SK280104B6 - Avirulentná vakcína proti besnote - Google Patents
Avirulentná vakcína proti besnote Download PDFInfo
- Publication number
- SK280104B6 SK280104B6 SK761-93A SK76193A SK280104B6 SK 280104 B6 SK280104 B6 SK 280104B6 SK 76193 A SK76193 A SK 76193A SK 280104 B6 SK280104 B6 SK 280104B6
- Authority
- SK
- Slovakia
- Prior art keywords
- mutant
- strain
- sad
- avirulent
- vaccine
- Prior art date
Links
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 15
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims abstract description 14
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 241000711798 Rabies lyssavirus Species 0.000 claims abstract description 14
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 14
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 12
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 9
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 18
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 claims description 17
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 claims description 17
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 9
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 claims description 8
- 102100024342 Contactin-2 Human genes 0.000 claims description 7
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 7
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 101000690440 Solanum lycopersicum Floral homeotic protein AGAMOUS Proteins 0.000 claims description 7
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 claims description 4
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 4
- 229960003127 rabies vaccine Drugs 0.000 claims description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 4
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 abstract description 6
- 206010037742 Rabies Diseases 0.000 abstract description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 18
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 15
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 13
- 101100162403 Arabidopsis thaliana ALEU gene Proteins 0.000 description 10
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 10
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 9
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 9
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 7
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 6
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 6
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 5
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 5
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 5
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 4
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 4-aminofolic acid Chemical compound C1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 2
- LHEJDBBHZGISGW-UHFFFAOYSA-N 5-fluoro-3-(3-oxo-1h-2-benzofuran-1-yl)-1h-pyrimidine-2,4-dione Chemical compound O=C1C(F)=CNC(=O)N1C1C2=CC=CC=C2C(=O)O1 LHEJDBBHZGISGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 229960003896 aminopterin Drugs 0.000 description 2
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 2
- VEZXCJBBBCKRPI-UHFFFAOYSA-N beta-propiolactone Chemical compound O=C1CCO1 VEZXCJBBBCKRPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 229960000380 propiolactone Drugs 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 241000700179 Apodemus Species 0.000 description 1
- 241001359030 Arvicola amphibius Species 0.000 description 1
- 241000711515 Berne virus Species 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282421 Canidae Species 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 240000000731 Fagus sylvatica Species 0.000 description 1
- 235000010099 Fagus sylvatica Nutrition 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 241000466354 Myodes Species 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 101900083372 Rabies virus Glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000010530 Virus Neutralization Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 230000016571 aggressive behavior Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 210000004754 hybrid cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000644 isotonic solution Substances 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 231100000636 lethal dose Toxicity 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000007505 plaque formation Effects 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000013112 stability test Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/205—Rhabdoviridae, e.g. rabies virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/20011—Rhabdoviridae
- C12N2760/20111—Lyssavirus, e.g. rabies virus
- C12N2760/20134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
Oblasť techniky
Predložený vynález sa týka novej vakcíny proti besnote.
Doterajší stav techniky
Vírus besnoty je rhabdovírus, obsahujúci päť proteínov, vrátane jedného vonkajšieho proteínu, menovite glykoproteinu, ktorý spúšťa syntézu neutralizujúcich protilátok pri inokulovaných živočíchoch. Injekcia purifikovaného glykoproteínu chráni živočíchy proti superiníčkcii. Kmene vírusu besnoty, ktoré sú najčastejšie používané, hlavne CVS kmeň a ERA kmeň, od ktorých sú odvodené SAD kmene ako je SAD Berne a SAD B19, sú opísané v ..Rabies Viruses“ H. F. Clarkom a T. J. Wiktorom - Strain of Human Viruses, publikované Majer and Plotkin Karger, Basilej, 1972, str. 177-182. Aminokyselinová sekvencia glykoproteinov CVS kmeňa bola opísaná Yelvertonom a spol. v ..Rabies vírus glykoprotein analogs: Biosynthesis in Escherichia coli“, Science, 219, 614-620.
Tento glykoprotein má dve zreteľné hlavné antigénne miesta spojené s neutralizáciou vírusu (miesta II a ΠΙ). Miesto III v polohe 330-340 obsahuje arginin 333, ktorý determinuje virulenciu kmeňa.
