CN101463355B - 狂犬病街毒株hn10全基因组序列及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了狂犬病街毒株HN10全基因组序列，该序列如SEQ ID No.1所示。还提供了该全基因组序列扩增引物，如SEQ ID No.2至SEQ ID No.49所示。本发明将病毒基因组序列分为24个片段，用PCR方法扩增相应cDNA，利用片段引物进行直接测序，所用引物根据狂犬病毒的保守区域核苷酸序列所设计，引物3’末端尽可能终止在兼并密码子较少的氨基酸位置，且最后一个碱基终止在氨基酸密码子第二位碱基。本发明有效地扩增出目的片度，提供了全基因序列，有利于了解病毒的分类、进化、致病性及分子流行病学等，该病毒有可能作为反向遗传系统载体使用，而该病毒序列的测定为病毒载体的构建奠定了基础。

Description

狂犬病街毒株HN10全基因组序列及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及狂犬病街毒序列，具体的说是狂犬病街毒株HN10全基因组序列，及其制备方法和用途。

背景技术

狂犬病是死亡率为100％的疾病，对人们的健康构成了很大的威胁，了解狂犬病毒分子流行病学有助于控制狂犬病毒流行，对狂犬病街毒株进行核苷酸的测序并进行分析成为分子流行病学的有力工具。目前，狂犬病街毒株的基因组全长序列的测定是一个很难的技术，主要是狂犬病毒基因组全长约12kb，碱基突变的比例较大，在既要保证序列准确性，又要在以尽量很少步骤的情况下得到全长基因组序列，两者之间一直很难平衡。

针对上述现有技术存在的问题，目前急需一种有效、准确可靠的全基因组测序方法，并通过该方法得到狂犬病街毒全基因组序列。

发明内容

为了改进和弥补现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种可靠准确的测序方法，并提出该方法测序得到的狂犬病街毒株HN10全基因组序列。

本发明的另一目的在于提出一种所述狂犬病街毒株HN10全基因组序列的用途。

本发明的发明思路为：本发明发明人经过长时间的实验研究，利用分子生物学的方法，对病毒的基因组全长进行了分段，并针对该分段设计了特异性扩增引物，通过对多个狂犬病毒全基因组序列的比对，选择狂犬病毒保守区域的核苷酸序列进行引物设计，引物3’末端尽可能终止在兼并密码子较少的氨基酸位置且最后一个碱基终止在氨基酸密码子的第二碱基，共设计24对引物用来扩增狂犬病毒HN10的全基因组，引物扩增片段一般不超过1.1kb；引物设计完成后针对目的基因进行PCR扩增，然后进行测序，最终得到了准确的狂犬病街毒株的全长序列。

为了实现本发明的目的，本发明采用如下具体技术方案：

狂犬病街毒株HN10全基因组序列，该序列如序列表SEQ ID No.1所示，狂犬病街毒株HN10的基因组全长包括11923个核苷酸。

上述狂犬病街毒株HN10全基因组序列扩增引物，所述扩增引物如序列表SEQ ID No.2至SEQ ID No.49所示，共24个引物对。

一种制备上述狂犬病街毒株HN10全基因组序列的方法，其具体步骤如下：

(1)病毒的分离；

(2)病毒RNA的提取；

(3)病毒RNA的逆转录；

(4)引物合成如SEQ ID No.2至SEQ ID No.49所示，针对所示引物将病毒基因组序列分段，分为24个段；

(5)利用SEQ ID No.2至SEQ ID No.49所示引物分别对分段基因序列进行目的基因的PCR扩增；

(6)目的基因片段的回收；

(7)目的基因序列测序。

所述步骤(1)病毒RNA的提取具体步骤为：取经BHK-21细胞传至第四代的病毒HN10，反复冻融3次；离心，取病毒悬液，先加入0.2ml总RNA提取试剂(TRIzol LS Reagent)匀浆后，再加入0.8ml总RNA提取试剂(TRIzol LSReagent)，混匀；-20℃放置30min，加氯仿，混匀，室温放置5min，离心；取离心后上层水相，加入与上层水相等体积的异丙醇，混合，室温放置10min；离心，弃上清，留沉淀，加入75％冰预冷的乙醇，振荡洗涤，离心，弃上清，室温干燥沉淀后将沉淀溶于无核酸酶的超纯水中。上述步骤中离心均在4℃下。

