RU2128519C1 - Авирулентная вакцина против бешенства, штамм вируса бешенства, используемый для изготовления вакцины против бешенства и способ его получения - Google Patents
Авирулентная вакцина против бешенства, штамм вируса бешенства, используемый для изготовления вакцины против бешенства и способ его получения Download PDFInfo
- Publication number
- RU2128519C1 RU2128519C1 RU93048174A RU93048174A RU2128519C1 RU 2128519 C1 RU2128519 C1 RU 2128519C1 RU 93048174 A RU93048174 A RU 93048174A RU 93048174 A RU93048174 A RU 93048174A RU 2128519 C1 RU2128519 C1 RU 2128519C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- strain
- rabies
- mutant
- sad
- avirulent
- Prior art date
Links
- 241000711798 Rabies lyssavirus Species 0.000 title claims abstract description 16
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 18
- 206010037742 Rabies Diseases 0.000 title abstract description 5
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims abstract description 11
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 11
- 102100024342 Contactin-2 Human genes 0.000 claims abstract description 7
- 101000690440 Solanum lycopersicum Floral homeotic protein AGAMOUS Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 7
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims abstract description 4
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 claims abstract description 4
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 claims description 15
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 claims description 15
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 7
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 229960003127 rabies vaccine Drugs 0.000 claims description 5
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 4
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 abstract description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract 1
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 abstract 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 abstract 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 18
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 15
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 13
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 12
- 101100162403 Arabidopsis thaliana ALEU gene Proteins 0.000 description 9
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 9
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 9
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 7
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 6
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 5
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 5
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 5
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 5
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 5
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 4
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 4
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 4
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- 241000282421 Canidae Species 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- VEZXCJBBBCKRPI-UHFFFAOYSA-N beta-propiolactone Chemical compound O=C1CCO1 VEZXCJBBBCKRPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 3
- 229960000380 propiolactone Drugs 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 4-aminofolic acid Chemical compound C1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000005374 Poisoning Diseases 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 229960003896 aminopterin Drugs 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 210000004754 hybrid cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 2
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 231100000572 poisoning Toxicity 0.000 description 2
- 230000000607 poisoning effect Effects 0.000 description 2
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 241000700179 Apodemus Species 0.000 description 1
- 101100478627 Arabidopsis thaliana S-ACP-DES2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241001359030 Arvicola amphibius Species 0.000 description 1
- 241000711515 Berne virus Species 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 241000466354 Myodes Species 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 101150038966 SAD2 gene Proteins 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 229960004279 formaldehyde Drugs 0.000 description 1
- 235000019256 formaldehyde Nutrition 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000007917 intracranial administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 231100000636 lethal dose Toxicity 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 229940126578 oral vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/205—Rhabdoviridae, e.g. rabies virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/20011—Rhabdoviridae
- C12N2760/20111—Lyssavirus, e.g. rabies virus
- C12N2760/20134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение предназначено для получения средства специфической профилактики против бешенства. Вакцина против бешенства содержит авирулентный мутант штамма SAD Berne вируса бешенства. Штамм характеризуется тем, что содержит в положении 333 природную глутаминовую кислоту, кодон которой отличается от кодонов аргинина по крайней мере двумя нуклеотидами. Штамм депонирован в Национальной Коллекции Культур Микроорганизмов и имеет регистрационный номер C. N.С.М. 1-1238. Штамм получен путем отбора с использованием моноклональных антител, нейтрализующих штамм SAD и нейтрализующих штамм ТAG 1. Штамм и вакцина на его основе характеризуются повышенной безопасностью и эффективностью. 3 с. и 2 з.п. ф-лы, 1 табл., 4 ил.
Description
Изобретение относится к новой вакцине против бешенства.
Вирус бешенства является рабдовирусом, содержащим пять протеинов, в котором один внешний протеин, гликопротеин, инициирует синтез нейтрализующих антител у привитых животных. Введение очищенного гликопротеина защищает животное от внешней инфекции. Наиболее используемые штаммы вируса бешенства, а именно штаммы CVS и SAD, которые происходят от штаммов SAD, таких как SAD Berne и SAD B19, описаны в "Rabies Viruses", H.F. Clark и T.I. Wictor-Strains of Human Viruses, изд. Majer and Plotkin Karger, Bale, 1972, стр. 177 - 182. Последовательность аминокислот гликопротеина штамма CVS описана Yelverton и др. в "Rabies virus glucoprotein analogs: biosynthesis in Escherichia coli" Science 219, 614 - 620.
