CN102296052B - 一种针对ppGalNAc-T13多克隆抗体的特异性抗原肽及其制备与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物化学及分子免疫学领域，公开了针对ppGalNAc-T13多克隆抗体的特异性抗原肽及其制备与应用。本发明所述抗原肽的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示或其保守性变异多肽。ppGalNAc-T13与ppGalNAc-T1相似度高达85%，但与本发明制备的特异性针对ppGalNAc-T13的多克隆抗体不与ppGalNAc-T1发生交叉反应，也不与ppGalNAc-Ts家族中的其他成员发生交叉反应；本发明采用原核表达系统获得抗原，并且抗原携带有GST标签的技术方案，使产物易于纯化。本发明所提供的制备方法简单，制备的抗体免疫原性强。

Description

一种针对ppGalNAc-T13多克隆抗体的特异性抗原肽及其制备与应用

技术领域

本发明属于生物化学及分子免疫学领域，主要涉及了一种针对ppGalNAc-T13多克隆抗体的特异性抗原，并公开了所述抗原肽的制备及其在ppGalNAc-T13多克隆抗体制备中的应用。

背景技术

多肽：N-乙酰氨基半乳糖转移酶家族(ppGalNAc-Ts)是O-型糖蛋白糖链合成反应的第一步起始糖基转移酶，其催化形成Tn抗原(GalNAc-Ser/Thr)。ppGalNAc-T是一个大的基因家族，现在已报道的ppGlaNAc-T有20种。ppGalNAc-Ts家族成员均为II型膜蛋白，N端有一个4～22个氨基酸的胞浆区，继以一个15～25个氨基酸的穿膜区，通过一个长短不一的茎区与C端伸入高尔基体内大约450个氨基酸的催化区相连接。ppGalNAc-Ts基因家族各个成员的在不同组织中的表达有很大差异，例如ppGalNAc-T1是各组织广泛分布的，ppGalNAc-T14为肾脏组织特异性表达，ppGalNAc-T13为神经细胞特异性表达等。目前国际上关于ppGalNAc-Ts基因家族的功能研究方兴未艾，近年取得一些初步进展，例如，ppGalNAc-T1参与淋巴细胞和血细胞表面selectin ligand糖基化，ppGalNAc-T1的缺失影响微血管循环和淋巴细胞归巢，还会造成B细胞的凋亡；ppGalNAc-T3参与FGF23的糖基化修饰，保护其不受furin蛋白酶的剪切，使得FGF23能够正常分泌到胞外行使功能。已在瘤样钙质沉积的病人中发现多例ppGalNAc-T3基因上SNP，直接与瘤样钙质沉积病的形成相关；ppGalNAc-T14参与死亡受体DR4和DR5的糖基化修饰，增强细胞对Apo2L/TRAIL的敏感度，对于肿瘤的药物治疗有着重大意义；在Xenopus中的研究发现T16参与调控TGF-beta，Activin，BMP信号通路，对于Xenopus的中枢神经系统发育起到了十分重要的作用。ppGalNAc-Ts家族成员因其不同的组织分布以及其和肿瘤、发育的相关性，使得ppGalNAc-Ts家族各成员可以用做肿瘤诊断和发育的标志物，在科研和临床上有重大的应用价值。例如，ppGalNAc-T3可作为前列腺癌的标志物，并且与肺腺癌病人的生存期有一定的相关性；ppGalNAc-T6可以作为乳腺癌的免疫组化检测标志；ppGalNAc-T12可作为结肠癌发生、发展的负指数；ppGalNAc-T13可作为神经母细胞瘤向骨髓转移的标志物。

ppGalNAc-T家族具有极高的保守性，家族成员间蛋白质序列的同源性都在40％以上，尤其是本发明中涉及的ppGalNAc-T13与同家族中的ppGalNAc-T1在蛋白质序列上的相似度高达85％，因此，如何保证T13抗体的特异性至关重要。