所述步骤(2)病毒RNA的逆转录具体步骤为：将随机引物稀释至0.2μg/μl，取33μl总RNA液，65℃水浴10min，取出后立即冰浴，离心，将32μl液体转移至cDNA第一链合成试剂(Ready-To-Go You-Prime First-Strand Beads)反应管中，再向反应管中加入1μl随机引物，使总体积达到33μl，室温1min，混匀，离心，37℃水浴60min，即得逆转录产物cDNA。

所述步骤(3)病毒基因组序列分段为：将步骤(2)病毒逆转录产物cDNA分为24个片段，每片段不超过1.1kb。

所述步骤(4)PCR扩增反应体系为：H₂O 34.5ul，10×Pfx扩增缓冲液5ul，10mM dNTP mix 1.5ul，50mM MgSO₄ 1ul，正向引物F 1ul，反向引物R 1ul，cDNA 5ul，Pfx DNA聚合酶1ul；

PCR循环条件参数：先用94℃ 2min进行一个循环，然后用94℃ 15sec；50℃30sec；68℃40sec进行35个循环，最后再进行一个68℃ 10min的延伸。

本发明的用途：狂犬病街毒株HN10的全基因组序列确定后，可根据该基因组的序列进行狂犬病毒反向遗传技术的研究，例如，首先根据全基因组序列设计能将全长基因分割成几段的酶切位点，然后根据这些酶切位点将全基因组制备成载体(制备载体的方法为本领域技术人员公知内容)，该载体对于某些特殊用途的蛋白有相当大的作用，如，利用狂犬病毒载体的嗜神经特性，将治疗老年痴呆症的某些蛋白连上该狂犬病毒载体，狂犬病毒载体将这些蛋白运载到神经组织的特殊位置，发挥作用，从而可有效治疗老年痴呆症。可运用模型小鼠(即患老年痴呆症的小鼠)进行这种实验。

本发明的优点与效益：

本发明将病毒基因组序列分为24个片段，用PCR方法扩增相应的cDNA，再利用扩增该片段的引物进行直接测序，在扩增中所用引物是根据狂犬病毒保守区域的核苷酸序列所设计的，引物3’末端尽可能终止在兼并密码子较少的氨基酸位置，且最后一个碱基终止在氨基酸密码子的第二位碱基。本发明可以有效地扩增出目的片度，提供了全基因序列，有利于了解病毒的分类、进化、致病性及分子流行病学等，本病毒可以作为反向遗传系统的载体使用，而该病毒序列的测定为病毒载体的构建奠定了基础，因此，本发明具备潜在的应用前景。

上述内容已经充分的说明了本发明的技术方案和有益效果，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步叙述，以使公众对发明内容有更深入的了解，具体实施方式的实施例均为最佳的技术方案，而并非对本发明的限制。

具体实施方式

实施例1狂犬病街毒株HN10全基因组序列的制备

(1)病毒的分离：

取狂犬病人死后脑组织海马回部位样品(样品来源于湖南省一患狂犬病死亡的人脑组织，经患者家属同意)约0.3g，加含青霉素(500U/mL)与链霉素(2mg/mL)及2％胎牛血清的PBS(pH7.4)研磨成30％悬液，4℃2000rpm离心20min，后取上清接种于细胞培养瓶内已形成单层的BHK-21细胞上，2h后补加含2％胎牛血清的DMEM液，37℃5％CO₂培养。

(2)病毒RNA的提取：

取经BHK-21细胞传至第四代的病毒HN10，反复冻融3次。4℃12000r/min离心10min，取病毒悬液放于1.5ml EP管中，先加入0.2ml TRIzol LS Reagent(Invitrogen公司)匀浆后，再加入0.8mlTRIzol LS Reagent。混匀，在-20℃冰箱中放置30min，加200μl氯仿，快速颠倒充分混匀，室温放置5min，4℃离心，12000rpm离心15min，取离心后上层水相加入新1.5ml EP管中，每管加入与上清等体积的异丙醇，轻柔混合，室温放置10min，4℃12000rpm离心10min，弃上清，留沉淀，加入1ml 75％新配制的冰预冷的乙醇，振荡洗涤，4℃12000rpm离心10min，弃上清，室温干燥沉淀，后将沉淀溶于70μl无核酸酶的超纯水中。

