KR20180013976A - 평가 대상 약제의 혈액 독성 평가 방법 및 평가 대상 약제의 혈액 독성 평가용 모델 - Google Patents

평가 대상 약제의 혈액 독성 평가 방법 및 평가 대상 약제의 혈액 독성 평가용 모델 Download PDF

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Abstract

본 발명은 골수 독성의 임상 예견성이 뛰어난, 평가 대상 약제의 혈액 독성 평가 방법 및 평가 대상 약제의 혈액 독성 평가용 모델을 제공하는 것으로서,　NOG 마우스에 인간 GM-CSF/IL-3 유전자가 도입되어, 혈액 중의 백혈구에 있어서의 인간 유래 백혈구의 함유량이 20개수％ 이상인 인간화된 개변형 NOG 마우스에 대하여 평가 대상 약제를 투여하는 공정과, 상기 평가 대상 약제를 투여한 후의 상기 개변형 NOG 마우스의 시료에 대해, 인간 유래 혈구세포의 세포수를 측정하고, 상기 평가 대상 약제 대신에 용매를 투여한 대조와 비교하여 상기 인간 유래 혈구세포의 세포수가 변화한 경우에, 상기 평가 대상 약제에 혈액 독성이 있다고 평가하는 공정을 포함하는 평가 대상 약제의 혈액 독성 평가 방법이다.

Description

평가 대상 약제의 혈액 독성 평가 방법 및 평가 대상 약제의 혈액 독성 평가용 모델
본 발명은 평가 대상 약제의 혈액 독성 평가 방법, 및 평가 대상 약제의 혈액 독성 평가용 모델에 관한 것이다.
골수장해에 기인하여 발현하는 백혈구 감소 등의 혈액 독성은 항암제의 주요 부작용이며(비특허문헌 1 참조), 많은 항암제에 있어서 투여량 제한 인자(DLF)로 되어 있다. 의약 개발의 연구 단계에서는, 실험동물의 말초혈을 이용한 혈액학적 검사에 의해 혈액 독성의 평가를 행하고 있다. 그러나, 상기 실험동물을 이용한 항암제의 혈액 독성의 평가 실험에서는, 상기 골수장해의 정도가 상기 실험동물과 인간에서는 다른 경우가 있어, 임상 예견성이 부족하다. 특히, 설치류를 이용한 실험에 있어서는, 반응성이나 상기 골수장해로부터의 회복 기간이 상기 인간의 임상 지견과는 다르다. 이 차이의 요인으로서, 주로 상기 인간과 상기 실험동물에서는, 상기 항암제에 대한 골수세포의 감수성이나 세포 증식 시간이 상위한 것 등을 들 수 있다. 또, 상기 항암제의 조혈계 세포의 분화 증식능에의 영향을 조사하기 위해, 콜로니 형성 시험이나 ATP 분석을 행하는 경우도 있지만, 이들 시험관내(in vitro) 실험에서는, 상기 항암제가 체내에서 대사됨으로써 효과를 발현하는 경우, 평가가 곤란한 것에 더하여, 회복성의 추이에 대한 검토도 곤란하다.
지금까지의 동물 실험에서는, 상기 골수장해를 일으키는 골수 독성에 대한 임상 예견성이 낮아, 상기 동물 실험에서의 투여량으로부터 상기 인간의 임상에서의 투여량의 추정이 곤란했다. 따라서, 골수 독성의 임상 예견성이 높은 평가 방법은 지금까지 보고되고 있지 않다.
또, 중증 면역부전 마우스인 NOG 마우스(특허문헌 1 및 비특허문헌 2 참조)에 X선을 전신 조사하여 골수를 파괴한 후, 인간 제대혈 유래 CD34＋ 세포를 이식한 마우스가 보고되고 있다(비특허문헌 3 참조).
또, 상기 NOG 마우스에 X선을 전신 조사하여 골수를 파괴한 후, 인간 제대혈 유래 CD34＋ 세포를 이식한 마우스와, C57BL/6J 마우스 골수 유래의 Lineage-세포를 이식한 마우스에 있어서, 벤젠에 의한 혈액 독성을 평가한 것이 보고되고 있다(비특허문헌 4 및 비특허문헌 5 참조).
그러나, 인간화된 상기 NOG 마우스에 있어서, 모든 조직 유래의 혈구세포 중에 인간 백혈구계 전구세포 및 인간 백혈구계 성숙세포가 확인되고는 있지만, 골수구계 세포의 분화는 충분하지 않고, 특히, 과립구의 분화가 거의 인지되지 않는다. 따라서, NOG 마우스를 이용한 경우라도, 골수 독성의 임상 예견성이 높은, 평가 대상 약제의 혈액 독성 평가를 행하는 것은 곤란하고, 평가 대상 약제의 혈액 독성 평가에 적합한 모델 동물은 아직 존재하지 않는다.
일본국 특허 제3753321호 공보
일약리지(日藥理誌) 132, p.343∼346(2008) Blood 100, p.3175∼3182(2002) 전력중앙연구소 보고 연구보고: V09011, 2010년 4월 전력중앙연구소 보고 연구보고: V11063, 2013년 1월 PLoS One. 2012; 7(12): e50448
본 발명은 상기 종래의 여러 문제를 해결하고, 이하의 목적을 달성하는 것을 과제로 한다. 즉, 본 발명은 골수 독성의 임상 예견성이 뛰어난, 평가 대상 약제의 혈액 독성 평가 방법 및 평가 대상 약제의 혈액 독성 평가용 모델을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은, 상기 목적을 해결하기 위해 예의 검토한 결과, 인간화된 개변형 NOG 마우스를 이용하여, 평가 대상 약제에 의한 인간의 혈액 독성을 평가할 수 있는 것을 발견하고, 본 발명의 완성에 이르렀다.
본 발명은, 본 발명자들에 의한 상기 지견에 근거한 것이며, 상기 과제를 해결하기 위한 수단으로는 이하와 같다. 즉,
＜1＞ NOG 마우스에 인간 GM-CSF/IL-3 유전자가 도입되어, 혈액 중의 백혈구에 있어서의 인간 유래 백혈구의 함유량이 20개수％ 이상인, 인간화된 개변형 NOG 마우스에 대하여 평가 대상 약제를 투여하는 공정과,
상기 평가 대상 약제를 투여한 후의 상기 개변형 NOG 마우스의 시료에 대해, 인간 유래 혈구세포의 세포수를 측정하고, 상기 평가 대상 약제 대신에 용매를 투여한 대조와 비교하여 상기 인간 유래 혈구세포의 세포수가 변화한 경우에, 상기 평가 대상 약제에 혈액 독성이 있다고 평가하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 평가 대상 약제의 혈액 독성 평가 방법이다.
＜2＞　상기 인간화된 개변형 NOG 마우스가, 개변형 NOG 마우스에 방사선 조사를 행하여 마우스 유래 골수세포를 배제하고, 인간 유래 hCD34＋ 세포를 이식하여 생착시킴으로써 제작되는 상기 ＜1＞에 기재한 평가 대상 약제의 혈액 독성 평가 방법이다.
＜3＞　상기 평가 대상 약제가, 상기 인간화된 개변형 NOG 마우스의 시료에 대하여 투여되는 상기 ＜1＞ 내지 ＜2＞ 중 어느 하나에 기재한 평가 대상 약제의 혈액 독성 평가 방법이다.
＜4＞　상기 인간 유래 혈구세포가 백혈구, 과립구, 적혈구 및 혈소판 중 적어도 어느 하나이며,
상기 평가 대상 약제에 혈액 독성이 있다라는 평가가 백혈구 감소, 과립구 감소, 적혈구 감소, 혈소판 감소, 백혈구 증가 및 범혈구 감소 중 적어도 어느 하나에 근거하여 행해지는 상기 ＜1＞ 내지 ＜3＞ 중 어느 하나에 기재한 평가 대상 약제의 혈액 독성 평가 방법이다.
＜5＞　상기 인간 유래 혈구세포가 인간 유래 과립구이고, 또한 상기 평가 대상 약제에 혈액 독성이 있다라는 평가가 과립구 감소에 근거하여 행해지는 상기 ＜1＞ 내지 ＜4＞ 중의 어느 하나에 기재한 평가 대상 약제의 혈액 독성 평가 방법이다.
＜6＞　상기 평가 대상 약제가 항암제인 상기 ＜1＞ 내지 ＜5＞ 중 어느 하나에 기재한 평가 대상 약제의 혈액 독성 평가 방법이다.
＜7＞　상기 항암제가 살(殺)세포형 항암제인 상기 ＜6＞에 기재한 평가 대상 약제의 혈액 독성 평가 방법이다.
＜8＞　상기 살세포형 항암제가, 캄프토테신(camptothecin) 유연체(類緣體), 캄프토테신 유연체를 내포하는 복합체, 파클리탁셀(paclitaxel) 유연체, 파클리탁셀을 내포하는 복합체 및 백금 착체 유도체 중 적어도 어느 하나인 상기 ＜7＞에 기재한 평가 대상 약제의 혈액 독성 평가 방법이다.
＜9＞　상기 살세포형 항암제가, 이리노테칸(irinotecan), 노기테칸(nogitecan), 7-에틸-10-히드록시캄프토테신, 파클리탁셀 및 옥살리플라틴(oxaliplatin) 중 적어도 어느 하나인 상기 ＜7＞에 기재한 평가 대상 약제의 혈액 독성 평가 방법이다.
