CN102061287B

CN102061287B - 抗人ppGalNAc-T2单克隆抗体及其应用

Info

Publication number: CN102061287B
Application number: CN201010555708A
Authority: CN
Inventors: 刘春亮; 林丹丹; 顾文超; 姜智; 徐岚; 吴士良
Original assignee: Suzhou University
Current assignee: Suzhou University
Priority date: 2010-11-23
Filing date: 2010-11-23
Publication date: 2012-10-03
Anticipated expiration: 2030-11-23
Also published as: CN102061287A

Abstract

本发明属于微生物工程领域，具体涉及一种抗人ppGalNAc-T2单克隆抗体及其制备方法和应用，所述单克隆抗体由杂交瘤细胞株LW-5F3产生。所述高特异性、高效价的鼠抗人ppGalNAc-T2单克隆抗体，能够采用间接免疫酶联吸附实验(ELISA)，免疫印迹(Western-blot)，免疫细胞荧光(Immunocytoflurescence)，免疫荧光流式细胞分析(Flowcytometer Analysis)或免疫组织化学(Immunohistochemistry)等多种手段实现对ppGalNAc-T2表达的快速通量检测。

Description

抗人ppGalNAc-T2单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明属于微生物工程领域，具体涉及一种抗人ppGalNAc-T2单克隆抗体及其制备方法和应用。

背景技术

多肽：N-乙酰氨基半乳糖转移酶(ppGalNAc-T)家族是催化蛋白质肽链上丝氨酸或苏氨酸(Ser/Thr)残基以合成O-糖链的起始酶。迄今为止，在哺乳动物中该酶家族至少有18个成员被克隆表达鉴定。通过基因数据库比较分析提示该家族有24个潜在的成员组成。所有的ppGalNAc-Ts都能够结合底物UDP-GalNAc，但它们在蛋白质骨架上的催化位点又有所不同，正是这种不同使得该酶成员众多，并有着广泛的组织分布。近年来研究表明，ppGalNAc-T家族成员在多种人肿瘤细胞或组织中存在异常表达，例如在鳞状癌变组织中ppGalNAcT1表达异常下降而ppGalNAc-T2和ppGalNAc-T3表达升高；在结肠癌中发现了ppGalNAc-T1，ppGalNAc-T2，和ppGalNAc-T3表达的异常升高。其中ppGalNAc-T3的异常表达还在结肠癌、胃癌、肺癌、胰腺癌、胆囊癌、前列腺癌以及原发性肝胆管癌中均有报道；在乳腺癌及胃癌中发现ppGalNAc-T6异常表达；还有研究小组在人胃肠道肿瘤中检测到ppGalNAc-T12的表达也发生了异常改变；重要的是，这些存在于肿瘤中的异常表达情况可成为潜在的肿瘤诊断依据。

为了更方便快捷地检测ppGalNAc-T在肿瘤中的异常表达情况，制备ppGalNAc-T抗体显得尤为重要。ppGalNAc-T2作为的ppGalNAc-T酶家族的一个重要成员，是O-糖链起始合成关键酶。

现有技术中，国外研究小组制备ppGalNAc-T2单/多克隆抗体，且用于人肿瘤的检测研究有以下报道：1)如2000年，来自日本的Takuhiro Kohsaki等人制备了兔抗人ppGalNAc-T2多克隆抗体用于检测结肠癌细胞及组织，发现ppGalNAc-T2存在明显高表达(参考：J Gastroenterol 2000；35：840-848)；2)早在1999年，丹麦的Ulla Mandel研究小组就成功制备了鼠抗人ppGalNAc-T2单克隆抗体并命名为UH4(IgG1)，该研究小组还对该抗体作了较为细致深入的研究(参考Glycobiology，1999，9(1)：43-52)。

与多克隆抗体相比，单克隆抗体有高特异性、高效价等优点，更适用于目标抗原的检测，上述技术方案中，丹麦Ulla Mandel小组的制备方案具有以下优点：1)采用昆虫细胞表达产物作为免疫原，比传统的原核蛋白抗原或新兴的DNA抗原相比，在制备单克隆抗体上更有优势；2)在筛选阳性克隆时，选用了三级筛选，分别是间接免疫酶联吸附试验ELISA、免疫荧光流式细胞分析法和免疫共沉淀法；这更有利于筛选出真正的阳性克隆。

但他们的方案中同时存在了不足：首先，他们选用了昆虫杆状病毒表达系统(Sf9细胞)制备免疫原，但存在的一些问题如杆状病毒的基因组学研究相对薄弱，有关病毒晚期基因的高表达和调控机制等还不十分清楚，表达产物的纯化比较困难，多元表达等方面的技术还不够成熟等，均有待进一步解决；其次，所制备的抗体在ELISA和免疫沉淀中有着较好的表现，但在免疫印迹WesternBlot实验中的表现却不尽人意，这就限制了该抗体的使用，因为免疫印迹试验是现在最为通用可靠的可定量检测目的蛋白表达情况的一种手段。

