JPH06511151A - アルコール中毒患者を同定しアルコール消費を監視するためのイムノアッセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 アルコール中毒患者を同定しアルコール消費を監視するためのイムノアッセイ発 明の分野 本発明は、アルコール中毒者を同定し、アルコール消費を監視するのに有益なイ ムノアッセイに関する。特に、本発明は、アルコール中毒者中に見られるが、非 アルコール中毒者中に見られないトランスフェリン同族体の検出及び定量化に関 する。

発明の背景 米国単独のアルコールに関連する問題の大きさは、ばく大である。現在、毎年２ ０ｏ、　ｏｏｏ人を越える死亡（１０人に１人の死亡）はアルコール中毒を原因 としており、病院の全医療費の２０％がアルコールに関連している（ウェスト（ Ｗｅｓｔ、　Ｌ、　Ｔ、　）、マックスウェル（Ｍａｘｗｅｌ　ｌ、　Ｄ、　Ｓ 、　）、ノープル（Ｎｏｂｌｅ、　Ｌ　Ｐ、　）及びソロモン（Ｓｏｌｏｍｏｎ 。

Ｄ、　Ｈ，）著、Ａｎｎ、　Ｉｎｊ、Ｍｅｄ、、　１００．４０５−４１６．１ ９８４）、米国中で、アルコール中毒に関連する生産性の損失及び健康管理費用 の年間経費は１１７０億ドルと推定される（Ｓｉｘｔｈ　５ｐｅｃｉａｌ　Ｒｅ ｐｏｒｔ　ｔｏ　Ｃｏｎｇｒｅｓｓ　ｏｎ　Ａｌｃｏｈｏｌ　ａｎｄ　Ｈｅａｌ ｔｈ、　Ｒｏｃｋｖｉ撃撃■AＭＤ。

Ｄｅｐｔ、　）ｌｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕ＆Ｉｎ　５ｅｒＶｉＣｅＳ、　ＮＩ ＡＡＡ、　１９８７：２１−２３．　（ＤＨＨ３Ｐｕｂｌｉモ≠狽奄盾氏@Ｎｏ 。

ＡＤＭ　８７−１５１９））。約１８００万人のアメリカ人がアルコール依存性 であると考えられる。

アルコール中毒を診断するのに使用される現在の試験は、その条件につき特定し ない。それ故、多重試験が行われ、評価されてアルコール中毒の診断に至る。

多重試験に基く重度指数がアルコール関連の肝臓病の治療を監視するのに使用さ れる（ブレーク（Ｂｌａｋｅ、　Ｊ、　）及びオリゴ（Ｏｒｒｅｇｏ、　Ｈ，） 著、ＣＩｔｎ、ＣｈｅｆｆＬ、３７．５−１３゜１９９１’）。アルコール中毒 において、血清γ−グルタミルトランスフェラーゼがしばしば増加される（ロラ ソン（Ｒｏｔ　１ａｓｏｎ、　Ｊ、　）　、ピンチャーリイ（Ｐｉｎｃｈｅｒｌ ｙ、　Ｇ、　）及びロビンソン（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ、　Ｄ、　）著、Ｃｌ１ｎ、 ＣｈｉｆｆＬＡｃｔａ、　３９．７５−８０．１９７２；ロサルキ（Ｒｏｓａｌ ｋｉ、　Ｓ、　）及びラウ（Ｒａｕ、　Ｄ、　）著、Ｃｌ１ｎ、ＣｈｉｉＬＡｃ ｔａ、　３９．４１−４７．１９７２）。またA 増加がα−リポタンパク質（ジョハンソン（Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ、　Ｂ、　）及 びメドフス（Ｍｅｄｈｕｓ。

ん）著、Ａｃｔａ　Ｍｅｄ、５ｃａｎｄ、、　１９５．２７３−２７７、１９７ ４）及び血清鉄（ヒルマン（Ｈｉｌｌｍａｎ。

Ｒ，）著、Ａｎｎ、Ｎ、Ｙ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、　２５２．２９７−３０６． １９７５；バーバート（Ｈｅｒｂｅｒｔ、　Ｖ、　）及びラスマン（Ｔｉｓｍａ ｎ、　Ｇ、　）著、Ａｎｎ、Ｎ、Ｙ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、　２５２．３０７− ３１５．１９７５）で観察された。アルコール中毒者はしばしば種々の形態の貧 血及び血液凝固障害を有するので、その他の異常な研究結果として、増大された プロトロンビン時間及び血小板減少が挙げられる（ギトロウ（Ｇｉｔｌｏ＊、Ｓ 、）及びペイサー（Ｐｅｙｓｅｒ、　Ｈ，Ｓ、　）著、“Ａ−１ｃｏｈｏｌｉｓ ａ　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　Ｇｕｉｄｅ”、　Ｇｒｕｎ ｅ　ａｎｄ　５ｔｒａｔｔｏｎ、　ＩｎｃA　、フィラデ ルフィ乙ＰＡ、２１８頁、　１９８８）。最近、ブレーク及びオリゴはアルコー ル関連の肝臓病の治療に対する予後徴候の重要性の種々の指数を説明し、機能変 数（主として血液試験）が組織学的異常性よりも重要であると結論した（ブレー ク及びオリゴ著、Ｃｌ１ｎ、Ｃｈｅｍ、、３７．５−１３．１９９１）。それに もがかわらず、高レベルの臨床熟線化がアルコール中毒患者からの臨床データを 評価するのに必要である。

アルコール摂取のレベルの評価が、治療結果に関するその効果のために非常に重 要である（ブレーク及びオリゴ著、Ｃｌ１ｎ、Ｃｈｅａ、３７．５−１３．１９ ９１：オリゴ、ブレーク、ブレンディス（Ｂｌｅｎｄｉｓ、　Ｌ、　ｌ＋Ｌ　） 、コンプトンＣＣｏｍｐｔｏｎ、　Ｋ、　Ｖ、　）及びイスラエル（Ｉｓｒａｅ ｌ、　Ｙ、　）著、Ｎ、Ｂｎｇ、Ｊ、Ｍｅｄ、、　３１７．１４２１−１４２７ ．１９８７）　。しがしながら、患者、特にアルコール中毒者は、アルコール消 費を報告する点で信頼できない（オリゴ、ブレーク、ブレンディス、カバー（Ｋ ａｐｕｒ、　Ｂ、　Ｍ、）及びイスラエル著、Ｌａｎｃｅｔ、　１３５４−１３ ５６、１９７９）。こうして、長期間の過度のアルコール消費と相関関係のある 生化学試験が非常に有益である。例えば、スチブラー及び共同研究者（スチブラ ー（Ｓｔｉｂｌｅｒ、　Ｈ，）、ポルグ（Ｂｏｒｇ、　Ｓ）及びアルグランデ（ ＡＩ　Ｉｕｇｌａｎｄｅ、　Ｃ，）著、Ａｃｔａ　ＭｅｄＳｃａｎｄ、、　２０ ６．２７５−２８１．１９７９）は、トランスフェリンの高い等電点（ｐｉ）の イソ型が１週間以上にわたって毎日６０ｇ以上のエタノールを摂取した患者の８ １％で増加され、そして患者が１０日以上にわたって禁酒する場合に高いｐｉの イソ型が正常なレベルに戻ることを見出した。

トランスフェリンは、７９．５００ダルトンの分子量を有する血液の主要な鉄輸 送糖タンパク質である。そのタンパク質部分は、夫々、鉄結合部位を有する二つ の同種の半分を有する単一ポリペプチド鎖からなる（マツクギラーリイ（Ｍａｃ Ｇｉ　１ｌｉｒｒａｙ、　Ｒ，Ｔ、　Ａ、　）、メンデツ（Ｍｅｎｄｅｚ、　Ｅ 、　）　、ンエワール（Ｓｈｅｗａｌｅ、　Ｊ、　Ｇ、　）、シンハ（Ｓｉｎ■ ＝B Ｓ、に、）、ラインバックージング（Ｌｉｎｅｂａｃｋ−Ｚｉｎｇ、　Ｊ、　） 及びプリュー　（Ｂｒｅｗ、　Ｋ、　）著、Ｊ、Ｂｉｏｌ、ＣｈｅＩＬ、　２５ ８．３５４３−３５５３．１９８３）　。その分子の炭水化物鎖は、糖タンパク 質のＣ末端ドメインの４１３及び６１１の位置にあるアスパラギン（Ａｓｎ）残 基に結合されている（マツクギラーリイ、メンデツ、シアワール、シンハ、ライ ンバツクージング及びプリュー著、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ−、２５８，３５４ ３−３５５３，１９８３）。

その分子の５種のイソ型が、等電点電気泳動の差異（これらは炭水化物鎖の末端 に結合されたシアル酸の異なる量を反映すると考えられる）に基いて検出された 。主要なイソ型は５．４のｐｌを有し、カリトランスフェリン分子量たり４個の シアル酸末端を有する（パン・エイフ（ｖａｎ　Ｅｉ　ｊｋ、　ｌ（、Ｇ、　） 　、パン・ノート（ｖａｎ　Ｎｏｏｒｔ。

Ｗ、Ｌ、）、デ・ジョング（ｄｅ　Ｊｏｎｇ、　Ｇ、　）及びコスタ−（Ｋｏｓ ｔｅｒ、　Ｊ、　Ｆ、　）著、ＣＩ　ｉｎ、　Ｃｈｉｎ。

Ａｃｔａ、　１６５．１４１−１４５．１９８７；ペトレン（Ｐｅｔｒｅｎ、　 Ｓ、　）及びベスターベルグ（Ｖｅｓｔｅｒ−ｂｅｒｇ、　０．　）著、Ｂｉｏ ｃｈｉｕＢｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ、　９９４．１６１−１６５．１９８９）　 。５．６及び５．７の高ｐＩ値に集中する少量のトランスフェリンは正常な血清 中に存在し、夫々１個または２個のシアル酸末端を欠いているトランスフェリン に相当すると考えられる。

これらのイソ型力快々トリジアロートランスフェリン及びジシアロートランスフ エリンと称される（マルツ（Ｍａｒｚ、Ｌ、）　、ハラトン（Ｈａｔｔｏｎ、　 Ｉｔ　Ｗ、　Ｃ，）　、ベリイ（Ｂｅ−ｒｒｙ、　Ｌ、　Ｒ，）及びレゲルジ（ ＲｅｇｏｅｒｚＬ　Ｅ、　）著、Ｃａｎｊ、Ｂｉｏｃｈｅｔ、　６０．６２４− ６３０゜１９８２）。アルコール中毒者からの血清中にかなり増加されているイ ソ型は５．７のｐｌで集中し、′ジシアロートランスフェリグとして広く知られ ている。更に、アルコール中毒の血清は痕跡量のｐｌ５．８及び５．９のトラン スフェリンイソ型（これらは夫々１個及び０個のシアル酸末端を有すると考えら れる）を含むことがある。これらのイソ型は夫々モノシアロートランスフェリン 及びアシアロ−トランスフェリンと称される。トランスフェリンの約８０％は二 つの“アンテナ”中に配置されると考えられるオリゴ糖鎖を有し、２アンテナ（ ｂｉａｎｔｅｎｎａｒｙ）型と称される。トランスフェリンのその他の１５％は ３アンテナ形態であり、トランスフェリンの残りの５％は４アンテナ形態である （マル′人ハットン、ベリイ及びレゲルジ著、ＣａｎＪ、Ｂｉｏｃｈｅａ、　６ ０．６２４−６３０．１９８２）。トランスフェリンの３アンテナのオリゴ糖形 態及び４アンテナのオリゴ糖形態は約５．２〜５．３のｐｌで表示されると考え られる。

上記のトランスフェリンイソ型は、３−１０または３−１１のｐＨ勾配で等電点 電気泳動を使用して検出された。狭いｐＨ範囲（５−７または４−８）が使用さ れる場合、トランスフェリンの更に別のイソ型が５．５〜６．０のｐｌで見られ る（パン・エイフ、パン・ノート及びパンーデル＋ヘウル（ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｈ ｅｕｌ、　Ｃ，）著、Ｊ、　ＣＩ　ｉｎ、　Ｃｈｅａ　Ｃ１ｉｎ、　Ｂｉｏｃ− ｈｅｍ、　１８．５６３−５６６、１９８０；パン・エイフ、パン・ノート、ク ロース（Ｋｒｏｏｓ、　Ｌ　Ｊ、　）及びパン・デル・ヘウル著、Ｃｌ１ｎ、Ｃ ｈｉｍ、Ａｃｔａ、　１２１．２０１−２１６．１９８２；パン・エイフ、パン ・ノート及びパン・デル・ヘウル著、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｃｈｅｍ、Ｃｌ１ｎ、Ｂｉ ｏｃｈｅｕ、　１６゜５５７−５６０．１９７０）。これらの更に別のイソ型が 単離され、異なる量の鉄を結合するとして特性決定された。一種のジ鉄（ＩＩＩ ）形態、二種のモノ鉄（Ｉｌｌ）形態、及び結合された鉄を欠いている（無鉄） トランスフェリンの一形態がある。鉄の“飽和”を増大するための条件が使用さ れていたが、これらの条件は二つの鉄結合部位の完全な飽和を生じない。従って 、′飽和”条件はｐｌ５．７のイソ型を特性決定し、定量化するのに研究者らに より使用されていたが、シアル酸末端を欠いているトランスフェリンイソ型と同 時に移動し得るトランスフェリンのモノ鉄（Ｉｌｌ）形態及び無鉄形態の量につ き依然として成る種の疑問がある。

