ES2705015T3 - Anticuerpo anti-CD27 - Google Patents

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ES2705015T3 ES10841020T ES10841020T ES2705015T3 ES 2705015 T3 ES2705015 T3 ES 2705015T3 ES 10841020 T ES10841020 T ES 10841020T ES 10841020 T ES10841020 T ES 10841020T ES 2705015 T3 ES2705015 T3 ES 2705015T3
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Abstract

Anticuerpo humanizado o fragmento de anticuerpo del mismo, que reconoce y se une a una región extracelular de un polipéptido codificado por el gen de CD27 que contiene una cadena de azúcar unida a O a la que no se encuentra unida la galactosa; en el que el anticuerpo o el fragmento comprende una VH que comprende las secuencias de aminoácidos de CDR1 a 3 representadas por SEC ID nº 58 a 60, respectivamente, y el anticuerpo o fragmento comprende una VL que comprende las secuencias de aminoácidos de CDR1 a 3 representadas por SEC ID nº 61 a 63, respectivamente, en el que la VH del anticuerpo humanizado o fragmento comprende la secuencia de aminoácidos representada por cualquiera de SEC ID nº 96, 105 y 107, y la VL del anticuerpo humanizado o fragmento comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 97.

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpo anti-CD27.
Campo de la invención
La presente divulgación se refiere a un anticuerpo humanizado o a un fragmento de anticuerpo del mismo, que reconoce específicamente un polipéptido codificado por el gen CD27 que contiene una cadena de azúcar unida a O a la que no se encuentra unida la galactosa y se une a la región extracelular del péptido; a un hibridoma que produce el anticuerpo humanizado; a un ADN que codifica el anticuerpo humanizado; a un vector que comprende el ADN; a un transformante obtenible mediante transformación del vector; a un procedimiento para producir un anticuerpo humanizado o un fragmento de anticuerpo del mismo utilizando el hibridoma o el transformante, y a un agente diagnóstico que utiliza el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo del mismo, o a un agente terapéutico que comprende el anticuerpo humanizado o el fragmento de anticuerpo del mismo como un principio activo. Antecedentes de la técnica
En los últimos años se ha informado de algunos casos en los que la aparición de diversas enfermedades o el avance de la patología es acompañada por cambios estructurales en las cadenas de azúcar unidas a la proteína que expresan las células implicadas en la enfermedad o patología de la misma. Son representativos de estos casos la expresión del antígeno Tn, que es uno de los antígenos de cadena de azúcar unidos a O (de tipo serina/treonina) y que se observa en más de 80% de los tipos de cáncer humano, y la expresión de un antígeno sialil-Tn en el que el ácido siálico se encuentra unido al antígeno Tn (literatura no de patentes n° 2).
Es conocido que las expresiones de estos antígenos de cadena de azúcar se observan raramente en las células normales y se ha llevado a cabo investigación para aplicarlas como moléculas diana de terapias de vacuna específicas del cáncer a la atención médica (literatura no de patentes n° 1). Las expresiones de los antígenos de cadena de azúcar específicos del cáncer se encuentran bajo el control de la actividad de enzimas que constituyen la complicada ruta biosintética de las cadenas de azúcar y la complicada ruta metabólica de las cadenas de azúcar en los organismos vivos. Por ejemplo, es conocido que, en las células de cáncer, los cambios en el patrón de expresión de un gen codificante de las proteínas responsables de la ruta biosintética de las cadenas de azúcar conduce a la rotura de la ruta biosintética de las cadenas de azúcar.
El antígeno Tn es conocido como un intermediario de la ruta biosintética de una cadena de azúcar unida a O en las células normales y presenta una estructura (GalNAc a-Ser/Thr) en la que la N-acetilgalactosamina (GalNAc) se encuentra unida mediante enlace a a un grupo hidroxilo en una cadena lateral de un determinado residuo de serina (Ser) o treonina (Thr) de una secuencia de aminoácidos de una proteína.
La biosíntesis de una cadena de azúcar unida mediante O de tipo normal (tal como el antígeno TF) tiene lugar mediante la transferencia de una molécula de galactosa al extremo terminal no reductor del antígeno Tn por la actividad de una galactosiltransferasa 1p3 nuclear (1p3Gal-T nuclear, sintetasa-T). Se considera que la ruta biosintética de las cadenas de azúcar resulta bloqueada como resultado de la reducción de la actividad de la galactosiltransferasa 1p3 nuclear intracelular y, de esta manera, se expresa el antígeno T o el antígeno sialil-Tn en muchos tipos de estirpe celular de cáncer.
El mecanismo de reducción de la actividad de la galactosiltransferasa 1p3 nuclear en las células de cáncer es complicado y no ha sido aclarado por completo. Sin embargo, como un posible mecanismo, se ha supuesto que la actividad de la galactosiltransferasa 1p3 nuclear intracelular es reduce mucho debido a una mutación en un gen codificante de una determinada proteína chaperón (Cosmc) que resulta necesaria para la expresión de actividad de la galactosiltransferasa 1p3 nuclear (literatura no de patentes n° 6).
Basándose en el hecho de que la expresión del antígeno Tn se observa comúnmente en una pluralidad de tipos de cáncer, se considera que la aberración en la ruta biosintética de las cadenas de azúcar o en la ruta metabólica de las cadenas de azúcar en las células es la causa principal de cambios habituales en las estructuras de las cadenas de azúcar unidas a muchas glucoproteínas diferentes que se expresan en las células. El cáncer es una enfermedad representativa que es conocido que presenta una estrecha relación entre el cambio estructural de una cadena de azúcar y el avance de la patología. Aparte del cáncer, es conocido que la nefropatía de IgA es otra enfermedad en la que existe una estrecha asociación entre el cambio estructural en una cadena de azúcar y el avance patológico. La nefropatía de IgA es la nefritis glomerular crónica, que se caracteriza patológicamente por mostrar la deposición granular de una inmunoglobulina, la inmunoglobulina A (IgA), en el mesangio glomerular, y fue informada por primera vez por Berger en 1968 (literatura no de patentes n° 2).
La nefropatía de IgA es una nefritis representativa que explica aproximadamente la mitad de los pacientes de nefritis glomerular crónica en el Japón. Se cree que aproximadamente el 40% de los pacientes que han sido diagnosticados con nefropatía de IgA sufrirán una transición de la enfermedad a insuficiencia renal de estadio tardío en 20 años y que inevitablemente recibirán hemodiálisis, trasplante renal o similar. Tal como se ha indicado anteriormente, aunque la nefropatía de IgA se ha reconocido generalmente como una enfermedad de mal pronóstico, todavía no se ha establecido una terapia validada clínicamente.
Es conocido que IgA1, de entre dos isotipos diferentes de IgA (IgA1 e IgA2) en el cuerpo del paciente de nefropatía de IgA se deposita principalmente en el riñón. Además, como causa del depósito de IgA1, se ha informado de que una estructura de una cadena de azúcar unida a O enlazada a una región bisagra presente en la molécula de IgA1 pero ausente de la molécula de IgA2 cambia de un tipo normal a antígeno Tn o antígeno sialil-Tn (referencias n° 3 y 4 de la literatura no de patentes).
Se ha demostrado que una vez la deficiencia de galactosa de una cadena de azúcar de tipo unida a O añadida a la región bisagra de IgA1 ha resultado en la conversión en la cadena de azúcar en un antígeno Tn o sialil-Tn, se potencia la capacidad de autoaglutinación de la molécula de IgA1 y se acelera el depósito de la molécula de IgA1 en las zonas mesangiales renales (literatura no de patente n° 5).
Además, se ha informado de una caída en la actividad de la galactosiltransferasa 1p3 nuclear debido a un nivel de expresión reducido de Cosmc en células productoras de IgA aisladas de pacientes de nefropatía de IgA (literatura no de patentes n° 6).
En otras palabras, la ruta biosintética de las cadenas de azúcar resulta bloqueada a medio camino en las células productoras de IgA en el cuerpo de los pacientes con nefropatía de IgA y, en consecuencia, se produce IgA1 con cadena de azúcar deficiente en lugar de IgA1 con una cadena de azúcar de tipo normal. Como uno de los mecanismos patogénicos de la nefropatía de IgA se defiende que la inflamación resulta inducida como consecuencia del depósito de esta IgA1 con cadena de azúcar deficiente en el glomérulo renal.
Generalmente, la IgA es producida por las células B en la sangre o en células plasmáticas diferenciadas a partir de células B. La célula plasmática es el estadio final de la diferenciación de las células B. Las células plasmáticas se distribuyen en tejidos linfoides secundarios, tejidos mucosales sistémicos, médula ósea, etc., y producen grandes cantidades de anticuerpos. Es conocido que las células plasmáticas productoras de IgA se distribuyen principalmente en los tejidos mucosales.
Por otra parte, es conocido que, en el centro germinal de los tejidos linfoides secundarios, las células B de memoria o las células plasmáticas se diferencian a partir de clones de células B que han adquirido la capacidad de producir anticuerpos IgA de alta afinidad y, de esta manera, se distribuyen células diferenciadas por todo el órgano diana en todo el cuerpo y producen continuamente anticuerpos durante un periodo de tiempo prolongado. Sin embargo, no está claro en qué estadio del proceso de diferenciación de las células B, se desarrollan las células que producen la IgA de cadena de azúcar deficiente implicada en la patogénesis de la nefropatía de IgA, y a qué tejidos corporales se distribuyen las células B o células plasmáticas que producen la IgA con cadena de azúcar deficiente.
Entre las proteínas conocidas como moléculas de superficie de la membrana celular expresadas en las células B o en las células plasmáticas, CD27 es conocido como una de las moléculas a las que se une una cadena de azúcar unida a O (literatura no de patente n° 7). La molécula CD27, perteneciente como miembro a la superfamilia de receptores del factor de necrosis tumoral (TNFR), es una proteína membranal de tipo I con un peso molecular de aproximadamente 55 kDa y se encuentra presente como dímero unido mediante disulfuro de dos monómeros (literatura no de patente n° 8).
Es conocido que CD27 se expresa en algunos linfocitos T, así como en las células plasmáticas y células B. En particular, es conocido que el nivel de expresión de CD27 se incrementa con la diferenciación de las células B en células B de memoria y células plasmáticas en el proceso de diferenciación de las células B. Es conocido que CD27, al que se une la cadena de azúcar unida a O, se expresa en estas células durante el proceso de diferenciación, aunque no se ha demostrado claramente el residuo aminoácido al que se une la cadena de azúcar (literatura no de patente n° 9).
Como molécula de ligando de CD27, se conoce CD70, perteneciente a la familia de TNF. Es conocido que CD70 se une a CD27 expresado en algunas células B o T, e induce señales de proliferación celular y estimula a las células B a producir anticuerpos (literatura no de patentes n° 10).
Además, es conocido que la expresión de CD27 se encuentra incrementada en varios tipos de células de cáncer, así como en células normales. Como tipos de cáncer que expresan CD27 se ha informado de una diversidad de linfomas no de Hodgkin, tales como el linfoma de las células del manto, leucemia linfocítica crónica, leucemia linfocítica pequeña, linfoma de Burkitt, linfoma folicular, linfoma MALT, linfoma de células B grandes difusas y plasmacitoma (literatura no de patentes n° 11).
Es conocido que muchas células de cáncer expresan una proteína deficiente en cadena de azúcar que contiene una cadena de azúcar que incluye antígeno Tn, antígeno sialil-Tn y similares, tal como se ha indicado anteriormente.
Como anticuerpo que reconoce específicamente CD27, se ha informado de un anticuerpo S152 obtenido mediante la inmunización con células de leucemia aisladas de pacientes con síndrome de Sézary (literatura no de patentes n° 8). Sin embargo, el anticuerpo S152 también se ha demostrado que presenta una afinidad para las células B y T normales. Actualmente no se conoce anticuerpo que reconozca específicamente la molécula CD27 que contiene una cadena de azúcar unida a O a la que no se una la galactosa.
El documento n° WO 2010/001908 describe además anticuerpos anti-CD27.
Es generalmente conocido que, al administrar un anticuerpo no humano, tal como un anticuerpo de ratón, en el ser humano, resulta reconocido como sustancia foránea de manera que se induce un anticuerpo humano contra el anticuerpo de ratón (anticuerpo humano antiratón, HAMA) en el cuerpo del ser humano.
Es conocido que HAMA reaccionar con el anticuerpo de ratón administrado, induciendo de esta manera efectos secundarios (referencias n° 12 a 15 de la literatura no de patentes), potencia la eliminación del anticuerpo de ratón del cuerpo (referencias n° 16 a 18 de la literatura no de patentes) y reduce el efecto terapéutico del anticuerpo de ratón (referencias 19 y 20 de la literatura no de patentes).
Con el fin de resolver estos problemas, se han realizado esfuerzos por preparar un anticuerpo quimérico humano o un anticuerpo humanizado a partir de un anticuerpo no humano utilizando técnicas de recombinación génica. Un anticuerpo humanizado presenta diversas ventajas en la administración en el ser humano en comparación con un anticuerpo no humano, tal como un anticuerpo de ratón. Por ejemplo, se ha informado de que la inmunogenicidad se reduce, y la semivida en sangre se alarga, en un ensayo con monos, en comparación con un anticuerpo de ratón (referencias n° 21 y 22 de la literatura no de patentes). Es decir, se espera que el anticuerpo humanizado cause menos efectos secundarios en anticuerpos humanos que en anticuerpos no humanos y presentan un efecto terapéutico sostenido durante un tiempo prolongado.
Además, debido a que se prepara un anticuerpo humanizado utilizando las técnicas de recombinación génica, puede prepararse como diversas formas de moléculas. Por ejemplo, en el caso de que se utilice la subclase y1 como región constante de cadena pesada (en adelante denominada "región C") de un anticuerpo humano (la región C de cadena H se denomina "CH"), puede prepararse un anticuerpo humanizado con funciones efectoras elevadas, tales como la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (en adelante denominada "actividad de ADCC") (literatura no de patentes n° 23) y puede esperarse la prolongación de la semivida en sangre en comparación con anticuerpos de ratón (literatura no de patentes n° 24).
En particular, en el caso del tratamiento para la eliminación de las células positivas para CD27, son importantes las actividades citotóxicas, tales como la citotoxicidad dependiente del complemento (en adelante denominada "actividad CDC") y la actividad de ADCC mediante la región Fc (la región después de la región bisagra de cadena pesada de anticuerpo) de un anticuerpo, para dañar específicamente las células diana mediante acumulación de células efectoras en proximidad a un tejido tumoral mediante el anticuerpo. En el tratamiento de seres humanos, preferentemente se utiliza un anticuerpo quimérico humano, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo humano para mostrar las actividades citotóxicas (referencias n° 25 y 26 de la literatura no de patentes).
Además, con los recientes avances en la ingeniería de proteínas y la ingeniería genética, el anticuerpo humanizado también puede prepararse como fragmento de anticuerpo con un peso molecular pequeño, tal como Fab, Fab', F(ab')2, un anticuerpo de cadena sencilla (en adelante denominado "scFv") (literatura no de patentes n° 27), un fragmento de región V dimerizada (en adelante denominado "diacuerpo") (literatura no de patentes n° 28), un fragmento de región V estabilizado por disulfuro (en adelante denominado "dsFv") (literatura no de patentes n° 29) o un péptido que comprende una región determinante de complementariedad (en adelante denominada "CDR") (literatura no de patentes n° 30). Estos fragmentos de anticuerpos presentan una transitividad más excelente a tejidos diana que las moléculas de anticuerpo completo (literatura no de patentes n° 31).
Listado de referencias
Literatura no de patentes
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Sumario de la invención
Problemas que debe resolver la invención
Tal como se ha indicado anteriormente, no se conocen anticuerpos que reconozcan específicamente una molécula CD27 que contiene una cadena de azúcar unida a O. El anticuerpo que reconoce específicamente CD27 que contiene una cadena de azúcar unida a la que no se encuentra unida galactosa resulta muy útil para el diagnóstico y terapia de una enfermedad relacionada con CD27 que contiene una cadena de azúcar unida a O a la que no se encuentra unida galactosa.
Por lo tanto, un objetivo de la presente invención es proporcionar un anticuerpo monoclonal que reconoce específicamente CD27 que contiene una cadena de azúcar unida a O a la que no se encuentra unida galactosa y que se une a una región extracelular de CD27 o a un método de utilización del mismo.
