CN101532008A - 抗β-catenin单克隆抗体制备及在结肠癌病理检测中的应用 - Google Patents
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Abstract
抗β－catenin单克隆抗体制备及在结肠癌病理检测中的应用，属于生物医药技术领域。本发明应用重组小鼠β－catenin蛋白，免疫Balb/c小鼠，应用杂交瘤技术，通过ELISA双筛得到1株抗β－catenin单抗1D3，其亚型为IgG2a。用免疫印迹法(Western blot)检测β－catenin抗体的纯度和特异性以及结肠癌细胞系SW48和HCT116中β－catenin蛋白的表达。用免疫组化SP法检测β－catenin在正常结肠组织和结肠癌组织中的不同表达。本发明制备了高效价、特异性的抗β－catenin单克隆抗体。用该抗体检测证实，正常结肠组织β－catenin表达在细胞膜中，而结肠癌组织β－catenin则在细胞浆中表达。提示结肠癌发生后β－catenin由细胞膜易位入细胞浆中表达，这可作为结肠癌的诊断的参考指标。
Description
技术领域
抗β-catenin单克隆抗体制备及在结肠癌病理检测中的应用，属于生物医药技术领域。
背景技术
β-catenin是一种新的原癌基因产物，也是细胞内十分重要的信号分子，它在肿瘤病因研究领域中有重要作用。β-catenin的相对分子质量约为92000，其编码基因定位于人类染色体3p21。它的功能参与钙黏蛋白介导的细胞间黏附，并且作为Wnt信号通路的重要成员参与细胞增殖、分化的调节，是近年来大肠癌研究领域的热点。然而，用于临床的β-catenin抗体国内生产很少，为了能够提供质优、价廉的β-catenin抗体，我们应用美国MD公司制备的小鼠重组β-catenin蛋白制备了抗β-catenin单克隆抗体，并分析了β-catenin蛋白在人结肠癌细胞株以及在结肠良、恶性肿瘤组织中的表达情况。从实验结果来看，本发明制备的抗体具有效价高，特异性强等特点，可用于科研或临床诊断结肠癌。
发明内容
本发明的目的是提供抗β-catenin单克隆抗体制备及在结肠癌病理检测中的应用，为β-catenin蛋白的表达、肿瘤病因研究提供有价值的物质条件。
本发明的技术方案：一种抗β-catenin单克隆抗体的制备方法，应用重组小鼠β—catenin蛋白，免疫Balb/c小鼠，应用杂交瘤技术，通过ELISA双筛得到1株抗β-catenin单抗1D3，其亚型为IgG2a；步骤为：
将免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，HAT培养液选择培养10天，6块96孔板中500孔有杂交瘤细胞生长，融合率为90％；融合后第12天，进行第1次ELISA双筛选，先将吸出的上清分别与融合蛋白β-catenin和P21包被的抗原板行EL1SA检测，选择β-catenin为阳性而P21为阴性的克隆进行第一次亚克隆，此后重复进行ELISA筛选及亚克隆3-4次，最后获得1株能稳定分泌抗β-catenin McAb的杂交瘤细胞株，命名1D3，亚类鉴定为IgG2a。
抗β-catenin单克隆抗体在结肠癌病理检测中的应用：
用免疫印迹法Western blot检测β-catenin抗体的纯度和特异性以及结肠癌细胞系SW48和HCT116中β-catenin蛋白的表达；用免疫组化SP法检测β-catenin在正常结肠组织和结肠癌组织中的不同表达；结果显示：
(1)抗β-catenin抗体特异结合β-catenin重组蛋白
β-catenin重组蛋白经8％的SDS-PAGE电泳，将凝胶中的β-catenin转移至PVDF膜上，封闭后，用抗β-catenin抗体进行免疫染色，加入制备并纯化的β-catenin抗体，工作浓度1∶2000，4℃过夜，加入HRP标记的羊抗鼠抗体，工作浓度1∶5000，于37℃反应1h，出现Mr为92000的条带，与文献报道相符，证明此抗体为抗β-catenin的特异性抗体；
(2)抗β-catenin抗体在结肠癌细胞株中的应用
从人结肠癌细胞株SW48和HCT116中分别提取细胞总蛋白，用制备的抗β-catenin抗体做免疫印迹检测，得到两条特异性条带，说明这两种结肠癌细胞株均为β-catenin蛋白表达；
(3)β-catenin在结肠癌组织中的表达
