CN101892240B - 日本血吸虫β-catenin基因、蛋白及用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种日本血吸虫基因，所述基因具有编码β-catenin蛋白的核苷酸序列，该核苷酸序列包含：编码SEQ ID NO.1氨基酸序列的DNA序列，或编码SEQ ID NO.1所示氨基酸序列中缺失、添加、插入或取代一个或多个氨基酸所得到的具有SEQ ID NO.1相同活性的氨基酸序列的DNA序列。本发明还公开了上述基因编码的蛋白质。本发明的日本血吸虫β-catenin基因和蛋白，参与调控血吸虫的器官分化、虫卵的形成及卵胚发育等过程，对开发控制血吸虫生长发育的新药具有很高的应用价值。

Description

日本血吸虫β-catenin基因、蛋白及用途

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种日本血吸虫β-catenin(β-连环蛋白)基因、蛋白及用途。

背景技术

血吸虫病是一种严重危害人类健康的慢性消耗性寄生虫病，目前该病在全球74个国家和地区流行，主要集中在热带、亚热带欠发达国家和地区，感染人数超过2亿。2007年我国仍有约60万人口感染该病，其中80％以上集中在安徽、江西、湖北和湖南等省的沼泽和湖泊地区。目前中国血吸虫病的防治仍以吡喹酮等化学药物为主，该药物虽然能够有效杀伤体内血吸虫成虫，但不能控制重复感染，且长期使用可能诱发虫体的耐药性，因此新的治疗药物亟待开发。然而，要使新药研究取得突破性进展，充分了解血吸虫的生长发育过程及其相关的调控机制是重要基础。

日本血吸虫生活史复杂，在整个生活循环过程中表现出明显的形态学及生理生化方面的改变，但是，以往研究者对血吸虫的研究主要集中于表观生物学及组织化学层面，对于虫体复杂的生长发育调控机理缺乏认识，因而在新药开发方面没有新的突破。生物体的生长发育由细胞间的信号网路系统调控，日本血吸虫也不例外。

真核生物的生长发育、生殖生理等生命进程由进化保守的Hedgehog、BMP、Wnt等信号网络系统进行调节。其中Wnt信号通路是调控细胞增殖和分化的重要途径，在胚胎发育、细胞命运及组织器官形态发生等生物学过程均发挥重要调控作用。模式生物上的研究发现，Wnt信号通路存在经典和非经典的细胞信号传递途径。经典通路指Wnt/β-catenin信号通路；非经典通路包括：平面细胞极性通路(planar cell polarity pathway，PCP)及Wnt/Ca²⁺信号通路。β-catenin(β-连环蛋白)是经典Wnt信号途径的关键信号分子，在Wnt信号未被激活时，胞浆内的β-catenin大部分与细胞膜上的钙黏蛋白结合，少部分与轴蛋白、腺瘤性结肠息肉病基因蛋白、酪蛋白激酶、糖原合酶激酶形成巨大复合体，最终导致β-catenin通过蛋白酶体被降解，因而胞浆内游离β-catenin水平极低。当Wnt信号激活后，β-catenin复合体不被降解，大量游离的β-catenin在胞质中聚集，这种累积打破了细胞内原有的β-catenin出核和入核平衡，使得细胞核内的β-catenin大大增加，促进Wnt/β-catenin信号通路靶基因的转录激活。

利用生物信息学方法，预测到血吸虫体内也存在Wnt信号通路。并参考其它模式生物数据，利用血吸虫转录本组及蛋白质组数据重构了血吸虫Wnt信号通路(http://lifecenter.sgst.cn/schistosoma/en/pathwayImage.do？map＝map04310&name＝Wnt％20signaling％20pathway)。目前该通路对血吸虫生长发育的调控机制在国内外尚未有详细报道。本实验室率先开展了血吸虫Wnt信号通路的相关研究，已鉴定了两个Wnt配体：SjWnt4(GenBank登陆号DQ643829)和sjWnt10(GenBank登陆号DQ643830)；三个Frizzled家族七次跨膜受体：sjFz5(GenBank登陆号EU370926)，sjFz7(GenBank登陆号EU370927)和sjFz9(GenBank登陆号GQ500895)。通路中更多成员的鉴定及生物学特性的分析，有助于全面认识Wnt信号通路对血吸虫生长发育调控的分子机制，从而发现重要的功能分子用于发展候选疫苗或药靶。

目前国内外尚没有日本血吸虫β-catenin基因的研究报道。

发明内容

本发明要解决由于对日本血吸虫的生长发育调控机制缺乏认识而导致在新药研发方面难以取得突破的技术问题，提供一种日本血吸虫β-catenin基因和蛋白，该β-catenin基因参与调控血吸虫的器官分化、虫卵的形成及卵胚发育等过程，对开发控制血吸虫生长发育的新药具有较高的应用价值。

此外，还需要提供一种日本血吸虫β-catenin基因和蛋白质的用途。

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：

在本发明的一个方面，提供了一种日本血吸虫基因，所述基因具有编码β-catenin蛋白的核苷酸序列，该核苷酸序列包含下述DNA序列之一：

(1)编码SEQ ID NO.1氨基酸序列的DNA序列；

(2)编码SEQ ID NO.1所示氨基酸序列中缺失、添加、插入或取代一个或多个氨基酸所得到的具有SEQ ID NO.1相同活性的氨基酸序列的DNA序列。

优选的，所述基因具有SEQ ID NO.2所示的DNA序列。

在本发明的另一方面，提供了一种日本血吸虫蛋白质，所述蛋白质选自：

(1)具有SEQ ID NO.1氨基酸序列的蛋白质；

(2)具有SEQ ID NO.1中部分氨基酸序列的活性片段或保守性变异蛋白质；

(3)SEQ ID NO.1所示氨基酸序列中缺失、添加、插入或取代一个或多个氨基酸所得到的具有SEQ ID NO.1相同活性的氨基酸序列的蛋白质。

优选的，所述蛋白质具有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列。

在本发明中，由于体内或纯化期间蛋白质本身的修饰等或由于编码蛋白基因的多态性及变异，天然存在的蛋白质会出现氨基酸的缺失、添加、插入、取代或其他变异。事实上，存在着一些生理和生物活性上基本等同于无变异蛋白质的蛋白。这些结构不同于相应的蛋白质但与该蛋白质没有明显的功能差异的多肽或蛋白称为功能等同变异体。