Aminokyselinová sekvencia glykoproteínu SAD Bemc kmeňa nebola úplne stanovená. Predsa však je možné stanoviť, že antigénové miesto III glykoproteínu SAD Berne kmeňa je identické glykoproteínovému miestu CVS kmeňa.
Vakcíny proti besnote pri bežnom použití sú buď vakcíny vyrobené z inaktivovaných vírusov, alebo vakcíny obsahujúce vírusové kmene, ktorých virulencia bola oslabená, alebo rekombinantných vírusov (napríklad vakcína).
Vírus môže byť inaktivovaný rôznymi metódami, obzvlášť chemickými metódami, ako je spracovanie s formaldehydom alebo β-propiolaktónom.
Hlavnou nevýhodou takéhoto spôsobu výroby vakcíny je zaobchádzanie s virulentnými kmeňmi, ktoré vyžaduje veľmi prísne operačné podmienky a prináša nebezpečenstvo kontaminácie pre pracovníkov.
Navyše inaktivované vakcíny podané orálne nemajú ochrannú silu.
Zoslabenie virulencie vírusových kmeňov je dobre známou technikou; môže sa vykonávať napríklad postupným prechádzaním vírusových kmeňov hostiteľom, ktorý sa líši od vektorových druhov (králik alebo myš, napríklad), alebo v bunkových kultúrach. Toto poskytuje kmene, ktoré sú zle adaptovateľné na pôvodného hostiteľa a sú preto menej patogénne proti nemu, zatiaľ čo si súčasne udržiavajú svoju vakcinačnú kapacitu.
SAD kmene, ako je SAD BI9 a SAD Berne kmene, ktoré sú dostupné, sú zoslabené kmene, ktoré boli už v Európe testované pri vakcinácii líšok. Môžu byť zmiešané s návnadami na orálne podanie. Predsa však sa tieto kmene preukázali byť patogénne proti iným živočíšnym druhom a ľuďom. Existuje tu tak možné nebezpečenstvo kontaminácie, čo podstatne znižuje hodnotu týchto kmeňov na orálnu vakcináciu.
Napríklad orálne podanie SAD Berne kmeňa skupine 23 divokých hlodavcov vybraných s Apodemus flavicolus a sylvaticus, Arvicola terrestris, Clethrionomys clareolus a Minotus agresti, spôsobilo smrť dvoch zvierat v dôsledku besnoty.
Testy na myšiach tiež ukázali, že SAD Berne kmeň je patogénny proti týmto druhom ako pri intracerebrálnoin podaní, rovnako aj pri intramuskulámom podaní, ako je ukázané na krivkách na pripojených obrázkoch la a lb, kde:
obr. la je krivka mortality pri dospelých myšiach ako funkcia dávok (v plakotvomých jednotkách) pri intracerebrálnom podaní, obr. lb je krivka mortality pri dospelých myšiach ako funkcia dávok (v plakotvomých jednotkách) pri intramuskulámom podaní.
% mortalita sa pozorovala na myšiach pri dávke 105’5 PFU podanej orálne.
Preto je SAD Berne kmeň nebezpečný pre divoko žijúce zvieratá a ľudí, ak sa používa v akciách vakcinácie líšok. To isté platí i pre SAD B19 kmeň.
Bola už navrhnutá avirulentná vakcína proti besnote s cieľom odstrániť túto nevýhodu. Táto vakcína, opísaná v európskej patentovej prihláške EPO 350 398, obsahuje avirulentný mutant SAD kmeňa vírusu besnoty, v ktorom arginín 333 glykoproteínu bol nahradený aminokyselinou inou ako je lyzín, napríklad glycínom, izoleucínom alebo serínom.
Tento mutant je získaný zmenou jediného nukleotidu v kodóne arginínu 333.
Na nešťastie sa tento mutant môže zvrátiť na rodičovský kmeň jednoduchou reverznou mutáciou.
Táto vakcína, ktorá sa používa na orálne podanie, nie je preto úplne bez nebezpečenstva, pokiaľ ide o iné živočíšne druhy.
Predložený vynález sa týka účinnej vakcíny, ktorá umožňuje zmiernenie uvedených nevýhod.
Podstata vynálezu
Vakcína podľa vynálezu obsahuje avirulentný mutant SAD kmeňa vírusu besnoty, v ktorom arginin 333 glykoproteínu bol nahradený prirodzene sa vyskytujúcou aminokyselinou. ktorej kodón sa líši dvoma nukleotidmi od kodónu, ktorý' kóduje arginin.
