TWI483737B - Anti-system ASC amino acid transporter 2 (ASCT2) antibody - Google Patents

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Description

抗系統ASC胺基酸轉運蛋白2(ASCT2)抗體
本發明係關於一種特異性識別系統ASC胺基酸轉運蛋白2(system ASC amino acid transpoter 2，以下記為ASCT2)之細胞外區域之天然型立體結構且與該細胞外區域結合的單株抗體或該抗體片段、產生該抗體之融合瘤、編碼該抗體之DNA、含有該DNA之載體、導入該載體而獲得之轉形體、使用該融合瘤或該轉形體之抗體或該抗體片段之製造方法、含有該抗體或該抗體片段之治療藥、及含有該抗體或該抗體片段之診斷藥。
ASCT2多肽係包含全長541個胺基酸之10次跨膜蛋白質，其作為鈉離子依賴性地經由細胞膜輸送中性胺基酸之轉運蛋白而發揮功能。
胺基酸轉運蛋白根據受質特異性等功能特徵被分為若干「系統」，ASCT2屬於系統ASC，其鈉離子依賴性地對L-丙胺酸、L-絲胺酸、L-蘇胺酸、L-半胱胺酸、L-麩醯胺等中性胺基酸之細胞內吞發揮功能(非專利文獻1)。
又，ASCT2係D型猴反轉錄病毒與3個C型病毒[貓內源性病毒(RD114)、狒狒內源性病毒、鳥類網狀內皮症病毒]所共有之病毒的細胞表面受體(非專利文獻2、3)。
作為ASCT2之名稱，已知有：鈉依賴性中性胺基酸轉運蛋白2型(sodium-dependent neutral amino acid transporter type 2)、脂肪細胞胺基酸轉運蛋白(adipocyte amino acid transporter，AAAT)、中性胺基酸轉運蛋白B(neutral amino acid transporter B，ATB)、胺基酸轉運蛋白B0 (amino acid transporter B0 ，ATB0 )、ATBO、狒狒M7病毒受體(baboon M7 virus receptor()、M7V1、M7VS1、胰島素活性胺基酸轉運蛋白(insulin-activated amino acid transporter)、FLJ31068、RD114病毒受體(RD114 virus receptor)、RD114/猴D型反轉錄病毒(RD114/simian type D retrovirus receptor)、RDR、RDRC、或R16(非專利文獻1、3)。
進而，作為ASCT2之其他名稱，已知有溶質載體家族1(中性胺基酸轉運蛋白)成員5、溶質載體家族1成員5、或SLC1A5，屬於SLC1家族。
關於癌與ASCT2或SLC1A5之表現的關係，藉由使用EST(expressed sequence tag，表現序列標籤)資料庫之研究得知，SLC1A5、SLC7A5及SLC38A5之3種轉運蛋白於癌組織中明顯表現亢進(非專利文獻4)。
又，於正常肝臟中完全未見SLC1A5之表現，相對於此，於肝細胞癌或肝母細胞瘤之臨床組織中可見SLC1A5之表現(非專利文獻5)。進而，與正常組織相比，低分化星形細胞瘤或多形性膠質母細胞瘤之臨床組織中SLC1A5亦表現亢進(非專利文獻6)。
又，於大腸癌與攝護腺癌之臨床組織中，ASCT2之表現係藉由免疫組織染色或西方墨點法進行檢測，ASCT2之表現較高之患者的預後較差(非專利文獻7、8)。
進而，大腸癌、肝癌、乳癌、星形細胞瘤及神經母細胞瘤之數種細胞株中，麩醯胺之內吞係由ASCT2負責(非專利文獻9~12)。藉由使用作為ASCT2之受質之丙胺酸-絲胺酸-蘇胺酸混合物競爭抑制麩醯胺之細胞內吞，會抑制細胞之增殖(非專利文獻9)。
作為與ASCT2結合之抗體，已知有針對人類ASCT2之細胞內N末端或C末端之部分肽的多株抗體(非專利文獻13、14、15)。
已知於生物體內，若抗體與表現於細胞膜上之抗原蛋白結合，則抗體依賴性細胞阻礙活性(以下記為ADCC活性)或補體依賴性細胞阻礙活性(以下記為CDC活性)等抗體所具有之效應活性會誘導細胞阻礙(非專利文獻16)。
又，識別人類ASCT2之多株抗體係由LifeSpan Biosciences公司(目錄編號：LS-C16840及LC-C31887)、Aviva Systems Biology公司(目錄編號：ARP42247_T100)、Santa Cruz Biotechnology公司(目錄編號：sc-50698及sc-50701)、或Millipore公司(目錄編號：AB5468)銷售。
先前技術文獻 非 專利文獻
非專利文獻1：J. Biol. Chemistry,271,18657(1996)
非專利文獻2：Proc. Natl. Acad. Sci. USA,96,2129(1999)
非專利文獻3：J. Virology,73,4470(1999)
非專利文獻4：Seminars in Cancer Biology,15,254(2005)
非專利文獻5：Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol.,283,G1062(2002)
非專利文獻6：NeuroReport,15,575(2004)
非專利文獻7：Anticancer Research,22,2555(2002)
非專利文獻8：Anticancer Research,23,3413(2003)
非專利文獻9：J. Surgical Research,90,149(2000)
非專利文獻10：J. Cellular Physiology,176,166(1998)
非專利文獻11：J. Neuroscience Research,66,959(2001)
非專利文獻12：Am. J. Physiol. Cell Physiol.,282,C1246(2002)
非專利文獻13：J. Gene Medicine,6,249(2004)
非專利文獻14：Am. J. Physiol. Cell Physiol.,281,C963(2001)
非專利文獻15：Biochem. J.,382,27(2004)
非專利文獻16：Cancer Res.,56,1118(1996)
非專利文獻13~15中所記載之抗體均為識別ASCT2之細胞內部分的抗體，因此無法與表現於細胞之細胞膜上之ASCT2結合。
又，非專利文獻16中所記載之抗體無法與表現於細胞之細胞膜上之ASCT2結合，因此無法期待由該等效應活性引起之細胞阻礙。又，該等抗體均為識別ASCT2之細胞內部分之抗體，因此無法抑制由於活細胞中表現之ASCT2所引起的胺基酸之細胞內吞。
進而，尚不知曉特異性識別ASCT2之細胞外區域之天然型立體結構且與該細胞外區域結合之單株抗體。
因此，本發明之課題在於提供一種特異性識別ASCT2之細胞外區域之天然型立體結構且與該細胞外區域結合之單株抗體或該抗體片段。又，提供一種產生該抗體之融合瘤、編碼該抗體之DNA、含有該DNA之載體、導入該載體而獲得之轉形體、使用該融合瘤或該轉形體之抗體或該抗體片段之製造方法、含有該抗體或該抗體片段之治療藥、及含有該抗體或該抗體片段之診斷藥。
本發明係關於如下之(1)~(24)。
(1)一種單株抗體或該抗體片段，其特異性識別系統ASC胺基酸轉運蛋白2(以下，記為ASCT2)之細胞外區域之天然型立體結構且與該細胞外區域結合，並且該抗體之重鏈可變區域(以下，記為VH)含有序列編號76所表示之胺基酸序列，該抗體之輕鏈可變區域(以下，記為VL)含有序列編號84所表示之胺基酸序列。
(2)一種單株抗體或該抗體片段，其特異性識別ASCT2之細胞外區域之天然型立體結構且與該細胞外區域結合，並且該抗體VH含有序列編號82所表示之胺基酸序列，該抗體之VL含有序列編號84所表示之胺基酸序列。
(3)如(1)或(2)之單株抗體或該抗體片段，其係抑制經由ASCT2之胺基酸之細胞內吞。
(4)如(1)至(3)中任一項之單株抗體或該抗體片段，其具有細胞阻礙活性。
(5)如(4)之單株抗體或該抗體片段，其中細胞阻礙活性為抗體依賴性細胞阻礙(ADCC)活性或補體依賴性細胞阻礙(CDC)活性。
(6)如(1)至(5)中任一項之抗體片段，其係選自Fab、Fab'、F(ab')2 、單鏈抗體(scFv)、二聚化V區域(Diabody)、二硫醚穩定化V區域(dsFv)及含有CDR之肽中之抗體片段。
(7)如(1)至(6)中任一項之單株抗體或該抗體片段，其係基因重組抗體。
(8)如(7)之單株抗體或該抗體片段，其係選自人類化抗體及人類抗體中之基因重組抗體。
(9)一種融合瘤，其產生如(1)至(8)中任一項之單株抗體。
(10)一種DNA，其編碼如(1)至(8)中任一項之單株抗體或該抗體片段。
(11)一種重組體載體，其含有如(10)之DNA。
(12)一種轉形體，其係將如(11)之重組體載體導入至宿主細胞中而獲得。
(13)一種如(1)至(8)中任一項之單株抗體或該抗體片段之製造方法，其係於培養基中培養如(9)之融合瘤、或如(12)之轉形體，使如(1)至(8)中任一項之單株抗體或該抗體片段生成蓄積於培養物中，再自培養物中採集單株抗體或該抗體片段。
(14)一種與ASCT2相關之疾病之治療藥，其含有如(1)至(8)中任一項之單株抗體或該抗體片段作為有效成分。
(15)如(14)之治療藥，其中與ASCT2相關之疾病為癌。
(16)如(15)之治療藥，其中癌為血癌、食道癌、胃癌、大腸癌、肝癌或攝護腺癌。
(17)一種ASCT2之免疫學檢測或測定方法，其使用如(1)至(8)中任一項之單株抗體或該抗體片段。
(18)如(17)之檢測或測定方法，其中免疫學測定方法為免疫沈澱法。
(19)一種表現ASCT2之細胞之免疫學檢測或測定方法，其使用如(1)至(8)中任一項之抗體或該抗體片段。
(20)如(19)之檢測或測定方法，其中免疫學檢測方法為螢光細胞染色法。
(21)一種ASCT2之免疫學檢測用或測定用試劑，其含有如(1)至(8)中任一項之抗體或該抗體片段。
(22)一種與ASCT2相關之疾病之診斷藥，其含有如(1)至(8)中任一項之抗體或該抗體片段。
(23)如(22)之診斷藥，其中與ASCT2相關之疾病為癌。
(24)如(23)之診斷藥，其中癌為血癌、食道癌、胃癌、大腸癌、肝癌或攝護腺癌。
根據本發明，可提供一種特異性識別ASCT2之細胞外區域之天然型立體結構且與該細胞外區域結合之單株抗體或該抗體片段、產生該抗體之融合瘤、編碼該抗體之DNA、含有該DNA而成之載體、導入該載體而獲得之轉形體、使用該融合瘤或該轉形體之抗體或該抗體片段之製造方法。
本發明之單株抗體或該抗體片段可用於與ASCT2相關之疾病之治療藥及診斷藥等，並且非常有效。
本發明係關於一種特異性識別ASCT2之細胞外區域之天然型立體結構且與該細胞外區域結合之單株抗體或該抗體片段。
作為本發明之ASCT2，其種類並無特別限定，較佳可列舉哺乳動物，具體可列舉人類。
ASCT2之胺基酸序列資訊可自NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)等公知之資料庫取得。
例如可列舉：具有序列編號2所表示之胺基酸序列的人類ASCT2(NCBI存取編號：NP_005619)、或具有序列編號86所表示之小鼠ASCT2(NCBI存取編號：NP_033227)等。
作為本發明中之ASCT2，例如可列舉：具有序列編號2所表示之胺基酸序列的多肽，或者包含序列編號2所表示之胺基酸序列中有一個以上之胺基酸缺失、置換或附加之胺基酸序列且具有ASCT2之功能的多肽。
具有與序列編號2所表示之胺基酸序列具有較佳為60%以上、更佳為80%以上、更佳為90%以上之同源性之胺基酸序列的多肽，包含具有最佳為95%以上之同源性之胺基酸序列且具有ASCT2之功能的多肽亦包含於本發明之ASCT2中。
具有序列編號2所表示之胺基酸序列中有1個以上之胺基酸缺失、置換、或附加之胺基酸序列的多肽可藉由如下方式而獲得：使用部位特異性變異導入法[Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)、Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons(1987-1997)、Nucleic Acids Research,10,6487(1982)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA,79,6409(1982)、Gene,34,315(1985)、Nucleic Acids Research,13,4431(1985)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA,82,488(1985)]等，對編碼具有例如序列編號2所表示之胺基酸序列之多肽的DNA導入部位特異性變異。
缺失、置換或附加之胺基酸之數量並無特別限定，較佳為1個~數十個，例如1~20個，更佳為1個~數個，例如1~5個胺基酸。
作為編碼ASCT2之基因，例如可列舉序列編號1所表示之鹼基序列。
含有編碼如下多肽之DNA的基因亦包含於編碼本發明之ASCT2的基因中，該多肽包含序列編號1所表示之鹼基序列中有1個以上之鹼基缺失、置換或附加之鹼基序列且具有ASCT2之功能。
又，含有編碼如下多肽之DNA的基因亦包含於編碼本發明之ASCT2的基因中，該多肽包含與序列編號1所表示之鹼基序列具有至少60%以上之同源性的鹼基序列，較佳為具有80%以上之同源性之鹼基序列，更佳為具有95%以上之同源性之鹼基序列，且具有ASCT2之功能。
進而，含有編碼如下多肽之DNA的基因等亦包含於編碼本發明之ASCT2之基因中，該多肽包含具有序列編號1所表示之鹼基序列之DNA及於嚴格條件下進行雜交之DNA，且具有ASCT2之功能。
作為於嚴格條件下進行雜交之DNA，係指以具有序列編號1所表示之鹼基序列之DNA作為探針，藉由菌落雜交法、溶菌斑雜交法、南方墨點雜交法、或DNA微陣列法等而獲得之可雜交的DNA。
具體而言，可列舉可藉由如下方式進行鑑定之DNA：使用固定有源自雜交之菌落或噬菌斑之DNA、或具有該序列之PCR產物或寡聚DNA的過濾器或載玻片，於0.7~1.0 mol/L之氯化鈉存在下，於65℃下進行雜交[Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)、Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons(1987~1997)、DNA Cloning 1：Core Techniques,A Practical Approach,Second Edition,Oxford University,(1995)]後，使用0.1~2倍濃度之SSC溶液(1倍濃度之SSC溶液之組成含有150 mmol/L氯化鈉、15 mmol/L檸檬酸鈉)，於65℃之條件下清洗過濾器或載玻片。
作為可雜交之DNA，可列舉與序列編號1所表示之鹼基序列具有至少60%以上之同源性的DNA，較佳為具有80%以上之同源性之DNA，更佳為具有95%以上之同源性之DNA。
對於編碼真核生物之蛋白質之基因的鹼基序列，常常可見基因之多型。本發明中所使用之基因由於上述多型而使鹼基序列產生微小變異之基因亦包含於編碼本發明之ASCT2之基因中。
除特別明示之情形以外，本發明之同源性的數值可為使用業者公知之同源性檢索程式算出之數值。
關於鹼基序列，可列舉使用BLAST[J. Mol. Biol.,215,403(1990)]中預設之參數而算出之數值等。
又，關於胺基酸序列，可列舉使用BLAST2[Nucleic Acids Res.,25,3389(1997)、Genome Res.,7,649(1997)、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Education/BLASTinfo/information3.html]中預設之參數而算出之數值等。
作為預設之參數，G(Cost to open gap，起始空隙罰分)於鹼基序列之情形時為5，於胺基酸序列之情形時為11；-E(Cost to extend gap，延伸空隙罰分)於鹼基序列之情形時為2，於胺基酸序列之情形時為1；-q(Penalty for nucleotide mismatch，核酸錯配罰分)為-3；-r(reward for nucleotide match，核酸匹配得分)為1；-e(expect value，期望值)為10；-W(wordsize，字長)於鹼基序列之情形時為11個殘基，於胺基酸序列之情形時為3個殘基；-y[Dropoff(X) for blast extensions in bits，blast延伸降低值域]於blastn之情形時為20，於blastn以外之程式時為7；-X(X dropoff value for gapped alignment in bits，空隙比對之降低值(位元))為15；及-Z(final X dropoff value for gapped alignment in bits，最終空隙比對之降低值(位元))於blastn之情形時為50，於blastn以外之程式時為25(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/html/blastcgihelp.html)。
含有序列編號2所表示之胺基酸序列之部分序列的多肽可藉由業者公知之方法而製作。例如可藉由如下方式製作：使編碼序列編號2所表示之胺基酸序列之DNA的一部分缺失，並對導入有含有該DNA之表現載體之轉形體進行培養。
又，基於如此製作之多肽或DNA，藉由與上述相同之方法，可獲得具有序列編號2所表示之胺基酸序列之部分序列中有1個以上之胺基酸缺失、置換或附加之胺基酸序列的多肽。
進而，含有序列編號2所表示之胺基酸序列之部分序列之多肽，或者具有序列編號2所表示之胺基酸序列之部分序列中有1個以上之胺基酸缺失、置換或附加之胺基酸序列的多肽，亦可藉由Fmoc法(茀基甲氧羰基法)及tBoc法(第三丁氧羰基法)等化學合成法而製造。
作為本發明之ASCT2之細胞外區域，例如可列舉：使用公知之跨膜區域預測程式SOSUI(http://sosui.proteome. bio.tuat.ac.jp/sosuiframe0.html)、TMHMM ver. 2(http://www. cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)或ExPASy Proteomics Server(http://Ca.expasy.org/)等預測序列編號2所表示之該多肽之胺基酸序列而獲得的區域等。
具體而言，可列舉ExPASy Proteomics Server所預測之細胞外區即第74號~第98號、第154號~第224號、第287號~第305號、第357號~第376號、及第420號~第425號之5個區域。
或可列舉：文獻[J. Biol. Chemistry,271,18657(1996)]或[J. Virology,73,4470(1999)]中所預測之細胞外區即第65號~第88號、第152號~第224號、第288號~第306號、第361號~第380號、及第447號~第451號之五個區域。
本發明中，自N末側起依序將ASCT2之五個細胞外區域表示為EL1區域、EL2區域、EL3區域、EL4區域及EL5區域。例如序列編號2所表示之ASCT2多肽之胺基酸序列中之EL2區域為第154號~第224號或第152號~第224號。
本發明之單株抗體係與ASCT2之細胞外區域結合，較佳為與ASCT2之細胞外區域中選自EL1~EL5區域中之至少一個區域結合，更佳為與ASCT2之細胞外區域中之至少EL2區域結合。
作為本發明之ASCT2之細胞外區域的天然型立體結構，若具有序列編號2所表示之胺基酸序列之ASCT2的細胞外區域具有與可於天然狀態下獲得之立體結構同等之立體結構，則可為任意結構。
本發明之抗體或該抗體片段特異性識別ASCT2之細胞外區域之天然型立體結構且與該細胞外區域結合的情況可藉由如下方法而確認：使用固相三明治法等之放射免疫測定法、或使用酶免疫測定法(ELISA)等之針對表現有ASCT2之細胞的公知之免疫學檢測法，較佳為螢光細胞染色法等可檢查抗體針對表現有特定抗原之細胞與特定抗原之結合性的方法。
例如，可列舉使用FMAT8100HTS系統(Applied Biosystems公司製造)等之螢光抗體染色法[Cancer Immunol. Immunother.,36,373(1993)]、使用流式細胞儀之螢光細胞染色法、或使用Biacore Systems(GE Healthcare公司製造)等之表面離體子共振等方法。
又，亦可將公知之免疫學檢測法[Monoclonal Antibodies-Principles and practice,Third edition,Academic Press(1996)、Antibodies-A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory(1988)、單株抗體實驗指南講談社科學(1987)]等加以組合而確認。
作為表現有ASCT2之細胞，只要表現ASCT2則可為任意細胞，例如可列舉人類體內天然存在之細胞、由人類體內天然存在之細胞而建立之細胞株、或藉由基因重組技術獲得之細胞等。
作為人類體內天然存在之細胞，可列舉癌症患者體內表現有該多肽之細胞，例如可列舉藉由活組織檢查等而獲得之腫瘤細胞中表現有該ASCT2之細胞等。
作為由人類體內天然存在之細胞而建立之細胞株，可列舉將自上述癌症患者獲得之表現有該ASCT2之細胞株化而獲得之細胞株中表現有該ASCT2的細胞株。
例如可列舉作為由人類細胞建立之細胞株的多發性骨髓瘤細胞株KMS-11[生命科學研究資源庫(HSRRB)編號：JCRB1179]或RPMI8226(HSRRB編號：JCRB0034)等。
作為藉由基因重組技術而獲得之細胞，具體而言，例如可列舉：藉由將含有編碼該ASCT2之cDNA的表現載體導入至昆蟲細胞或動物細胞等中而獲得的表現有該ASCT2之細胞等。
作為本發明之單株抗體，例如可列舉：由融合瘤產生之抗體、或由利用含有抗體基因之表現載體進行轉形而獲得之轉形體產生的基因重組抗體。
融合瘤例如可藉由如下方式製備：製備上述表現有ASCT2之細胞等作為抗原，由免疫該抗原之動物誘導具有抗原特異性之抗體產生細胞，進而使該抗體產生細胞與骨髓瘤細胞融合。
可藉由培養上述融合瘤，或將該融合瘤細胞投予動物使該動物腹水癌化，並將該培養液或腹水加以分離、純化而取得抗ASCT2抗體。
作為免疫抗原之動物，只要可製作融合瘤，則可使用任意動物，較佳為使用小鼠、大鼠、倉鼠或兔子等。
又，自上述動物取得具有抗體產生能力之細胞，於活體外對該細胞實施免疫後，使之與骨髓瘤細胞融合而製作融合瘤，該融合瘤所產生之抗體等亦包含於本發明之抗體中。
作為由本發明之融合瘤產生之單株抗體的具體例，可列舉：由融合瘤KM3998產生之抗體KM3998、由融合瘤KM4000產生之抗體KM4000、由融合瘤KM4001產生之抗體KM4001、由融合瘤KM4008產生之抗體KM4008、由融合瘤KM4012產生之抗體KM4012及由融合瘤KM4018產生之抗體KM4018等。
融合瘤KM4008及KM4012係於2008年5月1日，基於布達佩斯條約，以FERM BP-10962及FERM BP-10963之編號寄存於獨立行政法人產業技術綜合研究所專利生物寄存中心(國際公開第2010/008075號)。
進而，與由上述融合瘤產生之抗體所結合之抗原決定位結合的單株抗體亦包含於本發明之單株抗體中。
作為本發明之基因重組抗體，包含人類型嵌合抗體、人類化抗體、人類抗體或各自之抗體片段等藉由基因重組而製造之抗體。
基因重組抗體中，具有單株抗體之特徵、抗原性較低、血漿半衰期延長者作為治療藥較佳。作為基因重組抗體，例如可列舉使用基因重組技術而修飾上述本發明之單株抗體而獲得者。
作為本發明之基因重組抗體，具體可列舉以下(1)~(3)之抗體。
(1)抗體之重鏈可變區域(以下，記為VH)之互補決定區域(Complementarity Determining Region，以下記為CDR)1、CDR2及CDR3分別含有序列編號26、27及28所表示之胺基酸序列，及/或抗體之輕鏈可變區域(以下，記為VL)之CDR1、CDR2及CDR3分別含有序列編號29、30、31所表示之胺基酸序列的基因重組抗體。
(2)抗體之VH之CDR1、CDR2及CDR3分別含有序列編號32、33及34所表示之胺基酸序列，及/或VL之CDR1、CDR2及CDR3分別含有序列編號35、36及37所表示之胺基酸序列的基因重組抗體。
(3)抗體之VH之CDR1、CDR2及CDR3分別含有序列編號49、50及51所表示之胺基酸序列，及/或抗體之VL之CDR1、CDR2及CDR3分別含有序列編號52、53及54所表示之胺基酸序列的基因重組抗體。
人類型嵌合抗體係指包含人類以外之動物之抗體的VH及VL與人類抗體之重鏈恆定區域(以下，記為CH)及輕鏈恆定區域(以下，記為CL)的抗體。
本發明之人類型嵌合抗體可藉由如下方式製造：自產生特異性識別ASCT2之細胞外區域之立體結構且與該細胞外區域結合之單株抗體的融合瘤，取得編碼VH及VL之cDNA，將該等分別插入至具有編碼人類抗體之CH及CL之基因的動物細胞用表現載體中，而構建人類型嵌合抗體表現載體，並將該載體導入至動物細胞中，使抗體表現而製作本發明之人類型嵌合抗體。
作為人類型嵌合抗體之CH，只要屬於人類免疫球蛋白(以下，記為hIg)，則可為任意者，較佳為使用hIgG型者。進而，亦可使用屬於hIgG型之hIgG1、hIgG2、hIgG3及hIgG4等亞型中之任意者。
又，作為人類型嵌合抗體之CL，只要屬於hIg則可為任意者，可使用κ型或λ型者。
作為本發明之人類型嵌合抗體，可列舉以下(1)~(3)。
(1)抗體之VH含有序列編號19所表示之胺基酸序列，且抗體之VL含有序列編號21所表示之胺基酸序列的人類型嵌合抗體
(2)抗體之VH含有序列編號23所表示之胺基酸序列，且抗體之VL含有序列編號25所表示之胺基酸序列的人類型嵌合抗體
(3)抗體之VH含有序列編號46所表示之胺基酸序列，且抗體之VL含有序列編號48所表示之胺基酸序列的人類型嵌合抗體
作為本發明之人類型嵌合抗體，具體而言，例如可列舉：人類型嵌合抗體cKM4008、cKM4012及cKM4018等。
人類化抗體係指將人類以外之動物之抗體之VH及VL之CDR的胺基酸序列移植至人類抗體之VH及VL之適當位置而獲得的抗體，亦稱為人類型CDR移植抗體、改型抗體(reshaped-antibody)等。
本發明之人類化抗體可藉由如下方式製造。將由產生特異性識別ASCT2之細胞外區域之立體結構且與該細胞外區域結合的人類以外之動物之單株抗體的融合瘤所產生之人類以外的動物之抗體之VH及VL的CDR之胺基酸序列移植至任意人類抗體之VH及VL的構架(以下，記為FR)，構建編碼所獲得之抗體可變區域(以下，記為V區域)的cDNA，將該cDNA分別插入至具有編碼人類抗體之CH及CL之基因的動物細胞用表現載體中而構建人類化抗體表現載體。藉由將該表現載體導入至動物細胞中而使抗體表現，可製造本發明之人類化抗體。
人類化抗體之VH及VL之FR的胺基酸序列只要為源自人類抗體之VH及VL之FR之胺基酸序列，則可使用任意者。
例如使用蛋白質結構資料庫(Protein Data Bank)等資料庫中所登錄之人類抗體之VH及VL之FR的胺基酸序列、或Sequences of Proteins of Immunological Interest,US Dept. Health and Human Services(1991)等中所記載之人類抗體之VH及VL之FR之各亞群的共同胺基酸序列等。
作為人類化抗體之CH，只要屬於hIg則可為任意者，較佳為hIgG型。進而亦可使用屬於hIgG型之hIgG1、hIgG2、hIgG3及hIgG4等亞型中之任一者。
又，作為人類型CDR移植抗體之CL，只要為屬於hIg則可為任意者，可使用κ型或λ型者。
作為本發明之人類化抗體，具體而言，較佳為含有以下
(a)抗體之VH及(b)抗體之VL之至少一者的人類化抗體。再者，以下(a)及(b)中，所導入之修飾的數量並無限制。(a)含有序列編號71所表示之胺基酸序列，或選自序列編號71所表示之胺基酸序列中之第2號之Val、第9號之Ser、第20號之Val、第30號之Ser、第38號之Arg、第46號之Glu、第86號之Leu、第93號之Val、第95號之Tyr及第116號之Val中之至少一個胺基酸殘基被置換為其他胺基酸殘基之胺基酸序列的VH
(b)含有序列編號72所表示之胺基酸序列，或選自序列編號72所表示之胺基酸序列中之第8號之Pro、第15號之Val、第38號之Gln、第43號之Ala、第44號之Pro、第71號之Phe及第87號之Tyr中之至少一個胺基酸殘基被置換為其他胺基酸殘基之胺基酸序列的VL
作為本發明之人類化抗體中所含之VH，較佳為以下(1)~(3)。
(1)含有序列編號71所表示之胺基酸序列中之第9號之Ser、第20號之Val、第38號之Arg、第46號之Glu、第93號之Val、第95號之Tyr及第116號之Val被置換為其他胺基酸殘基之胺基酸序列的VH
(2)含有序列編號71所表示之胺基酸序列中之第20號之Val、第46號之Glu、第95號之Tyr及第116號之Val被置換為其他胺基酸殘基之胺基酸序列的VH
(3)含有序列編號71所表示之胺基酸序列中之第46號之Glu、及第95號之Tyr被置換為其他胺基酸殘基之胺基酸序列的VH
作為上述VH之胺基酸序列，例如可列舉導入有選自如下修飾中之至少一種修飾的胺基酸序列：將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第2號之Val置換為Ile，將第9號之Ser置換為Pro，將第20號之Val置換為Ile，將第30號之Ser置換為Thr，將第38號之Arg置換為Lys，將第46號之Glu置換為Lys，將第86號之Leu置換為Val，將第93號之Val置換為Thr，將第95號之Tyr置換為Phe，及將第116號之Val置換為Leu。
作為上述VH之胺基酸序列，具體而言，例如可列舉導入有以下之1~10個修飾之胺基酸序列。
作為導入有10個修飾之VH之胺基酸序列，具體可列舉將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第2號之Val置換為Ile，將第9號之Ser置換為Pro，將第20號之Val置換為Ile，將第30號之Ser置換為Thr，將第38號之Arg置換為Lys，將第46號之Glu置換為Lys，將第86號之Leu置換為Val，將第93號之Val置換為Thr，將第95號之Tyr置換為Phe，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列。
作為導入有9個修飾之VH之胺基酸序列，具體而言，例如可列舉以下(1)~(10)之胺基酸序列。
(1)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第9號之Ser置換為Pro，將第20號之Val置換為Ile，將第30號之Ser置換為Thr，將第38號之Arg置換為Lys，將第46號之Glu置換為Lys，將第86號之Leu置換為Val，將第93號之Val置換為Thr，將第95號之Tyr置換為Phe，及將第116編號之Val置換為Leu的胺基酸序列
(2)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第2號之Val置換為Ile，將第20號之Val置換為Ile，將第30號之Ser置換為Thr，將第38號之Arg置換為Lys，將第46號之Glu置換為Lys，將第86號之Leu置換為Val，將第93號之Val置換為Thr，將第95號之Tyr置換為Phe，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列
(3)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第2號之Val置換為Ile，將第9號之Ser置換為Pro，將第30號之Ser置換為Thr，將第38號之Arg置換為Lys，將第46號之Glu置換為Lys，將第86號之Leu置換為Val，將第93號之Val置換為Thr，將第95號之Tyr置換為Phe，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列
(4)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第2號之Val置換為Ile，將第9號之Ser置換為Pro，將第20號之Val置換為Ile，將第38號之Arg置換為Lys，將第46號之Glu置換為Lys，將第86號之Leu置換為Val，將第93號之Val置換為Thr，將第95號之Tyr置換為Phe，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列
(5)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第2號之Val置換為Ile，將第9號之Ser置換為Pro，將第20號之Val置換為Ile，將第30號之Ser置換為Thr，將第46號之Glu置換為Lys，將第86號之Leu置換為Val，將第93號之Val置換為Thr，將第95號之Tyr置換為Phe，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列
(6)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第2號之Val置換為Ile，將第9號之Ser置換為Pro，將第20號之Val置換為I1e，將第30號之Ser置換為Thr，將第38號之Arg置換為Lys，將第86號之Leu置換為Val，將第93號之Val置換為Thr，將第95號之Tyr置換為Phe，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列
(7)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第2號之Val置換為Ile，將第9號之Ser置換為Pro，將第20號之Val置換為Ile，將第30號之Ser置換為Thr，將第38號之Arg置換為Lys，將第46號之Glu置換為Lys，將第93號之Val置換為Thr，將第95號之Tyr置換為Phe，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列
(8)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第2號之Val置換為Ile，將第9號之Ser置換為Pro，將第20號之Val置換為Ile，將第30號之Ser置換為Thr，將第38號之Arg置換為Lys，將第46號之Glu置換為Lys，將第86號之Leu置換為Val，將第95號之Tyr置換為Phe，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列
(9)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第2號之Val置換為Ile，將第9號之Ser置換為Pro，將第20號之Val置換為Ile，將第30號之Ser置換為Thr，將第38號之Arg置換為Lys，將第46號之Glu置換為Lys，將第86號之Leu置換為Val，將第93號之Val置換為Thr，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列
(10)將序列編號71所表示之胺基酸序列中第2號之Val置換為Ile，將第9號之Ser置換為Pro，將第20號之Val置換為Ile，將第30號之Ser置換為Thr，將第38號之Arg置換為Lys，將第46號之Glu置換為Lys，將第86號之Leu置換為Val，將第93號之Val置換為Thr，及將第95號之Tyr置換為Phe的胺基酸序列