目前，已报导的ppGalNAc-Ts家族中多克隆抗体的制备方法主要有两种：一种是使用合成多肽作为抗原；一种是使用外源表达的完整的ppGalNAc-Ts全酶作为抗原。这两种方法各有优劣。使用合成多肽作为抗原的优点在于可以选择同源性较低的多肽片段作为抗原，以保证抗体的特异性；但是，合成的多肽一般只有十几个氨基酸残基，分子量较小，免疫原性较差，通常需要将其与MAP(multiple antigenic peptide)、钥孔血蓝蛋白(KLH)等蛋白载体偶联，有些还需加入免疫佐剂，因此，此方法成本十分高昂：通常合成10～20mg的纯度85％以上的抗原蛋白价格一般在120元/氨基酸残基，偶联MAP的价格在一千元以上。使用外源表达的完整ppGalNAc-Ts全酶作可以为抗原可以大大提高其免疫原性，但是对于生产出来的抗体特异性比较难保证，尤其像ppGalNAc-T13与ppGalNAc-T1两种糖基转移酶的氨基酸序列相似度高达85％，如使用全酶做抗原，基本不可能产生特异性针对ppGalNAc-T13的多克隆抗体。

发明内容

为克服现有多克隆抗体制备方法价格昂贵、免疫原性差(合成多肽法)以及特异性不能保证(全酶法)等不足，本发明提供了一种ppGalNAc-T13的特异性抗原及其多克隆抗体的制备方法。本发明制备的ppGalNAc-T13抗体不与相似度高达85％的ppGalNAc-T1发生交叉反应，也不与ppGalNAc-Ts家族中的其他成员发生交叉反应；本发明通过原核表达系统获得抗原，并且抗原携带有GST(glutathione S-transferase)标签，易于纯化；本发明克服了合成多肽免疫原性差、价格昂贵的缺点，同时也具备极高的特异性。

本发明所采用的技术方案：

本发明第一方面提供了一种分离的抗原肽，所述抗原肽为氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的多肽或其保守性变异多肽。

本发明第二方面提供了一种融合蛋白，含有所述抗原肽与标签蛋白，可以是所述抗原肽与标签蛋白的融合蛋白。

所述标签蛋白选自：GST、FLAG、MAP(multiple antigenic peptide)、钥孔血蓝蛋白(KLH)。

本发明实施例具体列举了氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的多肽与GST的融合蛋白。

本发明第三方面提供了一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸编码所述抗原肽或融合蛋白。

优选的，编码所述抗原肽的多核苷酸的碱基序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明第四方面提供了一种载体，含有所述多核苷酸。

优选的，所述载体选自：pGEX-5X-1、pGEX-5X-2、pGEX-5X-3、pGEX-4T-1、pGEX-4T-2、pGEX-4T-3、pGEX-6P-1、pGEX-6P-2、pGEX-6P-3、pET-41a(+)、pET-41b(+)、pET-41c(+)、pET-42a(+)、pET-42b(+)、pET-42c(+)。

本发明第五方面提供了一种工程菌，含有所述载体。

优选的，所述工程菌选自原核表达菌株。

更优选的，所述原核表达菌株选自：BL21(DE3)、Rosetta 2、Origami 2、Rosetta-gami 2、Origami B等菌株。

更优选的，所述原核表达菌株为BL21(DE3)。

本发明第六方面提供了所述抗原肽或融合蛋白的制备方法：选自以下任一：

(1)利用化学合成方法合成所述抗原肽；

(2)在合适的条件下培养所述工程菌并使其表达所述抗原肽或融合蛋白，而后分离及纯化获得所述抗原肽或融合蛋白。

本发明第七方面提供了所述抗原肽或融合蛋白用于制备特异性针对ppGalNAc-T13的多克隆抗体的用途。

本发明第八方面提供了一种多克隆抗体，为以所述的抗原肽或融合蛋白为抗原制得。

优选的，所述多克隆抗体为采用本发明的抗原肽或融合蛋白作为免疫抗原免疫动物获得。

本发明第九方面提供了所述的多克隆抗体在制备诊断或治疗肿瘤药物或制剂中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明制备的抗体不和与ppGalNAc-T13相似度高达85％的ppGalNAc-T1发生交叉反应，更不与ppGalNAc-Ts家族其它成员发生交叉反应；本发明通过简单的分子克隆实验制备出所需的抗原蛋白，且该抗原蛋白与GST融合表达，易于纯化；本发明克服了合成多肽方法免疫原性差、价格昂贵等缺点，也克服了使用全酶作为抗原特异性的不到保证的缺点；本发明得到的特异性针对ppGalNAc-T13的多克隆抗体不仅可以用于检测变性后的ppGalNAc-T13蛋白，还可以用于检测具有活性的天然构象的ppGalNAc-T13蛋白，并且本发明提供的特异性针对ppGalNAc-T13的多克隆抗体具有极高的灵敏度。