(3)病毒RNA的逆转录：

将随机引物Pd(N)6(大连宝生物公司)稀释至0.2μg/μl，将水浴箱预热至65℃，吸取33μl总RNA液加入EP管中，放入65℃中水浴10min，取出后立即冰浴2min，瞬时离心，将32μl液体转移至Ready-To-Go You-Prime First-StrandBeads(AMERSHAM公司)反应管中，再向反应管中加入1μl随机引物Pd(N)6(0.2μg/μl)，使总体积达到33μl，室温1min，混匀，瞬时离心，37℃水浴60min，即得逆转录产物cDNA。

(4)病毒基因序列扩增引物的设计与合成：

通过对多个狂犬病毒全基因组序列的比对，选择狂犬病毒保守区域的核苷酸序列进行引物设计，引物3’末端尽可能终止在兼并密码子较少的氨基酸位置且最后一个碱基终止在氨基酸密码子的第二碱基，共设计24对引物用来扩增狂犬病病毒HN10的全基因组，引物扩增片段一般不超过1.1kb。具体引物序列及其对应位点如表1所示，SEQ ID No.2和SEQ ID No.3为正反引物对，SEQ ID No.4和SEQ ID No.5为正反引物对，SEQ ID No.6和SEQ ID No.7为正反引物对，SEQID No.8和SEQ ID No.9为正反引物对，SEQ ID No.10和SEQ ID No.11为正反引物对，SEQ ID No.12和SEQ ID No.13为正反引物对，SEQ ID No.14和SEQ IDNo.15为正反引物对，SEQ ID No.16和SEQ ID No.17为正反引物对，SEQ ID No.18和SEQ ID No.19为正反引物对，SEQ ID No.20和SEQ ID No.21为正反引物对，SEQ ID No.22和SEQ ID No.23为正反引物对，SEQ ID No.24和SEQ ID No.25为正反引物对，SEQ ID No.26和SEQ ID No.27为正反引物对，SEQ ID No.28和SEQID No.29为正反引物对，SEQ ID No.30和SEQ ID No.31为正反引物对，SEQ IDNo.32和SEQ ID No.33为正反引物对，SEQ ID No.34和SEQ ID No.35为正反引物对，SEQ ID No.36和SEQ ID No.37为正反引物对，SEQ ID No.38和SEQ IDNo.39为正反引物对，SEQ ID No.40和SEQ ID No.41为正反引物对，SEQ ID No.42和SEQ ID No.43为正反引物对，SEQ ID No.44和SEQ ID No.45为正反引物对，SEQ ID No.46和SEQ ID No.47为正反引物对，SEQ ID No.48和SEQ ID No.49为正反引物对。引物的位置以狂犬病毒PV株(GenBank登录号：M13215)的基因组为参考。

表1

“F”代表正向引物，“R”代表反向引物。引物的位置以狂犬病毒PV株(GenBank登录号：M13215)的基因组为参考

(5)目的基因的PCR扩增，将全基因分为24个片段分别扩增并直接测序，引物和对应扩增位点如表1所示。

PCR扩增反应体系为：在0.2ml EP管中加入以下试剂进行PCR反应：ddH2O34.5ul，10×Pfx Amplification Buffer 5ul，10mM dNTP mix 1.5ul，50mM MgSO41ul，正向引物F 1ul，反向引物R 1ul，cDNA 5ul，Pfx DNA Polymerase(Invitrogen公司)1ul。

PCR用以下程序循环：先用94℃2min进行一个循环，然后用94℃15sec；50℃30sec；68℃40sec进行35个循环，最后再进行一个68℃10min的延伸。