作為導入有8個修飾之VH之胺基酸序列，具體而言，例如可列舉以下(1)~(45)之胺基酸序列。(1)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第20號之Val置換為Ile，將第30號之Ser置換為Thr，將第38號之Arg置換為Lys，將第46號之Glu置換為Lys，將第86號之Leu置換為Val，將第93號之Val置換為Thr，將第95號之Tyr置換為Phe，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列(2)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第9號之Ser置換為Pro，將第30號之Ser置換為Thr，將第38號之Arg置換為Lys，將第46號之Glu置換為Lys，將第86號之Leu置換為Val，將第93號之Val置換為Thr，將第95號之Tyr置換為Phe，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列(3)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第9號之Ser置換為Pro，將第20號之Val置換為Ile，將第38號之Arg置換為Lys，將第46號之Glu置換為Lys，將第86號之Leu置換為Val，將第93號之Val置換為Thr，將第95號之Tyr置換為Phe，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列(4)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第9號之Ser置換為Pro，將第20號之Val置換為Ile，將第30號之Ser置換為Thr，將第46號之Glu置換為Lys，將第86號之Leu置換為Val，將第93號之Val置換為Thr，將第95號之Tyr置換為Phe，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列(5)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第9號之Ser置換為Pro，將第20號之Val置換為Ile，將第30號之Ser置換為Thr，將第38號之Arg置換為Lys，將第86號之Leu置換為Val，將第93號之Val置換為Thr，將第95號之Tyr置換為Phe，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列(6)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第9號之Ser置換為Pro，將第20號之Val置換為Ile，將第30號之Ser置換為Thr，將第38號之Arg置換為Lys，將第46號之Glu置換為Lys，將第93號之Val置換為Thr，將第95號之Tyr置換為Phe，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列(7)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第9號之Ser置換為Pro，將第20號之Val置換為Ile，將第30號之Ser置換為Thr，將第38號之Arg置換為Lys，將第46號之Glu置換為Lys，將第86號之Leu置換為Val，將第95號之Tyr置換為Phe，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列(8)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第9號之Ser置換為Pro，將第20號之Val置換為Ile，將第30號之Ser置換為Thr，將第38號之Arg置換為Lys，將第46號之Glu置換為Lys，將第86號之Leu置換為Val，將第93號之Val置換為Thr，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列(9)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第9號之Ser置換為Pro，將第20號之Val置換為Ile，將第30號之Ser置換為Thr，將第38號之Arg置換為Lys，將第46號之Glu置換為Lys，將第86號之Leu置換為Val，將第93號之Val置換為Thr，及將第95號之Tyr置換為Phe的胺基酸序列(10)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第2號之Val置換為Ile，將第30號之Ser置換為Thr，將第38號之Arg置換為Lys，將第46號之Glu置換為Lys，將第86號之Leu置換為Val，將第93號之Val置換為Thr，將第95號之Tyr置換為Phe，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列(11)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第2號之Val置換為Ile，將第20號之Val置換為Ile，將第38號之Arg置換為Lys，將第46號之Glu置換為Lys，將第86號之Leu置換為Val，將第93號之Val置換為Thr，將第95號之Tyr置換為Phe，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列(12)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第2號之Val置換為Ile，將第20號之Val置換為Ile，將第30號之Ser置換為Thr，將第46號之Glu置換為Lys，將第86號之Leu置換為Val，將第93號之Val置換為Thr，將第95號之Tyr置換為Phe，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列(13)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第2號之Val置換為Ile，將第20號之Val置換為Ile，將第30號之Ser置換為Thr，將第38號之Arg置換為Lys，將第86號之Leu置換為Val，將第93號之Val置換為Thr，將第95號之Tyr置換為Phe，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列(14)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第2號之Val置換為Ile，將第20號之Val置換為Ile，將第30號之Ser置換為Thr，將第38號之Arg置換為Lys，將第46號之Glu置換為Lys，將第93號之Val置換為Thr，將第95號之Tyr置換為Phe，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列(15)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第2號之Val置換為Ile，將第20號之Val置換為Ile，將第30號之Ser置換為Thr，將第38號之Arg置換為Lys，將第46號之Glu置換為Lys，將第86號之Leu置換為Val，將第95號之Tyr置換為Phe，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列(16)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第2號之Val置換為Ile，將第20號之Val置換為Ile，將第30號之Ser置換為Thr，將第38號之Arg置換為Lys，將第46號之Glu置換為Lys，將第86號之Leu置換為Val，將第93號之Val置換為Thr，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列(17)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第2號之Val置換為Ile，將第20號之Val置換為Ile，將第30號之Ser置換為Thr，將第38號之Arg置換為Lys，將第46號之Glu置換為Lys，將第86號之Leu置換為Val，將第93號之Val置換為Thr，及將第95號之Tyr置換為Phe的胺基酸序列(18)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第2號之Val置換為Ile，將第9號之Ser置換為Pro，將第38號之Arg置換為Lys，將第46號之Glu置換為Lys，將第86號之Leu置換為Val，將第93號之Val置換為Thr，將第95號之Tyr置換為Phe，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列(19)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第2號之Val置換為Ile，將第9號之Ser置換為Pro，將第30號之Ser置換為Thr，將第46號之Glu置換為Lys，將第86號之Leu置換為Val，將第93號之Val置換為Thr，將第95號之Tyr置換為Phe，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列(20)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第2號之Val置換為Ile，將第9號之Ser置換為Pro，將第30號之Ser置換為Thr，將第38號之Arg置換為Lys，將第86號之Leu置換為Val，將第93號之Val置換為Thr，將第95號之Tyr置換為Phe，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列(21)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第2號之Val置換為Ile，將第9號之Ser置換為Pro，將第30號之Ser置換為Thr，將第38號之Arg置換為Lys，將第46號之Glu置換為Lys，將第93號之Val置換為Thr，將第95號之Tyr置換為Phe，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列(22)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第2號之Val置換為Ile，將第9號之Ser置換為Pro，將第30號之Ser置換為Thr，將第38號之Arg置換為Lys，將第46號之Glu置換為Lys，將第86號之Leu置換為Val，將第95號之Tyr置換為Phe，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列(23)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第2號之Val置換為Ile，將第9號之Ser置換為Pro，將第30號之Ser置換為Thr，將第38號之Arg置換為Lys，將第46號之Glu置換為Lys，將第86號之Leu置換為Val，將第93號之Val置換為Thr，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列(24)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第2號之Val置換為Ile，將第9號之Ser置換為Pro，將第30號之Ser置換為Thr，將第38號之Arg置換為Lys，將第46號之Glu置換為Lys，將第86號之Leu置換為Val，將第93號之Val置換為Thr，及將第95號之Tyr置換為Phe的胺基酸序列(25)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第2號之Val置換為Ile，將第9號之Ser置換為Pro，將第20號之Val置換為Ile，將第46號之Glu置換為Lys，將第86號之Leu置換為Val，將第93號之Val置換為Thr，將第95號之Tyr置換為Phe，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列(26)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第2號之Val置換為Ile，將第9號之Ser置換為Pro，將第20號之Val置換為Ile，將第38號之Arg置換為Lys，將第86號之Leu置換為Val，將第93號之Val置換為Thr，將第95號之Tyr置換為Phe，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列(27)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第2號之Val置換為Ile，將第9號之Ser置換為Pro，將第20號之Val置換為Ile，將第38號之Arg置換為Lys，將第46號之Glu置換為Lys，將第93號之Val置換為Thr，將第95號之Tyr置換為Phe，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列(28)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第2號之Val置換為Ile，將第9號之Ser置換為Pro，將第20號之Val置換為Ile，將第38號之Arg置換為Lys，將第46號之Glu置換為Lys，將第86號之Leu置換為Val，將第95號之Tyr置換為Phe，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列(29)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第2號之Val置換為Ile，將第9號之Ser置換為Pro，將第20號之Val置換為Ile，將第38號之Arg置換為Lys，將第46號之Glu置換為Lys，將第86號之Leu置換為Val，將第93號之Val置換為Thr，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列(30)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第2號之Val置換為Ile，將第9號之Ser置換為Pro，將第20號之Val置換為Ile，將第38號之Arg置換為Lys，將第46號之Glu置換為Lys，將第86號之Leu置換為Val，將第93號之Val置換為Thr，及將第95號之Tyr置換為Phe的胺基酸序列(31)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第2號之Val置換為Ile，將第9號之Ser置換為Pro，將第20號之Val置換為Ile，將第30號之Ser置換為Thr，將第86號之Leu置換為Val，將第93號之Val置換為Thr，將第95號之Tyr置換為Phe，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列(32)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第2號之Val置換為Ile，將第9號之Ser置換為Pro，將第20號之Val置換為Ile，將第30號之Ser置換為Thr，將第46號之Glu置換為Lys，將第93號之Val置換為Thr，將第95號之Tyr置換為Phe，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列(33)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第2號之Val置換為Ile，將第9號之Ser置換為Pro，將第20號之Val置換為Ile，將第30號之Ser置換為Thr，將第46號之Glu置換為Lys，將第86號之Leu置換為Val，將第95號之Tyr置換為Phe，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列(34)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第2號之Val置換為Ile，將第9號之Ser置換為Pro，將第20號之Val置換為Ile，將第30號之Ser置換為Thr，將第46號之Glu置換為Lys，將第86號之Leu置換為Val，將第93號之Val置換為Thr，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列(35)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第2號之Val置換為Ile，將第9號之Ser置換為Pro，將第20號之Val置換為Ile，將第30號之Ser置換為Thr，將第46號之Glu置換為Lys，將第86號之Leu置換為Val，將第93號之Val置換為Thr，及將第95號之Tyr置換為Phe的胺基酸序列(36)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第2號之Val置換為Ile，將第9號之Ser置換為Pro，將第20號之Val置換為Ile，將第30號之Ser置換為Thr，將第38號之Arg置換為Lys，將第93號之Val置換為Thr，將第95號之Tyr置換為Phe，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列(37)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第2號之Val置換為Ile，將第9號之Ser置換為Pro，將第20號之Val置換為Ile，將第30號之Ser置換為Thr，將第38號之Arg置換為Lys，將第86號之Leu置換為Val，將第95號之Tyr置換為Phe，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列(38)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第2號之Val置換為Ile，將第9號之Ser置換為Pro，將第20號之Val置換為Ile，將第30號之Ser置換為Thr，將第38號之Arg置換為Lys，將第86號之Leu置換為Val，將第93號之Val置換為Thr，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列(39)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第2號之Val置換為Ile，將第9號之Ser置換為Pro，將第20號之Val置換為Ile，將第30號之Ser置換為Thr，將第38號之Arg置換為Lys，將第86號之Leu置換為Val，將第93號之Val置換為Thr，及將第95號之Tyr置換為Phe的胺基酸序列(40)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第2號之Val置換為Ile，將第9號之Ser置換為Pro，將第20號之Val置換為Ile，將第30號之Ser置換為Thr，將第38號之Arg置換為Lys，將第46號之Glu置換為Lys，將第95號之Tyr置換為Phe，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列。(41)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第2號之Val置換為Ile，將第9號之Ser置換為Pro，將第20號之Val置換為Ile，將第30號之Ser置換為Thr，將第38號之Arg置換為Lys，將第46號之Glu置換為Lys，將第93號之Val置換為Thr，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列(42)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第2號之Val置換為Ile，將第9號之Ser置換為Pro，將第20號之Val置換為Ile，將第30號之Ser置換為Thr，將第38號之Arg置換為Lys，將第46號之Glu置換為Lys，將第93號之Val置換為Thr，及將第95號之Tyr置換為Phe的胺基酸序列(43)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第2號之Val置換為Ile，將第9號之Ser置換為Pro，將第20號之Val置換為Ile，將第30號之Ser置換為Thr，將第38號之Arg置換為Lys，將第46號之Glu置換為Lys，將第86號之Leu置換為Val，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列(44)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第2號之Val置換為Ile，將第9號之Ser置換為Pro，將第20號之Val置換為Ile，將第30號之Ser置換為Thr，將第38號之Arg置換為Lys，將第46號之Glu置換為Lys，將第86號之Leu置換為Val，及將第95號之Tyr置換為Phe的胺基酸序列(45)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第2號之Val置換為Ile，將第9號之Ser置換為Pro，將第20號之Val置換為Ile，將第30號之Ser置換為Thr，將第38號之Arg置換為Lys，將第46號之Glu置換為Lys，將第86號之Leu置換為Val，及將第93號之Val置換為Thr的胺基酸序列作為導入有7個修飾之VH的胺基酸序列，具體可列舉以下(1)~(19)之胺基酸序列。(1)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第2號之Val置換為Ile，將第9號之Ser置換為Pro，將第20號之Val置換為Ile，將第30號之Ser置換為Thr，將第46號之Glu置換為Lys，將第95號之Tyr置換為Phe，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列(2)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第2號之Val置換為Ile，將第9號之Ser置換為Pro，將第20號之Val置換為Ile，將第38號之Arg置換為Lys，將第46號之Glu置換為Lys，將第95號之Tyr置換為Phe，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列(3)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第2號之Val置換為Ile，將第9號之Ser置換為Pro，將第20號之Val置換為Ile，將第46號之Glu置換為Lys，將第86號之Leu置換為Val，將第95號之Tyr置換為Phe，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列(4)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第2號之Val置換為Ile，將第9號之Ser置換為Pro，將第20號之Val置換為Ile，將第46號之Glu置換為Lys，將第93號之Val置換為Thr，將第95號之Tyr置換為Phe，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列(5)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第2號之Val置換為Ile，將第20號之Val置換為Ile，將第30號之Ser置換為Thr，將第38號之Arg置換為Lys，將第46號之Glu置換為Lys，將第95號之Tyr置換為Phe，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列(6)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第2號之Val置換為Ile，將第20號之Val置換為Ile，將第30號之Ser置換為Thr，將第46號之Glu置換為Lys，將第86號之Leu置換為Val，將第95號之Tyr置換為Phe，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列(7)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第2號之Val置換為Ile，將第20號之Val置換為Ile，將第30號之Ser置換為Thr，將第46號之Glu置換為Lys，將第93號之Val置換為Thr，將第95號之Tyr置換為Phe，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列(8)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第2號之Val置換為Ile，將第20號之Val置換為Ile，將第38號之Arg置換為Lys，將第46號之Glu置換為Lys，將第86號之Leu置換為Val，將第95號之Tyr置換為Phe，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列(9)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第2號之Val置換為Ile，將第20號之Val置換為Ile，將第38號之Arg置換為Lys，將第46號之Glu置換為Lys，將第93號之Val置換為Thr，將第95號之Tyr置換為Phe，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列(10)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第2號之Val置換為Ile，將第20號之Val置換為Ile，將第46號之Glu置換為Lys，將第86號之Leu置換為Val，將第93號之Val置換為Thr，將第95號之Tyr置換為Phe，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列(11)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第9號之Ser置換為Pro，將第20號之Val置換為Ile，將第30號之Ser置換為Thr，將第38號之Arg置換為Lys，將第46號之Glu置換為Lys，將第95號之Tyr置換為Phe，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列(12)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第9號之Ser置換為Pro，將第20號之Val置換為Ile，將第30號之Ser置換為Thr，將第46號之Glu置換為Lys，將第86號之Leu置換為Val，將第95號之Tyr置換為Phe，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列(13)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第9號之Ser置換為Pro，將第20號之Val置換為Ile，將第30號之Ser置換為Thr，將第46號之Glu置換為Lys，將第93號之Val置換為Thr，將第95號之Tyr置換為Phe，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列(14)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第9號之Ser置換為Pro，將第20號之Val置換為Ile，將第38號之Arg置換為Lys，將第46號之Glu置換為Lys，將第86號之Leu置換為Val，將第95號之Tyr置換為Phe，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列(15)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第9號之Ser置換為Pro，將第20號之Val置換為Ile，將第38號之Arg置換為Lys，將第46號之Glu置換為Lys，將第93號之Val置換為Thr，將第95號之Tyr置換為Phe，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列(16)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第20號之Val置換為Ile，將第30號之Ser置換為Thr，將第38號之Arg置換為Lys，將第46號之Glu置換為Lys，將第86號之Leu置換為Val，將第95號之Tyr置換為Phe，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列(17)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第20號之Val置換為Ile，將第30號之Ser置換為Thr，將第38號之Arg置換為Lys，將第46號之Glu置換為Lys，將第93號之Val置換為Thr，將第95號之Tyr置換為Phe，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列(18)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第20號之Val置換為Ile，將第30號之Ser置換為Thr，將第46號之Glu置換為Lys，將第86號之Leu置換為Val，將第93號之Val置換為Thr，將第95號之Tyr置換為Phe，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列(19)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第20號之Val置換為Ile，將第38號之Arg置換為Lys，將第46號之Glu置換為Lys，將第86號之Leu置換為Val，將第93號之Val置換為Thr，將第95號之Tyr置換為Phe，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列作為導入有6個修飾之VH之胺基酸序列，具體而言，例如可列舉以下(1)~(7)之胺基酸序列。(1)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第20號之Val置換為Ile，將第38號之Arg置換為Lys，將第46號之Glu置換為Lys，將第93號之Val置換為Thr，將第95號之Tyr置換為Phe，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列(2)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第9號之Ser置換為Pro，將第38號之Arg置換為Lys，將第46號之Glu置換為Lys，將第93號之Val置換為Thr，將第95號之Tyr置換為Phe，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列(3)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第9號之Ser置換為Pro，將第20號之Val置換為Ile，將第46號之Glu置換為Lys，將第93號之Val置換為Thr，將第95號之Tyr置換為Phe，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列(4)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第9號之Ser置換為Pro，將第20號之Val置換為Ile，將第38號之Arg置換為Lys，將第93號之Val置換為Thr，將第95號之Tyr置換為Phe，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列(5)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第9號之Ser置換為Pro，將第20號之Val置換為Ile，將第38號之Arg置換為Lys，將第46號之Glu置換為Lys，將第95號之Tyr置換為Phe，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列(6)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第9號之Ser置換為Pro，將第20號之Val置換為Ile，將第38號之Arg置換為Lys，將第46號之Glu置換為Lys，將第93號之Val置換為Thr，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列(7)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第9號之Ser置換為Pro，將第20號之Val置換為Ile，將第38號之Arg置換為Lys，將第46號之Glu置換為Lys，將第93號之Val置換為Thr，及將第95號之Tyr置換為Phe的胺基酸序列作為導入有5個修飾之VH之胺基酸序列，具體而言，例如可列舉以下(1)~(6)之胺基酸序列。
(1)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第2號之Val置換為Ile，將第20號之Val置換為Ile，將第46號之Glu置換為Lys，將第95號之Tyr置換為Phe，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列(2)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第9號之Ser置換為Pro，將第20號之Val置換為Ile，將第46號之Glu置換為Lys，將第95號之Tyr置換為Phe，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列(3)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第20號之Val置換為Ile，將第30號之Ser置換為Thr，將第46號之Glu置換為Lys，將第95號之Tyr置換為Phe，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列(4)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第20號之Val置換為Ile，將第38號之Arg置換為Lys，將第46號之Glu置換為Lys，將第95號之Tyr置換為Phe，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列(5)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第20號之Val置換為Ile，將第46號之Glu置換為Lys，將第86號之Leu置換為Val，將第95號之Tyr置換為Phe，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列(6)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第20號之Val置換為Ile，將第46號之Glu置換為Lys，將第95號之Tyr置換為Phe，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列作為導入有4個修飾之VH之胺基酸序列，具體而言，例如可列舉以下(1)~(10)之胺基酸序列。
(1)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第9號之Ser置換為Pro，將第20號之Val置換為Ile，將第46號之Glu置換為Lys，及將第95號之Tyr置換為Phe的胺基酸序列(2)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第9號之Ser置換為Pro，將第38號之Arg置換為Lys，將第46號之Glu置換為Lys，及將第95號之Tyr置換為Phe的胺基酸序列(3)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第9號之Ser置換為Pro，將第46號之Glu置換為Lys，將第93號之Val置換為Thr，及將第95號之Tyr置換為Phe的胺基酸序列(4)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第9號之Ser置換為Pro，將第46號之Glu置換為Lys，將第95號之Tyr置換為Phe，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列(5)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第20號之Val置換為Ile，將第38號之Arg置換為Lys，將第46號之Glu置換為Lys，及將第95號之Tyr置換為Phe的胺基酸序列(6)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第20號之Val置換為Ile，將第46號之Glu置換為Lys，將第93號之Val置換為Thr，及將第95號之Tyr置換為Phe的胺基酸序列(7)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第20號之Val置換為Ile，將第46號之Glu置換為Lys，將第95號之Tyr置換為Phe，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列(8)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第38號之Arg置換為Lys，將第46號之Glu置換為Lys，將第93號之Val置換為Thr，及將第95號之Tyr置換為Phe的胺基酸序列(9)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第38號之Arg置換為Lys，將第46號之Glu置換為Lys，將第95號之Tyr置換為Phe，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列(10)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第46號之Glu置換為Lys，將第93號之Val置換為Thr，將第95號之Tyr置換為Phe，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列作為導入有3個修飾之VH之胺基酸序列，具體而言，例如可列舉以下(1)~(35)之胺基酸序列，(1)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第9號之Ser置換為Pro，將第20號之Val置換為Ile，及將第38號之Arg置換為Lys的胺基酸序列(2)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第9號之Ser置換為Pro，將第20號之Val置換為Ile，及將第46號之Glu置換為Lys的胺基酸序列(3)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第9號之Ser置換為Pro，將第20號之Val置換為Ile，及將第93號之Val置換為Thr的胺基酸序列(4)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第9號之Ser置換為Pro，將第20號之Val置換為Ile，及將第95號之Tyr置換為Phe的胺基酸序列(5)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第9號之Ser置換為Pro，將第20號之Val置換為Ile，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列(6)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第9號之Ser置換為Pro，將第38號之Arg置換為Lys，及將第46號之Glu置換為Lys的胺基酸序列(7)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第9號之Ser置換為Pro，將第38號之Arg置換為Lys，及將第93號之Val置換為Thr的胺基酸序列(8)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第9號之Ser置換為Pro，將第38號之Arg置換為Lys，及將第95號之Tyr置換為Phe的胺基酸序列(9)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第9號之Ser置換為Pro，將第38號之Arg置換為Lys，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列(10)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第9號之Ser置換為Pro，將第46號之Glu置換為Lys，及將第93號之Val置換為Thr的胺基酸序列(11)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第9號之Ser置換為Pro，將第46號之Glu置換為Lys，及將第95號之Tyr置換為Phe的胺基酸序列(12)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第9號之Ser置換為Pro，將第46號之Glu置換為Lys，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列(13)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第9號之Ser置換為Pro，將第93號之Val置換為Thr，及將第95號之Tyr置換為Phe的胺基酸序列(14)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第9號之Ser置換為Pro，將第93號之Val置換為Thr，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列(15)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第9號之Ser置換為Pro，將第95號之Tyr置換為Phe，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列(16)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第20號之Val置換為Ile，將第38號之Arg置換為Lys，及將第46號之Glu置換為Lys的胺基酸序列(17)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第20號之Val置換為Ile，將第38號之Arg置換為Lys，及將第93號之Val置換為Thr的胺基酸序列(18)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第20號之Val置換為Ile，將第38號之Arg置換為Lys，及將第95號之Tyr置換為Phe的胺基酸序列(19)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第20號之Val置換為Ile，將第38號之Arg置換為Lys，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列(20)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第20號之Val置換為Ile，將第46號之Glu置換為Lys，及將第93號之Val置換為Thr的胺基酸序列(21)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第20號之Val置換為Ile，將第46號之Glu置換為Lys，及將第95號之Tyr置換為Phe的胺基酸序列(22)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第20號之Val置換為Ile，將第46號之Glu置換為Lys，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列(23)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第20號之Val置換為Ile，將第93號之Val置換為Thr，及將第95號之Tyr置換為Phe的胺基酸序列(24)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第20號之Val置換為Ile，將第93號之Val置換為Thr，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列(25)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第20號之Val置換為Ile，將第95號之Tyr置換為Phe，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列(26)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第38號之Arg置換為Lys，將第46號之Glu置換為Lys，及將第93號之Val置換為Thr的胺基酸序列(27)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第38號之Arg置換為Lys，將第46號之Glu置換為Lys，及將第95號之Tyr置換為Phe的胺基酸序列(28)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第38號之Arg置換為Lys，將第46號之Glu置換為Lys，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列(29)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第38號之Arg置換為Lys，將第93號之Val置換為Thr，及將第95號之Tyr置換為Phe的胺基酸序列(30)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第38號之Arg置換為Lys，將第93號之Val置換為Thr，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列(31)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第38號之Arg置換為Lys，將第95號之Tyr置換為Phe，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列(32)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第46號之Glu置換為Lys，將第93號之Val置換為Thr，及將第95號之Tyr置換為Phe的胺基酸序列(33)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第46號之Glu置換為Lys，將第93號之Val置換為Thr，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列(34)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第46號之Glu置換為Lys，將第95號之Tyr置換為Phe，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列(35)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第93號之Val置換為Thr，將第95號之Tyr置換為Phe，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列作為導入有2個修飾之VH之胺基酸序列，具體而言，例如可列舉以下(1)~(45)之胺基酸序列。