功能等同变异体同样适用于通过人工手段向一种蛋白质的氨基酸序列中导入这类变异而制成的多肽。

例如，人白介素2(IL-2)的氨基酸序列中用丝氨酸替换特定的半胱氨酸残基所得到的多肽仍保留着IL-2的活性[Science，224，1431(1984)]。

此外，在用基因工程方法生产蛋白质时，常把所需蛋白质表达为融合蛋白质，例如，把源于其他蛋白质的N-末端肽链加到所需蛋白质的N-末端以提高所需蛋白质的表达，或者把一个合适的肽链加到所需蛋白的N-或C-末端，表达该蛋白并使用一种对所加肽链具有亲和力的载体使所需蛋白的纯化变得更加容易。

就决定基因上特定氨基酸的密码子(三联体碱基组合)而言，每种氨基酸存在1到6个密码子。因此尽管依赖于氨基酸序列，但仍有许多编码一种氨基酸的基因。在自然界中，基因并不稳定，常发生核酸变异。基因的变异可能不影响所编码的氨基酸序列(沉默变异)，这种情况下，会产生编码相同氨基酸序列的不同基因。因此，即使分离出了编码特定氨基酸序列的基因，随着含有该基因生物体的传代，仍不可避免地会产生编码相同氨基酸序列的不同基因。

用各种基因工程技术人工产生编码相同氨基酸序列的各种基因并不困难。例如，当编码所需蛋白质的天然基因的密码子在用于以基因工程技术产生蛋白质的宿主中可利用性较低、表达的蛋白量不够时，可以人工将密码子转变成在该宿主中可利用性高的另一密码子而不改变所编码的氨基酸序列，即可增强所需蛋白质的表达。因此，这类人工生产的不同多核苷酸也包括在本发明的范围内，只要它能编码出本发明公开的氨基酸序列即可。

另外，由至少一种改变(如蛋白质的氨基酸序列中有一个或多个氨基酸残基的缺失、添加、插入或取代)所得的多肽或蛋白一股具有功能上等同于所述蛋白质的活性，编码这类多肽或蛋白的基因也包括在本发明的范围内，不管它是从天然来源分离还是人工生产的。

一股的，编码功能等同变异体的基因是同源的。因此，能与本发明的基因杂交且编码具有β-catenin活性的蛋白质的核酸分子也包括在本发明的范围内。

在本发明的另一方面，还提供了一种包含上述日本血吸虫基因DNA序列的全部或部分序列的重组载体。

所述重组载体包括重组克隆载体或重组表达载体，重组表达载体包括重组原核表达载体、重组真核表达载体。

优选的，所述重组载体包含编码SEQ ID NO.1中8-310位氨基酸序列的DNA序列。

在本发明的另一方面，还提供了一种宿主细胞，包含上述重组载体，或已用上述基因序列转化或转染。

在本发明的另一方面，还提供了一种上述日本血吸虫基因的用途，用于制备预防或治疗血吸虫病的药物；或用于筛选预防或治疗血吸虫病的药物。

在本发明的另一方面，还提供了一种上述日本血吸虫蛋白质的用途，用于制备预防或治疗血吸虫病的药物；或用于筛选预防或治疗血吸虫病的药物。

所述药物通过阻断血吸虫生长发育来发挥作用。

本发明日本血吸虫β-catenin基因、蛋白可用于发展为高效候选疫苗或药靶。

本发明日本血吸虫β-catenin基因，由实时荧光定量PCR分析结果表明，其在日本血吸虫各个发育阶段均有表达，在虫卵中表达量最高，23d雌虫次之，13d虫体和23d雄虫的表达量约是23d雌虫的一半，其它阶段的表达量相对较低；Western blotting分析结果显示β-catenin在日本血吸虫不同发育阶段蛋白水平的变化和mRNA变化基本一致。结合日本血吸虫发育特征，推测Wnt/β-catenin信号通路可能对虫体的器官分化，虫卵的形成及卵胚发育等过程起重要的调控作用，本发明的日本血吸虫β-catenin基因，为开发阻断虫体发育的新药提供了新思路。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1是本发明实施例1日本血吸虫β-catenin基因保守的ARM结构特征图；

图2是本发明实施例2实时定量PCR分析β-catenin在日本血吸虫不同发育阶段表达量的变化图；

图3是本发明实施例3重组质粒pET28a-β-catenin-310的BamH I/Xho I双酶切产物鉴定图；

图4是本发明实施例3的SDS-PAGE分析pET28a-β-catenin-310重组质粒的包涵体表达及纯化图；

图5是本发明实施例4天然虫体蛋白和抗β-catenin抗血清的Western Blotting分析图；

图6是本发明实施例5的SDS-PAGE分析pET28a载体及pET28a-α-tubulin重组质粒的诱导表达图；

图7是本发明实施例5天然虫体蛋白和抗α-tubulin抗血清的Western Blotting分析图；

图8是本发明实施例6的Western Blotting分析日本血吸虫不同发育阶段β-catenin蛋白水平表达量的变化图。

具体实施方式

下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著，黄培堂，汪嘉玺，朱厚础，等译.第3版，北京：科学出版社，2002)中所述的方法进行。