(6)目的基因片段的回收：

回收基因片段的试剂盒购自QIAgen公司。具体回收方法如下：

使用TAE缓冲液制作1％琼脂糖凝胶，然后对目的DNA进行琼脂糖凝胶电泳。在长波紫外灯下切出含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体。切碎胶块。将胶块放入一无色离心管中，称其重量(100mg～100μl)。加3倍胶块体积的Buffer QG，50℃水浴10min(或直到胶块完全溶解)。可以每隔2-3min震荡离心管以助溶解。胶块完全溶解后，混合物应该为黄色(如同没溶解胶之前Buffer QG的颜色)，将QIAquick spin column放置于2ml收集管上，小心将溶液转移到QIAquick column中，使DNA结合到膜上，13000rpm离心1min，弃滤液，将QIAquick column再放回同一收集管中，加0.75ml Buffer PE，洗结合到膜上的DNA。弃滤液，13000rpm再离心1min，将QIAquick放入干净的1.5ml离心管中，加30μl的洗脱液到QIAquick膜的中心部位，并静置1min，然后13000rpm离心1min。

(7)序列测序：将所回收的目的基因片段送至北京博迈德科技发展有限公司，用上述表1中的引物进行分段测序，最后对所测定的序列利用BioEdit生物软件进行序列拼接，利用该软件对各段序列重叠部分的比对作用，将24个片段首尾相接，最终得到狂犬病街毒株HN10全基因组序列，如SEQ ID No.1所示。

为了保证测序结果的准确，将每个片段进行了三次独立的PCR扩增，并将扩增结果分别送至测序，然后再将这三次的测序结果进行比较，并结合测序峰图进行碱基的校对，这样尽可能避免了由于碱基的偶然变异而使序列发生变化。

狂犬病街毒株HN10的全基因组序列确定后，可根据该基因组的序列进行狂犬病毒反向遗传技术的研究。

序列表

<110>中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所

<120>狂犬病街毒株HN10全基因组序列及其制备方法和用途

<130>

<160>49

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>11923

<212>DNA

<213>狂犬病街毒株HN10全基因组序列，人工序列

<400>1

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ttggaaatag agggttaaga atccctccag agggggtgtt aaattgtctt gaaagagttg    5880

