BRPI0617373B1 - Composições e métodos do vírus da raiva - Google Patents

Abstract

COMPOSIÇÕES E MÉTODOS DO VÍRUS DA RAIVA. Composições e métodos do Vírus da Raiva são fornecidos. A seqüência completa da linhagem Evelyn-Rokitnicki-Abelseth (ERA) do Vírus da Raiva é revelada. Um sistema de genética reversa para a produção de vírus da ERA recombinante e seus derivados é fornecido, juntamente com composições que incluem vírus, ácidos nucléicos e/ou proteínas derivadas da linhagem ERA. Em alguns casos, as composições são composições imunogênicas úteis para os tratamentos à pré- ou à pós-exposição ao vírus da Raiva.

Description

Referência a Pedido(s) de Patente Relacionado(s)

[001] Este pedido de patente reivindica o benefício do Pedido de Patente Provisório No. US 60/727,038, depositado em 14 de outubro de 2005, o qual é aqui incorporado em sua totalidade como referência.

Declaração de Suporte Governamental

[002] Esta invenção foi feita pelos Centros para o Controle e a Prevenção de Doenças (Centers for Disease Control and Prevention), uma agência do Governo dos Estados Unidos. Em conseqüência, o Governo dos Estados Unidos possui certos direitos sobre a invenção.

Campo

[003] Esta divulgação se refere ao campo da virologia. Mais especificamente, esta divulgação se refere a composições e métodos que são úteis para a produção de composições imunogênicas, para proteger mamíferos da infecção por vírus rábicos.

Fundamentos da Divulgação

[004] A Raiva permanece sendo uma das doenças mais aterradoras, que afeta seres humanos e animais, apesar dos avanços científicos significativos em sua prevenção e em seu controle. A Raiva se apresenta como um problema distinto em diferentes partes do mundo. Nas Américas, existem reservatórios de raiva em muitas espécies animais, incluindo guaxinins, gambás, raposas e morcegos (Rupprecht e outros, Emerg. Infect. Dis. 1(4):107-114, 1995). Epidemias de infecções de raiva nesses mamíferos terrestres são descobertas em vastas regiões geográficas pelos Estados Unidos. Por exemplo, a raiva do guaxinim afeta uma região de mais de 1 milhão de quilômetros quadrados, da Flórida até Maine. Embora a raiva em espécies selvagens ainda exista em países desenvolvidos, fez-se progresso no controle e na eliminação da raiva em espécies selvagens, através do uso da imunização oral de animais selvagens.

[005] Ainda assim, a raiva permanece sendo uma grande ameaça à saúde pública, e persiste ocasionando entre 50.000 e 60.000 mortes humanas a cada ano (Organização Mundial da Saúde, Abril 2003). Os seres humanos tornam-se infectados com o vírus da raiva principalmente através de mordidas de animais rábicos, domésticos e selvagens. Nos países em desenvolvimento, os cães são responsáveis por aproximadamente 94% das mortes humanas por raiva. A raiva de cães ainda é epidêmica na maioria dos países da África, Ásia e América do Sul, e nesses países os cães são responsáveis pela maior parte das mortes pela doença. O controle da infecção do vírus da raiva em animais domésticos e selvagens, portanto, não apenas reduz a mortalidade nesses animais, mas também reduz o risco à exposição humana.

[006] O vírus da raiva é transmitido através de aberturas na pele por mordida ou arranhão de um animal infectado. A exposição ao vírus da raiva resulta em sua penetração em extremidades nervosas periféricas, sem mielina, seguida por seu espalhamento através de transporte axonal retrógrado, a replicação ocorrendo exclusivamente nos neurônios e, finalmente, a chegada no sistema nervoso central (SNC). A infecção do SNC causa disfunção celular e morte (Rupprecht & Dietzschold, Lab. Invest. 57:603, 1987). Como o vírus da raiva se propaga diretamente de uma célula a outra, ele praticamente contorna o reconhecimento imunológico (Clark & Prabhakar, Rabies, Em: Olson e outros, eds., Comparative Pathology of Viral Disease, 2:165, Boca Raton, FL, EUA, CRC Press, 1985).

[007] O vírus da raiva (VR) é um rabdovírus-um vírus de RNA não segmentado com polaridade de sentido negativo. Dentro da família dos rhabdovírus, o vírus da raiva é o protótipo do gênero Lyssavirus. O VR é composto de dois principais componentes estruturais: uma núcleocápsideo ou proteína-ribonucléica (PRN), e um envelope na forma de uma membrana de duas camadas que envolve o núcleo de PRN. O componente infeccioso de todos os rhabdovírus é o núcleo de PRN, o qual consiste no genoma de RNA de filamento negativo em encapsidação por nucleoproteína (N) em combinação com RNA-polimerase dependente-RNA (L) e fosfoproteína (P). A membrana que envolve a PRN contém duas proteínas: a glicoproteína trans-membrana (G) e a proteína matricial (M), localizadas no interior da membrana. Portanto, o genoma viral codifica estas cinco proteínas: as três proteínas da PRN (N, L e P), a proteína matricial (M) e a glicoproteína (G).

[008] Os determinantes moleculares de patogenia de várias linhagens do vírus da raiva não foram totalmente elucidados. A patogenia do VR foi atribuída a eventos multigênicos (Yamada e outros, Microbiol. Immunol. 50:25-32, 2006). Por exemplo, algumas posições no genoma do VR, se sofrerem mutação, afetam a transcrição ou a replicação viral, reduzindo a virulência. Mutações no resíduo serina 389 do local de fosforilação do gene N (Wu e outros, J. Virol. 76:4153-4161, 2002) ou na seqüência central GDN do motivo protéico (motif) C altamente conservado no gene L (Schnell e Conzelmann, Virol. 214:522-530, 1995) reduziram dramaticamente a transcrição e a replicação do VR.

[009] A proteína G, também referida como proteína de pico, está envolvida na ligação celular e na fusão de membrana do VR. A região de aminoácido nas posições 330 a 340 (referida como local antigênico III) da proteína G foi identificada como importante para a virulência de certas linhagens do VR. Diversos estudos sustentam o conceito de que a patogenia de linhagens fixas do VR é determinada pela presença de arginina ou lisina no resíduo de aminoácido 333 da glicoproteína (Dietzschold e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 70-74, 1983; Tuffereau e outros, Virol. 172: 206212, 1989).

[010] Este fenômeno parece ser aplicável ao menos aos vírus da raiva fixos tais como as linhagens CVS, ERA, PV, SAD-B19 e HEP-Flury (Anilionis e outros, Nature 294:275-278, 1981; Morimoto e outros, Virol. 173:465-477, 1989). Por exemplo, vírus de vacina da raiva possuindo um aminoácido diferente de Arg na posição 333 da glicoproteína como descrito, por exemplo, em WO 00/32755 (que descreve mutantes do VR nos quais todos os três nucleotídeos no códon da proteína G Arg333 são alterados em comparação com o vírus mãe, de maneira que a Arg na posição 333 seja substituída com outro aminoácido); na Patente Européia 350398 (que descreve um mutante do VR não-virulento SAG1 derivado da linhagem Bern SAD do VR, em que o Arg na posição 333 da glicoproteína é substituído por Ser); e no pedido de patente Europeu 583998 (que descreve um mutante do VR atenuado, SAG2, no qual o Arg na posição 333 na proteína G é substituído por Glu).

[011] Outras linhagens, tais como a linhagem RC-HL, possuem um resíduo de arginina na posição 333 da G, mas não causam infecção letal em camundongos adultos (Ido e outros, Microl. Immunol. 38:479-482, 1994; Ito e outros, J. Virol. 75:9121-9128, 2001). Desta forma, toda a G pode contribuir para a virulência do VR, embora os determinantes ou as regiões não tenham sido antes identificados. O gene da G codifica a única proteína que induz um anticorpo neutralizante viral. Ao menos três estados da glicoproteína do VR são conhecidos: o estado nativo (N) sendo o responsável pela ligação de receptores; um estado hidrofóbico ativo (A) necessário na etapa inicial no processo de fusão de membrana (Gaudin, J. Cell Biol. 150:601-612, 2000), e uma conformação inativa de fusão (I). O dobramento e a maturação corretos da G desempenham papéis importantes para o reconhecimento imunológico. As três posições glicosiladas potenciais no domínio da ERA G extracelular ocorrem nos resíduos de Asn37, Asn247 e Asn319 (Wojczyk e outros, Glycobiology. 8: 121-130, 1998), respectivamente. A não-glicosilação da G não só afeta a conformação, mas também inibe a apresentação da proteína na superfície celular. Portanto, a elucidação dos determinantes moleculares que fundamentam a patogenia do vírus da raiva apresenta um problema complexo.

Síntese da Divulgação

[012] A seqüência completa da linhagem de vírus que corresponde à vacina fixa de Evelyn-Rokitnicki-Abelseth (ERA) para o vírus da raiva é revelada aqui, juntamente com métodos para seqüenciar estas e outras linhagens de Lyssavirus.

[013] Um sistema de genética reversa para o vírus da raiva é também descrito, em particular utilizando a linhagem do vírus da raiva ERA como um exemplo. O uso de uma RNA polimerase de T7, contendo um sinal de localização nuclear (NLS) de oito aminoácidos na extremidade terminal N facilitou a recuperação do vírus. Além da linhagem do vírus da ERA mãe, diversos outros vírus derivados são descritos, incluindo ERA- (remoção da região psi), ERAverdel (gene de proteína fluorescente verde inserido na região psi), ERAverde2 (gene de proteína fluorescente verde inserido na região intergênica de fosfoproteína e proteína matriz), ERA2g (contendo uma cópia extra da glicoproteína na região psi), ERAg3 (com uma mutação no aminoácido 333 na glicoproteína), ERA2g3 (com uma cópia extra da glicoproteína alterada no aminoácido 333 na região psi), ERA-G (em que a glicoproteína foi removida), ERAgm (genes M e G trocados no genoma), e ERAgmg (duas cópias da G na construção rearranjada de ERAgm). A unidade de transcrição extra foi incorporada dentro do genoma do vírus da ERA para a expressão eficiente de Fases Abertas de Leitura (ORFs). Otimizando-se as condições de propagação, as quais são descritas aqui, os vírus resgatados atingem títulos que excedem 109 ffu/ml tanto em frascos de bioreatores como de tecido estacionário.

[014] É também revelada uma linhagem celular modificada que constitutivamente expressa a glicoproteína da ERA. A linhagem celular, denominada BSR-G, é útil para a produção de vírus da raiva recombinantes, incluindo os atenuados e/ou os deficientes em replicação.

[015] O acima exposto e outros objetivos, recursos e vantagens da invenção ficarão mais aparentes a partir da seguinte descrição detalhada.

Breve Descrição dos Desenhos

[016] Fig. 1A - Ilustração esquemática do plasmídeo de transcrição da ERA. Posições das enzimas de ácido ribonucléico (ribozimas) em cabeça- de-martelo e do genoma da ERA anti-genômico são indicadas graficamente. As posições relativas das proteínas N, P, M, G e L são mostradas em uma direção de 5’ para 3’.

[017] Fig. 1B - Diagrama esquemático de construção do plasmídeo pTMF de cDNA genômico do vírus da raiva de comprimento completo. Fragmentos F1, F2 de produtos de RT-PCR e locais de reconhecimento de enzima de restrição (Nhe1, Kpn1, Blp1, Pst1 e Not1) (não desenhado em escala). A barra à esquerda indica uma ribozima em cabeça de martelo RdRz e a barra à direita indica a ribozima do vírus delta da hepatite HDVRz. O símbolo ♦ indica que os locais Kpn1 ou Pst1 foram removidos, e a seta vertical f indica que os locais Nhe1 ou Not1 foram deixados intactos.

[018] Fig. 2 - Ilustração esquemática do mecanismo proposto de atuação autogênica da RNA polimerase do NLST7. O complexo de reagentes de transfecção de DNA é trazido para dentro de células por endocitose. A maior parte do DNA liberado dos lisossomos e endossomos é retida no citoplasma da célula. Uma quantidade limitada de plasmídeos são transfectadas para o núcleo: 1) através de um promotor imediato-prematuro de CMV, o gene do NLST7 é transcrito pela RNA polimerase celular II; 2) mRNA de NLST7 maduro é transportado do núcleo para o citoplasma para a síntese de RNA polimerase do NLST7; 3) a RNA polimerase do NLST7 recentemente sintetizada é trans-locada para o núcleo, enquanto que uma quantidade residual de NLST7 permanece no citoplasma; 4) a RNA polimerase do NLST7 inicia a transcrição através de um promotor de pT7. Por modificações pós-transcricionais, mRNA de NLST7 adicional é para a síntese de proteínas, desse modo aumentando a eficiência do resgate de vírus.

[019] Fig. 3 - Diagrama esquemático dos 10 genomas derivados de vírus da ERA. O tamanho de cada gene não é desenhado em escala. O símbolo “*” denota mutações da G no resíduo Aa333 e ¥ é a região Psi.

[020] Fig. 4A - Análise vírus da ERA-G recuperado em células transfectadas, espalhamento e crescimento em uma linha de células BHK-G. Em A, os focos virais de ERA-G foram restringidos mesmo depois de sete dias de pós-transfecção com plasmídeos para a recuperação de vírus. Em B, os vírus da ERA-G resgatados não se espalharam após passarem por células BSR normais. Somente células individuais foram manchadas por DFA. Em C, o vírus da ERA cresceu bem na linhagem celular BHK-G constitutiva.

[021] Fig. 4B - Análise de expressão da G em uma linhagem de células BHK-G. Por indicação indireta de mancha fluorescente, a G do vírus da raiva da ERA foi expresso no citoplasma em uma linhagem de células BHK-G estável.

[022] Fig. 4C - Análise de mRNA da G em células infectadas por vírus da ERA-G por Northern Blot com uma sonda de G. A segunda coluna mostra que o mRNA do gene da G foi detectado em células BHK-G infectadas por vírus da ERA-G, enquanto que no RNA genômico do vírus não foi detectado. A coluna 1 foi o controle do RNA total das células BHK- G infectadas por vírus da raiva da ERA-, onde tanto o mRNA da G quanto o RNA genômico viral foram detectados.

[023] Fig. 5 - Curva do crescimento de vírus em uma única etapa. Todas as linhagens ERA do vírus da raiva recuperadas cresceram até 109 ou 1010 ffu/ml, mas a ERA-G só chegou até 107ffu/ml.

[024] Fig. 6 - Focos verdes em células BSR infectadas com vírus da raiva da ERAverde1/ERAverde2. Trans1 é a unidade de transcrição incorporada nas regiões intergênicas Psi e L. Trans2 é a unidade de transcrição nas regiões intergênicas P e M. Ambas as ERAverde1 e a ERAverde2 expressaram a proteína GFP de forma estável em células BSR infectadas com vírus, enquanto que a ocorrência dos focos verdes da ERAverde2 ocorreu 48 horas mais cedo depois a infecção com vírus do que a ERAverde1.

[025] Fig. 7 - Análise da expressão do mRNA da G em vírus da raiva da ERA rearranjada em duplo G, e G, M. No Northern blot com uma sonda de G, a medição por fotometria de densidade de mRNA da G na ERA2g (coluna 1), na ERAgm (coluna 3) e na ERA2g3 (coluna 4) representou níveis acentuados de mRNA, em comparação com as células infectadas com vírus da ERA (coluna 2). As razões foram calculadas através do uso de vírus da ERA como 100%.

[026] Fig. 8A - Sobrevivência após desafio em camundongos inoculados com ERA recombinantes e derivados. Camundongos de três semanas de idade foram inoculados intra-muscularmente com os oito vírus recuperados. Em 10 dias após a inoculação, nos grupos ERA, ERA- e ERAverde1, 50%, 50% e 20% dos camundongos mostraram sinais clínicos de raiva, mas sem mortalidade, respectivamente. Nenhum sinal adverso foi observado nos outros grupos.

[027] Fig. 8B - Sobrevivência após desafio em camundongos inoculados com ERA recombinantes e derivados. Os camundongos sobreviventes ao teste da Fig. 8A foram desafiados intra-muscularmente com um vírus da raiva de cão/coiote do Texas. Em 5 dias após o desafio, nos grupos ERA e ERA-, 40 e 62% dos camundongos mostraram sinais de raiva e foram sacrificados, respectivamente. Em todos os outros grupos, nenhum sinal de raiva foi observado.

[028] Fig. 8C - Sobrevivência após inoculação i.c. com vírus da ERA e ERAg3 recombinantes. Camundongos de três semanas de idade foram inoculados com linhagens de vírus da ERAg3 e ERA-G, respectivamente. Todos os camundongos sucumbiram 15 dias após a inoculação no grupo ERA, enquanto que no grupo ERAg3 todos os camundongos sobreviveram sem sinais clínicos.

[029] Fig. 8D - Sobrevivência após inoculação i.c. de camundongos em amamentação. Camundongos de dois dias em amamentação foram inoculados intra-cerebralmente com construções de vírus da ERAg3 e ERAG, respectivamente. Todos os camundongos sucumbiram no grupo ERAg3, enquanto que nenhum camundongo morreu no ERA-G.

[030] Fig. 8E - Neutralização de título de anticorpo em camundongos com ERA recombinante e vírus derivados. Títulos de anticorpos de neutralização em camundongos foram determinados pelo RFFIT, na faixa desde 1,36 até 5,61 IU por ml dentre os grupos inoculados com vírus.

[031] Fig. 9A - Sobrevivência após infecção com vírus da Raiva de Morcego do Alabama. Hamsters foram inoculados com Vírus da Raiva de Morcego do Alabama vivos, depois tratados pós-exposição com vírus da ERAg3 ou imunoglobulina de raiva e com vacina de VR inativa disponível comercialmente. A sobrevivência foi avaliada ao longo de um período de mais de três meses.

[032] Fig. 9B - Sobrevivência após infecção com vírus da Raiva de Cão de Rua da Tailândia. Hamsters foram inoculados com Vírus da Raiva de Morcego do Alabama vivos, depois tratados pós-exposição com vírus da ERAg3 ou imunoglobulina de raiva e com vacina de VR inativa disponível comercialmente. A sobrevivência foi avaliada ao longo de um período de mais de três meses.

[033] Fig. 9C - Sobrevivência após infecção com vírus da Raiva de Cão Coiote do Texas. Hamsters foram inoculados com Vírus da Raiva de Morcego do Alabama vivos, depois tratados pós-exposição com vírus da ERAg3 ou imunoglobulina de raiva e com vacina de VR inativa disponível comercialmente. A sobrevivência foi avaliada ao longo de um período de mais de três meses. Listagem de Seqüências

[034] As seqüências de ácidos nucléicos e de aminoácidos listadas na listagem de seqüências em anexo são mostradas utilizando-se abreviações de letras padronizadas para as bases dos nucleotídeos, e códigos de três letras para os aminoácidos, conforme definido em 37 C.R.F. 1.822. Apenas um filamento de cada seqüência de ácido nucléico é mostrado, mas o filamento complementar deve ser considerado como incluído por qualquer referência ao filamento mostrado a não ser que o contexto deixe claro que apenas um filamento deve ser considerado. Convenientemente, deve ser entendido que uma seqüência apresentada como DNA pode ser convertida para RNA substituindo-se os resíduos de tiamina por uracilas.

[035] SEQ ID NO: 1. Vírus tipo selvagem da ERA CDC, 11.931 nucleotídeos - nucleotídeos 1-58, Região Líder - nucleotídeos 71-1420, gene da N - nucleotídeos 1514-2404, gene da P - nucleotídeos 2496-3101, gene da M - nucleotídeos 3317-4888, gene da G - nucleotídeos 4964-5362, região-Psi - nucleotídeos 5417-11797, gene L - nucleotídeos 11862-11931, região Seguidora

[036] SEQ ID NO: 2. ERACDC: 71 a 1420: 450 aa, proteína N.

[037] SEQ ID NO: 3. ERACDC: 1514 a 2404: 297 aa, proteína P.

[038] SEQ ID NO: 4. ERACDC: 2496 a 3101: 202 aa, proteína M.

[039] SEQ ID NO: 5. ERACDC: 3317 a 4888: 524 aa, proteína G.

[040] SEQ ID NO: 6. ERACDC: 5417 a 11797: 2127 aa, proteína L.

[041] SEQ ID NO: 7. ERA (rERA) recombinante por sistema de genética reversa é de 11.930 nucleotídeos. O tubo de poli (Ag) específico entre o gene da G e a região-psi na linhagem ERA do tipo selvagem passou por mutação para um tubo de poli (A7) em sistema de genética reversa de ERA recombinante como um marcador de seqüência. À luz disso, a rERA é mais curta do que a ERA do tipo selvagem por uma molécula. Todas as outras informações da seqüência são exatamente as mesmas.

[042] SEQ ID NO: 8. linhagem ERAg3 (11.930 nucleotídeos), aminoácido na proteína G (333 Aa) foi alterado; os ácidos nucléicos correspondentes estão nas posições 4370 a 4372.