Vynález sa ďalej týka avirulentných mutantov SAD kmeňa vírusu besnoty, v ktorých arginin v polohe 333 glykoproteínu bol nahradený aminokyselinou, ktorej kodón sa líši od kodónu arginínu dvoma nukleotidmi.
Vynález sa ďalej týka spôsobu získania definovaných avirulentných mutantov. Tento spôsob sjwčiva v:
i. výbere - zo SAD kmeňa vírusu besnoty - takých mutantov, ktoré nie sú neutralizované monoklonálnou protilátkou, neutralizujúcou uvedený SAD kmeň, ale neneutralizujúcou TAG1 kmeň, definovaný ďalej, ii. izolácii, sekvenovaním 333 oblasti glykoproteínu mutantov vybraných v stupni (i) mutanta, ktorý obsahuje lyzín v polohe 333, iii. príprave monoklonálnej protilátky, ktorá neutralizuje tak SAD kmeň, ako mutant získaný v stupni (ii), ale neneutralizuje TAG1 kmeň, a iv. uskutočnení druhého výberu z mutantov získaných v stupni (i), pomocou monoklonálnej protilátky pripravenej v stupni (iii).
Monoklonálne protilátky použité na výber mutantov podľa vynálezu sa získajú íúziou myelómových buniek s bunkami produkujúcimi protivirusové protilátky, hybridizačnou technikou opísanou KOHLEROM a MILSTEINOM v NÁTURE, zv. 256, 495-497 (1975), technikou, ktorá je v odbore dobre známa.
Táto technika môže byť použitá na fúzovanie buniek pochádzajúcich z odlišných druhov; predsa však je výhodné použiť bunky pochádzajúce z rovnakých živočíšnych druhov. Napríklad je výhodné použiť na jednej strane my
SK 280104 Β6 šie myelómové bunky a na druhej strane bunky sleziny myši predtým imunizovanej kmeňom vírusu besnoty podľa uvedeného protokolu.
Všeobecne vyjadrené, táto hybridizačná metóda, opísaná vo vzťahu k myším bunkám, zahrnuje nasledujúce stupne:
1. imunizácia myší daným množstvom vírusu inaktivovaného β-propiolaktónom,
2. odstránenie sleziny imunizovanej myši a oddelenie splenocytov,
3. fúzia takto získaných splenocytov s myšími myelómovými bunkami za prítomnosti promótora fúzie,
4. kuftiváciu hybridných buniek, ktoré boli získané, v selektívnom médiu, v ktorom sa fúzované myelómové bunky nevyvíjajú a za prítomnosti vhodných zložiek, a
5. výber buniek produkujúcich požadovanú protilátku a klonovanie takýchto buniek.
Imunizačný protokol obsahuje intraperitoneálnu injekciu Balb-C myši s 100 pg CV5 vírusu inaktivovaného β-propiolaktónom, spolu s FREUND-ovým kompletným adjuvans a intravenóznu booster-dávku 4 dni pred fúziou počas 1 mesiaca.
Splenocyty imunizovanej myši sa získajú po odstránení sleziny zvyčajným postupom.
Myšie myelómové bunky použité na získanie neutralizujúcich monoklonálnych protilátok sú Balb-C myšie myelómové buky pochádzajúce z SP2O línie. Tieto myelómové bunky boli vybrané pre ich citlivosť k aminopterínu a kultivované vo vhodnom médiu ako je Eagle - základné médium modifikované pomocou DULBCCO (Dulbecco Modified Eagle médium), ďalej tu označované ako DMEM, ku ktorému bolo pridaných 15 % žrebčieho séra.
Myelómové bunky boli fúzované so splenocytmi zmiešaním 5.107 myelómových buniek s 5.10' slezinových buniek imunizovanej myši, za prítomnosti fúzneho promótora ako je napríklad polyetylénglykol.
Po inkubácii pri 37 °C boli bunky premyté v DMEM, resuspendované a potom kultivované v selektívnom médiu, vhodnom len pre rast hybridných buniek. Takéto médium obsahuje hypoxantín, amínopterín a tymidín.
Supematanty kultúry boli potom delené 7 až 20 dní po fúzii uvedením supematantov do kontaktu so suspenziou CVS vírusu a výberom protilátok, ktoré neutralizujú uvedenú suspenziu.
