CN101985474B

CN101985474B - 抗结核杆菌cfp-10单克隆抗体tbca6及应用

Info

Publication number: CN101985474B
Application number: CN2010105047275A
Authority: CN
Inventors: 姚航平; 卢洪洲
Original assignee: SHANGHAI PUBLIC HEALTH CLINICAL CENTER; Zhejiang University ZJU
Current assignee: SHANGHAI PUBLIC HEALTH CLINICAL CENTER; Zhejiang University ZJU
Priority date: 2010-10-12
Filing date: 2010-10-12
Publication date: 2011-11-09
Anticipated expiration: 2030-10-12
Also published as: CN101985474A

Abstract

本发明提供一种抗结核分枝杆菌培养滤液蛋白10的单克隆抗体，经特异的抗原肽免疫小鼠，收集致敏的小鼠B淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合，利用酶联免疫吸附试验和免疫印迹检测法判定阳性克隆，建立分泌抗结核分枝杆菌培养滤液蛋白10单克隆抗体的杂交瘤细胞系TBCA6，把阳性的细胞扩增培养并注射至同品系的小鼠腹腔诱导产生含抗体的腹水，经过收集与抗体亲和纯化，获得抗结核分枝杆菌培养滤液蛋白10的单克隆抗体。本发明提供的单克隆抗体在结核分枝杆菌培养滤液蛋白10检测及定量分析中应用。

Description

抗结核杆菌CFP-10单克隆抗体TBCA6及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及抗结核分枝杆菌培养滤液蛋白10(CFP-10)的单克隆抗体的制备及应用，是利用细胞工程、抗体工程技术，获得分泌抗CFP-10的单克隆抗体的杂交瘤细胞系，通过同品系的小鼠诱导腹水，制备抗CFP-10的单克隆抗体TBCA6，鉴定为IgG1、κ型，再通过亲和纯化、电泳、免疫等技术实现对该抗体的应用。

背景技术

结核早期诊断技术是一直困扰医学诊断领域的一个重要难题。20世纪，因抗生素研究的发展和广泛应用，人类曾成功地控制了结核病。但是，由于抗药性不断出现与积累，结核分枝杆菌对于21世纪的人类依然是一个现实威胁。更严重的是，近年来，全球人类免疫缺陷病毒(HIV)和艾滋病(AIDS)的流行已成为全球结核病发病率及死亡率第三次回升的主要原因，同时结核病也是AIDS病人最常见的机会感染和致死病因。结核病和艾滋病并发的趋势，使得治疗难上加难。诊断是治疗的前提，如果能够早期诊断，结核病的危害会大幅度减小。中国作为结核菌高感染率地区和HIV感染的快速增长地区，提高结核病及HIV/AIDS合并结核感染的早期准确诊断水平刻不容缓。

传统的早期诊断手段是结核菌素皮试。这是基于迟发型超敏反应原理的一种皮肤试验。但是两个缺陷使得这种诊断方法的意义非常有限。其一：该方法不能区分曾经感染过结核杆菌的健康者与结核杆菌正在活动的发病者；其二：该方法不能区分结核杆菌的感染者与卡介苗的注射者。所以，传统的早期诊断方法只能提供非常有限的参考信息，确诊往往要等到病人出现结核病灶之后。而这时候再做治疗已经晚了，特别是对耐药结核杆菌，病人预后很差。

ELISPOT技术带来了结核病早期诊断的革命。其一，由于ELISPOT方法采用结核分枝杆菌特异性的多肽，可以避免卡介苗注射者的交叉反应；其二，由于ELISPOT检测的是病人当时的细胞免疫水平，可以有效区别健康的TB携菌者与发病的TB活动病人。但是ELISPOT检测步骤繁琐，需要特殊仪器设备且试剂昂贵，在多数低收入的结核高负担国家和地区较难推广。

发展一种快速、灵敏的结核早期诊断方法已迫在眉睫。基于以上背景，本项目选定目前公认的结核分枝杆菌特异抗原蛋白CFP-10为靶抗原，利用现代生物信息学和分子生物学技术，设计并合成几段候选的CFP-10特异的抗原肽序列，采用融合杂交瘤技术建立稳定分泌抗结核分枝杆菌特异抗原蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系，并大量制备、纯化和鉴定这些单克隆抗体。譥单克隆抗体的成功获得，为建立新型的结核病诊断方法——基于免疫学技术的诊断奠定物质基础。同时对疾病发病机理、诊断、预后及疗效判定等方面的研究起到重要作用。