本发明以7d童虫cDNA为模板，通过RACE技术获得日本血吸虫β-catenin全长cDNA序列，再利用生物信息学软件分析该基因及其编码蛋白的结构。结果表明，该β-catenin的cDNA序列全长2354bp，含完整的开放阅读框2016bp，编码671个氨基酸。利用荧光实时定量PCR方法分析了β-catenin基因在日本血吸虫不同发育阶段mRNA水平的变化。以含有多个抗原表位的β-catenin部分cDNA序列为模板，构建原核表达载体，表达β-catenin重组蛋白。以纯化的原核表达产物为抗原，免疫BALB/c小鼠制备抗血清，以此抗血清为一抗，通过Western blotting分析β-catenin在日本血吸虫不同发育阶段蛋白水平的变化。实验结果显示β-catenin基因的mRNA水平在虫卵中最高，23d雌虫次之，在13d童虫和23d雄虫中也较高，约是23d雌虫的一半，在其它发育阶段虫体水平相对较低，结合日本血吸虫发育特征，推测Wnt/β-catenin信号通路可能对虫体的器官分化，虫卵的形成及卵胚发育等过程起重要的调控作用，表明该β-catenin基因编码蛋白对开发控制血吸虫生长发育的新药具有较高的应用价值。

实施例1日本血吸虫β-catenin全长cDNA序列的获得及生物信息学分析

1.不同发育阶段的日本血吸虫收集

日本血吸虫中国大陆株尾蚴由中国农业科学院上海兽医研究所钉螺室提供，新西兰大白兔腹部贴片，按照所需不同阶段虫体分别感染2000～15000条尾蚴，分别在感染后7d、13d、18d、23d、32d、42d用肝门静脉灌注法收集虫体，并将23d、32d及42d虫体雌雄分开，取感染42d兔的肝脏，剪碎匀浆后分别过80目、120目、160目、200目及300目筛网纯化虫卵，将收集的不同发育阶段虫体做好标记后液氮保存备用。

2.日本血吸虫β-catenin全长cDNA序列的扩增及生物信息学分析

取液氮中冻存的7d童虫，按Trizol试剂盒说明书进行总RNA抽提。分别用1％琼脂糖凝胶和分光光度计检测RNA的完整性和浓度。以NCBI获得的与其它物种β-catenin有部分同源性的日本血吸虫EST序列(GenBank登陆号AA618990)为模板设计RACE引物，由上海英俊生物工程有限公司合成。3’-RACE正义引物/正义巢式引物(5’-3’)分别为：CAACTTCACGTTCTGGATCTCAAGC(SEQ ID NO.3)，TGCTGCGTATACTGCTGCTATCCTG(SEQ ID NO.4)；5’-RACE反义引物/反义巢式引物(5’-3’)分别为：TCAGGACGTGTTATTTCATCAGTGG(SEQ ID NO.5)，GACCAACAACAGATTTCAGTAATGG(SEQ ID NO.6)。

参照RACE试剂盒说明书，将7d童虫RNA分别转录为3’-RACE cDNA和5’-RACE cDNA。首轮touch-down PCR扩增条件如下：94℃5min预变性；94℃30s，70℃3min设定5个循环；94℃30s，70℃30s，72℃3min设定5个循环；94℃30s，68℃30s，72℃3min设定25个循环；最后72℃延伸10min。第二轮是特异巢式PCR，将首轮touch-down PCR产物经灭菌去离子水稀释50倍后取5μL作模板，扩增条件为94℃5min，94℃30s，68℃30s，72℃3min，共25个循环。

经两轮PCR，3’-RACE、5’-RACE分别得到长346bp、1568bp的产物。将扩增后的PCR产物与T载体连接，转化DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆到上海英骏生物技术公司进行测序鉴定。用Gene tool软件将3’-RACE序列、5’-RACE和已知的作为RACE模板的β-catenin EST序列拼接，得到完整的β-catenin全长cDNA序列。

将获得的cDNA序列通过NCBI进行同源性比对和ORF分析，推测其编码框和蛋白结构域(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)；通过ExPASy分析β-catenin等电点、稳定性等生化特性(http://cn.expasy.org/tools/protparam.html)；通过Signal P分析信号肽的存在与否(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)。

上述序列分析表明该β-catenin基因全长2354bp(见SEQ ID NO.2)，完整编码框为2016bp，共编码671个氨基酸(SEQ ID NO.1)，理论相对分子量为75.69kD，理论等电点为6.15，无信号肽序列。

同源性分析表明，该β-catenin基因编码的氨基酸序列与曼氏血吸虫β-catenin的相似性为85％，与日本三角涡虫、非洲爪蟾、黑腹果蝇、人等其它物种β-catenin的相似性均在30％～35％之间。对该蛋白序列进行高级结构预测，其氨基端含有系列的丝氨酸/苏氨酸残基，能够被磷酸化，调节蛋白的稳定性。中间区域有6个β-catenin家族典型的ARM重复(ARM为armadillo的简称，为β-catenin在果蝇属的同源性基因)，构成2个ARM超家族，其中每个ARM重复能形成三个α-螺旋，该蛋白通过α-螺旋间相互作用形成精密的右手超螺旋高级结构(图1)，能够有效防止蛋白水解作用。至此确定该基因为日本血吸虫β-catenin。

实施例2β-catenin在日本血吸虫不同发育阶段mRNA表达量分析

1.实验方法

按照实时定量PCR的引物设计原则，设计β-catenin引物，上游引物(5’-3’)：AAGGCATCCATCAGAAGT(SEQ ID NO.7)；下游引物(5’-3’)：ACTGCTTTCATAGACTGCCATAC(SEQ ID NO.8)，扩增片段长度为207bp。选择18S rRNA(GenBank登陆号AY157226.1)作内参，上游引物(5’-3’)：TTAGTTGGTGGAGCGATTTGTCTGG(SEQ ID NO.9)；下游引物(5’-3’)：CTGTTATTGCTCAATTTCGTGCGAC(SEQ ID NO.10)，扩增片段214bp。引物序列由公司合成。

