BRPI0617373A2

BRPI0617373A2 - composições e métodos do vìrus da raiva

Info

Publication number: BRPI0617373A2
Application number: BRPI0617373-0A
Authority: BR
Inventors: Charles E Rupprecht; Xlanfu Wu
Original assignee: Goverment Of The United States Of America Representado Por The Secretary Of The Dept Of Health And H
Priority date: 2005-10-14
Filing date: 2006-10-13
Publication date: 2013-01-01
Also published as: EP2351843A3; US7863041B2; WO2007047459A1; ZA200803131B; US20110070264A1; HK1123326A1; US20080274130A1; CA2624768A1; EP1945780B1; CA2943039C; WO2007047459A8; AU2006304268A2; BRPI0617373B1; EP1945780A1; EP2351843A2; CA2624768C; CN101287838B; CA2943039A1; EP2351843B1; HK1223968A1

Abstract

COMPOSIçõES E MéTODOS DO VìRUS DA RAIVA. Composições e métodos do Vírus da Raiva são fornecidos. A sequência completada linhagem Evelyn-Rokitnicki-Abelseth (ERA) do Vírus da Raiva é revelada. Um sistema de genética reversa para a produção de vírus da ERA recombinante e seus derivados é fornecido, juntamente com composições que incluem vírus, ácidos nucléicos e/ou proteínas derivadas da linhagem ERA. Em alguns casos, as composições são composições imunogênicas úteis para os tratamentos à pré ou à pós-exposição ao vírus da Raiva.

Description

RELATÓRIO DESCRITIVO Pedido de Patente de Invenção para "COMPOSIÇOES E

MÉTODOS DO VÍRUS DA RAIVA".

Referência a Pedido(s) de Patente Relacionado(s)

Este pedido de patente reivindica o benefício do Pedido de Patente Provisório No. US 60/727,038, depositado em 14 de outubro de 2005, o qual é aqui incorporado em sua totalidade como referência.

Declaração de Suporte Governamental

Esta invenção foi feita pelos Centros para o Controle e a Prevenção de Doenças (<Centers for Disease Control and Prevention), uma agência do Governo dos Estados Unidos. Em conseqüência, o Governo dos Estados Unidos possui certos direitos sobre a invenção.

Campo

Esta divulgação se refere ao campo da virologia. Mais especificamente, esta divulgação se refere a composições e métodos que são úteis para a produção de composições imunogênicas, para proteger mamíferos da infecção por vírus rábicos.

Fundamentos da Divulgação

A Raiva permanece sendo uma das doenças mais aterradoras, que afeta seres humanos e animais, apesar dos avanços científicos significativos em sua prevenção e em seu controle. A Raiva se apresenta como um problema distinto em diferentes partes do mundo. Nas Américas, existem reservatórios de raiva em muitas espécies animais, incluindo guaxinins, gambás, raposas e morcegos (Rupprecht e outros, Emerg. Infect Dis. 1(4): 107-114, 1995). Epidemias de infecções de raiva nesses mamíferos terrestres são descobertas em vastas regiões geográficas pelos Estados Unidos. Por exemplo, a raiva do guaxinim afeta uma região de mais de 1 milhão de quilômetros quadrados, da Flórida até Maine. Embora a raiva em espécies selvagens ainda exista em países desenvolvidos, fez-se progresso no controle e na eliminação da raiva em espécies selvagens, através do uso da imunização oral de animais selvagens.

Ainda assim, a raiva permanece sendo uma grande ameaça à saúde pública, e persiste ocasionando entre 50.000 e 60.000 mortes humanas a cada ano (Organização Mundial da Saúde, Abril 2003). Os seres humanos tornam-se infectados com o vírus da raiva principalmente através de mordidas de animais rábicos, domésticos e selvagens. Nos países em desenvolvimento, os cães são responsáveis por aproximadamente 94% das mortes humanas por raiva. A raiva de cães ainda é epidêmica na maioria dos países da África, Ásia e América do Sul, e nesses países os cães são responsáveis pela maior parte das mortes pela doença. O controle da infecção do vírus da raiva em animais domésticos e selvagens, portanto, não apenas reduz a mortalidade nesses animais, mas também

reduz o risco à exposição humana. I0 o vírus da raiva é transmitido através de aberturas na pele por

mordida ou arranhão de um animal infectado. A exposição ao vírus da raiva

resulta em sua penetração em extremidades nervosas periféricas, sem mielina,

seguida por seu espalhamento através de transporte axonal retrógrado, a

replicação ocorrendo exclusivamente nos neurônios e, finalmente, a chegada no

sistema nervoso central (SNC). A infecção do SNC causa disfunção celular e

morte (Rupprecht & Dietzschold, Lab. Invest. 57:603, 1987). Como o vírus da

raiva se propaga diretamente de uma célula a outra, ele praticamente contorna o

reconhecimento imunológico (Clark & Prabhakar, Rabiesi Em: Olson e outros,

eds., Comparative Pathology of Viral Disease, 2:165, Boca Raton, FL, EUA,

CRC Press, 1985).

O vírus da raiva (VR) é um rabdovírus-um vírus de RNA não segmentado com polaridade de sentido negativo. Dentro da família dos rhabdovírus, o vírus da raiva é o protótipo do gênero Lyssavirus. O VR é composto de dois principais componentes estruturais: uma núcleocápsideo ou proteína-ribonucléica (PRN), e um envelope na forma de uma membrana de duas camadas que envolve o núcleo de PRN. O componente infeccioso de todos os rhabdovírus é o núcleo de PRN, o qual consiste no genoma de RNA de filamento negativo em encapsidação por nucleoproteína (N) em combinação com RNA- polimerase dependente-RNA (L) e fosfoproteína (Ρ). A membrana que envolve a PRN contém duas proteínas: a glicoproteína trans-membrana (G) e a proteína matricial (M), localizadas no interior da membrana. Portanto, o genoma viral codifica estas cinco proteínas: as três proteínas da PRN (N,Le P), a proteína

matricial (M) e a glicoproteína (G).

Os determinantes moleculares de patogenia de várias linhagens do vírus da raiva não foram totalmente elucidados. A patogenia do VR foi atribuída a eventos multigênicos (Yamada e outros, Microbiol ImmunoL 50:25-32, 2006). Por exemplo, algumas posições no genoma do VR, se sofrerem mutação, afetam a transcrição ou a replicação viral, reduzindo a virulência. Mutações no resíduo serina 389 do local de fosforilação do gene N (Wu e outros, J. Virol 76:4153- 4161, 2002) ou na seqüência central GDN do motivo protéico (motifi C altamente conservado no gene L (Schnell e Conzelmann, Virol 214:522-530, 1995) reduziram dramaticamente a transcrição e a replicação do VR.

A proteína G, também referida como proteína de pico, está envolvida na ligação celular e na fusão de membrana do VR. A região de aminoácido nas posições 330 a 340 (referida como local antigênico III) da proteína G foi identificada como importante para a virulência de certas linhagens do VR. Diversos estudos sustentam o conceito de que a patogenia de linhagens fixas do VR é determinada pela presença de arginina ou lisina no resíduo de aminoácido 333 da glicoproteína (Dietzschold e outros, Proc. Natl Aead Sei. USA 80: 70-74, 1983; Tuffereau e outros, Virol 172: 206-212, 1989). Este fenômeno parece ser aplicável ao menos aos vírus da raiva

fixos tais como as linhagens CVS, ERA, PV, SAD-B19 e HEP-Flury (Anilionis e outros, Nature 294:275-278, 1981; Morimoto e outros, Virol 173:465-477, 1989). Por exemplo, vírus de vacina da raiva possuindo um aminoácido diferente de Arg na posição 333 da glicoproteína como descrito, por exemplo, em WO 00/32755 (que descreve mutantes do VR nos quais todos os três nucleotídeos no códon da proteína G Arg333 são alterados em comparação com o vírus mãe, de maneira que a Arg na posição 333 seja substituída com outro aminoácido); na Patente Européia 350398 (que descreve um mutante do VR não-virulento SAGl derivado da linhagem Bern SAD do VR, em que o Arg na posição 333 da glicoproteína é substituído por Ser); e no pedido de patente Europeu 583998 (que descreve um mutante do VR atenuado, SAG2, no qual o Arg na posição 333 na proteína G é substituído por Glu). Outras linhagens, tais como a linhagem RC-HL, possuem um resíduo de arginina na posição 333 da G, mas não causam infecção letal em camundongos adultos (Ido e outros, MicroL ImmunoL 38:479-482, 1994; Ito e outros, J. ViroL 75:9121-9128, 2001). Desta forma, toda a G pode contribuir para a virulência do VR, embora os determinantes ou as regiões não tenham sido antes identificados. O gene da G codifica a única proteína que induz um anticorpo neutralizante viral. Ao menos três estados da glicoproteína do VR são conhecidos: o estado nativo (N) sendo o responsável pela ligação de receptores; um estado hidrofóbico ativo (A) necessário na etapa inicial no processo de fusão de membrana (Gaudin, J. Cell BioL 150:601-612, 2000), e uma conformação inativa de fusão (I). O dobramento e a maturação corretos da G desempenham papéis importantes para o reconhecimento imunológico. As três posições glicosiladas potenciais no domínio da ERA G extracelular ocorrem nos resíduos de Asn37, Asn247 e Asn319 (Wojczyk e outros, Glycobiology. 8: 121-130, 1998), respectivamente. A não-glicosilação da G não só afeta a conformação, mas também inibe a apresentação da proteína na superfície celular. Portanto, a elucidação dos determinantes moleculares que fundamentam a patogenia do vírus da raiva apresenta um problema complexo.

Síntese da Divulgação A seqüência completa da linhagem de vírus que corresponde à

vacina fixa de Evelyn-Rokitnicki-Abelseth (ERA) para o vírus da raiva é revelada aqui, juntamente com métodos para seqüenciar estas e outras linhagens de Lyssavirus.

Um sistema de genética reversa para o vírus da raiva é também descrito, em particular utilizando a linhagem do vírus da raiva ERA como um exemplo. O uso de uma RNA polimerase de T7, contendo um sinal de localização nuclear (NLS) de oito aminoácidos na extremidade terminal N facilitou a recuperação do vírus. Além da linhagem do vírus da ERA mãe, diversos outros vírus derivados são descritos, incluindo ERA- (remoção da região psi), ERAverdel (gene de proteína fluorescente verde inserido na região psi), ERAverde2 (gene de proteína fluorescente verde inserido na região intergênica de fosfoproteína e proteína matriz), ERA2g (contendo uma cópia extra da glicoproteína na região psi), ERAg3 (com uma mutação no aminoácido 333 na glicoproteína), ERA2g3 (com uma cópia extra da glicoproteína alterada no aminoácido 333 na região psi), ERA-G (em que a glicoproteína foi removida), ERAgm (genes MeG trocados no genoma), e ERAgmg (duas cópias da G na construção rearranjada de ERAgm). A unidade de transcrição extra foi incorporada dentro do genoma do vírus da ERA para a expressão eficiente de Fases Abertas de Leitura (ORFs). Otimizando-se as condições de propagação, as quais são descritas aqui, os vírus resgatados atingem títulos que excedem IO9 ffu/ml tanto em frascos de bioreatores como de tecido estacionário.

É também revelada uma linhagem celular modificada que constitutivamente expressa a glicoproteína da ERA. A linhagem celular, denominada BSR-G, é útil para a produção de vírus da raiva recombinantes,

incluindo os atenuados e/ou os deficientes em replicação.

O acima exposto e outros objetivos, recursos e vantagens da invenção ficarão mais aparentes a partir da seguinte descrição detalhada. Breve Descrição dos Desenhos

Fig. IA - Ilustração esquemática do plasmídeo de transcrição da ERA. Posições das enzimas de ácido ribonucléico (ribozimas) em cabeça-de- martelo e do genoma da ERA anti-genômico são indicadas graficamente. As posições relativas das proteínas Ν, Ρ, M, G e L são mostradas em uma direção de

5' para 3'.

Fig. IB - Diagrama esquemático de construção do plasmídeo pTMF de cDNA genômico do vírus da raiva de comprimento completo.

Fragmentos Fl, F2 de produtos de RT-PCR e locais de reconhecimento de enzima de restrição (Nhel, Kpnl1Blpl, Pstl e Notl) (não desenhado em escala). A barra à esquerda indica uma ribozima em cabeça de martelo RdRz e a barra à direita indica a ribozima do vírus delta da hepatite HDVRz. O símbolo ♦ indica que os locais Kpnl ou Pstl foram removidos, e a seta vertical * indica que os

IocaisNhel ou Notl foram deixados intactos.

Fig. 2 - Ilustração esquemática do mecanismo proposto de

atuação autogênica da RNA polimerase do NLST7. O complexo de reagentes

de transfecção de DNA é trazido para dentro de células por endocitose. A maior parte do DNA liberado dos lisossomos e endossomos é retida no citoplasma da célula. Uma quantidade limitada de plasmídeos são transfectadas para o núcleo: 1) através de um promotor imediato-prematuro de CMV, o gene do NLST7 é transcrito pela RNA polimerase celular II; 2) mRNA de NLST7 maduro é transportado do núcleo para o citoplasma para a síntese de RNA polimerase do NLST7; 3) a RNA polimerase do NLST7 recentemente sintetizada é trans-locada para o núcleo, enquanto que uma quantidade residual de NLST7 permanece no citoplasma; 4) a RNA polimerase do NLST7 inicia a transcrição através de um promotor de pT7. Por modificações pós-transcricionais, mRNA de NLST7 adicional é para a síntese de proteínas, desse modo aumentando a eficiência do resgate de vírus.

Fig. 3 - Diagrama esquemático dos 10 genomas derivados de vírus da ERA. O tamanho de cada gene não é desenhado em escala. O símbolo "*" denota mutações da G no resíduo Aa333 e Ψ é a região Psi.

Fig. 4A - Análise vírus da ERA-G recuperado em células transfectadas, espalhamento e crescimento em uma linha de células BHK-G. Em A, os focos virais de ERA-G foram restringidos mesmo depois de sete dias de pós-transfecção com plasmídeos para a recuperação de vírus. Em B, os vírus da ERA-G resgatados não se espalharam após passarem por células BSR normais. Somente células individuais foram manchadas por DFA. Em C, o vírus da ERA cresceu bem na linhagem celular BHK-G constitutiva.

Fig. 4B - Análise de expressão da G em uma linhagem de células BHK-G. Por indicação indireta de mancha fluorescente, a G do vírus da raiva da ERA foi expresso no citoplasma em uma linhagem de células BHK-G estável.

Fig. 4C - Análise de mRNA da G em células infectadas por vírus da ERA-G por Northern Blot com uma sonda de G. A segunda coluna mostra que o mRNA do gene da G foi detectado em células BHK-G infectadas por vírus da ERA-G, enquanto que no RNA genômico do vírus não foi detectado. A coluna 1 foi o controle do RNA total das células BHK-G infectadas por vírus da raiva da ERA-, onde tanto o mRNA da G quanto o RNA genômico viral foram detectados. Fig. 5 - Curva do crescimento de vírus em uma única etapa.

Todas as linhagens ERA do vírus da raiva recuperadas cresceram até IO9 ou IO10 ffu/ml, mas a ERA-G só chegou até 107ffu/ml.

Fig. 6 - Focos verdes em células BSR infectadas com vírus da raiva da ERAverdel/ERAverde2. Transi é a unidade de transcrição incorporada nas regiões intergênicas Psi e L. Trans2 é a unidade de transcrição nas regiões intergênicas P e M. Ambas as ERAverdel e a ERAverde2 expressaram a proteína GFP de forma estável em células BSR infectadas com vírus, enquanto que a ocorrência dos focos verdes da ERAverde2 ocorreu 48 horas mais cedo depois a infecção com vírus do que a ERAverdel.

Fig. 7 - Análise da expressão do mRNA da G em vírus da raiva da ERA rearranjada em duplo G, e G, M. No Northern blot com uma sonda de G, a medição por fotometria de densidade de mRNA da G na ERA2g (coluna 1), na ERAgm (coluna 3) e na ERA2g3 (coluna 4) representou níveis acentuados de mRNA, em comparação com as células infectadas com vírus da ERA (coluna 2). As razões foram calculadas através do uso de vírus da ERA como 100%.

Fig. 8A - Sobrevivência após desafio em camundongos inoculados com ERA recombinantes e derivados. Camundongos de três semanas de idade foram inoculados intra-muscularmente com os oito vírus recuperados. Em 10 dias após a inoculação, nos grupos ERA, ERA- e ERAverdel, 50%, 50% e 20% dos camundongos mostraram sinais clínicos de raiva, mas sem mortalidade, respectivamente. Nenhum sinal adverso foi

observado nos outros grupos.

Fig. 8B - Sobrevivência após desafio em camundongos inoculados com ERA recombinantes e derivados. Os camundongos sobreviventes ao teste da Fig. 8A foram desafiados intra-muscularmente com um vírus da raiva de cão/coiote do Texas. Em 5 dias após o desafio, nos grupos ERA e ERA-, 40 e 62% dos camundongos mostraram sinais de raiva e foram sacrificados, respectivamente. Em todos os outros grupos, nenhum sinal de raiva foi observado.

Fig. 8C - Sobrevivência após inoculação i.c. com vírus da ERA e ERAg3 recombinantes. Camundongos de três semanas de idade foram inoculados com linhagens de vírus da ERAg3 e ERA-G, respectivamente. Todos os camundongos sucumbiram 15 dias após a inoculação no grupo ERA, enquanto que no grupo ERAg3 todos os camundongos sobreviveram sem sinais clínicos.

Fig. 8D - Sobrevivência após inoculação i.c. de camundongos em amamentação. Camundongos de dois dias em amamentação foram inoculados intra-cerebralmente com construções de vírus da ERAg3 e ERA-G, respectivamente. Todos os camundongos sucumbiram no grupo ERAg3, enquanto que nenhum camundongo morreu no ERA-G.

Fig. 8E - Neutralização de título de anticorpo em camundongos com ERA recombinante e vírus derivados. Títulos de anticorpos de neutralização em camundongos foram determinados pelo RFFIT, na faixa desde 1,36 até 5,61 IU por ml dentre os grupos inoculados com vírus.

Fig. 9A - Sobrevivência após infecção com vírus da Raiva de Morcego do Alabama. Hamsters foram inoculados com Vírus da Raiva de Morcego do Alabama vivos, depois tratados pós-exposição com vírus da ERAg3 ou imunoglobulina de raiva e com vacina de VR inativa disponível comercialmente. A sobrevivência foi avaliada ao longo de um período de mais de três meses.

Fig. 9B - Sobrevivência após infecção com vírus da Raiva de

Cão de Rua da Tailândia. Hamsters foram inoculados com Vírus da Raiva de Morcego do Alabama vivos, depois tratados pós-exposição com vírus da ERAg3 ou imunoglobulina de raiva e com vacina de VR inativa disponível comercialmente. A sobrevivência foi avaliada ao longo de um período de mais de três meses.

Fig. 9C - Sobrevivência após infecção com vírus da Raiva de Cão Coiote do Texas. Hamsters foram inoculados com Vírus da Raiva de Morcego do Alabama vivos, depois tratados pós-exposição com vírus da ERAg3 ou imunoglobulina de raiva e com vacina de VR inativa disponível comercialmente. A sobrevivência foi avaliada ao longo de um período de mais de três meses.

Listagem de Seqüências As seqüências de ácidos nucléicos e de aminoácidos listadas na listagem de seqüências em anexo são mostradas utilizando-se abreviações de letras padronizadas para as bases dos nucleotídeos, e códigos de três letras para os aminoácidos, conforme definido em 37 C.R.F. 1.822. Apenas um filamento de cada seqüência de ácido nucléico é mostrado, mas o filamento complementar deve ser considerado como incluído por qualquer referência ao filamento mostrado a não ser que o contexto deixe claro que apenas um filamento deve ser considerado. Convenientemente, deve ser entendido que uma seqüência apresentada como DNA pode ser convertida para RNA substituindo-se os

resíduos de tiamina por uracilas.

SEQ ID NO: 1. Vírus tipo selvagem da ERA CDC, 11.931

nucleotídeos

nucleotídeos 1-58, Região Líder nucleotídeos 71-1420, gene da N nucleotídeos 1514-2404, gene da P

nucleotídeos 2496-3101, gene da M nucleotídeos 3317-4888, gene da G nucleotídeos 4964-5362, região-Psi nucleotídeos 5417-11797, gene L nucleotídeos 11862-11931, região Seguidora

SEQ ID NO: 2. ERACDC: 71 a 1420: 450 aa, proteína N. SEQ ID NO: 3. ERACDC: 1514 a 2404: 297 aa, proteína P. SEQ ID NO: 4. ERACDC: 2496 a 3101: 202 aa, proteína M. SEQ ID NO: 5. ERACDC: 3317 a 4888: 524 aa, proteína G. SEQ ID NO: 6. ERACDC: 5417 a 11797: 2127 aa, proteína L.

SEQ ID NO: 7. ERA (rERA) recombinante por sistema de genética reversa é de 11.930 nucleotídeos. O tubo de poli (Ag) específico entre o gene da Gea região-psi na linhagem ERA do tipo selvagem passou por mutação para um tubo de poli (A7) em sistema de genética reversa de ERA recombinante como um marcador de seqüência. À luz disso, a rERA é mais curta do que a ERA do tipo selvagem por uma molécula. Todas as outras informações da seqüência são exatamente as mesmas. SEQ ID NO: 8. linhagem ERAg3 (11.930 nucleotídeos), aminoácido na proteína G (333 Aa) foi alterado; os ácidos nucléicos

correspondentes estão nas posições 4370 a 4372.

SEQ ID NO: 9. ERA- (11.577 nucleotídeos), sem a região psi (pseudo-região); uma unidade de transcrição extra foi introduzida nas posições de

nucleotídeo 4950 a 5008.

SEQ ID NO: 10. ERA-2G (13.150 nucleotídeos), esta linhagem

tem duas cópias do gene da G; a segunda cópia é inserida nas posições 4988 a 6559.

SEQ ID NO: 11. ERAverde (12.266 nucleotídeos), esta linhagem contém a seqüência codificadora para a GFP nas posições 4993 e 5673; ela aparece verde sob luz UV após a infecção das células ou do tecido.

SEQ ID NO: 12. ERA-G (10.288 nucleotídeos), esta linhagem não

tem o gene da G.

SEQ ID NO: 13. ERA-2g3 (13.150 nucleotídeos); esta linhagem tem duas cópias do gene da G (sendo que a segunda cópia está nas posições 4988 a 6559), ambas as quais são substituídas no aminoácido 333 (correspondente às posições de nucleotídeo 4370-4372 e 6041-6043 na seqüência mostrada).

SEQ ID NO: 14. ERA-pt (11.976 nucleotídeos, com uma unidade

de transcrição extra após o gene da P, nas posições 2469 a 2521).

SEQ ID NO: 15. Nucleotídeos ERA-pt-GFP (12.662 nucleotídeos,

com gene da GFP inserido após o gene P em 2505 a 3185.

SEQ ID NO: 16. ERA-gm (11.914 nucleotídeos) as posições dos genes da G e da M são trocadas na G nas posições 2505-4076 e da M nas

posições 4122-4127, respectivamente.

SEQ ID NO: 17. ERAg3m (11.914 nucleotídeos) as posições dos

genes da G e da M são trocadas na G nas posições 2505-4076 e da M nas

posições 4122-4127, respectivamente. O gene da G passa por mutação na posição

de aminoácido 333.

SEQ ID NO: 18. ERAgmg (13.556 nucleotídeos), esta linhagem

tem duas cópias do gene da G nas posições 2505-4076 e 4943-6514, flanqueando

o gene da M nas posições 4122-4727. SEQ ID NO: 19. Dez primeiros nucleotídeos da ribozima em cabeça de martelo correspondendo à extremidade 5' do genoma da ERA do vírus da raiva.

SEQ ID NO: 20. Seqüência de nucleotídeos que codifica o sinal de

localização nuclear (NLS) ao antígeno SV40 T.

SEQ ID NOs: 21-23. Seqüência Kozak artificiais.

SEQ ID NOs: 24-57. Oligonucleotídeos sintéticos.

SEQ ID NO: 58. Seqüência de aminoácidos da proteína G com

mutação na posição de aminoácido 333 (de Arg até Glu).

SEQ ID NOs: 59-65. Oligonucleotídeos sintéticos.

DESCRIÇÃO DETALHADA

I, Introdução

As zoonoses virais são difíceis de prevenir. Um grande paradigma é o controle da raiva em animais selvagens por vacinação oral. Todas as vacinas de raiva orais atualmente licenciadas se baseiam em uma fonte comum. O vírus da raiva (VR) fixo de Evelyn-Rokitnicki-Abelseth (ERA) foi derivado da linhagem de Street-Alabama-Duffering (SAD), primeiramente isolada a partir de um cão raivoso no Alabama (EUA) em 1935. A linhagem ERA foi derivada após múltiplas passagens do VR SAD no cérebro de camundongos, em células de rim de filhote de hamster (BHK), e embriões de galinha. A clonagem repetida da ERA em células de BHK resultou eventualmente em um clone B-19, que foi denominado SAD-B19 para estudos sobre vacinas. A primeira linhagem do VR recuperada por genética reversa foi o SAD-B19. Embora o VR SAD-B19 e o ERA sejam derivados da mesma fonte, diferentes resultados foram observados em vários estudos sobre vacinas orais em animais. Por exemplo, o ERA não induziu anticorpos de neutralização evidentes em gambás ou em guaxinins, enquanto que o SAD-B19 induziu. Para elucidar as potenciais diferenças entre essas duas linhagens do VR, um sistema de genética reversa para a linhagem

ERA do VR é necessária.

A genética reversa apresenta um caminho viável para modificar vírus de RNA de formas definidas. Um sistema para a genética reversa de uma linhagem inicial de vírus da raiva foi estabelecida com sucesso em 1994 (Schnell e outros, The EMBO J. 13, 4195-4203, 1994). Na década passada, foram feitos melhoramentos ao sistema, resultando em uma maior eficiência da recuperação do vírus. Essa eficiência aumentada facilitou a elucidação da patogenia do vírus,

interações proteína-proteína, e proteína-RNA.

Dentro do genoma do vírus da raiva, foi proposto que algumas regiões contêm sinais importantes, tais como região de promotores distai viral, encapsidação de nucleoproteína, local de iniciação de transcrição da RNA polimerase L dependente de RNA, poliadenilação e locais de terminação. Esses sinais são importantes para assegurar a recuperação eficiente de vírus e para projetar uma unidade de transcrição extra para aceitar uma Fase Aberta de Leitura (ORF) exógena dentro do genoma do vírus da raiva.

Esta divulgação oferece um sistema de genética reversa eficiente, e descreve o seu uso para produzir variantes do vírus da linhagem ERA. As modificações descritas aqui resultaram em linhagens que são candidatas adequadas para aceitar a expressão da ORF e o desenvolvimento de vacinas.

O sistema de genética reversa é composto de um conjunto de plasmídeos. Um primeiro plasmídeo inclui um cRNA viral de ERA. Para criar extremidades anti-genômicas virais autênticas no cDNA viral transcrito, cDNA ZO genômico de ERA é abordado por uma ribozima em cabeça-de-martelo na extremidade 3' e uma ribozima de vírus delta da hepatite na extremidade 5'. A fita anti-genômica é fundida ao sinal de iniciação de transcrição do fago bacterial T7, que está opcionalmente sob o controle do promotor imediato-prematuro de

citomegalovírus (CMV). O sistema também inclui uma pluralidade de plasmídeos auxiliares

que codificam proteínas envolvidas na encapsidação viral. Por exemplo, o

sistema tipicamente inclui plasmídeos auxiliares que codificam a nucleoproteína

viral (N), a fosfoproteína (P), polimerase dependente de RNA (L), e

opcionalmente a glicoproteína viral (G). O sistema também inclui um plasmídeo

que codifica a RNA polimerase do fago T7, que pode ser modificado pela adição

de um sinal de localização nuclear (NLS) para aumentar a expressão da

polimerase do T7 no núcleo de células transfectadas. O plasmídeo de expressão da RNA polimerase do T7 é construído como um "autogene", que transcreve o comprimento inteiro de cRNA anti-genômico viral para encapsidação de nucleoproteínas após a transfecção para dentro de células.

O sistema de genética reversa é útil na concepção e produção de composições imunogênicas para o tratamento (pré e/ou pós exposição) de vírus da raiva, e para produzir vetores de vírus da raiva ERA para expressar Fases Abertas de Leitura (ORFs) exógenas. Por exemplo, uma unidade de transcrição extra pode ser projetada, testada e incorporada dentro do genoma de ERA na região Psi e/ou na região intergênica de fosfoproteína (P) -matriz (M) de proteína. Essencialmente, qualquer ORF de interesse pode ser expressa no contexto do vetor ERA, incluindo antígenos codificadores de ORFs de vírus e outros patogênios, tais como os antígenos de outros lyssavirus, assim como para

expressar outras proteínas de interesse terapêutico.

Portanto, os métodos e as composições revelados aqui são úteis para a concepção e a produção de composições imunogênicas de vírus da raiva, incluindo composições adequadas como vacinas para o tratamento pré- e/ou pós- exposição do vírus da raiva.

II. Abreviações

ADE intensificação dependente de anticorpos

Ag-ELISA ELISA de captura de antígenos

DNA ácido desoxirribonucléico

ERA linhagem do vírus da Raiva de Evelyn-Rokitnicki-Abelseth

ELiSA ensaio imunoabsorvente com ligação enzimática

G glicoproteína

j.Ci intra-cerebral

IPA ensaio de imunofluorescência indireto

jm intramuscular

L RNA polimerase dependente de RNA

M proteína matricial

mAb anticorpo monoclonal

N nucleoproteína

ORF fase de leitura aberta

ρ fosfoproteína

pçR reação em cadeia de polimerase J1ace rápida amplifícação de extremidades 5' de cDNA

RNA ácido ribonucléico

RNP ribonucleoproteína

RT-PCR reação em cadeia de polimerase de transcrição reversa

RV vínis c^a ra*va

lrans_l unidade de transcrição extra 1

trans-2 unidade de transcrição extra 2

IIL Termos

A não ser que seja explicado de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado entendido comumente por alguém versado no assunto ao qual esta invenção pertence. De forma semelhante, a não ser que indicado de outra forma, os termos técnicos são usados de acordo com o uso convencional. As definições dos termos comuns na biológica molecular podem ser encontradas em Benjamin Lewin, Genes V, publicado por Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew e outros (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, publicada por Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); e Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Referencei publicado por

VCHPublishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8).

Os termos singulares "um", "uma", "o" e "a" incluem os referentes plurais, a não ser que o contexto indique claramente o contrário. De forma semelhante, a palavra "ou" pretende incluir "e", a não ser que o contexto indique claramente o contrário. Assim, "compreendendo A ou B" significa a inclusão de A, ou B, ou de A e B. Deve ser compreendido ainda que todos os tamanhos de bases ou tamanhos de aminoácidos, e todos os valores de peso molecular ou de massa molecular, dados para os ácidos nucléicos ou para os polipeptídios, são

aproximações, e são fornecidos em prol da descrição.

Para facilitar a revisão das várias modalidades da invenção, as

seguintes explanações de termos específicos são fornecidas: Adjuvante: Uma substância que acentua de forma não-específica a

reação imunológica a um antígeno. O desenvolvimento de adjuvantes de vacinas para uso em seres humanos é revisado em Singh e outros (.Nat. Biotechnol 17:1075-1081, 1999), o qual revela que, ao tempo de sua publicação, os sais de

20 alumínio e a micro-emulsão MF59 eram os únicos adjuvantes de vacina

aprovados para o uso em seres humanos.

Amplificação: A amplificação de uma molécula de ácido nucléico

(por ex., uma molécula de DNA ou de RNA) se refere ao uso de uma técnica de laboratório que aumente o número de réplicas de uma molécula de ácido nucléico em uma amostra. Um exemplo de amplificação é a reação em cadeia de polimerase (PCR), em que uma amostra é posta em contato com um par de primers de oligonucleotídeos sob condições que permitem a hibridação dos primers para um molde (ou modelo) de ácido nucléico na amostra. Os primers são estendidos sob condições adequadas, dissociados do molde, re-anelados, estendidos e dissociados para amplificar o número de réplicas do ácido nucléico. O produto da amplificação pode ser caracterizado por técnicas como a eletroforese, padrões de clivagem de endonuclease de restrição, hibridação ou ligação de oligonucleotídeos, e/ou seqüenciamento de ácidos nucléicos. Outros exemplos de métodos de amplificação incluem a

amplificação de deslocamento de filamento, como revelada na Patente US5744311; amplificação isotérmica sem transcrição, como revelada na Patente US6033881; amplificação de reação em cadeia de reparo, como revelada em W090/010Ó9; amplificação de reação em cadeia de ligase, como revelada em EP-A-320308; amplificação de reação em cadeia de ligase por preenchimento de espaços vazios, como revelada na Patente US5427930; e a amplificação sem transcrição de RNA NASBA™, como revelada na Patente US6025134. O método de amplificação pode ser modificado, incluindo, por exemplo, etapas adicionais ou o casamento da amplificação com um outro protocolo. Animal: Organismos vertebrados multicelulares vivos, uma

categoria que inclui, por exemplo, os mamíferos e as aves. O termo "mamífero" inclui tanto mamíferos humanos como não-humanos. De forma semelhante, o termo "sujeito" inclui tanto sujeitos humanos como sujeitos veterinários, por exemplo, seres humanos, primatas não-humanos, cães, gatos, cavalos e vacas. Anticorpo: Uma proteína (ou um complexo de proteínas) que

inclua um ou mais polipeptídios substancialmente codificados por genes de imunoglobulina ou por fragmentos de genes de imunoglobulina. Os genes de imunoglobulina reconhecidos incluem os genes de regiões constantes kappa, lambda, alfa, gama, delta, épsilon e um, assim como os genes de regiões variáveis de imunoglobulina miríades. As cadeias leves são classificadas como kappa ou lambda. As cadeias pesadas são classificadas como gama, um, alfa, delta ou épsilon, que por sua vez definem as classes de imunoglobulina, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente. A unidade estrutural de imunoglobulina (anticorpo) básica é geralmente um tetrâmero. Cada tetrâmero é composto por dois pares idênticos de cadeias de polipeptídio, cada uma possuindo uma cadeia "leve" (aproximadamente 25 kDa) e uma "pesada" (aproximadamente 50-70 kDa). A N-terminal de cada cadeia define uma região variável de aproximadamente 100 a 110 ou mais aminoácidos responsáveis principalmente pelo reconhecimento de antígenos. As expressões "cadeia leve variável" (Vl) e "cadeia pesada variável" (Vh) se referem, respectivamente, a estas cadeias leves e pesadas.

Como utilizado aqui, o termo "anticorpo" inclui imunoglobulinas intactas, assim como um número de fragmentos bem caracterizados. Por exemplo, Fabs, Fvs, e Fvs de cadeia simples (SCFvs) que se ligam a proteínas alvo (ou a um epitopo dentro de uma proteína ou uma proteína de fusão) seriam também agentes de ligação específicos para aquela proteína (epitopo), Esses fragmentos de anticorpos são os seguintes; (1) Fab, o fragmento que contém um fragmento de ligação de antígeno monovalente de uma molécula de anticorpo produzida pela digestão de todo o anticorpo com a enzima papaína para dar uma cadeia leve intacta e uma porção de uma cadeia pesada; (2) Fab', o fragmento de uma molécula de anticorpo obtida pelo tratamento de todo o anticorpo com pepsina, seguido por redução, para dar uma cadeia leve intacta e uma porção da cadeia pesada; dois fragmentos Fab' são obtidos para cada molécula de anticorpo; (3) (Fab')2, o fragmento do anticorpo obtido pelo tratamento de todo o anticorpo com a pepsina de enzima sem redução subseqüente; (4) F(ab% um dímero de dois fragmentos Fab' mantidos juntos por duas ligações de dissulfeto; (5) Fv, um fragmento modificado por engenharia genética contendo a região variável da cadeia leve e a região variável da cadeia pesada expresso em duas cadeias; e (6) anticorpo de cadeia simples, uma molécula de engenharia genética contendo a região variável da cadeia leve, a região variável da cadeia pesada, ligada por um ligante de polipeptídio adequado como uma molécula de cadeia simples fundida geneticamente. Os métodos de preparação desses fragmentos são rotineiros (ver, por exemplo, Harlow e Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual CSHL5NovaYork, 1999).

Os anticorpos para uso nos métodos e nas composições desta divulgação podem ser monoclonais ou poli-clonais. Meramente a título de exemplo, anticorpos monoclonais podem ser preparados a partir de hibridomas murinos de acordo com o método clássico de Kohler e Milstein (Nature 256:495- 97, 1975) ou métodos derivados deste.

Afinidade de ligação de anticorpos: A força da ligação entre um único local de ligação de anticorpos e um ligando (por ex., um antígeno ou epitopo). A afinidade de um local de ligação de anticorpos X para um ligando Y é representada pela constante de dissociação (Kd), que é a concentração de Y necessária para ocupar a metade dos locais de ligação X presentes em uma solução. Uma Kd pequena indica uma interação mais forte ou de mais alta afinidade entre XeYe uma concentração mais baixa de ligando é precisa para ocupar os locais. Em geral, a afinidade de ligação de anticorpos pode ser afetada pela alteração, modificação e/ou substituição de um ou mais aminoácidos no epitopo reconhecido pelo paratopo do anticorpo.

Em um exemplo, a afinidade de ligação de anticorpos é medida por titulação de ponto de extremidade em um teste Ag-ELISA. A afinidade de ligação de anticorpos é substancialmente diminuída (ou tem sua medição reduzida) pela modificação e/ou substituição de um ou mais aminoácidos no epitopo reconhecido pelo paratopo do anticorpo se o título de ponto de extremidade de um anticorpo específico para o epitopo modificado/substituído diferir em ao menos 4 vezes, tal como em ao menos 10 vezes, ao menos 100 vezes ou mais, em comparação com o epitopo inalterado.

Antígeno: Um composto, uma composição ou uma substância que possa estimular a produção de anticorpos ou uma reação de células-T em um animal, incluindo as composições que são injetadas ou absorvidas dentro de um animal. Um antígeno reage com os produtos de uma imunidade humoral ou

celular específica, incluindo as induzidas por imunogênios heterólogos. Em uma modalidade, um antígeno é um antígeno de vírus,

Atenuado: No contexto de um vírus vivo, tal como um vírus rábico, o vírus é atenuado se a sua habilidade de infectar uma célula ou um sujeito e/ou a sua habilidade de produzir doença for reduzida (por exemplo, eliminada). Tipicamente, um vírus atenuado conserva ao menos alguma capacidade de provocar uma reação imunológica após administração a um sujeito imuno-competente. Em alguns casos, um vírus atenuado é capaz de provocar uma reação imunológica protetora sem causar quaisquer sinais ou sintomas de infecção.

Ligação ou Ligação Estável: Um oligonucleotídeo se liga ou se liga estavelmente a um ácido nucléico alvo se uma quantidade suficiente do nucleotídeo formar pares de base ou for hibridado em seu ácido nucléico alvo, para permitir a detecção da ligação. A ligação pode ser detectada por propriedades físicas ou funcionais do completo de oligonucleotídeo alvo. Uma ligação entre um alvo e um oligonucleotídeo pode ser detectada por qualquer procedimento conhecido por alguém versado na técnica, incluindo avaliações de ligação físicas ou funcionais. A ligação pode ser detectada funcionalmente determinando-se se a ligação acarreta um efeito observável sobre um processo bio-sintético, tal como a expressão de um gene, replicação de DNA, transcrição, translação, e outros.

Os métodos físicos de detecção de ligação e filamentos complementares de DNA ou de RNA são bem conhecidos na técnica, e incluem métodos tais como o DNase I ou diferenciação química, Por exemplo, um método que é amplamente utilizado, por ser tão simples e confiável, envolve a observação de uma mudança na absorção de luz por uma solução contendo um oligonucleotídeo (ou um análogo) e um ácido nucléico alvo em 220 a 300 nm à medida que a temperatura é lentamente diminuída. Se o oligonucleotídeo ou análogo tiver se ligado ao seu alvo, há um repentino aumento de absorção em uma temperatura característica à medida que o oligonucleotídeo (ou o análogo) e o alvo se dissociam ou derretem. A ligação entre um oligômero e seu ácido nucléico alvo é freqüentemente caracterizada pela temperatura (Tm) na qual 50% do oligômero são derretidos em seu alvo. Uma maior Tm significa um complexo mais forte ou mais estável em relação a um complexo com uma Tm baixa.

cDNA (DNA Complementar): Um pedaço de DNA sem segmentos codificadores internos (íntrons) e seqüências reguladoras que determinam a transcrição. O cDNA é sintetizado em laboratório por transcrição reversa de RNA mensageiro extraído das células.

Eletroforese: A eletroforese se refere à migração de solutos ou de partículas carregados em um meio líquido sob a influência de um campo elétrico. Separações eletroforéticas são amplamente utilizadas para a análise de macro- moléculas. De particular importância é a identificação de proteínas e de seqüências de ácidos nucléicos. Tais separações podem ser baseadas em diferenças de tamanho e/ou de carga. As seqüências de nucleotídeos possuem uma carga uniforme e são portanto separadas com base em diferenças de tamanho. A eletroforese pode ser realizada em um meio líquido sem suporte (por exemplo, eletroforese capilar), mas normalmente o meio líquido passa através de um meio de suporte sólido. Os meios de suporte mais amplamente utilizados são géis, por exemplo, os géis de poliacrilamida e de agarose.

Os géis peneiradores (por exemplo, a agarose) impedem o fluxo de moléculas. O tamanho dos poros do gel determina o tamanho de uma molécula que pode fluir livremente através do gel. A quantidade de tempo para se passar através do gel aumenta conforme o tamanho das moléculas aumente. Em resultado, moléculas pequenas passam através do gel mais rapidamente do que moléculas grandes e portanto andam mais além da área de aplicação da amostra do que as moléculas maiores, em um dado período de tempo. Tais géis são utilizados para separações de seqüências de nucleotídeos baseadas em tamanho.

Os fragmentos de DNA linear migram através dos géis de agarose com uma mobilidade que é inversamente proporcional ao Iogi0 do seu peso molecular. Utilizando-se géis com diferentes concentrações de agarose, tamanhos diferentes de fragmentos de DNA podem ser obtidos. As concentrações mais elevadas de agarose facilitam a separação de pequenos DNAs, enquanto que concentrações baixas de agarose permitem o isolamento de DNAs maiores.

Epitopo: Um determinante antigênico. Eles são grupos químicos particulares, tais como seqüências de peptídeos contíguas ou não-contíguas, em uma molécula, que sejam antigênicas, isto é, que provoquem uma reação imunológica específica. Um anticorpo liga um epitopo antigênico particular com base na estrutura de três dimensões do anticorpo e da estrutura de três dimensões emparelhada (ou cognata) do epitopo.

Um "epitopo substituído" compreende ao menos uma substituição estrutural no epitopo, tal como uma substituição de um aminoácido por outro.

Hibridação (ou Hibridização): Os oligonucleotídeos e seus análogos hibridam por pontes de hidrogênio, que incluem as pontes de hidrogênio de Watson-Crick, de Hoogsteen ou de Hoogsteen reversa, entre bases complementares. Geralmente, o ácido nucléico consiste em bases nitrogenadas que são pirimidinas (citosina (C), uracila (U) e timina (T)) ou purinas (adenina (A) e guanina (G)). Essas bases nitrogenadas formam pontes de hidrogênio entre uma pirimidina e uma purina, e a ligação da pirimidina à purina é referida como "pareamento de base". Mais especificamente, A irá fazer pontes de hidrogênio com T ou com U5 e G irá ligar-se a C. "Complementar" se refere ao pareamento de base que ocorre entre duas seqüências de ácidos nucléicos distintas ou entre duas regiões distintas da mesma seqüência de ácido nucléico.

"Especificamente hibridizável" e "especificamente complementar" são expressões que indicam um grau suficiente de complementaridade tal que ligações estáveis e específicas ocorram entre o oligonucleotídeo (ou o seu análogo) e o DNA ou RNA alvo. O oligonucleotídeo ou análogo de oligonucleotídeo não precisa ser 100% complementar a sua seqüência alvo para ser especificamente hibridizável. Um oligonucleotídeo ou análogo é especificamente hibridizável quando a ligação do oligonucleotídeo ou análogo ao DNA ou RNA alvo interfere com o funcionamento normal do DNA ou RNA alvo, e quando há um grau de complementaridade suficiente para impedir qualquer ligação não-específica do oligonucleotídeo ou análogo a seqüências que não sejam alvo sob condições em que ligações específicas sejam desejadas, por

exemplo, sob condições fisiológicas no caso de exames ou sistemas in vivo. Tal ligação é referida como hibridação específica.

As condições de hibridação resultantes de graus particulares de rigor irão variar dependendo da natureza do método de hibridação de escolha e da composição e do comprimento das seqüências de ácidos nucléicos hibridantes. Geralmente, a temperatura de hibridação e a força iônica (especialmente a concentração de Na+ e/ou de Mg++) do tampão da hibridação irá determinar o rigor da hibridação, embora o número de lavagens também influenciem o rigor. Cálculos sobre condições de hibridação necessárias para se obter graus particulares de rigor são discutidos por Sambrook e outros (ed.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Ed.., Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, EUA, 1989, capítulos 9 e 11; e Ausubel e outros. Short Protocols in Molecular Biology, 4" Ed., John Wiley & Sons, Inc., 1999.

Para os propósitos da presente divulgação, as "condições rigorosas"

abrangem condições sob as quais a hibridação somente irá ocorrer se houver menos de 25% de incompatibilidade entre a molécula de hibridação e a seqüência alvo. As "condições rigorosas" podem ser divididas em níveis particulares de rigor para uma definição mais precisa. Assim, como utilizado aqui, as condições de "rigor moderado" são aquelas sob as quais moléculas com mais de 25% de incompatibilidade de seqüência não irão hibridar; as condições de "rigor médio" são aquelas sob as quais moléculas com mais de 15% de incompatibilidade de seqüência não irão hibridar; e as "condições de elevado rigor" são aquelas sob as quais moléculas com mais de 6% de incompatibilidade de seqüência não irão hibridar.

"Hibridação específica" se refere à ligação, duplexação ou hibridação de uma molécula apenas ou substancialmente apenas a uma seqüência particular de nucleotídeos quando esta seqüência estiver presente em uma mistura complexa (por exemplo, o DNA ou o RNA celular total). A hibridação específica pode ocorrer também sob condições de rigores variados.

Composição imunologicamente estimuladora: Uma expressão utilizada aqui para significar uma composição útil para estimular ou provocar uma reação imunológica específica (ou reação imunogênica) em um vertebrado. A composição imunologicamente estimuladora pode ser um antígeno de proteína ou um vetor de plasmídeo utilizado para expressar um antígeno de proteína. Em algumas modalidades, a reação imunológica é protetora ou oferece imunidade protetora, porque ela permite que o animal vertebrado resista melhor à infecção ou à progressão da doença proveniente do organismo contra o qual a composição imunologicamente estimuladora é direcionada.

Sem querer limitar-se a uma teoria específica, acredita-se que uma reação imunológica induzida por uma composição imunologicamente estimuladora possa surgir da geração de um anticorpo específico para um ou mais dos epitopos fornecidos na composição imunologicamente estimuladora. Alternativamente, a reação pode compreender uma reação baseada em células T- auxiliares ou citotóxicas a um ou mais dos epitopos fornecidos na composição imunologicamente estimuladora. Todas essas três reações podem se originar de células ingênuas ou de memória. Um exemplo específico de um tipo de composição imunologicamente estimuladora é uma vacina.

Em algumas modalidades, uma "quantidade eficaz" ou "quantidade imunologicamente estimuladora" de uma composição imunologicamente estimuladora é uma quantidade que, quando administrada a um sujeito, seja suficiente para gerar uma reação imunológica detectável. Tal reação pode compreender, por exemplo, a geração de um anticorpo específico para um ou mais dos epitopos fornecidos na composição imunologicamente estimuladora. Alternativamente, a reação pode compreender uma reação baseada em célula T- auxiliar (T-helper) ou em CTL (linfócito T citotóxico) a um ou mais dos epitopos fornecidos na composição imunologicamente estimuladora. Todas essas três reações podem se originar de células ingênuas ou de memória. Em outras modalidades uma "quantidade eficaz protetora" de uma composição imunologicamente estimuladora é uma quantidade que, quando administrada a um sujeito, seja suficiente para conferir imunidade protetora sobre o sujeito.

Inibiçâo ou tratamento de uma doença: A inibição do completo desenvolvimento de uma doença ou condição, por exemplo, em um sujeito que esteja em risco para uma doença. Um exemplo específico de doença é a raiva. "Tratamento" se refere a uma intervenção terapêutica que melhore um sinal ou sintoma de uma doença ou condição patológica após esta ter começado a se desenvolver. Como utilizado aqui, o termo "melhorar", com relação a uma doença, condição patológica ou a um sintoma, se refere a qualquer efeito benéfico observável do tratamento. O efeito benéfico pode ser evidenciado, por exemplo, pelo aparecimento demorado de sintomas clínicos da doença em um sujeito suscetível; pela redução de gravidade de alguns ou de todos os sintomas clínicos da doença; por uma progressão mais lenta da doença; pela redução no número de reincidências da doença; por uma melhora na saúde geral ou no bem- estar do sujeito; ou por outros parâmetros bem conhecidos na técnica que sejam

específicos para a doença particular.

Isolado: Um componente biológico "isolado" ou "purificado" (tal como um ácido nucléico, um peptídeo, uma proteína, complexo de proteínas, ou partícula) foi substancialmente separado, produzido a parte de, ou purificado a partir de outros componentes biológicos na célula do organismo em que o componente normalmente ocorra, isto é, outro DNA e RNA cromossômico ou extra-cromossômico, e proteínas. Os ácidos nucléicos, os peptídeos e as proteínas que foram "isolados" ou "purificados" portanto incluem ácidos nucléicos e proteínas purificados através de métodos de purificação convencionais. O termo também abrange ácidos nucléicos, peptídeos e proteínas preparados pela expressão recombinante em uma célula hospedeira, assim como ácidos nucléicos ou proteínas sintetizados quimicamente. O termo "isolado" ou "purificado" não requer pureza absoluta; ao revés, pretende ser um termo relativo. Assim, por exemplo, um componente biológico isolado é aquele em que o componente biológico esteja mais enriquecido do que no componente biológico em seu ambiente natural dentro de uma célula, ou em outro recipiente de produção. Preferivelmente, uma preparação é purificada de forma que o componente biológico represente ao menos 50%, tal como ao menos 70%, ao menos 90%, ao menos 95%, ou mais, do conteúdo de componente biológico total da preparação.

Marcador: Um composto ou uma composição detectável que seja conjugada diretamente ou indiretamente a uma outra molécula para facilitar a detecção desta molécula. Exemplos específicos, não limitativos, de indicadores incluem indicadores fluorescentes, ligações enzimáticas e isótopos radioativos.

Molécula de ácido nucléico: Uma forma polimérica de nucleotídeos, que pode incluir filamentos tanto sense como anti-sense de RNA, cDNA, DNA genômico, e formas sintéticas e polímeros misturados destes acima. Um nucleotídeo se refere a um ribonucleotídeo, desoxinucleotídeo ou a uma forma modificada de qualquer um desses tipos de nucleotídeo. A expressão "molécula de ácido nucléico", como aqui utilizada, é sinônima de "ácido nucléico" e de "polinucleotídeo". Uma molécula de ácido nucléico tem usualmente ao menos 10 bases de comprimento, a não ser que seja especificado de outra forma. A expressão inclui as formas de filamentos simples e duplos de DNA. Um polinucleotídeo pode incluir cada ou ambos os nucleotídeos modificados e os que ocorrem naturalmente, ligados juntos por ligações de nucleotídeos que ocorrem naturalmente e/ou que não ocorrem naturalmente.

Oligonucleotídeo: Uma molécula de ácido nucléico que geralmente compreenda um comprimento de 300 bases ou menos. O termo se refere com freqüência a desoxiribonucleotídeos de filamentos simples, mas também pode se referir a ribonucleotídeos de filamentos simples ou duplos, híbridos de RNA:DNA e DNAs de filamentos duplos, dentre outros. O termo "oligonucleotídeo" também inclui oligonucleosídeos (isto é, um oligonucleotídeo menos o fosfato) e qualquer outro polímero de base orgânica.

Em alguns exemplos, os oligonucleotídeos têm aproximadamente a 90 bases em comprimento, por exemplo, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 bases em comprimento. Outros oligonucleotídeos têm aproximadamente 25, aproximadamente 30, aproximadamente 35, aproximadamente 40, aproximadamente 45, aproximadamente 50, aproximadamente 55, aproximadamente 60 bases, aproximadamente 65 bases, aproximadamente 70 bases, aproximadamente 75 bases ou aproximadamente 80 bases em comprimento. Os oligonucleotídeos podem ser de filamentos simples, por exemplo, para uso como sondas ou como primers, ou podem ser de filamentos duplos, por exemplo, para uso na construção de um gene mutante. Os oligonucleotídeos podem ser oligonucleotídeos sense ou anti-sense. Um oligonucleotídeo pode ser modificado como discutido acima em referência às moléculas de ácido nucléico. Os oligonucleotídeos podem ser obtidos a partir de fontes de ácidos nucléicos existentes (por exemplo, genômicos ou de cDNA), mas também podem ser sintéticos (por exemplo, produzidos por síntese de laboratório ou de oligonucleotídeo in vitro).

Fase Aberta de Leitura (ORF, Open Reading Frame): Uma série de trincas de nucleotídeos (códons) que codificam aminoácidos sem quaisquer códons de terminação internos. Essas seqüências são usualmente traduzíveis em um peptídeo/polipeptídeo/proteína/poli-proteína. É reconhecido na técnica que os seguintes códons (mostrados para

RNA) podem ser utilizados de forma equivalente para codificar aminoácidos ou terminações específicas: Alanina (Ala ou A) GCU, GCG, GCA ou GCG; Arginina (Arg ou R) CGU, CGC, CGAs CGG, AGA ou AGG; Asparagina (Asn ou N) AAU ou AAC; Ácido Aspártico (Asp ou D) GAU ou GAC; Cisteína (Cys ou C) UGU ou UGC; Ácido Glutâmico (Glu ou E) GAA ou GAG; Glutamina (Gln ou Q) CAA ou CAG; Glicina (Gly ou G) GGU, GGC, GGA ou GGG; Histidina (His ou H) CAU ou CAC; Isoleucina (lie ou I) AUU, AUC ou AUA; Leucina (Leu ou L) UUA, UUG, CUU, CUC, CUA ou CUG; Lisina (Lys ou K) AAA ou AAG; Metionina (Met ou M) AUG; Fenilalanina (Phe ou F) UUU ou UUC; Prolina (Pro ou P) CCU, CCC, CCA ou CCG; Serina (Ser ou S) UCU, UCC, UCA, UCG, AGU ou AGC; Códon de terminação UAA (ocre) ou UAG (âmbar) ou UGA (opala); Treonina (Thr ou T) ACU, ACC, ACA ou ACG; Tirosina (Tyr ou Y) UAU ou UAC; Triptofan (Trp ou W) UGG; e Valina (Vai ou V) GUU, GUC, GUA ou GUG. Os códons correspondentes para DNA têm T

substituído por U em cada caso.

