SI9300392A - Avirulent anti-rabies vaccine - Google Patents
Avirulent anti-rabies vaccine Download PDFInfo
- Publication number
- SI9300392A SI9300392A SI9300392A SI9300392A SI9300392A SI 9300392 A SI9300392 A SI 9300392A SI 9300392 A SI9300392 A SI 9300392A SI 9300392 A SI9300392 A SI 9300392A SI 9300392 A SI9300392 A SI 9300392A
- Authority
- SI
- Slovenia
- Prior art keywords
- mutant
- strain
- sad
- virulent
- mutants
- Prior art date
Links
- 229960003127 rabies vaccine Drugs 0.000 title claims description 6
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims abstract description 14
- 241000711798 Rabies lyssavirus Species 0.000 claims abstract description 14
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 14
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 13
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 12
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 9
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 claims description 17
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 claims description 17
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 9
- 102100024342 Contactin-2 Human genes 0.000 claims description 7
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 7
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 101000690440 Solanum lycopersicum Floral homeotic protein AGAMOUS Proteins 0.000 claims description 7
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 claims description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 3
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 abstract description 7
- 206010037742 Rabies Diseases 0.000 abstract description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 19
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 16
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 description 13
- 101100162403 Arabidopsis thaliana ALEU gene Proteins 0.000 description 11
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 11
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 9
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 9
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 7
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 6
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 6
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 5
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 5
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 5
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 5
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 4
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 231100000111 LD50 Toxicity 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 3
- VEZXCJBBBCKRPI-UHFFFAOYSA-N beta-propiolactone Chemical compound O=C1CCO1 VEZXCJBBBCKRPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 4-aminofolic acid Chemical compound C1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 2
- 0 CC1CC(C*)CC1 Chemical compound CC1CC(C*)CC1 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 229960003896 aminopterin Drugs 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 210000004754 hybrid cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 241000700179 Apodemus Species 0.000 description 1
- 241001359030 Arvicola amphibius Species 0.000 description 1
- 241000711515 Berne virus Species 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ABSLZJVVNOCFCY-LUAWRHEFSA-N CCCCCC(CC)C(CC1)CC1C(C)/C=C\CC Chemical compound CCCCCC(CC)C(CC1)CC1C(C)/C=C\CC ABSLZJVVNOCFCY-LUAWRHEFSA-N 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 101710175243 Major antigen Proteins 0.000 description 1
- 241000466354 Myodes Species 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 101900083372 Rabies virus Glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 206010042566 Superinfection Diseases 0.000 description 1
- 230000010530 Virus Neutralization Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 229960000380 propiolactone Drugs 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000013112 stability test Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/205—Rhabdoviridae, e.g. rabies virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/20011—Rhabdoviridae
- C12N2760/20111—Lyssavirus, e.g. rabies virus
- C12N2760/20134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Mycology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
Nevirulentno cepivo proti steklini
Pričujoči izum se nanaša na novo cepivo proti steklini.
Virus stekline je rabdovirus, ki ga tvori pet proteinov, od katerih je eden zunanji protein, namreč glikoprotein, ki sproži pri cepljenih živalih sintezo nevtralizirajočih protiteles. Vbrizganje očiščenega glikoproteina ščiti žival pred superinfekcijo. Najbolj uporabljani sevi virusa stekline, zlasti sev CVS in sev ERA, iz katerih so izvedeni sevi SAD, kot seva SAD Beme in SAD B19, so opisani v Rabies Viruses H.F. Clarka in T.J. Wiktoqa - Strains of Human Viruses, ki sta ga objavila Majer in Plotkin Karger, Basel, 1972, str. 177-182. Sekvenco amino kislin glikoproteina seva CVS so opisali Yelverton et al. v Rabies virus glycoprotein analogs: biosynthesis in Escherichia coli, Science, 219,614-620.
Ta glikoprotein ima dve razločni glavni antigenski mesti, ki sta v zvezi z nevtralizacijo virusa (mesti II in III). Mesto III v legi 330-340 vsebuje arginin 333, ki določa virulenco tega seva.
Sekvenca amino kislin glikoproteina seva SAD Berne še ni bila popolnoma določena. Vendar je bilo mogoče določiti, da je antigensko mesto III glikoproteina seva SAD Beme identično mestu glikoproteina seva CVS.