Medios para resolver los problemas
La presente invención se refiere a (1) a (23) a continuación:
[1] . Un anticuerpo humanizado o un fragmento de anticuerpo del mismo, que reconoce y se une a una región extracelular de un polipéptido codificado por el gen de CD27 que contiene una cadena de azúcar unida a O a la que no se encuentra unida galactosa, en el que el anticuerpo o el fragmento comprende VH que comprende las secuencias de aminoácidos de CDR1 a 3 representada por las SEC ID n° 58 a 60, respectivamente, y el anticuerpo o fragmento comprende VL que comprende las secuencias de aminoácidos de CDR1 a 3 representadas por SEC ID n° 61 a 63, respectivametne, en las que VH del anticuerpo humanizado o fragmento comprende la secuencia de aminoácidos representada por cualquiera de las SEC ID n° 96, 105 y 107, y VL del anticuerpo humanizado o fragmento comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 97.
[2] . Un ADN que codifica el anticuerpo humanizado o el fragmento de anticuerpo del mismo según [1].
[3] . Un vector recombinante que comprende el ADN según [2].
[4] . Un transformante obtenible mediante la introducción del vector recombinante según [3] en una célula hospedadora.
[5] . Un procedimiento para producir el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo del mismo según [1], que comprende cultivar el transformante según [4] en un medio para formar y acumular el anticuerpo humanizado o el fragmento de anticuerpo del mismo según [1] en el cultivo y después recolectar el anticuerpo humanizado o el fragmento de anticuerpo del mismo a partir del cultivo.
[6] . Un método in vitro o ex vivo para detectar o medir inmunológicamente CD27 que contiene una cadena de azúcar unida a O a la que no se encuentra unida galactosa, que comprende el anticuerpo humanizado o el fragmento de anticuerpo del mismo según [1].
[7] . Un reactivo para detectar CD27 que contiene una cadena de azúcar unida a O a la que no se encuentra unida galactosa, que comprende el anticuerpo humanizado o el fragmento de anticuerpo del mismo según [1].
[8] . Un agente para la utilización en el diagnóstico o tratamiento de una enfermedad relacionada con CD27 que contiene una cadena de azúcar unida a O a la que no se encuentra unida galactosa, que comprende el anticuerpo humanizado o el fragmento de anticuerpo del mismo según [1], en el que la enfermedad relacionada con CD27 que contiene una cadena de azúcar unida a O a la que no se encuentra unida galactosa es la nefropatía de IgA.
[9] . Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo humanizado o el fragmento de anticuerpo del mismo según [1] o el agente de [8] y un portador farmacéuticamente aceptable.
[10] . Utilización del anticuerpo humanizado o el fragmento de anticuerpo del mismo según [1] para la preparación de un agente para el diagnóstico o tratamiento de una enfermedad relacionada con CD27 que contiene una cadena de azúcar unida a O a la que no se encuentra unida galactosa, en la que la enfermedad relacionada con CD27 que contiene una cadena de azúcar unida a O a la que no se encuentra unida galactosa es la nefropatía de IgA.
[11] . El anticuerpo humanizado o el fragmento de anticuerpo del mismo según [1] para la utilización en un método de diagnóstico o tratamiento de una enfermedad relacionada con CD27 que contiene una cadena de azúcar unida a O a la que no se encuentra unida galactosa, en la que la enfermedad relacionada con CD27 que contiene una cadena de azúcar unida a O a la que no se encuentra unida galactosa es la nefropatía de IgA.
Se da a conocer además en la presente memoria (1) a (23), a continuación:
(1) Un anticuerpo humanizado que reconoce y se une específicamente a una región extracelular de un polipéptido codificado por el gen de CD27 que contiene una cadena de azúcar unida a O a la que no se encuentra unida galactosa, en el que el anticuerpo comprende VH que comprende las secuencias de aminoácidos de CDR 1 a 3 representadas por las SEC ID n° 58 a 60, respectivamente, y el anticuerpo comprende VL que comprende las secuencias de aminoácidos de las CDR 1 a 3 representadas por las SEC ID n° 61 a 63, respectivamente, o un fragmento de anticuerpo de las mismas.
(2) El anticuerpo humanizado o el fragmento de anticuerpo del mismo indicado en (1), en el que VH del anticuerpo humanizado comprende una secuencia de aminoácidos en la que por lo menos una modificación seleccionada de la sustitución de Ser en la posición 30 por Asn, Val en la posición 48 por Ile, Ser en la posición 49 por Ala, Asn en la posición 77 por Gly, Val en la posición 93 por Thr, Ala en la posición 97 por Thr, y Thr en la posición 117 por Val, se introduce en la secuencia de aminoácidos representada por la s Ec ID n° 96, y en la que VL del anticuerpo humanizado comprende una secuencia de aminoácidos en la que por lo menos una modificación seleccionada de las sustituciones de Ile en la posición 21 por Leu, Pro en la posición 40 por Leu, Val en la posición 58 por Ile, Thr en la posición 85 por Ala y Tyr en la posición 87 por Phe se introduce en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC iD n° 97.
(3) El anticuerpo humanizado o el fragmento de anticuerpo del mismo indicado en (1), en el que VH del anticuerpo humanizado comprende la secuencia de aminoácidos representada por cualquiera de SEC ID n° 96, 105 y 107, y VL del anticuerpo humanizado comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 97;
(4) Un ADN que codifica el anticuerpo humanizado o el fragmento de anticuerpo del mismo indicado en cualquiera de (1) a (3).
(5) Un vector recombinante que comprende el ADN indicado en (4).
(6) Un transformante obtenible mediante la introducción del vector recombinante según [5] en una célula hospedadora.
(7) Un procedimiento para producir el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo del mismo descrito en cualquiera de (1) a (3), que comprende cultivar el transformante según (6) en un medio para formar y acumular el anticuerpo humanizado o el fragmento de anticuerpo del mismo descrito en cualquiera de (1) a (3) en el cultivo y después recolectar el anticuerpo humanizado o el fragmento de anticuerpo del mismo a partir del cultivo.
(8) Un método para detectar o medir inmunológicamente CD27 que contiene una cadena de azúcar unida a O a la que no se encuentra unida galactosa, que comprende utilizar el anticuerpo humanizado o el fragmento de anticuerpo del mismo indicado en cualquiera de (1) a (3).
(9) Un reactivo para detectar CD27 que contiene una cadena de azúcar unida a O a la que no se encuentra unida galactosa, que comprende el anticuerpo humanizado o el fragmento de anticuerpo del mismo indicado en cualquiera de (1) a (3), anteriormente.
(10) Un agente diagnóstico para una enfermedad relacionada con CD27, que contiene una cadena de azúcar unida a O a la que no se encuentra unida galactosa, que comprende el anticuerpo humanziado o el fragmento de anticuerpo del mismo indicado en cualquiera de (1) a (3).
(11) El agente diagnóstico indicado en (10), en el que la enfermedad relacionada con CD27 que contiene una cadena de azúcar unida a O a la que no se encuentra unida galactosa es la nefropatía de IgA. (12) El agente diagnóstico indicado en (10), en el que la enfermedad relacionada con CD27 que contiene una cadena de azúcar unida a O a la que no se encuentra unida galactosa es cáncer.
(13) Un agente terapéutico para una enfermedad relacionada con CD27, que contiene una cadena de azúcar unida a O a la que no se encuentra unida galactosa, que comprende el anticuerpo humanizado o el fragmento de anticuerpo del mismo indicado en cualquiera de (1) a (3) como un principio activo.
(14) El agente terapéutico indicado en (13), en el que la enfermedad relacionada con CD27 que contiene una cadena de azúcar unida a O a la que no se encuentra unida galactosa es la nefropatía de IgA.
(15) El agente terapéutico indicado en (13), en el que la enfermedad relacionada con CD27 que contiene una cadena de azúcar unida a O a la que no se encuentra unida galactosa es cáncer.
(16) Un método diagnóstico para una enfermedad relacionada con CD27 que contiene una cadena de azúcar unida a O a la que no se encuentra unida galactosa, que comprende detectar o medir una célula que expresa CD27 que contiene una cadena de azúcar unida a O a la que no se encuentra unida galactosa, mediante la utilización del anticuerpo humanizado o el fragmento de anticuerpo del mismo indicado en cualquiera de (1) a (3).
(17) Un método diagnóstico para una enfermedad relacionada con CD27 que contiene una cadena de azúcar unida a O a la que no se encuentra unida galactosa, que comprende detectar o medir CD27 que contiene una cadena de azúcar unida a O a la que no se encuentra unida galactosa, mediante la utilización del anticuerpo humanizado o el fragmento de anticuerpo del mismo indicado en cualquiera de (1) a (3).
(18) El método diagnóstico indicado en (16) o (17), en el que la enfermedad relacionada con CD27 que contiene una cadena de azúcar unida a O a la que no se encuentra unida galactosa es la nefropatía de IgA.
(19) El método diagnóstico indicado en (16) o (17), en el que la enfermedad relacionada con CD27 que contiene una cadena de azúcar unida a O a la que no se encuentra unida galactosa es cáncer.
(20) Utilización del anticuerpo humanizado o el fragmento de anticuerpo del mismo indicado en cualquiera de (1) a (3) para la preparación de un agente diagnóstico para una enfermedad relacionada con CD27 que contiene una cadena de azúcar unida a O a la que no se encuentra unida galactosa.
(21) Utilización del anticuerpo humanizado o el fragmento de anticuerpo del mismo indicado en cualquiera de (1) a (3) para la preparación de un agente terapéutico para una enfermedad relacionada con CD27 que contiene una cadena de azúcar unida a O a la que no se encuentra unida galactosa.
(22) La utilización del anticuerpo humanizado o el fragmento de anticuerpo del mismo indicado en (20) o (21), en la que la enfermedad relacionada con CD27 que contiene una cadena de azúcar unida a O a la que no se encuentra unida galactosa es la nefropatía de IgA, y
(23) La utilización del anticuerpo humanizado o el fragmento de anticuerpo del mismo indicado en (20) o (21), en la que la enfermedad relacionada con CD27 que contiene una cadena de azúcar unida a O a la que no se encuentra unida galactosa es cáncer.
Efectos de la invención
El anticuerpo humanizado de la presente invención o el fragmento de anticuerpo del mismo es un anticuerpo monoclonal que reconoce y se une específicamente a una región extracelular de un polipéptido que está codificado por el gen de CD27 y que contiene una cadena de azúcar unida a O a la que no se encuentra unida galactosa.
Una enfermedad relacionada con Cd27 con cadena de azúcar deficiente es diagnosticable mediante la detección o cuantificación de CD27 con cadena de azúcar deficiente o células que expresan el polipéptido, utilizando el anticuerpo humanizado de la presente invención o fragmento de anticuerpo del mismo.
Además, debido a que el anticuerpo humanizado de la presente invención o fragmento de anticuerpo del mismo puede unirse a la región extracelular de CD27 con cadena de azúcar deficiente, preferentemente se utiliza para la detección de células que expresan el polipéptido. Especialmente, debido a que el anticuerpo de la presente invención o fragmento de anticuerpo del mismo puede unirse a la región extracelular de CD27 con cadena de azúcar deficiente, preferentemente se utiliza para el análisis de citometría de flujo para detectar CD27 que se expresa sobre la membrana celular y mantiene la estructura tridimensional de la forma natural.
Además, el anticuerpo humanizado de la presente invención o fragmento de anticuerpo del mismo que presenta una actividad efectora puede dañar la célula que expresa un polipéptido CD27 con cadena de azúcar deficiente. Además, el anticuerpo humanizado anteriormente indicado o fragmento de anticuerpo del mismo que puede dañar y reducir el número de células que expresan polipéptidos CD27 con cadena de azúcar deficiente en el cuerpo vivo se utiliza eficazmente especialmente como medicamento.
Breve descripción de los dibujos
[Figura 1] La figura 1 muestra el método de construcción del vector plásmido pCR2.1 CD27 que comprende una secuencia de ADN que codifica una proteína CD27 humana.
[Figura 2] La figura 2 muestra el método de construcción del vector plásmido pCR CD27axb que comprende una secuencia de ADN que codifica una región extracelular de una proteína CD27 humana.
[Figura 3] La figura 3 muestra el método de construcción de un vector plásmido pBShCY4SP que presenta una región Fc de IgG4 humana de tipo mutante con una sustitución de aminoácido en una región constante de IgG4 humana.
[Figura 4] La figura 4 muestra el método de construcción de un vector plásmido pCR IgG4Fc BamHISall que comprende una secuencia de ADN en la que se ha insertado una secuencia de reconocimiento de enzima de restricción en una secuencia de ADN de una región Fc de IgG4 humana de tipo mutante.
[Figura 5] La figura 5 muestra el método de construcción de pKANTEX XhoI/SalI mediante la inserción de una secuencia de ADN de CD27-Fc.
[Figura 6] La figura 6 muestra el método de construcción del vector de expresión de la proteína CD27-Fc, pKANTEX CD27-hIgG4Fc.
[Figura 7] Las figuras 7(a) y (b) muestran los resultados del análisis de SDS-PAGE de las proteínas CD27-Fc que se expresan en células CHO/DG44 y en células Lec8 como células hospedadoras. La figura 7(a) muestra condiciones no reductoras sin adición de p-mercaptoetanol. La figura 7(b) muestra condiciones reductoras con la adición de p-mercaptoetanol. En las figuras 7(A) y (b), desde la izquierda, se muestra un marcador, una fracción de células Lec8 y una fracción de células CHO/DG44.
[Figura 8] La figura 8(a) muestra los resultados del análisis de SDS-PAGE de las proteínas CD27-Fc que se expresan en células CHO/DG44 y en células Lec8 como células hospedadoras. Además, la figura 8(b) muestra los resultados del análisis de transferencia western de las proteínas CD27-Fc que se expresan en células CHO/DG44 y en células Lec8 como células hospedadoras. En las figuras 8(a) y (b), desde el lado izquierdo de los carriles, se muestra un marcador, una muestra de células CHO/DG44 y una muestra de células Lec8. Se llevó a cabo la transferencia western mediante tinción utilizando un anticuerpo anti-RCASI (anticuerpo 22-1-1).
[Figura 9] La figura 9 muestra el método de construcción de un vector plásmido pCRCD27 axc que comprende un ADN codificante de la proteína CD27 y está destinado a la expresión en células animales. [Figura 10] La figura 10 muestra el método de construcción de un vector de expresión de células animales pKANTEX CD27.
[Figura 11] Las figuras 11(a) y (b) muestran los resultados del análisis de citometría de flujo de anticuerpos monoclonales anti-CD27 contra células CHO/DG44 expresantes de CD27 y células Lec8 expresantes de CD27. La figura 11(a) muestra los resultados en un histograma para CD27/Lec8-4 y la figura 11(b) muestra los resultados en un histograma para CD27/DG44-8. En ambos histogramas, la ordenada representa el número de células y la abscisa representa la intensidad de fluorescencia.
[Figura 12] Las figuras 12(a) y (b) muestran la actividad de unión de los anticuerpos monoclonales anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente, KM4030 y KM4031, de las células Lec8, CD27/Lec8-4 y CD27/DG44-8, según medición mediante la tinción de células fluorescentes. La figura 12(a) muestra los resultados de las mediciones con el sistema de detección celular ABI. La ordenada representa la intensidad de fluorescencia y la abscisa representa los anticuerpos reaccionados. La figura 12(b) muestra los resultados de las mediciones obtenidos mediante la utilización de un citómetro de flujo (CMF). La ordenada representa la intensidad media de fluorescencia y la abscisa representa los anticuerpos reaccionados.
[Figura 13] La figura 13(a) y (b) muestran los resultados del ELISA competitivo de los anticuerpos monoclonales anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente, KM4030 y KM4031. La figura 13(a) muestra la reactividad del anticuerpo monoclonal anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente, KM4030, y la figura 13(b) muestra la reactividad del anticuerpo monoclonal anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente, KM4031. La ordenada representa el crecimiento celular y la abscisa representa la concentración de anticuerpo.
[Figura 14] Las figuras 14(a) y (b) muestran la clonación génica de un anticuerpo monoclonal anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente.
[Figura 15] La figura 15 muestra el método de construcción de un vector de expresión de anticuerpo quimérico anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente.
[Figura 16] La figura 16 muestra el método de construcción de un vector de expresión de anticuerpo quimérico anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente.