本发明用到杂交瘤细胞技术。该技术将免疫小鼠的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，以建立分泌均质抗体的杂交瘤细胞系，也称为单克隆抗体技术。该技术涉及到动物免疫、细胞培养、细胞融合、细胞克隆培养和免疫测定等一系列方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种抗结核分枝杆菌培养滤液蛋白10(CFP-10)的单克隆抗体，具有SEQ No.1的氨基酸序列：Ala Ala Val Val Arg Phe Gln Glu AlaAla Asn Lys Gln Lys。该单克隆抗体亚型为IgG1、κ型，命名为杂交瘤细胞株TBCA6，能特异性识别结核分枝杆菌培养滤液蛋白10(CFP-10)的aa 53-66AAVVRFQEAANKQK抗原肽序列。抗结核分枝杆菌培养滤液蛋白10(CFP-10)单克隆抗体杂交瘤细胞已由中国典型培养物保藏中心保藏；地址：中国武汉武汉大学；保藏日期：2010年8月17日；保藏编号为：CCTCC NO.C201083。

本发明的第二个目的提供抗CFP-10单克隆抗体的制备方法，通过以下步骤和技术方案实现：

(1)动物的免疫：选择6周龄的BALB/C小鼠，以抗原肽(CFP-10的第53-66位氨基酸，14肽AAVVRFQEAANKQK)对小鼠进行免疫。14肽AAVVRFQEAANKQK通过固相法合成，在美国ABI公司的多肽合成仪(431A)上进行，采用Fmoc(9-芴甲氧羰基)方案，合成步骤按照ABI公司的多肽合成操作手册进行。经高效液相色谱纯化，纯度＞95％，序列鉴定通过质谱分析。

(2)小鼠骨髓瘤细胞的培养：培养小鼠骨髓瘤细胞SP2/0并使之保持良好的生长状态用于细胞融合。

(3)细胞融合：采用聚乙二醇融合法。以BALB/C小鼠腹腔巨噬细胞作为饲

细胞，在融合前一天，接种BALB/C小鼠腹腔巨噬细胞于96孔培养板，含20％FCS的HAT培养基培养一天。取(1)中小鼠的脾脏淋巴细胞和(2)中的小鼠骨髓瘤细胞，将上述两种细胞混合离心，然后以聚乙二醇(PEG 6000)介导细胞融合，融合后的细胞适当稀释，接种至饲养细胞培养板，适当条件培养。

(4)杂交瘤细胞的筛选：将上述培养物在HAT选择性培养基中培养。在细胞集落长到大小合适时，吸取细胞培养上清液做抗体鉴定，筛选阳性克隆。

(5)杂交瘤细胞的克隆化：以有限稀释法克隆杂交瘤细胞，将稀释到一定密度的细胞接种至96孔板，使每孔只有一个细胞生长。形成细胞集落的孔取培养上清液做酶联免疫吸附实验(ELISA)，鉴定阳性克隆。重复有限稀释克隆若干次，直到杂交瘤细胞的阳性孔率达到100％。将克隆化后的杂交瘤细胞扩大培养做抗体鉴定及理化性状分析。

(6)单抗腹水的诱导：在接种杂交瘤细胞前一周，给BALB/C小鼠腹腔注射降植烷每只0.5ml，然后每只接种5×10⁶阳性杂交瘤细胞，10天后收集腹水离心，测定抗体效价，并纯化单克隆抗体。

(7)单克隆抗体的纯化：利用Protein G亲和纯化法纯化腹水中的单克隆抗体。

(8)本发明得到一个产生抗CFP-10单克隆抗体的杂交瘤细胞系，即TBCA6，TBCA6杂交瘤细胞系经3次克隆化，持续培养六月余，分泌抗体稳定。该细胞株经液氮冻存，复苏后生长良好，抗体分泌未见衰退。ELISA间接法测得TBCA6培养上清效价为1∶128，腹水效价分别为1∶16384。经单克隆抗体免疫球蛋白亚型分析显示该杂交瘤细胞产生的抗体类型为IgG1。TBCA6已在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏号是：CCTCC No.C201083。

