TW201427996A - 抗ｆｏｌｒ１抗體 - Google Patents

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Abstract

本發明係針對人類FOLR1表現細胞相關疾病提供一種抗人類FOLR1抗體，其特異地識別人類FOLR1之胺基酸序列或其立體結構且與其結合，進而抗體依賴性細胞毒殺活性(ADCC活性)等效應器活性較高。本發明可提供一種特異地識別人類FOLR1之胺基酸序列或其立體結構且與其結合並進而具有ADCC活性及CDC活性的單株抗體或該抗體片段、編碼該抗體之DNA、包含該DNA之載體、導入該載體而獲得之轉形體、使用該轉形體之該抗體或該抗體片段之製造方法、以該抗體或該抗體片段作為有效成分之治療藥及診斷藥。

Description

抗FOLR1抗體
本發明係關於一種與葉酸受體α(Folate receptor α，以下記作FOLR1)結合而發揮抗體依賴性細胞毒殺活性(antibody-dependent cellular cytotoxicity，以下記作ADCC活性)及/或補體依賴性細胞毒殺活性(Complement-Dependent Cytotoxicity，以下記作CDC活性)之單株抗體或該抗體片段、編碼該抗體或該抗體片段之DNA、包含該DNA之載體、導入該載體而獲得之轉形體、使用該轉形體的該抗體或該抗體片段之製造方法、以該抗體或該抗體片段作為有效成分之治療藥及診斷藥。
FOLR1係對葉酸具有高親和性之GPI(Glycophos Phatidyl Inositol，糖基磷脂醯肌醇)錨定型膜蛋白，對細胞之增殖或存活具有重要功能(非專利文獻1)。於正常組織中，表現FOLR1之組織侷限於腎、肺、腸等(非專利文獻2)。
又，其表現部位係位於管腔側。另一方面，癌組織中之FOLR1表現並不侷限於管腔側，於卵巢癌(非專利文獻2、非專利文獻3、非專利文獻4)、腎癌(非專利文獻2)、肺癌(非專利文獻2、非專利文獻3)、乳癌(非專利文獻2)、間皮瘤(非專利文獻4)等較多之癌種中表現較高。
尤其是卵巢癌，報告有FOLR1表現量會對惡性度、進展、預後造成影響(非專利文獻5、非專利文獻6)。進而，亦已知卵巢癌患者之血 清中所含之可溶型FOLR1與正常人相比明顯地增加(非專利文獻7)。如此，FOLR1係作為癌治療標靶所期待之分子。
作為針對FOLR1之小鼠單株抗體，已知LK26(專利文獻1)。該LK26係作為癌治療抗體對患者進行投予，故而藉由CDR(Complementarity Determining Region，互補決定區)移植法而使其人源化(專利文獻2)。然而，伴隨人源化而可見親和性明顯降低。
因此，Ebel等人基於人源化LK26抗體而製作了具有與LK26抗體同等之對FOLR1之親和性的MORAb-003抗體(非專利文獻8)。可認為MORAb-003之體外(in vitro)抗腫瘤活性係基於ADCC活性及ODC活性。
然而，報告有MORAb-003不具有抑制葉酸、5-甲基四氫葉酸(5-MTHF)或培美曲塞(Pemetrexed)與FOLR1陽性細胞之結合之活性，亦不具有抗體單獨抑制FOLR1陽性細胞之增殖之活性(非專利文獻9)。
關於MORAb-003，於投予12.5至400mg/m2之第1相臨床試驗中報告了安全性及耐受性(非專利文獻10)。進而，於以鉑敏感性復發卵巢癌患者為對象之第2相臨床試驗中，報告藉由將紫杉醇及卡鉑與MORAb-003併用而顯示優異之抗腫瘤活性。
然而，針對耐鉑性復發卵巢癌患者之臨床試驗中，期中解析中未到達統計學上預先設定之評價項目(無惡化存活期間、全存活期間)之改善目標的可能性較高，因此中止。
作為以FOLR1作為癌治療標靶之藥劑，除上述抗體以外，例如亦可列舉使抗癌劑與葉酸結合而成之EC-145等。使抗癌劑與葉酸結合而成之藥劑係基於FOLR1吸收葉酸之性質而表現藥效。因此，可認為即便體內之癌細胞表現FOLR1，使抗癌劑與葉酸結合而成之藥劑對於葉酸吸收活性較低之癌細胞亦無效。
針對實體癌之治療方法及預後之改善日新月異。然而，關於卵 巢癌，不認為1980年代利用鉑製劑之治療方法出現以後顯著地改善了預後(非專利文獻11)，卵巢癌仍然為由婦科癌導致之死亡之主要原因。可認為其原因在於，卵巢癌對於鉑製劑產生耐性而復發，結果治療變得困難。
即，卵巢癌治療之課題在於：延長自鉑製劑等化學療法之奏效至復發之時間；阻止卵巢癌對於鉑製劑之耐性化；確立對鉑製劑已耐性化之卵巢癌之治療方法。
又，卵巢癌容易伴有由腹膜轉移導致之腹水蓄積，就耐鉑性卵巢癌而言，尤其是伴隨腹水蓄積之QOL(Quality of Life，生活品質)之降低成為問題，因此需要不僅對於原發病灶之癌細胞有效、而且對於腹膜轉移或存在於腹水中之癌細胞亦有效之治療藥。
進而，需要對於FOLR1表現較高但葉酸吸收活性降低之癌細胞亦有效之治療藥。
先前技術文獻 專利文獻
專利文獻1：歐州專利申請公開第0197435號說明書
專利文獻2：美國專利第5952484號說明書
非專利文獻
非專利文獻1：Int J Cancer, 2006. 119(2)：p.243-50.
非專利文獻2：Anal Biochem, 2005. 338(2)：p.284-93.
非專利文獻3：J Thorac Oncol, 2012. 7(5)：p.833-840.
非專利文獻4：J Thorac Cardiovasc Surg, 2001. 121(2)：p.225-33.
非專利文獻5：Int J Cancer, 1997. 74(2)：p.193-8.
非專利文獻6：Int J Cancer, 1998. 79(2)：p.121-6.
非專利文獻7：PLoS One, 2009. 4(7)：p.e6292.
非專利文獻8：Cancer Immun, 2007. 7：p.6.
非專利文獻9：Cancer Chemother Pharmacol, 2012. 70(1)：p.113-20.
非專利文獻10：Clin Cancer Res, 2010, 16(21)：p.5288-95.
非專利文獻11：Nat Rev Cancer, 2011. 11(10)：p.719-25.
作為以治療困難之耐鉑性卵巢癌為代表之具有FOLR1於癌細胞中表現之特徵的癌之治療抗體，期待一種飛躍地提高抗體之ADCC活性及/或CDC活性之抗FOLR1抗體。
本發明提供一種對於來自耐鉑性卵巢癌之細胞株亦於體外(in vitro)及體內(in vivo)顯示抗腫瘤活性之抗體或該抗體片段。進而，本發明提供一種編碼該抗體或該抗體片段之DNA、包含該DNA之載體、導入該載體而獲得之轉形體、使用該轉形體的該抗體或該抗體片段之製造方法、以該抗體或該抗體片段作為有效成分之治療藥及診斷藥。
本發明之主旨係如下所述。
(1)一種單株抗體或該抗體片段，其係與選自以下之(a)~(c)中之1種抗體競爭而特異地識別人類FOLR1，其與和存在於上述抗體所結合之人類FOLR1中之抗原決定基相同之抗原決定基結合，且顯示抗腫瘤活性。
(a)一種抗體，其包括包含互補鏈決定區域(Complementarity determining region，以下記作CDR)1~3分別由序列編號30、31、32所表示之胺基酸序列的抗體之重鏈(以下記作H鏈)，且包括包含CDR 1~3分別由序列編號33、34、35所表示之胺基酸序列的抗體之輕鏈(以下記作L鏈)
(b)一種抗體，其係包括包含CDR 1~3分別由序列編號30、31、32所表示之胺基酸序列的抗體之H鏈、且包括包含CDR 1~3分別由序列編號33、34、35所表示之胺基酸序列的抗體之L鏈者，並且序列編號32(抗體H鏈之CDR 3)所表示之胺基酸序列中之半胱胺酸經蘇胺酸、甲硫胺酸、異白胺酸、纈胺酸、苯丙胺酸或穀醯胺取代
(c)一種抗體，其包括包含序列編號98所表示之胺基酸序列的抗體之H鏈、且包括包含序列編號94所表示之胺基酸序列的抗體之L鏈
(2)如上述(1)之單株抗體或該抗體片段，其為基因重組抗體。
(3)如上述(2)之單株抗體或該抗體片段，其為選自人型嵌合抗體、人源化抗體及人抗體中之基因重組抗體。
(4)一種單株抗體或該抗體片段，其係選自以下之(a)~(c)中之1種單株抗體或該抗體片段。
(a)一種單株抗體及該抗體片段，其包括包含CDR 1~3分別由序列編號30~32所表示之胺基酸序列的抗體之H鏈、且包括包含CDR 1~3分別由序列編號33~35所表示之胺基酸序列的抗體之L鏈
(b)一種抗體，其係包括包含CDR 1~3分別由序列編號30、31、32所表示之胺基酸序列的抗體之H鏈、且包括包含CDR1~3分別由序列編號33、34、35所表示之胺基酸序列的抗體之L鏈者，並且序列編號32(抗體H鏈之CDR 3)所表示之胺基酸序列中之半胱胺酸經蘇胺酸、甲硫胺酸、異白胺酸、纈胺酸、苯丙胺酸或穀醯胺取代
(c)一種抗體，其包括包含序列編號98所表示之胺基酸序列的抗體之H鏈、且包括包含序列編號94所表示之胺基酸序列的抗體之L鏈
(5)如上述(1)至(4)中任一項之單株抗體及該抗體片段，其與序列編號1所表示之人類FOLR1之胺基酸序列結合。
(6)如上述(1)至(4)中任一項之抗體片段，其係選自包含Fab、Fab'、F(ab')2、單鏈抗體(scFv)、二聚物化V區域(雙功能抗體)、二硫 化物穩定化V區域(dsFv)及CDR之肽中之抗體片段。
(7)一種DNA，其編碼如上述(1)至(4)中任一項之單株抗體或該抗體片段。
(8)一種重組體載體，其含有如上述(7)之DNA。
(9)一種轉形株，其係將如上述(8)之重組體載體導入至宿主細胞中而獲得。
(10)一種如上述(1)至(4)中任一項之單株抗體或該抗體片段之製造方法，其特徵在於：於培養基中對如上述(9)之轉形株進行培養，於培養物中生成並蓄積如上述(1)或(4)之單株抗體或該抗體片段，並自培養物中採取該抗體或該抗體片段。
(11)一種人類FOLR1陽性細胞相關疾病之治療方法，其包括投予如上述(1)至(4)中任一項之單株抗體或該抗體片段。
(12)一種人類FOLR1陽性細胞相關疾病之治療藥，其包含如上述(1)至(4)中任一項之單株抗體或該抗體片段及藥理學上所容許之載體。
(13)一種人類FOLR1或人類FOLR1陽性細胞之免疫學檢測或測定方法，其係使用如上述(1)至(4)中任一項之單株抗體或該抗體片段。
(14)一種人類FOLR1陽性細胞相關疾病之診斷方法，其包括使用如上述(1)至(4)中任一項之單株抗體或該抗體片段檢測或測定人類FOLR1陽性細胞。
(15)一種人類FOLR1陽性細胞相關疾病之診斷藥，其包含如上述(1)至(4)中任一項之單株抗體或該抗體片段。
(16)一種方法，其係使用如上述(1)至(4)中任一項之單株抗體或該抗體片段，於治療開始前判斷該抗體之治療有效性。
本發明之單株抗體或該抗體片段係特異地識別人類FOLR1之胺基 酸序列或其立體結構且與其結合。本發明之單株抗體或該抗體片段具有較高之ADCC活性及CDC活性，進而對於來自耐鉑性卵巢癌之細胞株亦顯示抗腫瘤活性。
本發明之單株抗體或該抗體片段對於FOLR1低表現細胞亦具有ADCC活性。進而，本發明之單株抗體或該抗體片段對於存在於腹水中之表現FOLR1之癌細胞亦具有ADCC活性。並且，對於表現FOLR1之癌細胞，即便其葉酸吸收活性降低，本發明之單株抗體或該抗體片段亦具有ADCC活性。
又，本發明之單株抗體或該抗體片段不會抑制FOLR1與葉酸之結合。與人類FOLR1特異地結合且具有較高之ADCC活性及CDC活性的本發明之單株抗體或該抗體片段對於人類FOLR1陽性細胞相關疾病之治療及診斷等較為有用。
又，本發明可提供一種編碼該抗體之DNA、包含該DNA之載體、導入該載體而獲得之轉形體、使用該轉形體的該抗體或該抗體片段之製造方法、以該抗體或該抗體片段作為有效成分之治療藥及診斷藥。
圖1表示不含訊號序列之RA15-7抗體重鏈可變區域及各人源化RA15-7抗體改型體重鏈可變區域(HV0、HV2、HV3、HV4、HV5、HV6、HV7、HV8、HV10)之胺基酸序列。
圖2表示不含訊號序列之RA15-7抗體輕鏈可變區域及各人源化RA15-7抗體改型體輕鏈可變區域(LV0、LV2、LV3、LV4、LV6)之胺基酸序列。
圖3表示將ChRA15-7Acc抗體之親和性性設為100之情形時之HV7LV3-CDRH3-Cys101改型抗體相對於FOLR1-mycHis的親和性性評價結果(表面電漿子共振法)。
圖4(a)、(b)、(c)及(d)表示各抗體(DNPDF、MORAb-003DF、ChRA15-7DF、HuRA15-7CTDF)相對於FOLR1-Fc(黑圓點)、食蟹猴FOLR1-Fc(白圓點)、FOLR2-Fc(黑三角)及FOLR3-Fc(×)之反應性評價結果(ELISA)。縱軸表示吸光度，橫軸表示抗體濃度(ng/mL)。
圖5(a)及(b)表示HuRA15-7CTAcc抗體(黑圓點)、HuRA15-7Acc抗體(黑四角)及ChRA15-7Acc抗體(黑三角)相對於耐鉑性卵巢癌細胞株SKOV-3或OVCAR-3之ADCC活性評價結果。縱軸表示ADCC活性(%)，橫軸表示抗體濃度(ng/mL)。
圖6(a)及(b)表示對於卵巢癌細胞株IGR-OV1之CDC活性。縱軸表示CDC活性(%)，橫軸表示抗體濃度(μg/mL)。圖6(a)表示HuRA15-7CTAcc抗體(黑圓點)、HuRA15-7CTDF抗體(白圓點)、ChRA15-7Acc抗體(黑三角)及ChRA15-7DF抗體(白三角)之CDC活性評價結果。圖6(b)表示HuRA15-7CTAcc抗體(黑圓點)及MORAb-003抗體(黑三角)之CDC活性評價結果。
圖7(a)、(b)及(c)表示HuRA15-7CTAcc抗體(黑圓點)、MORAb-003Acc抗體(白三角)及MORAb-003抗體(黑三角)相對於卵巢癌細胞株IGR-OV1、SKOV-3或OVCAR-3之ADCC活性評價結果。縱軸表示ADCC活性(%)，橫軸表示抗體濃度(ng/mL)。
圖8表示HuRA15-7CTDF-770抗體(黑圓點)及MORAb-003DF-770抗體(黑三角)相對於對小鼠進行皮下移植並形成進展期癌之耐鉑性卵巢癌細胞株SKOV-3之集積性評價結果。縱軸表示各抗體之螢光強度相對於腫瘤部位之內部標準DNPDF-680抗體之螢光強度的比，橫軸表示投予後時間(日)。
圖9表示HuRA15-7CTAcc抗體(黑圓點)、HuRA15-7CRAcc抗體(白圓點)及MORAb-003DF抗體(黑三角)相對於耐鉑性卵巢癌細胞株OVCAR-3之ADCC活性評價結果。縱軸表示ADCC活性(%)，橫軸表示 抗體濃度(ng/mL)。
圖10表示以小鼠IgG2a作為陰性對象，使用LK26抗體並利用流式細胞儀對卵巢癌細胞株IGR-OV1、SKOV-3、OVCAR-3或MCAS中所表現之FOLR1進行解析，藉此使各卵巢癌細胞株上所表現之FOLR1分子數定量化的結果。縱軸表示每一細胞之FORL1表現分子數。
圖11(a)、(b)、(c)及(d)表示於卵巢癌性腹水中之細胞集團中加入作為HuRA15-7CTAcc抗體(黑圓點)、MORAb-003抗體(黑三角)及陰性對象之DNPDF抗體(X)時的對於FOLR1陽性細胞之細胞毒殺活性。縱軸表示細胞毒殺活性(%)，橫軸表示抗體濃度(ng/mL)。FZ12、FZ21、FZ26及FZ44分別表示卵巢癌性腹水之施體。
圖12(a)及(b)表示對各種卵巢癌細胞株之FOLR1表現量及葉酸吸收量進行解析之結果。圖12(a)表示使用HuRA15-7CTAcc抗體並利用流式細胞儀對FOLR1表現量進行解析之結果。圖12(b)表示使用標識化葉酸並利用流式細胞儀對葉酸吸收量進行解析之結果。縱軸表示對於陰性對象之相對MFI值，橫軸表示解析之卵巢癌細胞株。
作為本發明中之人類FOLR1，可列舉：包含序列編號1或基因庫許可編號NM_016725所表示之胺基酸序列且具有人類FOLR1之功能的多肽；包含使序列編號1或基因庫許可編號NM_016725所表示之胺基酸序列缺失、取代或加成1個以上胺基酸之胺基酸序列且具有人類FOLR1之功能的多肽；及包含與序列編號1或基因庫許可編號NM_016725所表示之胺基酸序列具有60%以上、較佳為80%以上、進而較佳為90%以上之相同性之胺基酸序列的多肽，包含具有最佳為95%以上之相同性之胺基酸序列且具有人類FOLR1之功能的多肽；包含具有序列編號1或基因庫許可編號NM_016725所表示之胺基酸序列之部分序列之胺基酸序列且具有人類FOLR1之功能的多肽等。
作為人類FOLR1之功能，係指藉由與配位子(例如葉酸)之結合而引起內噬作用並將葉酸吸收至細胞內。
作為獲得包含使序列編號1或基因庫許可編號NM_016725所表示之胺基酸序列缺失、取代或加成1個以上胺基酸之胺基酸序列的多肽之方法，可列舉：利用部位特異性變異導入法[分子選植試驗手冊、第二版、冷泉港實驗室出版(1989)、分子生物學通用方法、約翰威立(1987-1997)、Nucleic Acids Research、10、6487(1982)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、79、6409、(1982)、Gene、34、315(1985)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、82、488(1985)]等於例如編碼具有序列編號1所表示之胺基酸序列的多肽之DNA、即編碼人類FOLR1之基因中導入部位特異性變異之方法。
缺失、取代或加成之胺基酸之數並無特別限定，較佳為1個~數十個、例如1~20個胺基酸，更佳為1個~數個、例如1~5個胺基酸。
作為編碼人類FOLR1之基因，可列舉序列編號1或基因庫許可編號NM_016725所表示之鹼基序列。編碼本發明之人類FOLR1之基因亦包括：包含編碼含有使序列編號1或基因庫許可編號NM_016725所表示之鹼基序列缺失、取代或加成1個以上鹼基之鹼基序列且具有人類FOLR1之功能的多肽之DNA者；包含編碼含有與序列編號1或基因庫許可編號NM_016725所表示之鹼基序列具有至少60%以上之相同性之鹼基序列、具有較佳為80%以上之相同性之鹼基序列、具有進而較佳為95%以上之相同性之鹼基序列且具有人類FOLR1之功能的多肽之DNA者；及包含編碼含有於嚴格之條件下與具有序列編號1或基因庫許可編號NM_016725所表示之鹼基序列之DNA雜交之DNA且具有人類FOLR1之功能的多肽之DNA者等。
作為於嚴格之條件下雜交之DNA，係指藉由將具有序列編號1或基因庫許可編號NM_016725所表示之鹼基序列之DNA用於探針的菌落 雜交法、噬菌斑雜交法、南方墨點雜交法或DNA微陣列法等而獲得之可雜交之DNA。
具體而言，可列舉可藉由如下方式鑑定之DNA：利用使來自雜交之菌落或噬菌斑之DNA、或具有該序列之PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶鏈鎖反應)產物或寡聚DNA固定化之過濾片或載玻片，於0.7~1.0mol/L之氯化鈉存在下且在65℃下進行雜交[分子選植試驗手冊、第二版、冷泉港實驗室出版(1989)、分子生物學通用方法、約翰威立(1987-1997)、DNA Cloning 1：Coretechniques、A Practical Approach、第二版、牛津大學(1995)]後，使用0.1~2倍濃度之SSC(Saline Sodium Citrate，氯化鈉-檸檬酸鈉)溶液(1倍濃度之SSC溶液之組成包含150mmol/L氯化鈉、15mmol/L檸檬酸鈉)於65℃條件下對過濾片或載玻片進行洗淨。
作為上述可雜交之DNA，可列舉：與序列編號1或基因庫許可編號NM_016725所表示之鹼基序列具有至少60%以上之相同性之DNA、具有較佳為80%以上之相同性之DNA、具有進而較佳為95%以上之相同性之DNA。
於編碼真核生物之蛋白質之基因之鹼基序列中經常發現基因之多型。於本發明所使用之基因中，藉由上述多型而使鹼基序列產生小規模變異之基因亦包含於編碼本發明之FOLR1之基因中。
關於本發明中之相同性之數值，除特別地明確之情形以外，亦可為利用業者公知之相同性檢索程式算出之數值，就鹼基序列而言，可列舉利用BLAST[J.Mol.Biol.、215、403(1990)]中預設之參數算出之數值等，就胺基酸序列而言，可列舉利用BLAST2[Nucleic Acids Res.、25、3389(1997)、Genome Res.7、649(1997)、http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Education/BLASTinfo/information3.html]中預設之參數算出之數值等。
作為預設之參數，於為鹼基序列之情形時，G(Cost to open gap，起始空位罰分)為5，於為胺基酸序列之情形時，G為11，於為鹼基序列之情形時，-E(Cost to extend gap，空位延伸罰分)為2，於為胺基酸序列之情形時，-E為1，-q(Perlalty for nucleotide mismatch，核苷酸錯配罰分)為-3，-r(reward for nucleotide match，核苷酸匹配得分)為1，-e(expect value，期望值)為10，於為鹼基序列之情形時，-W(wordsize，序列長度)為11殘基，於為胺基酸序列之情形時，-W為3殘基、於為blastn之情形時，-y[Dropoff(X)for blast extensions in bits，BLAST延伸於比特上之下降]為20，於blastn以外之程式中，-y為7，-X(X dropoff value for gapped alignment in bits，以比特計對於中斷比對之X下降值)為15，且於為blastn之情形時，Z(final X dropoff value for gapped alignment in bits，以比特計對於中斷比對之最終X下降值)為50，於blastn以外之程式中，Z為25(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/html/blastcgihelp.html)。
作為獲得包含序列編號1或基因庫許可編號NM_016725所表示之胺基酸序列之部分序列的多肽之方法，例如可藉由使編碼序列編號1所表示之胺基酸序列之DNA之一部分缺失並對導入包含其之表現載體的轉形體進行培養而製作。
又，包含使序列編號1或基因庫許可編號NM_016725所表示之胺基酸序列之部分序列缺失、取代或加成1個以上胺基酸之胺基酸序列的多肽亦可利用上述部位特異性變異導入法等而獲得。
進而，包含序列編號1或基因庫許可編號NM_016725所表示之胺基酸序列之部分序列的多肽、或包含使序列編號1或基因庫許可編號NM_016725所表示之胺基酸序列之部分序列缺失、取代或加成1個以上胺基酸之胺基酸序列的多肽亦可藉由茀基甲氧基羰基(Fmoc，Fluorenylmethyloxycarbonyl)法或第三丁氧羰基(tBoc，t- Butyloxycarbonyl)法等化學合成法而製造。
本發明之單株抗體(以下亦稱為本發明之抗體)或該抗體片段係特異地識別人類FOLR1之胺基酸序列或其立體結構且與其結合之抗體或該抗體片段，具有抗腫瘤活性。
作為本發明中之人類FOLR1之立體結構，只要具有與包含序列編號1所表示之胺基酸序列之第1號至第257號所表示之胺基酸序列的人類FOLR1可以天然狀態獲得之結構同等之結構，則可為任意結構。所謂人類FOLR1可以天然狀態獲得之立體結構，係指人類FOLR1之天然型立體結構。
所謂本發明中之抗腫瘤活性，具體而言，可列舉ADCC活性及CDC活性。
所謂本發明中之ADCC活性，係指與細胞表面之人類FOLR1結合之抗體經由Fc部分而主要與自然殺手細胞(以下記作NK細胞)表面之FcγRIIIa結合，其結果，藉由自NK細胞放出之穿孔素或顆粒溶解酶等細胞毒殺性分子而產生之細胞融解反應[Clark M、Chemical Immunology、65、88(1997)；Gorter A等人、Immunol.Today、20、576(1999)]。
本發明之抗體不僅對於FOLR1高表現細胞，而且對於低表現細胞亦具有ADCC活性。又，與先前之抗FOLR1單株抗體相比，本發明之抗體對FOLR1低表現細胞顯示更高之ADCC活性。細胞中之FOLR1表現量可藉由西方墨點法、公知之免疫學檢測法或螢光細胞染色法等而確認。
具體而言，例如可列舉使用FMAT8100HTS system(Applied Biosystem公司製造)等之螢光抗體染色法[Cancer Immunol.Immunother.、36、373(1993)]、使用流式細胞儀之螢光細胞染色法等方法。進而，本發明之抗體之ADCC活性並不依存於細胞之葉酸吸收 量。本發明之抗體對於葉酸吸收量較低之FOLR1表現細胞亦具有ADCC活性。
細胞中之葉酸吸收量例如可利用由通常之免疫學檢測或測定法中使用之標記物所標記的葉酸而確認。
作為標記物，例如可列舉：鹼性磷酸酶、過氧化酶或螢光酶等酶、吖啶酯或咯吩等發光物質、或螢光異硫氰酸鹽(FITC，Fluorescein isothiocyanate)或異硫氰酸四甲基羅丹明(RITC，Tetramethyl rhodamine isothiocyanate)等螢光物質、放射性同位元素等。
所謂本發明中之CDC活性，係指與細胞表面之人類FOLR1結合之抗體經由Fc部分而與作為補體系C1之一成分的C1q結合，其結果，使C1至C9之各補體成分活化，最終C5至C9於細胞膜上形成稱為膜侵入複合體之孔形成聚合物而引起細胞溶解之反應[Immunol Today.1999 Dec；20(12)：576-82.]。
作為上述抗體，具體而言，可列舉以下之(i)或(ii)之單株抗體及該抗體片段。
(i)一種抗體，其包括包含CDR 1~3分別由序列編號30、31、32所表示之胺基酸序列的抗體之H鏈且包括包含CDR 1~3分別由序列編號33、34、35所表示之胺基酸序列的抗體之L鏈
(ii)一種抗體，其係包括包含CDR 1~3分別由序列編號30、31、32所表示之胺基酸序列的抗體之H鏈且包括包含CDR 1~3分別由序列編號33、34、35所表示之胺基酸序列的抗體之L鏈者，且使序列編號32(抗體H鏈之CDR 3)所表示之胺基酸序列中之半胱胺酸經蘇胺酸、甲硫胺酸、異白胺酸、纈胺酸、苯丙胺酸或穀醯胺取代
又，作為本發明之單株抗體，更具體而言，可列舉以下之(a)之單株抗體及該抗體片段。
(a)一種單株抗體及該抗體片段，其包括包含序列編號98所表示之胺基酸序列的抗體之VH且包括包含序列編號94所表示之胺基酸序列的抗體之VL
進而，作為本發明之單株抗體，可列舉：與上述單株抗體競爭而特異地識別人類FOLR1之胺基酸序列或其立體結構，與和存在於上述單株抗體所結合之人類FOLR1中之抗原決定基相同的抗原決定基結合之單株抗體及該抗體片段。
本發明中，所謂與單株抗體競爭之抗體，係指於與本發明之單株抗體相同或部分相同之人類FOLR1上具有抗原決定基(亦稱為Epitope)並與該抗原決定基結合之抗體。所謂與和本發明之單株抗體所結合之抗原決定基相同之抗原決定基結合的抗體，係指識別與本發明之單株抗體所識別之人類FOLR1之胺基酸序列相同的序列並與其結合之抗體。
關於本發明之單株抗體或該抗體片段與人類FOLR1之胺基酸序列或其立體結構結合之情況，可藉由利用使人類FOLR1固相化者之酶免疫測定法(ELISA)、西方墨點法、免疫組織染色(IHC)法、針對表現人類FOLR1之細胞的公知之免疫學檢測法、螢光細胞染色法等檢查特定抗原與針對特定抗原之抗體的結合性之方法而確認。