Ligado de modo operável: Uma primeira seqüência de ácido nucléico está ligada de modo operável a uma segunda seqüência de ácido nucléico quando a primeira seqüência de ácido nucléico é colocada em uma associação funcional com a segunda seqüência de ácido nucléico. Por exemplo, um promotor é ligado de modo operável a uma seqüência codificadora quando o promotor afeta a transcrição ou a expressão da seqüência codificadora. Geralmente, seqüências de DNA ligadas de modo operável são contíguas e, quando for necessário juntar duas regiões codificadoras de proteínas, na mesmo fase de leitura. Se íntrons estiverem presentes, as seqüências de DNA ligadas de modo operável podem não ser contíguas.

Paratopo: A porção de um anticorpo que é responsável por sua ligação a um determinante antigênico (epitopo) em um antígeno.

Portadores farmaceuticamente aceitáveis: Os portadores farmaceuticamente aceitáveis úteis nesta divulgação são convencionais. Remington's Pharmaceutical Sciences, de E. W. Martin, Mack Publishing Co,, Easton, PA, EUA, 15a Edição (1975) descreve composições e formulações adequadas para a distribuição farmacêutica de um ou mais compostos ou moléculas terapêuticas, tais como uma ou mais moléculas de ácido nucléico SARS-CoV, proteínas ou anticorpos que liguem essas proteínas, e agentes farmacêuticos adicionais.

Em geral, a natureza do portador irá depender do modo de administração particular a ser empregado. Por exemplo, as formulações parenterais usualmente compreendem fluidos injetáveis que incluem fluidos farmacêutica e fisiologicamente aceitáveis, tais como a água, o soro fisiológico, soluções de sais equilibradas, dextrose aquosa, glicerol ou outros, como um veículo. Para composições sólidas (por exemplo, formas de pós, pílulas, tabletes ou cápsulas, os portadores sólidos não-tóxicos convencionais incluem, por exemplo, formulações farmacêuticos de manitol, tactose, amido ou de estearato de magnésio. Além dos portadores biologicamente neutros, as composições farmacêuticas a serem administradas podem conter pequenas quantidades de substâncias auxiliares não-tóxicas, tais como agentes de umidade ou emulsificadores, preservativos, e agentes de tampão de pH e similares, por exemplo, acetato de sódio ou sorbitan monolaurato.

Polipeptídio: Um polímero no qual os monômeros sejam resíduos de aminoácido unidos juntos por ligações de amida. Quando os aminoácidos são alfa aminoácidos, tanto o isômero óptico L como o isômero óptico D podem ser utilizados, sendo os isômeros-L preferidos para muitos usos biológicos. Os termos "polipeptídio" ou "proteína", como utilizados aqui, devem abranger qualquer molécula de aminoácido e incluir moléculas de aminoácidos modificadas. O termo "polipeptídio" é especificamente usado para abranger as proteínas que ocorrem naturalmente, assim como aquelas que sejam produzidas de forma recombinante ou sintética.

Substituições conservadoras de aminoácidos são aquelas substituições que, quando feitas, menos interferem nas propriedades da proteína original, isto é, a estrutura e especialmente a função da proteína é conservada e não é significativamente alterada por tais substituições. Exemplos de substituições conservadoras são mostrados abaixo:

Resíduo Original Substituições Conservadoras Ala Ser Arg Lys Asn Gln; His Asp Glu Cys Ser Gln Asn Glu Asp His Asn; Gln Ile Leu, Val Leu He; Val Lys Arg; Gln; Glu Met Leu; Ile Phe Met; Leu; Tyr Ser Thr Thr Ser Trp Tyr Tyr Trp; Phe Val lie; Leu

As substituições conservadoras geralmente mantêm: (a) a estrutura da cadeia de polipeptídio na região da substituição, por exemplo, como uma folha ou de conformação helicoidal, (b) a carga ou a hidrofobia da molécula no local alvo, ou (c) o núcleo da cadeia lateral. Os aminoácidos são tipicamente classificados em uma ou mais categorias, incluindo a polar, hidrofóbica, ácida, básica e aromática, de acordo com suas cadeias laterais. Exemplos de aminoácidos polares incluem os que têm grupos funcionais de cadeia lateral tais como hidroxila, sulfidrila e amida, assim como os aminoácidos ácidos e básicos. Os aminoácidos polares incluem, sem limitações, asparagina, cisteína, glutamina, histidina, selenocisteína, serina, treonina, triptofan e tirosina. Exemplos de aminoácidos hidrofóbicos ou apolares incluem os resíduos que possuem cadeias laterais alifáticas apolares, tais como, sem limitações, leucina, isoleucina, valina, glicina, alanina, prolina, metionina e fenilalanina. Exemplos de resíduos básicos de atninoácido incluem os que têm uma cadeia lateral básica, tal como um grupo amino ou guanidino. Os resíduos básicos de aminoácidos incluem, sem limitações, arginina, homolisina e lisina. Exemplos de resíduos ácidos de aminoácido incluem os que têm um grupo funcional de cadeia lateral ácido, tal como um grupo carboxi. Os resíduos ácidos de aminoácidos incluem, sem limitações, ácido aspártico e ácido glutâmico. Os aminoácidos aromáticos incluem os que têm um grupo de cadeia lateral aromático. Exemplos de aminoácidos aromáticos incluem, sem limitações, bifenilalanina, histidina, 2-naftillalananina, pentafluorofenillalanina, fenilalanina, triptofan e tirosina. Nota-se que alguns aminoáciods são classificados em mais de um grupo, por exemplo, histidina, triptofan e tirosina são classificadas tanto como aminoácidos polares quanto aromáticos. Os aminoácidos adicionais que estão classificados em cada um dos grupos acima são conhecidos pelos técnicos versados no assunto.

As substituições de que em geral se espera a produção das maiores mudanças nas propriedades das proteínas serão não-conservadoras, por exemplo, mudanças em que (a) um resíduo hidrofílico, por exemplo, seril ou treonil, seja substituído para (ou por) um resíduo hidrofóbico, por exemplo, leucil, isoleucil, fenilalanil, valil ou alanil; (b) uma cisteína ou prolina seja substituída para (ou por) qualquer outro resíduo; (c) um resíduo que possui uma cadeia lateral eletropositiva, por exemplo, lisil, arginil ou histadil, seja substituída para (ou por) um resíduo eletronegativo, por exemplo, glutamil ou aspartil; ou (d) um resíduo que tem uma cadeia lateral volumosa, por exemplo, fenilalanina, seja substituído para (ou por) um que não tenha uma cadeia lateral, por exemplo, glicina.

Sondas e Primersx Uma sonda compreende uma molécula de ácido nucléico isolada ligada a um indicador detectável ou a outra molécula relatora. Indicadores típicos incluem isótopos radioativos, substratos de enzima, co- fatores, ligandos, agentes quimio-luminescentes ou fluorescentes, haptenos e enzimas. Métodos para indicação e orientação na escolha de indicadores apropriados para vários propósitos são discutidos, por exemplo, por Sambrook e outros, (ed.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Ed.., Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, EUA, 1989, capítulos 9 e 11; e Ausubel e outros. Short Protocols in Molecular Biology, 4a

Ed., John Wiley & Sons, Inc., 1999.

Primers (ou iniciadores) são moléculas de ácido nucléico curtas, por exemplo, oligonucleotídeos de DNA com 6 nucleotídeos ou mais em comprimento, por exemplo, que se hibridize em nucleotídeos complementares contíguos ou a uma seqüência a ser amplificada. Os oligonucleotídeos de DNA mais compridos podem ter 10, 12, 15, 20, 25, 30 ou 50 nucleotídeos ou mais em comprimento. Os primers podem ser anelados um filamento de DNA alvo complementar por hibridação de ácidos nucléicos para formar um híbrido entre o primer e o filamento de DNA alvo, e então o primer pode ser estendido ao longo do filamento de DNA alvo por uma enzima de DNA polimerase. Pares de primers podem ser utilizados para a amplificação de uma seqüência de ácido nucléico, por exemplo, pela reação em cadeia de polimerase (PCR) ou outros métodos de amplificação de ácidos nucléicos conhecidos na técnica. Outros exemplos de amplificação incluem a amplificação de deslocamento de filamento como revelada na Patente US5744311; amplificação isotérmica sem transcrição como revelada na Patente US6033881; amplificação de reação em cadeia de reparo como revelada em W090/01069; amplificação de reação em cadeia de ligase como revelada em EP-A-320308; amplificação de reação em cadeia de ligase por preenchimento de espaços vazios como revelada na Patente US5427930; e a amplificação de sem transcrição de RNA NASBA™, como revelada na Patente US6025134. Métodos para preparar e utilizar sondas e primers de ácidos nucléicos são descritos, por exemplo, por Sambrook e outros, (ed.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Ed.., Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, EUA, 1989, capítulos 9 e 11; e Ausubel e outros. Short Protocols in Molecular Biology, 4" Ed., John WUey & Sons, Inc., 1999; e Innis e outros, PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc., San Diego5 CA, EUA, 1990. Pares de primers de amplificação podem ser derivados de uma seqüência conhecida, por exemplo, utilizando-se programas de computador feitos para este propósito, tal como o Primer (Versão 0,5, © 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, MA, EUA). O versado na técnica irá notar que a especificidade de uma sonda ou de um primer particular aumenta com o seu comprimento. Assim, para se obter maior especificidade, as sondas e os primers podem ser selecionados compreendendo ao menos 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 ou mais nucleotídeos consecutivos de uma seqüência de nucleotídeos alvo.

Proteína: Uma molécula biológica, particularmente um polipeptídio, expressa por um gene e compreendida de aminoácidos.

Purificado: O termo "purificado" não requer pureza absoluta; ao revés, pretende ser um termo relativo. Assim, por exemplo, uma preparação de proteínas purificada é aquela em que a proteína em questão seja mais pura do que em seu ambiente natural dentro de uma célula. Geralmente, uma preparação de proteínas é purificada de forma que a proteína represente ao menos 50% do conteúdo total em proteína da preparação.

Ácido nucléico recombinante: Uma molécula de ácido nucléico que não ocorra naturalmente ou que tenha uma seqüência que seja feita de uma combinação artificial de dois outros segmentos de seqüência que normalmente são separados. Essa combinação artificial é obtida por síntese química ou, mais comumente, através da manipulação artificial de segmentos isolados de ácidos nucléicos, por ex., por técnicas de engenharia genética descritas por Sambrook e outros, (ed.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Ed.., Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, EUA, 1989. O termo "recombinante" inclui ácidos nucléicos que tenham sido alterados unicamente 3J&-

por adição, substituição ou remoção de uma porção de uma molécula de ácido nucléico natural.

Seqüências ou elementos reguladores: Esses termos se referem geralmente a uma classe de seqüências de DNA que influencia ou controla a expressão de genes. Incluídos nos termos estão os promotores, enhancers, regiões controladoras de lócus (LCRs), isolantes/elementos de fronteira, silenciadores, regiões de associação à matriz (MARs, também referidas como regiões de associação ao suporte), repressores, terminações transcricionais, origens de replicações, centrômetros, e locais de mais recombinação meiótica. Promotores são seqüências de DNA perto da extremidade-5' de um gene que atuem como um local de ligação para RNA polimerase dependente de DNA, e a partir do qual a transcrição seja iniciada. Enhancers são elementos de controle que elevam o nível de transcrição de um promotor, usualmente independentemente da orientação do enhancer ou de sua distância do promotor. Os LCRs conferem expressão de tecido-específico e regulada temporalmente aos genes aos quais estejam ligados. Os LCRs funcionam independentemente de sua posição em relação ao gene, mas são dependentes do número de réplicas. Acredita-se que eles funcionam para abrir a estrutura nucleossômica, de modo que outros fatores possam se ligar ao DNA. Os LCRs podem também afetar o tempo e o uso de origem da replicação. Os isolantes (também conhecidos como elementos de fronteira)) são seqüências de DNA que previnem a ativação (ou desativação) da transcrição de um gene, ao bloquearem os efeitos da cromatina circundante. Os silenciadores e os repressores são elementos de controle que suprimem a expressão de genes; eles atuam sobre um gene independentemente de sua orientação ou posição em relação ao gene. Os MARs são seqüências dentro do DNA que se ligam ao suporte nuclear; eles podem afetar a transcrição, possivelmente pela separação de cromossomos em domínios reguladores. Acredita-se que os MARs intermediam estruturas de ordem maior, de laço, dentro dos cromossomos. Terminações transcricionais são regiões nas vizinhanças do gene em que RNA polimerase é liberada do molde. Origens de replicação são regiões do genoma onde, durante a síntese de DNA ou a fase de replicação de divisão celular, começa o processo de replicação de DNA. Locais de mais recorabinação meiótica são regiões do genoma que se recombinam mais

freqüentemente do que a média durante a meiose.

Replicon: Qualquer elemento genético (por ex„ plasmideo,

cromossomo, vírus) que funcione como uma unidade auto-replicadora autônoma

de replicação de DNA in vivo.

Amostra: Uma porção, um pedaço ou segmento que seja

representativo de um todo. Este termo abrange qualquer material, inclusive, por exemplo, as amostras obtidas de um animal, vegetal, ou do ambiente.

Uma "amostra ambiental" inclui uma amostra obtida de objetos 0 inanimados ou de reservatórios dentro de um ambiente fechado ou aberto. As amostras ambientais incluem, mas não se limitam a: solo, água, poeira e amostras de ar; amostras em pacote, incluindo materiais de construção, móveis, e conteúdos de aterro sanitário; e outras amostras de reservatório, tais como

resíduos animais, grãos de colheita e alimentos. ,5 Uma "amostra biológica" é uma amostra obtida de um sujeito

vegetal ou animal. Como utilizadas aqui, as amostras biológicas incluem todas as

amostras úteis à detecção de infecções virais em sujeitos, incluindo, mas não se

limitando a: células, tecidos e fluidos corporais, tais como o sangue; derivações e

frações do sangue (tal como o soro); galhas extraídas; tecido de biópsia ou

removido cirurgicamente, incluindo tecidos que sejam, por exemplo, não fixos,

congelados, fixos em formalina e/ou presos em parafina; lágrimas, leite; crostas

de pele; lavagens de superfície; urina; eatarro; fluido cérebro-espinhal; fluido da

próstata; pus; aspirados de medula óssea; BAL; saliva; «Λ cervicais; swabs

vaginais; lavagem orofaringeal. Identidade de seqüência: A semelhança entre duas seqüências de

ácidos nucléicos, ou entre duas seqüências de aminoácidos, é expressa em termos

da similaridade entre as seqüências, também referida como identidade de

seqüência. A identidade de seqüência é freqüentemente medida em termos do

percentual de identidade (ou similaridade ou homologia); quanto mais alto o

percentual, mais semelhantes são as duas seqüências.

Métodos de alinhamento de seqüências para comparação são bem conhecidos na técnica. Vários programas c algoritmos de alinhamento são descritos em: Smith e Waterman (Adv. Appl Mathi 2:482, 1981); Needleman e Wunsch (J. Mol Biolt 48:443, 1970); Pearson e Lipman (Proe. Natl Acad Sci., 85:2444, 1988); Higgins e Sharp (Gene, 73:237-44, 1988); Higging e Sharp CCABIOS, 5:151-53, 1989); Corpet e outros {Nue. Acids Res., 16: 10881-90, 1988); Huang e outros (Comp. Appls. Biosci., 8:155-65, 1992); e Pearson e outros (Meth. Mol Biol, 24:307-31, 1994). Altschul e outros (.Nature Genet., 6:119-129, 1994) apresentam uma consideração detalhada sobre métodos de alinhamento de seqüência e cálculos de homologia.

As ferramentas de alinhamento ALIGN (Meyers e Miller, CABIOS 4:11-17, 1989) ou LFASTA (Pearson e Lipman, 1988) podem ser utilizadas para realizar comparações de seqüência (Internet Program © 1996, W. R. Pearson e a Universidade de Virgínia, "fasta20u63" versão 2.0u63, data de lançamento Dezembro 1996). O ALIGN compara seqüências inteiras umas às outras, enquanto que o LFASTA compara regiões de similaridade local. Essas ferramentas de alinhamento e seus respectivos tutoriais estão disponíveis na Internet no site da NCSA. Alternativamente, para comparações de seqüências de aminoácidos de mais de aproximadamente 30 aminoácidos, a função "Blast 2 sequences" pode ser empregada utilizando-se o conjunto matricial BLOSUM62 padrão configurado nos parâmetros padrão (custo de abertura de intervalos de 11, e um custo de intervalo por resíduo de 1). Quando se alinha peptídeos curtos (menos do que aproximadamente 30 aminoácidos), o alinhamento deve ser realizado utilizando-se as funções "Blast 2 sequences", empregando-se o conjunto matricial PAM30 configurado nos parâmetros padrões (penalidades de intervalo aberto de 9, e de extensão de intervalo de 1). O sistema de comparação de seqüências BLAST está disponível, por exemplo, no website da NCBI; ver também Altschul e outros, J. Mol BioL, 215:403-10, 1990; Gish e States, Nature Genet., 3:266-72, 1993; Madden e outros, Meth. Enzymoli 266:131-41, 1996; Altschul e outros, Nucleie Acids Res., 25:3389-402, 1997; e Zhang e Madden, Genome Res., 7:649-56, 1997. Os ortólogos (equivalentes às proteínas de outras espécies) de

proteína são em alguns casos caracterizados por possuírem uma identidade de seqüência de mais de 75% contada ao longo do comprimento inteiro do alinhamento com a seqüência de aminoácidos de proteínas específicas utilizando- se o ALIGN com os parâmetros padrões. Proteínas até com mais similaridade a uma seqüência de referência irão apresentar maiores percentuais de identidade quando avaliadas por este método, tais como ao menos 80%, ao menos 85%, ao menos 90%, ao menos 92%, ao menos 95%, ou ao menos 98% de identidade de seqüência. Além disso, a identidade de seqüência pode ser comparada ao longo do comprimento inteiro de cada ou de ambos os domínios de ligação das proteínas de fusão reveladas.

Quando significativamente menos do que a seqüência inteira estiver sendo comparado quanto à identidade de seqüência, as seqüências homólogas irão tipicamente possuir ao menos 80% de identidade de seqüência ao longo de janelas curtas de 10-20, e podem possuir identidades de seqüência de ao menos 85%, ao menos 90%, ao menos 95% ou ao menos 99%, dependendo de sua similaridade com a seqüência de referência. A identidade de seqüência sobre tais janelas curtas pode ser determinada utilizando-se o LFASTA; métodos são descritos no site da NCSA. O versado na técnica irá perceber que essas faixas de identidade de seqüência são fornecidas a título de orientação apenas; é inteiramente possível que homólogos com força significativa possam ser obtidos que estejam fora das faixas fornecidas. Conceitos semelhantes de homologia se aplicam aos ácidos nucléicos como descritos para as proteínas. Um indicador alternativo de que duas moléculas de ácidos nucléicos sejam proximamente relacionadas é quando as duas moléculas se hibridizam uma à outra sob condições rigorosas.

Seqüências de ácidos nucléicos que não apresentem um alto grau de identidade podem assim mesmo codificar seqüências de aminoácidos similares, devido à degeneração do código genético. Deve ser entendido que mudanças na seqüência de ácido nucléico podem ser feitas utilizando-se essa degeneração para produzir múltiplas seqüências de ácidos nucléicos que codifiquem substancialmente a mesma proteína. Agente de ligação específico: Um agente que se ligue

substancialmente somente a um alvo definido. Portanto, um agente de ligação de proteína-específica se liga substancialmente somente à proteína específica, ou a uma região específica dentro da proteína. Como utilizados aqui, os agentes de ligação de proteína-específica incluem anticorpos e outros agentes que se liguem substancialmente a um polipeptídio específico. Os anticorpos podem ser anticorpos monoclonais ou poli-clonais que sejam específicos para o polipeptídio, assim como porções ("fragmentos") imunologicamente eficazes destes.

A determinação se um agente particular se liga substancialmente apenas a um polipeptídio específico pode ser feita prontamente utilizando-se ou adaptando-se procedimentos de rotina. Exemplos de testes in vitro que fazem uso do procedimento Western blot incluem o IFA e o Ag-ELISA, e são descritos em muitos textos convencionais, incluindo Harlow e Lane, Using Ántibodies: A Laboratory Manual CSHL, Nova York, EUA, 1999.

Transformada: Uma célula "transformada" é uma célula na qual foi introduzida uma molécula de ácido nucléico por técnicas de biologia molecular. O termo abrange todas as técnicas através das quais uma molécula de ácido nucléico possa ser introduzida dentro de uma célula, incluindo transfecção com vetores virais, transformação com vetores de plasmídeos, e a introdução de uDNA nu" por eletroporação, lipofecção, e aceleração de pistola de partículas.

Vetor: Uma molécula de ácido nucléico como introduzida dentro de uma célula hospedeira, desse modo produzindo uma célula hospedeira transformada. Um vetor pode incluir seqüências de ácidos nucléicos que permitam que ele se replique em uma célula hospedeira, tal como uma origem de replicação (seqüências de DNA que participam no início da síntese de DNA). Um vetor pode incluir um ou mais genes marcadores selecionáveis e outros

elementos genéticos conhecidos na técnica.

Vírus: Organismo infeccioso microscópico que reproduza células vivas internas. Um vírus tipicamente consiste essencialmente em um núcleo de um único ácido nucléico circundado por uma camada de proteína, e tem a habilidade de se replicar somente dentro de uma célula viva. "Replicação viral" é a produção de vírus adicional pela ocorrência de ao menos um ciclo de vida viral. Um vírus pode corromper as funções normais da célula hospedeira, fazendo com que a célula se comporte de uma maneira determinada pelo vírus. Por exemplo, jysf

r

uma infecção viral pode resultar em uma célula produzindo uma citocina, ou reagindo a uma citocina, enquanto a célula não infectada normalmente não o faz.

Embora métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos descritos aqui possam ser utilizados na prática ou testando-se a presente invenção, métodos e materiais adequados são descritos abaixo.

Todas as publicações, os pedidos de patente, patentes e outras referências mencionadas aqui são incorporadas como referências em suas totalidades. Em caso de conflito, a presente descrição, incluindo a explanação dos termos, assumirá o controle. Além disso, os materiais, métodos e exemplos são ilustrativos apenas e não pretendem ser limitativos.

IV. Descrição Geral de Diversas Modalidades

É fornecido aqui em uma primeira modalidade um genoma de vírus da raiva recombinante compreendendo o ácido nucléico como apresentado na SEQ ID NO: 1 (comprimento completo da seqüência da ERA). São também fornecidas proteínas do vírus da raiva codificadas por esse genoma, incluindo proteínas específicas que compreendem uma seqüência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID NO: 2 (proteína N); SEQ ID NO: 3 (proteína P); SEQ ID NO: 4 (proteína M); SEQ ID NO: 5 (proteína G); ou na SEQ ID NO: 6 (proteína L); e moléculas de ácidos nucléicos isoladas que codificam tais proteínas. A título de exemplo, tais moléculas de ácidos nucléicos isoladas compreendem uma seqüência de nucleotídeos como apresentada em: nucleotídeos 71-1423 da SEQ ID NO: 1 (proteína N); nucleotídeos 1511-2407 da SEQ ID NO: 1 (proteína P); nucleotídeos 2491-3104 da SEQ ID NO: 1 (proteína M); nucleotídeos 3318-4892 da SEQ ID NO: 1 (proteína G); ou os nucleotídeos 5418-11.801 da SEQ ID NO: 1 (proteína L).

É também fornecido um genoma de vírus recombinante com a seqüência de ácido nucléico como apresenta na SEQ ID NO: 7, que difere da SEQ ID NO: 1, em virtude da remoção de um resíduo de adenosina na cauda Poli-A entre o gene da G e a região-psi. A SEQ ID NO: 7 também codifica as proteínas como mostradas nas SEQ ID NOs: 2-6. São também fornecidos genomas de derivados da linhagem ERA do vírus, como mostrado nas SEQ ID NOs: 8-18. Em certas modalidades, os genomas estão presentes em um vetor, tal como um plasmídeo.

Ainda outra modalidade descrita é um sistema para o seqüenciamento do comprimento completo de genomas do vírus da raiva através da utilização de um método descrito aqui. Sistemas de vetores virais para a expressão de proteínas heterólogas são também descritos.

Uma outra modalidade fornece composições que compreendem uma ou mais moléculas de ácido nucléico, uma ou mais proteínas, fornecidas aqui. Opcionalmente, tais composições contêm um portador farmaceuticamente aceitável, um adjuvante, ou uma combinação de dois ou mais destes.

É também fornecido um método para provocar uma reação imunológica contra um epitopo antigênico em um sujeito, compreendendo a introdução dentro do sujeito de uma composição que compreenda um nucleotídeo, peptídeo, ou polipeptídio descrito aqui, desse modo provocando

uma reação imunológica no sujeito.

Um outro aspecto da divulgação se refere a um sistema de vetores

para produzir vírus da raiva recombinantes. O sistema de vetores inclui um primeiro vetor (vetor de transcrição) que contém um comprimento completo de DNA antigenômico de vírus da raiva (ou um derivado deste) e um conjunto de vetores auxiliares contendo ácidos nucléicos que codifiquem ao menos uma proteína da linhagem ERA do vírus da raiva. A expressão dos vetores em uma célula hospedeira transfectada resulta na produção de um vírus da raiva recombinante vivo. Em certas modalidades, o DNA antigenômico é da linhagem ERA (por exemplo, SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 7) ou de um derivado desta, tal como uma das SEQ ID NOs: 8-18. Em certas modalidades, os vetores são

plasmídeos.

Para facilitar a recuperação do comprimento total de RNA viral, o vetor de transcrição pode incluir, em uma direção de 5' a 3': uma ribozima de cabeça-de-martelo; um cDNA antigenômico de vírus da raiva; e uma ribozima de vírus delta da hepatite. Os nucleotídeos da ribozima de cabeça-de-martelo são selecionados para serem complementares à seqüência genômica anti-sense do vírus da raiva. A transcrição do cDNA antigenômico fica sob o controle regulatório de transcrição de ao menos um dentre o promotor de CMV e o promotor de RNA polimerase do fago T7, e comumente sob o controle de ambos esses promotores.

Os vetores auxiliares tipicamente incluem um vetor que

compreende uma seqüência de polinucleotídeos que codifica uma proteína N do vírus da raiva; um vetor que compreende uma seqüência de polinucleotídeos que codifica uma proteína M do vírus da raiva; um vetor que compreende uma seqüência de polinucleotídeos que codifica uma proteína L do vírus da raiva; e um vetor que compreende uma seqüência de polinucleotídeos que codifica uma RNA polimerase do fago T7. Em uma modalidade, a RNA polimerase do T7 compreende um sinal de localização nuclear (NLS). Opcionalmente, o sistema de vetores pode incluir também um vetor que compreenda uma seqüência de nucleotídeos que codifique uma proteína G do vírus da raiva. A transcrição de uma ou mais das seqüências de polinucleotídeos

que codificam a proteína P5 M, L ou G do vírus da raiva, ou a polimerase de T7 está sob o controle regulatório de transcrição tanto do promotor de CMV como do promotor de T7. Em contraste, a transcrição da seqüência de polinucleotídeos que codifica a proteína N do vírus da raiva fica sob o controle regulatório de transcrição do promotor de T7, e a transcrição é independente de cap.

Ainda mais outras modalidades são vacinas de raiva vivas, cada uma compreendendo um genoma de vírus da raiva recombinante como fornecido aqui. Exemplos de tais genomas da raiva recombinantes compreendem a seqüência mostrada como ERA G333 (SEQ ID NO: 10). Opcionalmente, a

vacina da raiva é atenuada.

É também fornecido um método de produção de um vírus da raiva vivo (por exemplo, para uso em uma composição imunogênica, tal como uma vacina) através da introdução do sistema de vetores dentro de uma célula hospedeira. Após a transfecção do sistema de vetores para dentro de uma célula hospedeira adequada, o vírus vivo e opcionalmente atenuado é recolhido. A produção e a administração de uma vacina da raiva viva produzida por tais métodos são também previstas aqui. SGO

É também revelado um método de vacinação de um sujeito contra a raiva, em que o método compreende a administração de uma quantidade eficaz da vacina de raiva viva de acordo com a descrição fornecida ao sujeito, de modo que as células do sujeito sejam infectadas com a vacina da raiva, quando então uma reação imunológica anti-rábica é produzida no sujeito. Em uma modalidade, o sujeito é um ser humano. Em outra modalidade, o sujeito é um animal não- humano. Por exemplo, o animal não-humano em alguns casos é um gato, cão, rato, camundongo, morcego, raposa, guaxinim, esquilo, gambá, coiote ou lobo.

Em certas modalidades, a vacina da raiva é administrada entericamente. Por exemplo, a administração entérica em alguns casos compreende a administração oral. A administração oral inclui administração através de iscas de comida projetadas para vacinar populações de animais selvagens, por exemplo.

Composições farmacêuticas que incluem as vacinas da raiva vivas (por exemplo, uma vacina de raiva viva atenuada) e um portador ou excipiente farmaceuticamente aceitável são também fornecidos.

K Método de Seqüenciamento do Genoma de Lyssavirus

Inteiro

Para facilitar o seqüenciamento do comprimento completo do genoma ERA, um método para seqüenciar um vírus de RNA de filamento negativo de comprimento completo foi desenvolvido. Esse método é aplicável ao seqüenciamento de um Iyssavirusi tal como um vírus da raiva, assim como outro vírus de RNA de filamento negativo. O vírus da raiva é um vírus de RNA de filamento negativo simples com um genoma de aproximadamente 12 kb, com a faixa entre 11,918 (lyssavirus do morcego Australiano) e 11,940 (vírus Mokola). As seqüências de ácidos nucléicos virais da raiva no GENBANK focalizam principalmente as seqüências que codificam proteínas—proteína de nucleocapsídeo (N), glicoproteína (G), fosfoproteína (P) e genes de proteína matricial (M), que ficam perto da extremidade 3' do genoma. A análise filogenética prévia é principalmente baseada nos genes de N e G. Mas, para linhagens virais de raiva remotamente relacionadas, o gene (L) da RNA polimerase dependente de RNA é o candidato mais adequado para a análise filo genética. Infelizmente, poucas seqüências de genes (L) estão disponíveis em bases de dados de genes públicas. Além disso, foi proposto que tanto as regiões líderes quanto as seguidoras nas terminações virais rábicas desempenham papéis muito importantes para (a regulação da) transcrição e replicação viral. Estas podem ser as regiões conservadas para a encapsidação de nucleoproteína ou os locais de ligação para proteínas L/P, por exemplo. Também as regiões inter- gênicas entre a líder -Ν, N-P, P-M, M-G, a região de pseudo-gene e a G-L servem como os sinais para a iniciação da transcrição viral. Portanto, não apenas regiões codificadas, mas também regiões não-codificadas dentro do mesmo genoma viral, poderiam ser aplicadas à análise filogenética ou à pesquisa de evolução. Todas essas seqüências podem ser analisadas mais prontamente utilizando-se os métodos de seqüenciamento de genoma inteiro fornecidos aqui.

O método inclui uma transcrição reversa de uma etapa e uma clonagem de duas etapas em um vetor adequado. Esse método produz um genoma prontamente seqüenciado no vetor, sem a necessidade de se realizar reações RT-PCR repetidas tendentes a erros. Explorando as repetições invertidas encontradas nas extremidades do genoma rábico (e do genoma de outros lyssavirus), foram desenvolvidos primers universais e são descritos aqui para uso nos procedimentos de seqüenciamento rápido de genoma completo descritos aqui.

As regiões líderes e as regiões seguidoras no vírus da raiva contêm sinais para a transcrição e replicação viral. Com base na análise da seqüência de genomas disponível na GenBank, os nucleotídeos da terminal 11 são rigorosamente conservados em vírus da raiva ou em vírus relacionados à raiva, incluindo o vírus Mokola. O raciocínio por trás dos métodos de seqüenciamento fornecidos aqui se baseia nos nucleotídeos complementares da terminal 11. Como essas duas seqüências de nucleotídeos 11 são complementares, elas poderiam não ser utilizadas nas reações PCR seguintes. Deve ser entendido que outros vírus com repetições invertidas podem ser semelhantemente amplificados através da utilização de primers correspondentes às seqüências daquelas repetições. Os nucleotídeos de antigenoma senso 11 foram projetados como primers de transcrição reversa para o genoma purificado da ERA, cuja integridade foi verificada por comparação de tamanho e Northern Blot. Todo o genoma de cDNA foi confirmado também por Northern Blot com sondas de genes Ν, P, M5 G, L e nucleotídeos 11 por uma sonda de oligonucleotídeos, que

apenas ligava RNA genômico, e não mRNA viral.

É razoavelmente viável a transcrição reversa do genoma viral rábico inteiro em uma reação, utilizando-se cuidadosamente primers de seqüências-correspondentes de terminal conservados, desde que a qualidade da

preparação do genoma viral sela alta.

A seqüência da ERA é proximamente relacionada à da SAD, que é de suas derivadas. Isso não é surpreendente, porque a ERA foi enviada da CDC nos anos da década de 1970 para a Suíça, onde pesquisadores a adaptaram para que crescesse em células, antes de a enviarem para a Alemanha, onde foi mais uma vez derivada, e a derivação foi totalmente seqüenciada em - 1990. Até hoje, os vírus da raiva e relacionados à raiva têm sido classificados em sete tipos S diferentes: o vírus da raiva clássico tipol (ERA está incluída), tipo2 (morcego Lagos), tipo3 (Mokola), tipo4 (Duvenhage), tipo5 (lyssavirus do morcego Europeu (EBL) I), tipoó (EBL II) e tipo7 (vírus do morcego da Austrália) de acordo com proteção cruzada de soro e estudos de genética. A análise de seqüências desempenha um papel importante na filogenética, na pesquisa de 0 evolução, em estudos de previsão da função de genes, e outras áreas relacionadas, incluindo a localização de regiões reguladoras de transcrição e replicação viral, e portanto a bioinformática voltada para potenciais drogas

terapêuticas.

Com o desenvolvimento de técnicas na reação em cadeia de polimerase de transcrição reversa (PCR-TR), que são conhecidas pelos versados na técnica, é atualmente relativamente fácil fazer a transcrição reversa de até 12 kb ou mais de RNA para cDNA em uma reação. Sob condições ideais, a PCR

pode amplificar alvos de mais de 30 kb em uma reação.

Com o fornecimento aqui de métodos para gerar seqüências de genoma de vírus de comprimento completo, em particular seqüências de genomas da raiva, torna-se atualmente prática a análise de diferentes linhagens de vírus. A concepção eficaz de vírus atenuados, por exemplo para uso na imunização ou na produção de composições imunologicamente estimuladoras e vacinas, é também permitida utilizando-se os genomas de comprimento completo resultantes.

Não existe o genoma "geral" do vírus da raiva, mas esses genomas estão relacionados. As similaridades estão entre 60% e 100% nos diferentes tipos. Algumas regiões, tais como a do gene L, parecem ser mais conservadas, enquanto que outras, tais como a região psi, que não codifica um polipeptídio, são mais variáveis. Os vírus da raiva e os relacionados à raiva não só irão variar, mas também qualquer vírus de RNA irá mudar com o tempo. Como os vírus se adaptam e surgem é uma questão em aberto. Por este motivo, a análise de seqüências de genomas inteiros é importante para os estudos evolucionários, sobre patogenia e sobre a função de genes.

Esse sistema descrito aqui é o primeiro para o vírus da raiva no que diz respeito ao seqüenciamento de genomas completo. Acredita-se que pode ser útil para outros vírus de RNA, particularmente no gênero lyssavirus. Atualmente, para os estudos filogenéticos do vírus da raiva, os cientistas fazem uso somente dos genes Ν, P ou G, que são mais abundantes nas células ou tecidos infectados. Sabe-se que para a comparação de linhagens remotas, o gene L compreendendo mais da metade do genoma pode ser o local candidato ideal, o que deve ser usado. Infelizmente, tais comparações evolucionárias não são possíveis devido aos dados disponíveis serem muito limitados, ainda mais quanto à seqüência de genoma completo. Também para os estudos sobre transcrição e replicação viral, supõe-se que as regiões líderes e as seguidoras localizadas nas extremidades 3' e 5' do genoma desempenhem papéis importantes. As regiões inter-gênicas são também os sinais para estudos de eis e trans viral. Todos esses dados são bastante limitados, porque não estão incluídos no mRNA. Somente a seqüência de genoma completa pode fornecer a informação necessária neste nível. O seqüenciamento de genomas completos não só é útil para o desenvolvimento de vacinas, mas também é aplicável para os estudos sobre transcrição e replicação básicas de vírus, É também igualmente aplicável ao desenvolvimento de siRNA e terapia de genes.

VI. Seqüência do Genoma da ERA Utilizando o método descrito aqui, a seqüência única do genoma do vírus da raiva ERA foi gerada. Esta seqüência é mostrada na SEQ ID NO: 1. As cinco proteínas do vírus da raiva ERA (SEQ ID NOs: 2-6) são codificadas nas seguintes posições do genoma: N, 71-1423; P, 1511-2407; M1 2491-3104; G, 3318-4892; e Lj 5418-11801. A homologia entre ERA e SAD-B19 são: N 99,56%, P 98,65%, M 96,53%, G 99,05% e L 99,20%, respectivamente. Uma diferença específica entre a ERA e a SAD-B19 é a região intergênica entre Geo pseudo-gene, com o sinal de parada/poliadenilação de transcrição da SAD-B19 destruído.

A seqüência do genoma completo do vírus da raiva ERA é pré- requisito para o desenvolvimento de vacinas e para os estudos de patogema através da utilização de genética reversa.

VII. Sistema Otimizado para a Produção de Vírus

Os exemplos 6 e 7 fornecem um conjunto de condições ideais para a produção de vírus da ERA, em que os títulos atinjam até IO10 ffu por ml. Em bioreatores, o vírus resgatado pode crescer em -IO9 a IO10 fíu/ml. tais elevados níveis de produção são da maior importância para o desenvolvimento de vacinas orais, de modo que se possa produzir material de vacina suficiente em uma quantidade de tempo razoável com uma alocação de recursos razoável.

As condições de crescimento fornecidas podem produzir estavelmente tal título de vírus elevado para ambas as linhagens parenteral e ERA. Esses dados de produção são muito importantes for o potencial

desenvolvimento de vacinas de raiva orais.

VIII. Linhagem de Células BSR-Gpara a Produção de Vírus -G

Embora linhagens do VR com remoções da proteína G tenham sido

previamente resgatadas a partir de células de BHK, isso não foi possível com vírus da linhagem ERA sem a proteína G. Após a inoculação intra-cerebral ou intramuscular de camundongos com ERA-G, nenhum camundongo morreu ou

mostrou qualquer sintoma de raiva.

A ERA-G (sem glicoproteína) só pode crescer em células com a suplementação da glicoproteína. Caso contrário, o vírus mutante não pode se espalhar. Para ajudar no crescimento da ERA-G, uma linhagem de células BSR- G foi estabelecida, que expressa constitutivamente a glicoproteína da ERA. A produção dessa linhagem de células é descrita nos Exemplos abaixo. Essa linhagem de células é útil para a recuperação de linhagens do VR tais como a ERA-G que sejam refratárias à recuperação na ausência da Gi assim como para a

otimização da recuperação de outros sinais.

IX. Sistema de Genética Reversa para Vacinas de Vírus da

Raiva de Engenharia e Expressão de Proteínas Heterólogas

O RNA não pode ser prontamente manipulado diretamente por métodos de biologia molecular. As vacinas de vírus de RNA tradicionais são de isolados naturalmente atenuados, que são difíceis de controlar e apresentam resultados imprevisíveis. A tecnologia da genética reversa torna possível manipular vírus de RNA como DNAi que pode sofrer mutação, remoção e reconstrução de acordo com concepções deliberadas. Cada função dos genes pode ser estudada cuidadosamente, independentemente, e em conjunto, o que beneficia o desenvolvimento de vacinas. A genética reversa envolve a transcrição reversa do genoma viral de RNA em cDNA, e a clonagem em um vetor, tal como um plasmídeo. Após a transfecção das células hospedeiras, o vetor é transcrito em RNA, a ser encapsidade por proteínas estruturais, que também podem ser supridas por plasmídeos. O RNA encapsidado forma um complexo de ribonucleoproteína, resultando em partículas de vírus que podem ser resgatadas.

Embora três sistemas para a genética reversa do vírus da raiva (VR) tenham sido publicados (Schnell β outros, The EMBO 1 13, 4195-4203, 1994; Inoue e outros, J. Virol Method 107, 229-236, 2003; Ito e outros, Microbiol Immunol 47, 613-617, 2003), esses sistemas não são prontamente adaptáveis a outras linhagens. Atualmente, nenhuma linhagem do vírus da raiva foi resgatada com o auxílio de plasmídeos auxiliares de uma linhagem diferente, nem mesmo quando as linhagens são proximamente relacionadas. Assim, para qualquer mutação específica de linhagens do vírus ou para o desenvolvimento de vacinas, um sistema modelado especificamente tem que ser desenvolvido.

a linhagem ERA é uma boa candidata para o desenvolvimento de

vacinas orais para a raiva, mas sua patogenia residual é óbvia. Durante os anos da década de 1970, o VR da ERA passou por extenso desenvolvimento de vacinas (Black e Lawson, Can. J. Comp. Med 44:169-176, 1980; Charlton e Casey, Can. J. VeL Res. 20:168-172, 1978; Lawson e Crawley, Can. J. VeL Res. 36:339-344, 1972). Tanto a ERA como a SAD-B19 são derivadas da SAD. Hm testes de vacinas orais preliminares, a SAD-B19 foi eficaz em guaxinins e também em gambás, enquanto que a ERA não foi. Adicionalmente, a ERA mata camundongos de duas semanas de idade administrados por via intra-cerebral (i.c.), como demonstrado em testes com animais. Essas observações levantam dúvidas sobre o relacionamento dessas duas linhagens do VR e sobre os potenciais efeitos de alterações sutis. A partir de uma comparação da seqüência de genoma viral completa, a ERA e a SAD-B19 compartilham identidades de nucleotídeos extremamente altas e homologias de aminoácidos. Para clarificar a fundamentação genética da imunogenicidade e da ρ ato geni cidade dessas linhagens altamente relacionadas do vírus da raiva, um sistema de genética reversa eficiente foi desenvolvido para a ERA, diferente dos sistemas de genética reversa relatados previamente para o vírus da raiva.

O sistema de genética reversa da raiva revelado aqui é útil para uma variedade de propósitos, incluindo: (1) atenuar o vírus da ERA de uma maneira definida para o desenvolvimento de vacinas; (2) produzir vetores de vírus da ERA para expressar ORFs heterólogos (por ex., no contexto de composições terapêuticas, tais como vacinas e terapia genética.); (3) definir a base geral da patogênese do VR da ERA; e (4) determinar os efeitos biológicos das diferenças

genéticas entre os vírus da ERA e da SAD.

O sistema de genética reversa possui algumas ou todas as características seguintes, ilustradas esquematicamente na Fig. IA utilizando-se o cDNA antigenômico da linhagem ERA exemplificativo.

Esse sistema é baseado em um plasmídeo de transcrição de comprimento completo e mais uma pluralidade de plasmídeos auxiliares (por ex., cinco plasmídeos auxiliares). Os plasmídeos auxiliares codificam as proteínas N, P, L e opcionalmente a proteína G, assim como a polimerase de T7. Embora a proteína G não seja necessária para o resgate do vírus, ela melhora a eficiência da recuperação de vírus ou a germinação de vírus quando incluída na transfecção. A transcrição envolve tanto a RNA polimerase II dependente de RjSfA, que é disponível nas células dos mamíferos, como a polimerase do T7, que é suprida por plasmídeos pNLST7. A polimerase dual resulta em uma eficaz recuperação de vírus que é alta e também estável.

No plasmídeo de transcrição, ribozimas de cabeça-de-martelo e do vírus delta da hepatite abordam um cDNA antigenômico de vírus da raiva (por ex., linhagem ERA), permitindo a produção de extremidades 5' e 3' autênticas de vRNA genômico por transcrição. Os dez primeiros nucleotídeos da seqüência em cabeça-de-martelo são projetados para serem complementares aos dez primeiros nucleotídeos da seqüência genômica anti-senso. Por exemplo, os dez primeiros nucleotídeos da seqüência em cabeça-de-martelo para o cDNA antigenômico da ERA são: TGTTAAGCGT (SEQ ID NO: 19).

Duas construções de RNA polimerase do T7 modificadas foram estabelecidas, as quais suportam a recuperação de vírus mais eficientemente do que a RNA polimerase do T7 do tipo selvagem aplicada anteriormente. Uma RNA polimerase do T7 passou por mutação do primeiro ATG para AT. A segunda RNA polimerase do T7 tem um sinal de localização nuclear (NLS) de oito aminoácidos derivada do antígeno SV40 T grande de vírus fundida depois do primeiro ATG a partir do T7 mãe: ATG CCA AAA AAG AAG AGA AAG GTA GAA (SEQ ID NO: 20). O NLS está sublinhado. A adição do NLS resulta na RNA polimerase do T7 estando presente predominantemente no núcleo. Após o mecanismo de transfecção do plasmídeo de NLS modificado, o complexo de reagentes de transfecção de DNA se une à superfície da célula. Através de endocitose, o complexo é trazido até o endossomo/lisossomo, e o DNA é liberado para dentro do citosol. Na ausência do NLS, a maior parte dos plasmídeos transfectados fica retida no citosol e apenas uma porcentagem pequena do DNA liberado atinge o núcleo, onde é transcrito em RNA. Após a síntese de proteínas, a RNA polimerase do NLST7 é transportada de volta ao núcleo da célula, e os plasmídeos auxiliares (com promotores de T7/CMV) no núcleo serão transcritos por ambas as polimerases do NLST7 e celular II. Assim, mais mRNAs dos plasmídeos auxiliares e cRNA do pTMF de comprimento completo ou seus derivados foram sintetizados e resultaram na alta eficiência do resgate de vírus.

Após a expressão inicial do NLST7 pelo promotor de CMV, a polimerase do NLST7 se liga ao pT7 para a transcrição do gene do NLST7. Através da modificação dos transcritores no núcleo, mais mRNA de NLST7 é sintetizado, o que resulta em mais expressão de polimerase de NLST7. O pT7 da polimerase de NLST7 assim como o da unidade de transcrição de antigenômica de comprimento completo fica sob o controle da polimerase de NLST7, que atua como um "auto-gene". O mecanismo de auto-gene da polimerase do NLST7 é ilustrado na Fig. 2. Após a expressão da RNA polimerase de T7 no núcleo, as estruturas de T7 transfectadas continuam a transcrever o modelo de RNA de comprimento completo para encapsidação da proteína N e/ou ligação da proteína L, acentuando a eficiência da recuperação de vírus.

A polimerase de T7, e todos os outros plasmídeos, a não ser pelo plasmídeo codificador da proteína N pTN, são colocados sob o controle de ambos os elementos reguladores de transcrição de CMV e de T7. O ácido nucléico de codificação da proteína N fica sob o controle de um promotor de Tl e é traduzido de maneira cap-independente com base em um IRES (Local de Entrada de Ribossomo Interno). A RNA polimerase celular II sozinha pode ajudar na recuperação do VR se todos os plasmídeos forem clonados sob o controle do promotor de CMV (19). No sistema de genética reversa da ERA revelado aqui, apenas o pTN fica sob o controle do promotor de T7 e foi traduzido de maneira cap-independente. Todas as outras construções estão sob o controle de ambos os elementos reguladores de transcrição de CMV e de T7. Tipicamente, no VR, a síntese de N é abundante e a razão entre Ν, P e L é de aproximadamente 50:25:1. Para simular a transcrição viral do tipo selvagem e a montagem na genética reversa do VR, a expressão da N deve ser a mais alta. Com o auxílio da polimerase de NLST7 e do modo de tradução IRES, a proteína N foi expressa de eficientemente após a transfecção de plasmídeos. Isso reduz a competição para a transcrição com genes de manutenção em células hospedeiras, porque o sinal de iniciação de transcrição de T7 não existe em células de mamíferos, e resulta em uma maior eficiência da transcrição de T7. Para acentuar a produção de proteínas virais, os plasmídeos auxiliares podem ser construídos para que incorporem uma seqüência de Kozac que tenha sido otimizada para a eficiência da tradução para cada seqüência de codificação de proteína. Seqüências de Kozak otimizadas exemplificativas são mostradas na Tabela 2.

Tabela 2 - Seqüências de Kozak Otimizadas

Construções Promotores Contexto da Kozak SEQ ID NO: Caracteres Especiais pTMF CMV/T7 n/a n/a HamRZ/HdvRZ nas extremidades pTN T7/IRES ACCACCATGG SEQ ID NO: 21 n/a pMP CMV/T7 ACCACCATGA SEQ ID NO: 22 n/a pMG CMV/T7 ACCACCATGG SEQ ID NO: 21 n/a pML CMV/T7 ACCACCATGC SEQ ID NO: 23 n/a pNLST7 CMV/T7 ACCACCATGA SEQ ID NO: 22 NLS de 8 aminoácidos

CMV/T7 simboliza o promotor de CMV à frente do promotor de T7. HdRZ indica uma ribozima em cabeça-de-martelo e HDVRz é a ribozima do vírus delta da hepatite. pTMF é o plasmídeo de transcrição de comprimento completo, e PTN, pMP, pMG, pML e pNLST7 são

plasmídeos auxiliares.

Depois de cinco dias pós-transfecção no sistema de genética reversa da ERA, o vírus resgatado cresceu para IO7 ffu/ml de forma estável e contínua sem amplificação adicional. X, Vírus Derivados

O mecanismo completo da patogenia do vírus da Raiva não foi completamente caracterizado, o que torna o desenvolvimento racional de vacinas problemático. Por exemplo, a glicoproteína do VR parece desempenhar um papel tanto na patogenia quanto na imunogenicidade do vírus da raiva. As mutações (tais como na posição 333 da glicoproteína) resultam em vírus que não causa infecção letal em camundongos adultos (Ito e outros, Microl Immunol 38, 479- 482, 1994; Ito e outros, J. Virol 75, 9121-9128, 2001). Contudo, a super- expressão da glicoproteína do VR demonstrou levar à acentuação de apoptose e reação imunológica viral (Faber e outros, J. Virol 76, 3374-3381, 2002). Portanto, o vírus da linhagem ERA com uma proteína G modificada (por exemplo, removida, com substituição de aminoácidos) poderia ser uma linhagem particular para o desenvolvimento de vacinas.

Vírus da raiva recombinantes com propriedades favoráveis podem ser projetados utilizando-se o sistema de genética reversa revelado aqui. Os vírus recombinantes exemplificativos revelados aqui incluem, além da linhagem ERA mãe, ERA sem região-Psi (ERA-), ERAverdel (gene fluorescente verde inserido na regiao-Psi), ERAverde2 (gene fluorescente verde clonado na região intergênica P-M), ERAg2 (contendo uma cópia extra da G na região-Psi), ERAgm (genes MeG trocados no genoma), e ERAgmg (duas cópias da G na construção da ERAgm rearranjada). Essas linhagens exemplifícativas são

ilustradas esquematicamente na Fig. 3.

As linhagens modificadas possuindo glicoproteínas removidas e/ou

alteradas por mutação são particularmente adequadas para o uso como composições imunogênicas para o tratamento pré- e pós- exposição do vírus da raiva porque tais vírus são incapazes de se espalhar entre células e causa doença. Adicionalmente, os vírus modificados tais como na ERA2g3, a qual super- expressa a proteína G devido a uma duplicação de seqüências que codificam uma glicoproteína alterada por mutação, acentuam a apoptose e provocam uma reação

imunológica anti-viral aumentada.

Por exemplo, após inoculação intra-cerebral e intramuscular de

camundongos com uma remoção da G (ERA-G)5 nenhum efeito adverso foi observado. Além disso, a ERA-G protegeu camundongos do desafio letal de uma linhagem de rua do VR. Assim, a ERA-G parece ser uma linhagem mais segura do que a ERA para o desenvolvimento de vacinas. Adicionalmente, a mutação da arginina na posição de aminoácido 333 da ERA-G para ácido glutâmico (dos nucleotídeos AGA para GAG, como nas linhagens ERAg3 e ERA2g3) resulta em um vírus atenuado. A atenuação foi confirmada através de testes de inoculação em animais. Como a super-expressão da G do VR resulta na acentuação da apoptose e das reações imunológicas anti-virais, vírus atenuados tais como na ERA2g3 que possuem múltiplas cópias da G são particularmente favoráveis como candidatos a vacinas. O sistema para o desenvolvimento de vacinas da raiva descrito aqui não se limita a modificações no gene da G, e é aplicável de forma semelhante a cada uma das proteínas virais. Para facilitar uma abordagem sistemática para a modificação dos vários componentes de proteína, o mapeamento da patogenia pode ser resolvido por genética reversa com base nos dados de seqüência

apresentados aqui.

O sistema de genética reversa descrito aqui também permite um

sistema de vetores do vírus da raiva para a expressão de genes estranhos

(heterólogos). A modalidade descrita, não-limitativa, se baseia no vírus da ERA.

Uma unidade de transcrição extra é mostrada aqui sendo funcional em dois locais

diferentes após a incorporação ao genoma do VR da ERA. Em uma modalidade,

uma unidade de transcrição extra é incorporada na posição da região psi (trans 1).

Em uma modalidade alternativa, uma unidade de transcrição extra é inserida

dentro da região intergênica P-M do VR.

Em vírus de RNA negativos de filamento simples, as seqüências distais-3' do genoma servem principalmente como um promotor de transcrição, enquanto que as seqüências de terminal-5' do genoma servem como um promotor de replicação (Conzelmann e Schnell, J. ViroL 68:713-719, 1994; Finke et al., J. Virol 71:7281-7288, 1997). Assim, a trans2 ocupa uma posição que resulta em uma transcrição mais forte para comandar a expressão de ORFs do que a transi. Portanto, os vetores revelados aqui podem ser utilizados para modular a expressão de uma ORF heteróloga para um nível desejado, simplesmente selecionando a posição em que a ORF é inserida em um vetor. Por exemplo, quando um nível alto de expressão de uma proteína for desejado, a trans2 será tipicamente uma posição ideal para a inserção da ORF heteróloga. De forma semelhante, caso níveis de expressão mais moderados de expressão sejam desejados, a ORF heteróloga pode ser inserida na transi. Os níveis de expressão ideais para cada ORF e para aplicações particulares podem ser determinados pelo

versado na técnica sem experimentações indevidas.

Portanto, os vetores virais fornecidos aqui são excelentes construções para a inserção e a expressão de genes estranhos, como é demonstrado aqui com relação à expressão do gene de proteína fluorescente verde. Embora a utilidade e a eficácia dos vetores desejados sejam demonstradas em relação ao GFP, deve-se notar que os vetores são igualmente adequados para a expressão de qualquer gene ou ORF de interesse.