＜10＞　상기 대조와 비교하여 상기 인간 유래 혈구세포의 세포수가 변화한 후에, 상기 평가 대상 약제의 투여 전의 세포수로 회복하는 기간을 측정하고, 상기 기간에 근거하여 회복성을 평가하는 공정을 추가로 포함하는 상기 ＜1＞ 내지 ＜9＞ 중 어느 하나에 기재한 평가 대상 약제의 혈액 독성 평가 방법이다.
＜11＞　상기 인간 유래 혈구세포의 세포수와, 상기 마우스 유래 혈구세포의 세포수를 측정하고, 상기 평가 대상 약제 대신에 상기 용매를 투여한 상기 대조와 비교하여 상기 마우스 유래 혈구세포의 세포수가 변화한 경우에, 상기 평가 대상 약제에 혈액 독성이 있다고 평가하는 공정과,
상기 인간 유래 혈구세포의 평가 결과와 상기 마우스 유래 혈구세포의 평가 결과에 근거하여, 상기 평가 대상 약제의 혈액 독성의 종차(種差)를 평가하는 공정을 추가로 포함하는 상기 ＜1＞ 내지 ＜10＞ 중 어느 하나에 기재한 평가 대상 약제의 혈액 독성 평가 방법이다.
＜12＞　NOG 마우스에 인간 GM-CSF/IL-3 유전자가 도입되어, 혈액 중의 백혈구에 있어서의 인간 유래 백혈구의 함유량이 20개수％ 이상인, 인간화된 개변형 NOG 마우스로 이루어지는 것을 특징으로 하는 평가 대상 약제의 혈액 독성 평가용 모델이다.
본 발명에 의하면, 종래의 상기 여러 문제를 해결하고, 상기 목적을 달성할 수 있어, 골수 독성의 임상 예견성이 뛰어난, 평가 대상 약제의 혈액 독성 평가 방법 및 평가 대상 약제의 혈액 독성 평가용 모델을 제공할 수 있다.
도 1은 노기테칸의 혈액 독성 평가에 있어서의, 인간 유래 백혈구(hCD45＋)수의 추이를 나타내는 그래프이다.
도 2는 노기테칸의 혈액 독성 평가에 있어서의, 마우스 유래 백혈구(mCD45＋)수의 추이를 나타내는 그래프이다.
도 3은 노기테칸의 혈액 독성 평가에 있어서의, 인간 유래 과립구(CD66b＋)수의 추이를 나타내는 그래프이다.
도 4는 노기테칸의 혈액 독성 평가에 있어서의, 마우스 유래 과립구(Gr-1＋)수의 추이를 나타내는 그래프이다.
도 5는 파클리탁셀의 혈액 독성 평가에 있어서의, 인간 유래 백혈구(hCD45＋)의 추이를 나타내는 그래프이다.
도 6은 파클리탁셀의 혈액 독성 평가에 있어서의, 마우스 유래 백혈구(mCD45＋)수의 추이를 나타내는 그래프이다.
도 7은 파클리탁셀의 혈액 독성 평가에 있어서의, 인간 유래 과립구(CD66b＋)의 추이를 나타내는 그래프이다.
도 8은 파클리탁셀의 혈액 독성 평가에 있어서의, 마우스 유래 과립구(Gr-1＋)수의 추이를 나타내는 그래프이다.
도 9는 파클리탁셀의 혈액 독성 평가에 있어서의, 컨트롤군의 인간 유래 백혈구(hCD45＋)수 및 마우스 유래 백혈구(mCD45＋)수의 비율의 추이를 나타내는 그래프이다.
도 10은 파클리탁셀의 혈액 독성 평가에 있어서의, 파클리탁셀 투여군의 인간 유래 백혈구(hCD45＋)수 및 마우스 유래 백혈구(mCD45＋)수의 비율의 추이를 나타내는 그래프이다.
도 11은 옥살리플라틴의 혈액 독성 평가에 있어서의, 인간 유래 백혈구(hCD45＋)의 추이를 나타내는 그래프이다.
도 12는, 옥살리플라틴의 혈액 독성 평가에 있어서의, 마우스 유래 백혈구(mCD45＋)수의 추이를 나타내는 그래프이다.
도 13은 옥살리플라틴의 혈액 독성 평가에 있어서의, 인간 유래 과립구(CD66b＋)수의 추이를 나타내는 그래프이다.
도 14는 옥살리플라틴의 혈액 독성 평가에 있어서의, 마우스 유래 과립구(Gr-1＋)수의 추이를 나타내는 그래프이다.
(평가 대상 약제의 혈액 독성 평가 방법)
본 발명의 평가 대상 약제의 혈액 독성 평가 방법은, 약제 투여 공정과, 평가 공정을 포함하고, 추가로 필요에 따라 회복성 평가 공정, 종차 평가 공정 등의 기타 공정을 포함한다.
본 발명의 평가 대상 약제의 혈액 독성 평가 방법은, 생체내(in vivo) 혈액 독성 평가 방법이어도 되고, 시험관내 혈액 독성 평가 방법이어도 된다.
＜약제 투여 공정＞
상기 약제 투여 공정은, 인간화된 개변형 NOG 마우스에 대하여 평가 대상 약제를 투여하는 공정이다.
－ 인간화된 개변형 NOG 마우스(평가 대상 약제의 혈액 독성 평가용 모델) -
상기 인간화된 개변형 NOG 마우스는, 혈액 중의 백혈구에 있어서의 인간 유래 백혈구의 함유량이 20개수％ 이상인 개변형 NOG 마우스이다.
여기에서, 「인간화」란, 상기 혈액 중에 인간 유래의 혈액 세포가 도입된 것을 의미한다.
본 발명의 평가 대상 약제의 혈액 독성 평가용 모델은, 상기 인간화된 개변형 NOG 마우스로 이루어지는 평가 대상 약제의 혈액 독성 평가용 모델이다.
본 발명의 평가 대상 약제의 혈액 독성 평가용 모델 동물은, 본 발명의 평가 대상 약제의 혈액 독성 평가 방법에 적합하게 이용할 수 있다.
－－ 개변형 NOG 마우스(Tg-NOG 마우스) －－
상기 개변형 NOG 마우스(이하, 「Tg-NOG 마우스」라고 칭하는 경우가 있다.)란, NOG 마우스에 인간 GM-CSF/IL-3 유전자가 도입된 트랜스제닉 NOG 마우스(Tg-NOG 마우스)이며, 보다 상세하게는, 상기 NOG 마우스에, 인간 GM-CSF/IL-3 유전자가 도입된 C57BL/6 계통의 트랜스제닉 마우스(C57BL/6-IL-3/GM-CSF-Tg 마우스)를 역교배시켜 얻어지고, 전신적으로 인간 GM-CSF 및 인간 IL-3를 산생(産生)하는 개변형의 NOG 마우스이다.
상기 개변형 NOG 마우스는, 고에끼 자이단 호우징 짓껭 도부쯔 쥬오 겡뀨쇼(公益財團法人實驗動物中央硏究所, 공익재단법인 실험동물중앙연구소)에서 확립되어, Journal of Immunology, 2013, 191:2890-2899에 기재된 복합형 면역부전 마우스이다. 상기 개변형 NOG 마우스는, 정식명 「NOD. Cg-Pkdcscid Il2rgtm1Sug Tg(SV40-CSF2, IL3) 10-7 Jic/Jic」, 간략명 「NOG-GM-CSF/IL-3-Tg」이며, 고에끼 자이단 호우징 짓껭 도부쯔 쥬오 겡뀨쇼에서 입수할 수 있다.
－－－ NOG 마우스 －－－
상기 NOG 마우스란, 고에끼 자이단 호우징 짓껭 도부쯔 쥬오 겡뀨쇼에서 확립되어, Blood, 2002, 100, 3175-3182 및 일본국 특허 제3753321호 공보에 기재된 복합형 면역부전 마우스이다. 상기 NOG 마우스는, 정식명 「NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/Jic」, 간략명 「NOD/Shi-scid, IL-2Rγnull」이며, 고에끼 자이단 호우징 짓껭 도부쯔 쥬오 겡뀨쇼에서 입수할 수 있다.
상기 NOG 마우스는, 면역부전 SCID 마우스를 개량한 NOD/scid 마우스와, 여러 종의 사이토카인 수용체 공통 도메인인 IL-2 수용체 γ쇄 녹아웃(IL2RγKO) 마우스를 교배하여 얻어진 유전자 개변 마우스이며, T 세포, B 세포 및 NK 세포가 결실된 복합형 면역부전 마우스이다.
상기 NOG 마우스는, 종래의 면역부전 마우스와 비교하여 뛰어난 이종 세포 생착성을 갖고 있고, 예를 들면, 인간 조혈간세포를 이입한 경우, 높은 인간 백혈구의 분화를 나타내고, NOD/scid 마우스에서는 보이지 않았던 인간 T 림프구의 분화가 인지된다. 단, 상기 NOG 마우스에 있어서, 골수구계 세포의 분화는 충분하지는 않으며, 특히 과립구의 분화 효율은 극히 낮다.
이것에 대해, 상기 개변형 NOG 마우에서는, 인간 조혈간세포를 이입한(인간화한) 경우, 상기 NOG 마우스와 비교하여 인간 골수구계 세포의 분화 효율이 상승하고, 지금까지 보이지 않았던 인간 과립구의 분화가 인지되는 등 극히 유용한 인간 혈구세포의 분화를 나타낸다. 이러한 지견에 근거하여, 본 발명자들은, 상기 인간화된 개변형 NOG 마우스가 혈액 독성의 평가(특히, 과립구 감소의 평가)에 적합하다는 것을 발견했다.