基于以上分析，需要制备一种高特异性、高效价的鼠抗人ppGalNAc-T2单克隆抗体，使其能够用于间接免疫酶联吸附实验(ELISA)，免疫印迹(Western-blot)，免疫细胞荧光(Immunocytoflurescence)，免疫荧光流式细胞分析(Flowcytometer Analysis)，免疫组织化学(Immunohistochemistry)等多种研究手段，以实现ppGalNAc-T2表达的快速通量检测。

发明内容

本发明目的是提供一种人ppGalNAc-T2的单克隆抗体，利用该单克隆抗体通过免疫学方法检测人ppGalNAc-T2基因的蛋白表达水平；本发明的另一目的是提供能产生具有良好识别ppGalNAc-T2蛋白并能与其进行免疫学反应的单克隆抗体分泌型稳定杂交瘤细胞株，通过该细胞株大量生产均质的、稳定的、多用途的、可用于商业化的单克隆抗体。

为为达到上述目的，本发明具体技术方案是，一种杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株的保藏信息为：保藏单位：中国典型培养物保藏中心；地址：中国武汉大学；保藏日期2010年11月4日；保藏编号CCTCC NO：C2010106；分类命名：杂交瘤细胞株LW-5F3。

上述杂交瘤细胞株的制备方法包括以下步骤：

(1)利用ppGalNAc-T2基因(基因序列号是：NM_004481.3)原核表达产物免疫Balb/C小鼠以获取能产生针对该蛋白特异性抗体的致敏B细胞；

(2)获取融合细胞生长克隆：从免疫合格小鼠无菌取其脾细胞作为抗原致敏的B细胞，按常规方法，将B细胞与骨髓瘤细胞SP2/0株融合，然后利用常规的融合细胞HAT筛选方法进行筛选，进而获取融合细胞生长克隆；

(3)分泌单克隆抗体融合细胞克隆的筛选：①应用双抗体夹心ELISA或间接ELISA检测策略筛选分泌单克隆抗体融合细胞克隆是获取分泌单抗细胞克隆常规手段，发明人选用了间接ELISA检测手段进行检测；②使用免疫荧光流式细胞分析加以筛选：即以ELISA检测阳性的作为候选克隆，再采用免疫荧光流式细胞分析阳性作为关键指标以确立其阳性克隆；

(4)单克隆抗体杂交瘤细胞株的获得：采用双筛选方法，仅获得三株合格细胞克隆，其中一株细胞4D3(进行融合细胞培养时共用了12块96孔板，这里指的是第4块板的D列3行孔中的细胞)克隆免疫荧光信号均强于其他二株(11E7和9B12，同样的方法编号)，将该克隆细胞按常规单细胞克隆方法进行了二轮亚克隆并对每轮亚克隆进行双筛选：直至所有的亚克隆均呈强双阳性后，从中挑出一株生长最旺的单细胞克隆(编号5F3)扩大培养并进行传代冻存。

将上述技术方案中生长最旺的单细胞克隆(编号5F3)送交至武汉大学的中国典型培养物保藏中心保藏。

上述技术方案中，采用步骤(1)的策略是基于以下几方面考虑：

首先，原核表达产物作免疫原其表达量高(这是真核表达产物无法达到的)，易纯化(通过蛋白制备电泳的方法可以获取其纯度大于85％纯化物，纯化周期仅需1天的时间，大大减少了该蛋白降解的可能性)。

其次，该基因原核表达产物与天然表达蛋白能有相同的抗原识别位点完全满足制备抗体的要求；

再次，用PCR产物直接免疫动物属DNA疫苗的范畴，该技术到目前为止仅为探索阶段其技术不成熟，因此不宜采用该策略；

最后，选Balb/C小鼠免疫制备检测用单克隆抗体是通用策略，我们制备该抗体目的并不用于抗体的治疗故无需制备人源化的单抗，即便需要亦可在此基础上再进行研究。

上述技术方案中，采用步骤(3)的策略是基于以下几方面考虑：

ELISA的优点是可进行大量样本检测，操作时间短：2～3h内可出报告，但缺点是有一定的非特异性，考虑到ELISA检测存在一定非特异性风险，本发明采用了双筛选方法，与常规单抗筛选方法相比，双筛选比单筛选提高了筛选的可靠性；此外，发明人制备的免疫原是一种融合蛋白，因此用ELISA法有可能筛选了融合蛋白的标签的位点而非ppGalNAc-T2蛋白的位点的风险，所以必须用另一方法确立识别的是ppGalNAc-T2蛋白抗原表位来佐证。