Como se nota, o sistema de expressão heteróloga baseado na raiva fornecido aqui pode ser utilizado para expressar quaisquer proteínas estranhas (heterólogas). É particularmente previsto, a título de exemplo, que tais genes heterólogos sejam de outro organismo patogênico, tal como outros vírus patogênicos, por exemplo o vírus SARS, o vírus Nipah, etc. Além disso, os vetores revelados podem ser utilizados para a distribuição de outros genes terapêuticos, incluindo, por exemplo, genes que codifiquem proteínas de valor terapêutico ou moléculas de RNA funcionais, tais como as siRNAs.

XI. Composições Farmacêuticas e Imunologicamente

Estimuladoras e seus Usos

As composições farmacêuticas que incluem vírus resgatados atenuados ou fixos, seqüências de ácidos nucléicos de vírus ou polipeptídios de vírus compreendendo ao menos um epitopo de vírus são também abrangidos pela presente divulgação. Essas composições farmacêuticas incluem uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ou mais compostos ativos, tais como um vírus atenuado ou fixo, polipeptídios de vírus compreendendo ao menos um epitopo de vírus, ou uma ou mais moléculas de ácidos nucléicos que codificam esses polipeptídios, em conjunto com um portador farmaceuticamente aceitável. E previsto que, em certas modalidades, seqüências de ácidos nucléicos de vírus ou polipeptídios de vírus compreendendo múltiplos epitopos de vírus sejam úteis na preparação das composições farmacêuticas da divulgação.

São aqui reveladas substâncias adequadas para uso como composições imunologicamente estimuladoras para a inibição ou o tratamento (seja pré-exposição ou pós-exposição) de uma infecção de vírus, por exemplo, uma infecção de vírus da raiva.

Em uma modalidade, uma composição imunologicamente estimuladora contém um vírus (recombinante) resgatado atenuado ou fixo. Em uma outra modalidade, a composição contém um polipeptídeo de vírus isolado ou recombinante incluindo ao menos um epitopo de vírus (tal como uma proteína G do vírus da raiva). Em uma modalidade adicional, a composição imunologicamente estimuladora contém um vetor de ácido nucléico que inclui ao menos uma molécula de ácido nucléico revelada aqui, ou que inclui uma seqüência de ácido nucléico que codifica ao menos um epitopo de vírus. Em um exemplo específico, não limitativo, uma seqüência de ácido nucléico codificando ao menos um epitopo de vírus é expressa em uma unidade de transcrição, tal como as descritas nas Publicações PCT Nos. PCT/US99/12298 e PCT7US02/10764 (ambas as quais são aqui incorporadas em suas totalidades).

Os vírus, polipeptídios de vírus, construções, ou vetores que codifiquem tais polipeptídios, imunologicamente estimuladores são combinados com um portador ou veículo farmaceuticamente aceitável para a administração como uma composição imunologicamente estimuladora para sujeitos humanos ou animais.

As formulações imunogênicas podem ser convenientemente apresentadas em forma de dosagem única e preparadas através da utilização de técnicas farmacêuticas convencionais. Tais técnicas incluem a etapa de colocar em associação o ingrediente ativo e o(s) portadore(s) ou excipiente(s) farmacêutico(s). Em geral, as formulações são preparadas colocando-se em associação uniforme e intimamente o ingrediente ativo com portadores líquidos. As formulações adequadas para a administração parenteral incluem soluções de injeção estéreis aquosas e nao-aquosas que podem conter antioxidantes, tampões, bacteriostatos e solutos que tornam a formulação isotônica com o sangue do recipiente pretendido; e suspensões estéreis aquosas e não-aquosas que podem incluir agentes de suspensão e agentes de engrossamento. As formulações podem ser apresentadas em recipientes de dose única ou de dose múltipla, por exemplo, ampolas vedadas e frascos, e podem ser armazenadas em uma condição liofilizada que requeira apenas a adição de um portador líquido estéril, por exemplo, água para as injeções, imediatamente antes do uso. Soluções de injeções e suspensões extemporâneas podem ser preparadas a partir de pós, grânulos ou tabletes estéreis, utilizados comumente pelos versados na técnica.

Em certas modalidades, formulações de dosagem de unidade são as que contenham uma dose ou unidade, ou uma fração apropriada destas, do ingrediente administrado. Deve ser entendido que além dos ingredientes particularmente mencionados acima, as formulações abrangidas aqui podem incluir outros agentes comumente utilizados pelo versado na técnica.

As composições fornecidas aqui, incluindo aquelas para uso como composições imunologicamente estimuladoras, podem ser administradas por vias diferentes, tais como a oral, incluindo a bucal e a sublingual, retal, parenteral, aerossol, nasal, intramuscular, subcutânea, intra-dermal e tópica. Elas podem ser administradas de diferentes formas, incluindo mas não se limitando a soluções, emulsões e suspensões, micro-esferas, partículas, micro-partículas,

) nanopartículas e lipossomos.

O volume da administração irá depender da via de administração. A

título de exemplo, as injeções intramusculares podem estar na faixa de aproximadamente 0,1 ml a aproximadamente 10 ml. Os versados na técnica saberão os volumes apropriados para as diferentes vias de administração. Um progresso relativamente recente no campo dos compostos

imunoIogicamente estimuladores (por exemplo, vacinas) é a injeção direta de moléculas de ácido nucléico que codificam antígenos de peptídeo (amplamente descrita por Janeway & Traversl Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, página 13, 25, Garland Publishing, Inc., Nova York, EUA, 1997; e 0 Mcdonnell & Askari, N. Engl J. Med. 334:42-45, 1996). Vetores que incluam as moléculas de ácidos nucléicos descritas aqui, ou que incluam uma seqüência de ácido nucléico de codificação de um polipeptídeo de vírus que compreenda ao menos um epitopo de vírus, podem ser utilizados em tais métodos de vacinação

de DNA.

Portanto, a expressão "composição imuno logicamente

estimuladora", como utilizada aqui, também inclui vacinas de ácidos nucléicos em que uma molécula de ácido nucléico codificando um polipeptídeo de vírus que compreenda ao menos um epitopo de vírus seja administrada a um sujeito em uma composição farmacêutica. Para a imunização genética, métodos de distribuição adequados conhecidos pelos versados na técnica incluem a injeção direta de DNA plasmídeo em músculos (Wolff e outros, Hum. Mol Genet. 1:363, 1992), a distribuição de DNA complexado com portadores de proteína específicos (Wu e outros, J. BioL Chem. 264:16985, 1989), a co-precipitação de DNA com fosfato de cálcio (Benvenisty e Reshef, Proc. NatL Aead ScL 83:9551, 1986), a encapsidação de DNA em lipossomos (Kaneda e outros, Science 243:375, 1989), o bombardeio de partículas (Tang e outros, Nature 356:152, 1992; Eisenbraun e outros, DNA Cell BioL 12:791, 1993), e a infecção in vivo utilizando-se vetores retro-virais clonados (Seeger e outros, Proc. NatL Acad ScL 81:5849, 1984). De forma semelhante, as preparações de vacinas de ácidos nucléicos podem ser administradas através de portadores virais.

A quantidade de composto imuno-estimulador em cada dose de uma composição imunologicamente estimuladora é selecionada como uma quantidade que induza uma reação imuno-estimuladora ou imuno-protetora sem efeitos colaterais adversos significativos. Tal quantidade irá variar dependendo de qual imunogênico específico for empregado e como ele é apresentado. As injeções iniciais podem ficar na faixa de aproximadamente 1 μg a aproximadamente 1 mg, com algumas modalidades tendo uma faixa de aproximadamente 10 a aproximadamente 80 μδ, e ainda outras modalidades tendo uma faixa de aproximadamente 25 μg a aproximadamente 500 μδ. Após uma administração inicial da composição imunologicamente estimuladora, os sujeitos podem receber uma ou várias administrações de reforço, adequadamente espaçadas. As administração de reforço podem estar na faixa de aproximadamente 1 μ§ a aproximadamente 1 mg, com outras modalidades tendo uma faixa de aproximadamente 10 μg a aproximadamente 750 e ainda outras tendo uma faixa de aproximadamente 50 μg a aproximadamente 500 Reforços periódicos em intervalos de 1-5 anos, por exemplo, três anos, podem ser desejáveis para manter os níveis desejados de imunidade protetora.

É também previsto que as moléculas e composições imuno- estimuladoras fornecidas sejam administradas a um sujeito indiretamente, primeiro estimulando-se uma célula in vitro, após o qual a célula estimulada é administrada ao sujeito para provocar uma reação imunológica. Adicionalmente, as composições imunologicamente estimuladoras ou os métodos de tratamento podem ser administrados em combinação com outros tratamentos terapêuticos.

20 A preparação de iscas de alimentos contendo composições imunologicamente estimuladoras também se encontra dentro da habilidade dos versados na técnica. Por exemplo, a preparação de iscas de alimentos contendo vacinas do VR vivas é revelada por Wandeler e outros (Rev. InfecL Dis. 10 (suppl. 4):649-653, 1988), Aubert e outros (pp. 219-243, em Lyssavirus (Rupprecht e outros, eds.), Springer-V erlag, Nova York, 1994), e Fu e outros (pp. 607-617, em New Generation Vaccines (2a Ed.) (Levine e outros, eds.), Mareei Dekker, Inc., Nova York, 1997), cujas divulgações completas são aqui incorporadas como referências.

XIII. Kits

São também fornecidos aqui kits úteis na detecção e/ou no diagnóstico de infecção por vírus, por exemplo, infecção com um vírus da raiva ou outros lyssavirus. Um exemplo de um kit de ensaio fornecido aqui é um polipeptídio de vírus recombinante (ou fragmento deste) como um antígeno e um anticorpo anti-humano conjugado com enzima como um segundo anticorpo. Exemplos de tais kits podem incluir também um ou mais substratos enzimáticos. Tais kits podem ser usados para testar se uma amostra de um sujeito contém anticorpos contra uma proteína específica de vírus. Em tal kit, uma quantidade apropriada de um polipeptídio de vírus (ou fragmento deste) é fornecida em um ou mais recipientes, ou mantida sobre um substrato. Um polipeptídio de vírus pode ser fornecido em uma solução aquosa ou como um pó liofílizado, por exemplo. Os recipientes em que os polipeptídios de vírus são supridos podem ser qualquer recipiente convencional que seja capaz de conservar a forma suprida, por exemplo, tubos de centrifugação, ampolas ou garrafas.

A quantidade de cada polipeptídio suprido no kit pode ser qualquer quantidade apropriada, e pode depender do mercado para o qual o produto é direcionado. Por exemplo, se o kit for adaptado para pesquisa ou uso clínico, a quantidade de cada polipeptídio fornecido seria provavelmente uma quantidade suficiente para diversos ensaios. Orientações gerais para determinar quantidades apropriadas podem ser encontradas, por exemplo, em Ausubel e outros (eds.), Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Nova York, NY, EUA, 1999 e Harlow e Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, CSHL,

Nova York, EUA, 1999.

Os exemplos a seguir são fornecidos para ilustrar certos recursos

e/ou modalidades. Esses exemplos não devem ser vistos como se limitassem a

invenção às características ou modalidades descritas.

Exemplos

Exemplo X: Seqüenciamento do VR da ERA

Esse exemplo fornece uma descrição de um método para o seqüenciamento do genoma de comprimento completo de um rabdovírus, particularmente nesse caso um vírus da raiva.

A linhagem ERA do vírus da raiva foi obtida dos arquivos da CDC e foi propagada células do rim de filhotes de hamsters (BHK-21). O vírus foi colhido após quatro dias de infecção a 37°C, em um incubador de CO2 5% e foi purificado. Em breves palavras, o sobrenadante da célula foi coletado e centrifugado a 2.000 rpm por 15 minutos para remover os detritos de célula. O sobrenadante clareado foi submetido a mais uma centrifugação a 18.000 rpm por 1 hora. O grão foi re-suspenso em PBS e submetido à extração de RNA

genômico da raiva.

O RNA total das células BHK-21 infectadas com ERA foi extraído

com o reagente Trizol (GlBCO Invitrogen) de acordo com o protocolo

recomendado pelo fabricante. O RNA genômico de ERA foi purificado do

sobrenadante de vírus da ERA concentrado com um kit de RNA viral de alta

pureza da Roche.

A integridade do RNA genômico de ERA purificado foi verificada

por eletroforese de gel e Northern blot por sondas de hibridação de Ν, P, G e M.

Em breves palavras, 5 μg de RNA genômico foram carregados em um gel de

RNA desnaturado e transferidos para uma membrana de nylon para hibridação. A

sonda foi marcada utilizando-se o kit de marcação de DNA Dig da Roche, de

acordo com as instruções do fabricante. S&

Os 11 nucleotídeos conservados do antigenoma 5' do vírus da raiva foram projetados como um primer para transcrição reversa. A reação de RT foi realizada com um kit de síntese de cDNA de primeiro filamento da Invitrogen. O cDNA completo da genoma da ERA foi confirmado por Northern blot utilizando-se hibridação com sonda de Ν, Ρ, M e G, assim como os 11 nucleotídeos conservados como sondas de oligonucleotídeos marcadas por Digoxina.

Dois conjuntos de primers foram escolhidos para reações de PCR, que amplificam todo o genoma da ERA em dois fragmentos contíguos. Um conjunto de primers é composto dos 11 nucleotídeos na extremidade de antigenoma 5', Le5: ACGCTT AACAA (SEQ ID NO: 24) e BLp3; GTCGCTTGCTAAGCACTCCTGGTA (SEQ ID NO: 25). Um outro conjunto contém os 11 nucleotídeos complementares na extremidade de genoma 5', Le3: TGCGAATTGTT (SEQ ID NO: 26) e BLp5 CCAG GAGTGCTTAGCAAGCGACCT (SEQ ID NO: 27). Os primers Blp3 e Blp5 ficam localizados em uma região relativamente conservada no genoma do vírus da raiva.

Fragmentos da PCR foram purificados e clonados no vetor TOPO comprado da Invitrogen. O seqüenciamento foi conduzido em um seqüenciador ABI 310 e a seqüência foi montada pelo software BioEdit ou pelo software SeqMerge da Accelrys no ambiente GCG.

A seqüência alinhada completa do genoma da ERA é fornecida na SEQ ID NO: 1. As posições de seqüências codificadoras de proteína individuais são fornecidas na Tabela 3, com referência à SEQ ID NO: 1. As seqüências de aminoácido das proteínas N, P, M, G e L são fornecidas nas SEQ ID Nos: 2 a 6, respectivamente.

Tabela 3 - Posições de Seqüências Codificadoras de Proteína da linha ERA do Vírus da Raiva Gene/genoma NT Posições na seqüência da rERA ERA 11930 1-11930 N 1412 71-1423 P 962 1511-2407 M 789 2491-3104 G 1647 3318-4892 Região-Psi 398 L 6445 5418-11801 Líder 58 Seguidor 70

Esse método pode ser utilizado tanto para o vírus da raiva como para vírus relacionados à raiva. Os vírus da raiva e relacionados à raiva têm ao menos sete supostos tipos de espécie. O método de seqüência fornecido pode ser utilizado também para outros vírus de RNA de filamento negativo. Isso é assim porque quase todos os genomas de vírus de RNA de filamento negativo têm aproximadamente 12 nucleotídeos conservados em ambas extremidades distais, que podem servir de forma semelhante como primers para RT-PCR. Os primers irão evidentemente ser diferentes para diferentes espécies virais, e as seqüências de primers específicos podem ser determinadas por alguém versado na técnica

com base nos ensinamentos daqui.

Exemplo 2: Construção de Plasmídeos para um Sistema de

Genética Reversa para o Vírus da Raiva

Esse exemplo descreve o projeto e o desenvolvimento de um sistema de Genética Reversa para o Vírus da Raiva. A linhagem ERA do vírus da raiva foi obtida da ATCC e foi preparada como descrito (Wu e outros, J. Virol 76, 4153-4161). Para se obter o genoma de cDNA de vírus de comprimento completo, células BSR (um clone das células de rim de filhote de hamster, BHK) foram infectadas com vírus da linhagem ERA e desenvolvidas no meio essencial mínimo de Dulbecco suplementado com 100% se soro bovino fetal. O sobrenadantes foram resgatados e submetidos a centrifugação a 22.000 g por 1 hora. Os grãos de vírus foram coletados para a purificação de RNA genômico viral utilizando-se um kit de extração de vírus de RNA comprado da Qiagen (Valencia, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. A integridade do RNA genômico viral foi confirmada por eletroforese de gel. O cDNA genômico viral foi transcrito com o kit de síntese de cDNA de primeiro filamento da Invitrogen (Calrsbad5 CA, EUA). A mistura da reação de transcrição reversa (RT) foi aplicada à amplificação através da reação em cadeia de polimerase (PCR) para a síntese do cDNA genômico viral de comprimento completo e dos genes Ν, P, G e L, respectivamente. Para montar o cDNA genômico de vírus de comprimento completo, um plasmídeo PTMF foi construído em quatro etapas seqüenciais como ilustrado esquematicamente na Fig. 1B. Uma transcriptase reversa Superscript III e polimerase pfx de platina com prova de leitura (Invitrogen, Carlsbad5 CA, EUA) foram aplicadas à síntese de transcrição de cDNA e às amplificações de PCR consecutivas. Para as reações de transcrição reversa, 1 μg de RNA genômico purificado foi utilizado na mistura de reação RT e incubado a 50°C por 80 minutos, seguido por aquecimento a 85°C por 5 minutos para desativar a Superscript IIl Após a reação de RT, 1 unidade de RNaseH foi adicionada ao RNA modelo de digestão nos híbridos de cDNA- RNA.

Para gerar cDNA genômico de vírus de comprimento completo, dois fragmentos sobrepostos foram amplificados por RT-PCR da seguinte forma: Um fragmento (Fl) foi amplificado por RT-PCR com primers: Le-5Kpn (CCGGGTAÇCACGCTTAAC AACCAGATCAAAGA; SEQ ID NO: 28, local de reconhecimento da Kpnl sublinhado) e Le3-Bpl (TAGGTCGCTTGCTAAGÇACTCCTGGTAGGAC; SEQ ID NO: 29, local de reconhecimento da Blpl sublinhado). Um fragmento (F2) foi amplificado por RT-PCR com primers: Tr5-Blp

(GTCCTACCAGGAGTGCTTAGÇAAGCGACCTA; SEQ ID NO: 30, local de reconhecimento da Blpl sublinhado) e Tr3-Pst

CAAAACTGCAGACGCTTAACAAATAAACAACAAAA; SEQ ID NO: 31, local de reconhecimento da Pstl sublinhado). Após a síntese bem sucedida dos dois fragmentos acima, o Fl digerido pelas enzimas de restrição Kpnl e Blpl foi submetido à purificação de gel e clonado para o fagemídeo pBluescriptIISK(+) (Stratagene, La Jolla, CA, EUA) para formar o plasmídeo pSKFl. O fragmento F2 purificado com gel, cortado pela Blpl e Pstl foi consecutivamente clonado para o plasmídeo pSKFl para formar o cDNA antigenômico viral de comprimento completo. Uma ribozima em cabeça-de-martelo (oligol,

caaggctagctgttaagcgtctgatgagtccgtgaggacgaaactat

aggaaaggaattcctatagtcggtaççacgct; SEQ ID NO: 32, locais de reconhecimento de Nhel e Kpnl sublinhados; 01igo2,

agcgtggtaccgactataggaattcctttcctatagtttcgtcctcac

ggactcatcagacgcttaacagctagccttg; SEQ ID NO: 33, locais de reconhecimento de Kpnl e Nhel sublinhados) foi sintetizada contendo um local de reconhecimento de Nhel na extremidade 5' e um local de Kpnlna extremidade 3'. Ela foi fundida à frente da extremidade 5' do fragmento Fl. Uma ribozima de vírus delta da hepatite (oligo3,

gacctgcaggggtcggcatggcatctccacctcctcgcggtccgacct gggcatccgaaggaggacgcacgtccactcggatggctaagggagg gcgcggccgcactc; SEQ ID NO: 34 , (locais de reconhecimento de Pstl e Notl sublinhados; 01igo4,

gagtgcggccgcgccctcccttagccatccgagtggacgtgcgtcctc

cttcggatgcccaggtcggaccgcgaggaggtggagatgccatgccg

ACCCCTGCAGGTC; SEQ ID NO: 35, locais de reconhecimento de Notl e Pstl sublinhados)(Symons, Annu. Rev. Biochem. 61:641-671, 1992) foi sintetizada, possuindo um local de Pstl em sua extremidade 5' e um local de Notl em sua extremidade 3', e foi fundida à extremidade 3' do fragmento F2. O local de reconhecimento conjuntivo Kpnl, entre a ribozima em cabeça-de-martelo e o fragmento Fl, e o local de Pstl entre o fragmento F2 e a ribozima de vírus delta da hepatite, foram removidos por mutagênese direcionada local. O cDNA antigenômico viral de comprimento completo ficou espremido entre as ribozimas em cabeça-de-martelo e do vírus delta da hepatite. Ele foi removido e clonado para o fagemídeo pBluescriptIISK(+) para fazer uma construção de pSKF. O cDNA antigenômico viral completo com duas ribozimas foi fundido abaixo do local de iniciação de transcrição do T7 sob o controle do promotor prévio- imediato de CMV no plasmídeo pcDNA3.1/Neo (+) (lnvitrogen, Carlsbad5 CA). Essa última etapa finalizou a construção do plasmídeo pTMF. O genoma viral da ERA do tipo selvagem inclui um tubo de poliA de oito resíduos (poliA8) na região intergênica entre as regiões G e Psi. Para distinguir os vírus da ERA (rERA) resgatados da linhagem mãe, um comprimento de sete As (poliA?) foi introduzido à construção de pTMF pela remoção de um A ao invés do A8 original. Após o vírus rERA ter sido resgatado, RT-PCR foi feita e os dados seqüenciais subseqüentes confirmaram a existência do marcador de seqüência de poli A7 introduzido.

plasmídeo pTN: o gene N foi amplificado por RT-PCR com primers: (5N: ACCACC47GGATGCCGACAAGATTG; SEQ ID NO: 36, local de reconhecimento da Ncol e códon inicial sublinhados); e 3N: GGCCCATGGmiTGAGTCACTCGAATATGTCTT; SEQ ID NO: 37, local de reconhecimento da Ncol EcoRl e códon terminal sublinhados) e clonado para o plasmídeo pCITE-2a(+) (Promotor de Tradução Independente de Cap) (Novagen, Madison, WI, EUA).

plasmídeo pMP: o gene P foi amplificado por RT-PCR com primers: (5P: TTGGTACCACCATGAGCAAGATCTTTGTCAATC; SEQ ID NO: 38, local de reconhecimento da Kpnl e códon inicial sublinhados); e 3P: GGAGAGGAATTC77MGCAAGATGTATAGCGATTC; SEQ ID NO: 39, local de reconhecimento da EcoRl e códon terminal sublinhados) e clonado para o plasmídeo pcDNA3.1/Neo (+).

plasmídeo pMG: o gene G foi amplificado por RT-PCR com primers: (5G: TTGGTACCACC^TGGTTCCTCAGGCTCTCCTG; SEQ ID NO: 40, local de reconhecimento da Kpnl e códon inicial sublinhados); e 3G: AAAACTGCAGTCiCAGTCTGGTCTCACCCCCAC; SEQ ID NO: 41, local de reconhecimento da Pstl e códon terminal sublinhados) e clonado para o plasmídeo pcDNA3.1/Neo (+).

plasmídeo pML: o gene L foi amplificado por RT-PCR com primers: (5L: ACCGCTAGCACCACC^TGCTCGATCCTGGAGAGGTC; SEQ ID NO: 42, local de reconhecimento da Nhel e códon inicial sublinhados; e 3L: AAAACTGCAGrC4CAGGCAACTGTAGTCTAGTAG; SEQ ID NO: 43, local de reconhecimento da Pstl e códon terminal sublinhados) e clonado para o plasmídeo pcDNA3.1/Neo (+). plasmídeo pT7: cDNA genômico da bactéria BL-21 (.Novagene, Madison, WI, EUA) foi extraído com o Kit de Tecido Dneasy (Qiagen, Valencia, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. O gene da RNA polimerase do T7 foi purificado do DNA genômico por PCR com primers (5T7; TCGCTAGCACCACCATGAACACGATTAACATCGCTAAG; SEQ ID NO: 44, local de reconhecimento da Nhel e códon inicial sublinhados; e 3T7: GATGAATTC2X4CGCGAACGCGAAGTCCGACTC; SEQ ID NO: 45, local de reconhecimento da EcoRl e códon terminal sublinhados) e clonado para o plasmídeo pcDNA3.1/Neo (+).

plasmídeo NLST7: um sinal de localização nuclear (NLS) com oito aminoácidos, derivado do antígeno SV40 de T grande, foi adicionado à N terminal da RNA polimerase do T7 por PCR, utilizando-se o plasmídeo pT7 como o modelo, com primers (5T7NLS:

TrorTAOCCACCATGCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTAGAAAACACGA TTAACATCGCTAAGAAC; SEQ ID NO: 46, NLS sublinhado; e primer 3T7). O fragmento amplificado foi designado NLST7, e foi clonado para pcDNA3.1/Neo (+) para formar a construção de pNLST7.

plasmídeo pGFP: Plasmídeo phMGFP de Proteína Fluorescente Verde (GFP) Monster foi comprado da Promega (Madison, WI, EUA). O gene do GFP foi amplificado por PCR com primers (GFP5: AAAACTGCAGGCCACC^rGGGCGTGATCAAG; SEQ ID NO: 47, local de reconhecimento da Pstl e códon inicial sublinhados; e GFP3: CCGCTCGGTACCTATTMGCCGGCCTGGCGGG; SEQ ID NO: 48, local de reconhecimento da Kpnl e códon terminal sublinhados) e clonado para o plasmídeo pcDNA3.1/Neo (+).

Todas as construções de plasmídeos foram seqüenciadas ao menos três vezes para confirmar a ausência de mutações ou remoções inesperadas após a clonagem, a mutagênese direcionada local, ou a remoção de genes. Adicionalmente, a presença de uma seqüência marcadora consistindo em um tubo de poliA contendo sete resíduos de adenosina ao invés dos oito resíduos observados no genoma da ERA do tipo selvagem entre a glicoproteína e a região Psi foi confirmada. Exemplo 3: Expressão de RNA Polimerase do T7 em Células

BSR

Esse exemplo demonstra que a adição de um sinal de localização nuclear à RNA polimerase do fago T7 direciona a expressão da polimerase no núcleo de células transfectadas. A transfecção de células BSR foi realizada como descrito por Wu e outros (J. Virol 76, 4153-4161, 2002). Em breves palavras, as células BSR com confluência de quase 80% em uma placa de seis poços foram transfectadas com 0,5 \xg de P7 ou de plasmídeo pNLST7 por poço, respectivamente. Em 48 horas após transfecção, as células foram fixadas com 80% acetona iria por 1 hora e secadas na temperatura ambiente. O anticorpo monoclonal de camundongo contra a RNA polimerase do T7 e o conjugado FITC-IgG de cabra anti-camundongo foram sucessivamente adicionados, e foram lavados no procedimento de manchas fluorescentes indireto de duas etapas. Os resultados foram gravados após microscopia de UV. A RNA polimerase do T7 expressa de um pT7 sem um sinal de localização nuclear foi observado principalmente no citosol, enquanto que a polimerase de NLST7 incluindo um sinal de localização nuclear estava presente predominantemente no núcleo das células. Esses resultados indicam que a adição de um NLS direcionou eficientemente a RNA polimerase do T7 para o núcleo das células transfectadas.

Exemplo 4: Estabelecimento de linhagem celular BSR de glicoproteína da ERA expressa constitutivamente

Esse exemplo descreve a concepção e a produção de uma linhagem celular BHK que expressa constitutivamente a glicoproteína da ERA. Uma linhagem de células BHK que expressava a glicoproteína da ERA foi construída utilizando-se o sistema Flp-In™ (.Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). Em breves palavras, as células BHK-Flp-InT™ (possuindo um único local alvo de recombinação Flp integrado) foram desenvolvidas para aproximadamente 20% de confluência em uma placa de seis poços e mantidas em meio de DMEM comum, suplementado com 100 μ^πιΐ de Zeocina, antes da transfecção. O gene da G da ERA foi amplificado por PCR utilizando-se o plasmídeo pMG como modelo com primers EF5G5 (CACCATGGTTCCTCAGGCTCTCCTG; SEQ ID NO: 49) e EF5G3 (TCACAGTCTGGTCTCACCCCCAC; SEQ ID NO: 50), e clonados em um vetorpEF5/FRT/V5-D~TOPO vector (Invitrogen, Carlsbad, CAs EUA) para criar a construção de pEFG. O plasmídeo pOG44 expressando recombinase de Flp junto com pEFG na razão de 10:1 foi co-transfectado para as células Flp-In™-BHK. Após a transfecção, as células foram guardadas em DMEM sem Zeocina, mas com higromicina B a 4000 μ^πιΐ. Após 48 horas, as células foram divididas de modo que não mais do que 20% de confluência ocorresse no próximo dia. As células foram desenvolvidas em meio seletivo de higromicina B a 37°C por aproximadamente uma semana. A expressão de G da ERA alvo foi detectada por manchas fluorescentes indiretas com anticorpo monoclonal anti-G humano e conjugado FITC-IgG de cabra anti-humano. A linhagem de células que expressava constitutivamente a G foi designada BHK-G, e foi utilizada para o crescimento do vírus da ERA-G.

Exemplo 5: Modificação Definida da Linhagem de Evelyn- Rokitnicki-Abelseth (ERA) do Vírus da Raiva

Além da linhagem de vírus da ERA mãe descrita acima, linhas de vírus derivadas foram desenvolvidas utilizando-se o sistema de genética reversa revelado aqui. Diversos vírus modificados exemplificativos foram produzidos, quais sejam, da ERA- (remoção de toda a região psi), ERAverdel (gene de proteína verde fluorescente inserido em fosfoproteína e na região intergênica de proteína matricial), ERA2g (contendo uma cópia extra de glicoproteína na região psi), ERAg3 (com uma mutação no aminoácido 333 na glicoproteína), ERA2g3 (com uma cópia extra da glicoproteína com mutação em Aa333 na região psi), ERA-G (com a glicoproteína removida), ERAgm (genes MeG trocados no genoma), e ERAgmg (duas cópias da G na construção da ERAgm rearranjada). Esses derivados são ilustrados esquematicamente na Fig. 3. Otimizando-se as condições de crescimento da forma descrita, todos os vírus resgatados podem ser obtidos com títulos de vírus de IO9 a IO10 ffu/ml tanto em frascos de cultivo de tecidos como em bio-reatores.

Remoção de genes e mutagênese local direcionada no sistema de

genética reversa

Remoção da resião Psi do genoma da ERA do vírus da raiva A região Psi completa do genoma da ERA do vírus da raiva foi removida da seguinte forma: um fragmento de 3'Δψ foi amplificado utilizando-se pTMF como modelo por PCR com primers: 5Δψ: CCCTCTGCAGTTTGGTACCGTCGAGAAAAAAACATTAGATCAGAAG; SEQ ID NO: 51, locais de reconhecimento da Pstl e Kpnl sublinhados; e primer Le3-Blp) e foi clonado para o vetor pCR-BluntII -TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA5 EUA) para a construção do plasmídeo ρΡΔ5ψ. O fragmento de 5'Δψ foi amplificado utilizando-se o mesmo modelo por PCR com primers: (SnaB5: ATG A ACTTTCTACGTAAG AT AGTG; SEQ ID NO: 52, local de reconhecimento da SnaBl sublinhado; e 3Δψ:

CAAACTGCAGAGGGGTGTTAGTTTTTTTCAAAAAGAACCCCCCAAG; SEQ ID NO: 53, local de reconhecimento da Pstl sublinhado) e sucessivamente clonado para o plasmídeo ρΡΔ5ψ acima para finalizar a construção do plasmídeo ρΡΔψ. O fragmento recuperado pela digestão por enzima de restrição SnaBl e Pstl do plasmídeo ρΡΔψ substituiu o correspondente na construção de pSKF para fazer o plasmídeo pSKFAy. O fragmento de DNA inteiro contendo o cDNA genômico da ERA, digerido por Nhel e Notl do plasmídeo pSKFA\|/, foi re- clonado para o plasmídeo pcDNA3.1/Neo (+) para finalizar a construção do pTMFAy. Para a verificação da linhagem resgatada sem Psi, os primers designados Era- encobrindo a região Psi foram aplicados em RT-PCR com o RNA total das células BSR infectadas com ERA. Um fragmento de 400 bp correspondente à região Psi foi amplificado somente a partir de vírus da rERA, mas não da ERA. Os dados de seqüência verificaram a remoção completa da região Psi.

Remoção do serie da glicoproteína no genoma da ERA do vírus da

raiva:

O fragmento de 5^Δψ foi amplificado utilizando-se pSKF como modelo por PCR com primers {primer SnaB5, e 3Ag: CAAACTGCAGAGGGGTGTTAGTTTTTTTCACATCCAAGAGGATC; SEQ ID NO: 54). Após digestão pelas enzimas de restrição SnaBl e Pstl, esse fragmento recuperado foi clonado para substituir seu correspondente na construção do ρ8ΚΡΔψ. O fragmento de 3'gA\|/ foi amplificado utilizando-se o mesmo modelo por PCR com primers (5 Ag: CCTCTGCAGTTTGGTACCTTGAAAAAAACCTGGGTTCAATAG; SEQ ID NO: 55, e primer Le3-Blp), e foi consecutivamente clonado para o pSKFAy modificado, para substituir seu correspondente. O fragmento final, recuperado pelas enzimas de restrição SnaBl e Blpl cortadas desse pSKFAy sem o gene da G, foi re-clonado para o plasmídeo pcDNA3.1/Neo (+), para formar a construção de pTMFAg para a recuperação de vírus.

Mutagênese local direcionada de sene da elicoproteína

Uma mutagênese local direcionada para introduzir uma mudança em três nucleotídeos de AGA para GAG na posição do aminoácido 333 da glicoproteína foi feita como descrito anteriormente (Wu e outros, J. Virol 76: 4153-4161, 2002). Os primers na reação de mutagênese foram o primer M5G: CTCACTACAAGTCAGTCGAGACTTGGAATGAGATC (SEQ ID NO: 56, os três nucleotídeos que tiveram mutação em negrito), e o primer M3G; GACTGACTTTGAGTGAGCATCGGCTTCCATCAAGG (SEQ ID NO: 57). Para a linhagem recuperada (ERAg3), as mudanças de três nucleotídeos de AGA para GAG na posição do aminoácido 333 (aa333) foram confirmadas por seqüenciamento após RT-PCR com primers 5G e 3G. Após a confirmação por seqüenciamento de DNA, a G que passara por mutação foi clonada de volta para o plasmídeo pTMF para fazer a construção de pTMFg3 para a recuperação de vírus. A glicoproteína codificada por essa proteína alterada por mutação é representada pela SEQ ID NO: 58.

Incorporação de uma ORF exógena em genoma de vírus da raiva da ERA

Para expressar ORFs exógenas no VR3 uma unidade de transcrição extra com locais de reconhecimento de Pstl e Kpnl foi criada e incorporada nas regiões intergênicas Psi ou P-M, respectivamente. Em breves palavras, para a criação de uma unidade de transcrição extra na região Psi, as mesmas etapas foram seguidas, com a exceção da etapa de amplificação do fragmento de 5'Δψ, e o primer 3Δψ foi mudado para 3A\|/cis: CCAAACTGCAGCGAAAGGAGGGGTGTTAGTTTTTTTCATGATGAACC CCCCAAGGGGAGG (SEQ ID NO: 59). A construção final sem a região Psi, mas com uma unidade de transcrição extra, foi designada pMTFA\|/cis. O GFP, a G da ERA ou a G alterada por mutação nos resíduos do aminoácido 333 foi clonada para essa unidade de transcrição para formar as construções de pMTFgfpl, pMTF2g, pMTFg3, pMTF2g3, respectivamente, para o resgate do

vírus.

Para incorporar uma unidade de transcrição extra à região intergênica P-Mi o fragmento de cisp5 foi amplificado utilizando-se o pMTF como modelo com os primers cis55:

GACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCTGTTAAG (SEQ ID NO: 60), cis53: CCAAACTGCAGCGAAAGGAGGGGTGTTAGTTTTT TTCATGTTGACTTT AGGACATCTCG G (SEQ ID NO: 61), e foi clonada em substituição de seu correspondente no plasmídeo pMTF. O fragmento cisp3 foi amplificado e clonado de uma forma semelhante com os primers cis35: CCTTTCGCTGCAGTTTGGTACCGTCGAGAAAAAAACAGGCAACACCA

CTGAT AAAATGAAC (SEQ ID NO: 62) e cis33: CCTCCCCTTCAAGAGGGCCCCTGGAATCAG (SEQ ID NO: 63). Após a montagem dos fragmentos cisp5 e cisp 3 juntos, a construção final foi designada pMTFcisp, para aceitar ORFs. A construção recombinante contendo o gene do GFP foi denominada pTMFgíp2 para o resgate do vírus.

Para produzir um derivado da ERA, a designada ERAgm, na qual a seqüência codificadora de glicoproteína foi invertida em ordem com a seqüência codificadora de proteína matricial, o gene da glicoproteína foi removido como descrito acima. O gene da G (amplificado como revelado acima) foi então inserido entre os genes M e P, dando um genoma de vírus da raiva na ordem N- P-G-M-L. De forma semelhante, a mesma estratégia foi aplicada para produzir o derivado de ERAg3m, no qual a glicoproteína tem uma mutação de nucleotídeo tripla na resíduo de aminoácido 333 (de AGA para GAG) através da substituição do gene da G produzido por mutagênese local direcionada como descrito acima. Para produzir a construção de ERAgmg, uma cópia extra do gene da glicoproteína foi inserida entre os genes P e M, e fez o genoma de vírus da raiva na ordem N-P-G-M-G-L. Μ?

q/

Uma unidade de transcrição extra foi modificada e incorporada em duas regiões diferentes do genoma da ERA, quais sejam, a região psi e a região intergênica P-M. Quando ORFs heterólogas são incorporadas dentro dessas unidades de transcrição, designadas transi e trans2, respectivamente, o resultado é a produção eficaz do produto codificado.

A seqüência da unidade de transcrição é: CTAACACCCCTCCTTTCGCTGÇAGTTTGGTAÇÇGTCGAGAAAAA

AA (SEQ ID NO: 64, Pstl e Kpnl foram sublinhadas).

Exemplo 6: Recuperação de vírus mãe e derivados

Esse exemplo descreve a recuperação de vírus da ERA mãe e de

derivados exemplificativos utilizando o sistema de genética reversa revelado aqui. Células BSR foram transfectadas em confluência próxima a 80% em placas de seis poços com o plasmídeo pTMF (pTMFAy, pTMFg3, pTMF2g, pTMF2g3, pTMFgfpl, pTMFgfp2, pTMFAg, pTMFgm, ou pTMFgmg, respectivamente) com 3 μg/poço, juntamente com cinco plasmídeos auxiliares (pTN (^g/poço), pMP (O^g/poço), pML (O^g/poço), pMG (O^g/poço) e pNLST7 (^g/poço) pelo reagente TransIT-LTl (Mirus, Madison, WI) seguindo-se o protocolo recomendado pelo fabricante. Quatro dias após a transfecção, 1 ml de suspensão de células BSR fresca (aproximadamente 5x105 células) foi adicionado a cada poço. As células foram incubadas em 37°C, 5% CO2 por 3 dias. Os sobrenadantes das células foram coletados para a titulação do vírus.

Para titular o vírus resgatado, monocamadas de células BSR em placas de oito poços LAB-TEK (Naperville, IL) foram infectadas com diluições seriais de 10 vezes de sobrenadante de vírus e incubadas a 37°C, 0,5% CO2 por 48 horas. As células foram fixadas em 80% acetona fria na temperatura ambiente por 1 hora e manchadas com anticorpo monoclonal N de vírus anti-raiva marcado com FITC a 37°C por 30 minutos. Após três lavagens das placas com PBS, os focos manchados foram contados utilizando-se microscopia fluorescente direta. Detalhe sobre o ensaio fluorescente de VR direto (DFA) podem ser encontrados na Internet em cdc.gov/ncidod/dvrd/rabies/professional/publications/DFA- diagnosis/DF A_protocol.htm. Todos os virus com exce^So do ERA-G foram recuperados com alto titulo de celulas BSK cultivadas como indicado na Tabela 3. Surpreendentemente，ο rearranjo e a troca do gene da G com ο gene da M nao prejudicaram a recuperapSo do virus da ERA derivado recombinante. O rearranjo do gene da G nos genomas do VR anteriormente nao era considerado viavel devido a morte celular por causa da expressao excessiva de proteina G (Faber e outros, J. Virol 76:3374—3381, 2002). Contudo, esses resultados demonstram que ο rearranjo e possivel na linhagem ERA. Sendo assim, e provavel ο embaralho dos genes do VR e possivel nao apenas para ο gene da G, mas tambem para outros genes.

O virus da ERA-G (sem G) foi recuperado apos transfecpao com plasmideos seguindo-se ο mesmo procedimento dos outros resgates de constru9oes virais，mas os focos de virus foram muito limitados e restritos em areas locais apos ο primeiro estagio de transfec^ao. O virus resgatado nao foi capaz de se espalhar mais as celulas BSR saudaveis que estavam por perto (Fig. 4A), mesmo apos um semana de incuba?ao a 37°C, 5% CO2. A infecQao de celulas BSR normais com os sobrenadantes de transfec?ao acima apresentou manchas simples de celula no teste DFA, ο que sugere que ο virus resgatado foi incapaz de se espalhar. Para amplificar ο virus da ERA-G, uma linhagem de celulas BHK expressando constitutivamente a ERA-G foi estabelecida como descrito no Exemplo 4 (designada BHK-G). Por exame de ensaio fluorescente indireto, um agrupamento de celulas BHK expressando a G foi selecionado e mantido para amplificat?So do virus da ERA-G (Fig. 4B). Com ο auxilio da linhagem de celulas BHK-G, ο virus da ERA-G cresceu para IO7 ffu/mi. O RNA total das celulas BHK-G infectadas com virus da ERA-G foi extraido por analise de Northern blot (Fig. 4C) com uma sonda de gene G. O gene G estava ausente no RNA genomico viral, contudo, G mRNA foi detectado, proveniente de celulas BHK-G de suporte infectadas, No RNA genomico viral de ERA-G purificado, nenhum sinal de hibridapao foi detectado pela sonda G，indicando a remogao do gene da G no genoma da ERA.

Exemplo 7: Crescimento de Virus da ERA resgatado e de sens derivados para um alto titulo em bio-reator. No desenvolvimento de vacinas orais, um alto titulo de virus e tipicamente necessario para provocar uma imunidade confiavel apos a administra9ao. Esse exemplo demonstra que ο virus da ERA e sens derivados podem ser desenvolvidos para um alto titulo em um bio-reator em volumes aplicaveis a escala comercial. Todos os virus da ERA regatados foram amplificados em um bio-reator CELLine ADlOOO (IBS Integra Bioscience, Chur, Sui?a) ate titulos na faixa de IO7 a IO10 ffu/ml. Em poucas palavras, celulas BSR foram transfectadas com os vetores de transcriySo de anti-genoma exemplificativos e vetores auxiliares, como descrito acima. As celulas foram inoculadas em uma multiplicidade de infect?ao de 1 particula de virus (virion) por celula, em uma concentm饼ο de IO6 celulas/ml em um decimo do volume do recipiente do bio-reator. As celulas transfectadas foram desenvolvidas a 37°C, 5% CO2 em DMEM suplementado com 10% soro bovino fetal. O sobrenadante foi colhido a cada tres a cinco dias para entre duas e tres colheitas. A ERA-G deficiente cresceu menos bem em comparapSo com outros virus, com apenas 10 ffii/ml para a ERA-G (Tabela 3 e Fig. 5).

Tabela 3. Construcdes de plasmideos de comprimento coin ρ let ο e virus reseatados corresponde rites

Plasmid Rescued Titers ffu/ml from Titers ffu/ml constructs viruses cultured cells in bioreactors pTMF rERA 5 χ 10' 3 χ IOlu ρΤΜΡΔψ ERA- 6.3 χ 10' 3,2 χ 10ιυ pTMFg3 ERAg3 3 χ IOb 1,8 χ IOy pTMFgfpl ERAverdel 3.5 χ IO0 5,6 χ IOy pTMFgfp2 ERAverde2 2 χ 10' 6,2 χ IOy pTMF2g ERA2g 1,6 χ 10° 3,9 χ IOy pTMF2g3 ERA2g3 8 χ 10' 4,6 χ IOy pTMFAg ERA-G 1,2 χ 10' 1,5 χ 10' pTMFgm ERAgm 5,31 XlO0 1,9 χ IOv pTMFgmg ERAgmg 3,1 XlO0 1,2 χ 109

Exemplo 8: Expressao de protein as exogenas a partir de

unidades transcricionais extras em virus da raiva

Esse exemplo demonstra a expressao de proteinas recombinantes de uma ORF heterologa inserida dentro de um vetor de virus da raiva. Nesse exemplo, ο vetor de virus da ERA e utilizado como um prototipo de vetor de virus da raiva. Para construir ο virus da ERA como um vetor para aceitar ORFs,

uma unidade transcricional do VR conservadora entre os genes N e P foi modificada e introduzida dentro do genoma da ERA em dois locais diferentes: 1) na regiao psi，e 2) na regiao intergenica P-M (trans 2). A unidade transcricional foi projetada para possuir dois locais de reconhecimento de enzimas de transcri?ao iinicos, para facilitar a introdu9ao de seqiiencias de polinucleotideos

heterologos:

(TTTTTTTGATTGTGGGGAGGAAAGCS^^XQAAA££Aia^CAGCTCT TTTTTT: SEQ ID NO: 65，locais da Pstl e Kpnl sublinhados).

Em um primeiro exemplo, ο gene do GFP foi clonado nessa unidade para ο resgate de virus, uma vez que a expressao de GFP poderia ser observada diretamente sob um microscopio de UV quando as celulas BSR transfectadas estivessem ainda em incuba饼o. A expressao da proteina do GFP foi visivel diretamente por microscopia fluorescente com um filtro de excita<^o de 470±20nm. As celulas infectadas com a ERAverde2 (gene do GFP inserido apos ο gene P no genoma do VR trans-2) mostraram focos verde claros apos tres dias de transfecpao de plastnideos, enquanto que a ERAverdel (gene do GFP inserido apos ο gene G na regiao Ψ "tradicional" trans-1) nao apresentou focos verdes obvios ate cinco dias pos-Iransfec9So (Fig. 6). A unidade transcricional introduzida foi funcional no genoma do VR em ambos os locais, embora a expressao e ο acumulo tenham se tornado mais rapidamente aparentes quando ο GFP foi expresso da trans2. Portanto, esses resultados tambem indicam que ο nivel de expressao a partir de uma ORF heterologa pode ser modulado selecionando-se a unidade de transcri^ao na qual a ORF e clonada.

Em outros exemplos，1) uma copia adicional da G da ERA; on 2) uma copia adicional da G da ERA com uma substitui9ao de aminoacido na pOSi?ao 333, foi incorporada dentro do genoma viral da ERA. Os virus que tiveram recuperaiao bem sucedida foram denominados ERA2g e ERA2g3, respectivamente. Como a quantifica9ao da expressao da G viral nao era pratica, ο aumento relative nos niveis de expressao da G em celulas infectadas com ERA2g e ERA2g3 foi confirmado por Northern blot com uma sonda de G. Em breves termos, a sonda de gene da G da ERA foi marcada utilizando-se ο Kit de Marcagao de DNA Dig (Roche, Indianapolis, IN, EUA) e mapeada com ο Kit de Detec9So de Acido Nucleico Dig {Roche, Indianapolis, IN, EUA) e foi medida por espectrofotometria de densidade (Fig. 7). Os genes da G ligados em serie nos virus recuperados foram tambem confirmados por RT-PCR com primers 5G e 3G. Uma faixa predominante indicando uma tnica copia da G foi observada em l，5kb. Alem disso, uma segunda faixa mais fraca foi observada em aproximadamente 3,0kb, ο que indica ο arranjo em serie das duas Gs.

Esses resultados demonstram que a introdu^ao de unidades de transcri^ao dentro do genoma da ERA pode ser utilizada para expressar diversas proteinas heterologas de ORFs introduzidas. Alem disso, a expressao de proteinas codificadas pela ORF heterologa e modulada pela posi诉ο em que a ORF e inserida. Assim, ο virus da ERA e um vetor amplamente adaptavel para a

expressao de proteinas recombinantes.

Exemplo 9: Rea^ao imunologica in vivo a virus modificados por

engenharia

Esse exemplo demonstra os efeitos in vivo da inoculapao com ο virus da ERA modificado pro engenharia e de seus derivados exemplificativos. Todos os cuidados com os animais e procedimentos experimentais foram realizados de acordo com as OrientagSes Institucionais sobre Cuidados e Usos de Animais da CDC. Camundongos de oitenta e tres semanas de idade foram divididos em 8 grupos de 10 cada para a administrapao intramuscular (i.m.) de virus recuperados (IO6 ffu de virus por camundongo). Dez camundongos saudaveis foram mantidos como controles de teste nao infectados. Para as constru<?oes de ERA e ERAg3，inje^oes intra-cerebrais (i.e.) adicionais da mesma dose de virus foram aplicadas a um outro grupo de dez camundongos de tres semanas de idade. Em camundongos de dois dias de idade em amamentagao, somente os virus da ERAg3 e da ERA-G foram inoculados por via intra-cerebral， com a mesma dose. Os animais foram checados diariamente quanto a doen^as. Os animais doentes foram sacrificados por intoxicapao com CO2 e os cerebros foram removidos para diagnosticos do virus da raiva. Dez dias apos a infec^ao, sangue foi coletado atraves da via retro-orbital e os soros obtidos para a neutraliza<?ao de testes de anticorpos, segundo ο teste padrao rapido de inibi?ao de foco fluorescente (RFFIT) (Smith e outros, Bulletin of the World Health Organization. 48:535-541, 1973). Um mes apos a infecgao, os animais 73

sobreviventes foram desafiados com uma dose letal de virus da raiva de rua (homogenato de glandula salivar de cao/coiote) (Orciari e outros, Vaccine. 19:4511-4518,2001).

O anticorpo monoclonal de camundongo (Mab 523-11) contra a G do virus da raiva foi mantida na CDC (Hamir e outros, Vet Rec. 136, 295-296, 1995) e ο anticorpo monoclonal anti-N conjugado FITC foi comprado da Centocor (Horsham, PA). O anticorpo monoclonal da RNA polimerase do T7 foi adquirido da Novagen (Madison, WI, EUA). O conjugado FITC-IgG de cabra anti-camundongo foi comprado da Sigma-Aldrich (St. Louis, MI, EUA). Entre os camundongos de 3 semanas de idade inoculados por via

intramuscular pelas oito construt?oes de virus diferentes, 50% dos camundongos inoculados com ERA (rERA) ou ERA-, e 20% dos ratos inoculados com ERAverdel mostraram sinais neurologicos moderados 10 dias apos a inocula^ao. Nenhum outro grupo mostrou qualquer sinal sugestivo de infec^ao de virus da raiva (Fig. 8A). Os soros foram coletados para neutralizar a titulagao de anticorpos antes do desafio. A ERA2g (5,60 IU) e a ERA2g3 (5,61 IU) provocou titulos mais elevados do que as construpSes de virus de copia unica da G (Fig. 8E). Os camundongos sobreviventes 1 mes apos a inoculagao foram submetidos a um desafio com um virus de rua de cao/coiote letal (0,05 ml, mantido na CDC para os testes padronizados de desafio em animais). Nos grupos ERA e ERA-, de 40 a 62% dos camundongos demonstraram sinais de raiva moderados, respectivamente, e foram sacrificados. Todos os outros grupos sobreviveram sem quaisquer sinais de raiva (Fig. 8B). Nos grupos de i.e.，camundongos de tres semanas de idade sobreviveram apos inocula<?ao de ERAg3, mas sucumbiram apos a injegao de ERA (Fig. 8C). A constru9ao ERA-G nao matou camundongos de dois dias de idade em amamentapao, contudo, a ERAg3 foi virulenta ο suficiente para matar todos os camundongos em amamentagao infectados (Fig. 8D). Titulos de anticorpos exemplificativos sao mostrados na Tabela 4.

Tabela 4; Produiyao de anticorpos especiilcos da raiva

Grupo Titulo Medio

ERA 433

G333 468

2G 560 2G333 561 -PSI 490 GFP 437 G verde 833 G menos 136 Controles <1/5

Esses dados demonstram que todos os virus baseados na ERA foram capazes de provocar uxna rea<?So imunologica apos a inocula?ao. Como esperado, os varios derivados exemplificativos provocaram uma reapao imunologica protetora quando os camundongos foram inoculados antes do

desafio.

Alem da avaliaiao pos-exposigao descrita acima, a habilidade dos derivados do virus da ERA de provocar uma rea^o imunologica protetora apos infeciao com virus da raiva virulentos foi determinada. Em breves palavras, grupos de hamsters foram infectados com uma dentre tres linhagens diferentes de virus da raiva (n二9 por grupo), e receberam a vacina recombinante (HRA-g33), on imunoglobulina rabica mais vacinas rabicas comerciais desativadas. Aproximadamente 80-100% dos animais de controle sucumbiram, enquanto que aproximadamente 60-100% dos animais vacinados sobreviveram como mostra as Figs· 9A-C. Esses resultados demonstram que a administra^ao pos-exposipao dos virus da raiva derivados confere substancial prote沩ο contra diferentes linhagens

do virus da raiva.

