ES2691794T3 - Anticuerpo anti-FOLR1 - Google Patents

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ES2691794T3 ES13860315.4T ES13860315T ES2691794T3 ES 2691794 T3 ES2691794 T3 ES 2691794T3 ES 13860315 T ES13860315 T ES 13860315T ES 2691794 T3 ES2691794 T3 ES 2691794T3
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Hiroshi Ando
Mariko Nakano
Naoya Kameyama
Tsuguo Kubota
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Kyowa Hakko Kirin Co Ltd
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Abstract

Anticuerpo monoclonal o fragmento de anticuerpo del mismo que compite con un anticuerpo seleccionado de entre los (a) a (c) siguientes para reconocer específicamente el FOLR1 humano y que se une a un epítopo idéntico al epítopo sobre el FOLR1 humano al que se une el anticuerpo que se encuentra en las posiciones 55 a 62 en la secuencia de aminoácidos de FOLR1 humano representada por la SEC ID nº 1 y que muestra asimismo una actividad antitumoral: (a) un anticuerpo en el que las regiones determinantes de complementariedad (a las que se hace referencia en adelante como CDR) 1 a 3 de cadena pesada (a la que se hace referencia en adelante como cadena H) del anticuerpo comprenden las secuencias de aminoácidos representadas por las SEC ID nº 30, 31 y 32, respectivamente, y las CDR 1 a 3 de cadena ligera (a la que se hace referencia en adelante como cadena L) del anticuerpo comprenden las secuencias de aminoácidos representadas por las SEC ID nº 33, 34 y 35, respectivamente; (b) un anticuerpo en el que las CDR 1 a 3 de cadena H del anticuerpo comprenden las secuencias de aminoácidos representadas por las SEC ID nº 30, 31 y 32, respectivamente, y las CDR 1 a 3 de cadena L del anticuerpo comprenden las secuencias de aminoácidos representadas por las SEC ID nº 33, 34 y 35, respectivamente, y la cisteína en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID nº 32 (CDR3 de la cadena H de anticuerpo) es sustituida por treonina, metionina, isoleucina, valina, fenilalanina o glutamina, respecto al anticuerpo; y (c) un anticuerpo en el que la cadena H del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID nº 98 y la cadena L del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID nº 94.

Description

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DESCRIPCION
Anticuerpo anti-FOLRI.
Campo tecnico
La presente invencion se refiere a un anticuerpo monoclonal que se une al receptor de folato a (en adelante denominado FOLR1) y muestra actividad de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (en adelante denominada actividad ADCC) y/o actividad de citotoxicidad dependiente del complemento (en adelante denominada actividad CDC) o un fragmento de anticuerpo del mismo, un ADN codificante del anticuerpo o fragmento de anticuerpo del mismo, un vector que comprende el ADN, un transformante obtenido mediante la introduccion del vector, un metodo para preparar el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo del mismo utilizando el transformante, y un agente terapeutico y un agente diagnostico que comprende el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo a modo de principio activo.
La FOLR1 es una protema membranal anclada a GPI con una elevada afinidad para el folato y presenta importantes funciones relacionadas con la proliferacion o supervivencia celular (literatura no de patentes n° 1). FOLR1 muestra un patron de expresion restringida en los tejidos normales del rinon, pulmon, intestino o similar (literatura no de patentes n° 2).
La region de expresion se localiza en la luz intestinal. Ademas, la expresion de FOLR1 en los tejidos de cancer no se encuentra restringida a la luz intestinal y se observa una expresion elevada del mismo en una diversidad de canceres, tales como el cancer ovarico (literatura no de patentes n° 2, literatura no de patentes n° 3 y literatura no de patentes n° 4), cancer renal (literatura no de patentes n° 2), cancer de pulmon (literatura no de patentes n° 2 y literatura no de patentes n° 3), cancer de mama (literatura no de patentes n° 2) y mesotelioma (literatura no de patentes n° 4).
En particular, se ha informado de que el nivel de expresion de FOLR1 se relaciona con el grado de malignidad, la progresion y el pronostico en el cancer ovarico (literatura no de patentes n° 5 y literatura no de patentes n° 6). Ademas, se ha informado tambien de que FOLR1 soluble se encuentra significativamente elevado en el suero de los pacientes de cancer ovarico en comparacion con el suero de donantes sanos (literatura no de patentes n° 7). De esta manera, FOLR1 es una molecula diana prometedora para el tratamiento del cancer.
Se conoce LK26 como anticuerpo monoclonal de raton contra FOLR1 (literatura de patentes n° 1). LK26 ha sido humanizado mediante injertacion de CDR para la administracion en el paciente como anticuerpo para el tratamiento del cancer (literatura de patentes n° 2). Sin embargo, su afinidad se reduce notablemente por la humanizacion.
Por este motivo, Ebel et al. han preparado anticuerpo MORAb-003 que presenta una afinidad equivalente para FOLR1 a la del anticuerpo LK26, basada en el anticuerpo LK26 humanizado (literatura no de patentes n° 8). Se considera que la actividad antitumoral in vitro de MORAb-003 se atribuye a la actividad ADCC y a la actividad CDC.
Por otra parte, existe un informe de que MORAb-003 no presenta actividad inhibidora de la union del folato, 5- metiltetrahidrofolato (5-MTHF) o Pemetrexed a celulas positivas para FOLR1, y el anticuerpo por sf solo no presenta actividad inhibidora de la proliferacion de las celulas positivas para FOLR1 (literatura no de patentes n° 9).
Un ensayo clmico de fase I ha informado de que MORab-003 muestra seguridad y tolerabilidad a dosis administradas de entre 12,5 y 400 mg/m2 (literatura no de patentes n° 10). Ademas, un ensayo clmico de fase II ha informado de que MORAb-003 en combinacion con paclitaxel y carboplatino muestra una actividad antitumoral significativa en pacientes con cancer ovarico recurrente sensible al platino (literatura no de patentes n° 12).
Sin embargo, un ensayo clmico con pacientes con cancer ovarico recurrente resistente al platino fue interrumpido debido a la posibilidad de no cumplir el criterio de valoracion de mejora de criterios estadfsticos predeterminados (supervivencia sin progresion o periodo total de supervivencia) en un analisis preliminar.
Un ejemplo de agente anticancer con diana en FOLR1 puede ser EC-145, que se prepara mediante conjugacion de un agente anticancer y folato, ademas del anticuerpo anti-FOLR1 anteriormente indicado. El agente anticancer conjugado con folato muestra una eficacia basada en la propiedad de incorporacion del folato que presenta FOLR1. Por lo tanto, se sugiere que el agente anticancer conjugado con folato resultara ineficaz en las celulas de cancer con baja actividad de incorporacion del folato, aunque FOLR1 se expresa en las celulas de cancer del cuerpo.
A pesar de los continuos avances en el tratamiento de los canceres solidos y la mejora del pronostico, no se ha
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producido ninguna mejora notable en el pronostico del cancer ovarico, desde la aparicion de una terapia con un agente de platino en 1980 (literatura no de patentes n° 11) y el cancer ovarico todavfa es una causa importante de muerte por cancer en mujeres. El motivo es que el cancer ovarico se torna resistente al agente platino y, en consecuencia, el cancer ovarico recurrente es intratable.
Es decir, los retos del tratamiento del cancer ovarico son prolongar el periodo anterior a la recurrencia tras la respuesta a la quimioterapia utilizando un agente de platino o similar, con el fin de evitar la resistencia del cancer ovarico al agente de platino y establecer una terapia para el cancer ovarico resistente al platino.
Ademas, el cancer ovarico con frecuencia esta asociado a la acumulacion de ftquido ascftico debido a la diseminacion peritoneal. En particular, la acumulacion de ftquido ascftico en el cancer ovarico resistente al platino deteriora la CdV (Calidad de Vida) y, de esta manera, existe una demanda de agentes terapeuticos que resulten eficaces para las celulas de cancer presentes en la diseminacion peritoneal o ftquido ascftico, ademas de las celulas de cancer en el sitio primario.
Tambien existe una demanda de agentes terapeuticos eficaces para las celulas de cancer que muestran una expresion elevada de FOLR1 pero presentan una actividad de incorporacion baja del folato.
Listado de referencias
Documentos de patente
[Literatura de patentes n° 1] solicitud publicada de patente europea n° 0197435.
[Literatura de patentes n° 2] patente US n° 5952484.
Documentos no de patente
[Literatura no de patentes n° 1] Int. J. Cancer 119(2):243-50, 2006.
[Literatura no de patentes n° 2] Anal. Biochem. 338(2):284-93, 2005.
[Literatura no de patentes n° 1] Int. J. Cancer 119(2):243-50, 2006.
[Literatura no de patentes n° 2] Anal. Biochem. 338(2):284-93, 2005.
[Literatura no de patentes n° 3] J. Thorac. Oncol. 7(5):833-840, 2012.
[Literatura no de patentes n° 4] J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 121(2):225-33, 2001.
[Literatura no de patentes n° 5] Int. J. Cancer 74(2):193-8, 1997.
[Literatura no de patentes n° 6] Int. J. Cancer 79(2):121-6, 1998.
[Literatura no de patentes n° 7] PLoS One 4(7):p.e6292, 2009.
[Literatura no de patentes n° 8] Cancer Immun. 7:6, 2007.
[Literatura no de patentes n° 9] Cancer Chemother. Pharmacol. 70(1):113-20, 2012.
[Literatura no de patentes n° 10] Clin. Cancer Res. 16(21):5288-95, 2010.
[Literatura no de patentes n° 11] Nat. Rev. Cancer 11(10):719-25, 2011.
[Literatura no de patentes n° 12] J. Clin. Oncol. 28(15): 5001,2010.
Divulgacion de la invencion
Problemas que debe resolver la invencion
Se espera un anticuerpo anti-FOLR1 que muestra una actividad ADCC y/o actividad CDC drasticamente incrementadas como anticuerpo para el tratamiento de canceres caracterizados por la expresion de FOLR1, incluyendo el cancer ovarico resistente al platino intratable.
La presente invencion proporciona un anticuerpo o fragmento del mismo que muestra una actividad antitumoral contra ftneas celulares in vitro e in vivo, aunque se deriven de cancer ovarico resistente al platino. Ademas, la presente invencion proporciona un ADN codificante del anticuerpo o fragmento del mismo, un vector que comprende el ADN, un transformante obtenido mediante la introduccion del vector, un metodo para producir el anticuerpo o fragmento del mismo utilizando el transformante, y un agente terapeutico y un agente diagnostico que comprende el anticuerpo o fragmento de anticuerpo como principio activo.
Medios para resolver los problemas
El resumen de la presente invencion es el siguiente.
(1) Un anticuerpo monoclonal o un fragmento del mismo que compite con un anticuerpo seleccionado de
(a)-(c) a continuacion para reconocer espedficamente FOLR1 humano y se une a un epftopo identico al epftopo sobre FOLR1 humano al que se une el anticuerpo, que se encuentra en las posiciones 55 a 62 en la secuencia de aminoacidos de FOLR1 humano representado por la SEC ID n° 1 y que tambien muestra una actividad antitumoral:
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(a) un anticuerpo en el que las regiones determinates de complementariedad (en adelante CDR) 1 a 3 de cadena pesada (en adelante denominada cadena H) del anticuerpo comprende las secuencias de aminoacidos representadas por las SEC ID n° 30, 31 y 32, respectivamente, y las CDR 1 a 3 de cadena ligera (en adelante denominada cadena L) del anticuerpo comprenden las secuencias de aminoacidos representadas por las SEC ID n° 33, 34 y 35, respectivamente,
(b) un anticuerpo en el que las CDR 1 a 3 de cadena H del anticuerpo comprende las secuencias de aminoacidos representadas por las SEC ID n° 30, 31 y 32, respectivamente, y las CDR 1 a 3 de cadena L del anticuerpo comprenden las secuencias de aminoacidos representadas por las SEC ID n° 33, 34 y 35, respectivamente, y la cistema en la secuencia de aminoacidos representada por la SEC ID n° 32 (CDR3 de la cadena H de anticuerpo) es sustituida por treonina, metionina, isoleucina, valina, fenilalanina o glutamina, respecto al anticuerpo, y
(c) un anticuerpo en el que la cadena H del anticuerpo comprende la secuencia de aminoacidos representada por la SEC ID n° 98 y la cadena L del anticuerpo comprende la secuencia de aminoacidos representada por la SEC ID n° 94.
(2) El anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo descrito en (1), que es un anticuerpo recombinante.
(3) El anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo indicado en (2), en el que el anticuerpo recombinante se selecciona de un anticuerpo tbrido humano, un anticuerpo humanizado y un anticuerpo humano.
(4) Un anticuerpo monoclonal o un fragmento del mismo que se une a FOLR1 humano y se selecciona de (a)-(c) a continuacion:
(a) un anticuerpo monoclonal y un fragmento del mismo en el que las CDR 1 a 3 de cadena H del anticuerpo comprenden las secuencias de aminoacidos representadas por las SEC ID n° 30, 31 y 32, respectivamente, y las CDR 1 a 3 de cadena L del anticuerpo comprenden las secuencias de aminoacidos representadas por las SEC ID n° 33, 34 y 35, respectivamente,
(b) un anticuerpo en el que las CDR 1 a 3 de cadena H del anticuerpo comprende las secuencias de aminoacidos representadas por las SEC ID n° 30, 31 y 32, respectivamente, y las CDR 1 a 3 de cadena L del anticuerpo comprenden las secuencias de aminoacidos representadas por las SEC ID n° 33, 34 y 35, respectivamente, y la cistema en la secuencia de aminoacidos representada por la SEC ID n° 32 (CDR3 de cadena H de anticuerpo) es sustituida por treonina, metionina, isoleucina, valina, fenilalanina o glutamina, y
(c) un anticuerpo en el que la cadena H del anticuerpo comprende la secuencia de aminoacidos representada por la SEC ID n° 98 y la cadena L del anticuerpo comprende la secuencia de aminoacidos representada por la SEC ID n° 94.
(5) El anticuerpo monoclonal y el fragmento del mismo indicado en cualquiera de (1) a (4), que se une a la secuencia de aminoacidos de FOLR1 humano representado por la SEC ID n° 1.
(6) El fragmento de anticuerpo indicado en cualquiera de (1) a (4), que se selecciona de Fab, Fab', F(ab')2, un anticuerpo de cadena sencilla (scFv), una region V dimerica (diacuerpo), una region V estabilizada por disulfuro (dsFv) y un peptido que comprende CDR.
(7) Un ADN codificante del anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo descrito en cualquiera de (1) a (4).
(8) Un vector recombinante que comprende el ADN indicado en (7).
(9) Un transformante que se obtiene mediante la introduccion del vector recombinante de (8) en las celulas hospedadoras.
(10) Un metodo para producir el anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo de (1) o (4), que comprende cultivar el transformante de (9) en un medio, producir y acumular el anticuerpo monoclonal o el fragmento del mismo de (1) o (4) en el cultivo y recolectar el anticuerpo o fragmento del mismo a partir del cultivo.
(11) Una composicion farmaceutica que comprende el anticuerpo monoclonal o el fragmento del mismo de cualquiera de (1) a (4) y un portador farmaceuticamente aceptable.
(12) Un metodo para detectar o medir inmunologicamente FOLR1 humano o celulas positivas para FOLR1
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humanas utilizando el anticuerpo monoclonal o el fragmento de anticuerpo del mismo de cualquiera de (1) a (4).
(13) Un metodo ex vivo para diagnosticar enfermedades asociadas a celulas positivas para FOLR1 humanas, que comprende detectar o medir celulas positivas para FOLR1 humanas utilizando el anticuerpo monoclonal o el fragmento del mismo de cualquiera de (1) a (4).
(14) Una composicion farmaceutica para diagnosticar enfermedades asociadas a celulas positivas para FOLR1 humano, que comprende el anticuerpo monoclonal o el fragmento del mismo de cualquiera de (1) a (4).
(15) Un metodo para evaluar la eficacia terapeutica de un anticuerpo utilizando el anticuerpo monoclonal o el fragmento del mismo de cualquiera de (1) a (4), antes del inicio del tratamiento.
Efecto de la invencion
El anticuerpo monoclonal de la presente invencion o fragmento del mismo reconoce espedficamente una secuencia de aminoacidos de FOLR1 humano o una estructura conformacional del mismo y se une a el. El anticuerpo monoclonal de la presente invencion o fragmento del mismo presenta elevadas actividades ADCC y CDC y ademas muestra una actividad antitumoral contra lmeas celulares derivadas de cancer ovarico resistente al platino.
El anticuerpo monoclonal de la presente invencion o fragmento del mismo presenta una actividad ADCC contra las celulas con baja expresion de FOLR1. El anticuerpo monoclonal de la presente invencion o fragmento del mismo tambien presenta una actividad ADCC contra las celulas de cancer que expresan FOLR1 presentes en el lfquido asdtico. Ademas, el anticuerpo monoclonal de la presente invencion o fragmento del mismo presenta una actividad ADCC contra las celulas de cancer que expresan FOLR1 aunque las celulas de cancer presentan una actividad reducida de incorporacion del folato.
Ademas, el anticuerpo monoclonal de la presente invencion o fragmento del mismo no inhibe la union del folato a FOLR1. El anticuerpo monoclonal de la presente invencion o fragmento del mismo que se une espedficamente a FOLR1 humano y tambien presenta elevadas actividades ADCC y CDC resulta util para el tratamiento y diagnostico de las enfermedades asociadas a las celulas positivas para FOLR1 humano.
Ademas, la presente invencion puede proporcionar un ADN codificante del anticuerpo, un vector que comprende el ADN, un transformante obtenido mediante la introduccion del vector, un metodo para producir el anticuerpo o fragmento del mismo utilizando el transformante y un agente terapeutico y un agente diagnostico que comprenden el anticuerpo o fragmento de anticuerpo como principio activo.
Breve descripcion de los dibujos
La figura 1 representa las secuencias de aminoacidos de la region variable de cadena pesada del anticuerpo RA15-7 que no contiene secuencia de senal y la region variable de cadena pesada (HV0, HV2, HV3, HV4, HV5, HV6, HV7, HV8, HV10) de cada anticuerpo RA15-7 humanizado modificado.
La figura 2 representa las secuencias de aminoacidos de la region variable de cadena ligera del anticuerpo RA15-7 que no contiene secuencia de senal y la region variable de cadena ligera (LV0, LV2, LV3, LV4, LV6) de cada anticuerpo RA15-7 humanizado modificado.
La figura 3 representa el resultado (metodo de resonancia del plasmon superficial) de evaluacion de la afinidad del anticuerpo modificado HV7LV3-CDRH3-Cys101 para FOLR1-mycHis al considerar que la afinidad del anticuerpo ChRA15-7Acc es 100, mediante la utilizacion del metodo de resonancia del plasmon superficial.
La figura 4 (a), (b), (c) y (d) representa los resultados (ELISA) de evaluacion de la reactividad de cada anticuerpo (dNpDF, MORAb-003DF, ChRA15-7DF, y HuRA15-7CTDF) contra FOLR1-Fc (drculos negros), FOLR1-Fc de mono Cynomolgus (drculos blancos), FOLR2-Fc (triangulos negros) y FOLR3-Fc (*), en el que el eje vertical representa la absorbancia y el eje horizontal representa la concentracion de anticuerpo (ng/ml).
La figura 5(a) y (b) representan las actividades ADCC del anticuerpo HuRA15-7CTAcc (drculos negros), del anticuerpo HuRA15-7Acc (cuadrados negros) y del anticuerpo ChRA15-7Acc (triangulos negros) contra la lmea celular de cancer ovarico resistente al platino SKOV-3 u OVCAR-3, en donde el eje vertical representa la actividad ADCC (%) y el eje horizontal representa la concentracion de anticuerpo (ng/ml).
La figura 6(a) y (b) representa la actividad CDC contra la lmea celular de cancer ovarico IGR-OV1, en la que el eje vertical representa la actividad CDC (%) y el eje horizontal representa la concentracion de anticuerpo
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(ng/ml). La figura 6(a) muestra las actividades CDC del anticuerpo HuRA15-7CTAcc (drculos negros), del anticuerpo HuRA15-7CTDF (drculos blancos), del anticuerpo ChRA15-7Acc (triangulos negros) y del anticuerpo ChRA15-7DF (triangulos blancos). La figura 6(B) muestra las actividades CDC del anticuerpo HuRA15-7CTAcc (drculos negros) y del anticuerpo MORAb-003 (triangulos negros).
La figura 7(a), (b) y (c) representan las actividades ADCC del anticuerpo HuRA15-7CTAcc (drculos negros), del anticuerpo MORAb-003Acc (triangulos blancos) y del anticuerpo MORAb-003 (triangulos negros) contra la lmae celular de cancer ovarico IGR-OV, SKOV-3 u OVCAR-3, en donde el eje vertical representa la actividad ADCC (%) y el eje horizontal representa la concentracion de anticuerpo (ng/ml).
La figura 8 representa la acumulacion de anticuerpo HuRA15-7CTDF-770 (drculos negros) y de anticuerpo MORAb-003DF-770 (triangulos negros) en cancer avanzado que resulta de la implantacion subcutanea de la lmea celular de cancer ovarico resistente al platino SKOV-3 en ratones, en donde el eje vertical representa una proporcion entre la intensidad de fluorescencia de cada anticuerpo y la intensidad de fluorescencia del anticuerpo DNPDF-680 como estandar interno en el sitio tumoral, y el eje horizontal representa el tiempo (fecha) despues de la administracion.
La figura 9 representa las actividades ADCC del anticuerpo HuRA15-7CTAcc (drculos negros), del anticuerpo HuRA15-7CRAcc (drculos blancos) y del anticuerpo MORAb-003DF (triangulos negros) contra la lmea celular de cancer ovarico resistente al platino OVCAR-3, en donde el eje vertical representa la actividad ADCC (%) y el eje horizontal representa la concentracion de anticuerpo (ng/ml).
La figura 10 representa el numero cuantificado de moleculas FOLR1 expresadas en cada lmea celular de cancer ovarico, en el que se utilizo la IgG2a de raton como control negativo. Se analizo FOLR1 expresado sobre la lmea celular de cancer ovarico IGR-OV1, SKOV-3, OVCAR-3 o MCAS mediante citometna de flujo utilizando el anticuerpo LK26. El eje vertical representa el numero de moleculas FOLR1 expresadas en cada celula.
La figura 11(a), (b), (c) y (d) representan la citotoxicidad celular contra las celulas positivas para FOLR1 al anadir el anticuerpo HuRA15-7CTAcc (drculos negros), el anticuerpo MORAb-003 (triangulos negros) y el anticuerpo DNPDF (*) como control negativo a poblaciones celulares derivadas de lfquido asdtico de cancer ovarico, en donde el eje vertical representa la citotoxicidad celular (%) y el eje horizontal representa la concentracion de anticuerpo (ng/ml). FZ12, FZ21, FZ26 y FZ44 representan donantes de lfquido asdtico de cancer ovarico, respectivamente.
La figura 12(a) y (b) representa el nivel de expresion de FOLR1 y la incorporacion de folato de diversas lmeas celulares de cancer ovarico. La figura 12(a) muestra el nivel de expresion de FOLR1 mediante citometna de flujo utilizando el anticuerpo HuRA15-7CTAcc y la fig. 12(b) muestra la incorporacion de folato mediante citometna de flujo utilizando folato marcado. El eje vertical representa un valor de IMF respecto al control negativo y el eje horizontal representa la lmea celular de cancer ovarico analizada.
Formas de realizacion para poner en practica la invencion
Entre los ejemplos de FOLR1 humano de la presente invencion puede incluirse un polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos representada por la SEC ID n° 1 y que tambien presenta una funcion de FOLR1 humano, un polipeptido que comprende la secuencia de aminoacidos representada por la SEC ID n° 1 en la que uno o mas aminoacidos han sido delecionados, sustituidos o anadidos y que tambien presenta la funcion de FOLR1 humano, un polipeptido que comprende la secuencia de aminoacidos que presenta una homologfa de por lo menos 60%, preferentemente una homologfa de por lo menos 80%, mas preferentemente una homologfa de por lo menos 90% y lo mas preferentemente con una homologfa de por lo menos 95% respecto a la secuencia de aminoacidos representada por la SEC ID n° 1 y que tambien presenta la funcion de FOLR1 humano, un polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos compuesta de una secuencia parcial de la secuencia de aminoacidos representada por la SEC ID n° 1 y que tambien presenta la funcion de FOLR1 humano o similar.
La funcion de FOLR1 humano se refiere a la causa de la endocitosis mediante union a un ligando (p.ej., folato) e incorporacion intracelular del folato.
Entre los ejemplos del metodo para obtener el polipeptido que comprende la secuencia de aminoacidos representada por la SEC ID n° 1, en la que uno o mas aminoacidos se delecionan, sustituyen o anaden, se incluyen un metodo de introduccion de una mutacion espedfica de sitio en el ADN codificante de un polipeptido que presenta la secuencia de aminoacidos representada por la SEC ID n° 1, es decir, un gen codificante de FOLR1 humano utilizando mutagenesis espedfica de sitio [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, segunda edicion, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), Current Protocols in molecular Biology, John Wiley&Sons (1987-1997), Nucleic Acids Research 10:6487, 1982), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6409, 1982, Gene 34:315, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488, 1985, o similar.
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El numero de aminoacidos que se delecionan, sustituyen o anaden es, aunque sin limitacion particular, preferentemente 1 a docenas, por ejemplo 1 a 20, mas preferentemente 1 a varias, por ejemplo 1 a 5.
Entre los ejemplos del gen codificante de FOLR1 humano pueden incluirse una secuencia de nucleotidos representada por GenBank n° de acceso NM_016725. El gen codificante de FOLR1 humano de la presente invencion puede incluir un gen que comprende un ADN compuesto de una secuencia de nucleotidos que presenta la delecion, sustitucion o adicion de uno o mas nucleotidos en la secuencia de nucleotidos representada por GenBank n° de acceso NM_016725 y que codifica ademas un polipeptido que presenta la funcion de FOLR1 humano, un gen que comprende un ADN compuesto de la secuencia de nucleotidos que presenta una homologfa de por lo menos 60% o superior, preferentemente de 80% o superior, y mas preferentemente de 95% o superior respecto a la secuencia de nucleotidos representada por GenBank n° de acceso NM_016725 y codificante ademas de un polipeptido que presenta la funcion de FOLR1 humano, un gen que comprende un ADN que se hibrida con un aDn que presenta la secuencia de nucleotidos representada por GenBank n° de acdeso. NM_016725 bajo condiciones restrictivas y que tambien codifica un polipeptido que presenta la funcion de FOLR1 humano o similar.
El ADN que se hibrida bajo condiciones restrictivas se refiere a un ADN hibridable que se obtiene mediante hibridacion de colonias, hibridacion de placas, hibridacion de transferencia southern, micromatrices de ADN o similar, utilizando un ADN que presenta la secuencia de nucleotidos representada por GenBank n° de acceso NM_016725 como sonda.
Un ejemplo espedfico del mismo puede incluir un ADN que puede identificarse mediante la hibridacion [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), Current Protocols in molecular Biology, John Wiley&Sons, 1987-1997), DNA Cloning 1: Core techniques, A Practical Approach, segunda edicion, Oxford University, 1995] utilizando el filtro o portaobjetos de vidrio sobre el que se inmoviliza un ADN derivado de la colonia o placa hibridada, o producto de PCR u oligo de ADN, bajo la presencia de cloruro sodico 0,7 a 1,0 mol/l a 65°C, lavando despues el filtro o portaobjetos de vidrio a 65°C con una solucion SSC de concentracion de 0,1 a 2 veces (solucion SSC de concentracion de 1 vez: cloruro sodico 150 mmoles/l y citrato sodico 15 mmoles/l).
Entre los ejemplos del ADN hibridable pueden incluirse ADN que presenta una homologfa de 60% o superior, preferentemente de 80% o superior, mas preferentemente de 95% o superior respecto a la secuencia de nucleotidos representada por GenBank n° de acceso NM_016725.
En la secuencia de nucleotidos del gen codificante de una protema de un eucariota, con frecuencia se observan polimorfismos geneticos. El gen codificante de FOLR1 de la presente invencion incluye ademas un gen en el que se generan modificaciones menores en la secuencia de nucleotidos del gen mediante dicho polimorfismo.
El numero de la homologfa descrito en la presente invencion puede ser un numero calculado mediante la utilizacion de un programa de busqueda de homologfas conocido por el experto en la materia, a menos que se indique espedficamente lo contrario. Con respecto a la secuencia de nucleotidos, el numero puede calcularse utilizando BLAST [J. Mol. Biol. 215:403, 1990] con un parametro por defecto o similar. Ademas, con respecto a la secuencia de aminoacidos, el numero puede calcularse utilizando BLAST2 [Nucleic Acids Res. 25:3389, 1997; Genome Res. 7:649, 1997;
www.ncbi.nlm.nih.gov/Education/BLASTinfo/information3.html] con un parametro por defecto o similar.
Como parametro por defecto, G (coste de abrir hueco) es 5 para la secuencia de nucleotidos y 11 para la secuencia de aminoacidos; -E (coste de extender hueco) es 2 para la secuencia de nucleotidos y 1 para la secuencia de aminoacidos; -q (penalizacion de no correspondencia de nucleotido) es -3; r (premio por correspondencia de nucleotido) es 1; -e (valor esperado) es 10; -W (tamano de palabra) es 11 residuos para la secuencia de nucleotidos y 3 residuos para la secuencia de aminoacidos; y [parada (‘Dropoff)(X) para las extensiones de Blast en bits] es 20 para Blastn y 7 para un programa diferente de Blastn; -X (valor de parada X para la alineacion con huecos, en bits) es 15, y Z (valor de parada X final para la alineacion con huecos, en bits) es 50 para Blastn y 25 para un programa diferente de Blastn (
www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/html/blastcgihelp.html).
El polipeptido compuesto de una secuencia parcial de la secuencia de aminoacidos representada por la SEC ID n° 1 puede prepararse, por ejemplo, mediante la delecion parcial de un ADN codificante de la secuencia de aminoacidos representada por la SEC ID n° 1 y el cultivo de un transformante en el que se ha introducido un vector de expresion que comprende el ADN parcialmente delecionado.
El polipeptido que presenta una secuencia de aminoacidos en la que uno o mas aminoacidos han sido delecionados, sustituidos o anadidos a la secuencia parcial de la secuencia de aminoacidos representada por la SEC ID n° 1 tambien puede obtenerse mediante la mutagenesis espedfica de sitio anteriormente indicada.
Ademas, el polipeptido compuesto de la secuencia parcial de la secuencia de aminoacidos representada por la
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SEC ID n° 1 o el polipeptido en el que uno o mas aminoacidos han sido delecionados, sustituidos o anadidos en la secuencia parcial de la secuencia de aminoacidos representada por la SEC ID n° 1 tambien puede prepararse mediante un metodo de smtesis qmmica, tal como un metodo de fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc), un metodo de t-butiloxicarbonilo (tBoc) o similar.
El anticuerpo monoclonal (en adelante denominado anticuerpo de la presente invencion) o el fragmento del mismo es un anticuerpo o un fragmento del mismo que reconoce espedficamente las secuencias de aminoacidos de FOLR1 humano o la estructura conformacional del mismo y se une a el y presenta una actividad antitumoral.
En la presente invencion, la estructura conformacional de FOLR1 humano puede ser cualquier estructura, con la condicion de que presente una estructura equivalente a una estructura que puede formar en estado nativo FOLR1 humano que presenta la secuencia de aminoacidos entre la posicion 1 y la posicion 257 en la secuencia de aminoacidos representada por la SEC ID n° 1. La estructura conformacional que puede formar FOLR1 humano en un estado nativo se refiere a una estructura conformacional nativa de FOLR1 humano.
Espedficamente, la actividad antitumoral en la presente invencion puede incluir actividad ADCC y actividad CDC.
La actividad ADCC en la presente invencion es una reaccion citolftica en la que un anticuerpo unido a FOLR1 humano sobre la superficie celular se une a FcYRIIIa sobre la superficie de principalmente celulas asesinas naturales (en adelante denominadas celulas NK) mediante la fraccion Fc y, como resultado, la reaccion generada por moleculas citotoxicas, tales como la perforina y el granzima, liberadas por las celulas NK (Clark M., Chemical Immunology 65:88, 1997; Gorter A. et al., Immunol. Today 20:576, 1999).
El anticuerpo de la presente invencion presenta actividad ADCC contra las celulas con baja expresion de FOLR1, asf como celulas con elevada expresion de FOLR1. Ademas, el anticuerpo de la presente invencion muestra una actividad ADCC mas elevada contra las celulas con baja expresion de FOLR1 que los anticuerpos monoclonales anti-FOLR1 convencionales. El nivel de expresion de FOLR1 en las celulas puede confirmarse mediante transferencia western, un metodo de deteccion inmunologica conocido, un metodo de tincion celular fluorescente o similar.
Entre los ejemplos espedficos de los mismos pueden incluirse un metodo de tincion fluorescente de anticuerpos utilizando un sistema FMAT8100HTS (fabricado por Applied Biosystems) [Cancer Immunol. Immunother. 36:373, 1993] o similar, un metodo de tincion celular fluorescente que utiliza citometna de flujo, o similares. El anticuerpo de la presente invencion tambien presenta una actividad ADCC contra las celulas que expresan FOLR1 con baja actividad de incorporacion de folato.
La cantidad de incorporacion de folato en las celulas puede confirmarse mediante, por ejemplo, la utilizacion de folato marcado con un marcaje utilizado comunmente en el metodo de deteccion o medicion inmunologica. Entre los ejemplos del marcaje pueden incluirse enzimas tales como la fosfatasa alcalina, la peroxidasa, la luciferasa o similares; materiales luminiscentes, tales como ester de acridinio, lofina o similares; materiales fluorescentes, tales como isotiocianato de fluorescema (FITC) o isotiocianato de tetrametil-rodamina (RITC), materiales radioactivos o similares.
La actividad CDC en la presente invencion es una reaccion citolftica en la que un anticuerpo unido a FOLR1 humano sobre la superficie celular se une a C1q, que es un componente de C1 del sistema del complemento, mediante una fraccion Fc, y como resultado, los componentes del complemento respectivos C1 a c9 resultan activados y, finalmente, C5 a C9 forman un agregado formador de poro conocido como complejo de ataque membranal sobre la membrana celular [Immunol. Today. 20(12): 576-82, dic. 1999].
Espedficamente, el anticuerpo puede incluir anticuerpos monoclonales de (i) a (ii), a continuacion, y fragmentos de los mismos.
(i) un anticuerpo en el que las CDR 1 a 3 de cadena H del anticuerpo comprende las secuencias de aminoacidos representadas por las SEC ID n° 30, 31 y 32, respectivamente, y las CDR 1 a 3 de cadena L del anticuerpo comprenden las secuencias de aminoacidos representadas por las SEC ID n° 33, 34 y 35, respectivamente,
(i) un anticuerpo en el que las CDR 1 a 3 de cadena H del anticuerpo comprende las secuencias de aminoacidos representadas por las SEC ID n° 30, 31 y 32, respectivamente, y las CDR 1 a 3 de cadena L del anticuerpo comprenden las secuencias de aminoacidos representadas por las SEC ID n° 33, 34 y 35, respectivamente, y en las que la cistema en la secuencia de aminoacidos representada por la SEC ID n° 32 (CDR3 de cadena H de anticuerpo) ha sido sustituida por treonina, metionina, isoleucina, valina, fenilalanina o glutamina.
Mas espedficamente, el anticuerpo monoclonal de la presente invencion puede incluir un anticuerpo monoclonal
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de (a) a continuacion y un fragmento de anticuerpo del mismo.
(a) Un anticuerpo monoclonal y un fragmento del mismo en el que las VH del anticuerpo comprenden la secuencia de aminoacidos representada por la SEC ID n° 98 y la VL del anticuerpo comprende la secuencia de aminoacidos representada por la SEC ID n° 94.
Ademas, el anticuerpo monoclonal de la presente invencion puede incluir un anticuerpo monoclonal o un fragmento del mismo que compite con el anticuerpo monoclonal anterior para la union espedfica a la secuencia de aminoacidos de FOLR1 humana o a la estructura conformacional del mismo y se une a un epftopo que es identico al epftopo sobre FOLR1 humano al que se une el anticuerpo monoclonal anteriormente indicado.
En la presente invencion, el anticuerpo que compite con el anticuerpo monoclonal se refiere a un anticuerpo que presenta un epftopo (tambien denominado determinante antigenico) de FOLR1 humano que es identico o parcialmente identico al del anticuerpo monoclonal de la presente invencion y que se une al epftopo. El anticuerpo que se une a un epftopo identico al epftopo al que se une el anticuerpo monoclonal de la presente invencion se refiere a un anticuerpo que reconoce y se une a una secuencia identica a la secuencia de aminoacidos de FOLR1 humano reconocida por el anticuerpo monoclonal de la presente invencion.
La union del anticuerpo monoclonal de la presente invencion o el fragmento del mismo a la secuencia de aminoacidos de FOLR1 humano o estructura conformacional del mismo puede confirmarse mediante un metodo capaz de investigar un antigeno particular y la union de un anticuerpo al antigeno particular, tal como el ensayo de inmunosorcion ligada a enzima (ELISA), utilizando una transferencia western de FOLR1 humano en fase solida o inmunohistoqmmica (IHQ), o mediante un metodo conocido de deteccion inmunologica o un metodo de tincion celular fluorescente para las celulas que expresan FOLR1 humano.
Entre los ejemplos espedficos de los mismos pueden incluirse un metodo de tincion fluorescente de anticuerpos utilizando un sistema FMAT8100HTS (fabricado por Applied Biosystems) [Cancer Immunol. Immunother. 36:373, 1993] o similar, un metodo de tincion celular fluorescente que utiliza citometna de flujo, resonancia del plasmon superficial utilizando un sistema Biacore (fabricado por GE Healthcare) o similar o calorimetna de titulacion isotermica utilizando ITC (fabricado por DKSH) o similar.
Al examinar la union del anticuerpo monoclonal de la presente invencion o el fragmento del mismo a la secuencia de aminoacidos de FOLR1 humano o la estructura conformacional del mismo, mediante resonancia del plasmon superficial utilizando un sistema Biacore (fabricado por GE Healthcare) o similar, se inmoviliza un anticuerpo anti- IgG sobre un chip sensor CM5 mediante un metodo de acoplamiento de aminas y despues se deja que el anticuerpo o el fragmento del mismo fluya y se una a una cantidad apropiada y ademas se deja que fluya FOLR1 o un conjugado del mismo a diversas concentraciones conocidas, seguido de la medicion de la asociacion y disociacion.
Ademas, los inmunoensayos conocidos [Monoclonal Antibodies-Principles and practice, tercera edicion, Academic Press, 1996), Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988), Manual for monoclonal antibody experiments, Kodansha Scientific, 1987)] y similares pueden utilizarse en combinacion para la deteccion.
La celula que expresa FOLR1 humano puede ser cualquier celula, con la condicion de que expresa FOLR1 humano y, por ejemplo, una celula que se encuentra presente naturalmente en el cuerpo humano, una lrnea celular establecida a partir de la celula que se encuentra naturalmente presente en el cuerpo humano, una celula obtenida mediante tecnologfa de recombinacion genica o similar.
Entre los ejemplos de celula que se encuentra naturalmente presente en el cuerpo humano pueden incluirse una celula que expresa FOLR1 en el cuerpo de un paciente de cancer, espedficamente, una celula de cancer ovarico, una celula de cancer renal, una celula de cancer endometrial, una celula de cancer de pulmon, una celula de cancer de mama, una celula de cancer de vejiga, una celula de cancer pancreatico, una celula de cancer de colon o similares [Anal. Biochem., 338(2):284-293, 2005].
Entre los ejemplos de la lrnea celular establecida a partir de la celula que se encuentra naturalmente presente en el cuerpo humano puede incluirse una linea celular que expresa FOLR1, entre las lrneas celulares preparadas mediante el establecimiento de celulas que expresan FOLR1 obtenidas de los pacientes de cancer anteriormente indicados.
Entre los ejemplos de las mismas pueden incluirse SKOV-3 [American Type Culture Collection (en adelante denominada ATCC) n° HTB-77], TOV-112D (ATCC n° CRL-11731), ES-2 (ATCC n° CRL-1978), OV-90 (ATCC n° CRL-11732), PA-1 (ATCC n° CRL-1572), Caov-3( ATCC n° HTB-75), OVISE (celula del JCRB n° JCRB1043), MCAS (celula del JCRB n° JCRB0240), NIH: OVCAR-3 (ATCC n° HTB-161), IGR-OV1 (National Cancer Institute), o RMG-1 (celula del JCRB n° JCRB0172), que es una lrnea celular derivada de cancer ovarico establecida a partir del ser humano.
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Entre los ejemplos espedficos de la celula obtenida mediante tecnolog^a de recombinacion genica pueden incluirse una celula que expresa FOLR1 obtenida mediante la introduccion de un vector de expresion que comprende ADNc codificante de FOLR1 en una celula de insecto, una celula animal o similar.
El anticuerpo monoclonal de la presente invencion puede incluir un anticuerpo producido por un hibridoma y un anticuerpo recombinante producido por un transformante transformado con un vector de expresion que comprende un gen de anticuerpo.
El anticuerpo monoclonal se caracteriza porque es un anticuerpo secretado por una celula productora de anticuerpo de un unico clon y reconoce unicamente un epftopo (tambien denominado determinante antigenico) y presenta una secuencia de aminoacidos uniforme (estructura primaria) que constituye el anticuerpo monoclonal.
Entre los ejemplos del epftopo pueden incluirse una secuencia de aminoacidos, una estructura conformacional compuesta de la secuencia de aminoacidos, una secuencia de aminoacidos unida a una cadena sacarida, una estructura conformacional compuesta de la secuencia de aminoacidos unida a la cadena sacarida o similares, a la que reconoce y se une el anticuerpo monoclonal.
El epftopo al que se une el anticuerpo monoclonal de la presente invencion se encuentra preferentemente incluido en la secuencia de aminoacidos en las posiciones 55 a 62 en la secuencia de aminoacidos de FOLR1 humano representada por la SEC ID n° 1.
La secuencia de aminoacidos del epftopo al que se une preferentemente el anticuerpo monoclonal de la presente invencion comprende por lo menos un aminoacido seleccionado de los aminoacidos en las posiciones 55 a 62 y mas preferentemente comprende por lo menos un aminoacido seleccionado de los aminoacidos en las posiciones 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 y 62 en la secuencia de aminoacidos de SEC ID n° 1.
Ademas, la secuencia de aminoacidos del epftopo al que se une preferentemente el anticuerpo monoclonal de la presente invencion comprende por lo menos dos aminoacidos consecutivos seleccionados de los aminoacidos en las posiciones 55 a 62 de SEC ID n° 1, y mas preferentemente comprende por lo menos un aminoacido seleccionado de los aminoacidos en las posiciones 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 y 62 y tambien por lo menos dos aminoacidos consecutivos seleccionados de los aminoacidos en las posiciones 55 a 62 de la SEC ID n° 1 en la secuencia de aminoacidos de FOLR1 humano.
Entre los ejemplos espedficos de la secuencia de aminoacidos del epftopo al que se une el anticuerpo monoclonal de la presente invencion puede incluirse una secuencia de aminoacidos que comprende los aminoacidos en las posiciones 55 a 62 de la SEC ID n° 1 o similares.
El hibridoma puede obtenerse, por ejemplo, mediante la preparacion de la celula que expresa FOLR1 humano anteriormente indicada como antigeno, induciendo celulas productoras de anticuerpos con la especificidad de antigeno en un animal inmunizado con el antigeno y llevando a cabo la fusion de las celulas productoras de anticuerpos con las celulas de mieloma. Dicho hibridoma se cultiva o se inyecta en un animal para desarrollar la cancerizacion del ftquido asdtico, y el caldo de cultivo o ftquido asdtico se afsla y se purifica, obteniendo de esta manera un anticuerpo monoclonal anti-FOLR1.
El animal inmunizado con el antigeno puede ser cualquiera con la condicion de que pueda utilizarse para la preparacion del hibridoma, y preferentemente un raton, rata, hamster, pollo, conejo o similar. Ademas, los anticuerpos producidos a partir del hibridoma que se prepara mediante la obtencion de celulas con una capacidad productora de anticuerpos a partir de los animales, la inmunizacion de dichas celulas in vitro y a continuacion la fusion de las celulas con celulas de mieloma, tambien se encuentran incluidos en el anticuerpo de la presente invencion.
El anticuerpo recombinante de la presente invencion incluye anticuerpos producidos mediante recombinacion genetica, tales como un anticuerpo hnbrido humano, un anticuerpo injertado con CDR humano, un anticuerpo humano, un fragmento de anticuerpo o similares. El anticuerpo recombinante que presenta las propiedades del anticuerpo monoclonal, baja antigenicidad y una semivida en sangre prolongada resulta preferente como agente terapeutico. Entre los ejemplos de anticuerpo recombinante pueden incluirse los preparados mediante modificacion del anticuerpo monoclonal de la presente invencion mediante una tecnologfa de recombinacion genetica.
El anticuerpo hnbrido humano se refiere a un anticuerpo que comprende VH y VL de un anticuerpo de un animal no humano y una region constante de cadena pesada (en adelante denominada CH) y una region constante de cadena ligera (en adelante denominada CL) de un anticuerpo humano. El anticuerpo tnbrido humano de la presente invencion puede producirse mediante la obtencion de ADNc codificantes de VH y VL a partir del hibridoma productor del anticuerpo monoclonal que reconoce espedficamente y se une a la secuencia de aminoacidos de FOLR1 humano o a la estructura conformacional del mismo, la insercion de los ADNc en cada
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uno de los vectores de expresion para celulas animales que presentan genes codificantes de CH y CL de un anticuerpo humano de manera que se construye un vector expresante de anticuerpos hnbridos humanos y la introduccion de este vector en celulas animales para la expresion.
La CH del anticuerpo hnbrido humano puede ser cualquiera con la condicion de que pertenezca a las inmunoglobulinas humanas (en adelante Ig_h), preferentemente las pertenecientes a la clase IgG_h y tambien cualquiera de las subclases IgG1_h, IgG2_h, IgG3_h o IgG4_h pertenecientes a la clase IgG_h. Ademas, la CL del anticuerpo hnbrido humano puede ser cualquiera con la condicion de que pertenezca a IgG_h, y pueden utilizarse las pertenecientes a la clase k o A.
Entre los ejemplos espedficos del anticuerpo hnbrido humano de la presente invencion pueden incluirse un anticuerpo tnbrido que comprende VH de un anticuerpo que comprende la secuencia de aminoacidos representada por la SEC ID n° 27 y comprende VL de un anticuerpo que comprende la secuencia de aminoacidos representada por la SEC ID n° 29.
Ademas, el anticuerpo hnbrido de la presente invencion puede incluir un anticuerpo hnbrido que compite con el anticuerpo monoclonal de la presente invencion para reconocer y unirse espedficamente a la secuencia de aminoacidos de FOLR1 humano o a la estructura conformacional del mismo, y se une a un epftopo que es identico al epftopo en FOLR1 humano al que se une el anticuerpo monoclonal.
El anticuerpo injertado con CDR humano, tambien denominado anticuerpo humanizado, se refiere a un anticuerpo que se produce mediante injertacion de la secuencia de aminoacidos de las CDR de VH y VL de un anticuerpo animal no humano en la region correcta de VH y VL de un anticuerpo humano. El anticuerpo injertado con CDR humano de la presente invencion puede producirse mediante la construccion de ADNc codificante de la region V obtenida mediante injertacion de la secuencia de aminoacidos de las CDR de VH y VL de un anticuerpo monoclonal animal no humano, que reconoce y se une espedficamente a la secuencia de aminoacidos de FOLR1 humano o a la estructura conformacional del mismo, a la region marco (en adelante denominada FR) de VH y VL de cualquier anticuerpo humano, insertando el ADNc en cada uno de los vectores de expresion para celulas animales con genes codificantes de CH y CL de un anticuerpo humano, de manera que se construye un vector expresante del anticuerpo injertado con CDR y se introduce este vector en celulas animales para la expresion.
La CH del anticuerpo injertado con CDR humano puede ser cualquiera con la condicion de que pertenezca a Ig_h, preferentemente las pertenecientes a la clase IgG_h, y tambien cualquiera de entre las subclases IgG1_h, IgG2_h, IgG3_h o IgG4_h pertenecientes a la clase IgG_h. Ademas, la Cl del anticuerpo injertado con CDR humano puede ser cualquiera con la condicion de que pertenezca a IgG_h, y pueden utilizarse las pertenecientes a la clase k o A.
Entre los ejemplos espedficos del anticuerpo injertado con CDR humano de la presente invencion pueden incluirse un anticuerpo humanizado que comprende VH de un anticuerpo que comprende las CDR 1 a 3 que presentan las secuencias de aminoacidos representadas por las SEC ID n° 30 a 32 y comprende la VL de un anticuerpo que comprende las CDR 1 a 3 que presentan las secuencias de aminoacidos representadas por las SEC ID n° 33 a 35.
Entre los ejemplos espedficos del anticuerpo humanizado de la presente invencion pueden incluirse un anticuerpo humanizado que comprende por lo menos uno de (a) VH y (b) VL.
(a) VH de anticuerpo que comprende una secuencia de aminoacidos de SEC ID n° 100 o una secuencia de aminoacidos en la que por lo menos un residuo aminoacido seleccionado de Leu en la posicion 18, Ser en la posicion 30, Val en la posicion 37, Ala en la posicion 40, Pro en la posicion 41, Gly en la posicion 44, Leu en la posicion 45, Val en la posicion 48, Asp en la posicion 76 y Val en la posicion 95 de la secuencia de aminoacidos de SEC ID n° 100 se sustituye por otro residuo aminoacido.
(b) VL de anticuerpo que comprende una secuencia de aminoacidos de SEC ID n° 101 o una secuencia de aminoacidos en la que por lo menos un residuo aminoacido seleccionado de Val en la posicion 15, Ala en la posicion 43, Lys en la posicion 45, Phe en la posicion 71, Thr en la posicion 85 y Tyr en la posicion 87 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 101 se sustituye por otro residuo aminoacido.
Ademas, VH incluido en el anticuerpo humanizado de la presente invencion preferentemente es (1) a (8) a continuacion.
(1) VH que comprende una secuencia de aminoacidos en la que Leu en la posicion 18, Ser en la posicion 30, Val en la posicion 37, Ala en la posicion 40, Pro en la posicion 41, Gly en la posicion 44, Leu en la posicion 45, Val en la posicion 48, Asp en la posicion 76 y Val en la posicion 95 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 100 se sustituyen por otro residuo aminoacido.
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(2) VH que comprende una secuencia de aminoacidos en la que Val en la posicion 37, Ala en la posicion 40, Pro en la posicion 41, Gly en la posicion 44, Leu en la posicion 45, Val en la posicion 48, Asp en la posicion 76 y Val en la posicion 95 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 100 se sustituyen por otro residuo aminoacido.
(3) VH que comprende una secuencia de aminoacidos en la que Ser en la posicion 30, Ala en la posicion 40, Gly en la posicion 44, Leu en la posicion 45, Val en la posicion 48, Asp en la posicion 76 y Val en la posicion 95 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 100 se sustituyen por otro residuo aminoacido.
(4) VH que comprende una secuencia de aminoacidos en la que Val en la posicion 37, Ala en la posicion 40, Gly en la posicion 41, Leu en la posicion 45, Val en la posicion 48 y Val en la posicion 95 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 100 se sustituyen por otro residuo aminoacido.
(5) VH que comprende una secuencia de aminoacidos en la que Val en la posicion 37, Ala en la posicion 40, Pro en la posicion 41, Leu en la posicion 45 y Val en la posicion 48 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 100 se sustituyen por otro residuo aminoacido.
(6) VH que comprende una secuencia de aminoacidos en la que Ala en la posicion 40, Pro en la posicion 41, Leu en la posicion 45 y Val en la posicion 95 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 100 se sustituyen por otro residuo aminoacido.
(7) VH que comprende una secuencia de aminoacidos en la que Pro en la posicion 41, Leu en la posicion 45 y Val en la posicion 95 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 100 se sustituyen por otro residuo aminoacido.
(8) VH que comprende una secuencia de aminoacidos en la que Ala en la posicion 40 y Val en la posicion 95 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 100 se sustituyen por otro residuo aminoacido.
Entre los ejemplos de la secuencia de aminoacidos pueden incluirse una secuencia de aminoacidos que se introduce con por lo menos una modificacion seleccionada de la sustitucion de Leu por Met en la posicion 18, la sustitucion de Ser por Thr en la posicion 30, la sustitucion de Val por Ile en la posicion 37, la sustitucion de Ala por Pro en la posicion 40, la sustitucion de Pro por Ala en la posicion 41, la sustitucion de Gly por Ala en la posicion 44, la sustitucion de Leu por Pro en la posicion 45, la sustitucion de Val por Leu en la posicion 48, la sustitucion de Asp por Asn en la posicion 76 y la sustitucion de Val por Thr en la posicion 95 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 100.
Entre los ejemplos espedficos de la secuencia de aminoacidos de VH en la que se han introducido 10 modificaciones pueden incluirse una secuencia de aminoacidos que se introduce con la sustitucion de Leu por Met en la posicion 18, la sustitucion de Ser por Thr en la posicion 30, la sustitucion de Val por Ile en la posicion 37, la sustitucion de Ala por Pro en la posicion 40, la sustitucion de Pro por Ala en la posicion 41, la sustitucion de Gly por Ala en la posicion 44, la sustitucion de Leu por Pro en la posicion 45, la sustitucion de Val por Leu en la posicion 48, la sustitucion de Asp por Asn en la posicion 76 y la sustitucion de Val por Thr en la posicion 95 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 100.
Entre los ejemplos espedficos de la secuencia de aminoacidos de VH en la que se han introducido 9 modificaciones pueden incluirse las secuencias de aminoacidos de (1) a (10) a continuacion.
(1) Una secuencia de aminoacidos que se introduce con la sustitucion Leu por Met en la posicion 18, la sustitucion de Ser por Thr en la posicion 30, la sustitucion de Val por Ile en la posicion 37, la sustitucion de Ala por Pro en la posicion 40, la sustitucion de Pro por Ala en la posicion 41, la sustitucion de Gly por Ala en la posicion 44, la sustitucion de Leu por Pro en la posicion 45, la sustitucion de Val por Leu en la posicion 48 y la sustitucion de Asp por Asn en la posicion 76 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 100.
(2) Una secuencia de aminoacidos que se introduce con la sustitucion Leu por Met en la posicion 18, la sustitucion de Ser por Thr en la posicion 30, la sustitucion de Val por Ile en la posicion 37, la sustitucion de Ala por Pro en la posicion 40, la sustitucion de Pro por Ala en la posicion 41, la sustitucion de Gly por Ala en la posicion 44, la sustitucion de Leu por Pro en la posicion 45, la sustitucion de Val por Leu en la posicion 48 y la sustitucion de Val por Thr en la posicion 95 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 100.
(3) Una secuencia de aminoacidos que se introduce con la sustitucion Leu por Met en la posicion 18, la sustitucion de Ser por Thr en la posicion 30, la sustitucion de Val por Ile en la posicion 37, la sustitucion de Ala por Pro en la posicion 40, la sustitucion de Pro por Ala en la posicion 41, la sustitucion de Gly por Ala en la posicion 44, la sustitucion de Leu por Pro en la posicion 45, la sustitucion de Asp por Asn en la posicion 76 y la sustitucion de Val por Thr en la posicion 95 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n°
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(4) Una secuencia de aminoacidos que se introduce con la sustitucion Leu por Met en la posicion 18, la sustitucion de Ser por Thr en la posicion 30, la sustitucion de Val por Ile en la posicion 37, la sustitucion de Ala por Pro en la posicion 40, la sustitucion de Pro por Ala en la posicion 41, la sustitucion de Gly por Ala en la posicion 44, la sustitucion de Val por Leu en la posicion 48, la sustitucion de Asp por Asn en la posicion 76 y la sustitucion de Val por Thr en la posicion 95 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 100.
(5) Una secuencia de aminoacidos que se introduce con la sustitucion Leu por Met en la posicion 18, la sustitucion de Ser por Thr en la posicion 30, la sustitucion de Val por Ile en la posicion 37, la sustitucion de Ala por Pro en la posicion 40, la sustitucion de Pro por Ala en la posicion 41, la sustitucion de Leu por Pro en la posicion 45, la sustitucion de Val por Leu en la posicion 48, la sustitucion de Asp por Asn en la posicion 76 y la sustitucion de Val por Thr en la posicion 95 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 100.
(6) Una secuencia de aminoacidos que se introduce con la sustitucion Leu por Met en la posicion 18, la sustitucion de Ser por Thr en la posicion 30, la sustitucion de Val por Ile en la posicion 37, la sustitucion de Ala por Pro en la posicion 40, la sustitucion de Gly por Ala en la posicion 44, la sustitucion de Leu por Pro en la posicion 45, la sustitucion de Val por Leu en la posicion 48, la sustitucion de Asp por Asn en la posicion 76 y la sustitucion de Val por Thr en la posicion 95 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 100.
(7) Una secuencia de aminoacidos que se introduce con la sustitucion Leu por Met en la posicion 18, la sustitucion de Ser por Thr en la posicion 30, la sustitucion de Val por Ile en la posicion 37, la sustitucion de Pro por Ala en la posicion 41, la sustitucion de Gly por Ala en la posicion 44, la sustitucion de Leu por Pro en la posicion 45, la sustitucion de Val por Leu en la posicion 48, la sustitucion de Asp por Asn en la posicion 76 y la sustitucion de Val por Thr en la posicion 95 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 100.
(8) Una secuencia de aminoacidos que se introduce con la sustitucion Leu por Met en la posicion 18, la sustitucion de Ser por Thr en la posicion 30, la sustitucion de Ala por Pro en la posicion 40, la sustitucion de Pro por Ala en la posicion 41, la sustitucion de Gly por Ala en la posicion 44, la sustitucion de Leu por Pro en la posicion 45, la sustitucion de Val por Leu en la posicion 48, la sustitucion de Asp por Asn en la posicion 76 y la sustitucion de Val por Thr en la posicion 95 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 100.
(9) Una secuencia de aminoacidos que se introduce con la sustitucion Leu por Met en la posicion 18, la sustitucion de Val por Ile en la posicion 37, la sustitucion de Ala por Pro en la posicion 40, la sustitucion de Pro por Ala en la posicion 41, la sustitucion de Gly por Ala en la posicion 44, la sustitucion de Leu por Pro en la posicion 45, la sustitucion de Val por Leu en la posicion 48, la sustitucion de Asp por Asn en la posicion 76 y la sustitucion de Val por Thr en la posicion 95 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 100.
(10) Una secuencia de aminoacidos que se introduce con la sustitucion Leu por Met en la posicion 30, la sustitucion de Val por Ile en la posicion 37, la sustitucion de Ala por Pro en la posicion 40, la sustitucion de Pro por Ala en la posicion 41, la sustitucion de Gly por Ala en la posicion 44, la sustitucion de Leu por Pro en la posicion 45, la sustitucion de Val por Leu en la posicion 48, la sustitucion de Asp por Asn en la posicion 76 y la sustitucion de Val por Thr en la posicion 95 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 100.
Entre los ejemplos espedficos de la secuencia de aminoacidos de VH en la que se han introducido 8 modificaciones pueden incluirse las secuencias de aminoacidos de (1) a (11) a continuacion.
(1) Una secuencia de aminoacidos que se introduce con la sustitucion de Val por Ile en la posicion 37, la sustitucion de Ala por Pro en la posicion 40, la sustitucion de Pro por Ala en la posicion 41, la sustitucion de Gly por Ala en la posicion 44, la sustitucion de Leu por Pro en la posicion 45, la sustitucion de Val por Leu en la posicion 48, la sustitucion de Asp por Asn en la posicion 76 y la sustitucion de Val por Thr en la posicion 95 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 100.
(2) Una secuencia de aminoacidos que se introduce con la sustitucion de Leu por Met en la posicion 18, la sustitucion de Ser por Thr en la posicion 30, la sustitucion de Vale por Ile en la posicion 37, la sustitucion de Gly por Ala en la posicion 44, la sustitucion de Leu por Pro en la posicion 45, la sustitucion de Val por Leu en la posicion 48, la sustitucion de Asp por Asn en la posicion 76 y la sustitucion de Val por Thr en la posicion 95 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 100.
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(3) Una secuencia de aminoacidos que se introduce con la sustitucion de Leu por Met en la posicion 18, la sustitucion de Ser por Thr en la posicion 30, la sustitucion de Vale por Ile en la posicion 37, la sustitucion de Pro por Ala en la posicion 41, la sustitucion de Leu por Pro en la posicion 45, la sustitucion de Val por Leu en la posicion 48, la sustitucion de Asp por Asn en la posicion 76 y la sustitucion de Val por Thr en la posicion 95 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 100.
(4) Una secuencia de aminoacidos que se introduce con la sustitucion de Leu por Met en la posicion 18, la sustitucion de Ser por Thr en la posicion 30, la sustitucion de Vale por Ile en la posicion 37, la sustitucion de Pro por Ala en la posicion 41, la sustitucion de Gly por Ala en la posicion 44, la sustitucion de Leu por Pro en la posicion 45, la sustitucion de Val por Leu en la posicion 48 y la sustitucion de Val por Thr en la posicion 95 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 100.
(5) Una secuencia de aminoacidos que se introduce con la sustitucion de Leu por Met en la posicion 18, la sustitucion de Ser por Thr en la posicion 30, la sustitucion de Vale por Ile en la posicion 37, la sustitucion de Pro por Ala en la posicion 41, la sustitucion de Gly por Ala en la posicion 44, la sustitucion de Leu por Pro en la posicion 45, la sustitucion de Val por Leu en la posicion 48 y la sustitucion de Asp por Asn en la posicion 76 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 100.
(6) Una secuencia de aminoacidos que se introduce con la sustitucion de Leu por Met en la posicion 18, la sustitucion de Ser por Thr en la posicion 30, la sustitucion de Vale por Ile en la posicion 37, la sustitucion de Ala por Pro en la posicion 40, la sustitucion de Leu por Pro en la posicion 45, la sustitucion de Val por Leu en la posicion 48, la sustitucion de Asp por Asn en la posicion 76 y la sustitucion de Val por Thr en la posicion 95 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 100.
(7) Una secuencia de aminoacidos que se introduce con la sustitucion de Leu por Met en la posicion 18, la sustitucion de Ser por Thr en la posicion 30, la sustitucion de Val por Ile en la posicion 37, la sustitucion de Ala por Pro en la posicion 40, la sustitucion de Gly por Ala en la posicion 44, la sustitucion de Leu por Pro en la posicion 45, la sustitucion de Val por Leu en la posicion 48 y la sustitucion de Val por Thr en la posicion 95 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 100.
(8) Una secuencia de aminoacidos que se introduce con la sustitucion de Leu por Met en la posicion 18, la sustitucion de Ser por Thr en la posicion 30, la sustitucion de Val por Ile en la posicion 37, la sustitucion de Ala por Pro en la posicion 40, la sustitucion de Gly por Ala en la posicion 44, la sustitucion de Leu por Pro en la posicion 45, la sustitucion de Val por Leu en la posicion 48 y la sustitucion de Asp por Asn en la posicion 76 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 100.
(9) Una secuencia de aminoacidos que se introduce con la sustitucion de Leu por Met en la posicion 18, la sustitucion de Ser por Thr en la posicion 30, la sustitucion de Val por Ile en la posicion 37, la sustitucion de Ala por Pro en la posicion 40, la sustitucion de Pro por Ala en la posicion 41, la sustitucion de Leu por Pro en la posicion 45, la sustitucion de Val por Leu en la posicion 48 y la sustitucion de Val por Thr en la posicion 95 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 100.
(10) Una secuencia de aminoacidos que se introduce con la sustitucion de Leu por Met en la posicion 18, la sustitucion de Ser por Thr en la posicion 30, la sustitucion de Val por Ile en la posicion 37, la sustitucion de Ala por Pro en la posicion 40, la sustitucion de Pro por Ala en la posicion 41, la sustitucion de Leu por Pro en la posicion 45, la sustitucion de Val por Leu en la posicion 48 y la sustitucion de Asp por Asn en la posicion 76 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 100.
(11) Una secuencia de aminoacidos que se introduce con la sustitucion de Leu por Met en la posicion 18, la sustitucion de Ser por Thr en la posicion 30, la sustitucion de Val por Ile en la posicion 37, la sustitucion de Ala por Pro en la posicion 40, la sustitucion de Pro por Ala en la posicion 41, la sustitucion de Gly por Ala en la posicion 44, la sustitucion de Leu por Pro en la posicion 45 y la sustitucion de Val por Leu en la posicion 48 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 100.
Entre los ejemplos espedficos de la secuencia de aminoacidos de VH en la que se han introducido 7 modificaciones pueden incluirse las secuencias de aminoacidos de (1) a (5) a continuacion.
(1) Una secuencia de aminoacidos que se introduce con la sustitucion de Ser por Thr en la posicion 30, la sustitucion de Ala por Pro en la posicion 40, la sustitucion de Gly por Ala en la posicion 44, la sustitucion de Leu por Pro en la posicion 45, la sustitucion de Val por Leu en la posicion 48, la sustitucion de Asp por Asn en la posicion 76 y la sustitucion de Val por Thr en la posicion 95 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 100.
(2) Una secuencia de aminoacidos que se introduce con la sustitucion de Ala por Pro en la posicion 40, la sustitucion de Pro por Ala en la posicion 41, la sustitucion de Gly por Ala en la posicion 44, la sustitucion de Leu por Pro en la posicion 45, la sustitucion de Val por Leu en la posicion 48, la sustitucion de Asp por
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Asn en la posicion 76 y la sustitucion de Val por Thr en la posicion 95 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 100.
(3) Una secuencia de aminoacidos que se introduce con la sustitucion de Val por Ile en la posicion 37, la sustitucion de Ala por Pro en la posicion 40, la sustitucion de Pro por Ala en la posicion 41, la sustitucion de Leu por Pro en la posicion 45, la sustitucion de Val por Leu en la posicion 48, la sustitucion de Asp por Asn en la posicion 76 y la sustitucion de Val por Thr en la posicion 95 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 100.
(4) Una secuencia de aminoacidos que se introduce con la sustitucion de Val por Ile en la posicion 37, la sustitucion de Ala por Pro en la posicion 40, la sustitucion de Pro por Ala en la posicion 41, la sustitucion de Gly por ala en la posicion 44, la sustitucion de Leu por Pro en la posicion 45, la sustitucion de Val por Leu en la posicion 48 y la sustitucion de Val por Thr en la posicion 95 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 100.
(5) Una secuencia de aminoacidos que se introduce con la sustitucion de Val por Ile en la posicion 37, la sustitucion de Ala por Pro en la posicion 40, la sustitucion de Pro por Ala en la posicion 41, la sustitucion de Gly por ala en la posicion 44, la sustitucion de Leu por Pro en la posicion 45, la sustitucion de Val por Leu en la posicion 48 y la sustitucion de Asp por Asn en la posicion 76 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 100.
Entre los ejemplos espedficos de la secuencia de aminoacidos de VH en la que se han introducido 6 modificaciones pueden incluirse las secuencias de aminoacidos de (1) a (6) a continuacion.
(1) Una secuencia de aminoacidos que se introduce con la sustitucion de Val por Ile en la posicion 37, la sustitucion de Ala por Pro en la posicion 40, la sustitucion de Pro por Ala en la posicion 41, la sustitucion de Leu por Pro en la posicion 45, la sustitucion de Val por Leu en la posicion 48 y la sustitucion de Val por Thr en la posicion 95 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 100.
(2) Una secuencia de aminoacidos que se introduce con la sustitucion de Ala por Pro en la posicion 40, la sustitucion de Pro por Ala en la posicion 41, la sustitucion de Leu por Pro en la posicion 45, la sustitucion de Val por Leu en la posicion 48, la sustitucion de Asp por Asn en la posicion 76 y la sustitucion de Val por Thr en la posicion 95 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 100.
(3) Una secuencia de aminoacidos que se introduce con la sustitucion de Ala por Pro en la posicion 40, la sustitucion de Pro por Ala en la posicion 41, la sustitucion de Leu por Pro en la posicion 45, la sustitucion de Val por Leu en la posicion 48, la sustitucion de Asp por Asn en la posicion 76 y la sustitucion de Val por Thr en la posicion 95 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 100.
(4) Una secuencia de aminoacidos que se introduce con la sustitucion de Val por Ile en la posicion 37, la sustitucion de Pro por Ala en la posicion 40, la sustitucion de Leu por Pro en la posicion 45, la sustitucion de Val por Leu en la posicion 48, la sustitucion de Asp por Asn en la posicion 76 y la sustitucion de Val por Thr en la posicion 95 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 100.
(5) Una secuencia de aminoacidos que se introduce con la sustitucion de Val por Ile en la posicion 37, la sustitucion de Ala por Pro en la posicion 40, la sustitucion de Pro por Ala en la posicion 41, la sustitucion de Leu por Pro en la posicion 45, la sustitucion de Val por Leu en la posicion 48 y la sustitucion de Val por Thr en la posicion 95 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 100.
(6) Una secuencia de aminoacidos que se introduce con la sustitucion de Val por Ile en la posicion 37, la sustitucion de Ala por Pro en la posicion 40, la sustitucion de Pro por Ala en la posicion 41, la sustitucion de Gly por Ala en la posicion 44, la sustitucion de Leu por Pro en la posicion 45 y la sustitucion de Val por Leu en la posicion 48 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 100.
Entre los ejemplos espedficos de la secuencia de aminoacidos de VH en la que se han introducido 5 modificaciones pueden incluirse las secuencias de aminoacidos de (1) a (6) a continuacion.
(1) Una secuencia de aminoacidos que se introduce con la sustitucion de Val por Ile en la posicion 37, la sustitucion de Ala por Pro en la posicion 40, la sustitucion de Pro por Ala en la posicion 41, la sustitucion de Leu por Pro en la posicion 45 y la sustitucion de Val por Leu en la posicion 48 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 100.
(2) Una secuencia de aminoacidos que se introduce con la sustitucion de Ala por Pro en la posicion 40, la sustitucion de Pro por Ala en la posicion 41, la sustitucion de Leu por Pro en la posicion 45, la sustitucion de Val por Leu en la posicion 48 y la sustitucion de Val por Thr en la posicion 95 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 100.
(3) Una secuencia de aminoacidos que se introduce con la sustitucion de Val por Ile en la posicion 37, la
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sustitucion de Pro por Ala en la posicion 41, la sustitucion de Leu por Pro en la posicion 45, la sustitucion de Val por Leu en la posicion 48 y la sustitucion de Val por Thr en la posicion 95 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 100.
(4) Una secuencia de aminoacidos que se introduce con la sustitucion de Val por Ile en la posicion 37, la sustitucion de Ala por Pro en la posicion 40, la sustitucion de Leu por Pro en la posicion 45, la sustitucion de Val por Leu en la posicion 48 y la sustitucion de Val por Thr en la posicion 95 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 100.
(5) Una secuencia de aminoacidos que se introduce con la sustitucion de Val por Ile en la posicion 37, la sustitucion de Ala por Pro en la posicion 40, la sustitucion de Pro por Ala en la posicion 41, la sustitucion de Val por Leu en la posicion 48 y la sustitucion de Val por Thr en la posicion 95 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 100.
(6) Una secuencia de aminoacidos que se introduce con la sustitucion de Val por Ile en la posicion 37, la sustitucion de Ala por Pro en la posicion 40, la sustitucion de Pro por Ala en la posicion 41, la sustitucion de Leu por Pro en la posicion 45 y la sustitucion de Val por Leu en la posicion 95 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 100.
Entre los ejemplos espedficos de la secuencia de aminoacidos de VH en la que se han introducido 4 modificaciones pueden incluirse las secuencias de aminoacidos de (1) a (7) a continuacion.
(1) Una secuencia de aminoacidos que se introduce con la sustitucion de Ala por Pro en la posicion 40, la sustitucion de Pro por Ala en la posicion 41, la sustitucion de Leu por Pro en la posicion 45 y la sustitucion de Val por Thr en la posicion 95 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 100.
(2) Una secuencia de aminoacidos que se introduce con la sustitucion de Pro por Ala en la posicion 41, la sustitucion de Leu por Pro en la posicion 45, la sustitucion de Val por Leu en la posicion 48 y la sustitucion de Val por Thr en la posicion 95 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 100.
(3) Una secuencia de aminoacidos que se introduce con la sustitucion de Ala por Pro en la posicion 40, la sustitucion de Pro por Ala en la posicion 41, la sustitucion de Leu por Pro en la posicion 45 y la sustitucion de Val por Thr en la posicion 95 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 100.
(4) Una secuencia de aminoacidos que se introduce con la sustitucion de Val por Ile en la posicion 37, la
sustitucion de Pro por Ala en la posicion 41, la sustitucion de Leu por Pro en la posicion 45 y la sustitucion
de Val por Thr en la posicion 95 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 100.
(5) Una secuencia de aminoacidos que se introduce con la sustitucion de Val por Ile en la posicion 37, la
sustitucion de Ala por Pro en la posicion 40, la sustitucion de Leu por Pro en la posicion 45 y la sustitucion
de Val por Thr en la posicion 95 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 100.
(6) Una secuencia de aminoacidos que se introduce con la sustitucion de Val por Ile en la posicion 37, la
sustitucion de Ala por Pro en la posicion 40, la sustitucion de Pro por Ala en la posicion 41 y la sustitucion
de Val por Thr en la posicion 95 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 100.
(7) Una secuencia de aminoacidos que se introduce con la sustitucion de Val por Ile en la posicion 37, la sustitucion de Ala por Pro en la posicion 40, la sustitucion de Pro por Ala en la posicion 41 y la sustitucion de Leu por Pro en la posicion 45 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 100.
Entre los ejemplos espedficos de la secuencia de aminoacidos de VH en la que se han introducido 3 modificaciones pueden incluirse las secuencias de aminoacidos de (1) a (6) a continuacion.
(1) Una secuencia de aminoacidos que se introduce con la sustitucion de Pro por Ala en la posicion 41, la sustitucion de Leu por Pro en la posicion 45, la sustitucion de Val por Thr en la posicion 95 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 100.