상기 인간화된 개변형 NOG 마우스는, 상기 개변형 NOG 마우스에 방사선 조사를 행하여 마우스 유래 골수세포를 배제하고, 인간 유래 hCD34＋ 세포를 이식하여 생착시킴으로써 제작할 수 있다.
상기 방사선으로는, 예를 들면, X선, 감마선 등을 들 수 있다.
상기 조사의 방법으로는 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 공지의 방법을 적절히 선택할 수 있다.
조사되는 상기 방사선으로는, 상기 X선의 흡수선량으로 2.0Gy∼3.0Gy가 바람직하다. 상기 방사선 조사의 조사 횟수로는 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있다.
상기 방사선 조사 후, 상기 개변형 NOG 마우스에서 유래하는 골수세포가 배제된 것을 확인해도 된다.
상기 개변형 NOG 마우스에서 유래하는 골수세포가 배제된 것은, 예를 들면, 이하의 방법에 의해 확인할 수 있다.
상기 방사선 조사 후(예를 들면, 직후∼3일 후), 상기 개변형 NOG 마우스를 이소플루란 마취하에서 복대동맥으로부터 탈혈(脫血) 안락사 처치 후, 대퇴골을 채취한다. 대퇴골로부터 이스코브 개변 둘베코 배지(IMDM 배지)를 이용하여 씻어내고, 세포 현탁액을 조제한다. 나일론 필터를 통과시킨 여액을 골수세포액으로서 얻는다. 혈구 자동 분석 장치 등으로 골수세포액 중의 총 백혈구수 등을 계측하고, 표면 항원 마커를 지표로 한 형광 플로우 사이토메트리(FCM) 측정에 의해 얻어지는 비율로부터, 상기 골수세포액 중의 마우스 유래의 골수세포(예를 들면, 마우스 유래 mCD11b＋ 세포 등)의 세포수를 산출한다.
조혈간세포인 상기 인간 유래 hCD34＋ 세포가 상기 개변형 NOG 마우스에 이식되어, 생착하면, 상기 hCD34＋ 세포로부터 분화한 인간 유래 혈구세포(예를 들면, 인간 유래 백혈구 hCD45＋ 세포, 인간 유래 과립구 hCD66b＋ 세포 등)가 혈액 중에 나타난다.
상기 인간 유래 hCD34＋ 세포의 이식 방법으로는 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있다.
이식되는 상기 인간 유래 hCD34＋ 세포로는 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있지만, 인간 제대혈 유래 hCD34＋ 세포인 것이 바람직하다. 상기 인간 제대혈 유래 hCD34＋ 세포로는, 시판품이어도 되고, 건강한 사람의 제대혈로부터 분리한 것이어도 된다.
상기 인간 유래 hCD34＋ 세포의 이식수로는 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있지만, 1×104(cells/body)∼1×106(cells/body)가 바람직하다.
상기 인간 유래 혈구세포의 생착을 확인하는 방법으로는, 예를 들면, 이하의 방법에 의해 행할 수 있다.
상기 인간 유래 hCD34＋ 세포의 이식 후(5주 후∼7주 후)에, 상기 개변형 NOG 마우스의 혈액을 안와정맥총(眼窩靜脈叢)으로부터 채취한다. 혈구 자동 분석 장치 등으로 혈액 중의 총 백혈구수 등을 계측하고, 표면 항원 마커를 지표로 한 형광 플로우 사이토메트리(FCM) 측정에 의해 얻어지는 비율로부터, 상기 혈액 중의 인간 유래 혈구세포(예를 들면, 인간 유래 백혈구 hCD45＋ 세포) 및 마우스 유래 혈구세포(예를 들면, 마우스 유래 백혈구 mCD45＋ 세포)의 세포수를 산출한다.
마우스 유래 백혈구 mCD45＋ 세포 및 인간 유래 백혈구 hCD45＋ 세포의 비율을 산출하고, 혈액 중의 백혈구에 있어서의 인간 유래 백혈구의 함유량이 20개수％ 이상이면, 인간 유래 혈구세포가 생착하여, 상기 개변형 NOG 마우스가 인간화되었다고 판단한다.
또, 상기 인간 유래 혈구세포의 생착의 확인은, 상기 평가 대상 약제의 투여 전에 있어서의, 인간 유래 혈구세포의 세포수의 측정과 동시에 행해도 된다.
한편, 혈액 중의 백혈구에 있어서의 인간 유래 백혈구의 함유량이 20개수％ 미만인 경우에는, 인간 유래 과립구의 출현수가 너무 적어(과립구는 백혈구 중의 5개수％ 정도), 높은 인간화 효율을 갖는 본 발명의 인간화된 개변형 NOG 마우스의 특성으로서 불충분한 점에서, 혈액 독성의 평가에 적합하지 않다.
－ 평가 대상 약제 －
상기 평가 대상 약제로는 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들면, 항암제, 항균약, 항경련약, 항갑상선약 등을 들 수 있다. 이들 중에서도 항암제가 바람직하다. 또, 상기 평가 대상 약제는, 치료약, 피검약 및 의약품 후보가 되는 시험 화합물 중 어느 것이어도 되고, 천연 화합물 및 합성 화합물 중 어느 것이어도 된다.
－－ 항암제 －－
상기 항암제란, 암의 증식을 억제하는 것을 목적으로 한 약제를 의미하고, 예를 들면, 분자 표적약, 살세포형 항암제 등을 들 수 있다.
여기서, 「암」이란, 상피조직 유래의 악성 종양인 암종; 비상피조직 유래의 악성 종양인 육종; 혈액 악성 종양(백혈병 등)을 포함하는 광의의 악성 종양을 의미한다.
－－－ 분자 표적약 －－－
상기 분자 표적약이란, 암 세포에 특이적으로 발현하는 분자(단백질, 유전자 등)를 표적으로서 작용하는 약제이며, 작용 메커니즘의 관점에서, 예를 들면, 암 세포의 증식 인자의 시그널 전달을 저해하는 항암제, 암 세포에 발현하고 있는 암 세포의 증식에 관한 단백질 등의 기능을 저해하는 항암제, 면역 시스템을 통해 암 세포의 증식을 억제하는 항암제 등을 들 수 있다.
상기 분자 표적약으로는, 예를 들면, 저분자 저해약, 항체 의약 등을 들 수 있다.
상기 저분자 저해약으로는, 예를 들면, 티로신 키나아제 저해제, Raf 키나아제 저해제, 프로테아솜 저해제, mTOR 저해제, 칼시뉴린 저해약, 야누스 키나아제 저해약 등을 들 수 있다.
상기 항체 의약으로는, 예를 들면, 항CD20 항체, 항EGFR 항체, 항TNF-α 항체, 항CD30 항체, 항인간 IL-6 수용체 항체, 항HER2 항체, 항VEGF 항체, 항CD33 항체, 항CCR4 항체, 항CD52 항체 등을 들 수 있다.
－－－ 살세포형 항암제 －－－
상기 살세포형 항암제란, DNA 합성이나 세포 분열을 저해함으로써 암 세포를 사멸시키는 항암제를 말한다.
상기 살세포형 항암제로는, 예를 들면, 알킬화제, 대사 길항제, 토포이소머라아제 저해제, 유사분열 저해제, 항종양성 항균제, 백금 착체 유도체 등을 들 수 있다. 이들 중에서도, 토포이소머라아제 저해제 및 백금 착체 유도체가 바람직하다.
상기 알킬화제로는, 예를 들면, 이포스파미드, 시클로포스파미드, 다카르바진, 테모졸로미드, 니무스틴, 부슬판, 프로카르바진, 멜팔란, 라니무스틴 등을 들 수 있다.
상기 대사 길항제로는, 예를 들면, 에노시타빈, 카페시타빈, 카르모푸르, 클라드리빈, 겜시타빈, 시타라빈, 시타라빈옥포스페이트, 테가푸르, 테가푸르·우라실, 테가푸르·기메라실·오테라실칼륨, 독시플루리딘, 넬라라빈, 히드록시카바미드, 플루오로우라실, 플루다라빈, 페메트렉세드, 펜토스타틴, 메르캅토푸린, 메토트렉세이트 등을 들 수 있다.
상기 토포이소머라아제 저해제로는, 예를 들면, 캄프토테신 및 그 유연체, 에토포시드, 테니포시드, 독소루비신, 레보플록사신, 시프로플록사신 등을 들 수 있다. 이들 중에서도 캄프토테신 및 그 유연체가 바람직하다.
상기 캄프토테신 유연체로는, 예를 들면, 이리노테칸(CPT-11), 노기테칸(토포테칸), DB67, BNP1350, 엑사테칸, 루르토테칸, ST1481, CKD602, 7-에틸-10-히드록시캄프토테신(SN-38) 및 이들의 약리학적으로 허용되는 염 등을 들 수 있다.
이들 중에서도, 이리노테칸(CPT-11), 노기테칸(토포테칸), 7-에틸-10-히드록시캄프토테신(SN-38)이 바람직하다.
또, 상기 캄프토테신 유연체는, 상기 캄프토테신 및 캄프토테신 유연체 중 어느 것을 내포하는 복합체의 형태여도 된다.