Cepiva proti steklini, ki jih trenutno uporabljajo, so bodisi cepiva, izdelana iz inaktiviranih virusov, ali cepiva, ki sestoje iz virusnih sevov, katerih virulenca je bila oslabljena, ali rekombinatnih virusov (npr. vakcina).
Viruse se da inaktivirati po različnih postopkih, zlasti s kemičnimi postopki, kot je obdelava s formaldehidom ali /3-propiolaktonom.
Glavna pomanjkljivost tega postopka za izdelavo cepiva je rokovanje z virulentnimi sevi, ki zahteva zelo stroge delovne pogoje in prinaša tveganje okužbe zaposlenega osebja.
Poleg tega pa inaktivirana cepiva, dana oralno, nimajo zaščitne sposobnosti.
Slabljenje virulence virusnih sevov je dobro poznana tehnika; izvesti se da npr. z zaporednimi pasažami virusnih sevov na gostitelju, ki je različen od vrste (species) prenašalca (npr. zajca ali miši), ali v celičnih kulturah. Tako dobe seve, ki niso prilagojeni prvotnemu gostitelju in so zato zanj manj patogeni, obenem pa obdrže svojo vakcinacijsko sposobnost.
Sevi SAD, kot seva SAD B19 in SAD Beme, ki so splošno dostopni, so oslabljeni sevi, ki so jih že preizkusili v Evropi za cepljenje lisic. Lahko jih primešajo za oralno dajanje vabi. Vendar pa se je pokazalo, da so ti sevi patogeni za druge živalske vrste in za človeka. Obstaja torej potencialno tveganje okužbe, kar močno zmanjšuje vrednost teh sevov za oralno cepljenje.
Dejansko je npr. oralno dajanje seva SAD Beme skupini 23 divjih glodalcev, izbranih med glodalci Apodemus flavicolus in sylvaticus, Arvicola terrestris, Clethrionomys clareolus in Minotus agresti, povzročilo pogin dveh živali zaradi stekline.
Tudi poskusi na miših so pokazali, da je sev SAD Beme patogen za to vrsto tako pri intracerebralnem kot tudi pri intramuskulamem dajanju, kot kažejo krivulje na priloženih slikah la in lb, ki sta:
slika la krivulja smrtnosti odraslih miši v odvisnosti od doz (v enotah, ki tvorijo plake = PFU = plaque forming units), danih intracerebralno, *
slika lb krivulja smrtnosti pri odraslih miših v odvisnosti od doz (v enotah, ki tvorijo plake), danih intramuskulamo.
Pri oralnem dajanju doze 105,5 PFUso opazili pri miših 10%-no smrtnost.
Zato predstavlja sev SAD Beme kot tak nevarnost za divjad in ljudi, če ga uporabljajo pri kampanjih za cepljenje lisic. Isto velja za sev SAD B19.
Da bi ublažili to pomanjkljivost, so že predlagali nevirulentno cepivo proti steklini. To cepivo, opisano v patentni prijavi EP 350,398, sestoji iz nevirulentnega mutanta seva SAD virusa stekline, v katerem je bil arginin 333 glikoproteina nadomeščen z amino kislino, kije različna od lizina, npr. glicinom, izolevcinom ali serinom.
Ta mutant je izveden s spremembo enega samega nukleotida v kodonu arginina 333.
Na nesrečo se lahko ta mutant spet spremeni nazaj v prvotni sev z enostavno povratno (reverzno) mutacijo.
To cepivo, ki ga uporabljajo za oralno dajanje, zato ni brez nevarnosti za druge živalske vrste.
Pričujoči izum se nanaša na učinkovito cepivo, ki omogoča ublažitev gornjih pomanjkljivosti.
Cepivo v skladu z izumom sestoji iz nevirulentnega mutanta seva SAD virusa stekline, v katerem je bil arginin 333 glikoproteina nadomeščen z naravno amino kislino, katere kodon se razlikuje od tistih, ki kodirajo za arginin, po dveh nukleotidih.
Izum se nadalje nanaša na nevirulentne mutante seva SAD virusa stekline, v katerem je bil arginin 333 glikoproteina nadomeščen z amino kislino, katere kodon se razlikuje od kodonov arginina, po dveh nukleotidih.
