RO112582B1

RO112582B1 - Dublu mutant avirulent al unei suse sad a virusului rabic, procedeu de obtinere si vaccin

Info

Publication number: RO112582B1
Application number: RO93-01010A
Authority: RO
Inventors: Jacqueline Benejean; Anne Flamand; Marie Christine Tuffereau; Patrice Coulon; Florence Lafay
Original assignee: Virbac
Priority date: 1992-07-20
Filing date: 1993-07-20
Publication date: 1997-11-28
Also published as: MA22938A1; FR2693655A1; CZ283400B6; FR2693655B1; RU2128519C1; BG97964A; CA2100591A1; CZ140293A3; HU9302091D0; BR9302910A; FI933210L; TNSN93083A1; MX9304349A; US5853735A; PL299739A1; BG61066B1; PL172853B1; DE69323130D1; DE69323130T2; EP0583998B1

Description

Prezenta invenție se referă la un dublu mutant avirulent al unei sușe SAD a virusului rabic, procedeu de obținere și vaccin.

Virusul rabic este un rabdovirus constituit din cinci proteine, din care o proteină externă, glicoproteina care declanșează sinteza anticorpilor neutralizanți la animalele inoculate. Injectarea glicoproteinei purificate protejează animalul contra unei suprainfecții. Sușele virusului rabic cele mai utilizate, mai ales sușa CVS, de la care derivă sușele SAD, ca și sușele SAD Berne și SAD B19. Secvența de aminoacid a glicoproteinei sușei CVS a fost descrisă în literatura de specialitate. Această glicoproteina comportă două poziții antigenice majore distincte legate de neutralizarea virusului (situsurile II și III). Situsul III în poziția 33O-34D conține arginină 333 care determină virulența acestei sușe. Secvența de aminoacid a glicoproteinei sușei SAD Berne n-a fost stabilită în întregime. Totuși, s-a putut determina faptul că situsul antigenic II al glicoproteinei sușei SAD Berne este identic cu cel al glicoproteinei CVS.

Vaccinurile antirabice folosite la ora actuală sunt fie vaccinuri fabricate pornind de la viruși inactivați, fie vaccinuri constituite din sușe virale a căror virulență a fost atenuată, fie viruși recombinați (de exemplu vaccina).

Inactivarea virușilor poate fi realizată prin diferite procedee, mai ales prin procedee chimice cum ar fi tratamentul cu B-propiolactona.

Inconvenientul major al acestui procedeu de fabricație al vaccinurilor este manipularea sușelor virulente care necesită condiții de lucru foarte stricte și prezintă riscuri de contaminare a personalului. Pe de altă parte vbaccinurile inactivate care sunt administrate pe cale orală nu au putere de protecție.

Atenuarea virulenței sușelor virale este o tehnică bine cunoscută; ea poate fi realizată de exemplu, prin treceri succesive a sușelor virale la o gazdă diferită de spațiul vector (de exemplu iepure sau șoarece) sau în cultură de celule. Se obțin, astfel, sușe care nu mai sunt adaptate, de la gazda de origine, și deci mai puțin patogene, dar care își păstrează totuși capacitatea de vaccin.

Sușele SAD, ca și sușele SAD B19 și SAD Berne care sunt accesibile publicului, sunt sușe atenuate care au fost deja testate pentru vaccinarea vulpilor. Ele pot fi amestecate cu momeli pentru a fi adminsitrate pe cale orală. Totuși, s-a demonstrat că aceste sușe ar fi patogene pentru alte specii de animale și pentru om. Există deci un risc potențial de contaminare care diminuează considerabil interesul acestor sușe pentru vaccinarea orală.

într-adevăr, de exemplu, administrarea pe cale orală a sușei SAD Berne unui lot de 23 de rozătoare sălbatice alese dintre Apodemus favicolus, Apodemus sxlvaticus, Arvicola teiristris, Clethrionomys calreolus, Minotus agresti a provocat moarte prin turbare la două animale.

încercările pe șoarece au demonstrat, de asemenea, că sușa SAD Berne este patogenă pentru această specie atât pe cale intracerebrală cât și pe cale intramusculară, după cum arată curbele din figurile din prezenta invenție.

Pe cale orală, s-a observat la șoareci o mortalitate de 10 % la doza de 10⁵'⁵UFP.

Sușa SAD Berne ca atare, utilizată pentru campanii de vaccinare a vulpilor, prezintă deci un risc pentru fauna sălbatică și pentru om. La fel se întâmplă și cu sușa SADB19.