本发明同时要求保护一种人ppGalNAc-T2的单克隆抗体，所述人ppGalNAc-T2的单克隆抗体由上述杂交瘤细胞株LW-5F3产生，所述单克隆抗体为高特异性的鼠源抗ppGalNAc-T2单克隆抗体，所述单克隆抗体为IgM类，kapa型，制备所述人ppGalNAc-T2的单克隆抗体的方法有两种：

第一种方法包括以下步骤：以上述杂交瘤细胞4D3亚克隆的一株细胞5F3(即杂交瘤细胞株LW-5F3)作种子细胞用10％CBS+DMEM或10％CBS+RPMI-1640，在细胞培养设备(如转瓶细胞培养设备)中进行扩大培养，在培养上清中可分泌鼠抗人ppGalNAc-T2单克隆抗体；

第二种方法采用杂交瘤细胞株LW-5F3诱生腹水的方法来生产该单抗蛋白；

对上述两种方法进行比较：用ELISA法进行效价比较发现：腹水中抗体效价比培养上清(细胞浓度为10⁶/ml)抗体的效价高出3000倍以上，故采用该方法生产极大的提高了单抗蛋白产量大大的降低了生产成本。

上述技术方案中，用杂交瘤细胞株LW-5F3反复进行诱生腹水试验发现：该株能良好诱导产生大量血性腹水且目标抗体蛋白占在腹水总蛋白的比例能达到15～20％，其每毫升抗体蛋白产量均已达到毫克级以上，为下一步进行商业化生产提供了可靠保证。

本发明还保护一种利用上述抗人ppGalNAc-T2的单克隆抗体检测ppGalNAc-T2蛋白表达水平的应用。

因此，本发明同时要求保护一种利用上所述单克隆抗体采用免疫学方法检测ppGalNAc-T2蛋白表达水平的方法。

上述技术方案中，为检测人ppGalNAc-T2蛋白表达水平，优选地，可以使用以下免疫学方法，如：间接免疫酶联吸附试验(ELISA)法，免疫印迹试验(Western-blot)法，免疫细胞荧光试验(Immunocytoflurescence)法，免疫荧光流式细胞分析(Flowcytometer Analysis)等法对含多种形式ppGalNAc-T2蛋白的样本进行检测。

上述技术方案中，所述人ppGalNAc-T2蛋白包括：人ppGalNAc-T2的原核表达产物、人ppGalNAc-T2的真核表达产物、人ppGalNAc-T2表达蛋白的变性蛋白和非变性蛋白。

进一步的技术方案中，上述检测ppGalNAc-T2蛋白表达水平的方法，可以分析在肿瘤细胞或组织中ppGalNAc-T2的异常表达。

上述技术方案中，所述免疫学方法属于免疫学常见基本技术，属于本领域技术人员公知的技术；另外根据本发明现有的试验结果推测，所述抗体可以应用在免疫酶组织化学和免疫组织荧光化学试验。

由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：

1、在检测人ppGalNAc-T2蛋白的时候，本发明由于得到了特异性高、亲和力高的抗人ppGalNAc-T2单克隆抗体，因此，本发明所述检测方法无需提取RNA那样非常苛刻的试验条件(主要防止RNA降解)，也无需Real-timePCR技术那样需设严格的内参和外参和利用昂贵的实时定量PCR仪，不仅大大降低了检测的成本，更重要的是对检测时机的要求也大大降低了，没有上述专利严格；同时由于该单抗可大量生产也可制备直标抗体，而不用二级免疫试剂来降低成本和提高检测效率。

2、与丹麦的Ulla Mandel小组制备的单克隆抗体相比，本发明所述抗人ppGalNAc-T2的单克隆抗体不仅可以成功用于间接免疫酶联吸附(ELISA)，免疫细胞荧光(Immunocytoflurescence)，免疫荧光流式细胞分析(Flowcytometer Analysis)等实验，还可以成功用于免疫印记(Western Blot)实验。

3、本发明制备了一种抗人ppGalNAc-T2的单克隆抗体，该单克隆抗体具有高特异性和高亲和力，能够识别人ppGalNAc-T2的原核表达产物，人ppGalNAc-T2的真核表达产物。因此，利用该单克隆抗体可以简便快速准确地检测出人ppGalNAc-T2蛋白的表达水平。

4、本发明制备了一种可以分泌抗人ppGalNAc-T2单克隆抗体的杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株具有良好的传代能力并能大量扩增培养，能稳定体外分泌抗体，并且分泌抗体的能力随着培养代次增加没有下降，诱生腹水的能力也不随传代次数的增加而改变。