(2) Una secuencia de aminoacidos que se introduce con la sustitucion de Val por Ile en la posicion 37, la

sustitucion de Leu por Pro en la posicion 45 y la sustitucion de Val por Thr en la posicion 95 en la
secuencia de aminoacidos SEC ID n° 100.

(3) Una secuencia de aminoacidos que se introduce con la sustitucion de Val por Pro en la posicion 40, la

sustitucion de Leu por Pro en la posicion 45 y la sustitucion de Val por Thr en la posicion 95 en la
secuencia de aminoacidos SEC ID n° 100.
(4) Una secuencia de aminoacidos que se introduce con la sustitucion de Pro por Ala en la posicion 41, la
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sustitucion de Leu por Pro en la posicion 45, la sustitucion de Val por Thr en la posicion 95 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 100.

(5) Una secuencia de aminoacidos que se introduce con la sustitucion de Gly por Ala en la posicion 44, la

sustitucion de Leu por Pro en la posicion 45, la sustitucion de Val por Thr en la posicion 95 en la
secuencia de aminoacidos SEC ID n° 100.

(6) Una secuencia de aminoacidos que se introduce con la sustitucion de Leu por Pro en la posicion 45, la

sustitucion de Val por Leu en la posicion 48 y la sustitucion de Val por Thr en la posicion 95 en la
secuencia de aminoacidos SEC ID n° 100.
Entre los ejemplos espedficos de la secuencia de aminoacidos de VH en la que se han introducido 2 modificaciones pueden incluirse las secuencias de aminoacidos de (1) a (9) a continuacion.
(1) Una secuencia de aminoacidos que se introduce con la sustitucion de Leu por Met en la posicion 45 y la sustitucion de Val por Thr en la posicion 95 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 100.
(2) Una secuencia de aminoacidos que se introduce con la sustitucion de Ser por Thr en la posicion 30 y la sustitucion de Val por Thr en la posicion 95 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 100.
(3) Una secuencia de aminoacidos que se introduce con la sustitucion de Val por Ile en la posicion 37 y la sustitucion de Val por Thr en la posicion 95 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 100.
(4) Una secuencia de aminoacidos que se introduce con la sustitucion de Ala por Pro en la posicion 40 y la sustitucion de Val por Thr en la posicion 95 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 100.
(5) Una secuencia de aminoacidos que se introduce con la sustitucion de Pro por Ala en la posicion 41 y la sustitucion de Val por Thr en la posicion 95 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 100.
(6) Una secuencia de aminoacidos que se introduce con la sustitucion de Gly por Ala en la posicion 44 y la sustitucion de Val por Thr en la posicion 95 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 100.
(7) Una secuencia de aminoacidos que se introduce con la sustitucion de Leu por Pro en la posicion 45 y la sustitucion de Val por Thr en la posicion 95 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 100.
(8) Una secuencia de aminoacidos que se introduce con la sustitucion de Val por Ile en la posicion 48 y la sustitucion de Val por Thr en la posicion 95 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 100.
(9) Una secuencia de aminoacidos que se introduce con la sustitucion de Asp por Asn en la posicion 76 y la sustitucion de Val por Thr en la posicion 95 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 100.
Entre los ejemplos espedficos de la secuencia de aminoacidos de VH en la que se ha introducido 1 modificacion pueden incluirse las secuencias de aminoacidos de (1) a (10) a continuacion.
(1) Una secuencia de aminoacidos que se introduce con la sustitucion de Leu por Met en la posicion 18 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 100.
(2) Una secuencia de aminoacidos que se introduce con la sustitucion de Ser por Thr en la posicion 30 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 100.
(3) Una secuencia de aminoacidos que se introduce con la sustitucion de Val por Ile en la posicion 37 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 100.
(4) Una secuencia de aminoacidos que se introduce con la sustitucion de Val por Ile en la posicion 40 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 100.
(5) Una secuencia de aminoacidos que se introduce con la sustitucion de Pro por Ala en la posicion 41 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 100.
(6) Una secuencia de aminoacidos que se introduce con la sustitucion de Gly por Ala en la posicion 44 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 100.
(7) Una secuencia de aminoacidos que se introduce con la sustitucion de Leu por Pro en la posicion 45 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 100.
(8) Una secuencia de aminoacidos que se introduce con la sustitucion de Val por Ile en la posicion 48 en la
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secuencia de aminoacidos SEC ID n° 100.
(9) Una secuencia de aminoacidos que se introduce con la sustitucion de Asp por Asn en la posicion 76 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 100.
(10) Una secuencia de aminoacidos que se introduce con la sustitucion de Val por Thr en la posicion 95 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 100.
Ademas, VL incluido en el anticuerpo humanizado de la presente invencion preferentemente es (1) a (4) a continuacion.
(1) VL que comprende una secuencia de aminoacidos en la que Val en la posicion 15, Ala en la posicion 43, Lys en la posicion 45, Phe en la posicion 71, Thr en la posicion 85 y Tyr en la posicion 87 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 101 se sustituyen por otros residuos aminoacidos.
(2) VL que comprende una secuencia de aminoacidos en la que Val en la posicion 15, Lys en la posicion 45, Phe en la posicion 71 y Tyr en la posicion 87 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 101 se sustituyen por otros residuos aminoacidos.
(3) VL que comprende una secuencia de aminoacidos en la que Val en la posicion 15, Phe en la posicion 71 y Tyr en la posicion 87 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 101 se sustituyen por otros residuos aminoacidos.
(4) VL que comprende una secuencia de aminoacidos en la que Lys en la posicion 45 y Phe en la posicion 71 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 101 se sustituyen por otros residuos aminoacidos.
Entre los ejemplos de la secuencia de aminoacidos de VL pueden incluirse una secuencia de aminoacidos en la que se ha introducido por lo menos una modificacion seleccionada de la sustitucion de Val por Leu en la posicion 15, la sustitucion de Ala por Ser en la posicion 43, la sustitucion de Lys por Gln en la posicion 45, la sustitucion de Phe por Tyr en la posicion 71, la sustitucion de Thr por Gly en la posicion 85 y la sustitucion de Tyr por Phe en la posicion 87 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 101.
Entre los ejemplos de la secuencia de aminoacidos de VL en los que se han introducido 6 modificaciones pueden incluirse una secuencia de aminoacidos en la que se ha introducido una modificacion de Val por Leu en la posicion 15, la sustitucion de Ala por Ser en la posicion 43, la sustitucion de Lys por Gln en la posicion 45, la sustitucion de Phe por Tyr en la posicion 71, la sustitucion de Thr por Gly en la posicion 85 y la sustitucion de Tyr por Phe en la posicion 87 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 101.
Entre los ejemplos espedficos de la secuencia de aminoacidos de VL en la que se han introducido 5 modificaciones pueden incluirse las secuencias de aminoacidos de (1) a (6) a continuacion.
(1) Una secuencia de aminoacidos en la que se ha introducido la sustitucion de Ala por Ser en la posicion 43,

la sustitucion de Lys por Gln en la posicion 45, la sustitucion de Phe por Tyr en la posicion 71, la

sustitucion de Thr por Gly en la posicion 85 y la sustitucion de Tyr por Phe en la posicion 87 en la
secuencia de aminoacidos SEC ID n° 101.
(2) Una secuencia de aminoacidos en la que se ha introducido la sustitucion de Val por Leu en la posicion 15,

la sustitucion de Lys por Gln en la posicion 45, la sustitucion de Phe por Tyr en la posicion 71, la

sustitucion de Thr por Gly en la posicion 85 y la sustitucion de Tyr por Phe en la posicion 87 en la
secuencia de aminoacidos SEC ID n° 101.
(3) Una secuencia de aminoacidos en la que se ha introducido la sustitucion de Val por Leu en la posicion 15,

la sustitucion de Ala por Ser en la posicion 43, la sustitucion de Phe por Tyr en la posicion 71, la

sustitucion de Thr por Gly en la posicion 85 y la sustitucion de Tyr por Phe en la posicion 87 en la
secuencia de aminoacidos SEC ID n° 101.
(4) Una secuencia de aminoacidos en la que se ha introducido la sustitucion de Val por Leu en la posicion 15,

la sustitucion de Ala por Ser en la posicion 43, la sustitucion de Lys por Gln en la posicion 45, la

sustitucion de Thr por Gly en la posicion 85 y la sustitucion de Tyr por Phe en la posicion 87 en la
secuencia de aminoacidos SEC ID n° 101.
(5) Una secuencia de aminoacidos en la que se ha introducido la sustitucion de Val por Leu en la posicion 15,

la sustitucion de Ala por Ser en la posicion 43, la sustitucion de Lys por Gln en la posicion 45, la