[043] SEQ ID NO: 9. ERA- (11.577 nucleotídeos), sem a região psi (pseudo-região); uma unidade de transcrição extra foi introduzida nas posições de nucleotídeo 4950 a 5008.

[044] SEQ ID NO: 10. ERA-2G (13.150 nucleotídeos), esta linhagem tem duas cópias do gene da G; a segunda cópia é inserida nas posições 4988 a 6559.

[045] SEQ ID NO: 11. ERAverde (12.266 nucleotídeos), esta linhagem contém a seqüência codificadora para a GFP nas posições 4993 e 5673; ela aparece verde sob luz UV após a infecção das células ou do tecido.

[046] SEQ ID NO: 12. ERA-G (10.288 nucleotídeos), esta linhagem não tem o gene da G.

[047] SEQ ID NO: 13. ERA-2g3 (13.150 nucleotídeos); esta linhagem tem duas cópias do gene da G (sendo que a segunda cópia está nas posições 4988 a 6559), ambas as quais são substituídas no aminoácido 333 (correspondente às posições de nucleotídeo 4370-4372 e 6041-6043 na seqüência mostrada).

[048] SEQ ID NO: 14. ERA-pt (11.976 nucleotídeos, com uma unidade de transcrição extra após o gene da P, nas posições 2469 a 2521).

[049] SEQ ID NO: 15. Nucleotídeos ERA-pt-GFP (12.662 nucleotídeos, com gene da GFP inserido após o gene P em 2505 a 3185.

[050] SEQ ID NO: 16. ERA-gm (11.914 nucleotídeos) as posições dos genes da G e da M são trocadas na G nas posições 2505-4076 e da M nas posições 4122-4127, respectivamente.

[051] SEQ ID NO: 17. ERAg3m (11.914 nucleotídeos) as posições dos genes da G e da M são trocadas na G nas posições 2505-4076 e da M nas posições 4122-4127, respectivamente. O gene da G passa por mutação na posição de aminoácido 333.

[052] SEQ ID NO: 18. ERAgmg (13.556 nucleotídeos), esta linhagem tem duas cópias do gene da G nas posições 2505-4076 e 4943-6514, flanqueando o gene da M nas posições 4122-4727.

[053] SEQ ID NO: 19. Dez primeiros nucleotídeos da ribozima em cabeça de martelo correspondendo à extremidade 5’ do genoma da ERA do vírus da raiva.

[054] SEQ ID NO: 20. Seqüência de nucleotídeos que codifica o sinal de localização nuclear (NLS) ao antígeno SV40 T.

[055] SEQ ID NOs: 21-23. Seqüência Kozak artificiais.

[056] SEQ ID NOs: 24-57. Oligonucleotídeos sintéticos.

[057] SEQ ID NO: 58. Seqüência de aminoácidos da proteína G com mutação na posição de aminoácido 333 (de Arg até Glu).

[058] SEQ ID NOs: 59-65. Oligonucleotídeos sintéticos.

Descrição Detalhada I. Introdução

[059] As zoonoses virais são difíceis de prevenir. Um grande paradigma é o controle da raiva em animais selvagens por vacinação oral. Todas as vacinas de raiva orais atualmente licenciadas se baseiam em uma fonte comum. O vírus da raiva (VR) fixo de Evelyn-Rokitnicki-Abelseth (ERA) foi derivado da linhagem de Street-Alabama-Duffering (SAD), primeiramente isolada a partir de um cão raivoso no Alabama (EUA) em 1935. A linhagem ERA foi derivada após múltiplas passagens do VR SAD no cérebro de camundongos, em células de rim de filhote de hamster (BHK), e embriões de galinha. A clonagem repetida da ERA em células de BHK resultou eventualmente em um clone B-19, que foi denominado SAD-B19 para estudos sobre vacinas. A primeira linhagem do VR recuperada por genética reversa foi o SAD-B19. Embora o VR SAD-B19 e o ERA sejam derivados da mesma fonte, diferentes resultados foram observados em vários estudos sobre vacinas orais em animais. Por exemplo, o ERA não induziu anticorpos de neutralização evidentes em gambás ou em guaxinins, enquanto que o SAD-B19 induziu. Para elucidar as potenciais diferenças entre essas duas linhagens do VR, um sistema de genética reversa para a linhagem ERA do VR é necessária.

[060] A genética reversa apresenta um caminho viável para modificar vírus de RNA de formas definidas. Um sistema para a genética reversa de uma linhagem inicial de vírus da raiva foi estabelecida com sucesso em 1994 (Schnell e outros, The EMBO J. 13, 4195-4203, 1994). Na década passada, foram feitos melhoramentos ao sistema, resultando em uma maior eficiência da recuperação do vírus. Essa eficiência aumentada facilitou a elucidação da patogenia do vírus, interações proteína-proteína, e proteína-RNA.

[061] Dentro do genoma do vírus da raiva, foi proposto que algumas regiões contêm sinais importantes, tais como região de promotores distal viral, encapsidação de nucleoproteína, local de iniciação de transcrição da RNA polimerase L dependente de RNA, poliadenilação e locais de terminação. Esses sinais são importantes para assegurar a recuperação eficiente de vírus e para projetar uma unidade de transcrição extra para aceitar uma Fase Aberta de Leitura (ORF) exógena dentro do genoma do vírus da raiva.

[062] Esta divulgação oferece um sistema de genética reversa eficiente, e descreve o seu uso para produzir variantes do vírus da linhagem ERA. As modificações descritas aqui resultaram em linhagens que são candidatas adequadas para aceitar a expressão da ORF e o desenvolvimento de vacinas.

[063] O sistema de genética reversa é composto de um conjunto de plasmídeos. Um primeiro plasmídeo inclui um cRNA viral de ERA. Para criar extremidades anti-genômicas virais autênticas no cDNA viral transcrito, cDNA genômico de ERA é abordado por uma ribozima em cabeça-de-martelo na extremidade 3’ e uma ribozima de vírus delta da hepatite na extremidade 5’. A fita anti-genômica é fundida ao sinal de iniciação de transcrição do fago bacterial T7, que está opcionalmente sob o controle do promotor imediato-prematuro de citomegalovírus (CMV).

[064] O sistema também inclui uma pluralidade de plasmídeos auxiliares que codificam proteínas envolvidas na encapsidação viral. Por exemplo, o sistema tipicamente inclui plasmídeos auxiliares que codificam a nucleoproteína viral (N), a fosfoproteína (P), polimerase dependente de RNA (L), e opcionalmente a glicoproteína viral (G). O sistema também inclui um plasmídeo que codifica a RNA polimerase do fago T7, que pode ser modificado pela adição de um sinal de localização nuclear (NLS) para aumentar a expressão da polimerase do T7 no núcleo de células transfectadas. O plasmídeo de expressão da RNA polimerase do T7 é construído como um “autogene”, que transcreve o comprimento inteiro de cRNA anti-genômico viral para encapsidação de nucleoproteínas após a transfecção para dentro de células.

[065] O sistema de genética reversa é útil na concepção e produção de composições imunogênicas para o tratamento (pré e/ou pós exposição) de vírus da raiva, e para produzir vetores de vírus da raiva ERA para expressar Fases Abertas de Leitura (ORFs) exógenas. Por exemplo, uma unidade de transcrição extra pode ser projetada, testada e incorporada dentro do genoma de ERA na região Psi e/ou na região intergênica de fosfoproteína (P) -matriz (M) de proteína. Essencialmente, qualquer ORF de interesse pode ser expressa no contexto do vetor ERA, incluindo antígenos codificadores de ORFs de vírus e outros patogênios, tais como os antígenos de outros lyssavirus, assim como para expressar outras proteínas de interesse terapêutico.

[066] Portanto, os métodos e as composições revelados aqui são úteis para a concepção e a produção de composições imunogênicas de vírus da raiva, incluindo composições adequadas como vacinas para o tratamento pré- e/ou pós-exposição do vírus da raiva.

II. Abreviações

[067] ADE - intensificação dependente de anticorpos

[068] Ag-ELISA - ELISA de captura de antígenos

[069] DNA - ácido desoxirribonucléico

[070] ERA - linhagem do vírus da Raiva de Evelyn-Rokitnicki- Abelseth

[071] ELISA - ensaio imunoabsorvente com ligação enzimática

[072] G - glicoproteína

[073] i.c. - intra-cerebral

[074] IFA - ensaio de imunofluorescência indireto

[075] i.m. - intramuscular

[076] L - RNA polimerase dependente de RNA

[077] M - proteína matricial

[078] mAb - anticorpo monoclonal

[079] N - nucleoproteína

[080] ORF - fase de leitura aberta

[081] P - fosfoproteína

[082] PCR - reação em cadeia de polimerase

[083] RACE - rápida amplificação de extremidades 5’ de cDNA

[084] RNA - ácido ribonucléico

[085] RNP - ribonucleoproteína

[086] RT-PCR - reação em cadeia de polimerase de transcrição reversa

[087] RV - vírus da raiva

[088] trans-1 - unidade de transcrição extra 1

[089] trans-2 - unidade de transcrição extra 2

III. Termos

[090] A não ser que seja explicado de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado entendido comumente por alguém versado no assunto ao qual esta invenção pertence. De forma semelhante, a não ser que indicado de outra forma, os termos técnicos são usados de acordo com o uso convencional. As definições dos termos comuns na biológica molecular podem ser encontradas em Benjamin Lewin, Genes V, publicado por Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew e outros (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, publicada por Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-021829); e Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publicado por VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8).

[091] Os termos singulares “um”, “uma”, “o” e “a” incluem os referentes plurais, a não ser que o contexto indique claramente o contrário. De forma semelhante, a palavra “ou” pretende incluir “e”, a não ser que o contexto indique claramente o contrário. Assim, “compreendendo A ou B” significa a inclusão de A, ou B, ou de A e B. Deve ser compreendido ainda que todos os tamanhos de bases ou tamanhos de aminoácidos, e todos os valores de peso molecular ou de massa molecular, dados para os ácidos nucléicos ou para os polipeptídios, são aproximações, e são fornecidos em prol da descrição.

[092] Para facilitar a revisão das várias modalidades da invenção, as seguintes explanações de termos específicos são fornecidas:

[093] Adjuvante: Uma substância que acentua de forma não- específica a reação imunológica a um antígeno. O desenvolvimento de adjuvantes de vacinas para uso em seres humanos é revisado em Singh e outros (Nat. Biotechnol. 17:1075-1081, 1999), o qual revela que, ao tempo de sua publicação, os sais de alumínio e a micro-emulsão MF59 eram os únicos adjuvantes de vacina aprovados para o uso em seres humanos.

[094] Amplificação: A amplificação de uma molécula de ácido nucléico (por ex., uma molécula de DNA ou de RNA) se refere ao uso de uma técnica de laboratório que aumente o número de réplicas de uma molécula de ácido nucléico em uma amostra. Um exemplo de amplificação é a reação em cadeia de polimerase (PCR), em que uma amostra é posta em contato com um par de primers de oligonucleotídeos sob condições que permitem a hibridação dos primers para um molde (ou modelo) de ácido nucléico na amostra. Os primers são estendidos sob condições adequadas, dissociados do molde, re-anelados, estendidos e dissociados para amplificar o número de réplicas do ácido nucléico. O produto da amplificação pode ser caracterizado por técnicas como a eletroforese, padrões de clivagem de endonuclease de restrição, hibridação ou ligação de oligonucleotídeos, e/ou seqüenciamento de ácidos nucléicos.

[095] Outros exemplos de métodos de amplificação incluem a amplificação de deslocamento de filamento, como revelada na Patente US5744311; amplificação isotérmica sem transcrição, como revelada na Patente US6033881; amplificação de reação em cadeia de reparo, como revelada em WO90/01069; amplificação de reação em cadeia de ligase, como revelada em EP-A-320308; amplificação de reação em cadeia de ligase por preenchimento de espaços vazios, como revelada na Patente US5427930; e a amplificação sem transcrição de RNA NASBA™, como revelada na Patente US6025134. O método de amplificação pode ser modificado, incluindo, por exemplo, etapas adicionais ou o casamento da amplificação com um outro protocolo.

[096] Animal: Organismos vertebrados multicelulares vivos, uma categoria que inclui, por exemplo, os mamíferos e as aves. O termo “mamífero” inclui tanto mamíferos humanos como não-humanos. De forma semelhante, o termo “sujeito” inclui tanto sujeitos humanos como sujeitos veterinários, por exemplo, seres humanos, primatas não-humanos, cães, gatos, cavalos e vacas.

[097] Anticorpo: Uma proteína (ou um complexo de proteínas) que inclua um ou mais polipeptídios substancialmente codificados por genes de imunoglobulina ou por fragmentos de genes de imunoglobulina. Os genes de imunoglobulina reconhecidos incluem os genes de regiões constantes kappa, lambda, alfa, gama, delta, épsilon e um, assim como os genes de regiões variáveis de imunoglobulina miríades. As cadeias leves são classificadas como kappa ou lambda. As cadeias pesadas são classificadas como gama, um, alfa, delta ou épsilon, que por sua vez definem as classes de imunoglobulina, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente. A unidade estrutural de imunoglobulina (anticorpo) básica é geralmente um tetrâmero. Cada tetrâmero é composto por dois pares idênticos de cadeias de polipeptídio, cada uma possuindo uma cadeia “leve” (aproximadamente 25 kDa) e uma “pesada” (aproximadamente 50-70 kDa). A N-terminal de cada cadeia define uma região variável de aproximadamente 100 a 110 ou mais aminoácidos responsáveis principalmente pelo reconhecimento de antígenos. As expressões “cadeia leve variável” (VL) e “cadeia pesada variável” (VH) se referem, respectivamente, a estas cadeias leves e pesadas.

[098] Como utilizado aqui, o termo “anticorpo” inclui imunoglobulinas intactas, assim como um número de fragmentos bem caracterizados. Por exemplo, Fabs, Fvs, e Fvs de cadeia simples (SCFvs) que se ligam a proteínas alvo (ou a um epitopo dentro de uma proteína ou uma proteína de fusão) seriam também agentes de ligação específicos para aquela proteína (epitopo). Esses fragmentos de anticorpos são os seguintes: (1) Fab, o fragmento que contém um fragmento de ligação de antígeno monovalente de uma molécula de anticorpo produzida pela digestão de todo o anticorpo com a enzima papaína para dar uma cadeia leve intacta e uma porção de uma cadeia pesada; (2) Fab’, o fragmento de uma molécula de anticorpo obtida pelo tratamento de todo o anticorpo com pepsina, seguido por redução, para dar uma cadeia leve intacta e uma porção da cadeia pesada; dois fragmentos Fab’ são obtidos para cada molécula de anticorpo; (3) (Fab’)2, o fragmento do anticorpo obtido pelo tratamento de todo o anticorpo com a pepsina de enzima sem redução subseqüente; (4) F(ab’)2, um dímero de dois fragmentos Fab’ mantidos juntos por duas ligações de dissulfeto; (5) Fv, um fragmento modificado por engenharia genética contendo a região variável da cadeia leve e a região variável da cadeia pesada expresso em duas cadeias; e (6) anticorpo de cadeia simples, uma molécula de engenharia genética contendo a região variável da cadeia leve, a região variável da cadeia pesada, ligada por um ligante de polipeptídio adequado como uma molécula de cadeia simples fundida geneticamente. Os métodos de preparação desses fragmentos são rotineiros (ver, por exemplo, Harlow e Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, CSHL, Nova York, 1999).

[099] Os anticorpos para uso nos métodos e nas composições desta divulgação podem ser monoclonais ou poli-clonais. Meramente a título de exemplo, anticorpos monoclonais podem ser preparados a partir de hibridomas murinos de acordo com o método clássico de Kohler e Milstein (Nature 256:495-97, 1975) ou métodos derivados deste.

[0100] Afinidade de ligação de anticorpos: A força da ligação entre um único local de ligação de anticorpos e um ligando (por ex., um antígeno ou epitopo). A afinidade de um local de ligação de anticorpos X para um ligando Y é representada pela constante de dissociação (Kd), que é a concentração de Y necessária para ocupar a metade dos locais de ligação X presentes em uma solução. Uma Kd pequena indica uma interação mais forte ou de mais alta afinidade entre X e Y e uma concentração mais baixa de ligando é precisa para ocupar os locais. Em geral, a afinidade de ligação de anticorpos pode ser afetada pela alteração, modificação e/ou substituição de um ou mais aminoácidos no epitopo reconhecido pelo paratopo do anticorpo.

[0101] Em um exemplo, a afinidade de ligação de anticorpos é medida por titulação de ponto de extremidade em um teste Ag-ELISA. A afinidade de ligação de anticorpos é substancialmente diminuída (ou tem sua medição reduzida) pela modificação e/ou substituição de um ou mais aminoácidos no epitopo reconhecido pelo paratopo do anticorpo se o título de ponto de extremidade de um anticorpo específico para o epitopo modificado/substituído diferir em ao menos 4 vezes, tal como em ao menos 10 vezes, ao menos 100 vezes ou mais, em comparação com o epitopo inalterado.

[0102] Antígeno: Um composto, uma composição ou uma substância que possa estimular a produção de anticorpos ou uma reação de células-T em um animal, incluindo as composições que são injetadas ou absorvidas dentro de um animal. Um antígeno reage com os produtos de uma imunidade humoral ou celular específica, incluindo as induzidas por imunogênios heterólogos. Em uma modalidade, um antígeno é um antígeno de vírus.

[0103] Atenuado: No contexto de um vírus vivo, tal como um vírus rábico, o vírus é atenuado se a sua habilidade de infectar uma célula ou um sujeito e/ou a sua habilidade de produzir doença for reduzida (por exemplo, eliminada). Tipicamente, um vírus atenuado conserva ao menos alguma capacidade de provocar uma reação imunológica após administração a um sujeito imuno-competente. Em alguns casos, um vírus atenuado é capaz de provocar uma reação imunológica protetora sem causar quaisquer sinais ou sintomas de infecção.

[0104] Ligação ou Ligação Estável: Um oligonucleotídeo se liga ou se liga estavelmente a um ácido nucléico alvo se uma quantidade suficiente do nucleotídeo formar pares de base ou for hibridado em seu ácido nucléico alvo, para permitir a detecção da ligação. A ligação pode ser detectada por propriedades físicas ou funcionais do completo de oligonucleotídeo alvo. Uma ligação entre um alvo e um oligonucleotídeo pode ser detectada por qualquer procedimento conhecido por alguém versado na técnica, incluindo avaliações de ligação físicas ou funcionais. A ligação pode ser detectada funcionalmente determinando-se se a ligação acarreta um efeito observável sobre um processo bio-sintético, tal como a expressão de um gene, replicação de DNA, transcrição, translação, e outros.

[0105] Os métodos físicos de detecção de ligação e filamentos complementares de DNA ou de RNA são bem conhecidos na técnica, e incluem métodos tais como o DNase I ou diferenciação química, Por exemplo, um método que é amplamente utilizado, por ser tão simples e confiável, envolve a observação de uma mudança na absorção de luz por uma solução contendo um oligonucleotídeo (ou um análogo) e um ácido nucléico alvo em 220 a 300 nm à medida que a temperatura é lentamente diminuída. Se o oligonucleotídeo ou análogo tiver se ligado ao seu alvo, há um repentino aumento de absorção em uma temperatura característica à medida que o oligonucleotídeo (ou o análogo) e o alvo se dissociam ou derretem.

[0106] A ligação entre um oligômero e seu ácido nucléico alvo é freqüentemente caracterizada pela temperatura (Tm) na qual 50% do oligômero são derretidos em seu alvo. Uma maior Tm significa um complexo mais forte ou mais estável em relação a um complexo com uma Tm baixa.

[0107] cDNA (DNA Complementar): Um pedaço de DNA sem segmentos codificadores internos (íntrons) e seqüências reguladoras que determinam a transcrição. O cDNA é sintetizado em laboratório por transcrição reversa de RNA mensageiro extraído das células.

[0108] Eletroforese: A eletroforese se refere à migração de solutos ou de partículas carregados em um meio líquido sob a influência de um campo elétrico. Separações eletroforéticas são amplamente utilizadas para a análise de macro-moléculas. De particular importância é a identificação de proteínas e de seqüências de ácidos nucléicos. Tais separações podem ser baseadas em diferenças de tamanho e/ou de carga. As seqüências de nucleotídeos possuem uma carga uniforme e são, portanto, separadas com base em diferenças de tamanho. A eletroforese pode ser realizada em um meio líquido sem suporte (por exemplo, eletroforese capilar), mas normalmente o meio líquido passa através de um meio de suporte sólido. Os meios de suporte mais amplamente utilizados são géis, por exemplo, os géis de poliacrilamida e de agarose.

[0109] Os géis peneiradores (por exemplo, a agarose) impedem o fluxo de moléculas. O tamanho dos poros do gel determina o tamanho de uma molécula que pode fluir livremente através do gel. A quantidade de tempo para se passar através do gel aumenta conforme o tamanho das moléculas aumente. Em resultado, moléculas pequenas passam através do gel mais rapidamente do que moléculas grandes e, portanto, andam mais além da área de aplicação da amostra do que as moléculas maiores, em um dado período de tempo. Tais géis são utilizados para separações de seqüências de nucleotídeos baseadas em tamanho.