具體而言，可列舉使用FMAT8100HTS system(Applied Biosystem公司製造)等之螢光抗體染色法[Cancer Immunol.Immunother.、36、373(1993)]、使用流式細胞儀之螢光細胞染色法、使用Biacore system(GE healthcare公司製造)等之表面電漿子共振、使用ITC(DKSH公司製造)等之等溫滴定量熱法等方法。
於藉由利用Biacore system(GE healthcare公司製造)等之表面電漿子共振而確認本發明之單株抗體或該抗體片段與人類FOLR1之胺基酸序列或其立體結構結合的情況之情形時，較佳為利用胺偶合法將抗 IgG抗體固定於感測片CM5上之後，使該抗體或該抗體片段流過並結合適當量，進而使濃度已知之複數濃度之FOLR1或其融合體流過並對結合、解離進行測定。
又，亦可組合其他公知之免疫學檢測法[Monoclonal Antibodies-Principles and practice、Third edition、Academic Press(1996)、抗體試驗手冊、冷泉港實驗室(1988)、單株抗體實驗手冊、Kodansha Scientific(1987)]等而確認。
作為表現人類FOLR1之細胞，只要表現該FOLR1，則可為任意細胞，例如可列舉：天然存在於人體內之細胞、藉由由天然存在於人體內之細胞所確立的細胞株或基因重組技術而獲得之細胞等。
作為天然存在於人體內之細胞，例如可列舉癌患者體內之表現該FOLR1之細胞，具體而言，可列舉卵巢癌細胞、腎癌細胞、子宮內膜癌細胞、肺癌細胞、乳癌細胞、膀胱癌細胞、胰腺癌細胞及結腸癌細胞等[Anal Biochem、2005、338(2)：p.284-93.]。
作為由天然存在於人體內之細胞所確立之細胞株，例如可列舉：使自上述癌患者獲得之表現該FOLR1之細胞株化而獲得之細胞株中的表現該FOLR1之細胞株。
例如可列舉：由人所確立之細胞株即來自卵巢癌之細胞株SKOV-3[American Type Culture Collection(以下記作ATCC)編號：HTB-77]、TOV-112D(ATCC編號：CRL-11731)、ES-2(ATCC編號：CRL-1978)、OV-90(ATCC編號：CRL-11732)、PA-1(ATCC編號：CRL-1572)、Caov-3(ATCC編號：HTB-75)、OVISE(JCRB細胞編號：JCRB1043)、MCAS(JCRB細胞編號：JCRB0240)、NIH：OVCAR-3(ATCC編號：HTB-161)、IGR-OV1(National Cancer Institute)或RMG-1(JCRB細胞編號：JCRB0172)等。
作為由基因重組技術所獲得之細胞，具體而言，例如可列舉： 藉由將包含編碼該FOLR1之cDNA之表現載體導入至昆蟲細胞或動物細胞等中而獲得的表現該FOLR1之細胞等。
作為本發明之單株抗體，可列舉：藉由利用包含由融合瘤所生產之抗體或抗體基因之表現載體進行轉形的轉形體而生產之基因重組抗體。
所謂單株抗體，係單株抗體產生細胞所分泌之抗體，其特徵在於僅識別一個抗原決定基(亦稱為Epitope)且構成單株抗體之胺基酸序列(一次結構)較為均勻。
作為抗原決定基，例如可列舉單株抗體所識別並結合之單一胺基酸序列、包含胺基酸序列之立體結構、糖鏈所結合之胺基酸序列及包含糖鏈所結合之胺基酸序列之立體結構等。
本發明之單株抗體所結合之抗原決定基較佳為包含於序列編號1所表示之人類FOLR1之胺基酸序列(NCBI Reference Sequence：NM_016725.1)中之第55號~第62號胺基酸序列中。
本發明之單株抗體所結合之抗原決定基之胺基酸序列較佳為包含選自序列編號1之第55號~第62號胺基酸中的至少1個胺基酸，更佳為包含選自第55號、第56號、第57號、第58號、第59號、第60號、第61號及第62號胺基酸中之至少1個胺基酸。
又，本發明之單株抗體所結合之抗原決定基之胺基酸序列較佳為包含選自人類FOLR1之胺基酸序列中的序列編號1之第55號~第62號胺基酸序列中之至少連續之2個以上胺基酸，更佳為包含選自第55號、第56號、第57號、第58號、第59號、第60號、第61號及第62號胺基酸中之至少1個胺基酸且包含選自序列編號1之第55號~第62號胺基酸序列中之至少連續之2個以上胺基酸。
具體而言，作為本發明之單株抗體所結合之抗原決定基之胺基酸序列，可列舉包含序列編號1之第55號~第62號胺基酸之胺基酸序 列等。
融合瘤例如可藉由如下方式製備：製備表現上述人類FOLR1之細胞等作為抗原，自對該抗原免疫之動物誘導具有抗原特異性之抗體生產細胞，進而，使該抗體生產細胞與骨髓瘤細胞融合。培養該融合瘤或對動物投予該融合瘤細胞而使該動物腹水癌化，使該培養液或腹水分離、精製，藉此可獲得抗FOLR1單株抗體。
作為對抗原免疫之動物，只要可製作融合瘤，則可使用任意者，較佳為使用小鼠、大鼠、倉鼠、雞或兔子等。又，本發明之抗體亦包括：自上述動物獲得具有抗體產生能力之細胞，於體外(in vitro)對該細胞實施免疫後，與骨髓瘤細胞融合之製作的融合瘤所生產之抗體等。
本發明中，作為基因重組抗體，包含人型嵌合抗體、人型CDR移植抗體、人抗體或抗體片段等由基因重組所製造之抗體。於基因重組抗體中，作為治療藥，較佳為具有單株抗體之特徵，抗原性較低，延長血中半生期者。基因重組抗體例如可列舉使用基因重組技術使上述本發明之單株抗體改型者。
人型嵌合抗體係指包含人以外之動物之抗體之VH及VL、與人抗體之重鏈恆定區(以下記作CH)及輕鏈恆定區(以下記作CL)的抗體。本發明之人型嵌合抗體可以如下方式製造：自產生特異地識別人類FOLR1之胺基酸序列或其立體結構且與其結合之單株抗體的融合瘤獲得編碼VH及VL之cDNA，分別插入至具有編碼人抗體之CH及CL之基因的動物細胞用表現載體內而構築人型嵌合抗體表現載體，藉由導入至動物細胞內而使其表現。
作為人型嵌合抗體之CH，只要屬於人免疫球蛋白(以下記作hIg)，則可為任意者，較佳為使用hIgG型者，進而可使用屬於hIgG型之hIgG1、hIgG2、hIgG3或hIgG4等亞型之任一者。又，作為人型嵌 合抗體之CL，只要屬於hIg，則可為任意者，可使用κ型或λ型者。
作為本發明之人型嵌合抗體，具體而言，可列舉包括包含序列編號27所表示之胺基酸序列的抗體之VH且包括包含序列編號29所表示之胺基酸序列的抗體之VL之嵌合抗體。
進而，作為本發明之嵌合抗體，可列舉：與本發明之單株抗體競爭而特異地識別人類FOLR1之胺基酸序列或其立體結構，與和存在於上述單株抗體所結合之人類FOLR1中之抗原決定基相同的抗原決定基結合之嵌合抗體。
所謂人型CDR移植抗體，有時亦稱為人源化抗體，係指將人以外之動物之抗體之VH及VL的CDR之胺基酸序列移植至人抗體之VH及VL之適當位置的抗體。本發明之人型CDR移植抗體可以如下方式製造：將特異地識別人類FOLR1之胺基酸序列或其立體結構且與其結合之人以外之動物的單株抗體之VH及VL之CDR之胺基酸序列移植至任意之人抗體之VH及VL之構架區(以下記作FR)而形成V區域，構築編碼該V區域之cDNA，分別插入至具有編碼人抗體之CH及CL之基因的動物細胞用表現載體內而構築人型CDR移植抗體表現載體，藉由導入至動物細胞內而使其表現。
作為人型CDR移植抗體之CH，只要屬於hIg，則可為任意者，較佳為使用hIgG型者，進而可使用屬於hIgG型之hIgG1、hIgG2、hIgG3或hIgG4等亞型之任一者。又，作為人型CDR移植抗體之CL，只要屬於hIg，則可為任意者，可使用κ型或λ型者。
作為本發明之人型CDR移植抗體，具體而言，可列舉包括包含CDR 1~3由序列編號30~32所表示之胺基酸序列的抗體之VH且包括包含CDR 1~3由序列編號33~35所表示之胺基酸序列的抗體之VL之人源化抗體。
作為本發明之人源化抗體，具體而言，可列舉包含以下之(a)VH 及(b)VL之至少一者之人源化抗體。
(a)包含使選自序列編號100之胺基酸序列、或序列編號100之胺基酸序列之第18號Leu、第30號Ser、第37號Val、第40號Ala、第41號Pro、第44號Gly、第45號Leu、第48號Val、第76號Asp及第95號Val中之至少1個胺基酸殘基經其他胺基酸殘基取代之胺基酸序列的抗體之VH
(b)包含使選自序列編號101之胺基酸序列、或序列編號101之胺基酸序列中之第15號Val、第43號Ala、第45號Lys、第71號Phe、第85號Thr及第87號Tyr中之至少1個胺基酸殘基經其他胺基酸殘基取代之胺基酸序列的抗體之VL
進而，作為本發明之人源化抗體中所含之VH，較佳為以下之(1)~(8)。
(1)包含使序列編號100之胺基酸序列中之第18號Leu、第30號Ser、第37號Val、第40號Ala、第41號Pro、第44號Gly、第45號Leu、第48號Val、第76號Asp及第95號Val經其他胺基酸殘基取代之胺基酸序列的VH
(2)包含使序列編號100之胺基酸序列中之第37號Val、第40號Ala、第41號Pro、第44號Gly、第45號Leu、第48號Val、第76號Asp及第95號Val經其他胺基酸殘基取代之胺基酸序列的VH
(3)包含使序列編號100之胺基酸序列中之第30號Ser、第40號Ala、第44號Gly、第45號Leu、第48號Val、第76號Asp及第95號Val經其他胺基酸殘基取代之胺基酸序列的VH
(4)包含使序列編號100之胺基酸序列中之第37號Val、第40號Ala、第41號Pro、第45號Leu、第48號Val及第95號Val經其他胺基酸殘基取代之胺基酸序列的VH
(5)包含使序列編號100之胺基酸序列中之第37號Val、第40號 Ala、第41號Pro、第45號Leu及第48號Val經其他胺基酸殘基取代之胺基酸序列的VH
(6)包含使序列編號100之胺基酸序列中之第40號Ala、第41號Pro、第45號Leu及第95號Val經其他胺基酸殘基取代之胺基酸序列的VH
(7)包含使序列編號100之胺基酸序列中之第41號Pro、第45號Leu及第95號Val經其他胺基酸殘基取代之胺基酸序列的VH
(8)包含使序列編號100之胺基酸序列中之第40號Ala及第95號Val經其他胺基酸殘基取代之胺基酸序列的VH
作為上述VH之胺基酸序列，例如可列舉：導入使選自序列編號100之胺基酸序列中之第18號Leu經Met取代、使第30號Ser經Thr取代、使第37號Val經Ile取代、使第40號Ala經Pro取代、使第41號Pro經Ala取代、使第44號Gly經Ala取代、使第45號Leu經Pro取代、使第48號Val經Leu取代、使第76號Asp經Asn取代、或使第95號Val經Thr取代之改型中之至少1個改型之胺基酸序列。
作為導入導入10個改型之VH之胺基酸序列，具體而言，例如可列舉：使序列編號100之胺基酸序列中之第18號Leu經Met取代、使第30號Ser經Thr取代、使第37號Val經Ile取代、使第40號Ala經Pro取代、使第41號Pro經Ala取代、使第44號Gly經Ala取代、使第45號Leu經Pro取代、使第48號Val經Leu取代、使第76號Asp經Asn取代且使第95號Val經Thr取代之胺基酸序列。
作為導入9個改型之VH之胺基酸序列，具體而言，例如可列舉以下之(1)~(10)之胺基酸序列。
(1)使序列編號100之胺基酸序列中之第18號Leu經Met取代、使第30號Ser經Thr取代、使第37號Val經Ile取代、使第40號Ala經Pro取代、使第41號Pro經Ala取代、使第44號Gly經Ala取代、使第45號Leu 經Pro取代、使第48號Val經Leu取代且使第76號Asp經Asn取代之胺基酸序列
(2)使序列編號100之胺基酸序列中之第18號Leu經Met取代、使第30號Ser經Thr取代、使第37號Val經Ile取代、使第40號Ala經Pro取代、使第41號Pro經Ala取代、使第44號Gly經Ala取代、使第45號Leu經Pro取代、使第48號Val經Leu取代且使第95號Val經Thr取代之胺基酸序列
(3)使序列編號100之胺基酸序列中之第18號Leu經Met取代、使第30號Ser經Thr取代、使第37號Val經Ile取代、使第40號Ala經Pro取代、使第41號Pro經Ala取代、使第44號Gly經Ala取代、使第45號Leu經Pro取代、使第76號Asp經Asn取代且使第95號Val經Thr取代之胺基酸序列
(4)使序列編號100之胺基酸序列中之第18號Leu經Met取代、使第30號Ser經Thr取代、使第37號Val經Ile取代、使第40號Ala經Pro取代、使第41號Pro經Ala取代、使第44號Gly經Ala取代、使第48號Val經Leu取代、使第76號Asp經Asn取代且使第95號Val經Thr取代之胺基酸序列
(5)使序列編號100之胺基酸序列中之第18號Leu經Met取代、使第30號Ser經Thr取代、使第37號Val經Ile取代、使第40號Ala經Pro取代、使第41號Pro經Ala取代、使第45號Leu經Pro取代、使第48號Val經Leu取代、使第76號Asp經Asn取代且使第95號Val經Thr取代之胺基酸序列
(6)使序列編號100之胺基酸序列中之第18號Leu經Met取代、使第30號Ser經Thr取代、使第37號Val經Ile取代、使第40號Ala經Pro取代、使第44號Gly經Ala取代、使第45號Leu經Pro取代、使第48號Val經Leu取代、使第76號Asp經Asn取代且使第95號Val經Thr取代之胺基 酸序列
(7)使序列編號100之胺基酸序列中之第18號Leu經Met取代、使第30號Ser經Thr取代、使第37號Val經Ile取代、使第41號Pro經Ala取代、使第44號Gly經Ala取代、使第45號Leu經Pro取代、使第48號Val經Leu取代、使第76號Asp經Asn取代且使第95號Val經Thr取代之胺基酸序列
(8)使序列編號100之胺基酸序列中之第18號Leu經Met取代、使第30號Ser經Thr取代、使第40號Ala經Pro取代、使第41號Pro經Ala取代、使第44號Gly經Ala取代、使第45號Leu經Pro取代、使第48號Val經Leu取代、使第76號Asp經Asn取代且使第95號Val經Thr取代之胺基酸序列
(9)使序列編號100之胺基酸序列中之第18號Leu經Met取代、使第37號Val經Ile取代、使第40號Ala經Pro取代、使第41號Pro經Ala取代、使第44號Gly經Ala取代、使第45號Leu經Pro取代、使第48號Val經Leu取代、使第76號Asp經Asn取代且使第95號Val經Thr取代之胺基酸序列
(10)使序列編號100之胺基酸序列中之第30號Ser經Thr取代、使第37號Val經Ile取代、使第40號Ala經Pro取代、使第41號Pro經Ala取代、使第44號Gly經Ala取代、使第45號Leu經Pro取代、使第48號Val經Leu取代、使第76號Asp經Asn取代且使第95號Val經Thr取代之胺基酸序列
作為導入8個改型之VH之胺基酸序列，具體而言，例如可列舉以下之(1)~(11)之胺基酸序列。
(1)使序列編號100之胺基酸序列中之第37號Val經Ile取代、使第40號Ala經Pro取代、使第41號Pro經Ala取代、使第44號Gly經Ala取代、使第45號Leu經Pro取代、使第48號Val經Leu取代、使第76號Asp 經Asn取代且使第95號Val經Thr取代之胺基酸序列
(2)使序列編號100之胺基酸序列中之第18號Leu經Met取代、使第30號Ser經Thr取代、使第37號Val經Ile取代、使第44號Gly經Ala取代、使第45號Leu經Pro取代、使第48號Val經Leu取代、使第76號Asp經Asn取代且使第95號Val經Thr取代之胺基酸序列
(3)使序列編號100之胺基酸序列中之第18號Leu經Met取代、使第30號Ser經Thr取代、使第37號Val經Ile取代、使第41號Pro經Ala取代、使第45號Leu經Pro取代、使第48號Val經Leu取代、使第76號Asp經Asn取代且使第95號Val經Thr取代之胺基酸序列
(4)使序列編號100之胺基酸序列中之第18號Leu經Met取代、使第30號Ser經Thr取代、使第37號Val經Ile取代、使第41號Pro經Ala取代、使第44號Gly經Ala取代、使第45號Leu經Pro取代、使第48號Val經Leu取代且使第95號Val經Thr取代之胺基酸序列
(5)使序列編號100之胺基酸序列中之第18號Leu經Met取代、使第30號Ser經Thr取代、使第37號Val經Ile取代、使第41號Pro經Ala取代、使第44號Gly經Ala取代、使第45號Leu經Pro取代、使第48號Val經Leu取代且使第76號Asp經Asn取代之胺基酸序列
(6)使序列編號100之胺基酸序列中之第18號Leu經Met取代、使第30號Ser經Thr取代、使第37號Val經Ile取代、使第40號Ala經Pro取代、使第45號Leu經Pro取代、使第48號Val經Leu取代、使第76號Asp經Asn取代且使第95號Val經Thr取代之胺基酸序列
(7)使序列編號100之胺基酸序列中之第18號Leu經Met取代、使第30號Ser經Thr取代、使第37號Val經Ile取代、使第40號Ala經Pro取代、使第44號Gly經Ala取代、使第45號Leu經Pro取代、使第48號Val經Leu取代且使第95號Val經Thr取代之胺基酸序列
(8)使序列編號100之胺基酸序列中之t8番目Leu經Met取代、使第 30號Ser經Thr取代、使第37號Val經Ile取代、使第40號Ala經Pro取代、使第44號Gly經Ala取代、使第45號Leu經Pro取代、使第48號Val經Leu取代且使第76號Asp經Asn取代之胺基酸序列
(9)使序列編號100之胺基酸序列中之第18號Leu經Met取代、使第30號Ser經Thr取代、使第37號Val經Ile取代、使第40號Ala經Pro取代、使第41號Pro經Ala取代、使第45號Leu經Pro取代、使第48號Val經Leu取代且使第95號Val經Thr取代之胺基酸序列
(10)使序列編號100之胺基酸序列中之第18號Leu經Met取代、使第30號Ser經Thr取代、使第37號Val經Ile取代、使第40號Ala經Pro取代、使第41號Pro經Ala取代、使第45號Leu經Pro取代、使第48號Val經Leu取代且使第76號Asp經Asn取代之胺基酸序列
(11)使序列編號100之胺基酸序列中之第18號Leu經Met取代、使第30號Ser經Thr取代、使第37號Val經Ile取代、使第40號Ala經Pro取代、使第41號Pro經Ala取代、使第44號Gly經Ala取代、使第45號Leu經Pro取代且使第48號Val經Leu取代之胺基酸序列
作為導入7個改型之VH之胺基酸序列，具體而言，例如可列舉以下之(1)~(5)之胺基酸序列。
(1)使序列編號100之胺基酸序列中之第30號Ser經Thr取代、使第40號Ala經Pro取代、使第44號Gly經Ala取代、使第45號Leu經Pro取代、使第48號Val經Leu取代、使第76號Asp經Asn取代且使第95號Val經Thr取代之胺基酸序列
(2)使序列編號100之胺基酸序列中之第40號Ala經Pro取代、使第41號Pro經Ala取代、使第44號Gly經Ala取代、使第45號Leu經Pro取代、使第48號Val經Leu取代、使第76號Asp經Asn取代且使第95號Val經Thr取代之胺基酸序列
(3)使序列編號100之胺基酸序列中之第37號Val經Ile取代、使第 40號Ala經Pro取代、使第41號Pro經Ala取代、第45號Leu經Pro取代、使第48號Val經Leu取代、使第76號Asp經Asn取代且使第95號Val經Thr取代之胺基酸序列
(4)使序列編號100之胺基酸序列中之第37號Val經Ile取代、使第40號Ala經Pro取代、使第41號Pro經Ala取代、使第44號Gly經Ala取代、使第45號Leu經Pro取代、使第48號Val經Leu取代且使第95號Val經Thr取代之胺基酸序列
(5)使序列編號100之胺基酸序列中之第37號Val經Ile取代、使第40號Ala經Pro取代、使第41號Pro經Ala取代、使第44號Gly經Ala取代、使第45號Leu經Pro取代、使第48號Val經Leu取代且使第76號Asp經Asn取代之胺基酸序列
作為導入6個改型之VH之胺基酸序列，具體而言，例如可列舉以下之(1)~(6)之胺基酸序列。
(1)使序列編號100之胺基酸序列中之第37號Val經Ile取代、使第40號Ala經Pro取代、使第41號Pro經Ala取代、使第45號Leu經Pro取代、使第48號Val經Leu取代且使第95號Val經Thr取代之胺基酸序列
(2)使序列編號100之胺基酸序列中之第40號Ala經Pro取代、使第41號Pro經Ala取代、使第45號Leu經Pro取代、使第48號Val經Leu取代、使第76號Asp經Asn取代且使第95號Val經Thr取代之胺基酸序列
(3)使序列編號100之胺基酸序列中之第37號Val經Ile取代、使第41號Pro經Ala取代、使第45號Leu經Pro取代、使第48號Val經Leu取代、使第76號Asp經Asn取代且使第95號Val經Thr取代之胺基酸序列
(4)使序列編號100之胺基酸序列中之第37號Val經Ile取代、使第40號Ala經Pro取代、使第45號Leu經Pro取代、使第48號Val經Leu取代、使第76號Asp經Asn取代且使第95號Val經Thr取代之胺基酸序列
(5)使序列編號100之胺基酸序列中之第37號Val經Ile取代、使第 40號Ala經Pro取代、使第41號Pro經Ala取代、使第45號Leu經Pro取代、使第48號Val經Leu取代且使第95號Val經Thr取代之胺基酸序列
(6)使序列編號100之胺基酸序列中之第37號Val經Ile取代、使第40號Ala經Pro取代、使第41號Pro經Ala取代、使第44號Gly經Ala取代、使第45號Leu經Pro取代且使第48號Val經Leu取代之胺基酸序列
作為導入5個改型之VH之胺基酸序列，具體而言，例如可列舉以下之(1)~(6)之胺基酸序列。
(1)序列編號100之胺基酸序列中之第37號Val經Ile取代、使第40號Ala經Pro取代、使第41號Pro經Ala取代、使第45號Leu經Pro取代且使第48號Val經Leu取代之胺基酸序列
(2)序列編號100之胺基酸序列中之第40號Ala經Pro取代、使第41號Pro經Ala取代、使第45號Leu經Pro取代、使第48號Val經Leu取代且使第95號Val經Thr取代之胺基酸序列
(3)使序列編號100之胺基酸序列中之第37號Val經Ile取代、使第41號Pro經Ala取代、使第45號Leu經Pro取代、使第48號Val經Leu取代且使第95號Val經Thr取代之胺基酸序列
(4)使序列編號100之胺基酸序列中之第37號Val經Ile取代、使第40號Ala經Pro取代、使第45號Leu經Pro取代、使第48號Val經Leu取代且使第95號Val經Thr取代之胺基酸序列
(5)使序列編號100之胺基酸序列中之第37號Val經Ile取代、使第40號Ala經Pro取代、使第41號Pro經Ala取代、使第48號Val經Leu取代且使第95號Val經Thr取代之胺基酸序列
(6)使序列編號100之胺基酸序列中之第37號Val經Ile取代、使第40號Ala經Pro取代、使第41號Pro經Ala取代、使第45號Leu經Pro取代且使第95號Val經Thr取代之胺基酸序列
作為導入4個改型之VH之胺基酸序列，具體而言，例如可列舉以 下之(1)~(7)之胺基酸序列。
(1)使序列編號100之胺基酸序列中之第40號Ala經Pro取代、使第41號Pro經Ala取代、使第45號Leu經Pro取代且使第95號Val經Thr取代之胺基酸序列
(2)使序列編號100之胺基酸序列中之第41號Pro經Ala取代、使第45號Leu經Pro取代、使第48號Val經Leu取代且使第95號Val經Thr取代之胺基酸序列
(3)使序列編號100之胺基酸序列中之第40號Ala經Pro取代、使第41號Pro經Ala取代、使第45號Leu經Pro取代且使第95號Val經Thr取代之胺基酸序列
(4)使序列編號100之胺基酸序列中之第37號Val經Ile取代、使第41號Pro經Ala取代、使第45號Leu經Pro取代且使第95號Val經Thr取代之胺基酸序列
(5)使序列編號100之胺基酸序列中之第37號Val經Ile取代、使第40號Ala經Pro取代、使第45號Leu經Pro取代且使第95號Val經Thr取代之胺基酸序列
(6)使序列編號100之胺基酸序列中之第37號Val經Ile取代、使第40號Ala經Pro取代、使第41號Pro經Ala取代且使第95號Val經Thr取代之胺基酸序列
(7)使序列編號100之胺基酸序列中之第37號Val經Ile取代、使第40號Ala經Pro取代、使第41號Pro經Ala取代且使第45號Leu經Pro取代之胺基酸序列
作為導入3個改型之VH之胺基酸序列，具體而言，例如可列舉以下之(1)~(6)之胺基酸序列。
(1)使序列編號100之胺基酸序列中之第41號Pro經Ala取代、使第45號Leu經Pro取代且使第95號Val經Thr取代之胺基酸序列
(2)使序列編號100之胺基酸序列中之第37號Val經Ile取代、使第45號Leu經Pro取代且使第95號Val經Thr取代之胺基酸序列
(3)使序列編號100之胺基酸序列中之第40號Ala經Pro取代、使第45號Leu經Pro取代且使第95號Val經Thr取代之胺基酸序列
(4)使序列編號100之胺基酸序列中之第41號Pro經Ala取代、使第45號Leu經Pro取代且使第95號Val經Thr取代之胺基酸序列
(5)使序列編號100之胺基酸序列中之第44號Gly經Ala取代、使第45號Leu經Pro取代且使第95號Val經Thr取代之胺基酸序列
(6)使序列編號100之胺基酸序列中之第45號Leu經Pro取代、使第48號Val經Leu取代且使第95號Val經Thr取代之胺基酸序列
作為導入2個改型之VH之胺基酸序列，具體而言，例如可列舉以下之(1)~(9)之胺基酸序列。
(1)使序列編號100之胺基酸序列中之第18號Leu經Met取代且使第95號Val經Thr取代之胺基酸序列
(2)使序列編號100之胺基酸序列中之第30號Ser經Thr取代且使第95號Val經Thr取代之胺基酸序列
(3)使序列編號100之胺基酸序列中之第37號Val經Ile取代且使第95號Val經Thr取代之胺基酸序列
(4)使序列編號100之胺基酸序列中之第40號Ala經Pro取代且使第95號Val經Thr取代之胺基酸序列
(5)使序列編號100之胺基酸序列中之第41號Pro經Ala取代且使第95號Val經Thr取代之胺基酸序列
(6)使序列編號100之胺基酸序列中之第44號Gly經Ala取代且使第95號Val經Thr取代之胺基酸序列
(7)使序列編號100之胺基酸序列中之第45號Leu經Pro取代且使第95號Val經Thr取代之胺基酸序列
(8)使序列編號100之胺基酸序列中之第48號Val經Leu取代且使第95號Val經Thr取代之胺基酸序列
(9)使序列編號100之胺基酸序列中之第76號Asp經Asn取代且使第95號Val經Thr取代之胺基酸序列
作為導入1個改型之VH之胺基酸序列，具體而言，例如可列舉以下之(1)~(10)之胺基酸序列。
(1)使序列編號100之胺基酸序列中之第18號Leu經Met取代之胺基酸序列
(2)使序列編號100之胺基酸序列中之第30號Ser經Thr取代之胺基酸序列
(3)使序列編號100之胺基酸序列中之第37號Val經Ile取代之胺基酸序列
(4)使序列編號100之胺基酸序列中之第40號Ala經Pro取代之胺基酸序列