[Figura 17] La figura 17 muestra el método de construcción de un vector de expresión de anticuerpo quimérico anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente.
[Figura 18] La figura 18 muestra el método de construcción de un vector de expresión de anticuerpo quimérico anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente.
[Figura 19(A)] Las figuras 19(A)(a) y (b) muestran el resultado de la actividad de unión de diversos anticuerpos quiméricos anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente: KM4026 quimérico (0), KM4028 quimérico (A), KM4030 quimérico (o) y KM4031 quimérico (□) a las células CD27/Lec8-4, medida mediante la utilización de un citómetro de flujo (CMF). Además, la figura 19(A)(b) muestra los resultados de las mediciones de la actividad de unión del anticuerpo anti-CD27 disponible comercialmente O323 (•) a las células CD27/Lec8-4 utilizando un citómetro de flujo (CMF). La ordenada representa la intensidad media de fluorescencia y la abscisa representa la concentración final de los anticuerpos reaccionados.
[Figura 19(B)] La figura 19(B)(a) muestra el resultado de la actividad de unión de diversos anticuerpos quiméricos anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente: KM4026 quimérico (0), KM4028 quimérico (A), KM4030 quimérico (o) y KM4031 quimérico (□) a células CD27/DG44-4, medida mediante la utilización de un citómetro de flujo (CMF). Además, la figura 19(B)(b) muestra los resultados de las mediciones de la actividad de unión del anticuerpo anti-CD27 disponible comercialmente O323 (•) a las células CD27/DG44-4 utilizando un citómetro de flujo (CMF). La ordenada representa la intensidad media de fluorescencia y la abscisa representa la concentración final de los anticuerpos reaccionados.
[Figura 19(C)] La figura 19(C)(a) muestra el resultado de la actividad de unión de diversos anticuerpos quiméricos anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente: KM4026 quimérico (0), KM4028 quimérico (A), KM4030 quimérico (o) y KM4031 quimérico (□) a las células Lec8, medida mediante la utilización de un citómetro de flujo (CMF). Además, la figura 19(C)(b) muestra los resultados de las mediciones de la actividad de unión del anticuerpo anti-Tn disponible comercialmente 21-1-1 (■) a las células Lec8 utilizando un citómetro de flujo (CMF). La ordenada representa la intensidad media de fluorescencia y la abscisa representa la concentración final de los anticuerpos reaccionados.
[Figura 20] La figura 20 muestra la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (actividad ADCC) de diversos anticuerpos quiméricos anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente: KM4026 quimérico (0), KM4028 quimérico (A), KM4030 quimérico y KM4031 quimérico (□) a células CD27/Lec8-4. La ordenada representa la citotoxicidad celular (%) y la abscisa representa la concentración final de los anticuerpos respectivos.
[Figura 21] La figura 21 muestra la citotoxicidad celular dependiente del complemento (actividad CDC) de diversos anticuerpos quiméricos anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente: KM4026 quimérico, KM4028 quimérico, KM4030 quimérico y KM4031 quimérico a células CD27/Lec8-4. La ordenada representa la citotoxicidad celular (%) y la abscisa representa los anticuerpos reaccionados.
[Figura 22] La figura 22 muestra el método de construcción del vector plásmido pCR mfCD27 que comprende un ADN que codifica una proteína CD27 de Cynomolgus.
[Figura 23] La figura 23 muestra el método de construcción del vector plásmido mfCD27His que comprende un ADN que codifica una proteína CD27 de Cynomolgus.
[Figura 24] La figura 24 muestra el método de construcción de un vector de expresión de CD27 de Cynomolgus pKATEX mfCD27His.
[Figura 25] La figura 25 muestra el resultado de la actividad de unión de diversos anticuerpos quiméricos anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente: KM4026 quimérico, KM4028 quimérico, KM4030 quimérico, KM4031 quimérico y el anticuerpo anti-CD27 disponible comercialmente O323 a células CD27/Lec8 de Cynomolgus o células CD27/DG44 de Cynomolgus, medido mediante la utilización de un citómetro de flujo (CMF), La ordenada representa la intensidad media de fluorescencia y la abscisa representa los anticuerpos reaccionados.
[Figura 26] La figura 26 muestra la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (actividad ADCC) de diversos anticuerpos quiméricos anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente: KM4026 quimérico (♦), KM4028 quimérico (A), KM4030 quimérico (•) y KM4031 quimérico (■) en células CD27/Lec8 de Cynomolgus. La ordenada representa la citotoxicidad celular (%) y la abscisa representa la concentración final de los anticuerpos respectivos.
[Figura 27] La figura 27 muestra la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (actividad ADCC) de diversos anticuerpos quiméricos anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente KM4030 quimérico en células CD27/Lec8 de Cynomolgus (•) o células CD27/Lec8 humanas (o). La ordenada representa la citotoxicidad celular (%) y la abscisa representa la concentración final de los anticuerpos respectivos.
[Figura 28(A)] La figura 28(A)(a) muestra el sensograma Biacore de unión del anticuerpo anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente, KM4026, a CD27-Fc con cadena de azúcar deficiente (CD27-Fc de tipo antígeno Tn). La figura 28(A)(b) muestra el sensograma Biacore para la unión del anticuerpo anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente, KM4027, a CD27-Fc de cadena de azúcar deficiente (CD27-Fc de tipo antígeno Tn). La figura 28(A)(c) muestra el sensograma Biacore para la unión del anticuerpo anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente, KM4028, a CD27-Fc de cadena de azúcar deficiente (CD27-Fc de tipo antígeno Tn). La figura 28(A)(d) muestra el sensograma Biacore para la unión del anticuerpo anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente, KM4030, a CD27-Fc de cadena de azúcar deficiente (CD27-Fc de tipo antígeno Tn). La figura 28(A)(e) muestra el sensograma Biacore para la unión del anticuerpo anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente, KM4031, a CD27-Fc de cadena de azúcar deficiente (CD27-Fc de tipo antígeno Tn). La ordenada representa las UR (unidades de resonancia) y la abscisa representa el tiempo de reacción (segundos).
[Figura 28(B)] La figura 28(B)(a) muestra el sensograma Biacore de unión del anticuerpo anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente, KM4026, a CD27-Fc de tipo antígeno sialil-Tn. La figura 28(B)(b) muestra el sensograma Biacore de unión del anticuerpo anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente, KM4027, a CD27-Fc de tipo antígeno sialil-Tn. La figura 28(B)(c) muestra el sensograma Biacore de unión del anticuerpo anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente, KM4028, a CD27-Fc de tipo antígeno sialil-Tn. La figura 28(B)(d) muestra el sensograma Biacore de unión del anticuerpo anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente, KM4030, a CD27-Fc de tipo antígeno sialil-Tn. La figura 28(B)(e) muestra el sensograma Biacore de unión del anticuerpo anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente, KM4031, a CD27-Fc de tipo antígeno sialil-Tn. La ordenada representa las UR (unidades de resonancia) y la abscisa representa el tiempo de reacción (segundos).
[Figura 29] La figura 29(a) muestra el sensograma Biacore de unión del anticuerpo quimérico anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente, KM4030, a CD27-Fc con cadena de azúcar deficiente (CD27-Fc de tipo antígeno Tn). La figura 29(b) muestra el sensograma Biacore para la unión del anticuerpo humanizado HV0LV0 a CD27-Fc de cadena de azúcar deficiente (CD27-Fc de tipo antígeno Tn). La figura 29(c) muestra el sensograma Biacore para la unión del anticuerpo humanizado HV5LV0 a CD27-Fc de cadena de azúcar deficiente (CD27-Fc de tipo antígeno Tn). La figura 29(d) muestra el sensograma Biacore para la unión del anticuerpo humanizado HV7LV0 a CD27-Fc de cadena de azúcar deficiente (CD27-Fc de tipo antígeno Tn). La ordenada representa las UR (unidades de resonancia) y la abscisa representa el tiempo de reacción (segundos).
[Figura 30(A)] La figura 30(A) muestra el resultado de la actividad de unión del anticuerpo quimérico anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente, KM4030 (o) y anticuerpos humanizados anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente HV0LV0 (□), HV5LV0 (A) y HV7LV0 (0) a células CD27/Lec8-M19, medida mediante la utilización de un citómetro de flujo (CMF) La ordenada representa la intensidad media de fluorescencia y la abscisa representa la concentración final de los anticuerpos respectivos.
[Figura 30(B)] La figura 30(B) muestra el resultado de la actividad de unión del anticuerpo quimérico anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente, KM4030 (o) y anticuerpos humanizados anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente HV0LV0 (□), HV5LV0 (A) y HV7LV0 (0) a células CD27/DG44-4, medida mediante la utilizacion de un citómetro de flujo (CMF) La ordenada representa la intensidad media de fluorescencia y la abscisa representa la concentración final de los anticuerpos reaccionados.
[Figura 31] La figura 31 muestra el resultado de la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (actividad ADCC) del anticuerpo quimérico anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente, KM4030 (o), y anticuerpos humanizados anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente HV0LV0 (□), HV5LV0 (A) y HV7LV0 (0) a células CD27/Lec8-M19. La ordenada representa la citotoxicidad celular (%) y la abscisa representa la concentración final de los anticuerpos respectivos.
[Figura 32] La figura 32 muestra el resultado de la citotoxicidad dependiente del complemento (actividad CDC) del anticuerpo quimérico anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente, KM4030 (o), y anticuerpos humanizados anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente HV0LV0 (□), HV5LV0 (A) y HV7LV0 (0) a células CD27/Lec8-M19. La ordenada representa la citotoxicidad celular (%) y la abscisa representa la concentración final de los anticuerpos reaccionados.
[Figura 33(A)] La figura 33(A) muestra el resultado de la actividad de unión del anticuerpo quimérico anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente, KM4030 (o) y anticuerpos humanizados anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente HV0LV0 (□), HV5LV0 (A) y HV7LV0 (0) a células CD27/Lec8 medida mediante la utilización de un citómetro de flujo (CMF) La ordenada representa la intensidad media de fluorescencia y la abscisa representa la concentración final de los anticuerpos respectivos.
[Figura 33(B)] La figura 33(B) muestra el resultado de la actividad de unión del anticuerpo quimérico anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente, KM4030 (o) y anticuerpos humanizados anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente HV0LV0 (□), HV5LV0 (A) y HV7LV0 (0) a células CD27/DG44, medida mediante la utilización de un citómetro de flujo (CMF) La ordenada representa la intensidad media de fluorescencia y la abscisa representa la concentración final de los anticuerpos respectivos.
Realizaciones para llevar a cabo la invención
La presente invención se refiere a un anticuerpo monoclonal según las reivindicaciones (en adelante también denominado anticuerpo humanizado de la presente invención o el anticuerpo de la presente invención) que reconoce específicamente una región extracelular de un polipéptido codificado por un gen de CD27 que contiene una cadena de azúcar unida a O a la que no se encuentra unida galactosa (en adelante denominada "CD27") y que se une a la región extracelular.
El gen de CD27 puede ser cualquiera, con la condición de que codifique para CD27. Por ejemplo, el gen de CD27 puede ser un gen que contiene una secuencia de nucleótidos representada por la SEC iD n° 1. Además, el gen c D27 según la presente invención incluye un gen que se hibrida con un ADN consistente en la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID n° 1 bajo condiciones restrictivas y también codifica un polipéptido que presenta la función de CD27 y similares.
El ADN que se hibrida bajo condiciones restrictivas se refiere a un ADN hibridable que se obtiene mediante hibridación de colonias, hibridación de placas, hibridación de transferencia southern, micromatrices de ADN o similares, utilizando un ADN que presenta la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID n° 1 como sonda.
Un ejemplo específico de tal ADN es un ADN que puede identificarse llevando a cabo la hibridación a 65°C en presencia de cloruro sódico 0,7 a 1,0 mol/l utilizando un filtro o portaobjetos de vidrio con ADN derivado de colonias o placas o un producto de PCR o oligo de ADN que comprende la secuencia de nucleótidos inmovilizada sobre ella, y después lavar el filtro o portaobjetos de vidrio a 65°C con una concentración 0,1 a 2 veces de solución SSC (concentración de 1 vez de solución SSC: cloruro sódico 150 mmoles/l y citrato sódico 15 mmoles/l).
La hibridación puede llevarse a cabo según los métodos descritos en [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, segunda edición (Cold Spring) Harbor Lab. Press, 1989], Current Protocols in Molecular Biology, (John Wiley & Sons (1987-1997); DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, segunda edición, Oxford) University, 1995), y similares.
El ADN capaz de hibridación bajo condiciones restrictivas incluye ADN que presenta una homología de por lo menos preferentemente 60% o superior, más preferentemente de 80% o superior, y más preferentemente de 95% o superior respecto a la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID n° 1.
En la secuencia de nucleótidos del gen codificante de una proteína de un eucariota, con frecuencia se observan polimorfismos genéticos. El gen CD27 utilizado en la presente invención incluye además un gen en el que se genera una pequeña modificación en la secuencia de nucleótidos mediante dicho polimorfismo.
CD27 incluye un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 2; un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos en la que se ha eliminado, sustituido o añadido por lo menos un aminoácido a la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 2; un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que presenta por lo menos preferentemente 60% de homología, más preferentemente por lo menos 80%, más preferentemente por lo menos 90%, y lo más preferentemente por lo menos 95% respecto a la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 2 y que presenta la función de CD27 y similar.
El polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos en la que uno o más residuos aminoácidos han sido eliminados, sustituidos y/o añadidos a la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 2 puede obtenerse, por ejemplo, mediante la introducción de una mutación dirigida a sitio en el ADN codificante del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 2 mediante la utilización de un método para la mutagénesis dirigida a sitio descrita en Molecular Cloning, A Laboratory Manual, segunda edición (Cold Spring) Harbor Laboratory Press, 1989], Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, 1987-1997), Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6409, (1982), Gene 34:315, 1985, Nucleic Acids Research 13:4431, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985), o similar. El número de residuos aminoácidos que se eliminan, sustituyen o añaden no se encuentra particularmente limitado, y el número preferentemente es de 1 a una docena, tal como 1 a 20, y más preferentemente 1 a varios, tal como 1 a 5.
El número de la homología descrito en la presente invención puede ser un número calculado mediante la utilización de un programa de búsqueda de homologías conocido por el experto en la materia, a menos que se indique lo contrario. Con respecto a la secuencia de nucleótidos, el número puede calcularse mediante la utilización de un parámetro por defecto en BLAST [J. Mol. Biol., 215, 403 (1990)] o similar, y con respecto a la secuencia de aminoácidos, el número puede calcularse mediante la utilización de un parámetro por defecto en BLAST2 [Nucleic Acids Res., 25, 3389 (1997); Genome Res., 7, 649 (1997); http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Education/BLASTinfo/information3.html] o similar.
Como parámetro por defecto, G (coste de abrir hueco) es 5 para la secuencia de nucleótidos y 11 para la secuencia de aminoácidos; -E (coste de extender hueco) es 2 para la secuencia de nucleótidos y 1 para la secuencia de aminoácidos; -q (penalización de no correspondencia de nucleótido) es -3; r (premio por correspondencia de nucleótido) es; -e (valor esperado) es 10; -W (tamaño de palabra) es 11 residuos para la secuencia de nucleótidos y 3 residuos para la secuencia de aminoácidos; y [parada (‘Dropoff)(X) para las extensiones de Blast en bits] es 20 para blastn y 7 para un programa diferente de blastn; -X (valor de parada X para la alineación con huecos, en bits) es 15, y Z (valor de parada X final para la alineación con huecos, en bits) es 50 para blastn y 25 para un programa diferente de blastn (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/html/blastcgihelp.html). El polipéptido que comprende una secuencia parcial de la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 2 puede prepararse según un método conocido por el experto en la materia. Por ejemplo, puede prepararse mediante la eliminación de una parte del ADN codificante de la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 2 y el cultivo de un transformante en el que se introduce un vector de expresión que contiene el ADN. Además, basándose en el polipéptido o ADN preparado de esta manera, un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos en la que se ha eliminado, sustituido o añadido uno o más aminoácidos en una secuencia parcial de la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 2 puede prepararse de la misma manera que la descrita anteriormente.
Entre los ejemplos de la región extracelular de CD27 se incluye una región correspondiente a las posiciones 1 a 171 de la región extracelular predicha por una referencia [The Journal of Immunology, 147, 3165 (1991)] y similares.