sustitucion de Phe por Tyr en la posicion 71 y la sustitucion de Tyr por Phe en la posicion 87 en la
secuencia de aminoacidos SEC ID n° 101.
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(6) Una secuencia de aminoacidos en la que se ha introducido la sustitucion de Val por Leu en la posicion 15, la sustitucion de Ala por Ser en la posicion 43, la sustitucion de Lys por Gln en la posicion 45, la sustitucion de Phe por Tyr en la posicion 71 y la sustitucion de Tyr por Gly en la posicion 85 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 101.
Entre los ejemplos espedficos de la secuencia de aminoacidos de VL en la que se han introducido 4 modificaciones pueden incluirse las secuencias de aminoacidos de (1) a (6) a continuacion.
(1) Una secuencia de aminoacidos en la que se ha introducido la sustitucion de Val por Leu en la posicion 15, la sustitucion de Lys por Gln en la posicion 43, la sustitucion de Phe por Tyr en la posicion 71 y la sustitucion de Tyr por Phe en la posicion 87 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 101.
(2) Una secuencia de aminoacidos en la que se ha introducido la sustitucion de Lys por Gln en la posicion 15, la sustitucion de Phe por Tyr en la posicion 71, la sustitucion de Thr por Gly en la posicion 85 y la sustitucion de Tyr por Phe en la posicion 87 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 101.
(3) Una secuencia de aminoacidos en la que se ha introducido la sustitucion de Val por Leu en la posicion 15, la sustitucion de Phe por Tyr en la posicion 71, la sustitucion de Thr por Gly en la posicion 85 y la sustitucion de Tyr por Phe en la posicion 87 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 101.
(4) Una secuencia de aminoacidos en la que se ha introducido la sustitucion de Val por Leu en la posicion 15, la sustitucion de Lys por Gln en la posicion 45, la sustitucion de Thr por Gly en la posicion 85 y la sustitucion de Tyr por Phe en la posicion 87 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 101.
(5) Una secuencia de aminoacidos en la que se ha introducido la sustitucion de Val por Leu en la posicion 15, la sustitucion de Lys por Gln en la posicion 43, la sustitucion de Phe por Tyr en la posicion 71 y la sustitucion de Tyr por Phe en la posicion 87 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 101.
(6) Una secuencia de aminoacidos en la que se ha introducido la sustitucion de Val por Leu en la posicion 15, la sustitucion de Lys por Gln en la posicion 45, la sustitucion de Phe por Tyr en la posicion 71 y la sustitucion de Thr por Gly en la posicion 85 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 101.
Entre los ejemplos espedficos de la secuencia de aminoacidos de VL en la que se han introducido 3 modificaciones pueden incluirse las secuencias de aminoacidos de (1) a (4) a continuacion.
(1) Una secuencia de aminoacidos que se introduce con la sustitucion de Val por Ile en la posicion 15, la sustitucion de Phe por Tyr en la posicion 71 y la sustitucion de Tyr por Phe en la posicion 87 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 101.
(2) Una secuencia de aminoacidos que se introduce con la sustitucion de Lys por Gln en la posicion 45, la
sustitucion de Phe por Tyr en la posicion 71 y la sustitucion de Tyr por Phe en la posicion 87 en la
secuencia de aminoacidos SEC ID n° 101.
(3) Una secuencia de aminoacidos que se introduce con la sustitucion de Val por Ile en la posicion 15, la sustitucion de Lys por Gln en la posicion 45 y la sustitucion de Tyr por Phe en la posicion 87 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 101.
(4) Una secuencia de aminoacidos que se introduce con la sustitucion de Val por Ile en la posicion 15, la
sustitucion de Lys por Gln en la posicion 45 y la sustitucion de Phe por Tyr en la posicion 71 en la
secuencia de aminoacidos SEC ID n° 101.
Entre los ejemplos espedficos de la secuencia de aminoacidos de VL en la que se han introducido 2 modificaciones pueden incluirse las secuencias de aminoacidos de (1) a (9) a continuacion.
(1) Una secuencia de aminoacidos que se introduce con la sustitucion de Lys por Gln en la posicion 45 y la sustitucion de Phe porTyr en la posicion 71 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 101.
(2) Una secuencia de aminoacidos que se introduce con la sustitucion de Val por Ile en la posicion 15 y la sustitucion de Phe por Tyr en la posicion 71 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 101.
(3) Una secuencia de aminoacidos que se introduce con la sustitucion de Val por Ser en la posicion 43 y la sustitucion de Phe por Tyr en la posicion 71 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 101.
(4) Una secuencia de aminoacidos que se introduce con la sustitucion de Phe por Tyr en la posicion 71 y la sustitucion de Thr por Gly en la posicion 85 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 101.
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(5) Una secuencia de aminoacidos que se introduce con la sustitucion de Phe por Tyr en la posicion 71 y la sustitucion de Tyr por Phe en la posicion 87 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 101.
(6) Una secuencia de aminoacidos que se introduce con la sustitucion de Val por Ile en la posicion 15 y la sustitucion de Lys por Gln en la posicion 45 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 101.
(7) Una secuencia de aminoacidos que se introduce con la sustitucion de Ala por Ser en la posicion 43 y la sustitucion de Lys por Gln en la posicion 45 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 101.
(8) Una secuencia de aminoacidos que se introduce con la sustitucion de Lys por Gln en la posicion 45 y la sustitucion de Thr por Gly en la posicion 85 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 101.
(9) Una secuencia de aminoacidos que se introduce con la sustitucion de Lys por Gln en la posicion 45 y la sustitucion de Tyr por Phe en la posicion 87 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 101.
Entre los ejemplos espedficos de la secuencia de aminoacidos de VL en la que se ha introducido 1 modificacion puede incluirse la secuencia de aminoacidos de (1) a (6) a continuacion.
(1) Una secuencia de aminoacidos que se introduce con la sustitucion de Val por Ile en la posicion 15 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 101.
(2) Una secuencia de aminoacidos que se introduce con la sustitucion de Ala por Ser en la posicion 43 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 101.
(3) Una secuencia de aminoacidos que se introduce con la sustitucion de Lys por Gln en la posicion 45 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 101.
(4) Una secuencia de aminoacidos que se introduce con la sustitucion de Phe por Tyr en la posicion 71 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 101.
(5) Una secuencia de aminoacidos que se introduce con la sustitucion de Thr por Gly en la posicion 85 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 101.
(6) Una secuencia de aminoacidos que se introduce con la sustitucion de Tyr por Phe en la posicion 87 en la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 101.
Ademas, entre los ejemplos espedficos del anticuerpo humanizado de la presente invencion pueden incluirse un anticuerpo humanizado que comprende VH de la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 98 y una VL que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 94, un anticuerpo humanizado que comprende VH de la secuencia de aminoacidos de SEC ID n° 98 y/o VL de cualquiera de las secuencias de aminoacidos mostradas en la fig. 2, un anticuerpo humanizado que comprende VH de cualquiera de las secuencias de aminoacidos mostrada en la fig. 1 y/o VL que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 94 o similares.
Ademas, el anticuerpo humanizado de la presente invencion puede incluir un anticuerpo humanizado que compite con el anticuerpo monoclonal de la presente invencion para reconocer y unirse espedficamente a la secuencia de aminoacidos de FOLR1 humano o a la estructura conformacional del mismo, y se une a un epttopo que es identico al epttopo en FOLR1 humano al que se une el anticuerpo monoclonal.
El anticuerpo humano es originalmente un anticuerpo presente naturalmente en el cuerpo humano e incluye ademas un anticuerpo obtenido de una biblioteca de fagos de anticuerpo humano o un animal transgenico productor de anticuerpos humano, que se prepara basandose en las recientes tecnologfas avanzadas en ingeniena genetica, ingeniena celular e ingeniena del desarrollo.
El anticuerpo presente naturalmente en el cuerpo humano puede obtenerse, por ejemplo, mediante el aislamiento de un linfocito sangumeo periferico humano, la inmortalizacion del linfocito mediante la infeccion con virus EB o similar y despues la clonacion del mismo, cultivando de esta manera linfocitos capaces de producir el anticuerpo y el anticuerpo puede purificarse a partir del sobrenadante del cultivo.
La biblioteca fagica de anticuerpos humanos es una biblioteca en la que se expresan fragmentos de anticuerpos, tales como Fab y scFv, sobre la superficie fagica mediante la insercion de un gen de anticuerpo preparado a partir de una celula B humana en un gen fagico. Un fago que expresa un fragmento de anticuerpo que presenta la actividad de union de antfgeno deseada puede recuperarse a partir de la biblioteca, utilizando su actividad para unirse a un sustrato inmovilizado con antfgeno a modo de mdice. Ademas, el fragmento de anticuerpo puede convertirse ademas en una molecula de anticuerpo humano que comprende dos cadenas H completas y dos cadenas L completas mediante tecnicas de ingeniena genetica.
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Un animal transgenico productor de anticuerpos humanos es un animal en el que se ha introducido un gen de anticuerpo humano en las celulas. Espedficamente, un animal transgenico productor de anticuerpos humanos puede prepararse mediante la introduccion de un gen de anticuerpo humano en una celula ES de raton, injertando la celula ES en un embrion de estadio temprano de raton y seguidamente desarrollandolo. Un anticuerpo humano derivado de un animal transgenico productor de anticuerpos humanos puede prepararse mediante la obtencion de un hibridoma productor de anticuerpos humanos utilizando el metodo de preparacion de hibridoma que es comun para animales no humanos y despues cultivando el hibridoma para producir y acumular el anticuerpo humano en el sobrenadante de cultivo.
Un anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo en el que uno o mas aminoacidos han sido delecionados, anadidos, sustituidos o insertados en la secuencia de aminoacidos que constituye el anticuerpo anteriormente indicado o fragmento de anticuerpo y que presenta una actividad similar al anticuerpo anteriormente indicado o fragmento de anticuerpo tambien se encuentra incluido en el anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo de la presente invencion.
El numero de aminoacidos que se delecionan, anaden, sustituyen y/o insertan es uno o mas, y no se encuentra espedficamente limitado, sino que se encuentra comprendido en el intervalo en el que la delecion, adicion, sustitucion o insercion resulta posible mediante metodos conocidos, tales como la mutagenesis dirigida a sitio [Molecular Cloning, 2a edicion, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Current Protocols in molecular Biology, John Wiley&Sons, 1987-1997), Nucleic Acids Research, 10:6487, 1982), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6409, 1982), Gene 34:315, 1985, Nucleic Acids Research 13:4431, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488, 1985, o similar. Por ejemplo, el numero es preferentemente de 1 a docenas, mas preferentemente de 1 a 20, todavfa mas preferentemente de 1 a 10, y particularmente preferentemente de 1 a 5.
La expresion "uno o mas residuos aminoacidos son delecionados, anadidos, sustituidos y/o insertados" en la secuencia de aminoacidos del anticuerpo anteriormente indicado se refiere a lo siguiente. Es decir, significa que se ha producido una delecion, adicion, sustitucion o insercion de uno o una pluralidad de residuos aminoacidos en la secuencia de aminoacidos del anticuerpo. Ademas, la delecion, adicion, sustitucion o insercion puede producirse simultaneamente y el residuo aminoacido que se deleciona, anade, sustituye o inserta puede ser uno de tipo natural o uno de tipo no natural.
Entre los ejemplos del residuo aminoacido de tipo natural puede incluirse L-alanina, L-asparagina, acido L- aspartico, L-glutamina, acido L-glutamico, glicina, L-histidina, L-isoleucina, L-leucina, L-lisina, L-metionina, L- fenilalanina, L-prolina, L-serina, L-treonina, L-triptofano, L-tirosina, L-valina, L-cistema o similares.
Se muestran a continuacion ejemplos preferidos de residuos aminoacidos mutualmente sustituibles. Los aminoacidos en el mismo grupo son mutuamente sustituibles.
Grupo A: leucina, isoleucina, norleucina, valina, norvalina, alanina, acido 2-aminobutanoico, metionina, O- metilserina, t-butilglicina, t-butilalanina y ciclohexilalanina.
Grupo B: acido aspartico, acido glutamico, acido isoaspartico, acido isoglutamico, acido 2-aminoadfpico y acido 2-aminosuberico.
Grupo C: asparagina y glutamina.
Grupo D: lisina, arginina, ornitina, acido 2,4-diaminobutanoico y acido 2,3-diaminopropionico.
Grupo E: prolina, 3-hidroxiprolina y 4-hidroxiprolina.
Grupo F: serina, treonina y homoserina.
Grupo G: fenilalanina y tirosina.
Entre los fragmentos de anticuerpo de la presente invencion pueden incluirse Fab, F(ab')2, Fab', un anticuerpo de cadena sencilla (scFv), una region V dimerica (diacuerpo), una region V estabilizada por disulfuro (dsFv), un peptido que comprende CDR o similar.
Un Fab es un fragmento de anticuerpo que presenta un peso molecular de aproximadamente 50.000 y que presenta actividad de union a antfgeno, en el que aproximadamente la mitad del lado N-terminal de la cadena H y la cadena L entera se encuentran unidas entre sf mediante un enlace disulfuro entre fragmentos obtenidos mediante el tratamiento de IgG con una proteasa, la papama (cortada en un residuo aminoacido en la posicion 224 de la cadena H).
El Fab de la presente invencion puede obtenerse mediante el tratamiento del anticuerpo monoclonal, que reconoce espedficamente y se une a la secuencia de aminoacidos de FOLR1 humano o la estructura conformacional del mismo, con papama. Ademas, el Fab puede producirse mediante la insercion del ADN codificante de Fab del anticuerpo en un vector de expresion para procariotas o un vector de expresion para eucariotas, y la introduccion del vector en un procariota o eucariota para expresar el Fab.
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Un F(ab')2 es un fragmento con un peso molecular de aproximadamente 100.000 y que presenta actividad de union a antigeno y que incluye dos regiones Fab que se encuentran unidas en la posicion de bisagra obtenida mediante la digestion de la parte inferior de los dos enlaces disulfuro en la region bisagra de IgG con una proteasa, la pepsina.
El F(ab')2 de la presente invencion puede producirse mediante el tratamiento del anticuerpo monoclonal, que reconoce espedficamente y se une a la secuencia de aminoacidos de FOLR1 humano o la estructura conformacional del mismo, con pepsina. Ademas, el F(ab')2 puede producirse mediante la union de Fab' indicado posteriormente mediante un enlace tioeter o un enlace disulfuro.
Un Fab' es un fragmento de anticuerpo con un peso molecular de aproximadamente 50.000 y actividad de union a antigeno, que se obtiene mediante el corte de un enlace disulfuro en la region bisagra de F(ab')2 anteriormente indicado. El Fab' de la presente invencion puede obtenerse mediante tratamiento del F(ab')2, que reconoce y se une espedficamente a la secuencia de aminoacidos de FOLR1 humano de la presente invencion o la estructura conformacional del mismo con un agente reductor, tal como ditiotreitol. Ademas, el Fab' puede producirse mediante la insercion del ADN codificante del fragmento Fab del anticuerpo en un vector de expresion para procariotas o un vector de expresion para eucariotas, y la introduccion del vector en un procariota o eucariota para expresar el Fab'
Un scFv es un polipeptido VH-P-VL o VL-P-VH en el que una cadena VH y una cadena VL se unen utilizando un conector peptfdico apropiado (en adelante denominado "P") y es un fragmento de anticuerpo que presenta actividad de union a antigeno.
El scFv de la presente invencion puede producirse mediante la obtencion de ADNc codificantes de VH y VL del anticuerpo monoclonal de la presente invencion que reconocen y se unen espedficamente a la secuencia de aminoacidos de FOLR1 humano o la estructura conformacional del mismo, la construccion del ADN codificante de scFv, la insercion del ADN en un vector de expresion para procariotas o un vector de expresion para eucariotas, y seguidamente la introduccion del vector de expresion en un procariota o eucariota para expresar el scFv.
Un diacuerpo es un fragmento de anticuerpo en el que scFv se encuentra dimerizado, es un fragmento de anticuerpo que presenta actividad de union a antfgeno divalente. En la actividad de union a antfgeno divalente, los dos antfgenos pueden ser iguales o diferentes.
El diacuerpo de la presente invencion puede producirse mediante la obtencion de ADNc codificantes de VH y VL del anticuerpo monoclonal que reconoce y se une espedficamente a la secuencia de aminoacidos de FOLR1 humano o a la estructura conformacional del mismo, la construccion de ADN codificante de scFv de manera que la longitud de la secuencia de aminoacidos del conector peptfdico sea de 8 o menos residuos, la insercion del ADN en un vector de expresion para procariotas o un vector de expresion para eucariotas, seguido de la introduccion del vector de expresion en un procariota o eucariota para expresar el diacuerpo.
Se obtiene un dsFv mediante la union de polipeptidos en los que un residuo aminoacido de cada uno de VH y VL se sustituye por un residuo de cistema mediante un enlace disulfuro entre los residuos de cistema. El residuo aminoacido que debe sustituirse por un residuo de cistema puede seleccionarse basandose en una estimacion de la estructura conformacional del anticuerpo de acuerdo con metodos conocidos [Protein Engineering 7:697, 1994].
El dSFv de la presente invencion puede producirse mediante la obtencion de ADNc codificantes de VH y VL del anticuerpo monoclonal que reconoce y se une espedficamente a la secuencia de aminoacidos de FOLR1 humano de la presente invencion o la estructura conformacional del mismo, la construccion de ADN codificante de dsFv, la insercion del ADN en un vector de expresion para procariotas o un vector de expresion para eucariotas y seguidamente la introduccion del vector de expresion en un procariota o eucariota para expresar el dsFv.
Un peptido que comprende CDR se constituye mediante la inclusion de una o mas regiones de CDR de VH o VL. Un peptido que comprende una pluralidad de CDR puede conectarse directamente o mediante un conector peptfdico apropiado.
El peptido que comprende CDR de la presente invencion puede producirse mediante la construccion de ADN codificantes de los CDR de VH y VL del anticuerpo monoclonal que reconoce y se une espedficamente a la secuencia de aminoacidos de FOLR1 humano de la presente invencion o la estructura conformacional del mismo, la insercion del ADN en un vector de expresion para procariotas o un vector de expresion para eucariotas y seguidamente la introduccion del vector de expresion en un procariota o eucariota para expresar el peptido. El peptido que comprende CDR tambien puede producirse mediante un metodo de smtesis qmmica, tal como el metodo de Fmoc o el metodo de tBoc.
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El anticuerpo de la presente invencion incluye un derivado de anticuerpo en el que el anticuerpo monoclonal o el fragmento de anticuerpo del mismo que reconoce y se une espedficamente a la secuencia de aminoacidos de FOLR1 humano de la presente invencion o la estructura conformacional del mismo se conjuga qmmica o geneticamente con un isotopo radioactivo, un agente que presenta un peso molecular bajo, un agente con un peso molecular elevado, una protema, un anticuerpo terapeutico o similar.
El derivado de anticuerpo de la presente invencion puede producirse mediante la conjugacion qmmica de un isotopo radioactivo, un agente que presenta un peso molecular bajo, un agente con un peso molecular elevado, un inmunoestimulante, una protema, un anticuerpo terapeutico o similar con el lado N-terminal o el lado C- terminal de una cadena H o una cadena L del anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo, un sustituyente o
cadena lateral apropiada del anticuerpo o fragmento del mismo, una cadena sacarida en el anticuerpo
monoclonal o fragmento del mismo, o similar, que reconoce y se une espedficamente a la secuencia de aminoacidos de FOLR1 humano de la presente invencion o la estructura conformacional del mismo [Kotai Kogaku Nyumon, Chijin Shokan, 1994].
Ademas, puede producirse geneticamente uniendo un ADN codificante del anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo que reconoce y se une espedficamente a la secuencia de aminoacidos de FOLR1 humano de la
presente invencion o a la estructura conformacional del mismo a otro ADN codificante de una protema o un
anticuerpo terapeutico que debe conjugarse, insertar el ADN en un vector de expresion e introducir el vector de expresion en una celula hospedadora apropiada para la expresion.
Entre los ejemplos del isotopo radiactivo pueden incluirse 131I, 125I, 90Y, 64Cu, 99Tc, 77Lu, 211At o similares. El isotopo radiactivo puede conjugarse directamente con el anticuerpo mediante el metodo de cloramina T o similar. Ademas, puede conjugarse con el anticuerpo una sustancia quelante del isotopo radiactivo. El agente quelante puede incluir acido 1-isotiocianatobencil-3-metildietilen-triaminapentaacetico (MX-DTPA) o similar.
Entre los ejemplos del agente con un peso molecular bajo puede incluirse un agente antitumoral, tal como un agente alquilante, un agente nitrosourea, un antagonista del metabolismo, una sustancia antibiotica, un alcaloide vegetal, un inhibidor de topoisomerasa, un agente para la hormonoterapia, un antagonista hormonal, un inhibidor de aromatasa, un inhibidor de glucoprotema P, un derivado de comlejo de platino, un inhibidor de la etapa M y un inhibidor de cinasa [Clinical Oncology, Cancer and a chemotherapy company, 1996], un agente esteroide, tal como hidrocortisona y prednisona, un agente no esteroideo, tal como aspirina o indometacina, un agente inmunorregulador, tal como aurotiomalato o penicilamina, un agente inmunosupresor, tal como ciclofosfamida o azatioprina, un agente antiinflamatorio, tal como un agente antihistairnnico, por ejemplo, maleato de clorfeniramina o clemastina [Inflammation and Anti-inflammation Therapy, Ishiyaku Publishers, Inc., 1982] o similares.
Entre los ejemplos del agente antitumoral pueden incluirse amifostina (etiol), cisplatino, dacarbazina (DTIC), dactinomicina, mecloretamina (mostaza nitrogenada), estreptozocina, ciclofosfamida, ifosfamida, carmustina (BCNU), lomustina (CCNU), doxorrubicina (adriamicina), epirrubicina, gemcitabina (gemzar), daunorrubicina, procarbazina, mitomicina, citarabina, etoposido, metotrexato, 5-fluorouracilo, vinblastina, vincristina, bleomicina, daunomicina, peplomicina, estramustina, paclitaxel (taxol), docetaxel (Taxotea), aldesleucina, asparaginasa, busulfan, carboplatino, oxaliplatino, nedaplatino, cladribina, camptotecina, 10-hidroxi-7-etilcamptotecina (SN38), floxuridina, fludarabina, hidroxiurea, idarrubicina, mesna, irinotecan (CPT-11), nogitecan, mitoxantrona, topotecan, leuprolido, megestrol, melfalan, mercaptopurina, hidroxicarbamida, plicamicina, mitotano, pegaspargasa, pentostatina, pipobroman, tamoxifeno, goserelina, leuprorelina, flutamida, teniposido, testolactona, tioguanina, tiotepa, mostaza uracilo, vinorelbina, clorambucilo, hidrocortisona, prednisolona, metilprednisolona, vindesina, nimustina, semustina, capecitabina, tomudex, azacitidina, UFT, oxaloplatino, gefitinib (Iressa), imatinib (STI571), erlotinib, inhibidor de tirosina cinasa de tipo FMS-3 (Flt3), inhibidor de receptores del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR), inhibidor de receptores del factor de crecimiento fibroblastico (FGFR), inhibidor de receptores de factor de crecimiento epidermico (EGFR), tal como Tarceva o similar, radicicol, 17-alilamino-17-demetoxigeldanamicina, rapamicina, amsacrina, acido todo-trans- retinoico, talidomida, fadrozol, letrozol, exemestano, tiomalato de oro, D-penicilamina, bucilamina, azatioprina, mizoribina, ciclosporina, hidrocortisona, bexaroteno (targretina), dexametasona, progestinas, estrogenos, anastrozol (Arimidex), leupurina, aspirina, indometacina, celecoxib, maleato de clorfeniramina, clorfeniramina, clemastina, tretinoma, arsenico, bortezomib, alopurinol, caliqueamicina, ibritumomab tiuxetan, targretina, ozogamina, claritromicina, leucovorina, ifosfamida, quetoconazol, aminoglutetimida, suramina, maitansinoide o derivados de los mismos.
Entre los metodos para conjugar el agente de bajo peso molecular con el anticuerpo pueden incluirse, por ejemplo, un metodo en el que el agente y los grupos amino del anticuerpo se conjugan mediante glutaraldeddo, un metodo en el que un grupo amino del agente y un grupo carboxilo del anticuerpo se conjugan mediante carbodiimida soluble en agua, o similares.
Entre los ejemplos del agente con un peso molecular elevado pueden incluirse polietilenglicol (en adelante denominado PEG), albumina, dextrano, polioxietileno, copolfmero de estireno-acido maleico, polivinilpirrolidona,
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copoKmero de pirano, hidroxipropilmetacrilamida o similares. Mediante la union de dichos compuestos de alto peso molecular a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, se esperan los efectos siguientes: (1) mejora de la estabilidad frente a diversos factores qmmicos, ffsicos o biologicos, (2) notable prolongacion de la semivida en sangre, (3) desaparicion de la inmunogenicidad, supresion de la produccion de anticuerpos y similares [Bioconjugate Drug, Hirokawa Publishing, 1993]. Por ejemplo, el metodo para conjugar PEG con un anticuerpo incluye un metodo en el que se deja reaccionar un anticuerpo con un reactivo modificador de PEG [Bioconjugate Drug, Hirokawa Publishing, 1993]. El reactivo modificador de PEG incluye un agente modificador del grupo e- amino de la lisina (publicacion de patente japonesa n° S61-178926), un agente modificador de un grupo carboxilo de acido aspartico y acido glutamico (publicacion de patente japonesa n° S56-23587), un agente modificador de un grupo guanidina de arginina (publicacion de patente japonesa n° H2-117920) o similares.
El inmunoestimulador puede ser cualquier producto natural conocido como inmunoadyuvante. Entre los ejemplos espedficos de un agente potenciador de la inmunidad se incluyen p(1^-3)glucano (lentinano, esquizofilano), a- galactosilceramida o similares.
Entre los ejemplos de la protema pueden incluirse una citocina o un factor de crecimiento que activa una celula inmunocompetente, tal como celulas NK, macrofagos o neutrofilos, una protema toxica o similares.
Entre los ejemplos de la citocina o factor de crecimiento pueden incluirse IFNa, IFNp, IFNy, interleucina (en adelante, denominada IL)-2, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, IL-23, factor estimulante de colonias de granulocitos (G- CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos-macrofagos (GM-CSF), factor estimulante de colonias de macrofagos (M-CSF) o similares.
Entre los ejemplos de la protema toxica pueden incluirse la ricina, la toxina difterica, ONTAK o similar e incluye ademas una protema toxica en la que se ha introducido una mutacion en la protema con el fin de controlar la toxicidad.
Entre los ejemplos del anticuerpo terapeutico pueden incluirse un anticuerpo contra un antfgeno con el que se induce apoptosis mediante la union del anticuerpo, un antfgeno que participa en la formacion del estado patologico tumoral, un antfgeno que regula la funcion inmunologica y un antfgeno relacionado con la angiogenesis en la parte patologica.
Entre los ejemplos del antfgeno en el que se induce apoptosis mediante la union del anticuerpo pueden incluirse un agregado de diferenciacion (en adelante denominado CD) 19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD37, CD53, CD72, CD73, CD74, CDw75, CDw76, CD77, CDw78, CD79a, CD79b, CD80(B7.1), CD81, CD82, CD83, CDw84, CD85, CD86(B7.2), antfgeno leucocitario humano (HLA)-Clase II o receptor del factor de crecimiento epidermico (EGFR) o similar.
Entre los ejemplos del antfgeno participante en la formacion del estado patologico tumoral o del antfgeno que regula la funcion inmunologica pueden incluirse CD40, ligando de CD40, molecula de la familia de B7 (CD80, CD86, CD274, B7-DC, B7-H2, B7-H3 o B7-H4), ligando de la molecula de la familia de B7 (CD28, CTLA-4, ICOS, PD-1 o BTLA), OX-40, ligando de OX-40, CD137, molecula de la familia de receptores del factor de necrosis tumoral (TNF) (DR4, DR5, TNFR1 o TNFR2), molecula de la familia de receptores del ligando inductor de apoptosis relacionado con TNF (TRAIL), molecula de receptores de la familia TRAIL de receptores (TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRAIL-R3, o TRAIL-R4), activador receptor del ligando del factor nuclear kappa B (RANK), ligando RANK, CD25, receptor 4 del acido folico, citocina [IL-1a, IL-1p, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13, factor de crecimiento transformante (TGF)p, TNFa, etc.], receptores de dichas citocinas, quimiocina (SLC, ELC, 1-309, TARC, MDC, or CTACK, etc.) y receptores de dichas quimiocinas.
Entre los ejemplos del antfgeno que inhibe la angiogenesis en la parte patologica pueden incluirse el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), la angiopoyetina, el factor de crecimiento fibroblastico (FGF), EGF, el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGf), el factor de crecimiento similar a la insulina (IGF), la eritropoyetina (EPO), TGFp, IL-8, efilina, SDF-1, receptores de los mismos o similares.
Un anticuerpo de fusion con una protema o anticuerpo terapeutico puede producirse mediante la union de un ADNc codificante del anticuerpo monoclonal o fragmento de anticuerpo a un ADNc codificante de la protema, la construccion de un ADN codificante del anticuerpo de fusion, la insercion del ADN en un vector de expresion para procariotas o eucariotas, seguido de la introduccion del vector de expresion en un procariota o eucariota para expresar el anticuerpo de fusion.
En el caso de que el derivado de anticuerpo de la presente invencion se utilice para la deteccion o medicion inmunologica de FOLR1 humano o para el diagnostico de enfermedades asociadas a celulas positivas para FOLR1 humano, puede seleccionarse un marcaje utilizado en un metodo comun de deteccion o medicion inmunologica a modo de agente para la union al lado N-terminal o C-terminal de una cadena H o una cadena L del anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo, un sustituyente o cadena lateral apropiado del anticuerpo o fragmento del mismo, una cadena sacarida en el anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo, o similares, que
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reconoce y se une espedficamente a la secuencia de aminoacidos de FOLR1 humano o estructura conformacional del mismo.
Entre los ejemplos del marcaje pueden incluirse enzimas, tales como la fosfatasa alcalina, la peroxidasa o la luciferasa, materiales luminiscentes tales como el ester de acridinio o la lofina, materiales fluorescentes tales como el isotiocianato de fluorescema (FITC) o el isotiocianato de tetrametil-rodamina (RITC) o similares.
Ademas, la presente invencion se refiere a un agente terapeutico para enfermedades asociadas a celulas positivas para FOLR1, que comprende el anticuerpo monoclonal de la presente invencion o fragmento del mismo a modo de un principio activo.
Las enfermedades asociadas a las celulas positivas para FOLR1 puede ser cualquier enfermedad con la condicion de que se encuentre asociada a las celulas que expresan FOLR1 y, por ejemplo, cancer.
Entre los ejemplos del cancer pueden incluirse cancer hematologico, cancer de mama, cancer uterino, cancer colorrectal, cancer esofagico, cancer de estomago, cancer ovarico, cancer de pulmon, cancer renal, cancer rectal, cancer de tiroides, cancer del cuello uterino, cancer del intestino delgado, cancer de prostata, mesotelioma y cancer pancreatico, y preferentemente, cancer ovarico, cancer renal, cancer de pulmon, cancer de mama, cancer pancreatico o mesotelioma.
El agente terapeutico de la presente invencion comprende el anticuerpo monoclonal anteriormente indicado de la presente invencion o fragmento del mismo, o derivados del mismo, a modo de principio activo.
El agente terapeutico que comprende el anticuerpo de la presente invencion o el fragmento del mismo, o los derivados del mismo puede incluir unicamente el anticuerpo o fragmento del mismo, o derivado del mismo como principio activo. Resulta generalmente preferente que el agente terapeutico se prepare como preparacion farmaceutica producida mediante la mezcla de uno o mas portadores farmaceuticamente aceptables segun un metodo apropiado bien conocido en el campo tecnico de los farmaceuticos.
Resulta preferente utilizar la via que resulte mas eficaz para el tratamiento como via de administracion. Entre los ejemplos del mismo pueden incluirse la administracion oral y la administracion parenteral, tales como la administracion bucal, traqueal, intrarrectal, subcutanea, intramuscular o intravenosa, y preferentemente, la administracion intravenosa.
Entre los ejemplos de la forma de administracion pueden incluirse la pulverizacion, las capsulas, los comprimidos, los polvos, los granulos, el jarabe, la emulsion, el supositorio, la inyeccion, la pomada, la cinta, o similares.
Aunque la dosis clmica o la frecuencia de administracion vana dependiendo del efecto terapeutico objetivo, del metodo de administracion, del periodo de tratamiento, de la edad, del peso corporal y similares, habitualmente es de entre 10 pg/kg y 10 mg/kg al dfa por adulto.
El agente terapeutico de la presente invencion puede utilizarse individualmente o en combinacion con por lo menos uno de los isotopos radiactivos indicado anteriormente que presenta un bajo peso molecular, un peso de alto peso molecular, una protema y un anticuerpo terapeutico. Con respecto al metodo de combinacion del agente terapeutico de la presente invencion con otros agentes terapeuticos, el agente terapeutico que debe utilizarse en combinacion con el agente terapeutico de la presente invencion puede administrarse junto con el agente terapeutico de la presente invencion simultanea o secuencialmente.
Ademas, la presente invencion se refiere a un metodo de deteccion o medicion inmunologica de FOLR1 humano o celulas positivas para FOLR1 humano utilizando el anticuerpo monoclonal de la presente invencion o fragmento del mismo.
En la presente invencion, el metodo de deteccion o medicion inmunologica es un metodo para detectar o medir la cantidad de anticuerpo o la cantidad de antfgeno utilizando un antfgeno o anticuerpo marcado. Entre los ejemplos espedficos del metodo de deteccion o medicion inmunologica de FOLR1 pueden incluirse un metodo de deteccion o medicion de FOLR1 o de celulas positivas para FOLR1 mediante un metodo de inmunoanticuerpo marcado con sustancias radioactivas (RIA), un inmunoensayo enzimatico (EIA o ELIAS), un inmunoensayo fluorescente (FIA), un inmunoensayo luminiscente, transferencia western, un metodo de inmunoprecipitacion, un metodo de tincion de celulas fluorescentes, inmunohistoqmmica, un metodo ffsicoqmmico o similar.
Ademas, la presente invencion se refiere a un metodo ex vivo para diagnosticar enfermedades asociadas a las celulas positivas para FOLR1 humano, incluyendo la deteccion o medicion de celulas positivas para FOLR1 humano utilizando el anticuerpo monoclonal de la presente invencion o fragmento del mismo.
Para la deteccion o medicion de las celulas positivas para FOLR1, pueden utilizarse metodos de deteccion
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inmunologica conocidos indicados anteriormente. Preferentemente se utiliza un metodo de inmunoprecipitacion, un metodo de tincion celular fluorescente, inmunohistoqmmica o similar. Ademas, puede utilizarse un metodo de tincion de anticuerpos fluorescentes utilizando el sistema FMAT 8100 HTS (fabricado por Applied Biosystems) o similar.
En la presente invencion, la muestra de cuerpo vivo que debe utilizarse para detectar o medir celulas positivas para FOLRI no se encuentra particularmente limitada, con la condicion de que existe la posibilidad de que contenga una celula que expresa FOLR1, tal como celulas de tejido, sangre, plasma sangumeo, suero, lfquido pancreatico, orina, materia fecal, lfquido tisular, lfquido de cultivo o similar.
En la presente invencion, entre los ejemplos del metodo para diagnosticar enfermedades asociadas a las celulas positivas para FOLR1 humanas puede incluirse un metodo en el que el numero de celulas positivas para FOLR1 observadas en la muestra corporal viva que debe someterse a deteccion o medicion se utiliza como mdice para diagnosticar enfermedades asociadas a las celulas positivas para FOLR1 humano.