アルコール中毒の血清中のｐｌ５．７のイソ型の量は検出の方法により変化する 。

超薄ポリアクリルアミドゲル分離、続いて定量的デンシトメトリーを使用して、 シレンベルグ及びウニイル（Ｓｃｈｎｅｒｅｎｂｅｒｇ、　Ｆ、及ｎｅｉ１１． Ｊ、著、叶ｕｇ　Ａｌｃｏｈｏｌ　Ｄｅ−ｐｅｎｄ、、１９．１８１−１９１． １９８７）は、トランスフェリンのｐｌ５．７のイソ型が非アルコール中毒者中 の全トランスフェリンの１．４〜３．７％に相当し、かつ男性及び女性が夫々３ ．０％及び２，４％の平均レベルを有することを見出した。アルコール中毒者で は、ｐｌ５．７のイソ型が全トランスフェリンの２．５〜１６．４％を構成した 。男性及び女性は夫々６．４％及び７．４％の平均レベルを有していた。キンら は抗トランスフェリン抗体でトランスフェリンイソ型を検出する同様の方法を使 用した（キン（Ｘｉｎ、Ｙ、）、ラスカー（Ｌａｓｋｅｒ、　Ｊ、Ｍ、　）　、 ロスマン（Ｒｏｓｍａｎ、んＳ、）及びリーバ−（Ｌｉ　−ｅｂｅｒ、　Ｃ，Ｓ 、　）著、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、　１００．　Ａ３１２．１９９ １）。キンらは、アルコール中毒の血清が１４５±４３　ｍｇ／ｌ　（肝臓病の 場合）及び１１７±３０　ｆｆ１ｇ／Ｉ　（肝臓病ではない場合）の量の炭水化 物欠乏トランスフェリン（ＣＤＴ）を含むことを見出した。禁酒束又は非アルコ ール中毒者（肝臓病の場合又は肝臓病ではない場合）のＣＤＴレベルは６８〜８ ６ｍｇハの範囲であった。異常値が対照群の平均＋２標準偏差の合計と定義され る場合、ＣＤＴはアルコール中毒患者の約８０％で異常であった。不運なことに 、ＣＤＴ又はｐｌ５．７〜５．９のイソ型のかなりの量（６８〜８６ｍｇ／ｌ） がまた対照群中で見られた。　ストレイら（ストレイ（Ｓｔｏｒｅｙ、Ｅ、Ｌ、 ）　、マッシ（Ｍａｃｋ、　Ｕ、　）　、ポーウェル（Ｐｏｗｅ−１１，Ｌ、　 Ｗ、　）及びホリディ（Ｈｏｌｌｉｄａｙ、Ｊ、Ｗ、）著、Ｃｌ１ｎ、Ｃｈｅｍ 、、　３１．１５４３−１５４５．１９８６．ストレイ、アンダーマン（Ａｎｄ ｅｒｓｏｎ、　Ｇ、　Ｊ、　）、マッシ、ポーウェル及びホリデイ著、Ｌａｎｃ ｅｔ、　１２９２−１２９４．１９８７）は、予想された電荷の相違に基いてイ ソ型を分離するのにクロマトフォー力ソングを使用して“部分膜シアリル化され た”トランスフェリン画分（または高ｐ］イソ型）を測定した。溶離されたトラ ンスフェリンは、その後、トランスフェリンにつきラジオイムノアッセイ（ＲＩ Ａ）により同定された。非アルコール中毒血清中の高ｐｌｈランスフェリンイソ 型の最大量は１．５％であり、一方、２０種のアルコール中毒血清のうちの１８ 種が２〜１３％のアルコール中毒イソ型を含んでいた。

スチブラーら（スチブラ−（Ｓｔｉｂｌｅｒ、　Ｈ，）、ボルダ（Ｂｏｒｇ、　 Ｓ、　）及びジョウストラ（Ｊｏｕｓ　ｔｒａ、　Ｉｔ　）著、Ａｌｃｏｈｏｌ 　Ｃｌ１ｎ、Ｅｘｐ、Ｒｅｓ、、１０．５３４−５４４．１９８６）は、小さい 使い捨てのアニオン交換カラムを使用する別法を開発した。最初に、鉄がトラン スフェリンを飽和するのに不十分な量で患者の血清に添加される。その後、ピペ ラジン緩衝液（ｐＨ５，６５）中に希釈された血清がカラムに通される。ｐｌ５ ．７以上のｐ１イソ型を含む溶出液が、その後、二重抗体ＲＩＡを使用してトラ ンスフェリンにつき試験された。これらの異常なイソ型のレベルは血清１リツト ル当たりのＣＤＴのｍｇ数の量で報告された。全禁煙束は２７〜７１ｍｇ／ｌの ＣＤＴ範囲及び平均５０ｍｇ／ｌを有していた。正常な（適度の）アルコール消 費者は２６〜７４ｍｇ／ｌのＣＤＴ範囲及び平均５３ｍｇ／ｌを有していた。ア ルコール中毒者は３４〜３７２ｍｇ／Ｉの範囲及び平均１３８ｍｇハの高いＣＤ Ｔ値を有することがわかった。これらの平均値は、等電点電気泳動、続いて抗ヒ トトランスフェリンによるウェスタンプロットによるイソ型定量化を使用してキ ンら（キン、ラスカー、ロスマン及びリーバ−著、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ ｏｇｙ、　’１００゜Ａ３１２．１９９１）により得られた値に非常に近似して いる。正常な“ｐｌ５．７″イソ型値はトランスフェリンのモノ鉄（ＩＩＩ）形 態及び無鉄形態の存在によるものと考えられる。

スチブラーら（スチブラー、ボルダ及びジョウストラ著、Ａｌｃｏｈｏｌ　Ｃｌ １ｎ、Ｅｘｐ。

Ｒｅｓ、、　１０．５３４−５４４．１９８６）によるミクロアニオン交換法の 臨床評価は、アルコール中毒患者が１００％の特異性及び９１％の感度で禁煙束 及び適度の消費者から明らかに分離し得ることを示した。ＣＤＴ値は、先月中の アルコール消費と相関関係があった。アルコール中毒者を禁煙させると、その値 は１７日の平均半減期で減少した。それにもかかわらず、この試験は欠点を有す る。何となれば、トランスフェリンイソ型が最初に等電点電気泳動に基いて分離 される必要があるからである。

また、ピペラジン緩衝液のｐＨが５．６５のｐＨがらゎずかに０．０５ｐＨ単位 だけ異なる場合に、そのアッセイは正確に行われない。しがも最後に、その分離 は普通の血液凝固阻止薬ＥＤＴＡ及びヘパリンの如きイオン性添加剤に非常に感 受性であることがわかった。

トランスフェリンの遺伝Ｂ変異体及びＤ変異体は殆どの集団で稀であるが、Ｄ変 異体はアメリカの黒人及び成るアジア人並びに南アメリカの人口の約１０％中に 見られる（プツトマン（Ｐｕｔｍａｎ、　Ｆ、　）著、Ｔｈｅ　Ｐｌａｓｍａ　 Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ、　Ｆｕｎｃ−ｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｇ ｅｎｅｔｉｃ　Ｃｏｎｔｒｏｌ、　プツトマン編集、アカデミツク・プレス、ニ ューヨーク、　２６５−３１６頁、　１９７５）。これは擬陽性の結果を生じ得 る。何となれば、Ｂ変異体及びＤ変異体のｐＩはアルコール中毒のｐｌ５．７の イソ型の値に近似しているからである（ベーシング（Ｂｅｈｒｅｎｓ、　Ｕ、　 Ｊ、　）、ワーナー（Ｗａｒｎｅｒ、　Ｔ、　Ｉｔ　）　、ブラリイ（Ｂｒａｌ ｙ。

Ｌ、Ｆ、）、シャフナ−（Ｓｃｈａｆ　ｆｎｅｒ、　Ｆ、　）及びリーバ−（Ｌ ｉｅｂｅｒ、　Ｃ，Ｓ、　）著、Ａｌｃｏｈｏｌ　ｉｓｍ：Ｃ１１ｎ、Ｅｘｐ、 Ｒｅｓ、、　１２．４２７−４３１．１９８８；スチブラー、ボルダ及びベック マン（Ｂｅｃｋ−ｍａｎ、　Ｇ、　）著、Ａｌｃｏｈｏｌｉｓｍ：　Ｃｌ１ｎ、 Ｅｘｐ、Ｒｅｓ、、　１２．４５０−４５３．１９８８）。

トランスフェミルの高ｐＩイソ型に関する発表されたアッセイのありうる欠点に もかかわらず、そのアッセイの実用性及び重要性が確立された。また、スチブラ ーの研究所（スチブラー及びフルトクランッ（Ｈｕｔ　ｔｃｒａｎｔｚ、　Ｒ， ）著、Ａｌｃｏｈｏｌｉｓｍ：Ｃｌ１ｎ、Ｅｘｐ、Ｒｅｓ、、　１１．４６８− ４７３．１９８７；スチブラー、ダールグレン（Ｄａｈｌ　ｇｒｅｎ、　Ｌ、） 及びボルグ著、Ａｌｃｏｈｏｌ、　５．３９３−３９８．１９８８）は、アルコ ール中毒者の高ＣＤＴレベルが先の肝臓障害または関連肝臓障害に非依存性であ り（また非アルコール中毒の肝臓病患者は高ＣＤＴレベルを示さない）、かつＣ ＤＴレベルの測定がアルコール中毒の初期段階で婦人に関する早期の診断目的を 与え得ることを示した。

最近、重度の神経系欠乏及び炭水化物欠乏の血清糖タンパク質並びに高レベルの ＣＤＴ　（全トランスフェリンの約２５％）を特徴とする新しい遺伝的症候群が スチブラー及び同僚（ジエーケン（Ｊａｅｋｅｎ、Ｊ、）　、ｆ−ツガ−マウン ト（Ｅｇｇｅｒｍｏｕｎｔ、　Ｅ、　）及びスチブラー著、Ｌａｎｃｅｔ、　１ ３９８．１９８７；スチブラー及びジエーケン著、Ａｒｃｈ。

Ｄｉｓ、Ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ、　６５．１０７−１１１．１９９０；ジェーケン 及びスチブラー著、Ｇｅｎｅｔｉｃｓｏｆ　Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉａｔｒｉｃ　 Ｄｉｓｅａｓｅｓ、ウエツターブルグ（Ｗｅｔｔｅｒｂｕｒｇ、　Ｌ、　）編集 、　Ｗｅｎｎｅｒ| Ｇｒｅｎ　Ｉｎｔ、Ｓｙｍｐ、５ｅｒｉｅｓ、５１巻、マクミラン・プレス（Ｍ ａｃｍｉ　１ｌａｎ　Ｐｒｅｓｓ）、　ｏ　ンドン。

８９−８０頁、　１９８９）　、クリスチャンソンら（クリスチャンソン（Ｋｒ ｉｓｔｉａｎｓｓｏｎ、　Ｂ、　）、アンダーマン（Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ、ｖＬ 　）、トンビイ（Ｔｏｎｎｂｙ、　８．　）及びハブベルブ（Ｈａｇｂｅｒｇ。

Ｂ、）著、Ａｒｃｈ、Ｄｉｓ、Ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ、　６４．７１−７６、１９ ８９）及びジェーケンら（ジェーケン、パン・エイフ、パン・デル・ヘウル、コ ルビール（Ｃｏｒｂｅｅｌ、　Ｌ、　）、エッヶルズ（Ｅｅ−ｃｋｅｌｓ、　Ｒ ，）及びエツガーマウント著、Ｃｌ１ｎ、Ｃｈｉｍ、Ａｃｔａ、　１４４．２４ ５−２４７．１９８４）により記載された。これらの幼児からのＣＤＴ及び成る 種のグリコシルートランスフェラーゼ活性の炭水化物組成物に基いて、ジェーケ ン及びスチブラーは、その欠乏がＧｌｃＮＡｃ−トランスフェラーゼ■またはＩ Ｉ（これらはＧＩｃＮＡｃをＮ連鎖オリゴ糖の末端トリサツカリド配列に結合さ せる）にあり得ると結論した。ＧＩＣＮＡＣ−トランスフェラーゼの欠乏はオリ ゴ糖鎖にマンノース末端を有する糖タンパク質を生じる。これらの幼児のＣＤＴ がアルコール中毒者のＣＤＴとは異なること、または異常なＣＤＴが正常なトラ ンスフェリンとは同様に異なることは、未だ知られていない。しかしながら、ア ルコール中毒のトランスフェリンのスチブラー及びボルダの分析はオリゴ糖鎖の 末端トリサツカリド部分の減少された含量を示した（スチブラー及びポルグ著、 Ａｌｃｏｈｏｌ　Ｃｌ１ｎ、Ｅｘｐ、Ｒｅｓ、、　１０．６１−６４．１９８６ ）、幼児のｐｌ５．７のイソ型の炭水化物成分に関する同様のデータは未だ報告 されていなかった。

５．６．５．７．５．８及び５．９のｐｌに移動するＣＤ７種は、トランスフェ リンの共通のｐｌ５．４のイソ型を異なる期間にわたってノイラミニダーゼ酵素 でインキュベートすることにより人工的に生成し得る。（ペトレン（Ｐｅｔｒｅ ｎ、　Ｓ、　）及びベスターベルグ（Ｖｅｓｔｅｒｂｅｒｇ、　０．　）著、Ｂ ｉｏｃｈｉａ８ｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ、　９９４．１６１−１６５．１９８９ ：　？ルッ（Ｍａｒｚ、Ｌ、）　、ハ、、トン（Ｈａｔｔｏｎ、　！＋Ｌ　Ｗ、 　Ｃ，）　、ベリイ（Ｂｅｒｒｙ、　Ｌ、　Ｒ，）及びレゲルジ（Ｒｅ| ｇｏｅｒｚｉ、　Ｅ、　）著、Ｃａｎ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　６０．６２４ −６３０．１９８２；パン・、１１イ入パン−ノート、クロース及びパン・デル ・ヘウル著、Ｃｌ１ｎ、Ｃｈｉｍ、Ａｃｔａ、　１２１．２０１−２１６．１９ ８２を参照のこと）。