Этот гликопротеин содержит два основных антигенных различных сайта, связанных с нейтрализацией вируса /сайты II и III/. Сайт III в положении 330 - 340 содержит аргинин 333, который определяет вирулентность этого штамма.
Последовательность аминокислот гликопротеина штамма SAD Berne не установлена полностью. Однако можно определить, что антигенный сайт III гликопротеина штамма SAD Berne идентичен этому же сайту гликопротеина штамма CVS.
Используемые в настоящее время вакцины против бешенства являются либо вакцинами, полученными из инактивированного вируса, либо вакцинами, состоящими из вирусных штаммов, вирулентность которых уменьшена, либо рекомбинантными вирусами /например, вакцина/.
Инактивация вируса может быть осуществлена различными способами, в частности химическими способами, такими как обработка формолом или β-пропиолактоном.
Главным недостатком способа получения вакцины является работа с вирулентными штаммами, что требует точного соблюдения условий работы, и создает риск отравления для работающего персонала.
С другой стороны, инактивированные вакцины, вводимые оральным путем, не обладают защитными свойствами.
Снижение вирулентности вирусных штаммов основано на хорошо известной методике; оно может быть осуществлено, например, последовательным пропусканием вирусных штаммов через хозяина другого вида штамма /кролика или мыши, например/ или через клеточную культуру. Получают таким образом штаммы, несвойственные первоначальному хозяину, и, следовательно, менее патогенные при сохранении их вакцинирующей способности.
Штаммы SAD, такие как SADB19 и SAD Berne, являющиеся доступными, являются ослабленными штаммами и были испытаны в Европе для вакцинации лисиц. Они могут быть смешаны с приманкой для орального введения. Однако эти штаммы проявляют патогенность на других видах животных и на человеке. Следовательно, они создают потенциальный риск отравления, что значительно уменьшает интерес к этим штаммам для оральной вакцинации.
Действительно, например, оральное введение штамма SAD Berne группе из 23 диких грызунов, выбранных среди Apodemus flavicolus et sylvaticus, Arvicola terrestris, Clethrionomys clareolus, Minotus agresti, вызывает смерть от бешенства двух животных.
Испытания на мышах также показывают, что штамм SAD Berne является патогенным для этого типа животных, как при внутричерепном, так и при внутримышечном введении, как это показывают кривые на фиг. 1a и 1b, на которых соответственно показано:
фиг. 1a - кривая смертности взрослых мышей в зависимости от доз, вводимых интрацеребральным путем (в единицах образующих пятна, ЕОП);
фиг. 1b - кривая смертности взрослых мышей в зависимости от доз, введенных внутримышечным путем (в единицах, образующих пятна).
фиг. 1a - кривая смертности взрослых мышей в зависимости от доз, вводимых интрацеребральным путем (в единицах образующих пятна, ЕОП);
фиг. 1b - кривая смертности взрослых мышей в зависимости от доз, введенных внутримышечным путем (в единицах, образующих пятна).
При оральном пути введения у мышей отмечается 10%-ная смертность при дозе 105,5 ЕОП.
Штамм SAD Berne, применяемый как таковой в вакцинационной кампании на лисицах, представляет опасность для дикой фауны и человека. Это же относится и к штамму SAD B19.
Для устранения этого недостатка уже предлагалась авирулентная вакцина против бешенства. Эта вакцина, описанная в заявке на патент EP 350398, содержит авирулентный мутант штамма SAD вируса бешенства, который характеризуется тем, что вместо аргинина 333 гликопротеина он имеет аминокислоту, отличающуюся от лизина, например глицин, изолейцин или серин.
Этот мутант получают заменой одного нуклеотида в кодоне аргинина 333.
К сожалению, этот мутант может при простой обратной мутации вновь дать родительский штамм.
Следовательно, эта вакцина, используемая оральным путем, не всегда безопасна для животных других видов.