상기 복합체로는, 예를 들면, 캄프토테신 유연체를 리포솜 내에 봉입한 것, 캄프토테신 유연체와 인지질과의 복합체, 캄프토테신 유연체를 폴리머 미셀 내에 봉입한 것, 캄프토테신 유연체를 친수성 세그먼트와 소수성 세그먼트로 이루어지는 블록 코폴리머에 봉입한 것 등을 들 수 있다.
상기 캄프토테신 유연체를 친수성 세그먼트와 소수성 세그먼트로 이루어지는 블록 코폴리머에 봉입한 것으로는, 예를 들면, 하기 일반식 (I)로 표시되는 캄프토테신 유연체의 고분자 유도체를 들 수 있다.
[화학식 1]
Figure pct00001
상기 일반식 (I) 중, R1은 수소 원자 또는 치환기를 갖고 있어도 되는 (C1∼C6) 알킬기를 나타내고, t는 5∼11,500의 정수를 나타내며, A는 결합기를 나타내고, d, e 및 f는 정수를 나타내며, d＋e＋f는 3∼200의 정수를 나타내고, R2는 수소 원자, 치환기를 갖고 있어도 되는 (C1∼C6) 알킬기 또는 치환기를 갖고 있어도 되는 실릴기를 나타내며, R3는 수소 원자 또는 치환기를 갖고 있어도 되는 (C1∼C6) 알킬기를 나타내고, R4는 치환기를 갖고 있어도 되는 (C1∼C20) 알콕시기, 치환기를 갖고 있어도 되는 (C1∼C20) 알킬아미노기, 치환기를 갖고 있어도 되는 디(C1∼C20) 알킬아미노기 또는 치환기를 갖고 있어도 되는 (C1∼C20) 알킬아미노카르보닐 (C1∼C20) 알킬아미노기를 나타내며, P는 수소 원자, (C1∼C6) 아실기 또는 (C1∼C6) 알콕시카르보닐기를 나타낸다.
상기 유사분열 저해제로는, 예를 들면, 파클리탁셀 및 그 유연체, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신 등을 들 수 있다. 이들 중에서도, 상기 파클리탁셀 및 그 유연체가 바람직하다.
상기 파클리탁셀 및 그 유연체는, 탁산계의 구조를 갖는 화합물이며, 예를 들면, 파클리탁셀(CAS No. 33069-62-4), 7α-글루코실옥시아세틸파클리탁셀, 도세탁셀, 및 이들의 약리학적으로 허용되는 염 등을 들 수 있다.
또, 상기 파클리탁셀 유연체는, 상기 파클리탁셀 및 파클리탁셀 유연체 중 어느 것을 내포하는 복합체의 형태여도 된다.
상기 복합체로는, 예를 들면, 파클리탁셀 유연체를 알부민과 결합시킨 것, 파클리탁셀 유연체를 리포솜 내에 봉입한 것, 파클리탁셀 유연체와 인지질과의 복합체, 파클리탁셀 유연체를 폴리머 미셀 내에 봉입한 것, 파클리탁셀 유연체를 친수성 세그먼트와 소수성 세그먼트로 이루어지는 블록 코폴리머에 봉입한 것 등을 들 수 있다.
상기 파클리탁셀 유연체를 친수성 세그먼트와 소수성 세그먼트로 이루어지는 블록 코폴리머에 봉입한 것으로는, 예를 들면, 파클리탁셀 유연체를 하기 일반식 (II)로 표시되는 블록 코폴리머에 봉입한 것 등을 들 수 있다.
[화학식 2]
Figure pct00002
상기 일반식 (II) 중, R1은 수소 원자 또는 (C1∼C5) 알킬기를 나타내고, R2는 (C1∼C5) 알킬렌기를 나타내며, R3는 메틸렌기 또는 에틸렌기를 나타내고, R4는 수소 원자 또는 (C1∼C4) 아실기를 나타내며, R5는 수산기, 치환기를 갖고 있어도 되는 아릴 (C1∼C8) 알콕시기, 또는 -N(R6)-CO-NHR7을 나타내고, R6 및 R7은 서로 동일해도 달라도 되며, (C3∼C6) 환상 알킬기 또는 3급 아미노기로 치환되어 있어도 되는 (C1∼C5) 알킬기를 나타내고, n, m, x 및 y는 정수를 나타내며, n은 5∼1,000, m은 2∼300, x는 0∼300, y는 0∼300을 나타낸다. 단, x와 y의 합은 1 이상이고 또한 m 보다 크지 않은 것으로 하고, R5가 수산기인 비율이 m의 0％∼88％이며, 치환기를 갖고 있어도 되는 아릴 (C1∼C8) 알콕시기인 비율이 m의 1％∼89％이고, -N(R6)-CO-NHR7인 비율이 m의 11％∼30％이다.
상기 항종양성 항균제로는, 예를 들면, 마이토마이신 C, 블레오마이신, 아드리아마이신, 독소루비신 등을 들 수 있다.
상기 백금 착체 유도체로는, 예를 들면, 시스플라틴, 카르보플라틴, 옥살리플라틴 등을 들 수 있다. 이들 중에서도, 상기 옥살리플라틴이 바람직하다.
본 발명이, 생체내의 혈액 독성 평가 방법인 경우에는, 상기 개변형 NOG 마우스에 상기 평가 대상 약제를 투여하면 되고, 시험관내의 혈액 독성 평가 방법인 경우에는, 상기 개변형 NOG 마우스의 시료에 상기 평가 대상 약제를 투여하면 된다.
상기 시료로는, 상기 개변형 NOG 마우스에서 유래하는 시료이면 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들면, 골수세포, 혈액세포, 비(脾)세포, 간세포 등을 들 수 있다. 이들 중에서도, 골수세포, 혈액세포가 바람직하다.
상기 골수세포는, 예를 들면, 이하의 방법에 의해 조제할 수 있다.
상기 인간화된 개변형 NOG 마우스를, 이소플루란 마취하에서 복대동맥으로부터 탈혈 안락사 처치 후, 대퇴골을 채취한다. 대퇴골로부터 무균적으로 이스코브 개변 둘베코 배지(IMDM 배지)를 이용하여 씻어내고, 세포 현탁액을 조제한다. 나일론 필터(예를 들면, 35㎛ 지름, 셀 스트레이너, BD Biosciences사 제조)를 통과시킨 여액을, 골수세포를 포함하는 시료로서 얻는다.
상기 평가 대상 약제를 투여하는 방법으로는 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 각 약제에 적합한 투여 경로, 투여량, 투여 스케줄 등의 투여 조건을 적절히 선택할 수 있다.
예를 들면, 노기테칸을 평가하는 경우는, 3mg/kg∼30mg/kg(예를 들면, 30mg/kg)의 단회 정맥내 투여가 바람직하고, 파클리탁셀을 평가하는 경우는, 25mg/kg∼100mg/kg(예를 들면, 70mg/kg)의 단회 정맥내 투여가 바람직하며, 옥살리플라틴을 평가하는 경우는, 2.5mg/kg∼20mg/kg(예를 들면, 20mg/kg)의 단회 정맥내 투여가 바람직하다.
또는, 상기 평가 대상 약제를 투여하는 방법으로는, 평가하고자 하는 투여 경로, 투여량, 투여 스케줄 등의 투여 조건을 적절히 선택할 수 있다. 이것에 의해, 각각의 약제에 대해, 적합한(예를 들면, 혈액 독성이 적은, 회복성이 뛰어난 등의) 투여 조건을 평가하여 선정하는 것이 가능해진다.
본 발명이, 시험관내의 혈액 독성 평가 방법인 경우에는, 상기 평가 대상 약제를 투여하는 방법으로는 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 공지의 시험관내 실험의 각종 조건을 선택할 수 있으며, 예를 들면, 상기 평가 대상 약제를 포함하는 배지를 상기 개변형 NOG 마우스의 시료에 투여하면 된다.
＜평가 공정＞
상기 평가 공정은, 상기 평가 대상 약제를 투여한 후의 상기 개변형 NOG 마우스의 시료에 대해, 인간 유래 혈구세포의 세포수를 측정하고, 대조와 비교하여 상기 인간 유래 혈구세포의 세포수가 변화한 경우에, 상기 평가 대상 약제에 혈액 독성이 있다고 평가하는 공정이다.
－ 시료 －
상기 시료로는 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들면, 혈액, 골수세포, 비세포, 간세포 등을 들 수 있다. 이들 중에서도, 혈액이 바람직하다.
상기 혈액으로는 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들면, 정맥혈, 말초혈 등을 들 수 있다. 이들 중에서도, 피험체인 상기 개변형 NOG 마우스에 대한 부담이 낮고, 채취가 용이한 점에서, 말초혈이 바람직하다.
－ 인간 유래 혈구세포 －
상기 인간 유래 혈구세포는 백혈구, 과립구, 적혈구 및 혈소판 중 적어도 어느 하나인 것이 바람직하다.
상기 인간 유래 백혈구로는, 예를 들면, 과립구, 호중구, T 세포, B 세포, 단구, 수상세포 등을 들 수 있다. 이들 중에서도, 종래의 실험 마우스에서는 보이지 않았던 인간 유래 과립구의 분화가 상기 개변형 NOG 마우스에 있어서 처음으로 인지되어, 따라서 평가가 가능해진 점에서, 인간 유래 과립구가 바람직하다.
또, 본 발명이, 시험관내의 혈액 독성 평가 방법인 경우에는, 상기 평가 대상 약제를 투여한 후의 상기 개변형 NOG 마우스 유래의 시료에 대해, 인간 유래 혈구세포의 세포수를 측정하면 된다.