Pentru a înlătura acest incovenient, s-a propus un vaccin antirabic avirulent. Acest vaccin este constituit dintr-un mutant avirulent al sușei SAD a virusului turbării care este caracterizat prin faptul că posedă în locul argininei 333 a glicoproteinei un alt aminoacid decât lizina, de exemplu glicină, izoleucină sau serină. Acest mutant derivează prin schimbarea unei singure nucleotide în codonul argininei 333. Totuși, acest vaccin care este utilizat pentru administrare pe cale orală, nu este totuși fără pericol pentru celelalte specii de animale.

Dublu mutant al unei sușe SAD a virusului rabic, conform invenției, are caracteristica că glicoproteina posedă în

RO 112582 Bl poziția 333 un aminoacid natural al cărui codon diferă de cel al argininei prin două nucleotide. Aminoacidul din poziția 333 este acidul glutamic. Dublul mutant este un mutant al sușei SAD Berne și este depus în Colecția Națională de Culturi de Microorganisme (CNCM) a Institutului Pasteur - Franța, sub nr. 1-1238 din 9 iulie 1992. Procedeul de obținere a dublului mutant, în conformitate cu prezenta invenție, cuprinde următoarele etape: selecționarea, plecând de la sușa SAD a virusului rabic, a mutanților care nu sunt neutralizați de un anticorp monoclonal care neutralizează sușa SAD dar nu neutralizează sușa TAGI; izolarea, prin secventarea regiunii 333 a glicoproteinei mutanților obținuți în prima etapă, a unui mutant ce posedă în poziția 333 o lizină; prepararea unui anticorp monoclonal care neutralizează în același timp sușa SAD și mutantul obținut^în a 2-a etapă, dar nu neutralizează Sușa TAGI; efectuarea unei a doua selecții printre mutanții obținuți în prima etapă, cu ajutorul anticorpului monoclonal preparat în a 3-a etapă.

Vaccinul antirabic avirulent este constituit dintr-un dublu mutant al unei sușe SAD a virusului rabic, în conformitate cu cele arătate mai sus, în amestec cu un purtător acceptabil din punct de vedere farmaceutic.

Invenția prezintă avantajul că noul mutant, precum și vaccinul, nu prezintă risc pentru fauna sălbatică și pentru om.

Se dau, în continuare, trei exemple de realizare a invenției în legătură cu figura care reprezintă: a) curba mortalității la șoareci adulți, în funcție de dozele administrate (în unități formând plaja) pe cale intracelebrală; ²i b) Curba mortalității la șoareci adulți, în funcție de dozele administrate (în unități formând plaja) pe cale intramusculară.

Exemplul 1. Dublul mutant avirulent al sușei SAD a virusului rabic posedă în locul argininei 333 a glicoproteinei, un aminoacid al cărui codon diferă de cel al arigininei prin două nucleotide.

Exemplul 2. Procedeu de obținere a mutandului avirulent al sușei SAD al virusului rabic, cuprinde următoarele faze:

1) selecționarea, pornind de la o sușă SAD a virusului rabic, a mutanților care nu sunt neutralizați de un anticorp monoclonal care neutralizează sușa SAD, dar nu neutralizează sușa TAGI definită mai jos;

2) izolarea, prin secvențare a reginunii 333 a glicoproteinei mutanților selecționați în etapa 1), un mutant care posedă în poziția 333 o lizină;

3) prepararea unui anticorp monoclonal care neutralizează în acelșași timp sușa SAD și mutantul obținut în etapa

2) , dar nu neutralizează sușa TACI;

4) are loc o a doua selecție a mutanților obținuțftn etapa 1) cu ajutorul anticorpului monoclonal preparat în etapa

3) .

Exemplul 3. Vaccinul este constituit din mutantul avirulent al sușei SAD a virusului rabic, care posedă în locul argininei 333 a glicoproteinei, un aminoacid natural al cărui codon diferă de cei care codifică pentru ariginină prin două nucleotide.

Anticorpii monoclonali folosiți pentru selecționarea mutanților, conform cu prezenta invenție, sunt obținuți prin fuziunea celulelor de mielom și a celulelor care produc anticorpi antivirali conform tehnicii de hibridare care este binecunoscută specialiștilor în domeniu. Conform cu această tehnică, pot fi fuzionate celule care provin de la specii diferite, totuși este avantajos de folosit celule care provin de la aceeași specie de animale. De exemplu se folosesc de preferință, pe de o parte celule de mielom de șoarece și pe de altă parte celule de splină de șoarece, imunizate în prealabil cu o sușă a virusului turbării, în conformitate cu procedeul care este redat mai jos.

