също неутрализира лизиновия мутант или 8К мутанта получен по-горе.
Това моноклонално антитяло прави възможно осъществяването на втората селекция (операция 4) по метода съгласно изобретението.
Патогенната способност на мутантите, получени при тази втора селекция, се изследва чрез интрацеребрално инжектиране на възрастни мишки с 105 ЕОП. Мутантите, които не убиват при тази доза и при тази инжекционна схема, се считат за авирулентни.
Мутантите съгласно изобретението са двойни авирулентни мутанти на щам 8АБ, такива като щам 5АБ Вегпе, получени от две последователни селекции с помощта на описаните моноклонални антитела.
Мутантите съгласно изобретението могат също да имат и други мутации, като например мутация, придаваща резистентност на моноклонално антитяло, специфично за антигенен сайт И, което позволява откриването на възможен ревертант на вирулентност от щамовете 8АБ, използвани за орално ваксиниране на лисици.
Мутантите съгласно изобретението могат да бъдат мултиплицирани върху ВНК 21 бъбречни клетки от новороден хамстер в присъствието на СЕМ хранителна среда и 2% телешки серум при 33°С и във влажна атмосфера, съдържаща 5% СО2. Титруват се по известни методи, например чрез определяне на 50% летална доза (ЬО50) в млади мишки, чрез имунофлуоресценция или преброяване на лизисните плаки в агар. Те могат да бъдат съхранявани при -70°С. Анализът на нуклеотидната последователност на гликопротеина на тези мутанти показва, че кодонът на аминокиселината в позиция 333 се различава с наймалко два нуклеотида от всички възможни кодони на аргинина. Най-предпочитан от мутантите, които задоволяват това условие, е мутантът, който има глутаминова киселина в позиция 333, защото той се мултиплицира добре в клетъчна култура, по-малко патогенен е към новородени мишки и има добра защитна способност. Двойният мутант, съдържащ глутаминова киселина, чийто кодон е САА на мястото на аргинина в позиция 333, получен чрез горния метод от щам 8ΑΏ Вегпе и наричан оттук нататък 8АС2 е депозиран в Националната колекция за култури и микроорганизми (С.И.С.М) Институт Пастьор Франция на 9 юли 1992 под № 1-1238. Този мутант съдържа друга мутация, по-точно резистентност към моноклонално антитяло, специфично за антигенен сайт И, което е допълнителен маркер на щама.
По-нататък изобретението се описва поподробно по отношение на мутанта 8АС2, без това да ограничава обхвата на изобретението.
ПРИМЕРИ ЗА ИЗПЪЛНЕНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО
Пример 1. Тестове за генетична стабилност на щама при пасажи върху мозък на млади мишки мишки на 4-дневна възраст се инжектират с 103 ЕОП от 8АС2. Когато животните се разболеят, те се убиват. Подготвят се 6 отделни основни проби от смлян мозък; всяка проба се титрува и 3 възрастни мишки (контрола за патогенност) и една млада мишка (следващ пасаж) се инжектират с 30 μ\ при разреждане 1/10. 6-те млади мишки позволяват по този начин да се направят 6 самостоятелни серии по 3 пасажа.
Титрите на мозъците в ЕОП/т1 са показани в следната таблица:
| Се- рии | А | В | С | ϋ | Е | Е |
| |>и па- саж | >5.10’ | 1.5.107 | 107 | 106 | 106 | 106 |
| 2Р па- саж | >5.10’ | 2.5.107 | >5.10’ | >5.107 | >5.107 | >5.10’ |
| 3™ па- саж | >5.10’ | >5.10’ | >5.10’ | >5.107 | >5.107 | >5.10’ |
Всички възрастни (54 мишки) инжектирани след 1ви, 2ри или Зти пасаж оцеляват, показвайки липса на ревертивност.
Пример 2. Защитна способност на 8АС2.
Мишки се инжектират интрацеребрално с мутант 8АС2 и защитната способност на този мутант се определя чрез мускулно тестуване на 100 ЬО50 от щам СУЗ. Получените резултати са показани на фиг.2, която представлява графика, на чиято ордината е дадена защитната способност (%), като функция от количеството инжектиран мутант, изразено в ЕОП/мишка (Ιοβ). Същият тест се повтаря с мутанта 8К, имащ лизин в позиция 333.
Защитната способност на 5К и 8АС2 е 100% при 104 ЕОП/мишка и повече.