Tendo em vista as varias modalidades possiveis a que os principios

da inven9ao revelada podem ser aplicados, sera compreendido que as

modalidades ilustradas sao apenas exemplos preferidos da inven9ao e nao devem

ser consideradas como limitativas do escopo da inven^o, Ao reves, ο escopo da

inven^ao e definido pelas reivindicagoes a seguir. E portanto reivindicado como

invenpao tudo ο que estiver dentro do escopo e do espirito dessas reivindica^es. SOQb LISTAGEM DE SEQtJENCIAS

<110> O govemo dos Estados Unidos da America, como representado pelo Secretariado do

Departamento de Servigos da Saude e Humanos, Centro para ο ContiOle e a Prevengao de Doengas, Charles Wu, Xianfu

<120 > Metodos e Composigoes do Virus da Raiva

<130> 6395-70462-02

<150> 60/727,038 <151> 2005-10-14

<160> 65

<170> Patentln versao 3.3

<210> 1

<211> 11931

<212> DNA

<213 > virus da raiva

<220 > <221 > <222 > <223 > misc feature (1)--158) Regiao Lider <220 > <221> <222 > <223 > CDS (71)..(1420) gene da N <220 > <221> <222 > <223 > CDS (1514). gene dc ,(2404) 1 P <220 > <221 > <222 > <223 > CDS (2496). gene d« ..(3101) 1 M <20 > <221> <222 > <223 > CDS (3317). gene dc ,.(4888) a G <220 > <221 > <222 > <223 > misc feature (4964)..(5362) Regiao Psi <220 > <221 > <22 > <223 > CDS (5417) gene d. ..(1 1797) a L WO 2007/047459 PCT/US2006/040134

<220> <221> <222> <223>

misc一feature (11862)..(11931) Trailer region

<400> 1

acgcttaaca accagatcaa agaaaaaaca gacattgtca attgcaaagc aaaaatgtaa 60

cacccctaca atg gat gcc gac aag att gta ttc aaa gtc aat aat cag 109

Met Asp Ala Asp Lys lie Val Phe Lys Val Asn Asn Gln

5

10

gtg gtc tct ttg aag cct gag att ate gtg gat caa cat gag tac aag Val Val Ser Leu Lys Pro Glu 工Ie lie Val Asp Gln His Glu Tyr Lys 20 25

157

tac cct gcc ate aaa gat ttg aaa aag ccc tgt ata acc cta gga aag Tyr Pro Ala lie Lys Asp Leu Lys Lya Pro Cys lie Thr Leu Gly Lys 35 40 45

205

get ccc Ala Pro

gat

tta Leu

aat Asn

aaa gca Lys Ala

tac aag Tyr Lys

tea Ser 55

gtt Val

ttg Leu

tea ggc atg Ser Gly Met 60

age Ser

253

gcc gcc aaa ctt gat cct gac gat gta tgt tcc tat ttg gca gcg gca Ala Ala Lys Leu Asp Pro Asp Asp Val Cys Ser Tyr Leu Ala Ala Ala 65 70 75

301

atg cag Met Gln

ttt Phe 80

ttt Phe

gag

Glu

ggg

Qly

Thr

tgt Cys 85

ccg Pro

gaa Glu

gac Asp

tgg Trp

acc Thr 90

age Ser

tat Tyr

gga

Gly

349

ate gtg att gca cga aaa gga gat aag ate acc cca ggt.tct ctg gtg lie Val lie Ala Arg Lys Gly Asp Lys lie Thr Pro Gly Ser Leu Val 95 IOO 105

397

atg gaa Met Glu

ctg Leu

aca Thr

aga Arg 130

gac

ccc Pro

Thr

gtc Val

cct Pro 135

gag Glu

cat His

gcg Ala

tcc Ser

tta Leu 140

gtc Val

4 93

ggt ctt Gly Leu

ctc Leu

ttg Leu 145

agt Ser

ctg Leu

tat Tyr

agg Arg

ttg Leu 150

age Ser

Lys

ata lie

tcc Ser

ggg

Gly 155

caa Gln

Asn

541

act ggt Thr Gly

aac Asn 160

tat Tyr

aag Lys

Thr Asn

att lie 165

gca Ala

gac Asp

agg Arg

ata 工Ie

gag Glu 170

cag Gln

att lie

ttt Phe

589

gag aca Glu Thr 175

gcc Ala

cct Pro

ttt Phe

gtt Val

Lys 180

ate lie

gtg

Val

gaa Glu

cac His

cat His 185

act Thr

cta Leu

atg Met

Thr

637

act cac aaa atg tgt get aat tgg agt act ata cca aac ttc aga ttt Thr His Lys Met Cys Ala Asn Trp Ser Thr lie Pro Asn Phe Arg Phe

2/137 WO 2007/047459 PCT/US2006/040134

tea aat get Ser Asn Ala

gtt Val 305

ggt

Gly

cac His

gtg

Val

ttc Phe

aat ctc Asn Leu 310

att lie

cac His

ttt Phe

ttc ate cac Phe lie His

ttc cgt Phe Arg 290

tea Ser

cta Leu

ggc Gly

ttg agt Leu Ser 295

ggg

Gly

Lys

tct Ser

cct Pro

tat Tyr 300

tea Ser

aca Thr

get Ala 280

gtt Val

cct cac Pro His

tct Ser

tat Tyr 285

925

aga aga atg ttt gag cca Arg Arg Met Phe Glu Pro 270 275

ctt caa gaa Leu Gln Glu

tac Tyr

gag Glu 370

gcg Ala

get Ala

gaa Glu

ctg aca Leu Thr 375

aag Lys

act Thr

gac Asp

gta Val

gca Ala 380

ctg Leu

1213

gca gat gat gga act gtc aac tct gac gac gag gac tac ttc tea ggt Ala Asp Asp Gly Thr Val Asn Ser Asp Asp Glu Asp Tyr Phe Ser Gly 385 390 395

1261

gaa acc aga agt ccg gag get gtt tat act cga ate atg atg aat gga Glu Thr Arg Ser Pro Glu Ala Val Tyr Thr Arg lie Met Met Asn Gly 400 405 410

1309

ggt cga cta Gly Arg Leu 415

aag Lys

aga Arg

tct cac Ser His 420

ata lie

egg aga Arg Arg

tat Tyr

gtc Val 425

tea Ser

gtc Val

agt Ser

tcc Ser

1357

aat cat

gcc cgt cca

tea ttc gcc gag ttt cta

aag

1405

1117

1165

get cct cat Ala Pro His 335

gaa Glu

atg Met

tct Ser

gtt Val 340

cta Leu

ggg ggc Gly Gly

tat Tyr

ctg Leu 345

9Sa Gly

gag Qlu

gaa Glu

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1021

tat atg ggt caa gtc aga tcc cta aat gca acg gtt att get gca tgt Tyr Met Gly Gln Val Arg Ser Leu Asn Ala Thr Val 工:Le Ala Ala Cys 320 325 330

1069

190

195

200

205

ttg gcc gga acc tat gac Leu Ala Gly Thr Tyr Asp 210

atg ttt ttc tcc egg att gag cat cta tat Met Phe Phe Ser Arg lie Glu His Leu Tyr 215 220

733

tea gca ate aga gtg ggc aca gtt gtc act get tat gaa gac tgt tea Ser Ala lie Arg Val Gly Thr Val Val Thr Ala Tyr Glu Asp Cys Ser 225 230 235

781

gga ctg gta Gly Leu Val 240

tea ttt act ggg ttc ata aaa caa ate aat ctc acc get Ser Phe Thr Gly Phe lie Lys Gln lie Asn Leu Thr Ala 245 250

829

aga gag gca Arg Glu Ala 255

ata cta tat lie Leu Tyr

ttc Phe 260

ttc Phe

cac aag His Lys

Asn

ttt gag gaa Phe Glu Glu 265

gag Glu

ata lie

877

ggg cag gag Gly Gln Glu

3/137 WO 2007/047459 PCT/US2006/040134

gag aga 1852

Glu Arg

gaa Glu

aat Asn

gtt Val 550

gga Gly

gtc Val

Gln

ata lie

gtc Val 555

aga Arg

Gln

atg Met

agg Arg

tea Ser 550

ctt Leu

age Ser 540

ttc Phe

ctg Leu

ttc Phe

cag Gln

tea Ser 545

tac ctg Tyr Leu

cga Arg 505

ctt Leu

cac His

ctg Leu

gat Asp

gat

510

gga Gly

Lys

tcg Ser

CCC

Pro

Asn. 515

1708

CGt Pro 500

ttt Phe

ctc Leu 565

aag Lys

ata lie

tgg Trp

tea Ser

cag Gln 570

acc Thr

gta Val

gaa Glu

gag

Glu

att lie 575

ata lie

tcc Ser

tat gtc Tyr Val

1900

gcg

Ala 580

gtc Val

Asn

ttt Phe

ccc Pro

Asn 585

cct Pro

cca Pro

gga Gly

aag Lys

tct Ser 590

tea

Ser

gag

Glu

gat Asp

Lys

tea Ser 595

acc Thr

cag Gln

act Thr

ggc Gly 600

cga Arg

gag

Glu

CtC

Leu

aag Lys

aag Lys 605

gag Glu

Thr

aca Thr

CCC

Pro

act Thr 610

cct Pro

1996

tct Ser

cag Gln

aga Arg

gaa Glu 615

age Ser

caa Gln

tea Ser

tcg Ser

Lys 620

gcc agg Ala Arg

atg Met

gcg Ala

get Ala 625

caa Gln

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2044

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ggc

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cca

gcc Ala

ctt Leu

gaa Glu 635

tgg

Trp

tcg gcc Ser Ala

acc Thr

aat Asn 640

gaa Glu

gag gat Glu Asp

2092

cag atg gat Gln Met Asp

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His Qln Ala Arg

Pro Asn Ser Phe 435

Ala Glu Phe Leu Asn Lys Thr 440 445

tat Tyr

tcg Ser

agt Ser

gac

tea Ser 450

taagaagttg

tgccggaaat ctacggattg

1460

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Met

1516

age aag ate ttt gtc aat cct agt get att aga gcc ggt ctg gcc gat Ser Lys lie Phe Val Asn Pro Ser Ala lie Arg Ala Gly Leu Ala Asp 455 460 465

1564

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gag Glu

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gaa Glu

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gtt Val 475

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ctg Leu

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aat Asn 485

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gaa Glu 495

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1660

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gtg Val

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ggc Gly 525

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gag

Glu

gac ttt Asp Phe 530

1756

gga Gly

ga<

Gli

4/137 WO 2007/047459 PCTAJS2006/040134

ccg Pro

gta gtt Val Val

aac tgg Asn Trp

agg atg ate ggg Arg Met lie Gly

tct cca gtc cct Ser Pro Val Pro

att gga lie Gly 845

ctg get Leu Ala

ttg tea Leu Ser

tta Leu

gcc Ala

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tat

Tyr 830

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Asn

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Asn

gta tac aaa ttg agg aga acc ttt ate ttc cag tgg get gat tcc agg

5/137

aat ggt tac tcg ttc agg ate ctg egg cac Asn Gly Tyr Ser Phe Arg lie Leu Arg His 815 820

att ctg aaa tea ttc gac lie Leu Lys Ser Phe Asp 825

gat Asp

cta Leu 645

tea Ser

gtg

Val

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gag Glu 650

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ttc Phe

tcc Ser 660

Lys Lys

tat Tyr

aag Lys

ttt Phe 665

CCC

Pro

tct Ser

cga Arg

tcc Ser

tea Ser 670

ggg

Gly

ata lie

ctc Leu

ttg lieu

tat Tyr 675

aat Asn

ttt Phe

gag Glu

Gln

ttg Leu

Lys

atg Met

Asn

ctt Leu

gat

685

gat Asp

ata 工Ie

gtt Val

Lys

gag

Glu 690

gca Ala

Lys

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gta Val

cca Pro 695

ggt

Gly

gtg Val

acc Thr

cgt Arg

tta Leu 700

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cat His

gac Asp

ggg

Gly

tcc Ser 705

Lys

ctc Leu

ccc cta aga tgt gta ctg gga tgg gtc get ttg gcc aac cct aag aaa Pro Leu Arg Cys Val Leu Gly Trp Val Ala Leu Ala Asn Pro Lys Lys 710 715 720

ttc Phe

cag Gln 725

ttg Leu

tta Leu

gtc Val

gaa Glu

tcc Ser 730

gac

aag Lys

ctg Leu

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Lys 735

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atg Met

Gln

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a atg aac ttt cta cgt aag ata gtg aaa aat tgc agg gac gag gac act Met Asn Phe Leu Arg Lys Xle Val Lys Asn Cys Arg Asp Glu Asp Thr

750

755

760

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ctt Leu 780

cca Pro

ccc Pro

cct Pro

gaa Glu

tac Tyr 785

gtc Val

ccg Pro

ctg Leu

Lys

gaa Glu 790

ctt Leu

aca Thr

age Ser

aag Lys

aag Lys 795

2140

2236

2284

2332

2380

2434

2494 2543

2591

2639

2687

2735

2783

2831

2879

gga Gly

cat His

gga Gly 850

ggg

Glv WO 2007/047459 PCT/US2006/040134

gaa gga tgc acc aac ctg tea ggg ttc Glu Gly Cys Thr Asn Leu Ser Gly Phe ‘1005

gga tac

Gly Tyr

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tta Leu 1020

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Lys

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3496

3541

ccg Pro

gac Asp 1000

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ccc tgg Pro Trp

Gln

agg

Arg

aac ggg ttc act tgc aca ggc gtt gtg acg gag get gaa acc tat 3586

Asn Gly Phe Thr Cys Thr Gly Val Val Thr Glu Ala Glu Thr Tyr 1025 1030 1035

act aac ttc gtt ggt tat gtc aca acc acg ttc aaa aga aag cat 3631

Thr Asn Phe Val Gly Tyr Val Thr Thr Thr Phe Lys Arg Lys His 1040 1045 1050

ttc egc cca aca cca gat gca tgt aga gcc gcg tac aac tgg aag 3675

Pile Arg Pro Thr Pro Asp Ala Cys Arg Ala Ala Tyr Asn Trp Lys

tct ctg ctt cta gaa Ser Leu Leu Leu Glu 945

taatcagatt atatcccgca 3121

3071

ate lie

act Thr

tgg Trp

2927

Jcy 91 9G

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gaa Glu

ggg

Gly

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gaacatatgg gctcaactcc cattaaaccg ctgcatttca gatgtgaaaa aaactattaa

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cca Pro

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ggg

Gly

Lys

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cct att Pro lie

tac Tyr

acg Thr

ata lie 975

960

cca Pro

gac Asp

3181 3241 3301 3352

3400

gat gat gat

act Thr 895

gag Glu

ttc Phe

gtc Val

gga Gly

ttg Leu 900

caa Gln

ata lie

aga Arg

gtg

Val

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gca Ala

Lys

2975

cag Gln

tgt

Cys

cat His 910

ate 工Ie

cag Gln

ggc

Gly

aga Arg

ate lie 915

tgg

Trp

tgt Cys

ate Xle

Asn

atg Met 92 0

Asn

ccg aga Pro Arg

3023

Val Tyr Lys Leu Arg

Arg 865

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Gln 870

Trp Ala Asp Ser

Arg 875

a; S'

9' G：

ggt Gly 980

6/137 WO 2007/047459 PCT/US2006/040134

1055

1060

1065

atg Met 1070

gcc ggt gac ccc Ala Gly Asp Pro

aga Arg 1075

tat

Tyr

gaa Glu

gag tct Glu Ser

cat gac tac cac tgg ctt cga act gta Pro Asp Tyr Hie Trp Leu Arg Thr Val 1085 1090

acc

ccg tac Pro Tyr

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3721

3766

ctc Leu 1100

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ate lie

ata lie

tct Ser

cca Pro 1105

agt Ser

gtg Val

gca Ala

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ttg Leu 1110

gac Asp

cca Pro

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3811

aga Arg 1115

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gtc Val

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cct Pro

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ggg

Gly 1125

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tgc Cys

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3856

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gcg Ala

gtg Val

tct Ser

acc Thr 1135

tac Tyr

tgc

Cys

tcc Ser

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1140

cac His

gat Asp

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3901

att lie 1145

tgg

Trp

atg Met

CCC

Pro

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aat Asn 1150

ccg Pro

aga Arg

cta Leu

ggg

Gly

atg Met 1155

tct Ser

tgt Cys

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3946

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gca Ala

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Lys 1170

ggg agt

Gly Ser

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3991

tgc Cys 1175

ggc Gly

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gaa Glu 1180

aga Arg

ggc Gly

cta Leu

tat Tyr

aag Lys 1185

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4036

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tgt gga gtt cta gga ctt aga ctt atg Cys Gly Val Leu Gly Leu Arg Leu Met 1200

gat

1205

gga Gly

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tgg

Trp

gtc Val

gcg

Ala 1210

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Gln Thr

tea aat Ser Asn 1215

gaa Glu

acc Thr

aaa tgg Lys Trp

4126

tgc Cys 1220

CCC Pro

gat Asp

cag Gln

ttg Leu 1225

9tg Val

Asn

ctg cac gac Leu His Asp 1230

ttt Phe

cgc Arg

tea gac Ser Asp

4171

gaa Glu 1235

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gag Glu

cac His

ctt Leu

gtt Val 1240

gta Val

gag Glu

gag ttg gtc Glu Leu Val 1245

agg Arg

aag aga gag Lys Arg Glu

4216

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ctg Leu

gat Asp

gca Ala

cta Leu 1255

gag Glu

tcc Ser

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atg Met

Thr 1260

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aag tea gtg Lys Ser Val

4261

agt Ser 1265

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aga Arg

cgt Arg

CCC

Pro

agt Ser 1270

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ctt Leu 1275

C 1 t a 9 V

CCt ggg ttt Pro Gly Phe

4306

gga

gca tat acc ata ttc

aag acc ttg atg gaa gcc gat

4351

7/137 WO 2007/047459 PCT/US2006/040134

gcc ctg act gcc ttg atg ttg ata att ttc ctg Ala Leu Thr Ala Leu Met Leu lie lie Phe Leu 1415 ‘ 1420 1425

ttg ggt ctc ccg aac tgg ggg aag tat gta tta ctg agt gca Leu Gly Leu Pro Asn Trp Gly Lys Tyr Val Leu Leu Ser Ala 1400 1405 1410

Gly Lys Ala Tyr Thr lie Phe Asn Lys Thr Leu Met Glu Ala Asp 1280 1285 1290

get cac tac aag tea gtc aga act tgg aat gag ate ctc cct tea 4396

Ala His Tyr Lys Ser Val Arg Thr Trp Asn Glu lie Leu Pro Ser 1295 1300 1305

aaa ggg tgt tta aga gtt ggg ggg agg tgt cat cct cat gtg aac 4441

Lys Gly Cys Leu Arg Val Gly Gly Arg Cys His Pro His Val Asn 1310 1315 1320

ggg gtg ttt ttc aat ggt ata ata tta gga cct gac ggc aat gtc 4486

Gly Val Phe Phe Asn Gly lie 工Ie Leu Gly Pro Asp Gly Asn Val 1325 1330 1335

tta ate cca gag atg caa tea tcc ctc ctc cag caa cat atg gag 4531

Leu lie Pro Glu Met Gln Ser Ser Leu Leu Gln Gln His Met Glu 1340 1345 1350

ttg ttg gaa tcc tcg gtt ate ccc ctt gtg cac ccc ctg gca gac 4576

Leu Leu Glu Ser Ser Val lie Pro Leu Val His Pro Leu Ala Asp 1355 1360 1365

ccg tct acc gtt ttc aag gac ggt gac gag get gag gat ttt gtt 4621

Pro Ser Thr Val Phe Lys Aep Gly Asp Glu Ala Glu Asp Phe Val 1370 1375 1380

gaa gtt cac ctt ccc gat gtg cac aat cag gtc tea gga gtt gac 4666

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agg Arg

gag Glu

gtg Val

tea Ser 1450

gtc Val

act Thr

ccc Pro

Qln

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ggg

Gly

aag Lys

ate lie

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Thr 1445

4711

4756

tct Ser 1460

tea Ser

tgg

Trp

gaa Gly

tea Ser

cac Hxb 1465

aag Lys

agt Ser

ggg

Gly

ggt Gly

gag Glu 1470

acc Thr

aga Arg

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ttggggggtt 4 94 8

ctgggtagat 5008

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aga aga gtc aat cga tea gaa cct acg caa cac aat ctc aga ggg Arg Arg Val Asn Arg Ser Glu Pro Thr Gln His Asn Leu Arg Gly 1430 1435 1440

ggg

Gly

ggg Gly

8/137 WO 2007/047459 PCT/US2006/040134

tta Leu

agt Ser 1625

tgc 5875

Cys

tat tcc aag tcg tcc ccc ata gag aag Tyr Ser Lys Ser Ser Pro lie Glu Lys 1600 1605

gga aat aga ggg ctg aga ate ccc cca Gly Asn Arg Gly Leu Arg lie Pro Pro 1615 1620

ctg ttg aat ctc Leu Leu Asn Leu

acg Thr 1610

cta 5830

Leu

gga atg 5695

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1565

tct ctc Ser Leu 1560

tat ttc aag aag Tyr Phe Lys Lys 1555

cct gga gag gtc tat gat gac cct att gac cca ate gag tta Pro Gly Glu Val Tyr Asp Asp Pro lie Asp Pro lie Qlu Leu 1480 1485 . 149(

5470

ctt gag agg gtt gat tat gat aat gca ttt gga agg tat ctt gcc 5920

Leu Glu Arg Val Asp Tyr Asp Asn Ala Phe Gly Arg Tyr Leu Ala 1630 1635 1640

aac acg tat tcc tct tac ttg ttc ttc cat gta ate acc tta tac 5965

Asn Thr Tyr Ser Ser Tyr Leu Phe Phe His Val lie Thr Leu Tyr 1645 1650 1655

get gca cag tea atg att tct ctc tgg tta tat ggt gcc cac tct 5740

Ala Ala Gln Ser Met lie Ser Leu Trp Leu Tyr Gly Ala His Ser 1570 1575 1580

gaa tcc aac agg age egg aga tgt ata aca gac ttg gcc cat ttc 5785

Glu Ser Asn Arg Ser Arg Arg Cys lie Thr Asp Leu Ala His Phe 1585 1590 1595

gat gaa Asp Glu

ccc aga Pro Arg 1495

gga acc Gly Thr

ccc Pro

act Thr

gtc Val 1500

GCC

Pro

aac Asn

ate lie

ttg agg Leu Arg 1505

Asn

5515

tct gac Ser Asp

tac aat Tyr Asn 1510

ctc aac Leu Asn

tct Ser

cct Pro

ttg Leu 1515

ata lie

gaa gat Glu Asp

cct get Pro Ala 1520

aga Arg

5560

cta atg Leu Met

tta Leu

gaa Glu 1525

tgg Trp

tta Leu

Lys Thr

ggg

Gly 1530

aat Asn

aga Arg

cct Pro

tat egg Tyr Arg 1535

atg Met

5605

act cta aca gac aat tgc tcc agg tct ttc aga gtt ttg aaa Thr Leu Thr Asp Asn Cys Ser Arg Ser Phe Arg Val Leu Lys 1540 1545 1550

gat

5650

actgacacca cagacaaagg cagtcttcct gtgtgcaCaa atcagaagaa

acagttgtag acaaaccacg gggtgtctcg ggtgactctg tgcttgggca tcatggtgtg ttccatgata gcggactcag gatgagttaa ttgagagagg cccgtgaagg acataagcag tagctcacaa

taagcttttc cctgagacct

ttataaagtg ctgggtcatc caactggcaa cacttctcaa

tcatcccgcg tctcagcaaa agtcgagaaa aaaacattag

acttcaag atg ctc gat Met Leu Asp 1475

5248 5308 5368 5425

g U

a 1 9G

9/137 WO 2007/047459 PCT/US2006/040134

ttg Leu

tct Ser 1725

cgc Arg

ttc Phe

Asn

tcc tta Ser Leu 1730

atg Met

6190

ccg ate gtg aca aag gac ttt 6100

Pro lie Val Thr Lys Asp Phe 1695 1700

gtc ttg Val Leu

ctc Leu

tct Ser 1735

CCC

Pro

cca Pro

gag Glu

CCC Pro

cga Arg 1740

tac Tyr

tea Ser

gat

gac Asp

ttg Leu 1745

ata lie

6235

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cta Leu

tgc Cys 1750

cag Gln

ctg Leu

tac Tyr

att lie

get Ala 1755

ggg

Gly

gat Asp

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gtc Val

ttg Leu 1760

tct Ser

atg tgt Met Cys

tat gtc Tyr Val

gga

Gly

gtg Val

Asn 1765

aat Asn 1780

tcc Ser

ggc Gly

tat Tyr

gaa Glu

gtc Val 1770

agt tta gtc Ser Leu Val

cag aga Gln Arg 1785

ate lie

gca Ala

Lys

ata lie

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ttg Leu

ttt Phe

gag Glu 1775

agg

Arg 1790

cca Pro

cct Pro

6325

6370

ctc att Leu lie

6415

gta agt caa Val Ser Gln

ctt Leu IBlO

ttt agg get ctg Phe Arg Ala Leu 1825

gaa Glu

gag Glu

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ggt Gay 1815

ccc Pro

tgt Cys

gca aga Ala Arg

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Arg 1820

1830

1835

ttc Phe

gat caa ttc gac aac ata cat gac ttg gtt ttt Asp Gln Phe Asp Asn 工Ie His Asp Leu Val Phe

6505

gtg tat ggc Val Tyr Gly

cga aag ggt Arg Lys Gly

cat tgg His Trp

cta tat Lys Leu Tyr

sgg

Gly 1845

gat

cac His

cca Pro

cag gtt Gln Val

tat ata Tyr lie

cac att His lie

gat Asp 1850

LyB 1865

tat Tyr

Lys

6550

6595

ctt atg cta aaa Leu Met Leu Lys 1720

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aag Lys

tcc Ser

tac Tyr

cag gag Gln Glu

tgc

Cys

tta gca Leu Ala

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cta Leu

gcc Ala

Asn

gcc Ala

cta Leu 1660

gac Asp

tgg Trp

gat Aep

gaa Glu

gaa Glu 1665

aag Lys

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ate lie

cta gca Leu Ala 1670

tta Leu

gtt tac Val Tyr

tcc Ser

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tcc Ser

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ctt Leu 1710

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gac Asp

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aac tac Asn Tyr 1715

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6145

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ttg gta Leu Val 1685

aag

Lys

6055

9

1

91 t e aM

10/137 WO 2007/047459 PCT/US2006/040134

tgg aat cta aga ttg tat ttt gtc ate act gaa aaa ctc ttg gcc 7135

Trp Asn Leu Arg Leu Tyr Phe Val lie Thr Glu Lys Leu Leu Ala 2035 2040 2045

aac tac ate ttg cca ctt ttt gac gcg ctg act atg aca gac aac 7180

Asn Tyr lie Leu Pro Leu Phe Asp Ala Leu Thr Met Thr Asp Asn 2050 2055 2060

ctg aac aag gtg ttt aaa aag cfcg ate gac agg gtc acc ggg caa 7225

Leu Asn Lys Val Phe Lys Lys Leu lie Asp Arg Val Thr Gly Gln 2065 2070 2075

aag Lys

ccg Pro

cct Pro

gtc Val 1990

aat Asn

CCG

Pro

cga Arg

gag Glu

ttt Phe 1995

ctg Leu

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tct Ser

ata lie

gac

2000

ctc Leu

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7270

cca gat gaa gac ttg ata att ggc ctc aag cca aag 7045

Pro Asp Glu Asp Leu lie Xle Gly Leu Lys Pro Lys 2 0 05 2010 2015

ttg aag att gaa ggt cga ttc ttt get cta atg tea 7090

Leu Lys lie Glu Gly Arg Phe Phe Ala Leu Met Ser 2020 2025 2030

6955

ggg gat aca Gly Asp Thr

tgg

Trp 1930

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aag Lys

ctc Leu

ccg Pro

ate lie 1935

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cag Gln

ate lie

ttt Phe

gag Glu 1940

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cct gaa Pro Glu

tea Ser

atg Met 1945

gat Asp

ccg Pro

tea Ser

gaa Glu

ata lie 1950

ttg Leu

gat Asp

gac Asp

Lys

tea Ser 1955

cat His

tct Ser

ttc Phe

acc Thr

aga Arg 1960

acg Thr

aga Arg

cta Leu

get Ala

tct Ser 1965

tgg

Trp

ctg Leu

tea Ser

gaa Glu

Asn 1970

cga Arg

6910

6775

tat gaa aag tgg

cat

aga tta gag tea

gag gat 7315

1870

1875

agg agg Arg Arg

ggt ttt gat Gly Phe Asp

aag Lys

tac Tyr

tcc Ser

aag Lys

tgg

Trp 1895

tat Tyr

ctg gat Leu Asp

tea Ser

aga Arg 1900

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cta Leu

gcc cga gac Ala Arg Asp 1905

cac His

ccc Pro

ttg Leu

act Thr

ccc Pro 1910

tat Tyr

6730

91 t a g V

ggg

Gly

11/137 WO 2007/047459 PCT/US2006/040134

tcc aaa aga tgg gcc aga gtc tct Ser Lys Arg Trp Ala Arg Val Ser 2280 2285

7855

afca ttg lie Leu 2275

2240

cag gat ggc 7495

Gln Asp Gly 2165

tta gat Leu Asp

gcg Ala

tcc Ser 2155

aac ggc Asn Gly

cca Pro

acc Thr

tgt Cys 2160

tgg aat Trp Asn

tcc Set

acc Thr 2305

aat Asn

gcg Ala

cta Leu

Thr

gtg Val 2310

gca Ala

Gln

cac His

tct Ser

Gln 2315

tct Ser

7945

tct Ser

aag Lys 2245

cta Leu

ggg ctg Gly Leu

ate lie

acc Thr 2250

aag Lys

Lys

gaa Glu

gag

Glu

acc Thr 2255

atg Met

7765

7675

7720

aga ata tea agg aat gca ctt tcg ata tac aga gcc Arg lie Ser Arg Asn Ala Leu Ser 工Ie Tyr Arg Ala 2230 2235

ttg tcg cca ggg cta tct caa gag ggg ctc ctc tat gaa ttg gag Leu Ser Pro Gly Leu Ser Gln Glu Gly Leu Leu Tyr Glu Leu Glu 2215 2220 2225

ggg cta gaa ggc tta egg cag aag ggc tgg agt cta gtc age tta 7540

Gly Leu Glu Gly Leu Arg Gln Lys Gly Trp Ser Leu Val Ser Leu 2X70 2175 2180

ttg atg ata gat aga gaa tct caa ate agg aac aca aga acc aaa 7585

Leu Met lie Asp Arg Glu Ser Gln lie Arg Asn Thr Arg Thr Lys 2185 2190 2195

ata cta get caa gga gac aac cag gtt tta tgt ccg aca tat atg 7630

lie Leu Ala Gln Gly Asp Asn Gln Val Leu Cys Pro Thr Tyr Met 2200 2205 2210

tgc gtc Cys Val

tct Ser

aat Asn 2290

gac Asp

Gln

ata lie

gtc Val

Asn 2295

ctc Leu

gcc Ala

aat

ata lie

atg Met 2300

tcg Ser

7900

tgt agt tat Cys Ser Tyr

gac Aep 2260

ttc Phe

ctc Leu

ate lie

tat Tyr

gga

Gly 2265

Lys

acc Thr

cct Pro

ttg Leu

ttt Phe 2270

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7810

Tyr Glu Lys Trp 2095

Asn His Gln Arg Leu Glu Ser Thr Glu Asp 2100 2105

gta ttt Val Phe

tct Ser

gtc Val 2110

cta gat Leu Αερ

caa gtg ttt Gln Val Phe 2115

gga ttg Gly Leu

aag aga gtg Lys Arg Val 2120

ttt Phe

7360

tct aga aca Ser Arg Thr

cac His 2125

gag

Glu

ttt Phe

caa aag Gln Lys 2130

gcc tgg Ala Trp

ate lie

tat tat Tyr Tyr 2135

tea Ser

7405

gac aga Asp Arg

tea gac Ser Asp 2140

ctc Leu

ate lie

ggg Gly

tta egg Leu Arg 2145

gag gat Glu Asp

caa Gln

ata tac 工Ie Tyr 2150

tgc Cys

7450

ggc Gly

g 1

9G

12/137 WO 2007/047459 PCT/US2006/040134

atg Met

tcc ctc Ser Leu

gga Gly 2380

aga Arg

ttc Phe

cat His

ata lie

cga Arg 2385

cag

Gln

ttc Phe

tea Ser

gac

cct Pro 23 90

gtc Val

B170

tct Ser

gaa ggg Glu Gly

tta Leu 2395

tcc Ser

ttc Phe

tgg

Trp

aga Arg

gag Glu 2400

ate lie

tgg Trp

tta Leu

age Ser

tcc Ser 2405

cac His

8215

gag Glu

tcc tgg Ser Trp

gtt Val 2410

cac His

9cg Ala

ttg Leu

tgt

Cys

Gln 2415

gag Glu

get Ala

gga Gly

Abii

cca Pro 2420

gat Asp

ctt Leu

gga gag Gly Glu

aga Arg 2425

aca Thr

ctc Leu

gag Glu

age Ser

ttc Phe 2430

act Thr

cgc Arg

ctt Leu

cta Leu

gaa Glu 2435

gat

8305

cct Pro

acc acc Thr Thr

tta Leu 2440

aat Asn

ate 工Ie

aga Arg

gga Gly

993 Gly 2445

gcc Ala

agt Ser

cct Pro

acc Thr

att lie 2450

cta Leu

8350

etc Leu

aag gat Lys Asp

gca Ala 2455

ate 工Ie

aga Arg

aag Lys

get Ala

tta Leu 2460

tat Tyr

gac Asp

gag Glu

gtg Val

gac Asp 2465

aag Lys

8395

gtg Val

cat His

gag aat Glu Aan

aga gat Arg Asp

tea Ser 2470

ctg Leu

ttt Phe

cct cga Pro Arg

ttt Phe 2500

ctc Leu

agt Ser

gag Glu

cta Leu

ttc Phe 2505

agt Ser

tcg Ser

tct Ser

ttt Phe

ttg Leu 2510

gga Gly

8530

ate lie

ccc gag Pro Glu

tea Ser 2515

ate lie

att lie

gga Gly

ttg Leu

ata Xle 2520

Gln

aac Asn

tcc Ser

cga Arg

acg Tiir 2525

ata Xle

8575

aga Arg

agg cag Arg Gln

ttt Phe 2530

aga Arg

aag Lys

agt Ser

ctc Leu

tea Ser 2535

Lys

act Thr

tta Leu

gaa Glu

gaa Glu 2540

tcc Ser

tac Tyr

aag att Lys lie

ctg Leu 2350

age Ser

get Ala

gaa Glu

ggg

Gly

gat

2355

age Ser

ttt Phe

ctc Leu

cta Leu

gcc Ala 2360

tea Ser

agg ata Arg lie

ate lie 2365

tat Tyr

cta Leu

gat Asp

cct Pro

tct Ser 2370

ttg Leu

gga Gly

ggg

Gly

gta Val

tct Ser 2375

cag gca 7590

Gln Ala

2330

gat

ttt Phe

ctg Leu 2325

CtC Leu

atg Met

tea Ser

ttg ate aaa ccg atg Leu lie Lys Pro Met 2320

8125

atg Met

gtc Val

ttt cac Phe His

tac Tyr 2335

ctg Leu

cta Leu

ttt Phe

age Ser

cca Pro 2340

ate lie

tta Leu

aag Lys

gga Gly

aga Arg 2345

gtt Val

8035

a y 91 9G

g y

91 g G

13/137 WO 2007/047459 FCT/US2006/040134

tct ctg aca Ser Leu Thr

gtg tgg cct Val Trp Pro 2565

tgc tct tea gag agg gca Cys Ser Ser Glu Arg Ala 2570

8710

cct Pro

gat

ttc Phe

cct Pro

cta Leu 2700

gag Glu

gcc Ala

cct Pro

gtc Val 2705

ttc Phe

9115

tct att tct tgc Ser lie Ser Cys 2605

act tgt gga gca aca gga gga ggc aat cct aga Thr Cys Gly Ala Thr Gly Gly Gly Asn Pro Arg 2610 2615

gtt

Val

tct gta Ser Val

tea Ser 2 62 0

gta Val

ctc Leu

ccg Pro

tcc Ser

ttt Phe 2625

gat

cag Gln

tea Ser

ttt Phe

ttt Phe 2630

tea Ser

cga ggc ccc cta Arg GXy Pro Leu 2635

aag ggg tac ttg ggc tcg tcc acc tct atg tcg Lys Gly Tyr Leu Qly Ser Ser Thr Ser Met Ser 2640 2645

8935

acc Thr

cag cta Gln Leu

ttc Phe 2650

cat His

gca Ala

tgg Trp

gaa Glu

Lys 2655

C 1 t a g V

act Thr

aat Asn

gtt Val

cat His 2660

91 t a g V

gtg Val

act Thr

aag aga Lys Arg

aga gat Arg

9025

9070

cct cag agg gtt Pro Gln Arg Val 2560

aca gtt cct cac cct tct gag atg ttg Thr Val Pro His Pro Ser Glu Met Leu 2590 2555

aaa agg acg ggg tea gcc ttg cat agg ttc aag tct gcc aga tac 9160

Lys Arg Thr Gly Ser Ala Leu His Arg Phe Lys Ser Ala Arg Tyr 2710 2715 2720

age gaa gga ggg tat tct tct gtc tgc ccg aac ctc ctc tct cat 9205

Ser Glu Gly Gly Tyr Ser Ser Val Cys Pro Asel Leu Leu Ser His 2725 2730 2735

att tct gtt agt aca gac acc atg tct gat ttg acc caa gac ggg 9250

lie Ser Val Ser Thr Asp Thr Met Ser Asp Leu Thr Gln Asp Gly 2740 2745 2750

aag aac tac gat ttc atg ttc cag cca ttg atg ctt tat gca cag 9295

hVB Asn Tyr Asp Phe Met Phe Gln Pro Leu Met Leu Tyr Ala Gln

gat cta ctt agg Asp Leu Leu Arg 2575

gag ate tct tgg gga aga aaa gtg gta ggc acg Glu lie Ser Trp Gly Arg Lys Val Val Gly Thr 2580 2585

8755

ttc tac aac Phe Tyr Asn

tea Ser

2545

gag Glu

ate lie

cac ggg His Gly

att lie 2550

agt Ser

egg Arg

atg Met

acc Thr

cag Gln 2555

Thr

ggc Gly 2695

ggg

Gly

14/137 WO 2007/047459 PCT/US2006/040134

ctc tta Leu Leu

tac tea ate Tyr Ser 工Ie

tta Leu

9tg Val 2865

gca Ala

att lie

cac gac HiB Asp

tea Ser 2870

gga

Gly

acc ate ttc Thr lie Phe

tac aat gat Tyr Asn Aap

gat gtg tcg aaa aga ata tcc aga atg gtt tct ggg get gtg cct Asp Val Ser Lys Arg lie Ser Arg Met Val Ser Gly Ala Val Pro 2815 2820 2825

cac ttc cag agg His Phe Gln Arg 2830

ctt ccc gat Leu Pro Asp

ate cgt lie Arg 2835

ctg Leu

aga Arg

cca gga gat Pro Gly Asp

ttt Phe

gaa tct cta age Glu Ser Leu Ser 2845

ggt aga gaa Gly Arg Glu

aag Lys

tct Ser 2850

cac His

cat His

ate gga lie Gly

tea Ser 2855

get Ala

tcc cct aga gac Ser Pro Arg

gga tcc tcg Gly Ser Ser

tat ttg aga ggg ctc gca agg gga gta ttg ata Tyr Leu Arg Gly Leu Ala Arg Gly Val Leu lie 2895 2900

tgc ttc ttg aca Cys Phe Leu Thr

aga Arg 2910

atg Met

aca Thr

aat ate Asn lie

aat Asn 2915

att lie

aat aga cct Asn Arg Pro

ctt Leu 2920

gaa ttg ate Glu Leu lie

tea Ser

ggg

Gly 2925

gta Val

ate lie

tea tat Ser Tyr

att lie 2930

ctc Leu

ctg agg cta Leu Arg Leu

gat

Aep 2935

aac cat ccc Asn His Pro

tcc Ser

ttg Leu 2940

tac Tyr

ata lie

atg ctc Met Leu

aga Arg 2945

gaa Glu

ceg tct ctt Pro Ser Leu

aga Arg 2950

gga gag ata Gly Glu lie

ttt Phe

tct Ser 2955

ate lie

cct Pro

cag aaa Gln Lys

ate lie 2960

CCC

gcc get tat Ala Ala Tyr

acc act atg Thr Thr Met

Lys

Aen

cca Pro 2965

tgt tat ctc caa cat gtg cta cgc tat gag cga gag ata ate acg

gaa GlU 2970

ggc Qly

aga tea Arg Ser

ate lie 2975

ttg Leu

15/137

acc ctg gag acc tct cag ate ttc gag ttt ccg Thr Leu Glu Thr Ser Gln lie Phe Glu Phe Pro 2805 2810

2755

2760

2765

aca tgg aca tea Thr Trp Thr Ser 2770

gag ctg gta cag aga Qlu Leu Val Gln Arg 2775

gac aca agg cta aga Asp Thr Arg Leu Arg 2780

gac

tct acg ttt cat Ser Tlir Phe His 2785

tgg cac ctc cga tgc aac agg tgt gtg aga ccc Trp His Leu Arg Cys Asn Arg Cys Val Arg Pro 2790 2795

9340

9475

9520

9565

9610

9655

9700

9745

9790

9925

9970

a y 7 918 9 G 2 WO 2007/047459 PCT/US2006/040134

gca get aga acc atg act Ala Ala Arg Thr Met Thr 3085 3090

get cat 10465

Ala His

3155

gtt cag tgg gca acc Val Gln Trp Ala Thr 3150

ttg ate tcg ggc ttg Leu lie Ser Gly Leu 3145

tac age Tyr Ser

ccc Pro 3095

•aac 10285

Asn

ctg cta aaa gac tct tta cga agg aca aga Leu Leu Lys Asp Ser Leu Arg Arg Thr Arg 3070 3075

10240

Cys Tyr Leu Gln

His Val Leu Arg Tyr Qlu Arg Glu lie lie Thr 2985 2990

gcg tct Ala Ser

cca Pro

gag Glu 2995

aat Asn

gac

tgg cta Trp Leu

tgg Trp 3000

ate lie

ttt Phe

tea Ser

gac Asp

ttt Phe 3005

aga Arg

10015

agt gcc aaa Ser Ala Lys

atg Met 3010

acg tac Thr Tyr

cta acc Leu Thr

ctc Leu 3015

att lie

act Thr

tac Tyr

cag Gln

tct Ser 3020

cat His

10060

ctt cta Leu Leu

ctc Leu

cag Gln 3025

agg gtt Arg Val

gag aga Glu Arg

Asn 3030

cta Leu

tct Ser

aag Lys

agt Ser

atg Met 3035

Arg

10105

gat aac ctg cga caa ttg agt tcc ttg atg agg cag gtg ctg ggc Asp Asn Leu Arg Gln Leu Ser Ser Leu Met Arg Gln Val Leu Gly 3040 3045 3050

10150

ggg cac Gly His

gga Gly

gaa Glu 3055

gat Asp

acc Thr

tta gag Leu Glu

tea Ser 3060

gac gac

Asn

att lie

Gln 3065

cga Arg

10195

tat aag ctt aag cct att cta gat gat ctc aat gtt ttc ccc tct 10510

Tyr Lys Leu Lys Pro lie Leu Asp Asp Leu Asn Val Phe Pro Ser 3160 3165 ι 3170

ctc tgc ctt gta gtt ggg gac ggg tea ggg ggg ata tea agg gca 10555

Leu Cys Leu Val Val Gly Asp Gly Ser Gly Gly lie Ser Arg Ala 3175 3180 3185

gtc ctc aac atg ttt cca gat gcc aag ctt gtg ttc aac agt ctc 10600

Val Leu Asn Met Phe Pro Asp Ala Lys Leu Val Phe Asn Ser Leu 3190 3195 3200

aag aag gtg tcc cgt aag gta gga tgt tea gaa tgg gtc tgc tct 10330

Lys Lys Val Ser Arg Lys Val Gly Cys Ser Glu Trp Val Cys Ser

3100 3105 3110

get caa cag gtt gca gtc tct acc tea gca aac ccg gcc cct gtc 10375

Ala Gln Gln Val Ala Val Ser Thr Ser Ala Asn Pro Ala Pro Val

3115 3120 3125

tcg gag ctt gac ata agg gcc ctc tct aag agg ttc cag aac cct 10420

Ser Glu Leu Asp lie Arg Ala Leu Ser Lys Arg Phe Gln Asn Pro

3130 3135 3140

ggt Gly

9 1

aga Arg

16/137 WO 2007/047459 PCT/US2006/040134

cct tea gca ate atg agg gga gga aat Pro Ser Ala 工Ie Met Arg Gly Gly Asn 3220 3225

ggt ate gtc tcc aga gtg Gly lie Val Ser Arg Val 3230

10690

ata gat ttt gac tea ate tgg gaa aaa lie Asp Phe Asp Ser lie Trp Glu Lys 3235 3240

ccg tcc gac Pro Ser Asp

ttg aga Leu Arg 3245

Asn

10735

ttg gca Leu Ala

acc Thr

tgg Trp 3250

aaa tac ttc cag Lye Tyr Phe Gln

tea Ser 3255

gtc Val

caa

Gln

aag Iiys

cag Gln

gtc Val 3260

aac Asn

10780

atg Met

tcc Ser

tat

Tyr

gac

3265

ctc Leu

att att tgc lie lie Cys

gat Asp 3270

gca Ala

gaa Glu

gtt Val

act Thr

gac Asp 3275

att 工Ie

10825

gca Ala

tct Ser

ate lie

Asn 3280

egg Arg

ata acc ctg lie Thr Le-u

tta Leu 3285

atg Met

tcc Ser

gat

ttt Phe

gca Ala 3290

ttg Leu

tct Ser

at a lie

gat

gga Gly 3295

cca Pro

ctc tat ttg Leu Tyr Leu

gtc Val 3300

ttc Phe

Lys

act Thr

tat Tyr

ggg Gly

3305

act Thr

10915

atg Met

cta Leu

gta Val

aat Asn 3310

cca Pro

aac ta:c aag Asn Tyr Lys

get Ala 3315

att Xle

caa Gln

cac His

ctg Leu

tea Ser 3320

aga Arg

10960

gcg Ala

ttc Phe

CCC

Pro

tcg Ser 3325

gtc Val

aca ggg ttt Thr Gly Phe

ate lie 3330

acc Thr

Gln

gta Val

act Thr

tcg Ser 3335

tct Ser

11005

ttt Phe

tea Ser

tct Ser

gag Glu 3340

CtC

Leu

tac ctc cga Tyr Leu Arg

ttc Phe 3345

tcc Ser

Lys

cga Arg

ggg

Gly

aag Lys 3350

ctt Leu

11050

ttc Phe

aga Arg

gat Asp

get Ala 3355

gag Glu

tac ttg acc Tyr Leu Thr

tct Ser 3360

tcc Ser

acc Thr

ctt Leu

cga Arg

gaa Glu

3365

atg Met

11095

age Ser

ctt Leu

gtg

Val

tta Leu 3370

ttc Phe

aat tgt age Asn Cys Ser

age Ser 3375

ccc Pro

aag Lys

agt Ser

gag Glu

atg Met 3380

cag Gln

11140

aga get cgt tcc Arg Ala Arg Ser 3385

ttg aac tat cag gat Leu Asn Tyr Gln Asp 3390

ctt gtg aga gga ttt cct Leu Val Arg Qly Phe Pro 3395

11185

aca cat cca Thr His Pro

ctg Leu 3215

CCt 10645

Pro

tta gag gtg aat gac ctg atg get tcc Leu Glu Val Asn Asp Leu Met Ala Ser 3205 3210

ata tea aat cct tac aat gag atg ate ata act ctg 11230 lie Ser Asn Pro Tyr Asn Glu Met lie lie Thr Leu 3400 3405 3410

att lie

gac

agt Ser

gat Asp 3415

gta Val

gaa tct ttt Glu Ser Phe

cta Leu 3420

gtc Val

cac His

aag Lya

atg Met

gtt Val 3425

gat

1X275

gga

Gly

17/137 WO 2007/047459 PCT/US2006/040134

gtt ggc age ate aag Val Gly Ser lie Lys 3565

cat agg tac aac agg His Arg Tyr Asn Arg 3580

tea tcc cta cta gac Ser Ser Leu Leu Asp 3595

gat cta Asd Leu

tgg ate Trp lie

tcc Ser

acc Thr

tac agt tgc Tyr Ser Cys

aga Arg 3570

cta Leu 3585

ctg Leu 3600

a U a 1 9 G

gag Glu

gtg Val

gat

gaa Glu

ate 工Ie

aga cac Arg His 3575

aga tct Arg Ser 3590

ctt Leu

aga Arg

tgaaccggat actcctggaa

gcctgcccat gctaagactc ttgtgtgatg aacctttggt tgtttgattg tttttctcat

tatcttgaaa aaaacaagat cctaaatctg ttttgttgtt tatttgttaa gcgt

11725

11770

11817

11877 11931

<210> <211> <212> <213 >

2

450 PRT

rabies virus

aag get acc Lye Ala Thr

Arg 3560

ctc Leu

cac tgg ate agg ttg att tac aag ata His Trp lie Arg Leu 工Ie Tyr Lys lie 3550 3555

gat ctt gag tta Asp Leu Glu Leu 3430

cag agg gga act ctg Gln Arg Gly Thr Leu 3435

tct aaa gtg get ate att Ser Lys Val Ala lie lie 3440

11320

ata gcc lie Ala

aaa ccc Lys Pro

ate atg 工Ie Met 3445

cta act Leu Thr

ata gtt ttc lie Val Phe

gac ccc ttg Asp Pro Leu

tcc aac aga gtc Ser Asn Arg Val 3450

ttc tat Pbe Iyr 3465

cca Pro

ccg Pro

ttc aac gtt Phe Asn Val 3455

tct gat Ser Asp

ccc

Pro 3470

tcc Ser

Lys

11365

11410

ate ctg lie Leu

agg cac Arg His 3475

ttc aac ata Phe Asix lie

tgt cgc Cys Arg

agt Ser

act Thr

atg Met

tat Tyr 3485

cta Leu

11455

tct act Ser Thr

get tta Ala Leu 3490

ggt gac gtc Gly Asp Val

cct age Pro Ser 3495

ttc gca aga Phe Ala Arg

ctt Leu

cac His 3500

gac

11500

ctg tat Leu Tyr

aac aga Asn Arg 3505

cct Pro

ata act 工Ie Thr

tat tac Tyr Tyr 3510

ttc Phe

aga Arg

aag Lys

caa Gln

ttc Phe 3515

att lie

11545

cga ggg

gtt

Arg Gly Asn Val 3520

tat cta tct tgg agt tgg tcc aac gac acc tea Tyr Leu Ser Trp Ser Trp Ser Asn Asp Thr Ser 3525 3530

11590

gtg ttc aaa agg gta gcc tgt aat tct age ctg agt ctg tea tct Val Phe Lys Arg Val Ala Cys Asn Ser Ser Leu Ser Leu Ser Ser 3535 3540 3545