本发明中所涉及的菌株大肠杆菌DH5α、大肠杆菌BL21(DE3)已在《汪玲玲，杨辑，黄诚之，王海洪；大肠杆菌holo-ACP的过表达、分离纯化及长链脂酰ACP的合成，微生物学报，2008，48(7)：963～969》文献中公开。本发明涉及的菌株可通过公开市售的商业渠道取得，如上海天根生化科技(北京)有限公司，公司地址：上海市漕溪路258弄27号航星商务楼1号楼606室。本发明涉及的GSTrap层析柱和Protein A-Sepharose 4B层析柱均可通过市售的商业渠道获得，如GE Healthcare公司。

附图说明

图1为GST-T13AG融合蛋白诱导表达电泳图；

图2为GST-T13AG融合蛋白纯化电泳图；

图3为特异性针对ppGalNAc-T13的多克隆抗体IgG纯化电泳图；

图4为特异性针对ppGalNAc-T13的多克隆抗体与其它ppGalNAc-Ts的交叉特异性检测图；

图5为特异性针对ppGalNAc-T13的多克隆抗体的灵敏度的结果

图6为用特异性针对ppGalNAc-T13的抗体通过组织免疫荧光法检测C57小鼠脑组织中ppGalNAc-T13蛋白表达分布结果图；

图7为用特异性针对ppGalNAc-T13的多克隆抗体通过免疫沉淀法检测HEK-293T细胞中过表达ppGalNAc-T 13的Western Blotting结果图。

具体实施方式

以下实施例将结合附图对本发明作进一步说明。本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件进行。

实施例1：

特异性针对ppGalNAc-T13的多克隆抗体的制备：

(1)抗原序列的确立：

在ClustalX软件中输入ppGalNAc-T13(RefSeq Accession Number：NP_443149)和ppGalNAc-T1(RefSeq Accession Number：NP_065207)的蛋白序列进行比对，在ppGalNAc-T13蛋白的茎区选取一段序列T13 AG作为抗原，T13 AG序列如SEQ ID NO：2所示(RefSeq Accession Number：NP_443149：ppGalNAc-T13全蛋白质编码29位丝氨酸到80位亮氨酸)；

(2)重组质粒的构建：

抗原T13 AG的氨基酸序列对应的DNA序列如SEQ ID NO：1所示；根据pGEX-5X-1的多克隆位点和T13 AG的DNA序列设计引物：

上游引物：5′ATGGATCCCCAGTGAATGTAACAAATGTGATGACA 3′；(SEQ ID NO：3)；

下游引物：5′TAGAATTCGATTTTAAACAGCTCTTTCATTTTC 3′(SEQ ID NO：4)。

以ppGalNAc-T13全长cDNA(RefSeq Accession Number：NP_443149)为模板，通过PCR扩增得到目的片段，PCR反应条件为：94℃3min；94℃30s，56℃30s，68℃30s，25个循环；68℃10min；目的片段经BamH I(TaKaRa)、EcoR I(TaKaRa)双酶切后胶回收，以Ligation High连接酶(ToYoBo)连接入经BamH I、EcoR I双酶切的pGEX-5X-1质粒(Amersham)，连接反应条件为：

所构建的原核表达载体命名为pGEX-5X-1-T13 AG。将所构建的pGEX-5X-1-T13 AG原核表达载体常规方法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(天根生化科技有限公司)，使用含有100μg/ml氨苄青霉素的LB平板，37℃过夜筛选培养；挑取单菌落后摇菌，提取质粒并测序。