Настоящее изобретение относится к эффективной вакцине, которая позволяет устранить указанные недостатки.
Вакцина по изобретению включает авирулентный мутант штамма SAD вируса бешенства, который характеризуется тем, что вместо аргинина 333 гликопротеина он содержит природную аминокислоту, кодон которой отличается от кодонов, кодирующих аргинин двумя нуклеотидами.
Изобретение относится также и к способу получения авирулентного мутанта, указанного выше. Этот способ включает:
1) отбор, исходя из штамма SAD вируса бешенства, мутантов, которые не нейтрализованы моноклональными антителами, нейтрализующими вышеупомянутый штамм SAD, но не нейтрализующими штамм TAG1, описанный ниже;
2) отделение путем секвенирования области 333 гликопротеина мутантов, отобранных на стадии 1) от мутанта, содержащего в положении 333 лизин;
3) получение моноклонального антитела, которое одновременно нейтрализует вышеупомянутый штамм SAD и мутант, полученный на стадии 2), но не нейтрализует штамм TAG1;
4) проведение повторного отбора из мутантов, полученных на стадии 1) с помощью моноклонального антитела, полученного на стадии 3).
1) отбор, исходя из штамма SAD вируса бешенства, мутантов, которые не нейтрализованы моноклональными антителами, нейтрализующими вышеупомянутый штамм SAD, но не нейтрализующими штамм TAG1, описанный ниже;
2) отделение путем секвенирования области 333 гликопротеина мутантов, отобранных на стадии 1) от мутанта, содержащего в положении 333 лизин;
3) получение моноклонального антитела, которое одновременно нейтрализует вышеупомянутый штамм SAD и мутант, полученный на стадии 2), но не нейтрализует штамм TAG1;
4) проведение повторного отбора из мутантов, полученных на стадии 1) с помощью моноклонального антитела, полученного на стадии 3).
Моноклональные антитела, используемые при отборе мутантов по изобретению, получают слиянием клеток миеломы и клеток, производящих антивирусные антитела по методике гибридизации, описанной KOHLER et MILSTEIN, в журнале NATURE, 256, 495 - 497 /1975/, эта методика широко известна в настоящее время специалистам.
Согласно этой методике можно подвергать слиянию клетки, происходящие от различных видов, однако предпочтительными являются клетки животного одного и того же вида. Например, используют преимущественно, с одной стороны, клетки миеломы мыши и, с другой стороны, клетки селезенки мыши, предварительно иммунизированные штаммом вируса бешенства согласно протоколу, приведенному ниже.
В основном, этот способ гибридизации, описанный для клеток мышей, включает следующие стадии:
1) иммунизация мышей заданным количеством вируса, инактивированного β-пропиолактоном;
2) извлечение селезенки у иммунизированной мыши и отделение спленоцитов;
3) слияние полученных таким образом спленоцитов с клетками миеломы мыши в присутствии стимулятора слияния;
4) культивирование полученных гибридных клеток в избирательной среде, в которой не развиваются неслившиеся клетки миеломы, в присутствии усваиваемых элементов;
5) отбор клеток, вырабатывающих желаемые антитела и клонирование этих клеток.
1) иммунизация мышей заданным количеством вируса, инактивированного β-пропиолактоном;
2) извлечение селезенки у иммунизированной мыши и отделение спленоцитов;
3) слияние полученных таким образом спленоцитов с клетками миеломы мыши в присутствии стимулятора слияния;
4) культивирование полученных гибридных клеток в избирательной среде, в которой не развиваются неслившиеся клетки миеломы, в присутствии усваиваемых элементов;
5) отбор клеток, вырабатывающих желаемые антитела и клонирование этих клеток.
Протокол иммунизации включает внутрибрюшинное введение мышам Balb-C 100 мкг инактивированного β-пропиолактоном вируса CV5 с адъювантом Фрейда и повторную инъекцию внутривенным путем за 4 дня до слияния клеток после периода отдыха в течение 1 месяца.
Спленоциты иммунизированных мышей собирают после извлечения селезенки классическим способом.
