CN104884617A - 抗folr1抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明针对人FOLR1表达细胞相关的疾病提供特异性识别并结合人FOLR1的氨基酸序列或其空间结构、并且抗体依赖性细胞毒活性(ADCC活性)等效应活性高的抗人FOLR1抗体。本发明能够提供特异性识别并结合人FOLR1的氨基酸序列或其空间结构并且具有ADCC活性和CDC活性的单克隆抗体或该抗体片段、编码该抗体的DNA、含有该DNA的载体、导入该载体而得到的转化体、使用该转化体的该抗体或该抗体片段的制造方法、以该抗体或该抗体片段作为有效成分的治疗剂和诊断剂。

Description

抗FOLR1抗体
技术领域
本发明涉及与叶酸盐受体α(Folate receptor α，以下记作FOLR1)结合并发挥抗体依赖性细胞毒活性(antibody-dependent cellularcytotoxicity，以下记作ADCC活性)和/或补体依赖性细胞毒活性(Complement-Dependent Cytotoxicity，以下记作CDC活性)的单克隆抗体或该抗体片段、编码该抗体或该抗体片段的DNA、含有该DNA的载体、导入该载体而得到的转化体、使用该转化体的该抗体或该抗体片段的制造方法、以该抗体或该抗体片段作为有效成分的治疗剂和诊断剂。
背景技术
FOLR1是对叶酸具有高亲和性的GPI锚定型的膜蛋白，对细胞的增殖、存活具有重要的功能(非专利文献1)。在正常组织中，FOLR1局限于肾、肺、肠等进行表达(非专利文献2)。
另外，FOLR1的表达部位在管腔侧。另一方面，癌组织中的FOLR1表达不局限于管腔侧，在卵巢癌(非专利文献2、非专利文献3、非专利文献4)、肾癌(非专利文献2)、肺癌(非专利文献2、非专利文献3)、乳腺癌(非专利文献2)、间皮瘤(非专利文献4)等大量癌种中进行高表达。
特别是报道了：在卵巢癌中，FOLR1表达量对恶性程度、发展、预后产生影响(非专利文献5、非专利文献6)。此外还已知，卵巢癌患者的血清中含有的可溶型FOLR1与健康人相比显著增加(非专利文献7)。可见，FOLR1是被期待作为癌症治疗靶标的分子。
作为抗FOLR1的小鼠单克隆抗体，已知LK26(专利文献1)。对于该LK26而言，为了作为癌症治疗抗体对患者进行给用，进行了利用CDR移植法的人源化(专利文献2)。但是，观察到伴随人源化而产生的显著的亲和性降低。
因此，Ebel等人以人源化LK26抗体为基础，制作了具有与LK26抗体同等的对FOLR1的亲和性的MORAb-003抗体(非专利文献8)。认为MORAb-003的体外抗肿瘤活性基于ADCC活性和CDC活性。
但报道了：MORAb-003不具有抑制叶酸、5-甲基四氢叶酸(5-MTHF)或培美曲塞与FOLR1阳性细胞结合的活性，使用单一抗体时也不具有抑制FOLR1阳性细胞的增殖的活性(非专利文献9)。
关于MORAb-003，在给用12.5mg/m2至400mg/m2的一期临床试验中，报道了安全性和容许性(非专利文献10)。此外，在以铂敏感性复发卵巢癌患者为对象的二期临床试验中，报道了：通过将紫杉醇和卡铂与MORAb-003联用，显示出优良的抗肿瘤活性。
但是，针对铂耐受性复发卵巢癌患者的临床试验在中间分析中被认为达不到在统计学上预先设定的评价项目(无增恶存活时间、总存活时间)的改善目标的可能性高，从而将其中止。
作为以FOLR1为癌症治疗靶标的药剂，除了上述抗体以外，还可以列举例如在叶酸中接合有抗癌剂的EC-145等。在叶酸中接合有抗癌剂的药剂基于FOLR1摄入叶酸的性质而表现出药效。因此认为，对于在叶酸中接合有抗癌剂的药剂而言，即使体内的癌细胞表达FOLR1，对叶酸摄入活性低的癌细胞也无效。
针对固体瘤的治疗方法和预后的改善日新月异。但是，关于卵巢癌，在二十世纪八十年代出现利用铂制剂的治疗方法以后，不能说预后得到了显著改善(非专利文献11)，依然是由妇科癌症引起的死亡的主要原因。认为其理由在于，卵巢癌会产生铂制剂的抗药性而复发，结果，治疗变得困难。
即，延长从利用铂制剂等化学疗法的奏效至复发的时间、阻止卵巢癌对铂制剂产生抗药性、建立治疗对铂制剂产生了抗药性的卵巢癌的方法已成为卵巢癌治疗的课题。
另外，卵巢癌容易伴有因腹膜接种引起的腹水的积存，对于铂耐受性卵巢癌而言，伴随腹水的积存而产生的QOL(Quality of Life，生活质量)的降低特别成为问题，因此，要求不仅对原发病灶的癌细胞有效、而且对腹膜接种、腹水中存在的癌细胞也有效的治疗剂。
此外，要求对即使FOLR1高表达、叶酸摄入活性也降低的癌细胞也有效的治疗剂。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：欧洲专利申请公开第0197435号说明书
专利文献2：美国专利第5952484号说明书
非专利文献
非专利文献1：Int J Cancer,2006.119(2):p.243-50.
非专利文献2：Anal Biochem,2005.338(2):p.284-93.
非专利文献3：J Thorac Oncol,2012.7(5):p.833-840.
非专利文献4：J Thorac Cardiovasc Surg,2001.121(2):p.225-33.
非专利文献5：Int J Cancer,1997.74(2):p.193-8.
非专利文献6：Int J Cancer,1998.79(2):p.121-6.
非专利文献7：PLoS One,2009.4(7):p.e6292.
非专利文献8：Cancer Immun,2007.7:p.6.
非专利文献9：Cancer Chemother Pharmacol,2012.70(1):p.113-20.
非专利文献10：Clin Cancer Res,2010.16(21):p.5288-95.
非专利文献11：Nat Rev Cancer,2011.11(10):p.719-25.
发明内容
发明所要解决的问题
抗体的ADCC活性和/或CDC活性得到了飞跃性提高的抗FOLR1抗体被期待作为以难以治疗的铂耐受性卵巢癌为首的、特征在于FOLR1在癌细胞中表达的癌症的治疗抗体。
本发明提供即使对来源于铂耐受性卵巢癌的细胞株在体外和体内也显示出抗肿瘤活性的抗体或该抗体片段。此外，本发明提供编码该抗体或该抗体片段的DNA、含有该DNA的载体、导入该载体而得到的转化体、使用该转化体的该抗体或该抗体片段的制造方法、以该抗体或该抗体片段作为有效成分的治疗剂和诊断剂。
用于解决问题的方法
本发明的主旨如下。
(1)一种单克隆抗体或该抗体片段，其与选自下述(a)～(c)中的一种抗体竞争地特异性识别人FOLR1并结合于与上述抗体所结合的人FOLR1上存在的表位相同的表位，并且显示出抗肿瘤活性，
(a)包含互补决定区(complementarity determining region，以下记作CDR)1～3分别含有序列号30、31、32表示的氨基酸序列的抗体的重链(以下记作H链)且包含CDR1～3分别含有序列号33、34、35表示的氨基酸序列的抗体的轻链(以下记作L链)的抗体，
(b)包含CDR1～3分别含有序列号30、31、32表示的氨基酸序列的抗体的H链且包含CDR1～3分别含有序列号33、34、35表示的氨基酸序列的抗体的L链的抗体，序列号32(抗体H链的CDR3)表示的氨基酸序列中的半胱氨酸被取代成苏氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸或谷氨酰胺的抗体，
(c)包含含有序列号98表示的氨基酸序列的抗体的H链且包含含有序列号94表示的氨基酸序列的抗体的L链的抗体。
(2)如(1)所述的单克隆抗体或该抗体片段，其为基因重组抗体。
(3)如(2)所述的单克隆抗体或该抗体片段，其为选自人嵌合抗体、人源化抗体和人抗体中的基因重组抗体。
(4)选自下述(a)～(c)中的一种单克隆抗体或该抗体片段，
(a)包含CDR1～3分别含有序列号30、31、32表示的氨基酸序列的抗体的H链且包含CDR1～3分别含有序列号33、34、35表示的氨基酸序列的抗体的L链的单克隆抗体和该抗体片段，
(b)包含CDR1～3分别含有序列号30、31、32表示的氨基酸序列的抗体的H链且包含CDR1～3分别含有序列号33、34、35表示的氨基酸序列的抗体的L链的抗体，序列号32(抗体H链的CDR3)表示的氨基酸序列中的半胱氨酸被取代成苏氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸或谷氨酰胺的抗体，
(c)包含含有序列号98表示的氨基酸序列的抗体的H链且包含含有序列号94表示的氨基酸序列的抗体的L链的抗体。
(5)如(1)～(4)中任一项所述的单克隆抗体和该抗体片段，其与序列号1表示的人FOLR1的氨基酸序列结合。
(6)如(1)～(4)中任一项所述的抗体片段，其为选自Fab、Fab’、F(ab’)2、单链抗体(scFv)、二聚体化V区(双价抗体)、二硫键稳定的V区(dsFv)和包含CDR的肽中的抗体片段。
(7)一种DNA，其编码(1)～(4)中任一项所述的单克隆抗体或该抗体片段。
(8)一种重组载体，其含有(7)所述的DNA。
(9)一种转化株，其通过将(8)所述的重组载体导入宿主细胞中而获得。
(10)(1)～(4)中任一项所述的单克隆抗体或该抗体片段的制造方法，其特征在于，将(9)所述的转化株在培养基中进行培养，在培养物中生成并蓄积(1)或(4)所述的单克隆抗体或该抗体片段，并从培养物中收集该抗体或该抗体片段。
(11)一种人FOLR1阳性细胞相关的疾病的治疗方法，其包括给用(1)～(4)中任一项所述的单克隆抗体或该抗体片段。
(12)一种人FOLR1阳性细胞相关的疾病的治疗剂，其包含(1)～(4)中任一项所述的单克隆抗体或该抗体片段和药理学上容许的载体。
(13)一种人FOLR1或人FOLR1阳性细胞的免疫学检测或测定方法，其使用(1)～(4)中任一项所述的单克隆抗体或该抗体片段。
(14)一种人FOLR1阳性细胞相关的疾病的诊断方法，其包括：使用(1)～(4)中任一项所述的单克隆抗体或该抗体片段对人FOLR1阳性细胞进行检测或测定。
(15)一种人FOLR1阳性细胞相关的疾病的诊断剂，其含有(1)～(4)中任一项所述的单克隆抗体或该抗体片段。
(16)使用(1)～(4)中任一项所述的单克隆抗体或该抗体片段在治疗开始前对利用该抗体的治疗有效性进行判断的方法。
发明效果
本发明的单克隆抗体或该抗体片段特异性识别并结合人FOLR1的氨基酸序列或其空间结构。本发明的单克隆抗体或该抗体片段具有高的ADCC活性和CDC活性，并且对来源于铂耐受性卵巢癌的细胞株也显示出抗肿瘤活性。
本发明的单克隆抗体或该抗体片段对FOLR1低表达细胞也具有ADCC活性。此外，本发明的单克隆抗体或该抗体片段对腹水中存在的、表达FOLR1的癌细胞也具有ADCC活性。而且，对于表达FOLR1的癌细胞，即使其叶酸摄入活性降低，本发明的单克隆抗体或该抗体片段也具有ADCC活性。
另外，本发明的单克隆抗体或该抗体片段不抑制叶酸与FOLR1的结合。与人FOLR1特异性结合并且具有高的ADCC活性和CDC活性的本发明的单克隆抗体或该抗体片段对于人FOLR1阳性细胞相关的疾病的治疗和诊断等是有用的。
另外，本发明能够提供编码该抗体的DNA、含有该DNA的载体、导入该载体而得到的转化体、使用该转化体的该抗体或该抗体片段的制造方法、以该抗体或该抗体片段作为有效成分的治疗剂和诊断剂。
附图说明
图1表示不含信号序列的RA15-7抗体重链可变区和各人源化RA15-7抗体修饰体重链可变区(HV0、HV2、HV3、HV4、HV5、HV6、HV7、HV8、HV10)的氨基酸序列。
图2表示不含信号序列的RA15-7抗体轻链可变区和各人源化RA15-7抗体修饰体轻链可变区(LV0、LV2、LV3、LV4、LV6)的氨基酸序列。
图3表示在将ChRA15-7Acc抗体的亲和性设为100时的、HV7LV3-CDRH3-Cys101修饰抗体对FOLR1-mycHis的亲和性评价结果(表面等离子体共振法)。
图4(a)、(b)、(c)、和(d)表示各抗体(DNPDF、MORAb-003DF、ChRA15-7DF、HuRA15-7CTDF)对FOLR1-Fc(黑色圆形)、食蟹猴FOLR1-Fc(白色圆形)、FOLR2-Fc(黑色三角形)和FOLR3-Fc(×)的反应性评价结果(ELISA)。纵轴表示吸光度，横轴表示抗体浓度(ng/mL)。
图5(a)和(b)表示HuRA15-7CTAcc抗体(黑色圆形)、HuRA15-7Acc抗体(黑色方形)和ChRA15-7Acc抗体(黑色三角形)对铂耐受性卵巢癌细胞株SKOV-3或OVCAR-3的ADCC活性评价结果。纵轴表示ADCC活性(％)，横轴表示抗体浓度(ng/mL)。
图6(a)和(b)表示对卵巢癌细胞株IGR-OV1的CDC活性。纵轴表示CDC活性(％)，横轴表示抗体浓度(μg/mL)。图6(a)表示HuRA15-7CTAcc抗体(黑色圆形)、HuRA15-7CTDF抗体(白色圆形)、ChRA15-7Acc抗体(黑色三角形)和ChRA15-7DF抗体(白色三角形)的CDC活性评价结果。图6(b)表示HuRA15-7CTAcc抗体(黑色圆形)和MORAb-003抗体(黑色三角形)的CDC活性评价结果。
图7(a)、(b)、和(c)表示HuRA15-7CTAcc抗体(黑色圆形)、MORAb-003Acc抗体(白色三角形)和MORAb-003抗体(黑色三角形)对卵巢癌细胞株IGR-OV1、SKOV-3或OVCAR-3的ADCC活性评价结果。纵轴表示ADCC活性(％)，横轴表示抗体浓度(ng/mL)。
图8表示HuRA15-7CTDF-770抗体(黑色圆形)和MORAb-003DF-770抗体(黑色三角形)对皮下移植到小鼠中而发生了恶化癌变的铂耐受性卵巢癌细胞株SKOV-3的累积性评价结果。纵轴表示相对于肿瘤部位的内标DNPDF-680抗体的荧光强度的各抗体的荧光强度比，横轴表示给药后时间(天)。
图9表示HuRA15-7CTAcc抗体(黑色圆形)、HuRA15-7CRAcc抗体(白色圆形)和MORAb-003DF抗体(黑色三角形)对铂耐受性卵巢癌细胞株OVCAR-3的ADCC活性评价结果。纵轴表示ADCC活性(％)，横轴表示抗体浓度(ng/mL)。
图10表示通过以小鼠IgG2a作为阴性对象、使用LK26抗体利用流式细胞仪对卵巢癌细胞株IGR-OV1、SKOV-3、OVCAR-3或MCAS中表达的FOLR1进行分析而对各卵巢癌细胞株上表达的FOLR1分子数进行定量的结果。纵轴表示每个细胞的FORL1表达分子数。
图11(a)、(b)、(c)、和(d)表示在卵巢癌性腹水中的细胞团块中添加HuRA15-7CTAcc抗体(黑色圆形)、MORAb-003抗体(黑色三角形)、和作为阴性对象的DNPDF抗体(×)时的、对FOLR1阳性细胞的细胞抑制活性。纵轴表示细胞抑制活性(％)，横轴表示抗体浓度(ng/mL)。FZ12、FZ21、FZ26和FZ44分别表示卵巢癌性腹水的供体。
图12(a)和(b)表示对各种卵巢癌细胞株的FOLR1表达量和叶酸摄入量进行分析而得到的结果。图12(a)表示使用HuRA15-7CTAcc抗体利用流式细胞仪对FOLR1表达量进行分析而得到的结果。图12(b)表示使用标记化叶酸利用流式细胞仪对叶酸摄入量进行分析而得到的结果。纵轴表示相对于阴性对象的相对MFI值，横轴表示进行了分析的卵巢癌细胞株。
具体实施方式
作为本发明中的人FOLR1，可以列举包含序列号1或GenBank登记号NM_016725表示的氨基酸序列且具有人FOLR1的功能的多肽、包含在序列号1或GenBank登记号NM_016725表示的氨基酸序列中缺失、取代或添加一个以上的氨基酸而成的氨基酸序列且具有人FOLR1的功能的多肽、以及与序列号1或GenBank登记号NM_016725表示的氨基酸序列具有60％以上、优选80％以上、更优选90％以上的同源性的氨基酸序列的多肽、包含与序列号1或GenBank登记号NM_016725表示的氨基酸序列具有最优选95％以上的同源性的氨基酸序列且具有人FOLR1的功能的多肽、包含由序列号1或GenBank登记号NM_016725表示的氨基酸序列的部分序列构成的氨基酸序列且具有人FOLR1的功能的多肽等。
作为人FOLR1的功能，是指通过与配体(例如，叶酸)的结合而引起胞吞作用，从而将叶酸摄入细胞内。
作为得到具有在序列号1或GenBank登记号NM_016725表示的氨基酸序列中缺失、取代或添加一个以上的氨基酸而成的氨基酸序列的多肽的方法，可以列举如下方法：使用定点诱变法[Molecular Cloning,A Laboratory Manual(分子克隆实验指南)，第二版，冷泉港实验室出版社(1989)；Current Protocols inmolecular Biology(最新分子生物学实验方法),约翰威立父子出版公司(1987-1997)；Nucleic Acids Research,10,6487(1982)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA,79,6409,(1982)；Gene,34,315(1985)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,488(1985)]等，在例如编码具有序列号1表示的氨基酸序列的多肽的DNA、即编码人FOLR1的基因中导入定点突变。
缺失、取代或添加的氨基酸数没有特别限定，优选为一个至数十个、例如1～20个的氨基酸，更优选为一个至数个、例如1～5个的氨基酸。
作为编码人FOLR1的基因，可以列举序列号1或GenBank登记号NM_016725表示的碱基序列。由在序列号1或GenBank登记号NM_016725表示的碱基序列中缺失、取代或添加一个以上的碱基而成的碱基序列构成并且包含编码具有人FOLR1的功能的多肽的DNA的基因、由与序列号1或GenBank登记号NM_016725表示的碱基序列具有至少60％以上的同源性的碱基序列、优选具有80％以上的同源性的碱基序列、更优选具有95％以上的同源性的碱基序列构成并且包含编码具有人FOLR1的功能的多肽的DNA的基因、以及由在严格条件下与具有序列号1或GenBank登记号NM_016725表示的碱基序列的DNA杂交的DNA构成并且包含编码具有人FOLR1的功能的多肽的DNA的基因等也包括在本发明的编码人FOLR1的基因中。
作为在严格条件下杂交的DNA，是指使用具有序列号1或GenBank登记号NM_016725表示的碱基序列的DNA作为探针，通过菌落杂交法、噬菌斑杂交法、DNA印迹(Southern blot)杂交法或DNA微阵列法等得到的能够杂交的DNA。
具体而言，可以列举能够通过如下方法进行鉴定的DNA：使用固定有来源于杂交的菌落或噬菌斑的DNA、或者具有该序列的PCR产物或寡聚DNA的过滤器或载玻片，在0.7～1.0mol/L的氯化钠存在下在65℃下进行杂交[Molecular Cloning,A Laboratory Manual，第二版，冷泉港实验室出版社(1989)；Current Protocols inmolecular Biology，约翰威立父子出版公司(1987-1997)；DNA Cloning 1:Coretechniques,APractical Approach(DNA克隆1：核心技术与实用方法)，第二版，牛津大学(1995)]，然后，使用0.1～2倍浓度的SSC溶液(1倍浓度的SSC溶液的组成由150mmol/L的氯化钠、15mmol/L的柠檬酸钠构成)，在65℃的条件下清洗过滤器或载玻片，由此进行鉴定。
作为能够杂交的DNA，可以列举与序列号1或GenBank登记号NM_016725表示的碱基序列具有至少60％以上的同源性的DNA、优选具有80％以上的同源性的DNA、更优选具有95％以上的同源性的DNA。
编码真核生物的蛋白质的基因的碱基序列常常可以观察到基因的多态性。本发明的编码FOLR1的基因还包括使本发明中使用的基因由于这样的多态性而在碱基序列中产生小规模的突变而得到的基因。
除特别说明的情况以外，本发明中的同源性的数值可以是使用本领域技术人员公知的同源性检索程序计算出的数值，对于碱基序列而言，可以列举使用BLAST[J.Mol.Biol.,215,403(1990)]中默认的参数计算出的数值等，对于氨基酸序列而言，可以列举使用BLAST2[NucleicAcids Res.,25,3389(1997)；Genome Res.,7,649(1997)；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Education/BLASTinfo/information3.html]中默认的参数计算出的数值等。
作为默认的参数，G(起始空位罚分，Cost to open gap)在碱基序列的情况下为5，在氨基酸序列的情况下为11；-E(空位延伸罚分，Cost toextend gap)在碱基序列的情况下为2，在氨基酸序列的情况下为1；-q(核苷酸错配罚分，Penalty for nucleotide mismatch)为-3；-r(核苷酸匹配得分，reward for nucleotide match)为1；-e(期望值，expect value)为10；-W(字长大小，word size)在碱基序列的情况下为11个残基，在氨基酸序列的情况下为3个残基；-y(非空位延伸下降的阈值，Dropoff(X)forblast extensions in bits)在blastn的情况下为20，在blastn以外的程序中为7；-X(空位比对的下降阈值，X dropoff value for gapped alignment inbits)为15；Z(最终空位比对的下降值，final X dropoff value for gappedalignment in bits)在blastn的情况下为为50，在blastn以外的程序中为25(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/html/blastcgihelp.html)。
作为得到由序列号1或GenBank登记号NM_016725表示的氨基酸序列的部分序列构成的多肽的方法，例如，可以通过使编码序列号1表示的氨基酸序列的DNA的一部缺失并对导入有包含上述DNA的表达载体的转化体进行培养来制作。
另外，具有在序列号1或GenBank登记号NM_016725表示的氨基酸序列的部分序列中缺失、取代或添加一个以上的氨基酸而成的氨基酸序列的多肽也可以使用前述的定点诱变法等来得到。
此外，由序列号1或GenBank登记号NM_016725表示的氨基酸序列的部分序列构成的多肽或者具有在序列号1或GenBank登记号NM_016725表示的氨基酸序列的部分序列中缺失、取代或添加一个以上的氨基酸而成的氨基酸序列的多肽也可以通过芴甲氧羰基(Fmoc)法和叔丁氧羰基(tBoc)法等化学合成法来制造。
本发明的单克隆抗体(以下，也称为本发明的抗体)或该抗体片段是特异性识别并结合人FOLR1的氨基酸序列或其空间结构的抗体或该抗体片段，具有抗肿瘤活性。
作为本发明中的人FOLR1的空间结构，只要具有与包含序列号1表示的氨基酸序列的第1位至第257位表示的氨基酸序列的人FOLR1在天然状态下可以形成的结构同等的结构，则可以为任意一种结构。人FOLR1在天然状态下可以形成的空间结构是指人FOLR1的天然型的空间结构。
具体而言，本发明中的抗肿瘤活性可以列举ADCC活性和CDC活性。
本发明中的ADCC活性为如下反应：结合于细胞表面的人FOLR1的抗体经由Fc部分主要与自然杀伤细胞(以下记作NK细胞)表面的FcγRIIIa结合，结果，由从NK细胞释放的穿孔素或颗粒酶等细胞毒性分子产生的细胞溶解反应[Clark M,Chemical Immunology,65,88(1997)；Gorter A等,Immunol.Today,20,576(1999)]。
本发明的抗体不仅对FOLR1高表达细胞具有ADCC活性，对FOLR1低表达细胞也具有ADCC活性。另外，本发明的抗体对FOLR1低表达细胞显示出比以往的抗FOLR1单克隆抗体更高的ADCC活性。细胞中的FOLR1表达量可以通过蛋白免疫印迹法、公知的免疫学检测法、荧光细胞染色法等来确认。
具体而言，可以列举例如：使用FMAT8100HTS系统(应用生物系统公司制造)等的荧光抗体染色法[Cancer Immunol.Immunother.,36,373(1993)]、使用流式细胞仪的荧光细胞染色法等的方法。此外，本发明的抗体的ADCC活性不依赖于细胞的叶酸摄入量。本发明的抗体对叶酸摄入量低的FOLR1表达细胞也具有ADCC活性。
细胞中的叶酸摄入量例如可以使用利用通常的免疫学检测或测定方法中使用的标记物进行标记后的叶酸来确认。作为标记物，可以列举例如：碱性磷酸酶、过氧化物酶或荧光素酶等酶；吖啶酯或洛酚碱等发光物质；或者，异硫氰酸荧光素(FITC)或三甲基罗丹明(RITC)等荧光物质；放射性同位素；等。
本发明中的CDC活性为如下反应：结合于细胞表面的人FOLR1的抗体经由Fc部分与补体系统的C1的一种成分C1q结合，结果，C1至C9的各补体成分活化，最终C5至C9在细胞膜上形成被称为膜侵袭复合体的孔形成重合体而引起细胞的溶解[Immunol Today.1999Dec；20(12):576-82.]。
作为上述抗体，具体而言，可以列举下述(i)或(ii)的单克隆抗体和该抗体片段。
(i)包含CDR1～3分别含有序列号30、31、32表示的氨基酸序列的抗体的H链且包含CDR1～3分别含有序列号33、34、35表示的氨基酸序列的抗体的L链的抗体
(ii)包含CDR1～3分别含有序列号30、31、32表示的氨基酸序列的抗体的H链且包含CDR1～3分别含有序列号33、34、35表示的氨基酸序列的抗体的L链的抗体，序列号32(抗体H链的CDR3)表示的氨基酸序列中的半胱氨酸被取代成苏氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸或谷氨酰胺的抗体
另外，作为本发明的单克隆抗体，更具体而言，可以列举下述(a)的单克隆抗体和该抗体片段。
(a)包含含有序列号98表示的氨基酸序列的抗体的VH且包含含有序列号94表示的氨基酸序列的抗体的VL的单克隆抗体和该抗体片段
此外，作为本发明的单克隆抗体，可以列举同与上述单克隆抗体竞争地特异性识别人FOLR1的氨基酸序列或其空间结构并与上述单克隆抗体所结合的人FOLR1上存在的表位相同的表位结合的单克隆抗体和该抗体片段。
本发明中，与单克隆抗体竞争的抗体是指与本发明的单克隆抗体相同或部分相同的人FOLR1上具有表位(也称为抗原决定簇)并与该表位结合的抗体。同与本发明的单克隆抗体所结合的表位相同的表位结合的抗体是指识别并结合与本发明的单克隆抗体所识别的人FOLR1的氨基酸序列相同的序列的抗体。
本发明的单克隆抗体或该抗体片段与人FOLR1的氨基酸序列或其空间结构结合可以通过使用固相化的人FOLR1的酶联免疫吸附法(ELISA)、蛋白免疫印迹法、免疫组织染色(IHC)法、针对表达人FOLR1的细胞的公知的免疫学检测法、荧光细胞染色法等能够考察特定抗原与抗特定抗原的抗体的结合性的方法来确认。