Sub aspectul său general, acest procedeu de hibridare descris, cu referință la celulele de șoarece, cuprinde următoarele etape:

1) imunizarea șoarecelui cu o cantitate dată de virus inactivat cu Bpropiolactonă;

2) prelevarea splinei șoarecilor imunizați și separarea splenocitelor;

RO 112582 Bl

3) fuziunea splenocitelor astfel obținute cu celule de mielom de șoarece în prezența unui promotor de fuziune;

4) cultura celulelor hibride obținute într-un mediu selectiv pe care nu se dezvoltă celulele de mielom nefuzionate, și în prezența de elemente adecvate;

5) selectarea celulelor care produc anticorpul dorit și clonajul acestor celule.

Protocolul imunizării cuprinde injectarea șoarecilor Balb-C cu 100 g de virus CV5 inactivat cu B-propiolactonă pe cale intraperitoneală, cu adjuvant complet FREUND, și un rapel pe cale intravenoasă 4 zile înainte de fuziune, după o perioadă de repaos de o lună.Splenocitele șoarecilor imunizați sunt recuperate după prelevarea splinei, după metoda operatorie clasică. Celulele de mielom ale șoarecilor folosiți pentru obținerea anticorpilor monoclonali neutralizați sunt celulele de mielom a șoarecelui Balb-C care provine din SP₂0. S-au selecționat acele celule de mielom, pentru sensibilitatea lor la aminopterină și cultivate într-un mediu propice, cum ar fi mediul esențial Eagle modificat, care este denumit mai jos DMEM, la care s-a adăugat 15 % ser de vițel.

Fuziunea celulelor de mielom cu splenocitele, s-a realizat prin amestecarea a 5 x 1d⁷ celule de mielom cu 5x10⁷celule de splină de șoareci imunizați, în prezența unui producător de fuziune cum ar fi de exemplu polietilenglicol. După incubare la temperatura de 37°C, celulele se spală în mediu DMEM și sunt aduse în suspensie, apoi cultivate într-un mediu selectiv propice numnai creșterii de celule hibride. Un astfel de mediu conține hipoxantină, aminopterină și timidină. Se colecționează apoi supernatantele de cultură, 7 până la 20 de zile după fuzionare, și se pun în contact aceste supernatante cu o suspensie de virus CV5 și se rețin anticorpii care neutralizează suspensia respectivă.

Prin “anticorpii care neutralizează un virus” se înțeleg acei anticorpi care, în prezența unei suspensii a virusului, înhibă virulența acestuia.

Puterea neutralizantă a anticorpilor monoclonali obținuți ca mai sus, se determină conform unui procedeu care este binecunoscut specialiștilor în domeniu. Acest procedeu constă în punerea în contact a 100 ul se suspensie de virus ce conține 1000 UFP de virus și 100 ul supernatant de cultură de hibridon, în infectarea unei culturi de celule cu acest amestec, și după 4 zile de incubare, determinarea plajelor de lizare sub agrar, conform metodelor cunoscute în literatura de specialitate. Anticorpul este neutralizat dacă inhibă orice formare de palja sub agar, în condițiile descrise mai sus. Printre acești anticorpi se mai rețin și anticorpii care nu neutralizează mutantul avirulent TAGI care derivă din sușa CVS, depusă în Colecția Națională de Culturi de Microorganisme a Institutului Pasteur - Franța, sub nr. I-433 la data de 12 aprilie 1985.

Anticorpii monoclonali rezultați, care neutralizează deci sușa CVS, nu neutralizează mutantul avirulent TAGI, și permit selecționarea fnutanților avirulenți placând de la orice sușă a virusului turbării, care este neutralizată de acești anticorpi monoclonali.

Anticorpii monoclonali, astfel obținuți, sunt anticorpi care neutralizează în mod egal sușele SAD ale virusului rabic. Nu sunt convenabili pentru efectuarea primei selecții a procedeului din prezenta invenție.

Secvențarea regiunii 333 a glicoproteinei mutanților selecționați în etapa 1) se realizează conform metodei clasice, care este binecunoscută specialiștilor în domeniu. Această secvențare permite izolarea unui mutant care posedă în poziția 333 a glicoproteinei o lizină. Acest mutant este denumit, mai jos, “mutant SK”.