用Trizol法分别抽提虫卵、7d、13d、18d、23d、32d及42d虫体RNA，DNase I消化RNA中残留DNA，1％的琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，紫外分光光度法测定RNA浓度。参照PrimeScript^TM RT reagent Kit说明，将RNA反转录成cDNA，以SYBR Green I为荧光染料，反应体系为：2×SYBR Green PCR Premix Ex Taq 12.5μL，上游引物(10μM)0.5μL，下游引物(10μM)0.5μL，无菌去离子水9μL，cDNA模板2.5μL；反应条件为：95℃10s，然后95℃15s，60℃15s，72℃15s，共40个循环，其中每个循环的72℃15s结束时间为荧光信号检测点，每个样品均做三个重复。以7d童虫cDNA作10倍系列稀释后为模板，构建β-catenin和18S rRNA内参的标准曲线。保证每个标准曲线的相关系数R²＞0.99。实验结果以2^-△△CT法进行分析，得到不同期别每百万18S rRNA看家基因中β-catenin的含量。

2.结果

以10倍系列稀释的7d童虫cDNA为模板，首先构建了β-catenin和18S rRNA扩增标准曲线，分别为β-cetenin：Conc＝10^(-0.350*CT+7.990)，阈值(Threshold)0.069；18S rRNA：Conc＝10^(-0.336*CT+7.875)，阈值(Threshold)0.0908。这两条标准曲线都有良好的扩增效率和相关系数。

实时定量PCR分析结果表明(图2)，β-catenin在虫卵中表达量最高，23d雌虫次之，13d虫体和23d雄虫的表达量也较高，约是23d雌虫的一半，其它阶段的表达量相对较低。在虫体发育过程中，β-catenin mRNA水平从7d到13d逐渐上升，13d后又迅速下降，到18d降到最低水平(图2A)。合抱后的雌雄虫β-catenin mRNA水平逐渐升高，到23d达到高峰，随后又下降，到32d达到最低水平，而42d雌雄虫表达量又略有升高(图2B)。

实施例3重组质粒pET28a-β-catenin-310的构建及重组蛋白的表达和纯化

1.重组质粒的构建

用BepiPred 1.0b Server软件在线预测了β-catenin抗原表位，氨基酸8～310区段具有8个抗原指数较高表位，有较好的抗原性。因此选取该段氨基酸作为免疫组化定位的目标抗原，设计引物对如下：上游引物(5’-3’)：GTGGATCCATGAAAAAATACTCACATGTAG(SEQ ID NO.11)；下游引物(5’-3’)：GTCTCGAGATCACTAAGATTACGTAATCCC(SEQ ID NO.12)，上下游引物中分别引入BamH I和Xho I限制性内切酶位点(引物序列中划线处标出)。

以反转录的7d童虫cDNA为模板进行PCR扩增。将纯化的目的片段(957bp)和pET28a质粒分别进行BamH I和Xho I双酶切并连接，将连接产物转化DH5α感受态细胞，挑选克隆抽提质粒，经双酶切、测序鉴定后获得重组阳性质粒，命名为pET28a-β-catenin-310。重组质粒pET28a-β-catenin-310经BamH I/Xho I双酶切鉴定结果如图3所示。在图3中，M：DL2000DNA分子量标准；1：重组质粒pET28a-β-catenin-310的BamH I/Xho I双酶切产物。

2.重组质粒在原核细胞中的表达及纯化

将重组质粒转ABL21(DE3)表达型感受态细胞，挑取单克隆于LB培养基，37℃过夜培养。次日以1∶100接种新鲜LB培养基，待菌液OD₆₀₀为0.8时加入不同终浓度IPTG进行诱导。在诱导的不同时间分别收集菌液，确定IPTG最佳诱导时间。SDS-PAGE电泳分析经超声裂解后的菌体蛋白，判定其是以可溶性或包涵体形式表达。用His Bind Resin纯化重组蛋白，若为包涵体表达再用尿素浓度梯度降低的PBS进行透析，复性。

结果：用不同浓度IPTG诱导不同时间均获得了分子量约为36kDa的重组蛋白，与预测分子量一致，其中终浓度0.8mM的IPTG诱导4h获得最大表达量。蛋白表达分析表明重组蛋白以包涵体形式存在(图4A)。将包涵体溶于8M尿素，用His bind Resin纯化，将纯化后的蛋白用尿素浓度梯度降低的PBS透析至PBS中复性，得到纯化目的蛋白(图4B)。

实施例4pET28a-β-catenin-310蛋白抗血清的制备及特异性分析

1.抗血清的制备

取8～12周龄BALB/c雌性小鼠10只，其中2只用于佐剂对照。将纯化后的重组蛋白调整为1mg/mL，首次免疫时将蛋白与等体积弗氏完全佐剂混匀，背部皮下分点注射实验组8只小鼠，注射剂量为200uL/只(100ug蛋白)，同时取等体积无菌PBS与弗氏完全佐剂混匀后，同等剂量、同样途径注射入佐剂对照组小鼠。首次免疫后2周、4周分别进行第二次免疫和第三次免疫，免疫剂量及途径同于首免，所用佐剂为弗氏不完全佐剂。3免后5d小鼠尾静脉采血，用间接ELISA法检测血清中特异性IgG抗体水平，结果显示8只实验组小鼠效价均在1∶51 200以上，2只佐剂对照组小鼠血清系列稀释后OD₄₅₀均小于0.2。对效价高的实验组小鼠眼眶静脉丛采血，收集血清，置于-70℃冰箱冻存备用。

2.抗血清的特异性分析

本实验制备的抗血清为原核表达的重组蛋白免疫产生，因此用Western blotting分析抗血清和虫体天然β-catenin能否特异性结合。收集13d虫体，用PARIS^TM kit蛋白抽提试剂盒抽提虫体蛋白，用BCA法测定蛋白浓度，20μg虫体蛋白/孔进行SDS-PAGE电泳。电泳结束后按常规方法将蛋白转移到NC膜上，以1∶500稀释的pET28a-β-catenin-310蛋白免疫多抗作一抗，1∶2000稀释IRDye^TM800标记的羊抗小鼠IgG作二抗进行Western blotting，同时设置正常小鼠血清作阴性对照，通过Odyssey红外荧光扫描成像系统分析显色结果。