Izum se nadalje nanaša na postopek za pridobivanje zgoraj definiranih nevirulentnih mutantov. Ta postopek obstoji v tem, da
1) izberemo iz seva SAD virusa stekline tiste mutante, ki jih ne nevtralizira monoklonsko protitelo, ki nevtralizira omenjeni sev SAD, ki pa ne nevtralizira niže definiranega seva TAG1;
2) izoliramo z določitvijo sekvenc področja 333 glikoproteina mutantov, izbranih v stopnji 1), mutant, ki ima lizin v legi 333;
3) pripravimo monoklonsko protitelo, ki nevtralizira tako omenjeni sev SAD kot tudi mutant, dobljen v stopnji 2), vendar ne nevtralizira seva TAG1; in
4) izvedemo drugo izbiranje med mutanti, dobljenimi v stopnji 1, s pomočjo monoklonskega protitelesa, pripravljenega v stopnji 3).
Monoklonska protitelesa, ki jih uporabljamo za izbiranje mutantov v skladu z izumom, dobimo z zlitjem mielomskih celic s celicami, ki proizvajajo antivirusna protitelesa v skladu s tehniko hibridizacije, ki sta jo opisala KOHLER in MILSTEIN v NATURE, vol. 256, 495-497 (1975), tehniko, ki je sedaj strokovnjakom dobro poznana.
To tehniko lahko uporabimo, da zlijemo celice, ki izvirajo iz različnih vrst, vendar pa je ugodno uporabiti celice, ki izvirajo iz iste živalske vrste. Npr. prednostno je uporabiti po eni plati mišje mielomske celice in po drugi plati celice vranice miši, kije bila predhodno imunizirana s sevom virusa stekline v skladu z niže definiranim protokolom.
Čisto na splošno obsega ta postopek hibridizacije, ki ga opisujemo ob sklicevanju na mišje celice, te-le stopnje:
1) imunizacija miši z določeno množino virusa, inaktiviranega z /3-propiolaktonom;
2) odstranitev vranice imuniziranih miši in ločenje splenocitov;
3) zlitje tako dobljenih splenocitov z mišjimi mielomskimi celicami v prisotnosti promotoija zlitja;
4) gojenje dobljenih hibridnih celic v selektivnem mediju, v katerem se nezlite mielomske celice ne razvijajo, in v prisotnosti primernih sestavin; in
5) izbiranje celic, ki proizvajajo želeno protitelo, in kloniranje teh celic.
Imunizacijski protokol obsega intraperitonealno injiciranje mišim Balb-C 100 /ig virusa CV5, inaktiviranega z /3-propiolaktonom, skupaj s FREUND-ovim popolnim adjuvantom, in intravensko booster dozo 4 dni pred zlitjem po 1-mesečnem od5 moru.
Splenocite imuniziranih miši pridobimo po odstranitvi vranice v skladu z običajnim načinom dela.
Mišje mielomske celice, ki jih uporabljamo, da dobimo nevtralizirajoča monoklonska protitelesa, so mielomske celice miši Balb-C, ki izvirajo iz linije SP2O. Te mielomske celice smo izbrali zaradi njihove občutljivosti za aminopterin in gojili na ustreznem gojišču, kot je Eagle-ovo osnovno gojišče, modificirano po DULBECCO (Dulbecco Modified Eagle medium), v nadaljevanju imenovanem DMEM, ki mu je bilo dodanega 15% žrebičjega seruma.
Mielomske celice smo zlili s splenociti tako, da smo v prisotnosti promotorja zlitja, kot npr. polietilen glikola, zmešali 5.107 mielomskih celic s 5.107 celic vranice imuniziranih miši.
Po inkubaciji pri 37°C speremo celice v DMEM, ponovno suspendiramo in nato gojimo na selektivnem gojišču, primernem le za gojenje hibridnih celic. Tako gojišče vsebuje hipoksantin, aminopterin in timidin.
do 20 dni po zlitju nato izberemo kulturne supematante tako, da jih spravimo v stik s suspenzijo virusa CVS in izberemo protitelesa, ki nevtralizirajo omenjeno suspenzijo.
Protitelesa, ki nevtralizirajo virus, pomenijo protitelesa, ki, če jih spravimo v stik s suspenzijo omenjenega virusa, inhibirajo njegovo virulenco.