本发明提供产生单克隆抗体的杂交瘤细胞，它是由免疫的BALB/c小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞SP2/0经融合、筛选、克隆、传代和反复冻存、复苏后获得的小鼠杂交瘤细胞系TBCA6，能稳定分泌抗CFP-10的单克隆抗体TBCA6。

本发明的另一个目的是提供该单克隆抗体TBCA6在结核分枝杆菌培养滤液蛋白10检测和样本中的CFP-10蛋白的表达水平进行定性和定量中的应用，通过下述途径实现：

①以单克隆抗体TBCA6为探针，用SDS-PAGE电泳通过免疫印迹方法(Western Blot)方法，对结核杆菌及其培养物、各种体液样本、基因重组及人工合成样本中的CFP-10蛋白的情况进行鉴定。

②以单克隆抗体TBCA6为结合抗体，用免疫沉淀方法来鉴定上①所述试验样本中CFP-10的表达。

③以单克隆抗体TBCA6作为包被抗体或检测抗体，通过酶联免疫吸附试验(ELISA)对结核杆菌培养物、各种体液样本、基因重组及人工合成样本中的CFP-10蛋白的表达水平进行定性和定量分析。

本发明的优点在于提供了一种抗结核分枝杆菌特异抗原CFP-10的单克隆抗体，尚未见文献报道。制备方法简单易行，更为重要的是该方法制备的单克隆抗体可以有多种用途，如对临床和实验室的结核分枝杆菌的细菌培养物、结核分枝杆菌、临床体液样本、基因重组蛋白中CFP-10分子表达情况进行定性和定量分析，以及各种研究用途。

说明书附图

图1为单克隆抗体TBCA6的免疫球蛋白亚型分析。

图2采用免疫沉淀和Western-blot方法检测重组ESAT-6/CFP-10融合蛋白、结核分枝杆菌和其它分枝杆菌及其培养上清液等样本中CFP-10蛋白的表达。

图3用单抗作为包被抗体，重组ESAT-6/CFP-10融合蛋白作为标准抗原的酶联免疫吸附试验标准反应曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1.抗CFP-10的单克隆抗体的制备方法

(1)小鼠的免疫：首次免疫，将交联KLH的CFP-10的14肽(序列aa 53-66AAVVRFQEAANKQK)以弗氏完全佐剂乳化，第2、3次以不完全佐剂乳化，每BALB/C小鼠0.2ml(含CFP-10抗原肽200μg)，背部皮内多点注射，每两周一次。6周后加强免疫一次，于3天后进行细胞融合。

(2)小鼠骨髓瘤细胞SP2/0的培养：把来自BALB/C小鼠的SP2/0骨髓瘤细胞株以含10％FBS-DMEM培养基培养传代，在含5％CO₂饱和湿度的37℃孵箱中培养。融合前一天传代以保证融合时细胞进入对数生长期。

(3)细胞融合：以BALB/C小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞，在融合前一天，接种BALB/C小鼠腹腔巨噬细胞于96孔培养板，含20％FCS的HAT培养基培养一天，次日取脾脏，置200目不锈钢筛网中，剔除脂肪和结缔组织，撕开包膜，分离脾细胞，离心洗涤细胞1～2次后用培养液重悬。收集小鼠SP2/0骨髓瘤细胞，离心，洗涤2次后用培养液重悬，作为待融合的SP2/0细胞。以1.0×10⁸个免疫小鼠脾淋巴细胞与1.0×10⁷个小鼠骨髓瘤细胞SP2/0混合，在50％PEG6000作用下融合。两种细胞混合后洗涤一次，离心弃上清，轻弹管壁悬开细胞(勿加液体)用37℃预温的50％PEG6000(pH 8.0)0.8ml于60～90秒内逐滴加入细胞沉淀中，其间轻轻振摇离心管，但勿吹打，静置1分钟，然后按先慢后快的原则，于第1分钟内加完1ml无血清RPMI 1640，于第2分钟内加完2ml无血清RPMI 1640，于第3分钟内加完7ml无血清RPMI 1640，以后1分钟内逐渐加入37℃预温的无血清RPMI1640培养基30～40ml。800转/分钟低速离心5～10分钟。然后加入20％FCS HAT培养基，分别接种到加有饲养细胞的96孔培养板，一般每次融合的细胞铺4块板，置37℃5％CO₂孵箱中培养。