(5)使序列編號100之胺基酸序列中之第41號Pro經Ala取代之胺基酸序列
(6)使序列編號100之胺基酸序列中之第44號Gly經Ala取代之胺基酸序列
(7)使序列編號100之胺基酸序列中之第45號Leu經Pro取代之胺基酸序列
(8)使序列編號100之胺基酸序列中之第48號Val經Leu取代之胺基酸序列
(9)使序列編號100之胺基酸序列中之第76號Asp經Asn取代之胺基酸序列
(10)使序列編號100之胺基酸序列中之第95號Val經Thr取代之胺基酸序列
又，作為本發明之人源化抗體中所含之VL，較佳為以下之(1)~(4)。
(1)包含使序列編號101之胺基酸序列中之第15號Val、第43號Ala、第45號Lys、第71號Phe、第85號Thr及第87號Tyr經其他胺基酸殘基取代之胺基酸序列的抗體之VL
(2)包含使序列編號101之胺基酸序列中之第15號Val、第45號Lys、第71號Phe及第87號Tyr經其他胺基酸殘基取代之胺基酸序列的抗體之VL
(3)包含使序列編號101之胺基酸序列中之第15號Val、第71號Phe及第87號Tyr經其他胺基酸殘基取代之胺基酸序列的抗體之VL
(4)包含使序列編號101之胺基酸序列中之第45號Lys及第71號Phe經其他胺基酸殘基取代之胺基酸序列的抗體之VL
作為上述VL之胺基酸序列，例如可列舉：導入選自序列編號101之胺基酸序列中之第15號Val經Leu取代、使第43號Ala經Ser取代、使第45號Lys經Gln取代、使第71號Phe經Tyr取代、使第85號Thr經Gly取代、及使第87號Tyr經Phe取代之改型中之至少1個改型之胺基酸序列。
作為導入6個改型之VL之胺基酸序列，具體而言，例如可列舉：序列編號101之胺基酸序列中之第15號Val經Leu取代、使第43號Ala經Ser取代、使第45號Lys經Gln取代、使第71號Phe經Tyr取代、使第85號Thr經Gly取代且使第87號Tyr經Phe取代之胺基酸序列。
作為導入5個改型之VL之胺基酸序列，具體而言，例如可列舉以下之(1)~(6)之胺基酸序列。
(1)使序列編號101之胺基酸序列中之第43號Ala經Ser取代、使第45號Lys經Gln取代、使第71號Phe經Tyr取代、使第85號Thr經Gly取代且使第87號Tyr經Phe取代之胺基酸序列
(2)使序列編號101之胺基酸序列中之第15號Val經Leu取代、使第45號Lys經Gln取代、使第71號Phe經Tyr取代、使第85號Thr經Gly取代且使第87號Tyr經Phe取代之胺基酸序列
(3)使序列編號101之胺基酸序列中之第15號Val經Leu取代、使第43號Ala經Ser取代、使第71號Phe經Tyr取代、使第85號Thr經Gly取代且使第87號Tyr經Phe取代之胺基酸序列
(4)使序列編號101之胺基酸序列中之第15號Val經Leu取代、使第43號Ala經Ser取代、使第45號Lys經Gln取代、使第85號Thr經Gly取代且使第87號Tyr經Phe取代之胺基酸序列
(5)使序列編號101之胺基酸序列中之第15號Val經Leu取代、使第43號Ala經Ser取代、使第45號Lys經Gln取代、使第71號Phe經Tyr取代且使第87號Tyr經Phe取代之胺基酸序列
(6)使序列編號101之胺基酸序列中之第15號Val經Leu取代、使第43號Ala經Ser取代、使第45號Lys經Gln取代、使第71號Phe經Tyr取代且使第85號Thr經Gly取代之胺基酸序列
作為導入4個改型之VL之胺基酸序列，具體而言，例如可列舉以下之(1)~(6)之胺基酸序列。
(1)使序列編號101之胺基酸序列中之第15號Val經Leu取代、使第45號Lys經Gln取代、使第71號Phe經Tyr取代且使第87號Tyr經Phe取代之胺基酸序列
(2)使序列編號101之胺基酸序列中之第45號Lys經Gln取代、使第71號Phe經Tyr取代、使第85號Thr經Gly取代且使第87號Tyr經Phe取代之胺基酸序列
(3)使序列編號101之胺基酸序列中之第15號Val經Leu取代、使第71號Phe經Tyr取代、使第85號Thr經Gly取代且使第87號Tyr經Phe取代之胺基酸序列
(4)使序列編號101之胺基酸序列中之第15號Val經Leu取代、使第45號Lys經Gln取代、使第85號Thr經Gly取代且使第87號Tyr經Phe取代之胺基酸序列
(5)使序列編號101之胺基酸序列中之第15號Val經Leu取代、使第45號Lys經Gln取代、使第71號Phe經Tyr取代且使第87號Tyr經Phe取代之胺基酸序列
(6)使序列編號101之胺基酸序列中之第15號Val經Leu取代、使第45號Lys經Gln取代、使第71號Phe經Tyr取代且使第85號Thr經Gly取代之胺基酸序列
作為導入3個改型之VL之胺基酸序列，具體而言，例如可列舉以下之(1)~(4)之胺基酸序列。
(1)使序列編號101之胺基酸序列中之第15號Val經Leu取代、使第71號Phe經Tyr取代且使第87號Tyr經Phe取代之胺基酸序列
(2)使序列編號101之胺基酸序列中之第45號Lys經Gln取代、使第71號Phe經Tyr取代且使第87號Tyr經Phe取代之胺基酸序列
(3)使序列編號101之胺基酸序列中之第15號Val經Leu取代、使第45號Lys經Gln取代且使第87號Tyr經Phe取代之胺基酸序列
(4)使序列編號101之胺基酸序列中之第15號Val經Leu取代、使第45號Lys經Gln取代且使第71號Phe經Tyr取代之胺基酸序列
作為導入2個改型之VL之胺基酸序列，具體而言，例如可列舉以下之(1)~(9)之胺基酸序列。
(1)使序列編號101之胺基酸序列中之第45號Lys經Gln取代且使第71號Phe經Tyr取代之胺基酸序列
(2)使序列編號101之胺基酸序列中之第15號Val經Leu取代且使第71號Phe經Tyr取代之胺基酸序列
(3)使序列編號101之胺基酸序列中之第43號Ala經Ser取代且使第 71號Phe經Tyr取代之胺基酸序列
(4)使序列編號101之胺基酸序列中之第71號Phe經Tyr取代且使第85號Thr經Gly取代之胺基酸序列
(5)使序列編號101之胺基酸序列中之第71號Phe經Tyr取代且使第87號Tyr經Phe取代之胺基酸序列
(6)使序列編號101之胺基酸序列中之第15號Val經Leu取代且使第45號Lys經Gln取代之胺基酸序列
(7)使序列編號101之胺基酸序列中之第43號Ala經Ser取代且使第45號Lys經Gln取代之胺基酸序列
(8)使序列編號101之胺基酸序列中之第45號Lys經Gln取代且使第85號Thr經Gly取代之胺基酸序列
(9)使序列編號101之胺基酸序列中之第45號Lys經Gln取代且使第87號Tyr經Phe取代之胺基酸序列
作為導入1個改型之VL之胺基酸序列，具體而言，例如可列舉以下之(1)~(6)之胺基酸序列。
(1)使序列編號101之胺基酸序列中之第15號Val經Leu取代之胺基酸序列
(2)使序列編號101之胺基酸序列中之第43號Ala經Ser取代之胺基酸序列
(3)使序列編號101之胺基酸序列中之第45號Lys經Gln取代之胺基酸序列
(4)使序列編號101之胺基酸序列中之第71號Phe經Tyr取代之胺基酸序列
(5)使序列編號101之胺基酸序列中之第85號Thr經Gly取代之胺基酸序列
(6)使序列編號101之胺基酸序列中之第87號Tyr經Phe取代之胺基 酸序列
又，作為本發明之人源化抗體之具體例，可列舉：抗體之VH包含序列編號98之胺基酸序列及/或抗體之VL包含序列編號94之胺基酸序列的人源化抗體、抗體之VH包含序列編號98之胺基酸序列及/或抗體之VL包含圖2所表示之任一胺基酸序列的人源化抗體、或抗體之VH包含圖1所表示之任一胺基酸序列及/或抗體之VL包含序列編號94之胺基酸序列的人源化抗體等。
進而，作為本發明之人源化抗體，可列舉：與本發明之單株抗體競爭而特異地識別人類FOLR1之胺基酸序列或其立體結構，與和存在於上述單株抗體所結合之人類FOLR1中之抗原決定基相同的抗原決定基結合之人源化抗體。
人抗體原來係指天然存在於人體內之抗體，但亦包括自藉由最近之基因工程、細胞工程、發生工程之技術之進步所製作的人抗體噬菌體基因庫及人抗體產生基因轉殖動物獲得之抗體等。
天然存在於人體內之抗體例如對人末梢血液淋巴球進行單離，感染EB病毒等而使其不死化並進行選殖，藉此可對產生該抗體之淋巴球進行培養，可使該抗體自培養上清液中精製。
人抗體噬菌體基因庫係將自人B細胞製備之抗體基因插入至噬菌體基因中，藉此使Fab、scFv等抗體片段於噬菌體表面表現之基因庫。根據該基因庫，可以與使抗原固定化之基質之結合活性作為指標而回收使具有所需抗原結合活性之抗體片段於表面表現的噬菌體。該抗體片段亦可進而藉由基因工程方法而轉變為包含2條完全H鏈及2條完全L鏈之人抗體分子。
人抗體產生基因轉殖動物係指將人抗體基因併入至細胞內之動物。具體而言，例如可藉由向小鼠ES細胞內導入人抗體基因並將該ES細胞移植至小鼠之初始胚胎中之後使其孳生而製作人抗體產生基 因轉殖小鼠。來自人抗體產生基因轉殖動物之人抗體可藉由如下方式製作：使用由通常之人以外之動物所進行的融合瘤製作方法獲得人抗體產生融合瘤並進行培養，藉此於培養上清液中產生並蓄積人抗體。
使構成上述抗體或抗體片段之胺基酸序列缺失、加成、取代或插入1個以上胺基酸且具有與上述抗體或該抗體片段相同之活性的單株抗體或該抗體片段亦包含於本發明之單株抗體或該抗體片段中。
缺失、加成、取代及/或插入之胺基酸之數為1個以上，該數並無特別限定，係可藉由部位特異性變異導入法[分子選植第二版、冷泉港實驗室出版(1989)、分子生物學通用方法、約翰威立(1987-1997)、Nucleic Acids Research、10、6487(1982)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、79、6409(1982)、Gene、34、315(1985)、Nucleic Acids Research、13、4431(1985)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、82、488(1985)]等周知之技術而缺失、加成、取代或插入的程度之數。例如較佳為1~數十個，更佳為1~20個，進而較佳為1~10個，尤佳為1~5個。
作為使上述抗體之胺基酸序列缺失、加成、取代或插入1個以上胺基酸殘基，係指以下之情況。即，於抗體之胺基酸序列中存在1個或複數個胺基酸殘基之缺失、加成、取代或插入。又，存在缺失、加成、取代或插入同時產生之情形，亦存在缺失、加成、取代或插入之胺基酸殘基為天然型及非天然型之任一者之情形。
作為天然型胺基酸殘基，例如可列舉L-丙胺酸、L-天冬醯胺、L-天冬胺酸、L-穀醯胺、L-穀胺酸、甘胺酸、L-組胺酸、L-異白胺酸、L-白胺酸、L-離胺酸、L-甲硫胺酸、L-苯丙胺酸、L-脯胺酸、L-絲胺酸、L-蘇胺酸、L-色胺酸、L-酪胺酸、L-纈胺酸或L-半胱胺酸等。
以下，表示可相互取代之胺基酸殘基之較佳之例。同一群中所含之胺基酸殘基可相互取代。
A群：白胺酸、異白胺酸、甘白胺酸、纈胺酸、正纈胺酸、丙胺酸、2-胺基丁酸、甲硫胺酸、鄰甲基絲胺酸、第三丁基甘胺酸、第三丁基丙胺酸、環己基丙胺酸
B群：天冬胺酸、穀胺酸、異天冬胺酸、異穀胺酸、2-胺基己二酸、2-胺基辛二酸
C群：天冬醯胺、穀醯胺
D群：離胺酸、精胺酸、鳥胺酸、2、4-二胺基丁酸、2、3-二胺基丙酸
E群：脯胺酸、3-羥基脯胺酸、4-羥基脯胺酸
F群：絲胺酸、蘇胺酸、高絲胺酸
G群：苯丙胺酸、酪胺酸
本發明中，作為抗體片段，可列舉Fab、F(ab')2、Fab'、單鏈抗體(scFv)、包含二聚物化V區域(雙功能抗體)、二硫化物穩定化V區域(dsFv)及CDR之肽等。
Fab係利用作為蛋白質分解酶之木瓜酶對IgG進行處理而獲得之片段中(以H鏈之第224號胺基酸殘基切割)，H鏈之N末端側約二分之一與L鏈整體利用二硫化物結合而結合的分子量約5萬之具有抗原結合活性之抗體片段。
本發明之Fab可利用木瓜酶對特異地識別人類FOLR1之胺基酸序列或其立體結構且與其結合之單株抗體進行處理而獲得。又，將編碼該抗體之Fab之DNA插入至原核生物用表現載體或真核生物用表現載體中，藉由將該載體導入至原核生物或真核生物而使其表現，亦可製造Fab。
F(ab')2係利用作為蛋白質分解酶之胃蛋白酶使IgG之鉸鏈區域之2個二硫化物結合之下部分解而獲得的2個Fab區域於鉸鏈部分結合而構成之分子量約10萬之具有抗原結合活性之片段。
本發明之F(ab')2可利用胃蛋白酶對特異地識別人類FOLR1之胺基酸序列或其立體結構且與其結合之單株抗體進行處理而獲得。又，亦可使下述Fab'硫醚結合或二硫化物結合而製作。
Fab'係切割上述F(ab')2之鉸鏈區域之二硫化物結合而成的分子量約5萬之具有抗原結合活性之抗體片段。本發明之Fab'可利用二硫蘇糖醇等還原劑對特異地識別本發明之人類FOLR1之胺基酸序列或其立體結構且與其結合之F(ab')2進行處理而獲得。又，將編碼該抗體之Fab'片段之DNA插入至原核生物用表現載體或真核生物用表現載體中，藉由將該載體導入至原核生物或真核生物而使其表現，亦可製造Fab'。
scFv係利用適當之肽連結子(以下記作P)將1條VH與1條VL連結而成之VH-P-VL或VL-P-VH多肽，且為具有抗原結合活性之抗體片段。
本發明之scFv可以如下方式製造：獲得編碼特異地識別本發明之人類FOLR1之胺基酸序列或其立體結構且與其結合的單株抗體之VH及VL之cDNA，構築編碼scFv之DNA，將該DNA插入至原核生物用表現載體或真核生物用表現載體中，藉由將該表現載體導入至原核生物或真核生物而使其表現。
雙功能抗體係使scFv二聚物化而成之抗體片段，且為具有雙重抗原結合活性之抗體片段。雙重抗原結合活性可相同，亦可設為不同之抗原結合活性。
本發明之雙功能抗體可以如下方式製造：獲得編碼特異地識別本發明之人類FOLR1之胺基酸序列或其立體結構且與其結合的單株抗體之VH及VL之cDNA，以肽連結子之胺基酸序列的長度成為8殘基以下之方式構築編碼scFv之DNA，將該DNA插入至原核生物用表現載體或真核生物用表現載體中，藉由將該表現載體導入至原核生物或真核生物而使其表現。
dsFv係指使以半胱胺酸殘基取代VH及VL中之各1個胺基酸殘基之多肽經由該半胱胺酸殘基間之二硫化物結合而結合者。經半胱胺酸殘基取代之胺基酸殘基可根據已知之方法[Protein Engineering、7、697(1994)]並基於抗體之立體結構預測而選擇。
本發明之dsFv可以如下方式製造：獲得特異地識別編碼本發明之人類FOLR1之胺基酸序列或其立體結構且與其結合的單株抗體之VH及VL之cDNA，構築編碼dsFv之DNA，將該DNA插入至原核生物用表現載體或真核生物用表現載體中，藉由將該表現載體導入至原核生物或真核生物而使其表現。
包含CDR之肽係包含VH或VL之CDR之至少1個區域以上而構成。包含複數個CDR之肽可直接或經由適當之肽連結子而結合。
包含本發明之CDR之肽可以如下方式製造：構築編碼特異地識別本發明之人類FOLR1之胺基酸序列或其立體結構且與其結合的單株抗體之VH及VL之CDR之DNA，將該DNA插入至原核生物用表現載體或真核生物用表現載體中，藉由將該表現載體導入至原核生物或真核生物而使其表現。又，包含CDR之肽亦可藉由Fmoc法或tBoc法等化學合成法而製造。
於本發明之抗體中，包括使放射性同位元素、低分子藥劑、高分子藥劑、蛋白質或抗體醫藥等以化學或基因工程方式與特異地識別本發明之人類FOLR1之胺基酸序列或其立體結構且與其結合的單株抗體或該抗體片段結合而成之抗體之衍生物。
本發明中之抗體之衍生物可藉由使放射性同位元素、低分子藥劑、高分子藥劑、免疫活化劑、蛋白質或抗體醫藥等以化學方法[抗體工程入門、地人書館(1994)]與特異地識別本發明之人類FOLR1之胺基酸序列或其立體結構且與其結合的單株抗體或該抗體片段之H鏈或L鏈之N末端側或C末端側、抗體或該抗體片段中之適當取代基或側 鏈、進而單株抗體或該抗體片段中之糖鏈等結合而製造。
又，可藉由基因工程方法而製造：該基因工程方法係使編碼特異地識別本發明之人類FOLR1之胺基酸序列或其立體結構且與其結合的單株抗體或抗體片段之DNA與編碼欲結合之蛋白質或抗體醫藥之DNA連結並插入至表現載體中，將該表現載體導入至適當之宿主細胞中而使其表現。
作為放射性同位元素，例如可列舉131I、125I、90Y、64Cu、99Tc、77Lu或211At等。放射性同位元素可藉由氯胺T法等而與抗體直接結合。又，亦可使將放射性同位元素螯合之物質與抗體結合。作為螯合劑，可列舉1-異硫氰酸酯苄基-3-甲基二伸乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)等。
作為低分子藥劑，例如可列舉：烷基化劑、亞硝基脲劑、代謝拮抗劑、抗生物質、植物生物鹼、拓撲異構酶抑制劑、激素療法劑、激素拮抗劑、芳香酶抑制劑、P糖蛋白抑制劑、鉑錯合物衍生物、M期抑制劑或激酶抑制劑等抗癌劑[臨床腫瘤學、癌與化學療法社(1996)]；或氫化可的松、潑尼鬆(Prednisone)等類固醇劑；阿司匹林、吲哚美辛等非類固醇劑；硫代蘋果酸金(Gold Thiomalate)、青黴胺(Penicillamine)等免疫調節劑；環磷醯胺(Cyclophosphamide)、硫唑嘌呤等免疫抑制劑；馬來酸氯苯那敏或氯馬斯汀(Clemastine)之類的抗組織胺劑等抗炎症劑[炎症與抗炎症療法、醫歯藥出版股份有限公司(1982)]等。
作為抗癌劑，例如可列舉：氨磷汀(Ethyol)、順鉑、達卡巴嗪(DTIC)、放線菌素(Dactinomycin)、氮芥(Nitrogen mustard)、鏈脲佐菌素、環磷醯胺、異環磷醯胺、卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)、阿黴素(阿德力黴素)、艾達黴素、吉西他濱(Gemzar)、柔紅黴素、丙卡巴肼(Procarbazine)、絲裂黴素、阿糖胞苷、依託泊苷、甲 胺喋呤、5-氟尿嘧啶、長春花鹼、長春新鹼、博萊黴素、道諾黴素(Daunomycin)、培洛黴素、雌莫司汀、紫杉醇(泰克索)、歐洲紫杉醇(Taxotere)、阿地白介素(Aldesleukin)、天門冬素酶(Asparaginase)、白消安、卡鉑、奧沙利鉑、奈達帕汀(Nedaplatin)、克拉曲濱(Cladribine)、喜樹鹼、10-羥基-7-乙基-喜樹鹼(SN38)、氟脲苷(Floxuridine)、氟達拉濱、羥基脲、艾達黴素、美斯鈉(Mesna)、伊立替康(CPT-11)、拓撲替康、米托蒽醌、拓朴替康、亮丙瑞林(Leuprolide)、甲地孕酮、美法侖、巰基嘌呤、羥基脲、普卡黴素(Plicamycin)、米托坦(Mitotane)、培門冬酶(Pegaspargase)、去氧肋間型黴素(Pentostatin)、哌泊溴烷(Pipobroman)、他莫昔芬、戈舍瑞林、哌泊溴烷(Leuprorelin)、氟他胺(Flutamide)、替尼泊苷(Teniposide)、睾內酯(Testolactone)、硫鳥嘌呤(Thioguanine)、噻替哌(Thiotepa)、烏拉莫司汀(Uracilmustard)、長春瑞濱(Vinorelbine)、苯丁酸氮芥(Chlorambucil)、氫化可的松、強的松(Prednisone)、甲基強的松、長春地辛(Vindesine)、尼莫司汀(Nimustine)、司莫司汀(Semustine)、卡培他濱(Capecitabine)、雷替曲塞(Tomudex)、阿紮胞苷、優福定(UFT)、奧沙利鉑(Oxaliplatin)、吉非替尼(Iressa)、伊馬替尼(STI571)、埃羅替尼、FMS樣酪胺酸激酶3(FMS-like-tyrosine kinase 3)(FIt3)抑制劑、血管內皮生長因子受體(Vascular endothelial growth factor receptor)(VEGFR)抑制劑、纖維母細胞生長因子受體(Fibroblast growth factor receptor)(FGFR)抑制劑、特羅凱(Tarceva)等表皮生長因子受體(Epidermal growth factor receptor)(EGFR)抑制劑、根赤殼菌素(Radicicol)、17-烯丙基胺基-17-去甲氧基膠達納黴素、雷帕黴素(Rapamycin)、安吖啶(Amsacrine)、全反式視黃酸、沙利竇邁(Thalidomide)、法倔唑、來曲唑、依西美坦、硫代蘋果酸金、D-青黴胺(D-penicillamine)、布西拉明(Bucillamine)、硫唑嘌呤、咪唑立賓、 環孢靈、氫化可的松(Hydrocortisone)、蓓薩羅丁(Targretin)、地塞米松、助孕素類、雌激素類、阿那曲唑(Arimidex)、柳培林(Leuplin)、阿司匹林、吲哚美辛、塞來昔布、馬來酸氯苯那敏、氯苯那敏、氯馬斯汀、維生素A酸、砒素、硼替佐米、別嘌呤醇、卡奇黴素(Calicheamicin)、替伊莫單抗(Ibritumomab Tiuxetan)、蓓薩羅丁(Targretin)、奧佐米星(Ozogamicin)、克拉黴素、醛氫葉酸(Leucovorin)、異磷醯胺(Ifosfamide)、酮康唑(ketoconazole)、氨魯米特(Aminoglutethimide)、蘇拉明(Suramin)、類美登素(Maytansinoid)或其衍生物等。
作為使低分子藥劑與抗體結合之方法，例如可列舉：經由戊二醛而使藥劑與抗體之胺基間結合的方法、或藉由水溶性碳二醯亞胺而使藥劑之胺基與抗體之羧基結合的方法等。
作為高分子藥劑，例如可列舉聚乙二醇(以下記作PEG)、白蛋白、葡聚糖、聚氧乙烯、苯乙烯順丁烯二酸共聚物、聚乙烯吡咯啶酮、吡喃共聚物或羥基丙基甲基丙烯醯胺等。藉由使該等高分子化合物與抗體或抗體片段結合而期待如下效果：(1)對於化學、物理或生物之各種因子之穩定性之提昇、(2)血中半生期之顯著延長、(3)免疫原性之消失或抗體產生之抑制等效果[Bioconjugate Drug、廣川書店(1993)]。例如，作為使PEG與抗體結合之方法，可列舉與PEG化修飾試劑反應之方法等[Bioconjugate Drug、廣川書店(1993)]。作為PEG化修飾試劑，可列舉離胺酸對於e-胺基之修飾劑(日本專利特開昭61-178926號公報)、天冬胺酸及穀胺酸對於羧基之修飾劑(日本專利特開昭56-23587號公報)或精胺酸對於胍基之修飾劑(日本專利特開平2-117920號公報)等。
作為免疫活化劑，例如可為作為免疫佐劑而已知之天然物，作為具體例，可列舉β(1→3)葡聚糖(香菇多醣、西佐糖)或α半乳糖基腦 醯胺等提高免疫之藥劑。
作為蛋白質，可列舉使NK細胞、巨噬細胞或嗜中性球等免疫擔當細胞活化之細胞激素或增殖因子或毒素蛋白質等。
作為細胞激素或增殖因子，例如可列舉IFNα、IFNβ、IFNγ、介白素(以下記作IL)-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、顆粒球菌落刺激因子(G-CSF)、頼粒球/巨噬細胞菌落刺激因子(GM-CSF)或巨噬細胞菌落刺激因子(M-CSF)等。
作為毒素蛋白質，例如可列舉賴胺酸、白喉毒素或ONTAK等，亦包含為了調節毒性而將變異導入至蛋白質中之蛋白毒素。
作為抗體醫藥，可列舉針對如下抗原之抗體：藉由抗體之結合而誘導細胞死亡之抗原、與腫瘤之病態形成相關之抗原或調節免疫功能之抗原、與病變部位之血管新生相關之抗原。
作為藉由抗體之結合而誘導細胞死亡之抗原，例如可列舉：分化群(Cluster of differentiation)(以下記作CD)19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD37、CD53、CD72、CD73、CD74、CDw75、CDw76、CD77、CDw78、CD79a、CD79b、CD80(B7.1)、CD81、CD82、CD83、CDw84、CD85、CD86(B7.2)、人白細胞抗原(Human leukocyte antigen)(HLA)-Class II或表皮生長因子受體(Epidermaigrowth Factor Receptor)(EGFR)等。
作為與腫瘤之病態形成相關之抗原或調節免疫功能之抗原，例如可列舉：CD40、CD40配位子、B7家族分子(CD80、CD86、CD274、B7-DC、B7-H2、B7-H3或B7-H4)、B7家族分子之配位子(CD28、CTLA-4、ICOS、PD-1或BTLA)、OX-40、OX-4O配位子、CD137、腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor)(TNF)受體家族分子(DR4、DR5、TNFR1或TNFR2)、腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體受體(TNF-related apoptosis-inducing ligand receptor)(TRAIL)家族分子、 TRAIL家族分子之受體家族(TRAIL-R1、TRAIL-R2、TRAIL-R3或TRAIL-R4)、核因子kappa B受體活化因子(Receptor activator of nuclear factor kappa B)(RANK)、RANK配位子、CD-25、葉酸受體4、細胞激素[IL-1α、IL-1β、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、轉化生長因子(Transforming growth factor)(TGF)β或TNFα等]、該等細胞激素之受體、趨化素(SLC、ELC、I-309、TARC、MDC或CTACK等)或該等趨化素之受體。
作為抑制病變部位之血管新生之抗原，例如可列舉：血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor)(VEGF)、血管生成素(Angiopoietin)、成纖維細胞生長因子(Fibroblast growth factor)(FGF)、EGF、血小板衍生生長因子(Platelet-derived growth factor)(PDGF)、類胰島素生長因子(Insulin-like growth factor)(IGF)、紅血球生成因子(Erythropoietin)(EPO)、TGFβ、IL-8、Ephilin、SDF-1或該等之受體等。
與蛋白質或抗體醫藥之融合抗體可以如下方式製造：使編碼蛋白質之cDNA與編碼單株抗體或抗體片段之cDNA連結而構築編碼融合抗體之DNA，將該DNA插入至原核生物或真核生物用表現載體中，藉由將該表現載體導入至原核生物或真核生物而使其表現。
於將本發明中之抗體之衍生物用於人類FOLR1之免疫學檢測或測定、人類FOLR1陽性細胞相關疾病之診斷之情形時，作為與特異地識別本發明之人類FOLR1之胺基酸序列或其立體結構且與其結合的單株抗體或該抗體片段之H鏈或L鏈之N末端側或C末端側、抗體或該抗體片段中之適當取代基或側鏈、進而單株抗體或該抗體片段中之糖鏈等結合之藥劑，亦可選擇通常之免疫學檢測或測定法中所使用之標記物。
作為標記物，例如可列舉：鹼性磷酸酶、過氧化酶或螢光素酶 等酶；吖啶酯或咯吩等發光物質；或螢光異硫氰酸鹽(FITC)或異硫氰酸四甲基羅丹明(RITC)等螢光物質等。
又，本發明係關於一種含有本發明之單株抗體或該抗體片段作為有效成分之FOLR1陽性細胞相關疾病之治療藥。
作為FOLR1陽性細胞相關疾病，只要為變現FOLR1之細胞相關疾病，則可為任意者，例如可列舉癌。