actatgataa ggcatttgga aggtatctct ccaacacgta ttcctcttat ctgtttttcc    5940

acgtaattac cctatacatg aatgccctcg actgggagga agagaagacc atcttagctt    6000

tatggaaaga cttgacgtca gttgatgttg ggaaagattt agtcaagttc agagatcaaa    6060

tatggggact cctaattgtg acgaaagact ttgtgtactc tcagagctct aattgtcttt    6120

ttgacaggaa ctatacactt atgctgaaag accttttttt gtctcgtttc aactctctaa    6180

tgattttgct ttctccccct gagccccggt attcagacga tctgatatcc caactttgcc    6240

aactatacat cgccggagat caagtattgt ctatgtgtgg aaattcgggt tatgaagtca    6300

ttaagatact ggaaccctat gtcgtgaaca gcttagtcca gagggcagaa aagtttaggc    6360

ccctcatcca ctctttaggg gactttcctg tttttataaa ggacaaggtg agtcaactcg    6420

aggggacatt tggtcctagt gcaaaaaggt tttttcgggt attggatcag ttcgacaaca    6480

tacatgatct agtattcgtg tatggctgtt ataggcattg ggggcatcct tatatagatt    6540

atagaaaggg tctgtcaaag ttatatgatc aggttcacat caagaaggtg atagacaagt    6600

cctaccagga gtgtttggcg agcgacctgg cccggaggat ccttaggtgg ggatttgaca    6660

agtactctaa atggtatatt gattcgcgac tcctccccag agaccacccc ttgactcctt    6720

atatcaaaac tcagacatgg ccacccaaac atgtcgtgga tctggtggga gatgcatggc    6780

ataagctccc aatcacacag atatttgaga tccctgagtc aatggatcct tcagaaatac    6840

tagatgacaa gtcgcactct ttcaccagaa caagactagc ttcttggcta tcagagaaca    6900

gaggggggcc tgttcctagt gagaaggtca ttatcacagc tctgtccaag ccgcctgtca    6960

accccaggga gttcttaaaa tctatcgacc tcggagggtt acccgatgaa gacttgataa    7020

ttggcctcaa gccgaaagaa agggagctga agattgaagg tcgattcttt gccttgatgt    7080

cttggaattt gagactgtac ttcgttatca ctgaaaagct cctagctaat tatatcttgc    7140

cactctttga tgcgctgact atgacagaca acctgaacaa ggtgtttaaa aagttgatcg    7200

atcgagtaac cgggcaaggg cttttggact actcaagggt tacatatgct ttccacctgg    7260

actatgagaa gtggaacaat catcaaaggt tagagtcaac agaagatgta ttttctgtcc    7320

tagatcaggt gtttggatta aaaagggtat tctcgaggac tcatgagttt ttccagaagt    7380

cttggatcta ttattcggac agatcagacc tcatcgggct atgggaggac caaatatact    7440

gcttggatat gtctaacggc ccgacctgct ggaatggcca agatggcggg ctggaaggct    7500

tacgacagaa aggctggagt ctggtcagcc tgttaatgat agacagagag tctcagacta    7560

ggaacacaag aaccaagata ctggcgcaag gagacaacca agttctatgt ccaacatata    7620

tgttatcgcc tgggctgtcg agggaggggc ttctttatga actggagagt atatcaagaa    7680

atgccctttc aatataccga gctatcgagg agggagcagc aaagctaggg ctgattatca    7740

agaaggaaga gaccatgtgt agctatgact ttctcatcta cgggaaaact ccattatttc    7800

gaggcaacat cttggtgcct gagtcaaaaa gatgggccag agtctcttgc atctcgaacg    7860

accaaatagt caacctcgcc aatataatgt cgacagtgtc caccaacgct ttaactgtgg    7920

cacaacactc tcaatctttg atcaagccga tgagggactt tctgcttatg tcagtgcagg    7980

cagtctttca ctacttgctg ttcagcccca tcttaaaggg tagagtctac aaaattctaa    8040

gtgctgaggg ggacaacttt ctcctagcga tgtcaagaat aatctattta gacccttcct    8100

taggaggagt gtctggaatg tctttgggga gatttcatat acgccagttc tcagaccctg    8160

tctcagaggg gttgtccttc tggagagaga tctggctgag ctctcacgag tcctggattc    8220

acgcgttgtg tcaagaggca gggaaccctg atctcggaga gagaacactc gagagcttca    8280

ctcggcttct cgaggaccct actactttaa atatcaaggg aggggcaagc cccactatct    8340