Codonul (AAA) al acestui aminoacid (lizină) diferă de cel al argininei în poziția 333 a sușei SAD printr-o singură nucleotidă; codonul argininei în poziția 333 a sușei SAD fiind AGA. Se procedează, apoi, la prepararea anticorpului monoclonal care neutralizează în același timp sușa SAD și mutantul obținut mai sus. Acest anticorp monoclonal se obține reținând dintre anticorpii monoclonali care neutralizează sușa SAD și nu neutralizează sușa TAGI,

RO 112582 Bl pe cel care neutralizează în aceași măsură mutantul lizină sau mutantul SK obținut mai sus.

Acest anticorp monoclonal permite apoi să se procedeze la o a doua selecție 5 (etapa 4] a procedeului din prezenta invenție. Puterea patogenă a mutanților care rezultă din această a doua selecție este apoi etstată prin injectarea intracelebrală la 10⁵ UFP la șoareci adulți. 10 Mutanții care nu omoară la această doză, și pe această cale de injectare, sunt considerați avirulenți.

Mutanții, conform invenției, sunt dublu mutanți avirulenți ai unei sușe SAD, 15 cum ar fi în special sușa SAD Berne, care rezultă din două selecții succesive cu ajutorul anticorpilor monoclonali obținuți mai sus.

Mutanții, conform invenției, pot să 20 conțină alte mutații cum ar fi de exemplu o mutație care conferă rezistență unui anticorp monoclonal specific al situsului antigenic II, ceea ce permite recunoașterea unei eventuale revitalizări a virulenței 25 sușelor SAD utilizate pentru vaccinarea orală a vulpilor.

Mutanții, conform invenției, pot fi multiplicați pe celule de rinichi de hamsteri nou-născuți BHK 21, în prezența de mediu 30 GEM (mediu esențial de modificare minimă) și de 2 % ser de vițel, la temperatura de 33°C și în atmosferă umedă cu 5 % C0₂.

Ei se utilizează conform metodelor obișnuite, de exemplu prin determinarea 35 dozei letale 50 (DL₅₀) la șoareci, prin imunofluorescență sau detrminarea plajelor de liză sub agar. Pot fi conservate la -70°C.

Analiza secvenței în nucleotide a glicoproteinei acestor mutanți a relevat 40 faptul că, codonul aminoacidului în poziția

333 diferă prin cel puțin două nucleotide de toți codonii posibili ai argininei. Printre mutanții care îndeplinesc această condiție, este preferat în mod deosebit mutantul care posedă în poziția 333 un acid glutamic, căci el se multiplică bine în cultura celulelor, este mai puțin patogen pentru șoarecii nou-născuți și are o bună putere protectoare. Dublul mutant care are acid glutamic în codon este GAA în locul argininei 333, obținut conform procedeului de mai sus și plecând de la sușa Berne și care este denumită mai jos SAG2, și care a fost depusă în Colecția Națională de Culturi de Microorganisme a Institutului Pasteur - Franța, sub nr. I1238 la data de 9 iulie 1992. Acest mutant conține o altă mutație, și anume rezistența la un anticorp monoclonal specific situsului antigenic II, ceea ce servește la marcarea adițională a sușei.

Invenția deci va fi descrisă mai detaliat, cu referință la mutantul SAG2, fără a se limita la acest unic mutant.

S-au efectuat teste cu mutantul SAG2, astfel:

A. Teste de stabilitate genetică a sușei în cursul trecerilor în creierii șoarecilor: 10³ UFP de SAG2 au fost injectați la 6 șoareci de 4 zile. Când animalele se îmbolnăvesc, acestea sunt sacrificate. Se efctuează șase probe individuale; fiecare probă a fost triată și, apoi, 30 ul a unei diluții de 1/10 au fost injectați la 3 șoareci adulți (control de patogenitate) și la un șoricel (trecerea următoare). Cei șase șoareci au dat astfel posibilitatea să facă 6 serii independente de câte trei treceri.

Titrările creierilor în UFP/ml sunt date în tabelul care urmează.