Клетки миеломы мышей, используемые для получения нейтрализующих моноклональных антител, являются клетками миеломы мышей Balb-C, происходящих из колонии SP2O. Эти клетки миеломы были отобраны с точки зрения их чувствительности к аминоптерину и культивированы в соответствующей среде, такой как основная среда Игла, модифицированная DULBECCO (Dulbecco Modified Eagle medium), называемая далее среда DMEM, к которой добавлено 15% сыворотки жеребенка.
Слияние клеток миеломы со спленоцитами осуществляют путем смешивания 5 • 107 клеток миеломы с 5 • 107 клеток селезенки иммунизированной мыши в присутствии стимулятора слияния, такого как, например, полиэтиленгликоль.
После инкубации при 37oC клетки промыват в среде DMEM и вновь суспензируют, затем культивируют в избирательной среде, предназначенной исключительно для роста гибридных клеток. Эта среда содержит гипоксантин, аминоптерин и тимидин.
Отбирают затем супернатанты культур, спустя 7 - 20 дней после слияния клеток, приводя во взаимодействие супернатанты с суспензией вируса CVS и удерживая антитела, которые нейтрализуют вышеупомянутую суспензию.
Термин "антитело, нейтрализующее вирус" обозначает такие антитела, которые при помещении их в суспензию данного вируса ингибируют его вирулентность.
Нейтрализующая способность моноклональных антител, полученных выше, определяется классическим способом, хорошо известным специалисту. Этот способ состоит в смешивании 100 мкл суспензии вируса с содержанием вируса 1000 ЕОП и 100 мкл супернатанта культуры гибридомы, в инфицировании культуры клеток этой смесью и, после 4 дней инкубирования, в подсчете лизированных пятен на агаре по методу, описанному BUSSEREAU et al., 1982, J. Virol. Meth. Vol. 4, стр. 277 - 282. Антитела являются нейтрализаторами, если они ингибируют образование пятен на агаре в вышеупомянутых условиях.
Среди этих антител отбирают затем антитела, которые не нейтрализуют авирулентный мутант TAG1, производный штамма CVS, представленный в Национальной Коллекции Культур Микроорганизмов (C.N.C.M. - Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes) Института Пастера - Франция 12 апреля 1985 под N 1-433. Полученные моноклональные антитела, которые нейтрализуют штамм CVS, но не нейтрализуют авирулентный мутант TAG1, позволяют селекционировать авирулентные мутанты исходя из любого штамма вируса бешенства, который нейтрализуется этими моноклональными антителами.
Моноклональные антитела, полученные таким образом, являются антителами, нейтрализующими также штаммы SAD вируса бешенства. Они подходят также для осуществления первичного отбора по способу изобретения.
Секвенирование области 333 гликопротеина мутантов, отобранных на стадии 1) осуществляют по классической методике, хорошо известной специалисту [SANGER et al., 1977, Proc. Nat. Acad.Sci. USA, vol. 74, p. 5463 - 5467].
Это секвенирование позволяет изолировать мутант, который имеет в положении 333 гликопротеина лизин; этот мутант именуется далее "мутант SK".
Кодон /AAA/ этой аминокислоты /лизина/ отличается от кодона аргинина в положении 333 штамма SAD единственным нуклеотидом, причем кодон аргинина в положении 333 имеет строение AGA.
Далее переходят к получению моноклонального антитела, нейтрализующего одновременно штамм SAD и мутант, полученный выше.
Это моноклональное антитело получают удерживанием среди моноклональных антител, нейтрализующих SAD и не нейтрализующих TAG1, такого, который нейтрализует равным образом лизиновый мутант или мутант SK, полученные выше.
Это моноклональное антитело позволяет осуществить второй отбор /стадию 4/ способа по изобретению.
Патогенная возможность мутантов, полученных после второй селекции, определяется путем интрацеребральной инъекции 105 ЕОП взрослым мышам. Мутанты, которые не убивают при этой дозе и при этом методе введения, рассматриваются как авирулентные.
Мутанты по изобретению являются двойными авирулентными мутантами штамма SAD, в частности штамма SAD Berne, получаемыми двумя последовательными селекциями с помощью моноклональных антител, определенных выше.
Мутанты по изобретению могут, кроме того, заключать в себе другие мутации, как например мутацию, придающую устойчивость к моноклональным специфичным антителам антигенного сайта II, что позволяет распознать возможный ревертант вирулентности штаммов SAD, используемых для оральной вакцинации лис.