11635

9 1

18/137 WO 2007/047459 PCT/US2006/040134

<400> 2 Met Asp Ala

Lys Xle Val Phe Lys Val Asn Asn Gln Val Val Ser 10 15

Leu Lys Pro Glu lie lie Val Asp Gln His Qlu Tyr Lys Tyr Pro Ala 25 30

lie Lys Asp Leu Lys Lys Pro Cys lie Thr Leu Qly Lys Ala Pro 40 45

Leu Asn Lys Ala Tyr Lys Ser Val Leu Ser Gly Met Ser Ala Ala Lys 50 55 60

Leu Asp Pro Asp Asp Val Cys Ser Tyr Leu Ala Ala Ala Met Gln Phe 65 70 75 80

Phe Glu Gly Thr Cys Pro Glu Asp Trp Thr Ser Tyr Gly lie Val lie 85 90 95

Ala Arg Lys Gly Asp Lys lie Thr Pro Gly Ser Leu Val Glu lie Lys 100 105 110

Arg Thr Asp Val Glu Gly Asn Trp Ala Leu Thr Gly Gly Met Glu Leu 115 120 125

Thr Arg Asp Pro Thr Val Pro Glu His Ala Ser Leu Val Gly Leu Leu 130 135 140

Leu Ser Leu Tyr Arg Leu Ser Lys lie Ser Gly Gln Asn Thr Gly Aen 145 150 155 160

Tyr Lys Thr Asn lie Ala Asp Arg lie Glu Gln lie Phe Glu Thr Ala 165 170 175

Pro Phe Val Lya lie Val Glu His His Thr Leu Met Thr Thr His Lys 180 185 190

Met Cys Ala Asn Trp Ser Thr lie Pro Asn Phe Arg Phe Leu Ala Gly 195 200 205

Thr Tyr Asp Met Phe Phe Ser Arg lie Glu His Leu Tyr Ser Ala lie 210 215 220

Arg Val Qly Thr Val Val Thr Ala Tyr Glu Aep Cys Ser Gly Leu Val

19/137 WO 2007/047459 PCT/US2006/040134

225

230 235 240

Ser Phe Thr Gly Phe lie Lys Gln lie Asn Leu Thr Ala Arg Glu Ala

245 250

255

lie Leu Tyr Phe Phe His Lys Asn Phe Glu Glu Glu lie Arg Arg Met

260 265

270

Phe Glu Pro Gly Gln Glu Thr Ala Val Pro His Ser Tyr Phe lie His

275

280

285

Phe Arg Ser Leu Gly Leu Ser Gly Lys Ser Pro Tyr Ser Ser Asn Ala

290

2 95 300

Val Gly His Val Phe Asn Leu lie His Phe Val Gly Cys Tyr Met Gly

305 310

315 320

Gln Val Arg Ser Leu Asn Ala Thr Val lie Ala Ala Cys Ala Pro His 325 330 335

Qlu Met Ser Val Leu Gly Gly Tyr Leu Gly Glu Glu Phe Phe Gly Lys 340 345 350

Gly Thr Phe Glu Arg Arg Phe Phe Arg Asp Glu Lys Glu Leu Gln Glu 355 360 365

Tyr Glu Ala Ala Glu Leu Thr Lys Thr Asp Val Ala Leu Ala Asp Asp 370 375 380

Gly Thr Val Asn Ser Asp Asp Glu Asp Tyr Phe Ser Gly Glu Thr Arg

385 390 395

400

Ser Pro Glu Ala Val Tyr Thr Arg lie Met Met Asn Gly Gly Arg Leu

405 410

415

Lys Arg Ser His lie Arg Arg Tyr Val Ser Val Ser Ser Asn His Gln

420 425

430

Ala Arg Pro Asn Ser Phe Ala Glu Phe Leu Asn Lys Thr Tyr Ser Ser

435

440

445

Asp Ser 450

20/137 WO 2007/047459 PCT/US2006/040134

<210> <211> <212> <213>

3

297 PRT

rabies virus

<400> 3

Met Ser Lys lie Phe Val Asn Pro Ser Ala 10

lie krg Ala Gly Leu Ala 15

Asp Leu Glu Met Ala Glu Glu Thr Val 25

Leu lie Asn Arg Asn lie

Glu Asp Asn Gln Ala His Leu Gln Gly Glu Pro lie Glu Val Asp Asn 40 45

Leu Pro Glu Asp Met Gly Arg Leu His Leu Asp Asp Gly Lys Ser Pro 50 55 60

Asn Pro Gly Glu Met Ala Lys Val Gly Glu Gly Lys Tyr Arg Glu As】 65 70 75 80

Phe Gln Met Asp Glu Gly Glu 85

Leu Ser Phe Leu Phe Gln Ser Tyr 90 95

Leu Glu Asn Val Gly Val Gln lie Val Arg Gln Met Arg Ser Gly Glu 100 105 110

Arg Phe Leu Lys lie Trp Ser Gln Thr Val Glu Glu lie lie Ser Tyr 115 12 0 125

Val Ala Val Asn Phe Pro Asn Pro Pro Gly Lys Ser Ser Glu Asp Lya 130 135 140

Ser Thr Gln Thr Thr Gly Arg Glu Leu Lys Lys Glu Thr Thr Pro Thr 145 150 155 160

Pro Ser Gln Arg Glu Ser Gln Ser Ser Lys Ala Arg Met Ala Ala Gln 165 170 175

lie Ala Ser Gly Pro Pro Ala Leu Glu Trp Ser Ala Thr Asn Glu Glu 180 185 190

Asp Asp Leu Ser Val Glu Ala Glu lie Ala His Gln lie Ala Glu Ser 195 200 205

21/137 WO 2007/047459 PCT/US2006/040134

Phe Ser Lys Lys Tyr Lys Phe Pro Ser Arg Ser Ser Gly lie Leu Leu 210 215 220

Tyr Asn Phe Glu Gln Leu Lys Met Asn Leu Asp Asp lie Val Lys Glu 225 230 235 240

Ala Lys Asn Val Pro Gly Val Thr Arg Leu Ala His Asp Gly Ser Lys 245 250 255

Leu Pro Leu Arg Cys Val Leu Gly Trp Val Ala Leu Ala Asn Pro Lys 260 265 270

Lys Phe Gln Leu Leu VaX Glu Ser 275 280

Lys Leu Ser Lys lie Met Gln 285

Asp Asp Leu Asn Arg Tyr Thr Ser Cys 290 295

<210> <211> <212> <213>

4

202

PRT

rabies virus

<400> 4

Met Asn Phe Leu Arg Lys lie Val Lys Asn Cys Arg Asp Glu Asp Thr 1 5 10 15

Gln Lys Pro Ser Pro Val Ser Ala Pro Leu Asp Asp Asp Asp Leu Trp 25 30

Leu Pro Pro Pro Glu Tyr Val Pro Leu Lys Glu Leu Thr Ser Lys Lys 40 45

Asn Met Arg Asn Phe Cyg lie Asn Gly Gly Val Lys Val Cys Ser Pro 50 55 60

Asn Gly Tyr Ser Phe Arg lie Leu Arg His lie Leu Lys Ser Phe Asp 65 70 75 80

GHu lie Tyr Ser Gly Asn His Arg Met lie Gly Leu Ala Lys Val Val 85 90 95

lie Gly Leu Ala Leu Ser Gly Ser Pro Val Pro Glu Gly Met Asn Trp 100 105 no

22/137 WO 2007/047459 PCT/US2006/040134

Val Tyr Lys Leu Arg Arg Thr Phe lie Phe Gln Trp Ala Asp Ser Arg

115 120

125

Gly Pro Leu Glu Gly Glu Glu Leu Glu Tyr Ser Gln Glu lie Thr Trp

130

135

140

Asp Asp Asp Thr Glu Phe Val Gly Leu Gln lie Arg Val lie Ala Lys

145

0 155

160

Gln Cys His lie Gln Gly Arg lie Trp Cys lie Asn Met Asn Pro Arg

165 170

175

Ala Cys Gln Leu Trp Ser Asp Met Ser Leu Gln Thr Gln Arg Ser Glu 180 185 190

Glu Asp Lys Asp Ser Ser Leu Leu Leu Glu 195 200

<210> 5

<211> 524

<212> PRT

<213> rabies virus

<400> 5

Met Val Pro Gln Ala Leu Leu Phe Val Pro Leu Leu Val Phe Pro Leu 1 5 10 15

Cys Phe Gly Lys Phe Pro lie Tyr Thr lie Pro Asp Lys Leu Gly Pro 25 30

Trp Ser Pro lie Asp 工Ie His His Leu Ser Cys Pro Asn Asn Leu Val

35

40 45

Val Glu Asp Glu Gly Cye Thr Asn Leu Ser Gly Phe Ser Tyr Met Glu

50

55 60

Leu Lys Val Gly Tyr lie Leu Ala lie Lys Met Asn Gly Phe Thr Cys 65 70 75 80

Thr Gly Val Val Thr Glu Ala Glu Thr Tyr Thr Asn Phe Val Gly Tyr 85 90 95

Val Thr Thr Thr Phe Lys Arg Lys Hie Phe Arg Pro Thr Pro Asp Ala 100 105 110

23/137 WO 2007/047459 PCT/US2006/040134

Cys Arg Ala Ala Tyr Asn Trp Lys Met Ala Gly Asp Pro Arg Tyr Glu 115 120 125

Glu Ser Leu His Asn Pro Tyr Pro Asp Tyr His Trp Leu Arg Thr Val 130 135 140

Lys Thr Thr Lys Glu Ser Leu Val lie lie Ser Pro Ser Val Ala Asp 145 150 155 160

Leu Asp Pro Tyr Asp Arg Ser Leu His Ser Arg Val Phe Pro Ser Gly 165 170 175

Lys Cys Ser Gly Val Ala Val Ser Ser Thr Tyr Gys Ser Thr Asn His 180 185 190

Asp Tyr Thr lie Trp Met Pro Glu Asn Pro Arg Leu Gly Met Ser Cys 195 200 205

Asp lie Phe Thr Asn Ser Arg Gly Lys Arg Ala Ser Lys Gly Ser Glu 210 215 220

Thr Cys Gly Phe Val Asp Glu Arg Gly Leu Tyr Lys Ser Leu Lys Gly 225 230 235 240

Ala Cys Lys Leu Lys Leu Cys Gly Val Leu Gly Leu Arg Leu Met Asp 245 250 255

Gly Thr Trp Val Ala Met Gln Thr Ser Asn Glu Thr Lys Trp Cys Pro 260 265 270

Pro Asp Gln Leu Val Asn Leu His 275 280

Phe Arg Ser Asp Glu lie Glu 285

His Leu Val Val Glu Glu Leu Val Arg Lys Arg Glu Glu Cys Leu Asp 290 295 300

Ala Leu Glu Ser Xle Met Thr Thr Lys Ser Val Ser Phe Arg Arg Pro 305 310 315 320

Ser His Leu Arg Lys Leu Val Pro Gly Phe Gly Lys Ala Tyr Thr lie 325 330 335

Phe Asn Lys Thr Leu Met Glu Ala Asp Ala His Tyr Lys Ser Val Arg 340 345 350

24/137 WO 2007/047459 PCT/US2006/040134

Thr Trp Asn Glu 工Ie Leu Pro Ser Lys Gly Cys Leu Arg Val Gly Gly 355 360 3 65

Arg Cys His Pro His Val Asn Gly Val Phe Phe Asn Gly lie lie Leu 370 375 380

Gly Pro Asp Qly Asn Val Leu lie Pro Glu Met Gln Ser Ser Leu Leu 385 390 395 400

Gln Gln His Met Glu Leu Leu Glu Ser Ser Val lie Pro Leu Val His 405 410 415

Pro Leu Ala Asp Pro Ser Thr Val Phe Lys Asp Gly Asp Glu Ala Glu 420 425 430

Asp Phe Val Glu Va.1 His Leu Pro Asp Val His Asn Gln Val Ser Gly 435 440 445

Val Asp Leu Gly Leu Pro Asri Trp Gly LyB Tyr Val Leu Leu Ser Ala 450 455 460

Gly Ala Leu Thr Ala Leu Met Leu lie 工Ie Phe Leu Met Thr Cys Cys 465 470 475 480

Arg Arg Val Asn Arg Ser Glu Pro Thr Gln His Asn Leu Arg Gly Thr 485 490 495

Gly Arg Glu Val Ser Val Thr Pro Gln Ser Gly Lys lie lie Ser Ser 500 505 510

Trp Glu Ser His Lys Ser Gly Gly Glu Thr Arg Leu 515 520

<210> 6

<211> 2127

<212> PRT

<213> rabies virus

<400> 6

Met Leu Asp Pro

Gly Glu Val Tyr Asp As| 10

Pro lie Asp Pro lie Glu 15

Leu Glu Asp Glu Pro Arg Gly Thr Pro Thr Val Pro Asn lie Leu Arg

20

25

25/137 WO 2007/047459 PCT/US2006/040134

Asn Ser Asp Tyr Asn Leu Asri Ser Pro Leu lie Glu Asp Pro Ala Arg 40 45

Leu Met Leu Glu Trp Leu Lys Thr Gly Asn Arg Pro Tyr Arg Met Thr 50 55 60

Leu Thr Asp Asn Cys Ser Arg Ser Phe Arg Val Leu Lys Asp Tyr Phe 65 70 75 80

Lys Lys Val Asp Leu Gly Ser Leu Lys Val Gly Gly Met Ala Ala Gln 85 90 95

Ser Met lie Ser Leu Trp Leu Tyr Gly Ala His Ser Glu Ser Asn Arg 100 105 110

Ser Arg Arg Cys 工Ie Thr 115

Leu Ala His Phe Tyr Ser Lys Ser Ser 120 125

Pro lie Glu Lys Leu Leu Asn Leu Thr Leu Gly Asn Arg Gly Leu Arg 13 0 135 140

lie Pro Pro Glu Gly Val Leu Ser Cys Leu Glu Arg Val Asp Tyr Asp 14 5 150 155 160

Asn Ala Phe Gly Arg Tyr Leu Ala Asn Thr Tyr Ser Ser Tyr Leu Phe 165 170 175

Phe His Val lie Thr Leu Tyr Met Asn Ala Leu Asp Trp Asp Glu Glu 180 185 190

Lys Thr lie Leu Ala Leu Trp Lys Asp Leu Thr Ser Val Asp lie Gly 195 200 205

Lye Asp Leu Val Lys Phe Lys 210 215

Gln lie Trp Gly Leu Pro lie Val 220 ·

Thr Lys Asp Phe Val Tyr Ser Gln Ser Ser Asn Cys Leu Phe Asp Arg 225 230 235 240

Asn Tyr Thr Leu Met Leu Lys Glu Leu Phe Leu Ser Arg Phe Asn Ser 245 250 255

Leu Met Val Leu Leu Ser Pro Pro Glu Pro Arg Tyr Ser Asp Asp Leu 260 265 270

26/137 WO 2007/047459 PCT/US2006/040134

lie Ser Gln Leu Cys Gln Leu Tyr lie Ala Gly Asp Gln Val Leu Ser 275 280 285

Met Cys Gly Asn Ser Gly Tyr Glu Val lie Lys lie Leu Glu Pro Tyr 290 295 300

Val Val Asn Ser Leu Val Gln Arg AXa Glu Lys Phe Arg Pro Leu lie 305 310 315 320

His Ser Leii Gly Asp Phe Pro VaX Phe lie Lys Asp Lye Val Ser Gln 325 330 335

Leu Glu Glu Thr Phe Gly Pro Cys Ala Arg Arg Phe Phe Arg Ala Leu 340 345 350

Asp Gln Phe Asp Asn lie His Asp Leu Val Phe Val Tyr Gly Cys Tyr 355 360 365

Arg His Trp Gly His Pro Tyr lie Asp Tyr Arg Lys Gly Leu Ser Lys 370 375 380

Leu Tyr Aap Gln Val Hie lie Lys Lys Val lie Asp Lya Ser Tyr Gln 385 390 395 400

Glu Cys Leu Ala Ser 405

Leu Ala Arg Arg lie Leu Arg Trp Gly Phe 410 415

Asp Lys Tyr Ser Lys Trp Tyr Leu Asp Ser Arg Phe Leu Ala Arg Asp 420 425 430

His Pro Leu Thr Pro Tyr lie Lys Thr Gln Thr Trp Pro Pro Lys His 435 440 445

lie Val Asp Leu VaI Gly Asp Thr Trp His Lys Leu Pro lie Thr Gln 450 455 460

lie Phe Glu lie Pro Glu Ser Met Asp Pro Ser Glu lie Leu Asp Asp 465 470 475 480

Lys Ser His Ser Phe Thr Arg Thr Arg Leu Ala Ser Trp Leu Ser Glu 485 490 495

Asn Arg Gly Gly Pro Val Pro Ser Glu Lys Val lie lie Thr Ala Leu

27/137 WO 2007/047459 PCT/US2006/040134

500

505

510

Ser Lys Pro Pro Val Asn Pro Arg Glu Phe Leu Arg Ser Ile Asp Leu 515 520 525

GXy Gly Leu Pro Asp Glu Asp Leu lie Xle Gly Leu Lys Pro Lys Glu 530 535 540

Arg Qlu Leu Lys lie Glu Gly Arg Phe Phe Ala Leu Met Ser Trp Asn 545 550 555 560

Leu Arg Leu Tyr Phe Val lie Thr Glu Lys Leu Leu Ala Asn Tyr lie 565 570 575

Leu Pro Leu Phe 580

Ala Leu Thr Met Thr Asp Asn Leu Asn Lys Val 585 590

Phe Lys Lys Leu lie Asp Arg Val Thr Gly Gln Gly Leu Leu Asp Tyr 595 600 605

Ser Arg Val Thr Tyr Ala Phe His Leu 610 615

Tyr Glu Lys Trp Asn Asn 620

His Gln Arg Leu Glu Ser Thr Glu 625 630

Val Phe Ser Val Leu Asp Gln 635 640

Val Phe Gly Leu Lys Arg Val Phe Ser Arg Thr His Glu Phe Phe Gln 645 650 655

Lys Ala Trp lie Tyr Tyr Ser Asp Arg Ser 660 665

Leu lie Gly Leu Arg 670

Glu Asp Gln lie Tyr Cys Leu Asp Ala Ser Asn Gly Pro Thr Cys Trp 675 680 685

Asn Gly Gln Asp Gly Gly Leu Glu Gly Leu Arg Gln Lys Gly Trp Ser 690 695 700

Leu Val Ser Leu Leu Met lie Asp Arg Glu Ser Gln lie Arg Asn Thr 705 710 715 720

Arg Thr Lys lie Leu Ala Gln Gly 725

Asn Gln Val Leu Cys Pro Thr 730 735

28/137 WO 2007/047459 PCT/US2006/040134

Tyr Met Leu Ser Pro Gly Leu Ser Gln Glu Gly Leu Leu Tyr Glu Leu 740 745 750

Glu Arg lie Ser Arg Asn Ala Leu Ser lie Tyr Arg Ala Val Glu Glu 755 7S0 765

Gly Ala Ser Lys Leu Gly Leu lie Thr Lys Lys Glu Glu Thr Met Cys 770 775 780

Ser Tyr Asp Phe Leu lie Tyr Gly Lys Thr Pro Leu Phe Arg Gly Asn 785 7 90 795 800

S

lie Leu Val Pro Glu Ser Lys Arg Trp Ala Arg Val Ser Cys Val Ser 805 810 815

Asn Asp Qln lie Val Aen Leu Ala Asn lie Met Ser Thr Val Ser Thr 820 825 830

Asn Ala Leu Thr Val Ala Gln His Ser Gln Ser Leu lie Lys Pro Met 835 840 845

Gly Asp Phe Leu Leu Met Ser Val Gln Ala Val Phe His Tyr Leu Leu 850 855 860

Phe Ser Pro lie Leu Lys Gly Arg Val Tyr Lys lie Leu Ser Ala Glu 865 870 875 880

Gly Asp Ser Phe Leu Leu Ala Met Ser Arg lie lie Tyr Leu Asp Pro Ratx 890 895

Ser Leu Gly Gly Val Ser Gly Met Ser Leu Gly Arg Phe His lie Arg 900 905 910

Gln Phe Ser 915

Pro Val Ser Glu Gly Leu Ser Phe Trp Arg Glu lie 920 925

Trp Leu Ser Ser His Glu Ser Trp Val His Ala Leu Cys Gln Glu Ala 930 935 940

Gly Asn 945

Leu Gly Glu Arg Thr Leu Glu Ser Phe Thr Arg Leu 950 955 960

Leu Glu Asp Pro Thr Thr Leu Asn lie Arg Gly Gly Ala Ser Pro Thr 965 970 975

29/137 wo 2007/047459 PCT/US2006/040134 lie Leu Leu Lys Asp Ala lie Arg Lys Ala Leu Tyr Asp Glu Val Asp 980 985 990

Lys Val Glu Asn Ser Glu Phe Arg Glu Ala lie Leu Leu Ser Lys Thr

995

1000 1005

His Arg Asp Asn Phe lie Leu Phe Leu Thr Ser Val Glu Pro Leu

1010

1015 1020

Phe Pro Arg Phe Leu Ser Qlu Leu Phe Ser Ser Ser . Phe Leu Gly

1025

1030 1035

lie Pro Glu Ser lie lie Gly Leu lie Gln Asn Ser Arg Thr lie

1040

1045 1050

Arg Arg Gln Phe Arg Lys Ser Leu Ser Lys Thr Leu Glu Glu Ser

1055

1060 1065

Phe Tyr Asn Ser Glu lie His Gly lie Ser Arg Met Thr Gln Thr

1070

1075

Pro Gln Arg Val Gly Gly Val Trp Pro Cys Ser Ser Glu Arg Ala

1085

1090 1095

Asp Leu Leu Arg Glu lie Ser Trp Gly Arg Lys Val Val Gly Thr

1100

1105 1110

Thr Val Pro His Pro Ser Glu Met Leu Gly Le-U Leu Pro Lys Ser

1115

1120 1125

Ser lie Ser Cys Thr Cys Qly 1130 1135

Val Ser Val Ser Val Leu Pro 1145 1150

Ala Thr Gly Gly Gly 1140

Ser Phe Asp Gln Ser 1155

Asn

Arg

Phe Phe Ser

Arg Gly Pro Leu Lys Gly Tyr Leu Gly Ser Ser Thr Ser Met Ser

1160

1165

1170

Thr Gln Leu Phe His Ala Trp Glu Lys Val Thr Asn Val His Val

1175

1180

1185

Val Lys Arg Ala Leu Ser Leu Lys Glu Ser lie Asn Trp Phe lie

1190

1195

1200

30/137 WO 2007/047459 PCT/US2006/040134

Thr Arg Asp Ser Asn Leu Ala Gln Ala Leu lie Arg Asn 工Ie Met 1205 1210 1215

Ser Leu Thr Gly Pro Asp Phe Pro Leu Glu Glu Ala Pro Val Phe 1220 1225 1230

Lys Arg Thr Gly Ser Ala Leu His Arg Phe Lys Ser Ala Arg Tyr 1235 1240 1245

Ser Qlu Gly Gly Tyr Ser Ser Val Cys Pro Asn Leu Leu Ser His 1250 1255 1260

He ser Val Ser Thr Asp Thr Met Ser Asp Leu Thr Gln Asp Gly 1265 1270 1275

Lys Asn Tyr Asp Phe Met Phe Gln Pro Leu Met Leu Tyr Ala Gln 1280 1285 1290

Thr Trp Thr Ser Glu Leu Val Gln Arg Asp Thr Arg Leu Arg Asp 1295 1300 1305

Ser Thr Phe His Trp His Leu Arg Cys Aen Arg Cys Val Arg Pro

1310 1315

1320

lie Abp Asp Val Thr Leu Glu Thr Ser Gln lie Phe Glu Phe Pro

1325 1330

1335

Asp

Val Ser Lys Arg lie Ser Arg Met Val Ser Gly Ala Val Pro

1340 1345

1350

His Phe Gln Arg Leu Pro Asp lie Arg Leu Arg Pro Gly Asp Phe

1355 1360

1365

Glu

Gln

Ser Leu Ser Gly Arg Glu Lys Ser His His lie Gly Ser Ala

1370 1375

1380

Gly Le-u Leu Tyr Ser lie Leu Val Ala lie His Asp Ser Gly

1385 1390

1395

Tyr Asii Asp Gly Thr 工:Le Phe Pro Ala Asn lie Tyr Gly Lys Val

1410

1400 1405

Ser Pro Arg Asp Tyr Leu Arg Gly Leu Ala Arg Gly Val Leu lie

31/137 WO 2007/047459 PCT/US2006/040134

1415

1420 1425

Gly ser Ser lie Cys Phe Leu Thr Arg Met Thr Asn lie Asn 工Ie

1430

1435

1440

Asn Arg Pro Leu Glu Leu lie Ser Gly Val Xle Ser Tyr lie Leu

1445

1450

1455

Leu Arg Leu Asp Asn His Pro Ser Leu Tyr lie Met Leu Arg Glu

1460

1465

1470

Pro Ser Leu Arg Gly Glu lie Phe Ser lie Pro Gln Lys lie Pro

1475

1485

Ala Ala Tyr Pro Thr Thr Met Lys Glu Gly Asn Arg Ser lie Leu

1490

1495 1500

Cys Tyr Leu Gln His Val Leu Arg Tyr Glu Arg Glu lie lie Thr

1505

1510 1515

Ala Ser Pro Glu Asn Asp Trp Leu Trp lie Phe Ser Asp Phe Arg

1520

1525 1530

Ser Ala Lys Met Thr Tyr Leu Thr Leu lie Thr Tyr Gln Ser His

1535

1540 1545

Leu Leu Leu Gln Arg Val Glu Arg Asn Leu Ser Lys Ser Met Arg

1550

1555 1560

Asp Asn Leu Arg Gln Leu Ser Ser Leu Met Arg Gln Val Leu Gly

1565

1570 1575

Gly His Gly Glu Asp Thr Leu Glu Ser Asp Asp Asn lie Gln Arg

1580

.1585 1590

Leu Leu Lys Asp Ser Leu Arg Arg Thr Arg Trp Val Asp Qln Glu

1595

1600 1605

Val Arg His Ala Ala Arg Thr Met Thr Gly Asp Tyr Ser Pro Asn

1610

1615 1620

Lys Lys Val Ser Arg Lys Val Gly Cys Ser Glu Trp Val Cys Ser

1625

1630 1635

32/137 WO 2007/047459 PCT/US2006/040134

Ala Gln Gln Val Ala Val Ser Thr Ser Ala Asn Pro Ala Pro Val

1640

1645

1650

Ser Glu Leu Asp lie Arg Ala Leu Ser Lys Arg Phe Gln Asn Pro

1655

1660

1665

Leu lie Ser Gly Leu Arg Val Val Gln Trp Ala Thr Gly Ala His

1670

1675

Tyr Lys Leu Lys Pro lie Leu Asp Asp Leu Asn Val Phe Pro Ser

1685

1690

1695

Leu Cys Leu Val Val Gly Asp Gly Ser Gly Gly lie Ser Arg Ala

1700

1705

1710

Val Leu Asn Met Phe Pro Asp Ala Lys Leu Val Phe Asn Ser Leu

1715

1720

1725

Leu Qlu Val Asn Asp Leu Met Ala Ser Gly Thr His Pro Leu Pro

1730

1735

1740

Pro Ser Ala lie Met Arg Gly Gly Asn Gly lie Val Ser Arg Val

1745

1750

1755

lie Asp Phe Asp Ser lie Trp Glu Lys Pro Ser Asp Leu Arg Asn

1760

1765

1770

Leu Ala Thr Trp Lys Tyr Phe Gln Ser Val Gln Lys Gln Val Asn

1775

1780

1785

Met Ser Tyr Asp Leu lie lie Cys Asp Ala Glu Val Thr Asp lie

1790

1795

Ala Ser lie Asn Arg lie Thr Leu Leu Met Ser Asp Phe Ala Leu

1805

1810

1815

Ser lie Asp Gly Pro Leu Tyr Leu Val Phe Lys Thr Tyr Gly Thr

1820 1825

1830

Met Leu Val Asn Pro Asn Tyr Lys Ala lie Gln His Leu Ser Arg

1835

1845

Ala Phe Pro Ser Val Thr Gly Phe lie Thr Gln Val Thr Ser Ser 1850 1855 I860

33/137 WO 2007/047459 PCT/US2006/040134

Phe Ser Ser Glu Leu Tyr Leu Arg Phe Ser Lys Arg Gly Lys Leu 1865 1870 1875

Phe Arg Asp Ala Glu Tyr Leu Thr Ser Ser Thr Leu Arg Glu Met

Ser Leu Val Leu Phe Asn Cys Ser Ser Pro Lys Ser Glu Met Gin. !895 1900 1905

Arg Ala Arg Ser Leu Asn Tyr Gln Asp Leu Val Arg Gly Phe Pro 1910 1915 1920

Glu Glu 工Ie lie Ser Asn Pro Tyr Asn Glu Met 工Ie lie Thr Leu 1925 1930 1935

Xle Asp Ser Asp Val Glu Ser Phe Leu Val His Lys Met Val 1940 1945 1950

Leu Glu Leu Gln Arg Gly Thr Leu Ser Lys Val Ala lie lie 1955 I960 1965

Ile Ala lie Met lie Val Phe Ser Asn Arg Val Phe Asn Val Ser 1970 1975 1980

Lys Pro Leu Thr Asp Pro Leu Phe Tyr Pro Pro Ser Asp Pro Lys 1985 1990 1995

lie Leu Arg His Phe Asn lie Cys Arg Ser Thr Met Met Tyr Leu 2000 2005 2010

Ser Thr Ala Leu Gly Asp Val Pro Ser Phe Ala Arg Leu His Asp

2015

2020 2025

Leu Tyr Asn Arg Pro lie Thr Tyr Tyr Phe Arg Lys Gln Phe lie

2030

2035 2040

Arg Gly Asn Val Tyr Leu Ser Trp Ser Trp Ser Asn Asp Thr Ser

2045

2050 2055

Val Phe Lys Arg Val Ala Cys Asn Ser Ser Leu Ser Leu Ser Ser

2060

2065 2070

His Trp lie Arg Leu lie Tyr Lys lie Val Lys Ala Thr Arg Leu 2075 2080 2085

34/137 WO 2007/047459 PCT/XJS2006/040134

Val Gly 2090

Ser lie Lys Asp Leu 2095

Ser Arg Glu Val Glu 2100

Arg His Leu

His Arg 2105

Tyr Asn Arg Trp He 2110

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Arg Ser Arg

Ser Ser Leu Leu Asp Tyr Ser Cys Leu 2120 2125

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<212> DNA

<213> artificial sequence

<223> Recombinant ERA rabies virus genome

<220>

<221> misc—feature

<222> (1) . . (58)

<223> Leader region

<220>

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<220>

<221> misc—feature <222> (1514) . . (2404)

<220>

< 2 21> misc—feature <222> (2496) · . (3101)

<220>

<221> misc一feature <222> {3317) . . (4888)

<220>

<221> misc_feature

<222> (4963)..(5361)

<223> Psi region.

<220>

<221> misc一 feature <222> {5416) ·· (11796)

<220>

<221> misc一feature

<222> (11861) . . (11930)

<223> Trailer region

<400> 7

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acgcttaaca accagatcaa agaaaaaaca gacattgtca attgcaaagc aaaaatgtaa SO

cacccctaca atggatgccg acaagattgt attcaaagtc aataatcagg tggtctcttt 12 0

gaagcctgag attatcgtgg atcaacatga gtacaagtac cctgccatca aagatttgaa 180

aaagccctgt ataaccctag gaaaggctcc cgatttaaat aaagcataca agtcagtttt 240

gtcaggcatg agcgccgcca aacttgatcc tgacgatgta tgttcctatt tggcagcggc 300

aatgcagttt tttgagggga catgtccgga agactggacc agctatggaa tcgtgattgc 360

acgaaaagga gataagatca ccccaggttc tctggtggag ataaaacgta ctgatgtaga 420

agggaattgg gctctgacag gaggcatgga actgacaaga gaccccactg tccctgagca 480

tgcgtcctta gtcggtcttc tcttgagtct gtataggttg agcaaaatat ccgggcaaaa 540

cactggtaac tataagacaa acattgcaga caggatagag cagatttttg agacagcccc 600

ttttgttaaa atcgtggaac accatactct aatgacaact cacaaaatgt gtgctaattg 660

gagtactata ccaaacttca gatttttggc cggaacctat gacatgtttt tctcccggat 72 0

tgagcatcta tattcagcaa tcagagtggg cacagttgtc actgcttatg aagactgttc 780

aggactggta tcatttactg ggttcataaa acaaatcaat ctcaccgcta gagaggcaat 840

actatatttc ttccacaaga actttgagga agagataaga agaatgtttg agccagggca 900

ggagacagct gttcctcact cttatttcat ccacttccgt tcactaggct tgagtgggaa 960

atctccttat tcatcaaatg ctgttggtca cgtgttcaat ctcattcact ttgtaggatg 1020

ctatatgggt caagtcagat ccctaaatgc aacggttatt gctgcatgtg ctcctcatga 1080

aatgtctgtt ctagggggct atctgggaga ggaattcttc gggaaaggga catttgaaag 1140

aagattcttc agagatgaga aagaacttca agaatacgag gcggctgaac tgacaaagac 1200

tgacgtagca ctggcagatg atggaactgt caactctgac gacgaggact acttctcagg 12 60

tgaaaccaga agtccggagg ctgtttatac tcgaatcatg atgaatggag gtcgactaaa 1320

gagatctcac atacggagat atgtctcagt cagttccaat catcaagccc gtccaaactc 1380

attcgccgag tttctaaaca agacatattc gagtgactca taagaagttg aacaacaaaa 1440

tgccggaaat ctacggattg tgtatatcca tcatgaaaaa aactaacacc cctcctttcg 15 0 0

aaccatccca aacatgagca agatctttgt caatcctagt gctattagag ccggtctggc 1560

cgatcttgag atggctgaag aaactgttga tctgatcaat agaaatatcg aagacaatca 1620

ggctcatctc caaggggaac ccatagaagt ggacaatctc cctgaggata tggggcgact 1680

tcacctggat gatggaaaat cgcccaaccc tggtgagatg gccaaggtgg gagaaggcaa 1740

gtatcgagag gactttcaga tggatgaagg agaggatctt agcttcctgt tccagtcata 1800

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aaaggtccga agaggacaaa gattcctctc tgcttctaga ataatcagat tatatcccgc 3120 aaatttatca cttgtttacc tctggaggag agaacatatg ggctcaactc caacccttgg 3180 gagcaatata acaaaaaaca tgttatggtg ccattaaacc gctgcatttc atcaaagtca 3240 agttgattac ctttacattt tgatcctctt ggatgtgaaa aaaactatta acatccctca 3300 aaagactcaa ggaaagatgg ttcctcaggc tctcctgttt gtaccccttc tggtttttcc 3360 attgtgtttt gggaaattcc ctatttacac gataccagac aagcttggtc cctggagccc 3420 gattgacata catcacctca gctgcccaaa caatttggta gtggaggacg aaggatgcac 3480 caacctgtca gggttctcct acatggaact taaagttgga tacatcttag ccataaaaat 3540 gaacgggttc acttgcacag gcgttgtgac ggaggctgaa acctatacta acttcgttgg 3600 ttatgtcaca accacgttca aaagaaagca tttccgccca acaccagatg catgtagagc 3660 cgcgtacaac tggaagatgg ccggtgaccc cagatatgaa gagtctctac acaatccgta 3720 ccctgactac cactggcttc gaactgtaaa aaccaccaag gagtctctcg ttatcatatc 3780 tccaagtgtg gcagatttgg acccatatga cagatccctt cactcgaggg tcttccctag 3840 cgggaagtgc tcaggagtag cggtgtcttc tacctactgc tccactaacc acgattacac 3900 catttggatg cccgagaatc cgagactagg gatgtcttgt gacattttta ccaatagtag 3960 ggggaagaga gcatccaaag ggagtgagac ttgcggcttt gtagatgaaa gaggcctata 4020 taagtcttta aaaggagcat gcaaactcaa gttatgtgga gttctaggac ttagacttat 4080 ggatggaaca tgggtcgcga tgcaaacatc aaatgaaacc aaatggtgcc cccccgatca 4140 gttggtgaac ctgcacgact ttcgctcaga cgaaattgag caccttgttg tagaggagtt 4200 ggtcaggaag agagaggagt gtctggatgc actagagtcc atcatgacaa ccaagtcagt 4260 gagtttcaga cgtcccagtc atttaagaaa acttgtccct gggtttggaa aagcatatac 4320 catattcaac aagaccttga tggaagccga tgctcactac aagtcagtcg agacttggaa 4380 tgagatcctc ccttcaaaag ggtgtttaag agttgggggg aggtgtcatc ctcatgtgaa 4440 cggggtgttt ttcaatggta taatattagg acctgacggc aatgtcttaa tcccagagat 4500 gcaatcatcc ctcctccagc aacatatgga gttgttggaa tcctcggtta tcccccttgt 4560 gcaccccctg gcagacccgt ctaccgtttt caaggacggt gacgaggctg aggattttgt 4620 tgaagttcac cttcccgatg tgcacaatca ggtctcagga gttgacttgg gtctcccgaa 4680 ctgggggaag tatgtattac tgagtgcagg ggccctgact gccttgatgt tgataatttt 4740 cctgatgaca tgttgtagaa gagtcaatcg atcagaacct acgcaacaca atctcagagg 4800 gacagggagg gaggtgtcag tcactcccca aagcgggaag atcatatctt catgggaatc 4860

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acacaagagt gggggtgaga ccagactgtg aggactggcc gtcctttcaa ctatccaagt 4920 cctgaagatc acctcccctt ggggggttct ttttgaaaaa aacctgggtt caatagtcct 4980 cctcgaactc catgcaactg ggtagattca agagtcatga gattttcatt aatcctctca 5040 gttgatcaag caagatcatg tagattctca taatagggga gatcttctag cagtttcagt 5100 gactaacggt actttcattc tccaggaact gacaccaaca gttgtagaca aaccacgggg 5160 tgtctcgggt gactctgtgc ttgggcacag acaaaggtca tggtgtgttc catgatagcg 5220 gactcaggat gagttaattg agagaggcag tcttcctccc gtgaaggaca taagcagtag 5280 ctcacaatca tcccgcgtct cagcaaagtg tgcataatta taaagtgctg ggtcatctaa 5340 gcttttcagt cgagaaaaaa acattagatc agaagaacaa ctggcaacac ttctcaacct 5400 gagacctact tcaagatgct cgatcctgga gaggtctatg atgaccctat tgacccaatc 5460 gagttagagg atgaacccag aggaaccccc actgtcccca acatcttgag gaactctgac 5520 tacaatctca actctccttt gatagaagat cctgctagac taatgttaga atggttaaaa 5580 acagggaata gaccttatcg gatgactcta acagacaatt gctccaggtc tttcagagtt 5640 ttgaaagatt atttcaagaa ggtagatttg ggttctctca aggtgggcgg aatggctgca 5700 cagtcaatga tttctctctg gttatatggt gcccactctg aatccaacag gagccggaga 5760 tgtataacag acttggccca tttctattcc aagtcgtccc ccatagagaa gctgttgaat 5820 ctcacgctag gaaatagagg gctgagaatc cccccagagg gagtgttaag ttgccttgag 5880 agggttgatt atgataatgc atttggaagg tatcttgcca acacgtattc ctcttacttg 5940 ttcttccatg taatcacctt atacatgaac gccctagact gggatgaaga aaagaccatc 6000 ctagcattat ggaaagattt aacctcagtg gacatcggga aggacttggt aaagttcaaa 6060 gaccaaatat ggggactgcc gatcgtgaca aaggactttg tttactccca aagttccaat 6120 tgtctttttg acagaaacta cacacttatg ctaaaagaac ttttcttgtc tcgcttcaac 6180 tccttaatgg tcttgctctc tcccccagag ccccgatact cagatgactt gatatctcaa 6240 ctatgccagc tgtacattgc tggggatcaa gtcttgtcta tgtgtggaaa ctccggctat 6300 gaagtcatca aaatattgga gccatatgtc gtgaatagtt tagtccagag agcagaaaag 6360 tttaggcctc tcattcattc cttgggagac tttcctgtat ttataaaaga caaggtaagt 6420 caacttgaag agacgttcgg tccctgtgca agaaggttct ttagggctct ggatcaattc 6480 gacaacatac atgacttggt ttttgtgtat ggctgttaca ggcattgggg gcacccatat 6540 atagattatc gaaagggtct gtcaaaacta tatgatcagg ttcacattaa aaaagtgata 6600

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gataagtcct accaggagtg cttagcaagc gacctagcca ggaggatcct tagatggggt 6660 tttgataagt actccaagtg gtatctggat tcaagattcc tagcccgaga ccaccccttg 6720 actccttata tcaaaaccca aacatggcca cccaaacata ttgtagactt ggtggçggat 6780 acatggcaca agctcccgat cacgcagatc tttgagattc ctgaatcaat ggatccgtca 6840 gaaatattgg atgacaaatc acattctttc accagaacga gactagcttc ttggctgtca 6900 gaaaaccgag ggggacctgt tcctagcgaa aaagttatta tcacggccct gtctaagccg 6960 cctgtcaatc cccgagagtt tctgaggtct atagacctcg gaggattgcc agatgaagac 7020 ttgataattg gcctcaagcc aaaggaacgg gaattgaaga ttgaaggtcg attctttgct 7080 ctaatgtcat ggaatctaag attgtatttt gtcatcactg aaaaactctt ggccaactac 7140 atcttgccac tttttgacgc gctgactatg acagacaacc tgaacaaggt gtttaaaaag 7200 ctgatcgaca gggtcaccgg gcaagggctt ttggactatt caagggtcac atatgcattt 7260 cacctggact atgaaaagtg gaacaaccat caaagattag agtcaacaga ggatgtattt 7320 tctgtcctag atcaagtgtt tggattgaag agagtgtttt ctagaacaca cgagtttttt 7380 caaaaggcct ggatctatta ttcagacaga tcagacctca tcgggttacg ggaggatcaa 7440 atatactgct tagatgcgtc caacggccca acctgttgga atggccagga tggcgggcta 7500 gaaggcttac ggcagaaggg ctggagtcta gtcagcttat tgatgataga tagagaatct 7560 caaatcagga acacaagaac caaaatacta gctcaaggag acaaccaggt tttatgtccg 7620 acatatatgt tgtcgccagg gctatctcaa gaggggctcc tctatgaatt ggagagaata 7680 tcaaggaatg cactttcgat atacagagcc gtcgaggaag gggcatctaa gctagggctg 7740 atcatcaaga aagaagagac catgtgtagt tatgacttcc tcatctatgg aaaaacccct 7800 ttgtttagag gtaacatatt ggtgcctgag tccaaaagat gggccagagt ctcttgcgtc 7860 tctaatgacc aaatagtcaa cctcgccaat ataatgtcga cagtgtccac caatgcgcta 7920 acagtggcac aacactctca atctttgatc aaaccgatga gggattttct gctcatgtca 7980 gtacaggcag tctttcacta cctgctattt agcccaatct taaagggaag agtttacaag 8040 attctgagcg ctgaagggga tagctttctc ctagccatgt caaggataat ctatctagat 8100 ccttctttgg gaggggtatc tggaatgtcc ctcggaagat tccatatacg acagttctca 8160 gaccctgtct ctgaagggtt atccttctgg agagagatct ggttaagctc ccacgagtcc 8220 tggattcacg cgttgtgtca agaggctgga aacccagatc ttggagagag aacactcgag 8280 agcttcactc gccttctaga agatcctacc accttaaata tcagaggagg ggccagtcct 8340 accattctac tcaaggatgc aatcagaaag gctttatatg acgaggtgga caaggtggag 8400

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ttcttaacat ctgttgagcc tctgtttcct cgatttctca gtgagctatt cagttcgtct 8520

tttttgggaa tccccgagtc aatcattgga ttgatacaaa actcccgaac gataagaagg 85 80

cagtttagaa agagtctctc aaaaacttta gaagaatcct tctacaactc agagatccac 8640

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aaagaaggca acagatcaat cttgtgttat ctccaacatg tgctacgcta tgagcgagag 9960

ataatcacgg cgtctccaga gaatgactgg ctatggatct tttcagactt tagaagtgcc 10020

aaaatgacgt acctaaccct cattacttac cagtctcatc ttctactcca gagggttgag 10080

agaaacctat ctaagagtat gagagataac ctgcgacaat tgagttcctt gatgaggcag 10140

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gtgctgggcg ggcacggaga agatacctta gagtcagacg acaacattca acgactgcta 10200 aaagactctt tacgaaggac aagatgggtg gatcaagagg tgcgccatgc agctagaacc 10260 atgactggag attacagccc caacaagaag gtgtcccgta aggtaggatg ttcagaatgg 10320 gtctgctctg ctcaacaggt tgcagtctct acctcagcaa acccggcccc tgtctcggag 10380 cttgacataa gggccctctc taagaggttc cagaaccctt tgatctcggg cttgagagtg 10440 gttcagtggg caaccggtgc tcattataag cttaagccta ttctagatga tctcaatgtt 10500 ttcccatctc tctgccttgt agttggggac gggtcagggg ggatatcaag ggcagtcctc 10560 aacatgtttc cagatgccaa gcttgtgttc aacagtctct tagaggtgaa tgacctgatg 10620 gcttccggaa cacatccact gcctccttca gcaatcatga ggggaggaaa tgatatcgtc 10680 tccagagtga tagattttga ctcaatctgg gaaaaaccgt ccgacttgag aaacttggca 10740 acctggaaat acttccagtc agtccaaaag caggtcaaca tgtcctatga cctcattatt 10800 tgcgatgcag aagttactga cattgcatct atcaaccgga taaccctgtt aatgtccgat 10860 tttgcattgt ctatagatgg accactctat ttggtcttca aaacttatgg gactatgcta 10920 gtaaatccaa actacaaggc tattcaacac ctgtcaagag cgttcccctc ggtcacaggg 10980 tttatcaccc aagtaacttc gtctttttca tctgagctct acctccgatt ctccaaacga 11040 gggaagtttt tcagagatgc tgagtacttg acctcttcca cccttcgaga aatgagcctt 11100 gtgttattca atfcgtagcag ccccaagagt gagatgcaga gagctcgttc cttgaactat 11160 caggatcttg tgagaggatt tcctgaagaa atcatatcaa atccttacaa tgagatgatc 11220 ataactctga ttgacagtga tgtagaatct tttctagtcc acaagatggt tgatgatctt 11280 gagttacaga ggggaactct gtctaaagtg gctatcatta tagccatcat gatagttttc 11340 tccaacagag tcttcaacgt ttccaaaccc ctaactgacc ccttgttcta tccaccgtct 11400 gatcccaaaa tcctgaggca cttcaacata tgttgcagta ctatgatgta tctatctact 11460 gctttaggtg acgtccctag cttcgcaaga cttcacgacc tgtataacag acctataact 11520 tattacttca gaaagcaatt cattcgaggg aacgtttatc tatcttggag ttggtccaac 11580 gacacctcag tgttcaaaag ggtagcctgt aattctagcc tgagtctgtc atctcactgg 11640 atcaggttga tttacaagat agtgaagact accagactcg ttggcagcat caaggatcta 11700 tccagagaag tggaaagaca ccttcatagg tacaacaggt ggatcaccct agaggatatc 11760 agatctagat catccctact agactacagt tgcctgtgaa ccggàtactc ctggaagcct 11820 gcccatgcta agactcttgt gtgatgtatc ttgaaaaaaa caagatccta aatctgaacc 11880 tttggttgtt tgattgtttt tctcattttt gttgtttatt tgttaagcgt 11930

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55/137 WO 2007/047459 PCT/US2006/040134 aagtgccaaa atgacgtacc taaccctcat tacttaccag tctcatcttc tactccagag 9720 ggttgagaga aacctatcta agagtatgag agataacctg cgacaattga gttccttgat 9780 gaggcaggtg ctgggcgggc acggagaaga taccttagag tcagacgaca acattcaacg 9840 actgctaaaa gactctttac gaaggacaag atgggtggat caagaggtgc gccatgcagc 9900 tagaaccatg actggagatt acagccccaa caagaaggtg tcccgtaagg taggatgttc 9960 agaatgggtc tgctctgctc aacaggttgc agtctctacc tcagcaaacc cggcccctgt 10020 ctcggagctt gacataaggg ccctctctaa gaggttccag aaccctttga tctcgggctt 10080 gagagtggtt cagtgggcaa ccggtgctca ttataagctt aagcctattc tagatgatct 10140 caatgttttc ccatctctct gccttgtagt tggggacggg tcagggggga tatcaagggc 10200 agtcctcaac atgtttccag atgccaagct tgtgttcaac agtctcttag aggtgaatga 10260 cctgatggct tccggaacac atccactgcc tccttcagca atcatgaggg gaggaaatga 10320 tatcgtctcc agagtgatag attttgactc aatctgggaa aaaccgtccg acttgagaaa 10380 cttggcaacc tggaaatact tccagtcagt ccaaaagcag gtcaacatgt cctatgacct 10440 cattatttgc gatgcagaag ttactgacat tgcatctatc aaccggataa ccctgttaat 10500 gtccgatttt gcattgtcta tagatggacc actctatttg gtcttcaaaa cttatgggac 10560 tatgctagta aatccaaact acaaggctat tcaacacctg tcaagagcgt tcccctcggt 10620 cacagggttt atcacccaag taacttcgtc tttttcatct gagctctacc tccgattctc 10680 caaacgaggg aagtttttca gagatgctga gtacttgacc tcttccaccc ttcgagaaat 10740 gagccttgtg ttattcaatt gtagcagccc caagagtgag atgcagagag ctcgttcctt 10800 gaactatcag gatcttgtga gaggatttcc tgaagaaatc atatcaaatc cttacaatga 10860 gatgatcata actctgattg acagtgatgt agaatctttt ctagtccaca agatggttga 10920 tgatcttgag ttacagaggg gaactctgtc taaagtggct atcattatag ccatcatgat 10980 agttttctcc aacagagtct tcaacgtttc caaaccccta actgacccct tgttctatcc 11040 accgtctgat cccaaaatcc tgaggcactt caacatatgt tgcagtacta tgatgtatct 11100 atctactgct ttaggtgacg tccctagctt cgcaagactt cacgacctgt ataacagacc 11160 tataacttat tacttcagaa agcaattcat tcgagggaac gtttatctat cttggagttg 11220 gtccaacgac acctcagtgt tcaaaagggt agcctgtaat tctagcctga gtctgtcatc 11280 tcactggatc aggttgattt acaagatagt gaagactacc agactcgttg gcagcatcaa 11340 ggatctatcc agagaagtgg aaagacacct tcataggtac aacaggtgga tcaccctaga 11400 ggatatcaga' tctagatcat ccctactaga ctacagttgc ctgtgatccg gatactcctg 11460

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gttagtcgaa tccgacaagc tgagtaaaat catgcaagat gacttgaatc gctatacatc 2400 ttgctaaccg aacctctcca ctcagtccct ctagacaata aagtccgaga tgtcctaaag 2460 tcaacatgaa aaaaacaggc aacaccactg ataaaatgaa ctttctacgt aagatagtga 2520 aaaattgcag ggacgaggac actcaaaaac cctctcccgt gtcagcccct ctggatgacg 2580 atgacttgtg gcttccaccc cctgaatacg tcccgctgaa agaacttaca agcaagaaga 2640 acatgaggaa cttttgtatc aacggagggg ttaaagtgtg tagcccgaat ggttactcgt 2700 tcaggatcct gcggcacatt ctgaaatcat tcgacgagat atattctggg aatcatagga 2760 tgatcgggtt agtcaaagta gttattggac tggctttgtc aggatctcca gtccctgagg 2820 gcatgaactg ggtatacaaa ttgaggagaa cctttatctt ccagtgggct gattccaggg 2880 gccctcttga aggggaggag ttggaatact ctcaggagat cacttgggat gatgatactg 2940 agttcgtcgg attgcaaata agagtgattg caaaacagtg tcatatccag ggcagaatct 3000 ggtgtatcaa catgaacccg agagcatgtc aactatggtc tgacatgtct cttcagacac 3060 aaaggtccga agaggacaaa gattcctctc tgcttctaga ataatcagat tatatcccgc 3120 aaatttatca cttgtttacc tctggaggag agaacatatg ggctcaactc caacccttgg 3180 gagcaatata acaaaaaaca tgttatggtg ccattaaacc gctgcatttc atcaaagtca 3240 agttgattac ctttacattt tgatcctctt ggatgtgaaa aaaactatta acatccctca 3300 aaagactcaa ggaaagatgg ttcctcaggc tctcctgttt gtaccccttc tggtttttcc 3360 attgtgtttt gggaaattcc ctatttacac gataccagac aagcttggtc cctggagccc 3420 gattgacata catcacctca gctgcccaaa caatttggta gtggaggacg aaggatgcac 3480 caacctgtca gggttctcct acatggaact taaagttgga tacatcttag ccataaaaat 3540 gaacgggttc acttgcacag gcgttgtgac ggaggctgaa acctacacta acttcgttgg 3600 ttatgtcaca accacgttca aaagaaagca tttccgccca acaccagatg catgtagagc 3660 cgcgtacaac tggaagatgg ccggtgaccc cagatatgaa gagtctctac acaatccgta 3720 ccctgactac cactggcttc gaactgtaaa aaccaccaag gagtctctcg ttatcatatc 3780 tccaagtgtg gcagatttgg acccatatga cagatccctt cactcgaggg tcttccctag 3840 cgggaagtgc tcaggagtag cggtgtcttc tacctactgc tccactaacc acgattacac 3900 catttggatg cccgagaatc cgagactagg gatgtcttgt gacattttta ccaatagtag 3960 agggaagaga gcatccaaag ggagtgagac ttgcggcttt gtagatgaaa gaggcctata 4020 taagtcttta aaaggagcat gcaaactcaa gttatgtgga gttctaggac ttagacttat 4080 ggatggaaca tgggtcgcga tgcaaacatc aaatgaaacc aaatggtgcc ctcccgatca 4140

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gttggtgaac ctgcacgact ttcgctcaga cgaaattgag caccttgttg tagaggagtt 4200 ggtcaggaag agagaggagt gtctggatgc actagagtcc atcatgacaa ccaagtcagt 4260 gagtttcaga cgtctcagtc atttaagaaa acttgtccct gggtttggaa aagcatatac 4320 catattcaac aagaccttga tggaagccga tgctcactac aagtcagtca gaacttggaa 4380 tgagatcctc ccttcaaaag ggtgtttaag agttgggggg aggtgtcatc ctcatgtgaa 4440 cggggtgttt ttcaatggta taatattagg acctgacggc aatgtcttaa tcccagagat 4500 gcaatcatcc ctcctccagc aacatatgga gttgttggaa tcctcggtta tcccccttgt 4560 gcaccccctg gcagacccgt ctaccgtttt caaggacggt gacgaggctg aggattttgt 4620 tgaagttcac cttcccgatg tgcacaatca ggtctcagga gttgacttgg gtctcccgaa 4680 ctgggggaag tatgtattac tg^gtgcagg ggccctgact gccttgatgt tgataatttt 4740 cctgatgaca tgttgtagaa gagtcaatcg atcagaacct acgcaacaca atctcagagg 4800 gacagggagg gaggtgtcag tcactcccca aagcgggaag atcatatctt catgggaatc 4860 acacaagagt gggggtgaga ccagactgtg aggactggcc gtcctttcaa ctatccaagt 4920 cctgaagatc acctcccctt ggggggttca tcatgaaaaa aactaacacc cctcctttcg 4980 ctgcaggatg gttcctcagg ctctcctgtt tgtacccctt ctggtttttc cattgtgttt 5040 tgggaaattc cctatttaca cgataccaga caagcttggt ccctggagcc cgattgacat 5100 acatcacctc agctgcccaa acaatttggt agtggaggac gaaggatgca ccaacctgtc 5160 agggttctcc tacatggaac ttaaagttgg atacatctta gccataaaaa tgaacgggtt 5220 cacttgcaca ggcgttgtga cggaggctga aacctacact aacttcgttg gttatgtcac 5280 aaccacgttc aaaagaaagc atttccgccc aacaccagat gcatgtagag ccgcgtacaa 5340 ctggaagatg gccggtgacc ccagatatga agagtctcta cacaatccgt accctgacta 5400 ccactggctt cgaactgtaa aaaccaccaa ggagtctctc gttatcatat ctccaagtgt 5460 ggcagatttg gacccatatg acagatccct tcactcgagg gtcttcccta gcgggaagtg 5520 ctcaggagta gcggtgtctt ctacctactg ctccactaac cacgattaca ccatttggat 5580 gcccgagaat ccgagactag ggatgtcttg tgacattttt accaatagta gagggaagag 5640 agcatccaaa gggagtgaga cttgcggctt tgtagatgaa agaggcctat ataagtcttt 5700 aaaaggagca tgcaaactca agttatgtgg agttctagga cttagactta tggatggaac 5760 atgggtcgcg atgcaaacat caaatgaaac caaatggtgc cctcccgatc agttggtgaa 5820 cctgcacgac tttcgctcag acgaaattga gcaccttgtt gtagaggagt tggtcaggaa 5880

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gagagaggag tgtctggatg cactagagtc catcatgaca accaagtcag tgagtttcag 5940 acgtctcagt catttaagaa aacttgtccc tgggtttgga aaagcatata ccatattcaa 6000 caagaccttg atggaagccg atgctcacta caagtcagtc agaacttgga atgagatcct 6060 cccttcaaaa gggtgtttaa gagttggggg gaggtgtcat cctcatgtga acggggtgtt 6120 tttcaatggt ataatattag gacctgacgg caatgtctta atcccagaga tgcaatcatc 6180 cctcctccag caacatatgg agttgttgga atcctcggtt atcccccttg tgcaccccct 6240 ggcagacccg tctaccgttt tcaaggacgg tgacgaggct gaggattttg ttgaagttca 6300 ccttcccgat gtgcacaatc aggtctcagg agttgacttg ggtctcccga actgggggaa 6360 gtatgtatta ctgagtgcag gggccctgac tgccttgatg ttgataattt . tcctgatgac 6420 atgttgtaga agagtcaatc gatcagaacc tacgcaacac aatctcagag ggacagggag 6480 ggaggtgtca gtcactcccc aaagcgggaa gatcatatct tcatgggaat cacacaagag 6540 tgggggtgag accagactgt gaggtaccgt cgagaaaaaa acattagatc agaagaacaa 6600 ctggcaacac ttctcaacct gagacctact tcaagatgct cgatcctgga gaggtctatg 6660 atgaccctat tgacccaatc gagttagagg atgaacccag aggaaccccc actgtcccca 6720 acatcttgag gaactctgac tacaatctca actctccttt gatagaagat cctgctagac 6780 taatgttaga atggttaaaa acagggaata gaccttatcg gatgactcta acagacaatt 6840 gctccaggtc tttcagagtt ttgaaagatt atttcaagaa ggtagatttg ggttctctca 6900 aggtgggcgg aatggctgca cagtcaatga tttctctctg gttatatggt gcccactctg 6960 aatccaacag gagccggaga tgtataacag acttggccca tttctattcc aagtcgtccc 7020 ccatagagaa gctgttgaat ctcacgctag gaaatagagg gctgagaatc cccccagagg 7080 gagtgttaag ttgccttgag agggttgatt atgataatgc atttggaagg tatcttgcca 7140 acacgtattc ctcttacttg ttcttccatg taatcacctt atacatgaac gccctagact 7200 gggatgaaga aaagaccatc ctagcattat ggaaagattt aacctcagtg gacatcggga 7260 aggacttggt aaagttcaaa gaccaaatat ggggactgct gatcgtgaca aaggactttg 7320 tttactccca aagttccaat tgtctttttg acagaaacta cacacttatg ctaaaagatc 7380 ttttcttgtc tcgcttcaac tccttaatgg tcttgctctc tcccccagag ccccgatact 7440 cagatgactt gatatctcaa ctatgccagc tgtacattgc tggggatcaa gtcttgtcta 7500 tgtgtggaaa ctccggctat gaagtcatca aaatattgga gccatatgtc gtgaatagtt 7560 tagtccagag agcagaaaag tttaggcctc tcattcattc cttgggagac tttcctgtat 7620 ttataaaaga caaggtaagt caacttgaag agacgttcgg tccctgtgca agaaggttct 7680