(1)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第2號之Val置換為Ile，及將第9號之Ser置換為Pro的胺基酸序列(2)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第2號之Val置換為Ile，及將第20號之Val置換為Ile的胺基酸序列(3)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第2號之Val置換為Ile，及將第30號之Ser置換為Thr的胺基酸序列(4)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第2號之Val置換為Ile，及將第38號之Arg置換為Lys的胺基酸序列(5)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第2號之Val置換為Ile，及將第46號之Glu置換為Lys的胺基酸序列(6)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第2號之Val置換為Ile，及將第86號之Leu置換為Val的胺基酸序列(7)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第2號之Val置換為Ile，及將第93號之Val置換為Thr的胺基酸序列(8)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第2號之Val置換為Ile，及將第95號之Tyr置換為Phe的胺基酸序列(9)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第2號之Val置換為Ile，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列(10)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第9號之Ser置換為Pro，及將第20號之Val置換為Ile的胺基酸序列(11)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第9號之Ser置換為Pro，及將第30號之Ser置換為Thr的胺基酸序列(12)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第9號之Ser置換為Pro，及將第38號之Arg置換為Lys的胺基酸序列(13)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第9號之Ser置換為Pro，及將第46號之Glu置換為Lys的胺基酸序列(14)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第9號之Ser置換為Pro，及將第86號之Leu置換為Val的胺基酸序列(15)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第9號之Ser置換為Pro，及將第93號之Val置換為Thr的胺基酸序列(16)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第9號之Ser置換為Pro，及將第95號之Tyr置換為Phe的胺基酸序列(17)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第9號之Ser置換為Pro，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列(18)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第20號之Val置換為Ile，及將第30號之Ser置換為Thr的胺基酸序列(19)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第20號之Val置換為Ile，及將第38號之Arg置換為Lys的胺基酸序列(20)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第20號之Val置換為Ile，及將第46號之Glu置換為Lys的胺基酸序列(21)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第20號之Val置換為Ile，及將第86號之Leu置換為Val的胺基酸序列(22)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第20號之Val置換為Ile，及將第93號之Val置換為Thr的胺基酸序列(23)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第20號之Val置換為Ile，及將第95號之Tyr置換為Phe的胺基酸序列(24)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第20號之Val置換為Ile，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列(25)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第30號之Ser置換為Thr，及將第38號之Arg置換為Lys的胺基酸序列(26)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第30號之Ser置換為Thr，及將第46號之Glu置換為Lys的胺基酸序列(27)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第30號之Ser置換為Thr，及將第86號之Leu置換為Val的胺基酸序列(28)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第30號之Ser置換為Thr，及將第93號之Val置換為Thr的胺基酸序列(29)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第30號之Ser置換為Thr，及將第95號之Tyr置換為Phe的胺基酸序列(30)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第30號之Ser置換為Thr，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列(31)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第38號之Arg置換為Lys，及將第46號之Glu置換為Lys的胺基酸序列(32)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第38號之Arg置換為Lys，及將第86號之Leu置換為Val的胺基酸序列(33)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第38號之Arg置換為Lys，及將第93號之Val置換為Thr的胺基酸序列(34)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第38號之Arg置換為Lys，及將第95號之Tyr置換為Phe的胺基酸序列(35)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第38號之Arg置換為Lys，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列(36)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第46號之Glu置換為Lys，及將第86號之Leu置換為Val的胺基酸序列(37)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第46號之Glu置換為Lys，及將第93號之Val置換為Thr的胺基酸序列(38)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第46號之Glu置換為Lys，及將第95號之Tyr置換為Phe的胺基酸序列(39)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第46號之Glu置換為Lys，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列(40)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第86號之Leu置換為Val，及將第93號之Val置換為Thr的胺基酸序列(41)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第86號之Leu置換為Val，及將第95號之Tyr置換為Phe的胺基酸序列(42)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第86號之Leu置換為Val，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列(43)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第93號之Va1置換為Thr，及將第95號之Tyr置換為Phe的胺基酸序列(44)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第93號之Val置換為Thr，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列(45)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第95號之Tyr置換為Phe，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列作為導入有1個修飾之VH之胺基酸序列，具體而言，例如可列舉以下(1)~(10)之胺基酸序列。
(1)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第2號之Val置換為Ile的胺基酸序列(2)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第9號之Ser置換為Pro的胺基酸序列(3)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第20號之Val置換為Ile的胺基酸序列(4)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第30號之Ser置換為Thr的胺基酸序列(5)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第38號之Arg置換為Lys的胺基酸序列(6)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第46號之Glu置換為Lys的胺基酸序列(7)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第86號之Leu置換為Val的胺基酸序列(8)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第93號之Val置換為Thr的胺基酸序列(9)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第95號之Tyr置換為Phe的胺基酸序列(10)將序列編號71所表示之胺基酸序列中之第116號之Val置換為Leu的胺基酸序列關於本發明之人類化抗體所含之VL，較佳為以下(1)及(2)。
(1)含有序列編號72所表示之胺基酸序列中之第15號之Val、第43號之Ala、第44號之Pro、第71號之Phe、及第87號之Tyr被置換為其他胺基酸殘基之胺基酸序列的VL(2)含有序列編號72所表示之胺基酸序列中之第15號之Val、第71號之Phe及第87號之Tyr被置換為其他胺基酸殘基之胺基酸序列的VL作為上述VL之胺基酸序列，例如可列舉導入有選自如下修飾中之至少一種修飾的胺基酸序列：將序列編號72所表示之胺基酸序列中之第8號之Pro置換為Thr，將第15號之Val置換為Leu，將第38號之Gln置換為Arg，將第43號之Ala置換為Thr，將第44號之Pro置換為Val，將第71號之Phe置換為Tyr，及將第87號之Tyr置換為Phe。
作為上述VL之胺基酸序列，具體而言，例如可列舉導入有以下1~7個修飾之胺基酸序列。
作為導入有7個修飾之VL之胺基酸序列，具體可列舉：將序列編號72所表示之胺基酸序列中之第8號之Pro置換為Thr，將第15號之Val置換為Leu，將第38號之Gln置換為Arg，將第43號之Ala置換為Thr，將第44號之Pro置換為Val，將第71號之Phe置換為Tyr，及將第87號之Tyr置換為Phe的胺基酸序列。
作為導入有6個修飾之VL之胺基酸序列，具體而言，例如可列舉以下(1)~(7)之胺基酸序列。(1)將序列編號72所表示之胺基酸序列中之第15號之Val置換為Leu，將第38號之Gln置換為Arg，將第43號之Ala置換為Thr，將第44號之Pro置換為Val，將第71號之Phe置換為Tyr，及將第87號之Tyr置換為Phe的胺基酸序列(2)將序列編號72所表示之胺基酸序列中之第8號之Pro置換為Thr，將第38號之Gln置換為Arg，將第43號之Ala置換為Thr，將第44號之Pro置換為Val，將第71號之Phe置換為Tyr，及將第87號之Tyr置換為Phe的胺基酸序列(3)將序列編號72所表示之胺基酸序列中之第8號之Pro置換為Thr，將第15號之Val置換為Leu，將第43號之Ala置換為Thr，將第44號之Pro置換為Val，將第71號之Phe置換為Tyr，及將第87號之Tyr置換為Phe的胺基酸序列(4)將序列編號72所表示之胺基酸序列中之第8號之Pro置換為Thr，將第15號之Val置換為Leu，將第38號之Gln置換為Arg，將第44號之Pro置換為Val，將第71號之Phe置換為Tyr，及將第87號之Tyr置換為Phe的胺基酸序列(5)將序列編號72所表示之胺基酸序列中之第8號之Pro置換為Thr，將第15號之Val置換為Leu，將第38號之Gln置換為Arg，將第43號之Ala置換為Thr，將第71號之Phe置換為Tyr，及將第87號之Tyr置換為Phe的胺基酸序列(6)將序列編號72所表示之胺基酸序列中之第8號之Pro置換為Thr，將第15號之Val置換為Leu，將第38號之Gln置換為Arg，將第43號之Ala置換為Thr，將第44號之Pro置換為Val，及將第87號之Tyr置換為Phe的胺基酸序列(7)將序列編號72所表示之胺基酸序列中之第8號之Pro置換為Thr，將第15號之Val置換為Leu，將第38號之Gln置換為Arg，將第43號之Ala置換為Thr，將第44號之Pro置換為Val，及將第71號之Phe置換為Tyr的胺基酸序列作為導入有5個修飾之VL之胺基酸序列，具體而言，例如可列舉以下(1)~(21)之胺基酸序列。
(1)將序列編號72所表示之胺基酸序列中之第38號之Gln置換為Arg，將第43號之Ala置換為Thr，將第44號之Pro置換為Val，將第71號之Phe置換為Tyr，及將第87號之Tyr置換為Phe的胺基酸序列(2)將序列編號72所表示之胺基酸序列中之第15號之Val置換為Leu，將第43號之Ala置換為Thr，將第44號之Pro置換為Val，將第71號之Phe置換為Tyr，及將第87號之Tyr置換為Phe的胺基酸序列(3)將序列編號72所表示之胺基酸序列中之第15號之Val置換為Leu，將第38號之Gln置換為Arg，將第44號之Pro置換為Val，將第71號之Phe置換為Tyr，及將第87號之Tyr置換為Phe的胺基酸序列(4)將序列編號72所表示之胺基酸序列中之第15號之Val置換為Leu，將第38號之Gln置換為Arg，將第43號之Ala置換為Thr，將第71號之Phe置換為Tyr，及將第87號之Tyr置換為Phe的胺基酸序列(5)將序列編號72所表示之胺基酸序列中之第15號之Val置換為Leu，將第38號之Gln置換為Arg，將第43號之Ala置換為Thr，將第44號之Pro置換為Val，及將第87號之Tyr置換為Phe的胺基酸序列(6)將序列編號72所表示之胺基酸序列中之第15號之Val置換為Leu，將第38號之Gln置換為Arg，將第43號之Ala置換為Thr，將第44號之Pro置換為Val，及將第71號之Phe置換為Tyr的胺基酸序列(7)將序列編號72所表示之胺基酸序列中之第8號之Pro置換為Thr，將第43號之Ala置換為Thr，將第44號之Pro置換為Val，將第71號之Phe置換為Tyr，及將第87號之Tyr置換為Phe的胺基酸序列(8)將序列編號72所表示之胺基酸序列中之第8號之Pro置換為Thr，將第38號之Gln置換為Arg，將第44號之Pro置換為Val，將第71號之Phe置換為Tyr，及將第87號之Tyr置換為Phe的胺基酸序列(9)將序列編號72所表示之胺基酸序列中之第8號之Pro置換為Thr，將第38號之Gln置換為Arg，將第43號之Ala置換為Thr，將第71號之Phe置換為Tyr，及將第87號之Tyr置換為Phe的胺基酸序列(10)將序列編號72所表示之胺基酸序列中之第8號之Pro置換為Thr，將第38號之Gln置換為Arg，將第43號之Ala置換為Thr，將第44號之Pro置換為Val，及將第87號之Tyr置換為Phe的胺基酸序列(11)將序列編號72所表示之胺基酸序列中之第8號之Pro置換為Thr，將第38號之Gln置換為Arg，將第43號之Ala置換為Thr，將第44號之Pro置換為Val，及將第71號之Phe置換為Tyr的胺基酸序列(12)將序列編號72所表示之胺基酸序列中之第8號之Pro置換為Thr，將第15號之Val置換為Leu，將第44號之Pro置換為Val，將第71號之Phe置換為Tyr，及將第87號之Tyr置換為Phe的胺基酸序列(13)將序列編號72所表示之胺基酸序列中之第8號之Pro置換為Thr，將第15號之Val置換為Leu，將第43號之Ala置換為Thr，將第71號之Phe置換為Tyr，及將第87號之Tyr置換為Phe的胺基酸序列(14)將序列編號72所表示之胺基酸序列中之第8號之Pro置換為Thr，將第15號之Val置換為Leu，將第43號之Ala置換為Thr，將第44號之Pro置換為Val，及將第87號之Tyr置換為Phe的胺基酸序列(15)將序列編號72所表示之胺基酸序列中之第8號之Pro置換為Thr，將第15號之Val置換為Leu，將第43號之Ala置換為Thr，將第44號之Pro置換為Val，及將第71號之Phe置換為Tyr的胺基酸序列(16)將序列編號72所表示之胺基酸序列中之第8號之Pro置換為Thr，將第15號之Val置換為Leu，將第38號之Gln置換為Arg，將第71號之Phe置換為Tyr，及將第87號之Tyr置換為Phe的胺基酸序列(17)將序列編號72所表示之胺基酸序列中之第8號之Pro置換為Thr，將第15號之Val置換為Leu，將第38號之Gln置換為Arg，將第44號之Pro置換為Val，及將第87號之Tyr置換為Phe的胺基酸序列(18)將序列編號72所表示之胺基酸序列中之第8號之Pro置換為Thr，將第15號之Val置換為Leu，將第38號之Gln置換為Arg，將第44號之Pro置換為Val，及將第71號之Phe置換為Tyr的胺基酸序列(19)將序列編號72所表示之胺基酸序列中之第8號之Pro置換為Thr，將第15號之Val置換為Leu，將第38號之Gln置換為Arg，將第43號之Ala置換為Thr，及將第87號之Tyr置換為Phe的胺基酸序列(20)將序列編號72所表示之胺基酸序列中之第8號之Pro置換為Thr，將第15號之Val置換為Leu，將第38號之Gln置換為Arg，將第43號之Ala置換為Thr，及將第71號之Phe置換為Tyr的胺基酸序列(21)將序列編號72所表示之胺基酸序列中之第8號之Pro置換為Thr，將第15號之Val置換為Leu，將第38號之Gln置換為Arg，將第43號之Ala置換為Thr，及將第44號之Pro置換為Val的胺基酸序列作為導入有4個修飾之VL之胺基酸序列，具體而言，例如可列舉以下(1)~(4)之胺基酸序列。
(1)將序列編號72所表示之胺基酸序列中之第15號之Val置換為Leu，將第44號之Pro置換為Val，將第71號之Phe置換為Tyr，及將第87號之Tyr置換為Phe的胺基酸序列(2)將序列編號72所表示之胺基酸序列中之第15號之Val置換為Leu，將第43號之Ala置換為Thr，將第71號之Phe置換為Tyr，及將第87號之Tyr置換為Phe的胺基酸序列(3)將序列編號72所表示之胺基酸序列中之第15號之Val置換為Leu，將第38號之Gln置換為Arg，將第71號之Phe置換為Tyr，及將第87號之Tyr置換為Phe的胺基酸序列(4)將序列編號72所表示之胺基酸序列中之第8號之Pro置換為Thr，將第15號之Val置換為Leu，將第71號之Phe置換為Tyr，及將第87號之Tyr置換為Phe的胺基酸序列作為導入有3個修飾之VL之胺基酸序列，具體而言，例如可列舉以下(1)~(13)之胺基酸序列。
(1)將序列編號72所表示之胺基酸序列中之第8號之Pro置換為Thr，將第15號之Val置換為Leu，及將第71號之Phe置換為Tyr的胺基酸序列(2)將序列編號72所表示之胺基酸序列中之第8號之Pro置換為Thr，將第15號之Val置換為Leu，及將第87號之Tyr置換為Phe的胺基酸序列(3)將序列編號72所表示之胺基酸序列中之第8號之Pro置換為Thr，將第71號之Phe置換為Tyr，及將第87號之Tyr置換為Phe的胺基酸序列(4)將序列編號72所表示之胺基酸序列中之第15號之Val置換為Leu，將第38號之Gln置換為Arg，及將第71號之Phe置換為Tyr的胺基酸序列(5)將序列編號72所表示之胺基酸序列中之第15號之Val置換為Leu，將第38號之Gln置換為Arg，及將第87號之Tyr置換為Phe的胺基酸序列(6)將序列編號72所表示之胺基酸序列中之第15號之Val置換為Leu，將第43號之Ala置換為Thr，及將第71號之Phe置換為Tyr的胺基酸序列(7)將序列編號72所表示之胺基酸序列中之第15號之Val置換為Leu，將第43號之Ala置換為Thr，及將第87號之Tyr置換為Phe的胺基酸序列(8)將序列編號72所表示之胺基酸序列中之第15號之Val置換為Leu，將第44號之Pro置換為Val，及將第71號之Phe置換為Tyr的胺基酸序列(9)將序列編號72所表示之胺基酸序列中之第15號之Val置換為Leu，將第44號之Pro置換為Val，及將第87號之Tyr置換為Phe的胺基酸序列(10)將序列編號72所表示之胺基酸序列中之第15號之Val置換為Leu，將第71號之Phe置換為Tyr，及將第87號之Tyr置換為Phe的胺基酸序列(11)將序列編號72所表示之胺基酸序列中之第38號之Gln置換為Arg，將第71號之Phe置換為Tyr，及將第87號之Tyr置換為Phe的胺基酸序列(12)將序列編號72所表示之胺基酸序列中之第43號之Ala置換為Thr，將第71號之Phe置換為Tyr，及將第87號之Tyr置換為Phe的胺基酸序列(13)將序列編號72所表示之胺基酸序列中之第44號之Pro置換為Val，將第71號之Phe置換為Tyr，及將第87號之Tyr置換為Phe的胺基酸序列作為導入有2個修飾之VL之胺基酸序列，具體而言，例如可列舉以下(1)~(21)之胺基酸序列。
(1)將序列編號72所表示之胺基酸序列中之第8號之Pro置換為Thr，及將第15號之Val置換為Leu的胺基酸序列(2)將序列編號72所表示之胺基酸序列中之第8號之Pro置換為Thr，及將第38號之Gln置換為Arg的胺基酸序列(3)將序列編號72所表示之胺基酸序列中之第8號之Pro置換為Thr，及將第43號之Ala置換為Thr的胺基酸序列(4)將序列編號72所表示之胺基酸序列中之第8號之Pro置換為Thr，及將第44號之Pro置換為Val的胺基酸序列(5)將序列編號72所表示之胺基酸序列中之第8號之Pro置換為Thr，及將第71號之Phe置換為Tyr的胺基酸序列(6)將序列編號72所表示之胺基酸序列中之第8號之Pro置換為Thr，及將第87號之Tyr置換為Phe的胺基酸序列(7)將序列編號72所表示之胺基酸序列中之第15號之Val置換為Leu，及將第38號之Gln置換為Arg的胺基酸序列(8)將序列編號72所表示之胺基酸序列中之第15號之Val置換為Leu，及將第43號之Ala置換為Thr的胺基酸序列(9)將序列編號72所表示之胺基酸序列中之第15號之Val置換為Leu，及將第44號之Pro置換為Val的胺基酸序列(10)將序列編號72所表示之胺基酸序列中之第15號之Val置換為Leu，及將第71號之Phe置換為Tyr的胺基酸序列(11)將序列編號72所表示之胺基酸序列中之第15號之Val置換為Leu，及將第87號之Tyr置換為Phe的胺基酸序列(12)將序列編號72所表示之胺基酸序列中之第38號之Gln置換為Arg，及將第43號之Ala置換為Thr的胺基酸序列(13)將序列編號72所表示之胺基酸序列中之第38號之Gln置換為Arg，及將第44號之Pro置換為Val的胺基酸序列(14)將序列編號72所表示之胺基酸序列中之第38號之Gln置換為Arg，及將第71號之Phe置換為Tyr的胺基酸序列(15)將序列編號72所表示之胺基酸序列中之第38號之Gln置換為Arg，及將第87號之Tyr置換為Phe的胺基酸序列(16)將序列編號72所表示之胺基酸序列中之第43號之Ala置換為Thr，及將第44號之Pro置換為Val的胺基酸序列(17)將序列編號72所表示之胺基酸序列中之第43號之Ala置換為Thr，及將第71號之Phe置換為Tyr的胺基酸序列(18)將序列編號72所表示之胺基酸序列中之第43號之Ala置換為Thr，及將第87號之Tyr置換為Phe的胺基酸序列(19)將序列編號72所表示之胺基酸序列中之第44號之Pro置換為Val，及將第71號之Phe置換為Tyr的胺基酸序列(20)將序列編號72所表示之胺基酸序列中之第44號之Pro置換為Val，及將第87號之Tyr置換為Phe的胺基酸序列(21)將序列編號72所表示之胺基酸序列中之第71號之Phe置換為Tyr，及將第87號之Tyr置換為Phe的胺基酸序列作為導入有1個修飾之VL之胺基酸序列，具體而言，例如可列舉以下(1)~(7)之胺基酸序列。
(1)將序列編號72所表示之胺基酸序列中之第8號之Pro置換為Thr的胺基酸序列(2)將序列編號72所表示之胺基酸序列中之第15號之Val置換為Leu的胺基酸序列(3)將序列編號72所表示之胺基酸序列中之第38號之Gln置換為Arg的胺基酸序列(4)將序列編號72所表示之胺基酸序列中之第43號之Ala置換為Thr的胺基酸序列(5)將序列編號72所表示之胺基酸序列中之第44號之Pro置換為Val的胺基酸序列(6)將序列編號72所表示之胺基酸序列中之第71號之Phe置換為Tyr的胺基酸序列(7)將序列編號72所表示之胺基酸序列中之第87號之Tyr置換為Phe的胺基酸序列又，作為本發明之人類化抗體之具體例，可列舉以下(1)~(10)之抗體。
(1)包含含有序列編號71所表示之胺基酸序列之抗體之VH及含有序列編號72所表示之胺基酸序列之抗體之VL中至少一者的人類化抗體(2)包含含有序列編號76所表示之胺基酸序列之抗體之VH及含有序列編號72所表示之胺基酸序列之抗體之VL中至少一者的人類化抗體(3)包含含有序列編號78所表示之胺基酸序列之抗體之VH及含有序列編號72所表示之胺基酸序列之抗體之VL中至少一者的人類化抗體(4)包含含有序列編號80所表示之胺基酸序列之抗體之VH及含有序列編號72所表示之胺基酸序列之抗體之VL中至少一者的人類化抗體(5)包含含有序列編號82所表示之胺基酸序列之抗體之VH及含有序列編號72所表示之胺基酸序列之抗體之VL中至少一者的人類化抗體(6)包含含有序列編號71所表示之胺基酸序列之抗體之VH及含有序列編號84所表示之胺基酸序列之抗體之VL中至少一者的人類化抗體(7)包含含有序列編號76所表示之胺基酸序列之抗體之VH及含有序列編號84所表示之胺基酸序列之抗體之VL中至少一者的人類化抗體(8)包含含有序列編號78所表示之胺基酸序列之抗體之VH及含有序列編號84所表示之胺基酸序列之抗體之VL中至少一者的人類化抗體(9)包含含有序列編號80所表示之胺基酸序列之抗體之VH及含有序列編號84所表示之胺基酸序列之抗體之VL中至少一者的人類化抗體(10)包含含有序列編號82所表示之胺基酸序列之抗體之VH及含有序列編號84所表示之胺基酸序列之抗體之VL中至少一者的人類化抗體該等中，較佳為包含含有序列編號76所表示之胺基酸序列之抗體之VH及含有序列編號84所表示之胺基酸序列之抗體之VL的人類化抗體，以及包含含有序列編號82所表示之胺基酸序列之抗體之VH及含有序列編號84所表示之胺基酸序列之抗體之VL的人類化抗體。
人類抗體係指人類體內原本天然存在之抗體，自藉由最近之基因工程學、細胞工程學及發育工程學之技術進步而製作之人類抗體噬菌體基因庫(phage library)及產生人類抗體之基因轉殖動物所獲得之抗體等亦包含於本發明之人類抗體中。
人類體內天然存在之抗體例如可將人類周邊血液淋巴細胞單獨分離，使其感染EB病毒等而實現不朽化(immortalization)，並進行選殖，藉此可培養產生該抗體之淋巴細胞，自培養上清液中純化該抗體。
人類抗體噬菌體基因庫係藉由將自人類B細胞製備之抗體基因插入噬菌體基因中，使Fab、scFv等抗體片段表現於噬菌體表面的基因庫。
根據上述基因庫，以針對固定有抗原之受質的結合活性作為指標，可回收於表面表現有具有所需抗原結合活性之抗體片段的噬菌體。該抗體片段亦可進而藉由基因工程學手法而轉化為包含2條完整之H鏈及2條完整之L鏈的人類抗體分子。
產生人類抗體之基因轉殖動物係指將人類抗體基因組入至細胞內之動物。具體而言，例如可將人類抗體基因導入至小鼠ES細胞中，並將該ES細胞移植至小鼠之早期胚後，使之發育，藉此製作產生人類抗體之基因轉殖小鼠。
源自產生人類抗體之基因轉殖動物的人類抗體可藉由如下方式而製作：利用通常之人類以外之動物所進行之融合瘤製作方法，取得產生人類抗體之融合瘤，並進行培養，藉此於培養上清液中產生並蓄積人類抗體。
構成上述單株抗體或該抗體片段之胺基酸序列中缺失、附加、置換或插入有一個以上之胺基酸且具有與上述抗體或該抗體片段相同之活性的單株抗體或該抗體片段亦包含於本發明之單株抗體或該抗體片段中。
缺失、置換、插入及/或附加之胺基酸之數量為1個以上，其數量並無特別限定，係藉由部位特異性變異導入法[Molecular Cloning 2nd Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)、Current protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons(1987-1997)、Nucleic Acids Research,10,6487(1982)、Proc. Natl. Acad. Sci.,USA,79,6409(1982)、Gene,34,315(1985)、Nucleic Acids Research,13,4431(1985)、Proc. Natl. Acad. Sci USA,82,488(1985)]等眾所周知之技術可缺失、置換或附加之程度的數量。例如為1~數十個，較佳為1~20個，更佳為1~10個，更佳為1~5個。
上述抗體之胺基酸序列中缺失、置換、插入或附加有一個以上之胺基酸殘基表示如下。即，係表示同一序列中之任意、且1個或複數個胺基酸序列中缺失、置換、插入或附加有1個或複數個胺基酸殘基。又，存在同時發生缺失、置換、插入或附加之情形，亦存在置換、插入或附加之胺基酸殘基為天然型與非天然型之任意之情形。
作為天然型胺基酸殘基，例如可列舉：L-丙胺酸、L-天冬醯胺、L-天冬醯胺酸、L-麩醯胺、L-麩醯胺酸、甘胺酸、L-組胺酸、L-異白胺酸、L-白胺酸、L-離胺酸、L-甲硫胺酸、L-苯丙胺酸、L-脯胺酸、L-絲胺酸、L-蘇胺酸、L-色胺酸、L-酪胺酸、L-纈胺酸及L-半胱胺酸等。以下，揭示可相互置換之胺基酸殘基之較佳例。包含於同一群中之胺基酸殘基可相互置換。A群：白胺酸、異白胺酸、正白胺酸、纈胺酸、正纈胺酸、丙胺酸、2-胺基丁酸、甲硫胺酸、O-甲基絲胺酸、第三丁基甘胺酸、第三丁基丙胺酸、環己基丙胺酸B群：天冬醯胺酸、麩醯胺酸、異天冬醯胺酸、異麩醯胺酸、2-胺基己二酸、2-胺基辛二酸C群：天冬醯胺、麩醯胺D群：離胺酸、精胺酸、鳥胺酸、2,4-二胺基丁酸、2,3-二胺基丙酸E群：脯胺酸、3-羥基脯胺酸、4-羥基脯胺酸F群：絲胺酸、蘇胺酸、高絲胺酸G群：苯丙胺酸、酪胺酸本發明中，作為抗體片段，例如可列舉：Fab、F(ab')2 、Fab'、scFv、diabody、dsFv及含有CD R之肽等。Fab係於利用作為蛋白質分解酶之木瓜酶處理IgG而獲得之片段中(於H鏈之第224號之胺基酸殘基處切斷)，H鏈之N末端側約一半與L鏈全部以二硫鍵結合而成之分子量約5萬的具有抗原結合活性的抗體片段。本發明之Fab可利用木瓜酶對特異性識別ASCT2之細胞外區域之立體結構且與該細胞外區域結合的單株抗體進行處理而獲得。
又，亦可藉由將編碼抗體之Fab之DNA插入至原核生物用表現載體或真核生物用表現載體中，並將該載體導入至原核生物或真核生物中進行表現而製造Fab。F(ab')2 係利用作為蛋白質分解酶之胃蛋白酶將IgG之鉸鏈區域之2個二硫鍵的下部分解而獲得之2個Fab區域利用鉸鏈部分相結合而構成之分子量約為10萬之具有抗原結合活性之片段。
本發明之F(ab')2 可利用胃蛋白酶對特異性識別ASCT2之細胞外區域之立體結構且與該細胞外區域結合之單株抗體進行處理而獲得。又，亦可使下述Fab'以硫醚鍵或二硫鍵進行結合而製作。
Fab'係將上述F(ab')2 之鉸鏈區域之二硫鍵切斷而成之分子量約5萬的具有抗原結合活性之抗體片段。本發明之Fab'可利用二硫代蘇糖醇等還原劑對本發明之特異性識別ASCT2之細胞外區域之立體結構且與該細胞外區域結合的F(ab')2 進行處理而獲得。又，亦可藉由將編碼該抗體之Fab'片段之DNA插入至原核生物用表現載體或真核生物用表現載體中，並將該載體導入至原核生物或真核生物中進行表現而製造Fab'。
scFv係使用適當之肽連接子(以下記為P)將1條VH與1條VL連接而成之VH-P-VL或VL-P-VH多肽，且係具有抗原結合活性之抗體片段。本發明之scFv可藉由取得編碼本發明之特異性識別ASCT2之細胞外區域之立體結構且與該細胞外區域結合之單株抗體之VH及VL的cDNA，構建編碼scFv的DNA，將該DNA插入至原核生物用表現載體或真核生物用表現載體中，並將該表現載體導入至原核生物或真核生物中進行表現而製造。
diabody係將scFv經二聚化之抗體片段，且係具有二價之抗原結合活性之抗體片段。二價之抗原結合活性可相同，亦可將一方設為不同之抗原結合活性。本發明之diabody可藉由取得編碼本發明之特異性識別ASCT2之細胞外區域之立體結構且與該細胞外區域結合之單株抗體之VH及VL的cDNA，以肽連接子之胺基酸序列之長度成為8個殘基以下之方式構建編碼scFv之DNA，將該DNA插入至原核生物用表現載體或真核生物用表現載體中，並將該表現載體導入至原核生物或真核生物中進行表現而製造。
dsFv係指經由該半胱胺酸殘基間之二硫鍵，使將VH及VL中之各1個胺基酸殘基置換為半胱胺酸殘基的多肽相結合而成者。置換為半胱胺酸殘基之胺基酸殘基可依據已知之方法[Protein Engineering,7,697(1994)]，根據抗體之立體結構預測進行選擇。本發明之dsFv可藉由取得編碼本發明之特異性識別ASCT2之細胞外區域之立體結構且與該細胞外區域結合之單株抗體之VH及VL的cDNA，構建編碼dsFv的DNA，將該DNA插入至原核生物用表現載體或真核生物用表現載體中，並將該表現載體導入至原核生物或真核生物中進行表現而製造。
含有CDR之肽係含有VH或VL之CDR之至少1個區域以上而構成。含有複數個CDR之肽可直接或經由適當之肽連接子而結合。本發明之含有CDR之肽可藉由構建編碼本發明之特異性識別ASCT2之細胞外區域之立體結構且與該細胞外區域結合之單株抗體之VH及VL之CDR的DNA，將該DNA插入至原核生物用表現載體或真核生物用表現載體中，並將該表現載體導入至原核生物或真核生物中進行表現而製造。又，含有CDR之肽亦可藉由Fmoc法(茀基甲氧羰基法)、或tBoc法(第三丁氧羰基法)等化學合成法而製造。
本發明之單株抗體包括：本發明之特異性識別ASCT2之細胞外區域之天然型立體結構且與該細胞外區域結合之單株抗體，或藉由化學或基因工程學方法於該抗體片段上結合放射性同位素、低分子之藥劑、高分子之藥劑、蛋白質、或抗體醫藥等而成之抗體之衍生物。