Мутанты по изобретению могут быть размножены на клетках почки новорожденного хомяка BHK 21, в присутствии среды GEM (основная среда минимум-модификации Глазгоу, выпускаемая фирмой FLOW) и 2%-ной сыворотки теленка при 33oC во влажной атмосфере с 5%-ным содержанием CO2.
Их охарактеризовывают обычными методами, например, определяя летальную дозу 50 /ЛД50/ на мышах, иммунофлуоресценцией или обсчитывая лизированные пятна на агаре. Они могут храниться при -70oC.
Анализ последовательности нуклеотидов гликопротеина этих мутантов показывает, что кодон аминокислоты в положении 333 отличается по крайней мере двумя нуклеотидами от всех кодонов, возможных для аргинина. Среди мутантов, которые отвечают этим условиям, предпочтительным особенно является мутант, имеющий в 333 глутаминовую кислоту, так как он хорошо размножается на клеточной культуре, менее патогенен для новорожденных мышей, и он обладает высокой защитной способностью.
Двойной мутант, несущий глутаминовую кислоту, кодон которой: GAA на месте аргинина в положении 333, полученный по вышеприведенному способу; исходя из штамма SAD Berne, называемый далее SAG2, представлен в Национальную Коллекцию Культур Микроорганизмов /C.N.C.M. - Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes/ Института Пастера - Франция 9 июля 1992 под N 1-1238. Этот мутант содержит другую мутацию, а именно устойчивость к моноклональному специфическому антителу антигенного сайта II, что является дополнительным маркером штамма.
Далее представлено детальное описание изобретения, на примере мутанта SAG2, что однако не ограничивает изобретение только этим мутантом.
A - Исследование генетической стабильности штамма при проведении пассажей на мозге мышат.
103 ЕОП SAG2 вводят 6 мышатам в возрасте 4 дней. Когда животные заболевают /6/, их умерщвляют. Готовят 6 отдельных измельченных образцов; каждый образец оттитровывают и 30 мкл разбавленного 1/10 образца вводят 3 взрослым мышам /патогенный контроль/ и мышонку /следующий пассаж/, 6 мышат позволяют сделать 6 независимых серий из 3 пассажей.
Титры мозговых веществ в ЕОП /мл даны в таблице.
Все инъектированные взрослые особи /54 мыши/ после 1-го, 2-го и 3-го пассажей остались живы и показали отсутствие реверсии.
B - Защитная способность SAG2.
Мутант SAD2 вводят интрацеребральным путем мышам и определяют защитную способность мутанта в опыте внутримышечного введения 100 ЛД50 штамма CVS.
Полученные результаты представлены на фиг. 2, где графически показана защитная способность /%/ как функция количества введенного мутанта, выраженного в (ЕОП) UFP/мышь (log). Повторяют то же исследование с мутантом SK, имеющим в положении 333 лизин.
C - Патогенность SAG2 при интрацеребральном введении.
Вводят мутант SAG2 мышам в дозах от 10-0,5 до 106 ЕОП/мышь и не отмечают смертности в течение периода времени 28 дней.
Параллельно, осуществляют тот же опыт с вирусом SAD Berne или мутантом SK.
Результаты представлены на фиг. 3, где дан график зависимости % смертности /ось ординат/ от количества введенного мутанта мышам /ось абсцисс/.
Установлено, что мутант SAG2 не вызывает никакой смертности, тогда как мутант SK имеет слабую остаточную патогенность.
D - Патогенность SAG2 при внутримышечном введении.
Повторяют испытание, приведенное выше, но при внутримышечном введении. Полученные результаты представлены на фиг. 4, где приведен % смертности /ось ординат/ в зависимости от введенной дозы в ЕОП/мышь /ось абсцисс/.
Видно, что SAG2 и мутант SK не вызывают никакой смертности.
Мутанты по изобретению могут применяться в виде живой вакцины при всех обычно используемых способах введения при вакцинации и особенно при внутримышечном или оральном способе введения. Мутанты предварительно разбавляют в инертном фармацевтически пригодном растворителе, таком как физиологическая сыворотка.