Nevtralizacijsko sposobnost zgoraj dobljenih monoklonskih protiteles določimo z običajnim postopkom, ki je strokovnjaku dobro znan. Ta postopek obstoji v tem, da spravimo 100 μΐ suspenzije virusa, ki vsebuje 1000 PFU virusa, v stik s 100 μΐ supernatanta kulture hibridoma, okužimo celično kulturo s to zmesjo in po 4 dneh inkubacije preštejemo lizne plake pod agarjem po metodi, ki so jo opisali BUSSEREAU et al., 1982, J. Virol. Meth., vol. 4, str. 277-282. Protitelo je nevtralizirajoče, če inhibira pod zgoraj opisanimi pogoji tvorbo vseh plakov pod agarjem.
Nato izberemo od teh protiteles tista, ki ne nevtralizirajo nevirulentnega mutanta TAG1, izvedenega iz seva CVS, deponiranega v Collection Nationale de Cultures de
Micro-organismes (C.N.C.M.) INSTITUT PASTEUR - FRANCE 12. aprila 1985 pod štev. 1-433.
Dobljena monoklonska protitelesa, ki zato nevtralizirajo sev CVS, vendar ne nevtralizirajo nevirulentnega mutanta TAG1, omogočajo, da izberemo nevirulentne mutante iz kateregakoli seva virusa stekline, ki ga nevtralizirajo ta monoklonska protitelesa.
Tako dobljena monoklonska protitelesa so protitelesa, ki nevtralizirajo tudi seve SAD virusa stekline, in so zato primerna za izvedbo prvega izbiranja po postopku v smislu izuma.
Določitev sekvence področja 333 glikoproteina mutantov, izbranih v stopnji 1), izvedemo po običajni metodi, ki je strokovnjaku dobro znana [SANGER et al., 1977, Proč. Nat. Acad. Sci. USA, vol. 74, str. 5463-5467].
Ta določitev sekvence omogoča, da izoliramo mutant, ki ima v legi 333 glikoproteina lizin. Ta mutant označujemo v nadaljevanju kot mutant SK.
Kodon (AAA) te amino kisline (lizina) se razlikuje od kodona arginina v legi 333 seva SAD po enem samem nukleotidu, pri čemer je kodon arginina v legi 333 seva SAD AGA.
Nato pripravimo monoklonsko protitelo, ki nevtralizira tako sev SAD kot tudi zgoraj dobljeni mutant.
To monoklonsko protitelo dobimo tako, da izberemo med monoklonskimi protitelesi, ki nevtralizirajo sev SAD in ne nevtralizirajo TAG1, tisto monoklonsko protitelo, ki nevtralizira tudi lizinski mutant ali zgoraj dobljeni mutant SK.
To monoklonsko protitelo omogoča nato, da izvedemo drugo izbiranje (stopnja 4) po postopku v smislu izuma.
Patogenost mutantov, ki nastanejo kot posledica tega drugega izbiranja, testiramo nato z intracerebralno injekcijo 105 PFU odraslim mišim. Mutante, ki ne usmrtijo pri tej dozi in pri tem načinu injiciranja, smatramo kot nevirulentne.
Mutanti v smislu izuma so dvojni nevirulentni mutanti seva SAD, kot zlasti seva SAD Beme, ki nastanejo kot posledica dveh zaporendih izbiranj s pomočjo zgoraj definiranih monoklonskih protiteles.
Mutanti v skladu z izumom lahko vsebujejo tudi druge mutacije, npr. mutacijo, ki podeli odpornost proti monoklonskemu protitelesu, ki je specifično za antigensko mesto II, kar omogoči, da prepoznamo morebitnega revertanta virulence sevov SAD, ki se uporabljajo za oralno cepljenje lisic.
Mutante v smislu izuma lahko razmnožujemo na celicah ledvic hrčkovih mladičev BHK 21 v prisotnosti GEM (minimalno osnovno gojišče, modificirano po Glasgowu, ki ga prodaja FLOW) in 2% telečjega seruma, pri 33°C in vlažni atmosferi, ki vsebuje 5% CO2.