En la presente invención, la región extracelular del polipéptido codificado por el gen de CD27, que contiene una cadena de azúcar unida a O a la que no se encuentra unida galactosa puede ser cualquier CD27 que contenga una cadena de azúcar unida a O a la que no se encuentra unida galactosa. Específicamente, entre los ejemplos de la región extracelular se incluye una región extracelular de CD27 que contiene una cadena de azúcar unida a O a la que no se encuentra unida galactosa y que está codificada por la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID n° 1.
La expresión "cadena de azúcar unida a O" se refiere a una estructura en la que se une una cadena de azúcar mediante un grupo -OH contenido en cada cadena lateral de aminoácido de un residuo aminoácido de serina (Ser) o treonina (Thr) de una proteína.
Entre las cadenas de azúcar unidas a O, una cadena de azúcar unida a O que presenta N-acetilgalactosamina (GalNAc) unida al grupo -OH de la cadena lateral de aminoácidos de Ser o Thr en el polipéptido se denomina "cadena de azúcar de tipo mucina". Entre los ejemplos específicos de la cadena de azúcar unida a O se incluyen el antígeno T, el antígeno sialil-T, el antígeno Tn, el antígeno sialil-Tn y similares (Tabla 1).
[Tabla 1]
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En la presente invención, la expresión "cadena unida a O a la que no se encuentra unida galactosa" se refiere a una cadena de azúcar unida a O en la que la galactosa (Gal) no se encuentra unida a N-acetilgalactosamina (GalNAc) unida mediante un grupo -OH del residuo aminoácido de Ser o Thr en una proteína. Específicamente, entre los ejemplos se incluyen el antígeno Tn y el antígeno sialil-Tn anteriormente mencionados.
La cadena de azúcar unida a O a la que no se encuentra unida galactosa es un intermediario en la ruta sintética de una cadena de azúcar unida a O normal y, en general, se observa raramente en glucoproteínas producidas en células normales y la expresión de las mismas se confirma en enfermedades específicas, tales como el cáncer y la nefropatía.
A continuación, en la presente invención, la cadena de azúcar unida a O a la que no se encuentra unida galactosa puede en ocasiones denominarse cadena de azúcar anormal, una proteína a la que se encuentra unida la cadena de azúcar anormal en ocasiones puede denominarse proteína con cadena de azúcar deficiente y CD27 al que se encuentra unida la cadena de azúcar anormal en ocasiones puede denominarse CD27 con cadena de azúcar deficiente.
Entre los ejemplos del residuo aminoácido de un polipéptido al que se encuentra unido una cadena de azúcar unida a O se incluye un residuo aminoácido de serina (Ser) y de treonina (Thr) en una secuencia de aminoácidos de la región extracelular de la proteína CD27.
Además, el residuo aminoácido de un polipéptido al que se encuentra unida la cadena de azúcar unida a O puede confirmarse mediante una secuencia de consenso de cadena de azúcar unida a O utilizando un software de secuenciación, tal como el servidor NetOGlyc3.1 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/). Alternativamente, un sitio de unión específico de cadena de azúcar puede determinarse mediante análisis de espectrometría de masas (EM) de una glucoproteína que contiene una cadena de azúcar unida a O.
En la presente invención, como residuo aminoácido del polipéptido al que se encuentra unido la cadena de azúcar unida a O en la proteína CD27, puede unirse cualquiera de los residuos Ser y Thr en la secuencia de aminoácidos de la proteína CD27 mediante una cadena de azúcar unida a O. Entre los ejemplos de ellos preferentemente se incluye un sitio de unión de cadena de azúcar que comprende por lo menos un residuo aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Thr en la posición 118, Ser en la posición 127, Thr en la posición 129, Ser en la posición 132, Ser en la posición 133, Ser en la posición 137, Thr en la posición 143, Ser en la posición 149, Thr en la posición 156, Thr en la posición 162, Thr en la posición 173, Ser en la posición 175 y Thr en la posición 176 en la proteína CD27 representada por la SEC ID n° 2.
El número de cadenas de azúcar unidas a O que se unen a la región extracelular por cada molécula de proteína CD27 puede ser cualquier número con la condición de que las cadenas de azúcar unidas a O se unan a por lo menos un residuo Ser o Thr. El número de cadenas de azúcar unidas a O no se encuentra limitado.
Como método para obtener una célula que exprese CD27 que contiene una cadena de azúcar unida a O al que no se encuentra unida galactosa (en adelante denominada "CD27 con cadena de azúcar deficiente") de la presente invención, un método que comprende construir una célula expresante de CD27 deficiente en cadena de azúcar mediante la introducción de ADN codificante de CD27 en una estirpe celular en la que la actividad de un enzima capaz de añadir Gal a N-acetilgalactosamina (GalNAc) unida a Ser/Thr en el polipéptido, de una proteína que participa en la actividad del enzima, o de una proteína que participa en el transporte de la uridín 5'-difosfatogalactosa (UDP-galactosa), se encuentra reducida o anulada en el procedimiento de síntesis de cadena de azúcar unida a O, y de esta manera se obtiene la célula que expresa c D27 con cadena de azúcar deficiente.
Alternativamente, por ejemplo, la célula que expresa CD27 que presenta una cadena de azúcar unida a O al que no se encuentra unida galactosa también puede construirse mediante tratamiento de la célula que expresa CD27 con una cadena de azúcar unida a O normal con un enzima de corte de cadena de azúcar, tal como sialidasa y galactosidasa.
Entre los ejemplos específicos del enzima capaces de añadir Gal a GalNAc unido a Ser o Thr en el polipéptido pueden incluirse la p1,3-galactosiltransferasa [The Journal of Biological Chemistry, 277, 178-186 (2002)] y similares.
Entre los ejemplos de la proteína que participa en la actividad del enzima de adición de Gal a GalNAc unido a Ser o Thr en el polipéptido se incluye Cosmc [Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 99, 16613-16618 (2002)], que es una chaperona que participa en el plegamiento proteico del enzima, y similares.
Puede utilizarse una célula expresante de CD27 derivada de un paciente con nefropatía de IgA, como célula expresante de CD27, basándose en el hecho de que una actividad enzimática se encuentra reducida o anulada debido a la incidencia de adición, eliminación, sustitución o similar en un ADN que codifica un enzima capaz de añadir Gal a GalNAc unido a Ser/Thr en el polipéptido, una proteína que participa en la actividad del enzima, una proteína que participa en el transporte de UDP-galactosa, o similares.
Entre los ejemplos de la proteína que participa en el transporte de la UDP-galactosa se incluye el transportador de la UDP-galactosa y similares. Entre los ejemplos de la estirpe celular en la que la actividad del transportador de UDP-galactosa se encuentra reducida o anulada se incluyen las células Lec8 [Glycobiology, 1, 307-14 (1991)] y similares.
En la presente invención, entre los ejemplos de la célula que expresa CD27 con cadena de azúcar deficiente se incluye una célula que se encuentra naturalmente presente en el cuerpo humano, una estirpe celular establecida a partir de la célula que se encuentra naturalmente presente en el cuerpo humano, una célula obtenida mediante técnicas de recombinación genética, y similares.
Resulta preferida una estirpe celular en la que, en el procedimiento de síntesis de la cadena de azúcar unida a O, una actividad de un enzima capaz de añadir Gal a GalNAc unido a Ser/Thr en el polipéptido, una proteína que participa en la actividad del enzima o una proteína que participa en el transporte de UDP-galactosa, se encuentra reducida o eliminada tal como se ha indicado anteriormente, una célula que presenta una propiedad similar y presente naturalmente en el cuerpo humano, y similares.
Un ejemplo de la célula naturalmente presente en el cuerpo humano es preferentemente una estirpe celular en la que en el procedimiento de síntesis de cadena de azúcar unida a O, una actividad de un enzima capaz de añadir Gal a GalNAc unido a Ser/Thr en el polipéptido, una proteína que participa en la actividad del enzima o una proteína que participa en el transporte de la UDP-galactosa, se encuentra reducida o anulada.
Entre los ejemplos específicos de dicha célula se incluye una célula que expresa la proteína CD27 en los cuerpos de pacientes que sufren de nefropatía de IgA o cáncer. Entre los ejemplos de célula se incluye una célula que expresa la proteína CD27 entre las células de tipo inmunológico o células tumorales obtenidas mediante biopsia o similares.
Entre los ejemplos de la célula obtenida mediante técnicas de recombinación genética se incluye una célula expresante de CD27 con cadena de azúcar deficiente obtenida mediante la construcción de una célula hospedadora en la que, en el procedimiento de síntesis de cadena de azúcar unida a O, una actividad de un enzima de adición de Gal a GalNAc unido a Ser/Thr en el polipéptido, una proteína que participa en la actividad del enzima o una proteína que participa en el transporte de la UDP-galactosa, se encuentra reducida o anulada y después introducir un vector de expresión que contiene ADNc codificante de un polipéptido deseado en la célula hospedadora.
Entre los ejemplos específicos de célula hospedadora se incluyen una célula Lec8 en la que la actividad del transportador de UDP-galactosa se encuentra reducida, o una célula expresante de anticuerpos derivada de un paciente con nefropatía de IgA en la que la actividad enzimática se encuentra reducida o eliminada debido a una anormalidad en la p 1,3-galactosiltransferasa o en una proteína chaperona Cosmc que participa en la actividad del enzima.
Además, la proteína CD27 con cadena de azúcar deficiente puede construirse mediante la utilización de la célula expresante de CD27 anteriormente indicada para expresar y purificar la proteína CD27 con cadena de azúcar deficiente.
La proteína CD27 con cadena de azúcar deficiente puede obtenerse mediante la expresión de la proteína CD27 en forma de una proteína de fusión con otro material, seguido de purificación.
Entre los ejemplos del material que debe fusionarse con la proteína CD27 se incluyen polipéptidos, tales como región constante de anticuerpo, región Fc de anticuerpo, etiqueta GST, etiqueta histidina (también denominada "etiqueta His") y etiqueta Myc. La proteína de fusión puede separarse y purificarse mediante la utilización de una columna de afinidad, tal como una columna de proteína A, una columna de níquel y una columna de anticuerpo específico.
El anticuerpo monoclonal o el fragmento de anticuerpo de la presente invención presenta una actividad de unión a la célula CD27 con cadena de azúcar deficiente o CD27 con cadena de azúcar deficiente.
La unión del anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la presente invención a la región extracelular de un polipéptido CD27 con cadena de azúcar deficiente puede confirmarse mediante un método en el que se confirma la capacidad de unión de una célula que expresa un antígeno especificado y un anticuerpo para el antígeno específico, por ejemplo mediante un método de detección inmunológica conocido convencionalmente, preferentemente un método de tinción de células fluorescentes o similares.
Además, también puede confirmarse mediante una combinación de métodos de detección inmunológica convencionalmente conocidos [Monoclonal Antibodies-Principles and Practice, tercera edición, Academic Press (1996), Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988), Monoclonal Antibody Experiment Manual, Kodansha Scientific (1987)] y similares.
El anticuerpo monoclonal de la presente invención incluye un anticuerpo según las reivindicaciones producido por un hibridoma y un anticuerpo recombinante según las reivindicaciones producido por un transformante transformado con un vector de expresión que contiene un gen codificante de un anticuerpo.
El hibridoma puede prepararse mediante, por ejemplo, la preparación de la célula anteriormente indicada que expresa CD27 con cadena de azúcar deficiente como antígeno, que induce una célula productora de anticuerpo con especificidad de antígeno procedente de un animal inmunizado con el antígeno, y fusionar la célula productora de antígeno con una célula de mieloma. El anticuerpo anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente puede obtenerse mediante el cultivo del hibridoma o la administración de la célula de hibridoma en un animal para provocar un tumor ascítico en el animal, y separar y purificar el cultivo o el líquido ascítico.
El animal humanizado con un antígeno puede ser cualquier animal, con la condición de que pueda prepararse un hibridoma, y se utilizan convenientemente un ratón, rata, hámster, conejo y similares. Además, la célula que presenta actividad productora de anticuerpos puede obtenerse de dicho animal, y el anticuerpo de la presente invención incluye un anticuerpo según las reivindicaciones producido por un hibridoma obtenido mediante fusión de la célula después de la inmunización in vitro con una célula de mieloma.
El anticuerpo monoclonal es un anticuerpo secretado por un único clon de células productoras de anticuerpos y reconoce únicamente un epítopo (también denominado determinante antigénico) y presenta una secuencia de aminoácidos uniforme (estructura primaria).
Entre los ejemplos de epítopo se incluyen una única secuencia de aminoácidos, una estructura tridimensional que consiste en una secuencia de aminoácidos, una secuencia de aminoácidos que presenta una cadena de azúcar unida a la misma, una estructura tridimensional que consiste en una secuencia de aminoácidos que presenta una cadena de azúcar unida a la misma, y similares, que reconoce y a la que se une un anticuerpo monoclonal. Entre los ejemplos del epítopo del anticuerpo monoclonal de la presente invención se incluye una estructura tridimensional de la proteína c D27 con cadena de azúcar deficiente.
Entre los ejemplos del anticuerpo monoclonal de la presente exposición se incluye cualquier anticuerpo monoclonal, con la condición de que reconozca y también se une a la región extracelular de CD27 con cadena de azúcar deficiente. Entre los ejemplos específicos del anticuerpo monoclonal se incluyen los anticuerpos monoclonales KM4026, KM4027, KM4028, KM4030, KM4031 y similares.
Más específicamente, entre los ejemplos del anticuerpo monoclonal de la presente exposición se incluye un anticuerpo monoclonal KM4026 producido por el hibridoma KM4026, un anticuerpo monoclonal que compite con el anticuerpo monoclonal KM4026 para la unión a la región extracelular de CD27 con cadena de azúcar deficiente y un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo presente en la región extracelular de CD27 con cadena de azúcar deficiente a la que se une el anticuerpo monoclonal KM4026.
Entre los ejemplos del anticuerpo monoclonal de la presente exposición se incluye un anticuerpo monoclonal KM4027 producido por el hibridoma KM4027, un anticuerpo monoclonal que compite con el anticuerpo monoclonal KM4027 para la unión a la región extracelular de CD27 con cadena de azúcar deficiente y un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo presente en la región extracelular de CD27 con cadena de azúcar deficiente a la que se une el anticuerpo monoclonal KM4027.
Entre los ejemplos del anticuerpo monoclonal de la presente exposición se incluye un anticuerpo monoclonal KM4028 producido por el hibridoma KM4028, un anticuerpo monoclonal que compite con el anticuerpo monoclonal KM4028 para la unión a la región extracelular de CD27 con cadena de azúcar deficiente y un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo presente en la región extracelular de CD27 con cadena de azúcar deficiente a la que se une el anticuerpo monoclonal KM4028.
Entre los ejemplos del anticuerpo monoclonal de la presente exposición se incluye un anticuerpo monoclonal KM4030 producido por el hibridoma KM4030, un anticuerpo monoclonal que compite con el anticuerpo monoclonal KM4030 para la unión a la región extracelular de CD27 con cadena de azúcar deficiente y un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo presente en la región extracelular de CD27 con cadena de azúcar deficiente a la que se une el anticuerpo monoclonal KM4030.
Entre los ejemplos del anticuerpo monoclonal de la presente exposición se incluye un anticuerpo monoclonal KM4031 producido por el hibridoma KM4031, un anticuerpo monoclonal que compite con el anticuerpo monoclonal KM4031 para la unión a la región extracelular de CD27 con cadena de azúcar deficiente y un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo presente en la región extracelular de CD27 con cadena de azúcar deficiente a la que se une el anticuerpo monoclonal KM4031.
Entre los ejemplos del anticuerpo monoclonal que compite con el anticuerpo monoclonal de la presente invención se incluye específicamente un anticuerpo monoclonal que presenta una reacción competitiva con una diversidad de anticuerpos monoclonales y el epítopo presente en la región extracelular de CD27 con cadena de azúcar deficiente, tal como se ha indicado anteriormente.
Además, entre los ejemplos del anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo al que se une el anticuerpo monoclonal de la presente invención se incluyen, específicamente, un anticuerpo monoclonal que se une al epítopo presente en la región extracelular de CD27 con cadena de azúcar deficiente que resulta reconocido por una diversidad de anticuerpos monoclonales indicados anteriormente.