[0110] Os fragmentos de DNA linear migram através dos géis de agarose com uma mobilidade que é inversamente proporcional ao log10 do seu peso molecular. Utilizando-se géis com diferentes concentrações de agarose, tamanhos diferentes de fragmentos de DNA podem ser obtidos. As concentrações mais elevadas de agarose facilitam a separação de pequenos DNAs, enquanto que concentrações baixas de agarose permitem o isolamento de DNAs maiores.

[0111] Epitopo: Um determinante antigênico. Eles são grupos químicos particulares, tais como seqüências de peptídeos contíguas ou não- contíguas, em uma molécula, que sejam antigênicas, isto é, que provoquem uma reação imunológica específica. Um anticorpo liga um epitopo antigênico particular com base na estrutura de três dimensões do anticorpo e da estrutura de três dimensões emparelhada (ou cognata) do epitopo.

[0112] Um “epitopo substituído” compreende ao menos uma substituição estrutural no epitopo, tal como uma substituição de um aminoácido por outro.

[0113] Hibridação (ou Hibridização): Os oligonucleotídeos e seus análogos hibridam por pontes de hidrogênio, que incluem as pontes de hidrogênio de Watson-Crick, de Hoogsteen ou de Hoogsteen reversa, entre bases complementares. Geralmente, o ácido nucléico consiste em bases nitrogenadas que são pirimidinas (citosina (C), uracila (U) e timina (T)) ou purinas (adenina (A) e guanina (G)). Essas bases nitrogenadas formam pontes de hidrogênio entre uma pirimidina e uma purina, e a ligação da pirimidina à purina é referida como “pareamento de base”. Mais especificamente, A irá fazer pontes de hidrogênio com T ou com U, e G irá ligar-se a C. “Complementar” se refere ao pareamento de base que ocorre entre duas seqüências de ácidos nucléicos distintas ou entre duas regiões distintas da mesma seqüência de ácido nucléico.

[0114] “Especificamente hibridizável” e “especificamente complementar” são expressões que indicam um grau suficiente de complementaridade tal que ligações estáveis e específicas ocorram entre o oligonucleotídeo (ou o seu análogo) e o DNA ou RNA alvo. O oligonucleotídeo ou análogo de oligonucleotídeo não precisa ser 100% complementar a sua seqüência alvo para ser especificamente hibridizável. Um oligonucleotídeo ou análogo é especificamente hibridizável quando a ligação do oligonucleotídeo ou análogo ao DNA ou RNA alvo interfere com o funcionamento normal do DNA ou RNA alvo, e quando há um grau de complementaridade suficiente para impedir qualquer ligação não-específica do oligonucleotídeo ou análogo a seqüências que não sejam alvo sob condições em que ligações específicas sejam desejadas, por exemplo, sob condições fisiológicas no caso de exames ou sistemas in vivo. Tal ligação é referida como hibridação específica.

[0115] As condições de hibridação resultantes de graus particulares de rigor irão variar dependendo da natureza do método de hibridação de escolha e da composição e do comprimento das seqüências de ácidos nucléicos hibridantes. Geralmente, a temperatura de hibridação e a força iônica (especialmente a concentração de Na+ e/ou de Mg++) do tampão da hibridação irá determinar o rigor da hibridação, embora o número de lavagens também influenciem o rigor. Cálculos sobre condições de hibridação necessárias para se obter graus particulares de rigor são discutidos por Sambrook e outros (ed.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Ed.., Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, EUA, 1989, capítulos 9 e 11; e Ausubel e outros. Short Protocols in Molecular Biology, 4aEd., John Wiley & Sons, Inc., 1999.

[0116] Para os propósitos da presente divulgação, as “condições rigorosas” abrangem condições sob as quais a hibridação somente irá ocorrer se houver menos de 25% de incompatibilidade entre a molécula de hibridação e a seqüência alvo. As “condições rigorosas” podem ser divididas em níveis particulares de rigor para uma definição mais precisa. Assim, como utilizado aqui, as condições de “rigor moderado” são aquelas sob as quais moléculas com mais de 25% de incompatibilidade de seqüência não irão hibridar; as condições de “rigor médio” são aquelas sob as quais moléculas com mais de 15% de incompatibilidade de seqüência não irão hibridar; e as “condições de elevado rigor” são aquelas sob as quais moléculas com mais de 6% de incompatibilidade de seqüência não irão hibridar.

[0117] “Hibridação específica” se refere à ligação, duplexação ou hibridação de uma molécula apenas ou substancialmente apenas a uma seqüência particular de nucleotídeos quando esta seqüência estiver presente em uma mistura complexa (por exemplo, o DNA ou o RNA celular total). A hibridação específica pode ocorrer também sob condições de rigores variados.

[0118] Composição imunologicamente estimuladora: Uma expressão utilizada aqui para significar uma composição útil para estimular ou provocar uma reação imunológica específica (ou reação imunogênica) em um vertebrado. A composição imunologicamente estimuladora pode ser um antígeno de proteína ou um vetor de plasmídeo utilizado para expressar um antígeno de proteína. Em algumas modalidades, a reação imunológica é protetora ou oferece imunidade protetora, porque ela permite que o animal vertebrado resista melhor à infecção ou à progressão da doença proveniente do organismo contra o qual a composição imunologicamente estimuladora é direcionada.

[0119] Sem querer limitar-se a uma teoria específica, acredita-se que uma reação imunológica induzida por uma composição imunologicamente estimuladora possa surgir da geração de um anticorpo específico para um ou mais dos epitopos fornecidos na composição imunologicamente estimuladora. Alternativamente, a reação pode compreender uma reação baseada em células T-auxiliares ou citotóxicas a um ou mais dos epitopos fornecidos na composição imunologicamente estimuladora. Todas essas três reações podem se originar de células ingênuas ou de memória. Um exemplo específico de um tipo de composição imunologicamente estimuladora é uma vacina.

[0120] Em algumas modalidades, uma “quantidade eficaz” ou “quantidade imunologicamente estimuladora” de uma composição imunologicamente estimuladora é uma quantidade que, quando administrada a um sujeito, seja suficiente para gerar uma reação imunológica detectável. Tal reação pode compreender, por exemplo, a geração de um anticorpo específico para um ou mais dos epitopos fornecidos na composição imunologicamente estimuladora. Alternativamente, a reação pode compreender uma reação baseada em célula T-auxiliar (T-helper) ou em CTL (linfócito T citotóxico) a um ou mais dos epitopos fornecidos na composição imunologicamente estimuladora. Todas essas três reações podem se originar de células ingênuas ou de memória. Em outras modalidades uma “quantidade eficaz protetora” de uma composição imunologicamente estimuladora é uma quantidade que, quando administrada a um sujeito, seja suficiente para conferir imunidade protetora sobre o sujeito.

[0121] Inibição ou tratamento de uma doença: A inibição do completo desenvolvimento de uma doença ou condição, por exemplo, em um sujeito que esteja em risco para uma doença. Um exemplo específico de doença é a raiva. “Tratamento” se refere a uma intervenção terapêutica que melhore um sinal ou sintoma de uma doença ou condição patológica após esta ter começado a se desenvolver. Como utilizado aqui, o termo “melhorar”, com relação a uma doença, condição patológica ou a um sintoma, se refere a qualquer efeito benéfico observável do tratamento. O efeito benéfico pode ser evidenciado, por exemplo, pelo aparecimento demorado de sintomas clínicos da doença em um sujeito suscetível; pela redução de gravidade de alguns ou de todos os sintomas clínicos da doença; por uma progressão mais lenta da doença; pela redução no número de reincidências da doença; por uma melhora na saúde geral ou no bem-estar do sujeito; ou por outros parâmetros bem conhecidos na técnica que sejam específicos para a doença particular.

[0122] Isolado: Um componente biológico “isolado” ou “purificado” (tal como um ácido nucléico, um peptídeo, uma proteína, complexo de proteínas, ou partícula) foi substancialmente separado, produzido a parte de, ou purificado a partir de outros componentes biológicos na célula do organismo em que o componente normalmente ocorra, isto é, outro DNA e RNA cromossômico ou extra-cromossômico, e proteínas. Os ácidos nucléicos, os peptídeos e as proteínas que foram “isolados” ou “purificados” portanto incluem ácidos nucléicos e proteínas purificados através de métodos de purificação convencionais. O termo também abrange ácidos nucléicos, peptídeos e proteínas preparados pela expressão recombinante em uma célula hospedeira, assim como ácidos nucléicos ou proteínas sintetizados quimicamente. O termo “isolado” ou “purificado” não requer pureza absoluta; ao revés, pretende ser um termo relativo. Assim, por exemplo, um componente biológico isolado é aquele em que o componente biológico esteja mais enriquecido do que no componente biológico em seu ambiente natural dentro de uma célula, ou em outro recipiente de produção. Preferivelmente, uma preparação é purificada de forma que o componente biológico represente ao menos 50%, tal como ao menos 70%, ao menos 90%, ao menos 95%, ou mais, do conteúdo de componente biológico total da preparação.

[0123] Marcador: Um composto ou uma composição detectável que seja conjugada diretamente ou indiretamente a uma outra molécula para facilitar a detecção desta molécula. Exemplos específicos, não limitativos, de indicadores incluem indicadores fluorescentes, ligações enzimáticas e isótopos radioativos.

[0124] Molécula de ácido nucléico: Uma forma polimérica de nucleotídeos, que pode incluir filamentos tanto sense como anti-sense de RNA, cDNA, DNA genômico, e formas sintéticas e polímeros misturados destes acima. Um nucleotídeo se refere a um ribonucleotídeo, desoxinucleotídeo ou a uma forma modificada de qualquer um desses tipos de nucleotídeo. A expressão “molécula de ácido nucléico”, como aqui utilizada, é sinônima de “ácido nucléico” e de “polinucleotídeo”. Uma molécula de ácido nucléico tem usualmente ao menos 10 bases de comprimento, a não ser que seja especificado de outra forma. A expressão inclui as formas de filamentos simples e duplos de DNA. Um polinucleotídeo pode incluir cada ou ambos os nucleotídeos modificados e os que ocorrem naturalmente, ligados juntos por ligações de nucleotídeos que ocorrem naturalmente e/ou que não ocorrem naturalmente.

[0125] Oligonucleotídeo: Uma molécula de ácido nucléico que geralmente compreenda um comprimento de 300 bases ou menos. O termo se refere com freqüência a desoxiribonucleotídeos de filamentos simples, mas também pode se referir a ribonucleotídeos de filamentos simples ou duplos, híbridos de RNA:DNA e DNAs de filamentos duplos, dentre outros. O termo “oligonucleotídeo” também inclui oligonucleosídeos (isto é, um oligonucleotídeo menos o fosfato) e qualquer outro polímero de base orgânica.

[0126] Em alguns exemplos, os oligonucleotídeos têm aproximadamente 10 a 90 bases em comprimento, por exemplo, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 bases em comprimento. Outros oligonucleotídeos têm aproximadamente 25, aproximadamente 30, aproximadamente 35, aproximadamente 40, aproximadamente 45, aproximadamente 50, aproximadamente 55, aproximadamente 60 bases, aproximadamente 65 bases, aproximadamente 70 bases, aproximadamente 75 bases ou aproximadamente 80 bases em comprimento. Os oligonucleotídeos podem ser de filamentos simples, por exemplo, para uso como sondas ou como primers, ou podem ser de filamentos duplos, por exemplo, para uso na construção de um gene mutante. Os oligonucleotídeos podem ser oligonucleotídeos sense ou anti-sense. Um oligonucleotídeo pode ser modificado como discutido acima em referência às moléculas de ácido nucléico. Os oligonucleotídeos podem ser obtidos a partir de fontes de ácidos nucléicos existentes (por exemplo, genômicos ou de cDNA), mas também podem ser sintéticos (por exemplo, produzidos por síntese de laboratório ou de oligonucleotídeo in vitro).

[0127] Fase Aberta de Leitura (ORF, Open Reading Frame): Uma série de trincas de nucleotídeos (códons) que codificam aminoácidos sem quaisquer códons de terminação internos. Essas seqüências são usualmente traduzíveis em um peptídeo/polipeptídeo/proteína/poli-proteína.

[0128] É reconhecido na técnica que os seguintes códons (mostrados para RNA) podem ser utilizados de forma equivalente para codificar aminoácidos ou terminações específicas: Alanina (Ala ou A) GCU, GCG, GCA ou GCG; Arginina (Arg ou R) CGU, CGC, CGA, CGG, AGA ou AGG; Asparagina (Asn ou N) AAU ou AAC; Ácido Aspártico (Asp ou D) GAU ou GAC; Cisteína (Cys ou C) UGU ou UGC; Ácido Glutâmico (Glu ou E) GAA ou GAG; Glutamina (Gln ou Q) CAA ou CAG; Glicina (Gly ou G) GGU, GGC, GGA ou GGG; Histidina (His ou H) CAU ou CAC; Isoleucina (Ile ou I) AUU, AUC ou AUA; Leucina (Leu ou L) UUA, UUG, CUU, CUC, CUA ou CUG; Lisina (Lys ou K) AAA ou AAG; Metionina (Met ou M) AUG; Fenilalanina (Phe ou F) UUU ou UUC; Prolina (Pro ou P) CCU, CCC, CCA ou CCG; Serina (Ser ou S) UCU, UCC, UCA, UCG, AGU ou AGC; Códon de terminação UAA (ocre) ou UAG (âmbar) ou UGA (opala); Treonina (Thr ou T) ACU, ACC, ACA ou ACG; Tirosina (Tyr ou Y) UAU ou UAC; Triptofan (Trp ou W) UGG; e Valina (Val ou V) GUU, GUC, GUA ou GUG. Os códons correspondentes para DNA têm T substituído por U em cada caso.

[0129] Ligado de modo operável: Uma primeira seqüência de ácido nucléico está ligada de modo operável a uma segunda seqüência de ácido nucléico quando a primeira seqüência de ácido nucléico é colocada em uma associação funcional com a segunda seqüência de ácido nucléico. Por exemplo, um promotor é ligado de modo operável a uma seqüência codificadora quando o promotor afeta a transcrição ou a expressão da seqüência codificadora. Geralmente, seqüências de DNA ligadas de modo operável são contíguas e, quando for necessário juntar duas regiões codificadoras de proteínas, na mesmo fase de leitura. Se íntrons estiverem presentes, as seqüências de DNA ligadas de modo operável podem não ser contíguas.

[0130] Paratopo: A porção de um anticorpo que é responsável por sua ligação a um determinante antigênico (epitopo) em um antígeno.

[0131] Portadores farmaceuticamente aceitáveis: Os portadores farmaceuticamente aceitáveis úteis nesta divulgação são convencionais. Remington’s Pharmaceutical Sciences, de E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, EUA, 15a Edição (1975) descreve composições e formulações adequadas para a distribuição farmacêutica de um ou mais compostos ou moléculas terapêuticas, tais como uma ou mais moléculas de ácido nucléico SARS-CoV, proteínas ou anticorpos que liguem essas proteínas, e agentes farmacêuticos adicionais.

[0132] Em geral, a natureza do portador irá depender do modo de administração particular a ser empregado. Por exemplo, as formulações parenterais usualmente compreendem fluidos injetáveis que incluem fluidos farmacêutica e fisiologicamente aceitáveis, tais como a água, o soro fisiológico, soluções de sais equilibradas, dextrose aquosa, glicerol ou outros, como um veículo. Para composições sólidas (por exemplo, formas de pós, pílulas, tabletes ou cápsulas, os portadores sólidos não-tóxicos convencionais incluem, por exemplo, formulações farmacêuticas de manitol, tactose, amido ou de estearato de magnésio. Além dos portadores biologicamente neutros, as composições farmacêuticas a serem administradas podem conter pequenas quantidades de substâncias auxiliares não-tóxicas, tais como agentes de umidade ou emulsificadores, preservativos, e agentes de tampão de pH e similares, por exemplo, acetato de sódio ou sorbitan monolaurato.

[0133] Polipeptídio: Um polímero no qual os monômeros sejam resíduos de aminoácido unidos juntos por ligações de amida. Quando os aminoácidos são alfa aminoácidos, tanto o isômero óptico L como o isômero óptico D podem ser utilizados, sendo os isômeros-L preferidos para muitos usos biológicos. Os termos “polipeptídio” ou “proteína”, como utilizados aqui, devem abranger qualquer molécula de aminoácido e incluir moléculas de aminoácidos modificadas. O termo “polipeptídio” é especificamente usado para abranger as proteínas que ocorrem naturalmente, assim como aquelas que sejam produzidas de forma recombinante ou sintética.

[0134] Substituições conservadoras de aminoácidos são aquelas substituições que, quando feitas, menos interferem nas propriedades da proteína original, isto é, a estrutura e especialmente a função da proteína é conservada e não é significativamente alterada por tais substituições. Exemplos de substituições conservadoras são mostrados abaixo:

[0135] As substituições conservadoras geralmente mantêm: (a) a estrutura da cadeia de polipeptídio na região da substituição, por exemplo, como uma folha ou de conformação helicoidal, (b) a carga ou a hidrofobia da molécula no local alvo, ou (c) o núcleo da cadeia lateral.

[0136] Os aminoácidos são tipicamente classificados em uma ou mais categorias, incluindo a polar, hidrofóbica, ácida, básica e aromática, de acordo com suas cadeias laterais. Exemplos de aminoácidos polares incluem os que têm grupos funcionais de cadeia lateral tais como hidroxila, sulfidrila e amida, assim como os aminoácidos ácidos e básicos. Os aminoácidos polares incluem, sem limitações, asparagina, cisteína, glutamina, histidina, selenocisteína, serina, treonina, triptofan e tirosina. Exemplos de aminoácidos hidrofóbicos ou apolares incluem os resíduos que possuem cadeias laterais alifáticas apolares, tais como, sem limitações, leucina, isoleucina, valina, glicina, alanina, prolina, metionina e fenilalanina. Exemplos de resíduos básicos de aminoácido incluem os que têm uma cadeia lateral básica, tal como um grupo amino ou guanidino. Os resíduos básicos de aminoácidos incluem, sem limitações, arginina, homolisina e lisina. Exemplos de resíduos ácidos de aminoácido incluem os que têm um grupo funcional de cadeia lateral ácido, tal como um grupo carboxi. Os resíduos ácidos de aminoácidos incluem, sem limitações, ácido aspártico e ácido glutâmico. Os aminoácidos aromáticos incluem os que têm um grupo de cadeia lateral aromático. Exemplos de aminoácidos aromáticos incluem, sem limitações, bifenilalanina, histidina, 2-naftillalananina, pentafluorofenillalanina, fenilalanina, triptofan e tirosina. Nota-se que alguns aminoáciods são classificados em mais de um grupo, por exemplo, histidina, triptofan e tirosina são classificadas tanto como aminoácidos polares quanto aromáticos. Os aminoácidos adicionais que estão classificados em cada um dos grupos acima são conhecidos pelos técnicos versados no assunto.

[0137] As substituições de que em geral se espera a produção das maiores mudanças nas propriedades das proteínas serão não-conservadoras, por exemplo, mudanças em que (a) um resíduo hidrofílico, por exemplo, seril ou treonil, seja substituído para (ou por) um resíduo hidrofóbico, por exemplo, leucil, isoleucil, fenilalanil, valil ou alanil; (b) uma cisteína ou prolina seja substituída para (ou por) qualquer outro resíduo; (c) um resíduo que possui uma cadeia lateral eletropositiva, por exemplo, lisil, arginil ou histadil, seja substituída para (ou por) um resíduo eletronegativo, por exemplo, glutamil ou aspartil; ou (d) um resíduo que tem uma cadeia lateral volumosa, por exemplo, fenilalanina, seja substituído para (ou por) um que não tenha uma cadeia lateral, por exemplo, glicina.

[0138] Sondas e Primers: Uma sonda compreende uma molécula de ácido nucléico isolada ligada a um indicador detectável ou a outra molécula relatora. Indicadores típicos incluem isótopos radioativos, substratos de enzima, co-fatores, ligandos, agentes quimio-luminescentes ou fluorescentes, haptenos e enzimas. Métodos para indicação e orientação na escolha de indicadores apropriados para vários propósitos são discutidos, por exemplo, por Sambrook e outros, (ed.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Ed.., Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, EUA, 1989, capítulos 9 e 11; e Ausubel e outros. Short Protocols in Molecular Biology, 4aEd., John Wiley & Sons, Inc., 1999.