(3)将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)：

选择步骤2中测序正确的质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)(天根生化科技有限公司)，1L大肠杆菌BL21(DE3)培养液在37℃培养至OD值达到1.0；大肠杆菌BL21(DE3)培养基组分为：1％(w/v)蛋白胨，0.5％(w/v)酵母提取物，1％(w/v)NaCl，所述1L培养基中，蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，余量为水；培养温度为37℃。在大肠杆菌BL21(DE3)培养液中加入IPTG至0.5mM，26℃下诱导培养3h；裂解大肠杆菌BL21(DE3)：将1L诱导后的大肠杆菌BL21(DE3)培养液离心收集菌体，用100ml裂解缓冲液重悬，该缓冲液的组分为：PBS(pH＝7.3)，1％(v/v)Triton X-100，1mM苯甲基磺酰氟(PMSF，Phenylmethanesulfonyl fluoride)，所述1L缓冲液中，Triton X-1001mL，PMSF 174.2mg，余量为PBS(pH＝7.3)；超声波破碎20次，每次5s。然后将经超声波破碎后的菌体在4℃条件下，10,000rpm离心15min，收集上清。所得带有GST标签的融合蛋白命名为GST-T13 AG，在大肠杆菌中经IPTG诱导得到的含有GST-T13 AG融合蛋白的大肠杆菌裂解液的SDS-PAGE结果如图1所示，1为未用IPTG诱导的菌体裂解后的裂解液上清，2为用IPTG诱导后的菌体裂解后的裂解液上清。发明人对实验数据分析后发现，在大肠杆菌BL21(DE3)中可通过IPTG诱导表达得到了GST-T13 AG融合蛋白。

(4)纯化大肠杆菌BL21(DE3)菌体裂解破碎后的蛋白上清：

使用GE Healthcare公司的GSTrap HP亲和纯化柱，先用5倍柱床体积的PBS平衡该柱，接着上样超声破碎离心后得到的上清，再用5倍柱床体积的PBS冲洗该柱，然后用5倍柱床体积的还原性谷胱甘肽溶液洗脱。还原性谷胱甘肽溶液的组分为：50mM Tris-HCl，10mM还原性谷胱甘肽，pH为8.0，通过UV检测收集洗脱峰。然后使用安捷伦公司的Ultra超滤离心柱对洗脱液进行浓缩，得到高浓度的GST-T13 AG抗原蛋白。带有GST标签的GST-T13AG融合蛋白经GSTrap亲和纯化柱纯化以及经Ultra超滤离心柱浓缩得到的产物的SDS-PAGE结果如图2所示，1为IPTG诱导后的菌体裂解后的裂解液上清经GSTrap亲和纯化柱纯化后的产物；2为纯化得到的产物进一步经Ultra超滤离心柱浓缩后得到的产物。发明人对实验数据分析后发现，经GSTrap亲和纯化柱纯化及超滤离心浓缩后得到的产物分子量与理论分子量一致，其浓度达到免疫动物的要求。经测序，结果符合预期。

(5)所述氨基酸序列为SEQ ID NO：2的分离的抗原肽的获得：

所述氨基酸序列为SEQ ID NO：2的分离的抗原肽由化学合成多肽的方法直接制备获得。

(6)用纯化的抗原蛋白对家兔进行免疫：

每次使用步骤4中所得的纯化的融合蛋白200μg作为免疫抗原对家兔进行免疫，两星期一次；3个月后取血清，3,000rpm离心15分钟后得到抗血清；纯化抗血清：使用GEHealthcare公司的Hitrap Protein AHP亲和纯化柱，先用10倍柱床体积的结合液平衡该柱，结合液成分为20mM Na3PO4，pH为7.0，接着让特异性针对ppGalNAc-T13的抗血清通过该柱，再用5倍柱床体积的结合液冲洗该柱，然后用5倍柱床体积的洗脱液洗脱，洗脱液成分为0.1M Na3C6H5O7，pH为3.0，通过UV(254nm)检测收集洗脱峰。特异性针对ppGalNAc-T13的抗血清经Hitrap Protein A HP亲和纯化柱纯化后得到的产物的SDS-PAGE结果如图3所示，1为marker，2为未纯化的ppGalNAc-T13抗血清，3为纯化后的ppGalNAc-T13多克隆抗体。发明人对实验数据分析后发现，抗血清经过Hitrap Protein AHP亲和纯化柱纯化后得到的产物已将高丰度的血清白蛋白有效的去除，IgG抗体的纯度达到预期。