„Protilátkami neutralizujúcimi vírus“ sa mienia protilátky, ktoré pri uvedení do kontaktu so suspenziu uvedeného vírusu inhibujú jeho virulenciu.
Neutralizačná sila získaných monoklonálnych protilátok, sa stanoví bežnou metódou dobre známou odborníkom v odbore. Táto metóda zahŕňa uvedenie do kontaktu 100 μΐ suspenzie vírusu, obsahujúcej 1000 PFU vírusov so 100 μΐ supernatantu hybridómovej kultúry, infikovanie bunkovej kultúry touto zmesou a po 4 dňoch inkubácia, spočítanie lýzie plakov pod agarom metódou opísanou BUSSEREAUEM a spol. 1982, J. Virol. Méth., zv. 4, str. 277 až 282. Protilátka je neutralizujúca, ak inhibuje plne tvorbu plakov pod agarom za opísaných podmienok.
Potom sa z týchto protilátok vyberú tie, ktoré neneutralizujú TAG1 avirulentný mutant odvodený do CVS kmeňa, uloženého v Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (C.N.C.M.) INŠTITÚT PASTEUR - FRANCE,
12. apríla 1985 pod číslom 1-433.
Výsledné monoklonálne protilátky, ktoré neutralizujú CVS kmeň, ale neneutralizujú TAG1 avirulentný mutant, umožňujú vybrať avirulentné mutanty z akýchkoľvek kmeňov vírusu besnoty, ktorý je neutralizovaný týmito monoklonálnymi protilátkami.
Monoklonálne protilátky takto získané sú protilátky, ktoré tiež neutralizujú SAD kmene vírusu besnoty, takže sú vhodné na uskutočnenie prvej selekcie spôsobu podľa vynálezu.
Sekvenovanie 333 oblasti glykoproteínu mutantov vybraných v stupni (i) sa vykonáva zvyčajnou metódou dobre známou odborníkom v odbore (SANGER a spol., 1977, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, zv. 74, str. 5463-5467).
Toto sekvenovanie umožňuje izolovať mutant, ktorý obsahuje lyzín v polohe 333 glykoproteínu; tento mutant je tu ďalej označovaný ako „SK mutant“.
Kodón (AAA) tejto aminokyseliny (lyzin) sa líši jediným nukleotidom od kodónu arginínu v polohe 333 SAD kmeňa, kodónu arginínu v polohe 333 SAD kmeňa, ktorý je AGA.
Nasleduje príprava monoklonálnej protilátky, ktorá neutralizuje tak SAD kmeň, ako získaný mutant.
Táto monoklonálna protilátka sa získa výberom z vyššie monoklonálnych protilátok, ktoré neutralizujú SAD kmeň a neneutralizujú TAG1, takých monoklonálnych protilátok, ktoré tiež neutralizujú lyzinový mutant alebo získaný SK mutant.
Patogénna potencia mutantov vzniknutých z tohto druhého výberu sa potom testuje intracerebrálnou injekciou na dospelých myšiach s 103 PFU. Mutanty, ktoré neusmrcujú pri tejto dávke a tomto injekčnom spôsobe podania, sa považujú za avirulentné.
Uvedená monoklonálna protilátka umožňuje vykonať druhý výber (stupeň (iv)) spôsobu podľa vynálezu.
Mutanty podľa vynálezu sú dvojité avirulentné mutanty SAD kmeňa, ako hlavne SAD Berne kmeňa, vzniknuté z dvoch po sebe idúcich selekcií s pomocou definovaných monoklonálnych protilátok.
Mutanty podľa vynálezu môžu tiež obsahovať iné mutácie, napríklad mutáciu prepožičiavajúcu odolnosť proti monoklonálnej protilátke špecifickej pre antigénové miesto II, ktorá umožňuje rozpoznanie možného virulentného zvratu SAD kmeňov použitých na orálnu vakcináciu líšok.
Mutanty podľa vynálezu môžu byť multiplikované v BHK 21 bunkách obličiek škrečkov za prítomnosti GEM (minimálne esenciálne médium modifikované pomocou Glasgoe, dostupne od FLOW) a 2 % teľacieho séra, pri 33 °C, vo vlhkej atmosfére, obsahujúcej 5 % CO2.
Titrujú sa zvyčajnými metódami, napríklad stanovením 50 % letálnej dávky (LD50) na mladých myšiach, imunofluorescenciou alebo spočítaním lýzií pod agarom. Môžu byť uchovávané pri -70 °C.