结果：Western blotting结果表明pET28a-β-catenin-310多克隆抗体能与天然虫体蛋白中的单一条带相结合，被结合蛋白呈现明显绿色荧光，分子量在70kDa左右，与β-catenin预测的蛋白分子量一致(图5A)。阴性血清对照组无特异条带出现(图5B)，表明以原核表达的β-catenin为免疫原得到的抗血清能特异性识别虫体天然蛋白中的β-catenin，可用于分析不同发育阶段虫体β-catenin蛋白水平的表达变化。

实施例5日本血吸虫α-tubulin抗血清的制备及特异性分析

1.pET28a-α-tubulin重组质粒的构建及在原核细胞的表达

本研究以α-tubulin为内参，分析β-catenin在日本血吸虫不同发育阶段的蛋白水平的表达，为此也构建了α-tubulin的原核表达载体，并进行了表达、纯化和多克隆抗体制备。以NCBI获得的日本血吸虫α-tubulin(GenBank登陆号AY815746)完整核苷酸序列ORF为模板设计PCR引物对，上游引物(5’-3’)：GTGGATCCATGCGTGAATGTATTAGTGTAC(SEQ ID NO.13)；下游引物(5’-3’)：GTCTCGAGGTACTCTTCTCCTTCCCCTTCA(SEQ ID NO.14)，上下游引物中分别引入BamH I和Xho I限制性内切酶位点(引物序列中划线处标出)。引物序列由公司合成。

以反转录的7d童虫cDNA为模板进行PCR扩增。将纯化的目的片段(1365bp)和pET28a质粒分别进行BamH I和Xho I双酶切并连接，构建pET28a-α-tubulin重组质粒。将重组质粒转入BL21(DE3)表达型感受态细胞，用1mM IPTG诱导表达，His Bind Resin纯化重组蛋白。

结果：pET28a-α-tubulin重组质粒转入BL21(DE3)，用1mM IPTG诱导4h获得了分子量约为55kDa的重组蛋白，与预测分子量一致(图6)。在图6中，1：未诱导表达的pET28a；2：用1mM IPTG诱导表达4h的pET28a；3：未诱导表达的pET28a-α-tubulin；4：用1mM IPTG诱导表达4h的pET28a-α-tubulin。

2.pET28a-α-tubulin抗血清的制备及特异性分析

纯化后的重组蛋白免疫小鼠，制备抗α-tubulin免疫血清，用Western blotting分析该抗血清的特异性。日本血吸虫α-tubulin抗血清的制备及特异性分析过程同β-catenin。

结果：pET28a-α-tubulin多克隆抗体能与天然虫体蛋白中的单一条带相结合，被结合蛋白呈现明显绿色荧光，分子量在55kDa左右，与α-tubulin预测的蛋白分子量一致(图7A)。阴性血清对照组无条带产生(图7B)，表明以原核表达的α-tubulin为免疫原得到的抗血清能特异性识别虫体α-tubulin蛋白，可作为内参蛋白抗血清，用于分析不同发育阶段虫体β-catenin蛋白水平的的表达变化。

实施例6β-catenin在日本血吸虫不同发育阶段蛋白表达分析

用PARIS^TM kit蛋白抽提试剂盒分别抽提虫卵、7d、13d、18d、23d、32d、42d虫体蛋白，用BCA法测定蛋白浓度，50μg虫体蛋白/孔进行SDS-PAGE电泳。电泳结束后按常规方法将蛋白转移到NC膜上，分别以1∶500稀释的抗β-catenin免疫血清、抗α-tubulin免疫血清作一抗，1∶2000稀释IRDye^TM800标记的羊抗小鼠IgG作二抗进行Western blotting，通过Odyssey红外荧光扫描成像系统分析显色结果。

结果：日本血吸虫不同发育阶段β-catenin蛋白水平的表达变化见图8。在α-tubulin内参蛋白基本一致条件下，虫卵中β-catenin蛋白水平最高，23d雌/雄虫表达量次之，13d虫体表达量也较高。18d及32d雌雄虫表达量较低，但42d雌雄虫表达量均略有升高。该变化趋势与日本血吸虫不同发育阶段β-catenin的mRNA水平表达量的变化基本一致。