作為癌，例如可列舉血液癌、乳癌、子宮癌、結腸癌、食道癌、胃癌、卵巢癌、肺癌、腎癌、直腸癌、甲狀腺癌、子宮頸癌、小腸癌、前列腺癌、間皮瘤或胰腺癌等，較佳為可列舉卵巢癌、腎癌、肺癌、乳癌、胰腺癌或中皮種。
作為本發明之治療藥，係含有上述本發明之單株抗體或該抗體片段或該等之衍生物作為有效成分。
含有本發明之抗體或該抗體片段或者該等之衍生物的治療藥亦可為僅包含作為有效成分之該抗體或該抗體片段或者該等之衍生物者，但通常較理想為作為與藥理學上所容許之1種以上之載體一起混合並藉由製劑學之技術領域中公知之任意方法而製造的醫藥製劑而提供。
投予路徑較佳為使用治療時最有效者，可列舉經口投予、口腔內、氣管內、直腸內、皮下、肌內或靜脈內等非經口投予，較佳為可列舉靜脈內投予。
作為投予形態，例如可列舉噴霧劑、膠囊劑、錠劑、散劑、顆粒劑、糖漿劑、乳劑、栓劑、注射劑、軟膏或貼劑等。
投予量或投予次數根據目標治療效果、投予方法、治療期間、年齡及體重等而不同，通常成人為每天10μg/kg~10mg/kg。
本發明之治療藥可單獨使用，亦可併用上述放射性同位元素、低分子藥劑、高分子藥劑、蛋白質或抗體醫藥中之至少1種治療藥。 作為本發明之治療藥與其他治療藥之併用方法，與本發明之治療藥併用之治療藥可與本發明之治療藥同時投予，亦可連續地投予。
進而，本發明係關於一種使用本發明之單株抗體或該抗體片段之人類FOLR1或人類FOLR1陽性細胞之免疫學檢測或測定方法。
所謂本發明中之免疫學檢測或測定方法，係使用實施標記之抗原或抗體檢測或測定抗體量或抗原量之方法。作為FOLR1之免疫學檢測或測定方法，具體而言，可列舉：利用放射性物質標記免疫抗體法(RIA)、酶免疫測定法(EIA或ELISA)、螢光免疫測定法(FIA)、發光免疫測定法(Luminescent immunoassay)、西方墨點法、免疫沈澱法、螢光細胞染色法、免疫組織染色法或物理化學方法等檢測或測定FOLR1或FOLR1陽性細胞之方法。
又，本發明係關於一種人類FOLR1陽性細胞相關疾病之診斷方法，其包括使用本發明之單株抗體或該抗體片段檢測或測定人類FOLR1陽性細胞之步驟。
於檢測或測定FOLR1陽性細胞時，可使用上述公知之免疫學檢測法。較佳為使用免疫沈澱法、螢光細胞染色法或免疫組織染色法等。又，亦可使用FMAT8100HTS system(Applied Biosystem公司製造)等螢光抗體染色法等。
本發明中，作為成為檢測或測定FOLR1陽性細胞之對象之生體試樣，只要為組織細胞、血液、血漿、血清、胰液、尿、糞便、組織液或培養液等有包含表現FOLR1之細胞的可能性者，則並無特別限定。
作為本發明中之人類FOLR1陽性細胞相關疾病之診斷方法，例如可列舉將於作為檢測或測定之對象的生體試樣中觀測到之FOLR1陽性細胞數設為診斷人類FOLR1陽性細胞相關疾病之指標之方法。
本發明係關於一種含有本發明之單株抗體或該抗體片段作為有效成分之人類FOLR1陽性細胞相關疾病之診斷藥。
作為本發明之診斷藥，係含有上述本發明之單株抗體或該抗體片段或者該等之衍生物作為有效成分。
本發明之診斷藥亦可根據目標診斷法而包含用以進行抗原抗體反應之試劑、該反應之檢測用試劑。作為用以進行抗原抗體反應之試劑，可列舉緩衝液、鹽等。作為檢測用試劑，可列舉：識別該單株抗體或該抗體片段或者該等之衍生物的經標記之二次抗體或與標記對應之基質等通常之免疫學檢測或測定法中所使用之試劑。
以下，對本發明之抗體之製造方法、疾病之治療方法及疾病之診斷方法進行具體地說明。
1.單株抗體之製造方法 (1)抗原之製備
成為抗原之FOLR1或表現FOLR1之細胞可藉由將包含編碼FOLR1全長或其部分長度之cDNA的表現載體導入至大腸桿菌、酵母、昆蟲細胞或動物細胞等中而獲得。又，可自大量表現FOLR1之各種人腫瘤培養細胞、人組織等中使FOLR1精製而獲得。又，亦可直接使用該腫瘤培養細胞或該組織等作為抗原。進而，亦可藉由Fmoc法或tBoc法等化學合成法而製備具有FOLR1之部分序列之合成肽併用於抗原中。
本發明中所使用之FOLR1可以如下方式製造：使用分子選植試驗手冊、第二版、冷泉港實驗室出版(1989)或分子生物學通用方法、約翰威立(1987-1997)等中所記載之方法等並藉由例如以下之方法而使編碼該FOLR1之DNA於宿主細胞中表現。
首先，藉由將包含編碼FOLR1之部分之全長cDNA插入至適當之表現載體之啟動子的下游而製作表現載體。除上述全長cDNA以外，亦可使用基於全長cDNA而製備之包含編碼多肽之部分的適當長度之DNA片段。繼而，藉由將所獲得之該表現載體導入至適合於該表現載體之宿主細胞中，可獲得生產多肽之轉形體。
作為表現載體，只要為可於所使用之宿主細胞中自主複製或併入至染色體中並於可轉錄編碼多肽之DNA之位置含有適當之啟動子者，則可使用任意者。
作為宿主細胞，只要為屬於大腸桿菌等埃希氏菌屬等之微生物、酵母、昆蟲細胞或動物細胞等表現目標基因者，則可使用任意者。
於使用大腸桿菌等原核生物作為宿主細胞之情形時，表現載體較佳為可於原核生物中自主複製，同時包含啟動子、核糖體結合序列、含有編碼FOLR1之部分之DNA及轉錄終止序列的載體。又，該表現載體並非必需有轉錄終止序列，但較佳為於結構基因之正下方配置轉錄終止序列。進而，該表現載體亦可包含控制啟動子之基因。
作為該表現載體，較佳為使用將作為核糖體結合序列之夏尼-達爾加諾序列(亦稱為SD序列)與起始密碼子之間調節為適當距離(例如6~18鹼基)之質體。
又，作為編碼該FOLR1之DNA之鹼基序列，可以成為最適合於宿主內之表現的密碼子之方式取代鹼基，藉此可提昇目標FOLR1之生產率。
作為表現載體，只要為可於所使用之宿主細胞中發揮功能者，則可使用任意者，例如可列舉：pBTrp2、pBTac1、pBTac2(以上由Roche-Diagnostics公司製造)、pKK233-2(Pharmacia公司製造)、pSE280(Invitrogen公司製造)、pGEMEX-1(Promega公司製造)、pQE-8(Qiagen公司製造)、pKYP10(日本專利特開昭58-110600號公報)、pKYP200[Agricultural Biological Chemistry、48、669(1984)]、pLSA1[Agric Biol.Chem.、53、277(1989)]、pGEL1[Proc.Natl.Acad.Sci.、USA、82、4306(1985)]、pBluescript II SK(-)(Stratagene公司製造)、pTrs30[由大腸桿菌JM109/pTrS30(FERM BP-5407)製備]、 pTrs32[由大腸桿菌JM109/pTrS32(FERM BP-5408)製備]、pGHA2[由大腸桿菌IGHA2(FERM BP-400)製備、日本專利特開昭60-221091號公報]、pGKA2[由大腸桿菌IGKA2(FERM BP6798)製備、日本專利特開昭60-221091號公報]、pTerm2(US4686191、US4939094、US5160735)、pSupex、pUB110、pTP5、pC194、pEG400[J.Bacteriol.、172、2392(1990)]、pGEX(Pharmacia公司製造)、pET system(Novagen公司製造)或pME18SFL3等。
作為啟動子，只要為可於所使用宿主細胞中發揮功能者，則可為任意者。例如可列舉：trp啟動子(Ptrp)、lac啟動子、PL啟動子、PR啟動子或T7啟動子等來自大腸桿菌或噬菌體等之啟動子。又，亦可使用串聯2個Ptrp之串聯啟動子、tac啟動子、lacT7啟動子或let I啟動子等人為地設計改型之啟動子等。
作為宿主細胞，例如可列舉大腸桿菌XL-1Blue、大腸桿菌XL2-Blue、大腸桿菌DH1、大腸桿菌MC1000、大腸桿菌KY3276、大腸桿菌W1485、大腸桿菌JM109、大腸桿菌HB101、大腸桿菌No.49、大腸桿菌W3110、大腸桿菌NY49或大腸桿菌DH5α等。
作為向宿主細胞中導入表現載體之方法，只要為將DNA導入至所使用之宿主細胞中之方法，則可使用任意者，例如可列舉使用鈣離子之方法[Proc.Natl.Acad.Scl.USA、69、2110(1972)、Gene、17、107(1982)、Molecular&General Genetics、168、111(1979)]。
於使用動物細胞作為宿主之情形時，作為表現載體，只要為可於動物細胞中發揮功能者，則可使用任意者，例如可列舉pcDNA I、pcDM8(舟越公司製造)、pAGE107[日本專利特開平3-22979號公報；Cytotechnology、3、133(1990)]、pAS3-3(日本專利特開平2-227075號公報)、pcDM8[Nature、329、840(1987)]、pcDNA I/Amp(Invitrogen公司製造)、pcDNA3.1(Invitrogen公司製造)、pREP4(Invitrogen公司製 造)、pAGE103[J.Biochemistry、101、1307(1987)]、pAGE210、pME18SFL3或pKANTEX93(國際公開第97/10354號)等。
作為啟動子，只要為可於動物細胞中發揮功能者，則可使用任意者，例如可列舉：巨細胞病毒(CMV)之立即早期(immediate early)(IE)基因之啟動子、SV40之初始啟動子、反轉錄病毒之啟動子、金屬硫蛋白啟動子、熱休克啟動子、SRα啟動子或Moloney小鼠白血病病毒之啟動子或促進子。又，亦可將人CMV之IE基因之促進子與啟動子一起使用。
作為宿主細胞，例如可列舉：人白血病細胞Namalwa細胞、子細胞COS細胞、中國倉鼠卵巢細胞CHO細胞(Journal of Experimental Medicine、108、945(1958)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA、60、1275(1968)；Genetics、55、513(1968)；Chromosoma、41、129(1973)；Methods in Cell Science、18、115(1996)；Radiation Research、148、260(1997)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA、77、4216(1980)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA、60、1275(1968)；Cell、6、121(1975)；Molecular Cellgenetics、Appendix I、II(pp.883-900))、CHO/DG44、CHO-K1(ATCC編號：CCL-61)、DUkXB11(ATCC編號：CCL-9096)、Pro-5(ATCC編號：CCL-1781)、CHO-S(Life Technologies、Cat#11619)、Pro-3、大鼠骨髓瘤細胞YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20(或亦稱為YB2/0)、小鼠骨髓瘤細胞NS0、小鼠骨髓瘤細胞SP2/0-Ag14、敍利亞倉鼠細胞BHK或HBT5637(日本專利特開昭63-000299號公報)等。
作為向宿主細胞中導入表現載體之方法，只要為將DNA導入至動物細胞中之方法，則可使用任意者。例如可列舉電穿孔法[Cytotechnology、3、133(1990)]、磷酸鈣法(日本專利特開平2-227075號公報)或脂轉染法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA、84、7413(1987)]等。
於培養基中對以如上方式獲得之來自保有併入編碼FOLR1之DNA之表現載體的微生物或動物細胞等之轉形體進行培養，於培養物中生成並蓄積該FOLR1，自該培養物進行採取，藉此可製造FOLR1。於培養基中對該轉形體進行培養之方法可根據宿主之培養中所使用的通常之方法而進行。
於來自真核生物之細胞中表現之情形時，可獲得加成有糖或糖鏈之FOLR1。
於對利用使用誘導性啟動子之表現載體實施轉形之微生物進行培養時，亦可視需要於培養基中添加誘導物。例如於對利用使用lac啟動子之表現載體實施轉形之微生物進行培養之情形時，亦可於培養基中添加異丙基-β-D-硫代半乳呋喃糖苷等，於對利用使用trp啟動子之表現載體實施轉形之微生物進行培養之情形時，亦可於培養基中添加丙烯酸吲哚酯等。
作為對以動物細胞作為宿主而獲得之轉形體進行培養之培養基，例如可列舉：通常使用之RPMI1640培養基[The Journal of the American Medical Association、199、519(1967)]、Eagle之MEM培養基[Science、122、501(1952)]、杜爾貝科改良MEM培養基[Virology、8、396(1959)]、199培養基[Proc.Soc.Exp.Biol.Med.、73、1(1950)]、Iscove's Modified Dulbecco's Medium(IMDM)培養基、或於該等培養基中添加有胎牛血清(FBS)等之培養基等。培養通常係於pH值6~8、30~40℃、5%之CO2存在下等條件下進行1~7天。又，根據培養中之需要，亦可於培養基中添加康黴素或青黴素等抗生物質。
作為編碼FOLR1之基因之表現方法，除直接表現以外，亦可使用分泌生產或融合蛋白質表現等方法[分子選植試驗手冊、第二版、冷泉港實驗室出版(1989)]。
作為FOLR1之生產方法，有於宿主細胞內生產之方法、於宿主細 胞外分泌之方法或於宿主細胞外膜上生產之方法，藉由改變所使用之宿主細胞或生產之FOLR1之結構，可選擇適當之方法。
於宿主細胞內或宿主細胞外膜上生產FOLR1之情形時，藉由使用Paulson等人之方法[J.Biol.Chem.、264、17619(1989)]、Low等人之方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA、86、8227(1989)、Genes Develop.、4、1288(1990)]、日本專利特開平05-336963號公報或國際公開第94/23021號等中所記載之方法，可於宿主細胞外積極地分泌FOLR1。
又，亦可利用使用二氫葉酸還原酶基因等之基因擴增系(日本專利特開平2-227075號公報)而提昇FOLR1之產量。
所獲得之FOLR1例如可以如下方式單離、精製。
於FOLR1在細胞內以溶解狀態表現之情形時，培養結束後藉由離心分離而回收細胞，於水系緩衝液中懸浮後，使用超音波破碎機、法式濾壓壺、Manton-Gaulin均質機或球磨機等使細胞破碎而獲得無細胞萃取液。
自藉由對上述無細胞萃取液進行離心分離而獲得之上清液中，可單獨或組合使用通常之蛋白質之單離精製法，即，溶劑萃取法、利用硫酸銨等之鹽析法、脫鹽法、利用有機溶劑之沈澱法、利用二乙基胺基乙基(DEAE)-瓊脂糖凝膠、DIAION HPA-75(三菱化學公司製造)等樹脂之陰離子交換層析法、利用S-Sepharose FF(Pharmacia公司製造)等樹脂之陽離子交換層析法、利用丁基瓊脂糖凝膠、苯基瓊脂糖凝膠等樹脂之疏水性層析法、使用分子篩之凝膠過濾法、親和性層析法、層析聚焦法或等電點電泳等電泳法等方法，而獲得精製標品。
於FOLR1在細胞內形成不溶物而表現之情形時，以與上述相同之方式於回收後使細胞破碎並進行離心分離，藉此回收作為沈澱組分之該FOLR1之不溶物。利用蛋白質改質劑使回收之該FOLR1之不溶物可溶化。藉由對該可溶化液進行稀釋或透析而使該FOLR1恢復至正常之 立體結構後，可利用與上述相同之單離精製法獲得多肽之精製標品。
於使FOLR1或其糖修飾體等衍生物於細胞外分泌之情形時，可於培養上清液中回收該FOLR1或其糖修飾體等衍生物。藉由以與上述相同之方式利用離心分離等方法對該培養物進行處理而獲得可溶性組分，自該可溶性組分中，藉由使用與上述相同之單離精製法而獲得精製標品。
又，本發明中所使用之FOLR1亦可藉由Fmoc法或tBoc法等化學合成法而製造。又，亦可利用Advanced Chemtec公司製造、珀金埃爾默公司製造、Pharmacia公司製造、Protein Technology Instrument公司製造、Synthecell-Vega公司製造、Perceptive公司製造或島津製作所公司製造等之肽合成機進行化學合成。
(2)動物之免疫與融合用抗體產生細胞之製備
使3~20週齡之小鼠、大鼠或倉鼠等動物對於(1)中所獲得之抗原免疫，採取該動物之脾、淋巴節、末梢血液中之抗體產生細胞。又，於免疫原性較低且於上述動物中未發現充分之抗體效價之上升之情形時，亦可使用FOLR1剔除小鼠作為被免疫動物。
免疫係藉由於動物之皮下、靜脈內或腹腔內投予例如傳氏之完全佐劑或氫氧化鋁凝膠及百日咳菌疫苗等適當之佐劑並同時投予抗原而進行。於抗原為部分肽之情形時，製作BSA(小牛血清白蛋白)或KLH(Keyhole Limpet Hemocyanin，匙孔螺血氰蛋白)等載體蛋白質及複合物並將其用作免疫原。
抗原之投予係於第1次投予後，每1~2週進行5~10次。各投予後第3~7天自眼底靜脈群採血，利用酶免疫測定法[抗體試驗手冊、冷泉港實驗室(1988)]等測定其血清之抗體效價。針對用於免疫之抗原，將該血清顯示充分之抗體效價之動物作為融合用抗體產生細胞之供給源。
抗原之最終投予後第3~7天，自免疫之動物摘出脾臟等包含抗體產生細胞之組織，採取抗體產生細胞。於使用脾臟細胞之情形時，將脾臟切碎、解散後，進行離心分離，進而去除紅血球而獲得融合用抗體產生細胞。
(3)骨髓瘤細胞之製備
作為骨髓瘤細胞，係使用自小鼠中獲得之株化細胞，例如使用8-氮鳥嘌呤耐性小鼠(來自BALB/c)骨髓瘤細胞株P3-X63Ag8-U1(P3-U1)[微生物與免疫學之當前課題、18、1(1978]、P3-NS1/1Ag41(NS-1)[European J.Immunology、6、511(1976)]、SP2/0-Ag14(SP-2)[Nature、276、269(1978)]、P3-X63-Ag8653(653)[J.Immunology、123、1548(1979)]或P3-X63-Ag8(X63)[Nature、256、495(1975)]等。
該骨髓瘤細胞係於正常培養基[添加有穀醯胺、2-巰基乙醇、慶大黴素、FBS及8-氮鳥嘌呤之RPMI1640培養基]中繼代，於細胞融合之3~4天前在正常培養基中繼代，融合當天確保2×107個以上之細胞數。
(4)細胞融合與單株抗體產生融合瘤之製備
將(2)中所獲得之融合用抗體產生細胞及(3)中所獲得之骨髓瘤細胞於最低必需(Minimum Essential Medium)(MEM)培養基或PBS(磷酸二鈉1.83g、磷酸鉀0.21g、食鹽7.65g、蒸餾水1升、pH值7.2)中充分地洗淨，以細胞數成為融合用抗體產生細胞：骨髓瘤細胞=5~10：1之方式混合並進行離心分離後，去除上清液。
將沈澱之細胞群充分地解散後，於37℃下一面攪拌一面添加聚乙二醇-1000(PEG-1000)、MEM培養基與二甲基亞碸之混合液。進而，每1~2分鐘添加數次MEM培養基1~2mL後，添加MEM培養基而總量成為50mL。離心分離後，去除上清液。將沈澱之細胞群緩緩地解散後，針對融合用抗體產生細胞，在HAT培養基[添加有次黃嘌 呤、胸苷及胺基喋呤之正常培養基]中使細胞緩緩地懸浮。於5%之CO2培養箱中且在37℃下將該懸浮液培養7~14天。
培養後，選取培養上清液之一部分，藉由後述之結合試驗等融合瘤之選擇方法而選擇與包含FOLR1之抗原反應且與不包含FOLR1之抗原未反應的細胞群。繼而，藉由極限稀釋法而反覆進行2次選殖[第1次係使用HT培養基(自HAT培養基中去除胺基喋呤之培養基)、第2次係使用正常培養基]，選擇穩定且確認有較強抗體效價者作為單株抗體產生融合瘤。
(5)精製單株抗體之製備
對於經姥鮫烷處理[對2,6,10,14-四甲基十五烷(Pristane)0.5mL進行腹腔內投予並飼養2週]之8~10週齡之小鼠或裸小鼠，在腹內注射(4)中所獲得之單株抗體產生融合瘤。歷經10~21天使融合瘤腹水癌化。自該小鼠採取腹水，進行離心分離而去除固形物成分後，利用40~50%之硫酸銨進行鹽析，藉由辛酸沈澱法、DEAE-瓊脂糖凝膠管柱、蛋白質A-管柱或凝膠過濾管柱而進行精製，收集IgG或lgM組分而設為精製單株抗體。
又，於添加有10%之FBS之RPMI1640培養基等中對(4)中所獲得之單株抗體產生融合瘤進行培養後，藉由離心分離而去除上清液，懸浮於Hybridoma-SFM培養基中並培養3~7天。亦可對所獲得之細胞懸浮液進行離心分離，藉由蛋白質A-管柱或蛋白質G-管柱而對所獲得之上清液進行精製，收集IgG組分而獲得精製單株抗體。再者，於Hybridoma-SFM培養基中，亦可添加5%之Daigo GF21。
抗體之亞型之決定係使用亞型試劑盒並藉由酶免疫測定法而進行。蛋白量之定量係根據洛利法或280nm下之吸光度而算出。
(6)單株抗體之選擇
單株抗體之選擇係藉由利用以下所示之酶免疫測定法之結合試 驗及利用Biacore之動力學解析而進行。
(6-a)結合試驗
作為抗原，係使用自基因導入細胞、重組蛋白質或人組織獲得之精製多肽或部分肽等，該基因導入細胞、重組蛋白質或人組織係將包含編碼(1)中所獲得之FOLR1之cDNA的表現載體導入至大腸桿菌、酵母、昆蟲細胞或動物細胞等中而獲得。於抗原為部分肽之情形時，係製作BSA或KLH等載體蛋白質及複合物並加以使用。
將抗原分注至96孔板等板上並使其固相化後，分注血清、融合瘤之培養上清液或精製單株抗體等被驗物質作為第1抗體並進行反應。利用PBS或PBS-吐溫等充分地洗淨後，分注生物素、酶、經化學發光物質或放射線化合物等標記之抗免疫球蛋白抗體作為第2抗體並進行反應。利用PBS-吐溫充分地洗淨後，進行依據第2抗體之標記物質之反應，選擇對免疫原特異地反應之單株抗體。
又，與本發明之抗FOLR1單株抗體競爭並與FOLR1結合之單株抗體可藉由於上述結合試驗系中添加被檢抗體並進行反應而獲得。即，於添加被檢抗體時篩選單株抗體之結合受抑制之抗體，藉此就與FOLR1之胺基酸序列或其立體結構之結合而言，可獲得與所獲得之單株抗體競爭的單株抗體。
進而，與和與本發明之FOLR1之胺基酸序列或其立體結構結合之單株抗體所識別之抗原決定基相同的抗原決定基結合之抗體可以如下方式獲得：對上述結合試驗系中所獲得之抗體之抗原決定基進行鑑定，製作與經鑑定之抗原決定基之一部分合成肽或抗原決定基之立體結構相似的合成肽等並進行免疫。
(6-b)利用Biacore之動力學解析
利用Biacore T100測定抗原與被驗物之間的結合之動力學，利用機器所附帶之解析軟體對其結果進行解析。利用胺偶合法將抗小鼠 IgG抗體固定於感測片CM5上之後，使融合瘤培養上清液或精製單株抗體等被驗物質流過並結合適當量，進而使濃度已知之複數濃度之抗原流過並對結合、解離進行測定。使用機器所附帶之軟體並利用1：1結合模型對所獲得之資料進行動力學解析而獲得各種參數。
或者，利用例如胺偶合法將人類FOLR1固定於感測片上之後，使濃度已知之複數濃度之精製單株抗體流過並對結合、解離進行測定。使用機器所附帶之軟體並利用雙重結合模型對所獲得之資料進行動力學解析而獲得各種參數。
2.基因重組抗體之製作
作為基因重組抗體之製作例，以下表示人型嵌合抗體及人型CDR移植抗體之製作方法。
(1)基因重組抗體表現用載體之構築
基因重組抗體表現用載體係併入編碼人抗體之CH及CL之DNA的動物細胞用表現載體，可藉由在動物細胞用表現載體上分別選殖編碼人抗體之CH及CL的DNA而構築。
人抗體之C區域可使用任意之人抗體之CH及CL。例如，使用人抗體之γ1亞型之CH及κ型CL等。編碼人抗體之CH及CL之DNA係使用cDNA，亦可使用包含外顯子及內含子之染色體DNA。
動物細胞用表現載體只要為併入編碼人抗體之C區域之基因並能夠表現者，則可使用任意者。例如，使用pAGE107[Cytotechnol.、3、133(1990)]、pAGE103(J.Biochem.、101、1307(1987)]、pHSG274[Gene、27、223(1984)]、pKCR[Proc.Natl.Acad.Sci.USA、78、1527(1981)]、pSG1bd2-4[Cytotechnol.、4、173(1990)]或pSE1UK1Sed1-3[Cytotechnol.、13、79(1993)]等。
動物細胞用表現載體中之啟動子及促進子係使用SV40之初始啟動子[J.Biochem.、101、1307(1987)]、Moloney小鼠白血病病毒 LTR[Biochem.Biophys.Res.Commun.、149、960(1987)]或免疫球蛋白H鏈之啟動子[Cell、41、479(1985)]及促進子[Cell、33、717(1983)]等。
就基因重組抗體表現載體之構築之容易度、向動物細胞中導入之容易度、動物細胞內之抗體H鏈及L鏈之表現量之平衡較為均衡等方面而言，基因重組抗體表現用載體係使用抗體H鏈及L鏈存在於同一載體上之類型(串聯型)的基因重組抗體表現用載體[J.Immunol.Methods、167、271(1994)]，亦可使用抗體H鏈及L鏈存在於不同載體上之類型。串聯型基因重組抗體表現用載體係使用pKANTEX93(國際公開第97/10354號公報)、pEE18[Hybridoma、17、559(1998)]等。
(2)編碼來自除人以外之動物之抗體之V區域的cDNA之獲得及胺基酸序列之解析
編碼非人抗體之VH及VL之cDNA之獲得及胺基酸序列之解析係可以如下方式進行。
其產生非人抗體之融合瘤細胞中萃取mRNA而合成cDNA。將合成之cDNA選殖於噬菌體或質體等載體上而製作cDNA基因庫。
根據上述基因庫並使用編碼小鼠抗體之C區域部分或V區域部分之DNA作為探針，分別對具有編碼VH或VL之cDNA的重組噬菌體或重組質體進行單離。分別決定重組噬菌體或重組質體上之目標小鼠抗體之VH或VL之全鹼基序列，根據鹼基序列，分別推定VH或VL之全胺基酸序列。
製作產生非人抗體之融合瘤細胞之除人以外之動物係使用小鼠、大鼠、倉鼠或兔子等，只要可製作融合瘤細胞，則可使用任意動物。
自融合瘤細胞之全RNA之製備係使用硫氰酸胍-三氟乙酸銫法[Methods in Enzymol.、154、3(1987)]或RNA easy kit(Qiagen公司製 造)等試劑盒等。
自全RNA之mRNA之製備係使用寡聚(dT)固定化纖維素管柱法[分子選植試驗手冊、第二版、冷泉港實驗室出版(1989)]或Oligo-dT30<Super>mRNA純化試劑盒(塔卡拉生物公司製造)等試劑盒等。又，亦可使用Fast Track mRNA Isolation Kit(Invitrogen公司製造)或Quick Prep mRNA純化試劑盒(Pharmacia公司製造)等試劑盒而自融合瘤細胞製備mRNA。
cDNA之合成及cDNA基因庫之製作係使用公知之方法[分子選植試驗手冊、第二版、冷泉港實驗室出版(1989)、分子生物學通用方法、Supplement 1、約翰威立(1987-1997)]、SperScript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning(Invitrogen公司製造)或ZAP-cDNA Synthesis Kit(Stratagene公司製造)等試劑盒等。
於製作cDNA基因庫時，併入以自融合瘤細胞萃取之mRNA作為範本而合成之cDNA的載體只要為併入該cDNA之載體，則可使用任意者。例如，使用ZAP Express[Strategies、5、58(1992)]、pBluescript II SK(+)[Nucleic Acids Research、17、9494(1989)]、λZAP II(Stratagene公司製造)、λgt10、λgt11[DNA Cloning：A Practical Approach、1、49(1985)]、Lambda Blue Mid(Clontech公司製造)、λEx Cell、pT7T3-18U(Pharmacia公司製造)、pcD2[Mol.Cell.Biol.、3、280(1983)]或pUC18[Gene、33、103(1985)]等。