由于GST融合的抗原肽可产生ppGalNAc-T13特异性多克隆抗体，而GST中并不含有对应于ppGalNAc-T13的抗原表位结构特征，因此认为由融合蛋白所产生的ppGalNAc-T13多克隆抗体对于ppGalNAc-T13的特异性均源自融合蛋白中的SEQ ID NO：2片段，而SEQ IDNO：2在ppGalNAc-T13蛋白序列中为亲水结构域，此序列的多肽能够自然折叠并具有抗原表位的结构特征，所以序列为SEQ ID NO：2的抗原肽即使不与GST融合也可产生ppGalNAc-T13的多克隆抗体，并且其对于ppGalNAc-T13的特异性应与所述GST融合的抗原肽所产生的ppGalNAc-T13的多克隆抗体类似。

实施例2：

Western Blotting检测本实施例制备的多克隆抗体的特异性：

将实施例1所制备的特异性针对ppGalNAc-T13的多克隆抗体、抗Flag抗体和抗β-actin抗体分别与带Flag标签的ppGalNAc-Ts进行交叉特异性检测。

试验步骤：将编码ppGalNAc-Ts基因家族成员的cDNA分别克隆至pFLAG-CMV-3质粒中，克隆时所使用的引物序列如下，

ppGalNAc-T1：正向(5’GCGAATTCATGTGATGAAAAAAAGGAGAG3’)(SEQ ID NO：5)

             反向(5’CGGGATCCTCAGAATATTTCTGGAAGGGT3’)(SEQ ID NO：6)

ppGalNAc-T2：正向(5’GCGAATTCAAAAAAGAAAGACCTTCACAG3’)(SEQ ID NO：7)

             反向(5’CGGGATCCCTACTGCTGCAGGTTGAGCGT3’)(SEQ ID NO：8)

ppGalNAc-T3：正向(5’GCGAATTCATCAAGGATGGAAAGGAACAT3’)(SEQ ID NO：9)

             反向(5’CGGGATCCTTAATCATTTTGGCTAAGTAT3’)(SEQ ID NO：10)

ppGalNAc-T4：正向(5’GCGAATTCATTTCATGCCTCCGCAGGAGC3’)(SEQ ID NO：11)

             反向(5’CGGGATCCCTATTTCTCAAAACTCCAAAT3’)(SEQ ID NO：12)

ppGalNAc-T6：正向(5’GCGAATTCAGTCCTGGACCTCATGCTGGA3’)(SEQ ID NO：13)

             反向(5’CGGGATCCCTAGACAAAGAGCCACAACTG3’)(SEQ ID NO：14)

ppGalNAc-T8：正向(5’GCGAATTCAGGGACTTTACAAAACCTGTT3’)(SEQ ID NO：15)

             反向(5’CGGGATCCTCACTGGCTGTTGGTCTGACC3’)(SEQ ID NO：16)

ppGalNAc-T9：正向(5’GCGAATTCACGCATCGTGAGCGGCGACCG3’)(SEQ ID NO：17)

             反向(5’CGGGATCCTCAGTGCCGTGCGTGTTTGAT3’)(SEQ ID NO：18)

ppGalNAc-T10：正向(5’GCGAATTCACGGCAGCCCGACGGCACCCC3’)(SEQ ID NO：19)

              反向(5’CGGGATCCTCAGTTCCTATTGAATTTTTC3’)(SEQ ID NO：20)

ppGalNAc-T12：正向(5’GCGAATTCACGGCGCGAGCCGGTCATGCC3’)(SEQ ID NO：21)

              反向(5’CGGGATCCTCATAACATGCGCTCTTTGAA3’)(SEQ ID NO：22)

ppGalNAc-T13：正向(5’GCGAATTCACGGGGCGCGCAGAGGGCAGG3’)(SEQ ID NO：23)