本發明之抗體之衍生物可藉由利用化學方法[抗體工程入門，地人書館(1994)]，於本發明之特異性識別ASCT2之細胞外區域之天然型立體結構且與該細胞外區域結合之單株抗體或該抗體片段之H鏈或L鏈的N末端側或C末端側、抗體或該抗體片段中之適當之置換基或側鏈、進而單株抗體或該抗體片段中之糖鏈等上結合放射性同位素、低分子之藥劑、高分子之藥劑、免疫刺激劑、蛋白質或抗體醫藥等而製造。
又，本發明之抗體之衍生物可藉由如下基因工程學方法製造：將編碼本發明之特異性識別ASCT2之細胞外區域之天然型立體結構且與該細胞外區域結合之單株抗體或抗體片段的DNA，與編碼欲結合之蛋白質或抗體醫藥的DNA結合，並插入至表現載體中，再將該表現載體導入至適當之宿主細胞中進行表現。作為放射性同位素，例如可列舉：131 I、125 I、90 Y、64 Cu、199 Tc、77 Lu、或211 At等。放射性同位素可藉由氯胺T法等直接與抗體結合。又，可使螯合放射性同位素之物質與抗體結合。
作為螯合劑，例如可列舉：1-異硫氰酸苄酯-3-甲基二乙三胺五乙酸(MX-DTPA)等。
作為低分子之藥劑，例如可列舉：烷基化劑、亞硝基尿素劑、代謝拮抗劑、抗生素、植物生物鹼、定位異構轉化酶抑制劑、激素療法劑、激素拮抗劑、芳香環轉化酶抑制劑、P糖蛋白抑制劑、鉑錯合物衍生物、M期抑制劑、或激酶抑制劑等抗癌劑[臨床腫瘤學，癌與化學療法社(1996)]，或氫化可體松、強的松等類固醇劑，阿司匹林、吲哚美辛等非類固醇劑，硫蘋果酸金鹽、青黴胺等免疫調節劑，環磷醯胺、硫唑嘌呤等免疫抑制劑，馬來酸氯菲安明、或氯馬斯汀之類的抗組織胺劑等抗炎症劑[炎症與抗炎症療法，醫齒藥出版股份有限公司(1982)]等。
作為抗癌劑，例如可列舉：Amifostine(Ethyol)、順鉑、達卡巴仁(Aacarbazine，DTIC)、可美淨(Dactinomycin)、氮芥(mechlorethamine、nitrogen mustard)、鏈佐星(streptozocin)、環磷酸醯胺(cyclophosphamide)、異環磷醯胺(ifosfamide)、卡莫司汀(carmustine，BCNU)、洛莫司汀(lomustine，CCNU)、多柔比星(doxorubicin、adriamycin)、表柔比星(epirubicin)、吉西他濱(健擇)、唐黴素、甲芐肼、絲裂黴素(mitomycin)、阿糖胞苷(cytarabine)、依託泊苷(etoposide)、甲胺喋呤(methotrexate)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、長春花鹼(vinblastine)、長春新鹼(vincristine)、博來黴素(bleomycin)、道諾黴素(daunomycin)、培洛黴素(peplomycin)、雌莫司汀(estramustine)、太平洋紫杉醇(紫杉醇鹼)、歐洲紫杉醇(剋癌易)、普留淨(aldesleukin)、樂拿舒(asparaginase)、補束剋(busulfan)、卡鉑(carboplatin)、益樂鉑奧沙利鉑(oxaliplatin)、奈達鉑(nedaplatin)、克拉屈濱(cladribine)、喜樹鹼(camptothecin)、10-羥基-7-乙基喜樹鹼(SN38)、氟尿苷(floxuridine)、福達樂(fludarabine)、羥基脲、異環磷醯胺(ifosfamide)、艾達黴素(idarubicin)、美司鈉(mesna)、抗癌妥(CPT-11)、拓撲替康癌康定(nogitecan)、雙羥蒽醌(mitoxantrone)、拓撲替康癌康定(topotecan)、柳菩林(leuprolide)、甲地孕酮(megestrol)、美法侖(melphalan)、巰基嘌呤(mercaptopurine)、羥基碳醯胺、普卡黴素(plicamycin)、米托坦(mitotane)、培門冬酶(pegaspargase)、噴司他丁(pentostatin)、哌泊溴烷(pipobroman)、鏈佐星(streptozocin)、泰莫西芬(tamoxifen)、戈舍瑞林(goserelin)、柳菩林(leuprorelin)、氟他胺(flutamide)、替尼泊苷(teniposide)、睪內酯(testolactone)、硫鳥嘌呤(thioguanine)、塞替哌(thiotepa)、烏拉莫司汀(uracil mustard)、長春瑞濱(vinorelbine)、瘤可寧、氫化可體松(hydrocortisone)、潑尼松龍(prednisolone)、甲潑尼龍(methylprednisolone)、長春地辛(vindesine)、尼莫司汀(nimustine)、司莫司汀(semustine)、卡培他濱(capecitabine)、雷替曲塞(tomudex)、阿紮胞苷(azacitidine)、UFT(替加氟-尿嘧啶)、奧沙利鉑(oxalioplatin)、吉非替尼(艾瑞莎)、依麥替尼布(STI571)、埃羅替尼(Erlotinib)、Flt3抑制劑、管內皮生長因子受體(vascular endothelial growth facotr receptor，VEGFR)抑制劑、纖維芽細胞生長因子受體(fibroblast growth factor receptor，FGFR)抑制劑、艾瑞莎、得舒緩等上皮細胞生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)抑制劑、根赤殼菌素瑞迪士可黴素(radicicol)、17-烯丙胺基-17-去甲氧基格爾德黴素(17-AAG)、雷帕黴素(rapamycin)、安吖啶(amsacrine)、全反式維生素A酸(all-trans retinoic acid)、沙利竇邁(thalidomide)、來那度胺、阿那曲。唑、法倔唑(Fadrozole)、來曲唑(letrozole)、依西美坦(exemestane)、硫蘋果酸金鹽(gold thiomalate)、D青黴胺(D-penicilla mine)、布西拉明(bucilla mine)、硫唑嘌呤(azathioprine)、咪唑利賓(mizoribine)、環孢靈(cyclosporin)、雷帕黴素(rapamycin)、氫化可體松(hydrocortisone)、貝沙羅汀(塔革雷汀)、泰莫西芬(tamoxifen)、地塞美松(dexamethasone)、黃體素類、雌激素類、阿那曲唑(瑞寧得)、柳菩林(leuplin)、阿斯匹林、吲哚美辛(indomethacin)、塞來考昔(celecoxib)、硫唑嘌呤(azathioprine)、青黴胺(penicillamine)、硫蘋果酸金鹽(gold thiomalate)、馬來酸氯苯那敏(chlorpheniramine maleate)、氯苯那敏(chlorpheniramine)、氯馬斯汀(clemastine)、全反式維生素A酸(tretinoin)、貝沙羅汀(bexarotene)、砷、硼替左米(bortezomib)、安樂普諾(allopurinol)、替伊莫單抗(ibritumomab tiuxetan)、塔革雷汀(targretin)、吉妥單抗(gemtuzumab)、克拉黴素(clarithromycin)、亞葉酸(leucovorin)、異環磷醯胺(ifosfamide)、酮康唑(ketoconazole)、氨苯哌酮(aminoglutethimide)、舒拉明(suramin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、美登醇(Maytansinoid)或其衍生物等。
作為使低分子之藥劑與抗體結合之方法，例如可列舉：經由戊二醛使藥劑與抗體之胺基之間結合的方法、或經由水溶性碳二醯亞胺使藥劑之胺基與抗體之羧基結合的方法等。
作為高分子之藥劑，例如可列舉：聚乙二醇(以下記為PEG)、白蛋白、葡聚糖(dextran)、聚氧乙烯、苯乙烯-馬來酸共聚物、聚乙烯基吡咯啶酮、吡喃共聚物、或羥丙基甲基丙烯醯胺等。藉由使該等高分子化合物與抗體或抗體片段結合，可期待如下效果：(1)對化學、物理或生物等各種因子之穩定性之提高，(2)血漿半衰期之明顯延長，(3)免疫原性之消失或抗體產生之抑制等[生物結合醫藥品，廣川書店(1993)]。
作為使PEG與抗體結合之方法，例如可列舉與PEG化修飾試劑進行反應之方法等[生物結合醫藥品，廣川書店(1993)]。
作為PEG化修飾試劑，例如可列舉：離胺酸之ε-胺基之修飾劑(日本專利特開昭61-178926號公報)、天冬醯胺酸及麩醯胺酸之羧基之修飾劑(日本專利特開昭56-23587號公報)、或精胺酸之胍基之修飾劑(日本專利特開平2-117920號公報)等。
免疫刺激劑可為作為免疫佐劑(immunoadjuvant)而已知之天然物，關於具體例，作為使免疫亢進之藥劑，可列舉：β(1→3)葡聚糖(香菇多醣、西索菲蘭)、或α半乳糖基腦醯胺(KRN7000)等。
作為蛋白質，例如可列舉：使NK細胞、巨噬菌體及嗜中性白細胞等免疫活性細胞活化的細胞介素或增殖因子、以及毒素蛋白質等。
作為細胞介素或增殖因子，例如可列舉：干擾素(以下記為INF)-α、INF-β、INF-γ、介白素(以下記為IL)-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、顆粒細胞菌落刺激因子(G-CSF)、顆粒細胞-巨嗜細胞菌落刺激因子(GM-CSF)、或巨嗜細胞菌落刺激因子(M-CSF)等。
作為毒素蛋白質，例如可列舉：離胺酸、白喉毒素、或ONTAK等，亦包括為了調節毒性而對蛋白質導入變異而成之蛋白質毒素。
作為抗體醫藥，例如可列舉針對如下抗原之抗體：藉由與抗體結合而誘導細胞凋亡之抗原、與腫瘤之病情形成相關之抗原或調節免疫功能之抗原、及與病變部位之血管新生相關的抗原。
作為藉由與抗體結合而誘導細胞凋亡之抗原，例如可列舉：表面抗原分化簇(Cluster of differentiation)(以下記載為CD)19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD37、CD53、CD72、CD73、CD74、CDw75、CDw76、CD77、CDw78、CD79a、CD79b、CD80(B7.1)、CD81、CD82、CD83、CDw84、CD85、CD86(B7.2)、人類白細胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)第II型、或EGFR等。
作為與腫瘤之病情形成相關之抗原或調節免疫功能的抗體之抗原，例如可列舉：CD4、CD40、CD40配體、B7家族分子(CD80、CD86、CD274、B7-DC、B7-H2、B7-H3、或B7-H4)、B7家族分子之配體(CD28、CTLA-4、ICOS、PD-1、或BTLA)、OX-40、OX-40配體、CD137、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)受體家族分子(DR4、DR5、TNFR1、或TNFR2)、腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(TNF-related apoptosis-inducing ligand receptor，TRAIL)家族分子、TRAIL家族分子之受體家族(TRAIL-R1、TRAIL-R2、TRAIL-R3、或TRAIL-R4)、核因子κB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor kappa Bligand，RANK)、RANK配體、CD25、葉酸受體4、細胞介素[IL-1α、IL-1β、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、轉化生長因子(transforming growth factor，TGF)β或TNFα等]、該等細胞介素之受體、趨化激素(SLC、ELC、I-309、TARC、MDC、或CTACK等)、或該等趨化激素之受體。
作為抑制病變部位之血管新生之抗體的抗原，例如可列舉：血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、促血管生成素(Angiopoietin)、纖維母細胞生長因子(fibroblast growth factor，FGF)、EGF、血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor，PDGF)、類胰島素生長因子(insulin-like growth factor，IGF)、促紅細胞生成素(erythropoietin，EPO)、TGFβ、IL-8、Ephilin、SDF-1、或該等之受體等。
與蛋白質或抗體醫藥之融合抗體可藉由於編碼單株抗體或抗體片段之cDNA上連接編碼蛋白質之cDNA，構建編碼融合抗體之DNA，將該DNA插入至原核生物或真核生物用表現載體中，並將該表現載體導入至原核生物或真核生物中表現並製造融合抗體中進行表現而製造融合抗體。於使用上述抗體之衍生物作為檢測方法、定量方法、檢測用試劑、定量用試劑或診斷藥之情形時，作為與本發明之特異性識別ASCT2之細胞外區域之天然型立體結構且與該細胞外區域結合之單株抗體或該抗體片段結合之藥劑，可列舉通常之免疫學檢測或測定法中所使用之標記物。作為標記物，例如可列舉：鹼性磷酸酶、過氧化酶及螢光素酶等酶，吖啶鎓酯及咯吩等螢光物質，及螢光素異硫氰酸酯(fluorescein isothiocyanate，FITC)及四甲基羅丹明異硫氰酸酯(RITC)等螢光物質等。又，本發明包含抑制由ASCT2引起之胺基酸細胞內吞的單株抗體及該抗體片段。
作為評價本發明之抗體或該抗體片段之抑制由ASCT2引起之胺基酸細胞內吞之活性的方法，例如可列舉：使用活細胞數測定試劑等，對使抗體或該抗體片段與表現ASCT2之正常細胞或癌細胞反應而抑制麩醯胺依賴性增殖的情況進行評價的方法[J. Surgical Research,90,149(2000)]；及使用閃爍計數器等機器，對使抗體或該抗體片段與表現ASCT2之正常細胞或癌細胞反應而抑制經放射性物質標記之丙胺酸等胺基酸之細胞內吞的情況進行評價的方法[J. Biol. Chem.,271,14883(1996)]等。
進而，本發明包含具有補體結合細胞阻礙(CDC)活性、或抗體依賴性細胞阻礙(ADCC)活性等細胞阻礙活性之單株抗體及該抗體片段。
本發明之抗體或該抗體片段對抗原陽性培養細胞株之CDC活性、或ADCC活性可藉由公知之測定方法[Cancer Immunol. Immunother.,36,373(1993)]進行評價。進而，本發明包含具有細胞凋亡誘導活性之單株抗體及該抗體片段。又，本發明包含不與小鼠ASCT2結合且與人類ASCT2結合之單株抗體及該抗體片段。進而，本發明包含至少與人類ASCT2之細胞外區域中之EL2區域結合的單株抗體及該抗體片段。例如包含與選自序列編號2所表示之胺基酸序列中之第154號、第159號~第160號、第163號~第171號、第173號~第174號、第177號、第188號、第204號~第205號、第207號、第210號~第212號，或第214號~第223號中之至少一個胺基酸結合的單株抗體及該抗體片段。作為評價本發明之抗體或該抗體片段之結合特異性之方法，可使用公知之抗原決定位分析法。例如可測定針對依據胺基酸序列資訊將適當之部位置換為小鼠ASCT2之序列的人類/小鼠嵌合ASCT2之結合活性，藉此進行評價。又，本發明係關於一種含有特異性識別ASCT2之細胞外區域之天然型立體結構且與該細胞外區域結合之單株抗體或該抗體片段作為有效成分的與ASCT2相關之疾病之治療藥。
作為與ASCT2相關之疾病，只要為與表現ASCT2之細胞相關的疾病，則可為任意，例如可列舉癌。作為癌，例如可列舉：血癌、乳癌、子宮癌、大腸癌、食道癌、胃癌、卵巢癌、肺癌、腎癌、直腸癌、甲狀腺癌、宮頸癌、小腸癌、攝護腺癌及胰腺癌等。該等中，較佳為血癌、食道癌、胃癌、大腸癌、肝癌及攝護腺癌。作為血癌，例如可列舉：骨髓性白血病、淋巴性白血病、多發性骨髓瘤、何傑金氏淋巴瘤及非何傑金氏淋巴瘤等。
本發明之治療劑含有上述本發明之單株抗體或該抗體片段作為有效成分。含有本發明之抗體或該抗體片段、或該等之衍生物的治療劑可僅含有作為有效成分之該抗體或該抗體片段、或者該等之衍生物。通常較佳為與藥理學所容許之一個以上之載體一併混合，而提供藉由於製劑學之技術領域中公知之任意方法所製造之醫藥製劑。投予途徑較佳為使用治療時最有效之途徑，例如可列舉：經口投予，以及口腔內、氣管內、直腸內、皮下、肌肉內及靜脈內等非經口投予。該等中較佳為靜脈內投予。作為投予形態，例如可列舉：噴霧劑、膠囊劑、錠劑、散劑、顆粒劑、糖漿劑、乳劑、栓劑、注射劑、軟膏及貼劑等。
投予量或投予次數根據目標之治療效果、投予方法、治療期間、年齡、及體重等而有所不同，通常成人每1天10μg/kg~8 mg/kg。進而，本發明係關於一種使用特異性識別ASCT2之細胞外區域之天然型立體結構且與該細胞外區域結合之單株抗體或該抗體片段的ASCT2之免疫學檢測或測定方法，表現ASCT2之細胞之免疫學檢測或測定方法。
又，本發明係關於一種含有特異性識別ASCT2之細胞外區域之天然型立體結構且與該細胞外區域結合之單株抗體或該抗體片段作為有效成分的ASCT2之免疫學檢測用或測定用試劑及與ASCT2相關之疾病的診斷藥。本發明中，作為檢測或測定ASCT2之量之方法，可列舉任意公知之方法。例如可列舉免疫學檢測及測定方法等。所謂免疫學檢測或測定方法係指使用實施標記之抗原或抗體來檢測或測定抗體量或抗原量之方法。作為免疫學檢測或測定方法，例如可列舉：放射性物質標記免疫抗體法(RIA)、酶免疫測定法(EIA或ELISA)、螢光免疫測定法(FIA)、發光免疫測定法(luminescent immunoassay)、西方墨點法及物理化學方法等。
可藉由使用本發明之單株抗體或該抗體片段，檢測或測定表現ASCT2之細胞，而診斷上述ASCT2相關之疾病。表現ASCT2之細胞之檢測可使用公知之免疫學檢測法。作為免疫學檢測法，例如較佳為使用免疫沈澱法、螢光細胞染色法、免疫組織染色法及免疫組織染色法等。又，亦可使用FMAT8100HTS系統(Applied Biosystems公司製造)等螢光抗體染色法等。
作為本發明中成為檢測或測定ASCT2之對象之生物體樣本，只要為例如組織細胞、血液、血漿、血清、胰液、尿、糞便、組織液及培養液等可能含有表現ASCT2之細胞者，則無特別限定。
含有本發明之單株抗體或該抗體片段、或者該等之衍生物之診斷藥可根據目標診斷法而含有用以進行抗原抗體反應之試劑、該反應之檢測用試劑。作為用以進行抗原抗體反應之試劑，例如可列舉緩衝劑及鹽等。作為檢測用試劑，例如可列舉：該單株抗體及該抗體片段、識別該等之衍生物之經標記之二次抗體、以及對應於標記之受質等通常免疫學檢測或測定法中所使用之試劑。
以下，對本發明之抗體之製造方法、疾病之治療方法、及疾病之診斷方法進行具體說明。
1.單株抗體之製造方法(1)抗原之製備成為抗原之ASCT2或表現ASCT2之細胞1可藉由如下方式獲得：將含有編碼ASCT2全長或其部分長度之cDNA的表現載體導入至大腸桿菌、酵母、昆蟲細胞、或動物細胞等中。
又，可自大量表現ASCT2之各種人類腫瘤培養細胞、人類組織等純化ASCT2獲得。又，亦可將該腫瘤培養細胞、或該組織等直接用作抗原。進而，亦可藉由Fmoc法及tBoc法等化學合成法來製備具有ASCT2之部分序列的合成肽而用於抗原。本發明中所使用之ASCT2可使用Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)或Current Protocols In Molecular Biology,John Wiley & Sons(1987-1997)等中所記載之方法等，藉由例如以下之方法，使編碼該ASCT2之DNA於宿主細胞中進行表現而製造。
首先，藉由將含有編碼ASCT2之部分的全長cDNA插入至適當之表現載體之啟動子的下游而製作重組載體。亦可以全長cDNA為基礎而製備含有編碼多肽之部分的適當長度之DNA片段，並使用該DNA片段代替上述全長cDNA。其次，可藉由將所獲得之該重組載體導入至適合該表現載體之宿主細胞中，而獲得產生ASCT2之轉形體。作為表現載體，只要為可於所使用之宿主細胞中自主複製或可組入染色體中，且於可轉錄編碼ASCT2之DNA的位置含有適當之啟動子者，則可使用任意者。作為宿主細胞，只要為屬於大腸桿菌等埃希氏菌屬等之微生物、酵母、昆蟲細胞、或動物細胞等可表現目標基因者，則可使用任意者。
於使用大腸桿菌等原核生物作為宿主細胞之情形時，重組載體較佳為可於原核生物中自主複製，同時含有啟動子、核糖體結合序列、含有編碼ASCT2之部分之DNA、及轉錄終止序列的載體。又，轉錄終止序列對於上述重組載體並非必須，較佳為緊接結構基因配置轉錄終止序列。進而，該重組載體中亦可含有控制啟動子之基因。作為上述重組載體，較佳為使用將作為核糖體結合序列之香德氏序列(Shine-Dalgarno sequence)與起始密碼子之間調節成適當距離(例如6~18個鹼基)之質粒。又，作為編碼上述ASCT2之DNA之鹼基序列，可以成為最適合於宿主內之表現的密碼子之方式置換鹼基，藉此可提高目標ASCT2之產生率。
作為表現載體，只要為可於所使用之宿主細胞中發揮功能者，則可使用任意者。例如可列舉：pBTrp2、pBTac1、pBTac2(以上為Roche Diagnostics公司製造)、pKK233-2(Pharmacia公司製造)、pSE280(Invitrogen公司製造)、pGEMEX-1(Promega公司製造)、pQE-8(Qiagen公司製造)、pKYP10(日本專利特開昭58-110600號公報)、pKYP200[Agricultural Biological Chemistry,48,669(1984)]、pLSA1[Agric. Biol. Chem.,53,277(1989)]、pGEL1[Proc. Natl. Acad. Sci. USA,82,4306(1985)]、pBluescript II SK(-)(Stratagene公司製造)、pTrs30[由大腸桿菌JM109/pTrS30(FERM BP-5407)製備]、pTrs32[由大腸桿菌JM109/pTrS32(FERM SP-5408)製備]、pGHA2[由大腸桿菌IGHA2(FERM BP-400)製備，日本專利特開昭60-221091號公報]、pGKA2[由大腸桿菌IGKA2(FERM BP-6798)製備，日本專利特開昭60-221091號公報]、pTerm2(美國專利第4686191號說明書、美國專利第4939094號說明書、美國專利第5160735號說明書)、pSupex、pUB110、pTP5、pC194、pEG400[J. Bacteriol.,172,2392(1990)]、pGEX(Pharmacia公司製造)、pET系統(Novagen公司製造)及pME18SFL3等。作為啟動子，只要為可於所使用之宿主細胞中發揮功能者則可為任意者。例如可列舉：trp啟動子(Ptrp)、lac啟動子、PL啟動子、PR啟動子及T7啟動子等源自大腸桿菌或噬菌體等之啟動子。又，亦可使用將兩個Ptrp串聯而成之串聯啟動子、tac啟動子、lacT7啟動子、或let I啟動子等人工設計修飾之啟動子等。
作為宿主細胞，例如可列舉：大腸桿菌XL1-Blue、大腸桿菌XL2-Blue、大腸桿菌DH1、大腸桿菌MC1000、大腸桿菌KY3276、大腸桿菌W1485、大腸桿菌JM109、大腸桿菌HB101、大腸桿菌No.49、大腸桿菌W3110、大腸桿菌NY49及大腸桿菌DH5α等。作為對宿主細胞導入重組載體之方法，只要為將DNA導入至所使用之宿主細胞中之方法則可使用任意方法。例如可列舉使用鈣離子之方法[Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 69,2110(1972)、Gene,17,107(1982)、Molecular & General Genetics,168,111(1979)]。於使用動物細胞作為宿主之情形時，作為表現載體，只要為可於動物細胞中發揮功能者，則可使用任意者。例如可列舉：pcDNAI、pcDM8(Funakoshi公司製造)、pAGE107[日本專利特開平3-22979號公報，Cytotechnology,3,133(1990)]、pAS3-3(日本專利特開平2-227075號公報)、pCDM8[Nature,329,840(1987)]、pcDNAI/Amp(Invitrogen公司製造)、pcDNA3.1(Invitrogen公司製造)、pREP4(Invitrogen公司製造)、pAGE103[J. Biochemistry,101,1307(1987)]、pAGE210、pME18SFL3、或pKANTEX93(國際公開第97/10354號)等。
作為啟動子，只要為可於動物細胞中發揮功能者則可使用任意者。例如可列舉：巨細胞病毒(CMV，cytomegalovirus)之IE(immediate early，即刻早期)基因之啟動子、SV40之初始啟動子、反轉錄病毒之啟動子、金屬硫蛋白啟動子、熱休克啟動子、SRα啟動子、以及莫洛尼鼠類白血病病毒(moloney murine leukemia virus)之啟動子及促進子。又，亦可將人類CMV之IE基因之促進子與啟動子併用。
作為宿主細胞，例如可列舉：作為人類細胞之Namalwa細胞、作為猴細胞之COS細胞、作為中國倉鼠細胞之CHO細胞及HBT5637(日本專利特開昭63-000299號公報)等。作為對宿主細胞導入重組載體之方法，只要為向動物細胞中導入DNA之方法則可使用任意方法，例如可列舉：電穿孔法[Cytotechnology,3,133(1990)]、磷酸鈣法(日本專利特開平2-227075號公報)、或脂質體轉染法[Proc. Natl. Acad. Soi. USA,84,7413(1987)]等。將藉由以上方式獲得之源自保有組入有編碼ASCT2之DNA的重組載體之微生物、或動物細胞等之轉形體於培養基中進行培養，使該ASCT2生成蓄積於培養物中，自該培養物進行採集，藉此可製造ASCT2。將該轉形體於培養基中培養之方法可依據宿主之培養所使用之通常方法而進行。
於藉由源自真核生物之細胞進行表現之情形時，可獲得附加有糖或糖鏈之ASCT2。於對利用使用誘導性啟動子之重組載體進行轉形的微生物進行培養時，可視需要將誘導子添加至培養基中。例如於對使用lac啟動子之重組載體進行轉形的微生物進行培養之情形時，可於培養基中添加異丙基-β-D-硫代半乳糖苷等。又，例如，於對利用使用trp啟動子之重組載體進行轉形的微生物進行培養之情形時，可於培養基中添加吲哚丙烯酸等。
作為培養以動物細胞作為宿主而獲得之轉形體的培養基，例如可列舉：通常使用之RPMI1640培養基[The Journal of the American Medical Association,199,519(1967)]、Eagle之MEM培養基[Science,122,501(1952)]、杜貝可改良MEM培養基[Virology,8,396(1959)]及199培養基[Proc. Soc. Exp. Biol. Med.,73,1(1950)]、伊思考夫改良杜貝可培養基(IMDM)培養基以及向該等培養基中添加胎牛血清(FBS)等而成之培養基等。
培養通常於pH值6~8、34~40℃、54% CO2 之存在下等條件下進行1~7天。又，培養過程中亦可視需要於培養基中添加康黴素、青黴素等抗生素。作為編碼ASCT2之基因之表現方法，除直接表現以外，亦可使用分泌產生或融合蛋白質表現等方法[Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)]。作為ASCT2之產生方法，例如有產生於宿主細胞內之方法、分泌至宿主細胞外之方法、或產生於宿主細胞外膜上之方法。可藉由改變所使用之宿主細胞、或所產生之ASCT2之結構，而選擇適當之方法。於使ASCT2產生於宿主細胞內或宿主細胞外膜上之情形時，可藉由使用Paulson等之方法[J. Biol. Chem.,264,17619(1989)]、Lowe等之方法[Proc. Natl. Acad. Sci.,USA,86,8227(1989)、Genes Develop.,4,1288(1990)]、日本專利特開平05-336963號公報、或國際公開第94/23021號等中所記載之方法，使ASCT2積極分泌至宿主細胞外。又，亦可利用使用二氫葉酸還原酶基因等之基因擴增系統(日本專利特開平2-227075號公報)而使ASCT2之產生量上升。所獲得之ASCT2例如可藉由以下方式進行單獨分離、純化。
於使ASCT2以溶解狀態表現於細胞內之情形時，於培養完畢後藉由離心分離回收細胞，懸浮於水系緩衝液中後，使用超音波粉碎機、弗氏細胞破碎儀(French press)、Manton-Gaulin均質機(Manton-Gaulin homogenizer)、或球磨機等粉碎細胞，而獲得無細胞萃取液。可使用通常之蛋白質之單獨分離純化法，自藉由對該無細胞萃取液進行離心分離而獲得之上清液獲得純化標準品。
作為單獨分離純化法，例如可列舉：溶劑萃取法、利用硫酸銨等之鹽析法、脫鹽法、利用有機溶劑之沈澱法、使用二乙基胺基乙基(DEAE)-瓊脂糖凝膠、DIAION HPA-75(三菱化學公司製造)等樹脂之陰離子交換層析法、使用S-瓊脂糖FF(Pharmacia公司製造)等樹脂之陽離子交換層析法、使用丁基瓊脂糖凝膠及苯基瓊脂糖凝膠等樹脂之疏水性層析法、使用分子篩之凝膠過濾法、親和層析法、層析聚焦法以及等電聚焦電泳等電泳法等。該等方法可單獨或組合使用。
於ASCT2在細胞內形成不溶體而進行表現之情形時，以與上述相同之方式將細胞回收後進行粉碎，並進行離心分離，藉此以沈澱組分之形式回收該ASCT2之不溶體。利用蛋白質改性劑使所回收之該ASCT2之不溶體可溶化。藉由稀釋或透析該可溶化液體，使該ASCT2恢復至正常之立體結構後，可藉由與上述相同之單獨分離純化法獲得多肽之純化標準品。
於ASCT2或其糖修飾體等之衍生物分泌至細胞外之情形時，可於培養上清液中回收該ASCT2或其糖修飾體等之衍生物。以與上述相同之方式藉由離心分離等方法對該培養物進行處理，藉此取得可溶性組分，可藉由使用與上述相同之單獨分離純化法自該可溶性組分獲得純化標準品。又，本發明中所使用之ASCT2亦可藉由Fmoc法、或tBoc法等化學合成法而製造。又，亦可利用Advanced Chemtec公司、PerkinElmer公司、Pharmacia公司、ProteinTechnology Instrument公司、Synthecell-Vega公司、PerSeptive公司、或島津製作所公司等製造之肽合成機進行化學合成。
(2)動物之免疫與融合用抗體產生細胞之製備對3~20週齡之小鼠、大鼠或倉鼠等動物免疫(1)中所獲得之抗原，採集該動物之脾臟、淋巴結、周邊血液中之抗體產生細胞。又，於免疫原性較低，上述動物體內未見充分之抗體效價上升之情形時，亦可使用ASCT2敲出小鼠作為被免疫動物。免疫係藉由向動物之皮下、靜脈內或腹腔內一併投予例如傳氏之完全佐劑、或氫氧化鋁凝膠及百日咳菌疫苗等適當佐劑與抗原而進行。於抗原為部分肽之情形時，係與BSA(牛血清白蛋白)或KLH(Keyhole Limpet hemocyanin，匙孔血藍蛋白)等載體蛋白質製成結合體，並將其用作免疫原。抗原之投予係於第1次投予後，以1~2週為間隔進行5~10次。於各投予後第3~7天自眼底靜脈叢採血，使用酶免疫測定法[Antibodies-A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory(1988)]等調查其血清之抗體效價。提供其血清對用於免疫之抗原顯示出充分之抗體效價之動物作為融合用抗體產生細胞之供給源。
於抗原之最終投予後第3天~第7天，自經免疫之動物摘取脾臟等含有抗體產生細胞之組織，採集抗體產生細胞。於使用脾臟細胞之情形時，將脾臟切細、擢碎後，進行離心分離，進而除去紅細胞，取得融合用抗體產生細胞。
(3)骨髓瘤細胞之製備骨髓瘤細胞係使用自小鼠獲得之株化細胞。作為該株化細胞，例如可列舉：8-氮鳥嘌呤耐性小鼠(源自BALB/c)骨髓瘤細胞P3-X63Ag8-U1(P3-U1)[Current Topics in Microbiology and Immunology,18,1(1978)]、P3-NS1/1-Ag41(NS-1)[European J. Im munology,6,511(1976)]、SP2/0-Ag14(SP-2)[Nature,276,269(1978)]、P3-X63-Ag8653(653)[J. Immunology,123,1548(1979)]及P3-X63-Ag8(X63)[Nature,256,495(1975)]等。該骨髓瘤細胞係於正常培養基[添加有麩醯胺、2-巰基乙醇、慶大黴素、FBS、及8-氮鳥嘌呤之RPMI1640培養基]中進行繼代，於細胞融合之3~4天前於正常培養基中進行繼代，而於融合當天確保2×107 個以上之細胞數。
(4)細胞融合與單株抗體產生融合瘤之製備將(2)中所獲得之融合用抗體產生細胞與(3)中所獲得之骨髓瘤細胞利用MEM培養基或PBS(磷酸氫二鈉1.83 g、磷酸鉀0.21 g、食鹽7.65 g、蒸餾水1升，pH值7.2)充分清洗，以細胞數成為融合用抗體產生細胞：骨髓瘤細胞=5~10：1之方式進行混合，並進行離心分離後，除去上清液。將沈澱之細胞群充分擢碎後，一邊攪拌，一邊於37℃下添加聚乙二醇-1000(PEG-1000)、MEM培養基及二甲基亞碸之混合液。
進而每1~2分鐘添加MEM培養基1~2 mL，數次後，以總量成為50 mL之方式添加MEM培養基。離心分離後，除去上清液。將沈澱之細胞群緩慢擢碎後，將細胞緩慢懸浮於融合用抗體產生細胞之HAT培養基[添加有次黃嘌呤、胸苷、及胺基喋呤之正常培養基]中。將該懸浮液於5% CO2 培養箱中，於37℃下培養7~14天。
培養後，取培養上清液之一部分，藉由下述結合分析等融合瘤之選擇方法，選擇與含有ASCT2之抗原反應且不與不含有ASCT2之抗原反應之細胞群。繼而，藉由極限稀釋法重複選殖2次[第1次係使用HT培養基(自HAT培養基中除去胺基喋呤之培養基)，第2次係使用正常培養基]，選擇可見穩定且較強之抗體效價者作為單株抗體產生融合瘤。(5)純化單株抗體之製備對經異十九烷處理[腹腔內投予2,6,10,14-四甲基十五烷(Pristane) 0.5 ml，並飼養2週]之8~10週齡之小鼠或裸小鼠，將(4)中所獲得之單株抗體產生融合瘤注射至腹腔內。融合瘤經10~21天腹水癌化。自該小鼠採集腹水，進行離心分離除去固形物成分後，利用40~50%硫酸銨進行鹽析，進行辛酸沈澱法、利用DEAE-瓊脂糖凝膠管柱、蛋白A-管柱或凝膠過濾管柱之純化，收集IgG或IgM組分，而製成純化單株抗體。
又，將(4)中所獲得之單株抗體產生融合瘤於添加有10% FBS之RPMI1640培養基等中進行培養後，藉由離心分離除去上清液，懸浮於添加有5% Daigo GF21之Hybridoma SFM培養基中，培養3~7天。亦可將所獲得之細胞懸浮液進行離心分離，自所獲得之上清液，藉由蛋白A-管柱或蛋白G-管柱進行純化，收集IgG組分，獲得純化單株抗體。抗體之亞型之確定係使用亞型鑑定試劑盒並藉由酶免疫測定法而進行。蛋白量之定量係根據勞立法(Lowry method)法及280 nm下之吸光度而算出。
(6)單株抗體之選擇單株抗體之選擇係藉由以下所示之酶免疫測定法進行之結合分析、及胺基酸之細胞內吞抑制分析而進行。
(6-a)結合分析抗原係使用如下者：將(1)中所獲得之含有編碼ASCT2之cDNA之表現載體導入至大腸桿菌、酵母、昆蟲細胞、或動物細胞等中所獲得之基因導入細胞、重組蛋白質、或自人類組織中所獲得之純化多肽或部分肽等。於抗原為部分肽之情形時，係與BSA或KLH等載體蛋白質製成結合體(conjugate)而使用。
將抗原分注至96孔培養盤等培養盤中並固相化後，分注血清、融合瘤之培養上清液或純化單株抗體等受檢物質作為第1抗體而進行反應。利用PBS或PBS-Tween等充分清洗後，分注生物素、酶、經化學發光物質或放射線化合物等標記之抗免疫球蛋白抗體作為第2抗體而進行反應。利用PBS-Tween充分清洗後，進行與第2抗體之標記物質對應之反應，選擇特異性地與免疫原反應之單株抗體。
(6-b)胺基酸之細胞內吞抑制分析評價細胞係使用將(1)中所獲得之含有編碼ASCT2之cDNA之表現載體導入至動物細胞等中之基因導入細胞、或表現ASCT2之正常細胞或癌細胞。
作為評價本發明之單株抗體或該抗體片段之ASCT2的胺基酸之細胞內吞之抑制活性的方法，例如可列舉：使用活細胞數測定試劑等，對使單株抗體或該抗體片段與表現ASCT2之正常細胞或癌細胞反應而抑制麩醯胺依賴性增殖的情況進行評價之方法[J. Surgical Research,90,149(2000)]；及使用閃爍計數器等機器，對使單株抗體或該抗體片段與表現ASCT2之正常細胞或癌細胞反應而抑制經放射性物質標記之丙胺酸等胺基酸之細胞內吞的情況進行評價的方法[J. Biol. Chem.,271,14883(1996)」等。2.基因重組抗體之製作作為基因重組抗體之製作例，以下揭示人類型嵌合抗體及人類化抗體之製作方法。
(1)基因重組抗體表現用載體之構建所謂基因重組抗體表現用載體，係指組入有編碼人類抗體之CH及CL之DNA的動物細胞用表現載體，其可藉由於動物細胞用表現載體中分別選殖編碼人類抗體之CH及CL之DNA而構建。
人類抗體之C區域可使用任意之人類抗體之CH及CL。例如可使用：人類抗體之γ1亞型之CH及κ型之CL等。編碼人類抗體之CH及CL之DNA係使用cDNA，亦可使用包含外顯子及內含子之染色體DNA。
作為動物細胞用表現載體，只要為可組入並表現編碼人類抗體之C區域之基因者，則可使用任意者。例如可列舉：pAGE107[Cytotechno1.,3,133(1990)]、pAGE103[J. Biochem.,101,1307(1987)]、pHSG274[Gene,27,223(1984)]、pKCR[Proc. Natl. Acad. Sci. USA,78,1527(1981)]、pSG1bd2-4[Cytotechnol.,4,173(1990)]及pSE1UK1Sed1-3[Cytotechnol.,13,79(1993)]等。作為動物細胞用表現載體中之啟動子及促進子，例如可列舉：SV40之初始啟動子[J. Biochem.,101,1307(1987)]、莫洛尼鼠類白血病病毒LTR[Biochem. Biophys. Res. Commun.,149,960(1987)]及免疫球蛋白H鏈之啟動子[Cell,41,479(1985)]及促進子[Cell,33,717(1983)]等。
作為基因重組抗體表現用載體，就構建基因重組抗體表現載體之容易程度、導入至動物細胞中之容易程度、以及動物細胞內之抗體H鏈及L鏈之表現量達到均衡等方面而言，可使用抗體H鏈及L鏈存在於同一載體上之類型(串聯型)之基因重組抗體表現用載體[J. Immunol. Methods,167,271(1994)]，亦可使用抗體H鏈及L鏈存在於不同之載體上的類型。
作為串聯型基因重組抗體表現用載體，例如可列舉：pKANTEX93(國際公開第97/10354號)及pEE18[Hybridoma,17,559(1998)]等。(2)編碼源自人類以外之動物之抗體之V區域的cDNA之取得及胺基酸序列之分析編碼非人類抗體之VH及VL之cDNA之取得及胺基酸序列之分析可藉由以下方式進行。
自產生非人類抗體之融合瘤細胞萃取mRNA，合成cDNA。將所合成之cDNA於噬菌體或質粒等載體上進行選殖，而製作cDNA基因庫。使用編碼小鼠抗體之C區域部分或V區域部分之DNA作為探針，自上述基因庫分別單獨分離具有編碼VH或VL之cDNA的重組噬菌體或重組質粒。分別確定重組噬菌體或重組質粒上之目標小鼠抗體之VH或VL之全鹼基序列，自鹼基序列分別推測VH或VL之全胺基酸序列。
作為製作產生非人類抗體之融合瘤細胞之人類以外之動物，例如可列舉：小鼠、大鼠、倉鼠及兔子等，只要可製作融合瘤細胞，則可使用任意動物。源自融合瘤細胞之全RNA之製備可使用硫氰酸胍-三氟乙酸銫法[Methods in Enzymol.,154,3(1987)]、或RNA easy kit(Qiagen公司製造)等試劑盒等。
源自全RNA之mRNA之製備可使用寡聚(dT)固定化纖維素管柱法[Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)]、或Oligo-dT30<Super>mRNA純化試劑盒(Takara Bio公司製造)等試劑盒等。又，亦可使用Fast Track mRNA分離試劑盒(Invitrogen公司製造)、或Quick Prep mRNA純化試劑盒(Pharmacia公司製造)等試劑盒，由融合瘤細胞製備mRNA。cDNA之合成及cDNA基因庫之製作係使用公知之方法[Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)、Current Protocols in Molecular Biology,Supplement 1,John Wiley & Sons(1987-1997)]、或cDNA合成及質粒選殖用Super ScriptTM質粒系統(Invitrogen公司製造)或ZAP-cDNA合成試劑盒(Stratagene公司製造)等試劑盒等。於製作cDNA基因庫時，組入以自融合瘤細胞萃取之mRNA作為模板而合成之cDNA的載體只要為可組入該cDNA之載體，則可使用任意者。