附图说明

杂交瘤细胞株的保藏信息为：保藏单位：中国典型培养物保藏中心；地址：中国武汉大学；保藏日期2010年11月4日；保藏编号CCTCC NO：C2010106；分类命名：杂交瘤细胞株LW-5F3；

附图1为实施例一中制备抗人ppGalNAc-T2的单克隆抗体的制备方案图；

附图2为实施例一中5F3细胞不同代次的生长曲线图；

附图3为实施例一中单克隆抗体的亚类测定图。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

实施例一：鼠抗人ppGalNAc-T2蛋白单克隆抗体的制备

采用ppGalNAc-T2基因原核表达产物作为免疫原免疫Balb/C小鼠的策略以获取该免疫原致敏的B细胞，具体的操作方法：

1.制备单克隆抗体免疫原

1.1ppGalNAc-T2基因完整开放阅读框片段的扩增

直接从组织或细胞中获取纯化ppGalNAc-T2蛋白制备抗体十分困难，因而通过基因工程表达产物制备抗体是有效的方法，要获得基因工程表达产物调取目的基因是先决条件。

采用细胞系293T能产生大量的ppGalNAc-T2基因转录本，然后经总RNA的提取、RT-PCR扩增和重组转移载体pGEM-T-ppGalNAc-T2的构建，重组质粒的经测序，获取ppGalNAc-T2基因完整开放阅读框片段，具体包括以下步骤：

(1)取2×10⁶个生长良好的293T细胞(来源于ATCC，America)，用Trizol(Promega公司产品)提取总mRNA，按RT试剂盒(Promega公司产品)说明书的方法获取mRNA互补第一链(cDNA)；

(2)以步骤(1)所得mRNA互补第一链为模板，用第一对上下游引物进行100μl反应体系PFU酶的PCR扩增(100μl反应体系，3μl上样)，清洁后进行BamHI(TAKARA公司产品)单酶切；

所述上下游引物为：

F 5-GGATCCATGCGGCGGCGCTCGCGGATG(SEQ ID No.1)

R 5-GGATCCCTACTGCTGCAGGTTGAGCGTGAAC(SEQ ID No.2)

上述引物是根据公布的ppGalNAc-T2基因序列(基因序列号是：NM_004481.3)设计的，设计二对引物是基于以下二个方面考虑：

I、该基因ORF(Open Reading Frame)由1713bp组成，以一对引物通过低扩增效率的高保真酶PFU(Fermentas公司产品)(比普通Taq扩增效率要低2-3倍，但突变率和错配率很低，故调取大目的基因特别是大于500bp的基因时宜用)进行PCR扩增其产物量低不利于以后的基因操作；

II、一对通长引物PCR扩增长度过长基因(大于1000bp)易出现错配和突变)。

将上述PFU酶PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定在1700bp位置上有明显的条带，与预期分子量(1713bp)一致，该结果表明我们已经获得该基因的DNA片段。

(3)将步骤(2)双酶切所得的片段通过BamHI酶切点克隆到pGEM T(promega公司产品)载体上，酶切鉴定正确后备用，取3-4个重组菌落克隆的重组转移载体pGEM T-ppGalNAc-T2进行ppGalNAc-T2基因的测序(测序工作由上海Invitrogen公司完成)，测序结果与GENEBANK公布的ppGalNAc-T2(NM_004481.3)cDNA序列一致，且目的基因插入方向正确。

1.2重组表达载体pET32a(+)-ppGalNAc-T2的构建

将步骤1.1构建的经测序正确的质粒pGEM T-ppGalNAc-T2和质粒pET32a(+)(novagen公司产品)用BamH I酶于37℃酶切2小时后，割胶回收目的片段，并用T₄DNA连接酶(上述两种酶均为Fermentas公司产品)16℃连接过夜，得到含有重组表达载体pET32a(+)-ppGalNAc-T2的连接液；

继而将连接液转化大肠杆菌DH5α(由本室保存)，挑单菌落，质粒提取酶切鉴定，阳性克隆菌保种备用。

所述酶切鉴定包括以下步骤：将所得重组质粒pET32a(+)-ppGalNAc-T2用BamHI酶切经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果在1.7kb，5.9kb位置上各有一条明显的条带；与此同时，将重组质粒进行基因测序(测序工作由上海Invitrogen公司完成)，测序结果与GENEBANK公布的ppGalNAc-T2(NM_004481.3)cDNA序列一致，且目的基因插入方向正确。该结果表明我们已将ppGalNAc-T2基因片段正确克隆于原核表达载体pET32a(+)上。