Пример 3. Патогенност на 5АС2 при интрацеребрално приложение
Инжектират се мишки с мутанта ЗАС2 с дози в граници от 10 °5 до 106 ЕОП/мишка и не се наблюдава смъртност през период от 28 дни.
Успоредно с това, същият експеримент се провежда с вируса 8Αϋ Вегпе или с мутанта ЗК.
Резултатите са показани на фиг.З, която представлява графика, на ординатата на която е изразена смъртност в % като функция от количеството мутант, инжектиран на мишка (на абсцисата).
Установено е, че мутантът 8АО2 не причинява смъртност, там където мутантът ЗК има слаба остатъчна патогенна способност.
Пример 4. Патогенност на 8АС2 при мускулно приложение
Горният тест се повтаря, но при мускулно приложение. Резултатите са показани на фиг.4, която показва смъртността в проценти (на ординатата), като функция от приложената доза в ЕОП/мишка (на абсцисата). Както се вижда мутантите 8АО2 и 8К не предизвикват смъртност.
Мутантите съгласно изобретението могат да се прилагат като жива ваксина, по който и да е от начините на приложение, обикновено използвани за ваксинация, по-специално мускулно или орално. Мутантите се разтварят предимно във фармацевтично приемлив инертен носител, като физиологичен серум.
Claims (9)
1. Авирулентна противобясна ваксина, която се състои от авирулентен мутант на щам 8Αϋ на вируса на бяса, гликопротеинът на който включва в позиция 333 естествено възникнала аминокиселина, чийто кодон се различава от този на аргинина най-малко с два нуклеотида.
2. Ваксина съгласно претенция 1, характеризираща се с това, че аминокиселината в позиция 333 е глутаминова киселина.
3. Ваксина съгласно претенции 1 или 2, характеризираща се с това, че мутантът е мутант на щама 8Αϋ Вегпе.
4. Ваксина съгласно претенциите 1 до 3, характеризираща се с това, че мутантът е депозиран в С.М.С.М. (Националната колекция за култури и микроорганизми) - Институт Пастьор - Франция на 9 юли 1992 г. под № I1238.
5. Двоен авирулентен мутант на щам 55Αϋ на вируса на бяса, чийто гликопротеин има в позиция 333 естествено възникнала аминокиселина, чийто кодон се различава от този на аргинина с два нуклеотида.
6. Двоен авирулентен мутант съгласно претенция 5, характеризиращ се с това, че аминокиселината в позиция 333 е глутаминова киселина.
7. Двоен авирулентен мутант съгласно една от претенциите 5 или 6, характеризиращ се с това, че е мутант на щам 5Αϋ Вегпе.
8. Двоен авирулентен мутант на щам 8Αϋ, характеризиращ се с това, че е депозиран в Ο.Ν.Ο.Μ. (Националната колекция за култури и микроорганизми) - Институт Пастьор - Франция на 9 юли 1992 г, под номер 1-1238.
9. Метод за получаване на двойни мутанти, характеризиращ се с това, че се състои от:
- селекция от изходен щам 55 А ϋ на ви5 руса на бяса на мутанти, които не се неутрализират с моноклонално антитяло, неутрализиращо щам 55 Αϋ, и което неутрализира щам
ТАС1, определен по-долу;
- изолиране на мутант, имащ лизин в 10 позиция 333, чрез секвениране на участъка на 333-та позиция от гликопротеина на селекционираните мутанти;
- получаване на моноклонално антитяло, което неутрализира както щам 55Αϋ, така и
15 мутанта, получен от него, но не неутрализира щам ТАС1;
и
- втора селекция на мутантите, получени при първата селекция, с помощта на вече полученото специфично моноклонално антитяло.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9208947A FR2693655B1 (fr) | 1992-07-20 | 1992-07-20 | Vaccin antirabique avirulent. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| BG97964A BG97964A (bg) | 1994-04-29 |
| BG61066B1 true BG61066B1 (bg) | 1996-10-31 |
Family
ID=9432070
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| BG97964A BG61066B1 (bg) | 1992-07-20 | 1993-07-16 | Авирулентна противобясна ваксина |