El hibridoma KM4030 ha sido depositado en el Depósito de internacional de organismos patentados, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Central 6, 1-1-1, Higashi, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305­ 8566, Japón) bajo el Tratado de Budapest con la referencia n° FERM BP-10976 el 5 de junio de 2008
El anticuerpo recombinante incluye un anticuerpo producido mediante recombinación genética, tal como un anticuerpo quimérico humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano y un fragmento de anticuerpo de los mismos. Entre los anticuerpos recombinantes, resulta preferente como agente terapéutico uno con actividad de unión a antígeno, baja inmunogenicidad y semivida en sangre prolongada.
El anticuerpo quimérico humano es un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada (en adelante denominado "VH") y una región variable de cadena ligera (en adelante denominado "VL") de un anticuerpo de un animal no humano y una región constante de cadena pesada (en adelante denominado "CH") y una región constante de cadena ligera (en adelante denominada "CL") de un anticuerpo humano.
El anticuerpo quimérico humano de la presente invención puede producirse de la manera siguiente. Específicamente, el anticuerpo quimérico humano puede producirse mediante la obtención de ADNc codificantes de VH y VL de un anticuerpo monoclonal que reconoce específicamente CD27 con cadena de azúcar deficiente y que se une a la región extracelular o un hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal que reconoce específicamente CD27 con cadena de azúcar deficiente y se une a la región extracelular, mediante la inserción de cada una de ellas en un vector de expresión para células animales que comprende ADN codificantes de CH y CL de anticuerpo humano, construyendo de esta manera un vector para la expresión de anticuerpo quimérico humano y después introduciendo el vector en una célula animal para expresar el anticuerpo.
Como CH del anticuerpo quimérico humano, puede utilizarse cualquier CH, con la condición de que pertenezca a una inmunoglobulina humana (en adelante denominada "Ig_h") y resultan preferentes las pertenecientes a la clase IgG_h. Además, puede utilizarse cualquiera de las subclases pertenecientes a la clase IgG_h, tal como IgG1_h, IgG2_h, IgG3_h e IgG4_h.
Además, como CL del anticuerpo quimérico humano, puede utilizarse cualquier CL, con la condición de que pertenezca a la clase Ig_h, y también pueden utilizarse cualquiera perteneciente a la clase k o A.
Entre los ejemplos del anticuerpo quimérico humano de la presente exposición se incluyen los anticuerpos quiméricos humanos (1) a (5) a continuación:
(1) un anticuerpo quimérico humano en el que VH del anticuerpo es la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 25 y VL del anticuerpo es la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 35;
(2) un anticuerpo quimérico humano en el que VH del anticuerpo es la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 26 y VL del anticuerpo es la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 36;
(3) un anticuerpo quimérico humano en el que VH del anticuerpo es la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 27 y VL del anticuerpo es la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 37;
(4) un anticuerpo quimérico humano en el que VH del anticuerpo es la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 28 y VL del anticuerpo es la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 38, y
(5) un anticuerpo quimérico humano en el que VH del anticuerpo es la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 29 y VL del anticuerpo es la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 39.
Además, entre los ejemplos del anticuerpo quimérico humano de la presente exposición se incluyen los anticuerpos quiméricos humanos (1) a (5) a continuación:
(1) un anticuerpo quimérico humano en el que VH del anticuerpo comprende las secuencias de aminoácidos de las CDR 1 a 3 representadas por las SEC ID n° 40 a 42, respectivamente, y VL del anticuerpo comprende las secuencias de aminoácidos de las CDR 1 a 3 representadas por las SEC ID n° 43 a 45, respectivamente,
(2) un anticuerpo quimérico humano en el que VH del anticuerpo comprende las secuencias de aminoácidos de las CDR 1 a 3 representadas por las SEC ID n° 46 a 48, respectivamente, y VL del anticuerpo comprende las secuencias de aminoácidos de las CDR 1 a 3 representadas por las SEC ID n° 49 a 51, respectivamente,
(3) un anticuerpo quimérico humano en el que VH del anticuerpo comprende las secuencias de aminoácidos de las CDR 1 a 3 representadas por las SEC ID n° 52 a 54, respectivamente, y VL del anticuerpo comprende las secuencias de aminoácidos de las CDR 1 a 3 representadas por las SEC ID n° 55 a 57, respectivamente,
(4) un anticuerpo quimérico humano en el que VH del anticuerpo comprende las secuencias de aminoácidos de las CDR 1 a 3 representadas por las SEC ID n° 58 a 60, respectivamente, y VL del anticuerpo comprende las secuencias de aminoácidos de las CDR 1 a 3 representadas por las SEC ID n° 61 a 63, respectivamente,
(5) un anticuerpo quimérico humano en el que VH del anticuerpo comprende las secuencias de aminoácidos de las CDR 1 a 3 representadas por las SEC ID n° 64 a 66, respectivamente, y VL del anticuerpo comprende las secuencias de aminoácidos de las CDR 1 a 3 representadas por las SEC ID n° 67 a 69, respectivamente,
Un anticuerpo humanizado es un anticuerpo en el que las secuencias de aminoácidos de los CDR de VH y VL de un anticuerpo derivado de un animal no humano se injertan en posiciones apropiadas de VH y VL de un anticuerpo humano y también se denomina anticuerpo injertado con CDR humano o un anticuerpo reformado. El anticuerpo humanizado de la presente invención puede producirse mediante la construcción de ADNc codificante de una región variable de anticuerpo (en adelante denominada "región V") en la que las secuencias de aminoácidos de las CDR de VH y VL de un anticuerpo animal no humano producido por un hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal que reconoce específicamente la proteína CD27 con cadena de azúcar deficiente y que se une a la región extracelular en la presente invención, se injerta en marcos (en adelante denominados "FR") de VH y VL de cualquier anticuerpo humano, insertando cada uno de ellos en un vector para la expresión de células animales que comprenden genes codificantes de CH y CL de un anticuerpo humano para construir de esta manera un vector de expresión para anticuerpos humanizados e introducirlos en una célula animal para producir de esta manera la expresión.
Como secuencias de aminoácidos de las FR de VH y VL del anticuerpo humano de la presente exposición, pueden utilizarse cualesquiera secuencias de aminoácidos, con la condición de que sean secuencias de aminoácidos de VH y VL, respectivamente, derivadas de un anticuerpo humano. Entre los ejemplos se incluyen secuencias de aminoácidos de los FR de VH y VL de anticuerpos humanos registrados en una base de datos, tal como Protein Data Bank, secuencias de aminoácidos comunes de cada subgrupo de FR de VH y VL de anticuerpos humanos descritos en, por ejemplo, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Us Dept. Health and Human Services (1991), y similares.
Como CH del anticuerpo humanizado de la presente invención, puede utilizarse cualquier CH, con la condición de que pertenezca a la clase de Ig_h y resultan preferentes los de la clase IgG_h. Además, puede utilizarse cualquiera de las subclases pertenecientes a la clase IgG_h, tal como IgG1_h, IgG2_h, IgG3_h e IgG4_h.
Además, como CL del anticuerpo humanizado de la presente invención, puede utilizarse cualquier CL, con la condición de que pertenezca a la clase de Ig_h y pueden utilizarse los pertenecientes a la clase k o A.
Entre los ejemplos del anticuerpo humanizado de la presente exposición se incluyen los anticuerpos (1) a (5) humanizados a continuación:
(1) un anticuerpo humanizado en el que los CDR 1 a 3 de la VH del anticuerpo comprenden las secuencias de aminoácidos representadas por las SEC ID n° 40 a 42, respectivamente, y las CDR 1 a 3 de VL del anticuerpo comprenden las secuencias de aminoácidos representadas por SEC ID n° 43 a 45, respectivamente;
(2) un anticuerpo humanizado en el que los CDR 1 a 3 de la VH del anticuerpo comprenden las secuencias de aminoácidos representadas por las SEC ID n° 46 a 48, respectivamente, y las CDR 1 a 3 de VL del anticuerpo comprenden las secuencias de aminoácidos representadas por SEC ID n° 49 a 51, respectivamente;
(3) un anticuerpo humanizado en el que los CDR 1 a 3 de la VH del anticuerpo comprenden las secuencias de aminoácidos representadas por las SEC ID n° 52 a 54, respectivamente, y las CDR 1 a 3 de VL del anticuerpo comprenden las secuencias de aminoácidos representadas por SEC ID n° 55 a 57, respectivamente;
(4) un anticuerpo humanizado en el que los CDR 1 a 3 de la VH del anticuerpo comprenden las secuencias de aminoácidos representadas por las SEC ID n° 58 a 60, respectivamente, y las CDR 1 a 3 de VL del anticuerpo comprenden las secuencias de aminoácidos representadas por SEC ID n° 61 a 63, respectivamente;
(5) un anticuerpo humanizado en el que los CDR 1 a 3 de la VH del anticuerpo comprenden las secuencias de aminoácidos representadas por las SEC ID n° 64 a 66, respectivamente, y las CDR 1 a 3 de VL del anticuerpo comprenden las secuencias de aminoácidos representadas por SEC ID n° 67 a 69, respectivamente;
Además, como ejemplos específicos del anticuerpo humanizado de la presente exposición, un anticuerpo humanizado que comprende por lo menos uno de (a) VH y (b) VL. Además, en (a) y (b) a continuación, no se encuentra limitado el número de modificaciones que se introducen.
(a) VH que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID n° 96 o una secuencia de aminoácidos en la que Ser en la posición 30, Val en la posición 48, Ser en la posición 49, Asn en la posición 77, Val en la posición 93, Ala en la posición 97 y Thr en la posición 117 en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96 se sustituyen por otros residuos aminoácidos,
(b) VL que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID n° 97 o una secuencia de aminoácidos en la que Ile en la posición 21, Pro en la posición 40, Val en la posición 58, Thr en la posición 85 y Tyr en la posición 87 en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 97 se sustituyen por otros residuos aminoácidos.
Un ejemplo de VH comprendido en el anticuerpo humanizado de la presente exposición incluye VH que comprende una secuencia de aminoácidos en la que Ser en la posición 30, Val en la posición 48, Ser en la posición 49, Asn en la posición 77 y Ala en la posición 97 en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96 se sustituyen por otros residuos aminoácidos.
Entre ellos, como VH comprendida en el anticuerpo humanizado de la presente exposición, resultan preferentes (1) y (2) a continuación.
(1) VH que comprende una secuencia de aminoácidos en la que Val en la posición 48, Ser en la posición 49 y Ala en la posición 97 en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96 se sustituyen por otros residuos aminoácidos,
(2) VH que comprende una secuencia de aminoácidos en la que Ser en la posición 30 y Ala en la posición 97 en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96 se sustituyen por otros residuos aminoácidos.
Entre los ejemplos de la secuencia de aminoácidos de VH anterior se incluye una secuencia de aminoácidos en la que por lo menos una modificación seleccionada de modificaciones de aminoácidos de sustitución Ser en la posición 30 por Asn, Val en la posición 48 por Ile, Ser en la posición 49 por Ala, Asn en la posición 77 por Gly, Val en la posición 93 por Thr, Ala en la posición 97 por Thr, y Thr en la posición 117 por Val, se introduce en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96.
Específicamente, como secuencia de aminoácidos de VH, anteriormente, por ejemplo pueden indicarse secuencias de aminoácidos en las que se introducen la una a siete modificaciones siguientes.
Entre los ejemplos específicos de la secuencia de aminoácidos de VH en la que se introducen siete modificaciones se incluyen una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Ser en la posición 30 por Asn, Val en la posición 48 por Ile, Ser en la posición 49 por Ala, Asn en la posición 77 por Gly, Val en la posición 93 por Thr, Ala en la posición 97 por Thr, y Thr en la posición 117 por Val, en la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID n° 96.
Entre los ejemplos específicos de la secuencia de aminoácidos de VH en la que se introducen seis modificaciones se incluyen las secuencias de aminoácidos (1) a (7) a continuación:
(1) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Ser en la posición 30 por Asn, Val en la posición 48 por Ile, Ser en la posición 49 por Ala, Asn en la posición 77 por Gly, Val en la posición 93 por Thr, y Ala en la posición 97 por Thr, en la secuencia de aminoácidos representada por la s Ec ID n° 96;
(2) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Ser en la posición 30 por Asn, Val en la posición 48 por Ile, Ser en la posición 49 por Ala, Asn en la posición 77 por Gly, Val en la posición 93 por Thr, y Thr en la posición 117 por Val, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(3) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Ser en la posición 30 por Asn, Val en la posición 48 por Ile, Ser en la posición 49 por Ala, Asn en la posición 77 por Gly, Ala en la posición 97 por Thr, y Thr en la posición 117 por Val, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(4) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Ser en la posición 30 por Asn, Val en la posición 48 por Ile, Ser en la posición 49 por Ala, Val en la posición 93 por Thr, Ala en la posición 97 por Thr, y Thr en la posición 117 por Val, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(5) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Ser en la posición 30 por Asn, Val en la posición 48 por Ile, Asn en la posición 77 por Gly, Val en la posición 93 por Thr, Ala en la posición 97 por Thr, y Thr en la posición 117 por Val, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(6) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Ser en la posición 30 por Asn, Ser en la posición 49 por Ala, Asn en la posición 77 por Gly, Val en la posición 93 por Thr, Ala en la posición 97 por Thr, y Thr en la posición 117 por Val, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96, y
(7) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Val en la posición 48 por Ile, Ser en la posición 49 por Ala, Asn en la posición 77 por Gly, Val en la posición 93 por Thr, Ala en la posición 97 por Thr, y Thr en la posición 117 por Val, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96.
Entre los ejemplos específicos de la secuencia de aminoácidos de VH en la que se introducen cinco modificaciones en la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID n° 96 se incluyen las secuencias de aminoácidos (1) a (21) a continuación:
(1) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Ser en la posición 49 por Ala, Asn en la posición 77 por Gly, Val en la posición 93 por Thr, Ala en la posición 97 por Thr, y Thr en la posición 117 por Val, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(2) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Val en la posición 48 por Ile, Asn en la posición 77 por Gly, Val en la posición 93 por Thr, Ala en la posición 97 por Thr, y Thr en la posición 117 por Val, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(3) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Val en la posición 48 por Ile, Ser en la posición 49 por Ala, Val en la posición 93 por Thr, Ala en la posición 97 por Thr, y Thr en la posición 117 por Val, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(4) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Val en la posición 48 por Ile, Ser en la posición 49 por Ala, Asn en la posición 77 por Gly, Ala en la posición 97 por Thr, y Thr en la posición 117 por Val, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(5) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Val en la posición 48 por Ile, Ser en la posición 49 por Ala, Asn en la posición 77 por Gly, Val en la posición 93 por Thr, y Thr en la posición 117 por Val, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(6) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Val en la posición 48 por Ile, Ser en la posición 49 por Ala, Asn en la posición 77 por Gly, Val en la posición 93 por Thr, y Ala en la posición 97 por Thr, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(7) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Ser en la posición 30 por Asn, Asn en la posición 77 por Gly, Val en la posición 93 por Thr, Ala en la posición 97 por Thr, y Thr en la posición 117 por Val, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(8) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Ser en la posición 30 por Asn, Ser en la posición 49 por Ala, Val en la posición 93 por Thr, Ala en la posición 97 por Thr, y Thr en la posición 117 por Val, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(9) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Ser en la posición 30 por Asn, Ser en la posición 49 por Ala, Val en la posición 77 por Gly, Ala en la posición 97 por Thr, y Thr en la posición 117 por Val, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(10) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Ser en la posición 30 por Asn, Ser en la posición 49 por Ala, Asn en la posición 77 por Gly, Val en la posición 93 por Thr, y Thr en la posición 117 por Val, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(11) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Ser en la posición 30 por Asn, Ser en la posición 49 por Ala, Asn en la posición 77 por Gly, Val en la posición 93 por Thr, y Ala en la posición 97 por Thr, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(12) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Ser en la posición 30 por Asn, Val en la posición 48 por Ile, Val en la posición 93 por Thr, Ala en la posición 97 por Thr, y Thr en la posición 117 por Val, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(13) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Ser en la posición 30 por Asn, Val en la posición 48 por Ile, Asn en la posición 77 por Gly, Ala en la posición 97 por Thr, y Thr en la posición 117 por Val, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(14) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Ser en la posición 30 por Asn, Val en la posición 48 por Ile, Asn en la posición 77 por Gly, Val en la posición 93 por Thr, y Thr en la posición 117 por Val, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(15) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Ser en la posición 30 por Asn, Val en la posición 48 por Ile, Asn en la posición 77 por Gly, Val en la posición 93 por Thr, y Ala en la posición 97 por Thr, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(16) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Ser en la posición 30 por Asn, Val en la posición 48 por Ile, Ser en la posición 49 por Ala, Ala en la posición 97 por Thr, y Thr en la posición 117 por Val, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(17) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Ser en la posición 30 por Asn, Val en la posición 48 por Ile, Ser en la posición 49 por Ala, Val en la posición 93 por Thr, y Thr en la posición 117 por Val, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(18) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Ser en la posición 30 por Asn, Val en la posición 48 por Ile, Ser en la posición 49 por Ala, Val en la posición 93 por Thr, y Ala en la posición 97 por Thr, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(19) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Ser en la posición 30 por Asn, Val en la posición 48 por Ile, Ser en la posición 49 por Ala, Asn en la posición 77 por Gly, y Thr en la posición 117 por Val, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(20) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Ser en la posición 30 por Asn, Val en la posición 48 por Ile, Ser en la posición 49 por Ala, Asn en la posición 77 por Gly, y Ala en la posición 97 por Thr, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96, y
(21) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Ser en la posición 30 por Asn, Val en la posición 48 por Ile, Ser en la posición 49 por Ala, Asn en la posición 77 por Gly, y Val en la posición 93 por Thr, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96.