Titriramo jih po običajnih metodah, npr. z določitvijo 50%-ne letalne doze (LD50) pri miškah, z imunofluorescenco ali s štetjem liznih plakov pod agarjem. Hranimo jih lahko pri -70°C.
Analiza sekvence nukleotida glikoproteina teh mutantov je pokazala, da se kodon amino kisline v legi 333 razlikuje od vseh možnih kodonov arginina po vsaj dveh nukleotidih. Od mutantov, ki izpolnjujejo ta pogoj, je prav posebno prednosten mutant, ki ima v legi 333 glutaminsko kislino, ker se dobro razmnožuje v celični kulturi, ker je manj patogen za novorojene miške in ker ima dobro zaščitno sposobnost.
Dvojni mutant, ki nosi glutaminsko kislino, katere kodon je GAA, namesto arginina v legi 333, dobljen po zgornjem postopku iz seva SAD Beme in v nadaljevanju označen kot SAG2, je bil deponiran v Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (C.N.C.M.) INSTITUT PASTEUR - FRANCE 9. julija 1992 pod štev. 1-1238. Ta mutant vsebuje še drugo mutacijo, namreč odpornost proti monoklonskemu protitelesu, kije specifično za antigensko mesto II, kar rabi kot dodatni marker seva.
Izum bomo sedaj podrobneje razložili glede na mutant SAG2, vendar ne da bi s tem omejevali obseg izuma le na ta mutant. ;
A - Testi genetske stabilosti seva med pasažami v možganih mišk
Šestim 4 dni starim miškam smo injicirali 103 PFU mutanta SAG2. Ko so živali zbolele (D6), smo jih žrtvovali. Izdelali smo šest posamičnih drobljenih preparatov; vsak drobljeni preparat smo titrirali in trem odraslim mišim (kontrola patogenosti) in eni miški (naslednja pasaža) injicirali 30 μΐ razredčine 1:10. Tako je 6 mladih mišk omogočilo, da smo izvedli 6 neodvisnih serij s po 3 pasažami.
Titri v možganih so podani v PFU/ml v sledeči tabeli:
| Serija | A | B | C | D | E | F |
| 1. pasaža | >5.107 | >5.107 | 107 | 106 | 106 | 106 |
| 2. pasaža | >5.107 | >2,5.107 | >5.107 | >5.107 | >5.107 | >5.107 |
| 3. pasaža | >5.107 | >5.107 | >5.107 | >5.107 | >5.107 | >5.107 |
Vse odrasle miši (t.j. 54 miši), ki smo jim dali injekcijo po 1., 2. ali 3. pasaži, so preživele, kar dokazuje odsotnost reverzije.
B - Zaščitna sposobnost mutanta SAG2
Mišim smo injicirali intracerebralno mutant SAG2 in zaščitno sposobnost tega mutanta določili z intramuskulamim testiranjem doze 100 LD50 seva CVS.
Dobljeni rezultati so prikazani na sliki 2, ki je diagram, ki podaja začitno sposobnost (%) na ordinati v odvisnosti od množine injiciranega mutanta, izražene v PfU/miš (log). Isti test smo ponovili z mutantom SK, ki ima v legi 333 lizin.
Ugotovili smo, da je bila zaščitna sposobnost mutanta SK in mutanta SAG2 od 104 PFU/miš dalje 100%-na.
C - Patogenost mutanta SAG2 pri intracerebralnem dajanju
Mišim smo injicirali mutant SAG2 v dozah od ΙΟ0,5 do 106 PFU/miš in v teku 28 dni t
nismo ugotovili smrtnosti.
Vzporedno smo izvedli isti poskus z virusom SAD BERNE ali mutantom SK.
Rezultati so prikazani na sliki 3, ki je diagram, ki podaja % smrtnosti (na ordinati) v odvisnosti od množine injiciranega mutanta na miš (na abscisi).
Ugotovili smo, da mutant SAG2 ne povzroči smrtnosti, medtem ko ima mutant SK šibko rezidualno patogeno moč.
D - Patogenost mutanta SAG2 pri intramuskulamem dajanju
Gornji test smo ponovili, vendar z intramuskulamim dajanjem. Dobljeni rezultati so prikazani na sliki 4, ki podaja % smrtnosti (na ordinati) v odvisnosti od dane doze v PFU/miš (na abscisi).