(4)杂交瘤细胞的筛选：每隔4天换1/2培养液(HAT)一次，10天后改用含HT培养液。融合后的杂交瘤细胞在含HT的选择性培养液中大约持续培养两周。在细胞集落长到适当大小时(在10倍物镜下观察，细胞克隆大小以占满一个视野为宜)，吸取培养液上清，适当稀释后做ELISA，筛选阳性克隆。采用ELISA间接法筛选阳性杂交瘤克隆。主要步骤：①0.01M pH9.6碳酸盐缓冲液稀释ESAT-6/CFP-10重组融合蛋白，以及合成的CFP-10特异多肽，浓度200ng/ml，分别于96孔酶标板加入0.1ml/孔包板，4℃过夜；②0.01MpH7.4PBS-Tween 20洗板三次；③用2％BSA-0.01M pH 7.2的PBS封闭1小时；④同上洗板；⑤加入1∶5稀释的杂交瘤培养上清，0.1ml/孔，同时设阳性对照(免疫小鼠的血清)、阴性对照(SP2/0培养上清液)和空白对照，室温反应2小时；⑥洗板；⑦加1∶5000稀释的羊抗小鼠Ig(G+M)-HRP，0.1ml/孔，室温反应1小时；⑧洗板；⑨加入底物(TMB)室温避光反应5～10分钟；⑩2M H₂SO4终止反应；450nm测定其OD值，以P/N≥2.1为阳性。

(5)杂交瘤细胞的克隆化：杂交瘤细胞的克隆化培养按有限稀释法进行，选择抗体检测阳性(ESAT-6/CFP-10重组融合蛋白和合成的CFP-10特异多肽均阳性)的杂交瘤孔细胞作适当增殖后，准确计数细胞。用完全1640培养基稀释成10个/ml的细胞悬液接种到已有饲养细胞的96孔培养板中，每孔0.1ml，7-10天后观察细胞生长情况，并检测上清液中抗体水平，选择5个抗体滴度最高的，呈单个克隆细胞生长的培养孔，作再次克隆化培养。此方法可重复多次，直至单克隆孔抗体检测阳性率为100％。

(6)诱生腹水：在接种杂交瘤细胞前一周，给BALB/C小鼠腹腔注射降植烷每只0.5ml，然后每只接种5.0×10⁶阳性杂交瘤细胞，10天后收集腹水测定抗体效价。

(7)单克隆抗体的纯化：采用亲和纯化法(Protein G交联的Sepharose)纯化腹水中单克隆抗体。①腹水用冷Binding Buffer(结合缓冲液)稀释3倍后，于4℃10000rpm离心15分钟去除沉淀物。②将预装有Sepharose-Protein G的亲和纯化柱用10倍柱床体积的Binding Buffer充分流洗。③将稀释的腹水上柱，控制流速8～10滴/分钟。④将流穿的腹水重复上柱一次。⑤用20倍柱床体积的Binding Buffer充分洗涤，直至流穿液A280吸光值小于0.01。⑥用ElutionBuffer(洗脱缓冲液)洗脱结合的单克隆抗体，控制流速8～10滴/分钟，收集洗脱液于预加有0.1ml的磷酸钾缓冲液(PH7.9，0.5M)的收集管中，每管收集0.5ml含抗体的洗脱液，共收集20管以上。⑦于A280nm检测每管洗脱液的吸光度，并收集吸光值大于0.2的洗脱液。⑧将收集的洗脱液置于透析卡中，并于0.1M PH7.0的PBS中透析。每隔6小时换液一次，共透析24小时。⑨将透析后的抗体溶液稀释(1∶100)后，于280nm测蛋白含量。⑩将纯化的抗体分装于小管中，置于低温冰箱备用。