ＣＤＴがそれらの炭水化物鎖で一つ以上のシアル酸末端を欠いているトランスフ ェリンに相当する場合には、新しいトランスフェリン種は末端ガラクトース部分 を有するべきである。１９８１年に、セルベンら（セルベン（Ｃｅｒｖｅｎ、Ｃ ，）　、７．チブラー及びボルグ著、Ｕｐｐｓａｌａ　Ｊ、Ｍｅｄ、Ｓｃｉ、、 　８６．３９−５７．１９９１；セルベンの欧州特許出願第００４３３５９号Ａ ２．１９８２）は、血清標本中のアルコール中毒のトランスフェリンと正常なト ランスフェリンの相違を定量化する方法を記載した。抗ヒトトランスフェリンが 血清からトランスフェリンを捕捉するのに使用され、その後トランスフェリンが １２″Ｉ標識されたクロタラリア・ジュンセア（Ｃｒｏｔａｌａｒｉａ　ｊｕｎ ｃｅａＸソのレクチンがガラクトースに結合する）と反応させられた。ジョウス トラら（米国特許第４．６２６．３５５号）は、セルベンらの方法がアルコール 中毒の血清と非アルコール中毒の血清の間にかなりの相違を示さないこと、そし て高いバックグラウンドが見られたことを報告している。

先に説明されたように、等電点電気泳動、続いて定量的デンシトメトリー（タン パク質染色または抗ヒトトランスフェリン抗体による検出のいずれかの後）、及 びミクロアニオン交換カラム法は、正常なＣＤＴ及びアルコール中毒のＣＤＴの 量を区別するための明らかな相違を生じる。これらのアッセイは有益であるが、 時間を浪費し、労力を集中するので不便である。等電点電気泳動、続いて染色は 複雑な操作である。ミクロアニオンカラム技術は、夫々の試料につき別個の使い 捨てカラムを必要とし、続いて溶出液のＲＩＡ分析を必要とする。また、上記の ように、これらの方法により定量化されたＣＤＴの一部は、おそらく、正常な血 清中のＣＤＴの存在を原因とするトランスフェリンのモノ鉄（ＩＩＩ）形態及び 無鉄形態である。また、成る人種／民族の集団の約１０％に見られるトランスフ ェリンのＤ変異体か許容できない程に高い割合の擬陽性の結果を生じる。

ルメング及びリン（ルメング（Ｌｕｍｅｎｇ、　Ｌ、　）及びリン（Ｌｉｎ、　 Ｒ，Ｃ，）著、Ｒｅｖｉｅｗ　ｏｎＰｒｏｔｅｉｎ−Ａｃｅｔａｌｄｅｈｙｄｅ 　Ａｄｄｕｃｔｓ　ａｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｍａｒｋｅｒｓ　ｏｆ　Ａ ｌｃｏｈｏｌ　bｏｎｓｕｍｐｔ− ｉ　ｏｎ、印刷中）は、現在入手でき、また開発中であるアルコール中毒マーカ ー、特にエタノール代謝により生産されたマーカーを最近要約していた。彼らは 、ＣＤＴ血清の定量化が現在量も信頼できる試験であり、一方、その他の全ての マーカーが特異性または感度を欠如していると結論していた。エタノール代謝産 物の測定は、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＩ（）及びアルデヒドデヒドロ ゲナーゼ（ＡＤＬＩ（）の遺伝変異、埋填因子及び肝臓障害のために制限を有す る。血液タンパク質のアセトアルデヒド付加物（ＡＡ）　（特に、晶−ヘモグロ ビン）の定量化が若干有望であったが、アルコール中毒関連の測定の精度及び特 異性の欠如をまた問題としている。還元品に対し産生された抗体を使用する最近 の品−アルブミンの試験が有望である。

発明の要約 本発明は、アルコール中毒者中に見られるが、非アルコール中毒者中に見られな いトランスフェリン同族体と選択的に反応する抗体を提供する。抗体はポリクロ ーナル抗体またはモノクローナル抗体であってもよい。

また、本発明は、所望の抗体を誘導するのに充分なアルコール中毒トランスフェ リン同族体、またはその部分を含む免疫原で動物を免疫することを含む抗体の産 生方法を提供する。モノクローナル抗体が所望される場合、その方法は免疫され た動物からの免疫グロブリン産生細胞を不死細胞（ｉｆｆＩｆｆｌｏｒｔａｌ　 ｃｅｌｌｓ）と融合し、所望の抗体を産生ずるハイブリドーマを選択する付加的 な工程を含む。選択されたハイブリドーマ細胞は培養されてモノクローナル抗体 を産生ずるか、またはモノクローナル抗体を含む腹水を産生ずるように動物に注 射される。また、本発明は、モノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマを提 供する。

最後に、本発明はイムノアッセイ及びイムノアッセイを行うためのキットを提供 する。イムノアッセイは、ｌ）トランスフェリンを含む体液の試料を用意する工 程、２）試料を、アルコール中毒者中に見られるが、非アルコール中毒者中に見 られないトランスフェリン同族体と選択的に反応する抗体と接触させる工程、及 び３）試料中に存在するアルコール中毒トランスフェリン同族体のいずれかを検 出または定量化する工程を含む。キ・ノドは、アルコール中毒者中に見られるが 、非アルコール中毒者中に見られないトランスフェリン同族体と選択的に反応す る抗体の容器を含む。

本発明のイムノアッセイは、アルコール中毒者の同定を可能にし、かつアルコー ル消費の監視を可能にする。それは、アルコール中毒者及びアルコール消費の監 視につき従来技術のアッセイよりも極めて迅速カリ使用し易いアッセイである。

また、それは従来技術のアッセイよりも信頼性があり、かつ正確である。何とな れば、それはアルコール中毒者の体液中にのみ見られるトランスフェリン同族体 を検出するからである。特に、従来技術の方法はアルコール中毒と関連するかな りの量のｐＩイソ型の非アルコール中毒者中の存在のために成る個人ではアルコ ール中毒を正確に評価できなかった。この難点が本発明の方法により解消される 。

現在好ましい実施態様の詳細な説明 本発明は、アルコール中毒者中に見られるが、非アルコール中毒者中に見られな いトランスフェリン同族体と選択的に反応する抗体を提供する。′アルコール中 毒者”は、本明細書において、１週間以上の期間にわたって毎日６０ｇ以上のエ タノールを摂取する個人であると定義される。′非アルコール中毒者”は、アル コール中毒者の定義を満足しない個人である。非アルコール中毒者は、酒を飲ま ない者または上記の量よりも更に適度の酒を飲む者を含む。また、非アルコール 中毒者は、アルコール中毒の病歴を有するが、少なくとも１０日の期間にわたっ てアルコールを控えている者を含む。

本明細書に使用される“同族体”は、トランスフェリンが存在し得る種々の化学 形態を表す。例えば、トランスフェリン同族体として、トリジアロートランスフ ェリン、ジシアロートランスフエリン及びアンアロートランスフェリン並びにト ランスフェリンのジ鉄（ＩＩ＋）形態、２種のモノ鉄（ＩＩ＋）形態及び無鉄形 態が挙げられる。トランスフェリン同族体は従来技術に記載された“ｐＩイソ型 ”とは区別できる。何となれば、ｐｉイソ型は等電点電気泳動におけるそれらの 挙動により特定されるが、一方、同族体はそれらの化学組成に関して特定される からである。

こうして、ｐ＋イソ型は一種以上の同族体からなることがある。

本明細書に使用される“アルコール中毒トランスフェリン同族体”は、アルコー ル中毒者中に見られるが、非アルコール中毒者中に見られないトランスフェリン 同族体を表す。“正常なトランスフェリン同族体”は、非アルコール中毒者中に 見られるトランスフェリン同族体（これはまたアルコール中毒者中に見られるこ とがある）を表す。アルコール中毒トランスフェリン同族体と正常なトランスフ ェリン同族体の化学的な相違は未だ完全には特性決定されていない。しかしなが ら、トランスフェリンに通常存在する二つの２アンテナ炭化水素鎖のうちの一つ （または殆ど一つ）を欠いていることが明らかであるアルコール中毒トランスフ ェリン同族体が存在することが測定された（以下を参照のこと）。

本発明の抗体はアルコール中毒トランスフェリン同族体と選択的に反応する。

“選択的に”は、抗体が正常なトランスフェリン同族体よりもアルコール中毒ト ランスフェリン同族体との統計上かなり大きな反応性を示すことを意味する。こ の選択的反応性を測定するのに適した統計方法が当業界で公知である。

本発明の抗体を調製するために、動物がアルコ、−ル中毒トランスフェリン同族 体を含む免疫原で免疫し得る。こうして、免疫原は、アルコール中毒者の体液か ら単離された少なくとも一種のアルコール中毒トランスフェリン同族体を含むト ランスフェリン同族体の混合物であってもよい。例えば、免疫原は、全てのトラ ンスフェリン同族体と反応性の抗トランスフェリン抗体を使用するアフィニティ ークロマトグラフィーによりアルコール中毒者の血清から単離されたトランスフ ェリン同族体の集団であり得る。また、免疫原は等電点電気泳動により単離され たｐｌ５．７を有するトランスフェリン同族体の集団であり得る。背景の部分に 説明されたように、ｐｌ５．７のトランスフェリンのレベルはアルコール中毒者 でかなり増大されることが示された。アルコール中毒の血清中に見られるが、正 常な血清中に見られないその他のｐｌのイソ型がまた免疫原として使用し得る。

また、免疫原は所望の抗体を誘導するのに充分なアルコール中毒トランスフェリ ン同族体の部分であってもよい。例えば、トランスフェリンに通常存在する二つ の２アンテナ炭化水素鎖のうちの一つ（または殆ど一つ）を欠いていることが明 らかであるアルコール中毒トランスフェリン同族体が存在することが測定された （実施例１を参照のこと）。鎖の一つが全部または殆ど失われていると、正常な トランスフェリン同族体では露出されないタンパク質領域がアルコール中毒トラ ンスフェリン同族体で露出され、そして本発明の抗体は二つの２アンテナオリゴ 糖鎖のうちの一つが失われている場合に露出された領域に対して誘導された抗体 を含む。このような抗体の産生に適した免疫原は、炭水化物路が結合されている Ａｓｎ残基（Ａｓｎ　４１３及びＡｓｎ　６１１）付近のアミノ酸配列を有する ペプチドである。

トランスフェリンのアミノ酸配列が知られており（ヤング（Ｙａｎｇ、　Ｆ、　 ）　、ラム（ＬｕａＪ、Ｂ、）　、ｖツクギル（ＭｃＧｉ　ＩＩ、　Ｊ、　Ｒ， ）　、ムーア（Ｍｏｏｒｅ、　Ｃ，Ｍ、　）、ナイラー（Ｎａｙｌｏｒ、　Ｓ。

Ｌ、）、パン・ブラグト（ｖａｎ　Ｂｒａｇｔ、　Ｐ、　Ｈ，）、ボールドウィ ン（Ｂａｌｄｗｉｎ、　Ｗ、　Ｄ、　）及びポウマン（Ｂｏｗｍａｎ、　Ｂ、　 Ｈ，）著、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、　８１．２７５２−２７ ５６．１９８４）　、Ａｓ■ ４１１及びＡｓｎ　６１３付近の配列が容易に決定し得る。トランスフェリンの 配列は個人により変化し得るが、Ａｓｎ　４１１及びＡｓｎ　６１３付近の配列 は保存される。ペプチド免疫原のサイズは変化し得るが、長さが約１３〜１４の アミノ酸であることが好ましい。下記の配列を有するペプチドが特に好ましい。

Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　 Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ［配列番号１］ Ｇｌｎ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　 Ａｓｐ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ［配列番号２］ ペプチドは、メリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）著、ＪＡＣ３，８５，２ １４９，１９６３，デービス（Ｄａｖｉｓ）ら著、Ｂｉｏｃｈｅｗ＋１ｓｔｒｙ 　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、　ｔｏ、　３９４−４１４．１９８５；スチュ ワード（Ｓｔｅｗａｒｄ）及びヤング著、５ｏｌｉｄ　Ｐｈａｓｅ　Ｐｅｐｔｉ ｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ、　１９６９；米国特許第３、９４１．７６３号明細 書；フィン（Ｆｉｎｎ）ら著、Ｔｈｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、第３編、２巻、ノイ ラス（Ｎｅｕｒａｔｈ）ら編集、　１０５−２５３頁、　１９７６；並びにエリ クソン（Ｅｒｉｃｋｓｏｎ）ら著、ＴｈｅＰｒｏｔｅｉｎｓ、第３編、２巻、ノ イラスら編集、　２５７−５２７頁、　１９７６に記載された方法のような固相 ペプチド合成法により合成し得る。また、ペプチドは、下記の会社を含む種々の 源から商業上購入し得る。シグマ・ケミカル社（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ 　Ｃｏ、。

Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）　；ベニンスラ・ラボラトリイズ（ Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ。

Ｈｅｌｍｏｎｔ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）　：ベーチャム社（Ｂａｃｈｅｍ　 Ｉｎｃ、、　Ｔｏｒｒａｎｃｅ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）@； 及びベガ・バイオケミカルズ（Ｖｅｇａ　［１ｉｏｃｈｅｔ＋１ｃａｌｓ、　Ｔ ｕｃｓｏｎ、　Ａｒ１ｚｏｎａ）。