Vidimo, da SAG2 in mutant SK ne povzročata smrtnosti.
Mutante v smislu izuma lahko dajemo kot živo cepivo po kateremkoli načinu dajanja, ki se običajno uporablja za cepljenje, in zlasti z intramuskulamim ali oralnim dajanjem. Mutante s pridom razredčimo v inertnem, farmacevtsko sprejemljivem nosilcu, kot fiziološki raztopini.
Claims (4)
- PATENTNI ZAHTEVKI1. Nevirulentno cepivo proti steklini, označeno s tem, da sestoji iz nevirulentnega mutanta seva SAD virusa stekline, katerega glikoprotein ima v legi 333 naravno amino kislino, katere kodon se razlikuje od kodonov arginina po vsaj dveh nukleotidih.2. Cepivo po zahtevku 1, označeno s tem, da je amino kislina v legi 333 glutaminska kislina.3. Cepivo po zahtevku 1 in 2, označeno s tem, da je mutant mutant seva SAD Beme.4. Cepivo po kateremkoli od zahtevkov 1 do 3, označeno s tem, da je mutant mutant, deponiran v Collection Nationale de Cultures de Micro - organismes - INSTITUT PASTEUR (C.N.C.M.) - FRANCE 9. julija 1992 pod štev. 1-1238.5. Dvojni nevirulentni mutant seva SAD virusa stekline, označen s tem, da ima njegov glikoprotein v legi 333 naravno amino kislino, katere kodon se razlikuje od kodonov arginina po dveh nukleotidih.6. Dvojni nevirulentni mutant po zahtevku 5, označen s tem, da je amino kislina v legi 333 glutaminska kislina.7. Dvojni nevirulentni mutant po enem od zahtevkov 5 ali 6, označen s tem, da je mutant seva SAD Berne.8. Dvojni nevirulentni mutant seva SAD Berne, deponiran v Collection Nationale de Cultures de Micro - organismes (C.N.C.M.) INSTITUT PASTEUR FRANCE 9. julija 1992 pod štev. 1-1238.9. Postopek za pridobivanje dvojnih mutantov po kateremkoli od zahtevkov 5 do 8, označen s tem, da1) izberemo iz seva SAD virusa stekline tiste mutante, ki jih ne nevtralizira monoklonsko protitelo, ki nevtralizira omenjeni sev SAD, ki pa ne nevtralizira seva TAG1;
- 2) izoliramo z določitvijo sekvenc področja 333 glikoproteina mutantov, izbranih v stopnji 1), mutant, ki ima lizin v legi 333;
- 3) pripravimo monoklonsko protitelo, ki nevtralizira tako omenjeni sev SAD kot tudi mutant, dobljen v stopnji 2), ki pa ne nevtralizira seva TAG1; in
- 4) izvedemo drugo izbiranje izmed mutantov, dobljenih v stopnji 1), s pomočjo monoklonskega protitelesa, pripravljenega v stopnji 3).
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9208947A FR2693655B1 (fr) | 1992-07-20 | 1992-07-20 | Vaccin antirabique avirulent. |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SI9300392A true SI9300392A (en) | 1994-06-30 |
Family
ID=9432070
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SI9300392A SI9300392A (en) | 1992-07-20 | 1993-07-20 | Avirulent anti-rabies vaccine |
Country Status (20)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5853735A (sl) |
| EP (1) | EP0583998B1 (sl) |
| AT (1) | ATE175877T1 (sl) |
| BG (1) | BG61066B1 (sl) |
| BR (1) | BR9302910A (sl) |
| CA (1) | CA2100591C (sl) |
| CZ (1) | CZ283400B6 (sl) |
| DE (1) | DE69323130T2 (sl) |
| FI (1) | FI933210A (sl) |
| FR (1) | FR2693655B1 (sl) |
| HR (1) | HRP931065B1 (sl) |
| HU (1) | HU219266B (sl) |
| MA (1) | MA22938A1 (sl) |
| MX (1) | MX9304349A (sl) |
| PL (1) | PL172853B1 (sl) |
| RO (1) | RO112582B1 (sl) |
| RU (1) | RU2128519C1 (sl) |
| SI (1) | SI9300392A (sl) |
| SK (1) | SK280104B6 (sl) |
| TN (1) | TNSN93083A1 (sl) |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1131414B1 (en) * | 1998-11-27 | 2007-03-07 | Intervet International BV | Stable, attenuated rabies virus mutants and live vaccines thereof |