1.3ppGalNAc-T2基因原核表达产物的获得与纯化：

将上述已经酶切鉴定重组表达载体pET32a(+)-ppGalNAc-T2转化原核表达菌大肠杆菌BL21株(Invitrogen公司产品)，挑单菌落于挑单个菌落至含氨苄霉素MDG(5ml)培养基中，摇床培养过夜；然后取该培养液1ml加至100ml含氨苄霉素的ZYM-5052自动诱导表达培养基中，过夜培养(注：MDG培养基，ZYM-5052自动诱导表达培养基及培养要求均参考文献：F William Studier.Protein production by auto-induction in high-density shaking cultures，Protein Expression and Purification.2005，41：207-234)。

加等体积的2×SDS-PAGE电泳上样缓冲液，于沸水浴中孵育15min，12,000r/min 4离心15min取上清，上样于8块12％SDS-PAGE制备胶(10cm×8cm×1.5mm)(每块胶均上1ml蛋白样本液，同时设预染蛋白分子量marker孔)于冰水浴中电泳，电泳后按预染蛋白分子量marker指示分子量割取含目标蛋白的胶条，上述胶条剪碎后置于蛋白透析袋(14,000-20,000D，pharmacia公司产品)中，加适量电极缓冲液浸没后扎紧，置于Western Blot转移片中央，加满电极缓冲液后，将电泳槽置于冰水浴中进行110mA电洗脱3h，再将透析袋置于冰冷的0.01M PBS(pH7.2)中透析24h，无菌取上清于12,000r/min 4℃离心15min再取上清，用少许样本进行紫外分光仪(Eppendorf公司产品)进行含量分析和12％SDS-PAGE电泳纯度，其余样本按每份100ul分装-80℃冻存备用。

上述纯化物经紫外分光仪测定其含量为1.0mg/ml和经电泳鉴定发现：在分子量85kd位置有一条明显蛋白条带，其纯度约85％，该条带与我们预计目标表达产物分子量一致：ppGalNAc-T2(65Kd)+Tag标签(约20Kd)＝85Kd；该结果表明：已经获得了目的基因表达产物电泳纯样本，已经能满足作免疫原免疫小鼠制备单克隆抗体的需要。

2.抗原致敏B淋巴细胞的免疫小鼠获得

无菌取步骤1.3所得ppGalNAc-T2基因原核表达并纯化的蛋白样本(蛋白浓度1.0mg/ml)用0.01M PBS(pH7.2)10×稀释后加等体积的弗氏完全佐剂(sigma公司产品)充分混匀后按30μg/只蛋白剂量注射于5只5周龄雌性的SPF级Balb/c小鼠(由苏州大学实验动物中心提供)腹腔中，每隔二周后按上述等蛋白剂量加弗氏不完全佐剂(sigma公司产品)腹腔免疫各一次，三次免疫后再隔一周按30ug/只蛋白剂量(无佐剂)进行四免，四免后5～7天，眼眶静脉采血取血清作待测抗体；以步骤1.3所述ppGalNAc-T2纯化蛋白(1mg/ml)作固定标准抗原，做间接ELISA，效价超过1∶1000的为合格小鼠，此时无菌取其脾细胞作为抗原致敏B淋巴细胞。

ELISA效价已达到1∶1000，该结果表明我们已经获得了能产生较高效价针对原核表达产物特异性抗体的免疫小鼠，同时说明该小鼠脾脏内已有抗原致敏B淋巴细胞克隆。至此已经完成了制备单抗第一重要阶段。

在此需说明的是：免疫小鼠获取抗原致敏B淋巴细胞有多种方法，本实施例采用了经典免疫方法，该方法的优点是免疫效果好，主要体现在B淋巴细胞受抗原免疫刺激时间长，受免疫刺激B淋巴细胞基因重排克隆稳定，为以后获取优良稳定杂交瘤细胞克隆奠定了良好的基础，其缺点是免疫期长：需40-50天免疫周期；另外一种方法是将抗原直接注射小鼠脾脏免疫，该方法的优点是需要的抗原量少(10ng-2μg/只)，免疫期短：20-28天即可，但缺点是操作困难，小鼠应激反应强、B淋巴细胞基因重排克隆稳定性差，在制备该抗体时，发明人考虑需要抗原易得故用经典免疫法以获取高稳定性基因重排的抗原致敏B淋巴细胞。

3.融合细胞克隆的获取和分泌抗体克隆的筛选

3.1融合细胞生长克隆培养

无菌取上述一只合格小鼠脾脏，将其置于无菌培养皿中，10％FBS+RPMI-1640洗涤2-3次后剪成小块，用无菌玻璃片研磨，挤出脾细胞，30-40ml 10％FBS+RPMI 1640吹散重悬细胞，过尼龙膜进行细胞筛后(单细胞易于细胞融合)再用RPMI-1640培养基洗涤2-3次并计数；