ペプチドは動物を直接に免疫するのに使用し得ろカ（、使用されるｍＮ（こ免疫 原キャリヤーにカップリングされることが好まり＼。好適なキヤＩＪヤー４よ、 それら（二カップリングされた］＼ブテンに対して宿主動物中で抗体の産生を車 ｑ激てきる化合物である。このようなキャリヤーは通常であり、公知である。そ れら（ま一般１こ高分子量の化合物である。殆どの場合、キャリヤーはタンｌ＜ り質まｔこ（よポ１）ペプチドであるが、その他の物質、例えば、充分なサイズ と免疫原性の炭水化物、多糖、リポ多糖、核酸、等が使用し得る。好適な免疫原 ギヤ１ツヤータンパク質及びポリペプチドは一般に４．０００−１０．０００． ０００、好ましく番ま１５．０００より大き０分子量を有する。好適なキャリヤ ータン／くり質及びポリペプチドとして、アルブミン（ｆ！ＡＩえば、ウソ血清 アルブミン、卵白アルブミン、ヒト血清アルブミン）、免疫り゛ロブリン、チロ グロブリン（例えば、ウソチログロブ１ノン）、ヘモシアニン（？Ｉえ（ず、キ ーホールリン勺トヘモソアニン）及びｆｌＪペプチド、Ｍえ（ぼ、ポ１）＋）シ ンまたはポリアラニンリシンが挙げられる。

ペプチドは、当業界で公知の方法を使用してギヤ１ツヤ一に力・ノブ１ノングさ れる。

例えば、ペプチドは、接合試薬、例えば、グルタルアルデヒドイミド、Ｎ，　Ｎ −カルボニルジイミダゾール、■ーヒドロキシベン゛／ト１ノア゛／−ルー水和 物、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ｎ−ト１ノフルオロアセチルイミダゾール シアノーケンブロミド、３−（２’　−ベン゛ノチア゛／１）ルージチオ）プロ ピオネートスクシンイミドエステル、ヒドラジン、またＧｔアフィニティー標識 法を用いてキャリヤーにカップ百ルグし得る。また、可能な力・ツブ「リングｉ １１の１ノストにつきＰｉｅｒｃｅ　Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅｒａ ｌ　Ｃａｔａｌｏｇ　（１９８９）を参照のこと。

通常の免疫原キャリヤー物質及びがツブリング技術（こ関する追加の参考文献Ｃ よ以下のとおりである。エーランガー（Ｅｒｌａｎｇｅｒ）著、ｊＪｅｔｈ．Ｅ ｎｚｙｍｏｌ．、７０．　８５−１０４。

１９８０；　７ケラ（Ｍａｋｅｌａ）及びセノくう（Ｓｅｐｐａｌａ）著、Ｈａ ｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｉｍ−ｍｕｎｏｌｏｇｙ，　 Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，　１９ａａ：／＜−カー（Ｐａｒｋｅｒ）著、Ｒａｄｉｏ ｉａｎｕｎｏａｓｓａｙ　ｏｆ　Ｂｉ盾奄潤| ｇｉｃａｌｌｙ　Ａｃｔｉｖｅ　Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，　Ｒｒｅｎｔｉｃｅ−Ｈ ａｌｌ．　１９７６；／＜　）ラー（Ｂｕｔｌｅｒ）著、ＪCｌａｎ− ｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．、７，　ｌ−２４．　１９７４；ワインリブ（Ｉｌｌｅｉ ｎｒｙｂ）及びジュロ・ンフ（Ｓｈｒｏｆｆ）著、Ｄｒｕｇ．Ｍｅｔａｂ．Ｒｅ ｖ．、　１０，　２７１−８３．　１９７９＋ブロウトン（Ｂｒｏｕｇｈｔｏｎ ）及びストロング（Ｓｔｒｏｎｇ）著、ＣＩｉｎ．Ｃｈｅｉ，　２２．　７２６ −３２．　１９７６；プレイフェアー（Ｐｌａｙｆａｉｒ）ら著、ＢｒＪｅｄ． Ｂｕｌｌ，、３０．　２４−３１．　１９７４。

キャリヤー分子にカンブリングされたペプチドの数（″エピトープ密度″）は１ からキャリヤー分子の利用可能なカップリング基の数までの範囲である。特別な キャリヤーのエピトープ数はキャリヤーの分子量並びにカップリング部位の密度 及び利用可能性に依存する。最適のエピトープ密度はキャリヤー分子の利用可能 なカップリング基の約ｌＯ％〜約５０％にはいる。

ポリクローナル抗体を産生ずるために、免疫原が動物を免疫するのに使用される 。動物を免疫する方法は公知であり、通常であり、適当な免疫化プロトコル及び 免疫原濃度は当業者により容易に決定し得る。例えば、本発明の抗体は、アジュ バント（例えば、完全フロインドアジュバントまたは不完全フロインドアジュバ ント）と混合した本発明の免疫原を適当な宿主動物（例えば、ウサギ、ヤギ、ウ マ、またはその他の哺乳類）に注射することにより調製し得る。免疫原の注射は 、適当な力価の抗血清が得られるまで続けられる。抗血清が回収され、必要また は所望により既知技術を使用して更に精製されてもよい。例えば、抗体はアフィ ニティー精製されてもよく、またはＤＥ−５２クロマトグラフイーによるように 分別されてもよい。

また、本発明の抗体は、免疫された動物（例えば、ラット、ハムスター、マウス またはその他の哺乳類）からの細胞を不死細胞（例えば、骨髄腫細胞）と融合す ることにより体細胞ハイブリダイゼーションにより調製し得る。体細胞ハイブリ ダイゼーションの方法及びモノクローナル抗体の産生方法は公知である。

簡単に言えば、動物がポリクローナル抗体の産生につき上記されたのと同し方法 で免疫原で免疫される。その後、免疫グロブリンを産生できる免疫された細胞（ Ｂ細胞）が動物のリンパ器官（通常、好ましくは膵臓）から回収される。細胞の 回収は当業界で公知の通常の手段により行われる。

動物の免疫化の別法として、抗原特異的Ｂ細胞の刺激が試験管内で行い得る。

そうするために、免疫担当細胞が動物から除去されたリンパ器官から回収される 。

回収及び試験管内の免疫化に関する操作は当業者に公知である（リーディング（ Ｒｅａｄｉｎｇ）著、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１２１．　１８−２７．　 １９８６；グレートコス（Ｇｒａｔｅｃｏｓ）ら著、Ｊ．ＩｎｕＭｅｔｈ．、１ ０３．　１６９−１７８．　＋９８５：ミ・ノンｓ／しくＭｉｓｈｅｌｌ）及び シイギ（Ｓｈｉｉｇｉ）著、Ｓｅｌｅｃｔｅｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｃｅｌ ｌｕｌａｒ　ｌｎｍｕｎｏｌｏｇｙ．　１９８０）。

ハイブリドーマの産生のために融合ツク−トナーとして使用するのに適した不死 細胞は当業界で公知である。免疫グロブリン成分を分泌しなし＼骨髄腫細胞力（ 不死細胞として使用されることが好ましい。

融合は、一般に、免疫原の最後の注射の約４〜５日後１こ行われる。融合４よ、 ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）融合法、電気融合法並びに免疫イヒ学法及び 生イヒ学法（例えば、サモイロピッチ（Ｓａｍｏｉｌｏｖｉｃｈ）ら著、Ｊ．１ ｍＭｅｔｈ．、　１０１，　１５３−１７０。

１９８７を参照のこと）を含む幾つかの公知の方法のし）ずれ力）（こ従って１ １（１得る。

融合ハイブリッド細胞は既知の方法により選択され、クローンイヒされ、適当な 特異性のモノクローナル抗体を産生ずる１１イブリドーマ力（種々の公知のイム ノアッセイ技術のいずれかを使用してクローン化された／１イブ１ノット細胞を スフ冨ノーニングすることにより同定される。本発明の抗体を産生ずるため（こ 、選択されｔこハイブリドーマが培地中で培養でき、その結果、１１イブ１ノド ーマカ（抗体を産生じ、培地中に分泌する。また、ハイブリドーマが動物（こ腹 腔内注射されて抗体を含む腹水を産生する腫瘍を生じ得る。モノクローナル抗体 を調製し、精製する方法ｃマ公知である（例えば、ボデウス（Ｂｏｄｅｕｓ）ら 著、Ｉｍｍｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．、　７９．　１　（１９８５）；　／＜ジン（Ｂ ａｚｉｎ）　ら著、Ｉｎｔｉ．ｃａｎｃｅｒ，　１０．　５６８　（１９８２） ；　／＜ジン著、Ａｄｖ．　Ｃａｎｃｅｒ　ＲｅｓD。

５０、　２７９　（１９８７）；バジン著、Ｊ．　Ｉｍｍｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．、 ７Ｌ　９　（１９８４）を参照のこと）。

また、好適な抗体試薬は、組換えＤＮＡ技術を使用して調製し得る。このような 技術は公知であり、一本鎖抗体の産生を含む。

こうして、本発明に使用するのに適した抗体はモノクローナル抗体また（まポリ クローナル抗体であってもよく、抗血清また（よその精製画分（ｆｉｌえｉｆｆ ’，　ＤＥ５２分Ｗｌ＋された抗体またはアフィニティー精製された抗体）であ ってもよく、既知のイ゛ツタイブまたはサブクラス（例えば、ＩｇＧ　、ＩｇＭ 　、等）であってもよく、抗原を結合できる抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ 　、　Ｆ（ａｂ’　）またｉ；！Ｆ（ａｂ’）２）であってもよく、または一本 鎖抗体試薬の如きその他の抗体試薬であってもよし１ツ抗体（こ関する唯一の要 件は、それが少なくとも一種のアルコール体に対し特異性を有することである。

本発明の抗体は、体液中のアルコール中毒トランスフェリン同族体の検出または 定量化を可能にするあらゆるイムノアッセイ法に使用し得る。多くのこのような イムノアッセイ技術が知られている。適当なイムノアッセイ法として、ラジオイ ムノアッセイ、酵素イムノアッセイ及び蛍光イムノアッセイが挙げられる。イム ノアッセイは競合結合フォーマットで行われてもよく、またはイムノメトリック （ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｒｉｃ）アッセイであってもよい。それは均一アッセイま たは不均一アッセイであってもよい。適当な均一技術は、蛍光消光及び蛍光増強 、エネルギー転移イムノアッセイ、第二抗体立体障害イムノアッセイ、基質標識 イムノアッセイ、補欠分子族標識イムノアッセイ及び酵素モジュレータ−標識イ ムノアッセイである。イムノアッセイは自動化されてもよく、または手動で行わ れてもよい。

イムノアッセイを行うために、トランスフェリンを含む体液の試料が、アルコー ル中毒トランスフェリン同族体と選択的に反応する本発明の抗体と接触させられ る。体液は、血清、血漿、唾液またはその他の体液であってもよいが、血清であ ることが好ましい。

イムノアッセイに使用される試薬の一つは、アルコール中毒トランスフェリン同 族体の検出または定量化を可能にするために標識される必要がある。好適な標識 が当業界で公知である。それらとして、以下のものが挙げられる。■）酵素（例 えば、ホースラディツシュペルオキシダーゼ、マレートデヒドロゲナーゼ、スタ フィロコツカルヌクレアーゼ、δ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコー ルデヒドロゲナーゼ、α−グリセロホスフェートデヒドロゲナーゼ、トリオース ホスフェートイソメラーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グル コースオキ７ダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、 カタラーゼ、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、グルコアミラー ゼ及びアセチルコリンエステラーゼ）、２）蛍光体（例えば、フルオレセインイ ソチオンアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフイ コンアニン、０−フタルデヒド及びフルオレスカミン）：３）ラジオヌクレオチ ド（例えば、１″５１）　：４）生物発光標識（例えば、ルンフエリン、ルシフ ェラーゼ及びアエクオリン（ａｅｑｕｏｒｉｎ）　＋　５）化学発光標識（例え ば、ルミノール、イソルミノ−ル、芳香族アクリジニウムエステル、イミダゾー ル、アクリジニウム塩及びオキサレートエステル）、及び６）ビオチン。所望の 試薬へのこれらの標識の結合及び標識の検出は、当業者に公知の通常の技術を使 用して行い得る。

好ましいイムノアッセイ構造はサンドイッチ（捕捉、二部位）アッセイである。

このアッセイにおいて、アルコール中毒トランスフェリン同族体と選択的に反応 する抗体が固体表面に固定化される。その後、体液が固体表面と接触させられ、 体液中のアルコール中毒トランスフェリン同族体が固定化抗体に結合する。未結 合の物質を洗浄して除いた後、標識成分が添加剤され、これが固定化抗体に既に 結合されたアルコール中毒トランスフェリン同族体に結合する。好適な標識は上 記の標識である。この標識成分は、全てのトランスフェリン同族体と反応性の標 識抗体であることが好ましい。結合された標識成分の量は最初の試料中のアルコ ール中毒トランスフェリン同族体の量に比例する。また、固体表面に結合された 抗体は全てのトランスフェリン同族体と反応性の抗体であってもよく、標識抗体 はアルコール中毒トランスフェリン同族体と選択的に反応する抗体であってもよ い。

固体表面を必要とする上記のアッセイ構造及びその他のアッセイ構造に使用する のに適した固体表面は公知である。それらとして、ポリスチレン、ガラス、ポリ プロピレン、ポリエチレン、ナイロン、ポリアクリルアミド、アガロース、ラテ ックス、及び紙が挙げられる。固体表面はマイクロタイタ・プレートの壁部、バ イアルまたは試験管の内表面、ディツプストリップまたはラテックスビーズが挙 げられる。