Analýza nukleotidovej sekvencie glykoproteínu týchto mutantov ukázala, že kodón aminokyseliny v polohe 333 sa líši aspoň dvoma nukleotidmi od všetkých možných kodónov arginínu. Z mutantov, ktorí spĺňajú túto podmienku, je mutant, ktorý obsahuje kyselinu glutámovú v polohe 333 zvlášť výhodný, pretože sa multiplikuje dobre v bunkovej kultúre, je menej patogénny proti novorodeným myšiam a má dobrú ochrannú silu.
Dvojitý mutant, nesúci kyselinu glutámovú, ktorej kodón je GAA namiesto arginínu v polohe 333, získaný uvedenou metódu zo SAD Berne kmeňa a označený ako SAG2, bol uložený v Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (C. N. C. M.) INŠTITÚT PASTEUR - FRANCE, 9. júla 1992 pod číslom 1-1238. Tento mutant obsahuje ďalšie mutácie, menovite rezistenciu k monoklonálnej protilátke špecifickej pre antigénové miesto Π, ktoré slúži ako ďalší marker kmeňa.
Vynález bude teraz detailnejšie opísaný vzhľadom na SAG 2 mutant bez toho, aby vynález bol tak obmedzovaný na tento samotný mutant.
Príklady uskutočnenia vynálezu
A - testy genetickej stability kmeňa počas pasážovania v mozgoch mladých myší
Šesť 4 dni starých myší bolo injektovaných 103 PFU
SAG2. Keď zvieratá ochoreli (D6), boli usmrtené odťatím
Titre mozgov v PFU/ml sú uvedené v tabuľke:
hlavy. Pripravilo sa šesť individuálnych základných prípravkov; každý základný prípravok bol titrovaný a 3 dospelé myši (kontrola patogenity) a jedna mladá myš (budúca pasáž) boli injektované 30 μΐ 1/10 zriedeného roztoku. 6 mladých myší takto umožnilo vykonať 6 nezávislých sérií 3 pasáží.
| Séria | A | B | C | D | E | F |
| 1. pas. | 5.10’ | 1,5.10’ | 10' | 106 | ιό5 | 10° |
| 2. pas. | >5.107 | 2,5.10'>5.10' | >5.10' | >5.10' | >5.10' | >5.10' |
| 3. pas. | >5.10' | >5.10'>5.10' | >5.10' | >5.10' | >5.10' | >5.10' |
Všetci dospelí (t. j. 54 myší) injektovaní po 1., 2. alebo 3. pasážovaní prežívajú, čo vykazuje neprítomnosť reverzie.
B. Chrániaca sila SAG2
Myši boli injektované intracerebrálne SAG2 mutantom a chrániaca sila tohto mutanta bola stanovená intramuskulámym testovaním 100 LD50 CVS kmeňa.
Získané výsledky sú uvedené na obr. 2, ktorý je grafom, udávajúcim chrániacu silu (%) na ordináte ako funkciu množstva injektovaného mutanta, vyjadrenú v PFU/myš (log). Bol opakovaný ten istý test s SK mutantom, obsahujúcim lyzín v polohe 333.
Zistilo sa, že chrániaca sila SK a SAG2 je 100 % pri 104 PFU/myš a vyššie.
C. Patogenita SAG2 pri intracerebrálnom podaní
Myši boli injektované SAG2 mutantom v dávkach v rozmedzí od 10 °’5 až 106 PFU/myš a nebola pozorovaná žiadna mortalita v priebehu obdobia 28 dní.
Paralelne bol ten istý pokus vykonaný s vírusom SAD BERNE alebo SK mutantom.
Výsledky sú uvedené na obr. 3, ktorý je grafom, uvádzajúcim % mortality (na ordináte) ako funkciu množstva mutanta injektovaného na myš (na abscisa).
Bolo zistené, že SAG2 mutant nepôsobí žiadnu mortalitu, zatiaľ čo SK mutant má slabú zvyškovú patogénnu účinnosť.
D. Patogenita SAG2 pri intramuskulámom podaní
Vyššie uvedený test bol opakovaný s tým rozdielom, že podanie bol intramuskuláme. Získané výsledky sú uvedené na obr. 4, ktorý udáva % mortality (na ordináte) ako funkciu dávky podanej v PFU/myš (na abscise).