Claims (5)
1. Авирулентная вакцина против бешенства, отличающаяся тем, что содержит авирулентный мутант штамма SAD вируса бешенства, в котором гликопротеин содержит в положении 333 природную глутаминовую кислоту, кодон который отличается от кодонов аргинина, по крайней мере двумя нуклеотидами.
2. Вакцина по п.1, отличающаяся тем, что мутантом является мутант штамма SAD Berene.
3. Вакцина по п.1 или 2, отличающаяся тем, что содержит штамм вируса бешенства C.N.C.M.No 1-1238.
4. Штамм вируса бешенства C.N.C.M.No 1-1238, используемый для получения авирулентной вакцины против бешенства.
5. Способ получения штамма вируса бешенства C.N.C.M.No 1-1238, отличающийся тем, что включает следующие стадии:
1) из штамма вируса бешенства C.N.C.M.No 1-1238 получают мутанты, которые не нейтрализуются моноклональным антителом, нейтрализующим штамм SAD, но не нейтрализующим штамм TAG1;
2) выделяют путем секвенирования положения 333 в гликопротеине мутантов, отобранных на стадии 1), мутант, имеющий в положении 333 лизин;
3) получают моноклональное антитело, которое одновременно нейтрализуют указанный штамм SAD и мутант, полученный на стадии 2), но не нейтрализует штамм TAG 1;
4) осуществляют второй отбор мутантов, полученных на стадии 1), с помощью моноклонального антитела, полученного на стадии 3).
1) из штамма вируса бешенства C.N.C.M.No 1-1238 получают мутанты, которые не нейтрализуются моноклональным антителом, нейтрализующим штамм SAD, но не нейтрализующим штамм TAG1;
2) выделяют путем секвенирования положения 333 в гликопротеине мутантов, отобранных на стадии 1), мутант, имеющий в положении 333 лизин;
3) получают моноклональное антитело, которое одновременно нейтрализуют указанный штамм SAD и мутант, полученный на стадии 2), но не нейтрализует штамм TAG 1;
4) осуществляют второй отбор мутантов, полученных на стадии 1), с помощью моноклонального антитела, полученного на стадии 3).
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FR9208947 | 1992-07-20 | ||
FR9208947A FR2693655B1 (fr) | 1992-07-20 | 1992-07-20 | Vaccin antirabique avirulent. |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU93048174A RU93048174A (ru) | 1997-02-10 |
RU2128519C1 true RU2128519C1 (ru) | 1999-04-10 |
Family
ID=9432070
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU93048174A RU2128519C1 (ru) | 1992-07-20 | 1993-07-19 | Авирулентная вакцина против бешенства, штамм вируса бешенства, используемый для изготовления вакцины против бешенства и способ его получения |
Country Status (20)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5853735A (ru) |
EP (1) | EP0583998B1 (ru) |
AT (1) | ATE175877T1 (ru) |
BG (1) | BG61066B1 (ru) |
BR (1) | BR9302910A (ru) |
CA (1) | CA2100591C (ru) |
CZ (1) | CZ283400B6 (ru) |
DE (1) | DE69323130T2 (ru) |
FI (1) | FI933210A (ru) |
FR (1) | FR2693655B1 (ru) |
HR (1) | HRP931065B1 (ru) |
HU (1) | HU219266B (ru) |
MA (1) | MA22938A1 (ru) |
MX (1) | MX9304349A (ru) |
PL (1) | PL172853B1 (ru) |
RO (1) | RO112582B1 (ru) |
RU (1) | RU2128519C1 (ru) |
SI (1) | SI9300392A (ru) |
SK (1) | SK280104B6 (ru) |
TN (1) | TNSN93083A1 (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2575800C2 (ru) * | 2010-11-05 | 2016-02-20 | Новавакс, Инк. | Вирусоподобные частицы (vlp) из гликопротеина вируса бешенства |
Families Citing this family (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2352231C (en) * | 1998-11-27 | 2010-06-01 | Akzo Nobel N.V. | Stable, attenuated rabies virus mutants and live vaccines thereof |