その他の好ましいアッセイは競合アッセイである。このアッセイにおいて、アル コール中毒トランスフェリン同族体と選択的に反応する制限量の抗体か固体表面 に固定化される。好適な固体表面は上記のものである。そのアッセイを行うため に、体液及び表面成分が固定化抗体に同時に添加される。標識成分は制限量の抗 体に結合することにつき体液中のアルコール中毒トランスフェリン同族体と競合 する。標識成分は標識免疫原、例えば、ペプチド及びペプチド−キャリヤー（こ れらの調製は上記されている）であってもよい。好適な標識は上記の標識である 。固定化抗体に結合された標識成分の量は、体液中に存在するアルコール中毒ト ランスフェリン同族体の量に反比例する。

特定の濃度、インキュベーションの温度及び時間、並びにその他のアッセイ条件 は、試料中のアルコール中毒トランスフェリン同族体の濃度、試料の性質、等の 如き因子に応じて、どのようなイムノアッセイが使用されるかにより変化し得る 。当業者はルーチン実験により操作条件及び最適のアッセイ条件を決定できるで あろう。

また、本発明は、アルコール中毒トランスフェリン同族体を検出または定量化す るためのキットを含む。キットは、本発明のイムノアッセイを実施するのに有益 な試薬を保持する１個以上の容器の包装された組み合わせである。キットの試薬 に適した容器として、びん、バイアル、試験管及びマイクロタイタ・プレートが 挙げられる。

キットは、アルコール中毒トランスフェリン同族体と選択的に反応する抗体の容 器を含む。抗体は上記の抗体であり、それらがアルコール中毒トランスフェリン 同族体を検出または定量化するのに使用される場合には、それらは上記の標識で 標識されてもよい。抗体は溶液中にあってもよく、凍結乾燥されていてもよく、 または上記の固体表面の如き固体表面に結合されていてもよい。

アルコール中毒トランスフェリン同族体と選択的に反応する抗体が標識されない 場合には、キットはまた体液中に存在するアルコール中毒トランスフェリンイソ 型の量を検出または定量化するのに有益な標識成分の容器を含んでいてもよい。

この標識成分は全てのトランスフェリン同族体または標識免疫原と反応性である 標識抗体であってもよく、または蛍光偏光用のポリーＬ−リシンにカップリング された標識ペプチドであってもよい。

最後に、キットは、当業界で公知であり、かつ商用の観点及び使用者の観点から 望ましいその他の物質、例えば、緩衝剤、酵素基質、希釈剤、標準物質、等を含 んでいてもよい。また、キットは、イムノアッセイを実施するための試験管及び マイクロタイタ・プレートの如き容器を含んでいてもよい。

トランスフェリン以外の糖タンパク質はアルコール中毒者中でグルコシル化の変 化パターンを有し得ることが考えられる。こうして、本発明の原理は、アルコー ル中毒者中に見られるが、非アルコール中毒者中に見られないこれらのその他の 糖タンパク賃の同族体と選択的に反応する抗体を産生ずることに拡張できること 、かつこれらの抗体はこれらのその他の糖タンパク質のアルコール中毒同族体を 検出し、定量化するのに使用し得ることが考えられる。

更に、本発明の原理は、背景部分に説明された遺伝的症候群（これは炭水化物欠 乏血清糖タンパク質を特徴とする）に見られるトランスフェリン及びその他の糖 タンパク質同族体を検出し、定量化するのに拡張できることが考えられる。実際 に、アルコール中毒トランスフェリン同族体と選択的に反応する本明細書（こ記 載された抗体は、この症候群を患っているものに見られるトランスフェリン同族 体と選択的に反応し得るものと、おそらく考えられる。

背景部分に説明されたように、トランスフェリンのｐ［５，７及びｐ＋５．９の イ゛）型は部分膜シアリル化されていると一般に考えられていた。これらは、ア ルコール中毒で増大されるトランスフェリンイソ型である。また、ｐ１５．７及 びｐ１５．９のイソ型は同様に成る種のガラクトース部分及びＮ−アセチル−グ ルコサミン部分を欠いていることが示唆されていた。スチブラー及びボルグ著、 Ｊ．Ａｌｃｏｈｏｌ　Ｃｌｉｎ。

ＥＸＩ）、　Ｒｅｓ．　１０．　６１−６４．　１９８６。しかしながら、本発 明の前に、誰もが、完全な２アンテナ炭水化物鎖力快われているかもしれないと いう可能性を意図して０な力１った。

ｐ１５．７及びｐ１５．９のイソ型の一部が本発明の前に一般に考えられて０た よう（こガラクトース末端であった（即ち、脱シアリル化されていた）場合、ガ ラクトースを検出するアッセイが考案し得た。抗ヒトトランスフェリンを使用し て血清からトランスフェリンを捕捉し、ビオチン標識リシヌス・コムニス（Ｒｉ ｃｉｎｕｓ　ｃｏｍｍ−ｕｎｉｓ）Ｉ　（ＲＣＡ−１）レクチンを使用してガラ クトース末端部分を定量化するこのようなアッセイを開発しようとする努力がな された。このア・ソセイの幾つかの変形が試みられたが、６〜１５％のｐ１５． ７のイソ型を含むアルコール中毒血清とのＲＣＡ−　１反応性が実証し得なかっ た。しかしながら、そのアッセイ系は、トランスフェリンをノイラミニダーゼで 処理することにより調製された部分膜シアリル化トランスフェリン標準物質を正 確に定量化した。

それ故、実験を行ってアルコール中毒のｐ１５．７のイソ型と正常なｐ１５．４ のイソ型の化学的相違を更に直接に測定した。ｐ１５．７のイソ型をストレイら 著、ＣＬｉλＣｈｅｒＬ，　３１１９．　１５４３．　１９８５に記載されたモ ノーＰクロマトフオーカシングゲルカラム（ファーマシア社（Ｐｈａｒｍａｃｉ ａ．　Ｕｐｐｓａｌａ，　Ｓｗｅｄｅｎ））による多重運転によりアルコール中 毒者の血清から単離した。ｐ１５．７の両分を溜め、等電点電気泳動により少な くとも９０％のｐ１５．７のイソ型であることが示された。差別的酸加水分解を 、バーディ（Ｈａｒｄｙ．　Ｉｔ　Ｒ．　）、タウンセンド（Ｔｏｗｎｓｅｎｄ ．　Ｒ．　Ｉｔ　）及びりー（Ｌｅｅ．　Ｙ．　Ｃ．　）著、Ａｎａｌ．Ｂｉｏ ｃｈｅａ．１７０．　５４−６２．　１９８８に記載されたようにして精製画分 に対して行った。次に炭水化物組成分析をデイオネックス（Ｄｉｏｎｅｘ）ＬＣ 　（ＨＰＬＣ）系（デイオネ・ノクス社（Ｄｉｏｎｅｘ　Ｃａｒｐ．、　Ｓｕｎ ｎｖａｌｅ，　ＣＡ））で行った。結果はｐ１５．７のイソ型につき約２：４： ３のガラクトース二Ｎーアセチルグルコサミン：マンノースの比を示し、同じ比 がｐ１５．４のイソ型について得られた。しかしながら、ｐ１５．７のイソ型の 単位重量当たりの夫々の炭水化物の合計％はｐ１５．４のイソ型で得られた値の ほぼ半分であった。これらのデータに基いて、本発明者らは、アルコール中毒者 中のｐ１５、７のイソ型の殆どが二つの２アンテナオリゴ糖鎖の一つを欠いてい ると仮定した。

それは、これらの鎖の一つの不在下で、鎖が結合されているＡｓｎ残基（Ａｓｎ 　４１３またはＡｓｎ　６１１）の周囲のアミノ酸が露出されていることで理由 付けされた。それ故、２アンテナ鎖の一つが失われている場合に露出されるＡｓ ｎ　４１３及び６１１付近の領域に対して抗体を誘導するのに使用し得る免疫原 が設計された。

Ａ．ペプチド合成 ヒトトランスフェリン（ヤング、ラム、マツクギル、モーア、ナイラー、）くン ・ブラグト、ボウルドウイン及びボウマン著、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．、　８１．　２７５２−２７５６、　１９８４）のアミノ酸配列のアミ ノ酸４０５−４１７及び６０７−６１９に相当する２種のペプチドを合成した。

位置４１３及び６１１にあるＡｓｎ残基は通常グリコジル化されており、そして これらのＡｓｎ残基に結合された炭水化物路が存在しないか、または実質的に端 を切り取られていた場合には、これらの残基付近のアミノ酸が露出されるので、 これらのペプチド配列を選んだ。合成された２種のペプチドの配列を以下に示す 。

Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　 Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ［配列番号１］ このペプチドを本明細書中Ｐｉと称する。

Ｇｌｎ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｖａｔ　Ｔｈｒ　 Ａｓｐ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ［配列番号２］ このペプチドを本明細書中Ｐ２と称する。

Ｐｉペプチド及びＰ２ペプチドを、ターシャリ−ブチルオキシカルボニル（ＢＯ Ｃ）アミノ酸化学を使用してアプライド・バイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂ ｉｏｓｙｓｔｅｍ）の型式４３１Ａペプチド合成装置で合成した。保護基を液体 フッ化水素で除去した。

Ｂ、ペプチド接合 ペプチドを、以下のようにしてカルボジイミドを使用してウシ血清アルブミン（ ＢＳＡＸシグマ・ケミカル社（セントルイス、！＋１Ｏ））またはキーホールリ ンベットヘモシアニン（ＫＬＨ）　（シグマ・ケミカル社）にカップリングした 。蒸留水０．５ｍｌ中のペプチドＰＩまたはＰ２２ｍｇの溶液を蒸留水０．２ｍ ｌ中のＢＳＡまたはＫＬＨ２ｆｆ１ｇと混合した。カルボジイミド１０ｗ＋ｇを 添加し、その反応を室温で２時間進行させた。その後、反応混合物を４℃で蒸留 水に対して徹底的に透析した。ペプチドが蒸留水に置換された対照を、接合の程 度及び抗体の特異性の両方の評価のために入れた。

接合体、キャリヤータンパク質及びペプチドにっきＵＶスペクトル（２８０ｎ１ ｎ）を得、そして接合の程度を２３０ｎｍ及び２８０ｎｍにおける光学密度（Ｏ Ｄ）の比から計算してキャリヤータンパク質１モル当たりのペプチドのモル数を 得た。調製された接合体、カップリング剤として使用されたカルボジイミド及び キャリヤータンパク質１モル当たりのペプチドのモル数を表１に示す。

表１ キャリヤータンパク質１モル当たりの 接合体　カップリング剤　ペプチドのモル数ＰＩ−ＢＳＡ　ＥＤＣ’　１２ Ｐ２−ＢＳＡ　ＥＤＣ測定せず３ ＰＩ−ＢＳＡ　ＣＭＣ２２３ Ｐ２−ＢＳＡ　ＣＭＣ２５ 円、ｐ２−Ｋｉｕ　ＥＤＣ測定せず３ １、ＥＤｃ＝１−エチル−３−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（Ｈ ＣＩ）（ピアス・ケミカル社（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｒ ｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ））２、ＣＭＣ＝１−シクロへキシル−３−（２−モルホ リノエチル）カルボジイミド（メソ−ｐ−トルエンスルホネート塩）（ピアス・ ケミカル社）３、接合体の大部分が不溶性であったので、Ｐ２−ＢＳＡＪｔ並び にＰＩ−ＫＬＨ及びＰ２−ＫＬＨ比を測定しなかった。

実施例２：アルコール中毒トランスフェリン同族体に対するウサギポリクロ−雌 のニューシーラント白ウサギ（ラングシャウ・ファーム（Ｌａｎｇｓｈａｗ　Ｆ ａｒａ　Ａｕ−ｇｕｓｔａ、　ＧＡ、　ＵＳＡ）を最初にパイタカイチス（Ｖａ ｉ　ｔａｋａｉ　ｔｉｓ）らの方法（ＣＩ　ｉｎ、　Ｅｎｄｏ。

Ｍｅｔａｂ、、　３３．９８８．１９７１）により実施例１に記載されたように して調製されたＲＡＳに接合されたペプチドＰ　ｌ　（ＰＩ−ＢＳＡ）及びＢＡ Ｓ　１．：接合されたペプチドＰ　２　（Ｐ２−ＢＳＡ）夫々３００μｇを含む 完全フロインドアジュバント（ＣＦＡＸＩＣＮイムノバイオロジカルズ（ＩＣＮ 　１ｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｓ、　Ｌｉ５ｌｅ、　ＩＬ、　ＵＳＡ））からな るエマルション２ｍｌで免疫した。二つのその後の免疫化をＰＩ−ＢＳＡ及びＰ ２−ＢＳＡの夫々３００μｇを含む不完全フロインドアジュバント（ＩＦＡＸＩ ｃＮイムノバイオロジカルズ）のエマルション２ｍｌを使用して行った。これら のその後の免疫化を最初の免疫化の３週後及び５週後に行った。第三の注射の７ 日後にウサギをネレンベルト（Ｎｅｒｅｎｂｅｒｔ）らの方法（Ｊ、１ｍｍｕｎ ｏ１．Ｍｅｔｈ、、　２４．１９．１９７８）により耳から採血した（３０　ｍ ｌ）　。血清を下記の項目Ｆに記載されたようにして試験し、その後、更なる使 用の前に一２０℃で凍結して貯蔵した。