[0139] Primers (ou iniciadores) são moléculas de ácido nucléico curtas, por exemplo, oligonucleotídeos de DNA com 6 nucleotídeos ou mais em comprimento, por exemplo, que se hibridize em nucleotídeos complementares contíguos ou a uma seqüência a ser amplificada. Os oligonucleotídeos de DNA mais compridos podem ter 10, 12, 15, 20, 25, 30 ou 50 nucleotídeos ou mais em comprimento. Os primers podem ser anelados um filamento de DNA alvo complementar por hibridação de ácidos nucléicos para formar um híbrido entre o primer e o filamento de DNA alvo, e então o primer pode ser estendido ao longo do filamento de DNA alvo por uma enzima de DNA polimerase. Pares de primers podem ser utilizados para a amplificação de uma seqüência de ácido nucléico, por exemplo, pela reação em cadeia de polimerase (PCR) ou outros métodos de amplificação de ácidos nucléicos conhecidos na técnica. Outros exemplos de amplificação incluem a amplificação de deslocamento de filamento como revelada na Patente US5744311; amplificação isotérmica sem transcrição como revelada na Patente US6033881; amplificação de reação em cadeia de reparo como revelada em WO90/01069; amplificação de reação em cadeia de ligase como revelada em EP-A-320308; amplificação de reação em cadeia de ligase por preenchimento de espaços vazios como revelada na Patente US5427930; e a amplificação de sem transcrição de RNA NASBA™, como revelada na Patente US6025134.

[0140] Métodos para preparar e utilizar sondas e primers de ácidos nucléicos são descritos, por exemplo, por Sambrook e outros, (ed.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Ed.., Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, EUA, 1989, capítulos 9 e 11; e Ausubel e outros. Short Protocols in Molecular Biology, 4a Ed., John Wiley & Sons, Inc., 1999; e Innis e outros, PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc., San Diego, CA, EUA, 1990. Pares de primers de amplificação podem ser derivados de uma seqüência conhecida, por exemplo, utilizando-se programas de computador feitos para este propósito, tal como o Primer (Versão 0,5, © 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, MA, EUA). O versado na técnica irá notar que a especificidade de uma sonda ou de um primer particular aumenta com o seu comprimento. Assim, para se obter maior especificidade, as sondas e os primers podem ser selecionados compreendendo ao menos 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 ou mais nucleotídeos consecutivos de uma seqüência de nucleotídeos alvo.

[0141] Proteína: Uma molécula biológica, particularmente um polipeptídio, expressa por um gene e compreendida de aminoácidos.

[0142] Purificado: O termo “purificado” não requer pureza absoluta; ao revés, pretende ser um termo relativo. Assim, por exemplo, uma preparação de proteínas purificada é aquela em que a proteína em questão seja mais pura do que em seu ambiente natural dentro de uma célula. Geralmente, uma preparação de proteínas é purificada de forma que a proteína represente ao menos 50% do conteúdo total em proteína da preparação.

[0143] Ácido nucléico recombinante: Uma molécula de ácido nucléico que não ocorra naturalmente ou que tenha uma seqüência que seja feita de uma combinação artificial de dois outros segmentos de seqüência que normalmente são separados. Essa combinação artificial é obtida por síntese química ou, mais comumente, através da manipulação artificial de segmentos isolados de ácidos nucléicos, por ex., por técnicas de engenharia genética descritas por Sambrook e outros, (ed.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Ed.., Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, EUA, 1989. O termo “recombinante” inclui ácidos nucléicos que tenham sido alterados unicamente por adição, substituição ou remoção de uma porção de uma molécula de ácido nucléico natural.

[0144] Seqüências ou elementos reguladores: Esses termos se referem geralmente a uma classe de seqüências de DNA que influencia ou controla a expressão de genes. Incluídos nos termos estão os promotores, enhancers, regiões controladoras de lócus (LCRs), isolantes/elementos de fronteira, silenciadores, regiões de associação à matriz (MARs, também referidas como regiões de associação ao suporte), repressores, terminações transcricionais, origens de replicações, centrômetros, e locais de mais recombinação meiótica. Promotores são seqüências de DNA perto da extremidade-5’ de um gene que atuem como um local de ligação para RNA polimerase dependente de DNA, e a partir do qual a transcrição seja iniciada. Enhancers são elementos de controle que elevam o nível de transcrição de um promotor, usualmente independentemente da orientação do enhancer ou de sua distância do promotor. Os LCRs conferem expressão de tecido- específico e regulada temporalmente aos genes aos quais estejam ligados. Os LCRs funcionam independentemente de sua posição em relação ao gene, mas são dependentes do número de réplicas. Acredita-se que eles funcionam para abrir a estrutura nucleossômica, de modo que outros fatores possam se ligar ao DNA. Os LCRs podem também afetar o tempo e o uso de origem da replicação. Os isolantes (também conhecidos como elementos de fronteira)) são seqüências de DNA que previnem a ativação (ou desativação) da transcrição de um gene, ao bloquearem os efeitos da cromatina circundante. Os silenciadores e os repressores são elementos de controle que suprimem a expressão de genes; eles atuam sobre um gene independentemente de sua orientação ou posição em relação ao gene. Os MARs são seqüências dentro do DNA que se ligam ao suporte nuclear; eles podem afetar a transcrição, possivelmente pela separação de cromossomos em domínios reguladores. Acredita-se que os MARs intermediam estruturas de ordem maior, de laço, dentro dos cromossomos. Terminações transcricionais são regiões nas vizinhanças do gene em que RNA polimerase é liberada do molde. Origens de replicação são regiões do genoma onde, durante a síntese de DNA ou a fase de replicação de divisão celular, começa o processo de replicação de DNA. Locais de mais recombinação meiótica são regiões do genoma que se recombinam mais freqüentemente do que a média durante a meiose.

[0145] Replicon: Qualquer elemento genético (por ex., plasmídeo, cromossomo, vírus) que funcione como uma unidade auto-replicadora autônoma de replicação de DNA in vivo.

[0146] Amostra: Uma porção, um pedaço ou segmento que seja representativo de um todo. Este termo abrange qualquer material, inclusive, por exemplo, as amostras obtidas de um animal, vegetal, ou do ambiente.

[0147] Uma “amostra ambiental” inclui uma amostra obtida de objetos inanimados ou de reservatórios dentro de um ambiente fechado ou aberto. As amostras ambientais incluem, mas não se limitam a: solo, água, poeira e amostras de ar; amostras em pacote, incluindo materiais de construção, móveis, e conteúdos de aterro sanitário; e outras amostras de reservatório, tais como resíduos animais, grãos de colheita e alimentos.

[0148] Uma “amostra biológica” é uma amostra obtida de um sujeito vegetal ou animal. Como utilizadas aqui, as amostras biológicas incluem todas as amostras úteis à detecção de infecções virais em sujeitos, incluindo, mas não se limitando a: células, tecidos e fluidos corporais, tais como o sangue; derivações e frações do sangue (tal como o soro); galhas extraídas; tecido de biópsia ou removido cirurgicamente, incluindo tecidos que sejam, por exemplo, não fixos, congelados, fixos em formalina e/ou presos em parafina; lágrimas, leite; crostas de pele; lavagens de superfície; urina; catarro; fluido cérebro-espinhal; fluido da próstata; pus; aspirados de medula óssea; BAL; saliva; swabs cervicais; swabs vaginais; lavagem orofaringeal.

[0149] Identidade de seqüência: A semelhança entre duas seqüências de ácidos nucléicos, ou entre duas seqüências de aminoácidos, é expressa em termos da similaridade entre as seqüências, também referida como identidade de seqüência. A identidade de seqüência é freqüentemente medida em termos do percentual de identidade (ou similaridade ou homologia); quanto mais alto o percentual, mais semelhantes são as duas seqüências.

[0150] Métodos de alinhamento de seqüências para comparação são bem conhecidos na técnica. Vários programas e algoritmos de alinhamento são descritos em: Smith e Waterman (Adv. Appl. Math., 2:482, 1981); Needleman e Wunsch (J. Mol. Biol., 48:443, 1970); Pearson e Lipman (Proc. Natl. Acad. Sci., 85:2444, 1988); Higgins e Sharp (Gene, 73:237-44, 1988); Higging e Sharp (CABIOS, 5:151-53, 1989); Corpet e outros (Nuc. Acids Res., 16: 10881-90, 1988); Huang e outros (Comp. Appls. Biosci., 8:155-65, 1992); e Pearson e outros (Meth. Mol. Biol., 24:307-31, 1994). Altschul e outros (Nature Genet., 6:119-129, 1994) apresentam uma consideração detalhada sobre métodos de alinhamento de seqüência e cálculos de homologia.

[0151] As ferramentas de alinhamento ALIGN (Meyers e Miller, CABIOS 4:11-17, 1989) ou LFASTA (Pearson e Lipman, 1988) podem ser utilizadas para realizar comparações de seqüência (Internet Program © 1996, W. R. Pearson e a Universidade de Virginia, “fasta20u63” versão 2.0u63, data de lançamento Dezembro 1996). O ALIGN compara seqüências inteiras umas às outras, enquanto que o LFASTA compara regiões de similaridade local. Essas ferramentas de alinhamento e seus respectivos tutoriais estão disponíveis na Internet no site da NCSA. Alternativamente, para comparações de seqüências de aminoácidos de mais de aproximadamente 30 aminoácidos, a função “Blast 2 sequences” pode ser empregada utilizando- se o conjunto matricial BLOSUM62 padrão configurado nos parâmetros padrão (custo de abertura de intervalos de 11, e um custo de intervalo por resíduo de 1). Quando se alinha peptídeos curtos (menos do que aproximadamente 30 aminoácidos), o alinhamento deve ser realizado utilizando-se as funções “Blast 2 sequences”, empregando-se o conjunto matricial PAM30 configurado nos parâmetros padrões (penalidades de intervalo aberto de 9, e de extensão de intervalo de 1). O sistema de comparação de seqüências BLAST está disponível, por exemplo, no website da NCBI; ver também Altschul e outros, J. Mol. Biol., 215:403-10, 1990; Gish e States, Nature Genet., 3:266-72, 1993; Madden e outros, Meth. Enzymol., 266:131-41, 1996; Altschul e outros, Nucleic Acids Res., 25:3389-402, 1997; e Zhang e Madden, Genome Res., 7:649-56, 1997.

[0152] Os ortólogos (equivalentes às proteínas de outras espécies) de proteína são em alguns casos caracterizados por possuírem uma identidade de seqüência de mais de 75% contada ao longo do comprimento inteiro do alinhamento com a seqüência de aminoácidos de proteínas específicas utilizando-se o ALIGN com os parâmetros padrões. Proteínas até com mais similaridade a uma seqüência de referência irão apresentar maiores percentuais de identidade quando avaliadas por este método, tais como ao menos 80%, ao menos 85%, ao menos 90%, ao menos 92%, ao menos 95%, ou ao menos 98% de identidade de seqüência. Além disso, a identidade de seqüência pode ser comparada ao longo do comprimento inteiro de cada ou de ambos os domínios de ligação das proteínas de fusão reveladas.

[0153] Quando significativamente menos do que a seqüência inteira estiver sendo comparado quanto à identidade de seqüência, as seqüências homólogas irão tipicamente possuir ao menos 80% de identidade de seqüência ao longo de janelas curtas de 10-20, e podem possuir identidades de seqüência de ao menos 85%, ao menos 90%, ao menos 95% ou ao menos 99%, dependendo de sua similaridade com a seqüência de referência. A identidade de seqüência sobre tais janelas curtas pode ser determinada utilizando-se o LFASTA; métodos são descritos no site da NCSA. O versado na técnica irá perceber que essas faixas de identidade de seqüência são fornecidas a título de orientação apenas; é inteiramente possível que homólogos com força significativa possam ser obtidos que estejam fora das faixas fornecidas. Conceitos semelhantes de homologia se aplicam aos ácidos nucléicos como descritos para as proteínas. Um indicador alternativo de que duas moléculas de ácidos nucléicos sejam proximamente relacionadas é quando as duas moléculas se hibridizam uma à outra sob condições rigorosas.

[0154] Seqüências de ácidos nucléicos que não apresentem um alto grau de identidade podem assim mesmo codificar seqüências de aminoácidos similares, devido à degeneração do código genético. Deve ser entendido que mudanças na seqüência de ácido nucléico podem ser feitas utilizando-se essa degeneração para produzir múltiplas seqüências de ácidos nucléicos que codifiquem substancialmente a mesma proteína.

[0155] Agente de ligação específico: Um agente que se ligue substancialmente somente a um alvo definido. Portanto, um agente de ligação de proteína-específica se liga substancialmente somente à proteína específica, ou a uma região específica dentro da proteína. Como utilizados aqui, os agentes de ligação de proteína-específica incluem anticorpos e outros agentes que se liguem substancialmente a um polipeptídio específico. Os anticorpos podem ser anticorpos monoclonais ou poli-clonais que sejam específicos para o polipeptídio, assim como porções (“fragmentos”) imunologicamente eficazes destes.

[0156] A determinação se um agente particular se liga substancialmente apenas a um polipeptídio específico pode ser feita prontamente utilizando-se ou adaptando-se procedimentos de rotina. Exemplos de testes in vitro que fazem uso do procedimento Western blot incluem o IFA e o Ag-ELISA, e são descritos em muitos textos convencionais, incluindo Harlow e Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, CSHL, Nova York, EUA, 1999.

[0157] Transformada: Uma célula “transformada” é uma célula na qual foi introduzida uma molécula de ácido nucléico por técnicas de biologia molecular. O termo abrange todas as técnicas através das quais uma molécula de ácido nucléico possa ser introduzida dentro de uma célula, incluindo transfecção com vetores virais, transformação com vetores de plasmídeos, e a introdução de “DNA nu” por eletroporação, lipofecção, e aceleração de pistola de partículas.

[0158] Vetor: Uma molécula de ácido nucléico como introduzida dentro de uma célula hospedeira, desse modo produzindo uma célula hospedeira transformada. Um vetor pode incluir seqüências de ácidos nucléicos que permitam que ele se replique em uma célula hospedeira, tal como uma origem de replicação (seqüências de DNA que participam no início da síntese de DNA). Um vetor pode incluir um ou mais genes marcadores selecionáveis e outros elementos genéticos conhecidos na técnica.

[0159] Vírus: Organismo infeccioso microscópico que reproduza células vivas internas. Um vírus tipicamente consiste essencialmente em um núcleo de um único ácido nucléico circundado por uma camada de proteína, e tem a habilidade de se replicar somente dentro de uma célula viva. “Replicação viral” é a produção de vírus adicional pela ocorrência de ao menos um ciclo de vida viral. Um vírus pode corromper as funções normais da célula hospedeira, fazendo com que a célula se comporte de uma maneira determinada pelo vírus. Por exemplo, uma infecção viral pode resultar em uma célula produzindo uma citocina, ou reagindo a uma citocina, enquanto a célula não infectada normalmente não o faz.

[0160] Embora métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos descritos aqui possam ser utilizados na prática ou testando-se a presente invenção, métodos e materiais adequados são descritos abaixo.

[0161] Todas as publicações, os pedidos de patente, patentes e outras referências mencionadas aqui são incorporadas como referências em suas totalidades. Em caso de conflito, a presente descrição, incluindo a explanação dos termos, assumirá o controle. Além disso, os materiais, métodos e exemplos são ilustrativos apenas e não pretendem ser limitativos.

IV. Descrição Geral de Diversas Modalidades

[0162] É fornecido aqui em uma primeira modalidade um genoma de vírus da raiva recombinante compreendendo o ácido nucléico como apresentado na SEQ ID NO: 1 (comprimento completo da seqüência da ERA). São também fornecidas proteínas do vírus da raiva codificadas por esse genoma, incluindo proteínas específicas que compreendem uma seqüência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID NO: 2 (proteína N); SEQ ID NO: 3 (proteína P); SEQ ID NO: 4 (proteína M); SEQ ID NO: 5 (proteína G); ou na SEQ ID NO: 6 (proteína L); e moléculas de ácidos nucléicos isoladas que codificam tais proteínas. A título de exemplo, tais moléculas de ácidos nucléicos isoladas compreendem uma seqüência de nucleotídeos como apresentada em: nucleotídeos 71-1423 da SEQ ID NO: 1 (proteína N); nucleotídeos 1511-2407 da SEQ ID NO: 1 (proteína P); nucleotídeos 2491-3104 da SEQ ID NO: 1 (proteína M); nucleotídeos 3318-4892 da SEQ ID NO: 1 (proteína G); ou os nucleotídeos 5418-11.801 da SEQ ID NO: 1 (proteína L).

[0163] É também fornecido um genoma de vírus recombinante com a seqüência de ácido nucléico como apresenta na SEQ ID NO: 7, que difere da SEQ ID NO: 1, em virtude da remoção de um resíduo de adenosina na cauda Poli-A entre o gene da G e a região-psi. A SEQ ID NO: 7 também codifica as proteínas como mostradas nas SEQ ID NOs: 2-6.

[0164] São também fornecidos genomas de derivados da linhagem ERA do vírus, como mostrado nas SEQ ID NOs: 8-18. Em certas modalidades, os genomas estão presentes em um vetor, tal como um plasmídeo.

[0165] Ainda outra modalidade descrita é um sistema para o seqüenciamento do comprimento completo de genomas do vírus da raiva através da utilização de um método descrito aqui. Sistemas de vetores virais para a expressão de proteínas heterólogas são também descritos.

[0166] Uma outra modalidade fornece composições que compreendem uma ou mais moléculas de ácido nucléico, uma ou mais proteínas, fornecidas aqui. Opcionalmente, tais composições contêm um portador farmaceuticamente aceitável, um adjuvante, ou uma combinação de dois ou mais destes.

[0167] É também fornecido um método para provocar uma reação imunológica contra um epitopo antigênico em um sujeito, compreendendo a introdução dentro do sujeito de uma composição que compreenda um nucleotídeo, peptídeo, ou polipeptídio descrito aqui, desse modo provocando uma reação imunológica no sujeito.

[0168] Um outro aspecto da divulgação se refere a um sistema de vetores para produzir vírus da raiva recombinantes. O sistema de vetores inclui um primeiro vetor (vetor de transcrição) que contém um comprimento completo de DNA antigenômico de vírus da raiva (ou um derivado deste) e um conjunto de vetores auxiliares contendo ácidos nucléicos que codifiquem ao menos uma proteína da linhagem ERA do vírus da raiva. A expressão dos vetores em uma célula hospedeira transfectada resulta na produção de um vírus da raiva recombinante vivo. Em certas modalidades, o DNA antigenômico é da linhagem ERA (por exemplo, SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 7) ou de um derivado desta, tal como uma das SEQ ID NOs: 8-18. Em certas modalidades, os vetores são plasmídeos.

[0169] Para facilitar a recuperação do comprimento total de RNA viral, o vetor de transcrição pode incluir, em uma direção de 5’ a 3’: uma ribozima de cabeça-de-martelo; um cDNA antigenômico de vírus da raiva; e uma ribozima de vírus delta da hepatite. Os nucleotídeos da ribozima de cabeça- de-martelo são selecionados para serem complementares à seqüência genômica anti-sense do vírus da raiva. A transcrição do cDNA antigenômico fica sob o controle regulatório de transcrição de ao menos um dentre o promotor de CMV e o promotor de RNA polimerase do fago T7, e comumente sob o controle de ambos esses promotores.

[0170] Os vetores auxiliares tipicamente incluem um vetor que compreende uma seqüência de polinucleotídeos que codifica uma proteína N do vírus da raiva; um vetor que compreende uma seqüência de polinucleotídeos que codifica uma proteína M do vírus da raiva; um vetor que compreende uma seqüência de polinucleotídeos que codifica uma proteína L do vírus da raiva; e um vetor que compreende uma seqüência de polinucleotídeos que codifica uma RNA polimerase do fago T7. Em uma modalidade, a RNA polimerase do T7 compreende um sinal de localização nuclear (NLS). Opcionalmente, o sistema de vetores pode incluir também um vetor que compreenda uma seqüência de nucleotídeos que codifique uma proteína G do vírus da raiva.

[0171] A transcrição de uma ou mais das seqüências de polinucleotídeos que codificam a proteína P, M, L ou G do vírus da raiva, ou a polimerase de T7 está sob o controle regulatório de transcrição tanto do promotor de CMV como do promotor de T7. Em contraste, a transcrição da seqüência de polinucleotídeos que codifica a proteína N do vírus da raiva fica sob o controle regulatório de transcrição do promotor de T7, e a transcrição é independente de cap.

[0172] Ainda mais outras modalidades são vacinas de raiva vivas, cada uma compreendendo um genoma de vírus da raiva recombinante como fornecido aqui. Exemplos de tais genomas da raiva recombinantes compreendem a seqüência mostrada como ERA G333 (SEQ ID NO: 10). Opcionalmente, a vacina da raiva é atenuada.

[0173] É também fornecido um método de produção de um vírus da raiva vivo (por exemplo, para uso em uma composição imunogênica, tal como uma vacina) através da introdução do sistema de vetores dentro de uma célula hospedeira. Após a transfecção do sistema de vetores para dentro de uma célula hospedeira adequada, o vírus vivo e opcionalmente atenuado é recolhido. A produção e a administração de uma vacina da raiva viva produzida por tais métodos são também previstas aqui.