具体而言，可以列举：使用FMAT8100HTS系统(应用生物系统公司制造)等的荧光抗体染色法[Cancer Immunol.Immunother.,36,373(1993)]、使用流式细胞术的荧光细胞染色法、使用Biacore系统(通用电气医疗集团制造)等的表面等离子体共振法、使用ITC(DKSH公司制造)等的等温滴定量热法等方法。
在通过使用Biacore系统(通用电气医疗集团制造)等的表面等离子体共振法来确认本发明的单克隆抗体或该抗体片段与人FOLR1的氨基酸序列或其空间结构结合的情况下，优选利用胺偶联法将抗IgG抗体固定到传感芯片CM5上，然后，使该抗体或该抗体片段流过而使其以适当量进行结合，进而，使浓度已知的多种浓度的FOLR1或其融合体流过，测定结合、解离。
另外，也可以将其他公知的免疫学检测方法[MonoclonalAntibodies-Principles and practice(单克隆抗体的原则与实践)，第三版，美国学术出版社(1996)；Antibodies-A Laboratory Manual(抗体实验指南)，冷泉港实验室(1988)；単クローン抗体実験マニュアル(单克隆抗体实验指南)，講談社サイエンティフィック(1987)]等组合来进行确认。
作为表达人FOLR1的细胞，只要表达该FOLR1则可以为任意的细胞，可以列举例如：天然存在于人体内的细胞、由天然存在于人体内的细胞建立的细胞株或通过基因重组技术得到的细胞等。
作为天然存在于人体内的细胞，可以列举例如在癌症患者体内表达该FOLR1的细胞，具体而言，可以列举卵巢癌细胞、肾癌细胞、子宫内膜癌细胞、肺癌细胞、乳腺癌细胞、膀胱癌细胞、胰腺癌细胞和结肠癌细胞等[Anal Biochem,2005.338(2):p.284-93.]。
作为由天然存在于人体内的细胞建立的细胞株，可以列举例如对从上述的癌症患者得到的表达该FOLR1的细胞进行株化而得到的细胞株中表达该FOLR1的细胞株。
例如，可以列举：作为由人建立的细胞株的来源于卵巢癌的细胞株SKOV-3[American Type Culture Collection(美国典型培养物保藏中心，以下记作ATCC)编号：HTB-77]、TOV-112D(ATCC编号：CRL-11731)、ES-2(ATCC编号：CRL-1978)、OV-90(ATCC编号：CRL-11732)、PA-1(ATCC编号：CRL-1572)、Caov-3(ATCC编号：HTB-75)、OVISE(JCRB细胞编号：JCRB1043)、MCAS(JCRB细胞编号：JCRB0240)、NIH:OVCAR-3(ATCC编号：HTB-161)、IGR-OV1(National Cancer Institute)或RMG-1(JCRB细胞编号：JCRB0172)等。
作为通过基因重组技术得到的细胞，具体而言，可以列举例如：通过将含有编码该FOLR1的cDNA的表达载体导入昆虫细胞或动物细胞等而得到的表达该FOLR1的细胞等。
作为本发明的单克隆抗体，可以列举：由杂交瘤生产的抗体、或者由利用包含抗体基因的表达载体进行转化而得到的转化体生产的基因重组抗体。
单克隆抗体为单一克隆的抗体产生细胞所分泌的抗体，其特征在于，仅识别一个表位(也称为抗原决定簇)，并且构成单克隆抗体的氨基酸序列(一级结构)一致。
作为表位，可以列举例如：单克隆抗体所识别并结合的单一氨基酸序列、由氨基酸序列构成的空间结构、结合有糖链的氨基酸序列以及由结合有糖链的氨基酸序列构成的空间结构等。
本发明的单克隆抗体所结合的表位优选包含在序列号1表示的人FOLR1的氨基酸序列(NCBI Reference Sequence:NM_016725.1)中第55位～第62位的氨基酸序列中。
本发明的单克隆抗体所结合的表位的氨基酸序列优选包含选自序列号1的第55位～第62位的氨基酸中的至少一个氨基酸，更优选包含选自第55位、第56位、第57位、第58位、第59位、第60位、第61位和第62位的氨基酸中的至少一个氨基酸。
另外，本发明的单克隆抗体所结合的表位的氨基酸序列优选包含人FOLR1的氨基酸序列中选自序列号1的第55位～第62位的氨基酸序列中的至少连续的两个以上的氨基酸，更优选包含选自第55位、第56位、第57位、第58位、第59位、第60位、第61位和第62位的氨基酸中的至少一个氨基酸且包含选自序列号1的第55位～第62位的氨基酸序列中的至少连续的两个以上的氨基酸。
具体而言，作为本发明的单克隆抗体所结合的表位的氨基酸序列，可以列举包含序列号1的第55位～第62位的氨基酸的氨基酸序列等。
杂交瘤例如可以通过如下方法来制备：制备上述表达人FOLR1的细胞等作为抗原，利用经该抗原免疫后的动物诱导出具有抗原特异性的抗体生产细胞，进而，使该抗体生产细胞与骨髓瘤细胞融合。对该杂交瘤进行培养，或者对动物给用该杂交瘤细胞而使该动物产生癌性腹水，并对该培养液或腹水进行分离、纯化，由此，可以获得抗FOLR1单克隆抗体。
作为进行抗原免疫的动物，只要能够制作杂交瘤则均可以使用，优选使用小鼠、大鼠、仓鼠、鸡或兔等。另外，由如下制作的杂交瘤生产的抗体等也包括在本发明的抗体中：从上述动物中获取具有抗体产生能力的细胞，在体外对该细胞实施免疫，然后与骨髓瘤细胞融合而制作杂交瘤。
本发明中，作为基因重组抗体，包括人嵌合抗体、人CDR移植抗体、人抗体或抗体片段等通过基因重组制造的抗体。基因重组抗体中，具有单克隆抗体的特征、抗原性低且血中半衰期延长的基因重组抗体优选作为治疗剂。基因重组抗体可以列举例如使用基因重组技术对上述本发明的单克隆抗体进行修饰而得到的抗体。
人嵌合抗体是指由人以外的动物的抗体的VH和VL与人抗体的重链恒定区(以下记作CH)和轻链恒定区(以下记作CL)构成的抗体。本发明的人嵌合抗体可以如下制造：由产生特异性识别并结合人FOLR1的氨基酸序列或其空间结构的单克隆抗体的杂交瘤获取编码VH和VL的cDNA，将它们分别插入到具有编码人抗体的CH和CL的基因的动物细胞用表达载体中，构建人嵌合抗体表达载体，将上述载体导入动物细胞中使其进行表达。
作为人嵌合抗体的CH，只要属于人免疫球蛋白(以下记作hIg)则均可以使用，优选hIgG类的CH，并且，可以使用属于hIgG类的hIgG1、hIgG2、hIgG3或hIgG4等亚类中的任意一种。另外，作为人嵌合抗体的CL，可以是属于hIg的任意一种CL，可以使用κ类或λ类的CL。
作为本发明的人嵌合抗体，具体而言，可以列举包含含有序列号27表示的氨基酸序列的抗体的VH且包含含有序列号29表示的氨基酸序列的抗体的VL的嵌合抗体。
此外，作为本发明的嵌合抗体，可以列举：同与本发明的单克隆抗体竞争地识别人FOLR1的氨基酸序列或其空间结构且与上述单克隆抗体所结合的人FOLR1上存在的表位相同的表位结合的嵌合抗体。
人CDR移植抗体有时也称为人源化抗体，是指将人以外的动物的抗体的VH和VL的CDR的氨基酸序列移植到人抗体的VH和VL的适当位置而得到的抗体。本发明的人CDR移植抗体可以如下制造：构建编码V区的cDNA，所述V区是将产生特异性识别并结合人FOLR1的氨基酸序列或其空间结构的人以外的动物的单克隆抗体的VH和VL的CDR的氨基酸序列移植到任意的人抗体的VH和VL的框架区(以下记作FR)中而形成的V区，将上述cDNA分别插入到具有编码人抗体的CH和CL的基因的动物细胞用表达载体中，构建人CDR移植抗体表达载体，并将其导入动物细胞中，由此进行表达，从而制造人CDR移植抗体。
作为人CDR移植抗体的CH，只要属于hIg则可以是任意一种CH，优选使用hIgG类的CH，并且，可以使用属于hIgG类的hIgG1、hIgG2、hIgG3或hIgG4等亚类中的任意一种。另外，作为人CDR移植抗体的CL，只要属于hIg则可以是任意一种CL，可以使用κ类或λ类的CL。
作为本发明的人CDR移植抗体，具体而言，可以列举：包含CDR1～3含有序列号30～32表示的氨基酸序列的抗体的VH且包含CDR1～3含有序列号33～35表示的氨基酸序列的抗体的VL的人源化抗体。
作为本发明的人源化抗体，具体而言，可以列举下述(a)VH和(b)VL中的至少一者的人源化抗体。
(a)包含序列号100的氨基酸序列或序列号100的氨基酸序列中的选自第18位的Leu、第30位的Ser、第37位的Val、第40位的Ala、第41位的Pro、第44位的Gly、第45位的Leu、第48位的Val、第76位的Asp和第95位的Val中的至少一个氨基酸残基被取代成其他氨基酸残基的氨基酸序列的抗体的VH
(b)序列号101的氨基酸序列、或序列号101的氨基酸序列中的第15位的Val、第43位的Ala、第45位的Lys、第71位的Phe、第85位的Thr和第87位的Tyr中的至少一个氨基酸残基被取代成其他氨基酸残基的氨基酸序列的抗体的VL
此外，作为本发明的人源化抗体中包含VH，优选下述(1)～(8)。
(1)包含序列号100的氨基酸序列中的第18位的Leu、第30位的Ser、第37位的Val、第40位的Ala、第41位的Pro、第44位的Gly、第45位的Leu、第48位的Val、第76位的Asp和第95位的Val被取代成其他氨基酸残基的氨基酸序列的VH
(2)包含序列号100的氨基酸序列中的第37位的Val、第40位的Ala、第41位的Pro、第44位的Gly、第45位的Leu、第48位的Val、第76位的Asp和第95位的Val被取代成其他氨基酸残基的氨基酸序列的VH
(3)包含序列号100的氨基酸序列中的第30位的Ser、第40位的Ala、第44位的Gly、第45位的Leu、第48位的Val、第76位的Asp和第95位的Val被取代成其他氨基酸残基的氨基酸序列的VH
(4)包含序列号100的氨基酸序列中的第37位的Val、第40位的Ala、第41位的Pro、第45位的Leu、第48位的Val和第95位的Val被取代成其他氨基酸残基的氨基酸序列的VH
(5)包含序列号100的氨基酸序列中的第37位的Val、第40位的Ala、第41位的Pro、第45位的Leu和第48位的Val被取代成其他氨基酸残基的氨基酸序列的VH
(6)包含序列号100的氨基酸序列中的第40位的Ala、第41位的Pro、第45位的Leu和第95位的Val被取代成其他氨基酸残基的氨基酸序列的VH
(7)包含序列号100的氨基酸序列中的第41位的Pro、第45位的Leu和第95位的Val被取代成其他氨基酸残基的氨基酸序列的VH
(8)包含序列号100的氨基酸序列中的第40位的Ala和第95位的Val被取代成其他氨基酸残基的氨基酸序列的VH
作为上述VH的氨基酸序列，可以列举例如导入有选自下述修饰中的至少一个修饰的氨基酸序列：将序列号100的氨基酸序列中的第18位的Leu取代成Met、将第30位的Ser取代成Thr、将第37位的Val取代成Ile、将第40位的Ala取代成Pro、将第41位的Pro取代成Ala、将第44位的Gly取代成Ala、将第45位的Leu取代成Pro、将第48位的Val取代成Leu、将第76位的Asp取代成Asn或将第95位的Val取代成Thr。
作为导入有10个修饰的VH的氨基酸序列，具体而言，可以列举例如：将序列号100的氨基酸序列中的第18位的Leu取代成Met、将第30位的Ser取代成Thr、将第37位的Val取代成Ile、将第40位的Ala取代成Pro、将第41位的Pro取代成Ala、将第44位的Gly取代成Ala、将第45位的Leu取代成Pro、将第48位的Val取代成Leu、将第76位的Asp取代成Asn并且将第95位的Val取代成Thr的氨基酸序列。
作为导入有9个修饰的VH的氨基酸序列，具体而言，可以列举例如下述(1)～(10)的氨基酸序列。
(1)将序列号100的氨基酸序列中的第18位的Leu取代成Met、将第30位的Ser取代成Thr、将第37位的Val取代成Ile、将第40位的Ala取代成Pro、将第41位的Pro取代成Ala、将第44位的Gly取代成Ala、将第45位的Leu取代成Pro、将第48位的Val取代成Leu并且将第76位的Asp取代成Asn的氨基酸序列
(2)将序列号100的氨基酸序列中的第18位的Leu取代成Met、将第30位的Ser取代成Thr、将第37位的Val取代成Ile、将第40位的Ala取代成Pro、将第41位的Pro取代成Ala、将第44位的Gly取代成Ala、将第45位的Leu取代成Pro、将第48位的Val取代成Leu并且将第95位的Val取代成Thr的氨基酸序列
(3)将序列号100的氨基酸序列中的第18位的Leu取代成Met、将第30位的Ser取代成Thr、将第37位的Val取代成Ile、将第40位的Ala取代成Pro、将第41位的Pro取代成Ala、将第44位的Gly取代成Ala、将第45位的Leu取代成Pro、将第76位的Asp取代成Asn并且将第95位的Val取代成Thr的氨基酸序列
(4)将序列号100的氨基酸序列中的第18位的Leu取代成Met、将第30位的Ser取代成Thr、将第37位的Val取代成Ile、将第40位的Ala取代成Pro、将第41位的Pro取代成Ala、将第44位的Gly取代成Ala、将第48位的Val取代成Leu、将第76位的Asp取代成Asn并且将第95位的Val取代成Thr的氨基酸序列
(5)将序列号100的氨基酸序列中的第18位的Leu取代成Met、将第30位的Ser取代成Thr、将第37位的Val取代成Ile、将第40位的Ala取代成Pro、将第41位的Pro取代成Ala、将第45位的Leu取代成Pro、将第48位的Val取代成Leu、将第76位的Asp取代成Asn并且将第95位的Val取代成Thr的氨基酸序列
(6)将序列号100的氨基酸序列中的第18位的Leu取代成Met、将第30位的Ser取代成Thr、将第37位的Val取代成Ile、将第40位的Ala取代成Pro、将第44位的Gly取代成Ala、将第45位的Leu取代成Pro、将第48位的Val取代成Leu、将第76位的Asp取代成Asn并且将第95位的Val取代成Thr的氨基酸序列
(7)将序列号100的氨基酸序列中的第18位的Leu取代成Met、将第30位的Ser取代成Thr、将第37位的Val取代成Ile、将第41位的Pro取代成Ala、将第44位的Gly取代成Ala、将第45位的Leu取代成Pro、将第48位的Val取代成Leu、将第76位的Asp取代成Asn并且将第95位的Val取代成Thr的氨基酸序列
(8)将序列号100的氨基酸序列中的第18位的Leu取代成Met、将第30位的Ser取代成Thr、将第40位的Ala取代成Pro、将第41位的Pro取代成Ala、将第44位的Gly取代成Ala、将第45位的Leu取代成Pro、将第48位的Val取代成Leu、将第76位的Asp取代成Asn并且将第95位的Val取代成Thr的氨基酸序列
(9)将序列号100的氨基酸序列中的第18位的Leu取代成Met、将第37位的Val取代成Ile、将第40位的Ala取代成Pro、将第41位的Pro取代成Ala、将第44位的Gly取代成Ala、将第45位的Leu取代成Pro、将第48位的Val取代成Leu、将第76位的Asp取代成Asn并且将第95位的Val取代成Thr的氨基酸序列
(10)将序列号100的氨基酸序列中的第30位的Ser取代成Thr、将第37位的Val取代成Ile、将第40位的Ala取代成Pro、将第41位的Pro取代成Ala、将第44位的Gly取代成Ala、将第45位的Leu取代成Pro、将第48位的Val取代成Leu、将第76位的Asp取代成Asn并且将第95位的Val取代成Thr的氨基酸序列
作为导入有8个修饰的VH的氨基酸序列，具体而言，可以列举例如下述(1)～(11)的氨基酸序列。
(1)将序列号100的氨基酸序列中的第37位的Val取代成Ile、将第40位的Ala取代成Pro、将第41位的Pro取代成Ala、将第44位的Gly取代成Ala、将第45位的Leu取代成Pro、将第48位的Val取代成Leu、将第76位的Asp取代成Asn并且将第95位的Val取代成Thr的氨基酸序列
(2)将序列号100的氨基酸序列中的第18位的Leu取代成Met、将第30位的Ser取代成Thr、将第37位的Val取代成Ile、将第44位的Gly取代成Ala、将第45位的Leu取代成Pro、将第48位的Val取代成Leu、将第76位的Asp取代成Asn并且将第95位的Val取代成Thr的氨基酸序列
(3)将序列号100的氨基酸序列中的第18位的Leu取代成Met、将第30位的Ser取代成Thr、将第37位的Val取代成Ile、将第41位的Pro取代成Ala、将第45位的Leu取代成Pro、将第48位的Val取代成Leu、将第76位的Asp取代成Asn并且将第95位的Val取代成Thr的氨基酸序列
(4)将序列号100的氨基酸序列中的第18位的Leu取代成Met、将第30位的Ser取代成Thr、将第37位的Val取代成Ile、将第41位的Pro取代成Ala、将第44位的Gly取代成Ala、将第45位的Leu取代成Pro、将第48位的Val取代成Leu并且将第95位的Val取代成Thr的氨基酸序列
(5)将序列号100的氨基酸序列中的第18位的Leu取代成Met、将第30位的Ser取代成Thr、将第37位的Val取代成Ile、将第41位的Pro取代成Ala、将第44位的Gly取代成Ala、将第45位的Leu取代成Pro、将第48位的Val取代成Leu并且将第76位的Asp取代成Asn的氨基酸序列
(6)将序列号100的氨基酸序列中的第18位的Leu取代成Met、将第30位的Ser取代成Thr、将第37位的Val取代成Ile、将第40位的Ala取代成Pro、将第45位的Leu取代成Pro、将第48位的Val取代成Leu、将第76位的Asp取代成Asn并且将第95位的Val取代成Thr的氨基酸序列
(7)将序列号100的氨基酸序列中的第18位的Leu取代成Met、将第30位的Ser取代成Thr、将第37位的Val取代成Ile、将第40位的Ala取代成Pro、将第44位的Gly取代成Ala、将第45位的Leu取代成Pro、将第48位的Val取代成Leu并且将第95位的Val取代成Thr的氨基酸序列
(8)将序列号100的氨基酸序列中的第18位的Leu取代成Met、将第30位的Ser取代成Thr、将第37位的Val取代成Ile、将第40位的Ala取代成Pro、将第44位的Gly取代成Ala、将第45位的Leu取代成Pro、将第48位的Val取代成Leu并且将第76位的Asp取代成Asn的氨基酸序列
(9)将序列号100的氨基酸序列中的第18位的Leu取代成Met、将第30位的Ser取代成Thr、将第37位的Val取代成Ile、将第40位的Ala取代成Pro、将第41位的Pro取代成Ala、将第45位的Leu取代成Pro、将第48位的Val取代成Leu并且将第95位的Val取代成Thr的氨基酸序列
(10)将序列号100的氨基酸序列中的第18位的Leu取代成Met、将第30位的Ser取代成Thr、将第37位的Val取代成Ile、将第40位的Ala取代成Pro、将第41位的Pro取代成Ala、将第45位的Leu取代成Pro、将第48位的Val取代成Leu并且将第76位的Asp取代成Asn的氨基酸序列
(11)将序列号100的氨基酸序列中的第18位的Leu取代成Met、将第30位的Ser取代成Thr、将第37位的Val取代成Ile、将第40位的Ala取代成Pro、将第41位的Pro取代成Ala、将第44位的Gly取代成Ala、将第45位的Leu取代成Pro并且将第48位的Val取代成Leu的氨基酸序列
作为导入有7个修饰的VH的氨基酸序列，具体而言，可以列举例如下述(1)～(5)的氨基酸序列。
(1)将序列号100的氨基酸序列中的第30位的Ser取代成Thr、将第40位的Ala取代成Pro、将第44位的Gly取代成Ala、将第45位的Leu取代成Pro、将第48位的Val取代成Leu、将第76位的Asp取代成Asn并且将第95位的Val取代成Thr的氨基酸序列
(2)将序列号100的氨基酸序列中的第40位的Ala取代成Pro、将第41位的Pro取代成Ala、将第44位的Gly取代成Ala、将第45位的Leu取代成Pro、将第48位的Val取代成Leu、将第76位的Asp取代成Asn并且将第95位的Val取代成Thr的氨基酸序列
(3)将序列号100的氨基酸序列中的第37位的Val取代成Ile、将第40位的Ala取代成Pro、将第41位的Pro取代成Ala、将第45位的Leu取代成Pro、将第48位的Val取代成Leu、将第76位的Asp取代成Asn并且将第95位的Val取代成Thr的氨基酸序列
(4)将序列号100的氨基酸序列中的第37位的Val取代成Ile、将第40位的Ala取代成Pro、将第41位的Pro取代成Ala、将第44位的Gly取代成Ala、将第45位的Leu取代成Pro、将第48位的Val取代成Leu并且将第95位的Val取代成Thr的氨基酸序列
(5)将序列号100的氨基酸序列中的第37位的Val取代成Ile、将第40位的Ala取代成Pro、将第41位的Pro取代成Ala、将第44位的Gly取代成Ala、将第45位的Leu取代成Pro、将第48位的Val取代成Leu并且将第76位的Asp取代成Asn的氨基酸序列
作为导入有6个修饰的VH的氨基酸序列，具体而言，可以列举例如下述(1)～(6)的氨基酸序列。
(1)将序列号100的氨基酸序列中的第37位的Val取代成Ile、将第40位的Ala取代成Pro、将第41位的Pro取代成Ala、将第45位的Leu取代成Pro、将第48位的Val取代成Leu并且将第95位的Val取代成Thr的氨基酸序列
(2)将序列号100的氨基酸序列中的第40位的Ala取代成Pro、将第41位的Pro取代成Ala、将第45位的Leu取代成Pro、将第48位的Val取代成Leu、将第76位的Asp取代成Asn并且将第95位的Val取代成Thr的氨基酸序列
(3)将序列号100的氨基酸序列中的第37位的Val取代成Ile、将第41位的Pro取代成Ala、将第45位的Leu取代成Pro、将第48位的Val取代成Leu、将第76位的Asp取代成Asn并且将第95位的Val取代成Thr的氨基酸序列
(4)将序列号100的氨基酸序列中的第37位的Val取代成Ile、将第40位的Ala取代成Pro、将第45位的Leu取代成Pro、将第48位的Val取代成Leu、将第76位的Asp取代成Asn并且将第95位的Val取代成Thr的氨基酸序列
(5)将序列号100的氨基酸序列中的第37位的Val取代成Ile、将第40位的Ala取代成Pro、将第41位的Pro取代成Ala、将第45位的Leu取代成Pro、将第48位的Val取代成Leu并且将第95位的Val取代成Thr的氨基酸序列
(6)将序列号100的氨基酸序列中的第37位的Val取代成Ile、将第40位的Ala取代成Pro、将第41位的Pro取代成Ala、将第44位的Gly取代成Ala、将第45位的Leu取代成Pro并且将第48位的Val取代成Leu的氨基酸序列
作为导入有5个修饰的VH的氨基酸序列，具体而言，可以列举例如下述(1)～(6)的氨基酸序列。
(1)将序列号100的氨基酸序列中的第37位的Val取代成Ile、将第40位的Ala取代成Pro、将第41位的Pro取代成Ala、将第45位的Leu取代成Pro并且将第48位的Val取代成Leu的氨基酸序列
(2)将序列号100的氨基酸序列中的第40位的Ala取代成Pro、将第41位的Pro取代成Ala、将第45位的Leu取代成Pro、将第48位的Val取代成Leu并且将第95位的Val取代成Thr的氨基酸序列
(3)将序列号100的氨基酸序列中的第37位的Val取代成Ile、将第41位的Pro取代成Ala、将第45位的Leu取代成Pro、将第48位的Val取代成Leu并且将第95位的Val取代成Thr的氨基酸序列
(4)将序列号100的氨基酸序列中的第37位的Val取代成Ile、将第40位的Ala取代成Pro、将第45位的Leu取代成Pro、将第48位的Val取代成Leu并且将第95位的Val取代成Thr的氨基酸序列
(5)将序列号100的氨基酸序列中的第37位的Val取代成Ile、将第40位的Ala取代成Pro、将第41位的Pro取代成Ala、将第48位的Val取代成Leu并且将第95位的Val取代成Thr的氨基酸序列
(6)将序列号100的氨基酸序列中的第37位的Val取代成Ile、将第40位的Ala取代成Pro、将第41位的Pro取代成Ala、将第45位的Leu取代成Pro并且将第95位的Val取代成Thr的氨基酸序列
作为导入有4个修饰的VH的氨基酸序列，具体而言，可以列举例如下述(1)～(7)的氨基酸序列。
(1)将序列号100的氨基酸序列中的第40位的Ala取代成Pro、将第41位的Pro取代成Ala、将第45位的Leu取代成Pro并且将第95位的Val取代成Thr的氨基酸序列
(2)将序列号100的氨基酸序列中的第41位的Pro取代成Ala、将第45位的Leu取代成Pro、将第48位的Val取代成Leu并且将第95位的Val取代成Thr的氨基酸序列
(3)将序列号100的氨基酸序列中的第40位的Ala取代成Pro、将第41位的Pro取代成Ala、将第45位的Leu取代成Pro并且将第95位的Val取代成Thr的氨基酸序列
(4)将序列号100的氨基酸序列中的第37位的Val取代成Ile、将第41位的Pro取代成Ala、将第45位的Leu取代成Pro并且将第95位的Val取代成Thr的氨基酸序列
(5)将序列号100的氨基酸序列中的第37位的Val取代成Ile、将第40位的Ala取代成Pro、将第45位的Leu取代成Pro并且将第95位的Val取代成Thr的氨基酸序列
(6)将序列号100的氨基酸序列中的第37位的Val取代成Ile、将第40位的Ala取代成Pro、将第41位的Pro取代成Ala并且将第95位的Val取代成Thr的氨基酸序列
(7)将序列号100的氨基酸序列中的第37位的Val取代成Ile、将第40位的Ala取代成Pro、将第41位的Pro取代成Ala并且将第45位的Leu取代成Pro的氨基酸序列
作为导入有3个修饰的VH的氨基酸序列，具体而言，可以列举例如下述(1)～(6)的氨基酸序列。
(1)将序列号100的氨基酸序列中的第41位的Pro取代成Ala、将第45位的Leu取代成Pro并且将第95位的Val取代成Thr的氨基酸序列
(2)将序列号100的氨基酸序列中的第37位的Val取代成Ile、将第45位的Leu取代成Pro并且将第95位的Val取代成Thr的氨基酸序列
(3)将序列号100的氨基酸序列中的第40位的Ala取代成Pro、将第45位的Leu取代成Pro并且将第95位的Val取代成Thr的氨基酸序列
(4)将序列号100的氨基酸序列中的第41位的Pro取代成Ala、将第45位的Leu取代成Pro并且将第95位的Val取代成Thr的氨基酸序列
(5)将序列号100的氨基酸序列中的第44位的Gly取代成Ala、将第45位的Leu取代成Pro并且将第95位的Val取代成Thr的氨基酸序列
(6)将序列号100的氨基酸序列中的第45位的Leu取代成Pro、将第48位的Val取代成Leu并且将第95位的Val取代成Thr的氨基酸序列
作为导入有2个修饰的VH的氨基酸序列，具体而言，可以列举例如下述(1)～(9)的氨基酸序列。
(1)将序列号100的氨基酸序列中的第18位的Leu取代成Met并且将第95位的Val取代成Thr的氨基酸序列
(2)将序列号100的氨基酸序列中的第30位的Ser取代成Thr并且将第95位的Val取代成Thr的氨基酸序列