Country Status (20)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5853735A (bg) |
| EP (1) | EP0583998B1 (bg) |
| AT (1) | ATE175877T1 (bg) |
| BG (1) | BG61066B1 (bg) |
| BR (1) | BR9302910A (bg) |
| CA (1) | CA2100591C (bg) |
| CZ (1) | CZ283400B6 (bg) |
| DE (1) | DE69323130T2 (bg) |
| FI (1) | FI933210A (bg) |
| FR (1) | FR2693655B1 (bg) |
| HR (1) | HRP931065B1 (bg) |
| HU (1) | HU219266B (bg) |
| MA (1) | MA22938A1 (bg) |
| MX (1) | MX9304349A (bg) |
| PL (1) | PL172853B1 (bg) |
| RO (1) | RO112582B1 (bg) |
| RU (1) | RU2128519C1 (bg) |
| SI (1) | SI9300392A (bg) |
| SK (1) | SK280104B6 (bg) |
| TN (1) | TNSN93083A1 (bg) |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL143149A0 (en) * | 1998-11-27 | 2002-04-21 | Akzo Nobel Nv | Stable, attenuated rabies virus mutants and live vaccines thereof |
| PL352840A1 (en) | 1999-06-03 | 2003-09-08 | Nippon Suisan Kaisha, Ltd. | Tricyclic fused heterocycle compounds, process for preparing the same and use thereof |
| US7074413B2 (en) | 2000-03-23 | 2006-07-11 | Thomas Jefferson University | Genetically engineered rabies recombinant vaccine for immunization of stray dogs and wildlife |
| MXPA04000589A (es) | 2001-07-20 | 2005-06-17 | Univ Georgia Res Found | Virus de la rabia atenuado con mutacion de nucleoproteina en el sitio de fosforilacion para vacunacion contra la rabia y terapia genetica en el snc. |
| ATE307606T1 (de) * | 2001-10-04 | 2005-11-15 | Ct Voor Onderzoek In Diergenee | Abgeschwächter mutantenstamm eines virus der newcastle-krankheit für eine in ovo impfung und dessen benutzung |
| WO2003030933A1 (en) * | 2001-10-10 | 2003-04-17 | Thomas Jefferson University | Recombinant rabies vaccine and methods of preparation and use |
| EP1415665A3 (en) * | 2002-11-01 | 2004-06-30 | ID-Lelystad, Instituut voor Dierhouderij en Diergezondheid B.V. | BHV5 mutants |
| EP1768697B1 (en) | 2004-07-12 | 2010-06-02 | Thomas Jefferson University | Recombinant rabies virus compositions |
| BRPI0617373B1 (pt) | 2005-10-14 | 2022-04-05 | The Goverment of The United States of America, Representado por, The Secretary of The Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention | Composições e métodos do vírus da raiva |
| FR2944292B1 (fr) | 2009-04-08 | 2013-08-23 | Sanofi Pasteur | Procede de purification du virus rabique |
| RU2694836C1 (ru) * | 2018-12-14 | 2019-07-17 | федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности" (ФГБНУ "ФЦТРБ-ВНИВИ") | Способ получения антигена вируса бешенства для серологической диагностики |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2580176B1 (fr) * | 1985-04-12 | 1988-02-26 | Centre Nat Rech Scient | Vaccin antirabique avirulent |
| FR2633832B1 (fr) * | 1988-07-05 | 1991-05-31 | Virbac | Vaccin antirabique avirulent |
-
1992
- 1992-07-20 FR FR9208947A patent/FR2693655B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
1993
- 1993-07-14 CZ CZ931402A patent/CZ283400B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1993-07-14 FI FI933210A patent/FI933210A/fi not_active Application Discontinuation
- 1993-07-16 EP EP93401843A patent/EP0583998B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1993-07-16 BG BG97964A patent/BG61066B1/bg unknown
- 1993-07-16 AT AT93401843T patent/ATE175877T1/de active
- 1993-07-16 DE DE69323130T patent/DE69323130T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1993-07-19 MX MX9304349A patent/MX9304349A/es unknown
- 1993-07-19 RU RU93048174A patent/RU2128519C1/ru not_active IP Right Cessation
- 1993-07-19 MA MA23238A patent/MA22938A1/fr unknown
- 1993-07-19 SK SK761-93A patent/SK280104B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1993-07-19 HR HR9208947A patent/HRP931065B1/xx not_active IP Right Cessation