Ｂ、抗ヒトトランスフェリン−セファロースの調製ヒト血清（正常及びアルコー ル中毒）からのトランスフェリンをアフィニティー精製するために、抗ヒトトラ ンスフェリン（アキセル（ＡＸＥＬＬ）　、アキュレート・ケミカル＆サイエン ティフィック社（Ａｃｃｕｒａｔｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ＆５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ 　Ｃｏｒｐｏｒａｔ−ｉｏｎ、　Ｗｅｓｔｂｕｒｙ、　Ｎ、Ｙ、、　ＵＳＡ）） ４０ｍｇを、０．５ＭのＮａＣｌを含むＯ，ＩＭのＮａＨＣＯｓ（ｐｉ（８，３ ）■ のＣＮＢｒ−活性化セファロース４Ｂ（ファーマシア・ファイン・ケミカルズＡ Ｂ（Ｐｈａｒ−ｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ　ＡＢ、　Ｕｐｐｓ ａｌａ、　Ｓｗｅｄｅｎ））　（製造業者の指示により前洗浄した）２ｇに添加 することにより免疫吸着剤を調製した。その後、その混合物を４°Ｃで一夜にわ たる反転により混合した。次に免疫吸着剤を０．２Ｍのグリシン緩衝液（ｐＨ８ ，０）に移し、室温で２時間にわたる反転により混合した。その後、そのゲルを 、ａ）０．５Ｍの塩化ナトリウムを含む０．１Ｍの重炭酸ナトリウム（ｐＨ８， ０）　；及びｂ）０．５Ｍの塩化ナトリウムを含むＯ，ＩＭの酢酸ナトリウム（ ｐＨ４，０）で交互に洗浄した。次に、そのゲルをＰＢＳ（０，１５ＭのＮａＣ Ｉを含むＯ，ＯＩＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７，３）中に！濁させ、使 用前に０．０２％のＮａＮ　ｓの存在下で貯蔵した。

Ｃ，ヒトトランスフェリンの精製 ヒトトランスフェリンのアフィニティー精製を、上記のようにして調製された抗 トランスフェリンーセファロース４８３　ｍｌをバイオ−ラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ ）使い捨てポリプロピレン・エコノーカラム（パイオーラド・ラボラトリイズ（ Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏ−ｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｒｉｃｈｗ＋ｏｎｄ、　ＣＡ 、　ＵＳＡ））に入れることにより行った。その後、マトリックスをＰＢＳ　］ Ｏｍ！で洗浄した。洗浄したマトリックスをヒト血清（正常またはアルコール中 毒）１ｍｌと共に室温で２時間にわたって回転によりインキュベートした。

未結合物質を回収し、マトリックスをＰＢＳ　１０ｍ１、続いて２Ｍのヨウ化カ リウム２ｍｌ、次にＰＢＳ　ｌ０ｍ１で２回洗浄した。結合したトランスフェリ ンを、塩酸を添加してｐＨを２．３に調節した０、１Ｍのグリシン２ｍｌて溶離 した。溶離したトランスフェリンを直ちに中和し、４°Ｃて一夜にわたって水２ リットルに対し透析し、最後に凍結乾燥した。

Ｄ、アフィニティー精製されたトランスフェリンのノイラミニダーゼ処理上記の ようにしてアフィニティー精製されたトランスフェリンをノイラミニダーゼ（シ グマ・ケミカルズ社）によりその製造業者の指示に従って消化した。簡単に言え ば、２ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５，０）を含む水溶液合計３０μｍ中のトラ ンスフェリン２０μｇを３７°Ｃて１時間にわたってノイラミニダーゼ３０ミリ 単位と共にインキュベートした。その後、その製剤をスクリーニングアッセイ（ 以下を参照のこと）に使用した。

Ｅ、アフィニティー精製されたトランスフェリンのＮ−グリヵナーゼ処理トラン スフェリンをヒラニ（Ｈｉｒａｎｉ）らの方法（Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、 　１６２．４８５−９２゜１９８７）によりＮ−グリカナーゼで消化した。全容 積２５μｌの１５０−のリン酸ナトリウム（ｐＨ７，６）中０，５μｇ／ｕｌの 濃度のトランスフェリンを３７℃で１８時間にわたって１単位のＮ−グリカナー ゼと共にインキュベートした。その後、その製剤をスクリーニングアッセイ（以 下を参照のこと）に使用した。

Ｆ、ウサギ抗血清のスクリーニング ウサギ抗血清を、実施例３、パートＢに記載された方法を使用して下記の抗原に 対して試験した。ｌ）表１にリストされたペプチド接合体の全部、２）カルボジ イミドで処理されたＢＳＡ及びＫＬＨ，３）ＢＳＡ及びＫＬＨ（未処理）、４） ＰＩ及びＰ２．５）アフィニティー精製された正常なトランスフェリン及びアル コール中毒トランスフェリン、６）ノイラミニダーゼ処理されたアフィニティー 精製された正常なトランスフェリン及びアルコール中毒トランスフェリン、及び ７）Ｎ−グリカナーゼ処理されたアフィニティー精製された正常なトランスフェ リン及びアルコール中毒トランスフェリン。抗血清はペプチド接合体、キャリヤ ータンパク質並びにＰｉ及びＰ２に対して高い反応性を示した。また、それはＮ −グリカナーゼ処理されたトランスフェリンに対して反応性を示し、それはアフ ィニティー精製された正常なトランスフェリンに対するよりもアフィニティー精 製されたアルコール中毒トランスフェリンに対して大きな反応性を示した。従っ て、ウサギ抗血清のＩｇＧフラクションを更なる試験のために得た。

実施例３　アルコール中毒トランスフェリン及び正常なトランスフェリンに対“ γ結合ブレバック“プロティンＧカラム（ゲネソクス社（Ｇｅｎｅｘ　Ｃｏｒｐ ｏｒａｔｉｏｎ。

Ｇａｉｊｈｅｒｓｂｕｒｇ、　ＭＤ、　ＵＳＡ））を使用して、先の実施例に記 載されたようにして調製されたウサギ抗ｐｔ及びＰ２血清のＩｇＧフラクション を精製した。ウサギ抗血清１ｍｌを、０１１５ＭのＮａＣｌ　（結合緩衝液）を 含む０．ＯＩＭのリン酸塩緩衝液（ｐ）１６．０）で１・１に希釈し、プロティ ンＧカラムに装填したく１ｍ１Ｚ分）。次にカラムを結合緩衝液１０ｍ１で洗浄 した。Ｏ，１，ＭのグリシンＨＣｌ　（ｐＨ３，０）　４　ｍｌを使用して溶離 を行った。

ＩｇＧを含む溶離画分を回収し、Ｏ，１５ＭのＮａＣｌを含む０．１Ｍのリン酸 ナトリウム緩衝液、Ｉ）Ｈ９，２で直接中和し、その後ＰＢＳ（０，１５ＭのＮ ａＣｌを含む０．ＯＩＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐ）１７．３）に対して透 析した。続いて、ウサギ抗体の精製１ｇＧフラクションの一部をケンダール（Ｋ ｅｎｄａｌ　ｌ）らの方法（Ｊ、Ｉａｎｕｎｏｌ、Ｍｅｊｈ、、　５６：３２９ ．１９８３）に従ってビオチンで標識した。

Ｂ　ウサギ抗体のＩｇＧフラクションのアンセイポリスチレンのマイクロタイタ ・プレート（イムノロン（ｌｒ＋＋ｎｕｎｏｌｏ口）２、コーク−エンジニアリ ング社（Ｃｏｏｋｅ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｃｏ、、　Ａｌｅｘａｎｄｒｉ ａ、　ＶＡ、　ＵＳＡ）のウェルを、Ｏ，１Ｍの重炭酸ナトリウム（ｐＨ９，０ ）中のヒトトランスフェリンペプチドＰＩ及びＰ２（先の項目に記載された製剤 ）に特異的なウサギ抗体の標識されていないＩｇＧフラクションの５Ｍｇ／ｕ＋ ｌ溶液１００μｌを夫々のウェルに添加し、プレートを３７℃で２時間インキュ ベートすることにより被覆した。未結合の抗体をデカントにより除去し、残って いるポリスチレンのタンパク質結合部位を、ウェルをＰＢＳ中の卵白アルブミン の１％溶液で満たすことによりブロックした。その後、ウェルをＰＢＳて３回洗 浄した。

次に、ＰＢＳ中のアフィニティー精製されたトランスフェリン（正常またはアル コール中毒）（実施例２に記載されたようにして調製）　２ｏ／１ｇ／ｍｔの溶 液１００μｌ／ウエルを夫々のウェルに添加し、４℃で一部インキユベートした 。その後、ウェルをＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳ中の１６５００に希釈されたホ ースラデイッンユペルオキソダーゼで標識されたヒトトランスフェリンのヒツジ 抗体（バイオデザイン・インターナショナル（Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ　Ｉｎｔｅｒ ｎａｔｉｏｎａｌ、　Ｋｅｎｎｅｂｕｎｋｐｏｒｔ、　ＭＥ、　ＵＳＡ））１０ ０μｍを添加し、プレートを３７℃で２時間インキュベートした。着色反応を室 温で２０分間にわたって基質緩衝液（０，１ＭのＮａＪＰＯｔ　、０．０５Ｍの クエン酸塩−水和物、ｐＨ５，０，０，０１５％の過酸化水素）中の基質０−フ ェニレンジアミン−２８Ｃ１（ＯＰＤ）　０．８　ｍｇ／ｍｌで発生させた。そ の後、その反応を２Ｎの硫酸５０μｌの添加により停止し、４９２ｒ＋ｍにおけ る吸光度をタイターチク・マルチスキャン（Ｔｉｔｅｒｔｅｋ　Ｍ−ｕｌｔｉｓ ｋａｎＸフロー・ラボラトリイズ（Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｍ ｃＣｌｅａｎ、　ＶＡ、　ＬＩＳＡ））で読み取った。

対照ウェルを、成るウェルが吸着抗体を有しておらず（吸着抗体を含まない対照 ）、成るウェルがトランスフェリンを有しておらず（抗原を含まない対照）、ま た成るウェルが吸着抗体を有しておらず、また抗原を有していない（基質対照） こと以外は、上記と同じ方法で巽製した。これらの対照を使用して抗原と標識抗 体の非特異的結合及び非酵素的基質加水分解に関する読み取り値を修正した。こ のアッセイの結果を表２に示す。

トランスフェリン　アルコール中毒／　００　（４９２ｎｍ）原−−−一一一一 −−ｊ坊１−−−−−−−−−ｍ−−−−Ｈａ　アルコール中毒　０．２２７ Ｎ１　アルコール中毒　０．５４８ Ｒｏ　アルコール中毒　０．４９９ ＢＬ　アルコール中毒　０．１３４ ＡＴ−１アルコール中毒　０．２７７ ＡＴ−２アルコール中毒　０．１６０ ４９　アルコール中毒　０．０７７ ３８　アルコール中毒　０．０９９ ４７　アルコール中毒　０．１６＋ １６　アルコール中毒　０．１４３ ８　アルコール中毒　０．１２６ １７　アルコール中毒　０．２２１ ４５　アルコール中毒　０．１３４ ４８　アルコール中毒　０．１３９ Ｓｉ　正常　０．０８４ Ｍ■　正常　０．０６３ ＢＡ　正常　０．０５６ 致−−−一一二響Ｈｏ、工り一 等しいか、または等しくないと仮定された変数を用し）る２試料［−検定（こよ るデータ（アルコール中毒トランスフェリン対正常なトランスフェリン）の統計 分析は、トランスフェリンペプチドＰ１及びＰ２のウサギ抗体のＩｇＧフラクシ ョンとアルコール中毒トランスフエ１ル対正常なトランスフェリンの反応性（ご つきく０．００１のｐ値を生した。平均と標準偏差は正常なトランス７１１１２ につき０．５１±０、０３５であり、アルコール中毒トランスフェリン（ごつき ０．２８２−＝０．３２０てあつｔこ。

アルコール中毒トランスフェリンに関する１４の値のうちのわずかに二つが正常 なトランスフェリンの平均＋２標準偏差の範囲内に入った。それ故、トランスフ ェリンペプチドＰＩ及びＰ２のウサギ抗体は正常なトランスフェリンに対するよ りもアルコール中毒トランスフェリンに対してかなり大きい反応性を示すことが 結論された。

実施例４：アフィニティー精製されたトランスフェリンへの抗トランスフェリン ペプチドＰＩ及びＰ２抗体のビオチン標識１ｇＧフラクションの結合アルコール 中毒血清及び正常な血清からのアフィニティー精製されたトランスフェリン（実 施例２に記載されたようにして調製）　（４００ｎｇ）を３７℃で２時間にわた ってＯ，１Ｍの重炭酸ナトリウム（ｐＨ９，０）中５μｇ／ｍｌのタンパク質の 濃度でマイクロフロア−（Ｍｉｃｒｏｆ　１ｕｏｒ）“Ｂ”ブラックポリスチレ ンマイクロタイタ・プレート（ダイナチック・ラボラトリイズ（Ｄｙｎａｔｅｃ ｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ａｌｅｘａｎｄｒｉａ、　ＶＡ、ＵＳＡ）） のウェルに吸着させた。結合されなかった抗原をデカントにより除去した。残り のポリスチレンタンパク質−結合部位を、ウェルをＰＢＳ中のフィッシュスキン ゼラチン（シグマ・ケミカル社）の１＝４５希釈液で満たし、プレートを３７℃ で１時間インキュベートすることによりブロックした。その後、マイクロタイタ ・ウェルをＰＢＳで３回洗浄し、１：ｌＯＯに希釈されたビオチンで標識したウ サギ抗トランスフェリンペプチドＰｌ及びＰ２のＩｇＧフラクション（実施例３ に記載されたようにして調製）１００μｌをウェルに添加し、３７°Ｃで２時間 インキュベートした。