AU777414B2 (en) | 1999-06-03 | 2004-10-14 | Nippon Suisan Kaisha, Ltd. | Tricyclic fused heterocycle compounds, process for preparing the same and use thereof |
US7074413B2 (en) | 2000-03-23 | 2006-07-11 | Thomas Jefferson University | Genetically engineered rabies recombinant vaccine for immunization of stray dogs and wildlife |
KR20040029377A (ko) * | 2001-07-20 | 2004-04-06 | 더 유니버시티 오브 죠지아 리서치 파운데이션, 인코포레이티드 | 공수병의 예방 접종 및 중추신경계 질환의 유전자 요법을위한 인산화 부위의 핵단백질 돌연변이를 갖는 약독화공수병 바이러스 |
EP1300157B1 (en) | 2001-10-04 | 2005-10-26 | Centrum voor Onderzoek in Diergeneeskunde en Agrochemie | Attenuated mutant newcastle disease virus strains for in ovo vaccination and their use |
EP1439856B1 (en) * | 2001-10-10 | 2009-04-01 | Thomas Jefferson University | Recombinant rabies vaccine and methods of preparation and use |
EP1415665A3 (en) * | 2002-11-01 | 2004-06-30 | ID-Lelystad, Instituut voor Dierhouderij en Diergezondheid B.V. | BHV5 mutants |
CA2573631A1 (en) | 2004-07-12 | 2006-02-16 | Thomas Jefferson University | Recombinant rabies virus compositions |
BRPI0617373B1 (pt) | 2005-10-14 | 2022-04-05 | The Goverment of The United States of America, Representado por, The Secretary of The Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention | Composições e métodos do vírus da raiva |
FR2944292B1 (fr) | 2009-04-08 | 2013-08-23 | Sanofi Pasteur | Procede de purification du virus rabique |
RU2694836C1 (ru) * | 2018-12-14 | 2019-07-17 | федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности" (ФГБНУ "ФЦТРБ-ВНИВИ") | Способ получения антигена вируса бешенства для серологической диагностики |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FR2580176B1 (fr) * | 1985-04-12 | 1988-02-26 | Centre Nat Rech Scient | Vaccin antirabique avirulent |
FR2633832B1 (fr) * | 1988-07-05 | 1991-05-31 | Virbac | Vaccin antirabique avirulent |
-
1992
- 1992-07-20 FR FR9208947A patent/FR2693655B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
1993
- 1993-07-14 FI FI933210A patent/FI933210A/fi not_active Application Discontinuation
- 1993-07-14 CZ CZ931402A patent/CZ283400B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1993-07-16 EP EP93401843A patent/EP0583998B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1993-07-16 BG BG97964A patent/BG61066B1/bg unknown
- 1993-07-16 AT AT93401843T patent/ATE175877T1/de active
- 1993-07-16 DE DE69323130T patent/DE69323130T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1993-07-19 HR HR9208947A patent/HRP931065B1/xx not_active IP Right Cessation
- 1993-07-19 MX MX9304349A patent/MX9304349A/es unknown
- 1993-07-19 SK SK761-93A patent/SK280104B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1993-07-19 RU RU93048174A patent/RU2128519C1/ru not_active IP Right Cessation
- 1993-07-19 MA MA23238A patent/MA22938A1/fr unknown
- 1993-07-19 BR BR939302910A patent/BR9302910A/pt not_active Application Discontinuation
- 1993-07-20 RO RO93-01010A patent/RO112582B1/ro unknown
- 1993-07-20 CA CA002100591A patent/CA2100591C/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-07-20 HU HU9302091A patent/HU219266B/hu unknown
- 1993-07-20 SI SI9300392A patent/SI9300392A/sl not_active IP Right Cessation
- 1993-07-20 PL PL93299739A patent/PL172853B1/pl unknown
- 1993-07-20 TN TNTNSN93083A patent/TNSN93083A1/fr unknown
-
1997
- 1997-01-17 US US08/785,616 patent/US5853735A/en not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2575800C2 (ru) * | 2010-11-05 | 2016-02-20 | Новавакс, Инк. | Вирусоподобные частицы (vlp) из гликопротеина вируса бешенства |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