例如可使用：ZAP Express[Strategies,5,58(1992)]、pBluescript II SK(+)[Nucleic Acids Research,17,9494(1989)]、λZAPII(Stratagene公司製造)、λgt10、λgt11[DNA Cloning：A Practical Approach,I,49(1985)]、Lambda Blue Mid(Clontech公司製造)、λExCell、pT7T3-18U(Pharmacia公司製造)、pcD2[Mol. Cell. Biol.,3,280(1983)]、或pUC18[Gene,33,103(1985)]等。作為導入由噬菌體或質粒載體構建之cDNA基因庫的大腸桿菌，只要為可導入、表現及維持該cDNA基因庫者，則可使用任意者。例如可使用：XL1-Blue MRF'[Strategies,5,81(1992)]、C600[Genetics,39,440(1954)]、Y1088、Y1090[Science. 222,778(1983)]、NM522[J. Mol. Biol.,166,1(1983)]、K802[J. Mol. Biol.,16,118(1966)]、或JM105[Gene,38,275(1985)]等。編碼源自cDNA基因庫之非人類抗體之VH或VL的cDNA純系之選擇係使用利用經同位素或經螢光標記之探針之菌落雜交法、或溶菌斑雜交法[Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)]等。又，亦可製備引子，以由mRNA合成之cDNA或cDNA基因庫作為模板，藉由聚合酶鏈鎖反應(Polymerase Chain Reaction)法[以下記為PCR法，Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)、Current Protocols in Molecular Biology,Supplement 1,John Wiley & Sons(1987-1997)]，而製備編碼VH或VL之cDNA。利用適當之限制酶等，將所選擇之cDNA切斷後，於pBluescript SK(-)(Stratagene公司製造)等質粒上進行選殖，藉由通常使用之鹼基序列分析方法等確定該cDNA之鹼基序列。
鹼基序列分析方法例如為：於進行雙脫氧法[Proc. Natl. Acad,Sci. USA,74,5463(1977)]等之反應後，使用A. L. F. DNA定序儀(Pharmacia公司製造)等鹼基序列自動分析裝置等進行分析。
藉由自所確定之鹼基序列分別推測VH及VL之全胺基酸序列，並與現有之抗體之VH及VL之全胺基酸序列[Sequences of Proteins of Immunological Interest,US Dept. Health and Human Services(1991)]進行比較，可分別確認所取得之cDNA是否編碼了含有分泌訊號序列之抗體之VH及VL之完整胺基酸序列。
關於包含分泌訊號序列之抗體之VH及VL之完整胺基酸序列，藉由與現有之抗體之VH及VL之全胺基酸序列[Sequences of Proteins of Immunological Interest,US Dept. Health and Human Services(1991)]進行比較，可推測分泌訊號序列之長度及N末端胺基酸序列。進而可知該等所屬之亞群。
又，VH及VL之各CDR之胺基酸序列亦可藉由與現有之抗體之VH及VL之胺基酸序列[Sequences of Proteins of Immunological Interest,US Dept. Health and Human Services(1991)]進行比較而找出。
又，可使用所獲得之VH及VL之完整胺基酸序列，對例如SWISS-PROT或PIR-Protein等任意之資料庫進行BLAST法[J. Mol. Biol.,215,403(1990)]等之同源性檢索，而確認VH及VL之完整胺基酸序列是否新穎。
(3)人類型嵌合抗體表現載體之構建於(1)中所獲得之基因重組抗體表現用載體之編碼人類抗體之CH或CL的各基因之上游分別選殖分別編碼非人類抗體之VH或VL的cDNA，可構建人類型嵌合抗體表現載體。為了將編碼非人類抗體之VH或VL之cDNA之3'末端側、與人類抗體之CH或CL之5'末端側連接，而製作以連接部分之鹼基序列編碼適當之胺基酸且成為適當之限制酶識別序列之方式設計的VH及VL之cDNA。以將所製作之VH及VL之cDNA以適當之形式分別表現於(1)中所獲得之人類化抗體表現用載體之編碼人類抗體之CH或CL之各基因之上游的方式分別進行選殖，可構建人類型嵌合抗體表現載體。
又，亦可使用兩端具有適當之限制酶之識別序列的合成DNA，並藉由PCR法分別對編碼非人類抗體VH或VL之cDNA進行擴增，而將該等分別選殖於(1)中所獲得之基因重組抗體表現用載體上。(4)編碼人類化抗體之V區域之cDNA之構建編碼人類化抗體之VH或VL之cDNA可藉由以下方式而構建。
分別選擇移植非人類抗體之VH或VL之CDR之胺基酸序列的人類抗體之VH或VL之構架區域(以下記為FR)之胺基酸序列。作為所選擇之FR之胺基酸序列，只要為源自人類抗體者，則可使用任意者。例如可使用：蛋白質資料庫(Protein Data Bank)等資料庫中所登錄之人類抗體之FR之胺基酸序列、或人類抗體之FR之各亞群之共同胺基酸序列[Sequences of Proteins of Immunological Interest,US Dept. Health and Human Services(1991)]等。
為了抑制抗體之結合活性之降低，而選擇與原本抗體之VH或VL之FR之胺基酸序列具有儘可能高之同源性(至少為60%以上)的FR之胺基酸序列。其次，於所選擇之人類抗體之VH或VL之FR之胺基酸序列上分別移植原抗體之CDR之胺基酸序列，而分別設計人類化抗體之VH或VL之胺基酸序列。考慮到可見於抗體之基因之鹼基序列中的密碼子之使用頻率[Sequences of Proteins of Immunological Interest,US Dept. Health and Human Services(1991)]，而將所設計之胺基酸序列變換為DNA序列，分別設計編碼人類化抗體之VH或VL之胺基酸序列的DNA序列。
基於所設計之DNA序列而合成包含100個鹼基左右之長度之數條合成DNA，並使用該等進行PCR反應。於該情形時，較佳為根據PCR反應時之反應效率及可合成之DNA之長度而設計H鏈、L鏈均為6條之合成DNA。又，藉由在位於兩端之合成DNA之5'末端導入適當之限制酶之識別序列，可於(1)中所獲得之人類化抗體表現用載體上容易地選殖編碼人類化抗體之VH或VL之cDNA。於PCR反應後，將擴增產物分別選殖於pBluescript SK(-)(Stratagene公司製造)等質粒上，藉由與(2)中所記載之方法相同之方法確定鹼基序列，而取得具有編碼所需人類化抗體之VH或VL之胺基酸序列的DNA序列之質粒。(5)人類化抗體之V區域之胺基酸序列之修飾已知人類化抗體於僅將非人類抗體之VH及VL之CDR移植至人類抗體之VH及VL之FR上時，其抗原結合活性與原非人類抗體相比有所降低[BIO/TECHNOLOGY,9,266(1991)]。
對於人類化抗體，鑑定人類抗體之VH及VL之FR之胺基酸序列之中直接地和與抗原之結合相關的胺基酸殘基、與CDR之胺基酸殘基相互作用之胺基酸殘基、及維持抗體之立體結構而間接地和與抗原之結合相關的胺基酸殘基，並將該等胺基酸殘基置換為原非人類抗體之胺基酸殘基，藉此可使降低之抗原結合活性上升。為了鑑定與抗原結合活性相關之FR之胺基酸殘基，可藉由X射線結晶分析[J. Mol. Biol.,112,535(1977)]或電腦模擬[Protein Engineering,7,1501(1994)]等來構建及分析抗體之立體結構。又，可針對各個抗體製作數種修飾體，反覆研究各自與抗原結合活性之相關性，而進行錯誤嘗試，藉此取得具有所需之抗原結合活性的修飾人類化抗體。人類抗體之VH及VL之FR之胺基酸殘基可藉由使用修飾用合成DNA，進行(4)中所記載之PCR反應，而進行修飾。針對PCR反應後之擴增產物，藉由(2)中所記載之方法，確定鹼基序列，而確認實施有目標修飾。
(6)人類化抗體表現載體之構建可於(1)中所獲得之基因重組抗體表現用載體之編碼人類抗體之CH或CL的各基因之上游，分別選殖所構建之編碼基因重組抗體之VH或VL的cDNA，而構建人類化抗體表現載體。
例如，可於構建(4)及(5)中所獲得之人類化抗體之VH或VL時所使用之合成DNA中，在位於兩端之合成DNA之5'末端導入適當之限制酶之識別序列，藉此以如下方式分別進行選殖：此等以適當之形式表現於(1)中所獲得之人類化抗體表現用載體之編碼人類抗體之CH或CL的各基因之上游。
(7)基因重組抗體之短暫表現(transient expression)可使用(3)及(6)中所獲得之基因重組抗體表現載體、或修飾該等而獲得的表現載體，進行基因重組抗體之短暫表現，對所製作之多種人類化抗體之抗原結合活性進行有效評價。
導入表現載體之宿主細胞只要為可表現基因重組抗體之宿主細胞，則可使用任意細胞。例如使用COS-7細胞[American Type Culture Collection(ATCC)編號：CRL1651][Methods in Nucleic Acids Res.,CRC press,283(1991)]。向COS-7細胞中導入表現載體，例如可採用如下方法：DEAE-葡聚糖法[Methods in Nucleic Acids Res.,CRC press (1991)]、或脂質體轉染法[Proc. Natl. Acad. Sci. USA,84,7413(1987)]等。
於導入表現載體後，培養上清中之基因重組抗體之表現量及抗原結合活性係使用酶免疫抗體法[Monoclonal A ntibodies-Principles and practice,Third edition,Academic Press(1996)、Antibodies-A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory(1988)、單株抗體實驗指南講談社科學(1987)]等而測定。(8)穩定表現基因重組抗體之轉形體之取得及基因重組抗體之製備可藉由將(3)及(6)中所獲得之基因重組抗體表現載體導入至適當之宿主細胞中，而獲得穩定表現基因重組抗體之轉形體。向宿主細胞中導入表現載體，可採用電穿孔法[日本專利特開平2-257891號公報、Cytotechnology,3,133(1990)]等。
導入基因重組抗體表現載體之宿主細胞只要為可表現基因重組抗體之宿主細胞，則可使用任意細胞。例如可使用：小鼠SP2/0-Ag14細胞(ATCC編號：CRL1581)、小鼠P3X63-Ag8.653細胞(ATCC編號：CRL1580)、二氫葉酸還原酶基因(以下，記為dhfr)缺失之CHO細胞[Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77,4216(1980)]、獲得凝聚素耐性之Lec13[Somatic Cell and Molecular genetics,12,55(1986)]、α1,6-海藻糖轉移酶基因缺失之CHO細胞(國際公開第2005/035586號、國際公開第02/31140號)、大鼠YB2/3HL. P2. G11. 16Ag. 20細胞(ATCC編號：CRL1662)等。
又，亦可使用：與細胞內糖核苷酸GDP-海藻糖之合成相關的酶等蛋白質、或與N-糖苷結合複合型糖鏈之還原末端之N-乙醯葡糖胺之6位中海藻糖之1位結合α之糖鏈修飾相關的酶等蛋白質、或與細胞內糖核苷酸GDP-海藻糖向高爾基體之輸送相關的蛋白質等之活性降低或缺失之宿主細胞例如α1,6-海藻糖轉移酶基因缺失之CHO細胞(國際公開第2005/035586號、國際公開第02/31140號)等。於導入表現載體後，穩定地表現基因重組抗體之轉形體係藉由於含有G418硫酸鹽(以下記為G418)等藥劑之動物細胞培養用培養基中進行培養而選擇(日本專利特開平2-257891號公報)。
動物細胞培養用培養基係使用RPMI1640培養基(Invitrogen公司製造)、GIT培養基(日本製藥公司製造)、EX-CELL301培養基(JRH公司製造)、IMDM培養基(Invitrogen公司製造)、Hybridoma-SFM培養基(Invitrogen公司製造)、或向該等培養基中添加有FBS等各種添加物而成之培養基等。
藉由將所獲得之轉形體於培養基中進行培養，可使基因重組抗體表現並蓄積於培養上清液中。培養上清液中之基因重組抗體之表現量及抗原結合活性可藉由ELISA法等進行測定。又，轉形株可利用DHFR擴增系(日本專利特開平2-257891號公報)等，使基因重組抗體之表現量上升。基因重組抗體係使用蛋白A-管柱自轉形體之培養上清液中純化[Monoclonal Antibodies-Principles and practice,Third edition,Academic Press(1996)、Antibodies-ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory(1988)]。又，亦可組合凝膠過濾、離子交換層析及超濾等蛋白質純化所使用之方法。
經純化之基因重組抗體之H鏈、L鏈或抗體分子整體之分子量可使用聚丙烯醯胺凝膠電泳法[Nature,227,680(1970)]、或西方墨點法[Monoclonal Antibodies-Principles and practice,Third edition,Academic Press(1996)、Antibodies-A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory(1988)]等進行測定。3.純化單株抗體或該抗體片段之活性評價經純化之本發明之單株抗體或該抗體片段之活性評價可藉由以下方式進行。
ASCT2表現細胞株之結合活性係使用上述1.(6a)中所記載之結合分析而測定。又,可使用螢光抗體法[Cancer Immunol. Immunother.,36.373(1993)]或使用Biacore系統等之表面離體子共振法等而測定。抑制由ASCT2引起之胺基酸之細胞內吞的活性係藉由上述1-(6b)中所記載之方法等而測定。又，抗原陽性培養細胞株之CDC活性、或ADCC活性係藉由公知之測定方法[Cancer Immunol. Immunother.,36,373(1993)]而測定。
4.使用本發明之抗ASCT2單株抗體或該抗體片段之疾病之治療方法本發明之特異性識別ASCT2之細胞外區域之天然型立體結構且與該細胞外區域結合之單株抗體或該抗體片段可用於與ASCT2相關之疾病之治療。含有本發明之單株抗體或該抗體片段、或該等之衍生物之治療劑可僅含有作為有效成分之該抗體或該抗體片段、或該等之衍生物，通常與藥理學上所容許之1種以上之載體一併混合，而提供藉由於製劑學之技術領域中公知之方法所製造之醫藥製劑。
作為投予途徑，可列舉：經口投予，以及口腔內，氣管內、直腸內、皮下、肌肉內及靜脈內等非經口投予。作為投予形態，例如可列舉：噴霧劑、膠囊劑、錠劑、散劑、顆粒劑、糖漿劑、乳劑、栓劑、注射劑、軟膏及貼劑等。
適合於經口投予之製劑為乳劑、糖漿劑、膠囊劑、錠劑、散劑、或顆粒劑等。乳劑或糖漿劑之類的液體製備物係使用水、蔗糖、山梨糖醇及果糖等糖類，聚乙二醇及丙二醇等二元醇類，芝麻油、橄欖油及大豆油等油類，對羥基苯甲酸酯類等防腐劑，以及草莓香料及薄荷等香料類等作為添加劑而製造。膠囊劑、錠劑、散劑或顆粒劑等係使用乳糖、葡萄糖、蔗糖及甘露糖醇等賦形劑，澱粉及海藻酸鈉等崩散劑，硬脂酸鎂及滑石粉等潤滑劑，聚乙烯醇、羥丙基纖維素及明膠等黏合劑，脂肪酸酯等界面活性劑以及甘油等塑化劑等作為添加劑而製造。
作為適合於非經口投予之製劑，例如可列舉：注射劑、栓劑及噴霧劑等。
注射劑係使用包含鹽溶液、葡萄糖溶液、或該等兩者之混合物的載體等而製造。栓劑係使用可可脂、氫化脂肪或羧酸等載體而製造。噴霧劑係使用不會刺激使用者之口腔及氣管黏膜且使本發明之單株抗體或該抗體片段以微細粒子之形式分散而使其變得容易吸收的載體等而製造。作為載體，例如可使用乳糖或甘油等。又，亦可以氣霧劑或乾粉劑之形式製造。進而，上述非經口劑中亦可添加適合於經口投予之製劑中作為添加劑而例示之成分。5.使用本發明之抗ASCT2單株抗體或該抗體片段的疾病之診斷方法藉由使用本發明之單株抗體或該抗體片段來檢測或測定表現有ASCT2或ASCT2之細胞，可診斷與ASCT2相關之疾病。
作為與ASCT2相關之疾病之一的癌之診斷，例如可藉由以下方式檢測或測定ASCT2而進行。首先，針對自複數名健康人之生物體所採集之生物體樣本，使用本發明之單株抗體或該抗體片段、或該等之衍生物，並使用下述免疫學方法，進行ASCT2之檢測或測定，檢查健康人之生物體樣本中之ASCT2之存在量。
其次，同樣地檢查受檢者之生物體樣本中之ASCT2之存在量，將其存在量與健康人之存在量進行比較。於受檢者之該多肽之存在量與健康者相比有所增加之情形時，診斷癌為陽性。所謂免疫學方法係指使用經標記之抗原或抗體來檢測或測定抗體量或抗原量之方法。例如可列舉：放射性物質標記免疫抗體法、酶免疫測定法、螢光免疫測定法、發光免疫測定法、西方墨點法及物理化學方法等。關於放射性物質標記免疫抗體法，例如係使本發明之抗體或該抗體片段與抗原或表現抗原之細胞等進行反應。進而與經放射線標記之抗免疫球蛋白抗體或結合片段反應後，利用閃爍計數器等進行測定。關於酶免疫測定法，例如係使本發明之抗體或該抗體片段與抗原或表現抗原之細胞等反應。進而與經標記之抗免疫球蛋白抗體或結合片段反應後，利用吸光光度計測定顯色色素。例如可使用三明治ELISA法等。作為酶免疫測定法中所使用之標記物，可使用公知[酶免疫測定法，醫學書院(1987)]之酶標記。例如可列舉：鹼性磷酸酶標記、過氧化酶標記、螢光素酶標記及生物素標記等。
三明治ELISA法係使抗體與固相結合後，捕捉作為檢測或測定對象之抗原，使被捕捉之抗原與第2抗體進行反應的方法。
於該ELISA法中，準備係識別欲檢測或測定之抗原的抗體或抗體片段且抗原識別部位不同之2種抗體，其中，使第1抗體或抗體片段預先吸附於培養盤(例如96孔培養盤)上。其後，利用FITC等螢光物質、過氧化酶等酶、或生物素等標記第2抗體或抗體片段。使吸附有上述抗體之培養盤與自生物體內分離之細胞或其粉碎液、組織或其粉碎液、細胞培養上清液、血清、胸水、腹水、或眼液等進行反應。其後，與經標記之單株抗體或抗體片段反應，並進行與標記物質對應之檢測反應。根據階段性地稀釋濃度已知之抗原而製作之校準曲線，可算出試驗樣本中之抗原濃度。作為三明治ELISA法中所使用之抗體，可使用多株抗體或單株抗體中之任一者，亦可使用Fab、Fab'、或F(ab)2 等抗體片段。
作為三明治ELISA法中所使用之2種抗體之組合，可為識別不同抗原決定位之單株抗體或抗體片段之組合，亦可為多株抗體與單株抗體或抗體片段之組合。螢光免疫測定法係採用文獻[Monoclonal Antibodies-Principles and practice,Third edition,Academic Press(1996)、單株抗體實驗指南講談社科學(1987)]等中所記載之方法。
作為螢光免疫測定法中所使用之標記物，可使用公知[螢光抗體法，Soft Science社(1983)]之螢光標記。例如使用FITC、或RITC等。發光免疫測定法係採用文獻[生物發光與化學發光臨床檢查42，廣川書店(1998)]等中所記載之方法。作為發光免疫測定法中所使用之標記物，可列舉公知之發光體標記，使用吖啶酯、或咯吩等。西方墨點法係藉由如下方式進行。藉由SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳[Antibodies-A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory(1988)]將抗原或表現抗原之細胞等分步分離。其後，將該凝膠轉漬至聚偏氟乙烯(PVDF)膜或硝化纖維素膜上，使識別抗原之抗體或抗體片段與該膜反應。進而與經FITC等螢光物質、過氧化酶等酶、或生物素等標記之抗小鼠IgG抗體或結合片段反應。其後，使該標記可見化，藉此進行測定。
以下揭示一例。將表現具有序列編號2所表示之胺基酸序列之多肽的細胞或組織溶解，於還原條件下以每條泳道之蛋白量為0.1~30 μg之條件藉由SDS-PAGE法進行泳動。將泳動之蛋白質轉印至PVDF膜上，於室溫下使其與含有1~10% BSA之PBS(以下，記為BSA-PBS)反應30分鐘而進行阻斷操作。
在此，使本發明之單株抗體反應，利用含有0.05~0.1%之Tween-20之PBS(以下記為Tween-PBS)進行清洗，於室溫下使其與經過氧化酶標記之山羊抗小鼠IgG反應2小時。利用Tween-PBS進行清洗，使用ECL西方墨點偵測試劑(Amersham公司製造)等檢測結合有單株抗體之條帶，藉此可檢測具有序列編號2所表示之胺基酸序列之多肽。作為西方墨點法之檢測中所使用之抗體，係使用可與未保持天然型立體結構之多肽相結合的抗體。
物理化學方法係藉由如下方式進行：例如藉由使作為抗原之ASCT2與本發明之單株抗體或該抗體片段結合，而形成凝聚體，並檢測該凝聚體。作為其他物理化學方法，例如可列舉：毛細管法、單向免疫擴散法(single radial immunodiffusion)、免疫比濁法(turbidimetric immunoassay)及乳膠免疫比濁法[臨床檢查法提要，金原出版(1998)]等。於乳膠免疫比濁法中，若使用使抗體或抗原過敏之粒徑為0.1~1 μm左右之聚乙烯乳膠等載體，利用對應之抗原或抗體引起抗原抗體反應，則反應液中之散射光增加，透射光減少。藉由測定吸光度或積分球濁度而檢測該變化，可測定試驗樣本中之抗原濃度等。
另一方面，表現有ASCT2之細胞之檢測或測定可使用公知之免疫學檢測法，較佳為使用免疫沈澱法、免疫細胞染色法、免疫組織染色法或螢光抗體染色法等。免疫沈澱法係使表現有ASCT2之細胞等與本發明之單株抗體或該抗體片段反應後，添加蛋白G-瓊脂糖凝膠等具有與免疫球蛋白特異性結合之能力的載體，而使抗原抗體複合體沈澱。或者，亦可藉由以下方法來進行。於ELISA用96孔培養盤上固定上述本發明之單株抗體或該抗體片段後，藉由BSA-PBS進行阻斷。於為抗體未經純化之狀態之例如融合瘤株培養上清液等未經純化之狀態之情形時，係將抗小鼠免疫球蛋白、抗大鼠免疫球蛋白、蛋白-A或蛋白-G等預先固定在ELISA用96孔培養盤上，並利用BSA-PBS進行阻斷後，分注融合瘤而培養上清液而進行結合。
其次，去除BSA-PBS，利用PBS充分清洗後，使其與表現有ASCT2之細胞或組織之溶解液反應。利用SDS-PAGE用樣本緩衝液，自充分地清洗後之培養盤萃取免疫沈澱物，並藉由上述西方墨點法進行檢測。免疫細胞染色法或免疫組織染色法係藉由如下螢光抗體染色法進行檢測：視情況為改良抗體之通透性而利用界面活性劑或甲醇等對表現抗原之細胞或組織等進行處理後，使其與本發明之單株抗體反應，進而與施加有FITC等螢光標記、過氧化酶等酶標記或生物素標記等之抗免疫球蛋白抗體或其結合片段反應後，使該標記可見化，利用顯微鏡進行顯微。
又，可使螢光標記之抗體與細胞進行反應，再利用流式細胞儀進行分析[Monoclonal Antibodies-Principles and practice,Third edition,Academic Press(1996)、單株抗體實驗指南講談社科學(1987)]。尤其是，與ASCT2之細胞外區域結合之本發明之單株抗體或該抗體片段可藉由螢光抗體染色法檢測保持天然型立體結構之細胞。
又，於使用螢光抗體染色法中之FMAT8100HTS系統(Applied Biosystems公司製造)等之情形時，可在不將所形成之抗體-抗原複合體、和與抗體-抗原複合體之形成無關的游離之抗體或抗原分離的情況下測定抗原量或抗體量。以下，藉由實施例更加具體地說明本發明，但本發明並不限定於下述實施例。
實施例
[實施例1]
各種細胞株、異種移植物、及正常組織中之ASCT2基因之表現分析(1)皮下移植至SCID小鼠之異種移植物之製作及腫瘤塊之製備藉由以下所示之方法，將人類癌細胞株皮下移植至SCID小鼠中，製作異種移植物。自所獲得之該異種移植物摘取腫瘤塊而製備。
將源自人類胰腺癌細胞株[ASPC-1(ATCC編號：CRL-1682)、CaPan-1(ATCC編號：HTB-79)、PANC-1(ATCC編號：CRL-1469)]、人類大腸癌細胞株[Colo205(理研Cellbank編號：RCB2127)、HT-29(ATCC編號：HTB-38)、LS180(ATCC編號：CCL-187)、SW1116(ATCC編號：CCL-233)、WiDr(ATCC編號：CCL-218)]之細胞以濃度成為約1×108 個/mL之方式懸浮於PBS中，將各自之細胞懸浮液100 μL移植至Fox CHASE C. B-17/Icr-scid Jcl小鼠(雄性，5週齡，CLEA Japan公司製造)各4隻之腹側部皮下。各細胞係使用懸浮於含有10%之非活化胎牛血清(Invitrogen公司製造)之RPMI1640培養基(Invitrogen公司製造)中進行繼代培養而成者，培養係於37℃下，於CO2 培養箱內進行。所獲得之異種移植物分別為xASPC1、xCaPan1、xPANC1、xColo205、xHT29、xLS180、xSW1116、xWiDr。腫瘤移植後，每天用游標卡尺測定腫瘤徑，將長徑達到1 cm左右之個體依次於麻醉下放血處死後，摘取腫瘤塊。將各腫瘤塊切成4份後，使用液氮進行急速冷凍，並保存於-80℃之冷凍器內。
(2)全RNA之萃取與聚腺苷酸(+)RNA之純化藉由以下所示之方法，自細胞株及(1)中所製作之異種移植物之腫瘤塊萃取全RNA，而純化聚腺苷酸(+)RNA。作為細胞株，係使用源自血癌之細胞株{KG-1(ATCC編號：CCL-246)、THP-1(ATCC編號：TIB-202)、HL-60(ATCC編號：CCL-240)[以上為源自急性骨髓性白血病(AML)之細胞株]、CCRF-CEM(ATCC編號：CCL-119)、CCRF-SB(ATCC編號：CCL-120)、Jurkat(ATCC編號：TIB-152)、HSB-2(ATCC編號：CCL-120)、HPB-ALL(理研Cellbank編號：RCB1935)[以上為源自急性淋巴性白血病(ALL)之細胞株]、K-562(ATCC編號：CCL-243)、KU812(ATCC編號：CRL-2099)[以上為源自慢性骨髓性白血病(CML)之細胞株]、KMS-11(HSRRB編號：JCRB1179)、ARH-77(ATCC編號：CRL-1621)、IM-9(ATCC編號：CCL-159)、RPMI8226(HSRRB編號：JCRB0034)、U266B1(ATCC編號：TIB-196)、MC/CAR(ATCC編號：CRL-8083)[以上為源自多發性骨髓瘤(MM)之細胞株]、HS-Sultan(ATCC編號：CRL-1484)、Daudi(ATCC編號：CCL-213)、Raji(ATCC編號：CCL-86)、Ramos(ATCC編號：CRL-1596)[以上為源自伯奇氏型淋巴瘤(BL)之細胞株]、U-937(ATCC編號：CRL-1593.2)、ML-1(DSMZ編號：ACC464)[以上為源自組織球性淋巴瘤(HS)之細胞株]}、源自肺癌之細胞株[PC-14(理研Cellbank編號：RCB0446)、PC-7(免疫生物研究所公司　製品編號：37011)、PC-9(免疫生物研究所公司　製品編號：37012)、PC-1(免疫生物研究所公司　製品編號：37008)(以上為非小細胞肺癌)、Lu-139(理研Cellbank編號：RCB0469)、NCI-H69(ATCC編號：HTB-119)、RERF-LC-MA(HSRRB編號：JCRB0812)、SBC-5(HSRRB編號：JCRB0819)(以上為小細胞肺癌)]、源自胃癌之細胞株[Kato III(理研Cellbank編號：RCB2088)、MKN-74(HSRRB編號：JCRB0255)、NUGC-4(理研Cellbank編號：RCB1939)、AZ-521(HSRRB編號：JCRB0061)]、源自大腸癌之細胞株{Colo205(理研Cellbank編號：RCB2127)、HT-29(ATCC編號：HTB-38)、LS174T[European Collection of Cell Cultures(ECACC)編號：87060401]、LS180(ATCC編號：CCL187)、SW1116(ATCC編號：CCL-233)}、源自胰腺癌之細胞株[ASPC-1(ATCC編號：CRL-1682)、BXPC-3(ATCC編號：CRL-1687)、CaPan-1(ATCC編號：HTB-79)]、源自惡性黑色素瘤(melanoma)之細胞株[G-361(ATCC編號：CRL-1424)、HMV-1(理研Cellbank編號：RCB0004)、SK-MEL-28(ATCC編號：HTB-72)]、源自正常肺之纖維母細胞[MRC-5(ATCC編號：CCL-171)]。
源自細胞株之全RNA之萃取係藉由以下方式進行。於採用接著系細胞株之情形時，使用抽氣器除去培養基，利用適當量之PBS進行清洗後，使用矽製之刮刀回收細胞。向培養盤中之每10 cm2 之細胞添加1 mL之TRIzol試劑(Invitrogen公司製造)，充分地進行懸浮而將細胞粉碎。進而，將所獲得之細胞粉碎液通過18G注射針10次，將基因組DNA粉碎。
於採用浮動系細胞株之情形時，係使用冷卻離心機(日立工機公司製造，Himac CF15R，轉子：T11A21)，以1500 rpm離心分離5分鐘，藉由傾析法除去培養基後，將細胞懸浮於PBS中，再次使用冷卻離心機(日立工機公司製造，Himac CF15R，轉子：T11A21)，以1500 rpm離心分離5分鐘，回收細胞。向所獲得之細胞中，每1×107 個細胞添加1 mL之TRIzol試劑(Invitrogen公司製造)，充分地懸浮使細胞粉碎。進而，將所獲得之細胞粉碎液通過18G注射針10次，使基因組DNA粉碎。(1)中製備之異種移植物之腫瘤塊之粉碎及全RNA萃取係藉由以下方式進行。將冷凍之腫瘤塊投入至TRIzol試劑(Invitrogen公司製造)10 mL中，立即使用Polytron均質機(Kinematica公司製造，PT2100)，以30000 rpm粉碎15秒鐘。
使用冷卻離心機(日立工機公司製造，Himac CF15R，轉子：T11A21)，以11000 rpm對所獲得之細胞粉碎液進行10分鐘之離心分離，一邊注意不取得沈澱，一邊將上清液移至新管中。於所獲得之上清液中添加氯仿2 mL，激烈振盪15秒鐘，於室溫下靜置2~3分鐘後，以冷卻離心機(日立工機公司製造，Himac CF7D2，轉子：RT3S3)，於4℃下，以3000 rpm進行90分鐘之離心分離。將上清液移至新管中，添加異丙醇5 mL，緩慢混合，於室溫下靜置10分鐘後，以冷卻離心機(日立工機公司製造，Himac CF15R，轉子：T11A21)，以11000 rpm進行10分鐘之離心分離，除去上清液後，添加75%乙醇水溶液10 mL，並加以混合，進而以冷卻離心機(日立工機公司製造，Himac CF15R，轉子：T11A21)，以11000 rpm進行5分鐘之離心分離，獲得沈澱。將所獲得之沈澱溶解於適當量之RNase-free water中，成為全RNA樣本。利用吸光光度計測定全RNA樣本之濃度，確認A260/A280之比成為1.7以上。於A260/A280之比未達1.7之情形時，進而使用RNeasy試劑盒(Qiagen公司製造)進行純化。
針對所獲得之全RNA樣本400 μg，使用MicroPoly(A)純化試劑盒(Ambion公司製造)並依據隨附說明書，純化聚腺苷酸(+)RNA。(3)cDNA之合成使用RT-PCR用SuperScript First-Strand Synthesis System(Invitrogen公司製造)，由(2)中所獲得之聚腺苷酸(+)RNA或源自市售組織之mRNA合成cDNA。
源自人類之正常組織(肝臟、肺、全腦、心臟、胃、脾臟、脊髓、小腸、骨骼肌、子宮、氣管、甲狀腺、胸腺、睪丸、唾液腺、攝護腺、胎盤、淋巴結、胰腺、大腸、血液、或腎臟)之mRNA係使用市售mRNA(Clontech公司製造)。
又、源自人類之臨床癌組織(肺癌、胃癌、大腸癌、腎癌、肝臟癌、子宮癌、乳癌、或食道癌)之mRNA亦使用市售RNA(BioChain公司製造)。相對於(2)中所獲得之聚腺苷酸(+)RNA或源自市售組織之mRNA(1 μg)，添加dNTP混合溶液(10 mmol/L，1 μL)、及Oligo(dT)12-18 (0.5 μg/μL，1 μL)，添加DEPC水使總量成為7 μL。
於65℃下加熱變性5分鐘後，於冰上急冷，靜置1分鐘以上之後，添加10×RT緩衝液(2 μL)、氯化鎂(25 mmol/L，4 μL)、DTT(0.1 mol/L，2 μL)、及RNaseOUT重組核酸酶抑制劑(1 μL)，於42℃下保溫2分鐘。進而添加SuperscriptII RT(1 μL)，於42℃下進行50分鐘之逆轉錄反應，繼而於70℃下加熱15分鐘，使酶失活。其後，於反應液中添加E. coli RNase H(1 μL)，於37℃下反應20分鐘後，添加DEPC水使總量成為1 mL。以下，即時PCR之反應系係使用將其進一步稀釋5倍之溶液10 μL。
(4)藉由即時PCR法(定量PCR法、Q-PCR法)之細胞株、異種移植物之腫瘤塊及正常組織中之ASCT2基因之mRNA表現量之定量向10 μL(3)中所獲得之cDNA[作為聚腺苷酸(+)RNA量相當於2 ng]中，添加由序列編號1設計而成之包含序列編號3所表示之序列之ASCT2基因之cDNA檢測用前置引子(Fw#1)及含有序列編號4所表示之序列之ASCT2基因之cDNA檢測用反置引子(Rv#1)(均為Proligo公司製造)，使各自之最終濃度達到300 nmol/L，進而添加10×R-PCR緩衝液(無Mg2+ )(Takara Bio公司製造，2 μL)、Mg2+ 溶液(250 mmol/L，0.2 μL)、dNTP混合物(10 mmol/L，0.6 μL)、Ex Taq R-PCR(以上為Takara Bio公司製造，0.2 μL)、及SYBR Green I(BMA公司製造，製品原液稀釋2500倍而成者，1 μL)，添加DEPC水使總量成為20 μL。
PCR反應係藉由如下方式實施：最初於94℃下用5分鐘，使Taq DNA聚合酶活化及將模板DNA變性，其後以94℃下30秒鐘之變性步驟、65℃下30秒鐘之退火步驟、繼而72℃下30秒鐘之DNA延伸反應步驟，以該等3個步驟為1個循環，共進行45個循環。使用PRISM7700(Applied Biosystems公司製造)測定嵌入擴增產物中之SYBR Green I所發出之螢光強度，藉由作為上述PRISM7700附帶之軟體Sequence detector ver.1.7a進行資料分析。
藉由即時PCR反應所獲得之訊號是否為目標擴增片段係將反應完畢後之反應液供於瓊脂糖凝膠電泳，根據主要擴增片段之尺寸進行判斷。再者，上述即時PCR反應係使用96孔之PCR培養盤而進行。
對於PCR培養盤之各孔之受檢體，係配置含有上述cDNA之反應液、陰性對照(殺菌水)及如下之校準曲線製作用標準品(1×10~1×106 複製/孔)而進行，該校準曲線製作用標準品係使用利用Qiagen Plasmid Midi Kit(Qiagen公司製造)進行純化之編碼ASCT2之部分片段的質粒HCHON2001712[Homo sapiens cDNA FLJ43232fis，日本DNA資料庫(DDBJ)存取編號：AK125222]而製作。
作為ASCT2之標準序列之NM_005628(序列編號1，GenBank存取編號：NM_005628)與用作校準曲線製作用模板之質粒HCHON2001712之全長序列之比對示於圖1(A)~(D)。NM_005628與HCHON2001712之全長序列之間存在不同部位，但ASCT2之表現量測定所使用之含有序列編號3所表示之序列之cDNA檢測用前置引子(Fw#1)及含有序列編號4所表示之序列之cDNA檢測用反置引子(Rv#1)均使用NM_005628與HCHON2001712之序列完全一致的部分進行設計。
將以如此方式獲得之細胞株、異種移植物之腫瘤塊及正常組織中之ASCT2基因之mRNA表現量的結果示於圖2(A)~(B)。mRNA表現量係以每2 ng聚腺苷酸(+)RNA之ASCT2表現分子數、及正常組織中表現最高之氣管的ASCT2基因表現量為1之情形時的相對比值來表示。如圖2(A)~(B)所示，於源自血癌之細胞株之KG-1(源自AML之細胞株)、HSB-2(源自ALL之細胞株)、K-562(源自CML之細胞株)、KMS-11、ARH-77(以上為源自MM之細胞株)中可見正常氣管之10倍以上之表現亢進，於Jurkat(源自ALL之細胞株)、IM-9、RPMI8226(以上為源自MM之細胞株)、HS-Sultan(源自BL之細胞株)、ML-1(源自HL之細胞株)中可見5倍以上之表現亢進，於THP-1(源自AML之細胞株)、CCRF-CEM(源自ALL之細胞株)、KU812(源自CML之細胞株)、Raji(源自BL之細胞株)、U-937(源自HS之細胞株)以及胃癌組織、食道癌組織中可見2倍以上之表現亢進。
[實施例2]
人類ASCT2-myc/His基因導入CHO細胞株之製作藉由以下所示之方法，取得含有序列編號5記載之基因序列及序列編號6記載之胺基酸序列之質粒pCR4-SLC1A5-myc/His，使用該質粒，取得人類ASCT2-myc/His基因導入CHO細胞株。
於具有序列編號7至10之鹼基序列之引子(10 μmol/L，各1 μL)中添加10×Ex Taq緩衝液(10 μL)、dNTP混合液(2 mmol/L，10 μL)、及Ex Taq聚合酶(以上為Takara Bio公司製造，1 μL)，進而添加殺菌水使總量成為100 μL。
以與實施例1(C)中所記載之方法相同之方式，進行如下PCR反應：於96℃下反應2分鐘後，以96℃下1分鐘、60℃下1分鐘、及72℃下1分鐘，以該等3個步驟為1個循環，共進行35個循環，而合成人類ASCT2基因之轉譯起點之鹼基為1時之1位至370位的基因序列(以下，記為N-SLC1A5)。
藉由瓊脂糖凝膠電泳將反應產物分離，使用QIAquick Gel萃取試劑盒(Qiagen公司製造)，萃取所獲得之約0.4 kb之擴增片段，使用TOPO TA選殖試劑盒(Invitrogen公司製造)，於pCR4 TOPO載體中選殖(以下，記為pCR4-N-SLC1A5)。
其次，以含有人類ASCT2基因之質粒HCHON2001712(DDBJ存取編號：AK125222)10 ng作為模板，添加具有序列編號11及序列編號12記載之鹼基序列之引子(10 μmol/L，分別為1 μL)、10×Ex Taq緩衝液(10 μL)、dNTP混合液(2 mmol/L，10 μL)、及Ex Taq聚合酶(以上為Takara Bio公司製造，1 μL)，進而添加殺菌水使總量成為100 μL。
於與上述相同之反應條件下進行PCR反應，合成編碼人類ASCT2基因之365位至1623位之基因序列的C末端附加有myc/His之融合蛋白質的基因序列(以下記為C-SLC1A5-myc/His)。藉由瓊脂糖凝膠電泳將反應產物分離，使用QIAquickGel萃取試劑盒(Qiagen公司製造)萃取所獲得之約1.2 kb的擴增片段。
以所獲得之萃取片段作為模板，添加具有序列編號11及序列編號13記載之鹼基序列之引子(10 μmol/L，分別為1 μL)、10×Ex Taq緩衝液(10 μL)、dNTP混合液(2 mmol/L，10 μL)、及Ex Taq聚合酶(以上為Takara Bio公司製造，1 μL)，進而添加殺菌水，使總量成為100 μL。於與上述相同之反應條件下進行PCR反應，於C-SLC1A5-Myc/His之C末端附加NotI及SpeI限制酶位點。
藉由瓊脂糖凝膠電泳分離所獲得之反應產物，使用QIAquick Gel萃取試劑盒(Qiagen公司製造)萃取所獲得之約1.2 kb之擴增片段，使用TOPO TA選殖試劑盒(Invitrogen公司製造)，於pCR4 TOPO載體中選殖(以下，記為pCR4-C-SLClA5-myc/His)。所獲得之基因序列係將序列編號1記載之序列與轉譯起點之鹼基為1時之第1455號之T置換為C，但未見胺基酸變異。
利用BssHII(Takara Bio公司製造)及SpeI(Takara Bio公司製造)消化所獲得之pCR4-N-SLClA5，藉由瓊脂糖凝膠電泳進行分離，使用QIAquick Gel萃取試劑盒(Qiagen公司製造)萃取所獲得之約4.4 kb之基因片段。
同樣地，利用BssHII(Takara Bio公司製造)及SpeI(Takara Bio公司製造)消化所獲得之pCR4-C-SLClA5-myc/His，萃取約1.4 kb之基因片段。使用Ligation high(東洋紡織公司製造)將各自之萃取片段連接後，藉由Cohen等人之方法[Proc. Natl. Acad. Sci. USA,69,2110(1972)]將大腸桿菌DH5α株(東洋紡織公司製造)進行轉形。