| RU2211837C2 (ru) | 1999-06-03 | 2003-09-10 | Ниппон Суйсан Кайся, Лтд. | Трехъядерные конденсированные гетероциклические соединения, способ их получения (варианты) и фармацевтическая композиция |
| WO2001070932A2 (en) | 2000-03-23 | 2001-09-27 | Thomas Jefferson University | Genetically engineered rabies recombinant vaccine for immunization of stray dogs and wildlife |
| US6706523B2 (en) * | 2001-07-20 | 2004-03-16 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Attenuated rabies virus with nucleoprotein mutation at the phosphorylation site for vaccination against rabies and gene therapy in the CNS |
| ATE307606T1 (de) * | 2001-10-04 | 2005-11-15 | Ct Voor Onderzoek In Diergenee | Abgeschwächter mutantenstamm eines virus der newcastle-krankheit für eine in ovo impfung und dessen benutzung |
| WO2003030933A1 (en) * | 2001-10-10 | 2003-04-17 | Thomas Jefferson University | Recombinant rabies vaccine and methods of preparation and use |
| EP1415665A3 (en) * | 2002-11-01 | 2004-06-30 | ID-Lelystad, Instituut voor Dierhouderij en Diergezondheid B.V. | BHV5 mutants |
| EP1768697B1 (en) | 2004-07-12 | 2010-06-02 | Thomas Jefferson University | Recombinant rabies virus compositions |
| WO2007047459A1 (en) | 2005-10-14 | 2007-04-26 | The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, Centers For Disease Control And Prevention | Rabies virus vector systems and compositions and methods thereof |
| FR2944292B1 (fr) | 2009-04-08 | 2013-08-23 | Sanofi Pasteur | Procede de purification du virus rabique |
| RU2694836C1 (ru) * | 2018-12-14 | 2019-07-17 | федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности" (ФГБНУ "ФЦТРБ-ВНИВИ") | Способ получения антигена вируса бешенства для серологической диагностики |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2580176B1 (fr) * | 1985-04-12 | 1988-02-26 | Centre Nat Rech Scient | Vaccin antirabique avirulent |
| FR2633832B1 (fr) * | 1988-07-05 | 1991-05-31 | Virbac | Vaccin antirabique avirulent |
-
1992
- 1992-07-20 FR FR9208947A patent/FR2693655B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
1993
- 1993-07-14 CZ CZ931402A patent/CZ283400B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1993-07-14 FI FI933210A patent/FI933210A/fi not_active Application Discontinuation
- 1993-07-16 AT AT93401843T patent/ATE175877T1/de active
- 1993-07-16 DE DE69323130T patent/DE69323130T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1993-07-16 BG BG97964A patent/BG61066B1/bg unknown
- 1993-07-16 EP EP93401843A patent/EP0583998B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1993-07-19 HR HR9208947A patent/HRP931065B1/xx not_active IP Right Cessation
- 1993-07-19 MA MA23238A patent/MA22938A1/fr unknown
- 1993-07-19 BR BR939302910A patent/BR9302910A/pt not_active Application Discontinuation
- 1993-07-19 SK SK761-93A patent/SK280104B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1993-07-19 RU RU93048174A patent/RU2128519C1/ru not_active IP Right Cessation
- 1993-07-19 MX MX9304349A patent/MX9304349A/es unknown
- 1993-07-20 PL PL93299739A patent/PL172853B1/pl unknown
- 1993-07-20 SI SI9300392A patent/SI9300392A/sl not_active IP Right Cessation
- 1993-07-20 CA CA002100591A patent/CA2100591C/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-07-20 HU HU9302091A patent/HU219266B/hu unknown
- 1993-07-20 RO RO93-01010A patent/RO112582B1/ro unknown
- 1993-07-20 TN TNTNSN93083A patent/TNSN93083A1/fr unknown
-
1997
- 1997-01-17 US US08/785,616 patent/US5853735A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| HRP931065A2 (en) | 1995-02-28 |