La presente invencion se refiere a un agente diagnostico para enfermedades asociadas a celulas positivas para FOLR1 humano, que comprende el anticuerpo monoclonal de la presente invencion o fragmento del mismo a modo de principio activo.
El agente diagnostico de la presente invencion comprende el anticuerpo monoclonal anteriormente indicado de la presente invencion o fragmento del mismo, o derivados del mismo, a modo de principio activo.
El agente diagnostico de la presente invencion puede incluir un reactivo para llevar a cabo una reaccion de antigeno-anticuerpo o un reactivo para la deteccion de la reaccion, dependiendo del metodo diagnostico deseado. El reactivo para llevar a cabo la reaccion de antigeno-anticuerpo puede incluir un tampon, una sal o similar. El reactivo para la deteccion puede incluir un reactivo utilizado generalmente para el metodo de deteccion o medicion inmunologica, tal como un anticuerpo secundario marcado que reconoce el anticuerpo monoclonal, fragmento del mismo o derivados del mismo o un sustrato correspondiente al marcaje.
A continuacion en la presente memoria, se describe en detalle un metodo para producir el anticuerpo de la presente invencion, un metodo para tratar la enfermedad y un metodo para el diagnostico de la enfermedad de la presente invencion.
1. Metodo de produccion de anticuerpos monoclonales
(1) Preparacion de antigeno
Puede obtenerse FOLR1 o una celula que expresa FOLR1 como antigeno mediante la introduccion de un vector de expresion que comprende ADNc codificante de una longitud completa de FOLR1 o una longitud parcial del mismo en Escherichia coli, una levadura, una celula de insecto, una celula animal o similar. Ademas, puede purificarse FOLR1 y obtenerse a partir de diversas lmeas celulares de cultivo tumoral humano, tejido humano o similar que expresa una gran cantidad de FOLR1. Las celulas tumorales en cultivo, el tejido o similar pueden simplemente utilizarse a modo de antigenos. Ademas, puede prepararse un peptido sintetico que presenta una secuencia parcial de FOLR1 mediante un metodo de smtesis qmmica, tal como un metodo de Fmoc o un metodo de tBoc y utilizarse como antigeno.
FOLR1 utilizado en la presente invencion puede producirse, por ejemplo, mediante la expresion de un ADN codificante de FOLR1 en una celula hospedadora utilizando un metodo descrito en Molecular Cloning, A Laboratory Manual, segunda edicion, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 o Current Protocols in molecular Biology, John Wiley&Sons (1987-1997), o similar siguiendo el metodo siguiente.
En primer lugar, se preparo un vector de expresion mediante la insercion de un ADNc de longitud completa que comprendfa la region codificante de FOLR1 cadena abajo de un promotor de un vector de expresion apropiado. Tambien puede utilizarse un fragmento de ADN con una longitud apropiada que comprende una region codificante del polipeptido que se prepara basandose en el ADNc de longitud completa, en lugar del ADNc de longitud completa anteriormente indicado. A continuacion, puede obtenerse un transformante productor del polipeptido mediante la introduccion del vector de expresion en una celula hospedadora adecuada para el vector de expresion.
Como vector de expresion, puede utilizarse cualquiera, con la condicion de que pueda replicarse autonomamente en la celula hospedadora o pueda integrarse en un cromosoma e incluye ademas un promotor adecuado en una posicion que permita que el ADN codificante del polipeptido pueda transcribirse.
Como celula hospedadora, puede utilizarse cualquiera, con la condicion de que pueda expresar el gen objetivo, tal como un microorganismo perteneciente al genero Escherichia, tal como Escherichia coli, una levadura, una celula de insecto, una celula animal o similar.
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En el caso de que se utilice un procariota, tal como Escherichia coli, como celula hospedadora, resulta preferente utilizar un vector que sea autonomamente replicable en el procariota e incluya un promotor, una secuencia de union ribosomica, el ADN codificante de FOLR1 y una secuencia de terminacion de la transcripcion a modo de vector de expresion. El vector de expresion anteriormente indicado no resulta necesario que presente una secuencia de terminacion de la transcripcion sino que se inserta una secuencia de terminacion de la transcripcion preferentemente en una posicion inmediatamente posterior al gen estructural. El vector de expresion puede incluir ademas un gen regulador del promotor.
A modo del vector de expresion anteriormente indicado, resulta preferente utilizar un plasmido en el que el espacio entre la secuencia de Shine-Dalgarno (tambien denominada secuencia SD), que es la secuencia de union ribosomica y el codon de inicio se ajustan a una distancia apropiada (por ejemplo, 6 a 18 nucleotidos).
Ademas, la secuencia de nucleotidos del ADN codificante de FOLR1 puede sustituirse por otra base de manera que sea un codon adecuado para la expresion en una celula hospedadora, mejorando de esta manera la productividad del FOLR1 deseado.
Puede utilizarse cualquier vector de expresion como el vector de expresion, con la condicion de que pueda funcionar en la celula hospedadora que debe utilizarse. Entre los ejemplos de la misma pueden incluirse pBTrp2, pBTacl, pBTac2 (todos fabricados por Roche Diagnostics), pKK233-2 (fabricado por Pharmacia), pSE280 (fabricado por Invitrogen), pGEMEX-1 (fabricado por Promega), pQE-8 (fabricado por QIAGEN), pKYP10 (publicacion de patente japonesa n° S58-110600), pKYP200 [Agricultural Biological Chemistry 48:669, 1984], pLSAI [Agric. Biol. Chem. 53:277, 1989], pGELI [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:4306, 1985], pBluescript II SK(-) (fabricado por Stratagene), pTrs30 [preparado a partir de Escherichia coli JM109/pTrS30 (FERM BP-5407)], pTrs32 [preparado a partir de Escherichia coli JM109/pTrS32 (FERM BP-5408)], pGHA2 [preparado a partir de Escherichia coli IGHA2 (FERM BP-400), publicacion de patente japonesa n° s6o-221091], pGKA2 [preparado a partir de Escherichia coli IGKA2 (FERM BP6798), publicacion de patente japonesa n° S60-221091], pTerm2 (US4686191, US4939094, US5160735), pSupex, pUB110, pTP5, pC194, pEG400 [J. Bacteriol. 172:2392, 1990], pGEX (fabricado por Pharmacia), sistema pET (fabricado por Novagen), pME18SFL3 o similar.
Puede utilizarse cualquier promotor, con la condicion de que pueda funcionar en la celula hospedadora que debe utilizarse. Entre los ejemplos del mismo pueden incluirse promotores tales como Escherichia coli, fagos o similares, tales como promotor trp (Ptrp), promotor lac, promotor PL, promotor PR, promotor T7 o similar. Ademas, pueden utilizarse promotores disenados y modificados artificialmente, tales como un promotor en tandem en el que se unen dos Ptrp en tandem, un promotor tac, un promotor lacT7, un promotor letI o similar.
Entre los ejemplos de la celula hospedadora puede incluirse Escherichia coli XL1-Blue, Escherichia coli XL2- Blue, Escherichia coli DH1, Escherichia coli MC1000, Escherichia coli KY3276, Escherichia coli W1485, Escherichia coli JM109, Escherichia coli HB101, Escherichia coli No. 49, Escherichia coli W3110, Escherichia coli NY49, Escherichia coli DH5a o similar.
Puede utilizarse cualquier metodo de introduccion del vector de expresion en la celula hospedadora, con la condicion de que sea un metodo para introducir ADN en la celula hospedadora que debe utilizarse, y entre los ejemplos de la misma pueden incluirse un metodo que utiliza iones de calcio [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:2110, 1972), Gene 17:107, 1982; Molecular&General Genetics 168:111, 1979] o similares.
En el caso de que se utilice una celula animal como celula hospedadora, puede utilizarse cualquier vector de expresion, con la condicion de que pueda utilizarse en la celula animal. Entre los ejemplos de ella pueden incluirse pcDNAI, pcDM8 (fabricados por Funakoshi), pAGE107 [publicacion de patente japonesa n° H3-22979; Cytotechnology 3:133, 1990)], pAS3-3 (publicacion de patente japonesa n° H2-227075), pCDM8 [Nature 329:840, 1987)], pcDNAI/Amp (fabricado por Invitrogen), pcDNA3.1 (fabricado por Invitrogen), pREP4 (fabricado por Invitrogen), pAGE103 [J. Biochemistry 101:1307, 1987)], pAGE210, pME18SFL3, pKANTEX93 (documento n° WO 97/10354) o similar.
Puede utilizarse cualquier promotor, con la condicion de que pueda funcionar en una celula animal. Entre los ejemplos del mismo pueden incluirse un gen de promotor temprano inmediato (IE), un gen de citomegalovirus (CMV), un promotor temprano de SV40, un promotor de retrovirus, un promotor metalotionema, un promotor de choque termico, un promotor SRa, un promotor o intensificador de virus de la leucemia murina de Moloney o similar. Ademas, puede utilizarse un intensificador del gen IE del CMV humano junto con el promotor.
Entre los ejemplos de la celula hospedadora puede incluirse una celula de leucemia Namalwa humana, una celula COS de mono, una celula de ovario de hamster chino (CHO) (Journal of Experimental Medicine 108:945, 1958); Proc. Natl. Acad. Sci. USA 60:1275, 1968); Genetics 55:513, 1968); Chromosoma 41:129, 1973); Methods in Cell Science 18:115, 1996); Radiation Research 148:260, 1997); Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216, 1980; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 60:1275, 1968); Cell 6:121, 1975; Molecular Cell Genetics, apendices I e II (paginas 883 a 900), CHO/DG44, CHO-K1 (ATCC n° CCL-61), DUkXB11 (ATCC n° CCL-9096), Pro-5 (ATCC n° CCL-
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1781), CHO-S (Life Technologies, m° de cat. 1 1619), Pro-3, celulas de mieloma de rata
YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20 (tambien denominadas YB2/0), celulas de mieloma de raton NS0, celulas de mieloma de raton SP2/0-Ag14, celulas de hamster sirio BHK o HBT5637 (publicacion de patente japonesa n° S63-000299) o similares.
Puede utilizarse cualquier metodo de introduccion del vector de expresion en las celulas hospedadoras, con la condicion de que sea un metodo para introducir ADN en una celula animal, y entre los ejemplos del mismo pueden incluirse la electroporacion [Cytotechnology 3:133, 1990], un metodo de fosfato de calcio (publicacion de patente japonesa n° H2-227075), un metodo de lipofeccion [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413, 1987, o similares.
Puede producirse FOLR1 mediante el cultivo del transformante derivado de un microorganismo o de una celula animal que presenta un vector de expresion, incluyendo el ADN codificante de FOLR1, en un medio para formar y acumular FOLR1 en el cultivo, y recuperarlo a partir del cultivo. El metodo de cultivo del transformante en el medio puede llevarse a cabo segun el metodo ffpico utilizado en el cultivo de huespedes.
En el caso de que se exprese FOLR1 en una celula derivada de eucariotas, puede obtenerse FOLR1 al que se unen azucares o cadenas de azucares.
En el caso de que se cultive un microorganismo transformado con un vector de expresion que contiene un promotor inducible, puede anadirse un inductor al medio, en caso necesario. Por ejemplo, puede anadirse al medio isopropil-p-D-tiogalactopiranosido o similar al cultivar un microorganismo transformado con un vector de expresion que utiliza el promotor lac. Ademas, puede anadirse acido indolacfflico o similar al medio al cultivar un microorganismo transformado con un vector de expresion utilizando el promotor trp.
Entre los ejemplos de medio para cultivar un transformante obtenido utilizando una celula animal como celula hospedadora pueden incluirse el medio generalmente utilizado RPMI 1640 [The Journal of the American Medical Association 199:519, 1967)], MEM de Eagle [Science 122:501, 1952)], MEM modificado por Dulbecco [Virology 8:396, 1959)] y medio 199 [Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 73:1, 1950], medio de Dulbecco modificado por Iscove (IMDM), medio al que se anade suero fetal bovino (FBS), etc., o similar. El cultivo se lleva a cabo generalmente a un pH de entre 6 y 8 y a una temperatura de entre 30°C y 40°C en presencia de 5% de CO2 durante 1 a 7 dfas. En caso necesario, puede anadirse al medio un antibiotico, tal como canamicina, ampicilina o similar, durante el cultivo.
Con respecto al metodo de expresion del gen codificante de FOLR1, ademas de dirigir la expresion, puede utilizarse la produccion por secrecion o la expresion de una protema de fusion [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, segunda edicion, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989]
El metodo para producir FOLR1 incluye un metodo de expresion intracelular en una celula hospedadora, un metodo de secrecion extracelular a partir de una celula hospedadora, un metodo para producirlo sobre la membrana externa de una celula hospedadora. El metodo apropiado puede seleccionarse modificando la celula hospedadora utilizada y la estructura de FOLR1 producida.
En el caso de que se produzca FOLR1 en una celula hospedadora o sobre la membrana externa de una celula hospedadora, FOLR1 puede ser positivamente secretado extracelularmente segun el metodo de Paulson et al., [J. Biol. Chem. 264:17619, 1989], el metodo de Lowe et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8227, 1989], Genes Develop. 4:1288, 1990], los metodos descritos en la publicacion de patente japonesa n° H5-336963 y documento n° WO 94/23021, o similares.
Ademas, puede incrementarse la cantidad producida de FOLR1 mediante la utilizacion de un sistema de amplificacion genica utilizando un gen de dihidrofolato reductasa (publicacion de patente japonesa n° H2- 227075).
El FOLR1 resultante puede aislarse y purificarse, por ejemplo, de la manera siguiente.
En el caso de que FOLR1 se expresa intracelularmente en un estado disuelto, las celulas despues del cultivo se recuperan mediante centrifugacion, se suspenden en un tampon acuoso y despues se rompen utilizando un ultrasonicador, prensa francesa, homogeneizador Manton Gaulin, molino Dyno-mill o similar con el fin de obtener un extracto libre de celulas.
El extracto libre de celulas se centrifuga para obtener un sobrenadante y puede obtenerse una preparacion purificada a partir del sobrenadante utilizando una tecnologfa general de aislamiento y purificacion de las protemas, es decir, extraccion con solvente, la precipitacion con elevada concentracion salina de sulfato amonico, etc., la desalacion, la precipitacion con un solvente organico, la cromatograffa de intercambio anionico utilizando una resina, tal como dietilaminoetil (DEAE)-sefarosa, DIAION HPA-75 (fabricado por Mitsubishi Chemical), la cromatograffa de intercambio cationico utilizando una resina, tal como S-Sepharose FF (fabricado
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por Pharmacia), la cromatograffa hidrofobica utilizando una resina, tal como butil-sefarosa o fenil-sefarosa, la filtracion en gel utilizando un tamiz molecular, la cromatograffa de afinidad, el cromatoenfoque, la electroforesis, tal como la electroforesis de enfoque isoelectrico o similar, individualmente o en combinacion.
En el caso de que FOLR1 se exprese intracelularmente mediante la formacion de un cuerpo no disuelto, las celulas se recuperan, se rompen y se centrifugan de la misma manera que anteriormente y el cuerpo no disuelto de FOLR1 se recupera en forma de una fraccion de precipitacion. El cuerpo no disuelto recuperado de FOLR1 se solubiliza con un agente desnaturalizante de protemas. El FOLR1 se genera en una estructura conformacional normal mediante la dilucion o dializacion de la solucion solubilizada, obteniendo seguidamente una preparacion purificada del polipeptido anteriormente indicado mediante el mismo metodo de purificacion mediante aislamiento que anteriormente.
Al secretar extracelularmente FOLR1 o derivado, tal como un producto glucosilado, FOLR1 o derivado, tal como un producto glucosilado, puede recuperarse a partir del sobrenadante de cultivo. El cultivo se trata mediante un metodo, tal como la centrifugacion de la misma manera que anteriormente, con el fin de obtener una fraccion soluble, puede obtenerse una preparacion purificada a partir de la fraccion soluble mediante el mismo metodo de purificacion mediante aislamiento que anteriormente.
Ademas, puede producirse FOLR1 utilizado en la presente invencion mediante un metodo de smtesis qmmica, tal como el metodo de Fmoc o el metodo de tBoc. Ademas, puede sintetizarse qmmicamente utilizando un sintetizador de peptidos fabricado por Advanced ChemTech, Perkin-Elmer, Pharmacia, Protein Technology Instrument, Synthecell-Vega, PerSeptive, Shimadzu Corporation o similar.
(2) Inmunicacion de animales y preparacion de celulas productoras de anticuerpos para la fusion
Se inmunizo un raton, rata o hamster de 3 a 20 semanas de edad con el antfgeno preparado en (1), anteriormente, y se recolectaron celulas productoras de anticuerpos a partir del bazo, ganglio linfatico o sangre periferica del animal. Ademas, en el caso de que el incremento de un tftulo de anticuerpos suficiente en el animal anteriormente indicado no se identifique debido a la baja inmunogenicidad, puede utilizarse un raton con desactivacion de FOLR1 como animal que debe inmunizarse.
La inmunizacion se lleva a cabo mediante la administracion del antfgeno en el animal mediante inyeccion subcutanea, intravenosa o intraperitoneal junto con el adyuvante apropiado, por ejemplo adyuvante de Freund completo, la combinacion de gel de hidroxido de aluminio con vacuna pertussis, o similar. En el caso de que el antfgeno sea un peptido parcial, se produce un conjugado con una protema portadora, tal como BSA (albumina de suero bovino), kLh (hemocianina de lapa americana) o similar, que se utiliza como el inmunogeno.
La administracion del antfgeno se lleva a cabo 5 a 10 veces cada semana o cada dos semanas despues de la primera administracion. El 3° a 7° dfa despues de cada administracion, se recoge una muestra de sangre del plexo venoso en el fondo ocular y se somete a ensayo el tftulo de anticuerpos del suero mediante inmunoensayo enzimatico [Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988] o similares. Un animal que muestra un tftulo de anticuerpos suficiente en su suero contra el antfgeno utilizado para la inmunizacion se utiliza como fuente de suministro de las celulas productoras de anticuerpos para la fusion.
Tres a siete dfas despues de la administracion final del antfgeno, se extrae tejido que contiene las celulas productoras de anticuerpos, tal como del bazo, del animal inmunizado, a fin de recolectar las celulas productoras del anticuerpo. Al utilizar las celulas de bazo, se extrae el bazo y se disgrega, seguido de centrifugacion. A continuacion, se obtienen las celulas productoras de anticuerpos para la fusion mediante la eliminacion de los eritrocitos.
(3) Preparacion de celulas de mieloma
Se utiliza una lmea celular establecida que se ha obtenido de ratones a modo de celulas de mieloma. Entre los ejemplos de la misma pueden incluirse la lmea celular de mieloma P3-X63Ag8-U1 (P3-U1) de raton resistente a 8-azaguanina (derivado de BALB/c) [Current Topics in Microbiology and Immunology 18:1, 1978], P3- NSl/lAg41(NS-1) [European J. Immunology 6:511, 1976], SP2/0-Ag14(SP-2) [Nature 276:269, 1978], P3-X63- Ag8653(653) [J. Immunology 123:1548, 1979], P3-X63-Ag8(X63) [Nature 256:495, 1975] o similares.
Las celulas de mieloma se subcultivan en un medio normal [un medio preparado mediante la adicion de glutamina, 2-mercaptoetanol, gentamicina, FBS y 8-azaguanina a medio RPMI-1640] y despues se subcultivan en el medio normal 3 o 4 dfas antes de la fusion celular con el fin de garantizar un numero celular de 2x107 o superior el dfa de la fusion.
(4) Fusion y preparacion de las celulas de hibridoma para producir anticuerpos monoclonales
Las celulas productoras de anticuerpos para la fusion obtenidas mediante (2), anteriormente, y las celulas de
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mieloma obtenidas mediante (3), anteriormente, se lavaron suficientemente con medio esencial mmimo (MEM) o PBS (1,83 g de fosfato disodico, 0,21 g de fosfato de potasio, 7,65 g de cloruro sodico y 1 litro de agua destilada, pH 7,2) y se mezclaron, proporcionando una proporcion de las celulas productoras de anticuerpos:celulas de mieloma para la fusion=5 a l0: 1, seguido de centrifugacion. A continuacion, se descarto el sobrenadante.
El grupo de celulas precipitado se disgrego suficientemente y despues se anadio la mezcla de polietilenglicol- 1000 (PEG-1000), MEM y dimetilsulfoxido bajo agitacion a 37°C. Ademas, se anadio 1 a 2 ml de MEM varias veces cada uno o dos minutos y se anadio MEM, proporcionando una cantidad total de 50 ml. Tras la centrifugacion, se descarto el sobrenadante. Tras disgregar suavemente el grupo de celulas precipitado, las celulas se suspendieron suavemente en medio HAT [un medio preparado mediante la adicion de hipoxantina, timidina y aminopterina al medio normal]. La suspension se cultivo en un incubador con 5% de CO2 durante 7 a 14 dfas a 37°C.
Tras el cultivo, se muestreo una parte del sobrenadante de cultivo y un grupo de celulas que era reactivo con un antfgeno que contema FOLR1 y no era reactivo con un antfgeno que no contema FOLR1 se selecciono mediante un metodo de seleccion de hibridoma, tal como un ensayo de union tal como se indica posteriormente. A continuacion, la clonacion se llevo a cabo dos veces mediante un metodo de dilucion limitante [en primer lugar, se utilizo medio HT (medio HAT del que se ha eliminado la aminopterina) y, en segundo lugar, se utilizo medio normal] y se selecciono un hibridoma que mostraba un tftulo de anticuerpos establemente elevado como hibridoma productor de anticuerpos monoclonales.
(5) Preparacion de anticuerpos monoclonales purificados
Los hibridomas productores de un anticuerpo monoclonal obtenidos mediante (4), anteriormente, se administraron mediante inyeccion intraperitoneal en ratones de 8 a 10 semanas o ratones desnudos tratados con pristano (0,5 ml de 2,6,10,14-tetrametilpentadecano (pristano), administrados intraperitonealmente, seguido de la alimentacion durante 2 semanas). El hibridoma desarrolla tumor ascites en 10 a 21 dfas. Se recogio el lfquido ascftico de los ratones, se centrifugo para eliminar los solidos, se sometio a precipitacon salina con sulfato amonico al 40-50% y despues se precipito con acido capnlico, se paso por una columna de DEAE-sefarosa, una columna de protema A o una columna de filtracion en gel para recoger una fraccion de IgG o IgM como anticuerpo monoclonal purificado.
Ademas, se cultivo un hibridoma productor de anticuerpos monoclonales obtenido mediante (4), anteriormente, en medio RPMI1640 que contema FBS al 10% o similar y el sobrenadante se elimino mediante centrifugacion. Se suspendieron en medio Hybridoma-SFM y se cultivaron durante 3 a 7 dfas. El anticuerpo monoclonal purificado puede obtenerse mediante centrifugacion de la suspension celular obtenida, seguido de la purificacion del sobrenadante resultante con una columna de protema A o una columna de protema G para recolectar las fracciones de IgG. A continuacion, puede anadirse 5% de DIGO GF21 al medio Hybridoma-SFM.
La subclase del anticuerpo puede determinarse utilizando un kit de tipado de subclase mediante inmunoensayo enzimatico. La cantidad de la protema puede determinarse mediante el metodo de Lowry o a partir de la absorbancia a 280 nm.
(6) Seleccion de anticuerpos monoclonales
Se llevo a cabo la seleccion del anticuerpo monoclonal mediante el ensayo de union siguiente, utilizando un inmunoensayo enzimatico y analisis cinetico con Biacore.
(6-A) Ensayo de union
Como antfgeno, se utilizo una celula en la que se habfa introducido un gen, o una protema recombinante obtenida mediante la introduccion de un vector de expresion que comprendfa un ADNc codificante de FOLR1 obtenido en: (1) Escherichia coli, una levadura, una celula de insecto, una celula animal o similar, o un polipeptido o peptido parcial purificado obtenido de un tejido humano. En el caso de que el antfgeno sea un peptido parcial, se prepara un conjugado con una protema portadora, tal como BSA o KLH, y se utiliza.
Tras generar dichos antfgenos en una capa solida mediante dispensacion de los antfgenos en una placa de 96 pocillos, se dispenso una sustancia que debfa someterse a ensayo, tal como suero, un sobrenadante de cultivo de un hibridoma o un anticuerpo monoclonal purificado a modo del anticuerpo primario y se dejo reaccionar. Tras lavar intensamente con PBS o PBS-Tween, se dispenso un anticuerpo antiinmunoglobulina marcado con biotina, un enzima, un material quimioluminiscente, un compuesto de radiacion o similar como anticuerpo secundario y se dejo reaccionar. Tras lavar intensamente con PBS-Tween, la reaccion se llevo a cabo de acuerdo con el marcaje del anticuerpo secundario para seleccionar un anticuerpo monoclonal que reaccionase espedficamente con el inmunogeno.
Ademas, el anticuerpo monoclonal de la presente invencion que compite con el anticuerpo monoclonal anti-
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FOLR1 y se une a FOLR1 puede obtenerse mediante la adicion de un anticuerpo de la invencion al sistema de ensayo de union anteriormente indicado para dejar que reaccione. Es dedr, un anticuerpo monoclonal que compite con el anticuerpo monoclonal obtenido en la union de una secuencia de aminoacidos de FOLR1 o una estructura conformacional del mismo puede obtenerse mediante cribado de un anticuerpo que inhibe la union del anticuerpo monoclonal tras la adicion del anticuerpo de la invencion.
Ademas, puede obtenerse un anticuerpo que se une al mismo epftopo que el epftopo reconocido por el anticuerpo monoclonal de la presente invencion que se une a la secuencia de aminoacidos de FOLR1 o la estructura conformacional del mismo, mediante la identificacion de un epftopo del anticuerpo obtenido mediante el sistema de ensayo de union anteriormente indicado, la preparacion de un peptido sintetico parcial del epftopo o un peptido sintetico que imita la estructura conformacional del epftopo, seguido de la inmunizacion.
(6-B) Analisis cinetico con Biacore
La cinetica entre un antigeno y una sustancia de ensayo se midio utilizando Biacore T100 y despues se analizaron los resultados utilizando el software de analisis que acompana al instrumento. Tras inmovilizar anticuerpo anti-IgG de raton sobre un chip sensor CM5 mediante un metodo de acoplamiento de aminas, se dejo fluir una sustancia de ensayo, tal como un sobrenadante de cultivo de un hibridoma, un anticuerpo monoclonal purificado o similar, para que se uniese a una cantidad apropiada y se dejo fluir ademas un antfgeno a diversas concentraciones conocidas. A continuacion, se midio la asociacion y disociacion. Utilizando los datos obtenidos y el software que acompanaba al instrumento, se llevo a cabo el analisis cinetico utilizando el modelo de union 1:1 para obtener diversos parametros.
Por el contrario, despues de inmovilizar FOLR1 humano sobre el chip sensor, por ejemplo mediante un metodo de acoplamiento de aminas, se dejo que fluyese un anticuerpo monoclonal purificado a diversas concentraciones conocidas seguido de la medicion de la asociacion y disociacion. Utilizando los datos obtenidos y el software que acompanaba al instrumento, se llevo a cabo el analisis cinetico utilizando un modelo de union bivalente para obtener diversos parametros.
2. Preparacion de anticuerpo recombinante
Como ejemplos de preparacion de anticuerpos recombinantes, se muestran a continuacion metodos de produccion de un anticuerpo hnbrido humano y de un anticuerpo injertado con CDR humano.
(1) Construccion de vector para la expresion de anticuerpos recombinantes
Un vector para la expresion de anticuerpos recombinantes es un vector de expresion para celulas animales en el que se han insertado ADN codificantes de cadenas pesadas (CP) y cadenas ligeras (CL) de un anticuerpo humano y puede construirse mediante clonacion de cada uno de los ADN codificantes de CP y CL de un anticuerpo humano en un vector de expresion para celulas animales.
Como region C de un anticuerpo humano, puede utilizarse la CP y CL de cualquier anticuerpo humano. Entre los ejemplos de la misma se incluyen CP de subclase y1 y CL de clase k de un anticuerpo humano o similar. Como ADN codificantes de CP y CL de un anticuerpo humano, generalmente puede utilizarse el ADNc y tambien puede utilizarse un ADN cromosomico compuesto de un exon y un intron.
Como vector de expresion para celulas animales, puede utilizarse cualquier vector de expresion, con la condicion de que pueda insertarse y expresarse en el mismo un gen codificante de la region C de un anticuerpo humano. Entre los ejemplos del mismo pueden incluirse pAGE107 [Cytotechnol.,3:133, 1990], pAGE103 [J. Biochem. 101;1307, 1987], pHSG274 [Gene 27:223, 1984], pKCR [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527, 1981], pSG1bd2-4 [Cytotechnol. 4:173, 1990)], pSE1UK1Sed1-3 [Cytotechnol. 13:79, 1993)] o similar.
Entre los ejemplos de un promotor y un intensificador para la utilizacion en un vector de expresion para celulas animales se incluye un promotor temprano de SV40 [J. Biochem. 101:1307, 1987], un LTR de virus de la leucemia de Moloney de raton [Biochem. Biophys. Res. Commun. 149:960, 1987], un promotor de cadena H de inmunoglobulina [Cell 41:479, 1985], un intensificador [Cell 33:717, 1983] o similares.
Como vector para la expresion de anticuerpos recombinantes, puede utilizarse un tipo de vector para la expresion de anticuerpos recombinantes en el que existen cadenas tanto H como L de anticuerpo en el mismo vector (tipo tandem) [J. Immunol. Methods 167:271, 1994], en terminos de facilidad de construccion de un vector para la expresion de anticuerpos recombinantes, la facilidad de introduccion en celulas animales y el equilibrio entre los niveles de expresion de las cadenas H y L de anticuerpo en las celulas animales y tambien puede utilizarse un tipo en el que las cadenas H y L de anticuerpo existen en vectores separados. Entre los ejemplos del tipo tandem del vector para la expresion de anticuerpos recombinantes se incluyen pKANTEX93 (documento n° WO 97/10354), pEE18 [Hybridoma 17:559, 1998] o similares.
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(2) Adquisicion de ADNc codificante de la region V de anticuerpo derivado de animales no humanos y analisis de la secuencia de aminoacidos
La adquisicion de los ADNc codificantes de VH y VL de un anticuerpo no humano y el analisis de la secuencia de aminoacidos pueden llevarse a cabo de la manera siguiente.
Se extrae ARNm de las celulas de hibridoma productoras de un anticuerpo no humano para sintetizar ADNc. El ADNc sintetizado se clona en un vector, tal como un fago o un plasmido, con el fin de obtener una biblioteca de ADNc.
Cada uno de los fagos recombinantes o plasmidos recombinantes que comprenden ADNc codificantes de VH o VL se afslan a partir de la biblioteca utilizando ADN codificante de la region C o la region V de un anticuerpo de raton a modo de sonda. Se determina la longitud completa de las secuencias de nucleotidos de VH y VL de un anticuerpo de raton de interes sobre el fago recombinante o plasmido recombinante y se deduce la longitud completa de las secuencias de aminoacidos de VH y VL deducidas a partir de las secuencias de nucleotidos, respectivamente.
Entre los ejemplos del animal no humano para preparar una celula de hibridoma que produce un anticuerpo no humano se incluye el raton, la rata, el hamster, el conejo o similar. Puede utilizarse cualquier animal con la condicion de que pueda producirse una celula de hibridoma a partir del mismo.
El ARN total puede prepararse a partir de una celula de hibridoma utilizando un metodo de tiocianato de guanidina-trifluoroacetato de cesio [Methods in Enzymol. 154:3, 1987] o un kit, tal como un kit RNA Easy (fabricado por Qiagen) o similar.
Puede prepararse ARNm a partir de ARN total utilizando un metodo de columna de celulosa de oligo (dT) inmovilizado [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, segunda edicion, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989], un metodo que utiliza un kit, tal como el kit de purificacion de ARNm Oligo-dT30 <Super> (fabricado por Takara Bio) o similares. Ademas, puede prepararse ARNm a partir de celulas de hibridoma utilizando un kit, tal como el kit de aislamiento de ARNm Fast Track (fabricado por Invitrogen), el kit de purificacion de ARNm Quick Prep (fabricado por Pharmacia) o similares.
Entre los ejemplos del metodo para sintetizar ADNc y preparar una biblioteca de ADNc se incluyen metodos conocidos [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, segunda edicion, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), Current Protocols in Molecular Biology, suplemento n° 1, John Wiley & Sons, 1987-1997], un metodo que utiliza un kit, tal como un sistema de plasmidos Super Script Plasmid System para la smtesis de ADNc y la clonacion de plasmidos (fabricado por Invitrogen), un kit de smtesis ZAP-cDNA (fabricado por Stratagene), etc., o similares.
El vector, en el que se inserta ADNc sintetizado utilizando ARNm extrafdo de una celula de hibridoma como molde para preparar una biblioteca de ADNc, puede ser cualquier vector, con la condicion de que pueda insertarse ADNc en el mismo. Entre los ejemplos del mismo se incluyen ZAP ExPress [Strategies 5:58, 1992], pBluescript II SK(+) [Nucleic Acids Research 17:9494, 1989], AZAPII (fabricado por Stratagene), Agt10 y Agt11 [DNA Cloning: A Practical Approach, I, 49, 1985], Lambda BlueMid (fabricado por Clontech), AExCell, pT7T3-18U (fabricado por Pharmacia), pcD2 [Mol. Cell. Biol. 3:280, 1983], pUC18 [Gene 33:103, 1985] o similar.
Puede utilizarse cualquier Escherichia coli para introducir la biblioteca de ADNc construida con un fago o vector plasmido, con la condicion de que la biblioteca de ADNc pueda introducirse, expresarse y mantenerse. Entre los ejemplos del mismo se incluyen XL1-Blue MRF [Strategies 5:81, 1992], C600 [Genetics 39:440, 1954], Y1088 e Y1090 [Science 222: 778, 1983], NM522 [J. Mol. Biol. 166:1, 1983], K802 [J. Mol. Biol. 16:118, 1966], JM105 [Gene 38:275, 1985] o similar.
Puede utilizarse un metodo de hibridacion de colonias o de hibridacion de placas utilizando una sonda marcada con isotopos o marcada fluorescentemente [Molecular Clonina, A Laboratory Manual, segunda edicion, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989] para seleccionar clones de ADNc codificantes de VH o VL de un anticuerpo no humano a partir de la biblioteca de ADNc o similar.
Ademas, el ADNc codificante de VH o VL puede prepararse mediante un metodo de reaccion en cadena de la polimerasa [en adelante denominado PCR Method, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, segunda edicion, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), Current Protocols in Molecular Biology, suplemento n° 1, John Wiley&Sons, 1987-1997] mediante la preparacion de cebadores y la utilizacion de ADNc preparado a partir de ARNm o una biblioteca de ADNc como molde.
La secuencia de nucleotidos del ADNc puede determinarse mediante la digestion del ADNc seleccionado con enzimas de restriccion apropiados o similares, clonandolos en un plasmido, tal como pBluescript SK(-) (fabricado por Stratagene), llevando a cabo un metodo de analisis de secuencias utilizado habitualmente. Por ejemplo, se
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lleva a cabo un metodo de analisis de las secuencias mediante la utilizacion de un analizador automatico de las secuencias de nucleotidos, tal como ABI PRISM3700 (fabricado por PE Biosystems) o secuenciador de ADN A.L.F. (fabricado por Pharmacia) despues de la reaccion, tal como mediante el metodo de dideoxi [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463, 1977].
Si los ADNc obtenidos codifican las secuencias de aminoacidos completas de VH y VL del anticuerpo que comprenden una secuencia de senal secretoria se confirma mediante la estimacion de las secuencias de aminoacidos completas de VH y VL a partir de la secuencia de nucleotidos determinada y comparandolas con las secuencias de aminoacidos completas de VH y VL de anticuerpos conocidos [A.L.F. dNa, US Dept. Health and Human Services, 1991].
Con respecto a las secuencias de aminoacidos completas de VH y VL del anticuerpo que comprende una secuencia de senal secretoria, puede estimarse la longitud de la secuencia de senal secretoria y la secuencia de aminoacidos N-terminal mediante la comparacion de ellas con las secuencias de aminoacidos completas de VH y VL de anticuerpos conocidos [A.L.F. DNA, US Dept. Health and Human Services, 1991], y ademas puede determinarse el subgrupo al que pertenecen. Ademas, puede determinarse la secuencia de aminoacidos de cada CDR de VH y VL mediante la comparacion de ella con las secuencias de aminoacidos de VH y VL de anticuerpos conocidos [A.L.F. DNA Sequencer, US Dept. Health and Human Services, 1991].
Ademas, la novedad de la secuencia de aminoacidos completa de VH y VL puede examinarse llevando a cabo una busqueda de homologfas en cualquier base de datos, por ejemplo SWlSS-PROT, PIR-Protein o similar utilizando las secuencias de aminoacidos completas obtenidas de VH y VL de acuerdo con el metodo de BLAST [J. Mol. Biol. 215:403, 1990] o similar.