Je zrejmé, že SAG2 a SK mutant nevyvoláva žiadnu mortalitu.
Mutanty podľa vynálezu môžu byť podané ako živá vakcína akýmkoľvek spôsobom zvyčajne používaným pre vakcináciu a hlavne intramuskulámym alebo orálnym podaním. Mutanty sú zvyčajne riedené farmaceutický prijateľným inertným vehikulom, ako je izotonický roztok.
Claims (9)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Avirulentná vakcína proti besnote, obsahujúca aviruletný mutant SAD kmeňa vírusu besnoty, glykoproteín, ktorý obsahuje v polohe 333 prirodzene sa vyskytujúcu aminokyselinu, ktorej kodón sa líši od kodónu arginínu aspoň dvoma nukleotidmi.
- 2. Vakcína podľa nároku 1, kde aminokyselinou v polohe 333 je kyselina glutámová.
- 3. Vakcína podľa jedného z nárokov 1 a 2, kde mutantom je mutant SAD Berne kmeňa.
- 4. Vakcína podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 3, kde mutantom je mutant uložený v Collection Nationale de Cultures de Microorganismes - INŠTITÚT PASTEUR (C.N.C.M.) - Francúzsko 9. júla 1992 pod číslom 1-1238.
- 5. Dvojitý avirulentný mutant SAD kmeňa vírusu besnoty, ktorého glykoproteín obsahuje v polohe 333 prirodzene sa vyskytujúcu aminokyselinu, ktorej kodón sa líši od kodónu arginínu dvoma nukleotidmi.
- 6. Dvojitý avirulentný mutant podľa nároku 5, kde aminokyselina v polohe 333 je kyselina glutámová.
- 7. Dvojity avirulentný mutant podľa jedného z nárokov 5 alebo 6, ktorým je mutant SAD Berne kmeňa.
- 8. Dvojitý' avirulentný mutant SAD Berne kmeňa, uložený v Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (C.N.C.M.) - INSTľľU PASTEUR - Francúzsko 9. júla 1992 pod číslom 1-1238.
- 9. Spôsob získania dvojitých mutantov podľa ktoréhokoľvek z nárokov 5až8, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa:(i) výber, zo SAD kmeňa vírusu besnoty takých mutantov, ktoré nie sú neutralizované monoklonálnou protilátkou, neutralizujúcou uvedený SAD kmeň, ale neneutralizujúcou TAG1 kmeň, (ii) izoláciu, sekvenovaním 333 oblasti glykoproteínu mutantov vybraných v stupni (i) mutanta, ktorý obsahuje lyzín v polohe 333, (iii) prípravu monoklonálnej protilátky, ktorá neutralizuje tak uvedený SAD kmeň, ako mutant získaný v stupni (ii), ale neneutralizuje TAG1 kmeň, a (iv) uskutočnenie druhého výberu z mutantov získaných v stupni (i) pomocou monoklonálnej protilátky pripravenej v stupni (iii).
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9208947A FR2693655B1 (fr) | 1992-07-20 | 1992-07-20 | Vaccin antirabique avirulent. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SK76193A3 SK76193A3 (en) | 1994-06-08 |
| SK280104B6 true SK280104B6 (sk) | 1999-08-06 |
Family
ID=9432070
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SK761-93A SK280104B6 (sk) | 1992-07-20 | 1993-07-19 | Avirulentná vakcína proti besnote |
Country Status (20)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5853735A (sk) |
| EP (1) | EP0583998B1 (sk) |
| AT (1) | ATE175877T1 (sk) |
| BG (1) | BG61066B1 (sk) |
| BR (1) | BR9302910A (sk) |
| CA (1) | CA2100591C (sk) |
| CZ (1) | CZ283400B6 (sk) |
| DE (1) | DE69323130T2 (sk) |
| FI (1) | FI933210A (sk) |
| FR (1) | FR2693655B1 (sk) |
| HR (1) | HRP931065B1 (sk) |
| HU (1) | HU219266B (sk) |
| MA (1) | MA22938A1 (sk) |
| MX (1) | MX9304349A (sk) |
| PL (1) | PL172853B1 (sk) |
| RO (1) | RO112582B1 (sk) |
| RU (1) | RU2128519C1 (sk) |
| SI (1) | SI9300392A (sk) |
| SK (1) | SK280104B6 (sk) |
| TN (1) | TNSN93083A1 (sk) |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2352231C (en) * | 1998-11-27 | 2010-06-01 | Akzo Nobel N.V. | Stable, attenuated rabies virus mutants and live vaccines thereof |