| EP0583998B1 (fr) | 1999-01-20 |
| FR2693655A1 (fr) | 1994-01-21 |
| FI933210A (fi) | 1994-01-21 |
| SK280104B6 (sk) | 1999-08-06 |
| CZ140293A3 (en) | 1994-02-16 |
| HU9302091D0 (en) | 1993-11-29 |
| BG97964A (bg) | 1994-04-29 |
| DE69323130T2 (de) | 1999-06-17 |
| SK76193A3 (en) | 1994-06-08 |
| HU219266B (en) | 2001-03-28 |
| RU2128519C1 (ru) | 1999-04-10 |
| CA2100591A1 (en) | 1994-01-21 |
| DE69323130D1 (de) | 1999-03-04 |
| PL299739A1 (en) | 1994-01-24 |
| CZ283400B6 (cs) | 1998-04-15 |
| TNSN93083A1 (fr) | 1994-03-17 |
| EP0583998A1 (fr) | 1994-02-23 |
| CA2100591C (en) | 2003-02-18 |
| BG61066B1 (bg) | 1996-10-31 |
| FR2693655B1 (fr) | 1994-10-14 |
| BR9302910A (pt) | 1994-02-16 |
| PL172853B1 (pl) | 1997-12-31 |
| MX9304349A (es) | 1994-06-30 |
| HRP931065B1 (en) | 1999-12-31 |
| US5853735A (en) | 1998-12-29 |
| HUT69961A (en) | 1995-09-28 |
| MA22938A1 (fr) | 1994-04-01 |
| FI933210A0 (fi) | 1993-07-14 |
| ATE175877T1 (de) | 1999-02-15 |
| RO112582B1 (ro) | 1997-11-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Morimoto et al. | Genetic engineering of live rabies vaccines | |
| Mebatsion | Extensive attenuation of rabies virus by simultaneously modifying the dynein light chain binding site in the P protein and replacing Arg333 in the G protein | |
| Lafay et al. | Vaccination against rabies: construction and characterization of SAG2, a double avirulent derivative of SADBern | |
| US4810634A (en) | Pseudorabies virus mutants incapable of producing glycoprotein X | |
| US4554159A (en) | Vaccine and method of immunizing against herpes simplex virus (types 1 and 2) | |
| Marshall et al. | Monoclonal antibody analysis of bovine herpesvirus-1 glycoprotein antigenic areas relevant to natural infection | |
| Finberg et al. | Host immune response to reovirus: CTL recognize the major neutralization domain of the viral hemagglutinin. | |
| Schumacher et al. | SAG-2 oral rabies vaccine | |
| SI9300392A (en) | Avirulent anti-rabies vaccine | |
| Mettenleiter et al. | Characterization of a quadruple glycoprotein-deleted pseudorabies virus mutant for use as a biologically safe live virus vaccine | |
| Le Blois et al. | Oral immunization of foxes with avirulent rabies virus mutants | |
| EP0402029B1 (en) | Monoclonal antibodies for post exposure treatment of rabies | |
| Lafon et al. | Human monoclonal antibodies specific for the rabies virus glycoprotein and N protein | |
| Flamand et al. | Avirulent mutants of rabies virus and their use as live vaccine | |
| Montaño-Hirose et al. | Protective activity of a murine monoclonal antibody against European bat lyssavirus 1 (EBL1) infection in mice | |
| DK170393B1 (da) | Avirulent rabies-vaccine samt avirulent mutant af stammen SAD Berne | |
| EP0621790A1 (en) | Attenuated, live vaccine for delaware strain ibdv | |
| US5275934A (en) | Method of detecting viral infection in vaccinated animals | |
| US5128128A (en) | Virus vaccine | |
| EP0263207B1 (en) | Virus vaccine | |
| Neutralizing | Novel Human Monoclonal Antibody | |
| YAMAMOTO et al. | NEW TYPE OF HERPES SIMPLEX VIRUS PRODUCED BY INTERTYPIC CROSS I. ANTIGENIC PROPERTIES | |
| Kit | Significance of Virulence Factors and Immuno-Evasion for the Design of Gene-Deleted Herpesvirus Marker Vaccines | |
| Crawford-Miksza | The Evolution of the AIDS-associated Adenoviruses |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| IF | Valid on the event date | ||
| KO00 | Lapse of patent |
Effective date: 20060410 |