tgctcaagga tgcaatcagg aaagccctgt atgacgaagt agataaggtg gagaactctg    8400

agttcagaga ggcaatcctc ttgtccaaaa cccataggga taattttata cttttcttga    8460

aatctgttga gcctctattt ccccgatttc tcagtgagct tttcagctcc tccttcttgg    8520

ggattcctga gtcaatcatc ggattgatac aaaactctcg gacaataagg agacagttta    8580

gaaaaagcct ctcaagaact ttggaggagt ctttttacaa ctcagagatc catgggatca    8640

accgaatgac tcagacacct cagcgagttg ggagggtgtg gacctgctcc tcggagaggg    8700

cagatctttt gagggaaatc tcttggggga ggaaagtagt gggtacaaca gttccccacc    8760

cttctgagat gttgggactg cttcctaagt cctccatctc ttgtacttgc ggggcaaccg    8820

gaggagggaa tcctagagtc tcagtgtctg tgctcccgtc ctttgatcag tcattttttt    8880

cacgaggccc tctaaaagga tacttgggat catccacctc catgtcgacc cagctgttcc    8940

atgcctggga gaaggtcacc aatgttcatg tggtgaaaag ggccctctca ctaaaagaat    9000

ccataaactg gttcatcaca agaaactcga atttggctca gactctgatt agaaacatca    9060

tgtctctaac tggccctgat tttcctctag aagaggcccc tgtgttcaag aggacagggt    9120

cagcattgca taggttcaag tccgctagat acagtgaggg gggatattct tctgtatgcc    9180

ccaatctcct ctctcatatc tccgtaagta cagacaccat gtctgatttg acccaagacg    9240

ggaagaacta tgatttcatg ttccagccct tgatgcttta tgcgcagaca tggacctccg    9300

aactggtaca aagagacaca aggctgaagg actctacatt tcactggcac cttcgatgta    9360

acaggtgtgt aaggccaatc gacgatatca cactggagac ctctcaggtc ttcgagtttc    9420

cggatgtgtc gaaaagaata tctaggatgg tctctggggc cgtgcctcac ttccaaaaac    9480

tccctgatat ccgcctgaaa cctggagatt ttgaatcttt aagtggtagg gaaaaatccc    9540

gtcacatagg gtctgctcaa gggctcctat attcgatctt ggtcgcaata catgactcag    9600

gatacaatga cggaactatc ttccctgtca acatatatgg caaggtctct cctagagact     9660

atttgagggg gctcgcaaga ggagtcctca tagggtcgtc catctgcttt ttgaccagaa     9720

tgactaatat caacattaac aggcctctcg agttgatctc aggcgtgatc tcatatatcc     9780

tcttgaggct ggataatcac ccatctttgt acataatgct cagagaaccg tctctgagag     9840

gagagatatt ttctataccc cagaaaattc cagctgctta cccaaccacg atgagggagg     9900

gtaatagatc tatcctatgt tacctccaac atgtgctgcg ctatgagcga gaggttatta     9960

cagcatctcc agagaatgac tggttgtgga tcttctcaga ctttaggagc tccaagatga    10020

cgtacctaac tctcatcact tatcagtccc atcttctact tcagagggtc gaaagaaatc    10080

tgtcgaagag tatgagagct aacctgcgac agatgagttc cttgatgagg caggtgctag    10140

gagggcatgg agaggacacg ttagagtcag atgatgacat tcaaaggcta ttaaaggact    10200

ctctgcgtag aacgaggtgg gtggatcaag aagtgcgcca tgcagccagg actatgacgg    10260

gggattacag ccccaataaa aagatgtcac gcaaggcggg atgttctgag tgggtttgct    10320

ctgctcagca ggttgcagtc tccacctcgg ctaatccggc ccctgtctca gagcttgaca    10380

taagggccct ctctaggagg tttcagaacc ctctcatctc gggattaaga gtggttcagt    10440

gggcgactgg tgctcattat aaacttaagc caattttgga tgatctcaat gtttttccat    10500

ctttatgtct tgtggtcgga gacggatcag ggggaatatc gagagcagta ctcaacatgt    10560

ttccagatgc taggcttgta ttcaatagct tgttggaggt gaatgacctg atggcctccg    10620

gaacacatcc attacctcct tcagcaatca tgagtggagg agatgacatt gtctccagag    10680

taatagactt cgactcaatc tgggagaaac catcggatct caggaacttg accacatgga    10740