- 1993-07-19 BR BR939302910A patent/BR9302910A/pt not_active Application Discontinuation
- 1993-07-20 TN TNTNSN93083A patent/TNSN93083A1/fr unknown
- 1993-07-20 SI SI9300392A patent/SI9300392A/sl not_active IP Right Cessation
- 1993-07-20 RO RO93-01010A patent/RO112582B1/ro unknown
- 1993-07-20 HU HU9302091A patent/HU219266B/hu unknown
- 1993-07-20 PL PL93299739A patent/PL172853B1/pl unknown
- 1993-07-20 CA CA002100591A patent/CA2100591C/en not_active Expired - Lifetime
-
1997
- 1997-01-17 US US08/785,616 patent/US5853735A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0583998A1 (fr) | 1994-02-23 |
| RU2128519C1 (ru) | 1999-04-10 |
| CZ283400B6 (cs) | 1998-04-15 |
| HRP931065B1 (en) | 1999-12-31 |
| ATE175877T1 (de) | 1999-02-15 |
| DE69323130T2 (de) | 1999-06-17 |
| US5853735A (en) | 1998-12-29 |
| MA22938A1 (fr) | 1994-04-01 |
| RO112582B1 (ro) | 1997-11-28 |
| HU9302091D0 (en) | 1993-11-29 |
| HUT69961A (en) | 1995-09-28 |
| CZ140293A3 (en) | 1994-02-16 |
| HU219266B (en) | 2001-03-28 |
| FI933210A0 (fi) | 1993-07-14 |
| TNSN93083A1 (fr) | 1994-03-17 |
| EP0583998B1 (fr) | 1999-01-20 |
| HRP931065A2 (en) | 1995-02-28 |
| BG97964A (bg) | 1994-04-29 |
| SK280104B6 (sk) | 1999-08-06 |
| BR9302910A (pt) | 1994-02-16 |
| FR2693655B1 (fr) | 1994-10-14 |
| MX9304349A (es) | 1994-06-30 |
| CA2100591C (en) | 2003-02-18 |
| SI9300392A (en) | 1994-06-30 |
| CA2100591A1 (en) | 1994-01-21 |
| FR2693655A1 (fr) | 1994-01-21 |
| DE69323130D1 (de) | 1999-03-04 |
| FI933210A (fi) | 1994-01-21 |
| SK76193A3 (en) | 1994-06-08 |
| PL172853B1 (pl) | 1997-12-31 |
| PL299739A1 (en) | 1994-01-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4810634A (en) | Pseudorabies virus mutants incapable of producing glycoprotein X | |
| Ludwig et al. | Biology and neurobiology of Borna disease viruses (BDV), defined by antibodies, neutralizability and their pathogenic potential | |
| Lafay et al. | Vaccination against rabies: construction and characterization of SAG2, a double avirulent derivative of SADBern | |
| DE69637264T2 (de) | Virales Material und Multiple-Sklerose assoziierte Nukleotidfragmente mit diagnostischen, prophylaktischen und therapeutischen Verwendungen | |
| Schneider et al. | Application of monoclonal antibodies for epidemiological investigations and oral vaccination studies | |
| EP0327305A2 (en) | Preparation of a recombinant subunit vaccine against pseudorabies infection | |
| JPH0586088A (ja) | ニワトリ貧血ウイルスワクチン及び診断法 | |
| Schumacher et al. | SAG-2 oral rabies vaccine | |
| BG61066B1 (bg) | Авирулентна противобясна ваксина | |
| Flamand et al. | Avirulent mutants of rabies virus and their use as live vaccine | |
| US6241989B1 (en) | Recombinant multivalent viral vaccine | |
| Yang et al. | Safety and immunogenicity of recombinant rabies virus (ERAGS) in mice and raccoon dogs | |
| US5632989A (en) | Attenuated, live vaccine for Delaware strain IBDV | |
| Yokoyama et al. | Construction of the recombinant feline herpesvirus type 1 deleted thymidine kinase gene | |
| DK170393B1 (da) | Avirulent rabies-vaccine samt avirulent mutant af stammen SAD Berne | |
| US7087234B1 (en) | Recombinant multivalent viral vaccine | |
| CA2382993A1 (en) | Attenuated recombinant rabies virus mutants and live vaccines thereof | |
| US5275934A (en) | Method of detecting viral infection in vaccinated animals | |
| US5128128A (en) | Virus vaccine | |
| EP0263207B1 (en) | Virus vaccine | |
| Neutralizing | Novel Human Monoclonal Antibody | |
| JPH05503209A (ja) | イヌパルボウイルス（ｃｐｖ）を含む弱毒イヌパルボウイルスワクチンとイヌ科動物におけるｃｐｖ感染予防 | |
| IL149173A (en) | Attenuated recombinant mutants of the rabies virus and vaccines prepared from them |