(3) Construccion de vector para la expresion de anticuerpos hibridos humanos
Se clono el ADNc codificante de VH y VL de anticuerpo de animal no humano cadena arriba de los genes codificantes de CP o CL del anticuerpo humano del vector para la expresion de anticuerpo recombinante obtenido en (1), anteriormente, construyendo de esta manera un vector para la expresion de un anticuerpo hfbrido humano.
Con el fin de ligar el extremo 3'-terminal del ADNc codificante de VH o VL del anticuerpo de un animal no humano y el extremo 5'-terminal de CH o CL del anticuerpo humano, se diseno cada ADNc de VH y VL y se preparo de manera que una secuencia de nucleotidos de una parte de ligamiento codificase los aminoacidos apropiados y presentase una secuencia de reconocimiento apropiada de un enzima de restriccion.
Los ADNc preparados de VH y VL se clonan respectivamente de manera que cada uno de ellos se expresa en una forma apropiada cadena arriba del gen codificante de CH o CL del anticuerpo humano del vector para la expresion del anticuerpo humano con injertacion del CDR obtenido en (1), anteriormente, a fin de construir un vector para la expresion de anticuerpos hfbridos humanos.
Ademas, se amplifico el ADNc codificante de VH o VL de un anticuerpo de animal no humano mediante PCR utilizando un aDn sintetico con una secuencia de reconocimiento de un enzima de restriccion apropiado en ambos extremos y cada uno de ellos puede clonarse en el vector obtenido en (1), anteriormente para la expresion de anticuerpos recombinantes.
(4) Construccion de ADNc codificante de la region V de anticuerpo injertado con CDR humano
Los ADNc codificantes de VH o VL de un anticuerpo humano injertado con CDR pueden obtenerse de la manera siguiente.
Se seleccionaron las secuencias de aminoacidos de las FR en VH o VL de un anticuerpo humano en el que se se habfan trasplantado las secuencias de aminoacidos de las CDR en VH o VL, respectivamente, de un anticuerpo no humano. Pueden utilizarse cualesquiera secuencias de aminoacidos de FR, con la condicion de que se derivan de un anticuerpo humano.
Entre los ejemplos del mismo se incluyen secuencias de aminoacidos de las FR de anticuerpos humanos registrados en una base de datos, tal como la Protein Data Bank o similar, o secuencias de aminoacidos comunes a subgrupos de FR de anticuerpos humanos [A. L. F. DNA, US Dept. Health and Human Services, 1991] o similares. Con el fin de inhibir la reduccion de la actividad de union del anticuerpo, se seleccionaron secuencias de aminoacidos de FR de alta homologfa (por lo menos 60%) con la secuencia de aminoacidos de FR en VH o VL del anticuerpo original.
A continuacion, se injertaron secuencias de aminoacidos de CDR del anticuerpo original en la secuencia de aminoacidos seleccionada de FR en VH o VL del anticuerpo humano, respectivamente, a fin de disenar cada secuencia de aminoacidos de VH o VL de un anticuerpo humano con injertacion de CDR. Las secuencias de
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aminoacidos disenadas se convirtieron en secuencias de ADN mediante la consideracion de la frecuencia de uso de los codones observada en las secuencias de nucleotidos de los genes de anticuerpos [A. L. F. DNA, US Dept. Health and Human Services (1991)], y se diseno la secuencia de ADN codificante de la secuencia de aminoacidos de VH o VL de un anticuerpo humano con injertacion de CDR.
Basandose en las secuencias de ADN disenadas, se sintetizaron varios ADN sinteticos con una longitud de aproximadamente 100 nucleotidos y se llevo a cabo la PCR utilizandolos. En este caso, resulta preferente el diseno de 6 ADN sinteticos por cada una de las cadenas H y L en vista de la eficiencia de reaccion de la reaccion de PCR y las longitudes de ADN que pueden sintetizarse.
Ademas, el ADN codificante de VH o VL de un anticuerpo humano injertado con CDR puede clonarse facilmente en el vector para la expresion del anticuerpo humano injertado con CDR obtenido en (1) mediante la introduccion de la secuencia de reconocimiento de un enzima de restriccion apropiado en el extremo 5-terminal de los ADN sinteticos existentes en ambos extremos.
Por el contrario, puede llevarse a cabo utilizando un ADN sintetico como ADN individual codificante de cada uno de la cadena H de longitud completa y la cadena L de longitud completa basandose en la secuencia de ADN disenada. Tras la reaccion de PCR, se clono un producto amplificado en un plasmido, tal como pBluescript SK(-) (fabricado por Stratagene) o similar y se determino la secuencia de nucleotidos de acuerdo con un metodo similar al metodo descrito en (2) con el fin de obtener un plasmido con una secuencia de ADN codificante de la secuencia de aminoacidos de VH o VL de un anticuerpo humano injertado con CDR deseado.
(5) Modificacion de la secuencia de aminoacidos de la region V del anticuerpo humano injertado con CDR
En el caso de que se produzca un anticuerpo humano injertado con CDR mediante la simple injertacion de unicamente CDR en VH y VL de un anticuerpo no humano en las FR de VH y VL de un anticuerpo humano, su actividad de union a antigenos es mas baja que la del anticuerpo no humano original [Bio/Technology 9:266, 1991].
En los anticuerpos humanos injertados con CDR, entre las secuencias de aminoacidos de las FR en VH y VL de un anticuerpo humano, un residuo aminoacido que se relaciona directamente con la union a un antigeno, un residuo aminoacido que interactua con un residuo aminoacido en la CDR y un residuo aminoacido que mantiene la estructura conformacional de un anticuerpo y se relaciona indirectamente con la union a un antfgeno se identifican y se sustituyen por residuos aminoacidos del anticuerpo no humano original, incrementando de esta manera la actividad de union a antfgenos que se ha reducido.
Con el fin de identificar los residuos aminoacidos relacionados con la actividad de union a antfgeno en la FR, puede construirse la estructura conformacional de un anticuerpo y analizarse mediante cristalograffa de rayos X [j. Mol. Biol. 112:535, 1977], modelado por ordenador [Protein Engineering 7:1501, 1994] o similar. Ademas, puede obtenerse un anticuerpo humano injertado con CDR modificado que presenta suficiente actividad de union al antfgeno mediante diversos esfuerzos, tales como la produccion de varios anticuerpos modificados de cada anticuerpo y el examen de las correlaciones con sus actividades de union a antfgeno.
La modificacion del residuo aminoacido de FR en VH y VL de un anticuerpo humano puede llevarse a cabo utilizando un ADN sintetico para la modificacion segun la PCR tal como se indica en (4). Con respecto al producto amplificado obtenido mediante PCR, se determina la secuencia de nucleotidos de acuerdo con el metodo descrito en (2) de manera que se examina si la modificacion deseada ha sido llevada a cabo.
(6) Construccion de vector para la expresion de anticuerpo humano injertado con CDR
Puede construirse un vector para la expresion de anticuerpo humano injertado con CDR mediante la clonacion de cada ADNc codificante de VH o VL de un anticuerpo recombinante construido, cadena arriba de cada gen codificante de CH o CL del anticuerpo humano en el vector para la expresion de un anticuerpo recombinante obtenido en (1).
Por ejemplo, se introducen secuencias de reconocimiento de un enzima de restriccion apropiado en el extremo 5'-terminal de ADN sinteticos situados en ambos extremos de los ADN sinteticos utilizados en la construccion de VH o VL del anticuerpo humano injertado con CDR obtenido en (4) y (5) y la clonacion puede llevarse a cabo de manera que se expresan en una forma apropiada cadena arriba de cada gen codificante de CH o CL del anticuerpo humano en el vector para la expresion de un anticuerpo humano injertado con CDR tal como se obtiene en (1).
(7) Expresion transitoria de anticuerpo recombinante
Los anticuerpos recombinantes pueden expresarse transitoriamente utilizando el vector para la expresion de anticuerpos recombinantes obtenido en (3) y (6) o el vector de expresion modificado del mismo de manera que
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se evalua eficientemente la actividad de union a antfgenos de diversos anticuerpos humanos injertados con CDR preparados.
Puede utilizarse cualquier celula como celula hospedadora en la que se introduce un vector de expresion con la condicion de que la celula hospedadora pueda expresar un anticuerpo recombinante. Por ejemplo, se utiliza una celula COS-7 (ATCC n° CRL1651) [Methods in Nucleic Acids Res., CRC Press, 283, 1991]. La introduccion del vector de expresion en las celulas COS-7 se lleva a cabo mediante la utilizacion de un metodo de DEAE- dextrano [Methods in Nucleic Acids Res., CRC Press, 1991], un metodo de lipofeccion [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413, 1987], o similares.
Tras la introduccion del vector de expresion, el nivel de expresion y la actividad de union a antigeno del anticuerpo recombinante en el sobrenadante de cultivo pueden determinarse mediante inmunoensayo enzimatico [Monoclonal Antibodies-Principles and Practice, tercera edicion, Academic Press, 1996; Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; Monoclonal Antibody Experiment Manual, Kodansha Scientific, 1987] o similares.
(8) Adquisicion de transformante que expresa establemente anticuerpos recombinantes y preparacion del anticuerpo recombinante
Puede obtenerse un transformante que expresa establemente un anticuerpo recombinante mediante la introduccion del vector para la expresion del anticuerpo recombinante obtenido en (3) y (6) en una celula hospedadora apropiada.
La introduccion del vector de expresion en una celula hospedadora se lleva a cabo mediante electroporacion [publicacion de patente japonesa n° H2-257891, Cytotechnology 3:133, 1990] o similar.
Como celula hospedadora en la que se introduce un vector para la expresion de anticuerpo recombinante, puede utilizarse cualquier celula con la condicion de que sea una celula hospedadora que pueda expresar el anticuerpo recombinante. Entre los ejemplos de la misma se incluyen CHO-K1 (ATCC n° CCL-61), DukXB11 (ATCC n° CCL-9096), Pro-5 (ATCC n° CCL-1781), CHO-S (Life Technologies, n° de cat. 11619), celula de mieloma de rata n° YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20 (tambien denominada YB2/0), celula de mieloma de raton NSO, celula de mieloma de raton SP2/0-Ag14 (ATCC n° CRL1581), celula P3-*63-Ag8653 de raton (ATCC n° CRL1580), celula CHO en la que un gen de dihidrofolato reductasa es defectuoso [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77:4216, 1980], Lec13 con resistencia adquirida a lectina [Somatic Cell and Molecular genetics 12:55, 1986], celula CHO en la que el gen de a1,6-fucosiltransferasa es defectuoso (documento n° WO 2005/035586, documento n° WO 02/31140), celula YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20 de rata (ATCC n° CRL1662), o similares.
Tambien resulta posible utilizar celulas hospedadoras en las que las celulas hospedadoras en las que una protema, tal como un enzima que participa en la smtesis del azucar-nucleotido intracelular GDP-fucosa, una protema tal como un enzima que participa en la modificacion de una cadena sacarida en la que la posicion 1 de la fucosa esta unida a la posicion 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante enlace a en la cadena sacarida compleja unida mediante N-glucosido o una protema que participa en el transporte de un azucar-nucleotido intracelular GDP-fucosa al cuerpo de Golgi muestra una actividad reducida o es deficiente, por ejemplo una celula CHO con desactivacion del gen de a1,6-fucosatransferasa (documentos n° WO 2005/035586 y n° WO 02/31140) o similar.
Tras la introduccion del vector de expresion, se seleccionan transformantes que expresan establemente un anticuerpo recombinante mediante el cultivo de los mismos en un medio para el cultivo de celulas animales que contiene un agente, tal como sulfato de G418 o similar (publicacion de patente japonesa n° H2-257891).
Entre los ejemplos del medio para el cultivo de celulas animales se incluyen el medio RPMI1640 (fabricado por Invitrogen), el medio GIT (fabricado por Nihon Pharmaceutical), el medio EX-CELL301 (fabricado por JRH), el medio IMDM (fabricado por Invitrogen), el medio Hybridoma-SFM (fabricado por Invitrogen), y medios obtenidos mediante la adicion de diversos aditivos, tales como FBS, a dichos medios, o similares.
El anticuerpo recombinante se produce y se acumula en un sobrenadante de cultivo mediante el cultivo de los transformantes obtenidos en un medio. El nivel de expresion y actividad de union a antfgeno del anticuerpo recombinante en el sobrenadante de cultivo puede medirse mediante ELISA o similar. Ademas, en el transformante, puede incrementarse el nivel de expresion del anticuerpo recombinante mediante la utilizacion del sistema de amplificacion de DHFR (publicacion de patente japonesa n° H2-257891) o similares.
El anticuerpo recombinante se purifica a partir del sobrenadante de cultivo del transformante mediante la utilizacion de una columna de protema A [Monoclonal Antibodies-Principles and Practice, tercera edicion, Academic Press, 1996), Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory,1988]. Ademas, puede utilizarse en combinacion metodos de purificacion de protemas, tales como la filtracion en gel, la cromatograffa de intercambio ionico o la ultrafiltracion.
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La cadena Ho la cadena L del anticuerpo recombinante purificado o el peso molecular de la molecula de anticuerpo globalmente puede determinarse mediante electroforesis en gel de poliacrilamida Nature 227:680, 1970], transferencia western [Monoclonal Antibodies-Principles and Practice, tercera edicion, Academic Press, 1996; Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988], o similar.
3. Evaluacion de la actividad de anticuerpo monoclonal purificado o fragmento del mismo
Las actividades del anticuerpo monoclonal purificado de la presente invencion o fragmento del mismo pueden evaluarse de la manera siguiente.
Se evaluo la actividad de union de la lmea celular expresante de FOLR1 mediante el ensayo de union descrito anteriormente en 1. (6-a) y un metodo de resonancia del plasmon superficial utilizando el sistema Biacore descrito en (6-b) anteriormente. Ademas, puede medirse mediante tecnologfa de anticuerpos fluorescentes [Cancer Immunol. Immunother. 36:373, 1993] o similar.
La actividad CDC o ADCC contra la lmea celular en cultivo positiva para antigeno se midio utilizando metodos de medicion conocidos [Cancer Immunol. Immunother. 36:3731933, 1933].
4. Metodo de regulacion de la actividad efectora del anticuerpo
Entre los ejemplos de los metodos de regulacion de la actividad efectora del anticuerpo monoclonal anti-FOLR1 de la presente invencion se incluyen un metodo de regulacion de la cantidad de fucosa (tambien denominada fucosa nuclear) que forma un enlace a1,6 con N-acetilglucosamina (GlcNAc) presente en un extremo reductor de una cadena sacarida unida mediante N de tipo complejo unida a asparagina (Asn) en la posicion 297 de la region Fc del anticuerpo (documentos n° WO 2005/035586, n° WO 2002/31140 y n° WO 00/61739), un metodo de modificacion residuos aminoacidos en la region Fc del anticuerpo, o similar. La actividad efectora del anticuerpo monoclonal anti-FOLR1 de la presente invencion puede regularse mediante la utilizacion de cualquiera de dichos metodos.
La "actividad efectora" se refiere a una actividad dependiente de anticuerpos inducida mediante la region Fc del anticuerpo. La actividad ADCC, actividad CDC, actividad ADP (fagocitosis dependiente de anticuerpos) causada por un fagocito, tal como un macrofago o una celula dendntica, o similar, es conocida.
Como metodo de medicion de la actividad efectora, por ejemplo las celulas de cancer como diana, las celulas mononucleares de sangre periferica humana (PBMC) como efector y los anticuerpos espedficos de celulas de cancer, se mezclan y tras 4 h de incubacion, puede determinarse la citotoxicidad celular mediante la medicion de la liberacion de lactato deshidrogenasa (LDH) a modo de mdice. Por el contrario, se mezclaron las PBMC humanas con, por ejemplo, un anticuerpo que reconoce un antfgeno espedfico de celula hematologica, tal como CD20, y tras la incubacion, puede determinarse la actividad efectora mediante la medicion de la liberacion de LDH o mediante citometna de flujo para el numero reducido de celulas. Por el contrario, se mezclo lfquido asdtico canceroso con anticuerpos espedficos de celulas de cancer, y tras la incubacion, puede determinarse la actividad efectora mediante la medicion de la liberacion de LDH o mediante citometna de flujo para el numero reducido de celulas.
La actividad efectora de un anticuerpo puede incrementarse o reducirse mediante la regulacion del contenido de fucosa nuclear en la cadena sacarida unida a N de tipo complejo de Fc del anticuerpo. Como metodo para reducir el contenido de la union de la fucosa a la cadena sacarida unida mediante N de tipo complejo a Fc del anticuerpo, se expresa el anticuerpo utilizando una celula CHO deficiente en gen de a1,6-fucosatransferasa, de manera que puede obtenerse un anticuerpo al que no se ha unido fucosa. El anticuerpo al que no se ha unido fucosa presenta una actividad ADCC mas elevada.
Por otra parte, como metodo para incrementar la cantidad de union de fucosa a la cadena sacarida unida a N de tipo complejo unida a Fc de un anticuerpo, se expresa un anticuerpo utilizando una celula hospedadora en la que se ha introducido el gen de a1,6-fucosatransferasa, de manera que puede obtenerse un anticuerpo al que se ha unido fucosa. La actividad ADCC dele anticuerpo al que se ha unido fucosa es inferior a la del anticuerpo al que no se ha unido fucosa.
Ademas, la actividad ADCC o la actividad CDC pueden incrementarse o reducirse mediante la modificacion de los residuos aminoacidos de la region Fc del anticuerpo. Por ejemplo, la actividad CDC de un anticuerpo puede incrementarse utilizando la secuencia de aminoacidos de la region Fc dada a conocer en la memoria de la solicitud publicada de patente US n° 2007/0148165.
Ademas, la actividad ADCC o la actividad CDC tambien puede incrementarse o reducirse llevando a cabo modificaciones de aminoacidos descritas en las memorias de las patentes US n° 6.737.056, n° 7.297.775 o n° 7.317.091.
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Ademas, resulta posible obtener un anticuerpo del que se ha regulado la actividad efectora mediante la aplicacion de los metodos anteriormente indicados en combinacion con un anticuerpo.
5. Metodo para el tratamiento de una enfermedad utilizando un anticuerpo monoclonal anti-FOLR1 o fragmento de anticuerpo de la presente invencion
El anticuerpo monoclonal o el fragmento del mismo de la presente invencion pueden utilizarse para tratar enfermedades asociadas a las celulas positivas para FOLR1.
El agente terapeutico que comprende el anticuerpo monoclonal de la presente invencion o el fragmento del mismo o el derivado del mismo puede incluir unicamente el anticuerpo o el fragmento del mismo o el derivado del mismo a modo de principio activo y generalmente se suministra en forma de una preparacion farmaceutica producida mediante la mezcla de la misma con uno o mas portadores farmaceuticamente aceptables de acuerdo con un metodo bien conocido en el campo tecnico de la farmaceutica.
Entre los ejemplos de via de administracion pueden incluirse la administracion oral y la administracion parenteral, tales como la administracion bucal, traqueal, intrarrectal, subcutanea, intramuscular, intravenosa o intraperitoneal. Entre los ejemplos de la forma de administracion pueden incluirse pulverizacion, las capsulas, los comprimidos, los polvos, los granulos, el jarabe, la emulsion, el supositorio, la inyeccion, la pomada, la cinta, o similares.
Entre los ejemplos de la preparacion farmaceutica adecuados para la administracion oral se incluyen emulsiones, pulverizaciones, capsulas, comprimidos, polvos, granulos o similares.
Se producen preparaciones lfquidas, tales como emulsiones y jarabes, utilizando, a modo de aditivos, agua, azucares tales como sacarosa, sorbitol o fructosa, glicoles tales como polietilenglicol o propilenglicol, aceites tales como aceite de sesamo, aceite de oliva o aceite de soja, antisepticos tales como p-hidroxibenzoato, saborizantes tales como saborizante de fresa o de menta-piperita, o similares.
Se producen capsulas, comprimidos, polvos, granulos o similares utilizando, como aditivos, excipientes tales como lactosa, glucosa, sacarosa o manitol, agentes desintegrantes tales como almidon o alginato sodico, lubricantes tales como estearato de magnesio o talco, ligantes tales como alcohol polivimlico, hidroxipropilcelulosa o gelatina, surfactantes tales como ester de acido graso, plastificadores tales como la glicerina, o similares.
Entre los ejemplos de la preparacion farmaceutica adecuados para la administracion parenteral pueden incluirse inyecciones, supositorios, pulverizaciones o similares.
Las inyecciones se preparan utilizando un portador, tal como una solucion salina, una solucion de glucosa, una mezcla de ambas. Pueden prepararse supositorios utilizando un portador, tal como manteca de cacao, grasa hidrogenada, acido carboxflico o similares.
Las pulverizaciones se preparan utilizando un portador que no estimula la membrana mucosa bucal o de las vfas respiratorias del paciente y puede facilitar la absorcion del anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo mediante la dispersion del mismo como partfculas finas. Entre los ejemplos del portador se incluyen lactosa, glicerina o similares. Ademas, puede prepararse en forma de aerosoles o polvos secos.
Ademas, los componentes ejemplificados como aditivos para las preparaciones adecuadas para las administraciones orales tambien pueden anadirse a las preparaciones parenterales.
6. Metodo para el diagnostico de enfermedades utilizando anticuerpo monoclonal anti-FOLR1 o fragmento de anticuerpo de la presente invencion
Una enfermedad relacionada con FOLR1 puede diagnosticarse mediante la deteccion o determinacion de FOLR1 o una celula que expresa FOLR1 utilizando el anticuerpo monoclonal o fragmento de anticuerpo de la presente invencion.
Puede llevarse a cabo un diagnostico de cancer, una de las enfermedades relacionadas con FOLR1, mediante, por ejemplo, la deteccion o medicion de FOLR1 de la manera siguiente.
El diagnostico puede llevarse a cabo mediante la deteccion de FOLR1 expresado en celulas de cancer del sitio primario del cancer, sitio metastasico o lfquido ascftico canceroso de un paciente utilizando un metodo inmunologico, tal como la citometna de flujo o similar.
Un metodo inmunologico es un metodo en el que se detecta o se determina una cantidad de anticuerpo o de
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antigeno utilizando un antigeno o anticuerpo marcado. Entre los ejemplos del mismo se incluyen el metodo de inmunoanticuerpos marcados con una sustancia radiactiva, el inmunoensayo enzimatico, el inmunoensayo fluorescente, el inmunoensayo luminiscente, la transferencia western, medios ffsicoqmmicos o similares.
Entre los ejemplos del metodo de inmunoanticuerpos marcados con una sustancia radiactiva se incluye un metodo en el que el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la presente invencion se deja reaccionar con un antigeno o una celula que expresa un antigeno o similar, despues el anticuerpo antiinmunoglobulina se somete a marcaje radioactivo o se deja que un fragmento de union del mismo reaccione con el, seguido de la determinacion utilizando un contador de centelleo o similar.
Entre los ejemplos del inmunoensayo enzimatico se incluyen un metodo en el que el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la presente invencion se deja reaccionar con un antigeno o una celula que expresa un antigeno o similar, y despues un anticuerpo antiinmunoglobulina o un fragmento de union del mismo se somete a marcaje del anticuerpo y se deja reaccionar con el mismo y el pigmento de color se mide con un espectrofotometro y, por ejemplo, puede utilizarse un ELISA de tipo sandwich.
Como marcaje utilizado en el inmunoensayo enzimatico, puede utilizarse cualquier marcaje enzimatico conocido [Enzyme Immunoassay, IGAKU-SHOIN Ltd., 1987]. Entre los ejemplos del mismo se incluyen el marcaje de fosfatasa alcalina, el marcaje de peroxidasa, el marcaje de luciferasa, el marcaje de biotina o similares.
El ELISA de tipo sandwich es un metodo en el que se une un anticuerpo a una fase solida, el antfgeno que debe detectarse o medirse se atrapa y se deja que otro anticuerpo reaccione con el antfgeno atrapado. En el ELISA, se preparan dos tipos de anticuerpos que reconocen el antfgeno que debe detectarse o medirse o fragmentos de anticuerpos de los mismos en los que el sitio de reconocimiento de antfgeno es diferente, y un anticuerpo o fragmento de anticuerpo se adsorbe previamente sobre una placa (p.ej., una placa de 96 pocillos) y otro anticuerpo o fragmento de anticuerpo se marca con una sustancia fluorescente, tal como FITC, un enzima tal como peroxidasa, o biotina, o similar.
La placa en la que se adsorbe el anticuerpo anteriormente indicado se deja reaccionar con las celulas o suspension fragmentada del mismo, tejido o solucion desintegrada del mismo, sobrenadante de cultivo celular, suero, efusion pleural, ftquido ascftico, solucion oftalmologica o similar, separada del cuerpo vivo, y despues se deja reaccionar con el anticuerpo monoclonal marcado o fragmento del mismo y se lleva a cabo una reaccion de deteccion segun la sustancia marcada. Puede calcularse una concentracion de antfgeno en la muestra de ensayo a partir de una curva de calibracion preparada mediante una dilucion escalonada de antfgeno de concentracion conocida.
Como anticuerpo utilizado para el ELISA de tipo sandwich, puede utilizarse cualquiera de un anticuerpo policlonal y un anticuerpo monoclonal o fragmentos de anticuerpo, tales como Fab, Fab' y F(ab)2. Como combinacion de dos tipos de anticuerpo utilizados en un ELISA de tipo sandwich, puede utilizarse una combinacion de anticuerpos monoclonales o fragmentos de anticuerpo que reconocen diferentes epftopos o una combinacion de anticuerpo policlonal con anticuerpo monoclonal o fragmentos de anticuerpo.
Un inmunoensayo fluorescente incluye un metodo descrito en la literatura [Monoclonal Antibodies - Principles and Practice, tercera edicion, Academic Press,1996; Manual for Monoclonal Antibody Experiments, Kodansha Scientific, 1987] o similares. Como marcaje utilizado para el inmunoensayo fluorescente, puede proporcionarse a tftulo de ejemplo cualquiera de los marcajes fluorescentes conocidos [Fluorescent Immunoassay, Soft Science, 1983]. Entre los ejemplos se incluye FITC, RITC o similares.
El inmunoensayo luminiscente se lleva a cabo utilizando los metodos descritos en la literatura Bioluminescence and Chemical Luminescence, Clinical test, 42, Hirokawa Shoten, 1998] o similar. Como marcaje utilizado para un inmunoensayo luminiscente, puede proporcionarse a tftulo de ejemplo cualquiera de los marcajes luminiscentes conocidos. Entre los ejemplos del mismo puede incluirse ester de acridinio, lofina o similares.
La transferencia western se lleva a cabo de la manera siguiente. Un antfgeno o celula que expresa un antfgeno se fracciona mediante SDS (dodecilsulfato sodico)-PAGE [Antibodies-A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, 1988]. A continuacion, el gel se transfiere a una membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF) o una membrana de nitrocelulosa y se deja que reaccione la membrana con anticuerpo que reconoce el antfgeno o fragmento de anticuerpo. Ademas, se deja reaccionar con un anticuerpo anti-IgG de raton o fragmento de anticuerpo que se marca con una sustancia fluorescente, tal como FITC, un marcaje enzimatico, tal como peroxidasa, un marcaje de biotina o similar. Despues de la reaccion, el marcaje se visualiza para la medicion. Se describe a continuacion un ejemplo del mismo.
Las celulas o tejidos en los que se expresa un polipeptido con la secuencia de aminoacidos representada por la SEC ID n° 1se rompen y, bajo condiciones reductoras, se someten a electroforesis 0,1 a 30 |jg de cantidad de protema por carril mediante un metodo de SDS-PAGE. La protema sometida a electroforesis se transfiere a una membrana de PVDF y se deja reaccionar con PBS que contiene 1% a 10% de BSA (en adelante denominada
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BSA-PBS) a temperatura ambiente durante 30 minutos para el bloqueo.
En la presente memoria, el anticuerpo monoclonal de la presente invencion se deja reaccionar, se lava con PBS que contiene Tween-20 al 0,05% a 0,1% (en adelante denominado Tween-PBS) y se deja reaccionar con anticuerpo de cabra anti-IgG de raton marcado con peroxidasa a temperatura ambiente durante 2 horas. Se lavo con Twen-PBS y se detecto una banda a la que se habfa unido el anticuerpo monoclonal utilizando reactivos de deteccion de transferencia western ECL (fabricados por Amersham) o similar, detectando de esta manera un polipeptido con la secuencia de aminoacidos representados por la SEC ID n° 1. Como anticuerpo utilizado para la deteccion en la transferencia western, se utiliza un anticuerpo que puede unirse a un polipeptido que no presenta estructura conformacional de un tipo natural.
El metodo ffsicoqmmico se lleva a cabo espedficamente haciendo reaccionar FOLR1 como antigeno con el anticuerpo monoclonal o fragmento de anticuerpo de la presente invencion para formar un agregado y detectando este agregado. Entre otros ejemplos de los metodos ffsicoqmmicos pueden incluirse un metodo capilar, un metodo de inmunodifusion unidimensional, una inmunoturbidimetna, una inmunoturbidimetna de latex [Handbook of Clinical Test Methods, KANEHARA&CO., LTD, 1988] o similar.
En un metodo de inmunoturbidimetna de latex, puede utilizarse un portador, tal como latex de poliestireno con un tamano de partfcula de aproximadamente 0,1 a 1 pm sensibilizado con anticuerpo o antigeno y al llevar a cabo una reaccion de antigeno-anticuerpo utilizando el antigeno o anticuerpo correspondiente, se incrementa la luz dispersada en la solucion de reaccion, mientras que se reduce la luz transmitida. Mediante la deteccion de dicho cambio como absorbancia o turbidez esferica integral, resulta posible medir la concentracion del antigeno, o similar, en la muestra de ensayo.
Un metodo para evaluar la eficacia terapeutica del anticuerpo utilizando el anticuerpo o fragmento del mismo de la presente invencion antes del inicio del tratamiento puede ser, por ejemplo, el siguiente.
En primer lugar, antes de iniciar el tratamiento, se recoge lfquido asdtico canceroso del cuerpo de un paciente y se anade a la suspension el anticuerpo o fragmento del mismo de la presente invencion. Tras un tiempo predeterminado, se mide la actividad antitumoral. Como resultado de la medicion, al observar la actividad antitumoral, puede reconocerse antes del inicio del tratamiento que el anticuerpo o fragmento del mismo de la presente invencion resulta eficaz en el tratamiento del paciente que presenta lfquido asdtico.
Ejemplos
A continuacion en la presente memoria la presente invencion se describe con mayor detalle haciendo referencia a ejemplos. Sin embargo, la presente invencion no se encuentra limitada a los ejemplos siguientes.
[Ejemplo 1]
Adquisicion de ADNc de FOLR1, FOLR2 y FOLR3
Se obtuvieron los ADNc de FOLR1 humano (en adelante denominado FOLR1), FOLR2 humano (en adelante denominado FOLR2) y FOLR3 humano (en adelante denominado FOLR3) de SC122853 (Origene), SC119666 (Origene) y n° 100015838 (Open Biosystem), respectivamente, y se utilizaron en los experimentos, posteriormente.
[Ejemplo 2]
Construccion de vector que expresa FOLR1
En primer lugar, se amplifico el gen de FOLR1 mediante PCR utilizando los cebadores FOLR1-F (SEC ID n° 2) y FOLR1-R (SEC ID n° 3). Se confirmo si el gen amplificado presentaba la secuencia deseada y despues se ligo en el vector pKANTEX93 (documento n° WO 97/10354) que habfa sido digerido con los enzimas de restriccion EcoRI y KpnI, construyendo de esta manera un vector de expresion del gen de FOLR1.
[Ejemplo 3]
Preparacion de celulas que expresan FOLR1
La lmea celular CHO (de ovario de hamster chino) deficiente en DHFR, DG44 (celula CHO/DG44) se obtuvo de la Mitsubishi Chemical Corporation Yokohama Research Center y se utilizo en la preparacion de celulas que expresan FOLR1. Para el cultivo se utilizo medio de cultivo [IMDM (GIBCO) complementado con suero de feto bovino dializado inactivado al 10% (dFBS), suplemento HT (Gibco) y gentamicina 50 pg/ml)
En primer lugar, el vector que expresaba FOLR1 se digirio mediante tratamiento con AatII y el ADN lineal
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obtenido de esta manera se purifico y se suspendio en una solucion esteril. Este ADN se transfirio a celulas CHO/DG44 mediante electroporacion y despues se cultivo durante 3 dfas en el medio de cultivo sin suplemento HT. Despues, se seleccionaron las celulas resistentes a farmaco en un medio de seleccion [IMDM, dFCS inactivado al 10%, G418 0,5 mg/ml (Nacalai) y gentamicina 50 pg/ml). Las celulas resistentes a farmaco seleccionadas de esta manera se sembraron en una placa de 96 pocillos a una densidad de 75 celulas/placa y se cultivaron ademas en el medio de seleccion durante 2 semanas. Se observo cada pocillo bajo un microscopio y se llevo a cabo en serie un cultivo extensivo de los clones individuales.
[Ejemplo 4]
Confirmacion de la expresion de FOLR1
Las celulas resistentes a farmaco obtenidas de esta manera se desprendieron con solucion de EDTA al 0,02% (Nacalai), se lavaron con PBS y despues se suspendieron en BSA al 1%/PBS. Despues, se sembraron en una placa de 96 pocillos a una densidad de 2x105 celulas/pocillo y se llevo a cabo la centrifugacion a 1.700 rpm durante 1 minuto. Se descarto el sobrenadante y se anadio anticuerpo LK26 (GeneTex) a una concentracion de 2 pg/ml utilizando BSA al 1%/PBS y la reaccion se llevo a cabo a 4°C durante 1 hora.
Se lavaron las celulas y despues se anadio anticuerpo anti-IgG de raton-FITC (Dako) diluido 100 veces en BSA al 1%/PBS y la reaccion se llevo a cabo a 4°C durante 1 hora. Las celulas se lavaron nuevamente y despues se suspendieron en BSA al 1%/PBS y se analizo la intensidad de la fluorescencia mediante citometna de flujo (mediante Beckman Coulter, FC500MPL). Se seleccionaron los clones que mostraban una expresion significativa de FOLR1 y se utilizaron estas celulas como celulas CHO expresantes de FOLR1.
[Ejemplo 5]
Clonacion de FOLR1 de mono Cynomolgus
Se clono FOLR1 de mono Cynomolgus a partir de tejido de rinon congelado de mono Cynomolgus. Se anadio RNAiso Plus (Takara) al tejido renal congelado con varios mm cuadrados y el tejido se homogeneizo utilizando un homogenizador Pestle (AsOne). Se dejo a temperatura ambiente durante 5 minutos y despues se obtuvo el ARN total siguiendo el protocolo recomendado de RNAiso Plus y se disolvio en solucion tratada con DEPC (Invitrogen). Despues, con el fin de sintetizar el ADNc a partir del ARN total, se utilizo un kit de smtesis de ADNc de primera cadena HrimeScript II (Takara) y oligodT como cebador a fin de llevar a cabo la transcripcion inversa.
Despues, se disenaron los cebadores CyFOLR1-F (SEC ID n° 4) y CyFOLR1-R (SEC ID n° 5) basandose en FOLR1 humano (NM 000802) y se utilizo FOLR1 de mono Rhesus (XM_001114655) para amplificar el gen de FOLR1 de mono Cynomolgus mediante PCR.
La muestra de PCR se sometio a electroforesis en un gel de agarosa al 2% y despues la banda amplificada se recorto y se recupero utilizando un kit de extraccion de gel QIAquick (Qiagen). Se llevo a cabo la clonacion TA mediante la utilizacion de un kit de clonacion TOPO TA para la secuenciacion (Invitrogen) y se transfirio a E. coli DH5a altamente competentes (Toyobo). Las E. coli se cultivaron en una placa de LB que contema ampicilina 100 pg/ml a 37°C durante la noche. Despues, se cultivo cada colonia y se extrajo el plasmido utilizando NA-2000 (Kurabo), seguido de analisis de secuenciacion.
Como resultado, se identifico la secuencia de nucleotidos de FOLR1 de mono Cynomolgus clonada como SEC ID N° 6 y se encontro que la secuencia de aminoacidos (SEC ID n° 7) basada en dicha secuencia de nucleotidos era identica a FOLR1 de mono Rhesus (XM_001114655).
[Ejemplo 6]
Construccion de vectores expresantes de FOLR1-Fc, FOLR2-Fc, FOLR3-Fc y FOLR1-Fc de mono Cynomolgus
Se llevo a cabo una PCR con el fin de construir vectores que expresaban las protemas recombinantes (en adelante denominadas FOLR1-Fc, FOLR2-Fc, FOLR3-Fc y FOLR1-Fc de mono Cynomolgus) que se prepararon mediante la adicion de Fc de IgG1 humano (region bisagra y region CH2-CH3) al extremo C-terminal de FOLR1 (aminoacidos 1-233), FOLR2 (aminoacidos 1-227), FOLR3 (aminoacidos 1-243) y FOLR1 de mono Cynomolgus (aminoacidos 1-233), respectivamente.
Se utilizaron FOLR1-Fc-F (SEC ID n° 8) y FOLR1-Fc-R (SEC ID n° 9) como cebadores para la preparacion de vector expresante de FOLR1-Fc, FOLR2-Fc-F (SEC ID n° 10) y FOlR2-Fc-R (SEC ID n° 11) como cebadores para la preparacion de vector expresante de FOLR2-Fc, FOLR3-Fc-F (SEC ID n° 12) y FOLR3-Fc-R (SEC ID n° 13) como cebadores para la preparacion de vector expresante de FOLR3-Fc y CyFOLR1-Fc-F (SEC ID n° 14) y CyFOLR1-Fc-R (SEC ID n° 15) como cebadores para la preparacion de vector expresante de FOLR1-Fc de mono Cynomolgus.