[0174] É também revelado um método de vacinação de um sujeito contra a raiva, em que o método compreende a administração de uma quantidade eficaz da vacina de raiva viva de acordo com a descrição fornecida ao sujeito, de modo que as células do sujeito sejam infectadas com a vacina da raiva, quando então uma reação imunológica anti-rábica é produzida no sujeito. Em uma modalidade, o sujeito é um ser humano. Em outra modalidade, o sujeito é um animal não-humano. Por exemplo, o animal não-humano em alguns casos é um gato, cão, rato, camundongo, morcego, raposa, guaxinim, esquilo, gambá, coiote ou lobo.

[0175] Em certas modalidades, a vacina da raiva é administrada entericamente. Por exemplo, a administração entérica em alguns casos compreende a administração oral. A administração oral inclui administração através de iscas de comida projetadas para vacinar populações de animais selvagens, por exemplo.

[0176] Composições farmacêuticas que incluem as vacinas da raiva vivas (por exemplo, uma vacina de raiva viva atenuada) e um portador ou excipiente farmaceuticamente aceitável são também fornecidos.

V. Método de Seqüenciamento do Genoma de Lyssavirus Inteiro

[0177] Para facilitar o seqüenciamento do comprimento completo do genoma ERA, um método para seqüenciar um vírus de RNA de filamento negativo de comprimento completo foi desenvolvido. Esse método é aplicável ao seqüenciamento de um lyssavirus, tal como um vírus da raiva, assim como outro vírus de RNA de filamento negativo. O vírus da raiva é um vírus de RNA de filamento negativo simples com um genoma de aproximadamente 12 kb, com a faixa entre 11,918 (lyssavirus do morcego Australiano) e 11,940 (vírus Mokola). As seqüências de ácidos nucléicos virais da raiva no GENBANK focalizam principalmente as seqüências que codificam proteínas—proteína de nucleocapsídeo (N), glicoproteína (G), fosfoproteína (P) e genes de proteína matricial (M), que ficam perto da extremidade 3’ do genoma. A análise filogenética prévia é principalmente baseada nos genes de N e G. Mas, para linhagens virais de raiva remotamente relacionadas, o gene (L) da RNA polimerase dependente de RNA é o candidato mais adequado para a análise filogenética. Infelizmente, poucas seqüências de genes (L) estão disponíveis em bases de dados de genes públicas. Além disso, foi proposto que tanto as regiões líderes quanto as seguidoras nas terminações virais rábicas desempenham papéis muito importantes para (a regulação da) transcrição e replicação viral. Estas podem ser as regiões conservadas para a encapsidação de nucleoproteína ou os locais de ligação para proteínas L/P, por exemplo. Também as regiões inter- gênicas entre a líder -N, N-P, P-M, M-G, a região de pseudo-gene e a G-L servem como os sinais para a iniciação da transcrição viral. Portanto, não apenas regiões codificadas, mas também regiões não-codificadas dentro do mesmo genoma viral, poderiam ser aplicadas à análise filogenética ou à pesquisa de evolução. Todas essas seqüências podem ser analisadas mais prontamente utilizando-se os métodos de seqüenciamento de genoma inteiro fornecidos aqui.

[0178] O método inclui uma transcrição reversa de uma etapa e uma clonagem de duas etapas em um vetor adequado. Esse método produz um genoma prontamente seqüenciado no vetor, sem a necessidade de se realizar reações RT-PCR repetidas tendentes a erros. Explorando as repetições invertidas encontradas nas extremidades do genoma rábico (e do genoma de outros lyssavirus), foram desenvolvidos primers universais e são descritos aqui para uso nos procedimentos de seqüenciamento rápido de genoma completo descritos aqui.

[0179] As regiões líderes e as regiões seguidoras no vírus da raiva contêm sinais para a transcrição e replicação viral. Com base na análise da seqüência de genomas disponível na GenBank, os nucleotídeos da terminal 11 são rigorosamente conservados em vírus da raiva ou em vírus relacionados à raiva, incluindo o vírus Mokola. O raciocínio por trás dos métodos de seqüenciamento fornecidos aqui se baseia nos nucleotídeos complementares da terminal 11. Como essas duas seqüências de nucleotídeos 11 são complementares, elas poderiam não ser utilizadas nas reações PCR seguintes. Deve ser entendido que outros vírus com repetições invertidas podem ser semelhantemente amplificados através da utilização de primers correspondentes às seqüências daquelas repetições. Os nucleotídeos de antigenoma senso 11 foram projetados como primers de transcrição reversa para o genoma purificado da ERA, cuja integridade foi verificada por comparação de tamanho e Northern Blot. Todo o genoma de cDNA foi confirmado também por Northern Blot com sondas de genes N, P, M, G, L e nucleotídeos 11 por uma sonda de oligonucleotídeos, que apenas ligava RNA genômico, e não mRNA viral.

[0180] É razoavelmente viável a transcrição reversa do genoma viral rábico inteiro em uma reação, utilizando-se cuidadosamente primers de seqüências-correspondentes de terminal conservados, desde que a qualidade da preparação do genoma viral sela alta.

[0181] A seqüência da ERA é proximamente relacionada à da SAD, que é de suas derivadas. Isso não é surpreendente, porque a ERA foi enviada da CDC nos anos da década de 1970 para a Suíça, onde pesquisadores a adaptaram para que crescesse em células, antes de a enviarem para a Alemanha, onde foi mais uma vez derivada, e a derivação foi totalmente seqüenciada em ~ 1990. Até hoje, os vírus da raiva e relacionados à raiva têm sido classificados em sete tipos diferentes: o vírus da raiva clássico tipo1 (ERA está incluída), tipo2 (morcego Lagos), tipo3 (Mokola), tipo4 (Duvenhage), tipo5 (lyssavirus do morcego Europeu (EBL) I), tipo6 (EBL II) e tipo7 (vírus do morcego da Austrália) de acordo com proteção cruzada de soro e estudos de genética. A análise de seqüências desempenha um papel importante na filogenética, na pesquisa de evolução, em estudos de previsão da função de genes, e outras áreas relacionadas, incluindo a localização de regiões reguladoras de transcrição e replicação viral, e, portanto, a bioinformática voltada para potenciais drogas terapêuticas.

[0182] Com o desenvolvimento de técnicas na reação em cadeia de polimerase de transcrição reversa (PCR-TR), que são conhecidas pelos versados na técnica, é atualmente relativamente fácil fazer a transcrição reversa de até 12 kb ou mais de RNA para cDNA em uma reação. Sob condições ideais, a PCR pode amplificar alvos de mais de 30 kb em uma reação.

[0183] Com o fornecimento aqui de métodos para gerar seqüências de genoma de vírus de comprimento completo, em particular seqüências de genomas da raiva, torna-se atualmente prática a análise de diferentes linhagens de vírus. A concepção eficaz de vírus atenuados, por exemplo para uso na imunização ou na produção de composições imunologicamente estimuladoras e vacinas, é também permitida utilizando-se os genomas de comprimento completo resultantes.

[0184] Não existe o genoma “geral” do vírus da raiva, mas esses genomas estão relacionados. As similaridades estão entre 60% e 100% nos diferentes tipos. Algumas regiões, tais como a do gene L, parecem ser mais conservadas, enquanto que outras, tais como a região psi, que não codifica um polipeptídio, são mais variáveis. Os vírus da raiva e os relacionados à raiva não só irão variar, mas também qualquer vírus de RNA irá mudar com o tempo. Como os vírus se adaptam e surgem é uma questão em aberto. Por este motivo, a análise de seqüências de genomas inteiros é importante para os estudos evolucionários, sobre patogenia e sobre a função de genes.

[0185] Esse sistema descrito aqui é o primeiro para o vírus da raiva no que diz respeito ao seqüenciamento de genomas completo. Acredita-se que pode ser útil para outros vírus de RNA, particularmente no gênero lyssavirus. Atualmente, para os estudos filogenéticos do vírus da raiva, os cientistas fazem uso somente dos genes N, P ou G, que são mais abundantes nas células ou tecidos infectados. Sabe-se que para a comparação de linhagens remotas, o gene L compreendendo mais da metade do genoma pode ser o local candidato ideal, o que deve ser usado. Infelizmente, tais comparações evolucionárias não são possíveis devido aos dados disponíveis serem muito limitados, ainda mais quanto à seqüência de genoma completo. Também para os estudos sobre transcrição e replicação viral, supõe-se que as regiões líderes e as seguidoras localizadas nas extremidades 3’ e 5’ do genoma desempenhem papéis importantes. As regiões inter-gênicas são também os sinais para estudos de cis e trans viral. Todos esses dados são bastante limitados, porque não estão incluídos no mRNA. Somente a seqüência de genoma completa pode fornecer a informação necessária neste nível. O seqüenciamento de genomas completos não só é útil para o desenvolvimento de vacinas, mas também é aplicável para os estudos sobre transcrição e replicação básicas de vírus. É também igualmente aplicável ao desenvolvimento de siRNA e terapia de genes. VI. Seqüência do Genoma da ERA

[0186] Utilizando o método descrito aqui, a seqüência única do genoma do vírus da raiva ERA foi gerada. Esta seqüência é mostrada na SEQ ID NO: 1. As cinco proteínas do vírus da raiva ERA (SEQ ID NOs: 2-6) são codificadas nas seguintes posições do genoma: N, 71-1423; P, 1511-2407; M, 2491-3104; G, 3318-4892; e L, 5418-11801. A homologia entre ERA e SAD-B19 são: N 99,56%, P 98,65%, M 96,53%, G 99,05% e L 99,20%, respectivamente. Uma diferença específica entre a ERA e a SAD-B19 é a região intergênica entre G e o pseudo-gene, com o sinal de parada/poliadenilação de transcrição da SAD-B19 destruído.

[0187] A seqüência do genoma completo do vírus da raiva ERA é pré- requisito para o desenvolvimento de vacinas e para os estudos de patogenia através da utilização de genética reversa. VII. Sistema Otimizado para a Produção de Vírus

[0188] Os exemplos 6 e 7 fornecem um conjunto de condições ideais para a produção de vírus da ERA, em que os títulos atinjam até 1010 ffu por ml. Em bioreatores, o vírus resgatado pode crescer em ~109 a 1010 ffu/ml. tais elevados níveis de produção são da maior importância para o desenvolvimento de vacinas orais, de modo que se possa produzir material de vacina suficiente em uma quantidade de tempo razoável com uma alocação de recursos razoável.

[0189] As condições de crescimento fornecidas podem produzir estavelmente tal título de vírus elevado para ambas as linhagens parenteral e ERA. Esses dados de produção são muito importantes for o potencial desenvolvimento de vacinas de raiva orais. VIII. Linhagem de Células BSR-G para a Produção de Vírus -G

[0190] Embora linhagens do VR com remoções da proteína G tenham sido previamente resgatadas a partir de células de BHK, isso não foi possível com vírus da linhagem ERA sem a proteína G. Após a inoculação intra-cerebral ou intramuscular de camundongos com ERA-G, nenhum camundongo morreu ou mostrou qualquer sintoma de raiva.

[0191] A ERA-G (sem glicoproteína) só pode crescer em células com a suplementação da glicoproteína. Caso contrário, o vírus mutante não pode se espalhar. Para ajudar no crescimento da ERA-G, uma linhagem de células BSR-G foi estabelecida, que expressa constitutivamente a glicoproteína da ERA. A produção dessa linhagem de células é descrita nos Exemplos abaixo. Essa linhagem de células é útil para a recuperação de linhagens do VR tais como a ERA-G que sejam refratárias à recuperação na ausência da G, assim como para a otimização da recuperação de outros sinais. IX. Sistema de Genética Reversa para Vacinas de Vírus da Raiva de Engenharia e Expressão de Proteínas Heterólogas

[0192] O RNA não pode ser prontamente manipulado diretamente por métodos de biologia molecular. As vacinas de vírus de RNA tradicionais são de isolados naturalmente atenuados, que são difíceis de controlar e apresentam resultados imprevisíveis. A tecnologia da genética reversa torna possível manipular vírus de RNA como DNA, que pode sofrer mutação, remoção e reconstrução de acordo com concepções deliberadas. Cada função dos genes pode ser estudada cuidadosamente, independentemente, e em conjunto, o que beneficia o desenvolvimento de vacinas. A genética reversa envolve a transcrição reversa do genoma viral de RNA em cDNA, e a clonagem em um vetor, tal como um plasmídeo. Após a transfecção das células hospedeiras, o vetor é transcrito em RNA, a ser encapsidade por proteínas estruturais, que também podem ser supridas por plasmídeos. O RNA encapsidado forma um complexo de ribonucleoproteína, resultando em partículas de vírus que podem ser resgatadas.

[0193] Embora três sistemas para a genética reversa do vírus da raiva (VR) tenham sido publicados (Schnell e outros, The EMBO J. 13, 41954203, 1994; Inoue e outros, J. Virol. Method. 107, 229-236, 2003; Ito e outros, Microbiol. Immunol. 47, 613-617, 2003), esses sistemas não são prontamente adaptáveis a outras linhagens. Atualmente, nenhuma linhagem do vírus da raiva foi resgatada com o auxílio de plasmídeos auxiliares de uma linhagem diferente, nem mesmo quando as linhagens são proximamente relacionadas. Assim, para qualquer mutação específica de linhagens do vírus ou para o desenvolvimento de vacinas, um sistema modelado especificamente tem que ser desenvolvido.

[0194] A linhagem ERA é uma boa candidata para o desenvolvimento de vacinas orais para a raiva, mas sua patogenia residual é óbvia. Durante os anos da década de 1970, o VR da ERA passou por extenso desenvolvimento de vacinas (Black e Lawson, Can. J. Comp. Med. 44:169-176, 1980; Charlton e Casey, Can. J. Vet. Res. 20:168-172, 1978; Lawson e Crawley, Can. J. Vet. Res. 36:339-344, 1972). Tanto a ERA como a SAD-B19 são derivadas da SAD. Em testes de vacinas orais preliminares, a SAD-B19 foi eficaz em guaxinins e também em gambás, enquanto que a ERA não foi. Adicionalmente, a ERA mata camundongos de duas semanas de idade administrados por via intra-cerebral (i.c.), como demonstrado em testes com animais. Essas observações levantam dúvidas sobre o relacionamento dessas duas linhagens do VR e sobre os potenciais efeitos de alterações sutis. A partir de uma comparação da seqüência de genoma viral completa, a ERA e a SAD-B19 compartilham identidades de nucleotídeos extremamente altas e homologias de aminoácidos. Para clarificar a fundamentação genética da imunogenicidade e da patogenicidade dessas linhagens altamente relacionadas do vírus da raiva, um sistema de genética reversa eficiente foi desenvolvido para a ERA, diferente dos sistemas de genética reversa relatados previamente para o vírus da raiva.

[0195] O sistema de genética reversa da raiva revelado aqui é útil para uma variedade de propósitos, incluindo: (1) atenuar o vírus da ERA de uma maneira definida para o desenvolvimento de vacinas; (2) produzir vetores de vírus da ERA para expressar ORFs heterólogos (por ex., no contexto de composições terapêuticas, tais como vacinas e terapia genética.); (3) definir a base geral da patogênese do VR da ERA; e (4) determinar os efeitos biológicos das diferenças genéticas entre os vírus da ERA e da SAD.

[0196] O sistema de genética reversa possui algumas ou todas as características seguintes, ilustradas esquematicamente na Fig. 1A utilizando- se o cDNA antigenômico da linhagem ERA exemplificativo.

[0197] Esse sistema é baseado em um plasmídeo de transcrição de comprimento completo e mais uma pluralidade de plasmídeos auxiliares (por ex., cinco plasmídeos auxiliares). Os plasmídeos auxiliares codificam as proteínas N, P, L e opcionalmente a proteína G, assim como a polimerase de T7. Embora a proteína G não seja necessária para o resgate do vírus, ela melhora a eficiência da recuperação de vírus ou a germinação de vírus quando incluída na transfecção.

[0198] A transcrição envolve tanto a RNA polimerase II dependente de RNA, que é disponível nas células dos mamíferos, como a polimerase do T7, que é suprida por plasmídeos pNLST7. A polimerase dual resulta em uma eficaz recuperação de vírus que é alta e também estável.

[0199] No plasmídeo de transcrição, ribozimas de cabeça-de-martelo e do vírus delta da hepatite abordam um cDNA antigenômico de vírus da raiva (por ex., linhagem ERA), permitindo a produção de extremidades 5’ e 3’ autênticas de vRNA genômico por transcrição. Os dez primeiros nucleotídeos da seqüência em cabeça-de-martelo são projetados para serem complementares aos dez primeiros nucleotídeos da seqüência genômica anti- senso. Por exemplo, os dez primeiros nucleotídeos da seqüência em cabeça- de-martelo para o cDNA antigenômico da ERA são: TGTTAAGCGT (SEQ ID NO: 19).

[0200] Duas construções de RNA polimerase do T7 modificadas foram estabelecidas, as quais suportam a recuperação de vírus mais eficientemente do que a RNA polimerase do T7 do tipo selvagem aplicada anteriormente. Uma RNA polimerase do T7 passou por mutação do primeiro ATG para AT. A segunda RNA polimerase do T7 tem um sinal de localização nuclear (NLS) de oito aminoácidos derivada do antígeno SV40 T grande de vírus fundida depois do primeiro ATG a partir do T7 mãe: ATG CCA AAA AAG AAG AGA AAG GTA GAA (SEQ ID NO: 20). O NLS está sublinhado. A adição do NLS resulta na RNA polimerase do T7 estando presente predominantemente no núcleo. Após o mecanismo de transfecção do plasmídeo de NLS modificado, o complexo de reagentes de transfecção de DNA se une à superfície da célula. Através de endocitose, o complexo é trazido até o endossomo/lisossomo, e o DNA é liberado para dentro do citosol. Na ausência do NLS, a maior parte dos plasmídeos transfectados fica retida no citosol e apenas uma porcentagem pequena do DNA liberado atinge o núcleo, onde é transcrito em RNA. Após a síntese de proteínas, a RNA polimerase do NLST7 é transportada de volta ao núcleo da célula, e os plasmídeos auxiliares (com promotores de T7/CMV) no núcleo serão transcritos por ambas as polimerases do NLST7 e celular II. Assim, mais mRNAs dos plasmídeos auxiliares e cRNA do pTMF de comprimento completo ou seus derivados foram sintetizados e resultaram na alta eficiência do resgate de vírus.

[0201] Após a expressão inicial do NLST7 pelo promotor de CMV, a polimerase do NLST7 se liga ao pT7 para a transcrição do gene do NLST7. Através da modificação dos transcritores no núcleo, mais mRNA de NLST7 é sintetizado, o que resulta em mais expressão de polimerase de NLST7. O pT7 da polimerase de NLST7 assim como o da unidade de transcrição de antigenômica de comprimento completo fica sob o controle da polimerase de NLST7, que atua como um “auto-gene”. O mecanismo de auto-gene da polimerase do NLST7 é ilustrado na Fig. 2. Após a expressão da RNA polimerase de T7 no núcleo, as estruturas de T7 transfectadas continuam a transcrever o modelo de RNA de comprimento completo para encapsidação da proteína N e/ou ligação da proteína L, acentuando a eficiência da recuperação de vírus.

[0202] A polimerase de T7, e todos os outros plasmídeos, a não ser pelo plasmídeo codificador da proteína N pTN, são colocados sob o controle de ambos os elementos reguladores de transcrição de CMV e de T7. O ácido nucléico de codificação da proteína N fica sob o controle de um promotor de T7 e é traduzido de maneira cap-independente com base em um IRES (Local de Entrada de Ribossomo Interno). A RNA polimerase celular II sozinha pode ajudar na recuperação do VR se todos os plasmídeos forem clonados sob o controle do promotor de CMV (19). No sistema de genética reversa da ERA revelado aqui, apenas o pTN fica sob o controle do promotor de T7 e foi traduzido de maneira cap-independente. Todas as outras construções estão sob o controle de ambos os elementos reguladores de transcrição de CMV e de T7. Tipicamente, no VR, a síntese de N é abundante e a razão entre N, P e L é de aproximadamente 50:25:1. Para simular a transcrição viral do tipo selvagem e a montagem na genética reversa do VR, a expressão da N deve ser a mais alta. Com o auxílio da polimerase de NLST7 e do modo de tradução IRES, a proteína N foi expressa de eficientemente após a transfecção de plasmídeos. Isso reduz a competição para a transcrição com genes de manutenção em células hospedeiras, porque o sinal de iniciação de transcrição de T7 não existe em células de mamíferos, e resulta em uma maior eficiência da transcrição de T7.

[0203] Para acentuar a produção de proteínas virais, os plasmídeos auxiliares podem ser construídos para que incorporem uma seqüência de Kozac que tenha sido otimizada para a eficiência da tradução para cada seqüência de codificação de proteína. Seqüências de Kozak otimizadas exemplificativas são mostradas na Tabela 2. Tabela 2 - Seqüências de Kozak Otimizadas

[0204] CMV/T7 simboliza o promotor de CMV à frente do promotor de T7. HdRZ indica uma ribozima em cabeça-de-martelo e HDVRz é a ribozima do vírus delta da hepatite. pTMF é o plasmídeo de transcrição de comprimento completo, e PTN, pMP, pMG, pML e pNLST7 são plasmídeos auxiliares.