              反向(5’CGGGATCCTCATGTGCCCAAGGTCATGTT3’)(SEQ ID NO：24)

ppGalNAc-T14：正向(5’GCGAATTCAGTGCAGACCCCTAAGCCTTC3’)(SEQ ID NO：25)

              反向(5’CGGGATCCTCAAGAGCTCACCATGTCCCA3’)(SEQ ID NO：26)

ppGalNAc-T15：正向(5’GCGAATTCAGCCAGGTACCGCCTGGACTT3’)(SEQ ID NO：27)

              反向(5’CGGGATCCTCATCGTTCATCCACAGCATT3’)(SEQ ID NO：28)

ppGalNAc-T16：正向(5’GCGAATTCACGGGGCGCGCAGCGGGCAGG3’)(SEQ ID NO：29)

              反向(5’CGGGATCCTCAATCAGGGGCTCTCCTGCC3’)(SEQ ID NO：30)

ppGalNAc-T17：正向(5’GCGAATTCACGCAGCGGAGACGCCTTCCA3’)(SEQ ID NO：31)

              反向(5’CGGGATCCCTACTTGATGGAGTTCTTAAT3’)(SEQ ID NO：32)

ppGalNAc-T18：正向(5’GCGAATTCACGGGGGCAGGAGCCGGCGCC3’)(SEQ ID NO：33)

              反向(5’CGGGATCCTCAGGACGCGAGGCTCCTCAG3’)(SEQ ID NO：34)

ppGalNAc-T20：正向(5’GCGAATTCAGATAAGCACCTGGTGAAGTC3’)(SEQ ID NO：35)

              反向(5’CGGGATCCCTAGGAGTTGGCATGGTGGTT3’)(SEQ ID NO：36)

克隆的内切酶选用EcoRI和BamHI。将质粒转染HEK-293T细胞，筛选出阳性克隆，培养并鉴定表达的蛋白正确，真核表达带有FLAG标签的ppGalNAc-Ts蛋白，转染36小时后，收集细胞，裂解得到含有带有FLAG标签的ppGalNAc-Ts蛋白的细胞总蛋白，将细胞总蛋白进行进一步的Western Blotting的实验。

结果如图4所示，从左到右依次为过表达含带Flag标签的ppGalNAc-T1、ppGalNAc-T2、ppGalNAc-T3、ppGalNAc-T4、ppGalNAc-T6、ppGalNAc-T8、ppGalNAc-T9、ppGalNAc-T10、ppGalNAc-T12、ppGalNAc-T13、ppGalNAc-T14、ppGalNAc-T15、ppGalNAc-T16、ppGalNAc-T17、ppGalNAc-T18和ppGalNAc-T20的HEK-293T细胞裂解液。其中：图A，图B和图C中分别为转染Flag-ppGalNAc-Ts质粒的HEK-293T细胞裂解液，图A为抗ppGalNAc-T13多克隆抗体检测图，图B为抗Flag抗体检测图，图C为抗β-actin抗体检测图。

图4-A为用特异性针对ppGalNAc-T13的多克隆抗体检测带Flag标签的ppGalNAc-T1、ppGalNAc-T2、ppGalNAc-T3、ppGalNAc-T4、ppGalNAc-T6、ppGalNAc-T8、ppGalNAc-T9、ppGalNAc-T10、ppGalNAc-T12、ppGalNAc-T13、ppGalNAc-T14、ppGalNAc-T15、ppGalNAc-T16、ppGalNAc-T17、ppGalNAc-T18和ppGalNAc-T20蛋白的Western Blotting结果图。一抗比例为1∶2000，抗兔二抗比例为1∶10000，使用Li-COR Odyssey双色红外成像系统显影拍照。

图4-B为用抗Flag抗体检测带Flag标签的ppGalNAc-T1、ppGalNAc-T2、ppGalNAc-T3、ppGalNAc-T4、ppGalNAc-T6、ppGalNAc-T8、ppGalNAc-T9、ppGalNAc-T10、ppGalNAc-T12、ppGalNAc-T13、ppGalNAc-T14、ppGalNAc-T15、ppGalNAc-T16、ppGalNAc-T17、ppGalNAc-T18和ppGalNAc-T20蛋白的Western Blotting结果图；一抗比例为1∶2000，抗鼠二抗比例为1∶15000，使用Li-COR Odyssey双色红外成像系统显影拍照。