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110>中国农业科学院上海兽医研究所

<120>日本血吸虫β-catenin基因、蛋白及用途

<160>14

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>671

<212>PRT

<213>Schistosoma japonicum

<400>1

Met Lys Lys Tyr Ser His Val Val Asp Ser Gln Asn Ser Lys Glu Phe

1               5                   10                  15

Gln Tyr Ser Leu Ser Val Asn Ser Ser Lys Ser Asp Leu Ser Thr Pro

            20                  25                  30

Thr Phe His Glu Cys Phe Ser Ser Val Glu Gln Leu Ser Gly Pro Val

        35                  40                  45

Ser Lys Leu Asn Glu Ile Ile Gln Glu Leu Ile Asn Tyr Lys Asn Asp

    50                  55                  60

Ala Glu Phe Ala Ala Leu Thr Ala Ser Asp Leu Ala Lys Arg Leu His

65                  70                  75                  80

Ser Asn Ile Ser Thr Asp Glu Ile Leu Gln Thr Met Ser Tyr Ile His

                85                  90                  95

Lys Leu Ala Arg Tyr Gln Ala Ala Arg Tyr Gly Leu Val Ser Cys Pro

            100                 105                 110

Glu Leu Val Gln Val Ile Ile Gln Ile Leu Gln Thr Thr Lys Asp Thr

        115                 120                 125

Asp Leu Gln Ser Glu Ala Ala Leu Thr Leu Gln Leu Leu Thr Lys Ser

    130                 135                 140

Leu Thr Gly Ala Lys Leu Thr Cys Glu Glu Ile Gly Ile Ser Lys Leu

145                 150                 155                 160

Val Asp Met Leu Arg His Pro Ser Glu Val Met Tyr Thr Thr Ala Leu

                165                 170                 175

Tyr Val Leu Asn Gln Leu Leu Trp His Leu Pro Asn Tyr Ala Arg Pro

            180                 185                 190

Glu Phe Arg Arg Tyr Asn Gly Gln Trp Asn Leu Ile Tyr Leu Leu Glu

        195                 200                 205

Glu Asn Arg Leu Asp Asp Ser Asn Trp Leu Leu Ile Cys Leu Asp Thr

    210                 215                 220

Leu Arg Met Ala Val Tyr Glu Ser Ser Glu Thr Lys Leu Ser Leu Ile

225                 230                 235                 240

Ser Thr Asn Ile Tyr Gln Ile Ile Val His Leu Leu Arg Thr Tyr Ser

                245                 250                 255

Ile Asn Met Lys Ile Ala Tyr Asn Leu Ala Arg Leu Ile Lys Val Leu

            260                 265                 270

Ser Val Cys Asn Glu Asn Lys Ile Lys Leu Val Glu Phe Gly Thr Val

        275                 280                 285

Glu Ala Leu Thr Pro Leu Leu Asn Ser Asn Asn Glu Val Leu Gln Leu

    290                 295                 300

Glu Thr Leu Trp Gly Leu Arg Asn Leu Ser Asp Gln Ala Tyr His Leu

305                 310                 315                 320

Ile Ala Thr Lys Asn Leu Ile Pro Ile Leu Ile Asn Leu Leu Ala Ser

                325                 330                 335

Lys Asn Glu His Ile Ser Ile Cys Ser Ala Gly Cys Leu Cys Asn Leu

            340                 345                 350

Thr Cys Gln Asn Val Gln Asn Lys Ser Leu Leu Val Glu Lys Gly Gly

        355                 360                 365

Val Lys Val Leu Cys Arg Leu Leu Cys Leu Asn Ser Asp Arg Gln Glu

    370                 375                 380

Ile Ala Glu Pro Ile Cys Ser Ala Leu Arg His Val Thr His Arg Asn

385                 390                 395                 400

Pro His Ala Asn Ser Ala Val Cys Glu Val Arg Thr Ser Asp Thr Leu

                405                 410                 415

Pro Thr Ile Ala Ser Leu Phe Leu Lys Tyr Gln Phe Val Ser Ala Leu

            420                 425                 430

Pro Leu Leu Lys Ser Val Val Gly Leu Val Arg Asn Leu Ser Thr Asp

        435                 440                 445

Glu Ile Thr Arg Pro Glu Leu Arg Asp Leu Asn Val Ser Lys Met Val

    450                 455                 460

Ala Asn Ile Phe Ile Gln Thr Phe Asn Ser Leu Asn Asp Ile Asn Lys

465                 470                 475                 480

Gln Gln Phe Asn Ile Glu Glu Gln Gln Cys Asn Asp Thr Leu Glu Gly

                485                 490                 495

Val Asn Leu Asp Asp Met Leu Glu Leu Thr Leu Ala Ala Leu Gln Ile

            500                 505                 510

Leu Ala Lys Asp Asn Thr Ile Gln Glu Glu Leu Ile His Thr Ala Gly

        515                 520                 525

Leu Ile Ser Ser Val Val Arg Leu Val Tyr Ser Pro Ser Glu Cys Leu

    530                 535                 540

Gln Arg Ala Ser Ser Ala Phe Leu Ser Gln Leu Ser Thr Ser Arg Ser

545                 550                 555                 560

Gly Ser Gln Ala Ile Glu Lys Glu Gly Val Cys Pro Arg Phe Thr Glu

                565                 570                 575

Leu Ile Gln Ser Asn Asn Glu Tyr Ile Ala Ala Tyr Thr Ala Ala Ile

            580                 585                 590

Leu Tyr Arg Ile Ala Gln Asp Lys Pro Glu Ser Tyr Arg Arg Arg Leu

        595                 600                 605

Ser Leu Glu Leu Arg Gln Ser Leu Phe Asp Gly Gly Leu Leu Asn Asp

    610                 615                 620

Pro Asn Glu Ile Leu Asp Pro Tyr Asn Ser Ser Pro Ser Lys Phe Ile

625                 630                 635                 640

Asn Ser Thr Ser Leu Pro Asp Asp Ser Ser Pro His Ile Lys Asp Arg

                645                 650                 655

Arg Ser Arg His Leu Ser Glu Ser Asn Leu Arg Gln Arg Ser Asn

            660                 665                 670

<210>2

<211>2354

<212>DNA

<213>Schistosoma japonicum

<220>

<221>CDS

<222>(255)..(2270)

<220>

<221>mi sc_feature

<222>(1745)..(1745)