(8)单克隆抗体的亚型鉴定：采用Serotec公司的小鼠单克隆抗体免疫球蛋白分型试剂盒分析。将纯化的单抗作适当稀释后进行检测，操作严格按试剂盒说明书进行。试验结果为TBCA6杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体为IgG1、κ型，具有SEQ No.1的氨基酸序列：Ala Ala Val Val Arg Phe Gln Glu Ala Ala Asn Lys GlnLys。命名为杂交瘤细胞株TBCA6，能特异性识别结核分枝杆菌培养滤液蛋白10(CFP-10)的aa 53-66AAVVRFQEAANKQK抗原肽序列。该抗结核分枝杆菌培养滤液蛋白10(CFP-10)单克隆抗体杂交瘤细胞已由中国典型培养物保藏中心保藏；地址：中国武汉武汉大学；保藏日期：2010年8月17日；保藏编号为：CCTCC NO.C201083。

结果参见附图1。

实施例2.用该单克隆抗体进行CFP-10的鉴定(定性)检测

本发明制备的抗CFP-10单克隆抗体可以用来鉴定的(定性检测)，鉴定方法可以通过下述两种方法实现：

1.免疫印迹法Western Blotting：重组CFP-10和ESAT-6/CFP-10融合蛋白以及结核分枝杆菌全蛋白裂解液用该单抗进行Western Blotting检测，在相应位置呈现目的条带，表明检测到CFP-10蛋白的表达。具体步骤：

(1)SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳：方法参见F.奥斯伯等《精编分子生物学实验指南》(科学出版社1998)。采用15％分离胶和5％浓缩胶，电泳条件为电压150V，溴酚蓝染料带距离胶底边1.5厘米左右终止电泳。

(2)电转移：方法参见F.奥斯伯等《精编分子生物学实验指南》(科学出版社1998)。用电转移方式将其转移至PVDF(0.22μm)膜上。

(3)免疫印迹：电转膜结束后，膜在5％脱脂奶粉封闭液中室温封闭1小时后，用本发明制备的单抗TBCA6作为一抗，室温孵育2小时或4℃反应过夜，用TBST(TBS加入0.5％Tween-20)洗涤3次，每次10min。以辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG作为二抗，室温反应2h，用上述方法洗涤后用ECL作用1min，于全自动化学发光成像仪(Bio-Rad VersaDoc 5000MP)曝光成像。

2.免疫沉淀法(IP)：将重组CFP-10和ESAT-6/CFP-10融合蛋白、结核分枝杆菌全蛋白裂解液、结核分枝杆菌培养上清液、临床结核病人结核性胸水与该单抗进行免疫沉淀反应，后经western-blot检测，在相应位置呈现目的条带，表明检测到CFP-10蛋白的表达。具体步骤：

①取1ug的重组蛋白或100ug结核分枝杆菌裂解蛋白，500ul结核分枝杆菌培养上清液或临床结核病人结核性胸水加纯化的1ug抗CFP-10单克隆抗体TBCA6，4℃缓慢摇动2小时；再加入20微升充分重悬的Protein G Agarose，4℃缓慢摇动过夜。

②2500rpm离心5分钟，小心吸除上清，注意不能吸掉Protein G Agarose。

③用0.5-1毫升TBST洗涤沉淀5次。

④完成最后一次洗涤后，去除上清，加入40微升1X SDS-PAGE电泳上样缓冲液重悬沉淀，瞬时高速离心把样品离心至管底。

⑤100℃或沸水浴处理3-5分钟，取部分样品用于SDS-PAGE电泳，暂时不用的样品-20℃保存。

⑥电泳结束后，将蛋白转移至PVDF膜。

⑦转膜结束后，将膜置于5％脱脂奶粉封闭液，室温封闭1小时。

⑧加兔抗CFP-10多抗，室温反应2小时。

⑨洗膜4次后加抗兔IgG-HRP，室温反应1小时。

⑩洗膜4次后ECL显色，VersaDoc 5000全自动化学发光成像仪曝光成像。

结果参见附图2，其中M：蛋白分子量Marker(15％SDS-PAGE)，1.ESAT-6/CFP-10重组融合蛋白，2.CFP-10重组蛋白，3.结核分枝杆菌培养上清液，4.结核性胸水，5.鸟胞内分枝杆菌裂解蛋白，6.堪萨斯分枝杆菌裂解蛋白，7.结核分枝杆菌裂解蛋白。