图4-C为用内参基因抗体抗β-actin抗体检测图4-A及4-B中各泳道相同含有带Flag标签的ppGalNAc-T1、ppGalNAc-T2、ppGalNAc-T3、ppGalNAc-T4、ppGalNAc-T6、ppGalNAc-T8、ppGalNAc-T9、ppGalNAc-T10、ppGalNAc-T12、ppGalNAc-T13、ppGalNAc-T14、ppGalNAc-T15、ppGalNAc-T16、ppGalNAc-T17、ppGalNAc-T18和ppGalNAc-T20表达的细胞裂解液蛋白的Western Blotting结果图；一抗比例为1∶2000，抗鼠二抗比例为1∶15000，使用Li-COR Odyssey双色红外成像系统显影拍照。

发明人对实验数据分析后发现根据本发明实验方法所制备的特异性针对ppGalNAc-T13的多克隆抗体具有极高的特异性，不与其它的ppGalNAc-Ts家族成员发生交叉反应。

实施例3：

Western Blotting检测本实施例制备的多克隆抗体的灵敏度：

实验原料：纯化后的GST-T13AG融合蛋白，特异性针对ppGalNAc-T13的多克隆抗体。

实验步骤：将GST-T13AG融合蛋白溶液梯度稀释，然后进行Western Blotting的实验通过Western Blotting检测实施例1中所制备的特异性针对ppGalNAc-T13的多克隆抗体的灵敏度的结果如图5所示，1-6分别表示上样量为25ng、12.5ng、6.25ng、0.625ng、0.0625ng、0.00625ng的GST-T13 AG融合蛋白，抗体稀释比例：一抗为1∶2000，抗兔二抗为1∶10000。发明人对实验数据分析后发现根据本发明实验方法所制备的特异性针对ppGalNAc-T13的多克隆抗体具有极高的灵敏度，可检测出最低为0.0625ng的抗原蛋白。

实施例4：

本发明所提供的特异性针对ppGalNAc-T13的多克隆抗体在免疫组化中的应用：

试验原料：成年C57小鼠的脑组织、特异性针对ppGalNAc-T13的多克隆抗体、神经元特异性抗体Anti-Neun。

试验步骤：成年C57小鼠经多聚甲醛灌注固定后，取脑组织，进行组织冰冻切片；得到的脑组织切片经血清封闭，通透后加入特异性针对ppGalNAc-T13的多克隆抗体以及anti-Neun抗体孵育过夜，再用荧光标记的驴抗鼠、驴抗兔IgG二抗孵育2小时，在荧光显微镜下进行观察。

用实施例1中所制备的特异性针对ppGalNAc-T13的多克隆抗体通过组织免疫荧光法检测C57小鼠脑组织中ppGalNAc-T13蛋白表达分布结果如图6所示，其中左图为Anti-Neun抗体标记荧光图像，中图为特异性针对ppGalNAc-T13的多克隆抗体标记荧光图像，右图为左图和中图的叠加图像。白色箭头所示处即为用抗体检测到的ppGalNAc-T13蛋白在C57小鼠脑组织中的表达分布。发明人对实验数据分析后发现本发明所提供的特异性针对ppGalNAc-T13的多克隆抗体可以应用于组织免疫荧光实验检测动物组织内ppGalNAc-T13蛋白的表达分布情况。