<223>n is a，c，g，or t

<400>2

gacttttgaa ggtagtctgt aaacagtgct tatttcgaaa attcccggaa gtaaataatg     60

tcacgttctt agttattttg tcttggcgtt cacaacatgt acagctaaaa atatgcaact    120

caaaaatgac cttcaaacct ataatcagaa cacagcaatc acggcactgt aaaccaggta    180

ttactaattt ttcaaagatt gtgtatattc tctacactta attcattgga aaacatattt    240

tcaaagaatt tgta atg aaa aaa tac tca cat gta gtt gat tca caa aat      290

                Met Lys Lys Tyr Ser His Val Val Asp Ser Gln Asn

                1               5                   10

tct aaa gaa ttt cag tac agt tta tct gtt aat tct tca aag tct gat      338

Ser Lys Glu Phe Gln Tyr Ser Leu Ser Val Asn Ser Ser Lys Ser Asp

        15                  20                  25

tta tct aca cca aca ttt cat gag tgt ttt tct tca gtt gaa caa tta      386

Leu Ser Thr Pro Thr Phe His Glu Cys Phe Ser Ser Val Glu Gln Leu

    30                  35                  40

tct gga ccg gta tct aaa ttg aat gag ata att caa gaa ctc att aac    434

Ser Gly Pro Val Ser Lys Leu Asn Glu Ile Ile Gln Glu Leu Ile Asn

45                  50                  55                  60

tat aaa aat gat gct gaa ttt gca gct ttg act gct tca gat tta gct    482

Tyr Lys Asn Asp Ala Glu Phe Ala Ala Leu Thr Ala Ser Asp Leu Ala

                65                  70                  75

aaa cgt ctt cat tct aac att tct act gat gaa ata ctt caa act atg    530

Lys Arg Leu His Ser Asn Ile Ser Thr Asp Glu Ile Leu Gln Thr Met

            80                  85                  90

tca tat att cat aaa ctt gca cgt tat caa gct gca cgt tat gga ttg    578

Ser Tyr Ile His Lys Leu Ala Arg Tyr Gln Ala Ala Arg Tyr Gly Leu

        95                  100                 105

gtg agt tgt cct gag ctt gtc caa gtt att att caa att cta caa aca    626

Val Ser Cys Pro Glu Leu Val Gln Val Ile Ile Gln Ile Leu Gln Thr

    110                 115                 120

act aaa gat act gat cta cag tca gaa gca gca tta aca ctt cag ttg    674

Thr Lys Asp Thr Asp Leu Gln Ser Glu Ala Ala Leu Thr Leu Gln Leu

125                 130                 135                 140

tta act aaa tca cta act ggt gct aaa ttg acc tgt gaa gaa atc ggt    722

Leu Thr Lys Ser Leu Thr Gly Ala Lys Leu Thr Cys Glu Glu Ile Gly

                145                 150                 155

atc tca aag tta gtt gat atg tta agg cat cca tca gaa gtg atg tat    770

Ile Ser Lys Leu Val Asp Met Leu Arg His Pro Ser Glu Val Met Tyr

            160                 165                 170

aca act gct ctc tat gta ttg aat caa tta tta tgg cat tta cca aat    818

Thr Thr Ala Leu Tyr Val Leu Asn Gln Leu Leu Trp His Leu Pro Asn

        175                 180                 185

tat gca cgt cca gaa ttc cga cga tat aat ggt caa tgg aat ctt att    866

Tyr Ala Arg Pro Glu Phe Arg Arg Tyr Asn Gly Gln Trp Asn Leu Ile

    190                 195                 200

tac tta ctc gaa gag aat cgt tta gat gac tca aat tgg tta tta ata    914

Tyr Leu Leu Glu Glu Asn Arg Leu Asp Asp Ser Asn Trp Leu Leu Ile

205                 210                 215                 220

tgt ttg gat aca tta cgt atg gca gtc tat gaa agc agt gaa aca aag    962

Cys Leu Asp Thr Leu Arg Met Ala Val Tyr Glu Ser Ser Glu Thr Lys

                225                 230                 235

tta tca ctt att tca acg aat att tat caa att att gta cat cta tta    1010

Leu Ser Leu Ile Ser Thr Asn Ile Tyr Gln Ile Ile Val His Leu Leu

            240                 245                 250

aga aca tat tca atc aat atg aaa att gct tat aat cta gca aga tta    1058

Arg Thr Tyr Ser Ile Asn Met Lys Ile Ala Tyr Asn Leu Ala Arg Leu

        255                 260                 265

att aaa gtt tta agt gta tgc aat gag aat aaa att aaa tta gtt gaa    1106

Ile Lys Val Leu Ser Val Cys Asn Glu Asn Lys Ile Lys Leu Val Glu

    270                 275                 280

ttt ggc act gta gaa gca tta aca cca tta ttg aat agt aac aat gaa    1154

Phe Gly Thr Val Glu Ala Leu Thr Pro Leu Leu Asn Ser Asn Asn Glu

285                 290                 295                 300

gta tta caa ttg gaa aca ctt tgg gga tta cgt aat ctt agt gat caa    1202

Val Leu Gln Leu Glu Thr Leu Trp Gly Leu Arg Asn Leu Ser Asp Gln

                305                 310                 315

gct tat cat tta ata gca aca aaa aat ctt ata cca ata tta att aat    1250

Ala Tyr His Leu Ile Ala Thr Lys Asn Leu Ile Pro Ile Leu Ile Asn

            320                 325                 330

tta ttg gct agt aaa aat gaa cat att tca ata tgt tca gct gga tgt    1298

Leu Leu Ala Ser Lys Asn Glu His Ile Ser Ile Cys Ser Ala Gly Cys

        335                 340                 345

tta tgt aat tta act tgt caa aat gta caa aat aaa agt tta ctt gtt    1346

Leu Cys Asn Leu Thr Cys Gln Asn Val Gln Asn Lys Ser Leu Leu Val

    350                 355                 360

gaa aaa ggt ggt gtt aaa gtt ctc tgt aga cta ttg tgt ttg aat tca    1394

Glu Lys Gly Gly Val Lys Val Leu Cys Arg Leu Leu Cys Leu Asn Ser

365                 370                 375                 380

gat cgt caa gag att gca gaa cca atc tgt tct gct tta cgt cat gta    1442

Asp Arg Gln Glu Ile Ala Glu Pro Ile Cys Ser Ala Leu Arg His Val

                385                 390                 395

act cat cgt aat cca cac gcg aat tca gct gtt tgt gaa gta cgt act    1490

Thr His Arg Asn Pro His Ala Asn Ser Ala Val Cys Glu Val Arg Thr

            400                 405                 410

agt gat act tta cca act att gca tca tta ttt tta aaa tat caa ttt    1538

Ser Asp Thr Leu Pro Thr Ile Ala Ser Leu Phe Leu Lys Tyr Gln Phe

        415                 420                 425

gta tcc gct tta cca tta ctg aaa tct gtt gtt ggt ctt gtt cga aat    1586