按脾细胞与骨髓瘤细胞系SP2/0细胞(来源于ATCC)5∶1～10∶1的比例将处于对数生长期的SP2/0细胞加入脾细胞悬浮液离心管中，用RPMI-1640培养基离心洗涤2-3次，按常规PEG细胞融合剂(北京赛驰公司产品)细胞融合法进行脾细胞与SP2/0融合；融合后离心去除融合液，重悬于120ml 20％FBSplus RPMI-1640培养液中，并按100ul/孔植于12块预先长有Balb/c小鼠腹腔巨噬或胸腺细胞饲养层中的96孔板的孔中，(注：融合前一天按3～4×10⁴个细胞/孔加入饲养细胞)种植12块96孔板，每孔加100μl含2×HAT(用100×HAT储存液(SIGMA公司产品)稀释)10％FBS PLUS RPMI-1640培养液的饲养细胞悬浮液；)于37℃5％CO₂培养，一周后用含1×HAT 20％FBS PLUSRPMI-1640培养液进行2/3换液并继续培养，于2周后培养出多个HAT抗性克隆(细胞克隆生长面积约占孔面积的1/4时)待筛选。

3.2分泌抗体克隆的筛选与亚克隆

各取克隆孔上清分成二份(50μl/份)作为待检抗体，检测前一天将ppGalNAc-T2原核表达纯化蛋白(1mg/ml)用0.1M Na₂CO₃/NaHCO₃(pH9.6)作1∶15稀释并按100ul/孔包被于96孔酶标板(corning公司产品)中，于4℃包被过夜，用0.01M PBS(pH7.2)洗涤2次，加200μl/孔5％CBS(GIBCO公司产品)/0.01M PBS(pH7.2)于37℃湿浮2h，用0.01M PBS(pH7.2)洗涤1次，每孔加一份待检抗体，设SP2/0细胞培养上清对照孔，37℃湿浮1h，0.02％Tween20/0.01M PBS(pH7.2)洗涤4次(4×10min)，各加50ul的1∶300affinity purified HRP conjugated goat anti-mouse IgG(H+L)(亲和纯辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(重链和轻链)二抗)(Bioworld公司产品)(5％CBS/0.01M PBS(pH7.2)稀释)二抗，同上湿浮1h，洗涤4次后，加50μl/孔OPD(上海生工产品)/H₂O₂显色液避光显色，ELISA酶标仪(Thermo公司产品)测定OD₄₉₀值，以试验孔OD₄₉₀值大于对照孔OD₄₉₀值2倍判读为阳性孔。

准备检测前一天将293T细胞扩增于细胞培养瓶(corning公司产品)中，于37℃5％CO₂培养；收集293T细胞，每孔1×10⁵个细胞，将细胞用0.01MPBS(pH7.2)洗涤1次，将细胞用2％福尔马林室温固定15min，PBS清洗两次，每管加入200μl含0.5％Saponin(Sigma公司产品)的破膜缓冲液重悬细胞，1000rpm离心5分钟，弃上清；加入100μl上述破膜缓冲液，每孔加1μl待检抗体(克隆孔细胞上清)并设SP2/0细胞培养上清对照孔，于4℃孵育0.5h；0.01M PBS(pH7.2)洗涤2次(2×5min)，更换为上述破膜缓冲液，每孔加1ul的affinity purified FITC conjugated goat anti-mouse IgG(H+L)(亲和纯FITC标记山羊抗小鼠IgG(重链和轻链)二抗)(Bioworld公司产品)(3％CBS/0.01M PBS(pH7.2)稀释)二抗4℃避光孵育0.5h，洗涤2次后，进行流式细胞术上样分析，通过对照孔判读阳性孔，筛选出双阳性克隆。

将上述双阳性的克隆进行至少2轮单细胞亚克隆(方法同融合细胞生长克隆培养)，待细胞长至30％细胞单层时再进行上述双筛选(同上方法)直至获得100％双阳性克隆后，取其中生长最旺盛一株克隆并命名为LW-5F3，将该克隆进行扩大培养，并冻存和复苏。

4.杂交瘤细胞克隆5F3不同代次的生长曲线及抗体分泌能力的稳定性分析

4.1不同代次的生长曲线

将1×10⁴/ml的第一代，第五代，第十代，第二十代杂交瘤5F3细胞株按2mL/孔分别种植于6孔标准细胞培养板(Corning公司产品)中，于37℃，5％CO₂培养箱中培养，分别在12h，24h，36h时间点每个代细胞各取3孔充分分散后用血球计数器计数，并以时间点作为横坐标，细胞数作为纵坐标绘出生长曲线，得图2。