상기 인간 유래 혈구세포의 세포수와, 상기 마우스 유래 혈구세포의 세포수를 측정하는 것이 바람직하다.
상기 측정은, 투여 후의 특정의 시간 경과 후의 측정점 1점에서 행해도 되지만, 소정의 스케줄로 경시(經時)적으로(복수의 측정점에서) 행하는 것이 바람직하다. 다시 말하면, 상기 측정 공정은, 투여 후의 상기 개변형 NOG 마우스의 시료를 경시적으로 채취하고, 상기 시료 중의 인간 유래 혈구세포의 세포수를 경시적으로 측정하는 것이 바람직하다.
상기 경시적인 측정의 스케줄로는 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들면, 투여 후 4일째, 7일째, 14일째, 21일째, 28일째, 35일째 및 42일째의 스케줄 등을 들 수 있다.
상기 시료 중의 인간 유래 혈구세포의 세포수를 측정하는 방법으로는, 예를 들면, 투여 후의 특정 시간 경과 후, 상기 개변형 NOG 마우스의 혈액을 안와정맥총으로부터 채취하고, 혈구 자동 분석 장치 등으로 혈액 중의 총 백혈구수 등을 계측하여, 인간에 특이적인 표면 항원 마커를 지표로 한 형광 플로우 사이토메트리(FCM) 측정에 의해 얻어지는 비율로부터, 상기 혈액 내의 인간 유래 혈구세포의 세포수를 산출함으로써 측정할 수 있다.
상기 마우스 유래 혈구세포의 세포수에 대해서도, 마우스에 특이적인 표면 항원 마커를 이용하여 마찬가지로 측정할 수 있다.
상기 표면 항원 마커로는 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 공지의 혈구세포의 검출에 이용하는 것을 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들면 이하와 같다.
상기 백혈구 전체에 관련된 표면 항원 마커: CD45 등
상기 과립구에 관련된 표면 항원 마커: CD66b, CD16, Gr-1 등
상기 B 세포에 관련된 표면 항원 마커: CD19 등
상기 T 세포에 관련된 표면 항원 마커: CD3 등
백혈구는, 이하의 표면 항원 마커를 지표로 분류하고, 비율을 산출함으로써, 인간 유래 백혈구 및 마우스 유래 백혈구를 구별하여 검출할 수 있다.
·인간 유래 혈구세포: hCD45＋ 세포(인간 백혈구), hCD66b＋ 세포(인간 과립구), hCD66b＋ hCD16＋ 세포(인간 호중구), hCD19＋ 세포(인간 B 세포)
·마우스 유래 혈구세포: mCD45＋ 세포(마우스 백혈구), mGr-1＋ 세포(마우스 과립구)
또, 혈구 자동 분석 장치(예를 들면, XT-2000iV, 시스멕쿠스 가부시키가이샤) 등으로 혈액 중의 총 백혈구수를 계수하고, 형광 플로우 사이토메트리(FCM)에 의해 얻어지는 비율로부터 각 혈구세포의 세포수를 산출한다.
상기 형광 플로우 사이토메트리(FCM) 측정으로는 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 공지의 장치를 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들면, LSRII(BD Bioscience) 등의 FACS(fluorescence activated cell sorting) 장치 등을 들 수 있다.
적혈구는, 이하의 표면 항원 마커를 지표로 분류하고, 비율을 산출함으로써, 인간 유래 적혈구 및 마우스 유래 적혈구를 구별하여 검출할 수 있다.
·인간 유래 혈구세포: hCD235a＋ 세포(인간 적혈구)
·마우스 유래 혈구세포: mTER119＋ 세포(마우스 적혈구)
혈소판은, 이하의 표면 항원 마커를 지표로 분류하고, 비율을 산출함으로써, 인간 유래 혈소판 및 마우스 유래 혈소판을 구별하여 검출할 수 있다.
·인간 유래 혈소판: hCD41a＋ 세포(인간 혈소판)
·마우스 유래 혈소판: mCD41＋ 세포(마우스 혈소판)
－ 대조 －
상기 대조란, 상기 평가 대상 약제 대신에, 약제에 이용한 용매만을 투여한 것 이외에는, 상기 개변형 NOG 마우스와 마찬가지로 처리한 대조 마우스이다.
또, 시험관내의 혈액 독성 평가 방법의 경우, 상기 대조란, 상기 약제 대신에, 약제에 이용한 용매만을 투여한 것 이외에는, 상기 개변형 NOG 마우스의 시료와 마찬가지로 처리한 대조 시료이다.
상기 용매로는, 상기 평가 대상 약제를 용해할 수 있으며, 의약적으로 허용되는 것이면 특별히 제한은 없고, 사용하는 상기 평가 대상 약제에 따라 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들면, 생리식염액, 5w/v％ 글루코오스 용액, 5v/v％ 에탄올/5v/v％ 크레모포 함유 생리식염액 등을 들 수 있다.
－ 혈액 독성의 평가 －
상기 평가 대상 약제에 혈액 독성이 있다라는 평가는, 백혈구 감소, 과립구 감소, 적혈구 감소, 혈소판 감소, 백혈구 증가 및 범혈구 감소 중 적어도 어느 하나에 근거하여 행해지는 것이 바람직하다.
상기 변화란, 대조에 대하여, 통계적으로 유의(有意)하게(예를 들면, student's t-test, p＜0.05) 증가 또는 감소하는 것이다.
상기 변화의 정도로는 특별히 제한은 없고, 목적으로 하는 약제, 혈액 독성, 투여 조건 등에 따라 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들면, 10％ 이상, 20％ 이상, 30％ 이상, 40％ 이상, 50％ 이상, 60％ 이상, 70％ 이상, 80％ 이상, 90％ 이상 등을 들 수 있다.
또, 혈액 독성의 유무(정성적인 평가)에 더하여, 복수의 측정점(예를 들면, 투여 후의 경과일, 약제, 투여량 등이 다른 측정점)에 있어서의 변화의 정도를 비교함으로써, 혈액 독성의 강약의 비교 등의 정량적인 평가를 행할 수 있다.
－－ 백혈구 감소 －－
상기 대조와 비교하여, 상기 백혈구의 세포수가 통계적으로 유의하게(예를 들면, student's t-test, p＜0.05) 감소한 경우에, 상기 평가 대상 약제에 혈액 독성이 있다고 평가한다.
－－ 과립구 감소 －－
상기 대조와 비교하여, 상기 과립구의 세포수가 통계적으로 유의하게(예를 들면, student's t-test, p＜0.05) 감소한 경우에, 상기 평가 대상 약제에 혈액 독성이 있다고 평가한다.
종래의 실험 마우스에서는 보이지 않았던 인간 유래 과립구의 분화가 상기 개변형 NOG 마우스에 있어서 처음으로 인지되어, 따라서 평가가 가능해진 점에서, 인간 유래 혈구세포가 인간 유래 과립구이고, 또한 혈액 독성이 과립구 감소인 것이 바람직하다.
－－ 적혈구 감소 －－
상기 대조와 비교하여, 상기 적혈구의 세포수가 통계적으로 유의하게(예를 들면, student's t-test, p＜0.05) 감소한 경우에, 상기 평가 대상 약제에 혈액 독성이 있다고 평가한다.
－－ 혈소판 감소 －－
상기 대조와 비교하여, 상기 혈소판의 세포수가 통계적으로 유의하게(예를 들면, student's t-test, p＜0.05) 감소한 경우에, 상기 평가 대상 약제에 혈액 독성이 있다고 평가한다.
－－ 백혈구 증가 －－
상기 대조와 비교하여, 상기 백혈구의 세포수가, 통계적으로 유의하게(예를 들면, student's t-test, p＜0.05) 증가한 경우에, 상기 평가 대상 약제에 혈액 독성이 있다고 평가한다.
상기 백혈구 증가는, 백혈구 이상 증식 등의 골수 이상 증식과 밀접하게 관련된다.
－－ 범혈구 감소 －－
상기 대조와 비교하여, 상기 백혈구, 상기 적혈구 및 상기 혈소판의 세포수가 각각 통계적으로 유의하게(예를 들면, student's t-test, p＜0.05) 감소한 경우에, 상기 평가 대상 약제에 혈액 독성이 있다고 평가한다.
또, 인간 유래 혈구세포의 평가를 행하는 상기 평가 공정에 더하여, 마우스 유래 혈구세포의 평가를 행하는 것이 바람직하다. 즉, 대조와 비교하여 상기 마우스 유래 혈구세포의 세포수가 변화한 경우에, 상기 평가 대상 약제에 혈액 독성이 있다고 평가하는 공정을 추가로 포함하는 것이 바람직하다.
＜기타 공정＞
상기 기타 공정으로는, 예를 들면, 회복성 평가 공정, 종차 평가 공정 등을 들 수 있다.
＜＜회복성 평가 공정＞＞
본 발명의 평가 대상 약제의 혈액 독성 평가 방법은, 회복성 평가 공정을 추가로 포함하는 것이 바람직하다.
상기 회복성 평가 공정은, 상기 대조와 비교하여 상기 인간 유래 혈구세포의 세포수가 변화한 후에, 상기 평가 대상 약제의 투여 전의 세포수로 회복하는 기간을 측정하고, 상기 기간에 근거하여 회복성을 평가하는 공정이다.
이것에 의해, 혈액 독성으로부터의 회복 정도도 예측할 수 있고, 인간의 임상에 있어서의 약제의 용량 반응성이나 약제의 적절한 투여 간격을 추정할 수 있으므로, 항암제가 투여되는 인간의 신체적 부담을 감소시키는 것 외에, 투여 계획의 입안이 용이하다.