(3)将序列号100的氨基酸序列中的第37位的Val取代成Ile并且将第95位的Val取代成Thr的氨基酸序列
(4)将序列号100的氨基酸序列中的第40位的Ala取代成Pro并且将第95位的Val取代成Thr的氨基酸序列
(5)将序列号100的氨基酸序列中的第41位的Pro取代成Ala并且将第95位的Val取代成Thr的氨基酸序列
(6)将序列号100的氨基酸序列中的第44位的Gly取代成Ala并且将第95位的Val取代成Thr的氨基酸序列
(7)将序列号100的氨基酸序列中的第45位的Leu取代成Pro并且将第95位的Val取代成Thr的氨基酸序列
(8)将序列号100的氨基酸序列中的第48位的Val取代成Leu并且将第95位的Val取代成Thr的氨基酸序列
(9)将序列号100的氨基酸序列中的第76位的Asp取代成Asn并且将第95位的Val取代成Thr的氨基酸序列
作为导入有1个修饰的VH的氨基酸序列，具体而言，可以列举例如下述(1)～(10)的氨基酸序列。
(1)将序列号100的氨基酸序列中的第18位的Leu取代成Met的氨基酸序列
(2)将序列号100的氨基酸序列中的第30位的Ser取代成Thr的氨基酸序列
(3)将序列号100的氨基酸序列中的第37位的Val取代成Ile的氨基酸序列
(4)将序列号100的氨基酸序列中的第40位的Ala取代成Pro的氨基酸序列
(5)将序列号100的氨基酸序列中的第41位的Pro取代成Alaに的氨基酸序列
(6)将序列号100的氨基酸序列中的第44位的Gly取代成Ala的氨基酸序列
(7)将序列号100的氨基酸序列中的第45位的Leu取代成Pro的氨基酸序列
(8)将序列号100的氨基酸序列中的第48位的Val取代成Leu的氨基酸序列
(9)将序列号100的氨基酸序列中的第76位的Asp取代成Asn的氨基酸序列
(10)将序列号100的氨基酸序列中的第95位的Val取代成Thr的氨基酸序列
另外，作为本发明的人源化抗体中包含的VL，优选下述(1)～(4)。
(1)包含序列号101的氨基酸序列中的第15位的Val、第43位的Ala、第45位的Lys、第71位的Phe、第85位的Thr和第87位的Tyr被取代成其他氨基酸残基的氨基酸序列的抗体的VL
(2)包含序列号101的氨基酸序列中的第15位的Val、第45位的Lys、第71位的Phe和第87位的Tyr被取代成其他氨基酸残基的氨基酸序列的抗体的VL
(3)包含序列号101的氨基酸序列中的第15位的Val、第71位的Phe和第87位的Tyr被取代成其他氨基酸残基的氨基酸序列的抗体的VL
(4)包含序列号101的氨基酸序列中的第45位的Lys和第71位的Phe被取代成其他氨基酸残基的氨基酸序列的抗体的VL
作为上述VL的氨基酸序列，可以列举例如导入有选自下述修饰中的至少一个修饰的氨基酸序列：将序列号101的氨基酸序列中的第15位的Val取代成Leu、将第43位的Ala取代成Ser、将第45位的Lys取代成Gln、将第71位的Phe取代成Tyr、将第85位的Thr取代成Gly并且将第87位的Tyr取代成Phe。
作为导入有6个修饰的VL的氨基酸序列，具体而言，可以列举例如将序列号101的氨基酸序列中的第15位的Val取代成Leu、将第43位的Ala取代成Ser、将第45位的Lys取代成Gln、将第71位的Phe取代成Tyr、将第85位的Thr取代成Gly并且将第87位的Tyr取代成Phe的氨基酸序列。
作为导入有5个修饰的VL的氨基酸序列，具体而言，可以列举例如下述(1)～(6)的氨基酸序列。
(1)将序列号101的氨基酸序列中的第43位的Ala取代成Ser、将第45位的Lys取代成Gln、将第71位的Phe取代成Tyr、将第85位的Thr取代成Gly并且将第87位的Tyr取代成Phe的氨基酸序列
(2)将序列号101的氨基酸序列中的第15位的Val取代成Leu、将第45位的Lys取代成Gln、将第71位的Phe取代成Tyr、将第85位的Thr取代成Gly并且将第87位的Tyr取代成Phe的氨基酸序列
(3)将序列号101的氨基酸序列中的第15位的Val取代成Leu、将第43位的Ala取代成Ser、将第71位的Phe取代成Tyr、将第85位的Thr取代成Gly并且将第87位的Tyr取代成Phe的氨基酸序列
(4)将序列号101的氨基酸序列中的第15位的Val取代成Leu、将第43位的Ala取代成Ser、将第45位的Lys取代成Gln、将第85位的Thr取代成Gly并且将第87位的Tyr取代成Phe的氨基酸序列
(5)将序列号101的氨基酸序列中的第15位的Val取代成Leu、将第43位的Ala取代成Ser、将第45位的Lys取代成Gln、将第71位的Phe取代成Tyr并且将第87位的Tyr取代成Phe的氨基酸序列
(6)将序列号101的氨基酸序列中的第15位的Val取代成Leu、将第43位的Ala取代成Ser、将第45位的Lys取代成Gln、将第71位的Phe取代成Tyr并且将第85位的Thr取代成Gly的氨基酸序列
作为导入有4个修饰的VL的氨基酸序列，具体而言，可以列举例如下述(1)～(6)的氨基酸序列。
(1)将序列号101的氨基酸序列中的第15位的Val取代成Leu、将第45位的Lys取代成Gln、将第71位的Phe取代成Tyr并且将第87位的Tyr取代成Phe的氨基酸序列
(2)将序列号101的氨基酸序列中的第45位的Lys取代成Gln、将第71位的Phe取代成Tyr、将第85位的Thr取代成Gly并且将第87位的Tyr取代成Phe的氨基酸序列
(3)将序列号101的氨基酸序列中的第15位的Val取代成Leu、将第71位的Phe取代成Tyr、将第85位的Thr取代成Gly并且将第87位的Tyr取代成Phe的氨基酸序列
(4)将序列号101的氨基酸序列中的第15位的Val取代成Leu、将第45位的Lys取代成Gln、将第85位的Thr取代成Gly并且将第87位的Tyr取代成Phe的氨基酸序列
(5)将序列号101的氨基酸序列中的第15位的Val取代成Leu、将第45位的Lys取代成Gln、将第71位的Phe取代成Tyr并且将第87位的Tyr取代成Phe的氨基酸序列
(6)将序列号101的氨基酸序列中的第15位的Val取代成Leu、将第45位的Lys取代成Gln、将第71位的Phe取代成Tyr并且将第85位的Thr取代成Gly的氨基酸序列
作为导入有3个修饰的VL的氨基酸序列，具体而言，可以列举例如下述(1)～(4)的氨基酸序列。
(1)将序列号101的氨基酸序列中的第15位的Val取代成Leu、将第71位的Phe取代成Tyr并且将第87位的Tyr取代成Phe的氨基酸序列
(2)将序列号101的氨基酸序列中的第45位的Lys取代成Gln、将第71位的Phe取代成Tyr并且将第87位的Tyr取代成Phe的氨基酸序列
(3)将序列号101的氨基酸序列中的第15位的Val取代成Leu、将第45位的Lys取代成Gln并且将第87位的Tyr取代成Phe的氨基酸序列
(4)将序列号101的氨基酸序列中的第15位的Val取代成Leu、将第45位的Lys取代成Gln并且将第71位的Phe取代成Tyr的氨基酸序列
作为导入有2个修饰的VL的氨基酸序列，具体而言，可以列举例如下述(1)～(9)的氨基酸序列。
(1)将序列号101的氨基酸序列中的第45位的Lys取代成Gln并且将第71位的Phe取代成Tyr的氨基酸序列
(2)将序列号101的氨基酸序列中的第15位的Val取代成Leu并且将第71位的Phe取代成Tyr的氨基酸序列
(3)将序列号101的氨基酸序列中的第43位的Ala取代成Ser并且将第71位的Phe取代成Tyr的氨基酸序列
(4)将序列号101的氨基酸序列中的第71位的Phe取代成Tyr并且将第85位的Thr取代成Gly的氨基酸序列
(5)将序列号101的氨基酸序列中的第71位的Phe取代成Tyr并且将第87位的Tyr取代成Phe的氨基酸序列
(6)将序列号101的氨基酸序列中的第15位的Val取代成Leu并且将第45位的Lys取代成Gln的氨基酸序列
(7)将序列号101的氨基酸序列中的第43位的Ala取代成Ser并且将第45位的Lys取代成Gln的氨基酸序列
(8)将序列号101的氨基酸序列中的第45位的Lys取代成Gln并且将第85位的Thr取代成Gly的氨基酸序列
(9)将序列号101的氨基酸序列中的第45位的Lys取代成Gln并且将第87位的Tyr取代成Phe的氨基酸序列
作为导入有1个修饰的VL的氨基酸序列，具体而言，可以列举例如下述(1)～(6)的氨基酸序列。
(1)将序列号101的氨基酸序列中的第15位的Val取代成Leu的氨基酸序列
(2)将序列号101的氨基酸序列中的第43位的Ala取代成Ser的氨基酸序列
(3)将序列号101的氨基酸序列中的第45位的Lys取代成Gln的氨基酸序列
(4)将序列号101的氨基酸序列中的第71位的Phe取代成Tyr的氨基酸序列
(5)将序列号101的氨基酸序列中的第85位的Thr取代成Gly的氨基酸序列
(6)将序列号101的氨基酸序列中的第87位的Tyr取代成Phe的氨基酸序列
另外，作为本发明的人源化抗体的具体例，可以列举：抗体的VH包含序列号98的氨基酸序列和/或抗体的VL包含序列号94的氨基酸序列的人源化抗体、抗体的VH包含序列号98的氨基酸序列和/或抗体的VL包含图2所示的任意一个氨基酸序列的人源化抗体、或者抗体的VH包含图1所示的任意一个氨基酸序列和/或抗体的VL包含序列号94的氨基酸序列的人源化抗体等。
此外，作为本发明的人源化抗体，可以列举：同与本发明的单克隆抗体竞争地特异性识别人FOLR1的氨基酸序列或其空间结构并与上述单克隆抗体所结合的人FOLR1上存在的表位相同的表位结合的人源化抗体。
人抗体原本是指天然存在于人体内的抗体，但也包括从利用最近的基因工程、细胞工程、发育工程的技术进步而制作的人抗体噬菌体文库和产生人抗体的转基因动物中得到的抗体等。
天然存在于人体内的抗体例如可以如下获得：分离人末梢血淋巴细胞，使其感染EB病毒等而永生化，并进行克隆，由此可以培养出产生该抗体的淋巴细胞，并可以从培养上清中纯化出该抗体。
人抗体噬菌体文库是通过将由人B细胞制备的抗体基因插入到噬菌体基因中而使Fab、scFv等抗体片段在噬菌体表面进行表达而得到的文库。可以以抗体片段对固定有抗原的底物的结合活性为指标，从该文库中回收在表面表达具有期望的抗原结合活性的抗体片段的噬菌体。该抗体片段还可以进一步通过基因工程方法转变为由两条完整的H链和两条完整的L链构成的人抗体分子。
产生人抗体的转基因动物是指细胞内整合有人抗体基因的动物。具体而言，例如，向小鼠ES细胞中导入人抗体基因，将该ES细胞移植到小鼠的早期胚胎中，然后使其发育，由此可以制作产生人抗体的转基因小鼠。来自于产生人抗体的转基因动物的人抗体可以如下制作：使用通常的在人以外的动物中进行的杂交瘤制作方法，获取产生人抗体的杂交瘤并进行培养，由此，在培养上清中产生并蓄积人抗体。
在构成上述抗体或抗体片段的氨基酸序列中缺失、添加、取代或插入一个以上的氨基酸并且具有与上述抗体或其抗体片段相同的活性的单克隆抗体或其抗体片段也包括在本发明的单克隆抗体或该抗体片段中。
缺失、添加、取代和/或插入的氨基酸数为一个以上，其数量没有特别限定，为利用定点诱变法[Molecular Cloning，第二版，冷泉港实验室出版社(1989)；Current Protocols inmolecular Biology，约翰威立父子出版公司(1987-1997)；Nucleic Acids Research,10,6487(1982)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA,79,6409(1982)；Gene,34,315(1985)；NucleicAcids Research,13,4431(1985)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,488(1985)]等公知的技术可以缺失、取代或添加的程度的数量。例如优选为一个至数十个，更优选为1～20个，进一步优选为1～10个，特别优选为1～5个。
在上述抗体的氨基酸序列中缺失、添加、取代或插入一个以上的氨基酸残基表示如下含义。即，意味着在抗体的氨基酸序列中，存在一个或多个氨基酸残基的缺失、添加、取代或插入。另外，现有在同时发生缺失、添加、取代或插入的情况，也存在被缺失、添加、取代或插入的氨基酸残基为天然型和非天然型中的任意一种的情况。
作为天然型氨基酸残基，可以列举例如：L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸或L-半胱氨酸等。
以下，示出可相互取代的氨基酸残基的优选例。同一组中所含的氨基酸残基可以相互取代。
A组：亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、缬氨酸、正缬氨酸、丙氨酸、2-氨基丁酸、蛋氨酸、O-甲基丝氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、环己基丙氨酸
B组：天冬氨酸、谷氨酸、异天冬氨酸、异谷氨酸、2-氨基己二酸、2-氨基辛二酸
C组：天冬酰胺、谷氨酰胺
D组：赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、2,4-二氨基丁酸、2,3-二氨基丙酸
E组：脯氨酸、3-羟基脯氨酸、4-羟基脯氨酸
F组：丝氨酸、苏氨酸、高丝氨酸
G组：苯丙氨酸、酪氨酸
本发明中，作为抗体片段，可以列举：Fab、F(ab’)2、Fab’、单链抗体(scFv)、二聚体化V区(diabody)、二硫键稳定的V区(dsFv)和包含CDR的肽等。
Fab是将IgG用作为蛋白分解酶的木瓜蛋白酶进行处理而得到的片段中(在H链的第224位的氨基酸残基处切断)、N末端侧约一半的H链与整个L链通过二硫键结合而成的分子量约为5万的具有抗原结合活性的抗体片段。
本发明的Fab可以通过将特异性识别并结合人FOLR1的氨基酸序列或其空间结构的单克隆抗体用木瓜蛋白酶进行处理而得到。另外，也可以将编码该抗体的Fab的DNA插入到原核生物用表达载体或真核生物用表达载体中并将该载体导入原核生物或真核生物中，由此使其进行表达，从而制造Fab。
F(ab’)2是将IgG的铰链区的两个二硫键的下部用作为蛋白分解酶的胃蛋白酶分解而得到的、两个Fab区在铰链部分结合而构成的、分子量约为10万的具有抗原结合活性的片段。
本发明的F(ab’)2可以通过将特异性识别并结合人FOLR1的氨基酸序列或其空间结构的单克隆抗体用胃蛋白酶进行处理而得到。另外，也可以通过使下述Fab’以硫醚键或二硫键结合来制作。
Fab’是将上述F(ab’)2的铰链区的二硫键切断而得到的分子量约为5万的具有抗原结合活性的抗体片段。本发明的Fab’可以通过将本发明的特异性识别并结合人FOLR1的氨基酸序列或其空间结构的F(ab’)2用二硫苏糖醇等还原剂进行处理而得到。另外，也可以将编码该抗体的Fab’片段的DNA插入到原核生物用表达载体或真核生物用表达载体中并将该载体导入原核生物或真核生物中，由此使其进行表达，从而制造Fab’。
scFv是使用适当的肽接头(以下记作P)将一条VH与一条VL连接而形成的VH-P-VL或VL-P-VH多肽，是具有抗原结合活性的抗体片段。
本发明的scFv可以通过如下方法制造：获取编码本发明的特异性识别并结合人FOLR1的氨基酸序列或其空间结构的单克隆抗体的VH和VL的cDNA，构建编码scFv的DNA，将该DNA插入到原核生物用表达载体或真核生物用表达载体中，并将该表达载体导入原核生物或真核生物中，由此进行表达。
双价抗体为scFv二聚体化而得到的抗体片段，是具有二价抗原结合活性的抗体片段。二价抗原结合活性可以相同，也可以使其中之一为不同的抗原结合活性。
本发明的双价抗体可以通过如下方法制造：获取编码本发明的特异性识别并结合人FOLR1的氨基酸序列或其空间结构的单克隆抗体的VH和VL的cDNA，以使肽接头的氨基酸序列的长度为8个残基以下的方式构建编码scFv的DNA，将该DNA插入到原核生物用表达载体或真核生物用表达载体中，并将该表达载体导入原核生物或真核生物中，由此进行表达。
dsFv是指使VH和VL中的各一个氨基酸残基取代为半胱氨酸残基的多肽借助该半胱氨酸残基之间的二硫键结合而得到的抗体片段。取代为半胱氨酸残基的氨基酸残基可以根据已知的方法[ProteinEngineering,7,697(1994)]基于抗体的空间结构预测来进行选择。
本发明的dsFv可以通过如下方法制造：获取编码本发明的特异性识别并结合人FOLR1的氨基酸序列或其空间结构的单克隆抗体的VH和VL的cDNA，构建编码dsFv的DNA，将该DNA插入到原核生物用表达载体或真核生物用表达载体中，并将该表达载体导入原核生物或真核生物中，由此进行表达。
包含CDR的肽包含VH或VL的CDR中的至少一个以上的区域而构成。包含多个CDR的肽可以直接结合或者借助肽接头而结合。
本发明的包含CDR的肽可以通过如下方法制造：构建编码本发明的特异性识别并结合人FOLR1的氨基酸序列或其空间结构的单克隆抗体的VH和VL的CDR的DNA，将该DNA插入到原核生物用表达载体或真核生物用表达载体中，并将该表达载体导入原核生物或真核生物中，由此进行表达。另外，包含CDR的肽也可以通过Fmoc法或tBoc法等化学合成法来制造。
本发明的抗体包括：利用化学方法或基因工程方法在本发明的特异性识别并结合人FOLR1的氨基酸序列或其空间结构的单克隆抗体或该抗体片段上结合放射性同位素、低分子药剂、高分子药剂、蛋白质或抗体药品等而得到的抗体的衍生物。
本发明中的抗体的衍生物可以通过利用化学方法[抗体工学入門(抗体工程入门)，地人书馆(1994)]在本发明的特异性识别并结合人FOLR1的氨基酸序列或其空间结构的单克隆抗体或该抗体片段的H链或L链的N末端侧或C末端侧、抗体或该抗体片段中的适当的取代基或侧链、以及单克隆抗体或该抗体片段中的糖链等上结合放射性同位素、低分子药剂、高分子药剂、免疫刺激剂、蛋白质或抗体药品等来制造。
另外，本发明中的抗体的衍生物也可以通过基因工程方法来制造，即，使编码本发明的特异性识别并结合人FOLR1的氨基酸序列或其空间结构的单克隆抗体或抗体片段的DNA与编码要结合的蛋白质或抗体药品的DNA连接后插入表达载体中，并将该表达载体导入适当的宿主细胞中，使其进行表达。
作为放射性同位素，可以列举例如：131I、125I、90Y、64Cu、99Tc、77Lu或211At等。放射性同位素可以通过氯胺T法等直接与抗体结合。另外，也可以在抗体上结合用于螯合放射性同位素的物质。作为螯合剂，可以列举1-异硫氰酸根合苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)等。
作为低分子药剂，可以列举例如烷化剂、亚硝基脲剂、代谢拮抗剂、抗生素、植物生物碱、拓扑异构酶抑制剂、激素疗法制剂、激素拮抗剂、芳香化酶抑制剂、P糖蛋白抑制剂、铂络合物衍生物、M期抑制剂或激酶抑制剂等抗癌剂[临床肿瘤学，癌与化学疗法公司(1996)]、或氢化可的松、泼尼松龙等甾类制剂、阿司匹林、吲哚美辛等非甾类制剂、硫代苹果酸金、青霉胺等免疫调节剂、环磷酰胺、硫唑嘌呤等免疫抑制剂、马来酸氯苯那敏或氯马斯汀这样的抗组胺剂等抗炎剂[炎症与抗炎疗法，医齿药出版株式会社(1982)]等。
作为抗癌剂，可以列举例如：阿米福汀(氨磷汀)、顺铂、达卡巴嗪(DTIC)、更生霉素、二氯甲基二乙胺(氮芥)、链脲霉素、环磷酰胺、异环磷酰胺、卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)、多柔比星(阿霉素)、表柔比星、吉西他滨(健择)、柔红霉素、丙卡巴肼、丝裂霉素、阿糖胞苷、依托泊苷、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、长春碱、长春新碱、博来霉素、道诺霉素、培洛霉素、雌莫司汀、紫杉醇(泰素)、多西紫杉醇(多西他奇)、阿地白介素、天冬酰胺酶、白消安、卡铂、奥沙利铂、奈达铂、克拉屈滨、喜树碱、10-羟基-7-乙基-喜树碱(SN38)、5-氟脱氧尿苷、氟达拉滨、羟基脲、伊达比星、美司那、依立替康(CPT-11)、拓扑替康(ノギテカン)、米托蒽醌、托泊替康、亮丙瑞林、甲地孕酮、美法仑、巯基嘌呤、羟基脲、普卡霉素、密妥坦、培门冬酶、喷司他丁、哌泊溴烷、他莫昔芬、戈舍瑞林、亮丙瑞林、氟他胺、替尼泊苷、睾内酯、硫鸟嘌呤、塞替派、乌拉莫司汀、长春瑞滨、苯丁酸氮芥、氢化可的松、泼尼松龙、甲基泼尼松龙、长春地辛、尼莫司汀、司莫司汀、卡培他滨、雷替曲塞、氮胞苷、UFT、奥沙利铂、吉非替尼(易瑞沙)、伊马替尼(STI571)、厄洛替尼、FMS样酪氨酸激酶3(Flt3)抑制剂、血管内皮生长因子受体(VEGFR)抑制剂、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)抑制剂、特罗凯等表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂、根赤壳菌素、17-烯丙基氨基-17-去甲氧基格尔德霉素、雷帕霉素、安吖啶、全反式维甲酸、沙利度胺、法曲唑、来曲唑、依西美坦、硫代苹果酸金、D-青霉胺、布西拉明、硫唑嘌呤、咪唑立宾、环孢素、氢化可的松、蓓萨罗丁(塔革雷汀)、地寒米松、孕激素类、雌激素类、阿那曲唑(瑞宁德)、利普安、阿司匹林、吲哚美辛、塞来昔布、马来酸氯苯那敏、氯苯那敏、氯马斯汀、维甲酸、砷、硼替佐米、别嘌呤醇、卡奇霉素、替伊莫单抗、塔革雷汀、奥唑米星、克拉霉素、瘤可维、异环磷酰胺、酮康唑、氨鲁米特、苏拉明、类美登醇(Maytansinoid)或其衍生物等。
作为使低分子药剂与抗体结合的方法，可以列举例如：通过戊二醛使药剂与抗体的氨基之间结合的方法、或者通过水溶性碳二亚胺使药剂的氨基与抗体的羧基结合的方法等。
作为高分子药剂，可以列举例如：聚乙二醇(以下记作PEG)、白蛋白、右旋糖酐、聚环氧乙烷、苯乙烯马来酸共聚物、聚乙烯吡咯烷酮、吡喃共聚物、羟丙基甲基丙烯酰胺等。通过使这些高分子化合物与抗体或抗体片段结合，可以期待发挥如下效果：(1)提高对化学性、物理性或生物性的各种因素的稳定性；(2)显著延长血中半衰期；(3)免疫原性消失或抑制抗体产生；等[バイオコンジュゲート医薬品，广川书店(1993)]。例如，作为使PEG与抗体结合的方法，可以列举与PEG化修饰试剂进行反应的方法等[バイオコンジュゲート医薬品，广川书店(1993)]。作为PEG化修饰试剂，可以列举：赖氨酸的ε-氨基的修饰剂(日本特开昭61-178926号公报)、天冬氨酸和谷氨酸的羧基的修饰剂(日本特开昭56-23587号公报)或精氨酸的胍基的修饰剂(日本特开平2-117920号公报)等。
作为免疫刺激剂，可以是作为免疫佐剂已知的天然物，作为具体例，使免疫亢进的药剂可以列举：β(1→3)葡聚糖(香菇多糖、西佐糖)或α-半乳糖神经酰胺等。
作为蛋白质，可以列举：使NK细胞、巨噬细胞或嗜中性粒细胞等免疫活性细胞活化的细胞因子或增殖因子、或者毒蛋白等。
作为细胞因子或增殖因子，可以列举例如：IFN-α、INF-β、INF-γ、白细胞介素(以下记作IL)-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)或巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)等。
作为毒蛋白，可以列举例如蓖麻毒素、白喉毒素或ONTAK等，还包括为调节毒性而向蛋白质中引入突变而得到的蛋白毒素。
作为抗体药品，可以列举：对通过抗体的结合诱导凋亡的抗原、与肿瘤的病态形成相关的抗原或调节免疫功能的抗原、与病变部位的血管新生相关的抗原具有抗性的抗体。
作为通过抗体的结合诱导凋亡的抗原，可以列举：分化抗原(Cluster of differentiation，以下记作CD)19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD37、CD53、CD72、CD73、CD74、CDw75、CDw76、CD77、CDw78、CD79a、CD79b、CD80(B7.1)、CD81、CD82、CD83、CDw84、CD85、CD86(B7.2)、人类白细胞抗原(HLA)II类或表皮生长因子受体(EGFR)等。
作为与肿瘤的病态形成相关的抗原或调节免疫功能的抗原，可以列举例如：CD40、CD40配体、B7家族分子(CD80、CD86、CD274、B7-DC、B7-H2、B7-H3或B7-H4)、B7家族分子的配体(CD28、CTLA-4、ICOS、PD-1或BTLA)、OX-40、OX-40配体、CD137、肿瘤坏死因子(TNF)受体家族分子(DR4、DR5、TNFR1或TNFR2)、TNF-相关的凋亡诱导配体受体(TRAIL)家族分子、TRAIL家族分子的受体家族(TRAIL-R1、TRAIL-R2、TRAIL-R3、或TRAIL-R4)、核因子κB受体活化因子配体(RANK)、RANK配体、CD-25、叶酸受体4、细胞因子[IL-1α、IL-1β、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、转化生长因子(TGF)β或TNFα等]、上述细胞因子的受体、趋化因子(SLC、ELC、I-309、TARC、MDC、或CTACK等)或上述趋化因子的受体。
作为抑制病变部位的血管新生的抗体的抗原，可以列举例如血管内皮生长因子(VEGF)、血管生成素、成纤维细胞生长因子(FGF)、EGF、血小板源性生长因子(PDGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、促红细胞生成素(EPO)、TGFβ、IL-8、Ephilin、SDF-1或者它们的受体等。
关于与蛋白质或抗体药品的融合抗体，可以使编码蛋白质的cDNA与编码单克隆抗体或抗体片段的cDNA连接，构建编码融合抗体的DNA，将该DNA插入到原核生物或真核生物用表达载体中，并将该表达载体导入到原核生物或真核生物中，由此使其表达，制造融合抗体。
在将本发明中的抗体的衍生物用于人FOLR1的免疫学检测或测定、人FOLR1阳性细胞相关的疾病的诊断的情况下，作为与特异性识别并结合本发明的人FOLR1的氨基酸序列或其空间结构的单克隆抗体或该抗体片段的H链或L链的N末端侧或C末端侧、抗体或该抗体片段中的适当的取代基或侧链、以及单克隆抗体或该抗体片段中的糖链等结合的药剂，也可以选择通常的免疫学检测或测定方法中使用的标记物。
作为标记物，可以列举例如：碱性磷酸酶、过氧化物酶或荧光素酶等酶；吖啶酯或洛酚碱等发光物质；或者，异硫氰酸荧光素(FITC)或三甲基罗丹明(RITC)等荧光物质；等。
另外，本发明涉及含有本发明的单克隆抗体或该抗体片段作为有效成分的FOLR1阳性细胞相关的疾病的治疗剂。
作为FOLR1阳性细胞相关的疾病，只要是表达了FOLR1的细胞相关的疾病则可以为任意疾病，可以列举例如癌症。
作为癌症，可以列举例如：血癌、乳腺癌、子宫癌、大肠癌、食道癌、胃癌、卵巢癌、肺癌、肾癌、直肠癌、甲状腺癌、子宫颈癌、小肠癌、前列腺癌、间皮瘤或胰腺癌等，优选列举卵巢癌、肾癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌或间皮瘤。
作为本发明的治疗剂，含有上述的本发明的单克隆抗体或该抗体片段或者它们的衍生物作为有效成分。