ＰＢＳで３回洗浄した後、１％のＢＳＡを含むＰＢＳ中にｌ：２０００に希釈さ れたストレプトアビノン−β−ガラクトシダーゼ（ベセスダ・リサーチ・ラボラ トリイズ（Ｂｅ−ｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ 、　Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、　ＭＤ、　ＵＳＡ））１００μｌをプレート■ 添加し、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄した 後、０、１Ｍの塩化ナトリウム及び１ｍＭの二塩化マグネシウムを含む０．０１ Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，５）中の４−メチル−ウンベリフェリル −β−Ｄ−ガラクトピラノシドの０．１Ｍｇ／ｍｌの溶液１００μｌをマイクロ タイタ・プレートのウェルに添加した。メチル−ウンベリフェロンの蛍光を、３ ６５ｎｍの励起波長及び４５０ｎｍの発光波長を使用して相対蛍光単位（ＲＦＵ ）として測定した。

対照ウェルを、成るウェルが吸着抗原を有しておらず（抗原を含まない対照）、 成るウェルが一次抗体（ウサギ抗トランスフェリンＩｇＧ）を有しておらず（− 次抗体を含まない対照）、成るウェルが抗原または一次抗体を有しておらず（ス トレプトアビジン−β〜ガラクトシダーゼ対照）、成るウェルが抗原、−次抗体 及びストレプトアビジン−β−ガラクトシダーゼを有していない（基質対照）こ と以外は、上記と同じ方法で調製した。抗原を含まない対照及び−次抗体を含ま ない対照またはストレプトアビジン−β−ガラクトシダーゼ対照は、抗体及び標 識試薬の非特異的結合に関する読み取り値を修正するのに利用でき、一方、基質 対照は非酵素的基質加水分解につき修正した。

結果を表３に示す。

ＧＧ−１アルコール中毒　１４３ ＯＬ　アルコール中毒　３０７ ■　アルコール中毒　５６３ ＭＤ　アルコール中毒　２６３ ＧＧ−２アルコール中毒　７０８ ＣＤ７／ｌ／：ｌ−ル中毒１．０７８ 油　アルコール中毒　７５６ ＧＲアルコール中毒　９０８ ＡＴ−１アルコール中毒　９４１ ＡＴ−２アルコール中毒　７３２ ＢＬ　アルコール中毒　１２５ ＳＣ正常　８７ ＢＡ　正常　２１６ ５Ｍ　正常　３１ ＭＹ　正常　〇 アルコール中毒トランスフェリンに関する平均と標準偏差は５９３±３２０であ り、正常なトランスフェリンに関して８４±８３であった。二つの平均の有意差 の推定のｔ−検定は＜ｏ、　ｏｏｉのｐ値を生じた。１１のアルコール中毒値の うちの二つが正常な平均＋２標準偏差の合計の下にあった。正常値のうちの一つ が比較的高がったが、正常値＋２標準偏差の合計を越えなかった。トランスフェ リンペプチドＰ１及びＰ２に対して産生されたウサギ抗血清はアルコール中毒血 清からのトランスフェリン製剤に対して特異性を有する抗体集団を有することが 結論された。

Ｂａ１ｂ／ｃマウス（スプラギュウーダウレイ社（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅ ｙ　Ｉｎｃ、、Ｉｎｄｉａｎａｐｏ−１ｉｓ、ＩＮ、　ＵＳＡ））を、パイタカ イチスらの方法（ＣＩｉｎ、Ｅｎｄｏ、Ｍｅｔａｂ、、　３３．９８８．１９７ １）を使用して免疫した。最初に、夫々生後６週のマウスに円−ＫＬＨ及びＰ２ −ＫＬＨ（実施例１に記載されたようにして調製）夫々２０μｇを含むＣＦＡか らなるエマル７ョン０、１　ｍｌを腹腔的注射した。続いて、マウスを、Ｐ１〜 ＫＬＨ及びＰ２−ＫＬＨ夫々１５μｇを含むＩＦＡのエマル７ョン０．１ｍｌで 免疫した。その後５回の免疫化を最初の注射後に合計６回の注射につき３０日間 隔で行った。

３回目及び６回目の注射の後にマウスがら採血し、ウサギ抗血清につき実施例２ 、項目Ｆに記載された幾つかの抗原に対して血清を試験した。予想されるように 、全ての抗血清がペプチド−接合体及びキャリヤータンパク質に対し高い反応性 を示した。２匹のマウスはＰ２に対し高い反応性を示したが、ＰＬに対し反応性 を示さなかった。１匹のマウスはＮ−グリヵナーゼ処理トランスフェリンに対し 反応性を示し、すべての抗血清がアルコール中毒トランスフェリン対正常なトラ ンスフェリンとのそれらの反応性の相違を明らかにした。

ハイブリドーマをＮ−グリヵナーゼ処理トランスフェリンと反応性の１匹のマウ スから産生した。融合の４日前に、マウスにアフィニティー精製されたアルコー ル中毒トランスフェリン２０μｇ及び精製されたアルコール中毒のｐＨ５，７の イソ型（実施例Ｉに記載されたようにして調製）６０Ｍｇを静脈内注射した。

Ｂ、ハイブリドーマの産生 免疫されたＢａ１ｂ／ｃマウスからの膵臓の単一の細胞懸濁液を、膵臓を２枚の 無菌ガラススライドの間て圧潰し、細胞を、１％のＦＣＡ　、ペニシリン（１０ ０単位／ｍ１）、ストレプトマイシン（１００４ｇ／ｍｌ）及びグルタミニ／（ ０，０３％）（全てギブ：１（Ｇｉｂｃｏ。

Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ、　ＮＹ、　Ｌｉ５Ａ）から入手した）を補給した培 地（ＨＬＩ培地、ｚ７ドトロニクス（Ｅｎｄｏｔｒｏｎｉｃｓ、　Ｃｏｏｎ　Ｒ ａｐｉｄｓ、　ＭＮ、　ＵＳＡ）から入手し得る）中で再懸濁させることにより 調製した。その後、５　Ｋ　１０’個の膵臓細胞を、コーラ−（Ｋｏｈｌｅｒ、 　Ｇ、　）及びミルスティン（Ｍｉｌｓｊｅｉｎ、Ｃ，）の方法（Ｎａｔｕｒｅ 、　２５６．４９５．１９７５）に従ってポリエチレングリコール１ｍｌと共に ２．５　ｘ　１０’個のＨＬＩ−６５３７ウス骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ。

Ｂｅｔｈｅｓｄａ、　’ＭＤ、　ＵＳＡ）と共にインキュベートし、ペレットに し、融合させた。ハイブリッド細胞をＨＡＴ培地（ヒボキサンチン、アミノプテ リン及びチミジン）及びＭＴ培地（アデノシン、アミノプテリン及びチミジン） による増殖により選択した。ハイブリドーマ培養物を、安定な細胞系が得られる まで限界希釈法によりクローン化した。ハイブリドーマ培養上澄みを下記の項目 Ｃに記載されたようにしてスクリーニングした。

Ｃ，ハイブリドーマのスクリーニング ハイブリドーマにより産生されたモノクローナル抗体を、ビオチン標識モノクロ ーナル抗体を使用するのではなく、アルカリホスファターゼ標識ヤギ抗マウスＩ ｇＧ　＋ＩｇＭ抗体を使用して結合モノクローナル抗体を検出した以外は、実施 例４の方法を使用して、Ｐ２並びにアルコール中毒血清及び正常な血清からのア フィニティー精製されたトランスフェリンに対してスクリーニングした。

簡単に言えば、ポリスチレンマイクロタイタ・プレートのウェルを、０．０５Ｍ の炭酸塩緩衝液（ｐＨ９，６）中の８００ｎｇ／ウェルのペプチドＰ２または４ ００ｎｇ／ウェルのアルコール中毒血清または正常な血清からのアフィニティー 精製されたトランスフェリンで一夜にわたって被覆した。洗浄後に、ウェルを室 温で３０分間にわたって１％のＢＳＡ−ＰＢＳ溶液と共にインキュベートするこ とにより裏面被覆した。次に、ハイフリドーマクローンの培養上澄み１００μｌ をウェルに添加し、プレートを４℃で１６時間インキュベートした。０．５％の トウィーン（Ｔｗｅｅｎ）２０（シグマ・ケミカル社）を含むＰＢＳで３回洗浄 した後、アルカリホスファターゼ標識抗マウス＋ｇｃ＋ＩｇＭ試薬（アメリカン ・クアレックス（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｑｕａｌｅｘ、　ＬａＭａｒｉｎｄａ、　 ＣＡ、ＵＳＡ））からのカタｏ／ｆＮｏ、　Ａ１０８ＡＮ）　（７）ｌ：１００ ０希釈液１００μｌをウニ／１４．−添加し、プレートを室温で６０分間インキ ュベー１化た。ＰＢＳで３回洗浄した後、５．３ｇ／ｌの　Ｎａ＋ＣＯｓ　ｍＭ 　、　０．４ｇハのＭｇＣ１，’６８２０及び２ｇ／ｌのＮａＮ、（ｐＨ９，５ ）からなる基質緩衝液中のＩμｇ／ｍｌのホスファターゼ基質溶液（シグマ社か らのシグマ１０４）１００μｍをプレートに添加した。次に、プレートを室温で ６０分間インキュベートした。その後、動的マイクロプレート・リーダー（モレ キュラー・デバイシイズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅ−ｖｉｃｅｓ、　Ｍｅｎｌ ｏ　Ｐａｒｋ、　ＣＡ、　ＵＳＡ））を使用して４０５ｎｍにおけるＯＤを読み 取った。結果を表４に示す。

青± 下記の物質に対するＯＤ　４０５’スクリ一ニング群　クローンの数　ペプチド Ｐ２”　アルコール中毒　正常なトランスフェリン３　トランスフェリン３１　 ２　０．１３８−１．１１６　０．３１２−０．４０４　０．０３３−０．０７ ０２　９　０．２９７−２．３７７　０．３１９−０．９４０　０．２６６−０ ．７８５３　３　０．０５４−０．１３５　０．０５０−０．０７２　０．２５ ３−０．２７８４　３　０．２７４−０．３５６　０．０５７−０．０８６　０ ．０２４−０．０９５１．００４０５＝４０５ｎｍにおける００．３０分間で生 成されたｐ−ニトロフェノール生成物の読み取り値 ２、　これらのハイブリドーマを産生ずるのに使用したマウスは、ペプチド単独 が抗原標的としてポリスチレンウェルに吸着された場合に、ペプチド２のみと反 応し、ペプチドｌには反応しなかった。

３、　実施例２に記載された抗トランスフェリンアフィニティーカラムを使用し てアルコール中毒トランスフェリン及び正常なトランスフェリンをアフィニティ ー精製した。

群１は、ペプチドＰ２及びアルコール中毒トランスフェリンと反応性であるが、 正常なトランスフェリンと反応性ではない抗体を産生ずるクローンを含む。４Ｃ ９クローンはこの群の２種のクローンのうちの一種である。ベーリンガー・マン ハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎ口ｈｅｉｍ）から人手し得るマウスイソ タイピングキットを使用するイソタイピングは、４Ｃ９クローンが１西抗体を産 生ずることを示した。

群２は、全ての３種の抗原標的（ペプチドＰ２並びにアルコール中毒トランスフ ェリン及び正常なトランスフェリン）と反応するクローンを含む。

群３は、正常なトランスフェリンのみと明らかに反応するクローンを含む。

群４は、ペプチドＰ２のみと反応するクローンを含む。

実施例６４Ｃ９モノクローナル抗体とアルコール中毒トランスフェリン、正常な トランスフェリン、ノイラミニダーゼ処理トランスフェリン及びＮ−グリカナー ゼ処理トランスフェリンの反応性 アフィニティー精製されたアルコール中毒トランスフェリン及び正常なトランス フェリン、ノイラミニダーゼ処理トランスフェリン並びにＮ−グリカナーゼ処理 トランスフェリンに対する４Ｃ９モノクローナル抗体の反応性を、実施例５に記 載されたようにして試験した。そうするために、マイクロタイタ・プレートのウ ェルを夫々の抗原４００ｎｇで被覆し、そのアッセイの残りを実施例５に記載さ れたようにして行った。結果を表５に示す。

表ニ トランスフェリン１、源、　ＯＤ 処理　（４０５ｎｍ）　２ ＪＭ”　、禁酒のアルコール中毒者　０．００９ＪＭ、禁酒のアルコール中毒者 、　−０，０１３’ノイラミニダーゼ ＪＭ、禁酒のアルコール中毒者、　０．５６１Ｎ−グリカナーゼ ＡＴ−１、アルコール中毒者　０．１２４ＲＦ、アルコール中毒者　０．０３４ ＪＭ−２、アルコール中毒者　０．０２３ＮＧ、アルコール中毒者　０．１１５ ＡＴ−２、アルコール中毒者　０．０２６ＨＨ、アルコール中毒者　０．０２９ ＪＷ、アルコール中毒者　０．０３５ ＰＢ、正常者　−０，００４ ペプチドＰ　２　０．５７６ １、トランスフェリンを実施例２に記載されたようにしてアフィニティー単離し た。

２、　４０５ｎｍにおける光学密度は、アルカリホスファターゼ酵素の作用によ る生成物生成（ｐ−ニトロフェノール）の読み取り値である。モノクローナル抗 体の非特異的吸着力司１かれた。

３、　個々の誘導トランスフェリンの頭文字（コード）４、　負のＯＤ読み取り 値は、非特異的モノクローナル抗体結合に関する対照が実験値よりも大きかった ことを示す。

表５が示すように、４Ｃ９モノクローナル抗体は脱グリコジル化された（Ｎ−グ リカナーゼ処理された）トランスフェリン及び既知のアルコール中毒血清からの アフィニティー精製されたトランスフェリンと反応する。それは正常な血清また は禁酒家の血清と殆ど反応しない。ＪＭは、血清標本が得られる前に３週間にわ たって禁酒したアルコール中毒患者であったことに注目されたい。また、４Ｃ９ 抗体は脱シアリル化された（ノイラミニダーゼ処理された）トランスフェリンと 反応しない。