여기에서, 「투여 전의 세포수로 회복하는」이란, 투여 전의 인간 유래 혈구세포의 세포수에 대한 변화의 정도가, 통계적으로 유의(예를 들면, student's t-test, p＜0.05)하지 않은 것을 의미한다.
＜＜종차 평가 공정＞＞
본 발명의 평가 대상 약제의 혈액 독성 평가 방법은, 종차 평가 공정을 추가로 포함하는 것이 바람직하다.
상기 종차 평가 공정은, 상기 인간 유래 혈구세포의 평가 결과와 상기 마우스 유래 혈구세포의 평가 결과에 근거하여, 혈액 독성의 종차를 평가하는 공정이다.
이것에 의해, 혈액 독성의 종차를 평가할 수 있으므로, 상기 개변형 NOG 마우스와는 다른 마우스를 이용한 기존의 혈액 독성 평가 결과에서는 얻을 수 없는 인간의 평가 결과를 추측할 수 있다.
상기 「종차」가 있다란, 동일한 측정점에서, 대조에 대한 상기 인간 유래 혈구세포의 변화의 정도와 대조에 대한 상기 마우스 유래 혈구세포의 변화의 정도가, 통계적으로 유의하게(예를 들면, student's t-test, p＜0.05) 상위한 것이다.
상기 변화의 정도로는 특별히 제한은 없고, 목적으로 하는 약제, 혈액 독성, 투여 조건 등에 따라 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들면, 10％ 이상, 20％ 이상, 30％ 이상, 40％ 이상, 50％ 이상, 60％ 이상, 70％ 이상, 80％ 이상, 90％ 이상 등을 들 수 있다.
또, 혈액 독성의 유무(정성적인 평가)에 더하여, 복수의 측정점(예를 들면, 투여 후의 경과일, 약제, 투여량 등이 다른 측정점)에 있어서의 변화의 정도를 비교함으로써, 정량적인 평가를 행할 수 있다.
본 발명의 평가 대상 약제의 혈액 독성 평가 방법에 의하면, 인간의 골수 독성의 임상 예견성이 뛰어난 혈액 독성 평가 방법을 제공할 수 있다. 특히, 인간의 과립구 감소증의 임상 예견성이 뛰어난 평가 대상 약제의 혈액 독성 평가 방법을 제공할 수 있다. 본 발명의 평가 대상 약제의 혈액 독성 평가 방법에 의하면, 설치류로 혈액 독성 평가를 행할 수 있기 때문에, 유인원을 이용하는 평가 실험을 대폭 감소시킬 수 있다. 또, 시험관내의 평가계에서는 불가능한, 체내에서 대사를 받고서 비로서 효과를 발현하는 항암제 등의 약제의 혈액 독성 평가를 행할 수 있다. 또, 인간의 임상 예견성이 뛰어난 본 발명을 이용함으로써, 인간에의 약제의 투여량의 설정으로 행할 수 있고, 혈액 독성의 발생을 억제하는 투여 조건을 선정할 수 있다. 본 발명은, 약제의 투여 조건(투여 경로, 투여량, 투여 스케줄 등)의 검증이나, 경시적인 변동 프로파일의 분석을 행할 수 있기 때문에, 인간의 임상에 있어서의 약제의 용량 반응성이나 약제의 적절한 투여 간격을 추정할 수 있다. 또, 혈액 독성으로부터의 회복의 정도도 예측할 수 있다. 이 때문에, 약제가 투여되는 인간의 신체적 부담을 감소시키는 것 외에, 투여 계획의 입안이 용이하다.
실시예
이하, 실시예에 근거하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이하의 실시예에 제한되는 것은 아니다.
실시예에서 이용한 마우스 등의 상세는 이하와 같다.
(마우스)
「Tg-NOG 마우스」: 고에끼 자이단 호우징 짓껭 도부쯔 쥬오 겡뀨쇼 제작
·성별: 자웅
·구입 시의 주령: 10주령∼18주령
·X선 조사 시의 주령: 6주령∼10주령
·인간 제대혈 유래 CD34＋ 세포 이식 시의 주령: 6주령∼10주령
·「살세포형 항암제」 투여 개시 시의 주령: 10주령∼18주령
(기기)
·X선 조사 장치: MBR-1505R(가부시키가이샤 히타치메디코 제조)
·FACS: LSRII(BD Biosciences사 제조)
·혈구 분석 장치: XT-2000iV(시스멕쿠스 가부시키가이샤 제조)
(시약)
·노기테칸: Topotecan(시그마 알드리치 재팬 제조), 생리식염액에 농도 3mg/mL로 용해했다.
·파클리탁셀(PTX): INDENA(등록상표) S.p.A사 제조, 무수 에탄올 및 크레모포 EL의 등량 혼합액에 35mg/mL로 용해했다. 투여 직전에 생리식염액으로 10배 희석했다.
·옥살리플라틴: 옥살리플라틴(NK), 니폰 가야쿠 가부시키가이샤 제조, 5w/v％ 글루코오스 수용액으로 2mg/mL, 3mg/mL 및 4mg/mL로 희석했다.
·7-에틸-10-히드록시캄프토테신(EHC): 도쿄 가세이 가부시키가이샤 제조
·항hCD45 항체, 항hCD66b 항체, 항hCD16 항체, 항hCD19 항체, 항hCD3 항체, 항mCD45 항체, 항mGr-1 항체: BioLegend 제조
·5w/v％ 글루코오스 수용액: 일본약국방 포도당 주사액(오츠카 당액 5％), 가부시키가이샤 오츠카 세이야쿠 고죠 제조
(세포)
·인간 제대혈 유래 CD34＋ 세포: 동결 인간 제대혈 유래 CD34＋ 세포(단일 도너), 1×106cells/vial, AllCells, LLC에서 구입
실시예 1 노기테칸의 혈액 독성 평가
17주령의 Tg-NOG 마우스(수컷 16마리, 암컷 2마리)에 2.5Gy의 X선을 조사한 후, 인간 제대혈 유래 CD34＋ 세포를 40,000cells/body 이식했다. 이식 후 7주째에 이소플루란 마취하에서 안와정맥총으로부터 말초혈을 채취하고, 말초혈 중의 생착을 확인했다. 결과를 표 1에 나타낸다.
[표 1]
Figure pct00003
평가에 적합한 마우스 12마리를 선택하고, 1군 6마리로서, 2군으로 나누어, 한쪽에 5w/v％ 글루코오스 용액을, 다른 쪽에 노기테칸 30mg/kg(3mg/mL, 10mL/kg)을 미정맥으로부터 단회 정맥내 투여했다. 동물의 할당은, 인간 백혈구수 및 인간 과립구수의 평균치가 거의 균일해지도록 군 분류를 행하였다.
투여일, 투여 후 3일째, 5일째, 7일째, 10일째, 14일째, 21일째 및 28일째에 이소플루란 마취하에서 안와정맥총으로부터 말초혈을 채취하고, 말초혈 중의 백혈구(WBC)수를 FACS로 계측했다. 도 1∼도 4에 결과를 나타낸다.
도 1은 노기테칸의 혈액 독성 평가에 있어서의, 인간 유래 백혈구(hCD45＋)수의 추이를 나타내는 그래프이다. 도 2는 노기테칸의 혈액 독성 평가에 있어서의, 마우스 유래 백혈구(mCD45＋)수의 추이를 나타내는 그래프이다. 도 3은 노기테칸의 혈액 독성 평가에 있어서의, 인간 유래 과립구(hCD66b＋)수의 추이를 나타내는 그래프이다. 도 4는 노기테칸의 혈액 독성 평가에 있어서의, 마우스 유래 과립구(mGr-1＋)수의 추이를 나타내는 그래프이다. 도 1∼도 4에 있어서, ―○―는 컨트롤군(5w/v％ 글루코오스 투여군), ―●―는 노기테칸 30mg/kg 군을 나타낸다.
Tg-NOG 마우스에 있어서, 마우스 유래 백혈구(mCD45＋) 및 마우스 유래 과립구(mGr-1＋) 수가 노기테칸의 투여 후 3일째∼ 5일째에 최저치를 나타냈지만, 7일째에는 회복으로 바뀌었다. 감소의 정도는 투여 전 값의 약 50％ 정도였다.
Tg-NOG 마우스에 있어서, 인간 유래 과립구(hCD66b＋)는 노기테칸의 투여 후 7일째∼10일째에 걸쳐 현저히 줄고, 과립구수는 투여 후 28일째에도 회복 경향은 보이지 않았다. 이것으로부터, 인간에서는 노기테칸 30mg/kg은 과립구 감소증을 일으킬 가능성이 높은 것을 알 수 있다.
인간 및 마우스 백혈구의 변동을 분별 측정함으로써, 노기테칸 투여 후의 백혈구 감소에 미치는 영향은 마우스보다 인간에서 강하게 발현하는 것이 나타나고, 혈액 독성의 종차를 확인하는 것이 가능한 것을 알 수 있다.
실시예 2-1 PTX의 혈액 독성 평가
9주령의 Tg-NOG 마우스(암컷 35마리)에 2.5Gy의 X선을 조사하고, 3시간∼5시간 후에, 인간 제대혈 유래 CD34＋ 세포를 40,000cells/body 이식했다. 이식 후 5주째에 이소플루란 마취하에서 안와정맥총으로부터 말초혈을 채취하고, 말초혈 중의 생착을 확인했다. 결과를 표 2에 나타낸다.