含有本发明的抗体或该抗体片段或者它们的衍生物的治疗剂可以仅含有作为有效成分的该抗体或该抗体片段或者它们的衍生物，但通常优选以与药理学上可容许的一种以上的载体一同混合并通过制剂学技术领域中公知的任意方法制造而成的医药制剂的形式来提供。
给药途径优选使用治疗时最有效的途径，可以列举：经口给药、或者口腔内、气管内、直肠内、皮下、肌肉内或静脉内等非经口给药，优选列举静脉内给药。
作为给药形式，可以列举例如：喷雾剂、胶囊剂、片剂、散剂、颗粒剂、糖浆剂、乳剂、栓剂、注射剂、软膏或胶带剂等。
给药量或给药次数根据目标治疗效果、给药方法、治疗时间、年龄和体重等而不同，通常成人每天为10μg/kg～10mg/kg。
本发明的治疗剂可以单独使用，也可以与前述的放射性同位素、低分子药剂、高分子药剂、蛋白质或抗体药品中至少一种治疗剂联用。作为本发明的治疗剂与其他治疗剂的联用方法，与本发明的治疗剂联用的治疗剂可以与本发明的治疗剂同时进行给药，也可以连续给药。
此外，本发明涉及使用本发明的单克隆抗体或该抗体片段的人FOLR1或人FOLR1阳性细胞的免疫学检测或测定方法。
本发明中的免疫学检测或测定方法是指使用实施过标记的抗原或抗体来检测或测定抗体量或抗原量的方法。作为FOLR1的免疫学检测或测定方法，具体而言，可以列举：放射免疫测定法(RIA)、酶免疫测定法(EIA或ELISA)、荧光免疫测定法(FIA)、发光免疫测定法(luminescent immunoassay)、蛋白免疫印迹法、免疫沉淀法、荧光细胞染色法、免疫组织染色法或通过物理化学方法等检测或测定FOLR1或FOLR1阳性细胞的方法。
另外，本发明涉及一种人FOLR1阳性细胞相关的疾病的诊断方法，其包括：使用本发明的单克隆抗体或该抗体片段对人FOLR1阳性细胞进行检测或测定。
在对FOLR1阳性细胞进行检测或测定时，可以使用前述的公知的免疫学检测法。优选使用免疫沉淀法、荧光细胞染色法或免疫组织染色法等。另外，也可以使用FMAT8100HTS系统(应用生物系统公司制造)等的荧光抗体染色法等。
本发明中，作为成为对FOLR1阳性细胞进行检测或测定的对象的生物体试样，只要是组织细胞、血液、血浆、血清、胰液、尿液、粪便、组织液或培养液等可能包含表达了FOLR1的细胞的生物体试样则没有特别限定。
作为本发明中的人FOLR1阳性细胞相关的疾病的诊断方法，可以列举例如如下方法：将在作为检测或测定的对象的生物体试样中观测到的FOLR1阳性细胞数作为诊断为人FOLR1阳性细胞相关的疾病的指标。
本发明涉及一种人FOLR1阳性细胞相关的疾病的诊断剂，其含有本发明的单克隆抗体或该抗体片段作为有效成分。
作为本发明的诊断剂，含有上述的本发明的单克隆抗体或该抗体片段或者它们的衍生物作为有效成分。
本发明的诊断剂可以根据目标诊断法而含有用于进行抗原抗体反应的试剂、该反应的检测用试剂。作为用于进行抗原抗体反应的试剂，可以列举缓冲液、盐等。作为检测用试剂，可以列举识别该单克隆抗体或该抗体片段或者它们的衍生物的标记的二次抗体、或与标记对应的基质等通常的免疫学检测或测定方法中使用的试剂。
以下，对本发明的抗体的制造方法、疾病的治疗方法和疾病的诊断方法进行具体说明。
1.单克隆抗体的制造方法
(1)抗原的制备
作为抗原的FOLR1或表达了FOLR1的细胞可以通过将包含编码全长或部分长度的FOLR1的cDNA的表达载体导入大肠杆菌、酵母、昆虫细胞或动物细胞等中而得到。另外，可以从大量表达了FOLR1的各种人肿瘤培养细胞、人组织等中纯化得到FOLR1。另外，也可以直接使用该肿瘤培养细胞或该组织等作为抗原。此外，也可以通过Fmoc法或tBoc法等化学合成方法制备具有FOLR1的部分序列的合成肽来作为抗原使用。
本发明中使用的FOLR1可以通过使用Molecular Cloning,ALaboratory Manual，第二版，冷泉港实验室出版社(1989)或CurrentProtocols inmolecular Biology，约翰威立父子出版公司(1987-1997)等中记载的方法等利用例如以下的方法使编码该FOLR1的DNA在宿主细胞中进行表达来制造。
首先，将包含编码FOLR1的部分的全长cDNA插入到适当的表达载体的启动子的下游，由此制作表达载体。也可以使用基于全长cDNA而制备的、包含编码多肽的部分的适当长度的DNA片段来代替上述全长cDNA。接着，将得到的该表达载体导入到适合于该表达载体的宿主细胞中，由此可以得到生产多肽的转化体。
作为表达载体，只要是能够在所使用的宿主细胞中自主复制或者能够整合到染色体中并且在能够转录编码多肽的DNA的位置含有适当的启动子的表达载体，则均可以使用。
作为宿主细胞，只要是大肠杆菌等属于埃希氏菌属等的微生物、酵母、昆虫细胞或动物细胞等能够表达目的基因的宿主细胞，则均可以使用。
在使用大肠杆菌等原核生物作为宿主细胞的情况下，表达载体优选为在原核生物中能够自主复制的同时包含启动子、核糖体结合序列、包含编码FOLR1的部分的DNA和转录终止序列的载体。另外，该表达载体不一定需要转录终止序列，但优选在紧邻结构基因的下游配置转录终止序列。该表达载体可以进一步含有调控启动子的基因。
作为该表达载体，优选使用将作为核糖体结合序列的夏因-达尔加诺(Shine-Dalgarno)序列(也称为SD序列)与起始密码子的间隔调节至适当距离(例如6～18个碱基)的质粒。
另外，作为编码该FOLR1的DNA的碱基序列，可以对碱基进行取代以形成最适于在宿主内表达的密码子，由此，能够提高目标FOLR1的生产率。
作为表达载体，只要是能够在所使用的宿主细胞中发挥功能的载体则均可以使用，可以列举例如：pBTrp2、pBTac1、pBTac2(以上为罗氏诊断公司制造)、pKK233-2(法玛西亚公司制造)、pSE280(英杰公司制造)、pGEMEX-1(普洛麦格公司制造)、pQE-8(凯杰公司制造)、pKYP10(日本特开昭58-110600号公报)、pKYP200[AgriculturalBiological Chemistry,48,669(1984)]、pLSA1[Agric Biol.Chem.,53,277(1989)]、pGEL1[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,4306(1985)]、pBluescript II SK(-)(ストラタジーン公司制造)、pTrs30[由大肠杆菌JM109/pTrS30(FERM BP-5407)制备]、pTrs32[由大肠杆菌JM109/pTrS32(FERM BP-5408)制备]、pGHA2[由大肠杆菌IGHA2(FERM BP-400)制备，日本特开昭60-221091号公报]、pGKA2[由大肠杆菌IGKA2(FERM BP6798)制备，日本特开昭60-221091号公报]、pTerm2(US4686191、US4939094、US5160735)、pSupex、pUB110、pTP5、pC194、pEG400[J.Bacteriol.,172,2392(1990)]、pGEX(法玛西亚公司制造)、pET系统(ノバジェン公司制造)或pME18SFL3等。
作为启动子，只要是能够在所使用的宿主细胞中发挥功能的启动子则均可以使用。可以列举例如：trp启动子(Ptrp)、lac启动子、PL启动子、PR启动子或T7启动子等来源于大肠杆菌或噬菌体等的启动子。另外，也可以使用将两个Ptrp串联而得到的串联启动子、tac启动子、lac T7启动子或let I启动子等经过人为设计修饰的启动子等。
作为宿主细胞，可以列举例如：大肠杆菌XL-1Blue、大肠杆菌XL2-Blue、大肠杆菌DH1、大肠杆菌MC1000、大肠杆菌KY3276、大肠杆菌W1485、大肠杆菌JM109、大肠杆菌HB101、大肠杆菌No.49、大肠杆菌W3110、大肠杆菌NY49或大肠杆菌DH5α等。
作为向宿主细胞中导入表达载体的方法，只要是向所使用的宿主细胞中导入DNA的方法则均可以使用，可以列举例如：使用钙离子的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,69,2110(1972)；Gene,17,107(1982)；Molecular & General Genetics,168,111(1979)]。
在使用动物细胞作为宿主的情况下，作为表达载体，只要是能够在动物细胞中发挥功能的表达载体则均可以使用，可以列举例如：pcDNA I、pcDM8(フナコシ公司制造)、pAGE107[日本特开平3-22979号公报；Cytotechnology,3,133(1990)]、pAS3-3(日本特开平2-227075号公报)、pcDM8[Nature,329,840(1987)]、pcDNA I/Amp(英杰公司制造)、pcDNA3.1(英杰公司制造)、pREP4(英杰公司制造)、pAGE103[J.Biochemistry,101,1307(1987)]、pAGE210、pME18SFL3或pKANTEX93(国际公开第97/10354号)等。
作为启动子，只要是能够在动物细胞中发挥功能的启动子则均可以使用，可以列举例如：巨细胞病毒(CMV)的即刻早期(IE)基因的启动子、SV40的早期启动子、逆转录病毒的启动子、金属硫蛋白启动子、热休克启动子、SRα启动子或者莫洛尼小鼠白血病病毒的启动子或增强子等。另外，也可以将人CMV的IE基因的增强子与启动子一同使用。
作为宿主细胞，可以列举例如：人白血病细胞那马瓦(Namalwa)细胞、猿细胞COS细胞、中国仓鼠卵巢细胞CHO细胞(Journal ofExperimental Medicine,108,945(1958)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA,60,1275(1968)；Genetics,55,513(1968)；Chromosoma,41,129(1973)；Methods in Cell Science,18,115(1996)；Radiation Research,148,260(1997)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77,4216(1980)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA,60,1275(1968)；Cell,6,121(1975)；Molecular Cellgenetics,Appendix I,II(pp.883-900))、CHO/DG44、CHO-K1(ATCC编号：CCL-61)、DUkXB11(ATCC编号：CCL-9096)、Pro-5(ATCC编号：CCL-1781)、CHO-S(Life Technologies,Cat#11619)、Pro-3、大鼠骨髓瘤细胞YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20(或者也称为YB2/0)、小鼠骨髓瘤细胞NS0、小鼠骨髓瘤细胞SP2/0-Ag14、叙利亚仓鼠细胞BHK或HBT5637(日本特开昭63-000299号公报)等。
作为向宿主细胞中导入表达载体的方法，只要是向动物细胞中导入DNA的方法则均可以使用。可以列举例如：电穿孔法[Cytotechnology,3,133(1990)]、磷酸钙法(日本特开平2-227075号公报)或脂质体转染法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84,7413(1987)]等。
将如上得到的包含整合有编码FOLR1的DNA的表达载体的来源于微生物或动物细胞等的转化体在培养基中进行培养，在培养物中生成并蓄积该FOLR1，并从该培养物中进行收集，由此可以制造FOLR1。将该转化体在培养基中进行培养的方法可以根据宿主的培养中使用的通常的方法来进行。
在来源于真核生物的细胞中进行表达时，能够得到附加有糖或糖链的FOLR1。
在对利用使用诱导性启动子的表达载体进行转化后的微生物进行培养时，可以根据需要向培养基中添加诱导物。例如，在对利用使用lac启动子的表达载体进行转化后的微生物进行培养时，可以向培养基中添加异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷等，在对利用使用trp启动子的表达载体进行转化后的微生物进行培养时，可以向培养基中添加吲哚丙烯酸等。
作为用于培养以动物细胞为宿主而得到的转化体的培养基，可以使用例如通常使用的RPMI1640培养基[The Journal of the AmericanMedical Association,199,519(1967)]、伊戈尔(Eagle)的MEM培养基[Science,122,501(1952)]、杜尔贝科(Dulbecco)改良的MEM培养基[Virology,8,396(1959)]、199培养基[Proc.Soc.Exp.Biol.Med.,73,1(1950)]、伊思考夫(Iscove)改良的杜尔贝科培养基(IMDM)或者向这些培养基中添加胎牛血清(FBS)等而得到的培养基等。培养通常在pH6～8、30～40℃、5％CO2存在下等条件下进行1～7天。另外，在培养中，可以根据需要向培养基中添加卡那霉素或青霉素等抗生素。
作为编码FOLR1的基因的表达方法，除了直接表达以外，还可以使用分泌生产或融合蛋白表达等方法[Molecular Cloning,A LaboratoryManual，第二版，冷泉港实验室出版社(1989)]。
作为FOLR1的生产方法，有在宿主细胞内生产的方法、分泌到宿主细胞外的方法或者在宿主细胞外膜上生产的方法，可以通过改变所使用的宿主细胞或所生产的FOLR1的结构来选择适当的方法。
在宿主细胞内或宿主细胞外膜上生产FOLR1的情况下，通过使用鲍尔森等人的方法[J.Biol.Chem.,264,17619(1989)]、罗等人的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,86,8227(1989)；Genes Develop.,4,1288(1990)]、日本特开平05-336963号公报或国际公开第94/23021号等中记载的方法，可以使FOLR1主动地分泌到宿主细胞外。
另外，还可以利用使用二氢叶酸还原酶基因等的基因扩增系统(日本特开平2-227075号公报)来提高FOLR1的生产量。
所得到的FOLR1例如可以如下进行分离、纯化。
在FOLR1在细胞内以溶解状态进行表达的情况下，在培养结束后通过离心分离来回收细胞，悬浮于水性缓冲液中，然后，利用超声波破碎机、法式压滤壶、MANTON-GULIN匀浆器或卧式砂磨机等将细胞破碎，得到无细胞提取液。
通过单独使用或组合使用通常的蛋白质的分离纯化方法、即溶剂提取法、利用硫酸铵等的盐析法、脱盐法、利用有机溶剂的沉淀法、使用二乙氨基乙基(DEAE)-琼脂糖、DIAION HPA-75(三菱化学公司制造)等树脂的阴离子交换层析法、使用S-Sepharose FF(法玛西亚公司制造)等树脂的阳离子交换层析法、使用丁基琼脂糖、苯基琼脂糖等树脂的疏水层析法、使用分子筛的凝胶过滤法、亲和层析法、聚焦层析法或者等电点电泳等电泳法等方法，可以从对上述无细胞提取液进行离心分离而得到的上清中得到纯化制备品。
在FOLR1在细胞内形成包涵体而进行表达的情况下，与上述同样地将细胞回收后进行破碎，并进行离心分离，由此，以沉淀级分的形式回收该FOLR1的包涵体。利用蛋白变性剂使回收的该FOLR1的包涵体可溶化。通过对该可溶化液进行稀释或透析，使该FOLR1恢复至正常的空间结构，然后，通过与上述同样的分离纯化方法，可以得到多肽的纯化制备品。
在FOLR1或其糖基化物等衍生物被分泌到细胞外的情况下，可以在培养上清中回收该FOLR1或其糖基化物等衍生物。将该培养物与上述同样地利用离心分离等方法进行处理，由此得到可溶性级分，通过使用与上述同样的分离纯化方法，可以从该可溶性级分中得到纯化制备品。
另外，本发明中使用的FOLR1也可以通过Fmoc法或tBoc法等化学合成法来制造。另外，还可以利用アドバンストケムテック公司、珀金埃尔默公司、法玛西亚公司、プロテインテクノロジインストルメント公司、シンセセル－ベガ公司、パーセプチブ公司或岛津制作所等制造的肽合成仪进行化学合成。
(2)动物的免疫与融合用抗体产生细胞的制备
对3～20周龄的小鼠、大鼠或仓鼠等动物进行(1)中得到的抗原的免疫，收集该动物的脾脏、淋巴结、末梢血中的抗体产生细胞。另外，在免疫原性低而无法在上述动物中观察到充分的抗体效价的升高的情况下，也可以使用FOLR1敲除小鼠作为被免疫动物。
免疫通过将抗原连同例如完全弗氏佐剂或者氢氧化铝凝胶和百日咳菌疫苗等适当的佐剂一同给用到动物的皮下、静脉内或腹腔内来进行。在抗原为部分肽的情况下，与BSA(牛血清白蛋白)或KLH(钥孔血蓝蛋白，Keyhole Limpet Hemocyanin)等载体蛋白制成结合物，将其作为免疫原使用。
关于抗原的给用，在第一次给用之后，每隔1～2周给用2～10次。每次给用后第3～7天从眼底静脉丛采血，利用酶免疫测定法[Antibodies-A Laboratory Manual，冷泉港实验室(1988)]等测定其血清的抗体效价。将其血清对免疫所用的抗原显示出充分的抗体效价的动物作为融合用抗体产生细胞的供给源。
在抗原的末次给用后第3～7天，从免疫后的动物中摘除脾脏等含有抗体产生细胞的组织，收集抗体产生细胞。在使用脾脏细胞的情况下，将脾脏细细切碎并搅散后，进行离心分离，进而除去红细胞，得到融合用抗体产生细胞。
(3)骨髓瘤细胞的制备
作为骨髓瘤细胞，使用由小鼠得到的确立细胞系，可以使用例如：8-氮杂鸟嘌呤抗性小鼠(BALB/c来源)骨髓瘤细胞株P3-X63Ag8-U1(P3-U1)[Current Topics in Microbiology and Immunology,18,1(1978)]、P3-NS1/1Ag41(NS-1)[European J.Immunology,6,511(1976)]、SP2/0-Ag14(SP-2)[Nature,276,269(1978)]、P3-X63-Ag8653(653)[J.Immunology,123,1548(1979)]、或P3-X63-Ag8(X63)[Nature,256,495(1975)]等。
将该骨髓瘤细胞在正常培养基[添加有谷氨酰胺、2-巯基乙醇、庆大霉素、FBS和8-氮杂鸟嘌呤的RPMI1640培养基]中传代，在细胞融合的3～4天之前传代到正常培养基中，以便在融合当天确保2×107个以上的细胞数。
(4)细胞融合与单克隆抗体产生杂交瘤的制备
将(2)中得到的融合用抗体产生细胞和(3)中得到的骨髓瘤细胞用最低必需培养基(MEM)或PBS(磷酸氢二钠1.83g、磷酸二氢钾0.21g、氯化钠7.65g、蒸馏水1升、pH7.2)充分洗涤，以使细胞数达到融合用抗体产生细胞:骨髓瘤细胞＝5～10:1的方式进行混合，离心分离后，弃去上清。
将沉淀的细胞群充分搅散后，在37℃下边搅拌边加入聚乙二醇-1000(PEG-1000)、MEM培养基和二甲亚砜的混合液。进而，每隔1～2分钟加入1～2mL的MEM培养基，重复数次后，加入MEM培养基至总量达到50mL。离心分离后，除去上清。将沉淀的细胞群轻轻搅散后，将融合用抗体产生细胞轻轻地悬浮于HAT培养基[添加有次黄嘌呤、胸腺嘧啶核苷和氨基蝶呤的正常培养基]中。将该悬浮液在5％CO2的培养箱中在37℃下培养7～14天。
培养后，抽取一部分培养上清，通过后述的结合分析等杂交瘤的筛选方法筛选与包含FOLR1的抗原反应且不与不含FOLR1的抗原反应的细胞群。然后，利用有限稀释法重复进行两次克隆[第一次使用HT培养基(从HAT培养基中除去氨基蝶呤的培养基)，第二次使用正常培养基]，筛选稳定地观察到强抗体效价的细胞作为产生单克隆抗体的杂交瘤。
(5)纯化单克隆抗体的制备
对姥鲛烷处理[腹腔内给用0.5mL的2,6,10,14-四甲基十五碳烷(姥鲛烷)并饲养2周]后的8～10周龄的小鼠或裸鼠腹腔内注射(4)中得到的产生单克隆抗体的杂交瘤。在10～21天杂交瘤产生癌性腹水。从该小鼠中收集腹水，离心分离除去固体成分后，用40～50％的硫酸铵进行盐析，利用辛酸沉淀法、DEAE-琼脂糖柱、蛋白A柱或凝胶过滤柱进行纯化，收集IgG或IgM级分，得到纯化单克隆抗体。
另外，将(4)中得到的产生单克隆抗体的杂交瘤在添加有10％FBS的RPMI1640培养基等中进行培养，然后，通过离心分离除去上清，悬浮于杂交瘤-SFM培养基中，培养3～7天。将得到的细胞悬浮液离心分离，由所得到的上清利用蛋白A柱或蛋白G柱进行纯化，收集IgG级分，由此也可以得到纯化单克隆抗体。另外，杂交瘤-SFM培养基中也可以添加5％ダイゴGF21。
抗体亚类的确定使用亚类分型试剂盒通过酶免疫测定法来进行。蛋白量的定量通过劳里法或280nm下的吸光度来计算。
(6)单克隆抗体的筛选
单克隆抗体的筛选通过以下所示的利用酶免疫测定法的结合分析、以及利用Biacore的动力学分析来进行。
(6-a)结合分析
作为抗原，使用将(1)中得到的包含编码FOLR1的cDNA的表达载体导入大肠杆菌、酵母、昆虫细胞或动物细胞等中而得到的基因导入细胞、重组蛋白或者由人组织得到的纯化多肽或部分肽等。在抗原为部分肽的情况下，可以与BSA或KLH等载体蛋白制成结合物并使用该结合物。
将抗原分注到96孔板等板中使其固相化，然后，分注血清、杂交瘤的培养上清或纯化单克隆抗体等受试物质作为第一抗体，使其发生反应。用PBS或PBS-吐温等充分洗涤后，分注由生物素、酶、化学发光物质或放射线化合物等标记的抗免疫球蛋白抗体作为第二抗体，使其发生反应。用PBS-吐温充分洗涤后，进行与第二抗体的标记物质对应的反应，筛选出对免疫原发生特异性反应的单克隆抗体。
另外，本发明的与抗FOLR1单克隆抗体竞争地与FOLR1结合的单克隆抗体可以通过在上述结合分析体系中添加受试抗体并使其发生反应来获得。即，通过筛选出在加入受试抗体后单克隆抗体的结合受到抑制的抗体，能够获得与获得的单克隆抗体竞争性地与FOLR1的氨基酸序列或其空间结构结合的单克隆抗体。
此外，同与本发明的与FOLR1的氨基酸序列或其空间结构结合的单克隆抗体所识别的表位相同的表位结合的抗体可以通过鉴定利用上述结合分析体系获得的抗体的表位并制作所鉴定的表位的部分合成肽或模拟表位的空间结构的合成肽等并用其进行免疫来获得。
(6-b)利用Biacore的动力学分析
使用Biacore T100，测定抗原与受试物之间的结合的动力学，利用设备附带的分析软件对其结果进行分析。利用胺偶联法将抗小鼠IgG抗体固定到传感芯片CM5上，然后，使杂交瘤培养上清或纯化单克隆抗体等受试物质流过而使其以适当量进行结合，进而，使浓度已知的多种浓度的抗原流过，测定结合、解离。使用设备附带的软件，利用1:1结合模型对所得到的数据进行动力学分析，得到各种参数。
或者，利用例如胺偶联法将人FOLR1固定到传感芯片上，然后，使浓度已知的多种浓度的纯化单克隆抗体流过，测定结合、解离。使用设备附带的软件，利用二价结合模型对所得到的数据进行动力学分析，得到各种参数。
2.基因重组抗体的制作
作为基因重组抗体的制作例，以下示出人嵌合抗体和人CDR移植抗体的制作方法。
(1)基因重组抗体表达用载体的构建
基因重组抗体表达用载体是整合有编码人抗体的CH和CL的DNA的动物细胞用表达载体，可以通过将编码人抗体的CH和CL的DNA分别克隆到动物细胞用表达载体中来构建。
人抗体的C区可以使用任意的人抗体的CH和CL。例如，使用人抗体的γ1亚类的CH和κ类的CL等。作为编码人抗体的CH和CL的DNA，使用cDNA，也可以使用由外显子和内含子构成的染色体DNA。
作为动物细胞用表达载体，只要是能够整合并表达编码人抗体的C区的基因的载体则均可以使用。可以列举例如：pAGE107[Cytotechnol.,3,133(1990)]、pAGE103[J.Biochem.,101,1307(1987)]、pHSG274[Gene,27,223(1984)]、pKCR[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,78,1527(1981)]、pSG1bd2-4[Cytotechnol.,4,173(1990)]或pSE1UK1Sed1-3[Cytotechnol.,13,79(1993)]等。
作为动物细胞用表达载体中的启动子和增强子，使用SV40的早期启动子[J.Biochem.,101,1307(1987)]、莫洛尼小鼠白血病病毒的LTR[Biochem.Biophys.Res.Commun.,149,960(1987)]或免疫球蛋白H链的启动子[Cell,41,479(1985)]和增强子[Cell,33,717(1983)]等。
从基因重组抗体表达载体的构建的容易度、向动物细胞中导入的容易度、抗体H链与L链在动物细胞内的表达量的平衡均衡等观点出发，作为基因重组抗体表达用载体，使用抗体H链和L链存在于同一载体上的类型(串联型)的基因重组抗体表达用载体[J.Immunol.Methods,167,271(1994)]，但也可以使用抗体H链和L链存在于不同载体上的类型。作为串联型基因重组抗体表达用载体，使用pKANTEX93(国际公开第97/10354号公报)、pEE18[杂交瘤,17,559(1998)]等。
(2)编码来源于人以外的动物的抗体的V区的cDNA的获得和氨基酸序列的分析
编码非人抗体的VH和VL的cDNA的获得和氨基酸序列的分析可以如下进行。
从产生非人抗体的杂交瘤细胞中提取mRNA，并合成cDNA。将合成的cDNA克隆到噬菌体或质粒等载体中，制作cDNA文库。
使用编码小鼠抗体的C区部分或V区部分的DNA作为探针，从上述文库中分别分离出具有编码VH或VL的cDNA的重组噬菌体或重组质粒。分别确定重组噬菌体或重组质粒上的作为目标的小鼠抗体的VH或VL的全长碱基序列，由碱基序列分别推定VH或VL的全长氨基酸序列。
作为用于制作产生非人抗体的杂交瘤细胞的人以外的动物，使用小鼠、大鼠、仓鼠或兔等，但只要能够制作杂交瘤细胞，则可以使用任意动物。
由杂交瘤细胞制备总RNA时，使用异硫氰酸胍三氟乙酸铯法[Methods in Enzymol.,154,3(1987)]、或者RNA easy试剂盒(凯杰公司制造)等试剂盒等。
由总RNA制备mRNA时，使用固定有寡聚(dT)的纤维素柱法[Molecular Cloning,A Laboratory Manual，第二版，冷泉港实验室出版社(1989)]、或者Oligo-dT30<Super>mRNA纯化试剂盒(宝生物公司制造)等试剂盒等。另外，也可以使用Fast Track mRNA分离试剂盒(英杰公司制造)或QuickPrep mRNA纯化试剂盒(法玛西亚公司制造)等试剂盒从杂交瘤细胞中制备mRNA。
在合成cDNA和制作cDNA文库时，使用公知的方法[MolecularCloning，A Laboratory Manual，第二版，冷泉港实验室出版社(1989)；Current Protocols in Molecular Biology，附录1，约翰威立父子出版公司(1987-1997)]、用于cDNA合成和质粒克隆的SuperScript质粒系统(英杰公司制造)或ZAP-cDNA合成试剂盒(ストラタジーン公司制造)等试剂盒等。