如附图2所示：用10％小牛血清培养基对5F3杂交瘤细胞株进行第一代，第五代，第十代，第二十代生长曲线分析，细胞的倍增时约为4h，而各代次生长速率亦基本一致。上述结果说明实施例一获得杂交瘤细胞能良好的传代并能大量扩增培养；同时并不随培养代次增加而生长能力下降。

4.2抗体分泌稳定性分析

首先对5F3杂交瘤细胞进行传代，分别取第一代，第五代，第十代，第二十代杂交瘤(初始细胞密度：2×10⁶/ml)培养过夜后的上清样本，通过紫外分光光度计测定各样本总蛋白的含量，同时将上清进行用SDS-PAGE电泳，操作步骤同Western Blot中，电泳结束后进行考马斯亮蓝染色，利用Quantity One分析软件分析抗体50Kd，25Kd二条带占总蛋白条带中的比例；分析结果显示：四个代次培养上清平均总蛋白的含量分别为6.08mg/ml，5.99mg/ml，6.09mg/ml，6.01mg/ml，而上述二条带占总蛋白的百分比约为7.13％，7.26％，7.11％，7.09％；从统计学分析四个代次的分泌抗体量无统计学上的差异；

其次，对细胞分泌上清进行ELISA鉴定，取第一代，第五代，第十代，第二十代杂交瘤(初始细胞密度：2×10⁶/ml)培养过夜后的上清样本作为一抗，以1.3中获得的ppGalNAc-T2原核纯化蛋白包板，进行ELISA，每组别均做6个重复孔，抗原抗体使用量及操作步骤同3.2中所描述；分析结果显示OD₄₉₀平均值分别为1.805，1.798，1.803，1.793；从统计学分析四个代次的分泌抗体能力无统计学上的差异；

从以上结果可以说明实施例一获得杂交瘤能稳定体外分泌抗体，同时说明随着培养代次增加而分泌抗体的能力不下降。

4.3杂交瘤细胞株5F3体内诱生腹水能力的指标：

同样用上述四个代次细胞，并按5×10⁶/只腹腔注射每代次注射5只5周龄雌性BALB/c小鼠(具体操作见下文，腹水制备)，四个代次细胞在二周内获得腹水平均数分别为4.51ml/只，4.78ml/只，4.66ml/只，4.59ml/只；用上述方法测腹水中平均总蛋白含量分别为100.12mg/ml，105.05mg/ml，101.75mg/ml，101.92mg/ml而抗体占总蛋白的百分比分别为19.08％，18.92％，19.73％；18.86％，统计学分析上述三个指标均无统计学上的差异性，结果说明该杂交瘤细胞诱生腹水的能力也不随传代次数的增加而改变。

5.目标杂交瘤体内诱生腹水产生

5.1小鼠的预处理：选择5周龄SPF级BALB/c小鼠(平均体重21g)10只，接种细胞前1-2周按0.5ml/只预先腹腔注射液体石蜡(上海化学试剂公司产品)(我们用弗氏不完全佐剂、降植烷、液体石蜡等三种试剂进行致敏效果的比较发现三者无明显差异，故选用廉价的液体石蜡)致敏。

5.2接种杂交瘤细胞：接种前一天，我们将上述杂交瘤细胞按1∶8-10传代待细胞处于对数生长期轻轻吹打悬浮细胞，1000r/min离心5min，弃培养液，用无血清培养基洗涤离心2次后，并用该培养基调细胞浓度至5X10⁶/ml，按0.5ml/只注射于上述的预处理的BALB/c小鼠腹腔中，注射后精心饲养。

5.3腹水的采集：注射后7-12天取腹水于5ml离心管中，1000r/min离心5min以去除腹水中的细胞，取上清4℃12000r/min离心15min，取少量上清并用紫外分光光度计和SDS-PAGE检测其蛋白含量和纯度，同时用间接ELISA法测定其效价，并分装-80℃冻存备用。