４Ｃ９がアルコール中毒と関連していると従来技術により示されたｐｌイソ型と 反応するか否かを決定するために予備実験を行った。そうするために、等電点電 気泳動を、４〜８のｐＨ勾配を使用して表５にリストされたトランスフェリン製 剤につき行った。二つのバンド（ｐｌ　５．７−５．８及び６．１−６．２）は アルコール中毒トランスフェリン製剤の特徴であることがわかったが、バンドの 一つ（ｐＩ　５．７−５．８）は未処理の正常なトランスフェリン製剤中に見ら れた。等電点電気泳動の結果を上記のイムノアッセイの結果と比較し、そのイム ノアッセイにおける４Ｃ９の活性とｐｌ５゜７−５．８のバンド及び６．１−６ ．２のバンドの強さとのおよその関係を示した。その相関関係がわずかに近似す るという事実は、ｐｌ　５．７−５．８のバンド及び６．１−６．２のバンドが おそらく非アルコール中毒トランスフェリン同族体を含むこと、及びアルコール 中毒トランスフェリン同族体がおそらくその他のｐ１バンド中に見られることを 示す。

実施例７：アルコール中毒患者及び正常な患者からのトランスフェリン製剤に対 する４Ｃ９モノクローナル抗体の反応性マイクロタイタ・プレートウェルに吸着 されたアフィニティー精製されたアルコール中毒トランスフェリン及び正常なト ランスフェリンのｌμｇ（４００ｎｇではない）を使用して実施例６を繰り返し た。また、トランスフェリン製剤を、全てのトランスフェリン（アルコール中毒 及び正常）と反応するモノクローナル抗体ＩＣ比並びにモノクローナル抗体４Ｃ ９と反応させた。光学密度を非特異的結合につトランスフェリン　ＯＤ　４０５ ｎｍ　００４０５ｎｍ製剤　４Ｃ９（抗アルコール中毒　１ｃＩＩトランスフエ リン）（抗トランスフェリン）ＡＴ−１、アルコール中毒　０．４３１　０．１ ６９ＭＤ、アルコール中毒　０．０９２　０．１７７ＣＤ、アルコール中毒　０ ．１５９　０．１６１ＯＬ、アルコール中毒　０．０７０　０．１７１１（Ｈ、 アルコール中毒　０．１０８　０．１５７ＧＡ、正常　０．００４　０．１１０ Ｍ１．正常　Ｑ、　０１５　０．１１９ＪＥ、正常　０．００９　０．１５７ ＪＡ、正常　０．００４　０．１５９ ３１、正常　０．００２　０．１４３ ４Ｃ９抗体と正常なトランスフェリンの反応性は殆ど検出されなかった。４Ｃ９ とアルコール中毒トランスフェリンの反応性は明らかであり、正常な血清からア フィニティー精製されたトランスフェリンとの反応性よりもかなり高かった。Ｉ ＣＩＩ抗体はアルコール中毒トランスフェリン及び正常なトランスフェリンと実 質的に同様に反応し、これはほぼ同じ量のトランスフェリン（アルコール中毒及 び正常）がポリスチレンマイクロタイタ・プレートウェルに吸着されたことを示 す。正常なトランスフェリン及びアルコール中毒トランスフェリンとの４Ｃ９抗 体の反応性の平均と標準偏差は夫々０．００６８±０．００４７及びＱ、　１７ ２±０．１３２であった。これらの相違の有意差に関する平均の統計上の比較は ＜０．０５のｐ値を生じた。五つのアルコール中毒トランスフェリン値のいずれ もが、正常な平均＋２標準偏差の合計よりも小さくなかった。

４Ｃ９がアルコール中毒と関連していると従来技術により示されたｐ＋イソ型と 反応するか否かを決定するために予備実験を行った。そうするために、等電点電 気泳動を、４〜８のｐＨ勾配を使用して表６にリストされたアルコール中毒トラ ンスフェリン製剤及び正常なトランスフェリン製剤につき行った。先の実施例の ように、イムノアッセイの結果はｐ１５．７−５．８のバンド及び６．１−６． ２のバンドの強さに関するおよその関係を示した。その相関関係がわずかに近似 するという事実は、ｐｉ　５．７−５．８のバンド及び６．１−６．２のバンド がおそらく非アルコール中毒トランスフェリン同族体を含むこと、及びアルコー ル中毒トランスフェリン同族体がおそらくその他のｐ１バンド中に見られること を示す。

（１）一般情報。

（ｉ）出願人：マクロラフ（Ｍａｋｈｉｏｕｆ、　Ｓａｍａｒ）（ｉ）出願人： パンコラ（Ｐａｎｋｏｗ、　Ｍａｒｋ　Ｌ、）（ｉ）出願人、アンダーソン（Ａ ｎｄｅｒｓｏｎ、　Ｂｙｒｏｎ　Ｅ、）（ｉ）出願人：ビーン（Ｂｅａｎ、　Ｐ ａｍｅｌａ）（ｉｉ）発明の名称：アルコール中毒者を同定し、アルコール消費 を監視するためのイムノアッセイ （ｉｉｉ）配列の数＝２ （ｉｖ）通信住所： （Ａ）受取人：ウィリアン・ブリフクス・オールズ・ホファー・ギルソン＆リオ ーネ（Ｗｉｌｌｉａｎ　Ｂｒ１ｎｋｓ　０１ｄｓ　Ｈｏｆｅｒ　Ｇ１１ｓｏｎ　 ＆Ｌｉｏｎｅ）（Ｂ）通り・Ｐ、０．ボックス１０３９５（Ｃ）都市ニジカゴ （Ｄ）州：イリノイ （Ｅ）国：米国 （Ｆ）郵便番号：　６０６１０ （Ｖ）コンピュータ読み取り可能形態：（Ａ）媒体型：ディスケット、５．２５ インチ、３６０Ｋｂ記憶（Ｂ）コンピュータ：　ＩＢＭ　ＸＴコンパチブル（Ｃ ）操作システム：ＭＳ−ＤＯ３ （Ｄ）ソフトウエア：ワードパーフェクト（ＷｏｒｄＰｅｒｆｅｃｔ）５．１（ ｖｉ）現在の出願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願臼：　１９９２年９月２５日（ｖｉｉ）先行出願データ： （Ａ）出願番号：　ＵＳ　０７／７６５．１６９（Ｂ）出願臼：　１９９１年９ 月２５日（ｖｉｉｉ）弁理士の情報： （Ａ）名称：クローク（Ｃｒｏｏｋ、　Ｗａｎｎｅｌｌ　Ｉｔ）（Ｂ）登録番号 ：　３１０７＋ （Ｃ）参照／明細書番号：　２５４５／４４（ｉｘ）電話連絡情報。

（Ａ）電話：　（３１２）３２１−４２２９（Ｂ）テレファックス：　（３１２ ）３２１−４２９９（２）配列番号ｌに関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１３のアミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （ｘｉ）配列の記載：配列番号ｌ： Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　 Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ（２）配列番号２に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ、１３のアミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （ｘｉ）配列の記載：配列番号２：　”Ｇｉｎ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｇｌ ｙ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｖａｔ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙフロン トページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，Ｓ　識別記号　庁内整理番号Ｃ０７Ｋ　１５／２８ 　ＺＮＡ　８３１８−４ＨＣ１２Ｎ　５／１８ ＧＯＩＮ　３３１５３　Ｄ　８３１０−２Ｊ／／　Ｃ１２Ｎ　１５１０６ （Ｃ１２Ｐ　２１１０８ Ｃ１２Ｒ１：９１） （８１）指定回　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ （ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、　ＭＲ， ＳＮ、　ＴＤ、　ＴＧ）、　ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　 ＣＨ，Ｃ３゜ＤＥ、ＤＫ、ＥＳ、ＦＩ、ＧＢ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、ＫＲ，ＬＫ、 　ＬＵ、　ＭＧ、　ＭＮ、　ＭＷ、　ＮＬ、　ＮＯ，ＰＬ、ＲＯ，ＲＵ、ＳＤ、 ５Ｅ （７１）出願人　ビーン　パメラ アメリカ合衆国　カリフォルニア州 ９００３１　ロサンゼルス　モンテシト　ドライヴ　１０７６ ＦＩ （７２）発明者　マクローフ　サーマルアメリカ合衆国　イリノイ州　６０６４ ６　シカゴ　ノース　ハイアウォーザ　６４３６（７２）発明者　バンコウ　マ ーク　エルアメリカ合衆国　イリノイ州　６０６１４　シカゴ　１　ノース　セ ミナリ−２１０６（７２）発明者　アンダーソン　バイロン　イーアメリカ合衆 国　イリノイ州　６００５３　モートン　グローブ　リーバ５８０１ （７２）発明者　ビーン　パメラ アメリカ合衆国　カリフォルニア州 ９００３１　ロサンゼルス　モンテシト　ドライヴ　１０７６

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. １．アルコール中毒者中に見られるが、非アルコール中毒者中に見られないトラ ンスフェリン同族体と選択的に反応する抗体。
2. ２．モノクローナル抗体である請求の範囲第１項に記載の抗体。
3. ３．マウス骨髄腫細胞を、夫々免疫原キャリヤーに接合された下記の２種のペプ チドの一つまたは両方で免疫されたマウスからの脾臓細胞と融合することにより 調製されたハイブリドーマにより産生される請求の範囲第２項に記載のモノクロ ーナル抗体。 【配列があります】〔配列番号１］ 【配列があります】［配列番号２］
4. ４．ＩｇＭクラスのマウスモノクローナル抗体である請求の範囲第３項に記載の モノクローナル抗体。
5. ５．ポリクローナル抗体である請求の範囲第１項に記載の抗体。
6. ６．夫々免疫原キャリヤーに接合された下記の２種のペプチドの一つまたは両方 で免疫されたウサギにより産生される請求の範囲第５項に記載のポリクローナル 抗体。 【配列があります】［配列番号１］ 【配列があります】［配列番号２］
7. ７．アルコール中毒者中に見られるが、非アルコール中毒者中に見られないトラ ンスフェリン同族体と選択的に反応するモノクローナル抗体を産生するハイブリ ドーマ。
8. ８．マウス骨髄腫細胞を、夫々免疫原キャリヤーに接合された下記の２種のペプ チドの一つまたは両方で免疫されたマウスからの脾臓細胞と融合することにより 調製された請求の範囲第７項に記載のハイブリドーマ。 【配列があります】［配列番号１］ 【配列があります】［配列番号２］
9. ９．ＩｇＭクラスのマウスモノクローナル抗体を産生する請求の範囲第８項に記 載のハイブリドーマ。
10. １０．アルコール中毒者中に見られるが、非アルコール中毒者中に見られないト ランスフェリン同族体と選択的に反応する抗体の産生方法であって、その方法が 動物を所望の抗体を誘導するのに充分なアルコール中毒トランスフェリン同族体 、またはその部分を含む免疫原で免疫することを特徴とする抗体の産生方法。
11. １１．動物を、夫々免疫原キャリヤーに接合された下記の２種のペプチドの一つ または両方で免疫する請求の範囲第１０項に記載の方法。 【配列があります】［配列番号１］ 【配列があります】［配列番号２］
12. １２．アルコール中毒者中に見られるが、非アルコール中毒者中に見られないト ランスフェリン同族体と選択的に反応するモノクローナル抗体の産生方法であっ て、その方法が、 ａ）動物を所望の抗体を誘導するのに充分なアルコール中毒トランスフェリン同 族体、またはその部分を含む免疫原で免疫し、ｂ）免疫された動物からの免疫グ ロブリン産生細胞を不死細胞と融合し、ｃ）アルコール中毒トランスフェリン同 族体と選択的に反応する抗体を産生するハイブリドーマを選択することを特徴と するモノクローナル抗体の産生方法。
13. １３．ｄ）選択されたハイブリドーマ細胞を培地中で培養し、そしてｅ）抗体を 培地から回収することを更に含む請求の範囲第１２項に記載の方法。
14. １４．ｄ）腹水を生じる腫瘍の生成を生じるように選択されたハイブリドーマ細 胞を動物に注射し、そして ｅ）抗体を腹水から回収することを更に含む請求の範囲第１２項に記載の方法。
15. １５．動物を、夫々免疫原キャリヤーに接合された下記の２種のペプチドの一つ または両方で免疫する請求の範囲第１２項に記載の方法。 【配列があります】［配列番号１］ 【配列があります】［配列番号２］
16. １６．不死細胞がマウス骨髄腫細胞であり、かつマウス骨髄腫細胞を夫々免疫原 キャリヤーに接合された２種のペプチドの一つまたは両方で免疫されたマウスか らの脾臓細胞と融合する請求の範囲第１５項に記載の方法。
17. １７．ハイブリドーマがＩｇＭクラスのマウスモノクローナル抗体を産生する請 求の範囲第１６項に記載の方法。
18. １８．トランスフェリンを含む体液の試料を用意し、その試料を、アルコール中 毒者中に見られるが、非アルコール中毒者中に見られないトランスフェリン同族 体と選択的に反応する抗体と接触させ、そして試料中に存在するアルコール中毒 トランスフェリン同族体のいずれかを検出または定量化することを特徴とするイ ムノアッセイ。
19. １９．体液が血清である請求の範囲第１８項に記載のイムノアッセイ。
20. ２０．抗体を固体表面に付着する請求の範囲第１８項に記載のイムノアッセイ。
21. ２１．抗体を標識する請求の範囲第１８項に記載のイムノアッセイ。
22. ２２．アルコール中毒者中に見られるが、非アルコール中毒者中に見られないト ランスフェリン同族体と選択的に反応する抗体の容器を含むことを特徴とするイ ムノアッセイを行うためのキット。