agtacttcca gtcagtccag aggaaggtga acatgtctta tgacctcatc atttgtgatg    10800

cagaagttac tgacatagca tcaattaatc ggataacact gttgatgtct gacttcgcat    10860

tgtctataga tggcccgctg tatttggtct tcaaaactta tgggactatg ctggtaaatc    10920

cagaatatag agcaattcaa cacctgtcaa gggcattccc ttcagtcaca ggatttataa    10980

cccagatgac ttcgtccttc tcatctgagc tataccttcg attctccaaa cggggaaaat    11040

tcttccgaga tgccgagtac ttaacctctt ctacccttcg agagatgagc ctcgtcttgt    11100

tcaactgtag cagccctaag agtgagatgc agagggctcg ctctttgaat taccaagatc    11160

ttgtaagagg attcccagag gagattatat ccaatcctta caatgagatg atcataacct    11220

tgattgacag tgatgtggaa tccttcctgg ttcacaagat ggtagatgat ctcgaattac    11280

aaagagggac tctatctaaa atgtctatca ttatagccat catgatagtt ttctccaata    11340

gagtctttaa tgtctctaaa ccattgacgg accctttgtt ttatccacca tctgacccca    11400

aaatcttgag gcacttcaac atatgctgca gtacaatgat gtatttggca actgctctag    11460

gtgatgtccc cagctttgct aggcttcatg acttgtacaa tagacccata acttattact    11520

tcaagaagca ggttattcga gggagtattt atctgtcttg gagttggtct gatgatacct    11580

ctgtgttcaa gagggtggca tgcaactcta gcttgagtct gtcgtctcac tggatcaggc    11640

tgatctacaa gatagtgaag accactagac tcatcgggag cattgaagac ttatctggag    11700

aggtggtgag acatcttcaa gggtataaca ggtggattac cctcgaggac atcagatcta    11760

gatcatctct attagactac agctgcttat gagctgaata ttgttgaggc ttgtaaatac    11820

tgaagctctt ggatggtgta ccctgaaaaa aaacaagatc ccaaatcaga acctctggtt    11880

gcttgattgt ttttttcatc tttatggttt atttgttaag cgt                      11923

<210>2

<211>19

<212>DNA

<213>正向引物

<400>2

gtacctagac gcttaacaa     19

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>反向引物

<400>3

cgtgaccaac agcatttgat    20

<210>4

<211>24

<212>DNA

<213>正向引物

<400>4

ttagtcggtc ttctcttgag tctt    24

<210>5

<211>24

<212>DNA

<213>反向引物

<400>5

ggaggggtgt tagttttttt catg    24

<210>6

<211>24

<212>DNA

<213>正向引物

<400>6

gttggtcacg tgttcaatct catt    24

<210>7

<211>24

<212>DNA

<213>反向引物

<400>7

ggtttccttc ttaagttctc ttcc    24

<210>8

<211>23

<212>DNA

<213>正向引物

<400>8

taacacccct ccttttgaac cat    23

<210>9

<211>23

<212>DNA

<213>反向引物

<400>9

gtggtgttgc ctgttttttt cac    23

<210>10

<211>20

<212>DNA

<213>正向引物

<400>10

aaaccccatc agcttcttct        20

<210>11

<211>20

<212>DNA

<213>反向引物

<400>11

ttgcactcac tcttatctg         20

<210>12

<211>20

<212>DNA

<213>正向引物

<400>12

aaacaggcaa caccactgat        20

<210>13

<211>20

<212>DNA

<213>反向引物

<400>13

atccttcatc ttccacaacc        20

<210>14

<211>25

<212>DNA

<213>正向引物

<400>14

cggagtgagt gcaagacaat gtcat  25

<210>15

<211>23

<212>DNA

<213>反向引物

<400>15

ttgctccctt tggatgctct ctt    23

<210>16

<211>21

<212>DNA

<213>正向引物

<400>16

cctggttgtg gaagatgaag g      21

<210>17

<211>19

<212>DNA

<213>反向引物

<400>17

aaacaccccg ttcacatgg        19

<210>18

<211>22

<212>DNA

<213>正向引物

<400>18

aacagcagag ggaagagagc at    22

<210>19

<211>20

<212>DNA

<213>反向引物

<400>19

ggatgagatc ttcgggactt       20

<210>20

<211>19

<212>DNA

<213>正向引物

<400>20

aggcagatgt catccccat        19