制作cDNA文库时，作为用于整合以由杂交瘤细胞提取出的mRNA为模板而合成的cDNA的载体，只要是能够整合该cDNA的载体则均可以使用。例如，使用ZAP ExPress[Strategies,5,58(1992)]、pBluescript II SK(+)[Nucleic Acids Research,17,9494(1989)]、λZAPII(ストラタジーン公司制造)、λgt10、λgt11[DNA Cloning:A PracticalApproach,I,49(1985)]、Lambda BlueMid(クローンテック公司制造)、λEx Cell、pT7T3-18U(法玛西亚公司制造)、pcD2[Mol.Cell.Biol.,3,280(1983)]或pUC18[Gene,33,103(1985)]等。
作为用于导入由噬菌体或质粒载体构建的cDNA文库的大肠杆菌，只要是能够导入、表达和保持该cDNA文库的大肠杆菌则均可以使用。例如，使用XL-1Blue MRF[Strategies,5,81(1992)]、C600[Genetics,39,440(1954)]、Y1088、Y1090[Science,222,778(1983)]、NM522[J.Mol.Biol.,166,1(1983)]、K802[J.Mol.Biol.,16,118(1966)]、或JM105[Gene,38,275(1985)]等。
从cDNA文库中筛选编码非人抗体的VH或VL的cDNA克隆时，使用利用同位素或荧光标记的探针的菌落杂交法或噬菌斑杂交法[Molecular Cloning,A Laboratory Manual，第二版，冷泉港实验室出版社(1989)]等。
另外，也可以通过如下方法制备编码VH或VL的cDNA：制备引物，以由mRNA合成的cDNA或cDNA文库为模板来进行聚合酶链反应法[以下记作PCR法；Molecular Cloning,A Laboratory Manual，第二版，冷泉港实验室出版社(1989)；Current Protocolsin Molecular Biology，附录1，约翰威立父子出版公司(1987-1997)]。
将筛选出的cDNA用适当的限制性酶等切断后，克隆到pBluescriptSK(-)(ストラタジーン公司制造)等质粒中，利用通常使用的碱基序列分析方法等确定该cDNA的碱基序列。作为碱基序列分析方法，例如，在进行双脱氧法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74,5463(1977)]等反应后，使用ABI PRISM3700(PE生物系统公司制造)或A.L.F.DNA测序仪(法玛西亚公司制造)等碱基序列自动分析装置等。
由确定的碱基序列分别推定VH和VL的全长氨基酸序列，并与已知的抗体的VH和VL的全长氨基酸序列[A.L.F.DNA，美国卫生与公众服务部(1991)]进行比较，由此，分别确认所获得的cDNA是否编码包含分泌信号序列的抗体的VH和VL的完整氨基酸序列。
关于包含分泌信号序列的抗体的VH和VL的完整氨基酸序列，通过与已知的抗体的VH和VL的全长氨基酸序列[A.L.F.DNA，美国卫生与公众服务部(1991)]进行比较，能够推定分泌信号序列的长度和N末端氨基酸序列，进而能够获知它们所属的亚类。另外，关于VH和VL的各CDR的氨基酸序列，也可以通过与已知的抗体的VH和VL的氨基酸序列[A.L.F.DNA，美国卫生与公众服务部(1991)]进行比较来找出。
另外，使用所得到的VH和VL的完整氨基酸序列，对例如SWISS-PROT或PIR-Protein等任意的数据库进行BLAST法[J.Mol.Biol.,215,403(1990)]等同源性检索，能够确认VH和VL的完整氨基酸序列是否是新的氨基酸序列。
(3)人嵌合抗体表达载体的构建
将分别编码非人抗体的VH或VL的cDNA分别克隆到(1)中得到的基因重组抗体表达用载体的编码人抗体的CH或CL的各基因的上游，由此，能够构建人嵌合抗体表达载体。
为了将编码非人抗体的VH或VL的cDNA的3’末端侧与人抗体的CH或CL的5’末端侧连接，制作以如下方式设计的VH和VL的cDNA：连接部分的碱基序列编码适当的氨基酸，并且成为适当的限制性酶识别序列。
将所制作的VH和VL的cDNA分别克隆到(1)中得到的人CDR移植抗体表达用载体的编码人抗体的CH或CL的各基因的上游，以使它们以适当的形式进行表达，从而构建人嵌合抗体表达载体。
另外，也可以使用在两端具有适当的限制性酶的识别序列的合成DNA，通过PCR法对编码非人抗体VH或VL的cDNA分别进行扩增，并将它们克隆到(1)中得到的基因重组抗体表达用载体中。
(4)编码人CDR移植抗体的V区的cDNA的构建
编码人CDR移植抗体的VH或VL的cDNA可以如下构建。
分别选择用于移植非人抗体的VH或VL的CDR的氨基酸序列的人抗体的VH或VL的FR的氨基酸序列。作为所选择的FR的氨基酸序列，只要是人抗体来源的氨基酸序列则均可以使用。
例如，使用蛋白数据库(Protein Data Bank)等数据库中登记的人抗体的FR的氨基酸序列或人抗体的FR的各亚群的共有氨基酸序列[A.L.F.DNA，美国卫生与公众服务部(1991)]等。为了抑制抗体的结合活性的降低，选择与原抗体的VH或VL的FR的氨基酸序列具有尽量高的同源性(至少60％以上)的FR的氨基酸序列。
接着，向所选择的人抗体的VH或VL的FR的氨基酸序列中分别移植原抗体的CDR的氨基酸序列，从而分别设计出人CDR移植抗体的VH或VL的氨基酸序列。考虑抗体基因的碱基序列中出现的密码子的使用频率[A.L.F.DNA，美国卫生与公众服务部(1991)]，将所设计的氨基酸序列转换成DNA序列，从而分别设计出编码人CDR移植抗体的VH或VL的氨基酸序列的DNA序列。
基于所设计的DNA序列，合成多条包含约100个碱基的长度的合成DNA，使用这些合成DNA进行PCR反应。这种情况下，从PCR反应中的反应效率和能够合成的DNA的长度考虑，优选对于H链、L链均设计6条合成DNA。
另外，通过在位于两端的合成DNA的5’末端导入适当的限制性酶的识别序列，可以容易地将编码人CDR移植抗体的VH或VL的cDNA克隆到(1)中得到的人CDR移植抗体表达用载体中。
或者，可以通过使用基于所设计的DNA序列合成为1条DNA的各H链、L链全长合成DNA来实施。PCR反应后，将扩增产物分别克隆到pBluescript SK(-)(ストラタジーン公司制造)等质粒中，通过与(2)中记载的方法同样的方法来确定碱基序列，从而获得具有编码期望的人CDR移植抗体的VH或VL的氨基酸序列的DNA序列的质粒。
(5)人CDR移植抗体的V区的氨基酸序列的修饰
仅将非人抗体的VH和VL的CDR移植到人抗体的VH和VL的FR中时，人CDR移植抗体的抗原结合活性与原来的非人抗体相比降低[BIO/TECHNOLOGY,9,266(1991)]。
在人CDR移植抗体中，鉴定出人抗体的VH和VL的FR的氨基酸序列中直接与抗原的结合相关的氨基酸残基、与CDR的氨基酸残基相互作用的氨基酸残基以及维持抗体的空间结构并间接与抗原的结合相关的氨基酸残基，将这些氨基酸残基取代为原来的非人抗体的氨基酸残基，由此能够使降低的抗原结合活性升高。
为了鉴定与抗原结合活性相关的FR的氨基酸残基，可以通过使用X射线晶体分析[J.Mol.Biol.,112,535(1977)]或计算机模拟分析[Protein Engineering,7,1501(1994)]等来进行抗体的空间结构的构建和分析。另外，通过针对各个抗体制作多种修饰体并反复研究它们与抗原结合活性的相关性来进行各种尝试，能够获得具有所需要的抗原结合活性的修饰人CDR移植抗体。
人抗体的VH和VL的FR的氨基酸残基可以通过使用修饰用合成DNA进行(4)中记载的PCR反应来进行修饰。对于PCR反应后的扩增产物，通过(2)中记载的方法来确定碱基序列，从而确认已实施了目标修饰。
(6)人CDR移植抗体表达载体的构建
将所构建的编码基因重组抗体的VH或VL的cDNA分别克隆到(1)中得到的基因重组抗体表达用载体的编码人抗体的CH或CL的各基因的上游，从而可以构建人CDR移植抗体表达载体。
例如，通过向(4)和(5)中得到的构建人CDR移植抗体的VH或VL时使用的合成DNA中、位于两端的合成DNA的5’末端导入适当的限制性酶的识别序列，将所构建的VH或VL的cDNA分别克隆到(1)中得到的人CDR移植抗体表达用载体的编码人抗体的CH或CL的各基因的上游，以使它们以适当的形式进行表达。
(7)基因重组抗体的瞬时表达
使用(3)和(6)中得到的基因重组抗体表达载体或者对上述载体进行修饰后的表达载体来进行基因重组抗体的瞬时表达，从而能够有效地评价所制作的多种人CDR移植抗体的抗原结合活性。
作为用于导入表达载体的宿主细胞，只要是能够表达基因重组抗体的宿主细胞则可以使用任何细胞，例如，使用COS-7细胞(ATCC编号：CRL1651)[Methods in Nucleic Acids Res.,CRC Press,283(1991)]。
向COS-7细胞中导入表达载体时，使用DEAE-右旋糖酐法[Methods in Nucleic Acids Res.,CRC出版社,(1991)]或脂质体转染法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84,7413(1987)]等。
导入表达载体后，培养上清中的基因重组抗体的表达量和抗原结合活性使用酶免疫分析法[Monoclonal Antibodies-Principles and practice，第三版，美国学术出版社(1996)；Antibodies-A Laboratory Manual，冷泉港实验室(1988)；単クローン抗体実験マニュアル，講談社サイエンティフィック(1987)]等进行测定。
(8)稳定表达基因重组抗体的转化株的获得和基因重组抗体的制备
通过将(3)和(6)中得到的基因重组抗体表达载体导入适当的宿主细胞中，能够得到稳定表达基因重组抗体的转化株。
向宿主细胞中导入表达载体时，使用电穿孔法[日本特开平2-257891号公报；Cytotechnology,3,133(1990)]等。
作为用于导入基因重组抗体表达载体的宿主细胞，只要是能够表达基因重组抗体的宿主细胞则可以使用任何细胞。例如，使用：CHO-K1(ATCC编号：CCL-61)、DUkXB11(ATCC编号：CCL-9096)、Pro-5(ATCC编号：CCL-1781)、CHO-S(Life Technologies,Cat#11619)、大鼠骨髓瘤细胞YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20(或者也称为YB2/0)、小鼠骨髓瘤细胞NS0、小鼠骨髓瘤细胞SP2/0-Ag14(ATCC编号：CRL1581)、小鼠P3-X63-Ag8653细胞(ATCC编号：CRL1580)、二氢叶酸还原酶基因缺陷的CHO细胞[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77,4216(1980)]、获得了凝集素抗性的Lec13[Somatic Cell and Molecular Genetics,12,55(1986)]、α1,6-岩藻糖转移酶基因缺陷的CHO细胞(国际公开第2005/035586号、国际公开第02/31140号)、大鼠YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20细胞(ATCC编号：CRL1662)等。
另外，还可以使用与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖的合成相关的酶等蛋白质或与在N-糖苷键复合型糖链的还原末端的N-乙酰葡糖胺的6位上使岩藻糖的1位进行α连接的糖链修饰相关的酶等蛋白质或与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖向高尔基体的转运相关的蛋白质等的活性降低或缺失的宿主细胞、例如α1,6-岩藻糖转移酶基因缺陷的CHO细胞(国际公开第2005/035586号、国际公开第02/31140号)等。
导入表达载体后，通过在含有G418硫酸盐等药剂的动物细胞培养用培养基中进行培养来筛选稳定表达基因重组抗体的转化株(日本特开平2-257891号公报)。
作为动物细胞培养用培养基，使用RPMI1640培养基(英杰公司制造)、GIT培养基(日本制药公司制造)、EX-CELL301培养基(JRH公司制造)、IMDM培养基(英杰公司制造)、杂交瘤-SFM培养基(英杰公司制造)或者在这些培养基中添加有FBS等各种添加物的培养基等。
通过将所得到的转化株在培养基中进行培养，在培养上清中表达并蓄积基因重组抗体。培养上清中的基因重组抗体的表达量和抗原结合活性可以通过ELISA法等来测定。另外，可以利用DHFR扩增系统(日本特开平2-257891号公报)等使转化株的基因重组抗体的表达量升高。
基因重组抗体使用蛋白A柱从转化株的培养上清中进行纯化[Monoclonal Antibodies-Principles and practice，第三版，美国学术出版社(1996)；Antibodies-A Laboratory Manual，冷泉港实验室(1988)]。另外，也可以将凝胶过滤、离子交换层析和超滤等蛋白质纯化中使用的方法进行组合。
纯化后的基因重组抗体的H链、L链或整个抗体分子的分子量可以使用聚丙烯酰胺凝胶电泳法[Nature,227,680(1970)]或蛋白免疫印迹法[Monoclonal Antibodies-Principles and practice，第三版，美国学术出版社(1996)；Antibodies-A Laboratory Manual，冷泉港实验室(1988)]等来测定。
3.纯化单克隆抗体或该抗体片段的活性评价
纯化后的本发明的单克隆抗体或该抗体片段的活性评价可以如下进行。
与FOLR1表达细胞株的结合活性使用上述1.(6-a)中记载的结合分析和(6-b)中记载的利用Biacore系统等的表面等离子体共振法来测定。另外，可以使用荧光抗体法[Cancer Immunol.Immunother.,36,373(1993)]来测定。
对抗原阳性培养细胞株的CDC活性或ADCC活性通过公知的测定方法[Cancer Immunol.Immunother.,36,373(1993)]来测定。
4.调控抗体的效应活性的方法
作为调控本发明的抗FOLR1单克隆抗体的效应活性的方法，已知对结合于抗体的Fc段的第297位的天冬酰胺(Asn)的N连接复合型糖链的还原末端存在的N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)上进行α1,6结合的岩藻糖(也称为核心岩藻糖)的量进行调控的方法(国际公开第2005/035586号、国际公开第2002/31140号、国际公开第00/61739号)或者通过对抗体的Fc段的氨基酸残基进行修饰来进行调控的方法等。对于本发明的抗FOLR1单克隆抗体而言，使用任意一种方法，均能够调控效应活性。
效应活性是指抗体的Fc段介导而引起的抗体依赖性的活性，已知ADCC活性、CDC活性或者由巨噬细胞或树状细胞等吞噬细胞引起的抗体依赖性吞噬作用(Antibody-dependent phagocytosis，ADP活性)等。
作为效应活性的测定方法，例如，可以将作为靶标的癌细胞、作为效应的人末梢血单核细胞(PBMC)混合，再混合癌细胞特异性抗体，孵育约4小时后，测定作为细胞抑制的指标的游离出来的乳酸脱氢酶(LDH)。或者，可以在人PBMC中混合例如识别CD20的各种血液细胞特异性抗原的抗体，孵育后，测定游离LDH、或测定利用流式细胞术得到的该细胞数的减少来作为效应活性。或者，可以在癌性腹水中混合癌细胞特异性抗体，孵育后，测定游离LDH、或测定利用流式细胞术得到的该细胞数的减少来作为效应活性。
通过对抗体的Fc的N连接复合型糖链的核心岩藻糖的含量进行调控，能够增加或降低抗体的效应活性。作为使与抗体的Fc上结合的N连接复合型糖链结合的岩藻糖的含量降低的方法，使用α1,6-岩藻糖转移酶基因缺陷的CHO细胞来表达抗体，由此，可以获得未结合岩藻糖的抗体。未结合岩藻糖的抗体具有高ADCC活性。
另一方面，作为使与抗体的Fc上结合的N连接复合型糖链结合的岩藻糖的含量增加的方法，使用导入有α1,6-岩藻糖转移酶基因的宿主细胞来表达抗体，由此，可以获得结合有岩藻糖的抗体。结合有岩藻糖的抗体具有比未结合岩藻糖的抗体低的ADCC活性。
另外，通过对抗体的Fc段的氨基酸残基进行修饰，能够增加或降低ADCC活性或CDC活性。例如，通过使用美国专利申请公开第2007/0148165号说明书记载的Fc段的氨基酸序列，能够使抗体的CDC活性增加。
另外，通过进行美国专利第6737056号说明书、美国专利第7297775号说明书或美国专利第7317091号说明书记载的氨基酸修饰，能够增加或降低ADCC活性或CDC活性。
此外，通过将上述方法组合而用于一种抗体，能够获得抗体的效应活性得到了调控的抗体。
5.使用本发明的抗FOLR1单克隆抗体或该抗体片段的疾病的治疗方法
本发明的单克隆抗体或该抗体片段可以用于治疗FOLR1阳性细胞相关的疾病。
含有本发明的单克隆抗体或该抗体片段或者它们的衍生物的治疗剂可以仅含有作为有效成分的该抗体或该抗体片段或者它们的衍生物，但通常优选以与药理学上容许的一种以上的载体一同混合并通过制剂学技术领域中公知的方法制造而成的医药制剂的形式来提供。
作为给药途径，可以列举：经口给药、或者口腔内、气管内、直肠内、皮下、肌肉内或静脉内等非经口给药。作为给药形式，可以列举例如：喷雾剂、胶囊剂、片剂、散剂、颗粒剂、糖浆剂、乳剂、栓剂、注射剂、软膏或胶带剂等。
作为适于经口给药的制剂，可以列举例如：乳剂、糖浆剂、胶囊剂、片剂、散剂或颗粒剂等。
乳剂或糖浆剂这样的液体制备物使用如下成分作为添加剂来制造：水、蔗糖、山梨糖醇或果糖等糖类、聚乙二醇或聚丙二醇等二醇类、芝麻油、橄榄油或大豆油等油类、对羟基苯甲酸酯等防腐剂或者草莓香料或薄荷等香料类等。
胶囊剂、片剂、散剂或颗粒剂等使用如下成分作为添加剂来制造：乳糖、葡萄糖、蔗糖或甘露醇等赋形剂、淀粉或海藻酸钠等崩解剂、硬脂酸镁或滑石等润滑剂、聚乙烯醇、羟丙基纤维素或明胶等粘结剂、脂肪酸酯等表面活性剂或者甘油等增塑剂等。
作为适于非经口给药的制剂，可以列举例如：注射剂、栓剂或喷雾剂等。
注射剂使用包含盐溶液、葡萄糖溶液或者这两者的混合物的载体等来制造。
栓剂使用可可脂、氢化脂肪或羧酸等载体来制造。
喷雾剂使用不刺激接受者的口腔和气管粘膜、并且使本发明的单克隆抗体或该抗体片段以微细粒子的形式分散从而易于吸收的载体等来制造。作为载体，例如使用乳糖或甘油等。另外，也可以制成气溶胶或干粉。
此外，上述非经口剂中，也可以添加在适于经口给药的制剂中作为添加剂所例示的成分。
6.使用本发明的抗FOLR1单克隆抗体或该抗体片段的疾病的诊断方法
通过使用本发明的单克隆抗体或该抗体片段对FOLR1或表达了FOLR1的细胞进行检测或测定，可以诊断FOLR1相关的疾病。
作为FOLR1相关的疾病之一的癌症的诊断例如以下述方式检测或测定FOLR1来进行。
使用流式细胞术等免疫学方法对患者体内的癌原发病灶、转移病灶或癌性腹水中的癌细胞中表达的FOLR1进行检测，由此，可以进行诊断。
免疫学方法是指使用实施过标记的抗原或抗体来检测或测定抗体量或抗原量的方法。例如，可以使用放射免疫测定法、酶免疫测定法、荧光免疫测定法、发光免疫测定法、蛋白免疫印迹法或物理化学方法等。
放射免疫测定法中，例如，使本发明的抗体或该抗体片段与抗原或表达抗原的细胞等反应，进而使实施过放射线标记的抗免疫球蛋白抗体或结合片段进行反应，然后，利用闪烁计数仪等进行测定。
酶免疫测定法中，例如，使本发明的抗体或该抗体片段与抗原或表达抗原的细胞等反应，进而使实施过标记的抗免疫球蛋白抗体或结合片段进行反应，然后，利用吸光光度计来测定发光色素。可以使用例如夹心ELISA法等。
作为酶免疫测定法中使用的标记物，可以使用公知(酶免疫测定法，医学书院(1987))的酶标记。可以使用例如：碱性磷酸酶标记、过氧化物酶标记、荧光素酶标记、生物素标记等。
夹心ELISA法为如下方法：将抗体结合在固相上后，使其捕获作为检测或测定对象的抗原，并使第二抗体与被捕获的抗原反应。该ELISA法中，准备两种识别要检测或测定的抗原的抗体或抗体片段，其抗原识别部位不同，预先使其中的第一抗体或抗体片段吸附到板(例如，96孔板)上，接着，将第二抗体或抗体片段用FITC等荧光物质、过氧化物酶等酶、生物素等预先进行标记。
在吸附有上述抗体的板上，使从生物体内分离出的细胞或其破碎液、组织或其破碎液、细胞培养上清、血清、胸水、腹水、眼液等进行反应，然后，使标记后的单克隆抗体或抗体片段反应，并进行与标记物质相对应的检测反应。由将浓度已知的抗原进行梯度稀释而制作的标准曲线计算出受试样品中的抗原浓度。
作为夹心ELISA法中使用的抗体，可以使用多克隆抗体或单克隆抗体中的任意一种，也可以使用Fab、Fab’、F(ab’)2等抗体片段。作为夹心ELISA法中使用的两种抗体的组合，可以是识别不同表位的单克隆抗体或抗体片段的组合，也可以是多克隆抗体与单克隆抗体或抗体片段的组合。
荧光免疫测定法中，通过文献[Monoclonal Antibodies-Principlesand practice，第三版，美国学术出版社(1996)；単クローン抗体実験マニュアル、講談社サイエンティフィック(1987)]等中记载的方法来进行测定。作为荧光免疫测定法中使用的标记物，可以列举公知(荧光抗体法，ソフトサイエンス公司(1983))的荧光标记。例如，可以列举FITC或RITC等。
发光免疫测定法中，通过文献[生物发光和化学发光，临床检查42，广川书店(1998)]等中记载的方法来进行测定。作为发光免疫测定法中使用的标记物，可以列举例如公知的发光体标记，可以列举吖啶酯、洛酚碱等。
蛋白免疫印迹法中，将抗原或表达抗原的细胞等用SDS(十二烷基硫酸钠)-PAGE[Antibodies-A Laboratory Manual，冷泉港实验室，(1988)]进行分级后，将该凝胶印迹到聚偏氟乙烯(PVDF)膜或硝酸纤维素膜上，使识别抗原的抗体或抗体片段与该膜进行反应，进而使实施过FITC等荧光物质、过氧化物酶等酶标记或生物素标记等的抗小鼠IgG抗体或结合片段进行反应，然后，使该标记可见化，由此来进行测定。以下示出一例。
使表达具有序列号1表示的氨基酸序列的多肽的细胞或组织溶解，在还原条件下使每个泳道的蛋白量为0.1～30μg，通过SDS-PAGE法进行电泳。将电泳后的蛋白转印到PVDF膜上，在含有1～10％BSA的PBS(以下记为BSA-PBS)中在室温下反应30分钟，进行封闭操作。
在此，使本发明的单克隆抗体进行反应，用含有0.05～0.1％的吐温-20的PBS(以下记为吐温-PBS)进行洗涤，并使过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG在室温下反应2小时。用吐温-PBS洗涤，使用ECL蛋白免疫印迹检测试剂(Amersham公司制造)等对结合有单克隆抗体的条带进行检测，由此，检测出具有序列号1表示的氨基酸序列的多肽。作为蛋白免疫印迹法的检测中使用的抗体，可以使用能够与未保持天然型的空间结构的多肽结合的抗体。
物理化学方法例如如下进行：使作为抗原的FOLR1与本发明的单克隆抗体或该抗体片段结合，由此形成凝集体，并对该凝集体进行检测。除此以外，作为物理化学方法，可以列举：毛细管法、一维免疫扩散法、免疫比浊法或乳胶免疫比浊法等[临床检查法提要，金原出版(1998)]等。
乳胶免疫比浊法中，使用敏化抗体或抗原的粒径约0.1μm～约1μm的聚苯乙烯乳胶等载体，利用对应的抗原或抗体引起抗原抗体反应时，反应液中的散射光增加，透射光减少。将该变化以吸光度或积分球浊度的形式进行检测，由此，测定受试样品中的抗原浓度等。
作为使用本发明的抗体或该抗体片段而在治疗开始前判断利用该抗体的治疗有效性的方法，可以列举下述方法。
首先，在治疗开始前，从患者体内收集癌性腹水，向其悬浮液中添加本发明的抗体或该抗体片段，一定时间后，测定抗肿瘤活性。测定的结果，在观测到抗肿瘤活性的情况下，在治疗开始前可以判断为本发明的抗体或该抗体片段对具有该腹水的患者的治疗有效。
实施例
以下，通过实施例更具体地对本发明进行说明，但本发明不限定于下述实施例。
[实施例1]
FOLR1、FOLR2和FOLR3cDNA的获得
人FOLR1(以下记作FOLR1，序列号1)、人FOLR2(以下记作FOLR2)和人FOLR3(以下记作FOLR3)的cDNA分别购入SC122853(Origene)、SC119666(Origene)和#100015838(OpenBiosystem)，用于以后的试验。
[实施例2]
FOLR1表达载体的构建
首先，使用引物FOLR1-F(序列号2)和FOLR1-R(序列号3)，通过PCR对FOLR1基因进行扩增。确认扩增基因为目标序列后，利用限制性酶EcoRI和KpnI识别序列与载体pKANTEX93(国际公开第97/10354号)连接，构建FOLR1基因表达载体。
[实施例3]
FOLR1表达细胞的制成
从三菱化学株式会社·横浜综合研究所获得DHFR基因缺陷的CHO(中国仓鼠卵巢)细胞DG44株(CHO/DG44细胞)，用于FOLR1表达细胞制成。培养使用添加有10％灭活后的透析胎牛血清(dFBS)(GIBCO)、HT添加剂(GIBCO)和50μg/mL庆大霉素的IMDM(GIBCO)(培养基)。
首先，将FOLR1基因表达载体通过AatII处理切断，对所得到的直链状DNA进行纯化，溶解于灭菌水中。通过电穿孔法将该DNA导入到CHO/DG44细胞中，利用不添加HT添加剂的培养基培养约3天。然后，使用筛选培养基[IMDM、10％灭活后的dFCS、0.5mg/mL G418(ナカライ)和50μg/mL庆大霉素]筛选抗药性细胞。将筛选出的抗药性细胞接种到96孔板上以使其达到75个细胞/板，然后，利用筛选培养基培养约2周。在显微镜下对每个孔进行观察，对形成了信号克隆的细胞依次进行放大培养。
[实施例4]
FOLR1表达的确认
将所得到的抗药性细胞用0.02％EDTA溶液(ナカライ)进行剥离，用PBS洗涤后，用1％BSA/PBS悬浮。接着，以使每孔达到2×105个的方式接种到96孔板上，以1700rpm进行1分钟的离心分离。除去上清后，添加用1％BSA/PBS制备成2μg/mL的LK26抗体(GeneTex)，在4℃下进行1小时的反应。
将细胞洗涤后，添加用1％BSA/PBS稀释至100倍的抗小鼠IgG-FITC(Dako)，在4℃下进行1小时的反应。再次将细胞洗涤后，将细胞用1％BSA/PBS进行悬浮，利用流式细胞仪(贝克曼库尔特公司制造，FC500MPL)对荧光强度进行分析。筛选FOLR1显著表达的克隆，将该细胞作为FOLR1表达CHO细胞。
[实施例5]
食蟹猴FOLR1的克隆
由冻结的食蟹猴肾组织克隆出食蟹猴FOLR1。在数mm见方的冻结肾组织中加入RNAiso Plus(Takara)，使用均质器杵(AsOne)将组织研碎。在室温下静置5分钟后，依照RNAiso plus的推荐规程获得总RNA，溶解于DEPC处理水(invitrogen)中。接着，为了由总RNA合成cDNA，使用PrimeScript II 1st strand cDNA合成试剂盒(Takara)和寡聚dT作为引物来进行逆转录反应。