[표 2]
Figure pct00004
평가에 적합한 마우스 9마리를 선택하고, 컨트롤군 5마리, PTX 투여군 4마리로 나누어, 컨트롤군에 PTX의 용매 용액(5v/v％ 에탄올/5v/v％ 크레모포 함유 생리식염액)을, PTX 투여군에 PTX 70mg/kg(3.5mg/mL, 20mL/kg)을, 미정맥내로부터 단회 정맥내 투여했다. 동물의 할당은, 인간 백혈구수 및 인간 과립구수의 평균치가 거의 균일해지도록 군 분류를 행하였다.
투여 후 4일째, 7일째, 14일째, 21일째, 28일째, 35일째 및 42일째에 이소플루란 마취하에서 안와정맥총으로부터 말초혈을 채취하고, 말초혈 중의 백혈구수를 FACS로 계측했다. 도 5∼도 10에 결과를 나타낸다.
도 5는 파클리탁셀의 혈액 독성 평가에 있어서의, 인간 유래 백혈구(hCD45＋)의 추이를 나타내는 그래프이다. 도 6은 파클리탁셀의 혈액 독성 평가에 있어서의, 마우스 유래 백혈구(mCD45＋)수의 추이를 나타내는 그래프이다. 도 7은 파클리탁셀의 혈액 독성 평가에 있어서의, 인간 유래 과립구(hCD66b＋)의 추이를 나타내는 그래프이다. 도 8은 파클리탁셀의 혈액 독성 평가에 있어서의, 마우스 유래 과립구(mGr-1＋)수의 추이를 나타내는 그래프이다. 도 5∼도 8에 있어서 □는 컨트롤군(5v/v％ 에탄올/5v/v％ 크레모포 함유 생리식염액 투여군), ■는 파클리탁셀 70mg/kg 군을 나타낸다.
도 9는 파클리탁셀의 혈액 독성 평가에 있어서의, 컨트롤군의 인간 유래 백혈구(hCD45＋)수 및 마우스 유래 백혈구(mCD45＋)수의 비율의 추이를 나타내는 그래프이다. 도 10은 파클리탁셀의 혈액 독성 평가에 있어서의, 파클리탁셀 투여군의 인간 유래 백혈구(hCD45＋)수 및 마우스 유래 백혈구(mCD45＋)수의 비율의 추이를 나타내는 그래프이다. 도 9∼도 10에 있어서 □는 마우스 유래 백혈구(mCD45＋)수, ■는 인간 유래 백혈구(hCD45＋)수를 나타낸다.
Tg-NOG 마우스에 있어서, 마우스 유래 과립구(mGr-1＋)는 PTX 투여 후 4일째에 감소를 나타내고, 투여 후 7일째에서는 회복성을 나타냈다. 인간 유래 과립구(hCD66b＋) 및 인간 유래 백혈구(hCD45＋)는, PTX의 투여 후 21일째에 걸쳐 감소하고, 인간 유래 과립구(hCD66b＋)수는, 투여 후 4일째∼21일째에서 낮은 값을 나타내며, 투여 후 28일째에 증가로 바뀌어 회복성을 나타냈다. 이것으로부터, 인간에서는 PTX 70mg/kg은 과립구 감소증을 일으킬 가능성이 높은 것을 알 수 있다. 또, PTX 투여 후의 인간 및 마우스의 백혈구 변동의 분별 측정한 결과로부터는 어느 쪽도 감소를 나타내어, 반응성에 큰 종차가 없는 것을 알 수 있다. 감소로부터 회복의 기간의 추이에서는, 마우스는 투여 후부터 7일의 기간이었던 것에 비해, 인간은 투여 후부터 28일의 기간을 나타내어, 회복 기간에 종차가 있는 것을 알 수 있다. 이것으로부터, 본 모델을 이용함으로써, 인간 백혈구에의 감소 정도의 추측과 동시에 회복 기간의 추측도 가능한 것을 알 수 있다. 회복 기간의 추측으로부터, 인간에 있어서의 투여 간격의 설정도 가능하다.
실시예 2-2 옥살리플라틴의 혈액 독성 평가
6주령의 Tg-NOG 마우스(암컷 24마리)에 2.5Gy의 X선을 조사하고, 3시간∼4시간 후에, 인간 제대혈 유래 CD34＋ 세포를 40,000cells/body 이식했다. 이식 후 5주째에 이소플루란 마취하에서 안와정맥총으로부터 말초혈을 채취하고, 말초혈 중의 생착을 확인했다. 결과를 표 3에 나타낸다.
[표 3]
Figure pct00005
평가에 적합한 마우스 11마리를 선택하고, 컨트롤군 5마리, 옥살리플라틴 투여군 6마리로 나누었다. 컨트롤군에는 5w/v％ 글루코오스 용액을, 옥살리플라틴 투여군은 6마리의 각 2마리에 각각 20mg/kg(2mg/mL, 10mL/kg), 30mg/kg(3mg/mL, 10mL/kg) 및 40mg/kg(4mg/mL, 10mL/kg)을 미정맥으로부터 단회 정맥내 투여했다. 동물의 할당은, 인간 백혈구수 및 인간 과립구 수의 평균치가 거의 균일해지도록 군 분류를 행하였다.
투여 후 4일째, 7일째, 14일째, 17일째, 21일째 및 28일째에 이소플루란 마취하에서 안와정맥총으로부터 말초혈을 채취하고, 말초혈 중의 백혈구수를 FACS로 계측했다. 30mg/kg 투여 동물 및 40mg/kg 투여 동물은 투여 후 7일째까지 사망했기 때문에, 20mg/kg 투여군의 결과를 도 11∼도 14에 결과를 나타낸다.
도 11은 옥살리플라틴의 혈액 독성 평가에 있어서의, 인간 유래 백혈구(hCD45＋)의 추이를 나타내는 그래프이다. 도 12는 옥살리플라틴의 혈액 독성 평가에 있어서의, 마우스 유래 백혈구(mCD45＋)수의 추이를 나타내는 그래프이다. 도 13은 옥살리플라틴의 혈액 독성 평가에 있어서의, 인간 유래 과립구(hCD66＋)의 추이를 나타내는 그래프이다. 도 14는 옥살리플라틴의 혈액 독성 평가에 있어서의, 마우스 유래 과립구(mGr-1＋)의 추이를 나타내는 그래프이다. 도 11∼도 14에 있어서, －○－는 컨트롤군(5w/v％ 글루코오스 투여군), －●－는 옥살리플라틴 20mg/kg 군을 나타낸다.
Tg-NOG 마우스에 있어서, 마우스 유래 백혈구(mCD45＋) 및 마우스 유래 과립구(mGr-1＋)는 옥살리플라틴 투여 후에 현저한 감소를 나타내고, 회복 경향을 나타내지 않고, 투여 후 17일째에는 빈사 상태가 되었다.
Tg-NOG 마우스에 있어서, 인간 유래 과립구(hCD66＋)는 옥살리플라틴의 투여 후 4일째에 경도한 감소를 나타내고, 7일째 이후는 완만한 회복 경향을 나타냈다. 이것으로부터, 인간에서는 마우스에 대하여 현저한 과립구 감소를 나타내는 투여량에 있어서도 과립구 감소증을 일으킬 가능성은 낮은 것을 알 수 있다.
인간 및 마우스 백혈구의 변동을 분별 측정함으로써, 옥살리플라틴 투여 후의 백혈구 감소에 미치는 영향은 인간보다 마우스에서 강하게 발현하는 것이 나타나고, 혈액 독성 평가에 있어서 노기테칸과는 다른 종차를 확인하는 것도 가능한 것을 알 수 있다.
실시예 3-1 콜로니 형성 시험에 의한 과립구계 골수 조혈 전구세포에 대한 EHC 및 PTX의 영향
인간 제대혈 유래 hCD34＋ 세포 이식 후 14주째의 마우스를 이소플루란 마취하에서 복대동맥으로부터 탈혈 안락사 처치 후, 대퇴골을 채취했다. 대퇴골로부터 무균적으로 이스코브 개변 둘베코 배지(IMDM, Life Technologies사 제조)를 이용하여 씻어내고, 세포 현탁액을 조제했다. 나일론 필터(35㎛ 지름, 셀 스트레이너, BD Biosciences사 제조)를 통과시킨 여액을 골수세포액으로 했다. 골수세포액의 일부로 FACS 해석을 행하고, 인간 유래 백혈구(hCD45＋) 및 마우스 유래 백혈구(mCD45＋)의 세포수의 비율을 산출했다.
인간 CD45＋ 세포를 5×104 세포/1.1mL/디시(dish)가 되도록 메틸셀룰로오스 배지(MethoCult H4534, Stem cell technologies사 제조)에 현탁하고, EHC를 0.14nM, 0.4nM, 1.2nM, 3.7nM, 11nM, 33nM으로, PTX를 0.12nM, 0.4nM, 1.1nM, 3.3nM, 10nM, 30nM, 90nM으로 각각 첨가한 후, 디시에 파종하여, 37℃, 5％ CO2에서 16일간 배양했다.
마우스 CD45＋ 세포를 2×104 세포/1.1mL/디시가 되도록 메틸셀룰로오스 배지(MethoCult GF M3534, Stem cell technologies사 제조)에 현탁하고, EHC를 1.2nM, 3.7nM, 11nM, 33nM, 100nM, 300nM으로, PTX를 0.12nM, 0.4nM, 1.1nM, 3.3nM, 10nM, 30nM, 90nM으로 각각 첨가한 후, 디시에 파종하여, 37℃, 5％ CO2에서 8일간 배양했다.