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ttagggctct ggatcaattc gacaacatac atgacttggt ttttgtgtat ggctgttaca 7740 ggcattgggg gcacccatat atagattatc gaaagggtct gtcaaaacta tatgatcagg 7800 ttcacattaa aaaagtgata gataagtcct accaggagtg cttagcaagc gacctagcca 7860 ggaggatcct tagatggggt tttgataagt actccaagtg gtatctggat tcaagattcc 7920 tagcccgaga ccaccccttg actccttata tcaaaaccca aacatggcca cccaaacata 7980 ttgtagactt ggtgggggat acatggcaca agctcccgat cacgcagatc tttgagattc 8040 ctgaatcaat ggatccgtca gaaatattgg atgacaaatc acattctttc accagaacga 8100 gactagcttc ttggctgtca gaaaaccgag ggggacctgt tcctagcgaa aaagttatta 8160 tcacggccct gtctaagccg cctgtcaatc cccgagagtt tctgaggtct atagacctcg 8220 gaggattgcc agatgaagac ttgataattg gcctcaagcc aaaggaacgg gaattgaaga 8280 ttgaaggtcg attctttgct ctaatgtcat ggaatctaag attgtatttt gtcatcactg 8340 aaaaactctt ggccaactac atcttgccac tttttgacgc gctgactatg acagacaacc 8400 tgaacaaggt gtttaaaaag ctgatcgaca gggtcaccgg gcaagggctt ttggactatt 8460 caagggtcac atatgcattt cacctggact atgaaaagtg gaacaaccat caaagattag 8520 agtcaacaga ggatgtattt tctgtcctag atcaagtgtt tggattgaag agagtgtttt 8580 ctagaacaca cgagtttttt caaaaggcct ggatctatta ttcagacaga tcagacctca 8640 tcgggttacg ggaggatcaa atatactgct tagatgcgtc caacggccca acctgttgga 8700 atggccagga tggcgggcta gaaggcttac ggcagaaggg ctggagtcta gtcagcttat 8760 tgatgataga tagagaatct caaatcagga acacaagaac caaaatacta gctcaaggag 8820 acaaccaggt tttatgtccg acatatatgt tgtcgccagg gctatctcaa gaggggctcc 8880 tctatgaatt ggagagaata tcaaggaatg cactttcgat atacagagcc gtcgaggaag 8940 gggcatctaa gctagggctg atcatcaaga aagaagagac catgtgtagt tatgacttcc 9000 tcatctatgg aaaaacccct ttgtttagag gtaacatatt ggtgcctgag tccaaaagat 9060 gggccagagt ctcttgcgtc tctaatgacc aaatagtcaa cctcgccaat ataatgtcga 9120 cagtgtccac caatgcgcta acagtggcac aacactctca atctttgatc aaaccgatga 9180 gggattttct gctcatgtca gtacaggcag tctttcacta cctgctattt agcccaatct 9240 taaagggaag agtttacaag attctgagcg ctgaagggga tagctttctc ctagccatgt 9300 caaggataat ctatctagat ccttctttgg gaggggtatc tggaatgtcc ctcggaagat 9360 tccatatacg acagttctca gaccctgtct ctgaagggtt atccttctgg agagagatct 9420

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ggttaagctc ccacgagtcc tggattcacg cgttgtgtca agaggctgga aacccagatc 9480 ttggagagag aacactcgag agcttcactc gccttctaga agatcctacc accttaaata 9540 tcagaggagg ggccagtcct accattctac tcaaggatgc aatcagaaag gctttatatg 9600 acgaggtgga caaggtggag aattcagagt ttcgagaggc aatcctgttg tccaagaccc 9660 atagagataa ttttatactc ttcttaacat ctgttgagcc tctgtttcct cgatttctca 9720 gtgagctatt cagttcgtct tttttgggaa tccccgagtc aatcattgga ttgatacaaa 9780 actcccgaac gataagaagg cagtttagaa agagtctctc aaaaacttta gaagaatcct 9840 tctacaactc agagatccac gggattagtc ggatgaccca gacacctcag agggttgggg 9900 gggtgtggcc ttgctcttca gagagggcag atctacttag ggagatctct tggggaagaa 9960 aagtggtagg cacgacagtt cctcaccctt ctgagatgtt ggggttactt cccaagtcct 10020 ctatttcttg cacttgtgga gcaacaggag gaggcaatcc tagagtttct gtatcagtac 10080 tcccgtcctt tgatcagtca tttttttcac gaggccccct aaaggggtac ttgggctcgt 10140 ccacctctat gtcgacccag ctattccatg catgggaaaa agtcactaat gttcatgtgg 10200 tgaagagagc tctatcgtta aaagaatcta taaactggtt cattactaga gattccaact 10260 tggctcaagc tctaattagg aacattatgt ctctgacagg ccctgatttc cctctagagg 10320 aggcccctgt cttcaaaagg acggggtcag ccttgcatag gttcaagtct gccagataca 10380 gcgaaggagg gtattcttct gtctgcccga acctcctctc tcatatttct gttagtacag 10440 acaccatgtc tgatttgacc caagacggga agaactacga tttcatgttc cagccattga 10500 tgctttatgc acagacatgg acatcagagc tggtacagag agacacaagg ctaagagact 10560 ctacgtttca ttggcacctc cgatgcaaca ggtgtgtgag acccattgac gacgtgaccc 10620 tggagacctc tcagatcttc gagtttccjgg atgtgtcgaa aagaatatcc agaatggttt 10680 ctggggctgt gcctcacttc cagaggcttc ccgatatccg tctgagacca ggagattttg 10740 aatctctaag cggtagagaa aagtctcacc atatcggatc agctcagggg ctcttatact 10800 caatcttagt ggcaattcac gactcaggat acaatgatgg aaccatcttc cctgtcaaca 10860 tatacgacaa ggtttcccct agagactatt tgagagggct cgcaagggga gtattgatag 10920 gatcctcgat ttgcttcttg acaagaatga caaatatcaa tattaataga cctcttgaat 10980 tgatctcagg ggtaatctca tatattctcc tgaggctaga taaccatccc tccttgtaca 11040 taatgctcag agaaccgtct cttagaggag agatattttc tatccctcag aaaatccccg 11100 ccgcttatcc aacc.actatg aaagaaggca acagatcaat cttgtgttat ctccaacatg 11160 tgctacgcta tgagcgagag ataatcacgg cgtctccaga gaatgactgg ctatggatct 11220

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tttcagactt tagaagtgcc aaaatgacgt acctaaccct cattacttac cagtctcatc 11280

ttctactcca gagggttgag agaaacctat ctaagagtat gagagataac ctgcgacaat 11340

tgagttcctt gatgaggcag gtgctgggcg ggcacggaga agatacctta gagtcagacg 11400

acaacattca acgactgcta aaagactctt tacgaaggac aagatgggtg gatcaagagg 114 60

tgcgccatgc agctagaacc atgactggag attacagccc caacaagaag gtgtcccgta 11520

aggtaggatg ttcagaatgg gtctgctctg ctcaacaggt tgcagtctct acctcagcaa 11580

acccggcccc tgtctcggag cttgacataa gggccctctc taagaggttc cagaaccctt 11640

tgatctcggg cttgagagtg gttcagtggg caaccggtgc tcattataag cttaagccta 11700

ttctagatga tctcaatgtt ttcccatctc tctgccttgt agttggggac gggtcagggg 11760

ggatatcaag ggcagtcctc aacatgtttc cagatgccaa gcttgtgttc aacagtctct 1182 0

tagaggtgaa tgaactgatg gcfctccggaa cacatccact gcctccttca gcaatcatga 11880

ggggaggaaa tgatatcgtc tccagagtga tagattttga ctcaatctgg gaaaaaccgt 11940

ccgacttgag aaacttggca acctggaaat acttccagtc agtccaaaag caggtcaaca 12000

tgtcctatga cctcattatt tgcgatgcag aagttactga cattgcatct atcaaccgga 12060

taaccctgtt aatgtccgat tttgcattgt ctatagatgg accactctat ttggtcttca 12120

aaacttatgg gactatgcta gtaaatccaa actacaaggc tattcaacac ctgfccaagag 12180

cgttcccctc ggtcacaggg tttatcaccc aagtaacttc gtctttttca tctgagctct 12240

acctccgatt ctccaaacga gggaagtttt tcagagatgc tgagtacttg acctcttcca 12300

cccttcgága aatgagcctt gtgttattca attgtagcag ccccaagagt gagatgcaga 12360

gagctcgttc cttgaactat caggatcttg tgagaggatt tcctgaagaa atcatatcaa 1242 0

atccttacaa tgagatgatc ataactctga ttgacagtga tgtagaatct tttctagtcc 124 8 0 acaagatggt tgatgatctt gagttacaga ggggaactct gtctaaagtg gctatcatta 12540 tagccatcat gatagttttc tccaacagag tcttcaacgt ttccaaaccc ctaactgacc 12600 ccttgttcta tccaccgtct gatcccaaaa tcctgaggca cttcaacata tgttgcagta 12660 ctatgatgta tctatctact gctttaggtg acgtccctag cttcgcaaga Gttcacgacc 12720 tgtataacag acctataact tattacttca gaaagcaatt cattcgaggg aacgtttatc 12780 tatcttggag ttggtccaac gacacctcag tgttcaaaag ggtagectgt aattctagcc 12840 tgagtctgtc atctcactgg atcaggttga tttacaagat agtgaagact accagactcg 12 900 ttggcagcat caaggatcta tccagagaag tggaaagaca ccttcatagg tacaacaggt 12960

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ggatcaccct agaggatatc agatctagat catccctact agactacagt tgcctgtgat 13 02 0

ccggatactc ctggaagcct gcccatgcta agactcttgt gtgatgtatc ttgaaaaaaa 13080

caagatccta aatctgaacc tttggttgtt tgattgtttt tctcattttt gttgtttat.t 13140

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acgcttaaca accagatcaa agaaaaaaca gacattgtca attgcaaagc aaaaatgtaa 60 cacccctaca atggatgccg acaagattgt attcaaagtc aataatcagg tggtctcttt 120 gaagcctgag attatcgtgg atcaacatga gtacaagtac cctgccatca aagatttgaa 180 aaagccctgt ataaccctag gaaaggctcc cgatttaaat aaagcataca agtcagtttt 240 gtcaggcatg agcgccgcca aacttgatcc tgacgatgta tgttcctatt tggcagcggc 300 aatgcagttt tttgagggga catgtccgga agactggacc agctatggaa tcgtgattgc 360 acgaaaagga gataagatca ccccaggttc tctggtggag ataaaacgta ctgatgtaga 420 agggaattgg gctctgacag gaggcatgga actgacaaga gaccccactg tccctgagca 480

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tgcgtcctta gtcggtcttc tcttgagtct gtataggttg agcaaaatat ccgggcaaaa 540 cactggtaac tataagacaa acattgcaga caggatagag cagatttttg agacagcccc 600 ttttgttaaa atcgtggaac accatactct aatgacaact cacaaaatgt gtgctaattg 660 gagtactata ccaaacttca gatttttggc cggaacctat gacatgtttt tctcccggat 720 tgagcatcta tattcagcaa tcagagtggg cacagttgtc actgcttatg aagactgttc 780 aggactggta tcatttactg ggttcataaa acaaatcaat ctcaccgcta gagaggcaat 840 actatatttc ttccacaaga actttgagga agagataaga agaatgtttg agccagggca 900 ggagacagct gttcctcact cttatttcat ccacttccgt tcactaggct tgagtgggaa 960 atctccttat tcatcaaatg ctgttggtca cgtgttcaat ctcattcact ttgtaggatg 1020 ctatatgggt caagtcagat ccctaaatgc aacggttatt gctgcatgtg ctcctcatga 1080 aatgtctgtt ctagggggct atctgggaga ggaattcttc gggaaaggga catttgaaag 1140 aagattcttc agagatgaga aagaacttca agaatacgag gcggctgaac tgacaaagac 1200 tgacgtagca ctggcagatg atggaactgt caactctgac gacgaggact acttctcagg 1260 tgaaaccaga agtccggagg ctgtttatac tcgaatcatg atgaatggag gtcgactaaa 1320 gagatctcac atacggagat atgtctcagt cagttccaat catcaagccc gtccaaactc 1380 attcgccgag tttctaaaca agacatattc gagtgactca taagaagttg aataacaaaa 1440 tgccggaaat ctacggattg tgtatatcca tcatgaaaaa aactaacacc cctcctttcg 1500 aaccatccca aacatgagca agatctttgt caatcctagt gctattagag ccggtctggc 1560 cgatcttgag atggctgaag aaactgttga tctgatcaat agaaatatcg aagacaatca 1620 ggctcatctc caaggggaac ccatagaagt ggacaatctc cctgaggata tggggcgact 1680 tcacctggat gatggaaaat cgcccaaccc tggtgagatg gccaaggtgg gagaaggcaa 1740 gtatcgagag gactttcaga tggatgaagg agaggatcct agcttcctgt tccagtcata 1800 cctggaaaat gttggagtcc aaatagtcag acaaatgagg tcaggagaga gatttctcaa 1860 gatatggtca cagaccgtag aagagattat atcctatgtc gcggtcaact ttcccaaccc 1920 tccaggaaag tcttcagagg ataaatcaac ccagactact ggccgagagc tcaagaagga 1980 gacaacaccc actccttctc agagagaaag ccaatcatcg aaagccagga tggcggctca 2040 aattgcttct ggccctccag cccttgaatg gtcggccacc aatgaagagg atgatctatc 2100 agtggaggct gagatcgctc accagattgc agaaagtttc tccaaaaaat ataagtttcc 2160 ctctcgatcc tcagggatac tcttgtataa ttttgagcaa ttgaaaatga accttgatga 2220 tatagttaaa gaggcaaaaa atgtaccagg tgtgacccgt ttagcccatg acgggtccaa 2280

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actcccccta agatgtgtac tgggatgggt cgctttggcc aactctaaga aattccagtt 2340

gttagtcgaa tccgacaagc tgagtaaaab catgcaagat gacttgaatc gctatacatc 2400

ttgctaaccg aacctctcca ctcagtccct ctagacaata aagtccgaga tgtcctaaag 2460

tcaacatgaa aaaaacaggc aacaccactg ataaaatgaa ctttctacgt aagatagtga 2520

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atgacttgtg gcttccaccc cctgaatacg tcccgctgaa agaacttaca agcaagaaga 2640

acatgaggaa cttttgtatc aacggagggg ttaaagtgtg tagcccgaat ggttactcgt 2700

tcaggatcct gcggcacatt ctgaaatcat tcgacgagat atattctggg aatcatagga 2760

tgatcgggtt agtcaaagta gttattggac tggctttgtc aggatctcca gtccctgagg 2 820

gcatgaactg ggtatacaaa ttgaggagaa cctttatctt ccagtgggct gattccaggg 2 880

gccctcttga aggggaggag ttggaatact ctcaggagat cacttgggat gatgatactg 2940

agttcgtcgg attgcaaata agagtgattg caaaacagtg tcatatccag ggcagaatct 3000

ggtgtatcaa catgaacccg agagcatgtc aactatggtc tgacatgtct cttcagacac 3060

aaaggtccga agaggacaaa gattcctctc tgcttctaga ataatcagat tatatcccgc 3120

aaatttatca cttgtttacc tctggaggag agaacatatg ggctcaactc caacccttgg 3180

gagcaatata acaaaaaaca tgttatggtg ccattaaacc gctgcatttc atcaaagtca 3240

agttgattac ctttacattt tgatcctctt ggatgtgaaa aaaactatta acatccctca 3300

aaagactcaa ggaaagatgg ttcctcaggc tctcctgttt gtaccccttc tggtttttcc 3360

attgtgtttt gggaaattcc ctatttacac gataccagac aagcttggtc cctggagccc 3420

gattgacata catcacctca gctgcccaaa caatttggta gtggaggacg aaggatgcac 3480

caacctgtca gggttctcct acatggaact taaagttgga tacatcttag ccataaaaat 3540

gaacgggttc acttgcacag gcgttgtgac ggaggctgaa acctacacta acttcgttgg 3600

ttatgtcaca accacgttca aaagaaagca tttccgccca acaccagatg catgtagagc 3660

cgcgtacaac tggaagatgg ccggtgaccc cagatatgaa gagtctctac acaatccgta 3 72 0

ccctgactac cactggcttc gaactgtaaa aaccaccaag gagtctctcg ttatcatatc 378 0

tccaagtgtg gcagatttgg acccatatga cagatccctt cactcgaggg tcttccctag 3840

cgggaagtgc tcaggagtag cggtgtcttc tacctactgc tccactaacc acgattacac 3900

catttggatg cccgagaatc cgagactagg gatgtcttgt gacattttta ccaatagtag 3960

agggaagaga gcatccaaag ggagtgagac ttgcggcttt gtagatgaaa gaggcctata 402 0

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taagtcttta aaaggagcat gcaaactcaa gttatgtgga gttctaggac ttagacttat 4080

ggatggaaca tgggtcgcga tgcaaacatc aaatgaaacc aaatggtgcc ctcccgatca 4140

gttggtgaac ctgcacgact ttcgdtcaga cgaaattgag caccttgttg tagaggagtt 4200

ggtcaggaag agagaggagt gtctggatgc actagagtcc atcatgacaa ccaagtcagt 4260

gagtttcaga cgtctcagtc atttaagaaa acttgtccct gggtttggaa aagcatatac 4320

catattcaac aagaccttga tggaagccga tgctcactac aagtcagtca gaacttggaa 4380

tgagatcctc ccttcaaaag ggtgtttaag agttgggggg aggtgtcatc ctcatgtgaa 4440

cggggtgttt ttcaatggta taatattagg acctgacggc aatgtcttaa tcccagagat 4500

gcaatcatcc ctcctccagc aacatatgga gttgttggaa tcctcggtta tcccccttgt 4560

gcaccccctg gcagacccgt ctaccgtttt caaggacggt gacgaggctg aggattttgt 4620

tgaagfctcac cttcccgatg tgcacaatca ggtctcagga gttgacttgg gtctcccgaa 4680

ctgggggaag tatgtattac tgagtgcagg ggccctgact gccttgatgt tgataatttt 4740

cctgatgaca tgttgtagaa gagtcaatcg atcagaacct acgcaacaca atctcagagg 4800

gacagggagg gaggtgtcag tcactcccca aagcgggaag atcatatctt catgggaatc 4860

acacaagagt gggggtgaga ccagactgtg aggactggcc gtcctttcaa ctatccaagt 4920

cctgaagatc acctcccctt ggggggttca tcatgaaaaa aactaacacc cctcctttcg 4980

ctgcaggcca ccatgggcgt gatcaagccc gacatgaaga tcaagctgcg gatggagggc 5040

gccgtgaacg gccacaaatt cgtgatcgag ggcgacggga aaggcaagcc ctttgagggt 5100

aagcagacta tggacctgac cgtgatcgag ggcgcccccc tgcccttcgc ttatgacatt 5160 ctcaccaccg tgttcgacta cggtaaccgt gtcttcgcca agtaccccaa ggacatccct gactacttca agcagacctt ccccgagggc tactcgtggg agcgaagcat gacatacgag gaccagggaa tctgtatcgc tacaaacgac atcaccatga tgaagggtgt ggacgactgc ttcgtgtaca aaatccgctt cgacggggtc aacttccctg ctaatggccc ggtgatgcag cgcaagaccc taaagtggga gcccagtacc gagaagatgt acgtgcggga cggcgtactg

aagggcgatg ttaatatggc actgctcttg gagggaggcg gccactaccg ctgcgacttc 5520

aagaccacct acaaagccaa gaaggtggtg cagcttcccg actaccactt cgtggaccac 5580

cgcatcgaga tcgtgàgcca cgacaaggac tacaacaaag tcaagctgta cgagcacgcc 5640

gaagcccaca gcggactacc ccgccaggcc ggctaatagg taccgtcgag aaaaaaacat 5700

tagatcagaa gaacaactgg caacacttct caacctgaga cctacttcaa gatgctcgat 5760 cctggagagg tctatgatga ccctattgac ccaatcgagt tagaggatga acccagagga

5220 5280 5340 5400 5460

5820

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acccccactg tccccaacat cttgaggaac tctgactaca atctcaactc tcctttgata 5880 gaagatcctg ctagactaat gttagaatgg ttaaaaacag ggaatagacc ttatcggatg 5940 actctaacag acaattgctc caggtctttc agagttttga aagattattt caagaaggta 6000 gatttgggtt ctctcaaggt gggcggaatg gctgcacagt caatgatttc tctctggtta 6060 tatggtgccc actctgaatc caacaggagc cggagatgta taacagactt ggcccatttc 6120 tattccaagt cgtcccccat agagaagctg ttgaatctca cgctaggaaa tagagggctg 6180 agaatccccc cagagggagt gttaagttgc cttgagaggg ttgattatga taatgcattt 6240 ggaaggtatc ttgccaacac gtattcctct tacttgttct tccatgtaat caccttatac 6300 atgaacgccc tagactggga tgaagaaaag accatcctag cattatggaa agatttaacc 6360 tcagtggaca tcgggaagga cttggtaaag ttcaaagacc aaatatgggg actgctgatc 6420 gtgacaaagg actttgttta ctcccaaagt tccaattgtc tttttgacag aaactacaca 6480 cttatgctaa aagatctttt cttgtctcgc ttcaactcct taatggtctt gctctctccc 6540 ccagagcccc gatactcaga tgacttgata tctcaactat gccagctgta cattgctggg 6600 gatcaagtct tgtctatgtg tggaaactcc ggctatgaag tcatcaaaat attggagcca 6660 tatgtcgtga atagtttagt ccagagagca gaaaagttta ggcctctcat tcattccttg 6720 ggagactttc ctgtatttat aaaagacaag gtaagtcaac ttgaagagac gttcggtccc 6780 tgtgcaagaa ggttctttag ggctctggat caattcgaca acatacatga cttggttttt 6840 gtgtatggct gttacaggca ttgggggcac ccatatatag attatcgaaa gggtctgtca 6900 aaactatatg atcaggttca cattaaaaaa gtgatagata agtcctacca ggagtgctta 6960 gcaagcgacc tagccaggag gatccttaga tggggttttg ataagtactc caagtggtat 7020 Gtggattcaa gattcctagc ccgagaccac cccttgactc cttatatcaa aacccaaaca 7080 tggccaccca aacatattgt agacttggtg ggggatacat ggcacaagct cccgatcacg 7140 cagatctttg agattcctga atcaatggat ccgtcagaaa tattggatga caaatcacat 7200 tctttcacca gaacgagact agcttcttgg ctgtcagaaa accgaggggg acctgttcct 7260 agcgaaaaag ttattatcac ggccctgtct aagccgcctg tcaatccccg agagtttctg 7320 aggtctatag acctcggagg attgccagat gaagacttga taattggcct caagccaaag 7380 gaacgggaat tgaagattga aggtcgattc tttgctctaa tgtcatggaa tctaagattg 7440 tattttgtca tcactgaaaa actcttggcc aactacatct tgccactttt tgacgcgctg 7500 actatgacag acaacctgaa caaggtgttt aaaaagctga tcgacagggt caccgggcaa 7560

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7740 7800

gggcttttgg actattcaag ggtcacatat gcatttcacc tggactatga aaagtggaac 7620

aaccatcaaa gattagagtc aacagaggat gtattttctg tcctagatca agtgtttgga 7680 ttgaagagag tgttttctag aacacacgag ttttttcaaa aggcctggat ctattattca gacagatcag accCcatcgg gttacgggag gatcaaatat actgcttaga tgcgtccaac

ggcccaacct gttggaatgg ccaggatggc gggctagaag gcttacggca gaagggctgg 7860

agtctagtca gcttattgat gatagataga gaatctcaaa tcaggaacac aagaaccaaa 7920

atactagctc aaggagacaa ccaggtttta tgtccgacat atatgttgtc gccagggcta 7980

tctcaagagg ggctcctcta tgaattggag agaatatcaa ggaatgcact ttcgatatac 8040

agagccgtcg aggaaggggc atctaagcta gggctgatca tcaagaaaga agagaccatg 8100

tgtagttatg acttcctcat ctatggaaaa acccctttgt ttagaggtaa catattggtg 8160

cctgagtcca aaagatgggc cagagtctct tgcgtctcta atgaccaaat agtcaacctc 8220

gccaatataa tgtcgacagt gtccaccaat gcgctaacag tggcacaaca ctctcaatct 82 8 0

ttgatcaaac cgatgaggga ttttctgctc atgtcagtac aggcagtctt tcactacctg 8340

ctatttagcc caatcttaaa gggaagagtt fcacaagattc tgagcgctga aggggatagc 8400

tttctcctag ccatgtcaag gataatctat ctagatcctt ctttgggagg ggtatctgga 8460

atgtccctcg gaagattcca tatacgacag ttctcagacc ctgtctctga agggttatcc 8520

ttctggagag agatctggtt aagctcccac gagtcctgga ttcacgcgtt gtgtcaagag 8580

gctggaaacc cagatcttgg agagagaaca ctcgagagct tcactcgcct tctagaagat 8640

cctaccacct taaatatcag aggaggggcc agtcctacca ttctactcaa ggafcgcaatc 8700

agaaaggctt tatatgacga ggtggacaag gtggagaatt cagagtttcg agaggcaatc 8760

ctgttgtcca agacccatag agataatttt atactcttct taacatctgt tgagcctctg 8820

tttcctcgat ttctcagtga gctattcagt tcgtcttttt tgggaatccc cgagtcaatc 8 880

attggattga tacaaaactc ccgaacgata agaaggcagt ttagaaagag tctctcaaaa 8940

actttagaag aatccttcta caactcagag atccacggga ttagtcggat gacccagaca 9000

cctcagaggg ttgggggggt gtggccttgc tcttcagaga gggcagatct acttagggag 9060

atctcttggg gaagaaaagt ggtaggcacg acagttcctc acccttctga gatgttgggg 9120

ttacttccca agtcctctat ttcttgcact tgtggagcaa caggaggagg caatcctaga 9180 gtttctgtat cagtactccc gtcctttgat cagfccatttt tttcacgagg ccccctaaag 9240 gggtacttgg gctcgtccac ctctatgtcg acccagctat tccatgcatg ggaaaaagtc 9300 actaatgttc atgtggtgaa gagagctcta tcgttaaaag aatctataaa ctggttcatt 9360

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actagagatt ccaacttggc tcaagctcta attaggaaca ttatgtctct gacaggccct 9420 gatttccctc tagaggaggc ccctgtcttc aaaaggacgg ggtcagcctt gcataggttc 9480 aagtctgcca gatacagcga aggagggtat tcttctgtct gcccgaacct cctctctcat 9540 atttctgtta gtacagacac catgtctgat ttgacccaag acgggaagaa ctacgatttc 9600 atgttccagc cattgatgct ttatgcacag acatggacat cagagctggt acagagagac 9660 acaaggctaa gagactctac gtttcattgg cacctccgat gcaacaggtg tgtgagaccc 9720 attgacgacg tgaccctgga gacctctcag atcttcgagt ttccggatgt gtcgaaaaga 9780 atatccagaa tggtttctgg ggctgtgcct cacttccaga ggcttcccga tatccgtctg 9840 agaccaggag attttgaatc tctaagcggt agagaaaagt ctcaccatat cggatcagct 9900 caggggctct tatactcaat cttagtggca attcacgact caggatacaa tgatggaacc 9960 atcttccctg tcaacatata cgacaaggtt tcccctagag actatttgag agggctcgca 10020 aggggagtat tgataggatc ctcgatttgc ttcttgacaa gaatgacaaa tatcaatatt 10080 aatagacctc ttgaattgat ctcaggggta atctcatata ttctcctgag gctagataac 10140 catccctcct tgtacataat gctcagagaa ccgtctctta gaggagagat attttctatc 10200 cctcagaaaa tccccgccgc ttatccaacc actatgaaag aaggcaacag atcaatcttg 10260 tgttatctcc aacatgtgct acgctatgag cgagagataa tcacggcgtc tccagagaat 10320 gactggctat ggatcttttc agactttaga agtgccaaaa tgacgtacct aaccctcatt 10380 acttaccagt ctcatcttct actccagagg gttgagagaa acctatctaa gagtatgaga 10440 gataacctgc gacaattgag ttccttgatg aggcaggtgc tgggcgggca cggagaagat 10500 accttagagt cagacgacaa cattcaacga ctgctaaaag actctttacg aaggacaaga 10560 tgggtggatc aagaggtgcg ccatgcagct agaaccatga ctggagatta cagccccaac 10620 aagaaggtgt cccgtaaggt aggatgttca gaatgggtct gctctgctca acaggttgca 10680 gtctctacct cagcaaaccc ggcccctgtc tcggagcttg acataagggc cctctctaag 10740 aggttccaga accctttgat ctcgggcttg agagtggttc agtgggcaac cggtgctcat 10800 tataagctta agcctattct agatgatctc aatgttttcc catctctctg ccttgtagtt 10860 ggggacgggt caggggggat atcaagggca gtcctcaaca tgtttccaga tgccaagctt 10920 gtgttcaaca gtctcttaga ggtgaatgac ctgatggctt ccggaacaca tccactgcct 10980 ccttcagcaa tcatgagggg aggaaatgat atcgtctcca gagtgataga ttttgactca 11040 atctgggaaa aaccgtccga cttgagaaac ttggcaacct ggaaatactt ccagtcagtc 11100

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caaaagcagg tcaacatgtc ctatgacctc attatttgcg atgcagaagt tactgacatt gcatctatca accggataac cctgttaatg tccgattttg cattgtctat agatggacca ctctatttgg tcttcaaaac ttatgggact atgctagtaa atccaaacta caaggctatt caacacctgt caagagcgtt cccctcggtc acagggttta tcacccaagt aacttcgtct ttttcatetg agctctacct ccgattctcc aaacgaggga agtttttcag agatgctgag tacttgacct cttccaccct tcgagaaatg agccttgtgt tattcaattg tagcagcccc aagagtgaga tgcagagagc tcgttccttg aactatcagg atcttgtgag aggatttcct gaagaaatca tatcaaatcc ttacaatgag atgatcataa ctctgattga cagtgatgta gaatcttttc tagtccacaa gatggttgat gatcttgagt tacagagggg aactctgtct aaagtggcta tcattatagc catcatgata gttttctcca acagagtctt caacgtttcc aaacccctaa ctgacccctt gttctatcca ccgtctgatc ccaaaatcct gaggcacttc aacatatgtt gcagtactat gatgtatcta tctactgctt taggtgacgt ccctagcttc gcaagacttc acgacctgta taacagacct ataacttatt acttcagaaa gcaattcatt cgagggaacg tttatctatc ttggagttgg tccaacgaca cctcagtgtt caaaagggta gcctgtaatt ctagcctgag tctgtcatct cactggatca ggttgattta caagatagtg aagactacca gactcgttgg cagcatcaag gatctatcca gagaagtgga aagacacctt cataggtaca acaggtggat caccctagag gatatcagat ctagatcatc cctactagac tacagttgcc tgtgatccgg atactcctgg aagcctgccc atgctaagac tcttgtgtga tgtatcttga aaaaaacaag atcctaaatc tgaacctttg gttgtttgat tgtttttctc 12240 atttttgttg tttatttgtt aagcgt 12266

<21Q> 12

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<212 > DNA

<213 > artificial sequence <220>

<223> Recombinant ERA-G rabies virus

<220>

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<220>

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<220>

72/137

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<221> raisc_feature

<222> (2496) .. (3101)

<220>

<2 21> misc_feature

<222> (3774)..(10154)

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acgcttaaca accagatcaa agaaaaaaca gacattgtca attgcaaagc aaaaatgtaa 60 cacccctaca atggatgccg acaagattgt attcaaagtc aataatcagg tggtctcttt 120 gaagcctgag attatcgtgg atcaacatga gtacaagtac cctgccatca aagatttgaa 180 aaagccctgt ataaccctag gaaaggctcc cgatttaaat aaagcataca agtcagtttt 240 gtcaggcatg agcgccgcca aacttgatcc tgacgatgta tgttcctatt tggcagcggc 300 aatgcagttt tttgagggga catgtccgga agactggacc agctatggaa tcgtgattgc 360 acgaaaagga gataagatca ccccaggttc tctggtggag ataaaacgta ctgatgtaga 420 agggaattgg gctctgacag gaggcatgga actgacaaga gaccccactg tccctgagca 480 tgcgtcctta gtcggtcttc tcttgagtct gtataggttg agcaaaatat ccgggcaaaa 540 cactggtaac tataagacaa acattgcaga caggatagag cagatttttg agacagcccc 600 ttttgttaaa atcgtggaac accatactct aatgacaact cacaaaatgt gtgctaattg 660 gagtactata ccaaacttca gatttttggc cggaacctat gacatgtttt tctcccggat 720 tgagcatcta tattcagcaa tcagagtggg cacagttgtc actgcttatg aagactgttc 780 aggactggta tcatttactg ggttcataaa acaaatcaat' ctcaccgcta gagaggcaat 840 actatatttc ttccacaaga actttgagga agagataaga agaatgtttg agccagggca 900 ggagacagct gttcctcact cttatttcat ccacttccgt tcactaggct tgagtgggaa 960 atctccttat tcatcaaatg Ctgttggtca cgtgttcaat ctcattcact ttgtaggatg 1020 ctatatgggt caagtcagat ccctaaatgc aacggttatt gctgcatgtg ctcctcatga 1080 aatgtctgtt ctagggggct atctgggaga ggaattcttc gggaaaggga catttgaaag 1140 aagattcttc agagatgaga aagaacttca agaatacgag gcggctgaac tgacaaagac 1200 tgacgtagca ctggcagatg atggaactgt caactctgac gacgaggact acttctcagg 1260 tgaaaccaga agtccggagg ctgtttatac tcgaatcatg atgaatggag gtcgactaaa 1320 gagatctcac atacggagat atgtctcagt cagttccaat catcaagccc gtccaaactc 1380 attcgccgag tttctaaaca agacatattc gagtgactca taagaagttg aataacaaaa 1440 tgccggaaat ctacggattg tgtatatcca tcatgaaaaa aactaacacc cctcctttcg 1500 aaccatccca aacatgagca agatctttgt caatcctagt gctattagag ccggtctggc 1560

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cgatcttgag atggctgaag aaactgttga tctgatcaat agaaatatcg aagacaatca 1620 ggctcatctc caaggggaac ccatagaagt ggacaatctc cctgaggata tggggcgact 1680 tcacctggat gatggaaaat cgcccaaccc tggtgagatg gccaaggtgg gagaaggcaa 1740 gtatcgagag gactttcaga tggatgaagg agaggatcct agcttcctgt tccagtcata 1800 cctggaaaat gttggagtcc aaatagtcag acaaatgagg tcaggagaga gatttctcaa 1860 gatatggtca cagaccgtag aagagattat atcctatgtc gcggtcaact ttcccaaccc 1920 tccaggaaag tcttcagagg ataaatcaac ccagactact ggccgagagc tcaagaagga 1980 gacaacaccc actccttctc agagagaaag ccaatcatcg aaagccagga tggcggctca 2040 aattgcttct ggccctccag cccttgaatg gtcggccacc aatgaagagg atgatctatc 2100 agtggaggct gagatcgctc accagattgc agaaagtttc tccaaaaaat ataagtttcc 2160 ctctcgatcc tcagggatac tcttgtataa ttttgagcaa ttgaaaatga accttgatga 2220 tatagttaaa gaggcaaaaa atgtaccagg tgtgacccgt ttagcccatg acgggtccaa 2280 actcccccta agatgtgtac tgggatgggt cgctttggcc aactctaaga aattccagtt 2340 gttagtcgaa tccgacaagc tgagtaaaat catgcaagat gacttgaatc gctatacatc 2400 ttgctaaccg aacctctcca ctcagtccct ctagacaata aagtccgaga tgtcctaaag 2460 tcaacatgaa aaaaacaggc aacaccactg ataaaatgaa ctttctacgt aagatagtga 2520 aaaattgcag ggacgaggac actcaaaaac cctctcccgt gtcagcccct ctggatgacg 2580 atgacttgtg gcttccaccc cctgaatacg tcccgctgaa agaacttaca agcaagaaga 2640 acatgaggaa cttttgtatc aacggagggg ttaaagtgtg tagcccgaat ggttactcgt 2700 tcaggatcct gcggcacatt ctgaaatcat tcgacgagat atattctggg aatcatagga 2760 tgatcgggtt agtcaaagta gttattggac tggctttgtc aggatctcca gtccctgagg 2820 gcatgaaotg ggtatacaaa ttgaggagaa cctttatctt ccagtgggct gattccaggg 2880 gccctcttga aggggaggag ttggaatact ctcaggagat cacttgggat gatgatactg 2940 agttcgtcgg attgcaaata agagtgattg caaaacagtg tcatatccag ggcagaatct 3000 ggtgtatcaa catgaacccg agagcatgtc aactatggtc tgacatgtct cttcagacac 3060 aaaggtccga agaggacaaa gattcctctc tgcttctaga ataatcagat tatatcccgc 3120 aaátttatca cttgtttacc tctggaggag agaacatatg ggctcaactc caacccttgg 3180 gagcaatata acaaaaaaca tgttatggtg ccattaaacc gctgcatttc atcaaagtca 3240 agttgattac ctttacattt tgatcctctt ggatgtgaaa aaaactaaca cccctctgca 3300

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gtttggtacc ttgaaaaaaa cctgggttca atagtcctcc ttgaactcca tgcaactggg 3360 tagattcaag agtcatgaga ttttcattaa tcctctcagt tgatcaagca agatcatgta 3420 gattctcata ataggggaga tcttctagca gtttcagtga ctaacggtac tttcattctc 3480 caggaactga caccaacagt tgtagacaaa ccacggggtg tctcgggtga ctctgtgctt 3540 gggcacagac aaaggtcatg gtgtgttcca tgatagcgga ctcaggatga gttaattgag 3600 agaggcagtc ttcctcccgt gaaggacata agcagtagct cacaatcatc tcgcgtctca 3660 gcaaagtgtg cataattata aagtgctggg tcatctaagc ttttcagtcg agaaaaaaac 3720 attagatcag aagaacaact ggcaacactt ctcaacctga gacctacttc aagatgctcg 3780 atcctggaga ggtctatgat gaccctattg acccaatcga gttagaggat gaacccagag 3840 gaacccccac tgtccccaac atcttgagga actctgacta caatctcaac tctcctttga 3900 tagaagatcc tgctagacta atgttagaat ggttaaaaac agggaataga ccttatcgga 3960 tgactctaac agacaattgc tccaggtctt tcagagtttt gaaagattat ttcaagaagg 4020 tagatttggg ttctctcaag gtgggcggaa tggctgcaca gtcaatgatt tctctctggt 4080 tatatggtgc ccactctgaa tccaacagga gccggagatg tataacagac ttggcccatt 4140 tctattccaa gtcgtccccc atagagaagc tgttgaatct cacgctagga aatagagggc 4200 tgagaatccc cccagaggga gtgttaagtt gccttgagag ggttgattat gataatgcat 4260 ttggaaggta tcttgccaac acgtattcct cttacttgtt cttccatgta atcaccttat 4320 acatgaacgc cctagactgg gatgaagaaa agaccatcct agcattatgg aaagatttaa 4380 cctcagtgga catcgggaag gacttggtaa agttcaaaga ccaaatatgg ggactgctga 4440 tcgtgacaaa ggactttgtt tactcccaaa gttccaattg tctttttgac agaaactaca 4500 cacttatgct aaaagatctt ttcttgtctc gcttcaactc cttaatggtc ttgctctctc 4560 ccccagagcc ccgatactca gatgacttga tatctcaact atgccagctg tacattgctg 4620 gggatcaagt cttgtctatg tgtggaaact ccggctatga agtcatcaaa atattggagc 4680 catatgtcgt gaatagttta gtccagagag cagaaaagtt taggcctctc attcattcct 4740 tgggagactt tcctgtattt ataaaagaca aggtaagtca acttgaagag acgttcggtc 4800 cctgtgcaag aaggttcttt agggctctgg atcaattcga caacatacat gacttggttt 4860 ttgtgtatgg ctgttacagg cattgggggc acccatatat agattatcga aagggtctgt 4920 caaaactata tgatcaggtt cacattaaaa aagtgataga taagtcctac caggagtgct 4980 tagcaagcga cctagccagg aggatcctta gatggggttt tgataagtac tccaagtggt 5040 atctggattc aagattccta gcccgagacc accccttgac tccttatatc aaaacccaaa 5100

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catggccacc caaacatatt gtagacttgg tgggggatac atggcacaag ctcccgatca 5160 cgcagatctt tgagattcct gaatcaatgg atccgtcaga aatattggat gacaaatcac 5220 attctttcac cagaacgaga ctagcttctt ggctgtcaga aaaccgaggg ggacctgttc 5280 ctagcgaaaa agttattatc acggccctgt ctaagccgcc tgtcaatccc cgagagtttc 5340 tgaggtctat agacctcgga ggattgccag atgaagactt gataattggc ctcaagccaa 5400 aggaacggga attgaagatt gaaggtcgat tctttgctct aatgtcatgg aatctaagat 5460 tgtattttgt catcactgaa aaactcttgg ccaactacat cttgccactt tttgacgcgc 5520 tgactatgac agacaacctg aacaaggtgt ttaaaaagct gatcgacagg gtcaccgggc 5580 aagggctttt ggactattca agggtcacat atgcatttca cctggactat gaaaagtgga 5640 acaaccatca aagattagag tcaacagagg atgtattttc tgtcctagat caagtgtttg 5700 gattgaagag agtgttttct agaacacacg agttttttca aaaggcctgg atctattatt 5760 cagacagatc agacctcatc gggttacggg aggatcaaat atactgctta gatgcgtcca 5820 acggcccaac ctgttggaat ggccaggatg gcgggctaga aggcttacgg cagaagggct 5880 ggagtctagt cagcttattg atgatagata gagaatctca aatcaggaac acaagaacca 5940 aaatactagc tcaaggagac aaccaggttt tatgtccgac atatatgttg tcgccagggc 6000 tatctcaaga ggggctcctc tatgaattgg agagaatatc aaggaatgca ctttcgatat 6060 acagagccgt cgaggaaggg gcatctaagc tagggctgat catcaagaaa gaagagacca 6120 tgtgtagtta tgacttcctc atctatggaa aaaccccttt gtttagaggt aacatattgg 6180 tgcctgagtc caaaagatgg gccagagtct cttgcgtctc taatgaccaa atagtcaacc 6240 tcgccaatat aatgtcgaca gtgtccacca atgcgctaac agtggcacaa cactctcaat 6300 ctttgatcaa accgatgagg gattttctgc tcatgtcagt acaggcagtc tttcactacc 6360 tgctatttag cccaatctta aagggaagag tttacaagat tctgagcgct gaaggggata 6420 gctttctcct agccatgtca aggataatct atctagatcc ttctttggga ggggtatctg 6480 gaatgtccct cggaagattc catatacgac agttctcaga ccctgtctct gaagggttat 6540 ccttctggag agagatctgg ttaagctccc acgagtcctg gattcacgcg ttgtgtcaag 6600 aggctggaaa cccagatctt ggagagagaa cactcgagag cttcactcgc cttctagaag 6660 atcctaccac cttaaatatc agaggagggg ccagtcctac cattctactc aaggatgcaa 6720 tcagaaaggc tttatatgac gaggtggaca aggtggagaa ttcagagttt cgagaggcaa 6780 tcctgttgtc caagacccat agagataatt ttatactctt cttaacatct gttgagcctc 6840

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tgtttcctcg atttctcagt gagctattca gttcgtcttt tttgggaatc cccgagtcaa 6900

tcattggatt gatacaaaac tcccgaacga taagaaggca gtttagaaag agtctctcaa 6960

aaactttaga agaatccttc tacaactcag agatccacgg gattagtcgg atgacccaga 7020

cacctcagag ggttgggggg gtgtggcctt gctcttcaga gagggcagat ctacttaggg 7080

agatctcttg gggaagaaaa gtggtaggca cgacagttcc tcacccttct gagatgttgg 7140

ggttacttcc caagtcctct atttcttgca cttgtggagc aacaggagga ggcaatccta 7200

gagtttctgt atcagtactc ccgtcctttg atcagtcatt tttttcacga ggccccctaa 7260

aggggtactt gggctcgtcc acctctafcgt cgacccagct attccatgca tgggaaaaag 7320

tcactaatgt tcatgtggtg aagagagctc tatcgttaaa agaatctata aactggttca 7380

ttactagaga ttccaacttg gctcaagctc taattaggaa cattatgtct ctgacaggcc 7440

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tcaagtctgc cagatacagc gaaggagggt attcttctgt ctgcccgaac ctcctctctc 7560

atatttctgt tagtacagac accatgtctg atttgaccca agacgggaag aactacgatt 7620

tcatgttcca gccattgatg ctttatgcac agacatggac atcagagctg gtacagagag 7680

acacaaggct aagagactct acgtttcatt ggcacctccg atgcaacagg tgtgtgagac 7740

ccattgacga cgtgaccctg gagacctctc agatcttcga gtttccggat gtgtcgaaaa 7800

gaatatccag aatggtttct ggggctgtgc ctcacttcca gaggcttccc gatatccgtc 7860

tgagaccagg agattttgaa tctctaagcg gtagagaaaa gtctcaccat atcggatcag 7920

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ccatcttccc tgtcaacata tacgacaagg tttcccctag agactatttg agagggctcg 8040

caaggggagt attgatagga tcctcgattt gcttcttgac aagaatgaca aatatcaata 8100

ttaatagacc tcttgaattg atctcagggg taatctcata tattctcctg aggctagata 8160

accatccctc cttgtacata atgctcagag aaccgtctct tagaggagag atattttcta 822 0

tccctcagaa aatccccgcc gcttatccaa ccactatgaa agaaggcaac agatcaatct 8280

tgtgttatct ccaacatgtg ctacgctatg agcgagagat aatcacggcg tctccagaga 8340

atgactggct atggatcttt tcagacttta gaagtgccaa aatgacgtac ctaaccctca 8400

ttacttacca gtctcatctt ctactccaga gggttgagag aaacctatct aagagtatga 8460

gagataacct gcgacaattg agttccttga tgaggcaggt gctgggcggg cacggagaag 8520

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gatgggtgga tcaagaggtg cgccatgcag ctagaaccat gactggagat tacagcccca 8640

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acaagaaggt gtcccgtaag gtaggatgtt cagaatgggt ctgctctgct caacaggttg 8700

cagtctctac ctcagcaaac ccggcccctg tctcggagct tgacataagg gccctctcta 87 60

agaggttcca gaaccctttg atctcgggct tgagagtggt tcagtgggca accggfcgctc 882 0

attataagct fcaagcctatt ctagatgatc tcaatgtttt cccatctctc tgccttgtag 8880

ttggggacgg gtcagggggg atatcaaggg cagtcctcaa catgtttcca gatgccaagc 8940

tfcgtgttcaa cagtctctta gaggtgaatg acctgatggc ttccggaaca catccactgc 9000

ctccttcagc aatcatgagg ggaggaaatg atatcgtctc cagagtgata gattttgact 9060

caatctggga aaaaccgtcc gacttgagaa acttggcaac ctggaaatac ttccagtcag 9120

tccaaaagca ggtcaacatg tcctatgacc tcattatttg cgatgcagaa gttactgaca 9180

ttgcatctat caaccggata accctgttaa tgtccgattt tgcattgtct atagatggac 9240

cactctattt ggtcttcaaa acttatggga ctatgctagt aaatccaaac tacaaggcta 93 00

ttcaacacct gtcaagagcg ttcccctcgg tcacagggtt tatcacccaa gtaacttcgt 9360

ctttttcatc tgagctctac ctccgattct ccaaacgagg gaagtttttc agagatgctg 942 0

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ccaagagtga gatgcagaga gctcgttcct tgaactatca ggatcttgtg agaggatttc 9540

ctgaagaaat catatcaaat ccttacaatg agatgatcat aactctgatt gacagtgatg 9600

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ccaaacccct aactgacccc ttgttctatc caccgtctga tcccaaaatc ctgaggcact 9780

tcaacatatg ttgcagtact atgatgtatc tatctactgc tttaggtgac gtccctagct 984 0

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tgaagactac cagactcgtt ggcagcatca aggatctatc cagagaagtg gaaagacacc 10080

ttcataggta caacaggtgg atcaccctag aggatatcag atctagatca tccctactag 10140

actacagttg cctgtgatcc ggatactcct ggaagcctgc ccatgctaag actcttgtgt 10200

gatgtatctt gaaaaaaaca agatcctaaa tctgaacctt tggttgtttg attgtttttc 10260

tcatttttgt tgtttatttg ttaagcgt 10288

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<212> DNA

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aggactggta tcatttactg ggttcataaa acaaatcaat ctcaccgcta gagaggcaat 84 0

actatatttc ttccacaaga actttgagga agagataaga agaatgtttg agccagggca 900

ggagacagct gttcctcact cttatttcat ccacttccgt tcactaggct tgagtgggaa 960

atctccttat tcatcaaatg ctgttggtca cgtgttcaat ctcattcact ttgtaggatg 1020

ctatatgggt caagtcagat ccctaaatgc aacggttatt gctgcatgtg ctcctcatga 1080

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aagattcttc agagatgaga aagaacttca agaatacgag gcggctgaac tgacaaagac 12 00

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tcacctggat gatggaaaat cgcccaaccc tggtgagatg gccaaggtgg gagaaggcaa 1740

gtatcgagag gactttcaga tggatgaagg agaggatcct agcttcctgt tccagtcata 1800

cctggaaaat gttggagtcc aaatagtcag acaaatgagg tcaggagaga gatttctcaa 1860

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tccaggaaag tcttcagagg ataaatcaac ccagactact ggccgagagc tcaagaagga 1980

gacaacaccc actccttctc agagagaaag ccaatcatcg aaagccagga tggcggctca 2040

aattgcttct ggccctccag cccttgaatg gtcggccacc aatgaagagg atgatctatc 2100

agtggaggct gagatcgctc accagattgc agaaagtttc tccaaaaaat ataagtttcc 2160

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ttgctaaccg aacctctcca ctcagtccct ctagacaata aagtccgaga tgtcctaaag 2460 tcaacatgaa aaaaacaggc aacaccactg ataaaatgaa ctttctacgt aagatagtga 252 0 aaaattgcag ggacgaggac actcaaaaac cctctcccgt gtcagcccct ctggatgacg 2580

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atgacttgtg gcfctccaccc cctgaatacg tcccgctgaa agaacttaca agcaagaaga 2640

acatgaggaa cttttgtatc aacggagggg ttaaagtgtg tagcccgaat ggttactcgt 2700

tcaggatcct gcggcacatt ctgaaatcat tcgacgagat atattctggg aatcatagga 2760

tgatcgggtt agtcaaagta gttattggac tggctttgtc aggatctcca gtccctgagg 2820

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aaatttatca cttgtttacc tctggaggag agaacatatg ggctcaactc caacccttgg 3180

gagcaatata acaaaaaaca tgttatggtg ccattaaacc gctgcatttc atcaaagtca 3240

agttgattac ctttacattt tgatoctctt ggatgtgaaa aaaactatta acatccctca 3300

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attgtgtttt gggaaattcc ctatttacac gataccagac aagcttggtc cctggagccc 342 0

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taagtcttta aaaggagcat gcaaactcaa gttatgtgga gttctaggac ttagacttat 4080 ggatggaaca tgggtcgcga tgcaaacatc aaatgaaacc aaatggtgcc ctcccgatca gttggtgaac ctgcacgact ttcgctcaga cgaaattgag caccttgttg tagaggagtt ggtcaggaag agagaggagt gtctggatgc actagagtcc atcatgacaa ccaagtcagt

gagtttcaga cgtctcagtc atttaagaaa acttgtccct gggtttggaa aagcatatac 432 0

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catattcaac aagaccttga tggaagcega tgctcactac aagtcagtcg agacttggaa 4380 tgagatcctc ccttcaaaag ggtgtttaag agttgggggg aggtgtcatc ctcatgtgaa 4440 cggggtgttt ttcaatggta taatattagg acctgacggc aatgtcttaa tcccagagat 4500 gcaatcatcc ctcctccagc aaeatatgga gttgttggaa tcctcggtta tcccccttgt 4560 gcaccccctg gcagacecgt etacegtttt caaggacggt gacgaggctg aggattttgt 4620 tgaagttcac ettcccgatg tgeaeaatca ggtctcagga gttgacttgg gtctcccgaa 4680 ctgggggaag tatgtattac tgagtgcagg ggccctgact gccttgatgt tgataatttt 4740 cctgatgaca tgttgtagaa gagtcaatcg atcagaacct acgcaacaca atctcagagg 4800 gacagggagg gaggtgtcag tcactcccca aagcgggaag atcatatctt catgggaatc 4860 acacaagagt gggggtgaga ccagactgtg aggactggcc gtcctttcaa ctatccaagt 4920 cctgaagatc acetcccctt ggggggttca tcatgaaaaa aactaacacc cctcctttcg 4980 ctgcaggatg gttcctcagg ctctcctgtt tgtacccctt ctggtttttc cattgtgttt 5040 tgggaaattc cctatttaca cgataccaga caagcttggt ccctggagcc cgattgacat 5100 acatcacctc agctgeceaa acaatttggt agtggaggac gaaggatgca ccaacctgtc 5160 agggttctcc taeatggaae ttaaagttgg atacatctta gccataaaaa tgaacgggtt 5220 cacttgcaca ggcgttgtga cggaggctga aacctacact aacttcgttg gttatgtcac 5280 aaccacgttc aaaagaaagc atttccgccc aacaccagat gcatgtagag ccgcgtacaa 5340 ctggaagatg gccggtgacc ccagatatga agagtctcta cacaatccgt accctgacta 5400 ccactggctt egaaetgtaa aaaccaccaa ggagtetctc gttatcatat ctccaagtgt 5460 ggcagatttg gacccatatg acagatccct tcactcgagg gtcttcccta gcgggaagtg 5520 ctcaggagta geggtgtctt ctacctactg ctccactaac cacgattaca ccatttggat 5580 gcccgagaat ccgagactag ggatgtcttg tgacattttt accaatagta gagggaagag 5640 agcatccaaa gggagtgaga cttgcggctt tgtagatgaa agaggcctat ataagtcttt 5700 aaaaggagca tgcaaaetea agttatgtgg agttctagga cttagactta tggatggaac 5760 atgggtcgcg atgeaaacat caaatgaaac caaatggtgc cctcccgatc agttggtgaa 5820 cctgcacgac tttcgcteag acgaaattga gcaccttgtt gtagaggagt tggtcaggaa 5880 gagagaggag tgtctggatg eactagagtc catcatgaca accaagtcag tgagtttcag 5940 acgtctcagt catttaagaa aacttgtccc tgggtttgga aaagcatata ccatattcaa 5000 caagaccttg atggaagccg atgctcacta caagtcagtc gagacttgga atgagatcct 6060 cccttcaaaa gggtgtttaa gagttggggg gaggtgtcat cctcatgtga acggggtgtt 6120