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Se proporcionaron los productos de PCR para la electroforesis en gel de agarosa y los genes amplificados se purificaron utilizando un kit de extraccion en gel QIAquick (Qiagen) y se llevo a cabo la subclonacion utilizando un kit de clonacion TA (Invitrogen). Se seleccionaron los vectores que presentaban la secuencia deseada y la secuencia deseada se digirio con EcoRI y AhdI.
Simultaneamente, se corto la region Fc de IgG1 humana a partir de pKANTEX93 utilizando AhdI y Spel. La secuencia deseada y la region Fc de IgG1 humana cortada de esta manera se ligaron a pKANTEX93 que ha^a sido tratado con EcoRI y SpeI y se utilizaron como vectores expresantes de protema recombinante FOLR1-Fc, FOLR2-Fc, FOLR3-Fc y FOLR1-Fc de mono Cynomolgus.
[Ejemplo 7]
Preparacion de celulas expresantes de FOLR1-Fc, FOLR2-Fc, FOLR3-Fc y FOLR1-Fc de mono Cynomolgus
En la preparacion de celulas expresantes de FOLR1-Fc, FOLR2-Fc, FOLR3-Fc y FOLR1-Fc de mono Cynomolgus, se utilizaron celulas CHO/Ms704 (documento n° WO 03/85107) que son celulas CHO/DG44 con desactivacion de FUT8 preparadas a partir de celulas CHO/DG44. Ademas, como los vectores de expresion se utilizaron los vectores expresantes de FOLR1-Fc, FOLR2-Fc, FOLR3-Fc y FOLR1-Fc de mono Cynomolgus preparados en el Ejemplo 6. Tfpicamente, se llevo a cabo el subcultivo, transfeccion genica y seleccion de las celulas resistentes a farmaco de la misma manera que en el Ejemplo 3.
Se llevo a cabo en serie el cultivo extensivo de las celulas resistentes a farmaco seleccionadas y despues las celulas se lavaron con PBS y se cultivaron en un medio de recoleccion [medio libre de suero EX-CELL 302 para celulas CHO (Sigma-Aldrich), L-glutamina 6 mmoles/l (Invitrogen) y gentamicina 50 pg/ml) durante 1 semana. Se recolecto el sobrenadante de cultivo y se proporciono para la purificacion posterior.
[Ejemplo 8]
Purificacion de FOLR1-Fc, FOLR2-Fc, FOLR3-Fc y FOLR1-Fc de mono Cynomolgus
Se purifico FOLR1-Fc, FOLR2-Fc, FOLR3-Fc y FOLR1-Fc de mono Cynomolgus a partir del sobrenadante de cultivo utilizando una columna llena de ProSep-vA High Capacity.
En primer lugar, se paso el sobrenadante de cultivo por la columna y despues se lavo la columna con PBS. La elucion se llevo a cabo en serie utilizando un tampon de elucion de pH 5,0, 3,5, 3,0 (monohidrato de acido cftrico 0,1 M-NaOH/pH 5,0, 3,5, 3,0). Las fracciones eluidas se neutralizaron rapidamente utilizando un tampon de neutralizacion (Tris-HCl 2 M/pH 8,5). Se midio la absorbancia (280 nm) de cada fraccion y se recogieron fracciones en serie que presentaban valores medidos elevados a modo de fraccion de anticuerpo. Se llevo a cabo la dialisis utilizando PBS y despues las protemas purificadas se pasaron por un filtro de 0,22 pm. El mdice de absorbancia a 280 nm era de 2,2 para FOLR1-Fc, de 2,3 para fOlR2-Fc, de 2,1 para FOLr3-Fc y de 2,2 para FOLR1-Fc de mono Cynomolgus y se calcularon sus concentraciones a partir de los mismos.
[Ejemplo 9]
Construccion de vector expresante de FOLR1-mycHis
Con el fin de construir un vector que exprese una protema recombinante que presenta myc y etiqueta His en el extremo C-terminal de FOLR1 (aminoacidos 1-233) (en adelante denominado FOLR1-mycHis), se llevo a cabo una PCR. Se utilizo FOLR1-mH-F (SEC ID n° 16) y FOLR1-mH-R (SEC ID n° 17) como cebadores para la preparacion de vector expresante de FOLR1-mycHis.
La secuencia deseada se purifico a partir del producto de PCR y se ligo a pKANTEX93 que habfa sido tratado con EcoRI y SpeI para preparar el vector expresante de FOLR1-mycHis.
[Ejemplo 10]
Preparacion de celulas expresantes de FOLR1-mycHis
Se utilizaron celulas CHO/DG44 para la preparacion de celulas expresantes de FOLR1-mycHis. Ademas, el vector expresante de FOLR1-mycHis preparado en el Ejemplo 9 se utilizo como el vector de expresion. Tfpicamente, se llevo a cabo el subcultivo, transfeccion genica y seleccion de las celulas resistentes a farmaco y se llevo a cabo la recoleccion del sobrenadante de cultivo de la misma manera que en el Ejemplo 7.
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Se purifico FOLRI-mycHis a partir del sobrenadante de cultivo utilizando la columna empaquetada con Ni-NTA Agarosa (Invitrogen).
En primer lugar, se aplico el tampon de lavado (NaH3PO4 50 mmoles/l (pH 8,0), NaCl 300 mmoles/l) a la columna y el sobrenadante de cultivo se paso por la columna y despues la columna se lavo con tampon de lavado. La elucion se llevo a cabo utilizando un tampon de elucion (preparado mediante la adicion de imidazol 500 mmoles/l al tampon de lavado). Se midio la absorbancia (280 nm) de las fracciones eluidas y se recogieron fracciones en serie que presentaban valores medidos elevados a modo de fraccion FOLRI-mycHis. Se llevo a cabo la dialisis utilizando PBS y despues las protemas purificadas se pasaron por un filtro de 0,22 pm y se utilizo como FOLRI- mycHis purificado. Se calculo la concentracion a partir del mdice de absorbancia a 280 nm de 2,8.
[Ejemplo 12]
Inmunizacion de rata
Con el fin de adquirir anticuerpos monoclonales contra FOLR1 se inmunizaron ratas SD hembra de 4 semanas de edad. En primer lugar, se administraron por via intraperitoneal 50 pg de FOLR1-Fc en ratas SD junto con 2 mg de adyuvante de hidroxido de aluminio (Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988) y vacuna pertussis (Nacalai) Dos semanas de la primera administracion, se administraron 50 pg de FOLR1-Fc una vez a la semana tres veces.
[Ejemplo 13]
Ensayo antisuero de rata
Se recogio sangre de la vena de la cola de la rata SD del Ejemplo 12 tres dfas despues de la administracion final y se analizo el tftulo de anticuerpos sericos contra FOLR1 mediante citometna de flujo. Se utilizaron celulas CHO expresantes de FOLR1 y celulas CHO expresantes de FOLR2 como celulas positivas y negativas, respectivamente.
En primer lugar, se desprendieron celulas CHO expresantes de FOLR1 y celulas CHO expresantes de FOLR2 utilizando solucion de EDTA al 0,02% (Nacalai) y despues se lavaron con PBS y despues se suspendieron en BSA al 1%/PBS. Despues, se sembraron las celulas en una placa de 96 pocillos a una densidad de 5x105 celulas/pocillo seguido de la centrifugacion a 1.500 rpm durante 1 minuto.
Se descarto el sobrenadante y despues se anadio suero de rata SD diluido 100 a 1.000 veces en BSA al 1%/PBS a las celulas y se dejaron reaccionar a 4°C durante 30 minutos. Se lavaron las celulas. A continuacion, se anadio anticuerpo policlonal anti-IgG(H+L) de rata marcado con Alexa488 (Invitrogen) diluido en BSA al 1%/PBS a las celulas y se dejaron reaccionar a 4°C durante 30 minutos. Las celulas se lavaron nuevamente y despues se suspendieron en BSA al 1%/PBS y se analizo la intensidad de fluorescencia mediante citometna de flujo.
[Ejemplo 14]
Preparacion de hibridoma
Las ratas SD que mostraban un tftulo serico significativo de anticuerpos contra las celulas CHO expresantes de FOLR1 se inmunizaron adicionalmente con 50 pg de FOLR1-Fc. Tres dfas despues, se extirpo quirurgicamente el bazo de la rata SD y se proporciono para la fusion celular.
En primer lugar, el bazo extirpado se homogeneizo sobre un portaobjetos de vidrio. Se suspendio dicho tejido de bazo en MEM (Invitrogen) y se paso por un filtro celular para eliminar el tejido residual. Se descarto el sobrenadante tras la centrifugacion y despues se provoco la hemolisis mediante la adicion de tampon de lisado de globulos rojos (Sigma). La reaccion se termino mediante la adicion de MEM y se descarto el sobrenadante tras la centrifugacion. Se suspendio lo resultante en MEM nuevamente y se utilizo como las celulas de bazo.
Las celulas de bazo obtenidas de esta manera se mezclaron con la lmea celular de mieloma de raton de 1/8 veces, P3-U1. Se descarto el sobrenadante tras la centrifugacion y se mezclaron 500 pl de solucion de PEG [cada una, 1 ml de polietilenglicol 1.000 (Junsei Chemical) y se mezclo MEM y se anadieron 350 pl de DMSO (Nacalai) al mismo] suavemente bajo calentamiento en un bano de agua a 37°C y se anadieron ademas 45 ml de MEM. Se descarto el sobrenadante tras la centrifugacion y se suspendieron las celulas en un medio HAT [5 ml de solucion HAT (Gibco) y se anadieron 0,5 ml de 2-mercaptoetanol 55 mmoles/l (Invitrogen) a 500 ml de
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RPMI1640 (Wako)]. El hibridoma obtenido se sembro en una placa de 96 pocillos y se cultivo.
[Ejemplo 15]
Cribado de hibridoma (sistema de deteccion celular ABI8200)
Tras cultivar el hibridoma durante 10 dfas, el sobrenadante de cultivo de cada pocillo se recolecto y la reactividad contra FOLR1 se analizo mediante un metodo de tincion fluorescente de anticuerpos (sistema de deteccion ABI8200, en adelante denominado FMAT). Se utilizaron celulas CHO expresantes de FOLR1 y celulas CHO expresantes de FOLR2 como celulas positivas y negativas, respectivamente. En primer lugar, las celulas positivas y negativas se desprendieron utilizando una solucion de tripsina al 0,05% (Invitrogen) y se sembraron en una placa de 96 pocillos a una densidad de 1x104 celulas/100 pl por pocillo y se cultivaron durante la noche.
A continuacion, se anadieron a cada pocillo 10 pE de sobrenadante de cultivo de hibridoma y 50 pl de anticuerpo policlonal anti-IgG(H+L) de rata marcado con Alexa647 (Invitrogen) diluido 1/5.000 veces. Se dejaron reaccionar a temperatura ambiente durante 3 horas y despues se analizo la intensidad fluorescente mediante FMAT. Los hibridomas en los pocillos que mostraban reactividad espedfica para celulas CHO positivas para FOLR1 en FMAT se clonaron dos veces mediante dilucion limitante.
[Ejemplo 16]
Cribado de hibridoma (metodo de resonancia del plasmon superficial)
Tras la clonacion, el sobrenadante de cultivo del hibridoma se utilizo para medir su afinidad para FOLR1 mediante un metodo de resonancia del plasmon superficial. Como instrumentos para la medicion, se utilizo un Biacore T10 (GE Healthcare) y un chip CM5 (GE Healthcare). En primer lugar, se inmovilizo el kit de captura de anticuerpos de raton (GE Healthcare) sobre el chip CM5 mediante acoplamiento de aminas.
Despues, el sobrenadante de cultivo de hibridoma se aplico utilizando HBS-EP+tampon (GE Healthcare) y los anticuerpos contenidos en el sobrenadante se capturaron sobre el chip CM5. A continuacion, se preparo FOLR1- mycHis mediante dilucion en cinco etapas (188, 375, 750, 1.500 y 3.000 ng/ml) como analito.
Se analizo la afinidad a partir de la constante de asociacion (Ka) y la constante de disociacion (Kd) mediante cinetica de ciclo unico. Se calcularon las constantes cineticas (ka, kd, KD) mediante un modelo de union 1:1 utilizando el software de evaluacion de Biacore T-100 (GE Healthcare).
Como resultado, las afinidades (KD, calculadas a partir de kd/ka) del anticuerpo LK26 (GeneTex) y del anticuerpo MOv18 (Alexis Biochemicals) para FOLR1-mycHis eran de 66 nmoles/l y 92 nmoles/l, respectivamente. Por otra parte, la afinidad del sobrenadante de cultivo del clon de hibridoma RA15-7 (en adelante denominado RA15-7) para FOLR1-mycHis era de 1,9 nmoles/l.
Por lo tanto, se revelo que el sobrenadante de cultivo de RA15-7 inclrna un anticuerpo que mostraba una afinidad muy elevada para FOLR1, en comparacion con el anticuerpo LK26 convencional y el anticuerpo MOv18.
[Ejemplo 17]
Evaluacion de la reactividad del sobrenadante de cultivo de RA15-7 (citometna de flujo)
La reactividad del anticuerpo contenido en el sobrenadante del cultivo de RA15-7 para la lmea celular de cancer ovarico humano PA-1 (ATCC n° CRL-1572) que es reactiva con el anticuerpo LK26 se analizo mediante citometna de flujo. Ademas, la lmea celular de cancer ovarico humano TOV-112D (ATCC n° CRL-11731) que no es reactiva con el anticuerpo LK26 se utilizo como control negativo para analizar la reactividad del anticuerpo contenido en el sobrenadante de cultivo de RA15-7 de la misma manera.
En primer lugar, las lmeas celulares de cancer ovarico humano PA-1 y TOV-112D se desprendieron utilizando solucion de EDTA al 0,02% (Nacalai) y despues se lavaron con PBS y se suspendieron en BSA al 1%/PBS. Despues, se sembraron las celulas en una placa de 96 pocillos a una densidad de 2x105 celulas/pocillo seguido de la centrifugacion a 1.500 rpm durante 1 minuto. Tras descartar el sobrenadante, se anadieron a cada pocillo 50 pl de sobrenadante de cultivo de RA15-7 y se dejaron reaccionar a 4°C durante 30 minutos.
Se lavaron las celulas y despues se anadio a las mismas anticuerpo policlonal anti-IgG de rata (H+L) marcado con Alexa488 (Invitrogen) diluido en BSA al 1%/PBS y se dejaron reaccionar a 4°C durante 30 minutos. Las celulas se lavaron nuevamente y despues se suspendieron en BSA al 1%/PBS y se analizo la intensidad de fluorescencia mediante citometna de flujo.
Como resultado, el sobrenadante del cultivo de RA15-7 mostro reactividad unicamente con PA-1 y ninguna
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reactividad con TOV-112D, al igual que el anticuerpo LK26. Por lo tanto, se sugiere que el anticuerpo contenido en el sobrenadante de cultivo de RA15-7 reconoce las celulas de cancer con elevada expresion de FOLR1.
De la misma manera, tambien se analizo mediante citometna de flujo la reactividad del sobrenadante de cultivo de RA15-7 con la lmea celular derivada de rinon de mono Cynomolgus JTC-12 (RCG1485, Riken Cell Bank). Como resultado, el sobrenadante de cultivo de RA15-7 mostro reactividad con las celulas JTC-12, al igual que el anticuerpo LK26. Por lo tanto, se sugirio que el anticuerpo contenido en el sobrenadante de cultivo de RA15-7 reconoda FOLR1 de mono Cynomolgus, ademas de FOLR1 humano.
[Ejemplo 18]
Identificacion de subclase del anticuerpo contenido en el sobrenadante de cultivo de RA15-7
Se identifico mediante ELISA la subclase del anticuerpo contenido en el sobrenadante de cultivo de RA15-7.
En primer lugar, se anadieron 50 pl/pocillo de anticuerpo policlonal anti-IgG(H+L) de rata (MP Biomedical) a una concentracion de 50 pg/ml utilizando PBS, a una placa de 96 pocillos para ELISA y se incubaron a 4°C durante la noche. Se lavo con PBS cada pocillo y despues se anadieron 100 pl/pocillo de BSA al 1%/PBS a temperatura ambiente durante 1 hora para el bloqueo. Se lavo cada pocillo con PBS nuevamente y despues se anadieron 50 pl/pocillo de sobrenadante de cultivo de RA15-7 y se dejaron reaccionar a temperatura ambiente durante 2 horas.
Se lavo cada pocillo con Tween-20 al 0,05%/PBS y se anadieron 50 pl/pocillo de cada isotipo de Ig de rata conjugada con HRP (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM) y anticuerpo espedfico de cadena k de rata (Southern Biotech) que se diluyeron en BSA al 1%/PBS y se dejaron reaccionar a temperatura ambiente durante 1 hora.
Se lavo cada pocillo con PBS y se anadieron 50 pl/pocillo de solucion de sustrato ABTS [2.2-azinobis(acido 3- etilbenzotiazol-6-sulfonico)amonio, Wako] (1 mmol/l, ABTS, tampon citrato 0,1 moles/l, pH 4,2; H2O2 al 0,1%] y se dejo que reaccionase a temperatura ambiente. Tras confirmar un suficiente desarrollo del color, se anadieron 50 pl/pocillo de solucion de SDS al 5% para terminar la reaccion y se midio la absorbancia a 415 nm.
Como resultado, el anticuerpo contenido en el sobrenadante de cultivo de RA15-7 se identifico como el anticuerpo IgG1K de rata.
[Ejemplo 19]
Evaluacion de la especificidad del anticuerpo contenido en el sobrenadante de cultivo de RA15-7 (ELISA)
Se evaluaron las reactividades del anticuerpo contenido en el sobrenadante de cultivo de RA15-7 con FOLR1-Fc, FOLR2-Fc, FOLR3-Fc y FOLR1-Fc de mono Cynomolgus.
En primer lugar, se anadieron 50 pl/pocillo de anticuerpo de cabra anti-IgG(H+L) de rata (CALTAG) diluidos 1.000 veces en PBS en una placa de 96 pocillos para ELISA y se incubaron a 4°C durante la noche.
Se lavo con PBS cada pocillo y despues se anadieron 100 pl/pocillo de BSA al 1%/PBS a temperatura ambiente durante 1 hora para el bloqueo. Se lavo cada pocillo con pBs nuevamente y despues se anadieron 50 pl/pocillo de sobrenadante de cultivo de RA15-7 y se dejaron reaccionar a temperatura ambiente durante 1 hora. Se lavo cada pocillo con Tween-20 al 0,05%/PBS y se anadieron 50 pl/pocillo de FOLR1-Fc, FOLR2-Fc, FOLR3-Fc y FOLR1-Fc de mono Cynomolgus que habfan sido diluidos en BSA al 1%/PBS y se dejaron reaccionar a temperatura ambiente durante 1 hora.
Se lavo cada pocillo con Tween-20 al 0,05%/PBS y despues se anadieron 50 pl/pocillo de anticuerpo de cabra anti-IgG(H+L) humano-POD (American Qualex) que hadan sido diluidos 2.000 veces en BSA al 1%/PBS y se dejaron reaccionar a temperatura ambiente durante 1 hora. Se lavo cada pocillo con PBS y despues se anadieron 50 pl/pocillo de solucion de sustrato ABTS y se dejaron reaccionar a temperatura ambiente. Tras confirmar un suficiente desarrollo del color, se anadieron 50 pl/pocillo de solucion de SDS al 5% para terminar la reaccion y se midio la absorbancia a 415 nm.
Como resultado, se demostro que el anticuerpo contenido en el sobrenadante de cultivo de RA15-7 se une a FOLR1-Fc humano y de mono Cynomolgus pero no se une a FOLR2-Fc y FOLR3-Fc. Es decir, se demostro que el anticuerpo contenido en el sobrenadante de cultivo de RA15-7 era anticuerpo espedfico para FOLR1 humano y de mono Cynomolgus.
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Se cultivo el hibridoma RA15-7 durante 1 semana en un medio que se preparo mediante la adicion de suero de feto bovino al 5% con contenido ultrabajo en IgG (Invitrogen) a Hybridoma-SFM (Invitrogen). La purificacion del anticuerpo de RA15-7 se llevo a cabo a partir del sobrenadante de cultivo de la misma manera que en el Ejemplo 8. Se calculo la concentracion a partir del mdice de absorbancia a 280 nm de 1,4.
[Ejemplo 21]
Evaluacion de la afinidad del anticuerpo mediante ELISA competitiva
Se evaluo si el anticuerpo de RA15-7, el anticuerpo LK26 y el anticuerpo MOv18 competfan entre sf para la union a FOLR1.
En primer lugar, se anadieron 50 pl/pocillo de cada anticuerpo preparado a una concentracion de 2 pg/ml utilizando PBS a una placa de 96 pocillos para ELISA y se incubaron a 4°C durante la noche. Se lavo con PBS cada pocillo y despues se anadieron 200 pl/pocillo de BSA al 1%/PBS a temperatura ambiente durante 1 hora para el bloqueo. Se lavo cada pocillo con PBS nuevamente y se anadieron 50 pl/pocillo de anticuerpo anti- FOLR1 (0,012 a 3 pg/ml) y FOLR1-Fc (0,2 pg/ml) y se dejaron reaccionar a temperatura ambiente durante 1 hora.
Se lavo cada pocillo con Tween-20 al 0,05%/PBS y despues se anadieron 50 pl/pocillo de anticuerpo de cabra anti-IgG(H+L) humano-POD (American Qualex) que habfan sido diluidos 5000 veces en BSA al 1%/PBS y se dejaron reaccionar a temperatura ambiente durante 1 hora. Se lavo cada pocillo con PBS y despues se anadieron 50 pl/pocillo de solucion de sustrato ABTS y se dejaron reaccionar a temperatura ambiente. Tras confirmar un suficiente desarrollo del color, se anadieron 50 pl/pocillo de solucion de SDS al 5% para terminar la reaccion y se midio la absorbancia a 415 nm.
Como resultado, se revelo que el anticuerpo de RA15-7 y el anticuerpo LK26 compiten entre sf para la union a FOLR1. Por otra parte, tambien se revelo que para la union a FOLR1, el anticuerpo de RA15-7 y el anticuerpo MOv18 no compiten entre sf y el anticuerpo LK26 y el anticuerpo MOv18 no compiten entre sf.
[Ejemplo 22]
Clonacion genica de regiones variables de cadena pesada y de cadena ligera del anticuerpo de RA15-7
Utilizando un RNAiso plus (Takara) de acuerdo con las instrucciones adjuntas, el hibridoma RA15-7 lavado con PBS se disolvio y se preparo el ARN total. El ARN total obtenido de esta manera se disolvio en agua tratada con DEPC (Invitrogen).
A continuacion, se purifico el ARNm a partir del ARN total obtenido de esta manera utilizando un kit de purificacion de ARNm Oligotex-dT30<Super> (a partir de ARN total) (Takara) de acuerdo con las instrucciones adjuntas. Ademas, se preparo ADNc a partir de ARNm purificado utilizando un kit de amplificacion de ADNc SMART RACE (Clontech) de acuerdo con las instrucciones adjuntas.
El ADNc resultante como molde y los cebadores IgG1H-A de rata (SEC ID n° 18) e IgG1H-B de rata (SEC ID n° 19) para el gen de cadena pesada de IgG1 de rata y los cebadores Ratk-A (SEC ID n° 20) y Ratk-B (SEC ID n° 21) para el gen de cadena ligera (cadena k) se utilizaron para amplificar cada gen mediante PCR. El gen amplificado se subclono, seguido del analisis de secuenciacion.
Como resultado, se revelo que la region variable de cadena pesada del anticuerpo de RA15-7 que comprendfa una secuencia de senal presentaba la secuencia de nucleotidos representada por la SEC ID n° 22 y la secuencia de aminoacidos representada por la SEC ID n° 23 y la region variable de la cadena ligera del anticuerpo de RA15-7 que comprendfa una secuencia de senal presentaba la secuencia de nucleotidos representada por la SEC ID n° 24 y la secuencia de aminoacidos representada por la SEC ID n° 25.
Se revelo ademas que, basandose en el informe de Kabat et al. [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services(1991)], la region variable de cadena pesada del anticuerpo de RA15-7 que no contema ninguna secuencia de senal presentaba la secuencia de nucleotidos representada por la SEC ID n° 26 y la secuencia de aminoacidos representada por la SEC ID n° 27 y la region variable de la cadena ligera del anticuerpo de RA15-7 que no contema ninguna secuencia de senal presentaba la secuencia de nucleotidos representada por la SEC ID n° 28 y la secuencia de aminoacidos representada por la SEC ID n° 29.
Ademas, se revelo que las secuencias de aminoacidos de CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada del
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anticuerpo de RA15-7 estaban representadas por las SEC ID n° 30, 31 y 32, respectivamente, Ademas, se revelo que las secuencias de aminoacidos de CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera del anticuerpo de RA15-7 estaban representadas por las SEC ID n° 33, 34 y 35, respectivamente,
[Ejemplo 23]
Construccion de expresante de anticuerpo de RA15-7 hibrido de rata/humano
Se preparo el vector expresante de anticuerpo de RA15-7 Imbrido de rata/humano mediante la union de los genes de las regiones variables de cadena pesada y cadena ligera de anticuerpo de RA15-7 a los genes de la cadena pesada de IgG1 humano y la region constante de la cadena k. Como vector se utilizo pKANTEX93 que contema el gen de la region constante de la IgG1K humana.
En primer lUGAR; se amplifico el gen de la region variable de cadena ligera del anticuerpo de RA15-7 mediante PCR utilizando los cebadores RA15-7-VLF (SEC ID n° 36) y RA15-7-VLR (SEC ID n° 37). La secuencia deseada se purifico a partir del producto de PCR y se ligo en pKANTEX93 que habfa sido tratado con EcoRI y BsiWI.
De la misma manera, el gen de la region variable de cadena pesada del anticuerpo de RA15-7 se amplifico por PCR utilizando RA15-7-VHF (SEC ID n° 38) y RA15-7-VHR (Sec ID n° 39). La secuencia deseada se purifico a partir del producto de PCR y se ligo a pKANTEX93 en el que se habfa ligando la region variable de cadena ligera del anticuerpo de RA15-7, que habfa sido tratado con NotI y ApaI. Se utilizo el vector como vector expresante de anticuerpo de RA15-7 (en adelante denominado ChRA15-7) Imbrido de rata/humano.
[Ejemplo 24]
Preparacion de celulas que expresan anticuerpo ChRA15-7 y anticuerpo ChRA15-7 con una cadena sacarida que no contiene fucosa
Se utilizaron celulas CHO/DG44 para la preparacion de celulas expresantes de anticuerpo ChRA15-7 a las que se habfa anadido una cadena sacarida que contema fucosa (en adelante denominadas "convencionales"). Ademas, se utilizaron celulas CHO/Ms704 para la preparacion de ChRA15-7 (en adelante denominado ChRA15- 7DF) con una cadena sacarida que no contema fucosa (en adelante denominada "desfucosilada"). El vector preparado en el Ejemplo 23 utilizo como el vector de expresion. Tfpicamente, se llevo a cabo el subcultivo, transfeccion genica y seleccion de las celulas resistentes a farmaco y se llevo a cabo la recoleccion del sobrenadante de cultivo de la misma manera que en el Ejemplo 7.
[Ejemplo 25]
Purificacion de anticuerpo ChRA15-7 y de anticuerpo ChRA15-7DF
Las purificaciones de los anticuerpos ChRA15-7 y ChRA15-7DF a partir del sobrenadante de cultivo recuperado se llevaron a cabo de la misma manera que en el Ejemplo 8. Con independencia del tipo, convencional o desfucosilado, se calculo la concentracion a partir del mdice de absorbancia a 280 nm, de 1,37.
[Ejemplo 26]
Preparacion de vector expresante de anticuerpo desfucosilado aplicado a tecnologia de potenciacion de CDC
Con el fin de preparar un anticuerpo desfucosilado aplicado a tecnologfa de potenciacion de CDC, se modifico la region constante de la cadena pesada de anticuerpo de pKANTEX93, en referencia a lo informado en los documentos n° WO2007/011041 y n° WO2011/108502. La secuencia de nucleotidos y la secuencia de aminoacidos despues de la modificacion se representan mediante las SEC ID n° 40 y 41, respectivamente. La region variable de cadena ligera y la region variable de cadena pesada del anticuerpo de RA15-7 y del anticuerpo MORAb-003 (documento n° WO2005/080431) se transfectaron en dicho vector para preparar vectores expresantes de anticuerpo ChRA15-7 desfucosilado aplicado a tecnologfa de potenciacion de CDC (en adelante denominado ChRA15-7Acc) y de anticuerpo MORAb-003 (en adelante denominado MORAb-003Acc).
[Ejemplo 27]
Preparacion de celulas expresantes de anticuerpo ChRA15-7Acc y anticuerpo MORAb-003Acc
Se utilizaron CELULAS CHO/Ms704 para la preparacion de celulas expresantes de anticuerpo ChRA15-7Acc y anticuerpo MORAb-003Acc. Los vectores expresantes de anticuerpo ChRA15-7Acc y MORAb-003Acc preparados en el Ejemplo 26 se utilizaron como vectores de expresion. Tfpicamente, se llevo a cabo el subcultivo, transfeccion genica y seleccion de las celulas resistentes a farmaco y se llevo a cabo la recoleccion del sobrenadante de cultivo de la misma manera que en el Ejemplo 7.
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Las purificaciones de los anticuerpos ChRA15-7Acc y MORAb-003Acc a partir del sobrenadante de cultivo recogido se llevaron a cabo de la misma manera que en el Ejemplo 8. Se calcularon las concentraciones a partir del mdice de absorbancia a 280 nm, de 1,34 y 1,60 para el anticuerpo ChRA15-7Acc y MORAb-003Acc, respectivamente.
[Ejemplo 29]
Medicion de la afinidad del anticuerpo ChRA15-7Acc (metodo de la resonancia del plasmon superficial)
Se midieron las afinidades del anticuerpo ChRA15-7Acc y del anticuerpo MORAb-003 para FOLR1 mediante un metodo de resonancia del plasmon superficial. La medicion se llevo a cabo de la misma manera que en el Ejemplo 16, excepto en que se inmovilizo un kit de captura de anticuerpos humanos (GE Healthcare) sobre el chip CM5 mediante acoplamiento de aminas y se aplico FOLR1-mycHis preparado mediante la dilucion en cinco etapas (12,3, 37, 111, 333, 1.000 ng/ml) como analito.
Como resultado, las afinidades (KD, calculado a partir de kd/ka) del anticuerpo ChRA15-Acc y del anticuerpo MORAb-003 para FOLR1-mycHis fueron de 0,57 nmoles/l y 57 nmoles/l, respectivamente (Tabla 1), indicando que el anticuerpo ChRA15-7Acc hnbrido de rata/humano preparado a partir del anticuerpo de RA15-7 era un anticuerpo que mostraba una afinidad elevada para FOLR1 en comparacion con el anticuerpo convencional MORAb-003.
Tabla 1
ka (x 105 (moles/l + s)'1) kd (x 10-3 (s)-1) KD (x 10-9 moles/l)
ChRA15-7Acc
17,6 1,00 0,57
MORAb-003
4,58 25,9 57
[Ejemplo 30]
Evaluacion de la afinidad del anticuerpo ChRA15-7DF (transferencia western)
Se evaluaron mediante transferencia western las reactividades del anticuerpo ChRA15-7DF y el anticuerpo MORAb-003.
En primer lugar, se suspendio FOLR1-mycHis en tampon para muestras reductor marcador de carril y en tampon para muestras no reductor marcador de carril (Thermo) y se incubaron a 100°C durante 5 minutos para preparar FOLR1-mycHis reductor y FOLR1-mycHis no reductor. Se llevo a cabo el SDS-PAGE de FOLR1-mycHis reductor y no reductor preparados mediante dilucion en cinco etapas (0,5, 2,7, 13, 67, 333 ng/carril) utilizando el gel e- PAGEL (ATTO) para SDS-PAGE.
A continuacion, el gel sometido a electroforesis se aplico sobre una membrana de PVDF (Millipore) y los papeles de filtro presumergidos en un tampon de transferencia (12,1 g de Tris, 14,4 g de glicina, 200 ml de metanol/1 l de agua esteril) se colocaron sobre la parte superior e inferior de la misma y se dejo que se produjese la transferencia.
Despues, la membrana de PVDF se bloqueo con BSA libre de globulina al 1% (Nacalai)/TBS. A continuacion, se hicieron reaccionar el anticuerpo ChRA15-7DF y el anticuerpo MORAb-003 a una concentracion de 5 pg/ml utilizando BSA libre de globulina al 1%/TBS con la membrana de PVDF a temperatura ambiente durante 1 hora.
Se lavo dicha membrana de PVDF y despues se hizo reaccionar IgG(H+L) de cabra antihumano-POD (American Qualex) diluido con BSA libre de globulina al 1%/TBS a temperatura ambiente durante 1 hora.
Se lavo nuevamente la membrana de PVDF y se hizo reaccionar con Chemi-Lumi One Super (Nacalai) durante 1 minuto y se detecto la fluorescencia de la membrana de PVDF utilizando un instrumento ImageQuant LAS 4000 mini (GE Healthcare).
Como resultado, tanto el anticuerpo ChRA15-7DF como el anticuerpo MORAb-003 mostraron reactividad unicamente con FOLR1-mycHis no reductor, indicando que eran anticuerpos que reconodan la estructura conformacional de FOLR1.
El anticuerpo MORAb-003 detecto 67 ng o mas de FOLR1-mycHis no reductor, mientras que el anticuerpo
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ChRA15-7DF detecto 2,7 ng o mas de FOLRI-mycHis no reductor.
Es decir, el anticuerpo ChRA15-7DF mostro una sensibilidad notablemente elevada en la deteccion de FOLRI- mycHis no reductor en comparacion con el anticuerpo MORAb-003.
[Ejemplo 31]
Comparacion de la actividad citotoxica celular dependiente de anticuerpos (ADCC) entre el anticuerpo ChRA15- 7DF y el anticuerpo MORAb-003
Se evaluo la actividad ADCC contra las lmeas celulares de cancer ovarico. Las lmeas celulares de cancer diana [Caov-3 (ATCC n° HTB-75), PA-1 (ATCC n° CRL-1572), IGR-OV1 (National Cancer Institute), SKOV-3 (ATCC n° HTB-77), RMG-1 (celulas del JCRB n° JCRB0172), OVCAR-3 (ATCC n° HTB-161)] se desprendieron de los matraces de cultivo utilizando solucion de EDTA al 0,02% (Nacalai) y se prepararon a una densidad de 1x104 celulas/50 pl utilizando un medio de medicion de la ADCC [RPMI1640 libre de rojo fenol (Gibco), dFCS inactivado al 5% (Gibco), gentamicina 50 pg/ml (Nacalai) y se utilizaron como soluciones de celulas diana.
A continuacion, la sangre periferica tratada con heparina de un donante sano normal se cargo en un tubo de separacion de linfocitos LeucoSep (Greiner) empaquetado con Lymphoprep (Cosmo Bio), seguido de centrifugacion a 1.000xg a temperatura ambiente durante 20 minutos. Tras la centrifugacion, se separo la fraccion de suero y se recogio una capa de PBMC. Las celulas se lavaron con el medio de medicion de la ADCC. Se preparo PBMC a una densidad de 2,5x105 celulas/50 pl utilizando el medio de medicion de ADCC y se utilizo como solucion de celulas efectoras.
En primer lugar se preparo la solucion de anticuerpo a concentraciones de 0,1, 1, 10, 100 y 1.000 ng/ml utilizando medio de medicion de la ADCC con el fin de que su concentracion final fuese de 0,033, 0,33, 3,3, 33 y 333 ng/ml.
Cada 50 pl/pocillo de la solucion celular diana, solucion de celulas efectoras y solucion de anticuerpo preparadas de esta manera se mezclaron en una placa de 96 pocillos de fondo en forma de U hasta un volumen total de 150 pl/pocillo. Se mezclo bien cada pocillo y despues se precipitaron las celulas mediante centrifugacion a 50xg y temperatura ambiente durante 5 minutos y se dejaron reaccionar a 37°C durante 4 horas.
A continuacion, se agito bien cada pocillo y las celulas se precipitaron adicionalmente mediante centrifugacion. Se dispensaron 50 pl del sobrenadante de cada pocillo en una nueva placa de ELISA. Se midio la actividad de lactato deshidrogenasa (LDH) en el sobrenadante dispensado mediante el ensayo de citotoxicidad no radioactiva Cyto Tox 96 (Promega). Se llevaron a cabo las manipulaciones de acuerdo con las instrucciones adjuntas.
Se calculo la actividad ADCC mediante la Ecuacion siguiente, despues de restar el valor medido de actividad de LDH del pocillo que contema unicamente medio de medicion de ADCC respecto del valor medido de actividad de LDH de cada pocillo y utilizando el valor como el valor medido corregido de actividad de LDH de cada pocillo.
Formula 1
Actividad ADCC (%)
imagen1
en el que 'Exp' indica el valor medido corregido de actividad de LDH de cada muestra; 'ET spo' indica el valor medido corregido de actividad de LDH del pocillo que contiene la mezcla de la solucion de celulas efectoras y la solucion de celulas diana; 'T total' indica el valor medido corregido de actividad de LDH del pocillo que contiene la mezcla de las celulas diana y la solucion de lisis acompanada del ensayo de citotoxicidad no radioactiva Cyto Tox 96; 'D' indica el valor medido corregido de actividad de LDH de la solucion de lisis, y 'T spo' indica el valor medido corregido de actividad de LDH del pocillo de solo celulas diana.
Como resultado, el anticuerpo ChRA15-7DF mostro una actividad ADCC a una concentracion mas baja que el anticuerpo MORAb-003 y su citotoxicidad maxima tambien era elevada. Ademas, el anticuerpo ChRA15-7DF mostraba una actividad ADCC a una concentracion mas baja que el anticuerpo MORAb-003 desfucosilado (MORAb-003DF) y su citotoxicidad maxima tambien era elevada.
Por lo tanto, se revelo que el anticuerpo ChRA15-7DF presentaba una actividad ADCC mas alta que el anticuerpo MORAb-003DF que habfa sido preparado mediante aplicacion de tecnologfa de potenciacion de ADCC (desfucosilacion) al anticuerpo anti-FOLR1 humanizado convencional (MORAb-003). Ademas, se sugirio que el anticuerpo ChRA15-7DF resultaba mas util como anticuerpo terapeutico para el cancer ovarico que MORAb-003 y MORAb-003DF.
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Construccion de vector expresante de FOLR1 hibrido de rata/humano
Con el fin de analizar el epftopo del anticuerpo, se prepararon tres tipos de FOLR1-mycHis hforido de rata/humano (en adelante denominado Rat1-FOLR1-mycHis, Rat2-FOLR1-mycHis y Rat4-FOLR1-mycHis) mediante la sustitucion de una parte de la secuencia de nucleotidos de FOLR1-mycHis por FOLR1 de rata (NM_133527).
Se preparo Rat1-FOLR1-mycHis mediante la sustitucion de la secuencia de aminoacidos en las posiciones 3 a 28 de la secuencia de aminoacidos de FOLR1 humano representada por la SEC ID n° 1 por la secuencia de aminoacidos en las posiciones 3 a 26 en la secuencia de aminoacidos de FOLR1 de rata representada por la SEC ID n° 102 y anadiendo las etiquetas myc e His en el extremo C-terminal.
Se preparo Rat2-FOLR1-mycHis mediante la sustitucion de la secuencia de aminoacidos en las posiciones 55 a 62 de la secuencia de aminoacidos de FOLR1 humano representada por la SEC ID n° 1 por la secuencia de aminoacidos en las posiciones 53 a 60 en la secuencia de aminoacidos de FOLR1 de rata representada por la SEC ID n° 102 y anadiendo las etiquetas myc e His en el extremo C-terminal.
Se preparo Rat4-FOLR1-mycHis mediante la sustitucion de la secuencia de aminoacidos en las posiciones 91 a 95 de la secuencia de aminoacidos de FOLR1 humano representada por la SEC ID n° 1 por la secuencia de aminoacidos en las posiciones 89 a 93 en la secuencia de aminoacidos de FOLR1 de rata representada por la SEC ID n° 102 y anadiendo las etiquetas myc e His en el extremo C-terminal.
Las secuencias de nucleotidos de Rat1-FOLR1-mycHis, Rat2-FOLR1-mycHis y Rat4-FOLR1-mycHis estan representadas por la SEC ID n° 42, SEC ID n° 43 y SEC ID n° 44, respectivamente, y las secuencias de aminoacidos de los mismos estan representadas por la SEC ID n° 45, SEC ID n° 46 y SEC ID n° 47, respectivamente.
Se sintetizo cada gen y se sustituyo por el gen FOLR1-mycHis en el vector expresante de FOLR1-mycHis del Ejemplo 9, construyendo de esta manera los vectores expresantes de Rat1-FOLR1-mycHis, Rat2-FOLR1-mycHis y Rat4-FOLR1-mycHis.
[Ejemplo 33]
Preparacion de celulas expresantes de Rat1-FOLR1-mvcHis. Rat2-FOLR1-mycHis y Rat4-FOLR1-mycHis
Se utilizaron las celulas CHO/DG44 en la preparacion de celulas expresantes de Rat1-FOLR1-mycHis, Rat2- FOLR1-mycHis y Rat4-FOLR1-mycHis. Los vectores preparados en el Ejemplo 32 se utilizaron como cada vector de expresion. Tfpicamente, se llevo a cabo el subcultivo, transfeccion genica y seleccion de las celulas resistentes a farmaco y se llevo a cabo la recoleccion del sobrenadante de cultivo de la misma manera que en el Ejemplo 7.
[Ejemplo 34]
Purificacion de Rat1-FOLR1-mycHis, Rat2-FOLR1-mycHis y Rat4-FOLR1-mycHis
Las purificaciones de Rat1-FOLR1-mycHis, Rat2-FOLR1-mycHis y Rat4-FOLR1-mycHis se llevaron a cabo de la misma manera que en el Ejemplo 11. Se calcularon todas las concentraciones a partir del mdice de absorbancia a 280 nm, de 2,8.
[Ejemplo 35]
Analisis de epitopos del anticuerpo ChRA15-7Acc (ELISA)
FOLR1-mycHis preparado en el Ejemplo 11 y Rat1-FOLR1-mycHis, Rat2-FOLR1-mycHis y Rat4-FOLR1-mycHis preparados en el Ejemplo 34 se utilizaron para evaluar las reactividades de los anticuerpos ChRA15-7Acc, MORAb-003 y MOv18.