導入由噬菌體或質體載體所構築之cDNA基因庫之大腸桿菌只要為可導入、表現及維持該cDNA基因庫者，則可使用任意者。例如，使用XL-1Blue MRF[Strategies、5、81(1992)]、C600[Genetics、39、440(1954)]、Y1088、Y1090[Science、222、778(1983)]、NM522[J.Mol.Biol.166、1(1983)]K802[J.Mol.Biol.、16、118(1966)]或JM105[Gene、38、275(1985)]等。
編碼非人抗體之VH或VL之cDNA株自cDNA基因庫中之選擇係使用利用經同位素或螢光標記之探針的菌落雜交法或噬菌斑雜交法[分子選植試驗手冊、第二版、冷泉港實驗室出版(1989)]等。
又，亦可藉由製備引子並以自mRNA合成之cDNA或cDNA基因庫作為範本進行聚合酶鏈鎖反應法[以下記作PCR法、分子選植試驗手冊、第二版、冷泉港實驗室出版(1989)、分子生物學通用方法、Supplement 1、約翰威立(1987-1997)]而製備編碼VH或VL之cDNA。
利用適當之限制酶等切割選擇之cDNA後，選殖於pBluescript SK(-)(Stratagene公司製造)等質體上，藉由通常使用之鹼基序列解析方法等而決定該cDNA之鹼基序列。鹼基序列解析方法係例如於進行雙脫氧法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA、74、5463(1977)]等之反應後，使用ABI PRISM3700(PE Biosystems公司製造)或A.L.F.DNA定序儀(Pharmacia公司製造)等鹼基序列自動分析裝置等。
根據決定之鹼基序列而分別推定VH及VL之全胺基酸序列，藉由與已知之抗體之VH及VL的全胺基酸序列[A.L.F.DNA、US Dept.Health and Human Services(1991)]進行比較而分別確認獲得之cDNA是否編碼包含分泌訊號序列之抗體之VH及VL的完全胺基酸序列。
關於包含分泌訊號序列之抗體之VH及VL的完全胺基酸序列，係藉由與已知之抗體之VH及VL之全胺基酸序列[A.L.F.DNA、US Dept.Health and Human Services(1991)]進行比較，可推定分泌訊號序列之長度及N末端胺基酸序列，進而可獲知該等所屬之亞群。又，關於VH及VL之各CDR之胺基酸序列，亦可藉由與已知之抗體之VH及VL之胺基酸序列[A.L.F.DNA、US Dept.Health and Human Services(1991)]進行比較而發現。
又，使用所獲得之VH及VL之完全胺基酸序列對例如SWISS-PROT或PIR-Protein等任意之資料庫進行BLAST法[J.Mol.Biol.、 215、403(1990)]等之相同性檢索，可確認VH及VL之完全胺基酸序列是否為新穎者。
(3)人型嵌合抗體表現載體之構築
於編碼(1)中所獲得之基因重組抗體表現用載體之人抗體之CH或CL的各基因之上游，分別選殖分別編碼非人抗體之VH或VL之cDNA，藉此可構築人型嵌合抗體表現載體。
為了將編碼非人抗體之VH或VL之cDNA的3'末端側與人抗體之CH或CL之5'末端側連結，而製作連結部分之鹼基序列編碼適當之胺基酸且以成為適當之限制酶識別序列之方式設計的VH及VL之cDNA。
將所製作之VH及VL之cDNA以該等按照適當之形態表現的方式分別選殖於編碼(1)中所獲得之人型CDR移植抗體表現用載體之人抗體之CH或CL的各基因之上游而構築人型嵌合抗體表現載體。
又，亦可使用兩端具有適當之限制酶之識別序列的合成DNA並利用PCR法分別擴增編碼非人抗體VH或VL之cDNA並選殖於(1)中所獲得之基因重組抗體表現用載體上。
(4)編碼人型CDR移植抗體之V區域之cDNA之構築
編碼人型CDR移植抗體之VH或VL之cDNA可以如下方式構築。
分別選擇將非人抗體之VH或VL之CDR之胺基酸序列移植的人抗體之VH或VL之FR之胺基酸序列。選擇之FR之胺基酸序列只要為來自人抗體者，則可使用任意者。
例如，使用Protein Data Bank等資料庫中所註冊之人抗體之FR之胺基酸序列或人抗體之FR之各亞群之共通胺基酸序列[A.L.F.DNA、US Dept.Health and Human Services(1991)]等。為了抑制抗體之結合活性之降低，而選擇與原來的抗體之VH或VL之FR之胺基酸序列具有儘可能高的相同性(至少60%以上)之FR之胺基酸序列。
繼而，於所選擇之人抗體之VH或VL之FR之胺基酸序列分別移植原來的抗體之CDR之胺基酸序列，分別設計人型CDR移植抗體之VH或VL之胺基酸序列。考慮抗體之基因之鹼基序列中可見的密碼子之使用頻度[A.L.F.DNA、US Dept.Health and Human Services(1991)]而將設計之胺基酸序列轉變為DNA序列，分別設計編碼人型CDR移植抗體之VH或VL之胺基酸序列的DNA序列。
基於所設計之DNA序列而合成包含100鹼基左右之長度的數條合成DNA，使用該等進行PCR反應。於該情形時，根據PCR反應中之反應效率及可合成之DNA之長度，較佳為設計包括H鏈、L鏈之合計6條合成DNA。
又，藉由在位於兩端之合成DNA之5'末端導入適當之限制酶之識別序列，可於(1)中所獲得之人型CDR移植抗體表現用載體上容易地選殖編碼人型CDR移植抗體之VH或VL的cDNA。
或者，可基於設計之DNA序列，藉由使用合成之各H鏈、L鏈全長合成DNA作為1條DNA序列而實施。PCR反應後，將擴增產物分別選植於p Bluescript SK(-)(Stratagene公司製造)等質體上，藉由與(2)中所記載之方法相同之方法而決定鹼基序列，獲得具有編碼所需之人型CDR移植抗體之VH或VL之胺基酸序列的DNA序列之質體。
(5)人型CDR移植抗體之V區域之胺基酸序列之改型
關於人型CDR移植抗體，若僅將僅非人抗體之VH及VL之CDR移植至人抗體之VH及VL之FR上，則其抗原結合活性與原來的非人抗體相比會降低[BIO/TECHNOLOGY、9、266(1991)]。
關於人型CDR移植抗體，於人抗體之VH及VL之FR之胺基酸序列中，鑑定與和抗原之直接結合相關之胺基酸殘基、與CDR之胺基酸殘基相互作用之胺基酸殘基、及維持抗體之立體結構並與和抗原之間接結合相關之胺基酸殘基，使該等胺基酸殘基經原來的非人抗體之胺基 酸殘基取代，藉此可提昇降低之抗原結合活性。
為了鑑定與抗原結合活性相關之FR之胺基酸殘基而使用X射線結晶解析[J.Mol.Biol.、112、535(1977)]或電腦建模[Protein Engineering、7、1501(1994)]等，藉此可進行抗體之立體結構之構築及解析。又，針對各抗體製作數種改型體，反覆研究與各自之抗原結合活性之關係並進行試誤，藉此可獲得具有必要之抗原結合活性的改型人型CDR移植抗體。
人抗體之VH及VL之FR之胺基酸殘基可使用改型用合成DNA進行(4)中所記載之PCR反應而改型。對於PCR反應後之擴增產物，藉由(2)中所記載之方法而決定鹼基序列並確認實施了目標改型。
(6)人型CDR移植抗體表現載體之構築
可於編碼(1)中所獲得之基因重組抗體表現用載體之人抗體之CH或CL的各基因之上游分別選殖編碼所構築之基因重組抗體之VH或VL的cDNA而構築人型CDR移植抗體表現載體。
例如，於構築(4)及(5)中所獲得之人型CDR移植抗體之VH或VL時使用之合成DNA中位於兩端之合成DNA的5'末端，導入適當之限制酶之識別序列，藉此以該等按照適當之形態表現之方式分別選殖於編碼(1)中所獲得之人型CDR移植抗體表現用載體之人抗體之CH或CL的各基因之上游。
(7)基因重組抗體之短暫性表現
可使用(3)及(6)中所獲得之基因重組抗體表現載體或使該等改型之表現載體進行基因重組抗體之短暫性表現，對所製作的多種人型CDR移植抗體之抗原結合活性進行有效地評價。
導入表現載體之宿主細胞只要為可表現基因重組抗體之宿主細胞，則可使用任意細胞，例如使用COS-7細胞(ATCC編號：CRL1651)[Methods in Nucleic Acids Res.、CRC Press、283(1991)]。
表現載體向COS-7細胞中之導入係使用DEAE-葡聚糖法[Methods in Nucleic Acids Res.、CRC Press(1991)]或脂轉染法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA、84、7413(1987)]等。
導入表現載體後，培養上清液中之基因重組抗體之表現量及抗原結合活性係使用酶免疫抗體法[Monoclonal Antibodies-Principles and practice、Third edition、Academic Press(1996)、抗體試驗手冊、冷泉港實驗室(1988)、單株抗體實驗手冊、Kodansha Scientific(1987)]等進行測定。
(8)穩定地表現基因重組抗體之轉形株之獲得與基因重組抗體之製備
藉由將(3)及(6)中所獲得之基因重組抗體表現載體導入至適當之宿主細胞中，可獲得穩定地表現基因重組抗體之轉形株。
表現載體向宿主細胞中之導入係使用電穿孔法[日本專利特開平2-257891號公報、Cytotechnoiogy、3、133(1990)]等。
導入基因重組抗體表現載體之宿主細胞只要為可表現基因重組抗體之宿主細胞，則可使用任意細胞。例如，使用CHO-K1(ATCC編號：CCL-61)、DUkXB11(ATCC編號：CCL-9096)、Pro-5(ATCC編號：CCL-1781)、CHO-S(Life Technologies、Cat#11619)、大鼠骨髓瘤細胞YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20(或亦稱為YB2/0)、小鼠骨髓瘤細胞NSO、小鼠骨髓瘤細胞SP2/0-Ag14(ATCC編號：CRL1581)、小鼠P3-X63-Ag8653細胞(ATCC編號：GRL1580)、二氫葉酸還原酶基因缺損之CHO細胞[Proc.Natl.Acad.Sci.USA、77、4216(1980)]、獲得凝集素耐性之Lec13[Somatic Cell and Molecular Genetics、12、55(1986)]、α1,6-海藻糖轉移酶基因缺損之CHO細胞(國際公開第2005/035586號、國際公開第02/31140號)、大鼠YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20細胞(ATCC編號：CRL1662)等。
又，亦可使用與細胞內糖核苷酸GDP-海藻糖之合成相關之酶等蛋白質、或與海藻糖之1位和N-糖苷結合複合型糖鏈之還原末端的N-乙醯葡糖胺之6位α結合之糖鏈修飾相關之酶等蛋白質、或者與細胞內糖核苷酸GDP-海藻糖向高基體中之輸送相關之蛋白質等的活性降低或缺失之宿主細胞，例如α1,6-海藻糖轉移酶基因缺損之CHO細胞(國際公開第2005/035586號、國際公開第02/31140號)等。
導入表現載體後穩定地表現基因重組抗體之轉形株係藉由於包含G418硫酸鹽等藥劑之動物細胞培養用培養基中進行培養而選擇(日本專利特開平2-257891號公報)。
動物細胞培養用培養基係使用在RPMI1640培養基(Invitrogen公司製造)、GIT培養基(日本製藥公司製造)、EX-CELL301培養基(JRH公司製造)、IMDM培養基(Invitrogen公司製造)、Hybridoma-SFM培養基(Invitrogen公司製造)或該等培養基中添加有FBS等各種添加物之培養基等。
藉由在培養基中對所獲得之轉形株進行培養而於培養上清液中表現並蓄積基因重組抗體。培養上清液中之基因重組抗體之表現量及抗原結合活性可藉由ELISA法等而測定。又，轉形株可利用DHFR擴增系(日本專利特開平2-257891號公報)等提昇基因重組抗體之表現量。
基因重組抗體係使用蛋白質α-管柱自轉形株之培養上清液中進行精製[Monoclonal Antibodies-Principles and practice、Third edition、Academic Press(1996)、抗體試驗手冊、冷泉港實驗室(1988)]。又，亦可組合凝膠過濾、離子交換層析及超過濾等蛋白質之精製中所使用之方法。
經精製之基因重組抗體之H鏈、L鏈或抗體分子整體之分子量可利用聚丙烯醯胺凝膠電泳法[Nature、227、680(1970)]或西方墨點法 [Monoclonal Antibodies-Principles and practice、Third edition、Academic Press(1996)、抗體試驗手冊、冷泉港實驗室(1988)]等進行測定。
3.精製單株抗體或該抗體片段之活性評價
經精製之本發明之單株抗體或該抗體片段之活性評價可以如下方式進行。
與FOLR1表現細胞株之結合活性係利用使用上述1.(6-a)中所記載之結合試驗及(6-b)中所記載之Biacore system等之表面電漿子共振法進行測定。又，可利用螢光抗體法[Cancer Immunol.Immunother.、36、373(1993)]等進行測定。
對於抗原陽性培養細胞株之CDC活性或ADCC活性係利用公知之測定方法[Cancer Immunol.Immunother.、36、373(1993)]進行測定。
4.控制抗體之效應器活性之方法
作為控制本發明之抗FOLR1單株抗體之效應器活性之方法，已知對與存在於與抗體之Fc區域之第297號天冬醯胺(Asn)結合的N結合複合型糖鏈之還原末端之N-乙醯葡糖胺(GlcNAc)α1,6結合的海藻糖(亦稱為核心海藻糖)之量進行控制之方法(國際公開第2005/035586號、國際公開第2002/31140號、國際公開第00/61739號)，或藉由使抗體之Fc區域之胺基酸殘基改型而進行控制之方法等。本發明之抗FOLR1單株抗體可使用任意方法控制效應器活性。
所謂效應器活性，係指經由抗體之Fc區域而引起之抗體依賴性之活性，已知ADCC活性、CDC活性、或由巨噬細胞或樹狀細胞等噬細胞所產生之抗體依賴性吞噬作用(Antibody-dependent Phagocytosis、ADP活性)等。
作為效應器活性之測定法，例如可將作為標靶之癌細胞、作為效應器之人末梢血液單核球(PBMC)、及癌細胞特異性抗體混合並培 養4小時左右後，對作為細胞毒殺之指標的游離之乳酸脫氫酶(LDH)進行測定。或者，可於人PBMC中混合例如識別CD20之類的血液細胞特異性抗原之抗體並進行培養後，藉由游離LDH之測定或流式細胞儀而測定該細胞數之減少並作為效應器活性。或者，於癌性腹水中混合癌細胞特異性抗體並進行培養後，藉由游離LDH之測定或流式細胞儀而測定該細胞數之減少並作為效應器活性。
藉由控制抗體之Fc之N結合複合型糖鏈之核心海藻糖的含量，可增加或降低抗體之效應器活性。作為使與和抗體之Fc結合之N結合複合型糖鏈結合的海藻糖之含量降低之方法，使用α1,6-海藻糖轉移酶基因缺損之CHO細胞表現抗體，藉此可獲得海藻糖未結合之抗體。海藻糖未結合之抗體具有較高之ADCC活性。
另一方面，作為使與和抗體之Fc結合之N結合複合型糖鏈結合的海藻糖之含量增加之方法，使用導入α1,6-海藻糖轉移酶基因之宿主細胞表現抗體，藉此可獲得海藻糖結合之抗體。海藻糖結合之抗體具有低於海藻糖未結合之抗體之ADCC活性。
又，藉由使抗體之Fc區域之胺基酸殘基改型，可使ADCC活性或CDC活性增加或降低。例如，藉由使用美國專利申請案公開第2007/0148165號說明書中所記載之Fc區域之胺基酸序列，可使抗體之CDC活性增加。
又，藉由進行美國專利第6,737,056號說明書、美國專利第7,297,775號說明書或美國專利第7,317,091號說明書中所記載之胺基酸改型，亦可使ADCC活性或CDC活性增加或降低。
進而，組合上述方法而用於一種抗體中，藉此可獲得控制抗體之效應器活性之抗體。
5.使用本發明之抗FOLR1單株抗體或該抗體片段之疾病之治療方法
本發明之單株抗體或該抗體片段可用於FOLR1陽性細胞相關疾病之治療。
含有本發明之單株抗體或該抗體片段或者該等之衍生物之治療藥可為僅含有作為有效成分之該抗體或該抗體片段或者該等之衍生物者，但通常作為與藥理學上所容許之1以上之載體一起混合並藉由製劑學之技術領域中公知之方法而製造的醫藥製劑而提供。
作為投予路徑，例如可列舉經口投予、口腔內、氣管內、直腸內、皮下、肌內、靜脈內或腹腔內等非經口投予。作為投予形態，例如可列舉噴霧劑、膠囊劑、錠劑、散劑、顆粒劑、糖漿劑、乳劑、栓劑、注射劑、軟膏或貼劑等。
作為適合於經口投予之製劑，例可列舉如乳劑、糖漿劑、膠囊劑、錠劑、散劑或頴粒劑等。
乳劑或糖漿劑之類的液體製備物可使用水、蔗糖、山梨醇或果糖等糖類、聚乙二醇或丙二醇等醇類、芝麻油、橄欖油或大豆油等油類、對羥基安息香酸酯類等防腐劑、或者草莓香料或胡椒薄荷等香料類等作為添加劑而製造。
膠囊劑、錠劑、散劑或顆粒劑等係使用乳糖、葡萄糖、蔗糖或甘露糖醇等賦形劑、澱粉或海藻酸鈉等崩解劑、硬脂酸鎂或滑石等潤滑劑、聚乙烯醇、羥基丙基纖維素或明膠等結合劑、脂肪酸酯等界面活性劑或甘油等塑化劑等作為添加劑而製造。
作為適合於非經口投予之製劑，例如可列舉注射劑、栓劑或噴霧劑等。
注射劑係使用包含鹽溶液、葡萄糖溶液或該兩者之混合物之載體等而製造。
栓劑係使用可可脂、氫化脂肪或羧酸等載體而製造。
噴霧劑係使用不刺激受容者之口腔及氣管黏膜且使本發明之單 株抗體或該抗體片段作為微細粒子而分散並使吸收變得容易之載體等而製造。作為載體，例如使用乳糖或甘油等。又，亦可作為氣溶膠或乾粉而製造。
進而，於上述非經口劑中，亦可以適合於經口投予之製劑之形式添加作為添加劑所例示之成分。
6.使用本發明之抗FOLR1單株抗體或該抗體片段之疾病之診斷方法
藉由使用本發明之單株抗體或該抗體片段檢測或測定FOLR1或表現FOLR1之細胞，可對FOLR1相關疾病進行診斷。
作為FOLR1相關疾病之一的癌之診斷例如可以如下方式檢測或測定FOLR1而進行。
藉由利用流式細胞儀等免疫學方法檢測患者體內之癌原發病灶、轉移病灶或癌性腹水中之癌細胞中所表現之FOLR1而進行診斷。
所謂免疫學方法，係指使用實施標記之抗原或抗體檢測或測定抗體量或抗原量之方法。例如，使用放射性物質標記免疫抗體法、酶免疫測定法、螢光免疫測定法、發光免疫測定法、西方墨點法或物理化學方法等。
放射性物質標記免疫抗體法係例如於抗原或表現抗原之細胞等中，使本發明之抗體或該抗體片段反應，進而使實施放射線標記之抗免疫球蛋白抗體或結合片段反應後，利用閃爍計數器等進行測定。
酶免疫測定法係例如於抗原或表現抗原之細胞等中，使本發明之抗體或該抗體片段反應，進而使實施標記之抗免疫球蛋白抗體或結合片段反應後，利用吸光光度計測定顯色色素。例如，使用三明治ELISA法等。
作為酶免疫測定法中所使用之標記物，可使用公知[酶免疫測定法、醫學書院(1987)]之酶標記。例如，使用鹼性磷酸酶標記、過氧化 酶標記、螢光素酶標記或生物素標記等。
三明治ELISA法係使抗體與固相結合後，捕獲作為檢測或測定對象之抗原，使第2抗體與捕獲之抗原反應的方法。於該ELISA法中，準備抗原識別部位不同之2種抗體，該抗體為識別欲檢測或測定之抗原之抗體或抗體片段，其中，使第1抗體或抗體片段吸附於預設板(例如96孔板)上，繼而，預先以FITC等螢光物質、過氧化酶等酶或生物素等標記第2抗體或抗體片段。
於上述抗體所吸附之板上，使自生體內分離之細胞或其破碎液、組織或其破碎液、細胞培養上清液、血清、胸水、腹水或眼液等反應後，使標記之單株抗體或抗體片段反應，進行與標記物質對應之檢測反應。根據階段性地稀釋濃度已知之抗原而製作之校準曲線，而算出被驗樣品中之抗原濃度。
作為三明治ELISA法中所使用之抗體，可使用多株抗體或單株抗體之任一者，亦可使用Fab、Fab'或F(ab')2等抗體片段。作為三明治ELISA法中所使用之2種抗體之組合，可為識別不同之抗原決定基的單株抗體或抗體片段之組合，亦可為多株抗體與單株抗體或抗體片段之組合。
螢光免疫測定法係利用文獻[Monoclonal Antibodies-Principles and practice、Third edition、Academic Press(1996)、單株抗體實驗手冊、Kodansha Scientific(1987)]等中所記載之方法進行測定。作為螢光免疫測定法中使用之標記物，例如可列舉公知[螢光抗體法、Soft science公司(1983)]之螢光標記。例如可列舉FITC或RITC等。
發光免疫測定法係利用文獻[生物發光與化學發光臨床檢査42、廣川書店(1998)]等中所記載之方法進行測定。作為發光免疫測定法中所使用之標記物，例如可列舉公知之發光體標記，可列舉吖啶酯、咯吩等。
西方墨點法係藉由如下方式進行測定：利用SDS(十二烷基硫酸鈉)-PAGE[抗體試驗手冊冷泉港實驗室(1988)]區分抗原或表現抗原之細胞等後，使該凝膠對聚偏二氟乙烯(PVDF)膜或硝基纖維素膜施加墨點，於該膜上使識別抗原之抗體或抗體片段反應，進而使施加FITC等螢光物質、過氧化酶等酶標記或生物素標記等之抗小鼠IgG抗體或結合片段反應後，使該標記可視化。將一例示於以下。
將表現具有序列編號1所表示之胺基酸序列之多肽的細胞或組織溶解，於還原條件下利用SDS-PAGE法使以每區帶之蛋白量計0.1~30μg之蛋白質泳動。將泳動之蛋白質轉移至PVDF膜上，於包含1~10%之BSA的PBS(以下記作BSA-PBS)中在室溫下反應30分鐘而進行封閉操作。
此處，使本發明之單株抗體反應，使利用包含0.05~0.1%之吐溫-20的PBS(以下記作吐溫-PBS)洗淨並進行過氧化酶標記之山羊抗小鼠IgG於室溫下反應2小時。利用吐溫-PBS洗淨並使用ECL Western Blotting Deteotion Reagents(Amersham公司製造)等檢測單株抗體所結合之帶，藉此檢測具有序列編號1所表示之胺基酸序列之多肽。作為西方墨點之檢測中所使用之抗體，使用可與未保持天然型立體結構之多肽結合之抗體。
物理化學方法例如藉由如下方式進行：藉由使作為抗原之FOLR1與本發明之單株抗體或該抗體片段結合而進行凝集體，對該凝集體進行檢測。除此以外，作為物理化學方法，例如可列舉毛細管法、一維免疫擴散法、免疫比濁法或乳膠免疫比濁法[臨床檢査法提要、金原出版(1998)]等。
關於乳膠免疫比濁法，若使用使抗體或抗原致敏之粒徑0.1~1μm左右之聚苯乙烯乳膠等載體並藉由對應之抗原或抗體而引起抗原抗體反應，則反應液中之散射光增加，透過光減少。將該變化作為吸 光度或積分球濁度而進行檢測，藉此測定被驗樣品中之抗原濃度等。
作為使用本發明之抗體或該抗體片段於治療開始前判斷該抗體之治療有效性的方法，例如可列舉以下者。
首先，治療開始前自患者體內採取癌性腹水，於其懸浮液中添加本發明之抗體或該抗體片段，一定時間後，測定抗腫瘤活性。於觀察測定之結果、抗腫瘤活性之情形時，在具有該腹水之患者之治療中，可於治療開始前判斷本發明之抗體或該抗體片段較為有效。
實施例
以下，藉由實施例對本發明進行具體說明，但本發明並不限定於下述實施例。
[實施例1] FOLR1、FOLR2及FOLR3 cDNA之獲得
人類FOLR1(以下記作FOLR1，序列編號1)、人類FOLR2(以下記作FOLR2)及人類FOLR3(以下記作FOLR3)之cDNA係分別購買SC122853(Origene)、SC119666(Origene)及#100015838(Open Biosystem)而用於以下之試驗。
[實施例2] FOLR1表現載體之構築
首先，使用引子FOLR1-F(序列編號2)及FOLR1-R(序列編號3)並藉由PCR而擴增FOLR1基因。確認擴增基因為目標序列後，利用限制酶EcoRI及KpnI識別序列使其與載體pKANTEX93(國際公開第97/10354號)連結而構築FOLR1基因表現載體。
[實施例3] FOLR1表現細胞之製作
自三菱化學股份有限公司‧橫浜綜合研究所獲得DHFR基因缺損CHO(中國倉鼠卵巢)細胞DG44株(CHO/DG44細胞)，用於FOLR1表現 細胞製作。培養係使用添加有10%之完成不活化之透析胎牛血清(dFBS)(GIBCO)、HT添加劑(GIBCO)及50μg/mL之建它黴素的IMDM(GIBCO)(潛伏期培養基)。
首先，藉由Aat II處理切割FOLR1基因表現載體，將所獲得之直鏈狀DNA精製並溶解於殺菌水中。藉由電穿孔法將該DNA導入至CHO/DG44細胞中，利用HT添加劑經去除之潛伏期培養基培養3天左右。其後，於選擇培養基[IMDM、10%之完成不活化之dFCS、0.5mg/mL之G418(Nacalai)及50μg/mL之建它黴素]中選擇耐藥性細胞。將所選擇之耐藥性細胞以成為75 Cells/板之方式播種於96孔板上，進而，利用選擇培養基培養2週左右。於顯微鏡下觀察每個孔，對成為單株者依序進行擴大培養。
[實施例4] FOLR1表現之確認
利用0.02%之EDTA溶液(Nacalai)將所獲得之耐藥性細胞剝離，利用PBS洗淨後，使之懸浮於1%之BSA/PBS中。繼而，以每1孔為2×105個之方式播種於96孔板上，以1700rpm進行1分鐘離心分離。去除上清液後，於1%之BSA/PBS中添加製備成2μg/mL之LK26抗體(GeneTex)，於4℃下反應1小時。
將細胞洗淨後，添加以1%之BSA/PBS稀釋成100倍之抗小鼠IgG-FITC(Dako)，於4℃下反應1小時。再次將細胞洗淨後，使細胞懸浮於1%之BSA/PBS中，利用流式細胞儀(Beckman Coulter公司製造、FC500MPL)解析螢光強度。選擇FOLR1顯著地表現之株並將該細胞設為FOLR1表現CHO細胞。
[實施例5] 食蟹猴FOLR1之選殖
自冷凍之食蟹猴腎組織選殖食蟹猴FOLR1。於數mm見方之冷凍 腎組織中添加RNAiso Plus(Takara)，並使用均質研缽(AsOne)將組織研碎。於室溫下靜置5分鐘後，根據RNAiso plus之推薦協定而獲得總RNA，並溶解於DEPC處理水(invitrogen)中。繼而，為了由總RNA合成cDNA，而使用PrimeScript II cDNA第一鏈合成試劑盒(Takara)及寡聚dT作為引子進行逆轉錄反應。
繼而，使用以人類FOLR1(NM_000802)及羅猴FOLR1(XM_001114655)作為參考而設計之引子-CyFOLR1-F(序列編號4)及CyFOLR1-R(序列編號5)，藉由PCR而擴增食蟹猴FOLR1基因。
使用2%之瓊脂糖凝膠對PCR樣品進行電泳，切出擴增之帶，利用QIAquick凝膠回收試劑盒(QIAGEN)進行回收。使用TOPO TA Cloning測序試劑盒(invitrogen)進行TA選植並導入至大腸桿菌Competent high DH5α(TOYOBO)中，利用包含100μg/mL之安比西林之LB板於37℃下培養一晚。其後，對各菌落進行培養，利用NA-2000(KURABO)萃取質體後，分別解析鹼基序列。
其結果，明確了所選殖之食蟹猴FOLR1之鹼基序列為序列編號6，且明確了基於該序列之胺基酸序列(序列編號7)與羅猴FOLR1(XM_001114655)相同。
[實施例6] FOLR1-Fc、FOLR2-Fc、FOLR3-Fc及食蟹猴FOLR1-Fc表現載體之構築