使用自動質粒萃取機PI-50(Kurabo公司製造)，自所獲得之轉形體萃取質粒，取得含有序列編號5所記載之基因序列與序列編號6記載之胺基酸序列之質粒pCR4-SLClA5-myc/His。
利用EcoRI(Takara Bio公司製造)及KpnI(Takara Bio公司製造)消化所獲得之pCR4-SLClA5-myc/His，藉由與上述相同之方式萃取基因片段，取得含有編碼人類ASCT2基因之C末端附加有myc/His之融合蛋白質的基因序列(以下，記為SLC1A5-myc/His)之片段。
將所獲得之包含SLC1A5-myc/His之片段預先與利用EcoRI(Takara Bio公司製造)及KpnI(Takara Bio公司製造)消化之pKANTEX93載體(WO 97/10354)連接，藉由與上述相同之方式，將大腸桿菌DH5α株(東洋紡織公司製造)轉形，獲得轉形體後，使用質粒萃取試劑盒(Qiagen公司製造)，取得表現質粒pKANTEX-SLC1A5-myc/His。
pKANTEX-SLC1A5-myc/His係藉由電穿孔法[Cytotechnology,3,133(1990)]，藉由以下之方式導入至CHO/DG44細胞[Somatic Cell and Molecular Genetics,12,555(1986)]中。
細胞係使用於如下培養基中進行繼代而成者，該培養基係於添加有10% FBS(Life Technologies公司製造)及建大黴素(Nacalai Tesque公司製造，50 μg/mL)之IMDM培養基(Invitrogen公司製造)(以下，記為A3培養基)中添加有1×HT添加物(Invitrogen公司製造)者。
將CHO/DG44細胞懸浮於含有氯化鉀(137 nmol/L)、氯化鈉(2.7 nmol/L)、磷酸氫二鈉(8.1 mmol/L)、磷酸二氫鈉(1.5 nmol/L)及氯化鎂(4 mmol/L)之緩衝液(以下記為K-PBS)中，成為8×106 個/mL，將所獲得之細胞懸浮液(200 μL，細胞數為1.6×106 個)與表現質粒pKANTEX-SLC1A5-myc/His(10 μg)混合。
將所獲得之混合液移至比色管(電極間距2 mm)中，使用GenePulserII(Bio-Rad公司製造)，於脈衝電壓0.35 kV、電氣容量250 μF之條件下進行基因導入。將比色管於冰上靜置後，將比色管中之細胞懸浮液懸浮於含有A3培養基之細胞培養用容器中，於37℃下，於5% CO2 培養箱中進行培養。
培養4天後，將培養基換成添加有G418(Nacalai Tesque公司製造，0.5 mg/mL)之A3培養基，繼續培養。中途更換培養基並進行繼代，自基因導入約2週後，取得對G418具有耐性之轉形細胞株。
以每10 mL成為5個細胞數之方式，利用添加有G418(Nacalai Tesque公司製造，0.5 mg/mL)之A3培養基稀釋對所獲得之G418有耐性之轉形細胞，將所稀釋之細胞懸浮液分注至96孔培養盤中，每次100 μL，階段性地使甲胺喋呤濃度上升並進行處理，藉此選擇高度表現ASCT2-myc/His之純系，取得人類ASCT2-myc/His基因導入CHO細胞株。
將所獲得之人類ASCT2-myc/His基因導入CHO細胞(1×105 ~5×105 個)懸浮於70%乙醇-PBS(1 mL)中，於冰溫下固定30分鐘。以成為1×106 ~5×106 細胞/孔之方式分注至96孔U字培養盤中，以1500 rpm離心分離5分鐘後，除去上清液，利用1% BSA-PBS，於冰溫下阻斷30分鐘。
藉由離心分離除去上清液，以最終濃度分別成為1.0、0.1及0.1 μg/mL之方式，利用1% BSA-PBS稀釋抗myc抗體PL14(醫學生物學研究所製造)、抗His抗體(Qiagen公司製造)及小鼠IgG1同型對照(Dako公司製造)作為1次抗體，以100 μL/孔進行分注，於冰溫下反應60分鐘。
利用1% BSA-PBS清洗1次，以100 μL/孔添加利用1% BSA-PBS稀釋50倍之FITC標記抗小鼠免疫球蛋白G(H+L)(Dako公司製造)作為2次抗體，於冰溫下，於遮光下反應30分鐘。
再次利用1% BSA-PBS清洗1次，懸浮於PBS中，利用流式細胞儀(Cytomics FC500 MPL，Beckman Coulter公司製造)測定螢光強度。將結果示於圖3。
如圖3所示，由於檢測出對抗myc抗體及抗His抗體較高之反應性，因此確認製作出目標人類ASCT2-myc/His基因導入CHO細胞株。
[實施例3]
針對ASCT2之N末部分肽之單株抗體之製作(1)免疫原之製備為了與載體蛋白質結合，而使用自動合成機(PSSM-8，島津製作所公司製造)合成序列編號14所記載之人類ASCT2之N末部分序列(自N末端起第2號至第16號之胺基酸)的C末端附加有Cys的N末部分肽。
為了提高免疫原性，而藉由以下方法製作與KLH(和光純藥公司製造)之結合體作為免疫原。即，使KLH溶解於PBS中，製備成10 mg/mL，滴加1/10容量之N-(間馬來醯亞胺苯甲醯氧基)丁二醯亞胺(MBS，Nacalai Tesque公司製造，25 mg/mL)後，攪拌30分鐘並進行反應。
將反應液通過預先以PBS平衡化之凝膠過濾管柱(凝膠過濾層析管柱G-25管柱，GE healthcare公司製造)，除去未反應之MBS，獲得KLH-MBS。將附加有Cys之人類ASCT2之N末部分肽(1 mg)溶解於磷酸鈉緩衝液(0.1 mol/L，pH值7.0)中，添加KLH-MBS(2.5 mg)，於室溫下進行3小時之攪拌反應。反應後，以PBS透析，獲得作為免疫原之人類ASCT2之N末肽-KLH結合體。
(2)動物之免疫與抗體產生細胞之製備將(1)中所獲得之人類ASCT2之N末肽-KLH結合體(100 μg)與鋁凝膠(2 mg)及百日咳疫苗(千葉縣血清研究所製造，1×109細胞)一併投予給4週齡雌SD大鼠(日本SLC公司製造)，進而初次投予2週後1週1次投予結合體(100 μg)共計投予4次。自尾靜脈採血，藉由以下所示之酶免疫測定法檢查對於人類ASCT2部分肽之反應性，於最終免疫3天後自顯示出充分之抗體效價之大鼠摘取脾臟。將脾臟於MEM培養基(日水製藥公司製造)中切細，以鑷子擢碎，以1200 rpm，離心分離5分鐘(CR5B，日立製作所公司製造)。於所獲得之沈澱組分中添加三-氯化銨緩衝液(pH值7.65)，處理1~2分鐘，藉此除去紅細胞。利用MEM培養基，將以沈澱組分之形式獲得之細胞組分清洗3次，製備抗體產生細胞。
(3)酶免疫測定法作為分析用抗原，藉由以下方法製作附加有序列編號14所記載之Cys之人類ASCT2之N末部分肽與甲狀腺球蛋白(以下記為THY)之結合體。結合體之製作方法與(1)相同，但使用4-[N-馬來醯亞胺甲基]-環己烷-1-羧酸丁二醯亞胺酯(SMCC，西格瑪公司)代替MBS。
於96孔EIA用培養盤(Greiner公司製造)中分注所獲得之人類ASCT2之N末肽-THY結合體(10 μg/mL，50 μL/孔)，於4℃下放置一晚使其吸附。洗去未吸附之結合體後，添加1% BSA-PBS(100 μL/孔)，於室溫下反應1小時，將剩餘之活性基阻斷。洗去未反應之BSA-PBS後，以50 μL/孔分注抗血清或培養上清液等受檢物質作為1次抗體，並反應2小時。利用0.05% tween-PBS進行清洗後，添加經稀釋之過氧化酶標記抗大鼠免疫球蛋白(Dako公司，50 μL/孔)作為2次抗體，於室溫下反應1小時。
利用0.05% tween-PBS進行清洗後，添加2,2-聯氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)銨(ABTS)受質液[ABTS(和光純藥公司製造，1 mmol/L)、檸檬酸緩衝液(0.1 mol/L，pH值4.2)、過氧化氫(0.1%)]進行顯色，使用盤式儀(Emax microplate reader，Molecular Device公司)測定樣本波長415 nm、參考波長490 nm下之吸光度(OD415-OD490)。(4)小鼠骨髓瘤細胞之製備將8-氮鳥嘌呤耐性小鼠骨髓瘤細胞株P3-U1[P3X63Ag8U.1，ATCC編號：CRL-1597，European Journal of Immunology,6,511(1976)]於RPMI1640培養基(Invitrogen公司製造)中添加有麩醯胺(1.5 mmol/L)、2-巰基乙醇(5×10-5 mol/L)、建大黴素(10 μg/ml)及FBS(10%)之培養基(以下，記為正常培養基)中進行培養，確保細胞融合時所必需之細胞數(2×107 個以上)，並將其作為母株供於細胞融合。
(5)融合瘤之製作將(2)中所獲得之抗體產生細胞與(4)中所獲得之骨髓瘤細胞以成為10：1之方式混合，以1200 rpm離心分離5分鐘(CR5B，日立製作所公司製造)後，去除上清液，將沈澱之細胞群充分擢碎後，一邊攪拌一邊於37℃下向每1×108 個抗體產生細胞添加0.5 mL之PEG-1000(1 g)、MEM培養基(Invitrogen公司製造，1 mL)及二甲基亞碸(0.35 mL)之混合液。
每1~2分鐘向上述懸浮液中添加MEM培養基(1 mL)，添加數次後，添加MEM培養基，使總量成為50 mL。以900 rpm離心分離5分鐘(CR5B，日立製作所公司製造)後，去除上清液，緩慢將細胞擢碎後，利用移液管吸入並滴加，緩慢地將細胞懸浮於向正常培養基中添加有HAT Media Supplement(Invitrogen公司製造)之培養基(以下，記為HAT培養基，100 mL)中。
將所獲得之懸浮液以200 μL/孔分注至96孔培養用培養盤中，於5% CO2 培養箱中，於37℃下培養10~14天。使用培養後之培養上清液，進行(3)中所記載之酶免疫測定，選擇特異地與人類ASCT2之N末部分肽反應的孔。由所選擇之孔中所含細胞藉由極限稀釋法進行選殖，重複2次，取得產生針對ASCT2之N末部分肽之單株抗體的融合瘤KM3842。使用亞型分型試劑盒(ABD Serotec公司製造)確定KM3842之抗體型為大鼠IgG2a。(6)純化單株抗體之取得將(5)中所獲得之融合瘤(5×106~20×106個/隻)分別注射至經異十九烷處理之8週齡裸雌小鼠(Balb/c，日本SLC公司製造)之腹腔內。10~21天後，融合瘤腹水癌化。自腹水蓄積之小鼠採集腹水(1~8 mL/隻)，以3000 rpm離心分離5分鐘(CR5B，日立製作所公司製造)，除去固形物成分後，藉由辛酸沈澱法[Antibodies-A Laboratory manual,Cold Spring Harbor Laboratory(1988)]進行純化，取得KM3842純化抗體。
[實施例4]單株純化抗體對ASCT2之N末部分肽之反應性研究藉由實施例3(3)中所記載之酶免疫測定法，研究單株抗體KM3842對ASCT2之N末部分肽之反應性。使用利用1%BSA-PBS將實施例3(6)中所獲得之KM3842純化抗體分別稀釋至10、1、0.1、0.01、0.001、及0.0001 μg/mL而獲得者作為1次抗體。測定結果如圖4所示，KM3842對ASCT2之N末部分肽顯示出特異性之反應性。
[實施例5]針對ASCT2之細胞外區域之單株抗體的製作(1)免疫原之製備將實施例2中所獲得之人類ASCT2-myc/His基因導入CHO細胞株於含有10% FBS之IMDM培養基(Invitrogen公司)中培養2~3天，使用0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)溶液(Nacalai Tesque公司製造)進行剝離。以每隻免疫動物成為6×106 ~1×107 個之細胞數之方式懸浮於PBS中。(2)動物之免疫及抗體產生細胞之製備將(1)中所獲得之細胞懸浮液與百日咳疫苗(千葉縣血清研究所製造，1×109細胞)一併投予給6週齡雄BXSB小鼠(日本SLC公司製造，3隻/1群)或4週齡雌SD大鼠(日本SLC公司製造，3隻/1群)。投予1週後，每週1次總計投予4次，投予後，自該小鼠之眼底或該大鼠之尾靜脈進行部分採血。
藉由以下所示之使用細胞分析系統(ABI 8200蜂巢式偵測系統，Applied Biosystems公司製造)或流式細胞儀(Cytomics FC500 MPL，Beckman Coulter公司製造)之螢光細胞染色法，測定上述血漿抗體效價，於最終免疫3天後自顯示出充分抗體效價之小鼠或大鼠摘取脾臟。藉由與實施例3(B)相同之方式，由所獲得之脾臟製備抗體產生細胞。
(3)螢光細胞染色法-1(細胞分析系統)分析用細胞係所使用實施例2中所獲得之ACST2-myc/His基因導入CHO細胞株及載體導入CHO細胞。將各自之細胞於含有10% FBS之IMDM培養基(Invitrogen公司製造)中培養2~3天，將以胰蛋白酶-EDTA溶液(Invitrogen公司製造)剝離之細胞懸浮於IMDM培養基中，於ABI 8200用黑色96孔培養盤中每1孔接種1×104 個細胞(100 μL)，培養一晚。
於該培養盤中，分注抗血清或培養上清液等受檢物質(10 μL/孔)作為1次抗體，添加ALEXA647標記抗小鼠免疫球蛋白G(H+L)或ALEXA647標記抗大鼠免疫球蛋白G(H+L)(均為Invitrogen公司製造，100 μL/孔)作為2次抗體，於遮光下放置4小時。使用ABI 8200蜂巢式偵測系統(Applied Biosystems公司製造)測定由雷射光(633 nmHe/Ne)激發之650~685 nm之螢光。
(4)螢光細胞染色法-2(流式細胞儀)分析用細胞係使用實施例2中所獲得之人類ASCT2-myc/His基因導入CHO細胞株及載體導入CHO細胞株。將各自之細胞於含有10% FBS之IMDM培養基(Invitrogen公司製造)中培養2~3天。將以0.02% EDTA溶液(Nacalai Tesque公司製造)剝離之細胞利用PBS進行清洗，進而為了避免抗體之非特異性吸附，而使用1% BSA-PBS於冰溫下阻斷20分鐘。向96孔U字培養盤中之每1孔接種5×105 個細胞(50 μL)，以1800 rpm離心分離2分鐘(05PR-22，日立工機公司製造)後，除去上清液。
以50 μL/孔添加抗血清或培養上清液等受檢物質作為1次抗體，於冰溫下反應30分鐘。以使用PBS之離心分離法清洗3次後，添加ALEXA488標記抗小鼠免疫球蛋白G(G+L)或ALEXA488標記抗大鼠免疫球蛋白G(G+L)(均為Invitrogen公司製造，50 μL/孔)作為2次抗體，於冰溫下，於遮光下反應30分鐘。
再次使用PBS，藉由離心分離法清洗3次，懸浮於PBS中，使用流式細胞儀(Cytomics FC500 MPL，Beckman Coulter公司製造)測定由雷射光(488 nmAr)激發之510~530 nm之螢光。
(5)融合瘤之製作藉由與實施例3(5)相同之方式，進行(2)中所獲得之抗體產生細胞與實施例3(4)中所獲得之骨髓瘤細胞之細胞融合。
其次，將藉由細胞融合所獲得之細胞懸浮於HAT培養基中。將所獲得之細胞懸浮液以200 μL/孔分注至96孔培養用培養盤中，於5% CO2 培養箱中，於37℃下培養8~10天。藉由(3)及(4)中所記載之螢光細胞染色法確認培養後之培養上清液的反應性，選擇與人類ASCT2-myc/His基因導入CHO細胞株反應且不與載體導入CHO細胞反應之孔。藉由極限稀釋法由所選擇之孔中所含之細胞進行選殖，重複2次，取得產生針對ASCT2之細胞外區域的單株抗體之融合瘤KM3998、KM4000、KM4001、KM4008、KM4012及KM4018。
所獲得之融合瘤中，小鼠單株抗體之亞型係藉由以下方法確定。
於96孔EIA用培養盤(Greiner公司製造)中分注抗小鼠免疫球蛋白‧兔多株抗體(Dako公司，10 μg/mL，50 μL/孔)，於4℃下放置一晚使其吸附。洗去未吸附之結合體後，添加1% BSA-PBS(100 μL/孔)，於室溫下反應1小時，而將殘留之活性基阻斷。
洗去未反應之BSA-PBS後，分注50 μL/孔之受檢物質，反應2小時。利用0.05% tween-PBS進行清洗後，添加經稀釋之亞型特異性過氧化酶標記抗小鼠免疫球蛋白(Invitrogen公司，50 μL/孔)作為2次抗體，於室溫下反應1小時。利用0.05% tween-PBS進行清洗後，添加實施例3(3)中所使用之ABTS受質液，使其顯色，使用盤式儀(Emax microplate reader，Molecular Device公司)測定樣本波長415 nm、參考波長490 nm之吸光度(OD415-OD490)。無法以上述方法確定亞型之小鼠單株抗體，係使用小鼠大鼠單株同型試劑盒(大日本住友製藥公司製造)來確定亞型。又，大鼠單株抗體之亞型係使用大鼠單株同型試劑盒(大日本住友製藥公司製造)來確定。將各融合瘤之動物種類及抗體型一覽示於表1。
(6)純化單株抗體之取得-1
KM3998之純化抗體係藉由以下方法取得。將(5)中所獲得之融合瘤(5×106 ~20×106 個/隻)分別注射至經異十九烷處理之8週齡裸雌小鼠(Balb/c，日本SLC公司製造)之腹腔內。10~21天後，融合瘤腹水癌化。自腹水蓄積之小鼠採集腹水(1~8 mL/隻)，進行過濾[Poul公司製造，5 μm，聚醚碸(PES)膜]而除去固形物成分後，藉由辛酸沈澱法[Antibodies-A Laboratory manual,Cold Spring Harbor Laboratory(1988)]進行純化。(7)純化單株抗體之取得-2 KM4000、KM4001、KM4008、KM4012或KM4018之純化抗體分別藉由以下方法取得。
將(5)中所獲得之各融合瘤於添加有10% FBS之RPMI1640中，於5% CO2 培養箱中，於37℃下進行培養。於細胞數達到5×107 個細胞時，以1200 rpm離心分離5分鐘(CR5B，日立製作所公司製造)，並除去上清液。將所獲得之細胞懸浮於添加有5% Daigo GF21(和光純藥製造)之Hybridoma SFM培養基(Gibco公司製造)中，製備為細胞數1×105 個/mL且總量為500 mL，於5% CO2 培養箱中，於37℃下培養3天。將所獲得之細胞懸浮液以1500 rpm離心分離5分鐘，使用瓶蓋過濾器(康寧公司製造，0.2 μm，PES膜)過濾所獲得之上清液。
KM4000、KM4001、KM4008及KM4012係使用蛋白A結合樹脂(Millipore公司製造)進行純化，KM4018係使用蛋白G結合樹脂(Millipore公司製造)進行純化。將各樹脂封裝於1 mL迷你管柱中，通過10 mL之平衡化緩衝液使其平衡化。
作為平衡化緩衝液，蛋白A結合樹脂係使用甘胺酸(1 mol/L)-氯化鈉(0.15 mol/L)(pH值8.6)，蛋白G結合樹脂係使用甘胺酸(0.5 mol/L)-PBS(pH值7.4)。將經過濾處理所獲得之培養上清液，以流速約100 mL/小時通過管柱後，以平衡化緩衝液10 mL清洗管柱。其次，使用檸檬酸緩衝液(0.1 mol/L，pH值3.0)，使吸附於管柱之抗體溶出。每次取500 μL溶出之抗體，添加至於預先加入有80 μL三(2 mol/L，pH值8.0)之試管中。使用紫外可見分光光度計(UV-1600，島津製作所公司製造)測定各管之OD280 nm，將檢測出蛋白質之組分加以回收。以PBS於4℃下徹夜透析後，進行過濾(Poul公司製造，0.2 μm，PES膜)，根據OD280 nm算出抗體濃度[OD280 nm測定值(A)/1.4=蛋白質濃度(mg/mL)]。[實施例6]單株純化抗體對ASCT2之細胞外區域的反應性研究(1)螢光細胞染色法(流式細胞儀)將實施例2中所獲得之人類ASCT2-myc/His基因導入CHO細胞、載體導入CHO細胞、及多發性骨髓瘤細胞株KMS-11(HSRRB編號：JCRB1179)分別於5% CO2 培養箱中，於37℃下培養3~4天。
人類ASCT2-myc/His基因導入CHO細胞及載體導入CHO細胞係以0.02% EDTA溶液(Nacalai Tesque公司製造)剝離，以PBS、0.02% EDTA及0.05%疊氮化鈉之混合溶液進行清洗。進而，為了避免抗體之非特異性吸附，人類ASCT2-myc/His基因導入CHO細胞及載體導入CHO細胞係使用1% BSA-PBS於冰溫下阻斷30分鐘，又，KMS-11係使用人類IgG(西格瑪公司，100 μg/mL)，於冰溫下阻斷30分鐘。
向96孔U字培養盤之每1孔中接種1×105 ~5×105 個細胞(100 μL)，以1500 rpm離心分離5分鐘(05PR-22，日立工機公司製造)後，除去上清液。利用1% BSA-PBS、0.02% EDTA及0.05%疊氮化鈉之混合溶液(以下，記為稀釋用溶液A)，以最終濃度成為10 μg/mL稀釋作為受檢物質之純化抗體及大鼠IgG2a-UNLB(陰性對照，Beckman Coulter公司製造)或KM511{陰性對照，抗G-CSF衍生物抗體，[Agric. Biol. Chem.,53,1095(1989)]、小鼠IgG1}作為1次抗體，以100 μL/孔進行添加，於冰溫下反應60分鐘。以稀釋用溶液A清洗2次後，添加以稀釋用溶液A稀釋之ALEXA488標記抗小鼠免疫球蛋白G(G+L)(Invitrogen公司製造，100 μL/孔)或ALEXA488標記抗大鼠免疫球蛋白G(G+L)(Invitrogen公司製造，100 μL/孔)、或FITC標記抗小鼠kappa-chain抗體(Southern Biotech公司製造，100 μL/孔)或FITC標記抗大鼠kappa-chain抗體(Southern Biotech公司製造，100 μL/孔)作為2次抗體，於冰溫下，於遮光下反應30分鐘。
再次利用稀釋用溶液A清洗3次，懸浮於PBS中，利用流式細胞儀(Cytomics FC500 MPL，Beckman Coulter公司製造)測定螢光強度。將測定結果示於圖5及圖6。如圖5所示，KM3998對人類ASCT2-myc/His基因導入CHO細胞及表現ASCT2mRNA之KMS-11顯示出較強之結合性，但對載體導入CHO細胞完全未顯示結合性。又，陰性對照抗體大鼠IgG2a-UNLB對任一細胞均未顯示結合性。由該結果顯示，KM3998對ASCT2表現細胞具有特異性之結合性。
又，如圖6所示，KM4000、KM4001、KM4008、KM4012及KM4018對人類ASCT2-myc/HiS基因導入CHO細胞及表現ASCT2mRNA之KMS-11顯示出較強之結合性(平均螢光強度)，而對載體導入CHO細胞完全未顯示結合性。又，陰性對照抗體大鼠IgG2a-UNLB及KM511對任一細胞均未顯示結合性。由該結果顯示，KM4000、KM4001、KM4008、KM4012、KM4018對ASCT2表現細胞具有特異性之結合性。
(2)西方墨點法於實施例2中所獲得之人類ASCT2-myc/HiS基因導入CHO細胞、載體導入CHO細胞、多發性骨髓瘤細胞株KMS-11(HSRRB編號：JCRB1179)及大腸癌細胞株WiDr(ATCC編號：CCL-218)中，分別向每5×107 個細胞添加1 mL之Tris-HCl(50 mmol/L，pH值7.2)、1% Triton×100、氯化鈉(150 mmol/L)、氯化鎂(2 mmol/L)、氯化鈣(2 mmol/L)、0.1%疊氮化鈉、苯甲基磺醯氟(PMSF，5 μmol/L)、N-乙基馬來醯亞胺(50 mmol/L)、亮抑酶肽(1 mg/ml)及二硫代蘇糖醇(0.1 mmol/L)之混合溶液(以下，記為細胞溶解用緩衝液A)，於4℃下放置2小時後，進行離心分離，將所獲得之上清液作為細胞溶解液。使用SDS-聚丙烯醯胺電泳(PAGEL，Atto公司製造)，每1條泳道分配5×104 個細胞分之各細胞溶解液，轉印至PVDF膜(Millipore公司製造)上。利用10% BSA-PBS將所轉印之該PVDF膜阻斷。其後，以分別成為10 μg/mL之方式，利用1% SSA-PBS稀釋受檢物質即純化抗體、實施例3中所獲得之KM3842(陽性對照)、大鼠IgG2a-UNLB(陰性對照，Beckman Coulter公司製造)及KM511(陰性對照)作為1次抗體，於4℃下反應一晚。利用0.1% tween-PBS(以下記為PBST)充分清洗所獲得之PVDF膜，將過氧化酶標記抗小鼠免疫球蛋白G)H+L)(Zymet公司製造)或過氧化酶標記抗大鼠免疫球蛋白G(H+L)(Dako公司製造)作為2次抗體，於室溫下反應1小時。
再次將該PVDF膜利用PBST充分清洗，使用ECL西方墨點偵測試劑(Amersham Pharmacia公司製造)，檢測結合有抗體之條帶。其結果為，KM3842於人類ASCT2-myc/His基因導入CHO細胞、表現ASCT2mRNA之KMS-11細胞及WiDr細胞中，於相當於ASCT2之分子量的分子量75 kDa附近檢測出條帶。另一方面，KM3998、KM4000、KM4001、KM4008、KM4012及KM4018未檢測出ASCT2。又，於載體導入CHO細胞中，亦未見任一抗體之反應性。根據上述流式細胞儀及西方墨點法之結果，認為KM3998、KM4000、KM4001、KM4008、KM4012及KM4018對ASCT2之結合活性因ASCT2之SDS變性而失活，表示KM3998、KM4000、KM4001、KM4008、KM4012及KM4018係識別並結合ASCT2之天然型立體結構之抗體。(3)免疫沈澱法於實施例2中所獲得之人類ASCT2-myc/His基因導入CHO細胞、及載體導入CHO細胞中，分別向每2×107 個細胞添加1 mL之Tris-HCl(50 mmol/L，pH值7.5)、1%TritonX100、氯化鈉(150 mmol/L)、EDTA(5 mmol/L)、0.1% SDS、0.5%去氧膽酸鈉、蛋白酶抑制劑混合物(Protease inhibitor cocktail，Roche-Diagnostics公司製造)及磷酸酶抑制劑混合物(Phosphatase inhibitor cocktail，Roche-Diagnostics公司製造)之混合溶液(以下，記為細胞溶解用緩衝液B)。
於4℃下攪拌30分鐘後，進行離心分離(CF15D，日立工機公司製造)。藉由蛋白分析試劑(Bio-Rad公司製造)測定所獲得之上清液之蛋白質濃度，利用細胞溶解用緩衝液B將蛋白質濃度製備為5 mg/mL，而製成細胞溶解液。
將作為受檢物質之純化抗體、實施例3中所獲得之KM3842(陽性對照)、大鼠IgG2a-UNLB(陰性對照，Beckman Coulter製造)及KM511(陰性對照)各2 μg，與所獲得之細胞溶解液1 mg於4℃下混合1小時。以0.1% BSA-PBST(300 μL)對蛋白G-瓊脂糖凝膠顆粒(Amersham公司製造，30 μL)或蛋白A-瓊脂糖凝膠顆粒(Amersham公司製造，30 μL)進行30分鐘以上之前處理後，藉由離心分離除去上清液，懸浮於Tris-HCl(50 mmol/L，pH值7.5)、1%TritonX100、氯化鈉(150 mmol/L)、EDTA(5 mmol/L)及蛋白酶抑制劑混合物(Roche-Diagnostics公司製造)之混合溶液(以下，記為顆粒清洗用緩衝液)(90 μL)中。
於顆粒懸浮液中添加抗體與細胞溶解液之混合溶液(100μL)，於4℃下混合2小時後，藉由離心分離回收顆粒。利用顆粒清洗用緩衝液將所回收之顆粒清洗3~5次後，溶解於2% SDS、Tris-HCl(62 mmol/L，pH值6.8)及10%甘油之混合溶液(以下，記為SDS-PAGE用樣本緩衝液)中，藉由以下之免疫墨點法分析所獲得之溶液。藉由SDS-聚丙烯醯胺電泳進行區分，轉印至PVDF膜(Millipore公司製造)。以5%脫脂乳-PBST將所獲得之該PVDF膜阻斷後，將實施例3中所獲得之KM3842(陽性對照，3.5 μg/mL)作為1次抗體，於室溫下反應2小時。利用PBST充分清洗所獲得之該PVDF膜，使其與過氧化酶標記抗大鼠免疫球蛋白G(H+L)(Dako公司製造)於室溫下反應1小時。再次利用PBST充分清洗該PVDF膜，使用ECL西方墨點偵測試劑(Amersham Pharmacia公司製造)檢測結合有抗體之條帶。
KM4000、KM4001、KM4008、KM4012、KM4018及陽性對照抗體KM3842於分子量75 kDa附近檢測出條帶。其結果顯示，KM4000、KM4001、KM4008、KM4012及KM4018為可藉由免疫沈澱反應檢測出ASCT2之抗體，且係識別ASCT2之立體結構的抗體。(4)經由ASCT2之胺基酸之細胞內吞之抑制活性將利用添加有10%非活化透析胎牛血清(以下為dFBS，Invitrogen公司製造)之Doulbecco改良Eagle培養基(DMEM，Invitrogen公司製造)(以下，記為不含麩醯胺之培養基)製備成2×104 個/mL之細胞數的人類大腸癌細胞株WiDr(ATCC編號：CCL-218)接種至96孔培養盤中，每次接種100 μL，並於5% CO2 培養箱中，於37℃下培養24小時。以20 μL/孔添加以最終濃度達到31.6~0.03 μg/mL之方式利用PBS稀釋製備的作為受檢物質之純化抗體、大鼠IgG2a-UNLB(陰性對照，Beckman Coulter公司製造)、KM511(陰性對照)及麩醯胺競爭胺基酸混合液[AST混合液、丙胺酸、絲胺酸、蘇胺酸(均為西格瑪公司製造，各3.3 mmol/L)之混合液]。
進而，以20 μL/孔添加以最終濃度成為0.2 mmol/L之方式由不含麩醯胺之培養基製備之麩醯胺溶液(Invitrogen公司製造)。向對照孔及空白培養盤之孔中添加PBS(20 μL/孔)及上述麩醯胺溶液(20 μL/孔)。除空白培養盤以外，於抗體添加後，於5% CO2 培養箱中，於37℃下培養72小時。以20 μL/孔添加利用不含麩醯胺之培養基稀釋成50%之{4-[3-(4-碘苯基)-2-(4-硝基苯基)-2H-5-四唑]-1,3-苯二磺酸鹽}(以下為WST-1試劑，Roche-Diagnostics公司製造)，進而於37℃下培養2小時。
使用微量盤分光光度計(Emax microplate reader，Molecular Device公司)，測定450 nm(對照波長650 nm)下之吸光度。將未添加抗體之對照孔之吸光度設為100%，將空白培養盤之孔之吸光度設為0%，算出添加有抗體之孔之相對增殖率(%)。
將測定結果示於圖7及圖8。如圖7所示，KM3998於高濃度下稍許抑制細胞增殖，但其效果低於麩醯胺競爭胺基酸混合液之效果，顯示KM3999對ASCT2之中和活性較低。又，如圖8所示，KM4000、KM4001、KM4008、KM4012及KM4018均抗體濃度依賴性地強力抑制細胞增殖。其結果顯示，KM4000、KM4001、KM4008、KM4012及KM4018藉由強力中和使麩醯胺細胞內吞之ASCT2之功能，而具有顯著抑制癌細胞增殖之活性。
[實施例7]編碼抗ASCT2單株抗體之可變區域之cDNA之單獨分離、分析(1)由抗ASCT2單株抗體產生融合瘤細胞製備mRNA使用RNeasy Maxi Kit(Qiagen公司製造)及Oligotex-dT30<Super>mRNA純化試劑盒(Takara Bio公司製造)並依據隨附說明書之方法，由實施例5(5)中所獲得之融合瘤KM4008、KM4012及KM4018(分別為5×107 個細胞)製備約6 μg之mRNA。
(2)抗ASCT2單株抗體之H鏈及L鏈可變區域之基因選殖使用BD SMART RACE cDNA Amplification Kit(BD Biosciences公司製造)並依據隨附說明書之方法，由0.6 μg之(1)中所取得之KM4008、KM4012及KM4018之mRNA分別取得5'側具有隨附試劑盒之BD SMART II A Oligonucleotide序列的cDNA。以所獲得之cDNA作為模板，使用隨附試劑盒之通用引子Amix，及序列編號15、16所表示之小鼠Ig(γ)特異性引子(mG3a2或mG2ba1)或序列編號43所表示之大鼠Ig(γ)特異性引子(rG2a)進行PCR反應，而擴增VH之cDNA片段。又，使用序列編號17所表示之小鼠Ig(κ)特異性引子(mKa1)或序列編號44所表示之大鼠Ig(κ)特異性引子(rKa2)代替Ig(γ)特異性引子，進行PCR反應，而擴增VL之cDNA片段。
大鼠Ig(κ)特異性引子(rKa2)之PCR反應係於如下條件下進行：於94℃下加熱5分鐘後，以於94℃下反應15秒鐘、於68℃下反應30秒鐘、於72℃下反應3分鐘為1個循環而進行40個循環後，於72℃下反應10分鐘。
其以外之PCR反應係於如下條件下進行：於94℃下加熱5分鐘後，以於94℃下反應15秒鐘、於72℃下反應3分鐘為1個循環而進行5個循環，以於94℃下反應15秒鐘、於72℃下反應3分鐘為1個循環而進行5個循環，以於94℃下反應15秒鐘、於68℃下反應30秒鐘、於72℃下反應3分鐘為1個循環而進行30個循環後，於72℃下反應10分鐘。PCR反應係使用PTC-200 DNA Engine(Bio-Rad公司製造)而進行。所獲得之PCR產物為H鏈約700 bp、L鏈約800 bp之尺寸。
為了確定所獲得之PCR產物之鹼基序列，而藉由瓊脂糖凝膠電泳進行分離，使用Gel萃取試劑盒(Qiagen公司製造)萃取PCR產物。使用TOPO TA選殖試劑盒(Invitrogen公司製造)，將所獲得之萃取片段與pCR4 TOPO載體連接，藉由Cohen等人之方法[Proc. Natl. Acad. Sci. USA,69,2110(1992)]，將大腸桿菌DH5α株(東洋紡織公司製造)轉形。使用自動質粒萃取機PI-50(Kurabo公司製造)，萃取質粒，使用BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit(PE Biosystems公司製造)並依據隨附說明書，使所獲得之轉形體進行反應後，利用DNA定序儀ABI PRISM3700(PE Biosystems公司製造)分析鹼基序列。
其結果為，cDNA之5'末端存在推測為起始密碼子之ATG序列，獲得含有全長之KM4008之H鏈cRNA的質粒08H2b10、含有KM4008之L鏈cDNA的質粒08La4、含有KM4012之H鏈cDNA的質粒12Ha5、含有KM4012之L鏈cDNA的質粒12La4、含有KM4018之H鏈cDNA的質粒18rHa1及含有KM4018之L鏈cDNA的質粒18Lb3。
將所獲得之含有KM4008之H鏈cDNA的質粒08H2b10所含之VH之全鹼基序列示於序列編號18，將含有由該質粒08H2b10所含之VH之全鹼基序列推測之訊號序列的分泌型VH之全胺基酸序列示於序列編號19，將含有KM4008之L鏈cDNA之質粒08La4所含之VL之全鹼基序列示於序列編號20，將含有由該質粒08La4所含之VL之全鹼基序列推測之訊號序列的分泌型VL之全胺基酸序列示於序列編號21，將含有KM4012之H鏈cDNA的質粒12Ha5所含之VH之全鹼基序列示於序列編號22，將含有由該質粒12Ha5所含之VH之全鹼基序列推測的訊號序列之分泌型VH之全胺基酸序列示於序列編號23，將含有KM4012之L鏈cDNA之質粒12La4所含之VL之全鹼基序列示於序列編號24，及將含有由該質粒12La4所含之VL之全鹼基序列推測的訊號序列之分泌型VL之全胺基酸序列示於序列編號25，將含有KM4018之H鏈cDNA之質粒18rHa1所含之VH之全鹼基序列示於序列編號45，將含有由該質粒18rHa1所含之VH之全鹼基序列推測之訊號序列的分泌型VH之全胺基酸序列示於序列編號46，將含有KM4018之L鏈cDNA之質粒18Lb3所含之VL之全鹼基序列示於序列編號47，將含有由該質粒18Lb3所含之VL之全鹼基序列推測之訊號序列的分泌型VL之全胺基酸序列示於序列編號48。
(3)抗ASCT2單株抗體之V區域之胺基酸序列之分析實施例5(7)中所獲得之KM4008、KM4012、KM4018之純化單株抗體中之H鏈及L鏈之N末端胺基酸序列係使用蛋白質定序儀(PPSQ-10，島津製作所公司製造)進行分析，確定約20個殘基。將所獲得之結果與由(2)中所獲得之各抗體之鹼基序列推測的胺基酸序列進行比較，結果確認各序列一致，確認(2)中所獲得之鹼基序列為目標抗體之鹼基序列。
又，根據與現有之小鼠抗體、或大鼠抗體之胺基酸序列資料[SEQUENCES of Proteins of Immunological Interest,US Dept. Health and Human Services(1991)]之比較可明確：單獨分離之各cDNA係編碼含有分泌訊號序列之ASCT2單株抗體KM4008、KM4012及KM4018之全長cDNA，KM4008之H鏈之分泌訊號序列為序列編號19中所記載之胺基酸序列之第1號~第19號，KM4008之L鏈之分泌訊號序列為序列編號21中所記載之胺基酸序列之第1號~第20號，KM4012之H鏈之分泌訊號序列為序列編號23中所記載之胺基酸序列之第1號~第19號，KM4012之L鏈之分泌訊號序列為序列編號25中所記載之胺基酸序列之第1號~第20號，KM4018之H鏈之分泌訊號序列為序列編號46中所記載之胺基酸序列之第1號~第19號，KM4018之L鏈之分泌訊號序列為序列編號48中所記載之胺基酸序列之第1號~第20號。
其次，使用抗ASCT2單株抗體KM4008、KM4012、KM4018之VH及VL之胺基酸序列，藉由blastp法[Nucleic Acids Res.,25,3389(1997)]對現有蛋白質之胺基酸序列資料庫進行檢索。結果未檢索到VH及VL均完全一致之胺基酸序列，抗ASCT2單株抗體KM4008、KM4012、KM4018之VH及VL均具有新穎之胺基酸序列。又，藉由與現有抗體之胺基酸序列進行比較，而鑑定抗ASCT2單株抗體KM4008、KM4012、KM4018之VH及VL之CDR序列。將抗ASCT2單株抗體KM4008之VH之CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列示於序列編號26、序列編號27及序列編號28，將VL之CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列示於序列編號29、序列編號30及序列編號31，將抗ASCT2單株抗體KM4012之VH之CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列示於序列編號32、序列編號33及序列編號34，將VL之CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列示於序列編號35、序列編號36及序列編號37，將抗ASCT2單株抗體KM4018之VH之CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列示於序列編號49、序列編號50及序列編號51，將VL之CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列示於序列編號52、序列編號53及序列編號54。
[實施例8]抗ASCT2人類型嵌合抗體之製作(1)抗ASCT2人類型嵌合抗體表現載體cKM4008_93之構建使用人類化抗體表現用載體pKANTEX93(WO 97/10354)與實施例7(2)中所獲得之含有KM4008之H鏈cDNA之質粒08H2b10及含有KM4008之L鏈cDNA之08La4，藉由以下方式構建抗ASCT2人類型嵌合抗體表現載體cKM4008_93。
藉由與實施例2相同之方式進行PCR反應。將質粒08H2b10(100 ng)作為模板，添加具有序列編號38及序列編號39記載之鹼基序列之引子(10 μmol/L，分別為1 μL)、10×Ex Taq緩衝液(5 μL)、dNTP混合液(2.5 mmol/L，4 μL)、及Ex Taq聚合酶(以上為Takara Bio公司製造，1 μL)，進而添加殺菌水使總量成為50 μL。PCR反應係於96℃下進行2分鐘變性處理後，以94℃下1分鐘、55℃下1分鐘、72℃下1分鐘為1循環，進行30個循環，進而以72℃下5分鐘之反應條件進行，而擴增編碼附加有用以插入至pKANTEX93中之限制酶識別序列的KM4008之VH的基因片段。
又，將質粒08La4(100 ng)作為模板，由具有序列編號40及序列編號41記載之鹼基序列之引子(10 μmol/L，分別為1 μL)、10×Ex Taq緩衝液(5 μL)、dNTP混合液(2.5 mmol/L，4 μL)、及Ex Taq聚合酶(以上為Takara Bio公司製造，1 μL)進行與上述相同之PCR反應，而擴增編碼附加有用以插入至pKANTEX93之限制酶識別序列的KM4008之VL的基因片段。
藉由瓊脂糖凝膠電泳將所獲得之各自之反應產物分離，使用Gel萃取試劑盒(Qiagen公司製造)萃取所獲得之約0.5 kbp的擴增片段。使用TOPO TA選殖試劑盒(Invitrogen公司製造)，將所獲得之基因片段與pCR4 TOPO載體連接，藉由與實施例7(2)相同之方式將大腸桿菌DH5α株(東洋紡織公司製造)轉形，取得含有編碼KM4008之VH之鹼基序列的質粒08VH3、含有編碼KM4008之VL之鹼基序列的質粒08VL6。
利用限制酶Apa I(Takara Bio公司製造)及Not I(Takara Bio公司製造)消化所獲得之質粒08VH3，利用限制酶EcoR I(Takara Bio公司製造)及BsiW I(Takara Bio公司製造)消化質粒08VL6後，藉由瓊脂糖凝膠電泳進行分離。使用Gel萃取試劑盒(Qiagen公司製造)萃取所獲得之約0.5 kbp之基因片段。