용매 대조에는, 디메틸술폭시드(DMSO, 최종 농도 0.002v/v％)를 이용했다. 각 농도 2 디시로 행하였다.
배양 기간 종료 후에 과립구계 유래의 콜로니 형성수를 계수하고, 각 농도의 콜로니수의 평균치를 산출했다. 용매 대조의 평균 콜로니수를 100％로 한 상대치로서 표시하고, 50％ 및 90％의 콜로니 형성 억제율을 나타내는 농도(IC50값, IC90값)를 산출했다. 결과를 표 4에 나타낸다.
[표 4]
Figure pct00006
EHC의 골수 중 과립구계 전구세포에 대한 영향은, 마우스에 비해 인간에서 높은 것을 알 수 있었다. 이 결과는, 말초혈의 해석 결과에서 마우스 백혈구가 일과성의 감소 후에 회복을 나타낸 것에 비해, 인간 백혈구는 감소로부터의 회복성이 보이지 않고, 반응성에 큰 차이가 인지된 것과 일치한다. PTX의 골수 중 과립구 전구세포에 대한 영향은, 인간과 마우스에서 거의 동일한 정도이며, 말초혈의 해석 결과에서 인간과 마우스의 백혈구 감소가 거의 동일한 정도였던 것과 일치한다.
실시예 3-2 콜로니 형성 시험에 의한 과립구계 골수 전구세포에 대한 노기테칸 및 옥살리플라틴의 영향
골수세포의 채취 조제, 배양 및 콜로니 형성 억제율의 산출은, 실시예 3-1에 기재한 것과 마찬가지로 실시했다.
인간 CD45＋ 세포에 대한 노기테칸의 폭로(曝露) 농도는 0.41nM, 1.2nM, 3.7nM, 11.1nM, 33.3nM, 100nM으로, 옥살리플라틴의 폭로 농도는 123nM, 370nM, 1,111nM, 3,333nM, 10,000nM, 30,000nM으로 행하였다.
마우스 CD45＋ 세포에 대한 노기테칸의 폭로 농도는 3.7nM, 11.1nM, 33.3nM, 100nM, 300nM, 900nM으로, 옥살리플라틴의 폭로 농도는 13.7nM, 41.2nM, 123nM, 370nM, 1,111nM으로 행하였다.
용매 대조에는, 노기테칸에서는 생리식염액을, 옥살리플라틴에서는 증류수를 이용했다.
용매 대조의 평균 콜로니수를 100％로 한 상대치로서 나타내고, 50％ 및 90％의 콜로니 형성 억제율을 나타내는 농도(IC50값, IC90값)를 산출했다. 결과를 표 5에 나타낸다.
[표 5]
Figure pct00007
노기테칸의 골수 중 과립구 전구세포에 대한 영향은, EHC와 마찬가지로 마우스에 비해 인간에서 높은 것으로 나타났다. 이 결과는, 노기테칸 투여 후의 Tg-NOG 마우스의 말초혈 중의 인간 백혈구가 저명한 감소로부터의 회복이 보이지 않고, 마우스 백혈구의 변동 추이와 큰 차이가 인지된 것과 일치한다.
옥살리플라틴의 골수 중 과립구 전구세포에 대한 영향은, 노기테칸 및 EHC와는 반대로 인간에 비해 마우스에서 높은 것으로 나타났다. 이 결과는, 옥살리플라틴 투여 후의 Tg-NOG 마우스의 말초혈 중의 인간 백혈구가 저명한 감소를 나타내지 않았던 것에 대해, 마우스 백혈구는 저명한 감소를 나타내어, 반응성에 큰 차이가 인지된 것과 일치한다.
이러한 것들로부터, Tg-NOG 마우스의 말초혈 중의 인간 및 마우스의 백혈구 획분(劃分)의 변동 추이는, 골수 중의 인간 및 마우스 조혈 전구세포에 대한 영향을 반영하고 있고, 항암제 투여 시의 골수 독성에 기인하여 발생하는 혈액 독성을 평가하는 모델로서, 또, 투여 계획의 입안에 유용한 것을 나타내고 있다.
또, Tg-NOG 마우스는, 마우스 체내에서 분화 유지되는 인간 유래 백혈구와 마우스 유래 백혈구에 대한 약제 응답성을 동시에 해석함으로써, 혈액 독성의 반응성이나 회복성 그리고 감수성의 종차에 대해 평가할 수 있는 모델인 것으로 나타났다.
따라서, 인간화된 개변형 NOG 마우스를 이용함으로써, 마우스 유래의 혈구세포에 대한 것과는 다른, 인간 유래의 혈구세포에 대한 혈액 독성의 반응성이나 회복성이, 특정의 평가 대상 약제에 한정되는 일 없이 적절히 평가할 수 있는 것을 알 수 있었다. 본 발명에 의하면, 골수 독성의 인간의 임상 예견성이 뛰어난, 평가 대상 약제의 혈액 독성 평가 방법 및 평가 대상 약제의 혈액 독성 평가용 모델을 제공할 수 있다.

Claims (12)

  1. NOG 마우스에 인간 GM-CSF/IL-3 유전자가 도입되어, 혈액 중의 백혈구에 있어서의 인간 유래 백혈구의 함유량이 20개수％ 이상인, 인간화된 개변형 NOG 마우스에 대하여 평가 대상 약제를 투여하는 공정과,
    상기 평가 대상 약제를 투여한 후의 상기 개변형 NOG 마우스의 시료에 대해, 인간 유래 혈구세포의 세포수를 측정하고, 상기 평가 대상 약제 대신에 용매를 투여한 대조와 비교하여 상기 인간 유래 혈구세포의 세포수가 변화한 경우에, 상기 평가 대상 약제에 혈액 독성이 있다고 평가하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 평가 대상 약제의 혈액 독성 평가 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 인간화된 개변형 NOG 마우스가, 개변형 NOG 마우스에 방사선 조사를 행하여 마우스 유래 골수세포를 배제하고, 인간 유래 hCD34＋ 세포를 이식하여 생착시킴으로써 제작되는 평가 대상 약제의 혈액 독성 평가 방법.
  3. 제 1 항 내지 제 2 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 평가 대상 약제가, 상기 인간화된 개변형 NOG 마우스의 시료에 대하여 투여되는 평가 대상 약제의 혈액 독성 평가 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 인간 유래 혈구세포가 백혈구, 과립구, 적혈구 및 혈소판 중 적어도 어느 하나이고,
    상기 평가 대상 약제에 혈액 독성이 있다라는 평가가 백혈구 감소, 과립구 감소, 적혈구 감소, 혈소판 감소, 백혈구 증가 및 범혈구 감소 중 적어도 어느 하나에 근거하여 행해지는 평가 대상 약제의 혈액 독성 평가 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 인간 유래 혈구세포가 인간 유래 과립구이고, 또한 상기 평가 대상 약제에 혈액 독성이 있다라는 평가가 과립구 감소에 근거하여 행해지는 평가 대상 약제의 혈액 독성 평가 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 평가 대상 약제가 항암제인 평가 대상 약제의 혈액 독성 평가 방법.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 항암제가 살(殺)세포형 항암제인 평가 대상 약제의 혈액 독성 평가 방법.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 살세포형 항암제가, 캄프토테신(camptothecin) 유연체(類緣體), 캄프토테신 유연체를 내포하는 복합체, 파클리탁셀(paclitaxel) 유연체, 파클리탁셀을 내포하는 복합체 및 백금 착체 유도체 중 적어도 어느 하나인 평가 대상 약제의 혈액 독성 평가 방법.
  9. 제 7 항에 있어서,
    상기 살세포형 항암제가, 이리노테칸(irinotecan), 노기테칸(nogitecan), 7-에틸-10-히드록시캄프토테신, 파클리탁셀 및 옥살리플라틴(oxaliplatin) 중 적어도 어느 하나인 평가 대상 약제의 혈액 독성 평가 방법.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 대조와 비교하여 상기 인간 유래 혈구세포의 세포수가 변화한 후에, 상기 평가 대상 약제의 투여 전의 세포수로 회복하는 기간을 측정하고, 상기 기간에 근거하여 회복성을 평가하는 공정을 추가로 포함하는 평가 대상 약제의 혈액 독성 평가 방법.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 인간 유래 혈구세포의 세포수와, 상기 마우스 유래 혈구세포의 세포수를 측정하고, 상기 평가 대상 약제 대신에 상기 용매를 투여한 상기 대조와 비교하여 상기 마우스 유래 혈구세포의 세포수가 변화한 경우에, 상기 평가 대상 약제에 혈액 독성이 있다고 평가하는 공정과,
    상기 인간 유래 혈구세포의 평가 결과와 상기 마우스 유래 혈구세포의 평가 결과에 근거하여, 상기 평가 대상 약제의 혈액 독성의 종차를 평가하는 공정을 추가로 포함하는 평가 대상 약제의 혈액 독성 평가 방법.
  12. NOG 마우스에 인간 GM-CSF/IL-3 유전자가 도입되어, 혈액 중의 백혈구에 있어서의 인간 유래 백혈구의 함유량이 20개수％ 이상인, 인간화된 개변형 NOG 마우스로 이루어지는 것을 특징으로 하는 평가 대상 약제의 혈액 독성 평가용 모델.
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