為了構築表現在FOLR1(1-233胺基酸)、FOLR2(1-227胺基酸)、FOLR3(1-243胺基酸)及食蟹猴FOLR1(1-233胺基酸)之C末端加成有人IgG1 Fc(Hlnge部及CH2-CH3部)之重組蛋白質(以下記作FOLR1-Fc、FOLR2-Fc、FOLR3-Fc及食蟹猴FOLR1-Fc)的載體，而實施PCR。
作為FOLR1-Fc表現載體製作用引子，使用FOLR1-Fc-F(序列編號8)及FOLR1-Fc-R(序列編號9)，作為FOLR2-Fc表現載體製作用引子， 使用FOLR2-Fc-F(序列編號10)及FOLR2-Fc-R(序列編號11)，作為FOLR3-Fc表現載體製作用引子，使用FOLR3-Fc-F(序列編號12)及FOLR3-Fc-R(序列編號13)，並且作為食蟹猴FOLR1-Fc表現載體製作用引子，使用CyFOLR1-Fc-F(序列編號14)及CyFOLR1-Fc-R(序列編號15)。
將PCR產物供給至瓊脂糖凝膠電泳，使用QIAquick凝膠回收試劑盒(QIAGEN)對擴增之基因進行單離，利用TA cloning試劑盒(Invitrogen)進行次選殖。選擇具有目標序列之載體並利用EcoRI及AhdI切出目標序列。
另一方面，利用AhdI及SpeI自pKANTEX93切出人IgG1 Fc區域。將切出之目標序列及人IgG1 Fc區域與經EcoRI及SpeI處理之pKANTEX93連結，而製成FOLR1-Fc、FOLR2-Fc、FOLR3-Fc及食蟹猴FOLR1-Fc重組蛋白質表現載體。
[實施例7] FOLR1-Fc、FOLR2-Fc、FOLR3-Fc及食蟹猴FOLR1-Fc表現細胞之製作
FOLR1-Fc、FOLR2-Fc、FOLR3-Fc及食蟹猴FOLR1-Fc表現細胞之製作係使用由CHO/DG44製作之FUT8剔除CHO/DG44細胞即CHO/Ms704細胞(國際公開第03/85107號)。又，表現載體係使用實施例6中所製作之FOLR1-Fc、FOLR2-Fc、FOLR3-Fc及食蟹猴FOLR1-Fc表現載體。通常繼代時之培養、基因導入及耐藥性細胞之選擇係以與實施例3相同之方式進行。
對所選擇之耐藥性細胞依序進行擴大培養後，利用PBS將細胞洗淨，於回收培養基[EX-CELL 302Serum-Free Medium for CHO Cells(Sigma-Aldrich)、6mmol/L之L-穀醯胺(invitrogen)及50μg/mL建它黴素]中培養1週。回收培養上清液並供給至其後之精製。
[實施例8] FOLR1-Fc、FOLR2-Fc、FOLR3-Fc及食蟹猴FOLR1-Fc之精製
自培養上清液中，使用填充於管柱中之ProSep-vA High Capacity將FOLR1-Fc、FOLR2-Fc、FOLR3-Fc及食蟹猴FOLR1-Fc進行精製。
首先，使培養上清液通過管柱，利用PBS將管柱洗淨後，利用pH值5.0、3.5、3.0之溶離緩衝液(0.1M檸檬酸-水合物-NaOH/pH值5.0、3.5、3.0)依序進行溶離。將溶離出之溶離份快速地以中和緩衝液(2M之Tris-HCl/pH值8.5)進行中和。測定各溶離份之吸光度(280nm)，回收測定值較高之連續溶離份作為抗體組分。利用PBS進行透析，將通過0.22μm之過濾片者設為精製蛋白質。於為FOLR1-Fc時將280nm下之吸光係數設為2.2而算出其濃度，於為FOLR2-Fc時將280nm下之吸光係數設為2.3而算出其濃度，於為FOLR3-Fc時將280nm下之吸光係數設為2.1而算出其濃度，於為食蟹猴FOLR1-Fc時將280nm下之吸光係數設為2.2而算出其濃度。
[實施例9] FOLR1-mycHis表現載體之構築
為了構築表現在FOLR1(1-233胺基酸)之C末端加成有myc及His標籤之重組蛋白質(以下記作FOLR1-mycHis)的載體，而實施PCR。作為FOLR1-mycHis表現載體製作用引子，使用FOLR1-mH-F(序列編號16)及FOLR1-mH-R(序列編號17)。
自PCR產物精製目標序列，並使之與經EcoRI及SpeI處理之pKANTEX93連結，而製成FOLR1-mycHis表現載體。
[實施例10] FOLR1-mycHis表現細胞之製作
FOLR1-mycHis表現細胞之製作係使用CHO/DG44細胞。又，表現載體係使用實施例9中所製作之FOLR1-mycHis表現載體。通常繼代 時之培養、基因導入、耐藥性細胞之選擇及培養上清液之回收係以與實施例7相同之方式進行。
[實施例11] FOLR1-mycHis之精製
自培養上清液使用填充於管柱中之Ni-NTA Agarose(invitrogen)精製FOLR1-mycHis。
首先，使洗淨緩衝液(50mmol/L之NaH2PO4(pH值8.0)、300mmol/L之NaCl)流至管柱中，使培養上清液通過管柱，利用洗淨緩衝液將管柱洗淨後，利用溶離緩衝液(於洗淨緩衝液中添加有500mmol/L之咪唑者)進行溶離。測定溶離出之溶離份之吸光度(280nm)，回收測定值較高之連續溶離份作為FOLR1-mycHis組分。利用PBS進行透析，將通過0.22μm之過濾片者設為精製FOLR1-mycHis。將280nm下之吸光係數設為2.8而算出濃度。
[實施例12] 對大鼠之免疫
為了獲得針對FOLR1之單株抗體，而對4週齡之雌SD大鼠進行免疫。首先，將50μg之FOLR1-Fc與2mg之氫氧化鋁佐劑(抗體實驗指南，冷泉港實驗室，1988)及百日咳疫苗(Nacalai)一起投予至SD大鼠腹腔內。自初次投予2週後，以1週1次之頻度3次投予50μg之FOLR1-Fc。
[實施例13] 大鼠抗血清評價
實施例12最終投予之3天後自SD大鼠之尾靜脈採血，利用流式細胞儀解析對於FOLR1之血清抗體效價。陽性對象細胞及陰性對象細胞係分別使用FOLR1表現CHO細胞及FOLR2表現CHO細胞。
首先，利用0.02%之EDTA溶液(Nacalai)將FOLR1表現CHO細胞及 FOLR2表現CHO細胞剝離，利用PBS洗淨後，使之懸浮於1%之BSA/PBS中。繼而，以每1孔為5×105個之方式播種於96孔板上，以1500rpm進行1分鐘離心分離。
去除上清液後，對細胞添加以1%之BSA/PBS稀釋成100至1000倍之SD大鼠血清，於4℃下反應30分鐘。將細胞洗淨後，對細胞添加經1%之BSA/PBS稀釋之Alexa488標記抗大鼠IgG(H+L)多株抗體(Invitrogen)，於4℃下反應30分鐘。再次將細胞洗淨後，使細胞懸浮於1%之BSA/PBS中，利用流式細胞儀解析螢光強度。
[實施例14] 融合瘤之製作
針對對FOLR1表現CHO細胞顯示充分之血清抗體效價之SD大鼠進行50μg之FOLR1-Fc追加免疫。3天後，以外科方式自SD大鼠摘出脾臟，供給至細胞融合。
首先，用載玻片將摘出之脾臟研碎並使組織解散。利用MEM(invitrogen)使該脾臟組織懸浮並通過Streiner，藉此去除多餘之組織。藉由離心分離而去除上清液後，添加紅細胞裂解液(SIGMA)而使其溶血。添加MEM停止反應，藉由離心分離而去除上清液後，再次利用MEM進行懸浮而製成脾臟細胞。
對所獲得之脾臟細胞混合1/8倍量之小鼠骨髓瘤細胞株P3-U1。藉由離心分離而去除上清液後，於37℃下之溫浴中加熱，同時緩緩地添加500μL之PEG溶液[將聚乙二醇1000(純正化學)及MEM各1mL進行混合並添加DMSO(Nacalai)350μL而成者]，進而添加45mL之MEM。藉由離心分離而去除上清液後，使細胞懸浮於HAT培養基[對500mL之RPMI 1640(Wako)添加5mL之HAT溶液(GIBCO)、0.5mL之55mmol/L之2-巰基乙醇(invitrogen)而成者]中。將所獲得之融合瘤播種於96孔板上並進行培養。
[實施例15] 融合瘤篩選(ABI8200細胞檢測系統)
將融合瘤培養10天後，採取各孔之培養上清液，利用螢光抗體染色法(ABI8200細胞檢測系統，以下記作FMAT)解析對於FOLR1之反應性。陽性對象細胞及陰性對象細胞係分別設為FOLR1表現CHO細胞及FOLR2表現CHO細胞。首先，利用0.05%之胰蛋白酶溶液(invitrogen)將陽性對象細胞及陰性對象細胞剝離，以每1孔分別為1×104個/100μL之方式播種於96孔板上並培養一晚。
繼而，於各孔中添加10μL之融合瘤培養上清液、及以最終成為1/5000倍之方式稀釋之50μL之Alexa647標記抗大鼠IgG(H+L)多株抗體(invitrogen)。於室溫下反應3小時後，利用FMAT解析螢光強度。對於藉由FMAT可見對FOLR1陽性CHO細胞之特異性反應之孔之融合瘤，利用極限稀釋法進行2次選殖。
[實施例16] 融合瘤篩選(表面電漿子共振法)
使用選殖後之融合瘤培養上清液，藉由表面電漿子共振法測定與FOLR1之親和性。測定機器係使用Biacore T100(GE healthcare)，並使用CM5晶片(GE healthcare)。首先，利用胺偶合法使小鼠抗體捕捉試劑盒(GE healthcare)固定於CM5晶片上。
繼而，使用HBS-EP+緩衝液(GE healthcare)使融合瘤培養上清液流過，而使CM5晶片捕捉上清液中所含之抗體。繼而，使稀釋成5等級之濃度(188、375、750、1500、3000ng/mL)之FOLR1-mycHis作為分析物流過。
親和性係利用單循環動力學(Single-cycle kinetics)方法解析結合速度常數(ka)及解離速度常數(kd)。速度論常數(ka、kd、KD)係利用Biacore T-100評估軟體(GE healthcare)根據1：1之結合模型(binding model)而算出。
其結果，LK26抗體(GeneTex)及MOv18抗體(ALEXIS BIOCHEMICALS)對於FOLR1-mycHis之親和性(根據KD、kd/ka而算出)分別為66nmol/L及92nmol/L。另一方面，融合瘤RA15-7株(以下記作RA15-7)之培養上清液對於FOLR1-mycHis之親和性為1.9nmol/L。
因此，明確RA15-7培養上清液包含與已存之LK26抗體及MOv18抗體相比對FOLR1顯示極高之親和性的抗體。
[實施例17] RA15-7培養上清液之反應性評價(流式細胞儀)
利用流式細胞儀解析RA15-7培養上清液中所含之抗體對於LK26抗體顯示反應之人卵巢癌細胞株PA-1(ATCC編號：CRL-1572)的反應性。又，將LK26抗體不顯示反應之人卵巢癌細胞株TOV-112D(ATCC編號：CRL-11731)作為陰性對象，以相同之方式解析RA15-7培養上清液中所含之抗體之反應性。
首先，利用0.02%之EDTA溶液(Nacalai)將人卵巢癌細胞株PA-1及TOV-112D細胞剝離，利用PBS洗淨後，使之懸浮於1%之BSA/PBS中。繼而，以每1孔為2×105個之方式播種於96孔板上，以1500rpm進行1分鐘離心分離。去除上清液後，於每1孔添加RA15-7培養上清液50μL，於4℃下反應30分鐘。
將細胞洗淨後，添加經1%之BSA/PBS稀釋之Alexa488標記抗大鼠1gG(H+L)多株抗體(Invitrogen)，於4℃下反應30分鐘。再次將細胞洗淨後，使細胞懸浮於1%之BSA/PBS中，利用流式細胞儀解析螢光強度。
其結果，與LK26抗體相同，RA15-7培養上清液僅對於PA-1顯示反應，對於TOV-112D不顯示反應。因此，啟示RA15-7培養上清液中 所含之抗體識別高度表現FOLR1之癌細胞。
同樣，利用流式細胞儀解析RA15-7培養上清液對於來自食蟹猴腎之細胞株JTC-12(RCB1485、RIKEN CELL BANK)之反應性。其結果，與LK26抗體相同，RA15-7培養上清液對JTC-12細胞顯示反應。因此，啟示RA15-7培養上清液包含不僅識別人類FOLR1而且亦識別食蟹猴FOLR1之抗體。
[實施例18] RA15-7培養上清液中所含之抗體之亞型之鑑定
藉由ELISA法而鑑定RA15-7培養上清液中所含之抗體之亞型。
首先，將利用PBS製備成50μg/mL之抗大鼠IgG(H+L)多株抗體(MP Biomedical)以50μL/孔分注於ELISA用96孔板上，於4℃下靜置一晚。利用PBS將孔洗淨後，以100μL/孔添加1%之BSA/PBS，於室溫下封閉1小時。再次利用PBS將孔洗淨後，以50μL/孔添加RA15-7培養上清液，於室溫下反應2小時。
利用0.05%之吐溫20/PBS將各孔洗淨，以50μL/孔添加經1%之BSA/PBS稀釋之經HRP標記之各大鼠lg同型(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、lgM)抗體及大鼠κ鏈特異性抗體(Southern Biotech)，於室溫下反應1小時。
利用PBS將各孔洗淨後，以50μL/孔添加ABTS[2,2-聯氮雙(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)銨、Wako]基質液[(1mmol/L之ABTS、0.1mol/L之檸檬酸緩衝液(pH值4.2)、0.1%之H2O2)]，並於室溫下反應。確認充分地顯色後，以50μL/孔添加5%之SDS溶液停止反應，測定415nm下之吸光度。
其結果，明確RA15-7培養上清液中所含之抗體為大鼠IgG1κ抗體。
[實施例19] RA15-7培養上清液中所含之抗體之特異性之評價(ELISA法)
對RA15-7培養上清液中所含之抗體對於FOLR1-Fc、FOLR2-Fc、FOLR3-Fc及食蟹猴FOLR1-Fc之反應性進行評價。
首先，將經PBS稀釋成1000倍之山羊抗大鼠IgG(H+L)(CALTAG)以50μL/孔分注於ELISA用96孔板上，於4℃下靜置一晚。
利用PBS將孔洗淨後，以100μL/孔添加1%之BSA/PBS，於室溫下封閉1小時。再次利用PBS將孔洗淨後，以50μL/孔添加RA15-7培養上清液，於室溫下反應1小時。利用0.05%之吐溫20/PBS將各孔洗淨，以50μL/孔添加經1%之BSA/PBS稀釋之FOLR1-Fc、FOLR2-Fc、FOLR3-Fc及食蟹猴FOLR1-Fc，於室溫下反應1小時。
利用0.05%之吐溫20/PBS將各孔洗淨後，以50μL/孔添加經1%之BSA/PBS稀釋成2000倍之山羊抗人IgG(H+L)-POD(Amerrcan Qualex)，於室溫下反應1小時。利用PBS將各孔洗淨後，以50μL/孔添加ABTS基質液並於室溫下反應。確認充分地顯色後，以50μL/孔添加5%之SDS溶液停止反應，測定415nm下之吸光度。
其結果，顯示RA15-7培養上清液中所含之抗體係與人及食蟹猴FOLR1-Fc結合，但未與FOLR2-Fc及FOLR3-Fc結合。即，顯示RA15-7培養上清液中所含之抗體為對於人及食蟹猴FOLR1具有特異性之抗體。
[實施例20] RA15-7抗體之精製
利用於Hybrldoma-SFM(invitrogen)中添加有5%之超低IgG胎牛血清(invitrogen)之培養基，將融合瘤RA15-7培養1週。RA15-7抗體自培養上清液之精製係藉由與實施例8相同之方法而進行。將280nm下之吸光係數設為1.4而算出濃度。
[實施例21] 利用競爭ELISA法之抗體結合性評價
對RA15-7抗體、LK26抗體及MOv18抗體是否相互競爭地與FOLR1結合進行評價。
首先，將經PBS製備成2μg/mL之各抗體以50μL/孔分注於ELISA用96孔板上，於4℃下靜置一晚。利用PBS將孔洗淨後，以200μL/孔添加1%之BSA/PBS，於室溫下封閉1小時。再次利用PBS將孔洗淨後，以50μL/孔分別添加抗FOLR1抗體(0.012~3μg/mL)及FOLR1-Fc(O.2μg/mL)，於室溫下反應1小時。
利用0.05%之吐溫20/PBS將各孔洗淨，以50μL/孔添加經1%之BSA/PBS稀釋成5000倍之山羊抗人IgG(H+L)-POD(American Qualex)，於室溫下反應1小時。利用PBS將各孔洗淨後，以50μL/孔添加ABTS基質液並於室溫下反應。確認充分地顯色後，以50μL/孔添加5%之SDS溶液停止反應，測定415nm下之吸光度。
其結果，明確與FOLR1之結合係RA15-7抗體及LK26抗體以競爭方式結合。另一方面，明確與FOLR1之結合係RA15-7抗體及MOv18抗體不競爭，LK26抗體及MOv18抗體亦不競爭。
[實施例22] RA15-7抗體重鏈及輕鏈可變區域基因之選殖
使用RNAiso plus(Takara)，根據隨附書將經PBS洗淨之融合瘤RA15-7溶解而製備總RNA。所獲得之總RNA係溶解於DEPC處理水(invrtrogen)中。
繼而，使用Oligotex-dT30<Super>mRNA純化試劑盒(來自總RNA)(Takara)，根據隨附書而自所獲得之總RNA精製mRNA。進而，使用SMART RACE cDNA Amplification Kit(Clontech)，根據隨附書由精製而成之mRNA製備cDNA。
以所獲得之cDNA作為範本，使用引子大鼠IgG1H-A(序列編號 18)及大鼠IgG1H-B(序列編號19)並利用PCR擴增大鼠IgG1重鏈基因，使用引子大鼠k-A(序列編號20)及大鼠k-B(序列編號21)並利用PCR擴增大鼠輕鏈(κ鏈)基因。對擴增之基因進行次選殖並解析鹼基序列。
其結果，明確包含訊號序列之RA15-7抗體重鏈可變區域係以序列編號22表示鹼基序列，以序列編號23表示胺基酸序列，包含訊號序列之RA15-7抗體輕鏈可變區域係以序列編號24表示鹼基序列，以序列編號25表示胺基酸序列。
又，根據Kabat等人[Sequences of Proteins of Immunological Interest,US Dept.Health and Human Services(1991)]之報告，明確不含訊號序列之RA15-7抗體重鏈可變區域係以序列編號26表示鹼基序列，以序列編號27表示胺基酸序列，不含訊號序列之RA15-7抗體輕鏈可變區域係以序列編號28表示鹼基序列，以序列編號29表示胺基酸序列。
又，明確RA15-7抗體重鏈之CDR 1、CDR2及CDR 3之胺基酸序列分別以序列編號30、31及32表示。進而，明確RA15-7抗體輕鏈之CDR 1、CDR2及CDR 3之胺基酸序列分別以序列編號33、34及35表示。
[實施例23] 大鼠/人嵌合型RA15-7抗體表現載體之構築
藉由將RA15-7抗體重鏈及輕鏈可變區域基因與人類IgG1重鏈及κ鏈恆定區基因連結，而製作大鼠/人嵌合型RA15-7抗體表現載體。使用包含人類IgG1κ之恆定區基因之pKANTEX93作為載體。
首先，使用引子RA15-7-VLF(序列編號36)及RA15-7-VLR(序列編號37)，利用PCR擴增RA15-7抗體輕鏈可變區域基因。自PCR產物精製目標序列，並使之與經EcoRI及BsiWI處理之pKANTEX93連結。
同樣地，使用引子RA15-7-VHF(序列編號38)及RA15-7-VHR(序 列編號39)，利用PCR擴增RA15-7抗體重鏈可變區域基因。自PCR產物精製目標序列，並與經NotI及ApaI處理之完成RA15-7抗體輕鏈可變區域基因組入之pKANTEX93連結，製成大鼠/人嵌合型RA15-7(以下記作ChRA15-7)抗體表現載體。
[實施例24] 加成有ChRA15-7抗體及不含海藻糖之糖鏈之ChRA15-7抗體表現細胞之製作
加成有包含海藻糖之糖鏈(以下稱為先前型)之ChRA15-7抗體之表現細胞之製作係使用CHO/DG44細胞。又，加成有不含海藻糖之糖鏈之(以下稱為非海藻糖型)ChRA15-7(以下記作ChRA15-7DF)抗體之製作係使用CHO/Ms704細胞。又，表現載體係使用實施例23中所製作之載體。通常繼代時之培養、基因導入、耐藥性細胞之選擇及培養上清液之回收係以與實施例7相同之方式進行。
[實施例25] ChRA15-7抗體及ChRA15-7DF抗體之精製
ChRA15-7抗體及ChRA15-7DF抗體自回收之培養上清液之精製係藉由與實施例8相同之方法而進行。無論為先前型或非海藻糖型，均將280nm下之吸光係數設為1.37而算出濃度。
[實施例26] 適應CDC活性增強技術之非海藻糖型抗體表現載體之製作
為了製作適應CDC活性增強技術之非海藻糖型抗體，以國際公開第2007/011041號及國際公開第2011/108502號之報告作為參考而將pKANTEX93之抗體重鏈恆定區改型。分別以序列編號40及41表示改型後之鹼基序列及胺基酸序列。向該載體中導入RA15-7抗體及MORAb-003抗體(國際公開第2005/080431號)之輕鏈可變區域及重鏈可變區域，而製作適應CDC活性增強技術之非海藻糖型ChRA15-7(以 下記作ChRA15-7Acc)抗體及MORAb-003(以下記作MORAb-003Acc)抗體表現載體。
[實施例27] ChRA15-7Acc抗體及MORAb-003Acc抗體表現細胞之製作
ChRA15-7Acc抗體及MORAb-003Acc抗體表現細胞之製作係使用CHO/Ms704細胞。又，表現載體係使用實施例26中所製作之ChRA15-7Acc抗體及MORAb-003Acc抗體表現載體。通常繼代時之培養、基因導入、耐藥性細胞之選擇及培養上清液之回收係以與實施例7相同之方式進行。
[實施例28] ChRA15-7Acc抗體及MORAb-003Acc抗體之精製
ChRA15-7Acc抗體及MORAb-003Acc抗體自回收之培養上清液之精製係藉由與實施例8相同之方法而進行。將ChRA15-7Acc抗體及MORAb-003Acc抗體之280nm下之吸光係數分別設為1.34及1.60而算出濃度。
[實施例29] ChRA15-7Aco抗體之親和性測定(表面電漿子共振法)
藉由表面電漿子共振法而測定ChRA15-7Acc抗體及MORAb-003抗體對於FOLR1之親和性。利用胺偶合法將人抗體捕捉試劑盒(GE healthcare)固定於CM5晶片上，並使稀釋成5等級之濃度(12.3、37、111、333、1000ng/mL)之FOLR1-mycHis作為分析物流過，除此以外，以與實施例16相同之方式進行。
其結果，ChRA15-7Acc抗體及MORAb-003抗體對於FOLR1-mycHis之親和性(根據KD、kd/ka而算出)分別為0.57nmol/L及57nmol/L(表1)。因此，明確由RA15-7抗體製作之大鼠/人嵌合型抗體ChRA15-7Acc為與已存抗體MORAb-003相比顯示對於FOLR1之更高 親和性的抗體。
[實施例30] ChRA15-7DF抗體之結合性評價(西方墨點法)
使用西方墨點法評價ChRA15-7DF抗體及MORAb-003抗體之反應性。
首先，藉由使FOLR1-mycHis懸浮於還原泳道標誌物樣品緩衝液及非還原泳道標誌物樣品緩衝液(Therrno)中並於100℃下處理5分鐘，而分別製成還原FOLR1-mycHis及非還原FOLR1-mycHis。於SDS-PAGE用凝膠e-PAGEL(ATTO)中，以每等級提高5倍之5等級之濃度(0.5、2.7、13、67、333ng/泳道)對還原及非還原FOLR1-mycHis進行SDS-PAGE。
繼而，將泳動結束之凝膠重疊於PVDF膜片(Millipore)上，利用經轉移緩衝液(12.1g三羥甲基胺基甲烷、14.4g甘胺酸、200mL甲醇/1L殺菌水)浸漬之濾紙夾持其上下而進行轉印。
其後，利用1%之無球蛋白BSA(Nacalai)/TBS對PVDF膜片進行封閉。繼而，使以1%之無球蛋白BSA/TBS製備成5μg/mL之ChRA15-7DF抗體及MORAb-003抗體於PVDF膜片上在室溫下反應1小時。
將該PVDF膜片洗淨後，使經1%之無球蛋白BSA/TBS稀釋之山羊抗人IgG(H+L)-POD(American Qualex)於室溫下反應1小時。
再次將PVDF膜片洗淨後，使Chemi-Lumi One Super(Nacalai)反應1分鐘，利用Image Quant LAS 4000 mini(GE healthcare)檢測PVDF 膜片之螢光。
其結果，啟示ChRA15-7DF抗體及MORAb-003抗體均為可見僅對非還原FOLR1-mycHis顯示反應、且識別FOLR1之高次結構之抗體。
又，MORAb-003抗體係檢測67ng以上之非還原FOLR1-mycHis，相對於此，ChRA15-7DF抗體係檢測2.7ng以上之非還原FOLR1-mycHis。
即，顯示，相對於MORAb-003抗體，ChRA15-7DF抗體之非還原狀態之FOLR1-mycHis檢測感度明顯較高。
[實施例31] ChRA15-7DF抗體與MORAb-003抗體之抗體依賴性細胞毒殺(ADCC)活性比較
評價對於卵巢癌細胞株之ADCC活性。自培養燒瓶利用0.02%之EDTA溶液(Nacalai)將作為標靶之癌細胞株[Caov-3(ATCC編號：HTB-75)、PA-1(ATCC編號：CRL-1572)、IGR-OV1((美國)國家癌症研究院)、SKOV-3(ATCC編號：HTB-77)、RMG-1(JCRB細胞編號：JCRB0172)、OVCAR-3(ATCC編號：HTB-161)]剝離，以ADCC測定培養基[不含酚紅之RPMI1640(GIBCO)、5%之完成非活化之dFCS(GIBCO)、50μg/mL之建它黴素(Nacalai)]製備成1×104 cells/50μL，而製成靶細胞溶液。
繼而，使經肝素處理之正常人末梢血液於填充有Lymphoprep(Cosmo Bio)之LeucoSep淋巴球分離管(Greiner)中形成雙層，以1000×g歷經20分鐘於室溫下進行離心分離。離心分離後，去除血清組分並回收PBMG層。利用ADCC測定培養基將細胞洗淨。利用ADCC測定培養基將PBMC製備成2.5×105 cells/50μL，而製成效應器細胞溶液。
抗體溶液係使最終濃度成為0.033、0.33、3.3、33、333ng/mL之 方式首先利用ADCC測定培養基製備成為0.1、1、10、100、1000ng/mL。
將以上述方式製備之靶細胞溶液、效應器細胞溶液、及抗體溶液分別以50μL/孔於U字底之96孔板中混合，以總量計設為150μL/孔。將各孔良好地混合後，藉由50×g、5分鐘、室溫下之離心分離而使細胞沈澱，於37℃下反應4小時。
繼而，充分地攪拌各孔，再次利用離心分離使細胞沈澱後，將孔之上清液分別以每次50μL分取至新ELISA板上。使用CytoTox 96非放射性細胞毒性分析試劑盒(Promega)測定分取之上清液中之乳酸脫氫酶(LDH)活性。操作係根據隨附書而進行。
ADCC活性之算出係首先自各孔之LDH活性測定值減去僅ADCC測定培養基之孔的LDH活性測定值而獲得各孔之LDH活性測定修正值後，根據下式而進行計算。
此處，Exp係表示各樣品之LDH活性測定修正值，ET spo係表示效應器細胞溶液及靶細胞溶液之混合孔之LDH活性測定修正值，T total係表示混合有靶細胞與CytoTox 96非放射性細胞毒性分析試劑盒隨附之裂解液之孔的LDH活性測定修正值，D係表示裂解液之LDH活性測定修正值，T spo係表示僅靶細胞之孔的LDH活性測定修正值。
其結果，ChRA15-7DF抗體係自低於MORAb-003抗體之濃度檢測出ADCC活性，最大細胞毒殺活性亦較高。進而，ChRA15-7DF抗體係自低於非海藻糖型MORAb-003(MORAb-003DF)抗體之濃度檢測出ADCC活性，最大細胞毒殺活性亦較高。
因此，明確ChRA15-7DF抗體與於已存之抗FOLR1人源化抗體(MORAb-003)中組合有已存之ADCC活性增強技術(非海藻糖化)之MORAb-003DF抗體相比，具有較高之ADCC活性。同時，啟示ChRA15-7DF抗體作為針對卵巢癌之治療抗體，與MORAb-003及MORAb-003DF相比較為有用。