將消化質粒08VL6而獲得之片段與同樣利用EcoR I(Takara Bio公司製造)及BsiW I(Takara Bio公司製造)消化之pKANTEX93載體連接，藉由與實施例7(2)相同之方式將大腸桿菌DH5α株(東洋紡織公司製造)轉形，使用質粒萃取試劑盒(Qiagen公司製造)，取得插入有KM4008之VL之pKANTEX93載體。
利用Apa I(Takara Bio公司製造)及Not I(Takara Bio公司製造)消化所獲得之插入有KM4008之VL的pKANTEX93載體後，將其與消化上述質粒08VH3所獲得之片段連接，藉由與實施例7(2)相同之方式將大腸桿菌DH5α株(東洋紡織公司製造)轉形，使用質粒萃取試劑盒(Qiagen公司製造)，取得插入有KM4008之VH及VL之抗ASCT2人類型嵌合抗體表現載體cKM4008_93。
(2)抗ASCT2人類型嵌合抗體表現載體cKM4012_93之構建藉由與(1)相同之方式，由人類化抗體表現用載體pKANTEX93(WO 97/10354)及實施例7(2)中所獲得之含有KM4012之H鏈cDNA的質粒12Ha5及含有KM4012之L鏈cDNA的質粒12La4，構建抗ASCT2人類型嵌合抗體表現載體cKM4012_93。
將質粒12Ha5及質粒12La4作為模板，使用具有序列編號38及序列編號42中所記載之鹼基序列之VH擴增用引子及具有序列編號40及序列編號41中所記載之鹼基序列的VL擴增用引子，進行PCR反應，擴增基因片段。對所獲得之各反應產物進行分離、萃取，並將其與pCR4 TOPO載體連接後，將大腸桿菌DH5α株(東洋紡織公司製造)轉形，取得含有編碼KM4012之VH之鹼基序列的質粒12VH1、及含有編碼KM4012之VL之鹼基序列的質粒12VL11。利用限制酶分別消化所獲得之質粒12VH1及質粒12VL11後，進行分離、萃取，取得質粒12VH1及質粒12VL11之片段。將所獲得之各片段與利用限制酶消化之pKANTEX93載體連接後，將大腸桿菌DH5α株(東洋紡織公司製造)轉形，取得插入有KM4012之VH及VL的抗ASCT2人類型嵌合抗體表現載體cKM4012_93。
(3)抗ASCT2人類型嵌合抗體表現載體cKM4018_93之構建藉由與(1)相同之方式，由人類化抗體表現用載體pKANTEX93(WO 97/10354)及實施例7(2)中所獲得之含有KM4018之H鏈cDNA的質粒18rHal及含有KM4018之L鏈cDNA的質粒18Lb3，構建抗ASCT2人類型嵌合抗體表現載體cKM4018_93。
將質粒18rHal及質粒18Lb3作為模板，使用具有序列編號55及序列編號56中所記載之鹼基序列的VH擴增用引子及具有序列編號57及序列編號58中所記載之鹼基序列的VL擴增用引子，進行PCR反應，擴增基因片段。
將所獲得之各反應產物進行分離、萃取，與pCR4 TOPO載體連接後，將大腸桿菌DH5α株(東洋紡織公司製造)轉形，取得含有編碼KM4018之VH之鹼基序列的質粒18VH5、及含有編碼KM4018之VL之鹼基序列的質粒18V2L1。
利用限制酶分別消化所獲得之質粒18VH5及質粒18V2L1後，進行分離、萃取，取得質粒18VH5及質粒18V2L1之片段。將所獲得之各片段與利用限制酶消化之pKANTEX93載體連接後，將大腸桿菌DH5α株(東洋紡織公司製造)轉形，取得插入有KM4018之VH及VL之抗ASCT2人類型嵌合抗體表現載體cKM4018_93。
(4)抗ASCT2人類型嵌合抗體於動物細胞中之表現使用上述(1)中所獲得之抗ASCT2人類型嵌合抗體表現載體cKM4008_93，藉由常法[Antibody Engineering,A Practical Guide,W. H. Freeman and Company(1992)]進行抗ASCT2人類型嵌合抗體於動物細胞中之表現。
又，同樣地使用抗ASCT2人類型嵌合抗體表現載體cKM4012_93、或抗ASCT2人類型嵌合抗體表現載體cKM4018_93，分別進行抗ASCT2人類型嵌合抗體於動物細胞中之表現，取得產生抗ASCT2人類型嵌合抗體之轉形株。
(5)純化抗體之取得將上述(4)中所獲得之轉形株分別以通常之培養法進行培養後，回收細胞懸浮液，以3000 rpm，於4℃之條件下離心分離15分鐘，回收培養上清液後，使用孔徑為0.22 μm之MillexGV過濾器(Millipore公司製造)對培養上清液進行過濾殺菌。使用ProteinA High-capacity樹脂(Millipore公司製造)管柱並依據隨附之說明書，自所獲得之培養上清液純化抗ASCT2人類型嵌合抗體cKM4008、cKM4012、cKM4018(以下，記為cKM4008、cKM4012、cKM4018)。使用梯度凝膠(Atto公司製造，目錄編號：E-T520L)並依據隨附之說明書，藉由SDS-PAGE確認所獲得之cKM4008、cKM4012、cKM4018之純化標準品之純化度及表現分子尺寸。關於經純化之抗ASCT2人類型嵌合抗體之泳動圖案，於非還原條件下係於分子量150~200千道爾頓(以下，記為kDa)附近可見7條條帶，於還原條件下可見約50 kDa及約25 kDa之2條條帶。
上述泳動圖案與將IgG型之抗體於相同條件下進行SDS-PAGE的結果[Antibodies-A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Chapter 14(1988)、Monoclonal Antibodies-Principles and Practice,Academic Press Limited(1996)]一致。因此，確認抗ASCT2人類型嵌合抗體cKM4008、cKM4012及cKM4018表現有正確結構。
[實施例9]
抗ASCT2人類型嵌合抗體之反應性研究(1)螢光細胞染色法(流式細胞儀)將實施例2中所獲得之人類ASCT2-myc/His基因導入CHO細胞、及多發性骨髓瘤細胞株OPM-2(DSMZ編號：ACC50)分別於5% CO2 培養箱中，於37℃下培養3~4天。利用0.02% EDTA溶液(Nacalai Tesque公司製造)將人類ASCT2-myc/His基因導入CHO細胞剝離，為了避免抗體之非特異性吸附，而使用1% BSA-PBS，於冰溫下阻斷30分鐘。向96孔U字培養盤之每1孔中接種1×105 ~5×105 個細胞(100 μL)，以1500 rpm離心分離5分鐘(05PR-22，日立工機公司製造)後，除去上清液。以最終濃度成為0.01 μg/mL至10 μg/mL之方式，利用1% BSA-PBS稀釋作為受檢物質之純化抗體作為1次抗體，添加100 μL/孔，於冰溫下反應60分鐘。
利用1% BSA-PBS進行清洗後，添加利用1% BSA-PBS稀釋之FITC標記抗人類免疫球蛋白G(H+L)(Jackson Laboratories公司製造)作為2次抗體，於冰溫下，於遮光下反應30分鐘。利用1% BSA-PBS進行清洗，懸浮於PBS中，利用流式細胞儀(Cytomics FC500 MPL，Beckman Coulter公司製造)測定螢光強度。將測定結果示於圖9。如圖9所示，抗ASCT2人類型嵌合抗體cKM4008、cKM4012及cKM4018分別對人類ASCT2-myc/His基因導入CHO細胞顯示出較強之結合性。又，明確對作為多發性骨髓瘤細胞株之OPM-2顯示出較強之反應性。
(2)ADCC活性標靶細胞係使用多發性骨髓瘤細胞株KMS-11(HSRRB編號：JCRB1179)，利用含有5% FBS(Invitrogen公司)之不含酚紅的RPMI1640培養基(Invitrogen公司)(以下為ADCC活性測定用培養基)將細胞濃度製備為2×105 個細胞/mL，而製成標靶細胞溶液。
效應細胞溶液之製備係使用Lymphoprep(Nycomed公司製造)並依據隨附之使用說明書，自健康人周邊血液將單核球(PBMC)組分進行分離。所分離之PBMC組分係於ADCC活性測定用培養基中離心分離2次並進行清洗後，將細胞濃度製備為2×106 個細胞/mL，而製成效應細胞溶液。將標靶細胞溶液以50 μL/孔(1×104 細胞/孔)分注至96孔U字底培養盤(Falcon公司製造)中，繼而添加50 μL效應細胞溶液(效應細胞與標靶細胞之比為10：1)。進而，利用ADCC活性測定用培養基稀釋抗ASCT2人類型嵌合抗體cKM4008、cKM4012或cKM4018，以各最終濃度成為0.01 ng/mL~1000 ng/mL之方式進行添加，使總量成為150 μL，於37℃下反應4小時。反應後，將培養盤離心分離，藉由使用LDH-Cytotoxic Test(和光純藥公司製造)並依據隨附之說明書，測定吸光度，而檢測上清液中之乳酸脫氫酶(LDH)活性。
標靶細胞自然游離之吸光度係藉由使用ADCC活性測定用培養基代替效應細胞溶液及抗體溶液，並進行與上述相同之操作而取得；又，效應細胞自然游離之吸光度資料係藉由使用ADCC活性測定用培養基代替標靶細胞溶液及抗體溶液，並進行與上述相同之操作而取得。
標靶細胞全游離之吸光度係藉由使用ADCC活性測定用培養基代替抗體溶液及效應細胞溶液，於反應完畢45分鐘前添加20 μL之9% Triton X-100溶液而進行反應，並進行與上述相同之操作而取得。ADCC活性係藉由以下計算式求出。
(式)ADCC活性(%)=[(受檢體之吸光度)-(效應細胞/標靶細胞自然游離之吸光度)]/[(標靶細胞全游離之吸光度)-(標靶細胞自然游離之吸光度)]×100將測定結果示於圖10。如圖10所示，明確抗ASCT2人類型嵌合抗體cKM4008、cKM4012及cKM4018對抗體濃度依賴性表現ASCT2之細胞具有ADCC活性。(3) CDC活性標靶細胞係使用實施例2中所獲得之人類ASCT2-myc/His基因導入CHO細胞、及大腸癌細胞株Colo205(ATCC編號：CCL-222)，利用0.02%-EDTA溶液(Nacalai Tesque公司製造)進行剝離，利用含有作為CDC測定用培養基而製作之1.4% BSA(Invitrogen公司製造)、50 μg/mL建大黴素(Nacalai Tesque公司製造)的RPMI1640培養基(Invitrogen公司製造)進行清洗後，以成為2×105 細胞/mL之方式懸浮於同培養基中，而製成標靶細胞溶液。
將人類補體血清(西格瑪公司製造，S2257-5ML)溶解於脫離子水5 mL中，添加等量之CDC測定用培養基而稀釋成2倍，製成人類補體溶液。於96孔平底培養盤(SUMITOMO BAKELITE公司製造)之各孔中分注50 μL補體溶液。繼而添加50μL標靶細胞溶液，進而添加50 μL經CDC用培養基稀釋之各抗體溶液，使總量成為150 μL，於37℃、5% CO2 條件下反應2小時。
於各孔中每次添加15 μL之WST-1試劑(Roche-Diagnostics公司製造)，以盤式混合機進行攪拌，於37℃、5% CO2 條件下反應2小時，使用微量盤分光光度計(Emax microplate reader，Molecular Device公司)，測定450 nm(對照波長650nm)下之吸光度。將添加有補體溶液50 μL、CDC用培養基100 μL之孔作為樣本，又，測定每次各添加有50 μL標靶細胞、補體溶液、CDC用培養基之孔(非添加抗體)之吸光度，CDC活性係根據以下之計算式算出。
(式)CDC活性(%)=[1-[(添加抗體之樣本之吸光度)-(空白吸光度)]/[(未添加抗體之吸光度)-(空白吸光度)]×100}將測定結果示於圖11。如圖11所示，明確抗ASCT2人類型嵌合抗體cKM4008、cKM4012及cKM4018抗體濃度依賴性地對ASCT2表現細胞具有CDC活性。又，明確對大腸癌細胞株Colo205亦具有CDC活性。
(4)經由ASCT2之胺基酸之細胞內吞之抑制活性將利用添加有10% DFBS(Invitrogen公司製造)之DMEM(Invitrogen公司製造)(以下，記為不含麩醯胺之培養基)製備成1×104 個/mL之細胞數的人類大腸癌細胞株WiDr(ATCC編號：CCL-218)接種至96孔培養盤中，每次接種100 μL，於5% CO2 培養箱中，於37℃下培養24小時。以最終濃度成為10~0.01 μg/mL之方式，以20 μL/孔添加利用PBS進行稀釋而製備之作為受檢物質之抗ASCT2人類型嵌合抗體、KM511(陰性對照)及麩醯胺競爭胺基酸混合液[AST混合液、丙胺酸、絲胺酸(均為西格瑪公司製造，各3.3 mmol/L)之混合液，進而以最終濃度成為0.2 mmol/L之方式，以20 μL/孔添加利用不含麩醯胺之培養基製備的麩醯胺溶液(Invitrogen公司製造)。
對照之孔及空白培養盤之孔中係添加PBS(20 μL/孔)及上述麩醯胺溶液(20 μL/孔)。除空白培養盤以外，其餘均於添加抗體後，於5% CO2 培養箱中，於37℃下培養72小時。以20 μL/孔添加利用不含麩醯胺之培養基稀釋成50%之WST-1試劑(Roche Diagnostics公司製造)，進而於37℃下培養2小時。使用微量盤分光光度計(Emax microplate reader，Molecular Device公司)，測定450 nm(對照波長650 nm)下之吸光度。將未添加抗體之對照孔之吸光度設為100%，將空白培養盤之孔之吸光度設為0%，算出添加有抗體之孔之相對增殖率(%)。
將測定結果示於圖12。如圖12所示，抗ASCT2人類型嵌合抗體cKM4008、cKM4012及cKM4018均抗體濃度依賴性地強力抑制細胞增殖。結果顯示，cKM4008、cKM4012及cKM4018具有藉由強力中和使麩醯胺細胞內吞之ASCT2的機能而顯著抑制癌細胞之增殖的活性。[實施例10]小鼠ASCT2-myc/His基因導入細胞株(以下，記為小鼠ASCT2/CHO)之製作藉由以下所示方法，取得含有序列編號59所記載之基因序列及序列編號60記載之胺基酸序列之質粒pBluescriptII SK(-)-Mouse_ASCT2-myc/His，使用該質粒，取得小鼠ASCT2-myc/His基因導入CHO細胞株。將小鼠ASCT2基因純系(Clone ID：4192790，Open Biosystems公司)之大腸桿菌液10 μL接種至含安比西林之LB培養基50 mL中，攪拌培養一晚後藉由離心分離(CR2DGII，日立工機公司製造，6000 rpm，10分鐘)回收菌體，使用質粒萃取試劑盒(Qiagen公司)，取得包含小鼠ASCT2基因之質粒。
使含有作為模板之上述質粒100 ng、10×KOD緩衝液I(10 μL)、dNTP混合液(2 mmol/L，5 μL)、MgCl2 (25 mmol/L，4 μL)、具有序列編號61及序列編號62所記載之鹼基序列之引子(10 μmol/L，分別為1 μL)、KOD聚合酶(東洋紡織公司製造，1 μL)、二甲基亞碸(5 μL)的總量為100 μL的溶液，於96℃下反應3分鐘後，以95℃下1分鐘、50℃下1分鐘、72℃下1.5分鐘之3個步驟為1個循環，共進行35循環，並於72℃下反應7分鐘。
藉由瓊脂糖凝膠電泳將反應產物分離，使用QIAquickGel萃取試劑盒(Qiagen公司製造)萃取所獲得之約1.7 kb之擴增片段。利用EcoRI(Takara Bio公司製造)及KpnI(Takara Bio公司製造)消化所獲得之萃取片段，使用QIAquickGel萃取試劑盒進行再萃取。使用Ligation high(東洋紡織公司製造)，將其與利用EcoRI(Takara Bio公司製造)及KpnI(Takara Bio公司製造)消化之pBluescriptII SK(-)載體連接後，藉由Cohen等人之方法[Proc. Natl. Acad. Sci. USA,69,2110(1972)]將大腸桿菌DH5α株(東洋紡織公司製造)轉形。
使用自動質粒萃取機PI-50(Kurabo公司製造)萃取質粒，自所獲得之轉形體取得含有序列編號59所記載之基因序列及序列編號60所記載之胺基酸序列的質粒pBluescriptII SK(-)-Mouse_ASCT2-myc/His。利用EcoRI(Takara Bio公司製造)及KpnI(Takara Bio公司製造)消化所獲得之pBluescriptII SK(-)-Mouse_ASCT2-myc/His，藉由與上述相同之方式萃取基因片段，並與預先利用EcoRI及KpnI消化之pKANTEX93載體(WO 97/10354)連接。藉由與上述相同之方式將大腸桿菌DH5α株(東洋紡織公司製造)轉形，而獲得轉形體後，使用質粒萃取試劑盒(Qiagen公司製造)取得表現質粒pKANTEX-Mouse_ASCT2-myc/His。
pKANTEX-Mouse_ASCT2-myc/His係藉由電穿孔法[Cytotechnology,3,133(1990)]，藉由以下方式導入至CHO/DG44細胞[Somatic Cell and Molecular Genetics,12,555(1986)]中。細胞係使用於向添加有10% DFBS(Invitrogen公司製造)及建大黴素(Nacalai Tesque公司製造，50 μg/mL)之IMDM培養基(Invitrogen公司製造)(以下，記為A4培養基)中添加1×HT添加物(Invitrogen公司製造)而成之培養基中進行繼代而成者。
將CHO/DG44細胞以成為8×106 個/mL之方式懸浮於含有氯化鉀(137 nmol/L)、氯化鈉(2.7 nmol/L)、磷酸氫二鈉(8.1 mmol/L)、磷酸二氫鈉(1.5 nmol/L)及氯化鎂(4 mmol/L)的緩衝液(以下，記為K-PBS)中，將所獲得之細胞懸浮液(200 μL，細胞數為1.6×106 個)與表現質粒pKANTEX-Mouse_ASCT2-myc/His(10 μg)混合。將所獲得之混合液移至比色管(電極間距2 mm)中，使用GenePulserII(Bio-Rad公司製造)，以脈衝電壓0.35 kV、電氣容量250 μF之條件進行基因導入。將比色管於冰上靜置後，將比色管中之細胞懸浮液懸浮於含有A4培養基之細胞培養用容器中，於37℃下，於5% CO2 培養箱中進行培養。培養4天後，將培養基換為添加有G418(Nacalai Tesque公司製造，0.5 mg/mL)之A4培養基，繼續培養。中途更換培養基並進行繼代，自基因導入約2週後，取得對G418具有耐性之轉形細胞株。
針對所獲得之G418耐性轉形細胞，以每1 mL達到5個之細胞數之方式，利用添加有G418(Nacalai Tesque公司製造，0.5 mg/mL)之A4培養基進行稀釋，將經稀釋之細胞懸浮液分注至96孔培養盤中，每次100 μL，階段性地使甲胺喋呤濃度上升而進行處理，藉此選擇高度表現小鼠ASCT2-myc/His之純系，取得小鼠ASCT2/CHO。[實施例11]
小鼠/人類嵌合ASCT2-myc/His基因導入細胞株(以下，記為小鼠/人類嵌合ASCT2/CHO)之製作將人類與小鼠之ASCT2蛋白質之示意圖示於圖13。圖13中之小鼠ASCT2蛋白質之示意圖中，黑色所示之部分(小鼠ASCT2之細胞外區域，相當於人類之第74號、第79號、第84號、第87號、第90號、第154號、第159號、第160號、第163號~第171號、第173號、第174號、第177號、第188號、第204號、第205號、第207號、第210號~第212號、第214號~第223號、第287號、第293號、第296號、第297號、第300號、第301號及第367號之胺基酸)為人類與小鼠之間不同之胺基酸。
ASCT2之細胞外區域中，關於人類與小鼠之間不同之胺基酸，EL1有5處，人類與小鼠之EL2存在較大差異，EL3有6處，EL4有1處。關於EL1、EL2及EL3，為了於位於其附近之限制酶切位點切出含有各區域之區域，並藉由重組而獲得小鼠置換體，藉由導入使用QuikChange定點突變試劑盒(Stratagene公司製造)之沉默突變，使人類ASCT2基因之EL3後方之NcoI位點消失，而導入BamIII位點。
又，關於小鼠ASCT2基因，係使EL2中之NcoI位點消失。關於有1處胺基酸不同之EL4，藉由導入變異而將人類ASCT2基因置換成小鼠型。藉由以下方式製作於各變異體之C末端側融合有myc/His標籤之蛋白質之基因，並導入至CHO細胞中。
(1)變異人類ASCT2基因之構建將實施例2中所製作之pCR4-SLC1A5-myc/His作為模板，於含有具有序列編號63及序列編號64所記載之鹼基序列的引子(0.1 μg/mL，2.5 μL)及QuikChange定點突變試劑盒所隨附之10×反應緩衝液(5 μL)、dNTP混合液(1 μL)的總量為50 μL之溶液中添加PfuTubo DNA聚合酶(1 μL)。進行如下PCR反應：於95℃下反應30秒鐘後，以95℃下30秒鐘、55℃下1分鐘、68℃下5分鐘之3個步驟為1個循環，共進行18個循環，反應完畢後添加1 μL之DnpI，再於37℃下反應1小時。
使用反應產物2 μL，將QuikChange定點突變試劑盒所隨附之大腸桿菌XL1-Blue株(Stratagene公司製造)轉形。使用自動質粒萃取機PI-50(Kurabo公司製造)萃取質粒，自所獲得之轉形體取得質粒pCR4-hNco1KO_ASCT2_myc/His。將上述質粒作為模板，使用具有序列編號65及序列編號66所記載之鹼基序列之引子(0.1 μg/mL，2.5 μL)，藉由與上述相同之方法取得質粒pCR4-hBam3KI_ASCT2-myc/His。
利用EcoRI(Takara Bio公司製造)及KpnI(Takara Bio公司製造)消化所取得之質粒，使用QIAquickGel萃取試劑盒進行萃取，使用Ligation high(東洋紡織公司製造)與預先利用EcoRI與KpnI消化之pBlue scriptII SK(-)載體(Stratagene公司製造)連接。
其後，藉由Cohen等人之方法[Proc. Natl,Acad. Sci. USA,69,2110(1972)]，將大腸桿菌DH5α株(東洋紡織公司製造)轉形，藉由與上述相同之方法，取得質粒pBluescriptII SK(-)hBam3KI_ASCT2-myc/His。(2)變異小鼠ASCT2基因之構建將實施例10中所製作之pBluescriptII SK(-)-Mouse_ASCT2-myc/His作為模板，使用具有序列編號67及序列編號68所記載之鹼基序列之引子，藉由與實施例11(1)相同之方法，取得質粒pBluescriptII SK(-)-mNcoKO_ASCT2-myc/His。
(3)小鼠/人類嵌合ASCT2/CHO之製作利用EcoRI(Takara Bio公司製造)及BcII(與FbaI相同，Takara Bio公司製造)消化利用(1)及(2)中所獲得之質粒將dam-之大腸桿菌株(目錄編號：C2925，New England Biolabs公司製造)再次轉形而取得之質粒。將含有人類ASCT2基因之質粒作為載體，嵌入小鼠ASCT2基因進行連接，而將大腸桿菌DH5α株轉形。
取得EL1被置換成小鼠型之質粒pBluescriptII SK(-)-mEL1_ASCT2-myc/His。同樣地，藉由於BclI及NcoI位點之重組取得EL2被置換成小鼠型之質粒pBluescriptII SK(-)-mEL2_ASCT2-myc/His，藉由於NcoI及BamIII位點之重組取得EL3被置換成小鼠型的質粒pBluescriptII SK(-)-mEL3_ASCT2-myc/His。
將(1)中所取得之pBluescriptII SK(-)hBam3KI_ASCT2-myc/His作為模板，使用具有序列編號69及序列編號70所記載之鹼基序列之引子，藉由與實施例11(1)相同之方法，取得EL4被置換成小鼠型之質粒pBluescriptII SK(-)-mEL4_ASCT2-myc/His。
利用EcoRI(Takara Bio公司製造)及KpnI(Takara Bio公司製造)消化所獲得之pBluescriptII SK(-)-mEL1_ASCT2-myc/His、pBluescriptII SK(-)-mEL2_ASCT2-myc/His、pBluescriptII SK(-)-mEL3_ASCT2-myc/His及pBluescriptII SK(-)-mEL4_ASCT2-myc/His。
藉由與上述相同之方式萃取基因片段，將其與預先利用EcoRI與KpnI消化之pKANTEX93載體(WO 97/10354)連接，將大腸桿菌DH5α株(東洋紡織公司製造)轉形，而獲得轉形體。其後，使用質粒萃取試劑盒(Qiagen公司製造)，分別取得表現質粒pKANTEX-mEL1_ASCT2-myc/His、pKANTEX-mEL2_ASCT2-myc/His、pKANTEX-mEL3_ASCT2-myc/His及pKANTEX-mEL4_ASCT2-myc/His。
pKANTEX-mEL1_ASCT2-myc/His、pKANTEX-mEL2_ASCT2-myc/His、pKANTEX-mEL3_ASCT2-myc/His及pKANTEX-mEL4_ASCT2-myc/His係藉由電穿孔法，藉由與實施例10相同之方法導入至CHO/DG44細胞中。
分別取得小鼠EL1型ASCT2-myc/His基因導入CHO細胞株(以下，記為mEL1/CHO)、小鼠EL2型ASCT2-myc/His基因導入CHO細胞株(以下，記為mLL2/CHO)、小鼠EL3型ASCT2-myc/His基因導入CHO細胞株(以下，記為mEL3/CHO)及小鼠EL4型ASCT2-myc/His基因導入CHO細胞株(以下，記為mEL4/CHO)。
[實施例12]抗ASCT2單株抗體對小鼠ASCT2/CHO及小鼠/人類嵌合ASCT2/CHO之反應性使用實施例10及實施例11中所製作之小鼠ASCT2/CHO及小鼠/人類嵌合ASCT2/CHO細胞，藉由與實施例9(1)相同之方法，使用FITC標記抗小鼠免疫球蛋白G(H+L)(Dako公司製造)或ALEXA488標記抗大鼠免疫球蛋白G(G+L)(Invitrogen公司製造)作為2次抗體，測定抗ASCT2單株抗體KM4008、KM4012及KM4018之反應性。將測定結果示於表2。表2中，以+記號表示有反應性，以-記號表示無反應性，以±記號表示反應性降低。如表2所示，抗ASCT2單株抗體KM4008、KM4012及KM4018均對小鼠ASCT2無反應。
又，KM4008及KM4012可見對mEL2/CHO之反應性降低。另一方面，KM4018可見對mEL2/CHO無反應，對mEL1/CHO及mEL3/CHO之反應性降低。根據以上結果明確，抗ASCT2單株抗體KM4008及KM4012識別並結合包含EL2之立體結構，抗ASCT2單株抗體KM4018識別並結合包含EL1、EL2及EL3之立體結構。
[實施例13]抗ASCT2人類化抗體之製作(1)抗ASCT2人類化抗體之VH及VL之胺基酸序列的設計抗ASCT2人類化抗體之VH之胺基酸序列係藉由以下方式設計。
首先，選擇實施例7(3)中所獲得之用以移植序列編號26~28各自所表示之KM4008VH之CDR1~3之胺基酸序列的人類抗體之VH之FR之胺基酸序列。使用GCG Package(Genetics Computer Group公司製造)作為序列分析系統，藉由BLASTP法[Nucleic Acid Res.,25,3389(1997)]，自現有之蛋白質之胺基酸資料庫檢索與KM4008同源性較高之人類抗體。比較同源性分數與實際之胺基酸序列之同源性，結果SWISSPROT資料庫存取編號：BAC01342，免疫球蛋白重鏈VHDJ區域(以下，記為BAC01342)顯示出77.0%之同源性，係同源性最高之人類抗體，因此選擇該抗體之FR之胺基酸序列。
於藉由以上方式決定之人類抗體之FR之胺基酸序列的適當位置移植序列編號26~28所表示之KM4008之VH之CDR之胺基酸序列。藉此，設計序列編號71所表示之抗ASCT2人類化抗體之VH之胺基酸序列HV0。其次，藉由以下方式設計抗ASCT2人類化抗體之VL之胺基酸序列。
選擇用於移植實施例7(3)中所獲得之序列編號29~31分別所表示之KM4008VL之CDR1~3之胺基酸序列的人類抗體之VL之FR之胺基酸序列。Kabat等人將現有之各種人類抗體之VL根據其胺基酸序列之同源性分類為亞群(HSG I~IV)，該等亞群之每個均報告有共同序列[Sequences of Proteins of Immunological Interest,US Dept. Health and Human Services(1991)]。因此，實施人類抗體之VL之亞群I~IV之共同序列之FR之胺基酸序列與KM4008之VL之FR的胺基酸序列之同源性檢索。
同源性檢索之結果為HSGI、HSGII、HSGIII、及HSGIV之同源性分別為77.5%、60.0%、63.8%、及68.8%。因此，KM4008VL之FR之胺基酸序列與亞群I之同源性最高。
基於以上結果，於人類抗體之VL之亞群I之共同序列之FR之胺基酸序列之適當位置移植KM4008之VL之CDR之胺基酸序列。但是，序列編號21所表示之KM4008之VL之胺基酸序列中之第124號之Leu雖然並非Kabat等人所列舉之人類抗體FR之胺基酸序列之相當部位中使用頻度最高之胺基酸殘基，但為使用頻度相對較高之胺基酸殘基，因此決定使用上述KM4008之胺基酸序列中可見之胺基酸殘基。以此方式設計序列編號72所表示之抗ASCT2人類化抗體之VL之胺基酸序列LV0。
上述所設計之抗ASCT2人類化抗體之VH之胺基酸序列HV0及VL之胺基酸序列LV0係於所選擇之人類抗體之FR之胺基酸序列僅移植有抗ASCT2小鼠單株抗體KM4008之CDR之胺基酸序列的序列。但是，通常於製作人類化抗體之情形時，僅將小鼠抗體之CDR之胺基酸序列移植至人類抗體之FR時，結合活性降低之情形居多。
因此，為了避免結合活性降低，而於移植CDR之胺基酸序列之同時，修飾人類抗體與大鼠抗體之間有所不同之FR之胺基酸殘基中認為可影響結合活性之胺基酸殘基。因此，本實施例亦藉由以下方式鑑定認為可影響結合活性之FR之胺基酸殘基。首先，使用電腦模擬之方法構建由上述所設計之抗ASCT2人類化抗體之VH之胺基酸序列HV0及VL之胺基酸序列LV0所組成的抗體V區域(以下，記為HV0LV0)之立體結構。
關於立體結構座標之製作及立體結構之顯示，係使用軟體Discovery Studio(Accelrys公司製造)並依據隨附之使用說明書而進行。又，亦藉由相同之方式構建抗ASCT2小鼠單株抗體KM4008之V區域之立體結構之電腦模型。進而，於HV0LV0之VH及VL之FR之胺基酸序列中，選擇與KM4008不同之胺基酸殘基，製作對KM4008之胺基酸殘基進行修飾之胺基酸序列，同樣地構建立體結構模型。對該等所製作之KM4008、HV0LV0及修飾體之V區域之立體結構進行比較，鑑定預測可影響抗體之結合活性的胺基酸殘基。
其結果為，作為HV0LV0之FR之胺基酸殘基中認為使抗原結合部位之立體結構發生變化而影響抗體之結合活性的胺基酸殘基，HV0係選擇第2號之Val、第9號之Ser、第20號之Val、第30號之Ser、第38號之Arg、第46號之Glu、第86號之Leu、第93號之Val、第95號之Tyr、及第116號之Val，LV0係選擇第8號之Pro、第15號之Val、第38號之Gln、第43號之Ala、第44號之Pro、第71號之Phe、及第87號之Tyr。
利用該等所選擇之胺基酸殘基中之至少1種以上之胺基酸序列修飾KM4008之相同部位所存在之胺基酸殘基，而設計具有各種修飾之人類化抗體之VH及VL。具體而言，係對VH導入將序列編號71所表示之胺基酸序列之第2號之Val置換為Ile，將第9號之Ser置換為Pro，將第20號之Val置換為Ile，將第30號之Ser置換為Thr，將第38號之Arg置換為Lys，將第46號之Glu置換為Lys，將第86號之Leu置換為Val，將第93號之Val置換為Thr，將第95號之Tyr置換為Phe，及將第116號之Val置換為Leu的胺基酸修飾中之至少1種修飾。
又，對VL導入將序列編號72所表示之胺基酸序列之第8號之Pro置換為Thr，將第15號之Val置換為Leu，將第38號之Gln置換為Arg，將第43號之Ala置換為Thr，將第44號之Pro置換為Val，將第71號之Phe置換為Tyr，及將第87號之Tyr置換為Phe的胺基酸修飾中之至少1種修飾。其結果為，作為對HV0LV0之FR所存在之至少一種胺基酸殘基進行修飾的抗ASCT2人類化抗體之抗體V區域，分別設計HV0LV3、HV2LV0、HV2LV3、HV4LV0、HV4LV3、HV7LV0、HV7LV3、HV10LV0、及HV10LV3。將H鏈可變區域HV2、HV4、HV7、HV10及L鏈可變區域LV3之胺基酸序列分別示於序列編號76、78、80、82及84。
(2)抗ASCT2人類化抗體之製作編碼抗ASCT2人類化抗體之可變區域之胺基酸序列的DNA，於利用編碼KM4008之VH或VL之胺基酸序列的DNA中所使用之密碼子進行胺基酸修飾之情形時，係使用哺乳動物細胞中高頻率使用之密碼子而製作。將編碼抗ASCT2人類化抗體之HV0及LV0之胺基酸序列的DNA序列分別示於序列編號73、74，又，將編碼進行胺基酸修飾之可變區域HV2、HV4、HV7、H10、及LV3之胺基酸序列的DNA序列分別示於序列編號75、77、79、81、及83。
使用該等DNA序列，藉由以下方法分別進行人類化抗體之表現載體之構建及人類化抗體之表現。
[實施例14]
抗ASCT2人類化抗體之製作(1)抗ASCT2人類型嵌合抗體表現載體KM4008HV2LV3_93之構建使用人類化抗體表現用載體pKANTEX93(WO 97/10354)與序列編號87及序列編號88之合成基因，藉由以下方式構建抗ASCT2人類化抗體表現載體KM4008HV2LV3_93。利用限制酶ApaI(Takara Bio公司製造)及NotI(Takara Bio公司製造)消化序列編號87之合成基因，利用限制酶EcoRI(Takara Bio公司製造)及BsiwI(Takara Bio公司製造)消化序列編號88之合成基因後，藉由瓊脂糖凝膠電泳進行分離。使用Gel萃取試劑盒(Qiagen公司製造)萃取所獲得之約0.5 kbp之基因片段。
將消化序列編號88之合成基因而獲得之片段，與同樣利用EcoRI(Takara Bio公司製造)及BsiWI(Takara Bio公司製造)消化之pKANTEX93載體連接，藉由Cohen等人之方法[Proc. Natl. Acad. Sci,USA,69,2110(1972)]將大腸桿菌DH5α(東洋紡織公司製造)轉形，使用質粒萃取試劑盒(Qiagen公司製造)，取得插入有序列編號88之合成基因之pKANTEX93載體。
利用ApaI(Takara Bio公司製造)及NotI(Takara Bio公司製造)消化所獲得之插入有序列編號88之合成基因的pKANTEX93載體後，將其與消化上述序列編號87之合成基因而獲得之片段連接，將大腸桿菌DH5α株(東洋紡織公司製造)轉形，使用質粒萃取試劑盒(Qiagen公司製造)，取得插入有序列編號87及序列編號88之合成基因的抗ASCT2人類化抗體表現載體KM4008HV2LV3_93。(2)抗ASCT2人類化抗體表現載體KM4008HV10LV3_93之構建藉由與(1)相同之方式，由人類化抗體表現用載體pKANTEX93(國際公開第97/10354)與序列編號88及序列編號89之合成基因構建抗ASCT2人類化抗體表現載體KM4008HV10LV393。
(3)抗ASCT2人類化抗體於動物細胞中之表現使用上述(1)及(2)中所獲得之抗ASCT2人類化抗體表現載體KM4008HV2LV3_93及KM4008HV10LV3_93，藉由常法[Antibody Engineering,A Practical Guide,W. H. Freeman and Company(1992)]，進行抗ASCT2人類化抗體於動物細胞中之表現，取得產生抗ASCT2人類化抗體之轉形株。(4)純化抗體之取得藉由通常之培養法分別培養上述(3)中所獲得之轉形體後，回收細胞懸浮液，以3000 rpm、4℃之條件進行15分鐘之離心分離，回收培養上清液後，使用孔徑為0.22 μm之Millex GV過濾器(Millipore公司製造)對培養上清液進行過濾殺菌。
使用ProteinA High-capacity樹脂(Millipore公司製造)管柱並依據隨附之說明書，自所獲得之培養上清液純化抗ASCT2人類化抗體KM4008HV2LV3、KM4008HV10LV3(以下，記為HV2LV3、HV10LV3)。
使用梯度凝膠(Atto公司製造，目錄編號：E-T520L)並依據隨附之說明書，藉由SDS-PAGE確認所獲得之HV2LV3、HV10LV3之純化標準品之純化度及表現分子尺寸。關於經純化之抗ASCT2人類化抗體之泳動圖案，於非還原條件下，於分子量150~200千道爾頓(以下，記為kDa)附近可見1條條帶，於還原條件下，於約50 kDa及約25 kDa處可見2條條帶。上述泳動圖案與相同條件下對IgG型之抗體進行SDS-PAGE之結果[Antibodies-A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Chapter 14(1988)、Monoclonal Antibodies-Principles and Practice,Academic Press Limited(1996)]一致。因此，確認抗ASCT2人類化抗體HV2LV3及HV10LV3表現有正確結構。
[實施例15]抗ASCT2人類化抗體之反應性研究(1)螢光細胞染色法(流式細胞儀)將實施例2中所獲得之人類ASCT2-myc/His基因導入CHO細胞、及多發性骨髓瘤細胞株KMS-11(HSRRB編號：JCRB1179)分別於5% CO2 培養箱中，於37℃下培養3~4天。利用0.02% EDTA溶液將細胞(Nacalai Tesque公司製造)剝離，為了避免抗體之非特異性吸附，而使用1% BSA-PBS，於冰溫下阻斷30分鐘。
向96孔U字培養盤之每1孔中接種1×105 ~5×105 個細胞(100 μL)，以1500 rpm離心分離5分鐘(05PR-22，日立工機公司製造)後，除去上清液。以最終濃度成為0.001 μg/mL至10 μg/mL之方式，利用1% BSA-PBS稀釋作為受檢物質之純化抗體作為1次抗體，以100 μL/孔進行添加，於冰溫下反應60分鐘。利用1% BSA-PBS進行清洗後，添加利用1% BSA-PBS進行稀釋之FITC標記抗人類免疫球蛋白G(H+L)(Jackson Laboratories公司製造)作為2次抗體，於冰溫下，於遮光下反應30分鐘。
利用1% BSA-PBS進行清洗，懸浮於PBS中，藉由流式細胞儀(Cytomics FC500 MPL，Beckman Coulter公司製造)測定螢光強度。將測定結果示於圖14。如圖14所示，抗ASCT2人類化抗體HV2LV3及HV10LV3與抗ASCT2人類型嵌合抗體cKM4008同樣地對人類ASCT2-myc/His基因導入CHO細胞顯示出較強之結合性。又，亦明確對作為多發性骨髓瘤細胞株之KMS-11顯示出較強之反應性。
(2)ADCC活性標靶細胞係使用多發性骨髓瘤細胞株KMS-11(HSRRB編號：JCRB1179)及小細胞肺癌株SBC-3(HSRRB編號：JCRB0818)，利用含有5% FBS(Invitrogen公司)之不含酚紅的RPMI1640培養基(Invitrogen公司)(以下為ADCC活性測定用培養基)將細胞濃度製備為2×105 細胞/mL，而製成標靶細胞溶液。
效應細胞溶液之製備係使用Lymphoprep(Nycomed公司製造)並依據隨附之使用說明書，自健康人周邊血液分離單細胞(PBMC)組分。利用ADCC活性測定用培養基對所分離之PBMC組分離心分離2次並進行清洗後，將細胞濃度製備為2×106 細胞/mL，製成效應細胞溶液。將標靶細胞溶液以50 μL/孔(1×104 細胞/孔)分注至96孔U字底培養盤(Falcon公司製造)中，繼而添加效應細胞溶液50 μL(效應細胞與標靶細胞之比為10：1)。進而，利用ADGC活性測定用培養基稀釋抗ASCT2人類化抗體HV2LV3、HV10LV3或抗ASCT2人類型嵌合抗體cKM4008，以各最終濃度成為0.01 ng/mL~1000 ng/mL之方式進行添加，使總量成為150 μL，於37℃下反應4小時。反應後，對培養盤進行離心分離，使用LDH-Cytotoxic Test(和光純藥公司製造)並依據隨附之說明書，測定吸光度，藉此檢測上清液中之乳酸脫氫酶(LDH)活性。標靶細胞自然游離之吸光度係藉由使用ADCC活性測定用培養基代替效應細胞溶液及抗體溶液，並進行與上述相同之操作而取得；又，效應細胞自然游離之吸光度資料係藉由使用ADCC活性測定用培養基代替標靶細胞溶液及抗體溶液，並進行與上述相同之操作而取得。
標靶細胞全游離之吸光度係藉由使用ADCC活性測定用培養基代替抗體溶液及效應細胞溶液，於反應完畢45分鐘前，添加20 μL之9% Triton X-100溶液進行反應，進行與上述相同之操作而取得。ADCC活性係根據以下之計算式求出。
(式)ADCC活性(%)=[(受檢體之吸光度)-(效應細胞/標靶細胞自然游離之吸光度)]/[(標靶細胞全游離之吸光度)-(標靶細胞自然游離之吸光度)]×100將測定結果示於圖15。如圖15所示，明確抗ASCT2人類化抗體HV2LV3及HV10LV3與抗ASCT2人類型嵌合抗體cKM4008同樣地抗體濃度依賴性地對表現ASCT2之細胞具有ADCC活性。