Serii	A	B	C	D	E	F
Prima trecere	>5X10⁷	1,5X10⁷	10⁷	10⁶	10⁶	10⁶
A doua trecere	>5X1O⁷	2,5X10⁷	>5X1O⁷	>5X10⁷	>5X10⁷	>5X10⁷
A treia trecere	>5X10⁷	>5X1O⁷	>5X1O⁷	>5X1O⁷	>5X10⁷	>5X10⁷

RO 112582 Bl

Toți adulții injectați (54 șoareci) după prima, a doua și a treia trecere au supraviețuit arătând absența reversiei.

B. Puterea protectoare a SAG2: Mutantul SAG2 a fost injectat pe cale intracerebrală unor șoareci și a fost determinată puterea protectoare a acestui mutant prin proba intramusculară de 100 DL a sușei CVS.

Rezultatele obținute sunt raportate în figura 2 care este un grafic ce arată puterea protectoare (5) în ordonate, în funcție de cantitatea mutantului injectat și exprimat în UFP/șoarece (100 g). A fost repetat testul cu mutantul SK, care poseda în poziția 333 o lizină.

S-a constatat ca puterea protectoare a SK și a SAG2 este de 100 %, plecând de la 10⁴ UFP/șoarece.

C. Patogenia lui SAG2 pe cale intracelulară: Mutantul SAG2 a fost injectat șoarecilor, în doze mergând de la 10^Ό'⁵la 10⁶ UFP/șoarece, și nu s-a constatat mortalitate timp de 28 zile. în paralel, s-a efectuat aceeași experineță cu virusul SAD Berne sau mutantul SK.

Rezultatele sunt raportate în figura 3, care este un grafic ce exprimă procentul de mortalitate (în ordonate) în funcție de cantitatea de mutant injectată pe șoarece (în abcise).

Se constată că mutantul SAG2 nu provoacă mortalitate în timp ce mutantul SK are o slabă putere patogenă reziduală.

D. Patogenia lui SAG2 pe cale intramusculară: se repetă testul de mai sus, dar pe cale intramusculară. Rezultatele obținute sunt raportate într-o figură 4 care dă procentul de mortalitate (în ordonate) în funcție de doza administrată în UFP/șoarece (în abcise).

Se observă că mutantul SAG2 și mutantul SK nu provoacă mortalitate.

Mutanții în conformitate cu prezenta invenție se administrează sub formă de vaccin viu, utilizând metode de administrare care sunt cunoscute pentru vaccinare. Se preferă calea intramusculară sau orală. Acești mutanți sunt diluați într-un vehicul inert care este acceptabil din punct de vedere farmaceutic, cum ar fi, de exemplu, serul fiziologic.

Claims

Revendicări

1. Dublu mutant avirulent al unei sușe SAD a virusului rabic, caracterizat prin aceea că glicoproteina posedă în poziția 333 un aminoacid natural al cărui codon diferă de cel al argininei prin două nucleotide.
2. Dublu mutant avirulent, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că aminoacidul din poziția 333 este acidul glutamic.
3. Dublu mutant avirulent, conform revendicărilor 1 sau 2, caracterizat prin aceea că este un mutant al sușei SAD Berne.
4. Dublu mutant avirulent, conform cu oricare dintre revendicările 1 - 3, caracterizat prin aceea că este dublu mutant al unei sușei SAD Berne depus în Colecția Națională de Culturi de Microorganisme (CNCM) a Institutului Pasteur Franța, sub nr. 1-1238 la data de 9 iulie 1992.
5. Procedeu pentru obținerea mutanților dubli, conform cu oricare dintre revendicările 1-4, caracterizat prin aceea că, cuprinde etapele:

- selecționarea, pornind de la o sușă SAD a virusului rabic, a mutanților care nu sunt neutralizați de un anticorp monoclonal care neutralizează sușa SAD, dar nu neutralizează sușa TAG I;

-izolarea, prin secventarea reginunii 333 a glicoproteinei mutanților selecționați în prima etapă, a unui mutant ce posedă în poziția 333 o lizină;

- prepararea unui anticorp monoclonal care neutralizează în același timp sușa SAD și mutantul obținut în etapa a doua, dar nu neutralizează sușa TAG I;

- efectuarea unei a doua selecții a mutanților obținuți în prima etapă, cu ajutorul anticorpului monoclonal preparat în etapa a 3-a.
6. Vaccin antirabic avirulent, caracterizat prin aceea că este constituit dintrun dublu muatnt avirulent a sușei SAD a virusului rabic, conform cu oricare dintre revendicările 1 - 4, în amestec cu un purtător acceptabil din punct de vedere farmaceutic.