[0205] Depois de cinco dias pós-transfecção no sistema de genética reversa da ERA, o vírus resgatado cresceu para 107 ffu/ml de forma estável e contínua sem amplificação adicional. X. Vírus Derivados

[0206] O mecanismo completo da patogenia do vírus da Raiva não foi completamente caracterizado, o que torna o desenvolvimento racional de vacinas problemático. Por exemplo, a glicoproteína do VR parece desempenhar um papel tanto na patogenia quanto na imunogenicidade do vírus da raiva. As mutações (tais como na posição 333 da glicoproteína) resultam em vírus que não causa infecção letal em camundongos adultos (Ito e outros, Microl. Immunol. 38, 479-482, 1994; Ito e outros, J. Virol. 75, 9121-9128, 2001). Contudo, a super-expressão da glicoproteína do VR demonstrou levar à acentuação de apoptose e reação imunológica viral (Faber e outros, J. Virol. 76, 3374-3381, 2002). Portanto, o vírus da linhagem ERA com uma proteína G modificada (por exemplo, removida, com substituição de aminoácidos) poderia ser uma linhagem particular para o desenvolvimento de vacinas.

[0207] Vírus da raiva recombinantes com propriedades favoráveis podem ser projetados utilizando-se o sistema de genética reversa revelado aqui. Os vírus recombinantes exemplificativos revelados aqui incluem, além da linhagem ERA mãe, ERA sem região-Psi (ERA-), ERAverde1 (gene fluorescente verde inserido na região-Psi), ERAverde2 (gene fluorescente verde clonado na região intergênica P-M), ERAg2 (contendo uma cópia extra da G na região-Psi), ERAgm (genes M e G trocados no genoma), e ERAgmg (duas cópias da G na construção da ERAgm rearranjada). Essas linhagens exemplificativas são ilustradas esquematicamente na Fig. 3.

[0208] As linhagens modificadas possuindo glicoproteínas removidas e/ou alteradas por mutação são particularmente adequadas para o uso como composições imunogênicas para o tratamento pré- e pós- exposição do vírus da raiva porque tais vírus são incapazes de se espalhar entre células e causa doença. Adicionalmente, os vírus modificados tais como na ERA2g3, a qual super-expressa a proteína G devido a uma duplicação de seqüências que codificam uma glicoproteína alterada por mutação, acentuam a apoptose e provocam uma reação imunológica anti-viral aumentada.

[0209] Por exemplo, após inoculação intra-cerebral e intramuscular de camundongos com uma remoção da G (ERA-G), nenhum efeito adverso foi observado. Além disso, a ERA-G protegeu camundongos do desafio letal de uma linhagem de rua do VR. Assim, a ERA-G parece ser uma linhagem mais segura do que a ERA para o desenvolvimento de vacinas. Adicionalmente, a mutação da arginina na posição de aminoácido 333 da ERA-G para ácido glutâmico (dos nucleotídeos AGA para GAG, como nas linhagens ERAg3 e ERA2g3) resulta em um vírus atenuado. A atenuação foi confirmada através de testes de inoculação em animais. Como a super-expressão da G do VR resulta na acentuação da apoptose e das reações imunológicas anti-virais, vírus atenuados tais como na ERA2g3 que possuem múltiplas cópias da G são particularmente favoráveis como candidatos a vacinas.

[0210] O sistema para o desenvolvimento de vacinas da raiva descrito aqui não se limita a modificações no gene da G, e é aplicável de forma semelhante a cada uma das proteínas virais. Para facilitar uma abordagem sistemática para a modificação dos vários componentes de proteína, o mapeamento da patogenia pode ser resolvido por genética reversa com base nos dados de seqüência apresentados aqui.

[0211] O sistema de genética reversa descrito aqui também permite um sistema de vetores do vírus da raiva para a expressão de genes estranhos (heterólogos). A modalidade descrita, não-limitativa, se baseia no vírus da ERA. Uma unidade de transcrição extra é mostrada aqui sendo funcional em dois locais diferentes após a incorporação ao genoma do VR da ERA. Em uma modalidade, uma unidade de transcrição extra é incorporada na posição da região psi (trans 1). Em uma modalidade alternativa, uma unidade de transcrição extra é inserida dentro da região intergênica P-M do VR.

[0212] Em vírus de RNA negativos de filamento simples, as seqüências distais-3’ do genoma servem principalmente como um promotor de transcrição, enquanto que as seqüências de terminal-5’ do genoma servem como um promotor de replicação (Conzelmann e Schnell, J. Virol. 68:713-719, 1994; Finke et al., J. Virol. 71:7281-7288, 1997). Assim, a trans2 ocupa uma posição que resulta em uma transcrição mais forte para comandar a expressão de ORFs do que a trans1. Portanto, os vetores revelados aqui podem ser utilizados para modular a expressão de uma ORF heteróloga para um nível desejado, simplesmente selecionando a posição em que a ORF é inserida em um vetor. Por exemplo, quando um nível alto de expressão de uma proteína for desejado, a trans2 será tipicamente uma posição ideal para a inserção da ORF heteróloga. De forma semelhante, caso níveis de expressão mais moderados de expressão sejam desejados, a ORF heteróloga pode ser inserida na trans1. Os níveis de expressão ideais para cada ORF e para aplicações particulares podem ser determinados pelo versado na técnica sem experimentações indevidas.

[0213] Portanto, os vetores virais fornecidos aqui são excelentes construções para a inserção e a expressão de genes estranhos, como é demonstrado aqui com relação à expressão do gene de proteína fluorescente verde. Embora a utilidade e a eficácia dos vetores desejados sejam demonstradas em relação ao GFP, deve-se notar que os vetores são igualmente adequados para a expressão de qualquer gene ou ORF de interesse.

[0214] Como se nota, o sistema de expressão heteróloga baseado na raiva fornecido aqui pode ser utilizado para expressar quaisquer proteínas estranhas (heterólogas). É particularmente previsto, a título de exemplo, que tais genes heterólogos sejam de outro organismo patogênico, tal como outros vírus patogênicos, por exemplo o vírus SARS, o vírus Nipah, etc. Além disso, os vetores revelados podem ser utilizados para a distribuição de outros genes terapêuticos, incluindo, por exemplo, genes que codifiquem proteínas de valor terapêutico ou moléculas de RNA funcionais, tais como as siRNAs. XI. Composições Farmacêuticas e Imunologicamente Estimuladoras e seus Usos

[0215] As composições farmacêuticas que incluem vírus resgatados atenuados ou fixos, seqüências de ácidos nucléicos de vírus ou polipeptídios de vírus compreendendo ao menos um epitopo de vírus são também abrangidos pela presente divulgação. Essas composições farmacêuticas incluem uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ou mais compostos ativos, tais como um vírus atenuado ou fixo, polipeptídios de vírus compreendendo ao menos um epitopo de vírus, ou uma ou mais moléculas de ácidos nucléicos que codificam esses polipeptídios, em conjunto com um portador farmaceuticamente aceitável. É previsto que, em certas modalidades, seqüências de ácidos nucléicos de vírus ou polipeptídios de vírus compreendendo múltiplos epitopos de vírus sejam úteis na preparação das composições farmacêuticas da divulgação.

[0216] São aqui reveladas substâncias adequadas para uso como composições imunologicamente estimuladoras para a inibição ou o tratamento (seja pré-exposição ou pós-exposição) de uma infecção de vírus, por exemplo, uma infecção de vírus da raiva.

[0217] Em uma modalidade, uma composição imunologicamente estimuladora contém um vírus (recombinante) resgatado atenuado ou fixo. Em uma outra modalidade, a composição contém um polipeptídeo de vírus isolado ou recombinante incluindo ao menos um epitopo de vírus (tal como uma proteína G do vírus da raiva). Em uma modalidade adicional, a composição imunologicamente estimuladora contém um vetor de ácido nucléico que inclui ao menos uma molécula de ácido nucléico revelada aqui, ou que inclui uma seqüência de ácido nucléico que codifica ao menos um epitopo de vírus. Em um exemplo específico, não limitativo, uma seqüência de ácido nucléico codificando ao menos um epitopo de vírus é expressa em uma unidade de transcrição, tal como as descritas nas Publicações PCT Nos. PCT/US99/12298 e PCT/US02/10764 (ambas as quais são aqui incorporadas em suas totalidades).

[0218] Os vírus, polipeptídios de vírus, construções, ou vetores que codifiquem tais polipeptídios, imunologicamente estimuladores são combinados com um portador ou veículo farmaceuticamente aceitável para a administração como uma composição imunologicamente estimuladora para sujeitos humanos ou animais.

[0219] As formulações imunogênicas podem ser convenientemente apresentadas em forma de dosagem única e preparadas através da utilização de técnicas farmacêuticas convencionais. Tais técnicas incluem a etapa de colocar em associação o ingrediente ativo e o(s) portadore(s) ou excipiente(s) farmacêutico(s). Em geral, as formulações são preparadas colocando-se em associação uniforme e intimamente o ingrediente ativo com portadores líquidos. As formulações adequadas para a administração parenteral incluem soluções de injeção estéreis aquosas e não-aquosas que podem conter antioxidantes, tampões, bacteriostatos e solutos que tornam a formulação isotônica com o sangue do recipiente pretendido; e suspensões estéreis aquosas e não-aquosas que podem incluir agentes de suspensão e agentes de engrossamento. As formulações podem ser apresentadas em recipientes de dose única ou de dose múltipla, por exemplo, ampolas vedadas e frascos, e podem ser armazenadas em uma condição liofilizada que requeira apenas a adição de um portador líquido estéril, por exemplo, água para as injeções, imediatamente antes do uso. Soluções de injeções e suspensões extemporâneas podem ser preparadas a partir de pós, grânulos ou tabletes estéreis, utilizados comumente pelos versados na técnica.

[0220] Em certas modalidades, formulações de dosagem de unidade são as que contenham uma dose ou unidade, ou uma fração apropriada destas, do ingrediente administrado. Deve ser entendido que além dos ingredientes particularmente mencionados acima, as formulações abrangidas aqui podem incluir outros agentes comumente utilizados pelo versado na técnica.

[0221] As composições fornecidas aqui, incluindo aquelas para uso como composições imunologicamente estimuladoras, podem ser administradas por vias diferentes, tais como a oral, incluindo a bucal e a sublingual, retal, parenteral, aerossol, nasal, intramuscular, subcutânea, intra-dermal e tópica. Elas podem ser administradas de diferentes formas, incluindo mas não se limitando a soluções, emulsões e suspensões, micro- esferas, partículas, micro-partículas, nanopartículas e lipossomos.

[0222] O volume da administração irá depender da via de administração. A título de exemplo, as injeções intramusculares podem estar na faixa de aproximadamente 0,1 ml a aproximadamente 10 ml. Os versados na técnica saberão os volumes apropriados para as diferentes vias de administração.

[0223] Um progresso relativamente recente no campo dos compostos imunologicamente estimuladores (por exemplo, vacinas) é a injeção direta de moléculas de ácido nucléico que codificam antígenos de peptídeo (amplamente descrita por Janeway & Travers, Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, página 13, 25, Garland Publishing, Inc., Nova York, EUA, 1997; e Mcdonnell & Askari, N. Engl. J. Med. 334:42-45, 1996). Vetores que incluam as moléculas de ácidos nucléicos descritas aqui, ou que incluam uma seqüência de ácido nucléico de codificação de um polipeptídeo de vírus que compreenda ao menos um epitopo de vírus, podem ser utilizados em tais métodos de vacinação de DNA.

[0224] Portanto, a expressão “composição imunologicamente estimuladora”, como utilizada aqui, também inclui vacinas de ácidos nucléicos em que uma molécula de ácido nucléico codificando um polipeptídeo de vírus que compreenda ao menos um epitopo de vírus seja administrada a um sujeito em uma composição farmacêutica. Para a imunização genética, métodos de distribuição adequados conhecidos pelos versados na técnica incluem a injeção direta de DNA plasmídeo em músculos (Wolff e outros, Hum. Mol. Genet. 1:363, 1992), a distribuição de DNA complexado com portadores de proteína específicos (Wu e outros, J. Biol. Chem. 264:16985, 1989), a co-precipitação de DNA com fosfato de cálcio (Benvenisty e Reshef, Proc. Natl. Acad. Sci. 83:9551, 1986), a encapsidação de DNA em lipossomos (Kaneda e outros, Science 243:375, 1989), o bombardeio de partículas (Tang e outros, Nature 356:152, 1992; Eisenbraun e outros, DNA Cell Biol. 12:791, 1993), e a infecção in vivo utilizando-se vetores retro-virais clonados (Seeger e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. 81:5849, 1984). De forma semelhante, as preparações de vacinas de ácidos nucléicos podem ser administradas através de portadores virais.

[0225] A quantidade de composto imuno-estimulador em cada dose de uma composição imunologicamente estimuladora é selecionada como uma quantidade que induza uma reação imuno-estimuladora ou imuno-protetora sem efeitos colaterais adversos significativos. Tal quantidade irá variar dependendo de qual imunogênico específico for empregado e como ele é apresentado. As injeções iniciais podem ficar na faixa de aproximadamente 1 μg a aproximadamente 1 mg, com algumas modalidades tendo uma faixa de aproximadamente 10 μg a aproximadamente 80 μg, e ainda outras modalidades tendo uma faixa de aproximadamente 25 μg a aproximadamente 500 μg. Após uma administração inicial da composição imunologicamente estimuladora, os sujeitos podem receber uma ou várias administrações de reforço, adequadamente espaçadas. As administração de reforço podem estar na faixa de aproximadamente 1 μg a aproximadamente 1 mg, com outras modalidades tendo uma faixa de aproximadamente 10 μg a aproximadamente 750 μg, e ainda outras tendo uma faixa de aproximadamente 50 μg a aproximadamente 500 μg. Reforços periódicos em intervalos de 1-5 anos, por exemplo, três anos, podem ser desejáveis para manter os níveis desejados de imunidade protetora.

[0226] É também previsto que as moléculas e composições imuno- estimuladoras fornecidas sejam administradas a um sujeito indiretamente, primeiro estimulando-se uma célula in vitro, após o qual a célula estimulada é administrada ao sujeito para provocar uma reação imunológica. Adicionalmente, as composições imunologicamente estimuladoras ou os métodos de tratamento podem ser administrados em combinação com outros tratamentos terapêuticos.

[0227] A preparação de iscas de alimentos contendo composições imunologicamente estimuladoras também se encontra dentro da habilidade dos versados na técnica. Por exemplo, a preparação de iscas de alimentos contendo vacinas do VR vivas é revelada por Wandeler e outros (Rev. Infect. Dis. 10 (suppl. 4):649-653, 1988), Aubert e outros (pp. 219-243, em Lyssavirus (Rupprecht e outros, eds.), Springer-Verlag, Nova York, 1994), e Fu e outros (pp. 607-617, em New Generation Vaccines (2a Ed.) (Levine e outros, eds.), Marcel Dekker, Inc., Nova York, 1997), cujas divulgações completas são aqui incorporadas como referências. XIII. Kits

[0228] São também fornecidos aqui kits úteis na detecção e/ou no diagnóstico de infecção por vírus, por exemplo, infecção com um vírus da raiva ou outros lyssavirus. Um exemplo de um kit de ensaio fornecido aqui é um polipeptídio de vírus recombinante (ou fragmento deste) como um antígeno e um anticorpo anti-humano conjugado com enzima como um segundo anticorpo. Exemplos de tais kits podem incluir também um ou mais substratos enzimáticos. Tais kits podem ser usados para testar se uma amostra de um sujeito contém anticorpos contra uma proteína específica de vírus. Em tal kit, uma quantidade apropriada de um polipeptídio de vírus (ou fragmento deste) é fornecida em um ou mais recipientes, ou mantida sobre um substrato. Um polipeptídio de vírus pode ser fornecido em uma solução aquosa ou como um pó liofilizado, por exemplo. Os recipientes em que os polipeptídios de vírus são supridos podem ser qualquer recipiente convencional que seja capaz de conservar a forma suprida, por exemplo, tubos de centrifugação, ampolas ou garrafas.

[0229] A quantidade de cada polipeptídio suprido no kit pode ser qualquer quantidade apropriada, e pode depender do mercado para o qual o produto é direcionado. Por exemplo, se o kit for adaptado para pesquisa ou uso clínico, a quantidade de cada polipeptídio fornecido seria provavelmente uma quantidade suficiente para diversos ensaios. Orientações gerais para determinar quantidades apropriadas podem ser encontradas, por exemplo, em Ausubel e outros (eds.), Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Nova York, NY, EUA, 1999 e Harlow e Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, CSHL, Nova York, EUA, 1999.

[0230] Os exemplos a seguir são fornecidos para ilustrar certos recursos e/ou modalidades. Esses exemplos não devem ser vistos como se limitassem a invenção às características ou modalidades descritas.

Exemplos Exemplo 1: Seqüenciamento do VR da ERA

[0231] Esse exemplo fornece uma descrição de um método para o seqüenciamento do genoma de comprimento completo de um rabdovírus, particularmente nesse caso um vírus da raiva.

[0232] A linhagem ERA do vírus da raiva foi obtida dos arquivos da CDC e foi propagada células do rim de filhotes de hamsters (BHK-21). O vírus foi colhido após quatro dias de infecção a 37°C, em um incubador de CO2 5% e foi purificado. Em breves palavras, o sobrenadante da célula foi coletado e centrifugado a 2.000 rpm por 15 minutos para remover os detritos de célula. O sobrenadante clareado foi submetido a mais uma centrifugação a 18.000 rpm por 1 hora. O grão foi re-suspenso em PBS e submetido à extração de RNA genômico da raiva.

[0233] O RNA total das células BHK-21 infectadas com ERA foi extraído com o reagente Trizol (GIBCO Invitrogen) de acordo com o protocolo recomendado pelo fabricante. O RNA genômico de ERA foi purificado do sobrenadante de vírus da ERA concentrado com um kit de RNA viral de alta pureza da Roche.

[0234] A integridade do RNA genômico de ERA purificado foi verificada por eletroforese de gel e Northern blot por sondas de hibridação de N, P, G e M. Em breves palavras, 5 μg de RNA genômico foram carregados em um gel de RNA desnaturado e transferidos para uma membrana de nylon para hibridação. A sonda foi marcada utilizando-se o kit de marcação de DNA Dig da Roche, de acordo com as instruções do fabricante.

[0235] Os 11 nucleotídeos conservados do antigenoma 5’ do vírus da raiva foram projetados como um primer para transcrição reversa. A reação de RT foi realizada com um kit de síntese de cDNA de primeiro filamento da Invitrogen. O cDNA completo da genoma da ERA foi confirmado por Northern blot utilizando-se hibridação com sonda de N, P, M e G, assim como os 11 nucleotídeos conservados como sondas de oligonucleotídeos marcadas por Digoxina.

[0236] Dois conjuntos de primers foram escolhidos para reações de PCR, que amplificam todo o genoma da ERA em dois fragmentos contíguos. Um conjunto de primers é composto dos 11 nucleotídeos na extremidade de antigenoma 5’, Le5: ACGCTTAACAA (SEQ ID NO: 24) e BLp3: GTCGCTTGCTAAGCACTCCTGGTA (SEQ ID NO: 25). Um outro conjunto contém os 11 nucleotídeos complementares na extremidade de genoma 5’, Le3: TGCGAATTGTT (SEQ ID NO: 26) e BLp5 CCAG GAGTGCTTAGCAAGCGACCT (SEQ ID NO: 27). Os primers Blp3 e Blp5 ficam localizados em uma região relativamente conservada no genoma do vírus da raiva.

[0237] Fragmentos da PCR foram purificados e clonados no vetor TOPO comprado da Invitrogen. O seqüenciamento foi conduzido em um seqüenciador ABI 310 e a seqüência foi montada pelo software BioEdit ou pelo software SeqMerge da Accelrys no ambiente GCG.

[0238] A seqüência alinhada completa do genoma da ERA é fornecida na SEQ ID NO: 1. As posições de seqüências codificadoras de proteína individuais são fornecidas na Tabela 3, com referência à SEQ ID NO: 1. As seqüências de aminoácido das proteínas N, P, M, G e L são fornecidas nas SEQ ID Nos: 2 a 6, respectivamente. Tabela 3 - Posições de Seqüências Codificadoras de Proteína da linha ERA do Vírus da Raiva

[0239] Esse método pode ser utilizado tanto para o vírus da raiva como para vírus relacionados à raiva. Os vírus da raiva e relacionados à raiva têm ao menos sete supostos tipos de espécie. O método de seqüência fornecido pode ser utilizado também para outros vírus de RNA de filamento negativo. Isso é assim porque quase todos os genomas de vírus de RNA de filamento negativo têm aproximadamente 12 nucleotídeos conservados em ambas extremidades distais, que podem servir de forma semelhante como primers para RT-PCR. Os primers irão evidentemente ser diferentes para diferentes espécies virais, e as seqüências de primers específicos podem ser determinadas por alguém versado na técnica com base nos ensinamentos daqui.