(3) CDC活性標靶細胞係使用大腸癌細胞株Colo205(ATCC編號：CCL-222)，利用0.02%-EDTA溶液(Nacalai Tesque公司製造)進行剝離，利用含有作為CDC測定用培養基而製作之1.4% BSA(Invitrogen公司製造)、50 μg/mL建大黴素(Nacalai Tesque公司製造)之RPMI1640培養基(Invitrogen公司製造)進行清洗後，於相同培養基中懸浮為2×105 細胞/mL，而製成標靶細胞溶液。將人類補體血清(西格瑪公司製造，S1764-1ML)溶解至脫離子水1 mL中，添加等量之CDC測定用培養基稀釋成2倍，而製成人類補體溶液。
向96孔平底培養盤(SUMITOMO BAKELITE公司製造)之各孔中，以50 μL/孔分注補體溶液。繼而，添加50 μL標靶細胞溶液，進而添加50 μL之利用CDC用培養基稀釋之各抗體溶液，使總量成為150 μL，於37℃、5% CO2 條件下反應2小時。
向各孔中每次添加15 μL之WST-1試劑(Roche-Diagnostics公司製造)，利用培養盤混合機進行攪拌，於37℃、5% CO2 條件下反應2小時，使用微量盤分光光度計(Emax microplate reader，Molecular Device公司)測定450 nm(對照波長650 nm)下之吸光度。將添加有50 μL補體溶液、100 μL之CDC用培養基的孔作為空白，又，測定分別添加有50 μL標靶細胞、補體溶液、CDC用培養基的孔(非添加抗體)之吸光度，CDC活性係藉由以下之計算式算出。
(式)CDC活性(%)={1-[(添加抗體之樣本之吸光度)-(空白吸光度)]/[(未添加抗體之吸光度)-(空白吸光度)]×100}將測定結果示於圖16。如圖16所示，明確抗ASCT2人類化抗體HV2LV3及HV10LV3與抗ASCT2人類型嵌合抗體cKM4008同樣地抗體濃度依賴性地對大腸癌細胞Colo205具有CDC活性。
(4)經由ASCT2之胺基酸之細胞內吞之抑制活性將利用添加有10% FBS(Invitrogen公司製造)之DMEM(Invitrogen公司製造)(以下，記為不含麩醯胺培養基)而製備成1×104 個/mL之細胞數的人類大腸癌細胞株WiDr(ATCC編號：CCL-218)以100 μL/孔接種至96孔培養盤中，於5% CO2 培養箱中，於37℃下培養24小時。
以20 μL/孔添加以最終濃度成為10~0.01 μg/mL之方式利用PBS進行稀釋而製備之作為受檢物質之抗ASCT2人類化抗體HV2LV3、HV10LV3、抗ASCT2人類型嵌合抗體cKM4008、KM511[陰性對照，抗G-CSF衍生物抗體，Agric. Biol. Chem.,53,1095(1989)，小鼠IgG1]及麩醯胺競爭胺基酸混合液[AST混合液、丙胺酸、絲胺酸、蘇胺酸(均為西格瑪公司製造，各3.3 mmol/L)之混合液]。進而，以20 μL/孔添加以最終濃度成為0.2 mmol/L之方式利用不含麩醯胺之培養基而製備之麩醯胺溶液(Invitrogen公司製造)。
向對照之孔及空白培養盤之孔中添加PBS(20 μL/孔)及上述麩醯胺溶液(20 μL/孔)。除空白培養盤以外，於添加抗體後，於5% CO2 培養箱中，於37℃下培養72小時。以20 μL/孔添加利用不含麩醯胺之培養基而稀釋成50%之WST-1試劑(Roche-Diagnostics公司製造)，進而於37℃下培養2小時。
使用微量盤分光光度計(Emax microplate reader，Molecular Device公司)測定450 nm(對照波長650 nm)下之吸光度。將未添加抗體之對照孔之吸光度設為100%，將空白培養盤之孔之吸光度設為0%，算出添加有抗體之孔之相對增殖率(%)。將測定結果示於圖17。如圖17所示，抗ASCT2人類化抗體HV2LV3及HV10LV3與抗ASCT2人類型嵌合抗體cKM4008同樣地抗體濃度依賴性地強力抑制細胞增殖。其結果顯示，HV2LV3及HV10LV3藉由強力中和使麩醯胺細胞內吞之ASCT2之功能，而具有顯著抑制癌細胞之增殖的活性。
雖然本發明已參考特定態樣進行詳細說明，但本領域技術人員均明瞭，只要不脫離本發明之意圖及範圍，則可進行各種變更及變形。再者，本申請案係基於2010年1月15日提出申請之美國臨時申請案(61/295297號)者，將該申請案中所記載之全部內容引用至本文中。
產業上之可利用性
根據本發明，可提供一種特異性識別系統ASC胺基酸轉運蛋白2(ASCT2)之細胞外區域之天然型立體結構且與該細胞外區域結合的單株抗體或該抗體片段、產生該抗體之融合瘤、編碼該抗體之DNA、含有該DNA而成之載體、將該載體轉形而獲得之轉形體、使用該融合瘤或該轉形體之抗體或該抗體片段之製造方法、含有該抗體或該抗體片段之治療藥、及含有該抗體或該抗體片段之診斷藥。
序列表自由內容
序列編號3-人工序列之描述：ASCT2引子(Fw#1)
序列編號4-人工序列之描述：ASCT2引子(Rv#1)
序列編號5-人工序列之描述：ASCT2-myc/His序列
序列編號6-人工序列之描述：ASCT2-myc/His序列
序列編號7-人工序列之描述：N-ASCT2引子(#1)序列
序列編號8-人工序列之描述：N-ASCT2引子(#2)序列
序列編號9-人工序列之描述：N-ASCT2引子(#3)序列
序列編號10-人工序列之描述：N-ASCT2引子(#4)序列
序列編號11-人工序列之描述：C-ASCT2-myc/His引子(Fw#2)序列
序列編號12-人工序列之描述：C-ASCT2-myc/His引子(Rv#2)序列
序列編號13-人工序列之描述：C-ASCT2-myc/His引子(Rv#3)序列
序列編號14-人工序列之描述：ASCT2肽(2-16,Cys)序列
序列編號15-人工序列之描述：引子(mG3a2)序列
序列編號16-人工序列之描述：引子(mG2ba1)序列
序列編號17-人工序列之描述：引子(mKa1)序列
序列編號38-人工序列之描述：cKM4008VH/cKW4012VH引子(Fw)序列
序列編號39-人工序列之描述：cKM4008VH引子(Rv)序列
序列編號40-人工序列之描述：cKM4008VL/cKM4012VL引子(Fw)序列
序列編號41-人工序列之描述：cKM4008VL/cKM4012VL引子(Rv)序列
序列編號42-人工序列之描述：cKM4012VH引子(Rv)序列
序列編號43-人工序列之描述：引子(rG2a)序列
序列編號44-人工序列之描述：引子(rKa2)序列
序列編號55-人工序列之描述：cKM4018VH引子(Fw)序列
序列編號56-人工序列之描述：cKM4018VH引子(Rv)序列
序列編號57-人工序列之描述：cKM4018VL引子(Fw)序列
序列編號58-人工序列之描述：cKM4018VL引子(Rv)序列
序列編號59-人工序列之描述：小鼠ASCT2-myc/His序列
序列編號60-人工序列之描述：小鼠ASCT2-myc/His序列
序列編號61-人工序列之描述：小鼠ASCT2-myc/His引子(Fw)序列
序列編號62-人工序列之描述：小鼠ASCT2-myc/His引子(Rv)序列
序列編號63-人工序列之描述：人類ASCT2 NcoI位點變異導入用引子(Fw)序列
序列編號64-人工序列之描述：人類ASCT2 NcoI位點變異導入用引子(Rv)序列
序列編號65-人工序列之描述：人類ASCT2 BamIII位點導入用引子(Fw)序列
序列編號66-人工序列之描述：人類ASCT2 BamIII位點導入用引子(Rv)序列
序列編號67-人工序列之描述：小鼠ASCT2 NcoI位點變異導入用引子(Fw)序列
序列編號68-人工序列之描述：小鼠ASCT2 NcoI位點變異導入用引子(Rv)序列
序列編號69-人工序列之描述：人類ASCT2 EL4小鼠型置換用引子(Fw)序列
序列編號70-人工序列之描述：人類ASCT2 EL4小鼠型置換用引子(Rv)序列
序列編號71-人工序列之描述：KM4008 HV0序列
序列編號72-人工序列之描述：KM4008 LV0序列
序列編號73-人工序列之描述：KM4008 HV0序列
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序列編號75-人工序列之描述：HV2序列
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序列編號83-人工序列之描述：LV3序列
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序列編號87-人工序列之描述：HV2合成基因序列
序列編號88-人工序列之描述：LV3合成基因序列
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<213>　人工
<220>
<223>　人工序列之描述：C-ASCT2-myc/His引子(Rv#3)序列
<400>　13
<210>　14
<211>　16
<212>　PRT
<213>　人工
<220>
<223>　人工序列之描述：ASCT2肽(2-16,Cys)序列
<400>　14
<210>　15
<211>　25
<212>　DNA
<213>　人工
<220>
<223>　人工序列之描述：引子(mG3a2)序列
<400>　15
<210>　16
<211>　30
<212>　DNA
<213>　人工
<220>
<223>　人工序列之描述：引子(mG2ba1)序列
<400>　16
<210>　17
<211>　32
<212>　DNA
<213>　人工
<220>
<223>　人工序列之描述：引子(mKa1)序列
<400>　17
<210>　18
<211>　417
<212>　DNA
<213>　家鼷鼠
<220>
<221>　CDS
<222>　(1)..(417)
<223>　KM4008VH核苷酸序列
<400>　18
<210>　19
<211>　139
<212>　PRT
<213>　家鼷鼠
<220>
<221>　肽
<222>　(1)..(139)
<223>　KM4008VH肽序列
<400>　19
<210>　20
<211>　384
<212>　DNA
<213>　家鼷鼠
<220>
<221>　CDS
<222>　(1)..(384)
<223>　KM4008VL核苷酸序列
<400>　20
<210>　21
<211>　128
<212>　PRT
<213>　家鼷鼠
<220>
<221>　肽
<222>　(1)..(128)
<223>　KM4008VL肽序列
<400>　21
<210>　22
<211>　417
<212>　DNA
<213>　家鼷鼠
<220>
<221>　CDS
<222>　(1)..(417)
<223>　KM4012VH核苷酸序列
<400>　22
<210>　23
<211>　139
<212>　PRT
<213>　家鼷鼠
<220>
<221>　肽
<222>　(1)..(139)
<223>　KM4012VH肽序列
<400>　23
<210>　24
<211>　384
<212>　DNA
<213>　家鼷鼠
<220>
<221>　CDS
<222>　(1)..(384)
<223>　KM4012VL核苷酸序列
<400>　24
<210>　25
<211>　128
<212>　PRT
<213>　家鼷鼠
<220>
<221>　肽
<222>　(1)..(128)
<223>　KM4012VL肽序列
<400>　25
<210>　26
<211>　5
<212>　PRT
<213>　家鼷鼠
<220>
<221>　肽
<222>　(1)..(5)
<223>　KM4008H CDR1肽序列
<400>　26
<210>　27
<211>　17
<212>　PRT
<213>　家鼷鼠
<220>
<221>　肽
<222>　(1)..(17)
<223>　KM4008H CDR2肽序列
<400>　27
<210>　28
<211>　11
<212>　PRT
<213>　家鼷鼠
<220>
<221>　肽
<222>　(1)..(11)
<223>　KM4008H CDR3肽序列
<400>　28
<210>　29
<211>　11
<212>　PRT
<213>　家鼷鼠
<220>
<221>　肽
<222>　(1)..(11)
<223>　KM4008L CDR1肽序列
<400>　29
<210>　30
<211>　7
<212>　PRT
<213>　家鼷鼠
<220>
<221>　肽
<222>　(1)..(7)
<223>　KM4008L CDR2肽序列
<400>　30
<210>　31
<211>　9
<212>　PRT
<213>　家鼷鼠
<220>
<221>　肽
<222>　(1)..(9)
<223>　KM4008L CDR3肽序列
<400>　31
<210>　32
<211>　5
<212>　PRT
<213>　家鼷鼠
<220>
<221>　肽
<222>　(1)..(5)
<223>　KM4012H CDR1肽序列
<400>　32
<210>　33
<211>　17
<212>　PRT
<213>　家鼷鼠
<220>
<221>　肽
<222>　(1)..(17)
<223>　KM4012H CDR2肽序列
<400>　33
<210>　34
<211>　11
<212>　PRT
<213>　家鼷鼠
<220>
<221>　肽
<222>　(1)..(11)
<223>　KM4012H CDR3肽序列
<400>　34
<210>　35
<211>　11
<212>　PRT
<213>　家鼷鼠
<220>
<221>　肽
<222>　(1)..(11)
<223>　KM4012L CDR1肽序列
<400>　35
<210>　36
<211>　7
<212>　PRT
<213>　家鼷鼠
<220>
<221>　肽
<222>　(1)..(7)
<223>　KM4012L CDR2肽序列
<400>　36
<210>　37
<211>　9
<212>　PRT
<213>　家鼷鼠
<220>
<221>　肽
<222>　(1)..(9)
<223>　KM4012L CDR3肽序列
<400>　37
<210>　38
<211>　40
<212>　DNA
<213>　人工
<220>
<223>　人工序列之描述：cKM4008VH/cKM4012VH引子(Fw)序列
<400>　38
<210>　39
<211>　40
<212>　DNA
<213>　人工
<220>
<223>　人工序列之描述：cKM4008VH引子(Rv)序列
<400>　39
<210>　40
<211>　40
<212>　DNA
<213>　人工
<220>
<223>　人工序列之描述：cKM4008VL/cKM4012VL引子(Fw)序列
<400>　40
<210>　41
<211>　40
<212>　DNA
<213>　人工
<220>
<223>　人工序列之描述：cKM4008VL/cKM4012VL引子(Rv)序列
<400>　41
<210>　42
<211>　40
<212>　DNA
<213>　人工
<220>
<223>　人工序列之描述：cKM4012VH引子(Rv)序列
<400>　42
<210>　43
<211>　26
<212>　DNA
<213>　人工
<220>
<223>　人工序列之描述：引子(rG2a)序列
<400>　43
<210>　44
<211>　29
<212>　DNA
<213>　人工
<220>
<223>　人工序列之描述：引子(rKa2)序列
<400>　44
<210>　45
<211>　426
<212>　DNA
<213>　溝鼠
<220>
<221>　CDS
<222>　(1)..(426)
<223>　KM4018VH核苷酸序列
<400>　45
<210>　46
<211>　142
<212>　PRT
<213>　溝鼠
<220>
<221>　肽
<222>　(1)..(142)
<223>　KM4018VH肽序列
<400>　46
<210>　47
<211>　393
<212>　DNA
<213>　溝鼠
<220>
<221>　CDS
<222>　(1)..(393)
<223>　KM4018VL核苷酸序列
<400>　47
<210>　48
<211>　131
<212>　PRT
<213>　溝鼠
<220>
<221>　肽
<222>　(1)..(131)
<223>　KM4018VL肽序列
<400>　48
<210>　49
<211>　5
<212>　PRT
<213>　溝鼠
<220>
<221>　肽
<222>　(1)..(5)
<223>　KM4018H CDR1肽序列
<400>　49
<210>　50
<211>　17
<212>　PRT
<213>　溝鼠
<220>
<221>　肽
<222>　(1)..(17)
<223>　KM4018H CDR2肽序列
<400>　50
<210>　51
<211>　14
<212>　PRT
<213>　溝鼠
<220>
<221>　肽
<222>　(1)..(14)
<223>　KM4018H CDR3肽序列
<400>　51
<210>　52
<211>　15
<212>　PRT
<213>　溝鼠
<220>
<221>　肽
<222>　(1)..(15)
<223>　KM4018L CDR1肽序列
<400>　52
<210>　53
<211>　7
<212>　PRT
<213>　溝鼠
<220>
<221>　肽
<222>　(1)..(7)
<223>　KM4018L CDR2肽序列
<400>　53
<210>　54
<211>　9
<212>　PRT
<213>　溝鼠
<220>
<221>　肽
<222>　(1)..(9)
<223>　KM4018L CDR3肽序列
<400>　54
<210>　55
<211>　40
<212>　DNA
<213>　人工
<220>
<223>　人工序列之描述：cKM4018 VH引子(Fw)序列
<400>　55
<210>　56
<211>　40
<212>　DNA
<213>　人工
<220>
<223>　人工序列之描述：cKM4018 VH引子(Rv)序列
<400>　56
<210>　57
<211>　40
<212>　DNA
<213>　人工
<220>
<223>　人工序列之描述：cKM4018 VL引子(Fw)序列
<400>　57
<210>　58
<211>　40
<212>　DNA
<213>　人工
<220>
<223>　人工序列之描述：cKM4018VL引子(Rv)序列
<400>　58
<210>　59
<211>　1731
<212>　DNA
<213>　人工
<220>
<221>　CDS
<222>　(1)..(1731)
<223>　人工序列之描述：小鼠ASCT2-myc/His序列
<400>　59
<210>　60
<211>　576
<212>　PRT
<213>　人工
<220>
<221>　肽
<222>　(1)..(576)
<223>　人工序列之描述：小鼠ASCT2-myc/His序列
<400>　60
<210>　61
<211>　59
<212>　DNA
<213>　人工
<220>
<223>　人工序列之描述：小鼠ASCT2-myc/His引子(Fw)序列
<400>　61
<210>　62
<211>　120
<212>　DNA
<213>　人工
<220>
<223>　人工序列之描述：小鼠ASCT2-myc/His引子(Rv)序列
<400>　62
<210>　63
<211>　28
<212>　DNA
<213>　人工
<220>
<223>　人工序列之描述：人類ASCT2 NcoI引子(Fw)序列
<400>　63
<210>　64
<211>　28
<212>　DNA
<213>　人工
<220>
<223>　人工序列之描述：人類ASCT2 NcoI引子(Rv)序列
<400>　64
<210>　65
<211>　36
<212>　DNA
<213>　人工
<220>
<223>　人工序列之描述：人類ASCT2 BamIII引子(Fw)序列
<400>　65
<210>　66
<211>　36
<212>　DNA
<213>　人工
<220>
<223>　人工序列之描述：人類ASCT2 BamIII引子(Rv)序列
<400>　66
<210>　67
<211>　35
<212>　DNA
<213>　人工
<220>
<223>　人工序列之描述：小鼠ASCT2 NcoI引子(Fw)序列
<400>　67
<210>　68
<211>　35
<212>　DNA
<213>　人工
<220>
<223>　人工序列之描述：小鼠ASCT2 NcoI引子(Rv)序列
<400>　68
<210>　69
<211>　30
<212>　DNA
<213>　人工
<220>
<223>　人工序列之描述：人類ASCT2 EL4引子(Fw)序列
<400>　69
<210>　70
<211>　30
<212>　DNA
<213>　人工
<220>
<223>　人工序列之描述：人類ASCT2 EL4引子(Rv)序列
<400>　70
<210>　71
<211>　120
<212>　PRT
<213>　人工
<220>
<221>　肽
<222>　(1)..(120)
<223>　人工序列之描述：KM4008 HV0序列
<400>　71
<210>　72
<211>　107
<212>　PRT
<213>　人工
<220>
<221>　肽
<222>　(1)..(107)
<223>　人工序列之描述：KM4008 LV0序列
<400>　72
<210>　73
<211>　360
<212>　DNA
<213>　人工
<220>
<221>　CDS
<222>　(1)..<360)
<223>　人工序列之描述：KM4008 HV0序列
<400>　73
<210>　74
<211>　321
<212>　DNA
<213>　人工
<220>
<221>　CDS
<222>　(1)..(321)
<223>　人工序列之描述：KM4008 LV0序列
<400>　74
<210>　75
<211>　360
<212>　DNA
<213>　人工
<220>
<221>　CDS
<222>　(1)..(360)
<223>　人工序列之描述：HV2序列
<400>　75
<210>　76
<211>　120
<212>　PRT
<213>　人工
<220>
<221>　肽
<222>　(1)..(120)
<223>　人工序列之描述：HV2序列
<400>　76
<210>　77
<211>　360
<212>　DNA
<213>　人工
<220>
<221>　CDS
<222>　(1)..(360)
<223>　人工序列之描述：HV4序列
<400>　77
<210>　78
<211>　120
<212>　PRT
<213>　人工
<220>
<221>　肽
<222>　(1)..(120)
<223>　人工序列之描述：HV4序列
<400>　78
<210>　79
<211>　360
<212>　DNA
<213>　人工
<220>
<221>　CDS
<222>　(1)..(360)
<223>　人工序列之描述：HV7序列
<400>　79
<210>　80
<211>　120
<212>　PRT
<213>　人工
<220>
<221>　肽
<222>　(1)..(120)
<223>　人工序列之描述：HV7序列
<400>　80
<210>　81
<211>　360
<212>　DNA
<213>　人工
<220>
<221>　CDS
<222>　(1)..(360)
<223>　人工序列之描述：HV10序列
<400>　81
<210>　82
<211>　120
<212>　PRT
<213>　人工
<220>
<221>　肽
<222>　(1)..(120)
<223>　人工序列之描述：HV10序列
<400>　82
<210>　83
<211>　321
<212>　DNA
<213>　人工
<220>
<221>　CDS
<222>　(1)..(321)
<223>　人工序列之描述：LV3序列
<400>　83
<210>　84
<211>　107
<212>　PRT
<213>　人工
<220>
<221>　肽
<222>　(1)..(107)
<223>　人工序列之描述：LV3序列
<400>　84
<210>　85
<211>　2758
<212>　DNA
<213>　家鼷鼠
<220>
<221>　CDS
<222>　(556)..(2223)
<223>　小鼠ASCT2核苷酸序列：GenBank寄存編號NM_009201
<400>　85
<210>　86
<211>　555
<212>　PRT
<213>　家鼷鼠
<220>
<221>　肽
<222>　(1)..(555)
<223>　ASCT2肽序列：GenPept寄存編號NM_033227
<400>　86
<210>　87
<211>　450
<212>　DNA
<213>　人工
<220>
<223>　人工序列之描述：HV2合成基因序列
<400>　87
<210>　88
<211>　410
<212>　DNA
<213>　人工
<220>
<223>　人工序列之描述：LV3合成基因序列
<400>　88
<210>　89
<211>　450
<212>　DNA
<213>　人工
<220>
<223>　人工序列之描述：HV10合成基因序列
<400>　89
圖1(A)表示NM_005628與HCHON2001712之比對。鹼基序列一致之部位以*記號表示。
圖1(B)表示NM_005628與HCHON2001712之比對。鹼基序列一致之部位以*記號表示。
圖1(C)表示NM_005628與HCHON2001712之比對。鹼基序列一致之部位以*記號表示。Q-PCR中所使用之擴增用引子之設計位置(Fw#1為NM_005628之鹼基編號2281至2301、HCHON2001712之鹼基編號1689至1709，Rv#1為NM_005628之鹼基編號2739至2719之反鏈、HCHON2001712之2139至2119之反鏈)以下劃線表示。
圖1(D)表示NM_005628與HCHON2001712之比對。鹼基序列一致之部位以*記號表示。Q-PCR中所使用之擴增用引子之設計位置(Fw#1為NM_005628之鹼基編號2281至2301、HCHON2001712之鹼基編號1689至1709，Rv#1為NM_005628之鹼基編號2739至2719之反鏈、HCHON2001712之2139至2119之反鏈)以下劃線表示。
圖2(A)表示癌細胞株、異種移植物、正常組織及臨床癌組織中之ACST2基因之mRNA的表現量。
圖2(B)表示癌細胞株、異種移植物、正常組織及臨床癌組織中之ACST2基因之mRNA的表現量。
圖3(a)表示藉由螢光細胞染色(流式細胞儀)測定小鼠IgGl抗體對載體導入CHO細胞(Vector/CHO)之反應性的結果。圖3(b)表示藉由螢光細胞染色(流式細胞儀)測定抗myc抗體(Anti-Myc)對載體導入CHO細胞(Vector/CHO)之反應性的結果。圖3(c)表示藉由螢光細胞染色(流式細胞儀)測定抗His抗體(Anti-His)對載體導入CHO細胞(Vector/CHO)之反應性的結果。圖3(d)表示藉由螢光細胞染色(流式細胞儀)測定小鼠IgGl抗體對固定化之人類ASCT2-myc/His基因導入CHO細胞(ASCT2/CHO)之反應性的結果。圖3(e)表示藉由螢光細胞染色(流式細胞儀)測定抗myc抗體(Anti-Myc)對固定化之人類ASCT2-myc/His基因導入CHO細胞(ASCT2/CHO)之反應性的結果。圖3(f)表示藉由螢光細胞染色(流式細胞儀)測定抗His抗體(Anti-His)對固定化之人類ASCT2-myc/His基因導入CHO細胞(ASCT2/CHO)之反應性的結果。橫軸表示螢光強度，縱軸表示細胞數量。將抗體之曲線塗黑，以白色曲線表示緩衝液。
圖4表示單株抗體KM3842對ASCT2之N末肽之結合ELISA中，該抗體對ASCT2之N末肽的反應性。橫軸表示抗體濃度(μg/mL)，縱軸表示吸光度比(OD415/490)。以▲記號表示使用人類ASCT2之N末肽-THY結合體之情形時的吸光度比，以■記號表示使用控制肽-THY結合體之情形時的吸光度比。
圖5(a)表示抗ASCT2單株抗體KM3998之螢光細胞染色(流式細胞儀)中，該抗體對ASCT2-myc/HiS基因導入CHO細胞(ASCT2/CHO)之反應性。圖5(b)表示抗ASCT2單株抗體KM3998之螢光細胞染色(流式細胞儀)中，該抗體對載體導入CHO細胞(Vector/CHO)之反應性。圖5(c)表示抗ASCT2單株抗體KM3998之螢光細胞染色(流式細胞儀)中，該抗體對KMS-11之反應性。橫軸表示螢光強度，縱軸表示細胞數量。將KM3998之曲線塗黑，以白色曲線表示大鼠IgG2a-UNLB。
圖6(a)及(b)係表示抗ASCT2單株抗體KM4000、KM4001、KM4008、KM4012及KM4018之螢光細胞染色(流式細胞儀)中，該等抗體對人類ASCT2-myc/His基因導入CHO細胞(ASCT2/CHO)之反應性。
圖6(c)及(d)表示抗ASCT2單株抗體KM4000、KM4001、KM4008、KM4012及KM4018之螢光細胞染色(流式細胞儀)中，該等抗體對載體導入CHO細胞(Vector/CHO)之反應性。圖6(e)及(f)表示抗ASCT2單株抗體KM4000、KM4001、KM4008、KM4012及KM4018之螢光細胞染色(流式細胞儀)中，該等抗體對KMS-11之反應性。橫軸表示抗體濃度(μg/mL)，縱軸表示平均螢光強度。以●記號與實線表示KM511之平均螢光強度，以■記號與實心粗線表示KM4000之平均螢光強度，以▲記號與虛線表示KM4001之平均螢光強度，以○記號與虛線表示KM4008之平均螢光強度，以□記號與虛線表示KM4012之平均螢光強度，以□記號與實線表示大鼠IgG2a-UNLB之平均螢光強度，以▲記號與實心粗線表示KM4018之平均螢光強度。
圖7表示抗ASCT2單株抗體KM3998對人類大腸癌細胞株WiDr之麩醯胺依賴性增殖的抑制活性。橫軸表示KM3998之最終濃度(μg/mL)，縱軸表示將未經抗體處理之細胞之增殖設為100%時的相對值(%)。以◆記號與實線表示KM3998之相對增殖率，以×記號與實線表示大鼠IgG2a-UNLB之相對增殖率，以虛線表示AST混合液之相對增殖率。
圖8(a)及(b)表示抗ASCT2單株抗體KM4000、KM4001、KM4008、KM4012及KM4018對人類大腸癌細胞株WiDr之麩醯胺依賴性增殖的抑制活性。橫軸表示各抗體之最終濃度(μg/mL)，縱軸表示將未經抗體處理之細胞之增殖設為100%時之相對值(%)。以◆記號與實線表示KM4000之相對增殖率，以■記號與實線表示KM4001之相對增殖率，以Δ記號與實線表示KM4008之相對增殖率，以○記號與實線表示KM4012之相對增殖率，以×記號與實線表示KM511之相對增殖率，以■記號與實線表示KM4018之相對增殖率，以×記號與實線表示大鼠IgG2a-UNLB之相對增殖率，以虛線表示AST混合液之相對增殖率。
圖9(a)表示抗ASCT2人類型嵌合抗體之螢光細胞染色(流式細胞儀)中，該抗體對人類ASCT2-myc/His基因導入CHO細胞(ASCT2/CHO)之反應性。圖9(b)表示抗ASCT2人類型嵌合抗體之螢光細胞染色(流式細胞儀)中，該抗體對人類多發性骨髓瘤細胞株OPM-2之反應性。橫軸表示抗體濃度(μg/mL)，縱軸表示平均螢光強度。以○記號與實線表示cKM4008之平均螢光強度，以Δ記號與實線表示cKM4012之平均螢光強度，以■記號與實線表示cKM4018之平均螢光強度。
圖10表示抗ASCT2人類型嵌合抗體對人類多發性骨髓瘤細胞株KMS-11之ADCC活性。橫軸表示抗體濃度(ng/mL)，縱軸表示ADCC活性。以○記號與實線表示cKM4008之ADCC活性，以Δ記號與實線表示cKM4012之ADCC活性，以■記號與實線表示cKM4018之ADCC活性。
圖11(a)表示抗ASCT2人類型嵌合抗體對人類ASCT2-myc/His基因導入CHO細胞(ASCT2/CHO)之CDC活性。圖11(b)表示抗ASCT2人類型嵌合抗體對人類大腸癌細胞Colo205之CDC活性。橫軸表示抗體濃度(μg/mL)，縱軸表示CDC活性。以○記號與實線表示cKM4008之CDC活性，以Δ記號與實線表示cKM4012之CDC活性，以■記號與實線表示cKM4018之CDC活性。
圖12表示抗ASCT2人類型嵌合抗體對人類大腸癌細胞株WiDr之麩醯胺依賴性增殖的抑制活性。橫軸表示各抗體之最終濃度(μg/mL)，縱軸表示將未經抗體處理之細胞之增殖設為100%時之相對值(%)。以○記號與實線表示cKM4008之相對增殖率，以Δ記號與實線表示KM4012之相對增殖率，以■記號與實線表示KM4018之相對增殖率，以+記號與實線表示KM511之相對增殖率，以虛線表示AST混合液之相對增殖率。
圖13(a)表示人類ASCT2蛋白質之示意圖。圖13(b)表示小鼠ASCT2蛋白質之示意圖。推測細胞外區域(EL1、EL2、EL3、EL4及EL5)中人類與小鼠中不同之胺基酸以黑色表示。
圖14(a)表示抗ASCT2人類化抗體HV2LV3及HV10LV3之螢光細胞染色(流式細胞儀)中，該等抗體對人類ASCT2-myc/His基因導入CHO細胞(ASCT2/CHO)之反應性。圖14(b)表示抗ASCT2人類化抗體HV2LV3及HV10LV3之螢光細胞染色(流式細胞儀)中，該等抗體對人類多發性骨髓瘤細胞株KMS-11的反應性。橫軸表示抗體濃度(μg/mL)，縱軸表示平均螢光強度。以○記號與實線表示HV2LV3之平均螢光強度，以Δ記號與實線表示HV10LV3之平均螢光強度，以■記號與實線表示抗ASCT2人類型嵌合抗體cKM4008之平均螢光強度。
圖15(a)表示抗ASCT2人類化抗體HV2LV3及HV10LV3對人類多發性骨髓瘤細胞株KMS-11的ADCC活性。圖15(b)表示抗ASCT2人類化抗體HV2LV3及HV10LV3對人類多發性骨髓瘤細胞株KMS-11的人類小細胞肺癌株SBC-3的ADCC活性。橫軸表示抗體濃度(ng/mL)，縱軸表示ADCC活性。以o記號與實線表示HV2LV3之ADCC活性，以Δ記號與實線表示HV10LV3之ADCC活性，以■記號與實線表示抗ASCT2人類型嵌合抗體cKM4008之ADCC活性。
圖16表示抗ASCT2人類化抗體HV2LV3及HV10LV3對人類大腸癌細胞株Colo2o5之CDC活性。橫軸表示抗體濃度(μg/mL)，縱軸表示CDC活性。以○記號與實線表示HV2LV3之CDC活性，以Δ記號與實線表示HV10LV3之CDC活性，以■記號與實線表示抗ASCT2人類型嵌合抗體cKM4008之CDC活性。
圖17表示抗ASCT2人類化抗體HV2LV3及HV10LV3對人類大腸癌細胞株WiDr之麩醯胺依賴性增殖的抑制活性。橫軸表示各抗體之最終濃度(μg/mL)，縱軸表示將未經抗體處理之細胞之增殖設為100%時之相對值(%)。以○記號與實線表示HV2LV3之相對增殖率，以Δ記號與實線表示HV10LV3之相對增殖率，以■記號與實線表示抗ASCT2人類型嵌合抗體cKM4008之相對增殖率，以+記號與實線表示KM511之相對增殖率，以虛線表示AST混合液之相對增殖率。
(無元件符號說明)

Claims (22)

  1. 一種單株抗體或具有抗原結合活性之該抗體片段，其特異性識別具有序列編號2所表示之胺基酸序列的系統ASC胺基酸轉運蛋白2之細胞外區域之天然型立體結構且與該細胞外區域結合，並且該抗體之重鏈可變區域含有序列編號76所表示之胺基酸序列，該抗體之輕鏈可變區域含有序列編號84所表示之胺基酸序列，該抗體片段具有含有序列編號76所表示之胺基酸序列的重鏈可變區域、及含有序列編號84所表示之胺基酸序列的輕鏈可變區域。
  2. 一種單株抗體或具有抗原結合活性之該抗體片段，其特異性識別具有序列編號2所表示之胺基酸序列的系統ASC胺基酸轉運蛋白2之細胞外區域之天然型立體結構且與該細胞外區域結合，並且該抗體之重鏈可變區域含有序列編號82所表示之胺基酸序列，該抗體之輕鏈可變區域含有序列編號84所表示之胺基酸序列，該抗體片段具有含有序列編號76所表示之胺基酸序列的重鏈可變區域、及含有序列編號84所表示之胺基酸序列的輕鏈可變區域。
  3. 如請求項1或2之單株抗體或具有抗原結合活性之該抗體片段，該抗體片段具有含有序列編號76所表示之胺基酸序列的重鏈可變區域、及含有序列編號84所表示之胺基酸序列的輕鏈可變區域，且該單株抗體或該抗體片段係抑制經由系統ASC胺基酸轉運蛋白2之胺基酸之細胞內 吞。
  4. 如請求項1或2之單株抗體或具有抗原結合活性之該抗體片段，該抗體片段具有含有序列編號76所表示之胺基酸序列的重鏈可變區域、及含有序列編號84所表示之胺基酸序列的輕鏈可變區域，且該單株抗體或該抗體片段具有細胞阻礙活性。
  5. 如請求項4之單株抗體或具有抗原結合活性之該抗體片段，該抗體片段具有含有序列編號76所表示之胺基酸序列的重鏈可變區域、及含有序列編號84所表示之胺基酸序列的輕鏈可變區域，其中細胞阻礙活性為抗體依賴性細胞阻礙活性或補體依賴性細胞阻礙活性。
  6. 如請求項1或2之具有抗原結合活性之抗體片段，其係選自Fab、Fab'、F(ab')2 、單鏈抗體(scFv)、二聚化V區域(Diabody)、二硫醚穩定化V區域(dsFv)及含有CDR之肽中之抗體片段。
  7. 如請求項1或2之單株抗體或具有抗原結合活性之該抗體片段，該抗體片段具有含有序列編號76所表示之胺基酸序列的重鏈可變區域、及含有序列編號84所表示之胺基酸序列的輕鏈可變區域，且該單株抗體或該抗體片段係基因重組抗體。
  8. 如請求項7之單株抗體或具有抗原結合活性之該抗體片段，該抗體片段具有含有序列編號76所表示之胺基酸序列的重鏈可變區域、及含有序列編號84所表示之胺基酸序列的輕鏈可變區域，且該單株抗體或該抗體片段係選 自人類化抗體及人類抗體中之基因重組抗體。
  9. 一種融合瘤，其產生如請求項1至8中任一項之單株抗體。
  10. 一種DNA，其編碼如請求項1至8中任一項之單株抗體或具有抗原結合活性之該抗體片段，該抗體片段具有含有序列編號76所表示之胺基酸序列的重鏈可變區域、及含有序列編號84所表示之胺基酸序列的輕鏈可變區域。
  11. 一種重組體載體，其含有如請求項10之DNA。
  12. 一種轉形體，其係將如請求項11之重組體載體導入至宿主細胞中而獲得。
  13. 一種如請求項1至8中任一項之單株抗體或具有抗原結合活性之該抗體片段之製造方法，該抗體片段具有含有序列編號76所表示之胺基酸序列的重鏈可變區域、及含有序列編號84所表示之胺基酸序列的輕鏈可變區域；該方法係於培養基中培養如請求項9之融合瘤、或如請求項12之轉形體，使如請求項1至8中任一項之單株抗體或具有抗原結合活性之該抗體片段生成並蓄積於培養物中，再自培養物中採集單株抗體或具有抗原結合活性之該抗體片段。
  14. 一種與系統ASC胺基酸轉運蛋白2相關之疾病之治療藥，其含有如請求項1至8中任一項之單株抗體或具有抗原結合活性之該抗體片段作為有效成分，該抗體片段具有含有序列編號76所表示之胺基酸序列的重鏈可變區域、及含有序列編號84所表示之胺基酸序列的輕鏈可變區域。
  15. 如請求項14之治療藥，其中與系統ASC胺基酸轉運蛋白2相關之疾病為大腸癌。
  16. 一種樣品中之系統ASC胺基酸轉運蛋白2之免疫學檢測或測定方法，其係使用如請求項1至8中任一項之單株抗體或具有抗原結合活性之該抗體片段，該抗體片段具有含有序列編號76所表示之胺基酸序列的重鏈可變區域、及含有序列編號84所表示之胺基酸序列的輕鏈可變區域。
  17. 如請求項16之檢測或測定方法，其中免疫學測定方法為免疫沈澱法。
  18. 一種樣品中表現系統ASC胺基酸轉運蛋白2之細胞之免疫學檢測或測定方法，其係使用如請求項1至8中任一項之單株抗體或具有抗原結合活性之該抗體片段，該抗體片段具有含有序列編號76所表示之胺基酸序列的重鏈可變區域、及含有序列編號84所表示之胺基酸序列的輕鏈可變區域。
  19. 如請求項18之檢測或測定方法，其中免疫學檢測方法為螢光細胞染色法。
  20. 一種系統ASC胺基酸轉運蛋白2之免疫學檢測用或測定用試劑，其含有如請求項1至8中任一項之單株抗體或具有抗原結合活性之該抗體片段，該抗體片段具有含有序列編號76所表示之胺基酸序列的重鏈可變區域、及含有序列編號84所表示之胺基酸序列的輕鏈可變區域。
  21. 一種與系統ASC胺基酸轉運蛋白2相關之疾病之診斷藥，其含有如請求項1至8中任一項之單株抗體或具有抗原結 合活性之該抗體片段，該抗體片段具有含有序列編號76所表示之胺基酸序列的重鏈可變區域、及含有序列編號84所表示之胺基酸序列的輕鏈可變區域。
  22. 如請求項21之診斷藥，其中與系統ASC胺基酸轉運蛋白2相關之疾病為大腸癌。
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