接着，使用参考人FOLR1(NM_000802)和猕猴FOLR1(XM_001114655)设计出的引物CyFOLR1-F(序列号4)和CyFOLR1-R(序列号5)，通过PCR对食蟹猴FOLR1基因进行扩增。
利用2％琼脂糖凝胶对PCR样品进行电泳，切下扩增出的条带，用QIAquick Gel提取试剂盒(QIAGEN)进行回收。使用TOPO TA测序用克隆试剂盒(invitrogen)进行TA克隆，导入到Competent high E.coliDH5α(TOYOBO)中，在含有100μg/mL的氨比西林的LB板中，在37℃下培养过夜。然后，对各菌落进行培养，用NA-2000(KURABO)提取质粒，然后，分别对碱基序列进行分析。
结果表明，克隆出的食蟹猴FOLR1的碱基序列为序列号6，并表明基于该序列的氨基酸序列(序列号7)与猕猴FOLR1(XM_001114655)相同。
[实施例6]
FOLR1-Fc、FOLR2-Fc、FOLR3-Fc和食蟹猴FOLR1-Fc表达载体的构建
为了构建表达在FOLR1(1-233氨基酸)、FOLR2(1-227氨基酸)、FOLR3(1-243氨基酸)和食蟹猴FOLR1(1-233氨基酸)的C末端添加有人IgG1Fc(铰链区和CH2-CH3区)的重组蛋白(以下记作FOLR1-Fc、FOLR2-Fc、FOLR3-Fc和食蟹猴FOLR1-Fc)的载体，实施PCR。
使用FOLR1-Fc-F(序列号8)和FOLR1-Fc-R(序列号9)作为FOLR1-Fc表达载体制作用引物，使用FOLR2-Fc-F(序列号10)和FOLR2-Fc-R(序列号11)作为FOLR2-Fc表达载体制作用引物，使用FOLR3-Fc-F(序列号12)和FOLR3-Fc-R(序列号13)作为FOLR3-Fc表达载体制作用引物，并且使用CyFOLR1-Fc-F(序列号14)和CyFOLR1-Fc-R(序列号15)作为食蟹猴FOLR1-Fc表达载体制作用引物。
将PCR产物供于琼脂糖凝胶电泳，使用QIAquick Gel提取试剂盒(QIAGEN)分离扩增后的基因，利用TA克隆试剂盒(Invitrogen)进行亚克隆。筛选具有目标序列的载体，利用EcoRI和AhdI切下目标序列。
另一方面，用AhdI和SpeI从pKANTEX93切下人IgG1Fc段。将切下的目标序列和人IgG1Fc段与用EcoRI和SpeI进行处理后的pKANTEX93连接，得到FOLR1-Fc、FOLR2-Fc、FOLR3-Fc和食蟹猴FOLR1-Fc重组蛋白表达载体。
[实施例7]
FOLR1-Fc、FOLR2-Fc、FOLR3-Fc和食蟹猴FOLR1-Fc表达细胞的制成
FOLR1-Fc、FOLR2-Fc、FOLR3-Fc和食蟹猴FOLR1-Fc表达细胞的制成中，使用作为由CHO/DG44制作的FUT8敲除CHO/DG44细胞的CHO/Ms704细胞(国际公开第03/85107号)。另外，表达载体使用实施例6中制作FOLR1-Fc、FOLR2-Fc、FOLR3-Fc和食蟹猴FOLR1-Fc表达载体。通常传代时的培养、基因导入和抗药性细胞的筛选与实施例3同样地进行。
将筛选出的抗药性细胞依次进行放大培养后，用PBS洗涤细胞，利用回收培养基[用于CHO细胞的EX-CELL 302无血清培养基(西格玛奥德里奇)、6mmol/L L-谷氨酰胺(invitrogen)和50μg/mL庆大霉素]培养1周。将培养上清回收，并供于接下来的纯化。
[实施例8]
FOLR1-Fc、FOLR2-Fc、FOLR3-Fc、和食蟹猴FOLR1-Fc的纯化
使用填充于柱中的ProSep-vA High Capacity，从培养上清中纯化出FOLR1-Fc、FOLR2-Fc、FOLR3-Fc和食蟹猴FOLR1-Fc。
首先，使培养上清从柱中通过，用PBS洗涤柱后，用pH为5.0、3.5、3.0的洗脱缓冲液(0.1M柠檬酸一水合物-NaOH/pH5.0、3.5、3.0)依次进行洗脱。将洗脱出的级分迅速地用中和缓冲液(2MTris-HCl/pH8.5)进行中和。测定各级分的吸光度(280nm)，回收测定值高的连续级分作为抗体级分。用PBS进行透析，将从0.22μm的过滤器中通过的成分作为纯化蛋白质。将FOLR1-Fc的280nm的吸光系数设定为2.2、将FOLR2-Fc的280nm的吸光系数设定为2.3、将FOLR3-Fc的280nm的吸光系数设定为2.1、将食蟹猴FOLR1-Fc的280nm的吸光系数设定为2.2，计算出浓度。
[实施例9]
FOLR1-mycHis表达载体的构建
为了构建表达在FOLR1(1-233氨基酸)的C末端添加有myc和His标签的重组蛋白(以下记作FOLR1-mycHis)的载体，实施PCR。作为FOLR1-mycHis表达载体制作用引物，使用FOLR1-mH-F(序列号16)和FOLR1-mH-R(序列号17)。
从PCR产物中纯化出目标序列，与利用EcoRI和SpeI进行处理后的pKANTEX93连接，得到FOLR1-mycHis表达载体。
[实施例10]
FOLR1-mycHis表达细胞的制成
FOLR1-mycHis表达细胞的制成中使用CHO/DG44细胞。另外，表达载体使用实施例9中制作的FOLR1-mycHis表达载体。通常传代时的培养、基因导入、抗药性细胞的筛选和培养上清的回收与实施例7同样地进行。
[实施例11]
FOLR1-mycHis的纯化
使用填充于柱中的Ni-NTA琼脂糖(invitrogen)，从培养上清中纯化出FOLR1-mycHis。
首先，使洗涤缓冲液(50mmol/L NaH2PO4(pH8.0)、300mmol/L NaCl)从柱中流过，使培养上清从柱中通过，用洗涤缓冲液洗涤柱后，用洗脱缓冲液(在洗涤缓冲液中添加有500mmol/L咪唑的缓冲液)进行洗脱。测定洗脱出的级分的吸光度(280nm)，回收测定值高的连续级分作为FOLR1-mycHis级分。用PBS进行透析，将从0.22μm的过滤器中通过的成分作为纯化FOLR1-mycHis。将280nm的吸光系数设定为2.8，计算出浓度。
[实施例12]
对大鼠的免疫
为了获得抗FOLR1的单克隆抗体，对4周龄的雌性SD大鼠进行免疫。首先，将50μg的FOLR1-Fc与2mg的氢氧化铝佐剂(Antibodies-A Laboratory Manual，冷泉港实验室，1988)和百日咳疫苗(ナカライ)一起对SD大鼠进行腹腔内给药。从初次给药2周后开始，以每周一次的频率给用50μg的FOLR1-Fc三次。
[实施例13]
大鼠抗血清评价
在实施例12的末次给药的3天后，从SD大鼠的尾静脉采血，通过流式细胞术分析对FOLR1的血清抗体效价。阳性对象细胞和阴性对象细胞分别使用FOLR1表达CHO细胞和FOLR2表达CHO细胞。
首先，将FOLR1表达CHO细胞和FOLR2表达CHO细胞用0.02％EDTA溶液(ナカライ)进行剥离，用PBS洗涤后，用1％BSA/PBS悬浮。接着，以使每孔达到5×105个的方式接种到96孔板上，以1500rpm进行1分钟的离心分离。
除去上清后，向细胞中添加用1％BSA/PBS稀释至100～1000倍的SD大鼠血清，在4℃下进行30分钟的反应。将细胞洗涤后，向细胞中添加用1％BSA/PBS稀释后的Alexa488标记抗大鼠IgG(H+L)多克隆抗体(Invitrogen)，在4℃下进行30分钟的反应。再次将细胞洗涤后，将细胞用1％BSA/PBS进行悬浮，利用流式细胞仪对荧光强度进行分析。
[实施例14]
杂交瘤的制作
对于对FOLR1表达CHO细胞显示出充分的血清抗体效价的SD大鼠追加免疫50μg的FOLR1-Fc。3天后，以外科方式从SD大鼠中摘除脾脏，供于细胞融合。
首先，将摘除的脾脏用载玻片研碎，将组织搅散。将该脾脏组织用MEM(invitrogen)进行悬浮，使其从セルストレーナー中通过，由此除去多余的组织。通过离心分离除去上清后，加入红细胞裂解液(SIGMA)而使其溶血。加入MEM而使反应停止，通过离心分离除去上清后，再次用MEM进行悬浮，得到脾脏细胞。
向所得到的脾脏细胞中混合1/8倍量的小鼠骨髓瘤细胞株P3-U1。通过离心分离除去上清后，在37℃的温浴中保温的同时，温和地添加500μL的PEG溶液[将分别各为1mL的聚乙二醇1000(纯正化学)和MEM混合并加入350μL的DMSO(ナカライ)而得到的溶液]，进一步添加45mL的MEM。通过离心分离除去上清后，将细胞用HAT培养基[向500mL的RPMI1640(Wako)中添加5mL的HAT溶液(GIBCO)、0.5mL的55mmol/L 2-巯基乙醇(invitrogen)而得到的培养基]进行悬浮。将所得到的杂交瘤接种到96孔板上，进行培养。
[实施例15]
杂交瘤筛选(ABI8200细胞检测系统)
将杂交瘤培养10天后，收集各孔的培养上清，通过荧光抗体染色法(ABI8200细胞检测系统，以下记作FMAT)分析对FOLR1的反应性。阳性对象细胞和阴性对象细胞分别设定为FOLR1表达CHO细胞和FOLR2表达CHO细胞。首先，将阳性对象细胞和阴性对象细胞用0.05％胰蛋白酶溶液(invitrogen)进行剥离，以使每孔达到1×104个/100μL的方式接种到96孔板上，培养过夜。
接着，将10μL的杂交瘤培养上清和以最终达到1/5000倍的方式进行了稀释的50μL的Alexa647标记抗大鼠IgG(H+L)多克隆抗体(invitrogen)添加到各孔中。在室温下使其反应3小时后，通过FMAT分析荧光强度。对于通过FMAT观察到对FOLR1阳性CHO细胞呈特异性的反应的孔的杂交瘤，进行两次利用有限稀释法的克隆。
[实施例16]
杂交瘤筛选(表面等离子体共振法)
使用克隆后的杂交瘤培养上清，通过表面等离子体共振法测定与FOLR1的亲和性。测定仪器使用Biacore T100(GE医疗集团)，使用CM5芯片(GE医疗集团)。首先，通过胺偶联法将小鼠抗体捕获试剂盒(GE医疗集团)固定到CM5芯片上。
接着，使用HBS-EP+缓冲液(GE医疗集团)，使杂交瘤培养上清流过，使上清中含有的抗体捕获到CM5芯片上。接着，以稀释至五个梯度的浓度(188ng/mL、375ng/mL、750ng/mL、1500ng/mL、3000ng/mL)的FOLR1-mycHis作为分析物而使其流过。
关于亲和性，通过单循环动力学法对结合速度常数(ka)和解离速度常数(kd)进行分析。速度理论常数(ka、kd、KD)使用Biacore T-100评价软件(GE医疗集团)通过1:1结合模型来算出。
结果，LK26抗体(GeneTex)和MOv18抗体(ALEXISBIOCHEMICALS)对FOLR1-mycHis的亲和性(通过KD、kd/ka算出)分别为66nmol/L和92nmol/L。另一方面，杂交瘤RA15-7克隆(以下记作RA15-7)的培养上清对FOLR1-mycHis的亲和性为1.9nmol/L。
因此可知，RA15-7培养上清包含与现有的LK26抗体和MOv18抗体相比对FOLR1显示出极高的亲和性的抗体。
[实施例17]
RA15-7培养上清的反应性评价(流式细胞术)
利用流式细胞仪分析RA15-7培养上清含有的抗体对LK26抗体显示反应的人卵巢癌细胞株PA-1(ATCC编号：CRL-1572)的反应性。另外，以LK26抗体不显示反应的人卵巢癌细胞株TOV-112D(ATCC编号：CRL-11731)作为阴性对象，同样地分析RA15-7培养上清中含有的抗体的反应性。
首先，将人卵巢癌细胞株PA-1和TOV-112D细胞用0.02％EDTA溶液(ナカライ)进行剥离，用PBS洗涤后，用1％BSA/PBS悬浮。接着，以使每孔达到2×105个的方式接种到96孔板上，以1500rpm进行1分钟的离心分离。除去上清后，以每孔50μL的量添加RA15-7培养上清，在4℃下进行30分钟的反应。
将细胞洗涤后，添加用1％BSA/PBS进行了稀释的Alexa488标记抗大鼠IgG(H+L)多克隆抗体(Invitrogen)，在4℃下进行30分钟的反应。再次将细胞洗涤后，将细胞用1％BSA/PBS进行悬浮，利用流式细胞仪对荧光强度进行分析。
结果，与LK26抗体同样地，RA15-7培养上清仅对PA-1观察到反应，对TOV-112D未观察到反应。因此暗示了：RA15-7培养上清中含有的抗体识别高表达FOLR1的癌细胞。
同样地，利用流式细胞仪分析RA15-7培养上清对来源于食蟹猴肾的细胞株JTC-12(RCB1485、RIKEN CELL BANK)的反应性。结果，与LK26抗体同样地，RA15-7培养上清对JTC-12细胞显示出反应。因此暗示了：RA15-7培养上清包含不仅识别人FOLR1、也识别食蟹猴FOLR1的抗体。
[实施例18]
RA15-7培养上清中含有的抗体的亚类的鉴定
通过ELISA法对RA15-7培养上清中含有的抗体的亚类进行鉴定。
首先，将用PBS制备成50μg/mL的抗大鼠IgG(H+L)多克隆抗体(MP Biomedical)以50μL/孔分注到ELISA用96孔板上，在4℃下静置过夜。用PBS将孔洗涤后，以100μL/孔添加1％BSA/PBS，在室温下进行1小时的封闭。再次用PBS将孔洗涤后，以50μL/孔添加RA15-7培养上清，在室温下使其反应2小时。
将各孔用0.05％吐温20/PBS进行洗涤，以50μL/孔添加用1％BSA/PBS稀释后的HRP标记的各大鼠Ig同型(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM)抗体和大鼠κ链特异的抗体(Southern Biotech)，在室温下使其反应1小时。
将各孔用PBS洗涤后，以50μL/孔加入ABTS[2.2-连氮双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)铵，Wako]基质液[(1mmol/L ABTS、0.1mol/L柠檬酸缓冲液(pH4.2)、0.1％H2O2)]，在室温下使其反应。在充分确认到发色后，以50μL/孔加入5％SDS溶液而使反应停止，测定415nm的吸光度。
结果表明，RA15-7培养上清中含有的抗体为大鼠IgG1κ抗体。
[实施例19]
RA15-7培养上清中含有的抗体的特异性的评价(ELISA法)
对RA15-7培养上清中含有的抗体对FOLR1-Fc、FOLR2-Fc、FOLR3-Fc和食蟹猴FOLR1-Fc的反应性进行评价。
首先，将用PBS稀释至1000倍的山羊抗大鼠IgG(H+L)(CALTAG)以50μL/孔分注到ELISA用96孔板上，在4℃下静置过夜。
用PBS将孔洗涤后，以100μL/孔添加1％BSA/PBS，在室温下进行1小时的封闭。再次用PBS将孔洗涤后，以50μL/孔添加RA15-7培养上清，在室温下使其反应1小时。将各孔用0.05％吐温20/PBS进行洗涤，以50μL/孔添加用1％BSA/PBS稀释后的FOLR1-Fc、FOLR2-Fc、FOLR3-Fc和食蟹猴FOLR1-Fc，在室温下使其反应1小时。
将各孔用0.05％吐温20/PBS洗涤后，以50μL/孔添加用1％BSA/PBS稀释至2000倍的山羊抗人IgG(H+L)-POD(American Qualex)，在室温下使其反应1小时。将各孔用PBS洗涤后，以50μL/孔加入ABTS基质液，在室温下使其反应。在充分确认到发色后，以50μL/孔加入5％SDS溶液而使反应停止，测定415nm的吸光度。
结果表明，RA15-7培养上清中含有的抗体与人和食蟹猴FOLR1-Fc结合，但不与FOLR2-Fc和FOLR3-Fc结合。即表明，RA15-7培养上清中含有的抗体为对人和食蟹猴FOLR1特异性的抗体。
[实施例20]
RA15-7抗体的纯化
利用在杂交瘤-SFM(invitrogen)中添加有5％的超低IgG胎牛血清(invitrogen)的培养基，将杂交瘤RA15-7培养1周。从培养上清中纯化RA15-7抗体的操作通过与实施例8同样的方法来进行。将280nm的吸光系数设定为1.4，计算出浓度。
[实施例21]
利用竞争ELISA法的抗体结合性评价
对RA15-7抗体、LK26抗体和MOv18抗体是否相互竞争地与FOLR1结合进行评价。
首先，将用PBS制备成2μg/mL的各抗体意50μL/孔分注到ELISA用96孔板上，在4℃下静置过夜。用PBS将孔洗涤后，以200μL/孔添加1％BSA/PBS，在室温下进行1小时的封闭。再次用PBS将孔洗涤后，以50μL/孔分别添加抗FOLR1抗体(0.012～3μg/mL)和FOLR1-Fc(0.2μg/mL)，在室温下使其反应1小时。
将各孔用0.05％吐温20/PBS进行洗涤，以50μL/孔添加用1％BSA/PBS稀释至5000倍的山羊抗人IgG(H+L)-POD(American Qualex)，在室温下使其反应1小时。将各孔用PBS洗涤后，以50μL/孔加入ABTS基质液，在室温下使其反应。在充分确认到发色后，以50μL/孔加入5％SDS溶液而使反应停止，测定415nm的吸光度。
结果表明，在与FOLR1的结合中，RA15-7抗体和LK26抗体竞争性地进行结合。另一方面表明，在与FOLR1的结合中，RA15-7抗体和MOv18抗体不发生竞争，LK26抗体和MOv18抗体也不发生竞争。
[实施例22]
RA15-7抗体重链和轻链可变区基因的克隆
使用RNAiso plus(Takara)，根据说明书将用PBS洗涤后的杂交瘤RA15-7溶解，制备总RNA。将所得到的总RNA溶解于DEPC处理的水(invitrogen)中。
接着，使用Oligotex-dT30<Super>mRNA纯化试剂盒(从总RNA中)(Takara)，根据说明书从所得到的总RNA中纯化出mRNA。进而，使用SMART RACE cDNA扩增试剂盒(Clontech)，根据说明书由纯化的mRNA制备cDNA。
以所得到的cDNA作为模板，使用引物RatIgG1H-A(序列号18)和RatIgG1H-B(序列号19)，通过PCR对大鼠IgG1重链基因进行扩增，使用引物Ratk-A(序列号20)和Ratk-B(序列号21)，通过PCR对大鼠轻链(κ链)基因进行扩增。对扩增后的基因进行亚克隆，对碱基序列进行分析。
结果表明，包含信号序列的RA15-7抗体重链可变区的碱基序列由序列号22表示，氨基酸序列由序列号23表示，包含信号序列的RA15-7抗体轻链可变区的碱基序列由序列号24表示，氨基酸序列由序列号25表示。
另外，根据Kabat等人[Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，美国卫生与公众服务部(1991)]的报道可知，不含信号序列的RA15-7抗体重链可变区的碱基序列由序列号26表示，氨基酸序列由序列号27表示，不含信号序列的RA15-7抗体轻链可变区的碱基序列由序列号28表示，氨基酸序列由序列号29表示。
另外可知，RA15-7抗体重链的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别由序列号30、31和32表示。另外可知，RA15-7抗体轻链的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别由序列号33、34和35表示。
[实施例23]
大鼠/人嵌合型RA15-7抗体表达载体的构建
将RA15-7抗体重链和轻链可变区基因与人IgG1重链和κ链恒定区基因连接，由此制作大鼠/人嵌合型RA15-7抗体表达载体。使用包含人IgG1κ的恒定区基因的pKANTEX93作为载体。
首先，使用引物RA15-7-VLF(序列号36)和RA15-7-VLR(序列号37)，通过PCR对RA15-7抗体轻链可变区基因进行扩增。从PCR产物中纯化出目标序列，与利用EcoRI和BsiWI进行处理后的pKANTEX93连接。
同样地，使用引物RA15-7-VHF(序列号38)和RA15-7-VHR(序列号39)，通过PCR对RA15-7抗体重链可变区基因进行扩增。从PCR产物中纯化出目标序列，与利用NotI和ApaI进行处理后的、重组有RA15-7抗体轻链可变区基因的pKANTEX93连接，得到大鼠/人嵌合型RA15-7(以下记作ChRA15-7)抗体表达载体。
[实施例24]
ChRA15-7抗体和附加有不含岩藻糖的糖链的ChRA15-7抗体表达细胞的制成
附加有含有岩藻糖的糖链的(以下称为现有型)ChRA15-7抗体的表达细胞的制成中使用CHO/DG44细胞。另外，附加有不含岩藻糖的糖链的(以下称为去岩藻糖型)ChRA15-7(以下记作ChRA15-7DF)抗体的制成中使用CHO/Ms704细胞。另外，表达载体使用实施例23中制作的载体。通常传代时的培养、基因导入、抗药性细胞的筛选和培养上清的回收与实施例7同样地进行。
[实施例25]
ChRA15-7抗体和ChRA15-7DF抗体的纯化
从回收的培养上清中纯化出ChRA15-7抗体和ChRA15-7DF抗体的操作通过与实施例8同样的方法来进行。不管是现有型还是去岩藻糖型，均将280nm的吸光系数设定为1.37，计算出浓度。
[实施例26]
应用了CDC活性增强技术的去岩藻糖型抗体表达载体的制作
为了制作应用了CDC活性增强技术的去岩藻糖型的抗体，参考国际公开第2007/011041号和国际公开第2011/108502号的报道，对pKANTEX93的抗体重链恒定区进行修饰。将修饰后的碱基序列和氨基酸序列分别用序列号40和41表示。在该载体中导入RA15-7抗体和MORAb-003抗体(国际公开第2005/080431号)的轻链可变区和重链可变区，得到应用了CDC活性增强技术的去岩藻糖型的ChRA15-7(以下记作ChRA15-7Acc)抗体和MORAb-003(以下记作MORAb-003Acc)抗体表达载体。
[实施例27]
ChRA15-7Acc抗体和MORAb-003Acc抗体表达细胞的制成
ChRA15-7Acc抗体和MORAb-003Acc抗体表达细胞的制成中使用CHO/Ms704细胞。另外，表达载体使用实施例26中制作的ChRA15-7Acc抗体和MORAb-003Acc抗体表达载体。通常传代时的培养、基因导入、抗药性细胞的筛选和培养上清的回收与实施例7同样地进行。
[实施例28]
ChRA15-7Acc抗体和MORAb-003Acc抗体的纯化
从回收的培养上清中纯化出ChRA15-7Acc抗体和MORAb-003Acc抗体的操作通过与实施例8同样的方法来进行。将ChRA15-7Acc抗体和MORAb-003Acc抗体的280nm的吸光系数分别设定为1.34和1.60，计算出浓度。
[实施例29]
ChRA15-7Acc抗体的亲和性测定(表面等离子体共振法)
通过表面等离子体共振法测定ChRA15-7Acc抗体和MORAb-003抗体对FOLR1的亲和性。通过胺偶联法将人抗体捕获试剂盒(GE医疗集团)固定到CM5芯片上，并且以稀释至五个梯度的浓度(12.3ng/mL、37ng/mL、111ng/mL、333ng/mL、1000ng/mL)的FOLR1-mycHis作为分析物而使其流过，除此以外，与实施例16同样地进行。
结果，ChRA15-7Acc抗体和MORAb-003抗体对FOLR1-mycHis的亲和性(通过KD、kd/ka算出)分别为0.57nmol/L和57nmol/L(表1)。因此可知，由RA15-7抗体制作的大鼠/人嵌合型抗体ChRA15-7Acc为与现有抗体MORAb-003相比对FOLR1显示出更高的亲和性的抗体。
[表1]
[实施例30]
ChRA15-7DF抗体的结合性评价(蛋白免疫印迹法)
使用蛋白免疫印迹法对ChRA15-7DF抗体和MORAb-003抗体的反应性进行评价。
首先，将FOLR1-mycHis用还原性泳道标记物上样缓冲液和非还原性泳道标记物上样缓冲液(Thermo)进行悬浮，在100℃下进行5分钟处理，由此，分别得到还原FOLR1-mycHis和非还原FOLR1-mycHis。在SDS-PAGE用凝胶e-PAGEL(ATTO)中将还原和非还原FOLR1-mycHis各5倍以五个梯度的浓度(0.5ng/泳道、2.7ng/泳道、13ng/泳道、67ng/泳道、333ng/泳道)进行SDS-PAGE。
接着，将结束电泳的凝胶重叠到PVDF膜(密理博)上，将上下用浸渍了转移缓冲液(12.1g Tris、14.4g甘氨酸、200mL甲醇/1L灭菌水)的滤纸夹持，进行转印。
然后，将PVDF膜利用1％无球蛋白的BSA(ナカライ)/TBS进行封闭。接着，使利用1％无球蛋白的BSA/TBS制备成5μg/mL的ChRA15-7DF抗体和MORAb-003抗体在PVDF膜上在室温下反应1小时。
将该PVDF膜洗涤后，使利用1％无球蛋白的BSA/TBS进行稀释后的山羊抗人IgG(H+L)-POD(American Qualex)在室温下反应1小时。
再次将PVDF膜洗涤后，使Chemi-Lumi One Super(ナカライ)反应1分钟，利用ImageQuant LAS 4000mini(GE医疗集团)对PVDF膜的荧光进行检测。
结果，ChRA15-7DF抗体和MORAb-003抗体均仅对非还原FOLR1-mycHis观察到反应，暗示其为识别FOLR1的高级结构的抗体。
另外，MORAb-003抗体检测到67ng以上的非还原FOLR1-mycHis，与此相对，ChRA15-7DF抗体检测到2.7ng以上的非还原FOLR1-mycHis。
即表明，相对于MORAb-003抗体，ChRA15-7DF抗体的非还原状态的FOLR1-mycHis检测灵敏度显著高。
[实施例31]
ChRA15-7DF抗体与MORAb-003抗体的抗体依赖性细胞毒(ADCC)活性比较
评价对卵巢癌细胞株的ADCC活性。将作为靶标的癌细胞株[Caov-3(ATCC编号：HTB-75)、PA-1(ATCC编号：CRL-1572)、IGR-OV1(国立癌症研究所)、SKOV-3(ATCC编号：HTB-77)、RMG-1(JCRB细胞编号：JCRB0172)、OVCAR-3(ATCC编号：HTB-161)]用0.02％EDTA溶液(ナカライ)从培养烧瓶中剥离，利用ADCC测定培养基[不含酚红的RPMI1640(GIBCO)、5％灭活后的dFCS(GIBCO)、50μg/mL庆大霉素(ナカライ)]制备成1×104个细胞/50μL，作为靶细胞溶液。
接着，将进行了肝素处理的健康人末梢血在填充有淋巴细胞分离液(Lymphoprep)(普迈生物)的LeucoSep淋巴细胞分离管(葛来娜)中形成多层，以1000×g在室温下进行20分钟的离心分离。离心分离后，血清级分除去，回收PBMC层。用ADCC测定培养基将细胞洗涤。将PBMC用ADCC测定培养基制备成2.5×105个细胞/50μL，作为效应细胞溶液。
关于抗体溶液，以使终浓度为0.033ng/mL、0.33ng/mL、3.3ng/mL、33ng/mL、333ng/mL的方式，首先，用ADCC测定培养基制备成0.1ng/mL、1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL、1000ng/mL。
将如上所述制备的靶细胞溶液、效应细胞溶液、以及抗体溶液分别各以50μL/孔混合到U字底的96孔板中，以总量计使其为150μL/孔。将各孔充分混合后，通过50×g、5分钟、室温的离心分离使细胞沉淀，在37℃反应4小时。
接着，将各孔充分搅拌，再次通过离心分离使细胞沉淀后，将孔的上清分别各分取50μL至新的ELISA板上。使用CytoTox 96非放射性细胞毒性检测试剂盒(普洛麦格)测定分取的上清中的乳酸脱氢酶(LDH)活性。操作根据说明书来进行。