实施例3用该单克隆抗体进行CFP-10分子的定量检测

本发明制备的抗CFP-10单克隆抗体可以用来定量检测重组CFP-10和ESAT-6/CFP-10融合蛋白、结核分枝杆菌培养上清液、各种临床体液样本中结核特异抗原CFP-10水平，检测方法可以通过下述两种方法实现：

1.间接ELISA法：

①将检测样本适当稀释于0.01M pH9.6碳酸盐缓冲液包被液中，同时将重组的CFP-10和ESAT-6/CFP-10融合蛋白适当系列浓度稀释在包被液中，作为定量标准品对照。在对应的酶标板孔中加入上述各待测样本和系列浓度的标准品100ul，室温孵育2h或4℃包被过夜。

②倒空液体并拍干残留液体，用0.01M pH7.4PBS-Tween 20洗液洗板三次。

③用2％BSA-0.01M pH 7.2的PBS封闭1小时。

④同上洗板3次。

⑤加入适当稀释的抗CFP-10单克隆抗体TBCA6，0.1ml/孔，室温反应2小时。

⑥同上洗板3次后，加羊抗小鼠IgG-HRP，0.1ml/孔，室温反应1小时。

⑦用洗涤液浸泡板5min后，同上洗板4次后，加入底物(TMB)室温避光反应5～10分钟。

⑧2M H₂SO4终止反应，450nm测定其OD值。

⑨绘制标准反应曲线，根据标准曲线求的待测样本中CFP-10的表达水平。

2.夹心ELISA法：

①包被：用包被缓冲液将单克隆抗体TBCA6稀释至1μg/mL。在酶标板反应孔中加0.1mL/孔，4℃过夜。次日弃去孔内溶液，用0.01M pH7.4PBS-Tween 20洗涤缓冲液洗板3次，每次3min。

②封闭：用2％BSA-0.01M pH 7.2的PBS室温封闭1小时。

③加样：加适当稀释的待检样品和系列浓度稀释的重组CFP-10标准品0.1mL/孔于上述已包被的反应孔中，置湿盒中室温反应2小时。

④洗板：用洗涤缓冲液洗板3次，每次3min。

⑤加二抗：加入适当稀释的抗CFP-10另一单克隆抗体TBCD6(IgM型，针对CFP-10不同靶位)或兔抗CFP-10多抗，0.1ml/孔，室温反应2小时。

⑥加酶联物：同上洗板3次后，加羊抗小鼠IgM-HRP或抗兔IgG-HRP，0.1ml/孔，室温反应1小时。

⑦显色：同上洗板4次后，加入底物(TMB)室温避光反应5～10分钟。

⑧终止、读板：2M H₂SO4终止反应，450nm测定其OD值。

⑨标准曲线及计算：以标准品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，生成标准曲线和直线回归方程式，根据标准反应曲线求的待测样本中CFP-10的表达含量。

结果参见附图3和表1。

表1ELISA法检测临床体液样本中CFP-10的阳性率及其在结核诊断中的应用

样本分类	例数	CFP-10阳性检出数
			结核分枝杆菌培养上清液	38	30
非结核分枝杆菌培养上清液	20	2
			临床诊断的结核性胸水	32	25
临床诊断的非结核性胸水	24	2
			健康人血清	20	1

利用CFP-10单抗建立的ELISA法对临床样本进行测试，在结核诊断中其敏感性达78.6％，特异性达92.2％。

应理解，本发明是结合最佳实施例进行描述的，然而在阅读了本发明的上述内容后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种抗结核分枝杆菌培养滤液蛋白10的单克隆抗体TBCA6，该单克隆抗体亚型为IgGl、κ型，能与结核分枝杆菌培养滤液蛋白10特异结合，由保藏号为CCTCC No.C201083的杂交瘤产生。

2.根据权利要求1所述的抗结核分枝杆菌培养滤液蛋白10的单克隆抗体TBCA6在制备结核分枝杆菌培养滤液蛋白10检测试剂中的应用。

3.根据权利要求1所述的抗结核分枝杆菌培养滤液蛋白10的单克隆抗体TBCA6在制备结核分枝杆菌培养滤液蛋白10定量分析试剂中的应用。