[實施例32] 大鼠/人嵌合型FOLR1表現載體之構築
為了進行抗體之抗原決定基解析，而製作3種使FOLR1-mycHis之鹼基序列之一部分被取代為大鼠FOLR1(NM_133527)而成之大鼠/人嵌合型FOLR1-mycHis(以下記作大鼠1-FOLR1-mycHis、大鼠2-FOLR1-mycHis及大鼠4-FOLR1-mycHis)。
大鼠1-FOLR1-mycHis係使序列編號1所表示之人類FOLR1之胺基酸序列中的第3至28號胺基酸序列經序列編號102所表示之大鼠FOLR1之胺基酸序列中的相當於第3至26號之胺基酸序列取代並對C末端賦予有myc及His標籤者。
大鼠2-FOLR1-mycHis係使序列編號1所表示之人類FOLR1之胺基酸序列中的第55至第62號胺基酸序列經序列編號102所表示之大鼠FOLR1之胺基酸序列中的相當於第53至第60號之胺基酸序列取代並對C末端賦予有myc及His標籤者。
大鼠4-FOLR1-mycHis係使序列編號1所表示之人類FOLR1之胺基酸序列中的第91至第95號胺基酸序列經序列編號102所表示之大鼠FOLR1之胺基酸序列中的相當於第89至93號之胺基酸序列取代並對C末端賦予有myc及His標籤者。
大鼠1-FOLR1-mycHis、大鼠2-FOLR1-mycHis及大鼠4-FOLR1-mycHis之鹼基序列分別以序列編號42、序列編號43及序列編號44表示，胺基酸序列分別以序列編號45、序列編號46及序列編號47表示。
藉由合成各基因並取代為實施例9之FOLR1-mycHis表現載體上之FOLR1-mycHis基因，而構築大鼠1-FOLR1-mycHis、大鼠2-FOLR1-mycHis及大鼠4-FOLR1-mycHis表現載體。
[實施例33] 大鼠1-FOLR1-mycHis、大鼠2-FOLR1-mycHis及大鼠4-FOLR1-mycHis表現細胞之製作
大鼠1-FOLR1-mycHis、大鼠2-FOLR1-mycHis及大鼠4-FOLR1-mycHis表現細胞之製作係使用CHO/DG44細胞。又，表現載體係使用實施例32中所製作之載體。通常繼代時之培養、基因導入、耐藥性細胞之選擇及培養上清液之回收係以與實施例7相同之方式進行。
[實施例34] 大鼠1-FOLR1-mycHis、大鼠2-FOLR1-mycHis及大鼠4-FOLR1-mycHis之精製
大鼠1-FOLR1-mycHis、大鼠2-FOLR1-mycHis及大鼠4-FOLK1-mycHis之精製係以與實施例11相同之方式進行。將280nm下之吸光係數均設為2.8而算出濃度。
[實施例35] ChRA15-7Acc抗體之抗原決定基解析(ELISA法)
使用實施例11中所製作之FOLR1-mycHis及實施例34中所製作之大鼠1-FOLR1-mycHis、大鼠2-FOLR1-mycHis、大鼠4-FOLR1-mycHis，對ChRA15-7Acc抗體、MORAb-003抗體及MOv18抗體之反應性進行評價。
首先，將以PBS製備成10μg/mL之FOLR1-mycHis、大鼠1-FOLR1-mycHis、大鼠2-FOLR1-mycHis及大鼠4-FOLR1-mycHis以50μL/孔分注於ELISA用96孔板上，於4℃下放置一晚。利用PBS將孔洗淨後，以200μL/孔添加1%之BSA/PBS，於室溫下封閉1小時。
再次利用PBS將孔洗淨後，分別以50μL/孔添加利用1%之BSA/PBS自10000ng/mL每次稀釋3倍而製備成7等級之濃度(14、41、123、370、1111、3333、10000ng/mL)的ChRA15-7Acc抗體、MORAb-003抗體、MOv18抗體，於室溫下反應1小時。
利用0.05%之吐溫20/PBS將各孔洗淨，於使ChRA15-7Acc抗體或MORAb-003抗體反應之孔內以50μL/孔添加經1%之BSA/PBS稀釋成5000倍之山羊抗人IgG(H+L)-POD(American Qualex)，並於使MOv18抗體反應之孔內以50μL/孔添加經1%之BSA/PBS稀釋成400倍之多株兔抗小鼠IgG-POD(Dako)，於室溫下反應1小時。
利用PBS將各孔洗淨後，以50μL/孔添加ABTS基質液並於室溫下反應。確認充分地顯色後，添加5%之SDS溶液停止反應，測定415nm下之吸光度。
將其結果示於表2。白圓點表示可見反應，×係表示未見反應。FOLR1-mycHis係與ChRA15-7Acc抗體、MORAb-003抗體及MOv18抗體反應。大鼠1-FOLR1-mycHis係與ChRA15-7Acc抗體及MORAb-003抗體反應，但未見MOv18抗體之反應。
大鼠2-FOLR1-mycHis係與MORAb-003抗體及MOv18抗體反應，但未見ChRA15-7Acc抗體之反應。大鼠4-FOLR1-mycHis係與ChRA15-7Acc抗體及MOv18抗體反應，但未見MORAb-003抗體之反應。
根據以上顯示，MOv18抗體、ChRA15-7Acc抗體、MORAb-003抗體分別於大鼠1-FOLR1-mycHis、大鼠2-FOLR1-mycHis、大鼠4-FOLR1-mycHis中識別包含使FOLR1-mycHis胺基酸序列取代為大鼠型之區域的序列。
具體而言，暗示MOv18抗體識別包含FOLR1-mycHis之第3至28號胺基酸序列之胺基酸序列，ChRA15-7Acc抗體識別包含FOLR1-mycHis之第55至第62號胺基酸序列之胺基酸序列，MORAb-003抗體 識別包含FOLR1-mycHis之第91至第95號胺基酸序列之胺基酸序列。
[實施例36] 人源化RA15-7抗體重鏈及輕鏈可變區域之設計
首先，選擇用以移植由序列編號30、31、32分別表示之RA15-7重鏈CDR 1、CDR2、CDR 3之胺基酸序列的人抗體重鏈可變區域構架區(FR)之胺基酸序列。已知之人抗體重鏈可變區域序列係根據國家生物技術資訊中心(The National Center for Biotechnology Information)所提供之lg Germline Genes資料庫而檢索與RA15-7重鏈FR序列之相同性較高之人抗體序列。
其結果，IGVH3-72為相同性最高之人抗體序列，故而選擇該抗體之FR。藉由將序列編號30、31、32所表示之RA15-7重鏈CDR 1、CDR2、CDR 3之胺基酸序列移植至以此種方式決定之人抗體FR序列的適當位置而設計HVO。
繼而，選擇用以移植由序列編號33、34、35分別表示之RA15-7輕鏈CDR 1、CDR2、CDR 3之胺基酸序列的人抗體重鏈可變區域構架區(FR)之胺基酸序列。
Kabat等人根據其胺基酸序列之相同性而將已知之各種人抗體之VL分類為亞群(HSG I~IV)，對於該等每一亞群報告共通序列[Sequences of Proteins of Immunological Interest、US Dept.Health and Human Services(1991)]。
因此，實施人抗體之VL之亞群I~IV(hSGI~hSGIV)之共通序列 的FR之胺基酸序列與RA15-7輕鏈FR序列之相同性檢索。其結果，hSGI為相同性最高之人抗體輕鏈共通序列。藉由將序列編號33、34、35所表示之RA15-7輕鏈CDR 1、CDR2、CDR 3之胺基酸序列移植至以此種方式決定之人抗體FR序列的適當位置而設計LVO。
繼而，藉由電腦建模而構築包含上述所設計之HVO及LVO之人源化抗體(HVOLVO)及ChRA15-7抗體的可變區域之預想三維結構並進行結構比較。三維結構之構築及座標資料之可視化係使用Discovery Studio(Accerlys)。
將預想對CDR環結構之保持等抗原結合活性之幫助較大之殘基、藉由疏水性相互作用等而有助於整體結構的維持之殘基、及預想在分子表面露出且潛在之抗原性風險較高之殘基作為改型候補殘基而對三維結構比較之結果進行鑑定。
藉由將選擇之改型候補殘基之1個以上取代為存在於ChRA15-7抗體之同一位置的胺基酸殘基而設計各人源化抗體改型體。作為不含訊號序列之人源化RA15-7抗體改型體之重鏈可變區域，如圖1所示之胺基酸序列般設計HV0、HV2、HV3、HV4、HV5、HV6、HV7、HV8、HV10。
同樣，作為不含訊號序列之人源化RA15-7抗體改型體之輕鏈可變區域，如圖2所示之胺基酸序列般設計LV0、LV2、LV3、LV4、LV6。
[實施例37] 人源化RA15-7抗體改型體表現載體之構築
將設計之不含訊號序列之各人源化RA15-7抗體改型體之重鏈及輕鏈可變區域的鹼基序列HV0、HV2、HV3、HV4、HV5、HV6、HV7、HV8、HV10、LV0、LV2、LV3、LV4及LV6(序列編號48~61)以與ChRA15-7表現載體之構築(實施例23)相同之方式導入至 pKANTEX93中。
[實施例38] 人源化RA15-7抗體改型體表現細胞之製作
人源化RA15-7抗體改型體表現細胞之製作係使用FUT8基因雙剔除CHO-K1株(Tsukahara et al.，Animal Cell Technology：Basic & Applied Aspects，175-183，2006)。將實施例37中所製作之各人源化抗體改型體表現載體根據Free Style MAX CHO Expression System(invitrogen)之操作工序書而短暫性地導入。將該等細胞培養一週左右並回收培養上清液。
[實施例39] 人源化RA15-7抗體改型體之精製
自實施例38中所回收之培養上清液中，使用MabSelect SuRe(GE healthcare)將各人源化抗體改型體精製。具體而言，使殺菌水、0.1M之檸檬酸溶液(pH值3.6)及0.2M之硼酸Na/150mmol/L之NaCl溶液(pH值7.5)於填充有載體之管柱上依序流過並進行平衡化。
使培養上清液通過管柱後，利用0.2M之硼酸Na/150mmol/L之NaCl溶液(pH值7.5)將管柱洗淨並使用0.1M之檸檬酸溶液(pH值3.6)進行溶離。溶離之溶離份係以1M之Tris-HCl(pH值9.0)快速地中和。
測定各溶離份之吸光度(280nm)，回收測定值較高之連續溶離份作為抗體組分。利用緩衝液(10mmol/L之檸檬酸、150mmol/L之NaCl、pH值6.0)進行透析，將通過0.22μm之過濾片者設為各人源化抗體改型體之精製抗體。將280nm下之吸光係數設為1.4而算出濃度。
[實施例40] 人源化RA15-7抗體改型體之親和性測定(表面電漿子共振法)
以與實施例29相同之方式藉由表面電漿子共振法而測定各人源 化抗體改型體對於FOLR1之親和性。
其結果，顯示5種人源化RA15-7抗體改型體(HV7LV3、HV10LV2、HV10LV3、HV10LV4及HV10LV6)對於FOLR1-mycHis之親和性保持ChRA15-7Acc所具有之親和性之約70%。
[實施例41] 人源化RA15-7抗體改型體HV7LV3之Cys(HV7LV3-CDRH3-Cys101)改型體之設計
人源化RA15-7抗體改型體HV7LV3之重鏈CDR 3包含Cys(Cys101)。於使Cys101經其他胺基酸取代時，考慮到與Cys類似之分子結構、疏水性強度、單純結構胺基酸等要素，選擇Met、Gly、Asp、Ser、Tyr、Ala、Ile、Val、Thr、Phe、Arg、Trp、Pro及Gln之合計14種胺基酸作為改型候補胺基酸。
[實施例42] HV7LV3-CDRH3-Gys101改型抗體表現載體之構築
製作HV7LV3-CDRH3-CyS101改型抗體表現載體。首先，使用併入HV7可變區域基因(序列編號62)之載體作為範本。根據隨附書而使用點變異導入試劑盒[Qurck Change II Site-Directed Mutagenesis Kit(Agilent Technologies)]，導入用以將Cys101改型為目標胺基酸之基因變異。將所獲得之DNA溶液轉形為XL1-Blue，自所形成之菌落萃取質體。
使Cys101經目標胺基酸取代之不含訊號序列之HV7可變區域之鹼基序列係由Met(C101M_DNA)：序列編號63、Gly(C101G_DNA)：序列編號64、Asp(C101D_DNA)：序列編號65、Ser(C101S_DNA)：序列編號66、Tyr(C101Y_DNA)：序列編號67、Ala(C101A_DNA)：序列編號68、Ile(C101I_DNA)：序列編號69、Val(C101V_DNA)：序列編號70、Thr(C101T_DNA)：序列編號71、Phe(C101F_DNA)：序列編號 72、Arg(C101R_DNA)：序列編號73、Trp(C101W_DNA)：序列編號74、Pro(C101P_DNA)：序列編號75、Gln(C101Q_DNA)：序列編號76分別表示。
使Cys101經目標胺基酸取代之不含訊號序列之HV7可變區域之胺基酸序列係由Met(C101M_AA)：序列編號77、Gly(C101G_AA)：序列編號78、Asp(C101D_AA)：序列編號79、Ser(C101S_AA)：序列編號80、Tyr(C101Y_AA)：序列編號81、Ala(C101A_AA)：序列編號82、Ile(C101I_AA)：序列編號83、Val(C101V_AA)：序列編號84、Thr(C101T_AA)：序列編號85、Phe(C101F_AA)：序列編號86、Arg(C101R_AA)：序列編號87、Trp(C101W_AA)：序列編號88、Pro(C101P_AA)：序列編號89、Gln(C101Q_AA)：序列編號90分別表示。
繼而，將HV7LV3抗體表現載體之重鏈可變區域基因HV7取代為使Cys101經目標胺基酸取代之HV7可變區域基因。重組係使用NotI、ApaI識別區域。將所獲得之載體設為HV7LV3-CDRH3-Cys101改型抗體表現載體。
[實施例43] HV7LV3-CDRH3-Cys101改型抗體表現細胞之製作及培養
使用實施例42中所製作之載體製作HV7LV3-CDRH3-Cys101改型抗體表現細胞。表現細胞、基因導入、培養上清液之回收係以與實施例38相同之方式進行。
[實施例44] HV7LV3-CDRH3-Cys101改型抗體之精製
HV7LV3-CDRH3-Cys101改型抗體之精製及濃度之算出係以與實施例39相同之方式進行。
[實施例45] HV7LV3-CDRH3-Cys101改型抗體之親和性測定(表面電漿子共振法)
以與實施例29相同之方式藉由表面電漿子共振法而測定各HV7LV3-CDRH3-Cys101改型抗體對於FOLR1之親和性。
其結果，顯示將Cys101分別改型為Ile(C101I)、Val(C101V)、Thr(C101T)、Phe(C101F)、Gln(C101Q)及Met(C101M)之抗體對於FOLR1-mysHis之親和性保持ChRA15-7Acc抗體所具有之親和性的50%以上。
具體而言，改型為C101I、C101V、C101T、C101F、C101Q及C101M之抗體分別顯示ChRA15-7Acc抗體之73%、55%、88%、80%、64%及59%之親和性(圖3)。其結果顯示相對於HV7LV3人源化抗體改型體，改型為C101T之(HuRA15-7CT)抗體之親和性提昇。
包含訊號序列之HuRA15-7CT抗體之輕鏈可變區域之鹼基序列及胺基酸序列係以序列編號91及92表示。又，不含訊號序列之HuRA15-7CT抗體之輕鏈可變區域之鹼基序列及胺基酸序列係以序列編號93及94表示。
同樣，包含訊號序列之HuRA15-7CT抗體之重鏈可變區域之鹼基序列及胺基酸序列係以序列編號95及96表示。又，不含訊號序列之HuRA15-7CT抗體之重鏈可變區域之鹼基序列及胺基酸序列係以序列編號97及98表示。
又，HuRA15-7CT抗體之重鏈CDR 1、CDR2及CDR 3之胺基酸序列分別以序列編號30、31及99表示。進而，HuRA15-7CT抗體之輕鏈CDR 1、CDR2及CDR 3之胺基酸序列分別以序列編號33、34及35表示。
[實施例46] 適應CDC活性增強技術之無海藻糖型HuRA15-7CT抗體表現載體之構築
適應CDC活性增強技術之無海藻糖型HuRA15-7CT(以下記作HuRA15-7CTAcc)抗體表現載體之構築係使用序列編號91作為輕鏈可變區域，使用序列編號95作為重鏈可變區域，以與實施例26相同之方式進行。
[實施例47] 非海藻糖型HuRA15-7CT抗體表現細胞及HuRA15-7CTAcc抗體表現細胞之製作
非海藻糖型HuRA15-7CT(以下記作HuRA15-7CTDF)抗體表現細胞及HuRA15-7CTAcc抗體表現細胞之製作係使用CHO/Ms704。表現載體係使用實施例42中所製作之HuRA15-7CT抗體表現載體或實施例46中所製作之HuRA15-7CTAcc抗體表現載體。通常繼代時之培養、基因導入、耐藥性細胞之選擇、培養上清液之回收係以與實施例7相同之方式進行。
[實施例48] HuRA15-7CTDF抗體及HuRA15-7CTAcc抗體之精製
HuRA15-7CTDF抗體及HuRA15-7CTAcc抗體自培養上清液中之精製係以與實施例8相同之方式進行。於為HuRA15-7CTDF抗體時將280nm下之吸光係數設為1.38而算出其濃度，於為HuRA15-7CTAcc抗體時將280nm下之吸光係數設為1.37而算出其濃度。
[實施例49] HuRA15-7CTAcc抗體之親和性測定(表面電漿子共振法)
以與實施例29相同之方式藉由表面電漿子共振法而測定HuRA15-7CTAcc抗體對於FOLR1之親和性。
其結果，HuRA15-7CTAcc抗體對於FOLR1-mycHis之親和性係KD值為0.65nmol/L(表3)。因此，顯示為以較MORAb-003抗體(KD=57nmol/L、實施例29)明顯更高之親和性與FOLR1結合之抗體。
[實施例50] HuRA15-7CTDF抗體及ChRA15-7DF抗體之特異性評價(ELISA法)
評價HuRA15-7CTDF抗體、ChRA15-7DF抗體及MORAb-003DF抗體對於FOLR1-Fc、FOLR2-Fc、FOLR3-Fc及食蟹猴FOLR1-Fc之反應性。
首先，將以PBS製備成2μg/mL之FOLR1-Fc、FOLR2-Fc、FOLR3-Fc及食蟹猴FOLR1-Fc以50μL/孔分注於ELISA用96孔板上，於4℃下放置一晚。利用PBS將孔洗淨後，以200μL/孔添加1%之BSA/PBS，於室溫下封閉1小時。再次利用PBS將孔洗淨後，以50μL/孔分別添加以1%之BSA/PBS製備成7階段之濃度(1.4、4.1、12、37、111、333、1000ng/mL)之HuRA15-7CTDF抗體、ChRA15-7DF抗體、MORAb-003DF抗體及作為陰性對象之非海藻糖型抗DNP人類IgG1(DNPDF)抗體，於室溫下反應1小時。
利用0.05%之吐溫20/PBS將各孔洗淨，以50μL/孔添加以1%之BSA/PBS稀釋成2000倍之山羊抗人kappa-HRP(Southern Biotech)，於室溫下反應1小時。利用PBS將各孔洗淨後，以50μL/孔添加ABTS基質液並於室溫下反應。確認充分地顯色後，添加5%之SDS溶液停止反應，測定415nm下之吸光度。
其結果，顯示HuRA15-7CTDF抗體、ChRA15-7DF抗體及MORAb-003DF抗體對於人類及食蟹猴FOLR1-Fc具有同等之結合活性，但與FOLR2-Fc及FOLR3-Fc不結合(圖4)。即，顯示HuRA15- 7CTDF抗體、ChRA15-7DF抗體及MORAb-003DF抗體為對於人類及食蟹猴FOLR1具有特異性之抗體。
[實施例51] 利用HuRA15-7CTAcc抗體之免疫組織染色
使用HuRA15-7CTAcc及作為陰性對象抗體之DNPDF實施對於由OCT複合物所包埋並冷凍之人類正常組織陣列(大腦、小腦、心臓、肺、胃、小腸、肝臓、胰腺、唾液腺、腎、甲狀腺、腎上腺、骨骼肌、脾臟、卵巢、子宮、胎盤、皮膚、乳腺)的免疫組織染色(IHC)。
首先，於-20℃下進行5分鐘利用丙酮之固定，進行10分鐘風乾後，於室溫下進行利用包含0.1%之NaN3及0.3%之H2O2之PBS的內因性過氧化酶之失活。繼而，進行利用生物素封閉系統(Daco)之內因性生物素之失活。
進而，利用1%之BSA/PBS進行封閉。繼而，使製備成1μg/mL之HuRA15-7CTAcc抗體、MORAb-003抗體及DNPDF抗體於室溫下反應1小時後，利用PBS進行洗淨。添加過氧化酶標記抗生蛋白鏈菌素(Nichirei)並反映5分鐘，利用PBS進行洗淨。添加以0.02%之H2O2/PBS製備之DAB Tablet(Wako)，為了顯色而反應10分鐘。使Mayer蘇木精(Wako)反應2秒左右，利用流水進行洗淨並對核染色。
對於染色之樣品，利用70%之乙醇處理5分鐘，利用95%之乙醇處理5分鐘，並且利用100%之乙醇處理5分鐘，進而反覆進行3次利用100%之乙醇之處理。繼而，反覆進行3次利用100%之二甲苯處理5分鐘之操作而使其清澈。最後，封入至Entellan New(Merck)中。
觀察染色標本，結果暗示HuRA15-7CTAcc抗體之染色為陽性之組織係肺(肺胞)、胃(黏膜)、小腸(黏膜、黏膜筋板)、胰腺(導管、腺胞細胞)、肝臓(膽管)、唾液腺(腺胞細胞、導管)、腎(腎小管、絲球體)、腎上腺(皮質細胞、間質組織)、甲狀腺(濾胞、傍濾胞細胞)、乳 腺(腺胞)、子宮(頸管上皮)、卵巢(上皮)、胎盤(合胞體性營養膜細胞)、皮膚(汗腺)，與文獻[Cancer Res，1992.52(23)：p.6708-11.、Int J Cancer、2006.119(2)：p.243-50.]之報告相同。
繼而，對於人卵巢癌組織8例(漿液性嚢胞癌4例、漿液性嚢胞瘤1例、黏液性嚢胞癌2例、邊界型黏液性嚢胞瘤1例)實施相同之染色。又，除HuRA15-7CTAcc抗體及陰性對象抗體之DNPDF抗體以外，亦將MORAb-003抗體用於染色。
其結果，顯示漿液性之5例中之5例(100%)、黏液性之3例中之1例(33%)可由HuRA15-7CTAcc抗體及MORAb-003抗體染色。又，顯示由兩抗體所染色之組織樣品由於染色之區域相同，因此兩抗體對於卵巢癌之特異性相等。進而，明確與MORAb-003抗體相比，HuRA15-7CTAcc抗體可進行更強地染色。
繼而，藉由H得分而使上述染色樣品之染色性定量化。H得分係分4個階段判定癌細胞中染色成陽性之細胞之染色強度，每5%求出各得分之癌細胞中之陽性佔有率(%)後，設為使各得分乘以陽性佔有率而獲得之值的總和。
其結果，於MORAb-003抗體及HuRA15-7CTAcc抗體上均發現染色之漿液性嚢胞癌4例、漿液性嚢胞瘤1例及黏液性嚢胞癌1例之任一樣品中，均相對於MORAb-003抗體，HuRA15-7CTAcc抗體顯示更高之H得分。另一方面，於黏液性嚢胞癌1例及邊界型黏液性嚢胞瘤1例之任一抗體中，均未發現染色，故而H得分為0。
根據以上，暗示與已存卵巢癌治療抗體MORAb-003相比，HuRA15-7CTAcc抗體與卵巢癌中所表現之FOLR1較強地結合。
[實施例52] 大鼠/人嵌合型抗體及人源化抗體之ADCC活性評價
使用ChRA15-7Acc抗體、適應CDC活性增強技術之非海藻糖型 HV7LV3人類IgG1(HuRA15-7Acc)抗體及HuRA15-7CTAcc抗體，以與實施例31相同之方式評價對於卵巢癌細胞株之ADCC活性。
其結果，顯示對於來自耐鉑性卵巢癌之SKOV-3細胞及OVCAR-3細胞，HuRA15-7Acc抗體及HuRA15-7CTAcc抗體之任一者之ADCC活性均與ChRA15-7Acc抗體相同(圖5)。
[實施例53] 大鼠/人嵌合型抗體及人源化抗體之CDC活性評價
評價對於卵巢癌細胞株之CDC活性。
自培養燒瓶中利用0.02%之EDTA溶液(Nacalai)將作為標靶之癌細胞株IGR-OV1剝離，以CDC測定培養基[不含酚紅之RPMI1640(GIBCO)、1.4%之BSA(SIGMA)]製備成1×104 cells/50μL而製成靶細胞溶液。
繼而，將人類血清冷凍乾燥品(SIGMA)溶解於精製水1mL中，進而添加CDC測定培養基1mL而製成補體溶液。抗體溶液係使最終濃度成為0.032、0.16、0.8、4.0、20、100μg/mL，首先利用CDC測定培養基將HuRA15-7CTAcc抗體、HuRA15-7CTDF抗體、ChRA15-7Acc抗體、ChRA15-7DF抗體及MORAb-003製備成0.096、0.48、2.4、12、60、300μg/mL。
將以上述方式製備之靶細胞溶液、補體溶液及抗體溶液以50μL/孔分別於平底之96孔板上混合，以總量計設為150μL/孔。將各孔充分地混合後，於37℃下反應2小時。繼而，充分地攪拌各孔，以30μL/孔添加CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay(Promega)並攪拌後，進而於37℃下反應1小時左右。觀察到充分之顯色後，測定490nm下之吸光度。
CDC活性之算出係首先自各孔之吸光度測定值減去混合有CDC測定培養基及補體溶液之孔的吸光度測定值而獲得各孔之吸光度修正值 後，根據下式而進行計算。
此處，Exp係表示各樣品之吸光度修正值，ST係表示混合有靶細胞溶液及補體溶液之孔的吸光度修正值。
其結果，明確HuRA15-7CTAcc抗體及HuRA15-7CTDF抗體分別對ChRA15-7Acc抗體及ChRA15-7DF抗體顯示明顯較高之CDC活性[圖6(a)]。進而，HuRA15-7CTAcc抗體較MORAb-003顯示明顯較高之CDC活性[圖6(b)]。
[實施例54] HuRA15-7CTAcc抗體與已存抗FOLR1抗體之ADCC活性比較
使用HuRA15-7CTAcc抗體、MORAb-003Acc抗體及MORAb-003抗體以與實施例31相同之方式評價對於卵巢癌細胞株之ADCC活性。
其結果，對於來自耐鉑性卵巢癌之SKOV-3細胞及OVCAR-3細胞，較MORAb-003及MORAb-003Acc抗體，自低濃度檢測出HuRA15-7CTAcc抗體之ADCC活性(圖7)。即，明確與於已存之抗FOLR1人源化抗體(MORAb-003)中組合有已存之ADCC活性增強技術(非海藻糖化)之MORAb-003Acc抗體相比，HuRA15-7CTAcc抗體顯示較高之ADCC活性。
同樣，對於IGR-OV1細胞，較MORAb-003抗體，自低濃度檢測出HuRA15-7CTAcc抗體之ADCC活性。又，MORAb-003Acc抗體對於卵巢癌細胞株之ADCC活性係按照IGR-OV1、SKOV-3、及OVCAR-3細胞之順序降低，但HuRA15-7CTAcc抗體之ADCC活性對於任一卵巢 癌細胞株均大致相同。
根據以上，暗示與已存抗體(MORAb-003)及於已存抗體中組合有已存技術之抗體(MORAb-003Acc)相比，HuRA15-7CTAcc抗體作為針對耐鉑性卵巢癌之治療抗體較為有用。
[實施例55] HuRA15-7CTDF抗體之腫瘤集積性評價
藉由螢光成像而解析HuRA15-7CTDF抗體及MORAb-003DF抗體之動態。首先，將HuRA15-7CTDF抗體及MORAb-003DF抗體分別以XenoLight CF 770 Kit標記，將(HuRA15-7CTDF-770抗體及MORAb-003DF-770抗體)、作為陰性對象之DNPDF抗體分別以XenoLight CFTM 680 Kit標記(DNPDF-680抗體)。經標記之各抗體之結合性係根據對於SKOV-3細胞之流式細胞儀反應性而確認。又，根據隨附書而求出各抗體之標記化率。