ADCC活性的计算中，首先，从各孔的LDH活性测定值中减去仅为ADCC测定培养基的孔的LDH活性测定值，得到各孔的LDH活性测定修正值，然后，通过下式进行计算。
在此，Exp表示各样品的LDH活性测定修正值，ET spo表示效应细胞溶液和靶细胞溶液的混合孔的LDH活性测定修正值，T total表示混合有靶细胞和CytoTox 96非放射性细胞毒性检测试剂盒附带的裂解液的孔的LDH活性测定修正值，D表示裂解液的LDH活性测定修正值，T spo表示仅为靶细胞的孔的LDH活性测定修正值。
结果，ChRA15-7DF抗体从比MORAb-003抗体低的浓度开始检测到ADCC活性，最大细胞毒活性也高。此外，ChRA15-7DF抗体与去岩藻糖型的MORAb-003(MORAb-003DF)抗体相比，也从较低的浓度开始检测到ADCC活性，最大细胞毒活性也高。
因此可知，ChRA15-7DF抗体与在现有的抗FOLR1人源化抗体(MORAb-003)中组合现有的ADCC活性增强技术(去岩藻糖化)而得到的MORAb-003DF抗体相比，具有高ADCC活性。同时暗示了：ChRA15-7DF抗体作为治疗卵巢癌的抗体比MORAb-003和MORAb-003DF有用。
[实施例32]
大鼠/人嵌合型FOLR1表达载体的构建
为了进行抗体的表位分析，制作三种将FOLR1-mycHis的碱基序列的一部分取代成大鼠FOLR1(NM_133527)的大鼠/人嵌合型FOLR1-mycHis(以下记作Rat1-FOLR1-mycHis、Rat2-FOLR1-mycHis和Rat4-FOLR1-mycHis)。
Rat1-FOLR1-mycHis是将序列号1表示的人FOLR1的氨基酸序列中第3位至第28位的氨基酸序列置换成相当于序列号102表示的大鼠FOLR1的氨基酸序列中第3位至第26位的氨基酸序列并在C末端附加myc和His标签而得到的大鼠/人嵌合型FOLR1-mycHis。
Rat2-FOLR1-mycHis是将序列号1表示的人FOLR1的氨基酸序列中第55位至第62位的氨基酸序列置换成相当于序列号102表示的大鼠FOLR1的氨基酸序列中第53位至第60位的氨基酸序列并在C末端附加myc和His标签而得到的大鼠/人嵌合型FOLR1-mycHis。
Rat4-FOLR1-mycHis是将序列号1表示的人FOLR1的氨基酸序列中第91位至第95位的氨基酸序列置换成相当于序列号102表示的大鼠FOLR1的氨基酸序列中第89位至第93位的氨基酸序列并在C末端附加myc和His标签而得到的大鼠/人嵌合型FOLR1-mycHis。
Rat1-FOLR1-mycHis、Rat2-FOLR1-mycHis和Rat4-FOLR1-mycHis的碱基序列分别示于序列号42、序列号43和序列号44，氨基酸序列分别示于序列号45、序列号46和序列号47。
通过合成各基因并取代为实施例9的FOLR1-mycHis表达载体上的FOLR1-mycHis基因来构建Rat1-FOLR1-mycHis、Rat2-FOLR1-mycHis和Rat4-FOLR1-mycHis表达载体。
[实施例33]
Rat1-FOLR1-mycHis、Rat2-FOLR1-mycHis和Rat4-FOLR1-mycHis表达细胞的制成
Rat1-FOLR1-mycHis、Rat2-FOLR1-mycHis和Rat4-FOLR1-mycHis表达细胞的制成中，使用CHO/DG44细胞。另外，表达载体使用实施例32中制作的载体。通常传代时的培养、基因导入、抗药性细胞的筛选和培养上清的回收与实施例7同样地进行。
[实施例34]
Rat1-FOLR1-mycHis、Rat2-FOLR1-mycHis和Rat4-FOLR1-mycHis的纯化
Rat1-FOLR1-mycHis、Rat2-FOLR1-mycHis和Rat4-FOLR1-mycHis的纯化与实施例11同样地进行。将280nm的吸光系数均设定为2.8来计算出浓度。
[实施例35]
ChRA15-7Acc抗体的表位分析(ELISA法)
使用实施例11中制作的FOLR1-mycHis和实施例34中制作的Rat1-FOLR1-mycHis、Rat2-FOLR1-mycHis、Rat4-FOLR1-mycHis，对ChRA15-7Acc抗体、MORAb-003抗体和MOv18抗体的反应性进行评价。
首先，将用PBS制备成10μg/mL的FOLR1-mycHis、Rat1-FOLR1-mycHis、Rat2-FOLR1-mycHis和Rat4-FOLR1-mycHis以50μL/孔分注到ELISA用96孔板上，在4℃下静置过夜。用PBS将孔洗涤后，以200μL/孔添加1％BSA/PBS，在室温下进行1小时的封闭。
再次用PBS将孔洗涤后，分别以50μL/孔添加用1％BSA/PBS从10000ng/mL起每次稀释3倍而制备成7个梯度的浓度(14ng/mL、41ng/mL、123ng/mL、370ng/mL、1111ng/mL、3333ng/mL、10000ng/mL)的ChRA15-7Acc抗体、MORAb-003抗体、MOv18抗体，在室温下使其反应1小时。
将各孔用0.05％吐温20/PBS进行洗涤，在使ChRA15-7Acc抗体或MORAb-003抗体反应的孔中以50μL/孔添加用1％BSA/PBS稀释至5000倍的山羊抗人IgG(H+L)-POD(American Qualex)，在使MOv18抗体反应的孔中以50μL/孔添加用1％BSA/PBS稀释至400倍的多克隆兔抗小鼠IgG-POD(Dako)，在室温下使其反应1小时。
将各孔用PBS洗涤后，以50μL/孔加入ABTS基质液，在室温下使其反应。在充分确认到发色后，加入5％SDS溶液而使反应停止，测定415nm的吸光度。
将其结果示于表2中。白色圆形表示观察到反应，×表示未观察到反应。ChRA15-7Acc抗体、MORAb-003抗体和MOv18抗体与FOLR1-mycHis发生了反应。ChRA15-7Acc抗体和MORAb-003抗体与Rat1-FOLR1-mycHis发生了反应，但未观察到MOv18抗体与Rat1-FOLR1-mycHis的反应。
MORAb-003抗体和MOv18抗体与Rat2-FOLR1-mycHis发生了反应，但未观察到ChRA15-7Acc抗体与Rat2-FOLR1-mycHis的反应。ChRA15-7Acc抗体和MOv18抗体与Rat4-FOLR1-mycHis发生了反应，但未观察到MORAb-003抗体与Rat4-FOLR1-mycHis的反应。
由上表明，MOv18抗体识别包含Rat1-FOLR1-mycHis中将FOLR1-mycHis氨基酸序列取代成大鼠型的区域的序列，ChRA15-7Acc抗体识别包含Rat2-FOLR1-mycHis中将FOLR1-mycHis氨基酸序列取代成大鼠型的区域的序列，MORAb-003抗体识别包含Rat4-FOLR1-mycHis中将FOLR1-mycHis氨基酸序列取代成大鼠型的区域的序列，。
具体而言，暗示了：MOv18抗体识别包含FOLR1-mycHis的第3位至第28位的氨基酸序列的氨基酸序列，ChRA15-7Acc抗体识别包含FOLR1-mycHis的第55位至第62位的氨基酸序列的氨基酸序列，并且MORAb-003抗体识别包含FOLR1-mycHis的第91位至第95位的氨基酸序列的氨基酸序列。
[表2]
[实施例36]
人源化RA15-7抗体重链和轻链可变区的设计
首先，选出用于移植分别由序列号30、31、32表示的RA15-7重链CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列的人抗体重链可变区框架区(FR)的氨基酸序列。关于已知的人抗体重链可变区序列，由美国生物技术信息国家中心(The National Center for Biotechnology Information)提供的Ig Germline Genes数据库检索与RA15-7重链FR序列的同源性高的人抗体序列。
结果，IGVH3-72是同源性最高的人抗体序列，因此选择该抗体的FR。将序列号30、31、32表示的RA15-7重链CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列移植到到如上确定的人抗体FR序列的适当位置，由此设计出HV0。
接着，选出用于移植分别由序列号33、34、35表示的RA15-7轻链CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列的人抗体重链可变区框架区(FR)的氨基酸序列。
卡巴特(Kabat)等人将已知的各种人抗体的VL根据其氨基酸序列的同源性分成四个亚组(HSG I～IV)，并报道了上述各亚组的共有序列[Sequences of Proteins of Immunological Interest，美国卫生与公众服务部(1991)]。
因此，实施了人抗体的VL的亚组I～IV(hSGI～hSGIV)的共有序列的FR的氨基酸序列与RA15-7轻链FR序列的同源性检索。结果，hSGI是同源性最高的人抗体轻链共有序列。将序列号33、34、35表示的RA15-7轻链CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列移植到到如上确定的人抗体FR序列的适当位置，由此设计出LV0。
接着，通过计算机建模构建包含上述设计好的HV0和LV0的人源化抗体(HV0LV0)和ChRA15-7抗体的可变区的预测三维结构，并进行结构比较。三维结构的构建和坐标数据的可视化使用DiscoveryStudio(Accerlys)。
三维结构比较的结果是，鉴定出预测对CDR环结构的保持等抗原结合活性的贡献大的残基、通过疏水性相互作用等而有助于维持整体结构的残基和露出于分子表面而预测到潜在的抗原性风险高的残基作为修饰候补残基。
将选出的修饰候补残基中的一个以上取代成存在于ChRA15-7抗体的相同位置的氨基酸残基，由此设计出各人源化抗体修饰体。作为不含信号序列的人源化RA15-7抗体修饰体的重链可变区，如图1所示的氨基酸序列那样，设计出HV0、HV2、HV3、HV4、HV5、HV6、HV7、HV8、HV10。
同样，作为不含信号序列的人源化RA15-7抗体修饰体的轻链可变区，如图2所示的氨基酸序列那样，设计出LV0、LV2、LV3、LV4、LV6。
[实施例37]
人源化RA15-7抗体修饰体表达载体的构建
与ChRA15-7表达载体的构建(实施例23)同样地，将设计出的不含信号序列的各人源化RA15-7抗体修饰体的重链和轻链可变区的碱基序列HV0、HV2、HV3、HV4、HV5、HV6、HV7、HV8、HV10、LV0、LV2、LV3、LV4和LV6(序列号48～61)导入到pKANTEX93中。
[实施例38]
人源化RA15-7抗体修饰体表达细胞的制成
人源化RA15-7抗体修饰体表达细胞的制成中，使用FUT8基因双敲除CHO-K1株(Tsukahara et al.,Animal Cell Technology:Basic &Applied Aspects,175-183,2006)。将实施例37中制作的各人源化抗体修饰体表达载体按照FreeStyle MAX CHO表达系统(invitrogen)的操作说明书进行瞬时导入。将这些细胞培养约一周，回收培养上清。
[实施例39]
人源化RA15-7抗体修饰体的纯化
使用MabSelect SuRe(GE医疗集团)，从实施例38中回收的培养上清中纯化出各人源化抗体修饰体。具体而言，使灭菌水、0.1M柠檬酸溶液(pH3.6)和0.2M硼酸Na/150mmol/L NaCl溶液(pH7.5)依次从填充有载体的柱中流过，使其平衡化。
使培养上清从柱中通过后，用0.2M硼酸Na/150mmol/L NaCl溶液(pH7.5)洗涤柱，用0.1M柠檬酸溶液(pH3.6)进行洗脱。将洗脱出的级分迅速地用1M Tris-HCl(pH9.0)进行中和。
测定各级分的吸光度(280nm)，回收测定值高的连续级分作为抗体级分。利用缓冲液(10mmol/L柠檬酸、150mmol/L NaCl、pH6.0)进行透析，将从0.22μm的过滤器通过的成分作为各人源化抗体修饰体的纯化抗体。将280nm的吸光系数设定为1.4，计算出浓度。
[实施例40]
人源化RA15-7抗体修饰体的亲和性测定(表面等离子体共振法)
与实施例29同样地，通过表面等离子体共振法测定各人源化抗体修饰体对FOLR1的亲和性。
结果显示，5种人源化RA15-7抗体修饰体(HV7LV3、HV10LV2、HV10LV3、HV10LV4和HV10LV6)对FOLR1-mycHis的亲和性保持了ChRA15-7Acc所具有的亲和性的约70％。
[实施例41]
人源化RA15-7抗体修饰体HV7LV3的Cys(HV7LV3-CDRH3-Cys101)修饰体的设计
人源化RA15-7抗体修饰体HV7LV3的重链CDR3中包含Cys(Cys101)。在将Cys101取代成其他氨基酸时，考虑与Cys类似的分子结构、疏水性强度、简单结构氨基酸等因素，选出Met、Gly、Asp、Ser、Tyr、Ala、Ile、Val、Thr、Phe、Arg、Trp、Pro和Gln共计14种氨基酸作为修饰候补氨基酸。
[实施例42]
HV7LV3-CDRH3-Cys101修饰抗体表达载体的构建
制作HV7LV3-CDRH3-Cys101修饰抗体表达载体。首先，使用整合有作为模板的HV7可变区基因(序列号62)的载体。根据说明书使用定点诱变试剂盒[QuickChange II定点诱变试剂盒(AgilentTechnologies)]，导入用于将Cys101修饰成目标氨基酸的基因突变。将所得到的DNA溶液转化为XL1-Blue，从形成的菌落中提取质粒。
Cys101被取代成目标氨基酸的不含信号序列的HV7可变区的碱基序列分别由Met(C101M_DNA)：序列号63、Gly(C101G_DNA)：序列号64、Asp(C101D_DNA)：序列号65、Ser(C101S_DNA)：序列号66、Tyr(C101Y_DNA)：序列号67、Ala(C101A_DNA)：序列号68、Ile(C101I_DNA)：序列号69、Val(C101V_DNA)：序列号70、Thr(C101T_DNA)：序列号71、Phe(C101F_DNA)：序列号72、Arg(C101R_DNA)：序列号73、Trp(C101W_DNA)：序列号74、Pro(C101P_DNA)：序列号75、Gln(C101Q_DNA)：序列号76表示。
Cys101被取代成目标氨基酸的不含信号序列的HV7可变区的氨基酸序列分别由Met(C101M_AA)：序列号77、Gly(C101G_AA)：序列号78、Asp(C101D_AA)：序列号79、Ser(C101S_AA)：序列号80、Tyr(C101Y_AA)：序列号81、Ala(C101A_AA)：序列号82、Ile(C101I_AA)：序列号83、Val(C101V_AA)：序列号84、Thr(C101T_AA)：序列号85、Phe(C101F_AA)：序列号86、Arg(C101R_AA)：序列号87、Trp(C101W_AA)：序列号88、Pro(C101P_AA)：序列号89、Gln(C101Q_AA)：序列号90表示。
接着，将HV7LV3抗体表达载体的重链可变区基因HV7取代为Cys101被取代成目标氨基酸的HV7可变区基因。重组使用NotI、ApaI识别区。将所得到的载体作为HV7LV3-CDRH3-Cys101修饰抗体表达载体。
[实施例43]
HV7LV3-CDRH3-Cys101修饰抗体表达细胞的制成和培养
使用实施例42中制作的载体来进行HV7LV3-CDRH3-Cys101修饰抗体表达细胞。表达细胞、基因导入、培养上清的回收与实施例38同样地进行。
[实施例44]
HV7LV3-CDRH3-Cys101修饰抗体的纯化
HV7LV3-CDRH3-Cys101修饰抗体的纯化和浓度的计算与实施例39同样地进行。
[实施例45]
HV7LV3-CDRH3-Cys101修饰抗体的亲和性测定(表面等离子体共振法)
与实施例29同样地，通过表面等离子体共振法测定各HV7LV3-CDRH3-Cys101修饰抗体对FOLR1的亲和性。
结果显示，将Cys101分别修饰成Ile(C101I)、Val(C101V)、Thr(C101T)、Phe(C101F)、Gln(C101Q)和Met(C101M)的抗体对FOLR1-mysHis的亲和性保持了ChRA15-7Acc抗体所具有的亲和性的50％以上。
具体而言，修饰成C101I、C101V、C101T、C101F、C101Q和C101M的抗体分别显示出ChRA15-7Acc抗体的73％、55％、88％、80％、64％和59％的亲和性(图3)。该结果表明，相对于HV7LV3人源化抗体修饰体，修饰成C101T的(HuRA15-7CT)抗体的亲和性提高。
将包含信号序列的HuRA15-7CT抗体的轻链可变区的碱基序列和氨基酸序列示于序列号91和92。另外，将不含信号序列的HuRA15-7CT抗体的轻链可变区的碱基序列和氨基酸序列示于序列号93和94。
同样地，将包含信号序列的HuRA15-7CT抗体的重链可变区的碱基序列和氨基酸序列示于序列号95和96。另外，将不含信号序列的HuRA15-7CT抗体的重链可变区的碱基序列和氨基酸序列示于序列号97和98。
另外，将HuRA15-7CT抗体的重链CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别示于序列号30、31、和99。此外，将HuRA15-7CT抗体的轻链CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别示于序列号33、34和35。
[实施例46]
应用了CDC活性增强技术的去岩藻糖型的HuRA15-7CT抗体表达载体的构建
应用了CDC活性增强技术的去岩藻糖型的HuRA15-7CT(以下记作HuRA15-7CTAcc)抗体表达载体的构建中，使用序列号91作为轻链可变区，使用序列号95作为重链可变区，与实施例26同样地进行。
[实施例47]
去岩藻糖型的HuRA15-7CT抗体表达细胞和HuRA15-7CTAcc抗体表达细胞的制成
去岩藻糖型的HuRA15-7CT(以下记作HuRA15-7CTDF)抗体表达细胞和HuRA15-7CTAcc抗体表达细胞的制成中使用CHO/Ms704。表达载体使用实施例42中制作的HuRA15-7CT抗体表达载体或实施例46中制作的HuRA15-7CTAcc抗体表达载体。通常传代时的培养、基因导入、抗药性细胞的筛选、培养上清的回收与实施例7同样地进行た。
[实施例48]
HuRA15-7CTDF抗体和HuRA15-7CTAcc抗体的纯化
从培养上清中纯化出HuRA15-7CTDF抗体和HuRA15-7CTAcc抗体的操作通过与实施例8同样地进行。将HuRA15-7CTDF抗体的280nm的吸光系数设定为1.38，将HuRA15-7CTAcc抗体的280nm的吸光系数设定为1.37，计算出浓度。
[实施例49]
HuRA15-7CTAcc抗体的亲和性测定(表面等离子体共振法)
与实施例29同样地，通过表面等离子体共振法测定HuRA15-7CTAcc抗体对FOLR1的亲和性。
结果，关于HuRA15-7CTAcc抗体对FOLR1-mycHis的亲和性，KD值为0.65nmol/L(表3)。因此可知，HuRA15-7CTAcc抗体是以比MORAb-003抗体(KD＝57nmol/L、实施例29)显著高的亲和性与FOLR1结合的抗体。
[表3]
[实施例50]
HuRA15-7CTDF抗体和ChRA15-7DF抗体的特异性评价(ELISA法)
对HuRA15-7CTDF抗体、ChRA15-7DF抗体和MORAb-003DF抗体对FOLR1-Fc、FOLR2-Fc、FOLR3-Fc和食蟹猴FOLR1-Fc的反应性进行评价。
首先，将用PBS制备成2μg/mL的FOLR1-Fc、FOLR2-Fc、FOLR3-Fc和食蟹猴FOLR1-Fc以50μL/孔分注到ELISA用96孔板上，在4℃下静置过夜。用PBS将孔洗涤后，以200μL/孔添加1％BSA/PBS，在室温下进行1小时的封闭。再次用PBS将孔洗涤后，分别以50μL/孔添加用1％BSA/PBS制备成7个梯度的浓度(1.4ng/mL、4.1ng/mL、12ng/mL、37ng/mL、111ng/mL、333ng/mL、1000ng/mL)的HuRA15-7CTDF抗体、ChRA15-7DF抗体、MORAb-003DF抗体和作为阴性对象的去岩藻糖型抗DNP人IgG1(DNPDF)抗体，在室温下使其反应1小时。
将各孔用0.05％吐温20/PBS进行洗涤，以50μL/孔添加用1％BSA/PBS稀释至2000倍的山羊抗人kappa-HRP(Southern Biotech)，在室温下使其反应1小时。将各孔用PBS洗涤后，以50μL/孔加入ABTS基质液，在室温下使其反应。在充分确认到发色后，加入5％SDS溶液而使反应停止，测定415nm的吸光度。
结果表明，HuRA15-7CTDF抗体、ChRA15-7DF抗体和MORAb-003DF抗体对人和食蟹猴FOLR1-Fc具有同等的结合活性，但不与FOLR2-Fc和FOLR3-Fc结合(图4)。即表明，HuRA15-7CTDF抗体、ChRA15-7DF抗体和MORAb-003DF抗体是对人和食蟹猴FOLR1呈特异性的抗体。
[实施例51]
利用HuRA15-7CTAcc抗体的免疫组织染色
使用HuRA15-7CTAcc和作为阴性对象抗体的DNPDF来实施包埋于OCT复合物并冻结的人正常组织阵列(大脑、小脑、心脏、肺、胃、小肠、肝脏、胰腺、唾液腺、肾脏、甲状腺、肾上腺、骨骼肌、脾脏、卵巢、子宫、胎盘、皮肤、乳腺)的免疫组织染色(IHC)。
首先，在-20℃下进行5分钟的利用丙酮的固定，进行10分钟的风干，然后，在室温下进行利用含有0.1％NaN3和0.3％H2O2的PBS的内源性过氧化物酶的失活。接着，进行利用生物素封闭系统(Daco)的、内源性生物素的失活。
进而，利用1％BSA/PBS进行封闭。接着，使制备成1μg/mL的HuRA15-7CTAcc抗体、MORAb-003抗体和DNPDF抗体在室温下反应1小时，然后，用PBS进行洗涤。添加过氧化物酶标记链霉亲和素(ニチレイ)，使其反应5分钟，用PBS洗涤。添加用0.02％H2O2/PBS制备的DAB Tablet(Wako)，为了发色而使其反应10分钟。使Mayer苏木素(Wako)反应约2秒，用流水洗涤，对核进行染色。
将染色后的样品用70％乙醇处理5分钟，用95％乙醇处理5分钟，然后用100％乙醇处理5分钟，进而将利用100％乙醇的处理重复3次。接着，将利用100％二甲苯处理5分钟的操作重复3次，进行澄清。最后，用エンテランニュー(メルク)封入。
对染色标本进行了观察，结果，HuRA15-7CTAcc抗体的染色为阳性的组织是肺(肺泡)、胃(粘膜)、小肠(粘膜、粘膜肌层)、胰腺(导管、腺胞细胞)、肝脏(胆管)、唾液腺(腺胞细胞、导管)、肾(肾小管、肾小球)、肾上腺(皮质细胞、间质组织)、甲状腺(滤泡、滤泡旁细胞)、乳腺(腺胞)、子宫(颈管上皮)、卵巢(上皮)、胎盘(合胞体性滋养层细胞)、皮肤(汗腺)，暗示与文献[Cancer Res,1992.52(23):p.6708-11.,Int J Cancer,2006.119(2):p.243-50.]的报道相同。
接着，对人卵巢癌组织8例(浆液性囊腺癌4例、浆液性囊腺瘤1例、粘液性囊腺癌2例、交界型粘液性囊腺瘤1例)实施同样的染色。另外，除了HuRA15-7CTAcc抗体和阴性对象抗体的DNPDF抗体以外，MORAb-003抗体也用于染色。
结果显示，对于浆液性而言，5例中的5例(100％)能够进行利用HuRA15-7CTAcc抗体和MORAb-003抗体的染色，对于粘液性而言，3例中的1例(33％)能够进行利用HuRA15-7CTAcc抗体和MORAb-003抗体的染色。另外，用两种抗体染色后的组织样品中，染色后的区域相同，因此表明，两种抗体对卵巢癌的特异性相等。此外可知，与MORAb-003抗体相比，HuRA15-7CTAcc抗体能够更强地进行染色。
接着，通过H评分对上述染色样品的染色性进行定量化。关于H评分，将癌细胞中染色成阳性的细胞的染色强度用四个等级进行判定，以5％的刻度求出各评分的癌细胞中的阳性占据率(％)，然后，得到将各评分与阳性占据率相乘而得到的值的总和。
结果，对于MORAb-003抗体和HuRA15-7CTAcc抗体均观察到染色的浆液性囊腺癌4例、浆液性囊腺瘤1例和粘液性囊腺癌1例，在任意一个样品中，相对于MORAb-003抗体，HuRA15-7CTAcc抗体均显示出更高的H评分。另一方面，对于粘液性囊腺癌1例和交界型粘液性囊腺瘤1例，对于任意一种抗体而言均没有观察到染色，因此，H评分为0。
由此暗示，HuRA15-7CTAcc抗体比现有的卵巢癌治疗抗体MORAb-003更强地与卵巢癌中表达的FOLR1结合。
[实施例52]
大鼠/人嵌合型抗体和人源化抗体的ADCC活性评价
使用ChRA15-7Acc抗体、应用了CDC活性增强技术的去岩藻糖型HV7LV3人IgG1(HuRA15-7Acc)抗体和HuRA15-7CTAcc抗体，与实施例31同样地评价对卵巢癌细胞株的ADCC活性。
结果表明，对于来源于铂耐受性卵巢癌的SKOV-3细胞和OVCAR-3细胞，HuRA15-7Acc抗体和HuRA15-7CTAcc抗体中的任意一种抗体的ADCC活性均与ChRA15-7Acc抗体同等(图5)。
[实施例53]
大鼠/人嵌合型抗体和人源化抗体的CDC活性评价
评价对卵巢癌细胞株的CDC活性。
将作为靶标的癌细胞株IGR-OV1用0.02％EDTA溶液(ナカライ)从培养烧瓶中剥离，利用CDC测定培养基[不含酚红的RPMI1640(GIBCO)、1.4％BSA(SIGMA)]制备成1×104个细胞/50μL，作为靶细胞溶液。
接着，将人血清冻结干燥品(SIGMA)用纯化水1mL溶解，进而加入CDC测定培养基1mL，作为补体溶液。关于抗体溶液，首先，以使终浓度达到0.032μg/mL、0.16μg/mL、0.8μg/mL、4.0μg/mL、20μg/mL、100μg/mL的方式，将HuRA15-7CTAcc抗体、HuRA15-7CTDF抗体、ChRA15-7Acc抗体、ChRA15-7DF抗体和MORAb-003用CDC测定培养基制备成0.096μg/mL、0.48μg/mL、2.4μg/mL、12μg/mL、60μg/mL、300μg/mL。
将如上所述制备的靶细胞溶液、补体溶液、以及抗体溶液分别各以50μL/孔混合到平底的96孔板中，以总量计使其为150μL/孔。将各孔充分混合后，在37℃下反应2小时。接着，将各孔充分搅拌，以30μL/孔加入CellTiter 96单溶液细胞增殖检测试剂盒(Promega)，搅拌后，再在37℃反应约1小时。在观察到充分的发色后，测定490nm的吸光度。
CDC活性的计算中，首先，从各孔的吸光度测定值中减去混合有CDC测定培养基和补体溶液的孔的吸光度测定值，得到各孔的吸光度修正值，然后，通过下式进行计算。
在此，Exp表示各样品的吸光度修正值，ST表示靶细胞溶液和补体溶液的混合孔的吸光度修正值。