实施例5：

本发明所提供的特异性针对ppGalNAc-T13的多克隆抗体在免疫沉淀中的应用：

试验原料：pcDNA3.1(+)载体，HEK-293T细胞，ProteinA Beads，特异性针对ppGalNAc-T13的多克隆抗体。

试验步骤：将全长的ppGalNAc-T13基因cDNA克隆至pcDNA3.1(+)载体中，分别用pcDNA3.1(+)空载体和上述构建的pcDNA3.1-ppGalNAc-T13载体转染HEK-293T细胞，48小时后，收集细胞，裂解，将细胞裂解液使用Protein A Beads进行免疫共沉淀实验，将beads上吸附的蛋白洗脱下来进行Western Blotting的实验。本发明所提供的特异性针对ppGalNAc-T13的多克隆抗体通过免疫沉淀法检测HEK-293T细胞过表达全长ppGalNAc-T13裂解液的Western Blotting结果如图7所示，其中1和2分别为转染pcDNA3.1(+)载体和转染pcDNA3.1-ppGalNAc-T13载体的HEK-293T细胞裂解液上清经过Protein Abeads免疫共沉淀后的洗脱液；3为转染pcDNA3.1-ppGalNAc-T13载体的HEK-293T细胞裂解液上清。发明人对实验数据分析后发现本发明所提供的特异性针对ppGalNAc-T13的多克隆抗体可以应用于免疫沉淀实验检测和富集细胞裂解液中ppGalNAc-T13。

本发明所得的特异性针对ppGalNAc-T13的多克隆抗体是用ppGalNAc-T13的茎区一段蛋白作为抗原得到的，由上述实施例可知，该抗体不与和ppGalNAc-T13同源性最高的ppGalNAc-T1发生交叉反应，也不与其它的ppGalNAc-Ts家族成员发生交叉反应。具有免疫印迹、组织细胞染色及免疫沉降等用途。不仅可以用于ppGalNAc-T13蛋白的体内检测，还可以用于ppGalNAc-T13蛋白的体外检测，并具有极高的灵敏度。

Claims (17)

1.一种分离的用于制备特异性针对ppGalNAc-T13的多克隆抗体抗原肽，其特征在于，所述抗原肽为氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的多肽。

2.一种分离的融合蛋白，含有权利要求1所述抗原肽与标签蛋白。

3.如权利要求2所述融合蛋白，其特征在于，所述标签蛋白选自：GST、FLAG、MAP（multipleantigenic peptide）、钥孔血蓝蛋白(KLH)。

4.如权利要求2所述融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白为氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的多肽与GST的融合蛋白。

5.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述分离的多核苷酸编码权利要求1所述抗原肽或编码权利要求2-4任一权利要求所述融合蛋白。

6.如权利要求5所述的分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸中，编码所述抗原肽的多核苷酸的碱基序列如SEQ ID NO:1所示。

7.一种载体，含有权利要求5或6所述多核苷酸。

8.如权利要求7所述载体，其特征在于，所述载体选自：pGEX-5X-1、pGEX-5X-2、pGEX-5X-3、pGEX-4T-1、pGEX-4T-2、pGEX-4T-3、pGEX-6P-1、pGEX-6P-2、pGEX-6P-3、pET-41a(+)、pET-41b(+)、pET-41c(+)、pET-42a(+)、pET-42b(+)或pET-42c(+)。

9.一种工程菌，含有权利要求7或8所述载体。

10.如权利要求9所述工程菌，其特征在于，所述工程菌选自原核表达菌株。

11.如权利要求10所述原核表达菌株，其特征在于，所述原核表达菌株选自：BL21(DE3)、Rosetta 2、Origami 2、Rosetta-gami 2或Origami B。

12.如权利要求11所述原核表达菌株，其特征在于，所述原核表达菌株为BL21(DE3)。

13.如权利要求1所述抗原肽或权利要求2-4中任一所述融合蛋白的制备方法：选自以下任一：

a)利用化学合成方法合成所述抗原肽或融合蛋白；

b)在合适的条件下培养权利要求9-12中任一所述工程菌并使其表达所述抗原肽或融合蛋白，而后分离及纯化获得所述抗原肽或融合蛋白。

14.如权利要求1所述抗原肽或权利要求2-4中任一所述融合蛋白用于制备特异性针对ppGalNAc-T13的多克隆抗体的用途。

15.一种多克隆抗体，为以权利要求1所述的抗原肽或权利要求2-4中任一所述融合蛋白为抗原制得。

16.如权利要求15所述的多克隆抗体在制备诊断或治疗肿瘤药物或制剂中的应用。

17.如权利要求15所述多克隆抗体的制备方法，为以权利要求1所述抗原肽或权利要求2-4中任一所述融合蛋白为免疫抗原免疫动物获得。

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