Entre los ejemplos específicos de la secuencia de aminoácidos de VH en la que se introducen cuatro modificaciones en la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID n° 96 se incluyen las secuencias de aminoácidos (1) a (35) a continuación:
(1) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Asn en la posición 77 por Gly, Val en la posición 93 por Thr, Ala en la posición 97 por Thr, y Thr en la posición 117 por Val, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(2) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Ser en la posición 49 por Ala, Val en la posición 93 por Thr, Ala en la posición 97 por Thr, y Thr en la posición 117 por Val, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(3) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Ser en la posición 49 por Ala, Asn en la posición 77 por Gly, Ala en la posición 97 por Thr, y Thr en la posición 117 por Val, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(4) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Ser en la posición 49 por Ala, Asn en la posición 77 por Gly, Val en la posición 93 por Thr, y Thr en la posición 117 por Val, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(5) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Ser en la posición 49 por Ala, Asn en la posición 77 por Gly, Val en la posición 93 por Thr, y Ala en la posición 97 por Thr, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(6) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Val en la posición 48 por Ile, Val en la posición 93 por Thr, Ala en la posición 97 por Thr, y Thr en la posición 117 por Val, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(7) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Val en la posición 48 por Ile, Asn en la posición 77 por Gly, Ala en la posición 97 por Thr, y Thr en la posición 117 por Val, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(8) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Val en la posición 48 por Ile, Asn en la posición 77 por Gly, Val en la posición 93 por Thr, y Thr en la posición 117 por Val, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(9) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Val en la posición 48 por Ile, Asn en la posición 77 por Gly, Val en la posición 93 por Thr, y Ala en la posición 97 por Thr, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(10) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Val en la posición 48 por Ile, Ser en la posición 49 por Ala, Ala en la posición 97 por Thr, y Thr en la posición 117 por Val, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(11) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Val en la posición 48 por Ile, Ser en la posición 49 por Ala, Val en la posición 93 por Thr, y Thr en la posición 117 por Val, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(12) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Val en la posición 48 por Ile, Ser en la posición 49 por Ala, Val en la posición 93 por Thr, y Ala en la posición 97 por Thr, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(13) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Val en la posición 48 por Ile, Ser en la posición 49 por Ala, Asn en la posición 77 por Gly, y Thr en la posición 117 por Val, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(14) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Val en la posición 48 por Ile, Ser en la posición 49 por Ala, Asn en la posición 77 por Gly, y Ala en la posición 97 por Thr, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(15) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Val en la posición 48 por Ile, Ser en la posición 49 por Ala, Asn en la posición 77 por Gly, y Val en la posición 93 por Thr, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(16) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Ser en la posición 30 por Asn, Val en la posición 93 por Thr, Ala en la posición 97 por Thr, y Thr en la posición 117 por Val, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(17) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Ser en la posición 30 por Asn, Asn en la posición 77 por Gly, Ala en la posición 97 por Thr, y Thr en la posición 117 por Val, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(18) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Ser en la posición 30 por Asn, Asn en la posición 77 por Gly, Val en la posición 93 por Thr, y Thr en la posición 117 por Val, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(19) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Ser en la posición 30 por Asn, Asn en la posición 77 por Gly, Val en la posición 93 por Thr, y Ala en la posición 97 por Thr, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(20) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Ser en la posición 30 por Asn, Ser en la posición 49 por Ala, Ala en la posición 97 por Thr, y Thr en la posición 117 por Val, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(21) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Ser en la posición 30 por Asn, Ser en la posición 49 por Ala, Val en la posición 93 por Thr, y Thr en la posición 117 por Val, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(22) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Ser en la posición 30 por Asn, Ser en la posición 49 por Ala, Val en la posición 93 por Thr, y Ala en la posición 97 por Thr, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(23) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Ser en la posición 30 por Asn, Ser en la posición 49 por Ala, Asn en la posición 77 por Gly, y Thr en la posición 117 por Val, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(24) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Ser en la posición 30 por Asn, Ser en la posición 49 por Ala, Asn en la posición 77 por Gly, y Ala en la posición 97 por Thr, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(25) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Ser en la posición 30 por Asn, Ser en la posición 49 por Ala, Asn en la posición 77 por Gly, y Val en la posición 93 por Thr, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(26) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Ser en la posición 30 por Asn, Val en la posición 48 por Ile, Ala en la posición 97 por Thr, y Thr en la posición 117 por Val, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(27) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Ser en la posición 30 por Asn, Val en la posición 48 por Ile, Val en la posición 93 por Thr, y Thr en la posición 117 por Val, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(28) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Ser en la posición 30 por Asn, Val en la posición 48 por Ile, Val en la posición 93 por Thr, y Ala en la posición 97 por Thr, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(29) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Ser en la posición 30 por Asn, Val en la posición 48 por Ile, Asn en la posición 77 por Gly, y Thr en la posición 117 por Val, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(30) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Ser en la posición 30 por Asn, Val en la posición 48 por Ile, Asn en la posición 77 por Gly, y Ala en la posición 97 por Thr, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(31) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Ser en la posición 30 por Asn, Val en la posición 48 por Ile, Asn en la posición 77 por Gly, y Val en la posición 93 por Thr, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(32) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Ser en la posición 30 por Asn, Val en la posición 48 por Ile, Ser en la posición 49 por Ala, y Thr en la posición 117 por Val, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(33) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Ser en la posición 30 por Asn, Val en la posición 48 por Ile, Ser en la posición 49 por Ala, y Ala en la posición 97 por Thr, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(34) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Ser en la posición 30 por Asn, Val en la posición 48 por Ile, Ser en la posición 49 por Ala, y Val en la posición 93 por Thr, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96, y
(35) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Ser en la posición 30 por Asn, Val en la posición 48 por Ile, Ser en la posición 49 por Ala, y Asn en la posición 77 por Gly, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
Entre los ejemplos específicos de la secuencia de aminoácidos de VH en la que se introducen tres modificaciones en la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID n° 96 se incluyen las secuencias de aminoácidos (1) a (35) a continuación:
(1) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Ser en la posición 30 por Asn, Val en la posición 48 por Ile, y Ser en la posición 49 por Ala, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(2) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Ser en la posición 30 por Asn, Val en la posición 48 por Ile, y Asn en la posición 77 por Gly, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(3) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Ser en la posición 30 por Asn, Val en la posición 48 por Ile, y Val en la posición 93 por Thr, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(4) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Ser en la posición 30 por Asn, Val en la posición 48 por Ile, y Ala en la posición 97 por Thr, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(5) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Ser en la posición 30 por Asn, Val en la posición 48 por Ile, y Thr en la posición 117 por Val, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(6) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Ser en la posición 30 por Asn, Ser en la posición 49 por Ala, y Asn en la posición 77 por Gly, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(7) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Ser en la posición 30 por Asn, Ser en la posición 49 por Ala, y Val en la posición 93 por Thr, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(8) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Ser en la posición 30 por Asn, Ser en la posición 49 por Ala, y Ala en la posición 97 por Thr, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(9) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Ser en la posición 30 por Asn, Ser en la posición 49 por Ala, y Thr en la posición 117 por Val, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(10) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Ser en la posición 30 por Asn, Asn en la posición 77 por Gly, y Val en la posición 93 por Thr, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(11) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Ser en la posición 30 por Asn, Asn en la posición 77 por Gly, y Ala en la posición 97 por Thr, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(12) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Ser en la posición 30 por Asn, Asn en la posición 77 por Gly, y Thr en la posición 117 por Val, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(13) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Ser en la posición 30 por Asn, Val en la posición 93 por Thr, y Ala en la posición 97 por Thr, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(14) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Ser en la posición 30 por Asn, Val en la posición 93 por Thr, y Thr en la posición 117 por Val, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(15) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Ser en la posición 30 por Asn, Ala en la posición 97 por Thr, y Thr en la posición 117 por Val, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(16) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Val en la posición 48 por Ile, Ser en la posición 49 por Ala, y Asn en la posición 77 por Gly, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(17) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Val en la posición 48 por Ile, Ser en la posición 49 por Ala, y Val en la posición 93 por Thr, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(18) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Val en la posición 48 por Ile, Ser en la posición 49 por Ala, y Ala en la posición 97 por Thr, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(19) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Val en la posición 48 por Ile, Ser en la posición 49 por Ala, y Thr en la posición 117 por Val, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(20) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Val en la posición 48 por Ile, Asn en la posición 77 por Gly, y Val en la posición 93 por Thr, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(21) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Val en la posición 48 por Ile, Asn en la posición 77 por Gly, y Ala en la posición 97 por Thr, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(22) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Val en la posición 48 por Ile, Asn en la posición 77 por Gly, y Thr en la posición 117 por Val, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(23) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Val en la posición 48 por Ile, Val en la posición 93 por Thr, y Ala en la posición 97 por Thr, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(24) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Val en la posición 48 por Ile, Val en la posición 93 por Thr, y Thr en la posición 117 por Val, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(25) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Val en la posición 48 por Ile, Ala en la posición 97 por Thr, y Thr en la posición 117 por Val, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(26) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Ser en la posición 49 por Ala, Asn en la posición 77 por Gly, y Val en la posición 93 por Thr, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(27) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Ser en la posición 49 por Ala, Asn en la posición 77 por Gly, y Ala en la posición 97 por Thr, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(28) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Ser en la posición 49 por Ala, Asn en la posición 77 por Gly, y Thr en la posición 117 por Val, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(29) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Ser en la posición 49 por Ala, Val en la posición 93 por Thr, y Ala en la posición 97 por Thr, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(30) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Ser en la posición 49 por Ala, Val en la posición 93 por Thr, y Thr en la posición 117 por Val, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(31) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Ser en la posición 49 por Ala, Ala en la posición 97 por Thr, y Thr en la posición 117 por Val, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(32) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Asn en la posición 77 por Gly, Val en la posición 93 por Thr, y Ala en la posición 97 por Thr, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(33) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Asn en la posición 77 por Gly, Val en la posición 93 por Thr, y Thr en la posición 117 por Val, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(34) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Asn en la posición 77 por Gly, Ala en la posición 97 por Thr, y Thr en la posición 117 por Val, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(35) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Val en la posición 93 por Thr, Ala en la posición 97 por Thr, y Thr en la posición 117 por Val, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
Entre los ejemplos específicos de la secuencia de aminoácidos de VH en la que se introducen dos modificaciones en la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID n° 96 se incluyen las secuencias de aminoácidos (1) a (21) a continuación:
(1) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Ser en la posición 30 por Asn, y Val en la posición 48 por Ile, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(2) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Ser en la posición 30 por Asn, y Ser en la posición 49 por Ala, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(3) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Ser en la posición 30 por Asn, y Asn en la posición 77 por Gly, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(4) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Ser en la posición 30 por Asn, y Val en la posición 93 por Thr, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(5) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Ser en la posición 30 por Asn, y Ala en la posición 97 por Thr, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(6) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Ser en la posición 30 por Asn, y Thr en la posición 117 por Val, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96; (7) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Val en la posición 48 por Ile, y Ser en la posición 49 por Ala, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(8) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Val en la posición 48 por Ile, y Asn en la posición 77 por Gly, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(9) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Val en la posición 48 por Ile, y Val en la posición 93 por Thr, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(10) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Val en la posición 48 por Ile, y Ala en la posición 97 por Thr, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96; (11) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Val en la posición 48 por Ile, y Thr en la posición 117 por Val, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96; (12) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Ser en la posición 49 por Ala, y Asn en la posición 77 por Gly, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(13) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Ser en la posición 49 por Ala, y Val en la posición 93 por Thr, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(14) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Ser en la posición 49 por Ala, y Ala en la posición 97 por Thr, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(15) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Ser en la posición 49 por Ala, y Thr en la posición 117 por Val, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96; (16) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Asn en la posición 77 por Gly, y Val en la posición 93 por Thr, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(17) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Asn en la posición 77 por Gly, y Ala en la posición 97 por Thr, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(18) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Asn en la posición 77 por Gly, y Thr en la posición 117 por Val, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96; (19) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Val en la posición 93 por Thr, y Ala en la posición 97 por Thr, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(20) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Val en la posición 93 por Thr, y Thr en la posición 117 por Val, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96, y (21) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Ala en la posición 97 por Thr, y Thr en la posición 117 por Val, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96. Entre los ejemplos específicos de la secuencia de aminoácidos de VH en la que se introduce una modificación en la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID n° 96 se incluyen las secuencias de aminoácidos (1) a (7) a continuación:
(1) una secuencia de aminoácidos en la que se introduce una sustitución de Ser en la posición 30 por Asn en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(2) una secuencia de aminoácidos en la que se introduce una sustitución de Val en la posición 48 por Ile en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(3) una secuencia de aminoácidos en la que se introduce una sustitución de Ser en la posición 49 por Ala en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(4) una secuencia de aminoácidos en la que se introduce una sustitución de Asn en la posición 77 por Gly en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(5) una secuencia de aminoácidos en la que se introduce una sustitución de Val en la posición 93 por Thr en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96;
(6) una secuencia de aminoácidos en la que se introduce una sustitución de Ala en la posición 97 por Thr en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96, y
(7) una secuencia de aminoácidos en la que se introduce una sustitución de Thr en la posición 117 por Val en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96.
Entre ejemplos más específicos de la secuencia de aminoácidos de VH del anticuerpo humanizado de la presente invención se incluyen las secuencias de aminoácidos representadas por las SEC ID n° 96, 105 y 107, respectivamente.
Como VL comprendido en el anticuerpo humanizado de la presente exposición, resulta preferente una secuencia de aminoácidos en la que se incluye Ile en la posición 21, Pro en la posición 40, Val en la posición 58, Thr en la posición 85 y Tyr en la posición 87 en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 97 se sustituyen por otros residuos aminoácidos.
Entre ellas, como secuencia de aminoácidos de VL del anticuerpo humanizado de la presente exposición, resulta preferente sustituir una secuencia de aminoácidos en la que Pro en la posición 40, Val en la posición 58 y Tyr en la posición 87 de la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 97 se sustituyen por otros residuos aminoácidos.
Entre los ejemplos de la secuencia de aminoácidos de la VL anterior se incluye una secuencia de aminoácidos en la que se ha introducido por lo menos una modificación seleccionada de las modificaciones de aminoácidos para sustituir Ile en la posición 21 por Leu, Pro en la posición 40 por Leu, Val en la posición 58 por Ile, Thr en la posición 85 por Ala, y Tyr en la posición 87 por Phe, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 97.
Específicamente, como secuencia de aminoácidos de VL, anteriormente, por ejemplo pueden indicarse secuencias de aminoácidos en las que se introducen la una a cinco modificaciones siguientes.
Entre los ejemplos específicos de la secuencia de aminoácidos de VL en la que se han introducido cinco modificaciones se incluye una secuencia de aminoácidos en la que se han introducido las sustituciones de Ile en la posición 21 por Leu, Pro en la posición 40 por Leu, Val en la posición 58 por Ile, Thr en la posición 85 por Ala y Tyr en la posición 87 por Phe, representada por la SEC ID n° 97, y similares.