Exemplo 2: Construção de Plasmídeos para um Sistema de Genética Reversa para o Vírus da Raiva

[0240] Esse exemplo descreve o projeto e o desenvolvimento de um sistema de Genética Reversa para o Vírus da Raiva. A linhagem ERA do vírus da raiva foi obtida da ATCC e foi preparada como descrito (Wu e outros, J. Virol. 76, 4153-4161). Para se obter o genoma de cDNA de vírus de comprimento completo, células BSR (um clone das células de rim de filhote de hamster, BHK) foram infectadas com vírus da linhagem ERA e desenvolvidas no meio essencial mínimo de Dulbecco suplementado com 100% se soro bovino fetal. O sobrenadantes foram resgatados e submetidos a centrifugação a 22.000 g por 1 hora. Os grãos de vírus foram coletados para a purificação de RNA genômico viral utilizando-se um kit de extração de vírus de RNA comprado da Qiagen (Valencia, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. A integridade do RNA genômico viral foi confirmada por eletroforese de gel. O cDNA genômico viral foi transcrito com o kit de síntese de cDNA de primeiro filamento da Invitrogen (Calrsbad, CA, EUA). A mistura da reação de transcrição reversa (RT) foi aplicada à amplificação através da reação em cadeia de polimerase (PCR) para a síntese do cDNA genômico viral de comprimento completo e dos genes N, P, G e L, respectivamente. Para montar o cDNA genômico de vírus de comprimento completo, um plasmídeo PTMF foi construído em quatro etapas seqüenciais como ilustrado esquematicamente na Fig. 1B. Uma transcriptase reversa Superscript III e polimerase pfx de platina com prova de leitura (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) foram aplicadas à síntese de transcrição de cDNA e às amplificações de PCR consecutivas. Para as reações de transcrição reversa, 1 μg de RNA genômico purificado foi utilizado na mistura de reação RT e incubado a 50°C por 80 minutos, seguido por aquecimento a 85°C por 5 minutos para desativar a Superscript III. Após a reação de RT, 1 unidade de RNaseH foi adicionada ao RNA modelo de digestão nos híbridos de cDNA- RNA.

[0241] Para gerar cDNA genômico de vírus de comprimento completo, dois fragmentos sobrepostos foram amplificados por RT-PCR da seguinte forma: Um fragmento (F1) foi amplificado por RT-PCR com primers: Le- 5Kpn (CCGGGTACCACGCTTAAC AACCAGATCAAAGA; SEQ ID NO: 28, local de reconhecimento da Kpn1 sublinhado) e Le3-Bpl (TAGGTCGCTTGCTAAGCACTCCTGGTAGGAC; SEQ ID NO: 29, local de reconhecimento da Blp1 sublinhado). Um fragmento (F2) foi amplificado por RT-PCR com primers: Tr5-Blp (GTCCTACCAGGAGTGCTTAGCAAGCGACCTA; SEQ ID NO: 30, local de reconhecimento da Blp1 sublinhado) e Tr3-Pst (AAAACTGCAGACGCTTAACAAATAAACAACAAAA; SEQ ID NO: 31, local de reconhecimento da Pst1 sublinhado). Após a síntese bem sucedida dos dois fragmentos acima, o F1 digerido pelas enzimas de restrição Kpn1 e Blp1 foi submetido à purificação de gel e clonado para o fagemídeo pBluescriptIISK(+) (Stratagene, La Jolla, CA, EUA) para formar o plasmídeo pSKF1. O fragmento F2 purificado com gel, cortado pela Blp1 e Pst1 foi consecutivamente clonado para o plasmídeo pSKF1 para formar o cDNA antigenômico viral de comprimento completo. Uma ribozima em cabeça-de-martelo (oligo1, CAAGGCTAGCTGTTAAGCGTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAAC TATAGGAAAGGAATTCCTATAGTCGGTACCACGCT; SEQ ID NO: 32, locais de reconhecimento de Nhe1 e Kpn1 sublinhados; Oligo2, AGCGTGGTACCGACTATAGGAATTCCTTTCCTATAGTTTCGTCCT CACGGACTCATCAGACGCTTAACAGCTAGCCTTG; SEQ ID NO: 33, locais de reconhecimento de Kpn1 e Nhe1 sublinhados) foi sintetizada contendo um local de reconhecimento de Nhe1 na extremidade 5’ e um local de Kpn1na extremidade 3’. Ela foi fundida à frente da extremidade 5’ do fragmento F1. Uma ribozima de vírus delta da hepatite (oligo3, GACCTGCAGGGGTCGGCATGGCATCTCCACCTCCTCGCGGTCCG ACCTGGGCATCCGAAGGAGGACGCACGTCCACTCGGATGGCTA AGGGAGGGCGCGGCCGCACTC; SEQ ID NO: 34 , (locais de reconhecimento de Pst1 e Not1 sublinhados; Oligo4, GAGTGCGGCCGCGCCCTCCCTTAGCCATCCGAGTGGACGTGCGT CCTCCTTCGGATGCCCAGGTCGGACCGCGAGGAGGTGGAGATGC CATGCCGACCCCTGCAGGTC; SEQ ID NO: 35, locais de reconhecimento de Not1 e Pst1 sublinhados)(Symons, Annu. Rev. Biochem. 61:641-671, 1992) foi sintetizada, possuindo um local de Pst1 em sua extremidade 5’ e um local de Not1 em sua extremidade 3’, e foi fundida à extremidade 3’ do fragmento F2. O local de reconhecimento conjuntivo Kpn1, entre a ribozima em cabeça-de-martelo e o fragmento F1, e o local de Pst1 entre o fragmento F2 e a ribozima de vírus delta da hepatite, foram removidos por mutagênese direcionada local. O cDNA antigenômico viral de comprimento completo ficou espremido entre as ribozimas em cabeça-de- martelo e do vírus delta da hepatite. Ele foi removido e clonado para o fagemídeo pBluescriptIISK(+) para fazer uma construção de pSKF. O cDNA antigenômico viral completo com duas ribozimas foi fundido abaixo do local de iniciação de transcrição do T7 sob o controle do promotor prévio-imediato de CMV no plasmídeo pcDNA3.1/Neo (+) (Invitrogen, Carlsbad, CA). Essa última etapa finalizou a construção do plasmídeo pTMF.

[0242] O genoma viral da ERA do tipo selvagem inclui um tubo de poliA de oito resíduos (poliA8) na região intergênica entre as regiões G e Psi. Para distinguir os vírus da ERA (rERA) resgatados da linhagem mãe, um comprimento de sete As (poliA7) foi introduzido à construção de pTMF pela remoção de um A ao invés do A8 original. Após o vírus rERA ter sido resgatado, RT-PCR foi feita e os dados seqüenciais subseqüentes confirmaram a existência do marcador de seqüência de poli A7 introduzido.

[0243] plasmídeo pTN: o gene N foi amplificado por RT-PCR com primers: (5N: ACCACCATGGATGCCGACAAGATTG; SEQ ID NO: 36, local de reconhecimento da Nco1 e códon inicial sublinhados); e 3N: GGCCCATGGTTATGAGTCACTCGAATATGTCTT; SEQ ID NO: 37, local de reconhecimento da Nco1 EcoR1 e códon terminal sublinhados) e clonado para o plasmídeo pCITE-2a(+) (Promotor de Tradução Independente de Cap) (Novagen, Madison, WI, EUA).

[0244] plasmídeo pMP: o gene P foi amplificado por RT-PCR com primers: (5P: TTGGTACCACCATGAGCAAGATCTTTGTCAATC; SEQ ID NO: 38, local de reconhecimento da Kpn1 e códon inicial sublinhados); e 3P: GGAGAGGAATTCTTAGCAAGATGTATAGCGATTC; SEQ ID NO: 39, local de reconhecimento da EcoR1 e códon terminal sublinhados) e clonado para o plasmídeo pcDNA3.1/Neo (+).

[0245] plasmídeo pMG: o gene G foi amplificado por RT-PCR com primers: (5G: TTGGTACCACCATGGTTCCTCAGGCTCTCCTG; SEQ ID NO: 40, local de reconhecimento da Kpn1 e códon inicial sublinhados); e 3G: AAAACTGCAG TCA CAGTCTGGTCTCACCCCCAC; SEQ ID NO: 41, local de reconhecimento da Pst1 e códon terminal sublinhados) e clonado para o plasmídeo pcDNA3.1/Neo (+).

[0246] plasmídeo pML: o gene L foi amplificado por RT-PCR com primers: (5L: ACCGCTAGCACCACCATGCTCGATCCTGGAGAGGTC; SEQ ID NO: 42, local de reconhecimento da Nhe1 e códon inicial sublinhados; e 3L: AAAACTGCAG TCA CAGGCAACTGTAGTCTAGTAG; SEQ ID NO: 43, local de reconhecimento da Pst1 e códon terminal sublinhados) e clonado para o plasmídeo pcDNA3.1/Neo (+).

[0247] plasmídeo pT7: cDNA genômico da bactéria BL-21 (Novagene, Madison, WI, EUA) foi extraído com o Kit de Tecido Dneasy (Qiagen, Valencia, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. O gene da RNA polimerase do T7 foi purificado do DNA genômico por PCR com primers (5T7: TCGCTAGCACCACCATGAACACGATTAACATCGCTAAG; SEQ ID NO: 44, local de reconhecimento da Nhe1 e códon inicial sublinhados; e 3T7: GATGAATTC TTA CGCGAACGCGAAGTCCGACTC; SEQ ID NO: 45, local de reconhecimento da EcoR1 e códon terminal sublinhados) e clonado para o plasmídeo pcDNA3.1/Neo (+).

[0248] plasmídeo NLST7: um sinal de localização nuclear (NLS) com oito aminoácidos, derivado do antígeno SV40 de T grande, foi adicionado à N terminal da RNA polimerase do T7 por PCR, utilizando-se o plasmídeo pT7 como o modelo, com primers (5T7NLS: TCGCTAGCCACCATGCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTAGAAAACA CGATTAACATCGCTAAGAAC; SEQ ID NO: 46, NLS sublinhado; e primer 3T7). O fragmento amplificado foi designado NLST7, e foi clonado para pcDNA3.1/Neo (+) para formar a construção de pNLST7.

[0249] plasmídeo pGFP: Plasmídeo phMGFP de Proteína Fluorescente Verde (GFP) Monster foi comprado da Promega (Madison, WI, EUA). O gene do GFP foi amplificado por PCR com primers (GFP5: AAAACTGCAGGCCACCATGGGCGTGATCAAG; SEQ ID NO: 47, local de reconhecimento da Pst1 e códon inicial sublinhados; e GFP3: CCGCTCGGTACCTATTA GCCGGCCTGGCGGG; SEQ ID NO: 48, local de reconhecimento da Kpn1 e códon terminal sublinhados) e clonado para o plasmídeo pcDNA3.1/Neo (+).

[0250] Todas as construções de plasmídeos foram seqüenciadas ao menos três vezes para confirmar a ausência de mutações ou remoções inesperadas após a clonagem, a mutagênese direcionada local, ou a remoção de genes. Adicionalmente, a presença de uma seqüência marcadora consistindo em um tubo de poliA contendo sete resíduos de adenosina ao invés dos oito resíduos observados no genoma da ERA do tipo selvagem entre a glicoproteína e a região Psi foi confirmada.

Exemplo 3: Expressão de RNA Polimerase do T7 em Células BSR

[0251] Esse exemplo demonstra que a adição de um sinal de localização nuclear à RNA polimerase do fago T7 direciona a expressão da polimerase no núcleo de células transfectadas. A transfecção de células BSR foi realizada como descrito por Wu e outros (J. Virol. 76, 4153-4161, 2002). Em breves palavras, as células BSR com confluência de quase 80% em uma placa de seis poços foram transfectadas com 0,5 μg de P7 ou de plasmídeo pNLST7 por poço, respectivamente. Em 48 horas após transfecção, as células foram fixadas com 80% acetona fria por 1 hora e secadas na temperatura ambiente. O anticorpo monoclonal de camundongo contra a RNA polimerase do T7 e o conjugado FITC-IgG de cabra anti-camundongo foram sucessivamente adicionados, e foram lavados no procedimento de manchas fluorescentes indireto de duas etapas. Os resultados foram gravados após microscopia de UV. A RNA polimerase do T7 expressa de um pT7 sem um sinal de localização nuclear foi observado principalmente no citosol, enquanto que a polimerase de NLST7 incluindo um sinal de localização nuclear estava presente predominantemente no núcleo das células. Esses resultados indicam que a adição de um NLS direcionou eficientemente a RNA polimerase do T7 para o núcleo das células transfectadas.

Exemplo 4: Estabelecimento de linhagem celular BSR de glicoproteína da ERA expressa constitutivamente

[0252] Esse exemplo descreve a concepção e a produção de uma linhagem celular BHK que expressa constitutivamente a glicoproteína da ERA. Uma linhagem de células BHK que expressava a glicoproteína da ERA foi construída utilizando-se o sistema Flp-In™ (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). Em breves palavras, as células BHK-Flp-InT™ (possuindo um único local alvo de recombinação Flp integrado) foram desenvolvidas para aproximadamente 20% de confluência em uma placa de seis poços e mantidas em meio de DMEM comum, suplementado com 100 μg/ml de Zeocina, antes da transfecção. O gene da G da ERA foi amplificado por PCR utilizando-se o plasmídeo pMG como modelo com primers EF5G5 (CACCATGGTTCCTCAGGCTCTCCTG; SEQ ID NO: 49) e EF5G3 (TCACAGTCTGGTCTCACCCCCAC; SEQ ID NO: 50), e clonados em um vetor pEF5/FRT/V5-D-TOPO vector (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) para criar a construção de pEFG. O plasmídeo pOG44 expressando recombinase de Flp junto com pEFG na razão de 10:1 foi co-transfectado para as células Flp-InTM-BHK. Após a transfecção, as células foram guardadas em DMEM sem Zeocina, mas com higromicina B a 4000 μg/ml. Após 48 horas, as células foram divididas de modo que não mais do que 20% de confluência ocorresse no próximo dia. As células foram desenvolvidas em meio seletivo de higromicina B a 37°C por aproximadamente uma semana. A expressão de G da ERA alvo foi detectada por manchas fluorescentes indiretas com anticorpo monoclonal anti-G humano e conjugado FITC-IgG de cabra anti- humano. A linhagem de células que expressava constitutivamente a G foi designada BHK-G, e foi utilizada para o crescimento do vírus da ERA-G.

[0253] Exemplo 5: Modificação Definida da Linhagem de Evelyn- Rokitnicki-Abelseth (ERA) do Vírus da Raiva

[0254] Além da linhagem de vírus da ERA mãe descrita acima, linhas de vírus derivadas foram desenvolvidas utilizando-se o sistema de genética reversa revelado aqui. Diversos vírus modificados exemplificativos foram produzidos, quais sejam, da ERA- (remoção de toda a região psi), ERAverde1 (gene de proteína verde fluorescente inserido em fosfoproteína e na região intergênica de proteína matricial), ERA2g (contendo uma cópia extra de glicoproteína na região psi), ERAg3 (com uma mutação no aminoácido 333 na glicoproteína), ERA2g3 (com uma cópia extra da glicoproteína com mutação em Aa333 na região psi), ERA-G (com a glicoproteína removida), ERAgm (genes M e G trocados no genoma), e ERAgmg (duas cópias da G na construção da ERAgm rearranjada). Esses derivados são ilustrados esquematicamente na Fig. 3. Otimizando-se as condições de crescimento da forma descrita, todos os vírus resgatados podem ser obtidos com títulos de vírus de 109 a 1010 ffu/ml tanto em frascos de cultivo de tecidos como em bio-reatores. Remoção de genes e mutagênese local direcionada no sistema de genética reversa Remoção da região Psi do genoma da ERA do vírus da raiva

[0255] A região Psi completa do genoma da ERA do vírus da raiva foi removida da seguinte forma: um fragmento de 3’Δy foi amplificado utilizando-se pTMF como modelo por PCR com primers: 5Δy: CCCTCTGCAGTTTGGTACCGTCGAGAAAAAAACATTAGATCAGA AG; SEQ ID NO: 51, locais de reconhecimento da Pst1 e Kpn1 sublinhados; e primer Le3-Blp) e foi clonado para o vetor pCR-BluntII -TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) para a construção do plasmídeo pPΔ5y. O fragmento de 5’Δy foi amplificado utilizando-se o mesmo modelo por PCR com primers: (SnaB5: ATGAACTTTCTACGTAAGATAGTG; SEQ ID NO: 52, local de reconhecimento da SnaB1 sublinhado; e 3Δy: CAAACTGCAGAGGGGTGTTAGTTTTTTTCAAAAAGAACCCCCCA AG; SEQ ID NO: 53, local de reconhecimento da Pst1 sublinhado) e sucessivamente clonado para o plasmídeo pPΔ5y acima para finalizar a construção do plasmídeo pPΔy. O fragmento recuperado pela digestão por enzima de restrição SnaB1 e Pst1 do plasmídeo pPΔy substituiu o correspondente na construção de pSKF para fazer o plasmídeo pSKFΔy. O fragmento de DNA inteiro contendo o cDNA genômico da ERA, digerido por Nhe1 e Not1 do plasmídeo pSKFΔy, foi re-clonado para o plasmídeo pcDNA3.1/Neo (+) para finalizar a construção do pTMFΔy. Para a verificação da linhagem resgatada sem Psi, os primers designados Era- encobrindo a região Psi foram aplicados em RT-PCR com o RNA total das células BSR infectadas com ERA. Um fragmento de 400 bp correspondente à região Psi foi amplificado somente a partir de vírus da rERA, mas não da ERA. Os dados de seqüência verificaram a remoção completa da região Psi. Remoção do gene da ghcogroteína no genoma da ERA do vírus da raiva:

[0256] O fragmento de 5’gΔy foi amplificado utilizando-se pSKF como modelo por PCR com primers (primer SnaB5, e 3Δg: CAAACTGCAGAGGGGTGTTAGTTTTTTTCACATCCAAGAGGATC; SEQ ID NO: 54). Após digestão pelas enzimas de restrição SnaB1 e Pst1, esse fragmento recuperado foi clonado para substituir seu correspondente na construção do pSKFΔy. O fragmento de 3’gΔy foi amplificado utilizando- se o mesmo modelo por PCR com primers (5Δg: CCTCTGCAGTTTGGTACCTTGAAAAAAACCTGGGTTCAATAG; SEQ ID NO: 55, e primer Le3-Blp), e foi consecutivamente clonado para o pSKFΔy modificado, para substituir seu correspondente. O fragmento final, recuperado pelas enzimas de restrição SnaB1 e Blp1 cortadas desse pSKFΔy sem o gene da G, foi re-clonado para o plasmídeo pcDNA3.1/Neo (+), para formar a construção de pTMFΔg para a recuperação de vírus. Mutagênese local direcionada de gene da glicoproteína

[0257] Uma mutagênese local direcionada para introduzir uma mudança em três nucleotídeos de AGA para GAG na posição do aminoácido 333 da glicoproteína foi feita como descrito anteriormente (Wu e outros, J. Virol. 76: 4153-4161, 2002). Os primers na reação de mutagênese foram o primer M5G: CTCACTACAAGTCAGTCGAGACTTGGAATGAGATC (SEQ ID NO: 56, os três nucleotídeos que tiveram mutação em negrito), e o primer M3G; GACTGACTTTGAGTGAGCATCGGCTTCCATCAAGG (SEQ ID NO: 57). Para a linhagem recuperada (ERAg3), as mudanças de três nucleotídeos de AGA para GAG na posição do aminoácido 333 (aa333) foram confirmadas por seqüenciamento após RT-PCR com primers 5G e 3G. Após a confirmação por seqüenciamento de DNA, a G que passara por mutação foi clonada de volta para o plasmídeo pTMF para fazer a construção de pTMFg3 para a recuperação de vírus. A glicoproteína codificada por essa proteína alterada por mutação é representada pela SEQ ID NO: 58. Incorporação de uma ORF exógena em genoma de vírus da raiva da ERA

[0258] Para expressar ORFs exógenas no VR, uma unidade de transcrição extra com locais de reconhecimento de Pst1 e Kpn1 foi criada e incorporada nas regiões intergênicas Psi ou P-M, respectivamente. Em breves palavras, para a criação de uma unidade de transcrição extra na região Psi, as mesmas etapas foram seguidas, com a exceção da etapa de amplificação do fragmento de 5’Δy, e o primer 3Δ\|/ foi mudado para 3Δycis: CCAAACTGCAGCGAAAGGAGGGGTGTTAGTTTTTTTCATGATGA ACCCCCCAAGGGGAGG (SEQ ID NO: 59). A construção final sem a região Psi, mas com uma unidade de transcrição extra, foi designada pMTFΔycis. O GFP, a G da ERA ou a G alterada por mutação nos resíduos do aminoácido 333 foi clonada para essa unidade de transcrição para formar as construções de pMTFgfp1, pMTF2g, pMTFg3, pMTF2g3, respectivamente, para o resgate do vírus.