En primer lugar, cada 50 pl/pocillo de FOLR1-mycHis, Rat1-FOLR1-mycHis, Rat2-FOLR1-mycHis y Rat4-FOLR1- mycHis, que habfan sido preparados a una concentracion de 10 pg/ml utilizando PBS se anadieron a una placa de 96 pocillos para ELISA y despues se incubaron a 4°C durante la noche. Se lavo con PBS cada pocillo y despues se anadieron 200 pl/pocillo de BSA al 1%/PBS a temperatura ambiente durante 1 hora para el bloqueo.
Se lavo cada pocillo con PBS nuevamente y despues se lavo cada pocillo con 50 pl de anticuerpo ChRA15-7Acc, anticuerpo MORAb-003 y anticuerpo MOv18, que habfan sido preparados mediante la dilucion en serie de 3
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veces en siete etapas a partir de 10.000 ng/ml en BSA al 1%/PBS (14, 41, 123, 370, 1.111, 3.333 y 10.000 ng/ml) y se hicieron reaccionar a temperatura ambiente durante 1 hora.
Se lavo cada pocillo con Tween-20 al 0,05%/PBS y se anadieron 50 pl/pocillo de anticuerpo de cabra anti- IgG(H+L) humano-POD (American Qualex) diluido 5.000 veces en BSA al 1%/PBS que se hicieron reaccionar con anticuerpo ChRA15-7Acc o anticuerpo MORAb-003 y se anadieron 50 pl/pocillo de anticuerpo policlonal de conejo anti-IgG de raton-POD (Dako) diluido 400 veces en BSA al 1%/PBS al pocillo y se hizo reaccionar con el anticuerpo MOv18 y despues se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 1 hora.
Se lavo cada pocillo con PBS y despues se anadieron 50 pl/pocillo de solucion de sustrato ABTS y se dejaron reaccionar a temperatura ambiente. Tras confirmar un suficiente desarrollo del color, se anadio solucion de SDS al 5% para terminar la reaccion y se midio la absorbancia a 415 nm.
Se muestran los resultados en la Tabla 2. Los drculos blancos indican que la reaccion se ha producido y 'x' indica que no se ha producido ninguna reaccion. Los anticuerpos ChRA15-7Acc, MORAb-003 y MOvI8 reaccionaron con FOLR1-mycHis. Los anticuerpos ChRA15-7Acc y MORAb-003 reaccionaron con Rat1-FOLR1- mycHis pero el anticuerpo MOvI8, no reacciono.
Los anticuerpos MORAb-003 y MOv18 reaccionaron con Rat2-FOLR1-mycHis pero el anticuerpo ChRA15-7Acc no reacciono. Los anticuerpos ChRA15-7Acc y MOv18 reaccionaron con Rat4-FOLR1-mycHis pero el anticuerpo MORAb-003 no reacciono.
Conjuntamente se demostro que los anticuerpos MOv18, ChRA15-7Acc y MORAb-003 reconocen la secuencia que comprende la region en la que la secuencia de aminoacidos de FOLR1-mycHis habfa sido sustituida por la de tipo rata, en Rat1-FOLR1-mycHis, Rat2-FOLR1-mycHis y Rat4-FOLR1-mycHis, respectivamente.
Espedficamente, se sugiere que los anticuerpos MOv18, ChRA15-7Acc y MORAb-003 reconocen la secuencia de aminoacidos en las posiciones 3 a 28 de la secuencia de aminoacidos en las posiciones 91 a 95 de FOLR1- mycHis, respectivamente.
Tabla 2___________
FOLR1-mycHis Rat1-FOLR1-mycHis Rat2-FOLR1 -mycHis Rat4-FOLR1 -mycHis
Anticuerpo MORAb-003
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O
O
X
anticuerpo ChRA15-7Acc Anticuerpo MOv18
OO
OX
X
O
O
O
[Ejemplo 36]
Diseno de regiones variables de cadena pesada y cadena ligera de anticuerpo RA15-7 humanizado
En primer lugar, con el fin de injertar las secuencias de aminoacidos de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada de RA15-7 representadas por las SEC ID n° 30, 31 y 32, respectivamente, y se selecciono la secuencia de aminoacidos de la region marco (FR) en la region variable de cadena pesada de un anticuerpo humano. La secuencia de anticuerpo humano anteriormente conocida con elevada homologfa con la secuencia de FR de la cadena pesada de RA15-7 se busco utilizando una base de datos de genes de lmea germinal de Ig proporcionada por The National Center for Biotechnology Information.
Como resultado, se selecciono FR de IGVH3-72 debido a que IGVH3-72 es una secuencia de anticuerpo humano que presenta la homologfa mas alta. Para disenar HV0, se injertaron las secuencias de aminoacidos de CDR1, cDr2, CDR3 de la cadena pesada de RA15-7, representadas por las SEC ID n° 30, 31 y 32 en la region correcta de la secuencia de FR del anticuerpo humano determinado de esta manera.
A continuacion, se seleccionaron las secuencias de aminoacidos de las regiones marco (FR) en la region variable de cadena ligera de un anticuerpo humano, en la que se injertaron las secuencias de aminoacidos de CDR1, CDR2 y CDR2 de la cadena ligera de RA15-7, representadas por las SEC ID n° 33, 34 y 35, respectivamente.
Kabat et al. han clasificado en subgrupos (HSG I-IV) las VL de los diversos anticuerpos humanos conocidos convencionalmente, basandose en la homologfa de sus secuencias de aminoacidos y han informado de las secuencias de consenso para cada uno de los subgrupos [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1991].
Por lo tanto, se llevo a cabo la busqueda de homologfas de las secuencias de aminoacidos de consenso de FR de VL subgrupos I-IV (hSGI-hSGIV) de los anticuerpos humanos con la secuencia de FR de la cadena ligera de RA15-7. Como resultado, hSGI era la secuencia de consenso de la cadena ligera de anticuerpo humano con la homologfa mas alta. Para disenar LV0, las secuencias de aminoacidos (SEC ID n° 33, 34 y 35) de CDR1, CDR2
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y CDR3 de la cadena ligera de RA15-7 se injertaron en una posicion apropiada de la secuencia de FR del anticuerpo humano determinado de esta manera, tal como se ha indicado anteriormente.
A continuacion, se construyeron las estructuras tridimensionales predichas de la region variable del anticuerpo humanizado anteriormente disenado (HV0LVO) compuesto de HV0 y LV0 y del anticuerpo ChRA15-7 utilizando una tecnica de modelado por ordenador, y se compararon entre sr Se utilizo Discovery Studio (Accelrys) para la construccion de la estructura tridimensional y la visualizacion de los datos de coordenadas.
Como resultado de la comparacion de las estructuras tridimensionales, los residuos que se esperaba que contribuyesen significativamente a la actividad de union a antigeno, tal como el mantenimiento de la estructura de bucle de CDR o similar, los residuos que se esperaba que contribuyesen al mantenimiento de la estructura entera mediante interacciones hidrofobicas o similares y los residuos que se esperaba que potencialmente presentasen un elevado riesgo antigenico mediante exposicion en la superficie de la molecula, fueron identificados como residuos candidatos para la modificacion.
Uno o mas de los residuos candidatos a modificacion seleccionados se sustituyeron por los residuos aminoacidos que se encontraban presentes en los sitios correspondientes del anticuerpo ChRA15-7 de manera que se disenase cada producto modificado del anticuerpo humanizado. Como region variable de cadena pesada del anticuerpo RA15-7 humanizado modificado que no contema ninguna secuencia de senal, se disenaron HV0, HV2, HV3, Hv4, HV5, HV6, HV7, HV8 y HV10 segun las secuencias de aminoacidos mostradas en la figura 1.
De la misma manera, como region variable de cadena ligera del anticuerpo RA15-7 humanizado modificado que no contema ninguna secuencia de senal, se disenaron LV0, LV2, LV3, LV4 y LV6 de acuerdo con las secuencias de aminoacidos mostradas en la figura 2.
[Ejemplo 37]
Construccion de vector expresante de anticuerpo RA15-7 humanizado modificado
HV0, HV2, HV3, HV4, HV5, HV6, HV7, HV8, HV10, LV0, LV2, LV3, LV4 y LV6 (SEC ID n°. 48 a 61), que son las secuencias de nucleotidos de las regiones variables de cadena pesada y de cadena ligera del anticuerpo RA15-7 humanizado modificado que no contienen ninguna secuencia de senal disenadas de esta manera se ligaron en pKANTEX93 de la misma manera que la construccion del vector de expresion de ChRA15-7 (Ejemplo 23).
[Ejemplo 38]
Preparacion de celulas expresantes de anticuerpo RA15-7 humanizado modificado
Se utilizo la lmea CHO-K1 de doble desactivacion genica del gen FUT8 (Tsukahara et al., Animal Cell Technology: Basic & Applied Aspects, 175-183, 2006) en la preparacion de celulas expresantes de anticuerpo RA15-7 humanizado modificado. Cada uno de los vectores expresantes de anticuerpo humanizado modificado preparados en el Ejemplo 37 se transfecto transitoriamente utilizando el sistema de expresion de CHO FreeStyle MAX (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se cultivaron dichas celulas durante una semana y se recolecto el sobrenadante del cultivo.
[Ejemplo 39]
Purificacion de anticuerpo RA15-7 humanizado modificado
Se purifico cada uno de los anticuerpos humanizados modificados a partir del sobrenadante de cultivo recolectado en el Ejemplo 38 utilizando MabSelect SuRe (GE Healthcare). En detalle, se aplicaron en serie una solucion esteril, solucion de citrato 0,1 M (pH 3,6) y una solucion de borato de Na 0,2 M/NaCl 150 mmoles/l (pH 7,5) a la columna empaquetada con portadores, para su equilibrado.
Se aplico el sobrenadante de cultivo a la columna y despues se lavo esta con solucion de borato de Na 0,2 M/NaCl 150 mmoles/l (pH 7,5). Para la elucion se utilizo solucion de citrato 0,1 M (pH 3,6). Las fracciones eluidas se neutralizaron rapidamente con Tris-Hcl 1 M (pH 9,0).
Se midio la absorbancia (280 nm) de cada fraccion y se recogieron fracciones en serie que presentaban valores medidos elevados a modo de fracciones de anticuerpo. Se sometieron a dialisis utilizando un tampon (acido cttrico 10 mmoles/l, NaCl 150 mmoles/l, pH 6,0) y se paso por un filtro de 0,22 pm cada anticuerpo purificado de los anticuerpos humanizados modificados. Se calculo la concentracion a partir del mdice de absorbancia a 280 nm de 1,4.
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Medicion de afinidad del anticuerpo RA15-7 humanizado modificado (metodo de resonancia del plasmon superficial)
De la misma manera que en el Ejemplo 29, se midio la afinidad de cada anticuerpo humanizado modificado para FOLR1 mediante un metodo de resonancia del plasmon superficial.
Como resultado, se demostro que las afinidades de los anticuerpos RA15-7 humanizados modificados (HV7LV3, HV10LV2, HV10LV3, HV10LV4, y HV10LV6) para FOLR1-mycHis conservaban aproximadamente 70% de la afinidad de ChRA15-7Acc.
[Ejemplo 41]
Diseno de producto modificado con Cys del anticuerpo RA15-7 humanizado modificado HV7LV3 (HV7LV3- CDRH3-Cys101)
Se incluyo Cys(Cys101) en la CDR3 de cadena pesada del anticuerpo RA15-7 humanizado modificado HV7LV3. En la sustitucion de Cys101 por otro aminoacido, se selecciono un total de 14 tipos de aminoacido: Met, Gly, Asp, Ser, Tyr, Ala, Ile, Val, Thr, Phe, Arg, Trp, Pro y Gln como candidatos para la modificacion de aminoacido, considerando factores tales como la estructura molecular, la hidrofobicidad, que son similares a los de Cys, y aminoacidos que son de estructura simple.
[Ejemplo 42]
Construccion de vector expresante de anticuerpo modificado HV7LV3-CDRH3-Cys101
Se construyo un vector expresante del anticuerpo modificado HV7LV3-CDRH3-Cys101. En primer lugar, se utilizo un vector ligado a un gen de region variable HV7 (SEC ID n° 62) a modo de molde. Se introdujo una mutacion genetica para la sustitucion de Cys101 por el aminoacido candidato utilizando un kit de introduccion de mutaciones puntuales [kit de mutagenesis dirigida a sitio QuickChange II (Agilent Technologies)] de acuerdo con las instrucciones adjuntas. La solucion de ADN obtenida se transformo en XL1-Blue y se extrajeron los plasmidos de las colonias formadas de esta manera.
La secuencia de nucleotidos de la region variable HV7 que no contema ninguna secuencia de senal, en la que Cys101 se habfa sustituido por el aminoacido candidato, esta representada por Met (ADN C101M): SEC ID n° 63, Gly (C101G_DNA): SEC ID n° 64, Asp (C101D DNA): SEC ID n° 65, Ser (C101S_DNA): SEC ID n° 66, Tyr (C101Y_DNA): SEC ID n° 67, Ala (C101A_DNA): SEC ID n° 68, Ile (C101I_DNA): SEC ID n° 69, Val (C101V_DNA): SEC ID n° 70, Thr (C101T_DNA): SEC ID n° 71, Phe (C101F_DNA): SEC ID n° 72, Arg
(C101R_DNA): SEC ID n° 73, Trp (C101W_DNA): SEC ID n° 74, Pro (C101P_DNA): SEC ID n° 75 o Gln
(C101Q_DNA): SEC ID n° 76, respectivamente.
La secuencia de aminoacidos de la region variable HV7 que no contema ninguna secuencia de senal, en la que Cys101 se habfa sustituido por el aminoacido candidato, esta representada por Met (C101M_AA): SEC ID n° 77, Gly (C101G_AA): SEC ID n° 78, Asp (C101D_AA): SEC ID n° 79, Ser (C101S_AA): SEC ID n° 80, Tyr (C101Y_AA): SEC ID n° 81, Ala (C101A_AA): SEC ID n° 82, Ile (C101I_AA): SEC ID n° 83, Val (C101V_AA): SEC ID n° 84, Thr (C101T_AA): SEC ID n° 85, Phe (C101F_AA): SEC ID n° 86, Arg (C101R_AA): SEC ID n° 87,
Trp (C101W_AA): SEC ID n° 88, Pro (C101P_AA): SEC ID n° 89 o Gln (C101Q_AA): SEC ID n° 90,
respectivamente.
A continuacion, el gen HV7 de la region variable de cadena pesada del vector expresante del anticuerpo HV7LV3 se sustituyo por el gen de la region variable HV7 en el que se habfa sustituido Cys101 por el aminoacido candidato. Para la recombinacion se utilizaron los sitios de reconocimiento NotI y ApaI. El vector obtenido se utilizo como el vector expresante del anticuerpo modificado HV7LV3-CDRH3-Cys101.
[Ejemplo 43]
Preparacion y cultivo de celulas expresantes de anticuerpo modificado HV7LV3-CDRH3-Cys101
Se prepararon celulas expresantes del anticuerpo modificado HVLV3-CDRH3-Cys101 utilizando el vector preparado en el Ejemplo 42. Se llevo a cabo la expresion celular, transfeccion genica y recoleccion del sobrenadante de cultivo de la misma manera que en el Ejemplo 38.
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La purificacion de los anticuerpos modificados HV7LV3-CDRH3-Cys101 y el calculo de su concentracion se llevaron a cabo de la misma manera que en el Ejemplo 39.
[Ejemplo 45]
Medicion de afinidad del anticuerpo modificado HV7LV3-CDRH3-Cys101 (metodo de la resonancia del plasmon superficial)
Se midieron las afinidades de los anticuerpos modificados HV7LV3-CDRH3-Cys101 para FOLR1 mediante el metodo de resonancia del plasmon superficial de la misma manera que en el Ejemplo 29.
Como resultado, se demostro que las afinidades de los anticuerpos en los que se habfa modificado Cys101 por Ile(C101I), Val(C101V), Thr(C101T), Phe(C101F), Gln(C101Q) y Met(C101M), respectivamente, para FOLR1- mycHis conservaban 50% o mas de la afinidad del anticuerpo ChRA15-7Acc.
En detalle, las afinidades de los anticuerpos con modificaciones C101I, C101V, C101T, C101F, C101Q y C101M eran de 73%, 55%, 88%, 80%, 64% y 59% de la afinidad del anticuerpo ChRA15-7Acc, respectivamente (figura 3), indicando que el anticuerpo con la modificacion C101T (HuRA15-7CT) mostraba una afinidad mejorada en comparacion con el anticuerpo modificado humanizado HV7LV3.
La secuencia de nucleotidos y la secuencia de aminoacidos de la region variable de cadena ligera del anticuerpo HuRA15-7CT con una secuencia de serial se representan mediante las SEC ID n° 91 y 92, respectivamente. Ademas, la secuencia de nucleotidos y la secuencia de aminoacidos de la region variable de cadena ligera del anticuerpo HuRA15-7CT sin secuencia de serial se representan mediante las SEC ID n° 93 y 94, respectivamente.
Ademas, la secuencia de nucleotidos y la secuencia de aminoacidos de la region variable de cadena pesada del anticuerpo HuRA15-7CT con una secuencia de serial se representan mediante las SEC ID n° 95 y 96, respectivamente. Ademas, la secuencia de nucleotidos y la secuencia de aminoacidos de la region variable de cadena pesada del anticuerpo HuRA15-7CT sin secuencia de serial se representan mediante las SEC ID n° 97 y 98, respectivamente.
Ademas, las secuencias de aminoacidos de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada del anticuerpo HuRA15- 7CT se representan mediante las SEC ID n° 30, 31 y 99, respectivamente, Las secuencias de aminoacidos de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera del anticuerpo HuRA15-7CT se representan mediante las SEC ID n° 33, 34 y 35, respectivamente,
[Ejemplo 46]
Construccion vector expresante de anticuerpo HuRA15-7CT desfucosilado de aplicacion de tecnologia de potenciacion de la CDC
La construccion del vector expresante de anticuerpo HuRA15-7CT desfucosilado de aplicacion de tecnologfa de potenciacion de la CDC (en adelante denominado HuRA15-7CTAcc) se llevo a cabo utilizando la SEC ID n° 91 y una region variable de cadena ligera y la SEC ID n° 95 como region variable de cadena pesada de la misma manera que en el Ejemplo 26.
[Ejemplo 47]
Preparacion de celulas expresantes de anticuerpo HuRA15-7CT desfucosilado y celulas expresantes de anticuerpo HuRA15-7CTAcc
Se utilizo CHO/Ms704 en la preparacion de celulas expresantes de anticuerpo HuRA15-7CT (en adelante denominado HuRA15-7CTDF) desfucosilado y celulas expresantes de anticuerpo HuRA15-7CTAcc. Como vector de expresion, se utilizo vector expresante del anticuerpo HuRA15-7CT preparado en el Ejemplo 42 o el vector expresante del anticuerpo HuRA15-7CTAcc preparado en el Ejemplo 46. Tfpicamente, se llevo a cabo el subcultivo, transfeccion genica y seleccion de las celulas resistentes a farmaco y se llevo a cabo la recoleccion del sobrenadante de cultivo de la misma manera que en el Ejemplo 7.
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La purificacion del anticuerpo HuRA15-7CTDF y del anticuerpo HuRA15-7CTAcc a partir del sobrenadante de cultivo se llevo a cabo de la misma manera que en el Ejemplo 8. Se calcularon las concentraciones a partir del mdice de absorbancia a 280 nm, de 1,38 y 1,37 para el anticuerpo HuRA15-7CTDF y HuRA15-7CTAcc, respectivamente.
[Ejemplo 49]
Medicion de la afinidad del anticuerpo HuRA15-7CTAcc (metodo de la resonancia del plasmon superficial)
De la misma manera que en el Ejemplo 29, se midio la afinidad del anticuerpo HuRA15-7CTAcc para FOLR1 mediante un metodo de resonancia del plasmon superficial.
Como resultado, con respecto a la afinidad del anticuerpo HuRA15-7CTAcc para FOLR1-mycHis, el valor de KD era de 0,65 nmoles/l (Tabla 3). Por lo tanto, se demostro que dicho anticuerpo se urna a FOLR1 a una afinidad notablemente mas elevada que el anticuerpo MORAb-003 (KD=57 nmoles/l, Ejemplo 29).
Tabla 3
ka (x 105 (moles/l + s)'1) kd (x 10-3 (s)-1) KD (x 10-9 moles/l)
HuRA15-7CTAcc
16,8 1,08 0,65
[Ejemplo 50]
Evaluacion de las especificidades del anticuerpo HuRA15-7CTDF y del anticuerpo ChRA15-7DF (ELISA)
Se evaluaron las reactividades del anticuerpo HuRA15-7CTDF, del anticuerpo ChRA15-7DF y del anticuerpo MORAb-003DF para FOLR1-Fc, FOLR2-Fc, FOLR3-Fc y FOLR1-Fc de mono Cynomolgus.
En primer lugar, se anadieron 50 pl/pocillo de FOLR1-Fc, FOLR2-Fc, FOLR3-Fc y FOLR1-Fc de mono Cynomolgus que se habfan preparado a una concentracion de 2 pg/ml utilizando PBS, a una placa de 96 pocillos para ELISA y se incubaron a 4°C durante la noche. Se lavaron con PBS y despues se anadieron 200 pl/pocillo de BSA al 1%/PBS a temperatura ambiente durante 1 hora para el bloqueo. Se lavaron con PBS nuevamente y se anadieron 50 pl/pocillo de anticuerpo HuRA15-7CTDF, anticuerpo ChRA15-7DF, anticuerpo MORAb-003DF y anticuerpo IgG1 humano anti-DNP desfucosilado (DNPDF) como control negativo mediante dilucion en siete etapas (1,4, 4,1, 12, 37, 111, 333, 1.000 ng/ml) en BSA al 1%/PBS y se dejaron reaccionar a temperatura ambiente durante 1 hora.
Se lavo cada pocillo con Tween-20 al 0,05%/PBS y despues se anadieron 50 pl/pocillo de anticuerpo de cabra anti-kappa humano-HRP (Southern Biotech) que habfan sido diluidos 2.000 veces en BSA al 1%/PBS y se dejaron reaccionar a temperatura ambiente durante 1 hora. Se lavo cada pocillo con PBS y despues se anadieron 50 pl/pocillo de solucion de sustrato ABTS y se dejaron reaccionar a temperatura ambiente. Tras confirmar un suficiente desarrollo del color, se anadio solucion de SDS al 5% para terminar la reaccion y se midio la absorbancia a 415 nm.
Como resultado, se demostro que las actividades de union del anticuerpo HuRA15-7CTDF, del anticuerpo ChRA15-7DF y del anticuerpo MORAb-003DF para FOLR1-Fc humano y de mono Cynomolgus eran equivalentes pero no se urnan a FOLR2-Fc ni a FOLR3-Fc (figura 4). Es decir, se demostro que el anticuerpo HuRA15-7CTDF, el anticuerpo ChRA15-7DF y el anticuerpo MORAb-003DF eran anticuerpos espedficos para FOLR1 humano y de mono Cynomolgus.
[Ejemplo 51]
Inmunohistoquimica mediante anticuerpo HuRA15-7CTAcc
La matriz de tejidos normales humanos congelados incluidos en compuesto OCT (cerebro, cerebelo, corazon, pulmon, estomago, intestino delgado, tngado, pancreas, glandula salival, rinon, tiroides, glandula adrenal, musculo esqueletico, bazo, ovario, utero, placenta, piel y glandula mamaria) se sometio a inmunohistoqmmica (IHQ) utilizando el anticuerpo HuRA15-7CTAcc y el anticuerpo DNPDF a modo de control negativo.
En primer lugar, se llevo a cabo la fijacion con acetona a -20°C durante 5 minutos y despues se llevo a cabo el secado al aire durante 10 minutos. A continuacion, se inactivo la peroxidasa endogena con PBS que conterna NaN3 al 0,1% y H2O2 al 0,3% a temperatura ambiente. A continuacion, se inactivo la biotina endogena utilizando
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un sistema de bloqueo de biotinas (Daco).
Ademas, se llevo a cabo el bloqueo utilizando BSA al 1%/PBS. Despues, anticuerpo HuRA15-7CTAcc, anticuerpo MORAb-003 y anticuerpo DNPDF preparados a una concentracion de 1 pg/ml se hicieron reaccionar a temperatura ambiente durante 1 hora y se llevo a cabo el lavado con PBS. Se anadio estreptavidina marcada con peroxidasa (Nichirei) y se hizo reaccionar durante 5 minutos y se llevo a cabo el lavado con PBS. Se anadio un comprimido de DAB (Wako) preparada utilizando H2O2 al 0,02%/PBS y se hizo reaccionar durante 10 minutos para el desarrollo de color. Se hizo reaccionar hematoxilina de Mayer (Wako) durante aproximadamente 2 segundos. Tras el lavado con agua corriente, se tineron los nucleos.
La muestra tenida se trato con etanol al 70% durante 5 minutos, etanol al 95% durante 5 minutos y etanol al 100% durante 5 minutos y despues etanol al 100% tres veces. A continuacion, se llevo a cabo el tratamiento con xileno al 100% durante 5 minutos y se repitio esta manipulacion tres veces, seguido de penetracion. Finalmente, se monto con Entellan®new (Merck).
El resultado del examen de la muestra tenida demostro que pulmon (alveolar), estomago (membrana mucosa), intestino delgado (membrana mucosa, lamina muscular mucosa), pancreas (conducto, celulas acinares), tngado (conducto biliar), glandula salival (celulas acinares, conducto), rinon (tubulos urirnferos, glomerulo), glandula adrenal (celulas corticales, tejido intersticial), tiroides (folroulo, celula parafolicular), glandula mamaria (acinos), utero (epitelio endocervical), ovario (epitelio), placenta (trofoblasto sincitial), piel (glandula sudonpara) eran positivos para la tincion por el anticuerpo HuRA15-7CTAcc, tal como se informa en la literatura [Cancer Res. 52(23):6708-11, 1992; Int. J. Cancer 119(2):243-50, 2006].
A continuacion, se sometieron a la misma tincion 8 casos de tejidos de cancer ovarico humano (4 casos de cistadenocarcinoma seroso, 1 caso de cistadenoma seroso, 2 casos de cistadenocarcinoma mucinoso, 1 caso de cistadenoma mucinoso lfmite). Ademas, tambien se utilizo el anticuerpo MORAb-003 para la tincion, ademas del anticuerpo HuRA-7CTAcc y el anticuerpo DNPDF de control negativo.
Como resultado, se demostro que cinco de cinco casos del tipo seroso (100%) y uno de tres casos del tipo mucinoso (33%) podfan tenirse con anticuerpo HuRA15-7CTAcc y anticuerpo MORAb-003. Las regiones tenidas de las muestras de tejido por ambos anticuerpos eran identicas entre sf, indicando que las especificidades de ambos anticuerpos para el cancer ovarico son identicas. Tambien se revelo que la tincion del anticuerpo HuRA15-7CTAcc era mas fuerte que la del anticuerpo MORAb-003.
A continuacion, se cuantifico la intensidad de tincion de la muestra tenida a partir de la puntuacion H. Con respecto a la puntuacion H, la intensidad de tincion de las celulas tenidas positivamente de las celulas de cancer se clasifico en cuatro categonas y se determino el porcentaje (%) de las celulas de cancer positivas a cada puntuacion mediante intervalos de evaluacion de 5% y despues se obtuvo la puntuacion global multiplicando cada puntuacion por el porcentaje de celulas de cancer positivas.
Como resultado, con respecto a los 4 casos de cistadenocarcinoma seroso, 1 caso de cistadenoma seroso y 1 caso de cistadenocarcinoma mucinoso que se habfan tenido tanto con anticuerpo MORAb-003 como anticuerpo HuRA15-7CTAcc, el anticuerpo HuRA15-7CTAcc mostro una puntuacion H mas elevada que el anticuerpo MORAb-003 en todas las muestras. Por otra parte, debido a que 1 caso de cistadenocarcinoma mucinoso y 1 caso de cistadenoma mucinoso lfmite no se tineron con ningun anticuerpo, su puntuacion H fue de 0.
Conjuntamente los datos sugieren que la union del anticuerpo HuRA15-7CTAcc a FOLR1 expresado en el cancer ovarico es mas fuerte que la del anticuerpo terapeutico convencional para cancer ovarico, MORAb-003.
[Ejemplo 52]
Evaluacion de la actividad ADCC de anticuerpo hibrido de rata/humano y de anticuerpo humanizado
Se utilizo anticuerpo ChRA15-7Acc, anticuerpo IgG1 humano HV7LV3 desfucosilado de aplicacion de tecnologfa de potenciacion de CDC (HuRA15-7Acc) y anticuerpo HuRA15-7CTAcc para evaluar su actividad ADCC frente a las lrneas celulares de cancer ovarico de la misma manera que en el Ejemplo 31.
Como resultado, se demostro que las actividades ADCC de los anticuerpos HuRA15-7Acc y HuRA15-7CTAcc contra las celulas SKOV-3 y las celulas OVCAR-3 derivadas del cancer ovarico resistente a platino eran equivalentes a las del anticuerpo ChRA15-7Acc (figura 5).
[Ejemplo 53]
Evaluacion de la actividad CDC de anticuerpo hibrido de rata/humano y de anticuerpo humanizado
Se evaluo la actividad CDC contra la lmea celular de cancer ovarico. Se desprendio IGR-OV1 como lmea celular
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cancer diana de un matraz de cultivo utilizando solucion de EDTA al 0,02% (Nacalai) y se preparo utilizando el medio de medicion de CDC [RPMI1640 libre de rojo fenol (Gibco), BSA al 1,4% (Sigma)] a una densidad de 1x104 celulas/50 pl, que se utilizo como solucion celular diana
A continuacion, se disolvio suero humano liofilizado (Sigma) en 1 ml de agua purificada y se anadio al mismo 1 ml de medio de medicion de CDC y se utilizo como solucion de complemento. Con el fin de preparar las soluciones de anticuerpo a las concentraciones finales de 0,032, 0,16, 0,8, 4,0, 20 y 100 pg/ml, en primer lugar, se prepararon los anticuerpos HuRA15-7CTAcc, HuRA15-7CTDF, ChRA15-7Acc, ChRA15-7DF y MORAb-003 a una concentracion de 0,096, 0,48, 2,4, 12, 60 y 300 pg/ml utilizando medio de medicion de CDC.
Se mezclaron 50 pl/pocillo de la solucion celular diana, solucion de complemento y solucion de anticuerpo preparados de esta manera, en una placa de fondo plano de 96 pocillos y a un volumen total de 150 pl/pocillo. Se mezclo bien cada pocillo y se dejo reaccionar a 37°C durante 2 horas. A continuacion, se mezclo bien cada pocillo y se anadieron 30 pl/pocillo de CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay (Promega) , se mezclaron y despues se dejaron reaccionar a 37°C durante aproximadamente 1 hora. Tras confirmar un desarrollo suficiente de color, se midio la absorbancia a 415 nm.
Se calculo la actividad CDC mediante la ecuacion siguiente tras restar la absorbancia medida del pocillo que contema la mezcla de medio de medicion de CDC y la solucion de complemento a partir de la absorbancia medida de cada pocillo y utilizando el valor calculado como la absorbancia corregida de cada pocillo.
Formula 2
Actividad CDC (%) = 100X ------------------H....--■..-----------------------
$1
En donde 'Exp' indica la absorbancia corregida de cada muestra y ST indica la absorbancia corregida del pocillo que contiene la mezcla de la solucion celular diana y la solucion de complemento.
Como resultado, se revelo que el anticuerpo HuRA15-7CTAcc y el anticuerpo HuRA15-7CTDF mostraban una actividad CDC significativamente elevada en comparacion con la del anticuerpo ChRA15-7Acc y del anticuerpo ChRA15-7DF, respectivamente (figura 6(a)]. Tambien se demostro que el anticuerpo HuRA15-7CTAcc mostraba una actividad CDC significativamente elevada en comparacion con la de MORAb-003 [figura 6(b)].
[Ejemplo 54]
Comparacion de la actividad ADCC de anticuerpo HuRA15-7CTAcc y anticuerpo convencional anti-FOLR1
Se utilizaron los anticuerpos HuRA15-7CTAcc, MORAb-003Acc y MORAb-003 para evaluar su actividad ADCC contra las lmeas celulares de cancer ovarico de la misma manera que en el Ejemplo 31.
Como resultado, el anticuerpo HuRA15-7CTAcc mostro actividad ADCC contra las celulas SKOV-3 y OVCAR-3 derivadas de cancer ovarico resistente al platino a concentraciones mas bajas que los anticuerpos MORAb-003 y MORAb-003Acc. 7). Es decir, se revelo que el anticuerpo HuRA15-7CTAcc presentaba una actividad ADCC mas alta que el anticuerpo MORAb-003Acc que habfa sido preparado mediante aplicacion de tecnologfa de potenciacion de ADCC (desfucosilacion) al anticuerpo anti-FOLR1 humanizado convencional (MORAb-003).
Ademas, el anticuerpo HuRA15-7CTAcc mostro actividad ADCC contra las celulas IGR-OV1 a una concentracion mas baja que el anticuerpo MORAb-003. Ademas, las actividades ADCC del anticuerpo MORAb-003Acc contra las lmeas celulares de cancer ovarico se redujeron en el orden IGR-OV1, SKOV-3 y OVCAR-3 mientras que el anticuerpo HuRA15-7CTAcc mostro actividades ADCC practicamente equivalentes contra todas las lmeas celulares de cancer ovarico.
Conjuntamente estos resultados sugieren que el anticuerpo HuRA15-7CTAcc resulta mas util como anticuerpo terapeutico para el cancer ovarico resistente al platino que el anticuerpo convencional (MORAb-003) y que el anticuerpo MORAb-003Acc preparado mediante la aplicacion de la tecnologfa convencional al anticuerpo convencional.
[Ejemplo 55]
Evaluacion de la acumulacion tumoral de anticuerpo HuRA15-7CTDF
Se analizo mediante imagenes de fluorescencia la cinetica in vivo de los anticuerpos HuRA15-7CTDF y MORAb- 003DF. En primer lugar, se marcaron los anticuerpos HuRA15-7CTDF y MORAb-003DF utilizando el kit XenoLight CF 770 (anticuerpos HuRA15-7CTDF-770 y MORAb-003DF-770), respectivamente, y el anticuerpo DNPDF de control negativo se marco utilizando el kit XenoLight CFTM 680 (anticuerpo dNpDF-680). La
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actividad de union de cada anticuerpo marcado a las celulas SKOV-3 se confirmo mediante citometna de flujo. Ademas, se determino la proporcion de marcaje de cada anticuerpo de acuerdo con las instrucciones adjuntas.
Las celulas SKOV-3 en cultivo se suspendieron en PBS y se trasplantaron subcutaneamente en el flanco dorsolateral de ratones BALB/cAJcI-nu/nu (hembra, de 5 semanas de edad, Clea-Japan). Al alcanzar los tumores un volumen de aproximadamente 200 mm3 tras el trasplante, se sustituyo el alimento por pienso sin alfalfa y se criaron adicionalmente durante 1 semana. Los ratones se dividieron aleatoriamente en 3 grupos y se asignaron 4 ratones a cada grupo de manera que presentasen un volumen tumoral medio aproximadamente igual.
A continuacion, se mezclaron 10 |jg de anticuerpo HuRA15-7CTDF-770 o anticuerpo MORAb-003DF-770 con 2 |jg de anticuerpo DNPDF-680 y se enraso el volumen total a 200 jl con PBS y se administraron en la vena de la cola de los ratones. Se evaluo la cinetica in vivo del anticuerpo administrado mediante fotograffa de la intensidad de fluorescencia en los ratones utilizando un instrumento IVIS Imaging System (Caliper). La primera fotograffa se obtuvo 4 horas despues de la administracion y despues a intervalos de tiempo constantes.
La intensidad de fluorescencia de los anticuerpos HuRA15-7CTDF-770 y MORAb-003DF-770 en los ratones fotografiados se corrigio a partir de la intensidad de fluorescencia de cada solucion de anticuerpo administrada. Ademas, se calculo la proporcion de intensidades de fluorescencia del anticuerpo HuRA15-7CTDF-770 o MORAb-003DF-770 a la intensidad de fluorescencia del anticuerpo DNPDF-680 como estandar interno de raton y se evaluo la cinetica in vivo de cada anticuerpo.
Como resultado, se localizo una concentracion notablemente elevada del anticuerpo HuRA15-7CTDF-770 en el tumor SKOV-3 trasplantado durante un tiempo prolongado en comparacion con el anticuerpo MORAb-003DF-770 (figura 8). Estos resultados sugieren que el anticuerpo de la presente invencion muestra una acumulacion y persistencia notables en cancer avanzado derivado de la lmea celular de cancer ovarico resistente al platino SKOV-3 y que presenta una actividad antitumoral mas elevada como anticuerpo terapeutico para el cancer.
[Ejemplo 56]
Ensayo de administracion unica en mono Cynomolgus
Se administro por via intravenosa el anticuerpo HuRA15-7CTAcc (100 mg/kg) en monos Cynomolgus (hembra, 4 a 6 semanas, 3) y se analizo el efecto. Como elementos de ensayo se llevo a cabo: observacion del estado general, peso corporal, ingesta de alimento, temperatura corporal, ensayo de orina (produccion de orina, gravedad espedfica de la orina, protemas en la orina, glucosa en orina, creatinina, NAG, Na, K y Cl), ensayo hematologico (leucocitos, linfocitos, celulas T, celulas Th, celulas Tc, celulas B, celulas NK, neutrofilos, monocitos, eosinofilos, basofilos, celulas no tenidas grandes, eritrocitos, nivel de Hb, valor de Ht, reticulocitos, plaquetas, PT, APTT y fibrinogeno), ensayo bioqmmico de la sangre (ALT, ALP, AST, CK, CRP, IL-6, C3, C4, CH50, bilirrubina total, protemas totales, albumina, globulina, trigliceridos, colesterol total, azucar en sangre, BUN, creatinina, fosforo inorganico, Ca, Na, K y Cl), autopsia, peso de los organos y examen histopatologico.
Como resultado, solo se observaron cambios ligeros inflamatorios y de la respuesta inmunologica y tambien se observaron los mismos cambios en la administracion de placebo. Por lo tanto, el anticuerpo HuRAl5-7CTAcc no mostro toxicidad espedfica en todos los elementos de ensayo.
[Ejemplo 57]
Preparacion de vector expresante de anticuerpo HuRA15-7CRAcc
Se aplico la tecnologfa de potenciacion de CDC al anticuerpo humanizado HV7LV3 modificado (HuRA15-7CR) (Ejemplo 42) en el que se habfa llevado a cabo la sustitucion del aminoacido Cys101 por Arg, de la misma manera que en el Ejemplo 26, de manera que se preparo un vector expresante de anticuerpo HuRA15-7CR (en adelante denominado HuRA15-7CRAcc) desfucosilado de aplicacion de la tecnologfa de potenciacion de CDC.
[Ejemplo 58]
Preparacion de celulas expresantes de anticuerpo HuRA15-7CRAcc
Se utilizaron celulas CHO/Ms704 en la preparacion de las celulas expresantes de anticuerpo HuRA15-7CRAcc. Ademas, se utilizo como vector de expresion el vector expresante de anticuerpo HuRA15-7CRAcc preparado en el Ejemplo 57. Tfpicamente, se llevo a cabo el subcultivo, transfeccion genica y seleccion de las celulas resistentes a farmaco y se llevo a cabo la recoleccion del sobrenadante de cultivo de la misma manera que en el Ejemplo 7.
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La purificacion del anticuerpo de HuRA15-7CRAcc se llevo a cabo a partir del sobrenadante de cultivo de la misma manera que en el Ejemplo 8. Se calculo la concentracion a partir del mdice de absorbancia a 280 nm de 1,37 para el anticuerpo HuRAl5-7CRAcc.
[Ejemplo 60]
Medicion de la afinidad del anticuerpo HuRA15-7CRAcc (metodo de la resonancia del plasmon superficial)
Se midio la afinidad del anticuerpo HuRA15-7CRAcc para FOLR1 mediante el metodo de resonancia del plasmon superficial. Se llevaron a cabo manipulaciones de la misma manera que en el Ejemplo 29, utilizando los anticuerpos HuRA15-7CTAcc, HuRA15-7CRAcc y MORAb-003DF.
Como resultado, las afinidades del anticuerpo HuRA15-7CRAcc y del anticuerpo MORAb-003DF para FOLR1- mycHis fueron de 2,6% y 1,1% de la del anticuerpo HuRA15-7CTACC, respectivamente.
[Ejemplo 61]
Evaluacion de la actividad ADCC del anticuerpo HuRA15-7CRAcc
Se evaluaron las actividades ADCC de los anticuerpos HuRA15-7CTAcc, HuRA15-7CRAcc y MORAb-003DF contra las lmeas celulares de cancer ovarico de la misma manera que en el Ejemplo 31.
Como resultado, se observo que la actividad ADCC contra la lmea celular de cancer ovarico resistente al platino OVCAR-3 a una concentracion mas baja de anticuerpo en el orden siguiente: HuRA15-7TAcc, HuRA15-7CRAcc y MORAb-003DF (figura 9). Es decir, aunque la afinidad del anticuerpo HuRA15-7CRAcc era equivalente a la del anticuerpo MORAb-003DF (Ejemplo 60), el anticuerpo HuRA15-7CRAcc mostro una actividad ADCC mas alta a una concentracion mas baja que MORAb-003DF. Conjuntamente estos resultados sugieren que el epftopo del anticuerpo derivado del clon RA15-7, asf como su grado de afinidad para FOLR1 resultan importantes para alcanzar una actividad ADCC fuerte del anticuerpo anti-FOLR1.
[Ejemplo 62]
Analisis de epitopos del anticuerpo HuRA15-7CTAcc (ELISA)
De la misma manera que en el Ejemplo 35, se evaluaron las reactividades de los anticuerpos ChRA15-7Acc, MORAb-003, MOv18 y HuRA15-7CTAcc utilizando FOLR1-mycHis preparado en el Ejemplo 11 y Rat1-FOLR1- mycHis, Rat2-FOLR1-mycHis y Rat4-FOLR1-mycHis preparados en el Ejemplo 34.
Se muestran los resultados en la Tabla 4. Los drculos blancos indican que la reaccion se ha producido y '*' indica que no se ha producido ninguna reaccion. El anticuerpo HuRA15-7CTAcc reacciono con FOLR1-mycHis, Rat1-FOLR1-mycHis y Rat4-FOLR1-mycHis pero no reacciono con Rat2-FOLR1-mycHis, indicando que el anticuerpo HuRA15-7CTAcc reconoda la secuencia de aminoacidos en las posiciones 55 a 62 de FOLR1- mycHis, como el anticuerpo ChRA15-7Acc.
Tabla 4 anticuerpo HuRA15-7CTAcc