| AU777414B2 (en) | 1999-06-03 | 2004-10-14 | Nippon Suisan Kaisha, Ltd. | Tricyclic fused heterocycle compounds, process for preparing the same and use thereof |
| US7074413B2 (en) | 2000-03-23 | 2006-07-11 | Thomas Jefferson University | Genetically engineered rabies recombinant vaccine for immunization of stray dogs and wildlife |
| KR20040029377A (ko) * | 2001-07-20 | 2004-04-06 | 더 유니버시티 오브 죠지아 리서치 파운데이션, 인코포레이티드 | 공수병의 예방 접종 및 중추신경계 질환의 유전자 요법을위한 인산화 부위의 핵단백질 돌연변이를 갖는 약독화공수병 바이러스 |
| EP1300157B1 (en) | 2001-10-04 | 2005-10-26 | Centrum voor Onderzoek in Diergeneeskunde en Agrochemie | Attenuated mutant newcastle disease virus strains for in ovo vaccination and their use |
| EP1439856B1 (en) * | 2001-10-10 | 2009-04-01 | Thomas Jefferson University | Recombinant rabies vaccine and methods of preparation and use |
| EP1415665A3 (en) * | 2002-11-01 | 2004-06-30 | ID-Lelystad, Instituut voor Dierhouderij en Diergezondheid B.V. | BHV5 mutants |
| CA2573631A1 (en) | 2004-07-12 | 2006-02-16 | Thomas Jefferson University | Recombinant rabies virus compositions |
| BRPI0617373B1 (pt) | 2005-10-14 | 2022-04-05 | The Goverment of The United States of America, Representado por, The Secretary of The Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention | Composições e métodos do vírus da raiva |
| FR2944292B1 (fr) | 2009-04-08 | 2013-08-23 | Sanofi Pasteur | Procede de purification du virus rabique |
| RU2694836C1 (ru) * | 2018-12-14 | 2019-07-17 | федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности" (ФГБНУ "ФЦТРБ-ВНИВИ") | Способ получения антигена вируса бешенства для серологической диагностики |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2580176B1 (fr) * | 1985-04-12 | 1988-02-26 | Centre Nat Rech Scient | Vaccin antirabique avirulent |
| FR2633832B1 (fr) * | 1988-07-05 | 1991-05-31 | Virbac | Vaccin antirabique avirulent |
-
1992
- 1992-07-20 FR FR9208947A patent/FR2693655B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
1993
- 1993-07-14 FI FI933210A patent/FI933210A/fi not_active Application Discontinuation
- 1993-07-14 CZ CZ931402A patent/CZ283400B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1993-07-16 EP EP93401843A patent/EP0583998B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1993-07-16 BG BG97964A patent/BG61066B1/bg unknown
- 1993-07-16 AT AT93401843T patent/ATE175877T1/de active
- 1993-07-16 DE DE69323130T patent/DE69323130T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1993-07-19 HR HR9208947A patent/HRP931065B1/xx not_active IP Right Cessation
- 1993-07-19 MX MX9304349A patent/MX9304349A/es unknown
- 1993-07-19 SK SK761-93A patent/SK280104B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1993-07-19 RU RU93048174A patent/RU2128519C1/ru not_active IP Right Cessation
- 1993-07-19 MA MA23238A patent/MA22938A1/fr unknown
- 1993-07-19 BR BR939302910A patent/BR9302910A/pt not_active Application Discontinuation
- 1993-07-20 RO RO93-01010A patent/RO112582B1/ro unknown
- 1993-07-20 CA CA002100591A patent/CA2100591C/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-07-20 HU HU9302091A patent/HU219266B/hu unknown
- 1993-07-20 SI SI9300392A patent/SI9300392A/sl not_active IP Right Cessation
- 1993-07-20 PL PL93299739A patent/PL172853B1/pl unknown
- 1993-07-20 TN TNTNSN93083A patent/TNSN93083A1/fr unknown
-
1997
- 1997-01-17 US US08/785,616 patent/US5853735A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FI933210A (fi) | 1994-01-21 |
| HU219266B (en) | 2001-03-28 |
| PL299739A1 (en) | 1994-01-24 |
| MX9304349A (es) | 1994-06-30 |