[0259] Para incorporar uma unidade de transcrição extra à região intergênica P-M, o fragmento de cisp5 foi amplificado utilizando-se o pMTF como modelo com os primers cis55: GACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCTGTTAAG (SEQ ID NO: 60), cis53: CCAAACTGCAGCGAAAGGAGGGGTGTTAGTTTTTTTCATGTTGA CTTTAGGACATCTCG G (SEQ ID NO: 61), e foi clonada em substituição de seu correspondente no plasmídeo pMTF. O fragmento cisp3 foi amplificado e clonado de uma forma semelhante com os primers cis35: CCTTTCGCTGCAGTTTGGTACCGTCGAGAAAAAAACAGGCAACA CCACTGATAAAATGAAC (SEQ ID NO: 62) e cis33: CCTCCCCTTCAAGAGGGCCCCTGGAATCAG (SEQ ID NO: 63). Após a montagem dos fragmentos cisp5 e cisp 3 juntos, a construção final foi designada pMTFcisp, para aceitar ORFs. A construção recombinante contendo o gene do GFP foi denominada pTMFgfp2 para o resgate do vírus.

[0260] Para produzir um derivado da ERA, a designada ERAgm, na qual a seqüência codificadora de glicoproteína foi invertida em ordem com a seqüência codificadora de proteína matricial, o gene da glicoproteína foi removido como descrito acima. O gene da G (amplificado como revelado acima) foi então inserido entre os genes M e P, dando um genoma de vírus da raiva na ordem N-P-G-M-L. De forma semelhante, a mesma estratégia foi aplicada para produzir o derivado de ERAg3m, no qual a glicoproteína tem uma mutação de nucleotídeo tripla na resíduo de aminoácido 333 (de AGA para GAG) através da substituição do gene da G produzido por mutagênese local direcionada como descrito acima. Para produzir a construção de ERAgmg, uma cópia extra do gene da glicoproteína foi inserida entre os genes P e M, e fez o genoma de vírus da raiva na ordem N-P-G-M-G-L.

[0261] Uma unidade de transcrição extra foi modificada e incorporada em duas regiões diferentes do genoma da ERA, quais sejam, a região psi e a região intergênica P-M. Quando ORFs heterólogas são incorporadas dentro dessas unidades de transcrição, designadas trans1 e trans2, respectivamente, o resultado é a produção eficaz do produto codificado.

[0262] A seqüência da unidade de transcrição é: CTAACACCCCTCCTTTCGCTGCAGTTTGGTACCGTCGAGAAAAA AA (SEQ ID NO: 64, Pst1 e Kpn1 foram sublinhadas).

Exemplo 6: Recuperação de vírus mãe e derivados

[0263] Esse exemplo descreve a recuperação de vírus da ERA mãe e de derivados exemplificativos utilizando o sistema de genética reversa revelado aqui. Células BSR foram transfectadas em confluência próxima a 80% em placas de seis poços com o plasmídeo pTMF (pTMFΔy, pTMFg3, pTMF2g, pTMF2g3, pTMFgfp1, pTMFgfp2, pTMFΔg, pTMFgm, ou pTMFgmg, respectivamente) com 3 μg/poço, juntamente com cinco plasmídeos auxiliares (pTN (1ig/poço), pMP ((.).5iig/poço), pML ((.).5iig/poço), pMG (0.5ig/poço) e pNLST7 (1ig/poço) pelo reagente TransIT-LT1 (Mirus, Madison, WI) seguindo-se o protocolo recomendado pelo fabricante. Quatro dias após a transfecção, 1 ml de suspensão de células BSR fresca (aproximadamente 5x105 células) foi adicionado a cada poço. As células foram incubadas em 37°C, 5% CO2 por 3 dias. Os sobrenadantes das células foram coletados para a titulação do vírus.

[0264] Para titular o vírus resgatado, monocamadas de células BSR em placas de oito poços LAB-TEK (Naperville, IL) foram infectadas com diluições seriais de 10 vezes de sobrenadante de vírus e incubadas a 37°C, 0,5% CO2 por 48 horas. As células foram fixadas em 80% acetona fria na temperatura ambiente por 1 hora e manchadas com anticorpo monoclonal N de vírus anti-raiva marcado com FITC a 37°C por 30 minutos. Após três lavagens das placas com PBS, os focos manchados foram contados utilizando-se microscopia fluorescente direta. Detalhe sobre o ensaio fluorescente de VR direto (DFA) podem ser encontrados na Internet em cdc.gov/ncidod/dvrd/rabies/professional/publications/DFA- diagnosis/DFA_protocol.htm.

[0265] Todos os vírus com exceção do ERA-G foram recuperados com alto título de células BSR cultivadas como indicado na Tabela 3. Surpreendentemente, o rearranjo e a troca do gene da G com o gene da M não prejudicaram a recuperação do vírus da ERA derivado recombinante. O rearranjo do gene da G nos genomas do VR anteriormente não era considerado viável devido à morte celular por causa da expressão excessiva de proteína G (Faber e outros, J. Virol. 76:3374-3381, 2002). Contudo, esses resultados demonstram que o rearranjo é possível na linhagem ERA. Sendo assim, é provável o embaralho dos genes do VR é possível não apenas para o gene da G, mas também para outros genes.

[0266] O vírus da ERA-G (sem G) foi recuperado após transfecção com plasmídeos seguindo-se o mesmo procedimento dos outros resgates de construções virais, mas os focos de vírus foram muito limitados e restritos em áreas locais após o primeiro estágio de transfecção. O vírus resgatado não foi capaz de se espalhar mais as células BSR saudáveis que estavam por perto (Fig. 4A), mesmo após um semana de incubação a 37°C, 5% CO2. A infecção de células BSR normais com os sobrenadantes de transfecção acima apresentou manchas simples de célula no teste DFA, o que sugere que o vírus resgatado foi incapaz de se espalhar. Para amplificar o vírus da ERA-G, uma linhagem de células BHK expressando constitutivamente a ERA-G foi estabelecida como descrito no Exemplo 4 (designada BHK-G). Por exame de ensaio fluorescente indireto, um agrupamento de células BHK expressando a G foi selecionado e mantido para amplificação do vírus da ERA-G (Fig. 4B). Com o auxílio da linhagem de células BHK-G, o vírus da ERA-G cresceu para 107 ffu/ml. O RNA total das células BHK-G infectadas com vírus da ERA-G foi extraído por análise de Northern blot (Fig. 4C) com uma sonda de gene G. O gene G estava ausente no RNA genômico viral, contudo, G mRNA foi detectado, proveniente de células BHK-G de suporte infectadas. No RNA genômico viral de ERA-G purificado, nenhum sinal de hibridação foi detectado pela sonda G, indicando a remoção do gene da G no genoma da ERA.

Exemplo 7: Crescimento de Vírus da ERA resgatado e de seus derivados para um alto título em bio-reator.

[0267] No desenvolvimento de vacinas orais, um alto título de vírus é tipicamente necessário para provocar uma imunidade confiável após a administração. Esse exemplo demonstra que o vírus da ERA e seus derivados podem ser desenvolvidos para um alto título em um bio-reator em volumes aplicáveis à escala comercial. Todos os vírus da ERA regatados foram amplificados em um bio-reator CELLine AD1000 (IBS Integra Bioscience, Chur, Suíça) até títulos na faixa de 107 a 1010 ffu/ml. Em poucas palavras, células BSR foram transfectadas com os vetores de transcrição de anti- genoma exemplificativos e vetores auxiliares, como descrito acima. As células foram inoculadas em uma multiplicidade de infecção de 1 partícula de vírus (vírion) por célula, em uma concentração de 106 células/ml em um décimo do volume do recipiente do bio-reator. As células transfectadas foram desenvolvidas a 37°C, 5% CO2 em DMEM suplementado com 10% soro bovino fetal. O sobrenadante foi colhido a cada três a cinco dias para entre duas e três colheitas. A ERA-G deficiente cresceu menos bem em comparação com outros vírus, com apenas 108 ffu/ml para a ERA-G (Tabela 3 e Fig. 5). Tabela 4. Construções de plasmídeos de comprimento completo e vírus resgatados correspondentes

Exemplo 8: Expressão de proteínas exógenas a partir de unidades transcricionais extras em vírus da raiva

[0268] Esse exemplo demonstra a expressão de proteínas recombinantes de uma ORF heteróloga inserida dentro de um vetor de vírus da raiva. Nesse exemplo, o vetor de vírus da ERA é utilizado como um protótipo de vetor de vírus da raiva. Para construir o vírus da ERA como um vetor para aceitar ORFs, uma unidade transcricional do VR conservadora entre os genes N e P foi modificada e introduzida dentro do genoma da ERA em dois locais diferentes: 1) na região psi, e 2) na região intergênica P-M (trans 2). A unidade transcricional foi projetada para possuir dois locais de reconhecimento de enzimas de transcrição únicos, para facilitar a introdução de seqüências de polinucleotídeos heterólogos: (TTTTTTTGATTGTGGGGAGGAAAGCGACGTCAAACCATGGCAG CTCTTTTTTT: SEQ ID NO: 65, locais da Pst1 e Kpn1 sublinhados).

[0269] Em um primeiro exemplo, o gene do GFP foi clonado nessa unidade para o resgate de vírus, uma vez que a expressão de GFP poderia ser observada diretamente sob um microscópio de UV quando as células BSR transfectadas estivessem ainda em incubação. A expressão da proteína do GFP foi visível diretamente por microscopia fluorescente com um filtro de excitação de 470+20nm. As células infectadas com a ERAverde2 (gene do GFP inserido após o gene P no genoma do VR trans-2) mostraram focos verde claros após três dias de transfecção de plasmídeos, enquanto que a ERAverdel (gene do GFP inserido após o gene G na região T “tradicional” trans-1) não apresentou focos verdes óbvios até cinco dias pós-transfecção (Fig. 6). A unidade transcricional introduzida foi funcional no genoma do VR em ambos os locais, embora a expressão e o acúmulo tenham se tornado mais rapidamente aparentes quando o GFP foi expresso da trans2. Portanto, esses resultados também indicam que o nível de expressão a partir de uma ORF heteróloga pode ser modulado selecionando-se a unidade de transcrição na qual a ORF é clonada.

[0270] Em outros exemplos, 1) uma cópia adicional da G da ERA; ou 2) uma cópia adicional da G da ERA com uma substituição de aminoácido na posição 333, foi incorporada dentro do genoma viral da ERA. Os vírus que tiveram recuperação bem sucedida foram denominados ERA2g e ERA2g3, respectivamente. Como a quantificação da expressão da G viral não era prática, o aumento relativo nos níveis de expressão da G em células infectadas com ERA2g e ERA2g3 foi confirmado por Northern blot com uma sonda de G. Em breves termos, a sonda de gene da G da ERA foi marcada utilizando-se o Kit de Marcação de DNA Dig (Roche, Indianapolis, IN, EUA) e mapeada com o Kit de Detecção de Ácido Nucléico Dig (Roche, Indianapolis, IN, EUA) e foi medida por espectrofotometria de densidade (Fig. 7). Os genes da G ligados em série nos vírus recuperados foram também confirmados por RT-PCR com primers 5G e 3G. Uma faixa predominante indicando uma única cópia da G foi observada em 1,5kb. Além disso, uma segunda faixa mais fraca foi observada em aproximadamente 3,0kb, o que indica o arranjo em série das duas Gs.

[0271] Esses resultados demonstram que a introdução de unidades de transcrição dentro do genoma da ERA pode ser utilizada para expressar diversas proteínas heterólogas de ORFs introduzidas. Além disso, a expressão de proteínas codificadas pela ORF heteróloga é modulada pela posição em que a ORF é inserida. Assim, o vírus da ERA é um vetor amplamente adaptável para a expressão de proteínas recombinantes. Exemplo 9: Reação imunológica in vivo a vírus modificados por engenharia

[0272] Esse exemplo demonstra os efeitos in vivo da inoculação com o vírus da ERA modificado pro engenharia e de seus derivados exemplificativos. Todos os cuidados com os animais e procedimentos experimentais foram realizados de acordo com as Orientações Institucionais sobre Cuidados e Usos de Animais da CDC. Camundongos de oitenta e três semanas de idade foram divididos em 8 grupos de 10 cada para a administração intramuscular (i.m.) de vírus recuperados (106 ffu de vírus por camundongo). Dez camundongos saudáveis foram mantidos como controles de teste não infectados. Para as construções de ERA e ERAg3, injeções intra- cerebrais (i.c.) adicionais da mesma dose de vírus foram aplicadas a um outro grupo de dez camundongos de três semanas de idade. Em camundongos de dois dias de idade em amamentação, somente os vírus da ERAg3 e da ERAG foram inoculados por via intra-cerebral, com a mesma dose. Os animais foram checados diariamente quanto a doenças. Os animais doentes foram sacrificados por intoxicação com CO2 e os cérebros foram removidos para diagnósticos do vírus da raiva. Dez dias após a infecção, sangue foi coletado através da via retro-orbital e os soros obtidos para a neutralização de testes de anticorpos, segundo o teste padrão rápido de inibição de foco fluorescente (RFFIT) (Smith e outros, Bulletin of the World Health Organization. 48:535- 541, 1973). Um mês após a infecção, os animais sobreviventes foram desafiados com uma dose letal de vírus da raiva de rua (homogenato de glândula salivar de cão/coiote) (Orciari e outros, Vaccine. 19:4511-4518, 2001).

[0273] O anticorpo monoclonal de camundongo (Mab 523-11) contra a G do vírus da raiva foi mantida na CDC (Hamir e outros, Vet Rec. 136, 295-296, 1995) e o anticorpo monoclonal anti-N conjugado FITC foi comprado da Centocor (Horsham, PA). O anticorpo monoclonal da RNA polimerase do T7 foi adquirido da Novagen (Madison, WI, EUA). O conjugado FITC-IgG de cabra anti-camundongo foi comprado da Sigma- Aldrich (St. Louis, MI, EUA).

[0274] Entre os camundongos de 3 semanas de idade inoculados por via intramuscular pelas oito construções de vírus diferentes, 50% dos camundongos inoculados com ERA (rERA) ou ERA-, e 20% dos ratos inoculados com ERAverde1 mostraram sinais neurológicos moderados 10 dias após a inoculação. Nenhum outro grupo mostrou qualquer sinal sugestivo de infecção de vírus da raiva (Fig. 8A). Os soros foram coletados para neutralizar a titulação de anticorpos antes do desafio. A ERA2g (5,60 IU) e a ERA2g3 (5,61 IU) provocou títulos mais elevados do que as construções de vírus de cópia única da G (Fig. 8E). Os camundongos sobreviventes 1 mês após a inoculação foram submetidos a um desafio com um vírus de rua de cão/coiote letal (0,05 ml, mantido na CDC para os testes padronizados de desafio em animais). Nos grupos ERA e ERA-, de 40 a 62% dos camundongos demonstraram sinais de raiva moderados, respectivamente, e foram sacrificados. Todos os outros grupos sobreviveram sem quaisquer sinais de raiva (Fig. 8B). Nos grupos de i.c., camundongos de três semanas de idade sobreviveram após inoculação de ERAg3, mas sucumbiram após a injeção de ERA (Fig. 8C). A construção ERA-G não matou camundongos de dois dias de idade em amamentação, contudo, a ERAg3 foi virulenta o suficiente para matar todos os camundongos em amamentação infectados (Fig. 8D). Títulos de anticorpos exemplificativos são mostrados na Tabela 4. Tabela 5: Produção de anticorpos específicos da raiva

[0275] Esses dados demonstram que todos os vírus baseados na ERA foram capazes de provocar uma reação imunológica após a inoculação. Como esperado, os vários derivados exemplificativos provocaram uma reação imunológica protetora quando os camundongos foram inoculados antes do desafio.

[0276] Além da avaliação pós-exposição descrita acima, a habilidade dos derivados do vírus da ERA de provocar uma reação imunológica protetora após infecção com vírus da raiva virulentos foi determinada. Em breves palavras, grupos de hamsters foram infectados com uma dentre três linhagens diferentes de vírus da raiva (n=9 por grupo), e receberam a vacina recombinante (ERA-g33), ou imunoglobulina rábica mais vacinas rábicas comerciais desativadas. Aproximadamente 80-100% dos animais de controle sucumbiram, enquanto que aproximadamente 60-100% dos animais vacinados sobreviveram como mostra as Figs. 9A-C. Esses resultados demonstram que a administração pós-exposição dos vírus da raiva derivados confere substancial proteção contra diferentes linhagens do vírus da raiva.

[0277] Tendo em vista às várias modalidades possíveis a que os princípios da invenção revelada podem ser aplicados, será compreendido que as modalidades ilustradas são apenas exemplos preferidos da invenção e não devem ser consideradas como limitativas do escopo da invenção. Ao revés, o escopo da invenção é definido pelas reivindicações a seguir. É, portanto, reivindicado como invenção tudo o que estiver dentro do escopo e do espírito dessas reivindicações.

Claims (16)

1. Sistema de vetores compreendendo: - um primeiro vetor compreendendo DNA antigenômico de vírus da raiva completo, caracterizado por o DNA antigenômico completo compreender DNA antigenômico da linhagem ERA da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 ou SEQ ID NO: 18 e, - uma pluralidade de vetores auxiliares compreendendo um vertor que compreende um sequência de polinucleotídeo que codifica um vetor compreendendo uma seqüência de polinucleotídeos que codifique uma proteína N de vírus da raiva; um vetor compreendendo uma seqüência de polinucleotídeos que codifique uma proteína P de vírus da raiva; um vetor compreendendo uma seqüência de polinucleotídeos que codifique uma proteína L de vírus da raiva; e um vetor compreendendo uma seqüência de polinucleotídeos que codifique uma RNA-polimerase de bacteriófago T7, compreendendo uma sequência NLS, em que a expressão da pluralidade de vetores em uma célula hospedeira transfectada resulta na produção de um vírus da raiva recombinante.

2. Sistema de vetores de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por os vetores serem plasmídeos.

3. Sistema de vetores de acordo com a reivindicação 1 ou a reivindicação 2, caracterizado por o primeiro vetor compreender em uma direção de 5’ para 3’: uma ribozima de peixe-martelo; um cDNA antigenômico de vírus da raiva; e uma ribozima de vírus da hepatite D, em que uma pluralidade de nucleotídeos da ribozima de peixe-martelo são complementares à seqüência genômica de sentido contrário do vírus da raiva.

4. Sistema de vetores de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por a transcrição do cDNA antigenômico estar sob o controle regulatório de transcrição de ao menos um dos promotores de CVM e promotores RNA-polimerase de bacteriófago T7.

5. Sistema de vetores de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por a transcrição do cDNA antigenômico estar sob o controle regulatório de transcrição tanto do promotor CMV e como do promotor de RNA-polimerase de bacteriófago T7.

6. Sistema de vetores de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por a pluralidade de vetores auxiliares compreender um vetor compreendendo uma seqüência de polinucleotídeos que codifique uma proteína M de vírus da raiva;

7. Sistema de vetores de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por compreender ainda um vetor compreendendo uma seqüência de polinucleotídeos que codifique uma proteína G de vírus da raiva.

8. Sistema de vetores de acordo com a reivindicação 6 ou reivindicação 7, caracterizado por a transcrição de uma ou mais das sequências de polinucleotídeos que codificam a proteína N, P, M, L ou G do vírus da raiva ou a polimerase de T7 estar sob o controle regulatório de transcrição tanto do promotor CMV como do promotor de T7.

9. Genoma de vírus recombinante caracterizado por compreender o ácido nucléico como definido em SEQ ID NO:1.

10. Genoma de vírus recombinante caracterizado por compreender o ácido nucléico como definido em SEQ ID NO:7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 18.

11. Genoma de vírus recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 9-10, caracterizado por compreender ainda um vetor.

12. Genoma de vírus recombinante de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por o vetor ser um plasmídeo.

13. Vírus recombinante caracterizado por compreender um genoma como definido na reivindicação 10.

14. Vacina anti-rábica viva compreendendo ao menos um genoma de vírus de raiva recombinante, caracterizada por o genoma de vírus de raiva recombinante compreender: - a seqüência mostrada em SEQ ID NO: 8; - a seqüência mostrada em SEQ ID NO: 10; - a seqüência mostrada em SEQ ID NO: 13. - a seqüência mostrada em SEQ ID NO: 16; ou - a seqüência mostrada em SEQ ID NO: 17.

15. Método para produzir uma vacina viva de vírus da raiva, caracterizado por compreender a introdução do sistema de vetores de qualquer uma das reivindicações 1 a 8 em uma célula hospedeira in vitro, e a recuperação de vírus da raiva recombinante.

16. Composição farmacêutica caracterizada por compreender a vacina anti-rábica viva da reivindicação 14 ou da reivindicação 16 e um portador ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

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