<210>21

<211>21

<212>DNA

<213>反向引物

<400>21

tcggatctac cgggtcatca t     21

<210>22

<211>22

<212>DNA

<213>正向引物

<400>22

atctcatccc cttgagttga ag    22

<210>23

<211>22

<212>DNA

<213>反向引物

<400>23

tggagagata ccttccaaat gc    22

<210>24

<211>20

<212>DNA

<213>正向引物

<400>24

aggagaggtt tatgatgacc       20

<210>25

<211>20

<212>DNA

<213>反向引物

<400>25

atcgagttga ctcaccttgt         20

<210>26

<211>24

<212>DNA

<213>正向引物

<400>26

gactatgata aggcatttgg aagg    24

<210>27

<211>24

<212>DNA

<213>反向引物

<400>27

ctagtcttgt tctggtgaaa gagt    24

<210>28

<211>22

<212>DNA

<213>正向引物

<400>28

taaaggacaa ggtgagtcaa ct      22

<210>29

<211>22

<212>DNA

<213>反向引物

<400>29

tctggaaaaa ctcatgagtc ct    22

<210>30

<211>21

<212>DNA

<213>正向引物

<400>30

tagatgacaa gtcgcactct t     21

<210>31

<211>21

<212>DNA

<213>反向引物

<400>31

gaggttgact atttggtcgt t     21

<210>32

<211>22

<212>DNA

<213>正向引物

<400>32

ctcatgagtt tttccagaag tc    22

<210>33

<211>22

<212>DNA

<213>反向引物

<400>33

ttgcatcctt gagcaagata gt    22

<210>34

<211>22

<212>DNA

<213>正向引物

<400>34

cagagtctct tgcatctcga ac    22

<210>35

<211>22

<212>DNA

<213>反向引物

<400>35

gacactgaga ctctaggatt cc    22

<210>36

<211>23

<212>DNA

<213>正向引物

<400>36

tcttgctcaa ggatgcaatc agg   23

<210>37

<211>23

<212>DNA

<213>反向引物

<400>37

tagagtcctt cagccttgtg tct      23

<210>38

<211>22

<212>DNA

<213>正向引物

<400>38

tagagtctca gtgtctgtgc tc       22

<210>39

<211>22

<212>DNA

<213>反向引物

<400>39

cagagacggt tctctgagca tt       22

<210>40

<211>25

<212>DNA

<213>正向引物

<400>40

gactctacat ttcactggca ccttc    25

<210>41

<211>25

<212>DNA

<213>反向引物

<400>41

agcagagcaa acccactcag aacat    25

<210>42

<211>21

<212>DNA

<213>正向引物

<400>42

acataatgct cagagaaccg t    21

<210>43

<211>21

<212>DNA

<213>反向引物

<400>43

ctgcatcaca aatgatgagg t    21

<210>44

<211>21

<212>DNA

<213>正向引物

<400>44

tgtctcagag cttgacataa g    21

<210>45

<211>21

<212>DNA

<213>反向引物

<400>45

ccgtcaatgg tttagagaca t    21

<210>46

<211>21

<212>DNA

<213>正向引物

<400>46

catcatttgt gatgcagaag t    21

<210>47

<211>21

<212>DNA

<213>反向引物

<400>47

gtcttcacta tcttgtagat c    21

<210>48

<211>21

<212>DNA

<213>正向引物

<400>48

agggactcta tctaaaatgt c    21

<210>49

<211>21

<212>DNA

<213>反向引物

<400>49

ttctgagtac acgcttaaca a    21

Claims (4)

1.一种狂犬病街毒株HN10全基因组序列扩增引物，其特征在于，所述全基因组序列如SEQ ID No.1所示，所述扩增引物如SEQ ID No.2至SEQ ID No.49所示，共24个引物对。

2.一种制备狂犬病街毒株HN10全基因组序列的方法，其特征在于，引物合成如SEQ ID No.2至SEQ ID No.49所示，针对所示引物将病毒基因组序列分为24段；利用SEQ ID No.2至SEQ ID No.49所示引物分别对分段基因序列进行目的基因的PCR扩增；目的基因片段的回收，测序；对所测定的序列利用生物软件对各段序列重叠部分的比对作用进行序列拼接，将24个片段首尾相接，最终得到狂犬病街毒株HN10全基因组序列，如SEQ ID No.1所示。

3.根据权利要求2所述的一种制备狂犬病街毒株HN10全基因组序列的方法，其特征在于，所述病毒基因组序列分段为：根据SEQ ID No.2至SEQ ID No.49所示引物将病毒逆转录产物cDNA分为24个片段，每片段不超过1.1kb。

4.根据权利要求2所述的一种制备狂犬病街毒株HN10全基因组序列的方法，其特征在于，所述步骤PCR扩增反应体系为：H₂O 34.5ul，10×Pfx扩增缓冲液5ul，10mM dNTP mix 1.5ul，50mM MgSO₄ 1ul，正向引物F 1ul，反向引物R 1ul，cDNA 5ul，Pfx DNA聚合酶1ul；

PCR循环条件参数：先用94℃2min进行一个循环，然后用94℃ 15sec；50℃ 30sec；68℃ 40sec进行35个循环，最后再进行一个68℃ 10min的延伸。