应用抗β-catenin抗体对正常结肠和结肠癌β-catenin的表达进行定位分析，按常规法作病理切片进行免疫组化染色，一抗为兔抗β-catenin，稀释度为1∶100，并用PBS替代一抗作为空白对照，DAB显色，苏木精复染，结果显示，β-catenin在正常结肠组织中表达在细胞膜上，而在结肠癌组织中有52.17％为阳性表达，并且发现β-catenin在细胞浆中大量表达，提示结肠癌发生后β-catenin由细胞膜易位入细胞浆。
本发明的有益效果：本发明应用重组小鼠β—catenin蛋白，免疫Balb/c小鼠，应用杂交瘤技术，通过ELISA双筛得到1株抗β-catenin单抗1D3，其亚型为IgG2a。用免疫印迹法(Western blot)检测β-catenin抗体的纯度和特异性以及结肠癌细胞系SW48和HCT116中β-catenin蛋白的表达。用免疫组化SP法检测β-catenin在正常结肠组织和结肠癌组织中的不同表达。结果，将β-catenin经SDS—PAGE分离，可见1条相对分子质量为92000的蛋白条带，与文献报道相符。用抗β-catenin单克隆抗体做Western blot分析显示，在分子量92000处有1条明显的区带，证明是抗β-catenin特异性抗体。从人结肠癌细胞株SW48和HCT116提取全细胞蛋白，经用所制备的β-catenin抗体反应，均可观察到β-catenin蛋白的表达。人结肠组织切片经抗β-eatenin抗体免疫组化染色，在正常结肠组织细胞膜中可见棕黄色颗粒，而在结肠癌组织的细胞浆中可见棕黄色颗粒。本发明制备了高效价、特异性的抗β-catenin单克隆抗体。用该抗体检测证实，正常结肠组织β-catenin表达在细胞膜中，而结肠癌组织β-catenin则在细胞浆中表达。提示结肠癌发生后β-catenin由细胞膜易位入细胞浆中表达，这可作为结肠癌的诊断的参考指标。
附图说明
图1抗β-catenin抗体特异性的Western blotting分析。1、P21蛋白，2、β-catenin重组蛋白。
图2Western-Blotting检测β-catenin在结肠癌细胞株中的表达。1、SW48细胞、HCT116细胞。
图3免疫组化检测β-catenin在结肠癌组织中的表达。1、正常结肠组织，2.结肠癌组织。
具体实施方式
1、主要试剂：
重组小鼠β-catenin蛋白，购自美国MD公司(蛋白含量3.98g/L，SDS-PAGE分离显示单一条带，Mr为92000)。
全细胞蛋白提取试剂盒，购自美国Activemotif生物公司。SP试剂盒为Promega的产品。
细胞株：人结肠癌细胞株SW48和HCT116均购自ATCC细胞株库。
动物：Balb/c小鼠，雌性，6—8周龄，20-25g/只，购自中国医学科学院动物研究所。
2、抗β-catenin McAb杂交瘤细胞的建立
将免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，HAT培养液选择培养10d，6块96孔板中500孔有杂交瘤细胞生长，融合率为90％。融合后第12天，进行第1次ELISA双筛选，先将吸出的上清分别与融合蛋白β-catenin和P21包被的抗原板行EL1SA检测，选择β-catenin为阳性而P21为阴性的克隆进行第一次亚克隆，此后重复进行ELISA筛选及亚克隆3-4次，最后获得1株能稳定分泌抗β-catenin McAb的杂交瘤细胞株，命名1D3，亚类鉴定为IgG2a。
3、小鼠抗β-catenin单克隆抗体的鉴定将杂交瘤细胞株扩大培养后收集上清，其效价可达10-5，用Protein ASepharose-4B柱进行层析纯化，纯化后抗体效价可达10-6，ELISA检测结果表明，杂交瘤培养上清，及纯化的抗体均能与β-catenin蛋白特异结合。
4、人结肠癌细胞株β—catenin蛋白表达的检测
用Western blot法检测两株细胞提取液中β-catenin蛋白的表达。每株细胞取蛋白各50μg，用8％SDS.PAGE电泳分离后电转移到PVDF膜上，封闭后，加入制备并纯化的β-catenin抗体(工作浓度1∶2000)，4℃过夜.加入HRP标记的羊抗鼠抗体(工作浓度1∶5000)于37℃反应1h，ECL显色后观察结果。
5、结肠组织中β-catenin表达的检测