| HUT69961A (en) | 1995-09-28 |
| US5853735A (en) | 1998-12-29 |
| BR9302910A (pt) | 1994-02-16 |
| SI9300392A (en) | 1994-06-30 |
| SK76193A3 (en) | 1994-06-08 |
| BG97964A (bg) | 1994-04-29 |
| EP0583998A1 (fr) | 1994-02-23 |
| DE69323130D1 (de) | 1999-03-04 |
| FR2693655A1 (fr) | 1994-01-21 |
| DE69323130T2 (de) | 1999-06-17 |
| MA22938A1 (fr) | 1994-04-01 |
| RO112582B1 (ro) | 1997-11-28 |
| RU2128519C1 (ru) | 1999-04-10 |
| PL172853B1 (pl) | 1997-12-31 |
| CZ140293A3 (en) | 1994-02-16 |
| HU9302091D0 (en) | 1993-11-29 |
| CA2100591C (en) | 2003-02-18 |
| BG61066B1 (bg) | 1996-10-31 |
| EP0583998B1 (fr) | 1999-01-20 |
| TNSN93083A1 (fr) | 1994-03-17 |
| CA2100591A1 (en) | 1994-01-21 |
| FI933210A0 (fi) | 1993-07-14 |
| HRP931065A2 (en) | 1995-02-28 |
| FR2693655B1 (fr) | 1994-10-14 |
| ATE175877T1 (de) | 1999-02-15 |
| CZ283400B6 (cs) | 1998-04-15 |
| HRP931065B1 (en) | 1999-12-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Lafay et al. | Vaccination against rabies: construction and characterization of SAG2, a double avirulent derivative of SADBern | |
| Tuffereau et al. | Arginine or lysine in position 333 of ERA and CVS glycoprotein is necessary for rabies virulence in adult mice | |
| Appleton et al. | Monoclonal antibody analysis of serotype-restricted and unrestricted bluetongue viral antigenic determinants | |
| Morimoto et al. | Genetic engineering of live rabies vaccines | |
| Marshall et al. | Monoclonal antibody analysis of bovine herpesvirus-1 glycoprotein antigenic areas relevant to natural infection | |
| SK280104B6 (sk) | Avirulentná vakcína proti besnote | |
| Carrascosa et al. | African swine fever virus attachment protein | |
| EP0402029B1 (en) | Monoclonal antibodies for post exposure treatment of rabies | |
| Le Blois et al. | Oral immunization of foxes with avirulent rabies virus mutants | |
| Nitayaphan et al. | Neutralizing monoclonal antibodies to Theiler's murine encephalomyelitis viruses | |
| Lafon et al. | Human monoclonal antibodies specific for the rabies virus glycoprotein and N protein | |
| Shimizu et al. | Monoclonal antibodies with neutralizing activity to equine herpesvirus 1 | |
| Matheise et al. | Antigenic analysis of the F protein of the bovine respiratory syncytial virus: identification of two distinct antigenic sites involved in fusion inhibition | |
| Flamand et al. | Avirulent mutants of rabies virus and their use as live vaccine | |
| Montaño-Hirose et al. | Protective activity of a murine monoclonal antibody against European bat lyssavirus 1 (EBL1) infection in mice | |
| US5449765A (en) | DNA encoding amino acids 590-710 of glycoprotein gII of pseudorabies virus | |
| EP0670901A1 (en) | Polypeptide fragment capable of inducing neutralising antibodies against feline immuno-deficiency virus | |
| DK170393B1 (da) | Avirulent rabies-vaccine samt avirulent mutant af stammen SAD Berne | |
| CA1336955C (en) | Respiratory syncytial virus: vaccines and diagnostic assays | |
| EP0920449B1 (en) | Morbillivirus-derived peptides | |
| US5128128A (en) | Virus vaccine | |
| Neutralizing | Novel Human Monoclonal Antibody | |
| Chang et al. | Isolation of gE gene deleted pseudorabies virus by using a gE specific monoclonal antibody | |
| Valcic et al. | Foot‐and‐Mouth Disease Virus C3 Resende Subtype Analysed by Means of Competition RIA Using Neutralizing Monoclonal Antibodies | |
| EP0101731A1 (en) | Attenuation of vaccines with monoclonal antibody |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MK4A | Patent expired |
Expiry date: 20130719 |