使培養之SKOV-3細胞懸浮於PBS中，皮下移植至BALB/cAJcl-nu/nu小鼠(雌性、5週齡、CLEA Japan)之側方背部。
移植之腫瘤之體積成為約200mm3後，變更為無紫苜蓿之飼料，進而飼養1週。以每一群4隻小鼠，按照平均腫瘤體積相等之方式將小鼠隨機地分成3個群。
繼而，對於小鼠之尾靜脈投予將10μg之HuRA15-7CTDF-770抗體或MORAb-003DF-770抗體與2μg之DNPDF-680抗體混合並以PBS使總量成為200μL者。投予之抗體之動態係使用IVIS Imaging System(Caliper)對來自小鼠之螢光強度進行攝影、評價。投予4小時後進行最初之攝影，以後隨著時間進行攝影。
來自攝影之小鼠之HuRA15-7CTDF-770抗體及MORAb-003DF-770抗體的螢光強度係根據各投予抗體溶液之螢光強度而進行修正。又，以來自DNPDF-680抗體之螢光強度作為小鼠內部標準，算出與觀 察到之HuRA15-7CTDF-770抗體及MORAb-003DF-770抗體之螢光強度之比，評價各抗體之動態。
其結果，明確與MORAb-003DF-770抗體相比，HuRA15-7CTDF-770抗體之移植之SKOV-3腫瘤塊明顯較多且長時間存在(圖8)。以上之結果係本發明之抗體對來自耐鉑性卵巢癌細胞株SKOV-3之進展期癌顯示顯著之集積性及殘存性，作為癌治療抗體顯示更高之抗腫瘤活性。
[實施例56] 食蟹猴單次投予試驗
對食蟹猴(雌性、4~6歲、3隻)之靜脈內投予HuRA15-7CTAcc抗體(100mg/kg)，解析其影響。作為檢査項目，實施一般狀態觀察、體重、攝食量、體溫、尿檢査(尿量、尿比重、尿蛋白質、尿糖、肌酸酐、NAG、Na、K、Cl)、血液學檢査(白血球、淋巴球、T細胞、Th細胞、Tc細胞、B細胞、NK細胞、嗜中性球、單球、好酸球、好鹼球、大型非染色球、紅血球、Hb濃度、Ht值、網狀紅血球、血小板、PT、APTT、血纖維蛋白原)、血液生物化學檢査(ALT、ALP、AST、CK、CRP、IL-6、C3、C4、CH50、總膽紅素、總蛋白質、白蛋白、球蛋白、甘油三酸酯、總膽固醇、血糖、BUN、肌酸酐、無機磷、Ca、Na、K、Cl)、剖檢、器官重量、病理組織學檢査。
其結果，雖發現與炎症、免疫反應相關之變化，但較輕微，又，即便投予安慰劑，亦發現相同之變化。因此，於任一檢査項目中，均未發現HuRA15-7CTAcc抗體特異性之毒性。
[實施例57] HuRA15-7CRAcc抗體表現載體之製作
使用使Cys101經Arg胺基酸取代之HV7LV3人源化抗體改型(HuRA15-7CR)抗體表現載體(實施例42)，以與實施例26相同之方式製 成適應CDC活性增強技術，製成適應CDC活性增強技術之非海藻糖型HuRA15-7CR(以下記作HuRA15-7CRAcc)抗體表現載體。
[實施例58] HuRA15-7CRAcc抗體表現細胞之製作
HuRA15-7CRAcc抗體表現細胞之製作係使用CHO/Ms704細胞。又，表現載體係使用實施例57中所製作之HuRA15-7CRAcc抗體表現載體。通常繼代時之培養、基因導入、耐藥性細胞之選擇及培養上清液之回收係以與實施例7相同之方式進行。
[實施例59] HuRA15-7CRAcc抗體之精製
HuRA15-7CRAcc抗體自回收之培養上清液中之精製係藉由與實施例8相同之方法而進行。將HuRA15-7CRAcc抗體之280nm下之吸光係數設為1.37而算出濃度。
[實施例60] HuRA15-7CRAcc抗體之親和性測定(表面電漿子共振法)
藉由表面電漿子共振法而測定HuRA15-7CRAcc抗體對於FOLR1之親和性。使用HuRA15-7CTAcc抗體、HuRA15-7CRAcc抗體及MORAb-003DF抗體，以與實施例29相同之方式進行操作。
其結果，HuRA15-7CRAcc抗體及MORAb-003DF抗體對於FOLR1-mycHis之親和性分別為HuRA15-7CTAcc抗體所具有之親和性之2.6%及1.1%。
[實施例61] HURA15-7CRAoc抗體之ADCC活性評價
使用HuRA15-7CTAcc抗體、HuRA15-7CRAcc抗體及MORAb-003DF抗體，以與實施例31相同之方式評價對於卵巢癌細胞株之ADCC活性。
其結果，對於耐鉑性卵巢癌細胞株OVCAR-3，按照HuRA15-7CTAcc抗體、HuRA15-7CRAcc抗體、MORAb-003DF抗體之順序，自更低之抗體濃度顯示ADCC活性(圖9)。即，雖然HuRA15-7CRAcc抗體具有與MORAb-003DF抗體相同之親和性(實施例60)，但HuRA15-7CRAcc抗體較MORAb-003DF自更低濃度顯示較強之ADCC活性。根據以上，為了使顯示抗FOLR1抗體發揮較強之ADCC活性，不僅對於FOLR1之親和性之強度，而且識別來自RA15-7株之抗體的抗原決定基(實施例35)之情形亦較為重要。
[實施例62] HuRA15-7CTAcc抗體之抗原決定基解析(ELISA法)
以與實施例35相同之方式，使用實施例11中所製作之FOLR1-mycHis及實施例34中所製作之大鼠1-FOLR1-mycHis、大鼠2-FOLR1-mycHis、大鼠4-FOLR1-mycHis評價ChRA15-7Acc抗體、MORAb-003抗體、MOv18抗體及HuRA15-7CTAcc抗體之反應性。
將其結果示於表4。白圓點係表示顯示反應，×係表示不顯示反應。HuRA15-7CTAcc抗體係對於FOLR1-mycHis、大鼠1-FOLR1-mycHis及大鼠4-FOLR1-mycHis顯示反應，對於大鼠2-FOLR1-mycHis不顯示反應。因此，暗示HuRA15-7CTAcc抗體係以與ChRA15-7Acc抗體相同之方式識別FOLR1-mycHis之第55至62號胺基酸序列。
[實施例63] 卵巢癌細胞株之細胞膜上所表現之FOLR1之定量解析
使用QIFIKIT(Dako)對卵巢癌細胞株(IGR-OV1、SKOV-3、OVCAR-3、MCAS)之細胞膜上之FOLR1表現量進行解析。分別以20μg/mL之濃度使用作為抗FOLR1抗體之LK26(GeneTex)及作為陰性對象之小鼠IgG2a(Dako)，根據QIFIKIT隨附書對細胞及校準珠粒進行染色。
染色細胞係每次製備3個樣品並分別利用流式細胞儀檢測MFI值(圖10)。基於3個樣品之MFI平均值而獲得各細胞之MFI值。繼而，將各細胞及校準珠粒之MFI值輸入至Yamasa Corporation股份有限公司所提供之ABC CALCULATOR for QIFIKIT中，求出各卵巢癌細胞株上所表現之FOLR1分子數。
其結果，顯示IGR-OV1、SKOV-3、OVCAR-3及MCAS之細胞膜上所表現之FOLR1係每一細胞分別為1.17×106、1.10×105、6.63×104及1.37×104分子(圖10)。
此處，若與實施例54(圖7)之結果相比較，則明確即便為FOLR1低表現(細胞膜上之FOLR1分子數為1×104~1×105)細胞，HuRA15-7CTAcc抗體亦顯示與FOLR1高表現(細胞膜上之FOLR1分子數為1×106)細胞相同之ADCC活性。根據以上，暗示作為不僅針對FOLR1高表現之癌細胞而且針對低表現之癌細胞之治療抗體，與已存抗體(MORAb-003)及於已存抗體中組合有已存技術之抗體(MORAb-003Acc)相比較為有用。
[實施例64] 人類乳癌組織免疫染色
以與實施例51相同之方式將人類乳癌組織陣列(BioChain)供給至免疫組織染色(IHC)。陣列係侵入性乳管癌(invasive ductal carcinoma)組織包含35例，侵入性小葉癌(invasive lobular carcinoma)組織包含2 例，正常組織包含3例，分別隨附雌激素受體(ER)、孕甾酮受體(PR)、Her2之陰陽之資訊。
染色之結果，關於HuRA15-7CTAcc及MORAb-003抗體之陽性情況，係於ER陽性且/或PR陽性且Her2陰性之組織中為56%及27%，於ER陽性且/或PR陽性且Her2陽性之組織中為50%及50%，於ER陰性且/或PR陰性且Her2陽性之組織中為71%及14%，於ER陰性且PR陰性且Her2陰性之組織中為22%及11%。根據該結果，明確與MORAb-003抗體相比，HuRA15-7CTAcc抗體可以更佳之感度對FOLR1陽性之乳癌組織進行染色。
進而，與MORAb-003抗體對於相同組織樣品之H得分相比，於HuRA15-7CTAcc抗體中未發現染色之樣品之H得分均為較高之得分。根據以上，暗示對於乳癌中所表現之FOLR1，HuRA15-7CTAcc抗體較已存抗體MORAb-003更強地結合。
[實施例65] 使用來自卵巢癌性腹水之細胞之自體性空乏(autologous depletion)試驗
自Moleoular Response公司(MR公司)購買來自冷凍之卵巢癌性腹水之細胞，實施以下之自體性空乏試驗。
首先，使來自冷凍卵巢癌性腹水之細胞於37℃之水槽中融解，懸浮於腹水細胞用培養基中。腹水細胞用培養基係使用在RPMI1640 GlutaMax(GIBCO)中添加有10%之完成不活化之FCS、1/100量之Penicillin & Streptomycin(GIBCO)、1/100量之non essential amino acid(GIBCO)及1/100量之Sodium Pyruvate(GIBCO)者。
首先，以成為2×106 cells/450μL之方式製備細胞懸浮液，以各孔450μL播種於24孔板上。繼而，以最終濃度成為1~1000ng/mL之方式利用腹水細胞用培養基製備HuRA15-7CTAcc抗體、MORAb-003抗 體及作為陰性對象之DNPDF抗體，以50μL/孔進行添加。其後，於37℃下培養24小時。
培養後，將各孔充分地移液並混和，以每次250μL分取至不同之管中。以200×g歷經5分鐘於4℃下對各管進行離心分離並去除上清液。繼而，使細胞顆粒懸浮於2mL之Stain Buffer(FBS)(BD Biosciences)中並進行相同之離心分離，去除上清液並將細胞洗淨。使細胞顆粒懸浮於100μL之Stain Buffer(FBS)中並進行癌細胞檢測用染色及陰性對象用染色。
癌細胞檢測用染色係使用CD45-PerCP(BD Biosciences)、CD14-FITC(BD Biosciences)、EpCAM-APC(BD Biosciences)及FOLR1-PE(R & D Systems)。陰性對象用染色係使用CD45-PerCP(BD Biosciences)、CD14-FITC(BD Biosciences)、mIgG1-APC(BD Biosciences)及mIgG1-PE(BD Biosciences)。
於室溫下反應30分鐘後，懸浮於2mL之Stain Buffer(FBS)中，進行利用離心分離之洗淨。於洗淨後之細胞顆粒中加入添加有1/100量之7-AAD(BD Biosciences)之400μL之Stain Buffer(FBS)並使其懸浮而製成流式細胞儀測定樣品。
對於用於細胞染色之螢光色素進行適當地補償後，利用流式細胞儀測定各樣品。首先，對7-AAD陰性(-)/CD45(-)/CD14(-)之細胞集團進行澆口，其次利用FSC、SSC去除淋巴球並對組分進行澆口。對於該細胞組分，於陰性對象用染色樣品中決定mIgG1-APC及mIgG1-PE之檢測位置後，將癌細胞檢測用染色樣品之FOLR1及EpCAM陽性(+)組分設為癌細胞集團。
又，藉由以7-AAD(-)/CD14(-)/CD45(+)之組分之檢測數成為常數之方式進行測定而比較各樣品間之癌細胞組分之細胞數變化。
將縱軸設為細胞毒殺活性(%)而表示癌細胞組分中所檢測出之細 胞數於添加有HuRA15-7CTAcc抗體、MORAb-003抗體或DNPDF抗體之樣品中以何種程度減少(圖11)。橫軸表示抗體濃度(ng/mL)。
此處，圖11之FZ12、FZ21、FZ26及FZ44分別表示卵巢癌性腹水之施體(SPECNUM/Patient ID為2003090712/7028、2009080521/173089、2009060526/5208及2003041044/113139)。又，顯示於MR公司所實施之ex vivo耐藥性試驗中，樣品均為包含順鉑耐性癌細胞之卵巢癌性腹水。
其結果如圖11所示，於任一樣品中，均與MORAb-003抗體相比，HuRA15-7CTAcc抗體自更低濃度檢測出更強之細胞毒殺活性。
根據以上，顯示若於來自卵巢癌患者之腹水之細胞群中添加HuRA15-7CTAcc抗體，則藉由腹水中之效應器細胞而殺傷腹水中之耐鉑性癌細胞。又，顯示HuRA15-7CTAcc抗體之該細胞毒殺活性高於已存卵巢癌治療抗體MORAb-003。
[實施例66] 卵巢癌細胞株之FOLR1表現量與葉酸吸收量之解析
首先，利用流式細胞儀對卵巢癌細胞株IGR-OV1(National Cancer Institute)、OVISE(JCRB細胞編號：JCRB1043)、SKOV-3(ATCC編號：HTB-77)、Caov-3(ATCC編號：HTB-75)、RMG-1(JCRB細胞編號：JCRB0172)、OV-90(ATCC編號：CRL-11732)、OVCAR-3(ATCC編號：HTB-161)、MCAS(JCRB細胞編號：JCRB0240)及TOV-112D(ATCC編號：CRL-11731)上所表現之FOLR1進行測定。
對各細胞株進行培養後，利用0.02%之EDTA溶液(Nacalai)將其剝離，利用PBS洗淨後，懸浮於FCM緩衝液(包含1mM之EDTA、0.05%之疊氮化鈉、5%之完成不活化之FCS的PBS)中。
繼而，以每1孔成為1×105個之方式播種於96孔板上，以1700rpm進行1分鐘離心分離。去除上清液後，添加以FCM緩衝液製備成1 μg/mL之HuRA15-7CTAcc抗體，於4℃下反應30分鐘。
將細胞洗淨後，添加以FCM緩衝液稀釋成200倍之Anti-Human IgG-FITC(Jackson)，於4℃下反應30分鐘。再次將細胞洗淨後，使細胞懸浮於FCM緩衝液中，利用流式細胞儀(Beckman Coulter公司製造、FC500MPL)解析螢光強度，求出各細胞之MFI值。同樣，求出以DNPDF抗體染色之各細胞之MFI值，算出HuRA15-7CTAcc抗體相對於DNPDF抗體之相對MFI值[圖12(a)]。
其結果，顯示按照IGR-OV1、OVISE、SKOV-3、Caov-3、RMG-1、OV-90、OVCAR-3、MOAS及TOV-112D之順序FOLR1表現較高。
繼而，利用不含葉酸之培養基[包含10%之完成不活化之透析FCS的不含葉酸之RPMI1640(invitrogen)]將相同之卵巢癌細胞株培養3天。其後，以最終濃度成為100nm之方式添加標記化葉酸，於37℃下培養3小時。
繼而，利用37℃之PBS將細胞洗淨後，利用添加有1mM之葉酸之培養基於37℃下培養3小時。利用PBS將細胞洗淨後，利用胰蛋白酶(GIBCO)將細胞剝離，懸浮於FCM緩衝液中。利用流式細胞儀解析螢光強度而求出各細胞之MFI值。同樣，求出未添加標記化葉酸之細胞之MFI值，算出100nM之標記化葉酸添加樣品相對於未添加標記化葉酸之樣品的相對MFI值[圖12(b)]。
其結果，顯示FOLR1表現量與葉酸吸收量不相關。例如，雖然SKOV-3為僅次於IGR-OV1、OVISE之FOLR1表現量，但葉酸吸收量低於IGR-OV1、OVISE、Caov-3、RMG-1及OV-90。其結果顯示利用接合有抗癌劑等之葉酸之治療即便對於FOLR1表現量較高之類型的癌，亦存在無效之情形。
另一方面，相對於葉酸吸收量較低之SKOV-3或OVCAR-3，本發明之抗體顯示有效之細胞毒殺活性(實施例54)。以上之結果顯示，由 於葉酸吸收量較少，故而對於未表現接合有抗癌劑等之葉酸的抗腫瘤活性之癌，本發明之抗體亦較為有效。
使用特定態樣對本發明進行了詳細地說明，但業者明確可不偏離本發明之意圖及範圍而進行各種變更及變形。再者，本申請案係基於2012年12月7日提出申請之美國臨時申請案(61/734,610號)及2012年12月7日提出申請之美國臨時申請案(61/734,547號)而引用整體。
序列表非關鍵文字
序列編號1：FOLR1之胺基酸序列
序列編號2：FOLR1-F之鹼基序列
序列編號3：FOLR1-R之鹼基序列
序列編號4：CyFOLR1-F之鹼基序列
序列編號5：CyFOLR1-R之鹼基序列
序列編號6：CyFOLR1_DNA之鹼基序列
序列編號7：CyFOLR1_AA之胺基酸序列
序列編號8：FOLR1-Fc-F之鹼基序列
序列編號9：FOLR1-Fc-R之鹼基序列
序列編號10：FOLR2-Fc-F之鹼基序列
序列編號11：FOLR2-Fc-R之鹼基序列
序列編號12：FOLR3-Fc-F之鹼基序列
序列編號13：FOLR3-Fc-R之鹼基序列
序列編號14：CyFOLR1-Fc-F之鹼基序列
序列編號15：CyFOLR1-Fc-R之鹼基序列
序列編號16：FOLR1-mH-F之鹼基序列
序列編號17：FOLR1-mH-R之鹼基序列
序列編號18：RatIgG1H-A之鹼基序列
序列編號19：RatIgG1H-B之鹼基序列
序列編號20：Ratk-A之鹼基序列
序列編號21：Ratk-B之鹼基序列
序列編號22：RA15-7VH_DNA之鹼基序列
序列編號23：RA15-7VH_AA之胺基酸序列
序列編號24：RA15-7VL_DNA之鹼基序列
序列編號25：RA15-7VL_AA之胺基酸序列
序列編號26：nonS_RA15-7VH_DNA之鹼基序列
序列編號27：nonS_RA15-7VH_AA之胺基酸序列
序列編號28：nonS_RA15-7VL_DNA之鹼基序列
序列編號29：nonS_RA15-7VL_AA之胺基酸序列
序列編號30：RA15-7VHCDR 1_AA之胺基酸序列
序列編號31：RA15-7VHCDR2_AA之胺基酸序列
序列編號32：RA15-7VHCDR 3_AA之胺基酸序列
序列編號33：RA15-7VLCDR 1_AA之胺基酸序列
序列編號34：RA15-7VLCDR2_AA之胺基酸序列
序列編號35：RA15-7VLCDR 3_AA之胺基酸序列
序列編號36：RA15-7-VLF之鹼基序列
序列編號37：RA15-7-VLR之鹼基序列
序列編號38：RA15-7-VHF之鹼基序列
序列編號39：RA15-7-VHR之鹼基序列
序列編號40：FcAcc_DNA之鹼基序列
序列編號41：FcAcc_AA之胺基酸序列
序列編號42：大鼠1-FOLR1-mycHis_DNA之鹼基序列
序列編號43：大鼠2-FOLR1-mycHis_DNA之鹼基序列
序列編號44：大鼠4-FOLR1-mycHis_DNA之鹼基序列
序列編號45：大鼠1-FOLR1-mycHis_AA之胺基酸序列
序列編號46：大鼠2-FOLR1-mycHis_AA之胺基酸序列
序列編號47：大鼠4-FOLR1-mycHis_AA之胺基酸序列
序列編號48：HV0之鹼基序列
序列編號49：HV2之鹼基序列
序列編號50：HV3之鹼基序列
序列編號51：HV4之鹼基序列
序列編號52：HV5之鹼基序列
序列編號53：HV6之鹼基序列
序列編號54：HV7之鹼基序列
序列編號55：HV8之鹼基序列
序列編號56：HV10之鹼基序列
序列編號57：LV0之鹼基序列
序列編號58：LV2之鹼基序列
序列編號59：LV3之鹼基序列
序列編號60：LV4之鹼基序列
序列編號61：LV6之鹼基序列
序列編號62：HuRA15-7HV7_DNA之鹼基序列
序列編號63：C101M_DNA之鹼基序列
序列編號64：C101G_DNA之鹼基序列
序列編號65：C101D_DNA之鹼基序列
序列編號66：C101S_DNA之鹼基序列
序列編號67：C101Y_DNA之鹼基序列
序列編號68：C101A_DNA之鹼基序列
序列編號69：C101I_DNA之鹼基序列
序列編號70：C101V_DNA之鹼基序列
序列編號71：C101T_DNA之鹼基序列
序列編號72：C101F_DNA之鹼基序列
序列編號73：C101R_DNA之鹼基序列
序列編號74：C101W_DNA之鹼基序列
序列編號75：C101P_DNA之鹼基序列
序列編號76：C101Q_DNA之鹼基序列
序列編號77：C101M_AA之胺基酸序列
序列編號78：C101G_AA之胺基酸序列
序列編號79：C101D_AA之胺基酸序列
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序列編號82：C101A_AA之胺基酸序列
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序列編號85：C101T_AA之胺基酸序列
序列編號86：G101F_AA之胺基酸序列
序列編號87：C101R_AA之胺基酸序列
序列編號88：C101W_AA之胺基酸序列
序列編號89：C101P_AA之胺基酸序列
序列編號90：C101Q_AA之胺基酸序列
序列編號91：HuRA15-7LV3_DNA之鹼基序列
序列編號92：HuRA15-7LV3_AA之胺基酸序列
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序列編號94：nonS_HuRA15-7LV3_AA之胺基酸序列
序列編號95：HuRA15-7CTVH_DNA之鹼基序列
序列編號96：HuRA15-7CTVH_AA之胺基酸序列
序列編號97：nonS_HuRA15-7CTVH_DNA之鹼基序列
序列編號98：nonS_HuRA15-7CTVH_AA之胺基酸序列
序列編號99：HuRA15-7CTVHCDR 3_AA之胺基酸序列
序列編號100：HV0_AA之胺基酸序列
序列編號101：LV0_AA之胺基酸序列
序列編號102：Rat FOLR1之胺基酸序列
<110> 日商協和醱酵麒麟有限公司
<120> 抗FOLR1抗體
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<170> 專利版3.3
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<213> 人工
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<223> nonS_HuRA15-7LV3_AA
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<213> 人工
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<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> nonS_HuRA15-7CTVH_DNA
<400> 97
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> nonS_HuRA15-7CTVH_AA
<400> 98
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<211> 13
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> HuRA15-7CTVHCDR3_AA
<400> 99
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<212> PRT
<213> 褐家鼠
<400> 102

Claims (16)

  1. 一種單株抗體或該抗體片段，其係與選自以下之(a)~(c)中之1種抗體競爭而特異地識別人類FOLR1，其與和存在於上述抗體所結合之人類FOLR1中之抗原決定基相同之抗原決定基結合，且顯示抗腫瘤活性，(a)一種抗體，其包括包含互補鏈決定區域(complementarity determining region，以下記作CDR)1~3分別由序列編號30、31、32所表示之胺基酸序列的抗體之重鏈(以下記作H鏈)，且包括包含CDR 1~3分別由序列編號33、34、35所表示之胺基酸序列的抗體之輕鏈(以下記作L鏈)(b)一種抗體，其係包括包含CDR 1~3分別由序列編號30、31、32所表示之胺基酸序列的抗體之H鏈、且包括包含CDR 1~3分別由序列編號33、34、35所表示之胺基酸序列的抗體之L鏈者，並且序列編號32(抗體H鏈之CDR 3)所表示之胺基酸序列中之半胱胺酸經蘇胺酸、甲硫胺酸、異白胺酸、纈胺酸、苯丙胺酸或穀醯胺取代(c)一種抗體，其包括包含序列編號98所表示之胺基酸序列的抗體之H鏈、且包括包含序列編號94所表示之胺基酸序列的抗體之L鏈。
  2. 如請求項1之單株抗體或該抗體片段，其為基因重組抗體。
  3. 如請求項2之單株抗體或該抗體片段，其為選自人型嵌合抗體、人源化抗體及人抗體中之基因重組抗體。
  4. 一種單株抗體或該抗體片段，其係選自以下之(a)~(c)中之1種單株抗體或該抗體片段，(a)一種單株抗體及該抗體片段，其包括包含CDR 1~3分別由 序列編號30、31、32所表示之胺基酸序列的抗體之H鏈、且包括包含CDR 1~3分別由序列編號33、34、35所表示之胺基酸序列的抗體之L鏈(b)一種抗體，其係包括包含CDR 1~3分別由序列編號30、31、32所表示之胺基酸序列的抗體之H鏈、且包括包含CDR 1~3分別由序列編號33、34、35所表示之胺基酸序列的抗體之L鏈者，並且序列編號32(抗體H鏈之CDR 3)所表示之胺基酸序列中之半胱胺酸經蘇胺酸、甲硫胺酸、異白胺酸、纈胺酸、苯丙胺酸或穀醯胺取代(c)一種抗體，其包括包含序列編號98所表示之胺基酸序列的抗體之H鏈、且包括包含序列編號94所表示之胺基酸序列的抗體之L鏈。
  5. 如請求項1至4中任一項之單株抗體及該抗體片段，其與序列編號1所表示之人類FOLR1之胺基酸序列結合。
  6. 如請求項1至4中任一項之抗體片段，其係選自包含Fab、Fab'、F(ab')2、單鏈抗體(scFv)、二聚物化V區域(雙功能抗體)、二硫化物穩定化V區域(dsFv)及CDR之肽中之抗體片段。
  7. 一種DNA，其編碼如請求項1至4中任一項之單株抗體或該抗體片段。
  8. 一種重組體載體，其含有如請求項7之DNA。
  9. 一種轉形株，其係將如請求項8之重組體載體導入至宿主細胞中而獲得。
  10. 一種如請求項1至4中任一項之單株抗體或該抗體片段之製造方法，其特徵在於：於培養基中對如請求項9之轉形株進行培養，於培養物中生成並蓄積如請求項1至4中任一項之單株抗體或該抗體片段，並自培養物中採取該抗體或該抗體片段。
  11. 一種人類FOLR1陽性細胞相關疾病之治療方法，其包括投予如請求項1至4中任一項之單株抗體或該抗體片段。
  12. 一種人類FOLR1陽性細胞相關疾病之治療藥，其包含如請求項1至4中任一項之單株抗體或該抗體片段及藥理學上所容許之載體。
  13. 一種人類FOLR1或人類FOLR1陽性細胞之免疫學檢測或測定方法，其係使用如請求項1至4中任一項之單株抗體或該抗體片段。
  14. 一種人類FOLR1陽性細胞相關疾病之診斷方法，其包括使用如請求項1至4中任一項之單株抗體或該抗體片段檢測或測定人類FOLR1陽性細胞。
  15. 一種人類FOLR1陽性細胞相關疾病之診斷藥，其包含如請求項1至4中任一項之單株抗體或該抗體片段。
  16. 一種方法，其係使用如請求項1至4中任一項之單株抗體或該抗體片段於治療開始前判斷該抗體之治療有效性。
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