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tttcaatggt ataatattag gacctgacgg caatgtctta atcccagaga tgcaatcatc 6180 cctcctccag caacatatgg agttgttgga atcctcggtt atcccccttg tgcaccccct 6240 ggcagacccg tctaccgttt tcaaggacgg tgacgaggct gaggattttg ttgaagttca 6300 ccttcccgat gtgcacaatc aggtctcagg agttgacttg ggtctcccga actgggggaa 6360 gtatgtatta ctgagtgcag gggccctgac tgccttgatg ttgataattt tcctgatgac 6420 atgttgtaga agagtcaatc gatcagaacc tacgcaacac aatctcagag ggacagggag 6480 ggaggtgtca gtcactcccc aaagcgggaa gatcatatct tcatgggaat cacacaagag 6540 tgggggtgag accagactgt gaggtaccgt cgagaaaaaa acattagatc agaagaacaa 6600 ctggcaacac ttctcaacct gagacctact tcaagatgct cgatcctgga gaggtctatg 6660 atgaccctat tgacccaatc gagttagagg atgaacccag aggaaccccc actgtcccca 6720 acatcttgag gaactctgac tacaatctca actctccttt gatagaagat cctgctagac 6780 taatgttaga atggttaaaa acagggaata gaccttatcg gatgactcta acagacaatt 6840 gctccaggtc tttcagagtt ttgaaagatt atttcaagaa ggtagatttg ggttctctca 6900 aggtgggcgg aatggctgca cagtcaatga tttctctctg gttatatggt gcccactctg 6960 aatccaacag gagccggaga tgtataacag acttggccca tttctattcc aagtcgtccc 7020 ccatagagaa gctgttgaat ctcacgctag gaaatagagg gctgagaatc cccccagagg 7080 gagtgttaag ttgccttgag agggttgatt atgataatgc atttggaagg tatcttgcca 7140 acacgtattc ctcttacttg ttcttccatg taatcacctt atacatgaac gccctagact 7200 gggatgaaga aaagaccatc ctagcattat ggaaagattt aacctcagtg gacatcggga 7260 aggacttggt aaagttcaaa gaccaaatat ggggactgct gatcgtgaca aaggactttg 7320 tttactccca aagttccaat tgtctttttg acagaaacta cacacttatg ctaaaagatc 7380 ttttcttgtc tcgcttcaac tccttaatgg tcttgctctc tcccccagag ccccgatact 7440 cagatgactt gatatctcáa ctatgccagc tgtacattgc tggggatcaa gtcttgtcta 7500 tgtgtggaaa ctccggctat gaagtcatca aaatattgga gccatatgtc gtgaatagtt 7560 tagtccagag agcagaaaag tttaggcctc tcattcattc cttgggagac tttcctgtat 7620 ttataaaaga caaggtaagt caacttgaag agacgttcgg tccctgtgca agaaggttct 7680 ttagggctct ggatcaattc gacaacatac atgacttggt ttttgtgtat ggctgttaca 7740 ggcattgggg gcacccatat atagattatc gaaagggtct gtcaaaacta tatgatcagg 7800 ttcacattaa aaaagtgata gataagtcct accaggagtg cttagcaagc gacctagcca 7860

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ggaggatcct tagatggggt tttgataagt actccaagtg gtatctggat tcaagattcc 7920 tagcccgaga ccaccccttg actccttata tcaaaaccca aacatggcca cccaaacata 7980 ttgtagactt ggtgggggat acatggcaca agctcccgat cacgcagatc tttgagattc 8040 ctgaatcaat ggatccgtca gaaatattgg atgacaaatc acattctttc accagaacga 8100 gactagcttc ttggctgtca gaaaaccgag ggggacctgt tcctagcgaa aaagttatta 8160 tcacggccct gtctaagccg cctgtcaatc cccgagagtt tctgaggtct atagacctcg 8220 gaggattgcc agatgaagac ttgataattg gcctcaagcc aaaggaacgg gaattgaaga 8280 ttgaaggtcg attctttgct ctaatgtcat ggaatctaag attgtatttt gtcatcactg 8340 aaaaactctt ggccaactac atcttgccac tttttgacgc gctgactatg acagacaacc 8400 tgaacaaggt gtttaaaaag ctgatcgaca gggtcaccgg gcaagggctt ttggactatt 8460 caagggtcac atatgcattt cacctggact atgaaaagtg gaacaaccat caaagattag 8520 agtcaacaga ggatgtattt tctgtcctag atcaagtgtt tggattgaag agagtgtttt 8580 ctagaacaca cgagtttttt caaaaggcct ggatctatta ttcagacaga tcagacctca 8640 tcgggttacg ggaggatcaa atatactgct tagatgcgtc caacggccca acctgttgga 8700 atggccagga tggcgggcta gaaggcttac ggcagaaggg ctggagtcta gtcagcttat 8760 tgatgataga tagagaatct caaatcagga acacaagaac caaaatacta gctcaaggag 8820 acaaccaggt tttatgtccg acatatatgt tgtcgccagg gctatctcaa gaggggctcc 8880 tctatgaatt ggagagaata tcaaggaátg cactttcgat atacagagcc gtcgaggaag 8940 gggcatctaa gctagggctg atcatcaaga aagaagagac catgtgtagt tatgacttcc 9000 tcatctatgg aaaaacccct ttgtttagag gtaacatatt ggtgcctgag tccaaaagat 9060 gggccagagt ctcttgcgtc tctaatgacc aaatagtcaa cctcgccaat ataatgtcga 9120 cagtgtccac caatgcgcta acagtggcac aacactctca atctttgatc aaaccgatga 9180 gggattttct gctcatgtca gtacaggcag tctttcacta cctgctattt agcccaatct 9240 taaagggaag agtttacaag attctgagcg ctgaagggga tagctttctc ctagccatgt 9300 caaggataat ctatctagat ccttctttgg gaggggtatc tggaatgtcc ctcggaagat 9360 tccatatacg acagttctca gaccctgtct ctgaagggtt atccttctgg agagagatct 9420 ggttaagctc ccacgagtcc tggattcacg cgttgtgtca agaggctgga aacccagatc 9480 ttggagagag aacactcgag agcttcactc gccttctaga agatcctacc accttaaata 9540 tcagaggagg ggccagtcct accattctac tcaaggatgc aatcagaaag gctttatatg 9600 acgaggtgga caaggtggag aattcagagt ttcgagaggc aatcctgttg tccaagaccc 9660

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<212> DNA

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<223> Recombinant ERA-pt rabies virus genome

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actatatttc ggagacagct atctccttat ctatatgggt aatgtctgtt aagattcttc tgacgtagca tgaaaccaga gagatctcac attcgccgag tgccggaaat aaccatccca cgatcttgag ggctcatctc tcacctggat gtatcgagag cctggaaaat gatatggtca tccaggaaag gacaacaccc aattgcttct agtggaggct ctctcgatcc tatagttaaa actcccccta gttagtcgaa ttgctaaccg tcaacatgaa acaggcaaca

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gaggacactc aaaaaccctc tcccgtgtca gcccctctgg atgacgatga cttgtggctt 2640 ccaccccctg aatacgtccc gctgaaagaa cttacaagca agaagaacat gaggaacttt 2700 tgtatcaacg gaggggttaa agtgtgtagc ccgaatggtt actcgttcag gatcctgcgg 2760 cacattctga aatcattcga cgagatatat tctgggaatc ataggatgat cgggttagtc 2820 aaagtagtta ttggactggc tttgtcagga tctccagtcc ctgagggcat gaactgggta 2880 tacaaattga ggagaacctt tatcttccag tgggctgatt ccaggggccc tcttgaaggg 2940 gaggagttgg aatactctca ggagatcact tgggatgatg atactgagtt cgtcggattg 3000 caaataagag tgattgcaaa acagtgtcat atccagggca gaatctggtg tatcaacatg 3060 aacccgagag catgtcaact atggtctgac atgtctcttc agacacaaag gtccgaagag 3120 gacaaagatt cctctctgct tctagaataa tcagattata tcccgcaaat ttatcacttg 3180 tttacctctg gaggagagaa catatgggct caactccaac ccttgggagc aatataacaa 3240 aaaacatgtt atggtgccat taaaccgctg catttcatca aagtcaagtt gattaccttt 3300 acattttgat cctcttggat gtgaaaaaaa ctattaacat ccctcaaaag actcaaggaa 3360 agatggttcc tcaggctctc ctgtttgtac cccttctggt ttttccattg tgttttggga 3420 aattccctat ttacacgata ccagacaagc ttggtccctg gagcccgatt gacatacatc 3480 acctcagctg cccaaacaat ttggtagtgg aggacgaagg atgcaccaac ctgtcagggt 3540 tctcctacat ggaacttáaa gttggataca tcttagccat aaaaatgaac gggttcactt 3600 gcacaggcgt tgtgacggag gctgaaacct acactaactt cgttggttat gtcacaacca 3660 cgttcaaaag aaagcatttc cgcccaacac cagatgcatg tagagccgcg tacaactgga 3720 agatggccgg tgaccccaga tatgaagagt ctctacacaa tccgtaccct gactaccact 3780 ggcttcgaac tgtaaaaacc accaaggagt ctctcgttat catatctcca agtgtggcag 3840 atttggaccc atatgacaga tcccttcact cgagggtctt ccctagcggg aagtgctcag 3900 gagtagcggt gtcttctacc tactgctcca ctaaccacga ttacaccatt tggatgcccg 3960 agaatccgag actagggatg tcttgtgaca tttttaccaa tagtagaggg aagagagcat 4020 ccaaagggag tgagacttgc ggctttgtag atgaaagagg cctatataag tctttaaaag 4080 gagcatgcaa actcaagtta tgtggagttc taggacttag acttatggat ggaacatggg 4140 tcgcgatgca aacatcaaat gaaaccaaat ggtgccctcc cgatcagttg gtgaacctgc 4200 acgactttcg ctcagacgaa attgagcacc ttgttgtaga ggagttggtc aggaagagag 4260 aggagtgtct ggatgcacta gagtccatca tgacaaccaa gtcagtgagt ttcagacgtc 4320 tcagtcattt aagaaaactt gtccctgggt ttggaaaagc atataccata ttcaacaaga 4380

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ccttgatgga agccgatgct cactacaagt cagtcgagac ttggaatgag atcctccctt 4440 caaaagggtg tttaagagtt ggggggaggt gtcatcctca tgtgaacggg gtgtttttca 4500 atggtataat attaggacct gacggcaatg tcttaatccc agagatgcaa tcatccctcc 4560 tccagcaaca tatggagttg ttggaatcct cggttatccc ccttgtgcac cccctggcag 4620 acccgtctac cgttttcaag gacggtgacg aggctgagga ttttgttgaa gttcaccttc 4680 ccgatgtgca caatcaggtc tcaggagttg acttgggtct cccgaactgg gggaagtatg 4740 tattactgag tgcaggggcc ctgactgcct tgatgttgat aattttcctg atgacatgtt 4800 gtagaagagt caatcgatca gaacctacgc aacacaatct cagagggaca gggagggagg 4860 tgtcagtcac tccccaaagc gggaagatca tatcttcatg ggaatcacac aagagtgggg 4920 gtgagaccag actgtgagga ctggccgtcc tttcaactat ccaagtcctg aagatcacct 4980 ccccttgggg ggttcttttt gaaaaaaacc tgggttcaat agtcctcctt gaactccatg 5040 caactgggta gattcaagag tcatgagatt ttcattaatc ctctcagttg atcaagcaag 5100 atcatgtaga ttctcataat aggggagatc ttctagcagt ttcagtgact aacggtactt 5160 tcattctcca ggaactgaca ccaacagttg tagacaaacc acggggtgtc tcgggtgact 5220 ctgtgcttgg gcacagacaa aggtcatggt gtgttccatg atagcggact caggatgagt 52·80 taattgagag aggcagtctt cctcccgtga aggacataag cagtagctca caatcatctc 5340 gcgtctcagc aaagtgtgca taattataaa gtgctgggtc atctaagctt ttcagtcgag 5400 aaaaaaacat tagatcagaa gaacaactgg caacacttct caacctgaga cctacttcaa 5460 gatgctcgat cctggagagg tctatgatga ccctattgac ccaatcgagt tagaggatga 5520 acccagagga acccccactg tccccaacat cttgaggaac tctgactaca atctcaactc 5580 tcctttgata gaagatcctg ctagactaat gttagaatgg ttaaaaacag ggaatagacc 5640 ttatcggatg actctaacag acaattgctc caggtctttc agagttttga aagattattt 5700 caagaaggta gatttgggtt ctctcaaggt gggcggaatg gctgcacagt caatgatttc 5760 tctctggtta tatggtgccc actctgaatc caacaggagc cggagatgta taacagactt 5820 ggcccatttc tattccaagt cgtcccccat agagaagctg ttgaatctca cgctaggaaa 5880 tagagggctg agaatccccc cagagggagt gttaagttgc cttgagaggg ttgattatga 5940 taatgcattt ggaaggtatc ttgccaacac gtattcctct tacttgttct tccatgtaat 6000 caccttatac atgaacgccc tagactggga tgaagaaaag accatcctag cattatggaa 6060 agatttaacc tcagtggaca tcgggaagga cttggtaaag ttcaaagacc aaatatgggg 6120

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actgctgatc gtgacaaagg actttgttta ctcccaaagt tccaattgtc tttttgacag 6180 aaactacaca cttatgctaa aagatctttt cttgtctcgc ttcaactcct taatggtctt 6240 gctctctccc ccagagcccc gatactcaga tgacttgata tctcaactat gccagctgta 6300 cattgctggg gatcaagtct tgtctatgtg tggaaactcc ggctatgaag tcatcaaaat 6360 attggagcca tatgtcgtga atagtttagt ccagagagca gaaaagttta ggcctctcat 6420 tcattccttg ggagactttc ctgtatttat aaaagacaag gtaagtcaac ttgaagagac 6480 gttcggtccc tgtgcaagaa ggttctttag ggctctggat caattcgaca acatacatga 6540 cttggttttt gtgtatggct gttacaggca ttgggggcac ccatatatag attatcgaaa 6600 gggtctgtca aaactatatg atcaggttca cattaaaaaa gtgatagata agtcctacca 6660 ggagtgctta gcaagcgacc tagccaggag gatccttaga tggggttttg ataagtactc 6720 caagtggtat ctggattcaa gattcctagc ccgagaccac cccttgactc cttatatcaa 6780 aacccaaaca tggccaccca aacatattgt agacttggtg ggggatacat ggcacaagct 6840 cccgatcacg cagatctttg agattcctga atcaatggat ccgtcagaaa tattggatga 6900 caaatcacat tctttcacca gaacgagact agcttcttgg ctgtcagaaa accgaggggg 6960 acctgttcct agcgaaaaag ttattatcac ggccctgtct aagccgcctg tcaatccccg 7020 agagtttctg aggtctatag acctcggagg attgccagat gaagacttga taattggcct 7080 caagccaaag gaacgggaat tgaagattga aggtcgattc tttgctctaa tgtcatggaa 7140 tctaagattg tattttgtca tcactgaaaa actcttggcc aactacatct tgccactttt 7200 tgacgcgctg actatgacag acaacctgaa caaggtgttt aaaaagctga tcgacagggt 7260 caccgggcaa gggcttttgg actattcaag ggtcacatat gcatttcacc tggactatga 7320 aaagtggaac aaccatcaaa gattagagtc aacagaggat gtattttctg tcctagatca 7380 agtgtttgga ttgaagagag tgttttctag aacacacgag ttttttcaaa aggcctggat 7440 ctattattca gacagatcag acctcatcgg gttacgggag gatcaaatat actgcttaga 7500 tgcgtccaac ggcccaacct gttggaatgg ccaggatggc gggctagaag gcttacggca 7560 gaagggctgg agtctagtca gcttattgat gatagataga gaatctcaaa tcaggaacac 7620 aagaaccaaa atactagctc aaggagacaa ccaggtttta tgtccgacat atatgttgtc 7680 gccagggcta tctcaagagg ggctcctcta tgaattggag agaatatcaa ggaatgcact 7740 ttcgatatac agagccgtcg aggaaggggc atctaagcta gggctgatca tcaagaaaga 7800 agagaccatg tgtagttatg acttcctcat ctatggaaaa acccctttgt ttagaggtaa 7860 catattggtg cctgagtcca aaagatgggc cagagtctct tgcgtctcta atgaccaaat 7920

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agtcaacctc gccaatataa tgtcgacagt gtccaccaat gcgctaacag tggcacaaca 7980

ctctcaatct ttgatcaaac cgatgaggga ttttctgctc atgtcagtac aggcagtctt 8040

tcactacctg ctatttagcc caatcttaaa gggaagagtt tacaagattc tgagcgctga 8100

aggggatagc tttctcctag ccatgtcaag gataatctat ctagatcctt ctttgggagg 8160

ggtatctgga atgtccctcg gaagattcca tatacgacag ttctcagacc ctgtctctga 8220

agggttatcc ttctggagag agatctggtt aagctcccac gagtcctgga ttcacgcgtt 8280

gtgtcaagag gctggaaacc cagatcttgg agagagaaca ctcgagagct tcactcgcct 834 0

tctagaagat cctaccacct taaatatcag aggaggggcc agtcctacca ttctactcaa 8400

ggatgcaatc agaaaggctt tatatgacga ggtggacaag gtggagaatt cagagtttcg 8460

agaggcaatc ctgttgtcca agacccatag agataatttt atactcttct taacatctgt 8520

tgagcctctg tttcctcgat ttctcagtga gctattcagt tcgtcttttt tgggaatccc 8580

cgagtcaatc attggattga tacaaaactc ccgaacgata agaaggcagt ttagaaagag 8640

tctctcaaaa actttagaag aatccttcta caactcagag atccacggga ttagtcggat 8700

gacccagaca cctcagaggg ttgggggggt gtggccttgc tcttcagaga gggcagatct 8760

acttagggag atctcttggg gaagaaaagt ggtaggcacg acagttcctc acccttctga 8820

gatgttgggg ttacttccca agtcctctat ttcttgcact tgtggagcaa caggaggagg 8880

caatcctaga gtttctgtat cagtactccc gtcctttgat cagtcatttt tttcacgagg 8940

ccccctaaag gggtacttgg gctcgtccac ctctatgtcg acccagctat tccatgcatg 9000

ggaaaaagtc actaatgttc atgtggtgaa gagagctcta tcgttaaaag aatctataaa 9060

ctggttcatt actagagatt ccaacttggc tcaagctcta attaggaaca ttatgtctct 9120

gacaggccct gatttccctc tagaggaggc ccctgtcttc aaaaggacgg ggtcagcctt 9180

gcataggttc aagtctgcca gatacagcga aggagggtat tcttctgtct gcccgaacct 9240

cctctctcat atttctgtta gtacagacac catgtctgat ttgacccaag acgggaagaa 9300

ctacgatttc atgttccagc cattgatgct ttatgcacag acatggacat cagagctggt 9360

acagagagac acaaggctaa gagactctac gtttcattgg cacctccgat gcaacaggtg 942 0

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gtcgaaaaga atatccagaa tggtttctgg ggctgtgcct cacttccaga ggcttcccga 9540

tatccgtctg agaccaggag attttgaatc tctaagcggt agagaaaagt ctcaccatat 9600

cggatcagct caggggctct tatactcaat cttagtggca attcacgact caggatacaa 9660

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tgatggaacc atcttccctg tcaacatata cgacaaggtt tcccctagag actatttgag 9720 agggctcgca aggggagtat tgataggatc ctcgatttgc ttcttgacaa gaatgacaaa 9780 tatcaatatt aatagacctc ttgaattgat ctcaggggta atctcatata ttctcctgag 9840 gctagataac catccctcct tgtacataat gctcagagaa ccgtctctta gaggagagat 9900 attttctatc cctcagaaaa tccccgccgc ttatccaacc actatgaaag aaggcaacag 9960 atcaatcttg tgttatctcc aacatgtgct acgctatgag cgagagataa tcacggcgtc 10020 tccagagaat gactggctat ggatcttttc agactttaga agtgccaaaa tgacgtacct 10080 aaccctcatt acttaccagt ctcatcttct actccagagg gttgagagaa acctatctaa 10140 gagtatgaga gataacctgc gacaattgag ttccttgatg aggcaggtgc tgggcgggca 10200 cggagaagat accttagagt cagacgacaa cattcaacga ctgctaaaag actctttacg 10260 aaggacaaga tgggtggatc aagaggtgcg ccatgcagct agaaccatga ctggagatta 10320 cagccccaac aagaaggtgt cccgtaaggt aggatgttca gaatgggtct gctctgctca 10380 acaggttgca gtctctacct cagcaaaccc ggcccctgtc tcggagcttg acataagggc 10440 cctctctaag aggttccaga accctttgat ctcgggcttg agagtggttc agtgggcaac 10500 cggtgctcat tataagctta agcctattct agatgatctc aatgttttcc catctctctg 10560 ccttgtagtt ggggacgggt caggggggat atcaagggca gtcctcaaca tgtttccaga 10620 tgccaagctt gtgttcaaca gtctcttaga ggtgaatgac ctgatggctt ccggaacaca 10680 tccactgcct ccttcagcaa tcatgagggg aggaaatgat atcgtctcca gagtgataga 10740 ttttgactca atctgggaaa aaccgtccga cttgagaaac ttggcaacct ggaaatactt 10800 ccagtcagtc caaaagcagg tcaacatgtc ctatgacctc attatttgcg atgcagaagt 10860 tactgacatt gcatctatca accggataac cctgttaatg tccgattttg cattgtctat 10920 agatggacca ctctatttgg tcttcaaaac ttatgggact atgctagtaa atccaaacta 10980 caaggctatt caacacctgt caagagcgtt cccctcggtc acagggttta tcacccaagt 11040 aacttcgtct ttttcatctg agctctacct ccgattctcc aaacgaggga agtttttcag 11100 agatgctgag tacttgacct cttccaccct tcgagaaatg agccttgtgt tattcaattg 11160 tagcagcccc aagagtgaga tgcagagagc tcgttccttg aactatcagg atcttgtgag 11220 aggatttcct gaagaaatca tatcaaatcc ttacaatgag atgatcataa ctctgattga 11280 cagtgatgta gaatcttttc tagtccacaa gatggttgat gatcttgagt tacagagggg 11340 aactctgtct aaagtggcta tcattatagc catcatgata gttttctcca acagagtctt 11400 caacgtttcc aaacccctaa ctgacccctt gttctatcca ccgtctgatc ccaaaatcct 11460

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gaggcacttc aacatatgtt gcagtactat gatgtatcta tctactgctt taggtgacgt 11520 ccctagcttc gcaagacttc acgacctgta taacagacct ataacttatt acttcagaaa 11580 gcaattcatt cgagggaacg tttatctatc ttggagttgg tccaacgaca cctcagtgtt 11640 caaaagggta gcctgtaatt ctagcctgag tctgtcatct cactggatca ggttgattta 11700 caagatagtg aagactacca gactcgttgg cagcatcaag gatctatcca gagaagtgga 11760 aagacacctt cataggtaca acaggtggat caccctagag gatatcagat ctagatcatc 11820 cctactagac tacagttgcc tgtgatccgg atactcctgg aagcctgccc atgctaagac 11880 tcttgtgtga tgtatcttga aaaaaacaag atcctaaatc tgaacctttg gttgtttgat 11940 tgtttttctc atttttgttg tttatttgtt aagcgt 11976

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acgcttaaca accagatcaa agaaaaaaca gacattgtca attgcaaagc aaaaatgtaa cacccctaca atggatgccg acaagattgt attcaaagtc aataatcagg tggtctcttt gaagcctgag attatcgtgg atcaacatga gtacaagtac cctgccatca aagatttgaa

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aaagccctgt ataaccctag gaaaggctcc cgatttaaat aaagcataca agtcagtttt 240

gtcaggcatg agcgccgcca aacttgatcc tgacgatgta tgttcctatt tggcagcggc 3 00

aatgcagttt tttgagggga catgtccgga agactggacc agctatggaa tcgtgattgc 360

acgaaaagga gataagatca ccccaggttc tctggtggag ataaaacgta ctgatgtaga 420

agggaattgg gctctgacag gaggcatgga actgacaaga gaccccactg tccctgagca 480

tgcgtcctta gtcggtcttc tcttgagtct gtataggttg agcaaaatat ccgggcaaaa 540

cactggtaac tataagacaa acattgcaga caggatagag cagatttttg agacagcccc 600

ttttgttaaa atcgtggaac accatactct aatgacaact cacaaaatgt gtgctaattg 660

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tgagcatcta tattcagcaa tcagagtggg cacagttgtc actgcttatg aagactgttc 780

aggactggta tcatttactg ggttcataaa acaaatcaat ctcaccgcta gagaggcaat 840

actatatttc ttccacaaga actttgagga agagataaga agaatgtttg agccagggca 900

ggagacagct gttcctcact cttatttcat ccacttccgt tcactaggct tgagtgggaa 960

atctccttat tcatcaaatg ctgttggtca cgtgttcaat ctcattcact ttgtaggatg 1020

ctatatgggt caagtcagat ccctaaatgc aacggttatt gctgcatgtg ctcctcatga 1080

aatgtctgtt ctagggggct atctgggaga ggaattcttc gggaaaggga catttgaaag 1140

aagattcttc agagatgaga aagaacttca agaatacgag gcggctgaac tgacaaagac 1200

tgacgtagca ctggcagatg atggaactgt caactctgac gacgaggact acttctcagg 1260

tgaaaccaga agtccggagg ctgtttatac tcgaatcatg atgaatggag gtcgactaaa 132 0

gagatctcac atacggagat atgtctcagt cagttccaat catcaagccc gtccaaactc 1380

attcgccgag tttctaaaca agacatattc gagtgactca taagaagttg aataacaaaa 1440

tgccggaaat ctacggattg tgtatatcca tcatgaaaaa aactaacacc cctcctttcg 1500

aaccatccca aacatgagca agatctttgt caatcctagt gctattagag ccggtctggc 1560

cgatcttgag atggctgaag aaactgttga tctgatcaat agaaatatcg aagacaatca 1620

ggctcatctc caaggggaac ccatagaagt ggacaatctc cctgaggata tggggcgact 1680

tcacctggat gatggaaaat cgcccaaccc tggtgagatg gccaaggtgg gagaaggcaa 1740

gtatcgagag gactttcaga tggatgaagg agaggatcct agcttcctgt tccagtcata 1800

cctggaaaat gttggagtcc aaatagtcag acaaatgagg tcaggagaga gatttctcaa 1860

gatatggtca cagaccgtag aagagattat atcctatgtc gcggtcaact ttcccaaccc 1920

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tccaggaaag tcttcagagg ataaatcaac ccagactact ggccgagagc tcaagaagga 1980 gacaacaccc actccttctc agagagaaag ccaatcatcg aaagccagga tggcggctca 2040 aattgcttct ggccctccag cccttgaatg gtcggccacc aatgaagagg atgatctatc 2100 agtggaggct gagatcgctc accagattgc agaaagtttc tccaaaaaat ataagtttcc 2160 ctctcgatcc tcagggatac tcttgtataa ttttgagcaa ttgaaaatga accttgatga 2220 tatagttaaa gaggcaaaaa atgtaccagg tgtgacccgt ttagcccatg acgggtccaa 2280 actcccccta agatgtgtac tgggatgggt cgctttggcc aactctaaga aattccagtt 2340 gttagtcgaa tccgacaagc tgagtaaaat catgcaagat gacttgaatc gctatacatc 2400 ttgctaaccg aacctctcca ctcagtccct ctagacaata aagtccgaga tgtcctaaag 2460 tcaacatgaa aaaaactaac acccctcctt tcgctgcagc caccatgggc gtgatcaagc 2520 ccgacatgaa gatcaagctg cggatggagg gcgccgtgaa cggccacaaa ttcgtgatcg 2580 agggcgacgg gaaaggcaag ccctttgagg gtaagcagac tatggacctg accgtgatcg 2640 agggcgcccc cctgcccttc gcttatgaca ttctcaccac cgtgttcgac tacggtaacc 2700 gtgtcttcgc caagtacccc aaggacatcc ctgactactt caagcagacc ttccccgagg 2760 gctactcgtg ggagcgaagc atgacatacg aggaccaggg aatctgtatc gctacaaacg 2 82-0 acatcaccat gatgaagggt gtggacgact gcttcgtgta caaaatccgc ttcgacgggg 2880 tcaacttccc tgctaatggc ccggtgatgc agcgcaagac cctaaagtgg gagcccagta 2940 ccgagaagat gtacgtgcgg gacggcgtac tgaagggcga tgttaatatg gcactgctct 3000 tggagggagg cggccactac cgctgcgact tcaagaccac ctacaaagcc aagaaggtgg 3060 tgcagcttcc cgactaccac ttcgtggacc accgcatcga gatcgtgagc cacgacaagg 3120 actacaacaa agtcaagctg tacgagcacg ccgaagccca cagcggacta ccccgccagg 3180 ccggctaagg taccgtcgag aaaaaaacag gcaacaccac tgataaaatg aactttctac 3240 gtaagatagt gaaaaattgc agggacgagg acactcaaaa accctctccc gtgtcagccc 3300 ctctggatga cgatgacttg tggcttccac cccctgaata cgtcccgctg aaagaactta 3360 caagcaagaa gaacatgagg aacttttgta tcaacggagg ggttaaagtg tgtagcccga 3420 atggttactc gttcaggatc ctgcggcaca ttctgaaatc attcgacgag atatattctg 3480 ggaatcatag gatgatcggg ttagtcaaag tagttattgg actggctttg tcaggatctc 3540 cagtccctga gggcatgaac tgggtataca aattgaggag aacctttatc ttccagtggg 3600 ctgattccag gggccctctt gaaggggagg agttggaata ctctcaggag atcacttggg 3660 atgatgatac tgagttcgtc ggattgcaaa taagagtgat tgcaaaacag tgtcatatcc 3720

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agggcagaat ctggtgtatc aacatgaacc cgagagcatg tcaactatgg tctgacatgt 3780 ctcttcagac àcaaaggtcc gaagaggaca aagattcctc tctgcttcta gaataatcag 3840 attatatccc gcaaatttat cacttgttta cctctggagg agagaacata tgggctcaac 3900 tccaaccctt gggagcaata taacaaaaaa catgttatgg tgccattaaa ccgctgcatt ■ 3960 tcatcaaagt caagttgatt acctttacat tttgatcctc ttggatgtga aaaaaactat 4020 taacatccct caaaagactc aaggaaagat ggttcctcag gctctcctgt ttgtacccct 4080 tctggttttt ccattgtgtt ttgggaaatt ccctatttac acgataccag acaagcttgg 4140 tccctggagc ccgattgaca tacatcacct cagctgccca aacaatttgg tagtggagga 4200 cgaaggatgc accaacctgt cagggttctc ctacatggaa cttaaagttg gatacatctt 4260 agccataaaa atgaacgggt tcacttgcac aggcgttgtg acggaggctg aaacctacac 4320 taacttcgtt ggttatgtca caaccacgtt caaaagaaag catttccgcc caacaccaga 4380 tgcatgtaga gccgcgtaca actggaagat ggccggtgac cccagatatg aagagtctct 4440 acacaatccg taccctgact accactggct tcgaactgta aaaaccacca aggagtctct 4500 cgttatcata tctccaagtg tggcagattt ggacccatat gacagatccc ttcactcgag 4560 ggtcttccct agcgggaagt gctcaggagt agcggtgtct tctacctact gctccactaa 4620 ccacgattac accatttgga tgcccgagaa tccgagacta gggatgtctt gtgacatttt 4680 taccaatagt agagggaaga gagcatccaa agggagtgag acttgcggct ttgtagatga 4740 aagaggccta tataagtctt taaaaggagc atgcaaactc aagttatgtg gagttctagg 4800 acttagactt atggatggaa catgggtcgc gatgcaaaca tcaaatgaaa ccaaatggtg 4860 ccctcccgat cagttggtga acctgcacga ctttcgctca gacgaaattg agcaccttgt 4920 tgtagaggag ttggtcagga agagagagga gtgtctggat gcactagagt ccatcatgac 4980 aaccaagtca gtgagtttca gacgtctcag tcatttaaga aaacttgtcc ctgggtttgg 5040 aaaagcatat accatattca acaagacctt gatggaagcc gatgctcact acaagtcagt 5100 cgagacttgg aatgagatcc tcccttcaaa agggtgttta agagttgggg ggaggtgtca 5160 tcctcatgtg aacggggtgt ttttcaatgg tataatatta ggacctgacg gcaatgtctt 5220 aatcccagag atgcaatcat ccctcctcca gcaacatatg gagttgttgg aatcctcggt 5280 tatccccctt gtgcaccccc tggcagaccc gtctaccgtt ttcaaggacg gtgacgaggc 5340 tgaggatttt gttgaagttc accttcccga tgtgcacaat caggtctcag gagttgactt 5400 gggtctcccg aactggggga agtatgtatt actgagtgca ggggccctga ctgccttgat 5460

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gttgataatt ttcctgatga catgttgtag aagagtcaat cgatcagaac ctacgcaaca 5520 caatctcaga gggacaggga gggaggtgtc agtcactccc caaagcggga agatcatatc 5580 ttcatgggaa tcacacaaga gtgggggtga gaccagactg tgaggactgg ccgtcctttc 5640 aactatccaa gtcctgaaga tcacctcccc ttggggggtt ctttttgaaa aaaacctggg 5700 ttcaatagtc ctccttgaac tccatgcaac tgggtagatt caagagtcat gagattttca 5760 ttaatcctct cagttgatca agcaagatca tgtagattct cataataggg gagatcttct 5820 agcagtttca gtgactaacg gtactttcat tctccaggaa ctgacaccaa cagttgtaga 5880 caaaccacgg ggtgtctcgg gtgactctgt gcttgggcac agacaaaggt catggtgtgt 5940 tccatgatag cggactcagg atgagttaat tgagagaggc agtcttcctc ccgtgaagga 6000 cataagcagt agctcacaat catctcgcgt ctcagcaaag tgtgcataat tataaagtgc 6060 tgggtcatct aagcttttca gtcgagaaaa aaacattaga tcagaagaac aactggcaac 6120 acttctcaac ctgagaccta cttcaagatg ctcgatcctg gagaggtcta tgatgaccct 6180 attgacccaa tcgagttaga ggatgaaccc agaggaaccc ccactgtccc caacatcttg 6240 aggaactctg actacaatct caactctcct ttgatagaag atcctgctag actaatgtta 6300 gaatggttaa aaacagggaa tagaccttat cggatgactc taacagacaa ttgctccagg 6360 tctttcagag ttttgaaaga ttatttcaag aaggtagatt tgggttctct caaggtgggc 6420 ggaatggctg cacagtcaat gatttctctc tggttatatg gtgcccactc tgaatccaac 6480 aggagccgga gatgtataac agacttggcc catttctatt ccaagtcgtc ccccatagag 6540 aagctgttga atctcacgct aggaaataga gggctgagaa tccccccaga gggagtgtta 6600 agttgccttg agagggttga ttatgataat gcatttggaa ggtatcttgc caacacgtat 6660 tcctcttact tgttcttcca tgtaatcacc ttatacatga acgccctaga ctgggatgaa 6720 gaaaagacca tcctagcatt atggaaagat ttaacctcag tggacatcgg gaaggacttg 6780 gtaaagttca aagaccaaat atggggactg ctgatcgtga caaaggactt tgtttactcc 6840 caaagttcca attgtctttt tgacagaaac tacacactta tgctaaaaga tcttttcttg 6900 tctcgcttca actccttaat ggtcttgctc tctcccccag agccccgata ctcagatgac 6960 ttgatatctc aactatgcca gctgtacatt gctggggatc aagtcttgtc tatgtgtgga 7020 aactccggct atgaagtcat caaaatattg gagccatatg tcgtgaatag tttagtccag 7080 agagcagaaa agtttaggcc tctcattcat tccttgggag actttcctgt atttataaaa 7140 gacaaggtaa gtcaacttga agagacgttc ggtccctgtg caagaaggtt ctttagggct 7200 ctggatcaat tcgacaacat acatgacttg gtttttgtgt atggctgtta caggcattgg 7260

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agaacactcg agagcttcac tcgccttcta gaagatccta ccaccttaaa tatcagagga 9060 ggggccagtc ctaccattct actcaaggat gcaatcagaa aggctttata tgacgaggtg 9120 gacaaggtgg agaattcaga gtttcgagag gcaatcctgt tgtccaagac ccatagagat 9180 aattttatac tcttcttaac atctgttgag cctctgtttc ctcgatttct cagtgagcta 9240 ttcagttcgt cttttttggg aatccccgag tcaatcattg gattgataca aaactcccga 9300 acgataagaa ggcagtttag aaagagtctc tcaaaaactt tagaagaatc cttctacaac 9360 tcagagatcc acgggattag tcggatgacc cagacacctc agagggttgg gggggtgtgg 9420 ccttgctctt cagagagggc agatctactt agggagatct cttggggaag aaaagtggta 9480 ggcacgacag ttcctcaccc ttctgagatg ttggggttac ttcccaagtc ctctatttct 9540 tgcacttgtg gagcaacagg aggaggcaat cctagagttt ctgtatcagt actcccgtcc 9600 tttgatcagt catttttttc acgaggcccc ctaaaggggt acttgggctc gtccacctct 9660 atgtcgaccc agctattcca tgcatgggaa aaagtcacta atgttcatgt ggtgaagaga 9720 gctctatcgt taaaagaatc tataaactgg ttcattacta gagattccaa cttggctcaa 9780 gctctaatta ggaacattat gtctctgaca ggccctgatt tccctctaga ggaggcccct 9840 gtcttcaaaa ggacggggtc agccttgcat aggttcaagt ctgccagata cagcgaagga 9900 gggtattctt ctgtctgccc gaacctcctc tctcatattt ctgttagtac agacaccatg 9960 tctgatttga cccaagacgg gaagaactac gatttcatgt tccagccatt gatgctttat 10020 gcacagacat ggacatcaga gctggtacag agagacacaa ggctaagaga ctctacgttt 10080 cattggcacc tccgatgcaa caggtgtgtg agacccattg acgacgtgac cctggagacc 10140 tctcagatct tcgagtttcc ggatgtgtcg aaaagaatat ccagaatggt ttctggggct 10200 gtgcctcact tccagaggct tcccgatatc cgtctgagac caggagattt tgaatctcta 10260 agcggtagag aaaagtctca ccatatcgga tcagctcagg ggctcttata ctcaatctta 10320 gtggcaattc acgactcagg atacaatgat ggaaccatct tccctgtcaa catatacgac 10380 aaggtttccc ctagagacta tttgagaggg ctcgcaaggg gagtattgat aggatcctcg 10440 atttgcttct tgacaagaat gacaaatatc aatattaata gacctcttga attgatctca 10500 ggggtaatct catatattct cctgaggcta gataaccatc cctccttgta cataatgctc 10560 agagaaccgt ctcttagagg agagatattt tctatccctc agaaaatccc cgccgcttat 10620 ccaaccacta tgaaagaagg caacagatca atcttgtgtt atctccaaca tgtgctacgc 10680 tatgagcgag agataatcac ggcgtctcca gagaatgact ggctatggat cttttcagac 10740 tttagaagtg ccaaaatgac gtacctaacc ctcattactt accagtctca tcttctactc 10800

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cagagggttg agagaaacct atctaagagt atgagagata acctgcgaca attgagttcc 10860 ttgatgaggc aggtgctggg cgggcacgga gaagatacct tagagtcaga cgacaacatt 10920 caacgactgc taaaagactc tttacgaagg acaagatggg tggatcaaga ggtgcgccat 10980 gcagctagaa ccatgactgg agattacagc cccaacaaga aggtgtcccg taaggtagga 11040 tgttcagaat gggtctgctc tgctcaa:cag gttgcagtct ctacctcagc aaacccggcc 11100 cctgtctcgg agcttgacat aagggccctc tctaagaggt tccagaaccc tttgatctcg 11160 ggcttgagag tggttcagtg ggcaaccggt gctcattata agcttaagcc tattctagat 11220 gatctcaatg ttttcccatc tctctgcctt gtagttgggg acgggtcagg ggggatatca 11280 agggcagtcc tcaacatgtt tccagatgcc aagcttgtgt tcaacagtct cttagaggtg 11340 aatgacctga tggcttccgg aacacatcca ctgcctcctt cagcaatcat gaggggagga 11400 aatgatatcg tctccagagt gatagatttt gactcaatct gggaaaaacc gtccgacttg 11460 agaaacttgg caacctggaa atacttccag tcagtccaaa agcaggtcaa catgtcctat 11520 gacctcatta tttgcgatgc agaagttact gacattgcat ctatcaaccg gataaccctg 11580 ttaatgtccg attttgcatt gtctatagat ggaccactct atttggtctt caaaacttat 11540 gggactatgc tagtaaatcc aaactacaag gctattcaac acctgtcaag agcgttcccc 11700 tcggtcacag ggtttatcac ccaagtaact tcgtcttttt catctgagct ctacctccga 11760 ttctccaaac gagggaagtt tttcagagat gctgagtact tgacctcttc cacccttcga 11820 gaaatgagcc ttgtgttatt caattgtagc agccccaaga gtgagatgca gagagctcgt 11880 tccttgaact atcaggatct tgtgagagga tttcctgaag aaatcatatc aaatccttac 11940 aatgagatga tcataactct gattgacagt gatgtagaat cttttctagt ccacaagatg 12000 gttgatgatc ttgagttaca gaggggaact ctgtctaaag tggctatcat tatagccatc 12060 atgatagttt tctccaacag agtcttcaac gtttccaaac ccctaactga ccccttgttc 12120 tatccaccgt ctgatcccaà aatcctgagg cacttcaaca tatgttgcag tactatgatg 12180 tatctatcta ctgctttagg tgacgtccct agcttcgcaa gacttcacga cctgtataac 12240 agacctataa cttattactt cagaaagcaa ttcattcgag ggaacgttta tctatcttgg 12300 agttggtcca acgacacctc agtgttcaaa agggtagcct gtaattctag cctgagtctg 12360 tcatctcact ggatcaggtt gatttacaag atagtgaaga ctaccagact cgttggcagc 12420 atcaaggatc tatccagaga agtggaaaga caccttcata ggtacaacag gtggatcacc 12480 ctagaggata tcagatctàg atcatcccta ctagactaca gttgcctgtg atccggatac 12540

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tcctggaagc ctgcccatgc taagactctt gtgtgatgta tcttgaaaaa aacaagatcc 12600 taaatctgaa cctttggttg tttgattgtt tttctcattt ttgttgttta tttgttaagc 12660

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acgcttaaca accagatcaa agaaaaaaca gacattgtca attgcaaagc aaaaatgtaa 60 cacccctaca atggatgccg acaagattgt attcaaagtc aataatcagg tggtctcttt 120 gaagcctgag attatcgtgg atcaacatga gtacaagtac cctgccatca aagatttgaa 180 aaagccctgt ataaccctag gaaaggctcc cgatttaaat aaagcataca agtcagtttt 240 gtcaggcatg agcgccgcca aacttgatcc tgacgatgta tgttcctatt tggcagcggc 300 aatgcagttt tttgagggga catgtccgga agactggacc agctatggaa tcgtgattgc 360 acgaaaagga gataagatca ccccaggttc tctggtggag ataaaacgta ctgatgtaga 420 agggaattgg gctctgacag gaggcatgga actgacaaga gaccccactg tccctgagca 480 tgcgtcctta gtcggtcttc tcttgagtct gtataggttg agcaaaatat ccgggcaaaa 54 0 cactggtaac tataagacaa acattgcaga caggatagag cagatttttg agacagcccc 600 ttttgttaaa atcgtggaac accatactct aatgacaact cacaaaatgt gtgctaattg 660

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gagtactata ccaaacttca gatttttggc cggaacctat gacatgtttt tctcccggat 720

tgagcatcta tattcagcaa tcagagtggg cacagttgtc actgcttatg aagactgttc 780

aggactggta tcatttactg ggttcataaa acaaatcaat ctcaccgcta gagaggcaat 840

actatatttc ttccacaaga actttgagga agagataaga agaatgtttg agccagggca 900

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ttgctaaccg aacctctcca ctcagtccct ctagacaata aagtccgaga tgtcctaaag 2460

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tcaacatgaa aaaaactaac acccctcctt tcgctgcagc caccatggtt cctcaggctc 2520 tcctgtttgt accccttctg gtttttccat tgtgttttgg gaaattccct atttacacga 2580 taccagacaa gcttggtccc tggagcccga ttgacataca tcacctcagc tgcccaaaca 2640 atttggtagt ggaggacgaa ggatgcacca acctgtcagg gttctcctac atggaactta 2700 aagttggata catcttagcc ataaaaatga acgggttcac ttgcacaggc gttgtgacgg 2760 aggctgaaac ctacactaac ttcgttggtt atgtcacaac cacgttcaaa agaaagcatt 2820 tccgcccaac accagatgca tgtagagccg cgtacaactg gaagatggcc ggtgacccca 2880 gatatgaaga gtctctacac aatccgtacc ctgactacca ctggcttcga actgtaaaaa 2940 ccaccaagga gtctctcgtt atcatatctc caagtgtggc agatttggac ccatatgaca 3000 gatcccttca ctcgagggtc ttccctagcg ggaagtgctc aggagtagcg gtgtcttcta 3060 cctactgctc cactaaccac gattacacca tttggatgcc cgagaatccg agactaggga 3120 tgtcttgtga catttttacc aatagtagag ggaagagagc atccaaaggg agtgagactt 3180 gcggctttgt agatgaaaga ggcctatata agtctttaaa aggagcatgc aaactcaagt 3240 tatgtggagt tctaggactt agacttatgg atggaacatg ggtcgcgatg caaacatcaa 3300 atgaaaccaa atggtgccct cccgatcagt tggtgaacct gcacgacttt cgctcagacg 3360 aaattgagca ccttgttgta gaggagttgg tcaggaagag agaggagtgt ctggatgcac 3420 tagagtccat catgacaacc aagtcagtga gtttcagacg tctcagtcat ttaagaaaac 3480 ttgtccctgg gtttggaaaa gcatatacca tattcaacaa gaccttgatg gaagccgatg 3540 ctcactacaa gtcagtcaga acttggaatg agatcctccc ttcaaaaggg tgtttaagag 3600 ttggggggag gtgtcatcct catgtgaacg gggtgttttt caatggtata atattaggac 3660 ctgacggcaa tgtcttaatc ccagagatgc aatcatccct cctccagcaa catatggagt 3720 tgttggaatc ctcggttatc ccccttgtgc accccctggc agacccgtct accgttttca 3780 aggacggtga cgaggctgag gattttgttg àagttcacct tcccgatgtg cacaatcagg 3840 tctcaggagt tgacttgggt ctcccgaact gggggaagta tgtattactg agtgcagggg 3900 ccctgactgc cttgatgttg ataattttcc tgatgacatg ttgtagaaga gtcaatcgat 3960 cagaacctac gcaacacaat ctcagaggga cagggaggga ggtgtcagtc actccccaaa 4020 gcgggaagat catatcttca tgggaatcac acaagagtgg gggtgagacc agactgtgat 4080 ttggtaccgt cgagaaaaaa acaggcaaca ccactgataa aatgaacttt ctacgtaaga 4140 tagtgaaaaa ttgcagggac gaggacactc aaaaaccctc tcccgtgtca gcccctctgg 4200

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atgacgatga cttgtggctt ccaccccctg aatacgtccc gctgaaagaa cttacaagca 4260 agaagaacat gaggaacttt tgtatcaacg gaggggttaa agtgtgtagc ccgaatggtt 4320 actcgttcag gatcctgcgg cacattctga aatcattcga cgagatatat tctgggaatc 4380 ataggatgat cgggttagtc aaagtagtta ttggactggc tttgtcagga tctccagtcc 4440 ctgagggcat gaactgggta tacaaattga ggagaacctt tatcttccag tgggctgatt 4500 ccaggggccc tcttgaaggg gaggagttgg aatactctca ggagatcact tgggatgatg 4560 atactgagtt cgtcggattg caaataagag tgattgcaaa acagtgtcat atccagggca 4620 gaatctggtg tatcaacatg aacccgagag catgtcaact atggtctgac atgtctcttc 4680 agacacaaag gtccgaagag gacaaagatt cctctctgct tctagaataa tcagattata 4740 tcccgcaaat ttatcacttg tttacctctg gaggagagaa catatgggct caactccaac 4800 ccttgggagc aatataacaa aaaacatgtt atggtgccat taaaccgctg catttcatca 4860 aagtcaagtt gattaccttt acattttgat cctcttggat gtgaaaaaaa ctaacacccc 4920 tctgcagttt ggtaccttga aaaaaacctg ggttcaatag tcctccttga actccatgca 4980 actgggtaga ttcaagagtc atgagatttt cattaatcct ctcagttgat caagcaagat 5040 catgtagatt ctcataatag gggagatctt ctagcagttt cagtgactaa cggtactttc 5100 attctccagg aactgacacc aacagttgta gacaaaccac ggggtgtctc gggtgactct 5160 gtgcttgggc acagacaaag gtcatggtgt gttccatgat agcggactca ggatgagtta 5220 attgagagag gcagtcttcc tcccgtgaag gacataagca gtagctcaca atcatctcgc 5280 gtctcagcaa agtgtgcata attataaagt gctgggtcat ctaagctttt cagtcgagaa 5340 aaaaacatta gatcagaaga acaactggca acacttctcà acctgagacc tacttcaaga 5400 tgctcgatcc tggagaggtc tatgatgacc ctattgaccc aatcgagtta gaggatgaac 5460 ccagaggaac ccccactgtc cccaacatct tgaggaactc tgactacaat ctcaactctc 5520 ctttgataga agatcctgct agactaatgt tagaatggtt aaaaacaggg aatagacctt 5580 atcggatgac tctaacagac aattgctcca ggtctttcag agttttgaaa gattatttca 5640 agaaggtaga tttgggttct ctcaaggtgg gcggaatggc tgcacagtca atgatttctc 5700 tctggttata tggtgcccac tctgaatcca acaggagccg gagatgtata acagacttgg 5760 cccatttcta ttccaagtcg tcccccatag agaagctgtt gaatctcacg ctaggaaata 5820 gagggctgag aatcccccca gagggagtgt taagttgcct tgagagggtt gattatgata 5880 atgcatttgg aaggtatctt gccaacacgt attcctctta cttgttcttc catgtaatca 5940 ccttatacat gaacgcccta gactgggatg aagaaaagac catcctagca ttatggaaag 6000

105/137 WO 2007/047459 PCT/US2006/040134

atttaacctc agtggacatc gggaaggact tggtaaagtt caaagaccaa atatggggac 6060 tgctgatcgt gacaaaggac tttgtttact cccaaagttc caattgtctt tttgacagaa 6120 actacacact tatgctaaaa gatcttttct tgtctcgctt caactcctta atggtcttgc 6180 tctctccccc agagccccga tactcagatg acttgatatc tCaactatgc cagctgtaca 6240 ttgctgggga tcaagtcttg tctatgtgtg gaaactccgg ctatgaagtc atcaaaatat 6300 tggagccata tgtcgtgaat agtttagtcc agagagcaga aaagtttagg cctctcattc 6360 attccttggg agactttcct gtatttataa aagacaaggt aagtcaactt gaagagacgt 6420 tcggtccctg tgcaagaagg ttctttaggg ctctggatca attcgacaac atacatgact 64 SO tggtttttgt gtatggctgt tacaggcatt gggggcaccc atatatagat tatcgaaagg 6540 gtctgtcaaa actatatgat caggttcaca ttaaaaaagt gatagataag tcctaccagg 6600 agtgcttagc aagcgaccta gccaggagga tccttagatg gggttttgat aagtactcca 6660 agtggtatct ggattcaaga ttcctagccc gagaccaccc cttgactcct tatatcaaaa 6720 cccaaacatg gccacccaaa catattgtag acttggtggg ggatacatgg cacaagctcc 6780 cgatcacgca gatctttgag attcctgaat caatggatcc gtcagaaata ttggatgaca 6840 aatcacattc tttcaccaga acgagactag cttcttggct gtcagaaaac cgagggggac 6900 ctgttcctag cgaaaaagtt attatcacgg ccctgtctaa gccgcctgtc aatccccgag 6960 agtttctgag gtctatagac ctcggaggat tgccagatga agacttgata attggcctca 7020 agccaaagga acgggaattg aagattgaag gtcgattctt tgctctaatg tcatggaatc 7080 taagattgta ttttgtcatc actgaaaaac tcttggccaa ctacatcttg ccactttttg 7140 acgcgctgac tatgacagac aacctgaaca aggtgtttaa aaagctgatc gacagggtca 7200 ccgggcaagg gcttttggac tattcaaggg tcacatatgc atttcacctg gactatgaaa 7260 agtggaacaa ccatcaaaga ttagagtcaa cagaggatgt attttctgtc ctagatcaag 7320 tgtttggatt gaagagagtg ttttctagaa cacacgagtt ttttcaaaag gcctggatct 7380 attattcaga cagatcagac ctcatcgggt tacgggagga tcaaatatac tgcttagatg 7440 cgtccaacgg cccaacctgt tggaatggcc aggatggcgg gctagaagge ttacggcaga 7500 agggctggag tctagtcagc ttattgatga tagatagaga atctcaaatc aggaacacaa 7560 gaaccaaaat actagctcaa ggagacaacc aggttttatg tccgacatat atgttgtcgc 7620 cagggctatc tcaagagggg ctcctctatg aattggagag aatatcaagg aatgcacttt 7680 cgatatacag agccgtcgag gaaggggcat ctaagctagg gctgatcatc aagaaagaag 7740

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ctctgtctaa agtggctatc attatagcca tcatgatagt tttctccaac agagtcttca 11340 acgtttccaa acccctaact gaccccttgt tctatccacc gtctgatccc aaaatcctga 11400 ggcacttcaa catatgttgc agtactatga tgtatctatc tactgcttta ggtgacgtcc 11460 ctagcttcgc aagacttcac gacctgtata acagacctat aacttattac ttcagaaagc 11520 aattcattcg agggaacgtt tatctatctt ggagttggtc caacgacacc tcagtgttca 11580 aaagggtagc ctgtaattct agcctgagtc tgtcatctca ctggatcagg ttgatttaca 11640 agatagtgaa gactaccaga ctcgttggca gcatcaagga tctatccaga gaagtggaaa 11700 gacaccttca taggtacaac aggtggatca ccctagagga tatcagatct agatcatccc 11760 tactagacta cagttgcctg tgatccggat actcctggaa gcctgcccat gctaagactc 11820 ttgtgtgatg tatcttgaaa aaaacaagat cctaaatctg aacctttggt tgtttgattg 11880 tttttctcat ttttgttgtt tatttgttaa gcgt 11914