组织切片来自外科结肠癌患者手术切除的正常结肠和结肠癌组织标本。病理组织学观察按全国结肠癌病理协作组制定的诊断标准作出明确诊断。按Dukes分期，其中A、B期22例，C、D期22例。按常规法作病理切片进行免疫组化染色。一抗为自制的兔抗β-catenin，稀释度为1∶100，并用PBS替代一抗作为空白对照。DAB显色，苏木精复染。结果判定：按照国外学者对组织中β-catenin的判定标准，β-catenin蛋白阳性反应为黄到棕黄色细小颗粒，定位于细胞浆。
结果：
1、抗β-catenin抗体特异结合β-catenin重组蛋白
β-catenin重组蛋白经8％的SDS-PAGE电泳，将凝胶中的β-catenin转移至PVDF膜上，用抗β-catenin抗体进行免疫染色，出现Mr为92000左右的条带(图1)，与文献报道相符，证明此抗体为抗β-catenin的特异性抗体。
2、抗β-catenin抗体在结肠癌细胞株中的应用
从人结肠癌细胞株SW48和HCT116中分别提取细胞总蛋白.用紫外分光光度法测定其蛋自含量分别为：4.78g/L、3.97g/L。用制备的抗β-catenin抗体做免疫印迹检测，得到两条特异性条带，说明这两种结肠癌细胞株均β-catenin蛋白表达。
3、β-catenin在结肠癌组织中的表达
应用抗β-catenin抗体对44例正常结肠和结肠癌β-catenin的表达进行进行了定位分析，结果显示，β-catenin在正常结肠组织中表达在细胞膜上.而在结肠癌组织中有52.17％为阳性表达.并且发现β-catenin在细胞浆中大量表达，提示结肠癌发生后β-catenin由细胞膜易位入细胞浆。
Claims (2)
1、一种抗β-catenin单克隆抗体的制备方法，其特征是应用重组小鼠β—catenin蛋白，免疫Balb/c小鼠，应用杂交瘤技术，通过ELISA双筛得到1株抗β-catenin单抗1D3，其亚型为IgG2a；步骤为：
将免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，HAT培养液选择培养10天，6块96孔板中500孔有杂交瘤细胞生长，融合率为90％；融合后第12天，进行第1次ELISA双筛选，先将吸出的上清分别与融合蛋白β-catenin和P21包被的抗原板行EL1SA检测，选择β-catenin为阳性而P21为阴性的克隆进行第一次亚克隆，此后重复进行ELISA筛选及亚克隆3-4次，最后获得1株能稳定分泌抗β-catenin McAb的杂交瘤细胞株，命名1D3，亚类鉴定为IgG2a。
2、用权利要求1所述方法制备的抗β-catenin单克隆抗体的在结肠癌病理检测中的应用，其特征是：
用免疫印迹法Western blot检测β-catenin抗体的纯度和特异性以及结肠癌细胞系SW48和HCT116中β-catenin蛋白的表达；用免疫组化SP法检测β-catenin在正常结肠组织和结肠癌组织中的不同表达；结果显示：
(1)抗β-catenin抗体特异结合β-catenin重组蛋白
β-catenin重组蛋白经8％的SDS-PAGE电泳，将凝胶中的β-catenin转移至PVDF膜上，封闭后，用抗β-catenin抗体进行免疫染色，加入制备并纯化的β-catenin抗体，工作浓度1∶2000，4℃过夜，加入HRP标记的羊抗鼠抗体，工作浓度1∶5000，于37℃反应1h，出现Mr为92000的条带，与文献报道相符，证明此抗体为抗β-catenin的特异性抗体；
(2)抗β-catenin抗体在结肠癌细胞株中的应用
从人结肠癌细胞株SW48和HCT116中分别提取细胞总蛋白，用制备的抗β-catenin抗体做免疫印迹检测，得到两条特异性条带，说明这两种结肠癌细胞株均为β-catenin蛋白表达；
(3)β-catenin在结肠癌组织中的表达
应用抗β-catenin抗体对正常结肠和结肠癌β-catenin的表达进行定位分析，按常规法作病理切片进行免疫组化染色，一抗为兔抗β-catenin，稀释度为1∶100，并用PBS替代一抗作为空白对照，DAB显色，苏木精复染，结果显示，β-catenin在正常结肠组织中表达在细胞膜上，而在结肠癌组织中有52.17％为阳性表达，并且发现β-catenin在细胞浆中大量表达，提示结肠癌发生后β-catenin由细胞膜易位入细胞浆。
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