FOLR1-mycHis o

Rat1-FOLR1-mycHis o

Rat2-FOLR1-mycHis x

Rat4-FOLR1-mycHis o
[Ejemplo 63]
Analisis cuantitativo de FOLR1 expresado sobre la membrana celular de lmeas celulares de cancer ovarico.
Se analizaron los niveles de expresion de FOLR1 sobre la membrana celular de las lmeas celulares de cancer ovarico (IGR-OV1, SKOV-3, OVCAR-3 y MCAS) utilizando QIFIKIT (Dako). Se utilizo LK26 (GeneTex) como anticuerpo anti-FOLR1 e IgG2a de raton (Dako) como control negativo a una concentracion de 20 pg/ml, respectivamente, para tenir celulas y perlas de calibracion de acuerdo con las instrucciones adjuntas en QlFlKIT.
Se preparo cada una de las celulas tenidas por triplicado y se detectaron sus valores de IMF mediante citometna de flujo (figura 10). Se utilizaron los valores de iMf medios de muestras por triplicado como el valor de IMF de cada celula. A continuacion, se introdujeron los valores de IMF de cada celula y perla de calibracion en ABC
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CALCULATOR para QIFIKIT proporcionado por Yamasa Corporation y se determino el numero de moleculas FOLR1 expresadas sobre las ftneas celulares de cancer ovarico.
Como resultado se demostro que el numero de moleculas de FOLR1 expresadas sobre las membranas celulares de IGR-OV1, SKOV-3, OVCAR-3 y MCAS era de 1,17*10®, 1,10*10®, 6,63*104 y 1,37*104 moleculas por celula, respectivamente (figura 10).
Conjuntamente con el resultado del Ejemplo 54 (figura 7) se revelo que el anticuerpo HuRA15-7CTAcc mostraba la misma actividad ADCC contra celulas tanto de expresion baja de moleculas de FOLR1 (numero de moleculas FOLR1 sobre la membrana celular: 1*104-1 *10®) como sobre celulas de expresion elevada de moleculas FOLR1 (numero de moleculas FOLR1 sobre la membrana celular: 1*10®). Por lo tanto, se sugiere que dicho anticuerpo resulta mas util como anticuerpo terapeutico para las celulas de cancer expresantes de un bajo nivel de FOLR1, asf como para celulas de cancer expresantes de un nivel elevado de FOLR1 que el anticuerpo convencional (MORAb-003) y que el anticuerpo (MORAb-003Acc) preparado mediante la aplicacion de tecnologfa convencional al anticuerpo convencional.
[Ejemplo 64]
Inmunohistoquimica del tejido de cancer de mama humano
De la misma manera que en el Ejemplo 51, se proporciono una matriz de tejidos de cancer mamario humano (BioChain) para la inmunohistoqmmica (IHQ). Se incluyeron en la matriz 3® casos de tejido de carcinoma ductal invasivo, 2 casos de tejido de carcinoma lobular invasivo y 3 casos de tejido normal, junto con informacion negativa o positiva de receptor de estrogenos (RE), receptor de progesterona (RP) y Her2.
El resultado de la tincion demostro que 56% y 27% de las celulas en tejido positivo para ER o positivo para PR y negativo para HER eran positivas para los anticuerpos HuRA15-7CTAcc y MORAb-003, respectivamente; 50% y 50% en tejidos positivos para ER o positivos para PR y positivos para Her2; 71% y 14% en tejidos negativos para ER o negativos para PR y positivos para Her2 y 22% y 11% en tejidos negativos para ER, negativos para Pr y negativos para Her2. A partir de estos resultados se revela que el anticuerpo HuRA15-7CTAcc puede tenir el tejido de cancer de mama positivo para FOLR1 con una sensibilidad mas elevada que el anticuerpo MORAb-003.
Ademas, todas las puntuaciones H de las muestras de tejido tenidas con anticuerpo HuRA15-7CTAcc eran mas altas que las de las mismas muestras tenidas con anticuerpo MORAb-003, lo que sugiere que la union del anticuerpo HuRA15-7CTAcc a FOLR1 expresado en el cancer de mama es mas fuerte que la del anticuerpo convencional MORAb-003.
[Ejemplo 65]
Ensayo de agotamiento autologo utilizando celulas derivadas de ftquido ascftico de cancer ovarico
Se obtuvieron celulas derivadas de ftquido ascftico de cancer ovarico congeladas de Molecular Response (MR) y se llevo a cabo el ensayo de agotamiento autologo a continuacion.
En primer lugar, las celulas derivadas de ftquido ascftico de cancer ovarico congeladas se descongelaron en un bano de agua a 37°C y se suspendieron en un medio para celulas del ftquido ascftico. Como medio para las celulas del ftquido ascftico, se utilizo un medio preparado mediante la adicion de FCS inactivado al 10%, 1/100 veces de penicilina y estreptomicina (Gibco), 1/100 veces de aminoacidos no esenciales (Gibco) y 1/100 veces de piruvato sodico (Gibco) a RPMI1640 Glutamax (Gibco).
En primer lugar, la suspension celular se preparo a una densidad de 2x10® celulas/450 pl y se sembraron 450 pl en cada pocillo de una placa de 24 pocillos. A continuacion, se preparo anticuerpo HuRA15-7CTAcc, anticuerpo MORAb-003 y un anticuerpo DNPDF de control negativo a una concentracion final de 1 a 1.000 ng/ml utilizando el medio para las celulas de ftquido ascftico y se anadieron 50 pl/pocillo del mismo. Despues, las celulas se cultivaron a 37°C durante 24 horas.
Tras el cultivo, cada pocillo se mezclo bien mediante pipeteado y se dispensaron 250 pl de cada uno en otros tubos. Se centrifugo cada tubo a 200xg y a 4°C durante 4 minutos y se descarto el sobrenadante. A continuacion, el pellet celular se suspendio en 2 ml de tampon de tincion (FBS) (BD Biosciences), seguido de la centrifugacion de la misma manera. Se descarto el sobrenadante, seguido del lavado de las celulas.] El pellet celular se suspendio en 100 pl de tampon de tincion (FBS) y se llevo a cabo la tincion para la deteccion de celulas de cancer y la tincion para el control negativo.
En la tincion para la deteccion de celulas de cancer, se utilizo CD45-PerCP (BD Biosciences), CD14-FITC (BD Biosciences), EpCAM-APC (BD Biosciences) y FOLR1-PE (R&D Systems). En la tincion para el control negativo, se utilizo CD45-PerCP (BD Biosciences), CD14-FITC (BD Biosciences), mIgG1-APC (BD Biosciences) y mIgG1-
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PE (BD Biosciences).
Se hicieron reaccionar a temperatura ambiente durante 30 minutos y despues se suspendieron en 2 ml de tampon de tincion (FBS), seguido de centrifugacion para el lavado. Tras el lavado, se anadieron 400 pl de tampon de tincion (FBS) complementado con 1/100 veces de 7-AAD (BD Biosciences) al pellet celular y se suspendieron y utilizaron como muestra para la medicion mediante citometna de flujo.
Tras la compensacion apropiada para los pigmentos fluorescentes utilizados en la tincion celular, cada muestra se sometio a citometna de flujo. En primer lugar, se selecciono la poblacion celular 7-AAD-negativa(-)/CD45(- )/CD14(-) seguido de la subselecciono de la poblacion excluyendo linfocitos mediante FSC y SSC. Con respecto a la poblacion celular, se determino un sitio de deteccion de mIgG1-APC y mIgG1-PE en la muestra de tincion de control negativo y se utilizaron las poblaciones positivas para FOLR1 y EpCAM de la muestra tenida para la deteccion de celulas de cancer a modo de poblaciones de celulas de cancer.
Ademas, se midio el recuento de deteccion de la fraccion 7-AAD(-)/CD14(-)/CD45(+) en un numero determinado y se comparo el numero de celulas en la poblacion de celulas de cancer entre muestras.
La reduccion del numero de celulas detectado en la poblacion de celulas de cancer por la adicion de anticuerpo HuRA15-7CTAcc, anticuerpo MORAb-003 o anticuerpo DNPDF se representa en el eje vertical como citotoxicidad celular (%) (figura 11). El eje horizontal representa la concentracion de anticuerpo (ng/ml).
En la presente memoria, FZ12, FZ21, FZ26 y FZ44 en la figura 11 representan donantes de ftquido ascftico de cancer ovarico (SPECNUM/ID de paciente: 2003090712/7028, 2009080521/173089, 2009060526/5208 y 2003041044/113139), respectivamente. El ensayo ex vivo de resistencia a farmaco demostro que todas las muestras eran de ftquido ascftico de cancer ovarico que conterna celulas de cancer resistentes a platino.
Como resultado, tal como se muestra en la figura 11, en todas las muestras el anticuerpo HuRA15-7CTAcc a concentracion mas baja mostro una citotoxicidad celular mas fuerte que el anticuerpo MORAb-003.
Conjuntamente, al anadir el anticuerpo HuRA15-7CTAcc a las poblaciones celulares derivadas de ftquido ascftico procedente de pacientes de cancer ovarico, las celulas de cancer resistentes a platino en el ftquido ascftico son eliminadas por celulas efectoras en el ftquido ascftico. Ademas, se encontro que la citotoxicidad celular del anticuerpo HuRA15-7CTAcc eran mas elevada que la del anticuerpo terapeutico convencional para cancer ovarico, MORAb-003.
[Ejemplo 66]
Analisis del nivel de expresion de FOLR1 y de la incorporacion del folato de la ftnea celular de cancer ovarico
En primer lugar, FOLR1 expresado sobre las ftneas celulares de cancer ovarico IGR-OV1 (National Cancer Institute), OVISE (celula del JCRB n° JCRB1043), SKOV-3 (ATCC n° HTB-77), Caov-3( ATCC n° HTB-75), RMG- 1 (celula de JCRB n° JCRB0172), OV-90 (ATCC n° CRL-11732), OVCAR-3 (ATCC n° HTB-161), MCAS (celula del JCRB n° JCRB0240) y TOV-112D (ATCC n° CRL-11731) se midio mediante citometna de flujo.
Se cultivo cada ftnea celular, se desprendio utilizando una solucion de EDTA al 0,02% (Nacalai), se lavo con PBS y despues se suspendio en tampon FCM (EDTA 1 mM, azida sodica al 0,05%, PBS que contiene FCS inactivado al 5%). A continuacion, se sembraron a una densidad de 1x105 celulas por pocillo en una placa de 96 pocillos, seguido de centrifugacion a 1.700 rpm durante 1 minuto. Tras descartar el sobrenadante, se anadio anticuerpo HuRA15-7CTAcc preparado a una concentracion de 1 pg/ml utilizando tampon FCM y se dejo reaccionar a 4°C durante 30 minutos.
Tras lavar las celulas, se anadio anticuerpo anti-IgG humano-FITC (Jackson) diluido 200 veces en tampon FCM y se dejo reaccionar a 4°C durante 30 minutos. Las celulas se lavaron nuevamente y se suspendieron en tampon FCM y se analizo la intensidad de fluorescencia mediante citometna de flujo (fabricado por Beckman Coulter, FC500MPL) para determinar el valor de IMF de cada celula. De la misma manera, se determino el valor de IMF de cada celula tenida con anticuerpo DNPDF para calcular un valor de IMF relativo de anticuerpo HuRA15- 7CTAcc a anticuerpo DNPDF (figura 12(a)].
Como resultado, se demostro que IGR-OV1, OVISE, SKOV-3, Caov-3, RMG-1, OV-90, OVCAR-3, MCAS y TOV- 112D, en este orden, mostraban una expresion de FOLR1 mas elevada.
A continuacion, se cultivaron las mismas ftneas celulares de cancer ovarico en un medio sin folato [RPMI1640 sin folato que contiene FCS dializado inactivado al 10% (Invitrogen)] durante 3 dfas. Despues, se anadio folato marcado a una concentracion final de 100 nM y se cultivaron a 37°C durante 3 horas.
A continuacion, las celulas se lavaron con PBS a 37°C y despues se cultivaron en un medio con adicion de folato
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1 mM a 37°C durante 3 horas. Las celulas se lavaron con PBS, se desprendieron con tripsina (Gibco) y despues se suspendieron en tampon FCM. Se analizo la intensidad de fluorescencia mediante citometna de flujo para determinar el valor de IMF de cada celula. De la misma manera, se determino el valor de IMF de las celulas a las que no se habfa anadido folato marcado a fin de calcular un valor de IMF relativo a la muestra con adicion de folato marcado 100 nM [figura 12(b)].
Como resultado, no se observo correlacion entre el nivel de expresion de FOLR1 y la incorporacion de folato. Por ejemplo, el nivel de expresion de FOLR1 de SKOV-3 siguio al nivel de iGR-OVI y OVISE aunque su incorporacion de folato era mas baja que la de IGR-OV1, OVISE, Caov-3, RMG-1 y OV-90. Este resultado sugiere que una terapia con folato conjugado con agente anticancer podna no resultar eficaz contra canceres con un nivel elevado de expresion de FOLR1 en algunos casos.
Por otra parte, el anticuerpo de la presente invencion mostro una citotoxicidad celular eficaz sobre SKOV-3 o OVCAR-3 con baja incorporacion de folato (Ejemplo 54). Conjuntamente estos resultados demuestran que el anticuerpo de la presente invencion resulta eficaz contra canceres que no son susceptibles a la actividad antitumoral del folato conjugado con agente anticancer debido a su baja incorporacion de folato.
Aunque la invencion se ha descrito en detalle y haciendo referencia a realizaciones espedficas de la misma, resultara evidente para el experto en la materia que pueden realizarse diversos cambios y modificaciones sin apartarse del alcance de la misma.
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1: secuencia de aminoacidos de FOLR1
2: secuencia de nucleotidos de FOLR1-F
3: secuencia de nucleotidos de FOLR1-R
4: secuencia de nucleotidos de CyFOLR1-F
5: secuencia de nucleotidos de CyFOLR1-R
6: secuencia de nucleotidos de CyFOLR1_DNA
7: secuencia de aminoacidos de CyFOLR1_AA
8: secuencia de nucleotidos de FOLR1-Fc-F
9: secuencia de nucleotidos de FOLR1-Fc-R
10: secuencia de nucleotidos de FOLR2-Fc-F
11: secuencia de nucleotidos de FOLR2-Fc-R
12: secuencia de nucleotidos de FOLR3-Fc-F
13: secuencia de nucleotidos de FOLR3-Fc-R
14: secuencia de nucleotidos de CyFOLR1-Fc-F
15: secuencia de nucleotidos de CyFOLR1-Fc-R
16: secuencia de nucleotidos de FOLR1-mH-F
17: secuencia de nucleotidos de FOLR1-mH-R
18: secuencia de nucleotidos de RatIgG1H-A
19: secuencia de nucleotidos de RatIgG1H-B
20: secuencia de nucleotidos de Ratk-A
21: secuencia de nucleotidos de Ratk-B
22: secuencia de nucleotidos de RA15-7VH_DNA
23: secuencia de aminoacidos de RA15-7VH_AA
24: secuencia de nucleotidos de RA15-7VLDNA
25: secuencia de aminoacidos de RA15-7VL_AA
26: secuencia de nucleotidos de nonS_RA15-7VH_DNA
27: secuencias de aminoacidos de nonS_RA15-7VH_AA
28: secuencia de nucleotidos de nonS_RA15-7VL_DNA
29: secuencias de aminoacidos de nonS_RA15-7VL_AA
30: secuencia de aminoacidos de RA15-7-VHCDR1_AA
31: secuencia de aminoacidos de RA15-7VHCDR2_AA
32: secuencia de aminoacidos de RA15-7VHCDR3_AA
33: secuencia de aminoacidos de RA15-7VLCDR1_AA
34: secuencia de aminoacidos de RA15-7VLCDR2_AA
35: secuencia de aminoacidos de RA15-7VLCDR3_AA
36: secuencia de nucleotidos de RA15-7-VLF
37: secuencia de nucleotidos de RA15-7-VLR
38: secuencia de nucleotidos de RA15-7-VHF
39: secuencia de nucleotidos de RA15-7-VHR
40: secuencia de nucleotidos de FcAcc_DNA
41: secuencia de aminoacidos de FcAcc_AA
42: secuencia de nucleotidos de Rat1-FOLR1-mycHis_DNA
43: secuencia de nucleotidos de Rat2-FOLR1-mycHis_DNA
44: secuencia de nucleotidos de Rat4-FOLR1-mycHis_DNA
45: secuencias de aminoacidos de Rat1-FOLR1-mycHis_AA
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SEC
ID n° 102
secuencias de aminoacidos de Rat2-FOLR1-mycHis_AA secuencias de aminoacidos de Rat4-FOLR1-mycHis_AA secuencia de nucleotidos de HV0 secuencia de nucleotidos de HV2 secuencia de nucleotidos de HV3 secuencia de nucleotidos de HV4 secuencia de nucleotidos de HV5 secuencia de nucleotidos de HV6 secuencia de nucleotidos de HV7 secuencia de nucleotidos de HV8 secuencia de nucleotidos de HV10 secuencia de nucleotidos de LV0 secuencia de nucleotidos de LV2 secuencia de nucleotidos de LV3 secuencia de nucleotidos de LV4 secuencia de nucleotidos de LV6 secuencia de nucleotidos de HuRA15-7HV7_DNA secuencia de nucleotidos de C101M_DNA secuencia de nucleotidos de C101G_DNA secuencia de nucleotidos de C101D_DNA secuencia de nucleotidos de C101S_DNA secuencia de nucleotidos de C101Y_DNA secuencia de nucleotidos de C101A_DNA secuencia de nucleotidos de C101I_DNA secuencia de nucleotidos de C101V_DNA secuencia de nucleotidos de C101T_DNA secuencia de nucleotidos de C101F_DNA secuencia de nucleotidos de C101R_DNA secuencia de nucleotidos de C101W_DNA secuencia de nucleotidos de C101P_DNA secuencia de nucleotidos de C101Q_DNA secuencia de aminoacidos de C101M_AA secuencia de aminoacidos de C101G_AA secuencia de aminoacidos de C101D_AA secuencia de aminoacidos de C101S_AA secuencia de aminoacidos de C101Y_AA secuencia de aminoacidos de C101A_AA secuencia de aminoacidos de C101I_AA secuencia de aminoacidos de C101V_AA secuencia de aminoacidos de C101T_AA secuencia de aminoacidos de C101F_AA secuencia de aminoacidos de C101R_AA secuencia de aminoacidos de C101W_AA secuencia de aminoacidos de C101P_AA secuencia de aminoacidos de C101Q_AA secuencia de nucleotidos de HuRA15-7LV3_DNA secuencias de aminoacidos de HuRA15-7LV3_AA secuencia de nucleotidos de nonS_HuRA15-7LV3_DNA secuencias de aminoacidos de nonS_HuRA15-7LV3_AA secuencia de nucleotidos de HuRA15-7CTVH_DNA secuencias de aminoacidos de HuRA15-7CTVH_AA secuencia de nucleotidos de nonS_HuRA15-7CTVH_DNA secuencias de aminoacidos de nonS_HuRA15-7CTVH_AA 99: secuencias de aminoacidos de HuRA15-7CTVHCDR3_AA secuencia de aminoacidos de HV0_AA secuencia de aminoacidos de LV0_AA secuencia de aminoacidos de FOLR1 de rata.
Listado de secuencias
<110> Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. <120> Anticuerpo anti-FOLR1 <130> W514748
<150> US61/734610 <151> 2012-12-07
<150> US61/734547 <151> 2012-12-07
<160> 102
<170> PatentIn version 3.3
10
15
<210> 1 <211> 257 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 1
imagen2
20
5
5
10
15
20
25
30
35
40

Asn Trp Thr Ser Gly Phe Asn Lys Cys Ala Val Gly Ala Ala Cys Gin 165 170 175

Pro Phe His Phe Tyr Phe Pro Thr Pro Thr Val Leu Cys Asn Glu lie 180 185 190

Trp Thr His Ser Tyr Lys Val Ser Asn Tyr Ser Arg Gly Ser Gly Arg 195 200 205

Cys lie Gin Met Trp Phe Asp Pro Ala Gin Gly Asn Pro Asn Glu Glu 210 215 220

Val Ala Arg Phe Tyr Ala Ala Ala Met Ser Gly Ala Gly Pro Trp Ala 225 230 235 240

Ala Trp Pro Phe Leu Leu Ser Leu Ala Leu Met Leu Leu Trp Leu Leu 245 250 255
Ser
<210>2 <211> 41 <212>ADN <213> Artificial
<220>
<223> FOLR1-F <400> 2
caagaattca ttaaacgaca aggacagaca tggctcagcg g
<210> 3 <211> 27 <212> ADN <213> Artificial
<220>
<223> FOLR1-R <400> 3
ccggtacctc agctgagcag ccacagc
<210> 4 <211> 22 <212> ADN <213> Artificial
<220>
<223> CyFOLR1-F <400> 4
atggctcagc ggatgacaac a continuacion
<210> 5 <211> 22 <212> ADN <213> Artificial
<220>
<223> CyFOLR1-R <400> 5
41
27
5
10
15
tcagcttagc agccagagca gc
22
<210>6 <211> 774 <212>ADN
<213> Macaca fascicularis
<400>6
atggctcagc ggatgacaac acagctgctg ctncttntag tgtgggtggc tgtagtaggg
60
gaggctcaga caaggactgc acgggccagg actgaacttc tcaatgtctg catgaacgcc
120
aagcaccaca aggaaaagcc aggcccggag gacaagttgc atgagcagtg tcgtccctgg
180
aagaagaatg cctgctgttc taccaacacc agccaggaag cccataagga tgtttcctac
240
ctatatagat tcaactggaa ccactgtgga gagatggcac ctgcctgcaa acggcatttc
300
atccaggaca cctgccteta cgagtgctcc cccaacttgg ggccctggat ccagcaggtg
360
gatcagagct ggcgcaaaga gcgggtgctg aacgtgcccc tgtgcaaaga ggactgtgag
420
caatggtggg aagactgtcg cacctcctac acctgcaaga gcaactggca caaaggctgg
480
aactggacct cagggtttaa caagtgccca gtgggagctg cctgccaaco tttccattto
540
tacttcccca cacccactgt tctgtgcaat gaaatctgga cttactccta caaggtcagc
600
aactacagcc gagggagtgg ccgctgcatc cagatgtggt tcgacccagc ccagggcaac
660
cccaatgagg aggtggcgag gttctatgct gcagccatga gtggggctgg gccctgggcg
720
gcctggcctc tcctacttag cctggcccta acgctgctct ggctgctaag ctga
774
<210> 7 <211> 257 <212> PRT
<213> Macaca fascicularis <400>7
Met Ala Gin Arg Met Thr Thr Gin Leu Leu Leu Leu Leu Val Trp Val 15 10 15
Ala Val Val Gly Glu Ala Gin Thr Arg Thr Ala Arg Ala Arg Thr Glu 20 25 30
imagen3
<210>8 <211> 41 <212>ADN <213> Artificial
10
<220>
<223> FOLRI-Fc-F <400> 8
caagaattca ttaaacgaca aggacagaca tggctcagcg g
15
<210>9 <211> 103
5
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
<212>ADN <213> Artificial
<220>
<223> FOLRI-Fc-R <400>9
catgactgac ggtcccccca ggagttcagg tgctgggcac ggtgggcatg tgtgagtttt 60
gtcacaagat ttgggctcca tggctgcagc atagaacctc gcc 103
<210> 10 <211> 54 <212> ADN <213> Artificial
<220>
<223> FOLR2-Fc-F <400> 10
catgaattca ttaaacgaca aggacagaca tggtctggaa atggatgcca cttc 54
<210> 11 <211> 98 <212> ADN <213> Artificial
<220>
<223> FOLR2-Fc-R <400> 11
catgactgac ggtcccccca ggagttcagg tgctgggcac ggtgggcatg tgtgagtttt 60
gtcacaagat ttgggctcca tggctgcagc atagaacc 98
<210> 12 <211> 50 <212> ADN <213> Artificial
<220>
<223> FOLR3-Fc-F <400> 12
catgaattca ttaaacgaca aggacagaca tggcctggca gatgatgcag 50
<210> 13 <211> 101 <212> ADN <213> Artificial
<220>
<223> FOLR3-Fc-R <400> 13
catgactgac ggtcccccca ggagttcagg tgctgggcac ggtgggcatg tgtgagtttt 60
gtcacaagat ttgggctcgg aatcaataat cccacgagac g 101
<210> 14 <211> 41 <212> ADN <213> Artificial
<220>
<223> CyFOLR1-Fc-F
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
<400> 14
catgaattca ttaaacgaca aggacagaca tggctcagcg g 41
<210> 15 <211> 102 <212>ADN <213> Artificial
<220>
<223> CyFOLR1-Fc-R <400> 15
catgactgac ggtcccccca ggagttcagg tgctgggcac ggtgggcatg tgtgagtttt 60 gtcacaagat ttgggctcca tggctgcagc atagaacctc gc 102
<210> 16 <211> 41 <212> ADN <213> Artificial
<220>
<223> FOLR1-mH-F <400> 16
caagaattca ttaaacgaca aggacagaca tggctcagcg g 41
<210> 17 <211> 121 <212> ADN <213> Artificial
<220>
<223> FOLR1-mH-R
<400> 17

catactagtt caatggtgat ggtgatgatg accggtatgc atattcagat cctcttctga 60

gatgagtttt tgttcgaagg gccctctaga ctcgagcatg gctgcagcat agaacctcgc 120

c 121
<210> 18 <211> 24 <212> ADN <213> Artificial
<220>
<223> RatIgG1H-A <400> 18
cgctggacag ggctccagag ttcc 24
<210> 19 <211> 27 <212> ADN <213> Artificial
<220>
<223> RatIgG1H-B <400> 19
gcaatcacct ccacagtttc tgggcac 27
5
10
15
20
25
30
35
40
<210> 20 <211> 31 <212>ADN <213> Artificial
<220>
<223> Ratk-A <400> 20
gactgaggca cctccagttg ctaactgttc c 31
<210> 21 <211> 29 <212> ADN <213> Artificial
<220>
<223> Ratk-B <400> 21
cctgttgaag ctcttgacga cgggtgagg 29
<210> 22 <211> 429 <212> ADN <213> Artificial
<220>
<223> RA15-7VH_ADN <400> 22

atgaagttgt ggctgaactg gattttcctt ttaacacttt taaatggtat ccagtgtgag 60

gtgaagttgt tggaatctgg aggaggtttg gtacagccgg ggggttctat gagactctcc 120

tgtgnagctt ctggattcac cttcactgat ttctacatga antggatcng cnagcctgca 180

gggaaggcac ctgagtggtt gggttttatt agaaacaaag ctaatggtta cacaacagag 240

ttcaatccgt ctgtgaaggg gcggttcgcc atctccagag ataataccca aaacatgctc 300

tatcttcaaa tgaacaccct aagagctgag gacactgcca cttactactg tgcaagatgc 360

ctctatggat atgcctatta ctatgttatg gatgcctggg gtcaaggaac ttcagtcact 420

gtctcctca 429
<210> 23 <211> 143 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> RA15-7VH_AA <400> 23
10
imagen4
<210> 24 <211> 381 <212>ADN <213> Artificial
<220>
<223> RA15-7VL_ADN <400> 24
ccactcagct
cctggggttg atgctactgt ggattacaga tgccatatgt 60
tgacacagtc
tccagcttcc ctgtctgcat ctctgggaga aactgtcacc 120
gaacaagtga
agacattttc cgtaatttag cgtggtatca gcagagacca 180
ctcagctcct
gatctatgat acaaataggt tggcagatgg ggtcccatca 240
gcagtggttc
tggcacacag tattctctaa agataaatag tctgcaatct 300
caggttattt
ctgtcaacaa tatgacaatt atccgctcac gttcggttct 360
tggagatcaa
a 381
15
<210> 25 <211> 127 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> RA15-7VL AA
<400> 25
5

Met Gly Val Pro Thr Gin Leu Leu Gly Leu Met Leu Leu Trp lie Thr 15 10 15

Asp Ala lie Cys Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ser 20 25 30

Ala Ser Leu Gly Glu Thr Val Thr lie Glu Cys Arg Thr Ser Glu Asp 35 40 45

lie Phe Arg Asn Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Arg Pro Gly Asn Ser Pro 50 55 60

Gin Leu Leu lie Tyr Asp Thr Asn Arg Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser 65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gin Tyr Ser Leu Lys lie Asn 85 90 95

Ser Leu Gin Ser Glu Asp Val Ala Gly Tyr Phe Cys Gin Gin Tyr Asp 100 105 110

Asn Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 115 120 125
<210> 26 <211> 372 5 <212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> nonS_RA15-7VH_ADN
10
<400> 26

gaggtgaagt tgttggaatc tggaggaggt ttggtacagc cggggggttc tatgagactc 60

tcctgtgcag cttctggatt caccttcact gatttctaca tgaactggat ccgccagcct 120

gaagggaagg cacctgagtg gttgggtttt attagaaaca aagctaatgg ttacacaaca 180

gagttcaatc cgtctgtgaa ggggcggttc gccatctcca gagataatac ccaaaacatg 240

ctctatcttc aaatgaacac cctaagagct gaggacactg ccacttacta ctgtgcaaga 300

tgcctctatg gatatgccta ttactatgtt atggatgcct ggggtcaagg aacttcagtc 360

actgtctcct ca 372
<210> 27
15 <211> 124
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
20 <223> nonS_RA15-7VH_AA
<400> 27
Glu Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Met Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Phe 20 25 30
Tyr Met Asn Trp lie Arg Gin Pro Ala Gly Lys Ala Pro Glu Trp Leu 35 40 45
Gly Phe He Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Phe Asn Pro 50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Ala lie Ser Arg Asp Asn Thr Gin Asn Met 65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gin Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr 85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Cys Leu Tyr Gly Tyr Ala Tyr Tyr Tyr Val Met Asp
100 105 110
Ala Trp Gly Gin Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
5 <210> 28
<211> 321 <212>ADN <213> Artificial
10
15
20
<220>
<223> nonS_RA15-7VL_ADN <400> 28

gacatccaga tgacacagtc tccagcttcc ctgtctgcat ctctgggaga aactgtcacc 60

atcgaatgtc gaacaagtga agacattttc cgtaatttag cgtggtatca gcagagacca 120

gggaactctc ctcagctcct gatctatgat acaaataggt tggcagatgg ggtcccatca 180

cggttcagtg gcagtggttc tggcacacag tattctctaa agataaatag tctgcaatct 240

gaagatgtcg caggttattt ctgtcaacaa tatgacaatt atccgctcac gttcggttct 300

gggaccaagc tggagatcaa a 321
<210> 29 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> nonS_RA15-7VL_AA <400> 29
5
10
15
20
25
30
35
imagen5
<210> 30 <211>5 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> RA15-7VHCDR1_AA <400> 30
Asp Phe Tyr Met Asn 1 5
<210> 31 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> RA15-7VHCDR2_AA <400> 31
imagen6
<210> 32 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> RA15-7VHCDR3_AA <400> 32
Cys Leu Tyr Gly Tyr Ala Tyr Tyr Tyr Val Met Asp Ala 15 10
<210> 33 <211> 11
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
<212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> RA15-7VLCDR1_AA <400> 33
Arg Thr Ser Glu Asp lie Phe Arg Asn Leu Ala 15 10
<210> 34 <211>7 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> RA15-7VLCDR2_AA <400> 34
Asp Thr Asn Arg Leu Ala Asp 1 5
<210> 35 <211>9 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> RA15-7VLCDR3_AA <400> 35
Gin Gin Tyr Asp Asn Tyr Pro Leu Thr 1 5
<210> 36 <211> 109 <212>ADN <213> Artificial
<220>
<223> RA15-7-VLF <400> 36
catgaattcg cctcctcaaa atgcattttc aagtgcagat tttcagcttc ctgcttattt 60
cggcctcagt cataatgtcc agaggagaca tccagatgac acagtctcc 109
<210> 37 <211> 32 <212> ADN <213> Artificial
<220>
<223> RA15-7-VLR <400> 37
catcgtacgt ttgatctcca gcttggtccc ag 32
<210> 38 <211> 101 <212> ADN <213> Artificial
<220>
<223> RA15-7-VHF
5
10
15
20
25
30
<400> 38
catgcggccg cgacccctca ccatgagagt gcttatttta ttgtggctgt tcacagcctt 60
tcctggtatt cttagtgagg tgaagttgtt ggaatctgga g 101
<210> 39 <211> 44 <212>ADN <213> Artificial
<220>
<223> RA15-7-VHR <400> 39
catgggccct tggtggaggc tgaggagaca gtgactgaag ttcc 44
<210> 40 <211> 993 <212> ADN <213> Artificial
<220>
<223> FcAcc ADN
<400> 40
gcctccacca
ggcacagcgg
tggaactcag
ggactctact
tacatctgca
aaatcttgtg
ccgtcagtct
gaggtcacat
tacgtggacg
agcacgttcc
gagtacaagt
aaaaccaaag
atgaccaaga
gccgtggagt
ctggactccg
cagcagggga
cagaagagcc
agggcccatc
ggtcttcccc ctggcaccct cctcnaagag cacctctggg 60
ccctgggctg
cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120
gcgccctgac
cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180
ccctcagcag
cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240
acgtgaatca
caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300
acaaaactca
cacatgccca acgtgcccag cacctgaact actgggggga 360
tcctcttccc
cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420
gcgtggtggt
ggacgtgagc cacgaagacc ccgaggtcca gttcaagtgg 480
gcgtggaggt
gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagttcaac 540
gtgtggtcag
cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaacggcaag 600
gcaaggtctc
caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660
gacagccccg
agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag 720
accaggtcag
cctgacctgc ctggtcaaag gcttctaccc cagcgacatc 780
gggagagcag
cgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccatg 840
acggctcctt
cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900
acatcttctc
atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960
tctccctgtc
tccgggtaaa tga 993
<210> 41 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> FcAcc AA

Claims (16)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    65
    1. Anticuerpo monoclonal o fragmento de anticuerpo del mismo que compite con un anticuerpo seleccionado de entre los (a) a (c) siguientes para reconocer espedficamente el FOLR1 humano y que se une a un epftopo identico al epftopo sobre el FOLR1 humano al que se une el anticuerpo que se encuentra en las posiciones 55 a 62 en la secuencia de aminoacidos de FOLR1 humano representada por la SEC ID n° 1 y que muestra asimismo una actividad antitumoral:
    (a) un anticuerpo en el que las regiones determinantes de complementariedad (a las que se hace referencia en adelante como cDr) 1 a 3 de cadena pesada (a la que se hace referencia en adelante como cadena H) del anticuerpo comprenden las secuencias de aminoacidos representadas por las SEC ID n° 30, 31 y
    32, respectivamente, y las CDR 1 a 3 de cadena ligera (a la que se hace referencia en adelante como cadena L) del anticuerpo comprenden las secuencias de aminoacidos representadas por las SEC ID n°
    33, 34 y 35, respectivamente;
    (b) un anticuerpo en el que las CDR 1 a 3 de cadena H del anticuerpo comprenden las secuencias de aminoacidos representadas por las SEC ID n° 30, 31 y 32, respectivamente, y las CDR 1 a 3 de cadena L del anticuerpo comprenden las secuencias de aminoacidos representadas por las SEC ID n° 33, 34 y 35, respectivamente, y la cistema en la secuencia de aminoacidos representada por la SEC ID n° 32 (CDR3 de la cadena H de anticuerpo) es sustituida por treonina, metionina, isoleucina, valina, fenilalanina o glutamina, respecto al anticuerpo; y
    (c) un anticuerpo en el que la cadena H del anticuerpo comprende la secuencia de aminoacidos representada por la SEC ID n° 98 y la cadena L del anticuerpo comprende la secuencia de aminoacidos representada por la SEC ID n° 94.
  2. 2. Anticuerpo monoclonal o fragmento de anticuerpo del mismo segun la reivindicacion 1, que es un anticuerpo recombinante.
  3. 3. Anticuerpo monoclonal o fragmento de anticuerpo del mismo segun la reivindicacion 2, en el que el anticuerpo recombinante se selecciona de entre un anticuerpo dbrido humano, un anticuerpo humanizado y un anticuerpo humano.
  4. 4. Anticuerpo monoclonal o fragmento de anticuerpo del mismo que se une a FOLR1 humano y se selecciona de entre los (a) a (c) siguientes:
    (a) un anticuerpo monoclonal y un fragmento de anticuerpo del mismo en el que las CDR 1 a 3 de cadena H del anticuerpo comprenden las secuencias de aminoacidos representadas por las SEC ID n° 30, 31 y 32, respectivamente, y las CDR 1 a 3 de cadena L del anticuerpo comprenden las secuencias de aminoacidos representadas por las SEC ID n° 33, 34 y 35, respectivamente;
    (b) un anticuerpo en el que las CDR 1 a 3 de cadena H del anticuerpo comprenden las secuencias de aminoacidos representadas por las SEC ID n° 30, 31 y 32, respectivamente, y las CDR 1 a 3 de cadena L del anticuerpo comprenden las secuencias de aminoacidos representadas por las SEC ID n° 33, 34 y 35, respectivamente, y la cistema en la secuencia de aminoacidos representada por la SEC ID n° 32 (CDR3 de la cadena H de anticuerpo) es sustituida por treonina, metionina, isoleucina, valina, fenilalanina o glutamina; y
    (c) un anticuerpo en el que la cadena H del anticuerpo comprende la secuencia de aminoacidos representada por la SEC ID n° 98 y la cadena L del anticuerpo comprende la secuencia de aminoacidos representada por la SEC ID n° 94.
  5. 5. Anticuerpo monoclonal y fragmento de anticuerpo del mismo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que se unen a la secuencia de aminoacidos de FOLR1 humano representado por la SEC ID n° 1.
  6. 6. Fragmento de anticuerpo del mismo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que se selecciona de entre Fab, Fab', F(ab')2, un anticuerpo de cadena unica (scFv), una region V dimerica (diacuerpo), una region V estabilizada por disulfuro (dsFv) y un peptido que comprende CDR.
  7. 7. ADN que codifica el anticuerpo monoclonal o el fragmento de anticuerpo del mismo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
  8. 8. Vector recombinante que comprende el ADN segun la reivindicacion 7.
  9. 9. Transformante que se obtiene introduciendo el vector recombinante segun la reivindicacion 8 en las celulas hospedadoras.
    5
    10
    15
    20
    25
  10. 10. Procedimiento para producir el anticuerpo monoclonal o el fragmento de anticuerpo del mismo segun la reivindicacion 1 o 4, que comprende cultivar el transformante segun la reivindicacion 9 en un medio, producir y acumular el anticuerpo monoclonal o el fragmento de anticuerpo del mismo segun la reivindicacion 1 o 4 en el cultivo y recoger el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo del mismo a partir del cultivo.
  11. 11. Composicion farmaceutica que comprende el anticuerpo monoclonal o el fragmento de anticuerpo del mismo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y un portador farmaceuticamente aceptable.
  12. 12. Procedimiento para detectar o medir inmunologicamente FOLR1 humano o celulas positivas para FOLR1 humano que utiliza el anticuerpo monoclonal o el fragmento de anticuerpo del mismo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
  13. 13. Procedimiento ex vivo para diagnosticar enfermedades asociadas a las celulas positivas para FOLR1 humano, que comprende detectar o medir las celulas positivas para FOLR1 humano que utiliza el anticuerpo monoclonal o el fragmento de anticuerpo del mismo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
  14. 14. Composicion farmaceutica para diagnosticar enfermedades asociadas a celulas positivas para FOLR1 humano, que comprende el anticuerpo monoclonal o el fragmento de anticuerpo del mismo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
  15. 15. Procedimiento para evaluar la eficacia terapeutica de un anticuerpo que utiliza el anticuerpo monoclonal o el fragmento de anticuerpo del mismo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, antes del inicio del tratamiento.
    FIG. 1
    RAIS-
    HVO
    HV2
    HV3
    HV4
    HV5
    HV6
    HV7
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    RA15-7
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    1234 5
    67890123456789 0123456789012345678
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    WIRQPAGKAP EWLG WVRQAPGK GL E WG WVRQP PGKGLEWG WVRQAAGK GP E WG FIRNKANGYTTEFNPSVKG
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    1234567890123
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    FIG. 2
    RA15-7
    LVQ
    LV2
    LV3
    LV 4
    LV6
    RA15-7
    LVO
    LV2
    LV3
    LV4
    LV6
    12345678901234567890123 DIQ MT Q S P A S L S A S L GE T VTIE C
    DIQMTQSPSSL SASVGDRVTITC
    DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC DIQMTQSPSSLSASLGDRVTITC DIQMTQSPSSLSASLGDRVTITC DIQMTQSPSSL SASLGDRVTITC
    45678901234
    567890123456789 0123456
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    FIG. 9
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