6.单克隆抗体免疫球蛋白抗体亚型分类分析

取上述的5F3克隆细胞培养上清及腹水，利用亚类测定试纸(Roche公司产品)鉴定单克隆抗体免疫球蛋白亚型分类分析。

检测结果见附图3，根据试纸显示该抗体为IgM，kapa亚型。

7.单克隆抗体的特异性分析

我们对5F3细胞培养上清及所制备腹水进行抗体特异性分析，这也同时涉及该单克隆抗体在检测ppGalNAc-T2蛋白表达水平时的应用。

7.1单克隆抗体对多种样本Western-Blot试验

单克隆抗体对原核表达及真核ppGalNAc-T2蛋白Western-Blot定性试验：

(1)以上述1.3中制备的原核抗原作为目标蛋白，按50μg/line(同时上等量同样处理的原核表达空菌体蛋白作阴性对照，并加预染蛋白分子量marker孔)上样于12％SDS-PAGE于冰水浴中电泳，电泳后，按湿转膜法于110mA冰水浴中将胶中的蛋白转移于NC膜(0.2um，pharmacia公司产品)上，0.01MPBS(pH7.2)浸没平衡15min后，于5％脱脂奶粉/0.01M PBS(pH7.2)4℃封闭过夜，加上述待测一抗室温孵育90min后，用0.02％Tween 20/0.01M PBS(pH7.2)洗涤4次(4×10min)后，1∶300 affinity purified HRP conjugated goatanti-mouse IgM(Bioworld公司产品)(3％脱脂奶粉/0.01M PBS(pH7.2)稀释)室温孵育60min并洗涤4次(同上)后，DAB(上海生工产品)/H₂O₂显色液中避光显色，充分洗涤后拍照。

(2)将pcDNA3.1-ppGalNAc-T2基因重组真核载体(自己构建)利用脂质体2000(Invitrogen公司产品)转染细胞株L929，以pcDNA3.1空载体转染L929作为空白mock对照，经600μg/ml G418(Sigma公司产品)筛选，获得L929/pcDNA3.1-ppGalNAc-T2及L929-mock转染细胞；以L929正常培养细胞系作为阴性对照，将上述三组细胞用10％FBS plus RPMI-1640培养基中培养于50ml标准细胞瓶中待细胞长满后收集细胞；将L929，L929/pcDNA3.1-ppGalNAc-T2及L929-mock三组细胞用0.25％(trypsin/0.01MPBS(pH7.2)消化后，用0.01M PBS(pH7.2)离心洗涤2-3次后，加60-80μl该缓冲液重悬细胞，加等体积的2×SDS-PAGE loding buffer于沸水浴中孵育15min后，于12,000r/min 4℃离心15min取上清，测蛋白的含量，进行电泳、电转移、抗体的显色，操作方法均同上。

结果显示，该结果表明我们的抗体在原核蛋白及真核蛋白的Western Blot实验中均有良好表现，该抗体不仅可以进行ppGalNAc-T2蛋白的定性分析，同时也可进行定量或半定量分析。

7.2细胞免疫荧光分析

取生长良好的1×10⁵个人肝癌细胞HepG2进行涂片，然后4％多聚甲醛(上海化学试剂公司产品)/0.01M PBS(pH7.2)室温固定30min，0.01M PBS(pH7.2)洗涤1次，0.02％Triton x-100(上海生工产品)/0.01M PBS(pH7.2)室温透化15min，3％CBS/0.02％Triton X-100/0.01M PBS(pH7.2)室温封闭1h，每孔加一份待检抗体并设对照孔，于37℃湿浮1h，0.02％tween20/0.01MPBS(pH7.2)洗涤4次(4×10min)，每孔加50ul的1∶300affinity purified FITCconjugated goat anti-mouse IgM(Bioworld公司产品)(3％CBS/0.01M PBS(pH7.2)稀释)二抗同上湿浮1h，洗涤4次后，抗淬灭剂封片，进行荧光显微镜拍照；结果显示，该单克隆抗体能很好的识别真核细胞中ppGalNAc-T2蛋白，在免疫荧光实验中有很好的表现，这也说明该抗体能够应用于免疫组化以及ppGalNAc-T2的细胞定位研究。

7.3流式细胞术

操作步骤同3.2中阳性克隆的流式细胞术筛选，细胞更换为人肝癌细胞系HepG2和人白血病细胞系Jurkat，并设立对照试验；腹水一抗稀释比例为1∶1000；affinity purified FITC conjugated goat anti-mouse IgM(亲和纯FITC标记山羊抗小鼠IgM(重链和轻链)二抗)二抗稀释比例为1∶200；结果显示，该单克隆抗体能够特异的标记HepG2细胞及Jurkat细胞，阳性标记率均达50％以上，说明该抗体的特异性较高，且能很好识别ppGalNAc-T2，这也为该单克隆抗体用于肿瘤ppGalNAc-T2异常表达的通量检测奠定个基础。

核苷酸和/或氨基酸序列表

<110> 苏州大学

<120> 抗人ppGalNAcT2单克隆抗体及其应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

ggatccatgc ggcggcgctc gcggatg 27

<210> 2

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

ggatccctac tgctgcaggt tgagcgtgaa c 31

Claims

1. 一种杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株的保藏信息为：保藏单位：中国典型培养物保藏中心；地址：中国武汉大学；保藏日期2010年11月4日；保藏编号CCTCCNO：C2010106；分类命名：杂交瘤细胞株LW-5F3。

2. 一种单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体由权利要求1所述杂交瘤细胞株LW-5F3产生。