FI933210A (fi) | 1994-01-21 |
HU219266B (en) | 2001-03-28 |
PL299739A1 (en) | 1994-01-24 |
MX9304349A (es) | 1994-06-30 |
HUT69961A (en) | 1995-09-28 |
US5853735A (en) | 1998-12-29 |
BR9302910A (pt) | 1994-02-16 |
SI9300392A (en) | 1994-06-30 |
SK76193A3 (en) | 1994-06-08 |
BG97964A (bg) | 1994-04-29 |
EP0583998A1 (fr) | 1994-02-23 |
DE69323130D1 (de) | 1999-03-04 |
FR2693655A1 (fr) | 1994-01-21 |
DE69323130T2 (de) | 1999-06-17 |
MA22938A1 (fr) | 1994-04-01 |
RO112582B1 (ro) | 1997-11-28 |
PL172853B1 (pl) | 1997-12-31 |
SK280104B6 (sk) | 1999-08-06 |
CZ140293A3 (en) | 1994-02-16 |
HU9302091D0 (en) | 1993-11-29 |
CA2100591C (en) | 2003-02-18 |
BG61066B1 (bg) | 1996-10-31 |
EP0583998B1 (fr) | 1999-01-20 |
TNSN93083A1 (fr) | 1994-03-17 |
CA2100591A1 (en) | 1994-01-21 |
FI933210A0 (fi) | 1993-07-14 |
HRP931065A2 (en) | 1995-02-28 |
FR2693655B1 (fr) | 1994-10-14 |
ATE175877T1 (de) | 1999-02-15 |
CZ283400B6 (cs) | 1998-04-15 |
HRP931065B1 (en) | 1999-12-31 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Lafay et al. | Vaccination against rabies: construction and characterization of SAG2, a double avirulent derivative of SADBern | |
DE60113512T2 (de) | Veränderter stamm des modifizierten vaccinia-virus ankara (mva) | |
JP2738524B2 (ja) | ウイルスに感染した動物とワクチン接種した動物を区別する方法 | |
RU2128519C1 (ru) | Авирулентная вакцина против бешенства, штамм вируса бешенства, используемый для изготовления вакцины против бешенства и способ его получения | |
HUT55243A (en) | Process for producing recombinant subunite vaccine against pseudolyssa | |
Schumacher et al. | SAG-2 oral rabies vaccine | |
Carrascosa et al. | African swine fever virus attachment protein | |
Le Blois et al. | Oral immunization of foxes with avirulent rabies virus mutants | |
Flamand et al. | Avirulent mutants of rabies virus and their use as live vaccine | |
Montaño-Hirose et al. | Protective activity of a murine monoclonal antibody against European bat lyssavirus 1 (EBL1) infection in mice | |
US6241989B1 (en) | Recombinant multivalent viral vaccine | |
DK170393B1 (da) | Avirulent rabies-vaccine samt avirulent mutant af stammen SAD Berne | |
US10190099B2 (en) | IBV strains and uses thereof | |
Consales et al. | The preparation of cultured rabies virus and the production of antiserum for human use | |
Yang et al. | Safety and immunogenicity of recombinant rabies virus (ERAGS) in mice and raccoon dogs | |
Turner | Humoral and cellular immune responses of mice to rabies and smallpox vaccines | |
US7087234B1 (en) | Recombinant multivalent viral vaccine | |
Jeansson | Production of herpes simplex antisera with increased type specificity in guinea pigs by antibody suppression | |
DE60028365T2 (de) | Chimäre nukleinsäuren und polypeptide aus lyssavirus | |
WO2013011942A1 (ja) | 変異狂犬病ウイルス及びワクチン | |
EP0621790A1 (en) | Attenuated, live vaccine for delaware strain ibdv | |
Leibowitz et al. | Increased hepatotropism of mutants of MHV, strain JHM, selected with monoclonal antibodies | |
Dhawane et al. | REPLACEMENT OF ERIG & HRIG BY HUMAN MONOCLONAL ANTIBODIES (MAbs) FOR RABIES TREATMENT | |
AU597934B2 (en) | Treating pseudorabis virus infection in swine | |
Shapouri et al. | Immunogenicity of E. coli‐expressed σ3 protein of avian reovirus in chickens |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
ND4A | Extension of patent duration |
Free format text: CLAIMS: 1 - 4 Extension date: 20180719 |
|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20130720 |