Val Ser Ala Leu Pro Leu Leu Lys Ser Val Val Gly Leu Val Arg Asn

    430                 435                 440

tta tcc act gat gaa ata aca cgt cct gaa ctt aga gat tta aat gta    1634

Leu Ser Thr Asp Glu Ile Thr Arg Pro Glu Leu Arg Asp Leu Asn Val

445                 450                 455                 460

tcc aag atg gta gct aat ata ttc ata caa aca ttc aat tca tta aat    1682

Ser Lys Met Val Ala Asn Ile Phe Ile Gln Thr Phe Asn Ser Leu Asn

                465                 470                 475

gat ata aat aaa caa caa ttc aat ata gaa gaa caa caa tgt aat gat    1730

Asp Ile Asn Lys Gln Gln Phe Asn Ile Glu Glu Gln Gln Cys Asn Asp

            480                 485                 490

aca tta gaa ggt gtn aat ctt gac gat atg tta gag tta aca tta gct    1778

Thr Leu Glu Gly Val Asn Leu Asp Asp Met Leu Glu Leu Thr Leu Ala

        495                 500                 505

gca tta caa att cta gca aaa gat aat act att caa gaa gaa tta ata    1826

Ala Leu Gln Ile Leu Ala Lys Asp Asn Thr Ile Gln Glu Glu Leu Ile

    510                 515                 520

cat aca gct ggt tta att tca tca gtt gta cga tta gtt tat tca cca    1874

His Thr Ala Gly Leu Ile Ser Ser Val Val Arg Leu Val Tyr Ser Pro

525                 530                 535                 540

tcg gaa tgt tta caa cgt gca tca tct gca ttt tta agt caa tta tca    1922

Ser Glu Cys Leu Gln Arg Ala Ser Ser Ala Phe Leu Ser Gln Leu Ser

                545                 550                 555

act tca cgt tct gga tct caa gca att gaa aaa gaa gga gta tgt cct    1970

Thr Ser Arg Ser Gly Ser Gln Ala Ile Glu Lys Glu Gly Val Cys Pro

            560                 565                 570

aga ttt act gaa ctt att caa tcg aat aat gaa tac att gct gcg tat    2018

Arg Phe Thr Glu Leu Ile Gln Ser Asn Asn Glu Tyr Ile Ala Ala Tyr

        575                 580                 585

act gct gct atc ctg tat cgt att gca caa gat aaa cct gaa tcg tat    2066

Thr Ala Ala Ile Leu Tyr Arg Ile Ala Gln Asp Lys Pro Glu Ser Tyr

    590                 595                 600

aga cgt cga cta tca tta gaa tta cgt caa tca ctt ttt gat gga gga    2114

Arg Arg Arg Leu Ser Leu Glu Leu Arg Gln Ser Leu Phe Asp Gly Gly

605                 610                 615                 620

tta ctt aat gat cca aat gaa ata tta gat cca tac aat tca agt cca    2162

Leu Leu Asn Asp Pro Asn Glu Ile Leu Asp Pro Tyr Asn Ser Ser Pro

                625                 630                 635

tca aaa ttt atc aat agt aca tca tta cca gat gat agt tca cca cat    2210

Ser Lys Phe Ile Asn Ser Thr Ser Leu Pro Asp Asp Ser Ser Pro His

            640                 645                 650

att aaa gat cga cga tca aga cat tta tct gaa tct aat tta aga caa    2258

Ile Lys Asp Arg Arg Ser Arg His Leu Ser Glu Ser Asn Leu Arg Gln

        655                 660                 665

cgt tca aat tag actgtaatag tattttgtat aattctctga ttaataacat        2310

Arg Ser Asn

    670

aattactaac ttgcaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa                   2354

<210>3

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(25)

<223>引物

<400>3

caacttcacg ttctggatct caagc                                      25

<210>4

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(25)

<223>引物

<400>4

tgctgcgtat actgctgcta tcctg                                      25

<210>5

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(25)

<223>引物

<400>5

tcaggacgtg ttatttcatc agtgg                                      25

<210>6

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(25)

<223>引物

<400>6

gaccaacaac agatttcagt aatgg                                      25

<210>7

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(18)

<223>引物

<400>7

aaggcatcca tcagaagt                                              18

<210>8

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(23)

<223>引物

<400>8

actgctttca tagactgcca tac                                        23

<210>9

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(25)

<223>引物

<400>9

ttagttggtg gagcgatttg tctgg                                      25

<210>10

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(25)

<223>引物

<400>10

ctgttattgc tcaatttcgt gcgac                                      25

<210>11

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(30)

<223>引物

<220>

<221>misc_feature

<222>(3)..(8)

<223>BamH I酶切位点

<400>11

gtggatccat gaaaaaatac tcacatgtag                                30

<210>12

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(30)

<223>引物

<220>

<221>misc_feature

<222>(3)..(8)

<223>Xho I酶切位点

<400>12

gtctcgagat cactaagatt acgtaatccc                                      30

<210>13

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(30)

<223>引物

<220>

<221>misc_feature

<222>(3)..(8)

<223>BamH I酶切位点

<400>13

gtggatccat gcgtgaatgt attagtgtac                                      30

<210>14

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(30)

<223>引物

<220>

<221>misc_feature

<222>(3)..(8)

<223>Xho I酶切位点

<400>14

gtctcgaggt actcttctcc ttccccttca                                      30

Claims (6)

1.一种日本血吸虫基因，其特征在于，所述基因为编码SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的β-catenin基因。

2.根据权利要求1所述的日本血吸虫基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列为SEQ IDNO.2所示的DNA序列。

3.一种日本血吸虫蛋白质，其特征在于，所述蛋白质为SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的β-catenin蛋白质。

4.一种重组载体，其特征在于，包含编码SEQ ID NO.1中8-310位氨基酸序列的DNA序列。

5.一种宿主细胞，其特征在于，包含权利要求4所述的重组载体。

6.一种抗血清，其特征在于，该抗血清是用权利要求4所述重组载体表达的重组蛋白免疫动物而制得。

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