结果表明，HuRA15-7CTAcc抗体和HuRA15-7CTDF抗体分别相对于ChRA15-7Acc抗体和ChRA15-7DF抗体显示出显著高的CDC活性[图6(a)]。此外，HuRA15-7CTAcc抗体显示出比MORAb-003显著高的CDC活性[图6(b)]。
[实施例54]
HuRA15-7CTAcc抗体与现有抗FOLR1抗体的ADCC活性比较
使用HuRA15-7CTAcc抗体、MORAb-003Acc抗体和MORAb-003抗体，与实施例31同样地评价对卵巢癌细胞株的ADCC活性。
结果，对于来源于铂耐受性卵巢癌的SKOV-3细胞和OVCAR-3细胞，从比MORAb-003和MORAb-003Acc抗体低的浓度开始检测到HuRA15-7CTAcc抗体的ADCC活性(图7)。即表明，HuRA15-7CTAcc抗体与在现有的抗FOLR1人源化抗体(MORAb-003)中组合现有的ADCC活性增强技术(去岩藻糖化)而得到的MORAb-003Acc抗体相比，具有高的ADCC活性。
同样地，对于IGR-OV1细胞，从比MORAb-003抗体低的浓度开始检测到HuRA15-7CTAcc抗体的ADCC活性。另外，MORAb-003Acc抗体对卵巢癌细胞株的ADCC活性以IGR-OV1、SKOV-3、然后OVCAR-3细胞的顺序降低，但HuRA15-7CTAcc抗体的ADCC活性对于任意一种卵巢癌细胞株均大致同等。
由此暗示，HuRA15-7CTAcc抗体作为治疗铂耐受性卵巢癌抗体比现有抗体(MORAb-003)和在现有抗体中组合现有技术而得到的抗体(MORAb-003Acc)有用。
[实施例55]
HuRA15-7CTDF抗体的肿瘤累积性评价
通过荧光成像对HuRA15-7CTDF抗体和MORAb-003DF抗体的动态进行分析。首先，将HuRA15-7CTDF抗体和MORAb-003DF抗体分别用XenoLight CF 770试剂盒进行标记(HuRA15-7CTDF-770抗体和MORAb-003DF-770抗体)，将作为阴性对象的DNPDF抗体用XenoLightCFTM 680试剂盒进行标记(DNPDF-680抗体)。标记后的各抗体的结合性通过对SKOV-3细胞的流式细胞术反应性来确认。另外，根据说明书求出各抗体的标记化率。
将培养后的SKOV-3细胞悬浮于PBS中，皮下移植到BALB/cAJcl-nu/nu小鼠(雌性、5周龄、日本クレア)的侧背部。在移植后的肿瘤的体积达到约200mm3时，变更为无紫花苜蓿的饲料，再饲养1周。每组4只小鼠，以使平均肿瘤体积同等的方式将小鼠随机地分为3组。
接着，将10μg的HuRA15-7CTDF-770抗体或MORAb-003DF-770抗体与2μg的DNPDF-680抗体混合，用PBS使总量为200μL，将所得物给用到小鼠的尾静脉。关于给药后的抗体的动态，使用IVIS成像系统(Caliper)，对来自小鼠的荧光强度进行拍摄、评价。在给药4小时后首次拍摄，以后经时地进行拍摄。
拍摄的小鼠的来源于HuRA15-7CTDF-770抗体和MORAb-003DF-770抗体的荧光强度用各给药抗体溶液的荧光强度进行修正。另外，以来源于DNPDF-680抗体的荧光强度作为小鼠内标，计算出所观察到的HuRA15-7CTDF-770抗体和MORAb-003DF-770抗体的荧光强度之比，评价各抗体的动态。
结果表明，HuRA15-7CTDF-770抗体与MORAb-003DF-770抗体相比，显著多且长时间地局部存在于移植后的SKOV-3肿瘤块中(图8)。以上的结果是，本发明的抗体对来源于铂耐受性卵巢癌细胞株SKOV-3的恶化癌症显示出显著的累积性和残留性，暗示作为癌症治疗抗体更高的抗肿瘤活性。
[实施例56]
食蟹猴单次给药试验
对食蟹猴(雌性、4～6岁、3只)静脉内给用HuRA15-7CTAcc抗体(100mg/kg)，对其影响进行分析。作为检查项目，实施一般状态观察、体重、摄食量、体温、尿检查(尿量、尿比重、尿蛋白、尿糖、肌酸酐、NAG、Na、K、Cl)、血液学检查(白细胞、淋巴细胞、T细胞、Th细胞、Tc细胞、B细胞、NK细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、大型非染色细胞、红细胞、Hb浓度、Ht值、网状红细胞、血小板、PT、APTT、纤维蛋白原)、血液生化学检查(ALT、ALP、AST、CK、CRP、IL-6、C3、C4、CH50、总胆红素、总蛋白、白蛋白、球蛋白、甘油三酯、总胆固醇、血糖、BUN、肌酸酐、无机磷、Ca、Na、K、Cl)、病理解剖、器官重量、病理组织学检查。
结果，虽然观察到炎症、与免疫反应相关的变化，但较为轻微，另外，在安慰剂给药中也观察到同样的变化。因此，在任意一个检查项目中，均没有观察到HuRA15-7CTAcc抗体特异性毒性。
[实施例57]
HuRA15-7CRAcc抗体表达载体的制作
使用将Cys101进行氨基酸取代成Arg的HV7LV3人源化抗体修饰(HuRA15-7CR)抗体表达载体(实施例42)，与实施例26同样地应用CDC活性增强技术，得到应用了CDC活性增强技术的去岩藻糖型的HuRA15-7CR(以下记作HuRA15-7CRAcc)抗体表达载体。
[实施例58]
HuRA15-7CRAcc抗体表达细胞的制成
HuRA15-7CRAcc抗体表达细胞的制成中使用CHO/Ms704细胞。另外，表达载体使用实施例57中制作的HuRA15-7CRAcc抗体表达载体。通常传代时的培养、基因导入、抗药性细胞的筛选和培养上清的回收与实施例7同样地进行。
[实施例59]
HuRA15-7CRAcc抗体的纯化
从回收的培养上清中纯化出HuRA15-7CRAcc抗体的操作通过与实施例8同样的方法来进行。将HuRA15-7CRAcc抗体的280nm的吸光系数设定为1.37，计算出浓度。
[实施例60]
HuRA15-7CRAcc抗体的亲和性测定(表面等离子体共振法)
通过表面等离子体共振法测定HuRA15-7CRAcc抗体对FOLR1的亲和性。使用HuRA15-7CTAcc抗体、HuRA15-7CRAcc抗体和MORAb-003DF抗体，与实施例29同样地进行操作。
结果，HuRA15-7CRAcc抗体和MORAb-003DF抗体对FOLR1-mycHis的亲和性分别为HuRA15-7CTAcc抗体所具有的亲和性的2.6％和1.1％。
[实施例61]
HuRA15-7CRAcc抗体的ADCC活性评价
使用HuRA15-7CTAcc抗体、HuRA15-7CRAcc抗体和MORAb-003DF抗体，与实施例31同样地评价对卵巢癌细胞株的ADCC活性。
结果，对于铂耐受性卵巢癌细胞株OVCAR-3，以HuRA15-7CTAcc抗体、HuRA15-7CRAcc抗体、MORAb-003DF抗体的顺序，从更低的抗体浓度开始显示出ADCC活性(图9)。即，尽管HuRA15-7CRAcc抗体具有与MORAb-003DF抗体同等的亲和性(实施例60)，但HuRA15-7CRAcc抗体从比MORAb-003DF低的浓度开始显示出强的ADCC活性。由上暗示，为了使抗FOLR1抗体发挥强的ADCC活性，不仅对FOLR1的亲和性强是重要的，而且识别来源于RA15-7克隆的抗体的表位(实施例35)也是重要的。
[实施例62]
HuRA15-7CTAcc抗体的表位分析(ELISA法)
与实施例35同样地，使用实施例11中制作的FOLR1-mycHis和实施例34中制作的Rat1-FOLR1-mycHis、Rat2-FOLR1-mycHis、Rat4-FOLR1-mycHis对ChRA15-7Acc抗体、MORAb-003抗体、MOv18抗体和HuRA15-7CTAcc抗体的反应性进行评价。
将其结果示于表4中。白色圆形表示观察到反应，×表示未观察到反应。HuRA15-7CTAcc抗体与FOLR1-mycHis、Rat1-FOLR1-mycHis和Rat4-FOLR1-mycHis观察到反应，与Rat2-FOLR1-mycHis未观察到反应。因此暗示了：HuRA15-7CTAcc抗体与ChRA15-7Acc抗体同样地识别FOLR1-mycHis的第55位至第62位的氨基酸序列。
[表4]
[实施例63]
卵巢癌细胞株的细胞膜上表达的FOLR1的定量分析
使用QIFIKIT(Dako)对卵巢癌细胞株(IGR-OV1、SKOV-3、OVCAR-3、MCAS)的细胞膜上的FOLR1表达量进行分析。将作为抗FOLR1抗体的LK26(GeneTex)和作为阴性对象的小鼠IgG2a(Dako)分别以20μg/mL的浓度使用，根据QIFIKIT附带的说明书对细胞和标准微珠进行染色。
染色细胞各准备3个样品，分别利用流式细胞仪检测MFI值(图10)。取3个样品的MFI平均值，作为各细胞的MFI值。接着，将各细胞和标准微珠的MFI值输入到雅玛山酱油株式会社提供的用于QIFIKIT的ABC计算器中，求出各卵巢癌细胞株上表达的FOLR1分子数。
结果显示，IGR-OV1、SKOV-3、OVCAR-3和MCAS的细胞膜上表达的FOLR1在每个细胞中分别为1.17×106、1.10×105、6.63×104和1.37×104分子(图10)。
在此，与实施例54(图7)的结果组合可知，即使是FOLR1低表达(细胞膜上的FOLR1分子数为1×104～1×105)的细胞，HuRA15-7CTAcc抗体也显示出与FOLR1高表达(细胞膜上的FOLR1分子数为1×106)的细胞同样的ADCC活性。由此暗示了：FOLR1不仅作为治疗高表达的癌细胞的抗体、作为治疗低表达的癌细胞的抗体，也比现有抗体(MORAb-003)和在现有抗体中组合现有技术而得到的抗体(MORAb-003Acc)有用。
[实施例64]
人乳腺癌组织免疫染色
与实施例51同样地，将人乳腺癌组织阵列(BioChain)供于免疫组织染色(IHC)。阵列中包含侵袭性导管癌组织35例、侵袭性小叶癌组织2例、正常组织3例，分别附带了雌激素受体(ER)、孕甾酮受体(PR)、Her2的阴阳的信息。
染色的结果是，利用HuRA15-7CTAcc和MORAb-003抗体呈阳性的是在ER阳性和/或PR阳性且Her2阴性的组织中为56％和27％、在ER阳性和/或PR阳性且Her2阳性的组织中为50％和50％、在ER阴性和/或PR阴性且Her2阳性的组织中为71％和14％、ER阴性且PR阴性且Her2阴性的组织中为22％和11％。由该结果表明，与MORAb-003抗体相比，HuRA15-7CTAcc抗体能够灵敏度更好地对FOLR1阳性的乳腺癌组织进行染色。
此外，用HuRA15-7CTAcc抗体观察到染色的样品的H评分相对于MORAb-003抗体对相同组织样品的H评分均为高评分。由此暗示了：HuRA15-7CTAcc抗体比现有抗体MORAb-003更强地与乳腺癌中表达的FOLR1结合。
[实施例65]
使用来源于卵巢癌性腹水的细胞的自体同源去除(autologousdepletion)试验
从Molecular Response公司(MR公司)购入冻结的来源于卵巢癌性腹水的细胞，实施以下的自体同源去除试验。
首先，将来源于冻结卵巢癌性腹水的细胞在37℃的水槽溶解，悬浮于腹水细胞用培养基中。腹水细胞用培养基使用在RPMI1640GlutaMax(GIBCO)中添加有10％灭活后的FCS、1/100量的青霉素&链霉素(GIBCO)、1/100量的非必需氨基酸(GIBCO)、和1/100量的丙酮酸钠(GIBCO)的培养基。
首先，以达到2×106个细胞/450μL的方式制备细胞悬浮液，以各孔450μL接种到24孔板上。接着，以使终浓度达到1～1000ng/mL的方式，将HuRA15-7CTAcc抗体、MORAb-003抗体和作为阴性对象的DNPDF抗体用腹水细胞用培养基进行制备，以50μL/孔进行添加。然后，在37℃下培养24小时。
培养后，通过移液将各孔充分混合，各分取250μL至其他试管中。将各试管在200×g、5分钟、4℃的条件下进行离心分离，除去上清。接着，用2mL的染色缓冲液(FBS)(BD Biosciences)对细胞团块进行悬浮，进行同样的离心分离，除去上清，对细胞进行洗涤。将细胞团块用100μL的染色缓冲液(FBS)进行悬浮，进行癌细胞检测用染色和阴性对象用染色。
癌细胞检测用染色中，使用CD45-PerCP(BD Biosciences)、CD14-FITC(BD Biosciences)、EpCAM-APC(BD Biosciences)和FOLR1-PE(R&D Systems)。阴性对象用染色中，使用CD45-PerCP(BDBiosciences)、CD14-FITC(BD Biosciences)、mIgG1-APC(BD Biosciences)、和mIgG1-PE(BD Biosciences)。
在室温下使其反应30分钟后，用2mL的染色缓冲液(FBS)进行悬浮，进行利用离心分离的洗涤。在洗涤后的细胞团块中加入添加有1/100量的7-AAD(BD Biosciences)的400μL的染色缓冲液(FBS)，进行悬浮，作为流式细胞术测定样品。
对细胞染色中使用的荧光色素适当进行校正后，利用流式细胞仪对各样品进行测定。首先，获得7-AAD阴性(-)/CD45(-)/CD14(-)的细胞团块，接着，获得用FSC、SSC除去淋巴细胞的级分。对于该细胞级分，用阴性对象用染色样品确定mIgG1-APC和mIgG1-PE的检测位置后，将癌细胞检测用染色样品的FOLR1和EpCAM阳性(+)级分作为癌细胞团块。
另外，以使7-AAD(-)/CD14(-)/CD45(+)的级分的检测计数达到一定数量的方式进行测定，由此，对各样品间的癌细胞级分的细胞数变化进行比较。
将癌细胞级分中检测到的细胞数在添加有HuRA15-7CTAcc抗体、MORAb-003抗体或DNPDF抗体的样品中减少了何种程度以细胞抑制活性(％)示于纵轴(图11)。横轴表示抗体浓度(ng/mL)。
在此，图11的FZ12、FZ21、FZ26、和FZ44分别表示卵巢癌性腹水的供体(SPECNUM/Patient ID为2003090712/7028、2009080521/173089、2009060526/5208和2003041044/113139)。另外显示，任意一个样品在MR公司实施的体外抗药性试验中均为包含顺铂抗药性的癌细胞的卵巢癌性腹水。
结果，如图11所示，在任意一个样品中，与MORAb-003抗体相比，HuRA15-7CTAcc抗体均从更低的浓度开始检测到更强的细胞毒活性。
由此表明，在来源于卵巢癌患者的腹水的细胞群中添加HuRA15-7CTAcc抗体时，腹水中的铂耐受性癌细胞被腹水中的效应细胞杀伤。另外表明，利用HuRA15-7CTAcc抗体的该细胞毒活性比现有卵巢癌治疗抗体MORAb-003高。
[实施例66]
卵巢癌细胞株的FOLR1表达量和叶酸摄入量的分析
首先，利用流式细胞仪测定卵巢癌细胞株IGR-OV1(NationalCancer Institute)、OVISE(JCRB细胞编号：JCRB1043)、SKOV-3(ATCC编号：HTB-77)、Caov-3(ATCC编号：HTB-75)、RMG-1(JCRB细胞编号：JCRB0172)、OV-90(ATCC编号：CRL-11732)、OVCAR-3(ATCC编号：HTB-161)、MCAS(JCRB细胞编号：JCRB0240)和TOV-112D(ATCC编号：CRL-11731)上表达的FOLR1。
对各细胞株进行培养后，用0.02％EDTA溶液(ナカライ)进行剥离，用PBS洗涤后，悬浮于FCM缓冲液(包含1mM EDTA、0.05％叠氮化钠、5％灭活后的FCS的PBS)中。接着，以每孔为1×105个的方式接种到96孔板上，以1700rpm进行1分钟的离心分离。除去上清后，添加用FCM缓冲液制备成1μg/mL的HuRA15-7CTAcc抗体，在4℃下进行30分钟的反应。
将细胞洗涤后，添加用FCM缓冲液稀释至200倍的抗人IgG-FITC(Jackson)，在4℃下进行30分钟的反应。再次将细胞洗涤后，将细胞用FCM缓冲液悬浮，利用流式细胞仪(贝克曼库尔特公司制造，FC500MPL)对荧光强度进行分析，求出各细胞的MFI值。同样地，求出用DNPDF抗体染色的各细胞的MFI值，计算出相对于DNPDF抗体的HuRA15-7CTAcc抗体中的相对MFI值[图12(a)]。
结果显示，以IGR-OV1、OVISE、SKOV-3、Caov-3、RMG-1、OV-90、OVCAR-3、MCAS和TOV-112D的顺序，FOLR1进行了高表达。
接着，将相同的卵巢癌细胞株用不含叶酸的培养基[包含10％灭活后的透析FCS的不含叶酸的RPMI1640(invitrogen)]培养3天。然后，添加标记化叶酸以使终浓度达到100nm，在37℃下培养3小时。
接着，用37℃的PBS将细胞洗涤后，用添加有1mM的叶酸的培养基在37℃下培养3小时。用PBS将细胞洗涤后，用胰蛋白酶(GIBCO)剥离细胞，用FCM缓冲液进行悬浮。利用流式细胞仪对荧光强度进行分析，求出各细胞的MFI值。同样地，求出未添加标记化叶酸的细胞的MFI值，计算出相对于未添加标记化叶酸的细胞的100nM的标记化叶酸添加样品的相对MFI值[图12(b)]。
结果表明，FOLR1表达量与叶酸摄入量未观察到相关关系。例如，SKOV-3的FOLR1表达量仅次于IGR-OV1、OVISE，但叶酸摄入量比IGR-OV1、OVISE、Caov-3、RMG-1和OV-90低。该结果表明，即使是FOLR1表达量高的类型的癌症，利用接合有抗癌剂等的叶酸的治疗有时也无效。
另一方面，对于叶酸摄入量低的SKOV-3、OVCAR-3，本发明的抗体显示出有效的细胞毒活性(实施例54)。以上的结果表明，由于叶酸摄入量少，因此，对于未观察到利用接合有抗癌剂等的叶酸的抗肿瘤活性的癌症，本发明的抗体也有效。
使用特定的方式对本发明详细进行了说明，但对于本领域技术人员而言显而易见的是，在不脱离本发明的意图和范围的情况下可以进行各种变更和变形。另外，本申请基于2012年12月7日提出的美国临时专利申请(61/734610号)和2012年12月7日提出的美国临时专利申请(61/734547号)，将其整体通过引用进行援引。
序列表自由文本
序列号1：FOLR1的氨基酸序列
序列号2：FOLR1-F的碱基序列
序列号3：FOLR1-R的碱基序列
序列号4：CyFOLR1-F的碱基序列
序列号5：CyFOLR1-R的碱基序列
序列号6：CyFOLR1_DNA的碱基序列
序列号7：CyFOLR1_AA的氨基酸序列
序列号8：FOLR1-Fc-F的碱基序列
序列号9：FOLR1-Fc-R的碱基序列
序列号10：FOLR2-Fc-F的碱基序列
序列号11：FOLR2-Fc-R的碱基序列
序列号12：FOLR3-Fc-F的碱基序列
序列号13：FOLR3-Fc-R的碱基序列
序列号14：CyFOLR1-Fc-F的碱基序列
序列号15：CyFOLR1-Fc-R的碱基序列
序列号16：FOLR1-mH-F的碱基序列
序列号17：FOLR1-mH-R的碱基序列
序列号18：RatIgG1H-A的碱基序列
序列号19：RatIgG1H-B的碱基序列
序列号20：Ratk-A的碱基序列
序列号21：Ratk-B的碱基序列
序列号22：RA15-7VH_DNA的碱基序列
序列号23：RA15-7VH_AA的氨基酸序列
序列号24：RA15-7VL_DNA的碱基序列
序列号25：RA15-7VL_AA的氨基酸序列
序列号26：nonS_RA15-7VH_DNA的碱基序列
序列号27：nonS_RA15-7VH_AA的氨基酸序列
序列号28：nonS_RA15-7VL_DNA的碱基序列
序列号29：nonS_RA15-7VL_AA的氨基酸序列
序列号30：RA15-7VHCDR1_AA的氨基酸序列
序列号31：RA15-7VHCDR2_AA的氨基酸序列
序列号32：RA15-7VHCDR3_AA的氨基酸序列
序列号33：RA15-7VLCDR1_AA的氨基酸序列
序列号34：RA15-7VLCDR2_AA的氨基酸序列
序列号35：RA15-7VLCDR3_AA的氨基酸序列
序列号36：RA15-7-VLF的碱基序列
序列号37：RA15-7-VLR的碱基序列
序列号38：RA15-7-VHF的碱基序列
序列号39：RA15-7-VHR的碱基序列
序列号40：FcAcc_DNA的碱基序列
序列号41：FcAcc_AA的氨基酸序列
序列号42：Rat1-FOLR1-mycHis_DNA的碱基序列
序列号43：Rat2-FOLR1-mycHis_DNA的碱基序列
序列号44：Rat4-FOLR1-mycHis_DNA的碱基序列
序列号45：Rat1-FOLR1-mycHis_AA的氨基酸序列
序列号46：Rat2-FOLR1-mycHis_AA的氨基酸序列
序列号47：Rat4-FOLR1-mycHis_AA的氨基酸序列
序列号48：HV0的碱基序列
序列号49：HV2的碱基序列
序列号50：HV3的碱基序列
序列号51：HV4的碱基序列
序列号52：HV5的碱基序列
序列号53：HV6的碱基序列
序列号54：HV7的碱基序列
序列号55：HV8的碱基序列
序列号56：HV10的碱基序列
序列号57：LV0的碱基序列
序列号58：LV2的碱基序列
序列号59：LV3的碱基序列
序列号60：LV4的碱基序列
序列号61：LV6的碱基序列
序列号62：HuRA15-7HV7_DNA的碱基序列
序列号63：C101M_DNA的碱基序列
序列号64：C101G_DNA的碱基序列
序列号65：C101D_DNA的碱基序列
序列号66：C101S_DNA的碱基序列
序列号67：C101Y_DNA的碱基序列
序列号68：C101A_DNA的碱基序列
序列号69：C101I_DNA的碱基序列
序列号70：C101V_DNA的碱基序列
序列号71：C101T_DNA的碱基序列
序列号72：C101F_DNA的碱基序列
序列号73：C101R_DNA的碱基序列
序列号74：C101W_DNA的碱基序列
序列号75：C101P_DNA的碱基序列
序列号76：C101Q_DNA的碱基序列
序列号77：C101M_AA的氨基酸序列
序列号78：C101G_AA的氨基酸序列
序列号79：C101D_AA的氨基酸序列
序列号80：C101S_AA的氨基酸序列
序列号81：C101Y_AA的氨基酸序列
序列号82：C101A_AA的氨基酸序列
序列号83：C101I_AA的氨基酸序列
序列号84：C101V_AA的氨基酸序列
序列号85：C101T_AA的氨基酸序列
序列号86：C101F_AA的氨基酸序列
序列号87：C101R_AA的氨基酸序列
序列号88：C101W_AA的氨基酸序列
序列号89：C101P_AA的氨基酸序列
序列号90：C101Q_AA的氨基酸序列
序列号91：HuRA15-7LV3_DNA的碱基序列
序列号92：HuRA15-7LV3_AA的氨基酸序列
序列号93：nonS_HuRA15-7LV3_DNA的碱基序列
序列号94：nonS_HuRA15-7LV3_AA的氨基酸序列
序列号95：HuRA15-7CTVH_DNA的碱基序列
序列号96：HuRA15-7CTVH_AA的氨基酸序列
序列号97：nonS_HuRA15-7CTVH_DNA的碱基序列
序列号98：nonS_HuRA15-7CTVH_AA的氨基酸序列
序列号99：HuRA15-7CTVHCDR3_AA的氨基酸序列
序列号100：HV0_AA的氨基酸序列
序列号101：LV0_AA的氨基酸序列
序列号102：Rat FOLR1的氨基酸序列

Claims (16)

1.一种单克隆抗体或该抗体片段，其与选自下述(a)～(c)中的一种抗体竞争地特异性识别人FOLR1并结合于与上述抗体所结合的人FOLR1上存在的表位相同的表位，并且显示出抗肿瘤活性，
(a)包含互补决定区(complementarity determining region，以下记作CDR)1～3分别含有序列号30、31、32表示的氨基酸序列的抗体的重链(以下记作H链)且包含CDR1～3分别含有序列号33、34、35表示的氨基酸序列的抗体的轻链(以下记作L链)的抗体，
(b)包含CDR1～3分别含有序列号30、31、32表示的氨基酸序列的抗体的H链且包含CDR1～3分别含有序列号33、34、35表示的氨基酸序列的抗体的L链的抗体，序列号32(抗体H链的CDR3)表示的氨基酸序列中的半胱氨酸被取代成苏氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸或谷氨酰胺的抗体，
(c)包含含有序列号98表示的氨基酸序列的抗体的H链且包含含有序列号94表示的氨基酸序列的抗体的L链的抗体。
2.如权利要求1所述的单克隆抗体或该抗体片段，其为基因重组抗体。
3.如权利要求2所述的单克隆抗体或该抗体片段，其为选自人嵌合抗体、人源化抗体和人抗体中的基因重组抗体。
4.选自下述(a)～(c)中的一种单克隆抗体或该抗体片段，
(a)包含CDR1～3分别含有序列号30、31、32表示的氨基酸序列的抗体的H链且包含CDR1～3分别含有序列号33、34、35表示的氨基酸序列的抗体的L链的单克隆抗体和该抗体片段，
(b)包含CDR1～3分别含有序列号30、31、32表示的氨基酸序列的抗体的H链且包含CDR1～3分别含有序列号33、34、35表示的氨基酸序列的抗体的L链的抗体，序列号32(抗体H链的CDR3)表示的氨基酸序列中的半胱氨酸被取代成苏氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸或谷氨酰胺的抗体，
(c)包含含有序列号98表示的氨基酸序列的抗体的H链且包含含有序列号94表示的氨基酸序列的抗体的L链的抗体。
5.如权利要求1～4中任一项所述的单克隆抗体和该抗体片段，其与序列号1表示的人FOLR1的氨基酸序列结合。
6.如权利要求1～4中任一项所述的抗体片段，其为选自Fab、Fab’、F(ab’)2、单链抗体(scFv)、二聚体化V区(双价抗体)、二硫键稳定的V区(dsFv)和包含CDR的肽中的抗体片段。
7.一种DNA，其编码权利要求1～4中任一项所述的单克隆抗体或该抗体片段。
8.一种重组载体，其含有权利要求7所述的DNA。
9.一种转化株，其通过将权利要求8所述的重组载体导入宿主细胞中而获得。
10.权利要求1或权利要求4所述的单克隆抗体或该抗体片段的制造方法，其特征在于，将权利要求9所述的转化株在培养基中进行培养，在培养物中生成并蓄积权利要求1或权利要求4所述的单克隆抗体或该抗体片段，并从培养物中收集该抗体或该抗体片段。
11.一种人FOLR1阳性细胞相关的疾病的治疗方法，其包括给用权利要求1～4中任一项所述的单克隆抗体或该抗体片段。
12.一种人FOLR1阳性细胞相关的疾病的治疗剂，其包含权利要求1～4中任一项所述的单克隆抗体或该抗体片段和药理学上容许的载体。
13.一种人FOLR1或人FOLR1阳性细胞的免疫学检测或测定方法，其使用权利要求1～4中任一项所述的单克隆抗体或该抗体片段。
14.一种人FOLR1阳性细胞相关的疾病的诊断方法，其包括：使用权利要求1～4中任一项所述的单克隆抗体或该抗体片段对人FOLR1阳性细胞进行检测或测定。
15.一种人FOLR1阳性细胞相关的疾病的诊断剂，其含有权利要求1～4中任一项所述的单克隆抗体或该抗体片段。
16.使用权利要求1～4中任一项所述的单克隆抗体或该抗体片段在治疗开始前对利用该抗体的治疗有效性进行判断的方法。
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