Entre los ejemplos específicos de la secuencia de aminoácidos de VL en la que se introducen cuatro modificaciones se incluyen las secuencias de aminoácidos (1) a (5) a continuación:
(1) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Pro en la posición 40 por Leu, Val en la posición 58 por Ile, Thr en la posición 85 por Ala, y Tyr en la posición 87 por Phe, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 97;
(2) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Ile en la posición 21 por Leu, Val en la posición 58 por Ile, Thr en la posición 85 por Ala, y Tyr en la posición 87 por Phe, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 97;
(3) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Ile en la posición 21 por Leu, Pro en la posición 40 por Leu, Thr en la posición 85 por Ala, y Tyr en la posición 87 por Phe, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 97;
(4) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Ile en la posición 21 por Leu, Pro en la posición 40 por Leu, Val en la posición 58 por Ile, y Tyr en la posición 87 por Phe, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 97, y
(5) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Ile en la posición 21 por Leu, Pro en la posición 40 por Leu, Val en la posición 58 por Ile, y Thr en la posición 85 por Ala, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 97.
Entre los ejemplos específicos de la secuencia de aminoácidos de VL en la que se introducen tres modificaciones se incluyen las secuencias de aminoácidos (1) a (9) a continuación:
(1) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Ile en la posición 21 por Leu, Pro en la posición 40 por Leu, y Val en la posición 58 por Ile, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 97;
(2) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Ile en la posición 21 por Leu, Pro en la posición 40 por Leu, y Thr en la posición 85 por Ala, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 97;
(3) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Ile en la posición 21 por Leu, Pro en la posición 40 por Leu, y Tyr en la posición 87 por Phe, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 97;
(4) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Ile en la posición 21 por Leu, Val en la posición 58 por Ile, y Thr en la posición 85 por Ala, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 97;
(5) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Ile en la posición 21 por Leu, Val en la posición 58 por Ile, y Tyr en la posición 87 por Phe, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 97;
(6) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Ile en la posición 21 por Leu, Thr en la posición 85 por Ala, y Tyr en la posición 87 por Phe, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 97;
(7) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Pro en la posición 40 por Leu, Val en la posición 58 por Ile, y Thr en la posición 85 por Ala, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 97;
(8) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Pro en la posición 40 por Leu, Val en la posición 58 por Ile, y Tyr en la posición 87 por Phe, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 97, y
(9) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Val en la posición 58 por Ile, Thr en la posición 85 por Ala, y Tyr en la posición 87 por Phe, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 97;
Entre los ejemplos específicos de la secuencia de aminoácidos de VL en la que se introducen dos modificaciones se incluyen las secuencias de aminoácidos (1) a (10) a continuación:
(1) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Ile en la posición 21 por Leu, y Pro en la posición 40 por Ile, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 97;
(2) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Ile en la posición 21 por Leu, y Val en la posición 58 por Ile, en la secuencia de aminoácidos representada por la s Ec ID n° 97;
(3) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Ile en la posición 21 por Leu, y Thr en la posición 85 por Ala, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 97;
(4) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Ile en la posición 21 por Leu, y Tyr en la posición 87 por Phe, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 97;
(5) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Pro en la posición 40 por Leu, y Val en la posición 58 por Ile, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 97;
(6) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Pro en la posición 40 por Leu, y Thr en la posición 85 por Ala, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 97;
(7) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Pro en la posición 40 por Leu, y Tyr en la posición 87 por Phe, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 97;
(8) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Val en la posición 58 por Ile, y Thr en la posición 85 por Ala, en la secuencia de aminoácidos representada por la s Ec ID n° 97;
(9) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Val en la posición 58 por Ile, y Tyr en la posición 87 por Phe, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 97, y
(10) una secuencia de aminoácidos en la que se introducen sustituciones de Thr en la posición 85 por Ala, y Tyr en la posición 87 por Phe, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 97.
Entre los ejemplos específicos de la secuencia de aminoácidos de VL en la que se ha introducido una modificación se incluye una secuencia de aminoácidos en la que se ha introducido una sustitución de Ile en la posición 21 por Leu representada por la SEC ID n° 97, una secuencia de aminoácidos en la que se ha introducido una sustitución de Pro en la posición 40 por Leu representada por la SEC ID n° 97, una secuencia de aminoácidos en la que se ha introducido una sustitución de Val en la posición 58 por Ile representada por la SEC ID n° 97, una secuencia de aminoácidos en la que se ha introducido una sustitución de Thr en la posición 85 por Ala representada por la SEC ID n° 97, y una secuencia de aminoácidos en la que se ha introducido una sustitución de Tyr en la posición 87 por Phe en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 97. Entre ejemplos más específicos de la secuencia de aminoácidos de VL del anticuerpo humanizado de la presente invención se incluye la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 97.
Además, entre los ejemplos específicos del anticuerpo humanizado de la presente exposición se incluyen los anticuerpos (1) a (5) humanizados a continuación:
(1) un anticuerpo humanizado que comprende por lo menos una de una región variable de cadena H que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 96 y la región variable de cadena L que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 97;
(2) un anticuerpo humanizado que comprende por lo menos una de una región variable de cadena H que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 101 y la región variable de cadena L que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 97;
(3) un anticuerpo humanizado que comprende por lo menos una de una región variable de cadena H que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 103 y la región variable de cadena L que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 97;
(4) un anticuerpo humanizado que comprende por lo menos una de las regiones variables de cadena H que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 105 y la región variable de cadena ligera L que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 97, y (5) un anticuerpo humanizado que comprende por lo menos una de una región variable de cadena H que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 107 y la región variable de cadena L que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 97.
Un anticuerpo humano es originalmente un anticuerpo presente naturalmente en el cuerpo humano e incluye además anticuerpos obtenidos de una biblioteca de fagos de anticuerpo humano o un animal transgénico productor de anticuerpos humanos, que se prepara basándose en las recientes avances en las técnica de ingeniería genética, ingeniería celular e ingeniería del desarrollo.
El anticuerpo presente naturalmente en el cuerpo humano puede obtenerse, por ejemplo, mediante el aislamiento de un linfocito sanguíneo periférico humano, la inmortalización del linfocito mediante la infección con virus EB o similar, seguido de la clonación del mismo, cultivando de esta manera los linfocitos obtenidos de esta manera y purificando el anticuerpo a partir del sobrenadante del cultivo.
La biblioteca fágica de anticuerpos humanos es una biblioteca en la que se expresan fragmentos de anticuerpos, tales como Fab y scFv, sobre la superficie fágica mediante la inserción de un gen codificante de anticuerpo preparado a partir de una célula B humana en un gen fágico. Un fago que expresa un fragmento de anticuerpo sobre la superficie celular que presenta la actividad de unión de antígeno deseada puede recuperarse a partir de la biblioteca, utilizando su actividad para unirse a un sustrato inmovilizado con antígeno a modo de marcador. El fragmento de anticuerpo puede convertirse además en una molécula de anticuerpo humano que consiste en dos cadenas H completas y dos cadenas L completas mediante técnicas de ingeniería genética.
Un animal transgénico productor de anticuerpos humanos se refiere a un animal en el que se ha introducido un gen de anticuerpo humano en las células. Específicamente, puede prepararse un animal transgénico productor de anticuerpo humano mediante la introducción de un gen codificante de un anticuerpo humano en una célula ES de ratón, injertando la célula ES en un embrión de estadio temprano de otro ratón y después desarrollándola hasta formar un animal completo.
Como método para preparar un anticuerpo humano a partir del animal transgénico producto de anticuerpo humano, puede prepararse un anticuerpo humano mediante la obtención de un hibridoma productor de anticuerpo humano mediante un método de preparación de hibridoma habitualmente llevado a cabo en animales no humanos, mediante el cultivo del hibridoma obtenido y mediante la producción y acumulación del anticuerpo humano en el sobrenadante del cultivo.
Un anticuerpo o fragmento del mismo en el que uno o más aminoácidos han sido eliminados, sustituidos, insertados o añadidos en la secuencia de aminoácidos que constituye el anticuerpo anteriormente indicado o fragmento de anticuerpo y que presenta una actividad similar al anticuerpo anteriormente indicado o fragmento de anticuerpo también se encuentra incluido en el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la presente exposición.
El número de residuos aminoácidos que se eliminan, sustituyen, insertan y/o añaden es uno o más, y no se encuentra específicamente limitado, aunque se encuentra dentro del intervalo en que la eliminación, sustitución o adición resulta posible mediante métodos conocidos, tales como la mutagénesis dirigida a sitio descrita en Molecular Cloning, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Current Protocols in Molecular Biology. John Willy & Sons (1987-1997); Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982), Proc, Natl, Acad, Sci. USA, 79, 6409 (1982); Gene, 34, 315 (1985), Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985) o similar. Por ejemplo, el número es de 1 a docenas, más preferentemente de 1 a 20, todavía más preferentemente de 1 a 10, y lo más preferentemente de 1 a 5.
La eliminación, sustitución, inserción o adición de uno o más aminoácidos en la secuencia de aminoácidos del anticuerpo anteriormente indicado se refiere a lo siguiente. Es decir, se refiere a que la eliminación, sustitución, inserción o adición de uno o una pluralidad de residuos aminoácidos en cualesquiera posiciones en una o una pluralidad de secuencias de aminoácidas de una única secuencia. Además, la eliminación, sustitución, inserción o adición pueden ocurrir en el miso caso y el aminoácido que se sustituye, inserta o añade puede ser uno de tipo natural o de tipo no natural.
Entre los ejemplos del aminoácido de tipo natural se incluye L-alanina, L-asparagina, ácido L-aspártico, L-glutamin, ácido L-glutámico, glicina, L-histidina, L-isoleucina, L-leucina, L-lisina, L-metionina, L-fenilalanina, L-prolina, L-serina, L-treonina, L-triptófano, L-tirosina, L-valina, L-cisteína y similares.
Se muestran a continuación unos ejemplos preferidos de residuos aminoácidos mutualmente sustituibles. Los aminoácidos en el mismo grupo son mutuamente sustituibles.
Grupo A: leucina, isoleucina, norleucina, valina, norvalina, alanina, ácido 2-aminobutanoico, metionina, O-metilserina, t-butilglicina, t-butilalanina y ciclohexilalanina.
Grupo B: ácido aspártico, ácido glutámico, ácido isoaspártico, ácido isoglutámico, ácido 2-aminoadípico y ácido 2-aminosubérico.
Grupo C: asparagina y glutamina.
Grupo D: lisina, arginina, ornitina, ácido 2,4-diaminobutanoico y ácido 2,3-diaminopropiónico.
Grupo E: prolina, 3-hidroxiprolina y 4-hidroxiprolina.
Grupo F: serina, treonina y homoserina.
Grupo G: fenilalanina y tirosina.
La actividad efectora del anticuerpo incluye actividad de ADCC, actividad de CDC, actividad de fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP), efectos de opsonización y similares. Puede controlarse mediante una diversidad de métodos.
Entre los ejemplos del método de control de la actividad efectora se incluye un método de control de una cadena de azúcar unida a la región Fc del anticuerpo, un método para llevar a cabo la modificación aminoácido de uno o más residuos aminoácidos en la región Fc del anticuerpo, y similares.
Entre los ejemplos del método para controlar una cadena de azúcar unida a la región Fc del anticuerpo se incluye un método para reducir la actividad de ADCC o CDC mediante la eliminación de una cadena de azúcar en la posición 297 del anticuerpo IgG [Molecular Immunology, 32, 1311, (1995), documento n° WO2008/030564], un método para reducir la actividad de CDC mediante la reducción de la unión de galactosa a la región Fc del anticuerpo, y similares.
Además, entre los ejemplos del método para controlar una cadena de azúcar unida a la región Fc del anticuerpo se incluye un método para producir un anticuerpo que contiene una cadena de azúcar que no presenta fucosa unida a N-acetilglucosamina (GlcNAc) de una base a la que se encuentra unida una cadena de azúcar, en la cadena de azúcar unida a N que está unida a la asparagina en la posición 297 de la región Fc del anticuerpo IgG (patentes US n° 7.214.775 y US n° 6.946.292), un método para producir un anticuerpo que contiene una cadena de azúcar que contiene GlcNAc bisectante unido a la misma [Nature Biotechnology, 17, 176, (1999)], un método para producir un anticuerpo que contiene una cadena de azúcar unida a galactosa (Gal) en el extremo no reductor [Hum. Antibod. Hybridomas, 5, 143 - 151. (1994)], y similares.
Entre los ejemplos del método para llevar a cabo la modificación de aminoácido del residuo o residuos aminoácidos en la región Fc del anticuerpo se incluye un método para controlar la actividad efectora mediante modificación de aminoácidos de la región Fc del anticuerpo (J.B.C., 277, 26733-26740, 2002, patentes US n° 6.737.056, US n° 7.297.775, documentos US 2007/0020260 y WO2005/070963), un método para controlar la actividad efectora mediante intercambio de dominios entre subclases respectivas de la región Fc de anticuerpo (documento n° WO2007/011041), y similares.
El fragmento de anticuerpo de la presente invención incluye Fab, F(ab')2, Fab', scFv, diacuerpo, dsFv y similares. El fragmento de anticuerpo de la presente invención incluye Fab, Fab', F(ab')2 , scFv, diacuerpo, dsFv, un péptido que comprende CDR y similares.
Un Fab es un fragmento de anticuerpo que presenta un peso molecular de aproximadamente 50.000 y actividad de unión a antígeno, en el que aproximadamente una mitad del lado N-terminal de la cadena H y la cadena L entera, entre fragmentos obtenidos mediante el tratamiento de una molécula de anticuerpo IgG con una proteasa, la papaína (cortando en un residuo aminoácido en la posición 224 de la cadena H), se unen entre sí mediante un enlace disulfuro.
El Fab de la presente invención puede obtenerse mediante tratamiento de un anticuerpo monoclonal que reconoce específicamente la proteína CD27 con cadena de azúcar deficiente según la presente invención y que se une a la región extracelular con la proteasa papaína. Además, el Fab puede producirse mediante la inserción del ADN codificante de Fab del anticuerpo en un vector de expresión para procariotas o un vector de expresión para eucariotas, y la introducción del vector en un procariota o eucariota para expresar el Fab.
Un F(ab')2 es un fragmento con un peso molecular de aproximadamente 100.000 y que presenta actividad de unión a antígeno y que incluye dos regiones Fab que se encuentran unidas en la posición de bisagra obtenida mediante la digestión de la parte inferior de los dos enlaces disulfuro en la región bisagra de IgG con una proteasa, la pepsina.
El F(ab')2 de la presente invención puede obtenerse mediante tratamiento de un anticuerpo monoclonal que reconoce específicamente la proteína CD27 con cadena de azúcar deficiente según la presente invención y que se une a la región extracelular con la proteasa pepsina. Además, el F(ab')2 puede producirse mediante la unión de Fab' indicado posteriormente, mediante un enlace tioéter o un enlace disulfuro.
Un Fab' es un fragmento de anticuerpo con un peso molecular de aproximadamente 50.000 y actividad de unión a antígeno, que se obtiene mediante el corte de un enlace disulfuro en la región bisagra de F(ab')2 anteriormente indicado.
El Fab' de la presente invención puede obtenerse mediante tratamiento de F(ab')2 que reconoce específicamente la proteína CD27 con cadena de azúcar deficiente según la presente invención y que se une a la región extracelular con el agente reductor ditiotreitol. Además, el Fab' puede producirse mediante la inserción del ADN codificante del fragmento Fab del anticuerpo en un vector de expresión para procariotas o un vector de expresión para eucariotas, y la introducción del vector en un procariota o eucariota para expresar el Fab'
Un scFv es un polipéptido VH-P-VL o VL-P-VH en el que una cadena VH y una cadena VL se unen utilizando un conector peptídico apropiado (en adelante denominado "P") y es un fragmento de anticuerpo que presenta actividad de unión a antígeno.
El scFv de la presente invención puede producirse mediante la obtención de ADNc codificantes de VH y VL de un anticuerpo monoclonal que reconoce específicamente la proteína CD27 con cadena de azúcar deficiente y se une a la región extracelular, la construcción de ADN codificante del scFv, la inserción del ADN en un vector de expresión para procariotas o en un vector de expresión para eucariotas, seguid ode la introducción del vector de expresión en un procariota o eucariota para expresar el scFv.