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<212> DNA

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aaagccctgt ataaccctag gaaaggctcc cgatttaaat aaagcataca agtcagtttt 240 gtcaggcatg agcgccgcca aacttgatcc tgacgatgta tgttcctatt tggcagcggc 300 aatgcagttt tttgagggga catgtccgga agactggacc agctatggaa tcgtgattgc 360 acgaaaagga gataagatca ccccaggttc tctggtggag ataaaacgta ctgatgtaga 420 agggaattgg gctctgacag gaggcatgga actgacaaga gaccccactg tccctgagca 480 tgcgtcctta gtcggtcttc tcttgagtct gtataggttg agcaaaatat ccgggcaaaa 540 cactggtaac tataagacaa acattgcaga caggatagag cagatttttg agacagcccc 600 ttttgttaaa atcgtggaac accatactct aatgacaact cacaaaatgt gtgctaattg 660 gagtactata ccaaacttca gatttttggc cggaacctat gacatgtttt tctcccggat 720 tgagcatcta tattcagcaa tcagagtggg cacagttgtc actgcttatg aagactgttc 780 aggactggta tcatttactg ggttcataaa acaaatcaat ctcaccgcta gagaggcaat 840 actatatttc ttccacaaga actttgagga agagataaga agaatgtttg agccagggca 900 ggagacagct gttcctcact cttatttcat ccacttccgt tcactaggct tgagtgggaa 960 atctccttat tcatcaaatg ctgttggtca cgtgttcaat ctcattcact ttgtaggatg 1020 ctatatgggt caagtcagat ccctaaatgc aacggttatt gctgcatgtg ctcctcatga 1080 aatgtctgtt ctagggggct atctgggaga ggaattcttc gggaaaggga catttgaaag 1140 aagattcttc agagatgaga aagaacttca agaatacgag gcggctgaac tgacaaagac 12 0 0 tgacgtagca ctggcagatg atggaactgt caactctgac gacgaggact acttctcagg 1260 tgaaaccaga agtccggagg ctgtttatac tcgaatcatg atgaatggag gtcgactaaa 1320 gagatctcac atacggagat atgtctcagt cagttccaat catcaagccc gtccaaactc 1380 attcgccgag tttctaaaca agacatattc gagtgactca taagaagttg aataacaaaa 1440 tgccggaaat ctacggattg tgtatatcca tcatgaaaaa aactaacacc cctcctttcg 1500 aaccatccca aacatgagca agatctttgt caatcctagt gctattagag ccggtctggc 1560 cgatcttgag atggctgaag aaactgttga tctgatcaat agaaatatcg aagacaatca 1620 ggctcatctc caaggggaac ccatagaagt ggacaatctc cctgaggata tggggcgact 1680 tcacctggat gatggaaaat cgcccaaccc tggtgagatg gccaaggtgg gagaaggcaa 1740 gtatcgagag gactttcaga tggatgaagg agaggatcct agcttcctgt tccagtcata 1800 cctggaaaat gttggagtcc aaatagtcag acaaatgagg tcaggagaga gatttctcaa 1860 gatatggtca cagaccgtag aagagattat atcctatgtc gcggtcaact ttcccaaccc 1920 tccaggaaag tcttcagagg ataaatcaac ccagactact ggccgagagc tcaagaagga 1980

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ttgctaaccg aacctctcca ctcagtccct ctagacaata aagtccgaga tgtcctaaag 2460

tcaacatgaa aaaaactaac acccctcctt tcgctgcagc caccatggtt cctcaggctc 2520

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aggacggtga cgaggctgag gattttgttg aagttcacct tcccgatgtg cacaatcagg 3840

tctcaggagt tgacttgggt ctcccgaact gggggaagta tgtattactg agtgcagggg 3 900

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atactgagtt cgtcggattg caaataagag tgattgcaaa acagtgtcat atccagggca 4620

gaatctggtg tatcaacatg aacccgagag catgtcaact atggtctgac atgtctcttc 4680

agacacaaag gtccgaagag gacaaagatt cctctctgct tctagaataa tcagattata 4740

tcccgcaaat ttatcacttg tttacctctg gaggagagaa catatgggct caactccaac 4800

ccttgggagc aatataacaa aaaacatgtt atggtgccat taaaccgctg catttcatca 4860

aagtcaagtt gattaccttt acattttgat cctcttggat gtgaaaaaaa ctaacacccc 4920

tctgcagttt ggtaccttga aaaaaacctg ggttcaatag tcctccttga actccatgca 498 0

actgggtaga ttcaagagtc atgagatttt cattaatcct ctcagttgat caagcaagat 5 040

catgtagatt ctcataatag gggagatctt ctagcagttt cagtgactaa cggtactttc 5100

attctccagg aactgacacc aacagttgta gacaaaccac ggggtgtctc gggtgactct 5160

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gtctcagcaa agtgtgcata attataaagt gctgggtcat ctaagctttt cagtcgagaa 5340

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tgctcgatcc tggagaggtc tatgatgacc ctattgaccc aatcgagtta gaggatgaac 5460

ccagaggaac ccccactgtc cccaacatct tgaggaactc tgactacaat ctcaactctc 5520

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ctttgataga agatcctgct agactaatgt tagaatggtt aaaaacaggg aatagacctt 5580

atcggatgac tctaacagac aattgctcca ggtctttcag agttttgaaa gattatttca 5640

agaaggtaga tttgggttct ctcaaggtgg gcggaatggc tgcacagtca atgatttctc 57 00

tctggttata tggtgcccac tctgaatcca acaggagccg gagatgtata acagacttgg 57 60

cccatttcta ttccaagtcg tcccccatag agaagctgtt gaatctcacg ctaggaaata 5820

gagggctgag aatcccccca gagggagtgt taagttgcct tgagagggtt gattatgata 5880

atgcatttgg aaggtatctt gccaacacgt attcctctta cttgttcttc catgtaatca 5940

ccttatacat gaacgcccta gactgggatg aagaaaagac catcctagca ttatggaaag 6000

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tgctgatcgt gacaaaggac tttgtttact cccaaagttc caattgtctt tttgacagaa 612 0

actacacact tatgctaaaa gatcttttct tgtctcgctt caactcctta atggtcttgc 6180

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agtggaacaa ccatcaaaga ttagagtcaa cagaggatgt attttctgtc ctagatcaag 7320 tgtttggatt gaagagagtg ttttctagaa cacacgagtt ttttcaaaag gcctggatct 7380 attattcaga cagatcagac ctcatcgggt tacgggagga tcaaatatac tgcttagatg 7440 cgtccaacgg cccaacctgt tggaatggcc aggatggcgg gctagaaggc ttacggcaga 7500 agggctggag tctagtcagc ttattgatga tagatagaga atctcaaatc aggaacacaa 7560 gaaccaaaat actagctcaa ggagacaacc aggttttatg tccgacatat atgttgtcgc 7620 cagggctatc tcaagagggg ctcctctatg aattggagag aatatcaagg aatgcacttt 7680 cgatatacag agccgtcgag gaaggggcat ctaagctagg gctgatcatc aagaaagaag 7740 agaccatgtg tagttatgac ttcctcatct atggaaaaac ccctttgttt agaggtaaca 7800 tattggtgcc tgagtccaaa agatgggcca gagtctcttg cgtctctaat gaccaaatag 7860 tcaacctcgc caatataatg tcgacagtgt ccaccaatgc gctaacagtg gcacaacact 7920 ctcaatcttt gatcaaaccg atgagggatt ttctgctcat gtcagtacag gcagtctttc 7980 actacctgct atttagccca atcttaaagg gaagagttta caagattctg agcgctgaag 8040 gggatagctt tctcctagcc atgtcaagga taatctatct agatccttct ttgggagggg 8100 tatctggaat gtccctcgga agattccata tacgacagtt ctcagaccct gtctctgaag 8160 ggttatcctt ctggagagag atctggttaa gctcccacga gtcctggatt cacgcgttgt 8220 gtcaagaggc tggaaaccca gatcttggag agagaacact cgagagcttc actcgccttc 8280 tagaagatcc taccacctta aatatcagag gaggggccag tcctaccatt ctactcaagg 8340 atgcaatcag aaaggcttta tatgacgagg tggacaaggt ggagaattca gagtttcgag 8400 aggcaatcct gttgtccaag acccatagag ataattttat actcttctta acatctgttg 8460 agcctctgtt tcctcgattt ctcagtgagc tattcagttc gtcttttttg ggaatccccg 8520 agtcaatcat tggattgata caaaactccc gaacgataag aaggcagttt agaaagagtc 8580 tctcaaaaac tttagaagaa tccttctaca actcagagat ccacgggatt agtcggatga 8640 cccagacacc tcagagggtt gggggggtgt ggccttgctc ttcagagagg gcagatctac 8700 ttagggagat ctcttgggga agaaaagtgg taggcacgac agttcctcac ccttctgaga 8760 tgttggggtt acttcccaag tcctctattt cttgcacttg tggagcaaca ggaggaggca 8820 atcctagagt ttctgtatca gtactcccgt cctttgatca gtcatttttt tcacgaggcc 8880 ccctaaaggg gtacttgggc tcgtccacct ctatgtcgac ccagctattc catgcatggg 8940 aaaaagtcac taatgttcat gtggtgaaga gagctctatc gttaaaagaa tctataaact 9000 ggttcattac tagagattcc aacttggctc aagctctaat taggaacatt .atgtctctga 9060

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caggccctga tttccctcta gaggaggccc ctgtcttcaa aaggacgggg tcagccttgc 9120 ataggttcaa gtctgccaga fcacagcgaag gagggtattc ttctgtctgc ccgaacctcc 9180 tctctcatat ttctgttagt acagacacca tgtctgattt gacccaagac gggaagaact 9240 acgatttcat gttccagcca ttgatgcttt atgcacagac atggacatca gagctggtac 9300 agagagacac aaggctaaga gactctacgt ttcattggca cctccgatgc aacaggtgtg 9360 tgagacccat tgacgacgtg accctggaga cctctcagat cttcgagttt ccggatgtgt 9420 cgaaaagaat atccagaatg gtttctgggg ctgtgcctca cttccagagg cttcccgata 9480 tccgtctgag accaggagat tttgaatctc taagcggtag agaaaagtct caccatatcg 9540 gatcagctca ggggctctta tactcaatct tagtggcaat tcacgactca ggatacaatg 9600 atggaaccat cttccctgtc aacatatacg acaaggtttc ccctagagac tatttgagag 9660 ggctcgcaag gggagtattg ataggatcct cgatttgctt cttgacaaga atgacaaata 9720 tcaatattaa tagacctctt gaattgatct caggggtaat ctcatatatt ctcctgaggc 9780 tagataacca tccctccttg tacataatgc tcagagaacc gtctcttaga ggagagatat 9840 tttctatccc tcagaaaatc cccgccgctt atccaaccac tatgaaagaa ggcaacagat 9900 caatcttgtg ttatctccaa catgtgctac gctatgagcg agagataatc acggcgtctc 9960 cagagaatga ctggctatgg atcttttcag actttagaag tgccaaaatg acgtacctaa 10020 ccctcattac ttaccagtct catcttctac tccagagggt tgagagaaac ctatctaaga 10080 gtatgagaga taacctgcga caattgagtt ccttgatgag gcaggtgctg ggcgggcacg 10140 gagaagatac cttagagtca gacgacaaca ttcaacgact gctaaaagac tctttacgaa 10200 ggacaagatg ggtggatcaa gaggtgcgcc atgcagctag aaccatgact ggagattaca 10260 gccccaacaa gaaggtgtcc cgtaaggtag gatgttcaga atgggtctgc tctgctcaac 10320 aggttgcagt ctctacctca gcaaacccgg cccctgtctc ggagcttgac ataagggccc 10380 tctctaagag gttccagaac cctttgatct cgggcttgag agtggttcag tgggcaaccg 10440 gtgctcatta taagcttaag cctattctag atgatctcaa tgttttccca tctctctgcc 10500 ttgtagttgg ggacgggtca ggggggatat caagggcagt cctcaacatg tttccagatg 10560 ccaagcttgt gttcaacagt ctcttagagg tgaatgacct gatggcttcc ggaacacatc 10620 cactgcctcc ttcagcaatc atgaggggag gaaatgatat cgtctccaga gtgatagatt 10680 ttgactcaat ctgggaaaaa ccgtccgact tgagaaactt ggcaacctgg aaatacttcc 10740 agtcagtcca aaagcaggtc aacatgtcct atgacctcat tatttgcgat gcagaagtta 10800

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attcgccgag tttctaaaca agacatattc gagtgactca taagaagttg aataacaaaa 1440 tgccggaaat ctacggattg tgtatatcca tcatgaaaaa aactaacacc cctcctttcg 1500 aaccatccca aacatgagca agatctttgt caatcctagt gctattagag ccggtctggc 1560 cgatcttgag atggctgaag aaactgttga tctgatcaat agaaatatcg aagacaatca 1620 ggctcatctc caaggggaac ccatagaagt ggacaatctc cctgaggata tggggcgact 1680 tcacctggat gatggaaaat cgcccaaccc tggtgagatg gccaaggtgg gagaaggcaa 1740 gtatcgagag gactttcaga tggatgaagg agaggatcct agcttcctgt tccagtcata 1800 cctggaaaat gttggagtcc aaatagtcag acaaatgagg tcaggagaga gatttctcaa 1860 gatatggtca cagaccgtag aagagattat atcctatgtc gcggtcaact ttcccaaccc 1920 tccaggaaag tcttcagagg ataaatcaac ccagactact ggccgagagc tcaagaagga 1980 gacaacaccc actccttctc agagagaaag ccaatcatcg aaagccagga tggcggctca 2040 aattgcttct ggccctccag cccttgaatg gtcggccacc aatgaagagg atgatctatc 2100 agtggaggct gagatcgctc accagattgc agaaagtttc tccaaaaaat ataagtttcc 2160 ctctcgatcc tcagggatac tcttgtataa ttttgagcaa ttgaaaatga accttgatga 2220 tatagttaaa gaggcaaaaa atgtaccagg tgtgacccgt ttagcccatg acgggtccaa 2280 actcccccta agatgtgtac tgggatgggt cgctttggcc aactctaaga aattccagtt 2340 gttagtcgaa tccgacaagc tgagtaaaat catgcaagat gacttgaatc gctatacatc 2400 ttgctaaccg aacctctcca ctcagtccct ctagacaata aagtccgaga tgtcctaaag 2460 tcaacatgaa aaaaactaac acccctcctt tcgctgcagc caccatggtt cctcaggctc 2520 tcctgtttgt accccttctg gtttttccat tgtgttttgg gaaattccct atttacacga 2580 taccagacaa gcttggtccc tggagcccga ttgacataca tcacctcagc tgcccaaaca 2640 atttggtagt ggaggacgaa ggatgcacca acctgtcagg gttctcctac atggaactta 2700 aagttggata catcttagcc ataaaaatga acgggttcac ttgcacaggc gttgtgacgg 2760 aggctgaaac ctacactaac ttcgttggtt atgtcacaac cacgttcaaa agaaagcatt 2820 tccgcccaac accagatgca tgtagagccg cgtacaactg gaagatggcc ggtgacccca 2880 gatatgaaga gtctctacac aatccgtacc ctgactacca ctggcttcga actgtaaaaa 2940 ccaccaagga gtctctcgtt atcatatctc caagtgtggc agatttggac ccatatgaca 3000 gatcccttca ctcgagggtc ttccctagcg ggaagtgctc aggagtagcg gtgtcttcta 3060 cctactgctc cactaaccac gattacacca tttggatgcc cgagaatccg agactaggga 3120

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tgtcttgtga catttttacc aatagtagag ggaagagagc atccaaaggg agtgagactt 3180 gcggctttgt agatgaaaga ggcctatata agtctttaaa aggagcatgc aaactcaagt 3240 tatgtggagt tctaggactt agacttatgg atggaacatg ggtcgcgatg caaacatcaa 3300 atgaaaccaa atggtgccct cccgatcagt tggtgaacct gcacgacttt cgctcagacg 3360 aaattgagca ccttgttgta gaggagttgg tcaggaagag agaggagtgt ctggatgcac 3420 tagagtccat catgacaacc aagtcagtga gtttcagacg tctcagtcat ttaagaaaac 3480 ttgtccctgg gtttggaaaa gcatatacca tattcaacaa gaccttgatg gaagccgatg 3540 ctcactacaa gtcagtcaga acttggaatg agatcctccc ttcaaaaggg tgtttaagag 3600 ttggggggag gtgtcatcct catgtgaacg gggtgttttt caatggtata atattaggac 3660 ctgacggcaa tgtcttaatc ccagagatgc aatcatccct cctccagcaa catatggagt 3720 tgttggaatc ctcggttatc ccccttgtgc accccctggc agacccgtct accgttttca 3780 aggacggtga cgaggctgag gattttgttg aagttcacct tcccgatgtg cacaatcagg 3840 tctcaggagt tgacttgggt ctcccgaact gggggaagta tgtattactg agtgcagggg 3900 ccctgactgc cttgatgttg ataattttcc tgatgacatg ttgtagaaga gtcaatcgat 3960 cagaacctac gcaacacaat ctcagaggga cagggaggga ggtgtcagtc actccccaaa 4020 gcgggaagat catatcttca tgggaatcac acaagagtgg gggtgagacc agactgtgat 4080 ttggtaccgt cgagaaaaaa acaggcaaca ccactgataa aatgaacttt ctacgtaaga 4140 tagtgaaaaa ttgcagggac gaggacactc aaaaaccctc tcccgtgtca gcccctctgg 4200 atgacgatga cttgtggctt ccaccccctg aatacgtccc gctgaaagaa cttacaagca 4260 agaagaacat gaggaacttt tgtatcaacg gaggggttaa agtgtgtagc ccgaatggtt 4320 actcgttcag gatcctgcgg cacattctga aatcattcga cgagatatat tctgggaatc 4380 ataggatgat cgggttagtc aaagtagtta ttggactggc tttgtcagga tctccagtcc 4440 ctgagggcat gaactgggta tacaaattga ggagaacctt tatcttccag tgggctgatt 4500 ccaggggccc tcttgaaggg gaggagttgg aatactctca ggagatcact tgggatgatg 4560 atactgagtt cgtcggattg caaataagag tgattgcaaa acagtgtcat atccagggca 4620 gaatctggtg tatcaacatg aacccgagag catgtcaact atggtctgac atgtctcttc 4680 agacacaaag gtccgaagag gacaaagatt cctctctgct tctagaataa tcagattata 4740 tcccgcaaat ttatcacttg tttacctctg gaggagagaa catatgggct caactccaac 4800 ccttgggagc aatataacaa aaaacatgtt atggtgccat taaaccgctg catttcatca 4860 aagtcaagtt gattaccttt acattttgat cctcttggat gtgaaaaaaa ctattaacat 4920

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ccctcaaaag actcaaggaa agatggttcc tcaggctctc ctgtttgtac cccttctggt 4980 ttttccattg tgttttggga aattccctat ttacacgata ccagacaagc ttggtccctg 5040 gagcccgatt gacatacatc acctcagctg cccaaacaat ttggtagtgg aggacgaagg 5100 atgcaccaac ctgtcagggt tctcctacat ggaacttaaa gttggataca tcttagccat 5160 aaaaatgaac gggttcactt gcacaggcgt tgtgacggag gctgaaacct acactaactt 5220 cgttggttat gtcacaacca cgttcaaaag aaagcatttc cgcccaacac cagatgcatg 5280 tagagccgcg tacaactgga agatggccgg tgaccccaga tatgaagagt ctctacacaa 5340 tccgtaccct gactaccact ggcttcgaac tgtaaaaacc accaaggagt ctctcgttat 5400 catatctcca agtgtggcag atttggaccc atatgacaga tcccttcact cgagggtctt 5460 ccctagcggg aagtgctcag gagtagcggt gtcttctacc tactgctcca ctaaccacga 5520 ttacaccatt tggatgcccg agaatccgag actagggatg tcttgtgaca tttttaccaa 5580 tagtagaggg aagagagcat ccaaagggag tgagacttgc ggctttgtag atgaaagagg 5640 cctatataag tctttaaaag gagcatgcaa actcaagtta tgtggagttc taggacttag 5700 acttatggat ggaacatggg tcgcgatgca aacatcaaat gaaaccaaat ggtgccctcc 5760 cgatcagttg gtgaacctgc acgactttcg ctcagacgaa attgagcacc ttgttgtaga 5820 ggagttggtc aggaagagag aggagtgtct ggatgcacta gagtccatca tgacaaccaa 5880 gtcagtgagt ttcagacgtc tcagtcattt aagaaaactt gtccctgggt ttggaaaagc 5940 atataccata ttcaacaaga ccttgatgga agccgatgct cactacaagt cagtcagaac 6000 ttggaatgag atcctccctt caaaagggtg tttaagagtt ggggggaggt gtcatcctca 6060 tgtgaacggg gtgtttttca atggtataat attaggacct gacggcaatg tcttaatccc 6120 agagatgcaa tcatccctcc tccagcaaca tatggagttg ttggaatcct cggttatccc 6180 ccttgtgcac cccctggcag acccgtctac cgttttcaag gacggtgacg aggctgagga 6240 ttttgttgaa gttcaccttc ccgatgtgca caatcaggtc tcaggagttg acttgggtct 6300 cccgaactgg gggaagtatg tattactgag tgcaggggcc ctgactgcct tgatgttgat 6360 aattttcctg atgacatgtt gtagaagagt caatcgatca gaacctacgc aacacaatct 6420 cagagggaca gggagggagg tgtcagtcac tccccaaagc gggaagatca tatcttcatg 6480 ggaatcacac aagagtgggg gtgagaccag actgtgagga ctggccgtcc tttcaactat 6540 ccaagtcctg aagatcacct ccccttgggg ggttcttttt gaaaaaaacc tgggttcaat 6600 agtcctcctt gaactccatg caactgggta gattcaagag tcatgagatt ttcattaatc 6660

120/137 WO 2007/047459 PCT/US2006/040134

ctctcagttg atcaagcaag atcatgtaga ttctcataat aggggagatc ttctagcagt 6720 ttcagtgact aacggtactt tcattctcca ggaactgaca ccaacagttg tagacaaacc 6780 acggggtgtc tcgggtgact ctgtgcttgg gcacagacaa aggtcatggt gtgttccatg 6840 atagcggact caggatgagt taattgagag aggcagtctt cctcccgtga aggacataag 6900 cagtagctca caatcatctc gcgtctcagc aaagtgtgca taattataaa gtgctgggtc 6960 atctaagctt ttcagtcgag aaaaaaacat tagatcagaa gaacaactgg caacacttct 7020 caacctgaga cctacttcaa gatgctcgat cctggagagg tctatgatga ccctattgac 7080 ccaatcgagt tagaggatga acccagagga acccccactg tccccaacat cttgaggaac 7140 tctgactaca atctcaactc tcctttgata gaagatcctg ctagactaat gttagaatgg 7200 ttaaaaacag ggaatagacc ttatcggatg actctaacag acaattgctc caggtctttc 7260 agagttttga aagattattt caagaaggta gatttgggtt ctctcaaggt gggcggaatg 7320 gctgcacagt caatgatttc tctctggtta tatggtgccc actctgaatc caacaggagc 7380 cggagatgta taacagactt ggcccatttc tattccaagt cgtcccccat agagaagctg 7440 ttgaatctca cgctaggaaa tagagggctg agaatccccc cagagggagt gttaagttgc 7500 cttgagaggg ttgattatga taatgcattt ggaaggtatc ttgccaacac gtattcctct 7560 tacttgttct tccatgtaat caccttatac atgaacgccc tagactggga tgaagaaaag 762 0 accatcctag cattatggaa agatttaacc tcagtggaca tcgggaagga cttggtaaag 7680 ttcaaagacc aaatatgggg actgctgatc gtgacaaagg actttgttta ctcccaaagt 7740 tccaattgtc tttttgacag aaactacaca cttatgctaa aagatctttt cttgtctcgc 7800 ttcaactcct taatggtctt gctctctccc ccagagcccc gatactcaga tgacttgata 7860 tctcaactat gccagctgta cattgctggg gatcaagtct tgtctatgtg tggaaactcc 7920 ggctatgaag tcatcaaaat attggagcca tatgtcgtga atagtttagt ccagagagca 7980 gaaaagttta ggcctctcat tcattccttg ggagactttc ctgtatttat aaaagacaag 8040 gtaagtcaac ttgaagagac gttcggtccc tgtgcaagaa ggttctttag ggctctggat 8100 caattcgaca acatacatga cttggttttt gtgtatggct gttacaggca ttgggggcac 8160 ccatatatag attatcgaaa gggtctgtca aaactatatg atcaggttca cattaaaaaa 8220 gtgatagata agtcctacca ggagtgctta gcaagcgacc tagccaggag gatccttaga 8280 tggggttttg ataagtactc caagtggtat ctggattcaa gattcctagc ccgagaccac 8340 cccttgactc cttatatcaa aacccaaaca tggccaccca aacatattgt agacttggtg 8400 ggggatacat ggcacaagct cccgatcacg cagatctttg agattcctga atcaatggat 8460

121/137 WO 2007/047459 PCT/US2006/040134

ccgtcagaaa tattggatga caaatcacat tctttcacca gaacgagact agcttcttgg 8520

ctgtcagaaa accgaggggg acctgttcct agcgaaaaag ttattatcac ggccctgtct 8580

aagccgcctg tcaatccccg agagtttctg aggtctatag acctcggagg attgccagat 8640

gaagacttga taattggcct caagccaaag gaacgggaat tgaagattga aggtcgattc 8700

tttgctctaa tgtcatggaa tctaagattg tattttgtca tcactgaaaa actcttggcc 8760

aactacatct tgccactttt tgacgcgctg actatgacag acaacctgaa caaggtgttt 8820

aaaaagctga tcgacagggt caccgggcaa gggcttttgg actattcaag ggtcacatat 8880

gcatttcacc tggactatga aaagtggaac aaccatcaaa gattagagtc aacagaggat 8940

gtattttctg tcctagatca agtgtttgga ttgaagagag tgttttctag aacacacgag 9000

ttttttcaaa aggcctggat ctattattca gacagatcag acctcatcgg gttacgggag 9060

gatcaaatat actgcttaga tgcgtccaac ggcccaacct gttggaatgg ccaggatggc 9X20

gggctagaag gcttacggca gaagggctgg agtctagtca gcttattgat gatagataga 9180

gaatctcaaa tcaggaacac aagaaccaaa atactagctc aaggagacaa ccaggtttta 9240

tgtccgacat atatgttgtc gccagggcta tctcaagagg ggctcctcta tgaattggag 9300

agaatatcaa ggaatgcact ttcgatatac agagccgtcg aggaaggggc atctaagcta 9360

gggctgatca tcaagaaaga agagaccatg tgtagttatg acttcctcat ctatggaaaa 9420

acccctttgt ttagaggtaa catattggtg cctgagtcca aaagatgggc cagagtctct 9480

tgcgtctcta atgaccaaat agtcaacctc gccaatataa tgtcgacagt gtccaccaat 9540

gcgctaacag tggcacaaca ctctcaatct ttgatcaaac cgatgaggga ttttctgctc 9600

atgtcagtac aggcagtctt tcactacctg ctatttagcc caatcttaaa gggaagagtt 9660

tacaagattc tgagcgctga aggggatagc tttctcotag ccatgtcaag gataatctat 972 0

ctagatcctt ctttgggagg ggtatctgga atgtccctcg gaagattcca tatacgacag 9780

ttctcagacc ctgtctctga agggttatcc ttctggagag agatctggtt aagctcccac 9840

gagtcctgga ttcacgcgtt gtgtcaagag gctggaaacc cagatcttgg agagagaaca 9900

ctcgagagct tcactcgcct tctagaagat cctaccacct taaatatcag aggaggggcc 9960

agtcctacca ttctactcaa ggatgcaatc agaaaggctt tatatgacga ggtggacaag 1002 0

gtggagaatt cagagtttcg agaggcaatc ctgttgtcca agacccatag agataatttt 10080

atactcttct taacatctgt tgagcctctg tttcctcgat ttctcagtga gctattcagt 1014 0

tcgtcttttt tgggaatccc cgagtcaatc attggattga tacaaaactc ccgaacgata 10200

122/137 WO 2007/047459 PCT/US2006/040134

agaaggcagt ttagaaagag tctctcaaaa actttagaag aatccttcta caactcagag 10260 atccacggga ttagtcggat gacccagaca cctcagaggg ttgggggggt gtggccttgc 10320 tcttcagaga gggcagatct acttagggag atctcttggg gaagaaaagt ggtaggcacg 10380 acagttcctc acccttctga gatgttgggg ttacttccca agtcctctat ttcttgcact 10440 tgtggagcaa caggaggagg caatcctaga gtttctgtat cagtactccc gtcctttgat IO5OO cagtcatttt tttcacgagg ccccctaaag gggtacttgg gctcgtccac ctctatgtcg 10550 acccagctat tccatgcatg ggaaaaagtc actaatgttc atgtggtgaa gagagctcta 10620 tcgttaaaag aatctataaa ctggttcatt actagagatt ccaacttggc tcaagctcta 10680 attaggaaca ttatgtctct gacaggccct gattCccctc tagaggaggc ccctgtcttc 10740 aaaaggacgg ggtcagcctt gcataggttc aagtctgcca gatacagcga aggagggtat 10800 tcttctgtct gcccgaacct cctctctcat atttctgtta gtacagacac catgtctgat 10860 ttgacccaag acgggaagaa ctacgatttc atgttccagc cattgatgct ttatgcacag 10920 acatggacat cagagctggt acagagagac acaaggctaa gagactctac gtttcattgg 10980 cacctccgat gcaacaggtg tgtgagaccc attgacgacg tgaccctgga gacctctcag 11040 atcttcgagt ttccggatgt gtcgaaaaga atatccagaa tggtttctgg ggctgtgcct llioo cacttccaga ggcttcccga tatccgtctg agaccaggag attfctgaatc tctaagcggt Hi6O agagaaaagt ctcaccatat cggatcagct caggggctct tatactcaat cttagtggca 1122 0 attcacgact caggatacaa tgatggaacc atcttccctg tcaacatata cgacaaggtt 11280 tcccctagag actatttgag agggctcgca aggggagtat tgataggatc ctcgatttgc 11340 ttcttgacaa gaatgacaaa tatcaatatt aatagacctc ttgaattgat ctcaggggta 11400 atctcatata ttctcctgag gctagataac catccctcct tgtacataat gctcagagaa 11460 ccgtctctta gaggagagat attttctatc cctcagaaaa tccccgccgc fctatccaacc 1152 0 actatgaaag aaggcaacag atcaatcttg tgttatctcc aacatgtgct acgctatgag H580 cgagagataa tcacggcgtc tccagagaat gactggctat ggatcttttc agactfctaga 11640 agtgccaaaa tgacgtacct aaccctcatt acttaccagt ctcatcttct actccagagg H700 gttgagagaa acctatctaa gagtatgaga gataacctgc gacaattgag ttccttgatg 11760 aggcaggtgc tgggcgggca cggagaagat accttagagt cagacgacaa cattcaacga 11820 ctgctaaaag actctttacg aaggacaaga tgggtggatc aagaggtgcg ccatgcagct 11880 agaaccatga ctggagatta cagccccaac aagaaggtgt cccgtaaggt aggatgttca 11940 gaatgggtct gctctgctca acaggttgca gtctctacct cagcaaaccc ggcccctgtc 12000

123/137 WO 2007/047459 PCT/US2006/040134

tcggagcttg acataagggc cctctctaag aggttccaga accctttgat ctcgggcttg 12060 agagtggttc agtgggcaac cggtgctcat tataagctta agcctattct agatgatctc 12120 aatgttttcc catctctctg ccttgtagtt gSSSacgggt caggggggat atcaagggca 12180 gtcctcaaca tgtttccaga tgccaagctt gtgttcaaca gtctcttaga ggtgaatgac 12240 ctgatggctt ccggaacaca tccactgcct ccttcagcaa tcatgagggg aggaaatgat 12300 atcgtctcca gagtgataga ttttgactca atctgggaaa aaccgtccga cttgagaaac 12360 ttggcaacct ggaaatactt ccagtcagtc caaaagcagg tcaacatgtc ctatgacctc 12420 attatttgcg atgcagaagt tactgacatt gcatctatca accggataac cctgttaatg 12480 tccgattttg cattgtctat agatggacca ctctatttgg tcttcaaaac ttatgggact 12540 atgctagtaa atccaaacta caaggctatt caacacctgt caagagcgtt cccctcggtc 12600 acagggttta tcacccaagt aacttcgtct ttttcatctg agctctacct ccgattctcc 12660 aaacgaggga agtttttcag agatgctgag tacttgacct cttccaccct tcgagaaatg 12720 agccttgtgt tattcaattg tagcagcccc aagagtgaga tgcagagagc tcgttccttg 12780 aactatcagg atcttgtgag aggatttcct gaagaaatca tatcaaatcc ttacaatgag 12840 atgatcataa ctctgattga cagtgatgta gaatcttttc tagtccacaa gatggttgat 12900 gatcttgagt tacagagggg aactctgtct aaagtggcta tcattatagc catcatgata 12960 gttttctcca acagagtctt caacgtttcc aaacccctaa ctgacccctt gttctatcca 13020 ccgtctgatc ccaaaatcct gaggcacttc aacatatgtt gcagtactat gatgtatcta 13080 tctactgctt taggtgacgt ccctagcttc gcaagacttc acgacctgta taacagacct 13140 ataacttatt acttcagaaa gcaattcatt cgagggaacg tttatctatc ttggagttgg 13200 tccaacgaca cctcagtgtt caaaagggta gcctgtaatt ctagectgag tctgtcatct 13260 cactggatca ggttgattta caagatagtg aagactacca gactcgttgg cagcatcaag 13320 gatctatcca gagaagtgga aagacacctt cataggtaca acaggtggat caccctagag 13380 gatatcagat ctagatcatc cctactagac tacagttgcc tgtgatccgg atactcctgg 13440 aagcctgccc atgctaagac tcttgtgtga tgtatcttga aaaaaacaag atcctaaatc 13500 tgaacctttg gttgtttgat tgtttttctc atttttgttg tttatttgtt aagcgt 13556

<210> 19

<211> 10

<212> DNA

<213> artificial sequence

124/137 WO 2007/047459 PCT/US2006/040134 <220>

<223> hammerhead terminuB

<400> 19 tgttaagcgt

10

<210> 20 <211> 27 <212> DNA

<213> artificial sequence <220>

<223> synthetic oligonucleotide encoding SV40 nuclear localization signal

<4 00> 20

atgccaaaaa agaagagaaa ggtagaa

<210> 21

<211> 10

<212> DNA

<213 > artificial sequence <220>

<223> Artificial Kozak sequence

<400 > 21

accaccatgg

<210> 22

<211> 10

<212> DNA

<213> artificial sequence <22 0>

<223> Artificial Kozak sequence

<400> 22

accaccatga ^o

<210> 23

<211> 10

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223 > Artificial Kozak sequence <400> 23

accaccatgc

10

<210> 24 <211> 11 <212> DNA

125/137 WO 2007/047459 <213> artificial sequence <220 >

<223> oligonucleotide primer Le5

<400> 24 acgcttaaca a

<210> 25

<211> 24

<212> DNA

<213> artificial sequence <220 >

<223> oligonucleotide primer Blp5

<400> 25

gtcgcttgct aagcactcct ggta

<210> 26

<211> 11

<212> DNA

<213> artificial sequence <22 0>

<223> oligonucleotide primer Le3

<400> 26 tgcgaattgt t

<210> 27

<211> 24

<212> DNA

<213> artificial sequence <220>

<223> oligonucleotide primer Blp5

<400> 27

ccaggagtgc ttagcaagcg acct

<210> 28 <211> 32 <212 > DNA <213> artificial sequence <22 0> <223 > oligonucleotide primer <4 00> 28

ccgggtacca cgcttaacaa ccagatcaaa ga

<210> 29 <211> 31

PCT/US2006/040134

11

24

11

24

126/137 WO 2007/047459 PCT/US2006/040134

<212> DNA

<213> artificial sequence <220>

<223> oligonucleotide primer Le3-Blp <4 00> 29

taggtcgctt gctaagcact ccfcggtagga c

<210> 30

<211> 31

<212> DNA

<213 > artificial sequence <220>

<223> oligonucleotide primer TrS-Blp

<4 00 > 30

gtcctaccag gagtgcttag caagcgacct a

<210> 31

<211> 34

<212> DNA

<213> artificial sequence <220>

<223> oligonucleotide primer Tr3-Pst

<400> 31

aaaactgcag acgcttaaca aataaacaac aaaa

<210> 32 <211> 79 <212> DNA

<213> artificial sequence <22 0>

<223> oligonucleotide primer HHl <400 > 32

caaggctagc tgttaagcgt ctgatgagtc cgtgaggacg aaactatagg aaaggaattc ctatagtcgg taccacgct

<210> 33

<211> 79

<212> DNA

<213 > artificial sequence <22 0>

<223> oligonucleotide primer HH2

<40 0> 33

agcgtggtac cgactatagg aattcctttc ctatagtttc gtcctcacgg actcatcaga

127/137 WO 2007/047459 PCT/US2006/040134

cgcttaacag ctagccttg

<210> 34 <211> 108 <212> DNA

<213 > artificial sequence <220>

<223> oligonucleotide priraer HDV3 <400> 34

gacctgcagg ggtcggcatg gcatctccac ctcctcgcgg tccgacctgg gcatccgaag gaggacgcac gtccactcgg atggctaagg gagggcgcgg ccgcactc

<210> 35 <211> 108 <212> DNA

<213 > artificial sequence <22 0>

<223> oligonucleotide primer HDV 4 <400> 35

gagtgcggcc gcgccctccc ttagccatcc gagtggacgt gcgtcctcct tcggatgccc aggtcggacc gcgaggaggt ggagatgcca tgccgacccc tgcaggtc

<21Q> 36

<211> 25

<212> DNA

<213> artificial sequence <220>

<223> oligonucleotide primer 5N

<40Q> 36

accaccatgg atgccgacaa gattg

<210> 37

<211> 33

<212> DNA

<213 > artificial sequence <22 0>

<223> oligonucleotide primer 3N

<400> 37

ggcccatggt tatgagtcac tcgaatatgt ctt

<210 > 38

<211> 33

<212> DNA

<213> artificial

sequence

128/137 WO 2007/047459 PCT/US2006/040134 <220>

<223> oligonucleotide primer 5Ρ

<400> 38

ttggtaccac catgagcaag atctttgtca ate 33

<210> 39 <211> 34 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223 > oligonucleotide primer <400> 39

ggagaggaat tcttagcaag atgtatagcg attc 34

<210> 40 <211> 32 <212> DNA <213 > artificial sequence <220> <223 > oligonucleotide primer 5G <400> 40 ttggtaccac catggttcct caggctctcc

32

<210> 41 <211> 33 <212 > DNA <213> artificial sequence <220> <223 > oligonucleotide primer <400> 41

aaaactgcag tcacagtctg gtctcacccc cac 33

<210> 42 <211> 36 <212> DNA <213 > artificial sequence <220> <223 > oligonucleotide primer <4 00> 42

accgctagca ccaccatgct cgatcctgga gaggtc

<210> 43 <211> 34 <212 > DNA

129/137 WO 2007/047459 PCT/US2006/040134

<213> artificial sequence <220>

<223> oligonucleotide primer 3L <400> 43

aaaactgcag tcacaggcaa ctgtagtcta gtag 3

<210> 44

<211> 38

<212> DNA

<213> artificial sequence <220>

<223> oligonucleotide primer 5T7

<400> 44

tcgctagcac caccatgaac acgattaaca tcgctaag 3

<210> 45

<211> 33

<212> DNA

<213 > artificial sequence <220>

<223> oligonucleotide primer 3T7

<4 00 > 45

gatgaattct tacgcgaacg cgaagtccga ctc 3,

<210> 46 <211> 63 <212> DNA

<213> artificial sequence <220>

<223> oligonucleotide primer 5T7NLS <4 00> 46

tcgctagcca ccatgccaaa aaagaagaga aaggtagaaa acacgattaa catcgcfcaag 60 aac

63

<210> 47 <211> 31 <212> DNA

<213 > artificial sequence <220>

<223> oligonucleotide primer GFP5 <400> 47

aaaactgcag gccaccatgg gcgtgatcaa g

130/137 WO 2007/047459 <210> 48 <211> 31 <212> DNA <213 > artificial sequence <220> <223 > oligonucleotide primer <400 > 48

ccgctcggta cctattagcc ggcctggcgg g

<210> 49 <211> 25 <212> DNA <213 > artificial sequence <22 0 > <223 > oligonucleotide primer <400> 49 caccatggtt cctcaggctc tcctg <210 > 50 <211> 23 <212 > DNA <213> artificial sequence <220> <223 > oligonucleotide primer <400> 50

tcacagtctg gtctcacccc cac

<210> 51 <211> 46

<212> DNA

<213> artificial seguence <220>

<223> oligonucleotide primer 5delpsi

<4 00> 51

ccctctgcag tttggtaccg tcgagaaaaa aacattagat

<210> 52

<211> 24

<212> DNA

<213> artificial sequence ' <220>

<223> oligonucleotide primer SnaBS

<4 0 0> 52

atgaactttc tacgtaagat agtg

PCT/US2006/040134

31

25

23

46

131/137 WO 2007/047459 PCT/US2006/040134

<210> 53

<211> 46

<212> DNA

<213> artificial sequence <22 0>

<223> oligonucleotide primer 3delpsi

<400> 53

caaactgcag aggggtgtta gtttttttca aaaagaaccc cccaag 4 6

<210> 54 <211> 44 <212> DNA <213 > artificial sequence <220> <223 > oligonucleotide primer <400> 54

caaactgcag aggggtgtta gtttttttca catccaagag gatc 44

<210> 55

<211> 42

<212> DITA

<213> artificial sequence <220>

<223> oligonucleotide primer Sdeltag

<400> 55

cctctgcagt ttggtacctt gaaaaaaacc tgggttcaat ag 42

<210> 55

<211> 35

<212> DNA

<213 > artificial sequence <220>

<223> oligonucleotide primer M5G

<400> 56

ctcactacaa gtcagtcgag acttggaatg agatc 35

<210 > 57

<211> 35

<212 > DNA

<213 > artificial sequence <220>

<223> oligonucleotide primer M3G

<400 > 57

gactgacttt gagtgagcat cggcttccat caagg 35

132/137 WO 2007/047459 PCT/US2006/040134

<210> 58 <211> 524 <212> PRT

<213 > artificial sequen.ce <22 0>

<223> Mutated G protein Aa333 <400> 58

Met Val Pro Gln Ala Leu Leu Phe Val Pro Leu Leu Val Phe Pro Leu 10 15

Cys Phe Gly Lys Phe Pro Ile Tyr Thr Ile Pro Asp Lys Leu Gly Pro 25 30

Trp Ser Pro Ile Asp Ile His His Leu Ser Cys Pro Asn Asn Leu Val 40 45

Val Glu Asp Glu Gly Cys Thr Asn Leu Ser Gly Phe Ser Tyr Met Glu 50 55 60

Leu Lys Val Gly Tyr Ile Leu Ala Ile Lys Met Asn Gly Phe Thr Cys 65 70 75 80

Thr Gly Val Val Thr Glu Ala Glu Thr Tyr Thr Asn Phe Val Gly Tyr 85 90 95

Val Thr Thr Thr Phe Lys Arg Lys His Phe Arg Pro Thr Pro Asp Ala 100 105 lio

Cye Arg Ala Ala Tyr Asn Trp Lys Met Ala Gly Asp Pro Arg Tyr Glu 115 120 125

Glu Ser Leu His Asn Pro Tyr Pro Asp Tyr His Trp Leu Arg Thr Val 130 135 140

Lys Thr Thr Lys Glu Ser Leu Val Ile Ile Ser Pro Ser Val Ala Asp 145 150 155 160

Leu Asp Pro Tyr Asp Arg Ser Leu His Ser Arg Val Phe Pro Ser Gly 165 170 175

Lys Cys Ser Gly Val Ala Val Ser Ser Thr Tyr Cys Ser Thr Asn His 180 185 190

133/137 WO 2007/047459 PCT/US2006/040134

Asp Tyr Thr Ile Trp Met Pro Glu Asn Pro Arg Leu Gly Met Ser Cys 195 200 205

Asp Ile Phe Thr Asn Ser Arg Gly Lys Arg Ala Ser Lys Gly Ser Glu 210 215 220

Thr Cys Gly Phe Val Asp Glu Arg Gly Leu Tyr Lys Ser Leu Lys Gly 225 230 235 240

Ala Cys Lys Leu Lys Leu Cys Gly Val Leu Gly Leu Arg Leu Met Asp 245 250 255

Gly Thr Trp Val Ala Met Gln Thr Ser Asn Glu Thr Lys Trp Cys Pro 260 265 270

Pro Asp Gln Leu Val Asn Leu His Asp Phe Arg Ser Asp Glu Ile Glu 275 280 285

His Leu Val Val Glu Glu Leu Val Arg Lys Arg Glu Glu Cys Leu Asp 290 295 300

Ala Leu Glu Ser Ile Met Thr Thr Lys Ser Val Ser Phe Arg Arg Pro 305 310 315 320

Ser His Leu Arg Lys Leu Val Pro Gly Phe Gly Lys Ala Tyr Thr Ile 325 330 335

Phe Asn Lys Thr Leu Met Glu Ala Asp Ala His Tyr Lys Ser Val Glu 340 345 350

Thr Trp Asn Glu Ile Leu Pro Ser Lys Gly Cys Leu Arg Val Gly Gly 355 360 365

Arg Cys His Pro His Val Asn Gly Val Phe Phe Asn Gly Ile Ile Leu 370 375 380

Gly Pro Asp Gly Asn Val Leu Ile Pro Glu Met Gln Sèr Ser Leu Leu 385 390 395 400

Gln Gln His Met Glu Leu Leu Glu Ser Ser Val Ile Pro Leu Val His 405 410 415

Pro Leu Ala Asp Pro Ser Thr Val Phe Lys Asp Gly Asp Glu Ala Glu 420 425 430

134/137 WO 2007/047459 PCT/US2006/040134 Asp Phe Val Glu Val His Leu Pro Asp Val His Aen Gln Val Ser Gly 435 440 445

Val Asp Leu Gly Leu Pro Asn Trp Gly Lys Tyr Val Leu Leu Ser Ala 450 '455 460

Gly Ala Leu Thr Ala Leu Met Leu Ile Ile Phe Leu Met Thr Cys Cys 465 470 475 480

Arg Arg Val Asn Arg Ser Glu Pro Thr Gln His Asn Leu Arg Gly Thr 485 490 495

Gly Arg Glu Val Ser Val Thr Pro Gln Ser Gly Lys Ile Ile Ser Ser 500 505 510

Trp Glu Ser His Lys Ser Gly Gly Glu Thr Arg Leu 515 520

<210> 59 <211> 60 <212> DNA <213> artificial sequence <220 > <223 > oligonucleotide primer <400> 59

ccaaactgca gcgaaaggag gggtgttagt ttttttcatg atgaaccccc caaggggagg 60

<210> 60

<211> 39

<212> DNA

<213> artificial sequence <220>

<223> oligonucleotide primer cis55

<400 > 60

gactcactat agggagaccc aagctggcta gctgttaag 3 9

<210> 61

<211> 60

<212> DNA

<213> artificial sequence <220>

<223> oligonucleotide primer cis53

<400> 61

135/137 WO 2007/047459 PCT/US2006/040134

ccaaactgca gcgaaaggag gggtgttagt ttttttcatg ttgactttag gacatctcgg 60

<210> 62 <211> 61 <212> DNA <213> artif χcial sequence <220> <223 > oligonucleotide primer <400> 62

cctttcgctg cagtttggta ccgtcgagaa aaaaacaggc aacaccactg ataaaatgaa 60 c 61

<210> 63 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> cis33 <400> 63

cctccccttc aagagggccc ctggaatcag 3 0

<210> 64

<211> 46

<212> DNA

<213 > artificial sequence <220>

<223> oligonucleotide primer TUl

<400> 64

ctaacacccc tcctttcgct gcagtttggt accgtcgaga aaaaaa 4 6

<210> 65

<211> 53

<212> DNA

<213> artificial sequence <22 0>

<223 > TU2

<400> 65

tttttttgat tgtggggagg aaagcgacgt caaaccatgg cagctctttt ttt 53

136/137 DECLARAÇÃO ANEXADA À LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS A listagem de seqüências não inclui matéria que vá além da divulgação do pedido de patente internacional.

A impressão da Listagem de Seqüências anexada é idêntica à seqüência de leitura por computador no disco de computador encaminhado.

Claims

1. Sistema de vetores compreendendo: - um primeiro vetor compreendendo DNA antigenômico de vírus da raiva completo, caracterizado pelo DNA antigenômico completo ser selecionado a partir de um DNA antigenômico de vírus da raiva completo ou de um derivado deste; e, - uma pluralidade de vetores auxiliares compreendendo ácidos nucléicos que codifiquem ao menos uma proteína de vírus da raiva da linhagem ERA, em que a expressão da pluralidade de vetores em uma célula hospedeira transfectada resulta na produção de um vírus da raiva recombinante.

2. Sistema de vetores de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo DNA antigenômico completo compreender um DNA antigenômico da linhagem ERA ou um derivado deste.

3. Sistema de vetores de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo DNA antigenômico completo ser selecionado dentre SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 ou SEQ ID NO: 18.

4. Sistema de vetores de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelos vetores serem plasmídeos.

5. Sistema de vetores de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo primeiro vetor compreender em uma direção de 5' para 3': uma ribozima de peixe-martelo; um cDNA antigenômico de vírus da raiva; e uma ribozima de vírus da hepatite D, em que uma pluralidade de nucleotídeos da ribozima de peixe-martelo são complementares à seqüência genômica de sentido contrário do vírus da raiva.

6. Sistema de vetores de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pela transcrição do cDNA antigenômico estar sob o controle regulatório de transcrição de ao menos um dos promotores de CVM e promotores RNA-polimerase de bacteriófago T7.

7. Sistema de vetores de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pela transcrição do cDNA antigenômico estar sob o controle regulatório de transcrição tanto do promotor CMV e como do promotor de RNA- polimerase de bacteriófago T7.

8. Sistema de vetores de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pela pluralidade de vetores auxiliares compreender: - um vetor compreendendo uma seqüência de nucleotídeos que codifique uma proteína N de vírus da raiva; - um vetor compreendendo uma seqüência de nucleotídeos que codifique uma proteína P de vírus da raiva; - um vetor compreendendo uma seqüência de nucleotídeos que codifique uma proteína L de vírus da raiva; e - um vetor compreendendo uma seqüência de nucleotídeos que codifique uma RNA-polimerase de bacteriófago T7.

9. Sistema de vetores de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por compreender ainda um vetor compreendendo uma seqüência de nucleotídeos que codifique uma proteína G de vírus da raiva.

10. Sistema de vetores de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caracterizado pela RNA-polimerase de bacteriófago T7 compreender um sinal de localização nuclear (SLN).

11. Sistema de vetores de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pela transcrição da seqüência de nucleotídeos que codifica a proteína N de vírus da raiva estar sob o controle regulatório de transcrição do promotor de T7, e pela transcrição ser independente de cap.

12. Sistema de vetores de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 11, caracterizado pela transcrição de uma ou mais das seqüências de nucleotídeos que codificam a proteína Ρ, M, L ou G do vírus da raiva ou a polimerase de T7 estar sob o controle regulatório de transcrição tanto do promotor CMV como do promotor de T7.

13. Genoma de vírus recombinante caracterizado por compreender o ácido nucléico como definido em SEQ ID NO:l.

14. Genoma de vírus recombinante caracterizado por compreender o ácido nucléico como definido em SEQ ID N0:7, ou um derivado deste.

15. Genoma de vírus recombinante de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo genoma de vírus compreender SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 ou SEQ ID NO: 18.

16. Genoma de vírus recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 13-15, caracterizado por compreender ainda um vetor.

17. Genoma de vírus recombinante de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo vetor ser um plasmídeo.

18. Vírus recombinante caracterizado por compreender um genoma como definido na reivindicação 14 ou 15.

19. Vírus recombinante de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo vírus ser um vírus atenuado.

20. Vacina anti-rábica viva compreendendo ao menos um genoma de vírus de raiva recombinante, caracterizada pelo genoma de vírus de raiva recombinante compreender: - a seqüência mostrada em SEQID NO: 8; - a seqüência mostrada em SEQ ID NO: 10; ou - a seqüência mostrada em SEQ ID NO: 13.

21. Vacina anti-rábica de acordo com a reivindicação 20, caracterizada por ser atenuada.

22. Proteína isolada caracterizada por compreender a seqüência de aminoácidos como definida em: SEQ ID NO: 2 (proteína N); SEQ ID NO: 3 (proteína P); SEQ ID NO: 4 (proteína M); SEQ ID NO: 5 (proteína G); SEQ ID NO: 6 (proteína L); ou SEQ ID NO: 58 (proteína G Aa333).

23. Molécula de ácido nucléico isolada caracterizada por codificar qualquer uma das proteínas segundo a reivindicação 22.

24. Molécula de ácido nucléico isolada de acordo com a reivindicação 23, caracterizada por compreender uma seqüência de nucleotídeos como definida em: a) nucleotídeos 71-1423 da SEQ ID NO: 1 (proteína N); b) nucleotídeos 1511-2407 da SEQ ID NO: 1 (proteína P); c) nucleotídeos 2491-3104 da SEQ ID NO: 1 (proteína M); d) nucleotídeos 3318-4892 da SEQ ID NO: 1 (proteína G); e) nucleotídeos 5418-11,801 da SEQ ID NO: 1 (proteína L), ou f) uma seqüência de nucleotídeos que se diferencie das seqüências em a) até e) apenas devido à degeneração do código genético.

25. Molécula de ácido nucléico isolada de acordo com a reivindicação 23, caracterizada por compreender uma seqüência de nucleotídeos como definida nos nucleotídeos 3317-4888 da SEQ ID NO: 8; ou uma seqüência de nucleotídeos que se diferencie desta apenas devido à degeneração do código genético.

26. Composição caracterizada por compreender ao menos uma proteína isolada da reivindicação 22.

27. Composição de acordo com a reivindicação 26, caracterizada por compreender ainda um portador farmaceuticamente aceitável, um adjuvante, ou uma combinação de dois ou mais destes.

28. Método para provocar uma reação imunológica contra um epitopo antigênico em um sujeito, caracterizado por introduzir no sujeito a composição da reivindicação 26, desse modo provocando uma reação imunológica no sujeito.

29. Método para seqüenciar genoma de vírus da raiva completo, caracterizado por compreender: a transcrição reversa de um genoma de vírus da raiva para produzir um filamento de DNA complementar; a amplificação de uma primeira porção e de uma segunda porção do filamento de DNA complementar para produzir um primeiro e um segundo segmentos genômicos de vírus da raiva amplificados; a clonagem do primeiro e do segundo segmentos genômicos de vírus da raiva amplificados em um vetor para produzir um antigenoma de vírus da raiva contíguo; e o seqüenciamento do antigenoma de vírus da raiva completo.

30. Método para produzir uma vacina viva de vírus da raiva, caracterizado por compreender a introdução do sistema de vetores de qualquer uma das reivindicações 8 a 19 em uma célula hospedeira, e a recuperação de vírus da raiva recombinante.

31. Método de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo vírus da raiva recombinante ser adequado ao uso como uma vacina viva de vírus da raiva.

32. Vacina viva de vírus da raiva caracterizada por ser produzida através do método da reivindicação 31.

33. Método para vacinar um sujeito contra a raiva, compreendendo a administração de uma quantidade eficaz da vacina viva anti- rábica segundo a reivindicação 20 ou a reivindicação 32 ao sujeito, de maneira que células do sujeito sejam infectadas com a vacina anti-rábica, caracterizado por uma reação anti-rábica ser produzida no sujeito.

34. Método de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo sujeito ser um ser humano.

35. Método de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo sujeito ser um animal não-humano.

36. Método de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo animal não-humano ser um gato, cachorro, rato, camundongo, morcego, raposa, guaxinim, esquilo, gambá, coiote ou lobo.

37. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 34 a 36, caracterizado pela administração compreender a administração oral.

38. Método de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pela administração oral compreender a administração através de iscas de alimentos projetada para vacinar populações animais selvagens.

39. Composição farmacêutica caracterizada por compreender a vacina anti-rábica viva da reivindicação 20 ou da reivindicação 32 e um portador ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

40. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 39, caracterizada pela vacina anti-rábica ser atenuada.