Un diacuerpo es un fragmento de anticuerpo en el que scFv se encuentra dimerizado y presenta actividad de unión a antígeno divalente. En la actividad de unión a antígeno divalente, los dos antígenos pueden ser iguales o diferentes.
El diacuerpo de la presente invención puede producirse mediante la obtención de ADNc codificantes de VH y VL del anticuerpo monoclonal que reconoce y se une específicamente a la proteína CD27 con cadena de azúcar deficiente y se une a la región extracelular, construyendo ADN codificante del scFv de manera que la longitud de la secuencia de aminoácidos de P es de 8 o menos residuos, la inserción del ADN en un vector de expresión para procariotas o un vector de expresión para eucariotas, seguido de la introducción del vector de expresión en un procariota o eucariota para expresar el diacuerpo.
Se obtiene un dsFv mediante la unión de polipéptidos en los que un residuo aminoácido de cada uno de VH y VL se sustituye por un residuo de cisteína mediante un enlace disulfuro entre los residuos de cisteína. El residuo aminoácido que debe sustituirse por un residuo de cisteína puede seleccionarse basándose en una estimación de la estructura tridimensional del anticuerpo de acuerdo con el método mostrado por Reiter et al. [Protein Engineering, 7, 697 (1994)].
El dsFv de la presente invención puede producirse mediante la obtención de ADNc codificantes de VH y VL de un anticuerpo monoclonal que reconoce específicamente la proteína CD27 con cadena de azúcar deficiente y se une a la región extracelular, la construcción de ADN codificante del dsFv, la inserción del ADN en un vector de expresión para procariotas o en un vector de expresión para eucariotas, seguido de la introducción del vector de expresión en un procariota o eucariota para expresar el dsFv.
Un péptido que comprende CDR se constituye mediante la inclusión de una o más regiones de CDR de VH o VL. El péptido que comprende una pluralidad de CDR puede producirse conectando los CDR directamente o mediante un conector peptídico apropiado.
El péptido que comprende CDR de la presente exposición puede producirse mediante la construcción de ADN codificante de los c Dr de VH y VL de un anticuerpo monoclonal que reconoce específicamente la proteína CD27 con cadena de azúcar deficiente y se une a la región extracelular, insertando el ADN en un vector de expresión para procariotas o en un vector de expresión para eucariotas, introduciendo seguidamente el vector de expresión en un procariota o eucariota para expresar el péptido.
El péptido que comprende CDR también puede producirse mediante un método de síntesis química, tal como un método de Fmoc (método de fluorenilmetoxicarbonilo) o un método de tBoc (método de t-butiloxicarbonilo). El anticuerpo de la presente invención incluye un conjugado de anticuerpos en el que un anticuerpo monoclonal o un fragmento de anticuerpo del mismo que reconoce específicamente la proteína CD27 con cadena de azúcar deficiente y que se une a la región extracelular, se une química o genéticamente a un agente, proteína, isótopo radioactivo o similar.
El conjugado que comprende el anticuerpo de la presente invención puede producirse mediante conjugación química de un agente, proteína, isótopo radiactivo o similar al lado N-terminal o lado C-terminal de una cadena H o de una cadena L del anticuerpo monoclonal o fragmento de anticuerpo del mismo que reconoce específicamente la proteína CD27 con cadena de azúcar deficiente y se une a la región extracelular en la presente invención, un sustituyente o cadena lateral apropiado del anticuerpo o fragmento de anticuerpo, una cadena de azúcar en el anticuerpo o fragmento de anticuerpo o similar [Antibody Engineering Handbook, editado por Osamu Kanemitsu, publicado por Chijin Shokan (1994)].
Además, el conjugado puede producirse genéticamente mediante la unión de un ADN codificante del anticuerpo monoclonal o fragmento de anticuerpo del mismo que reconoce específicamente la proteína CD27 con cadena de azúcar deficiente y se une a la región extracelular en la presente invención a otro ADN codificante de una proteína que debe conjugarse, mediante la inserción del ADN en un vector de expresión y la introducción en una célula hospedadora de un procariota o eucariota.
El agente incluye un agente quimioterápico, un anticuerpo terapéutico, un inmunoestimulante, un agente con peso molecular elevado, y similares.
La proteína incluye una citocina, un factor de crecimiento, una proteína tóxica y similares.
Además, el agente que debe conjugarse con el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo del mismo pueden encontrarse en forma de un profármaco. El profármaco en la presente invención es un agente que es sometido a modificación química por un enzima presente en el medio tumoral y que se convierte en una sustancia que presenta una actividad dañina para las células tumorales.
El agente quimioterápico incluye cualesquiera agentes quimioterápicos, tales como un agente alquilante, un agente nitrosourea, un antagonista del metabolismo, una sustancia antibiótica anticáncer, un alcaloide derivado de una planta, un inhibidor de topoisomerasa, un agente para la terapia hormonal, un antagonista hormonal, un inhibidor de aromatasa, un inhibidor de la glucoproteína P, un derivado de complejo de platino, un inhibidor de la etapa M y un inhibidor de cinasa.
Entre los ejemplos de agente quimioterápico se incluyen amifostina (Ethyol), cisplatino, dacarbazina (DTIC), dactinomicina, mecloretamina (mostaza nitrogenada), estreptozocina, ciclofosfamida, ifosfamida, carmustina (BCNU), lomustina (CCNU), doxorrubicina (adriamicina), doxorrubicina lipo (Doxyl), epirrubicina, gemcitabina (Gemsal), daunorrubicina, daunorrubicina lipo (Daunozoma), procarbazina, mitomicina, citarabina, etopósido, metotrexato, 5-fluorouracilo, fluorouracilo, vinblastina, vincristina, bleomicina, daunomicina, peplomicina, estramustina, paclitaxel (Taxol), docetaxel (Taxotea), aldesleucina, asparaginasa, busulfán, carboplatino, oxaliplatino, nedaplatino, cladribina, camptotecina, CPT-11, 10-hidroxi-7-etilcamptotecina (SN38), floxuridina, fludarabina, hidroxiurea, ifosfamida, idarrubicina, mesna, irinotecán, nogitecán, mitoxantrona, topotecán, leuprólido, megestrol, melfalán, mercaptopurina, hidroxicarbamida, plicamicina, mitotano, pegasparagasa, pentostatina, pipobromán, estreptozocina, tamoxifeno, goserelina, leuprorelina, flutamida, tenipósido, testolactona, tioguanina, tiotepa, mostaza uracilo, vinorelbina, clorambucilo, hidrocortisona, prednisolona, metilprednisolona, vindesina, nimustina, semustina, capecitabina, Tomudex, azacitidina, UFT, oxaliplatino, gefitinib (Iressa), imatinib (STI 571), elrotinib, un inhibidor de Flt3, un inhibidor de receptor de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR), un inhibidor de receptor de factor de crecimiento fibroblástico (FGFR), un inhibidor de receptor de factor de crecimiento epidérmico (EGFR) (tal como Iressa y Tarceva), radicicol, 17-alilamino-17-demetoxigeldanamicina, rapamicina, amsacrina, ácido todo-trans-retinoico, talidomida, anastrozol, fadrozol, letrozol, exemestano, tiomalato de oro, D-penicilamina, bucilamina, azatioprina, mizoribina, ciclosporina, rapamicina, hidrocortisona, bexaroteno (tal como Targretin), tamoxifeno, dexametasona, sustancias de progestina, sustancias de estrógeno, anastrozol (tal como Arimidex), Leuplina, aspirina, indometacina, celecoxib, azatioprina, penicilamina, tiomalato de oro, maleato de clorfeniramina, clorfeniramina, clemastina, tretinoína, bexaroteno, arsénico, voltezomib, alopurinol, gemtuzumab, ibritumomab tiuxetán, 131 tositumomab, Targretin, ozogamina, claritromicina, leucovorina, ifosfamida, quetoconazol, aminoglutetimida, suramina, metotrexato, maitansinoide y derivados de los mismos.
El método para conjugar el agente quimioterápico con el anticuerpo incluye un método en el que el agente quimioterápico y un grupo amino del anticuerpo se conjugan mediante un glutaraldehído, un método en el que un grupo amino del agente quimioterápico y un grupo carboxilo del anticuerpo se unen mediante carbodiimida soluble en agua, y similares.
El anticuerpo terapéutico puede incluir un anticuerpo contra un antígeno en el que se induce apoptosis mediante la unión del anticuerpo, un anticuerpo contra un antígeno que participa en la formación del estado patológico tumoral, un anticuerpo que regula la función inmunológica y un anticuerpo relacionado con la angiogénesis en la parte patológica.
El antígeno en el que se induce apoptosis mediante la unión del anticuerpo pueden incluirse un agregado de diferenciación (en adelante denominado CD) 19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD37, CD53, CD72, CD73, CD74, CDw75, CDw76, CD77, CDw78, CD79a, CD79b, CD80 (B7.1), CD81, CD82, CD83, CDw84, CD85, CD86 (B7.2), antígeno leucocitario humano (HLA)-Clase II, EGFR o similar.
El antígeno que regula la función inmunológica incluye CD4, CD40, ligando de CD40, moléculas de la familia de B7 (tales como CD80, CD8 6 , CD274, B7-DC, B7-H2, B7-H3 y B7-H4), ligandos de las moléculas de la familia de B7 (tales como CD28, CTLA-4, ICOS, PD-1, y BTLA), OX-40, ligando de OX-40, CD137, molécula de la familia de los receptores del factor de necrosis tumoral (TNF) (tales como DR4, DR5, TNFR1 y TNFR2), moléculas de la familia de receptores de ligandos inductor de apoptosis relacionados con TNF (TRAIL), familia de receptores de las moléculas de la familia TRAIL (tales como TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRAIL-R3 y TRAIL-R4), receptor activador del ligando del factor nuclear kappa B (RANK), ligando de RANK, CD25, receptor 4 del ácido fólico, citocina [interleucina-1a (en adelante interleucina se denomina "IL"), IL-1p, IL-4, IL-5, IL-6 , IL-10, IL-13, factor de crecimiento transformante (TGF) p y TNFa], receptores de dichas citocinas, quimiocinas (tales como SLC, ELC, I-309, TARC, MDC y CTACK) y receptores de dichas quimiocinas.
Entre los ejemplos del antígeno del anticuerpo que inhibe la angiogénesis en la parte patológica se incluyen el factor de crecimiento endotelial vascular (v Eg f ), la angiopoyetina, el factor de crecimiento fibroblástico (FGF), EGF, el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), el factor de crecimiento similar a la insulina (IGF), la eritropoyetina (EPO), TGFp, IL-8 , efilina, SDF-1, y similares.
El inmunoestimulador puede ser cualquier producto natural conocido como inmunoadyuvante. Entre los ejemplos de un agente potenciador inmunogénico se incluyen p-1,3-glucano (lentinano, esquizofilano), agalactosilceramida (KRN7000), polvos de hongos (picibanilo, BCG) y extracto fúngico (krestina)
El agente que presenta un peso molecular elevado incluye polietilenglicol (en adelante denominado 'PEG'), albúmina, dextrano, polioxietileno, copolímero de estireno-ácido maleico, polivinilpirrolidona, copolímero de pirano, hidroxipropilmetacrilamida y similares.
Mediante la unión de estos compuestos que presentan un peso molecular elevado a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, se esperan los efectos siguientes: (1 ) mejora de la estabilidad frente a diversos factores químicos, físicos o biológicos, (2) notable prolongación de la semivida en sangre, (3) desaparición de la inmunogenicidad, supresión de la producción de anticuerpos y similares [Bioconjugate Drug, Hirokawa Publishing, 1993].
Por ejemplo, el método para la unión de PEG a un anticuerpo incluye un método en el que se deja reaccionar un anticuerpo con un reactivo modificador de PEG [Bioconjugate Drug, Hirokawa Shoten (1993)]. El reactivo modificador de PEG incluye un agente modificador del grupo £-amino de la lisina (solicitud publicada de patente japonesa no examinada n° 178926/86), un agente modificador de un grupo carboxilo del ácido aspártico y del ácido glutámico (solicitud publicada de patente japonesa no examinada n° 23587/81), un agente modificador de un grupo guanidino de la arginina (solicitud publicada de patente japonesa no examinada n° 117920/90) y similares.
La citocina o el factor de crecimiento puede ser cualquier citocina o factor de crecimiento, con la condición de que potencia células tales como las células NK, los macrófagos y los neutrófilos. Entre los ejemplos se incluye el interferón (en adelante denominado 'IFN')-a, INF-p, INF-y, IL-2, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, IL-23, factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF) y similares.
Entre los ejemplos de proteína tóxica pueden incluirse ricina, toxina diftérica, ONTAK y similares, e incluye además una proteína tóxica en la que se ha introducido una mutación en la proteína con el fin de controlar la toxicidad.
Entre los ejemplos del isótopo radiactivo pueden incluirse 131I, 125I, 90Y, 64Cu, 199Tc, 77Lu, 211At o similares. El isótopo radiactivo puede conjugarse directamente con el anticuerpo mediante el método de la cloramina T.
Además, puede conjugarse con el anticuerpo una sustancia quelante del isótopo radiactivo. El agente quelante incluye metilbencildietileno-ácido triaminapentaacético (MX-DTPA) y similares.
En la presente invención, el anticuerpo utilizado en la presente invención puede administrarse en combinación con otro u otros agentes, y también puede utilizarse en combinación la irradiación con radiación. El otro agente incluye los agentes quimioterápico, terapéutico o inmunoestimulante, tal como citocinas, y similares.
La irradiación con radiación incluye fotones (electromagnética), la irradiación, tal como rayos X o rayos y, la irradiación con partículas, tal como haces de electrones, haces de protones o haces de partículas pesadas, y similares.
En el método para la administración combinada, el agente puede administrarse simultáneamente con el anticuerpo utilizado en la presente invención, o el agente puede administrarse antes o después de la administración del anticuerpo utilizado en la presente invención.
El método de detección, el método de determinación, el reactivo de detección, el reactivo de determinación o el agente diagnóstico en la presente invención incluye un método en el que se utiliza un marcaje específico mediante el marcaje del anticuerpo de la presente invención. El marcaje incluye un marcaje que se utiliza en un método de detección o medición inmunológica general, y entre los ejemplos se incluyen enzimas, tales como la fosfatasa alcalina, la peroxidasa y la luciferasa; materiales luminiescentes, tales como éster de acridinio y lofina; materiales fluorescentes, tales como isotiocianato de fluoresceína (FITC) y trimetilrodamina (RITC) y similares. A continuación en la presente memoria, se describe con mayor detalle el procedimiento de producción del anticuerpo de la presente invención.
1. Procedimiento de producción de anticuerpo monoclonal
(1) Preparación de antígeno
De acuerdo con el procedimiento siguiente, puede obtenerse CD27 con cadena de azúcar deficiente como antígeno o una célula que expresa CD27 con cadena de azúcar deficiente, mediante la introducción de un vector de expresión que comprende un ADNc codificante de C27 de longitud completa o parcial en levaduras, una célula de insecto, una célula animal o similar, en la que un enzima capaz de añadir Gal a GalNAc unido a Ser/Thr en el polipéptido, una proteína que participa en la actividad del enzima o una proteína que participa en el transporte de la UDP-galactosa se encuentra reducida o anulada, en el procedimiento de síntesis de cadenas de azúcar unidas a O.
Además, CD27 con cadena de azúcar deficiente puede purificarse a partir de una diversidad de células en cultivo derivadas del ser humano, tejidos humanos y similares que expresan una gran cantidad de CD27 con cadena de azúcar deficiente en una membrana célular o en un medio de cultivo, preparando de esta manera los antígenos. Alternativamente, puede prepararse un péptido sintético con una secuencia parcial de CD27 con cadena de azúcar deficiente y utilizarse como antígeno. Además, CD27 con cadena de azúcar deficiente también puede obtenerse mediante una adición in vitro de una cadena de azúcar a CD27 que se expresa y se purifica utilizando un procariota, tal como Escherichia coli, que carece de capacidad de adición de cadena de azúcar.
Además, de manera similar, una célula que expresa CD27 que contiene una cadena de azúcar unida a O normal puede obtenerse mediante la introducción de un vector de expresión que comprende un ADNc codificante de CD27 de longitud completa o de longitud parcial en una célula hospedadora (tal como una célula de levadura, célula de insecto o célula animal) que presenta un procedimiento de síntesis de cadena de azúcar unida a O normal, y purificar la proteína CD27 que contiene una cadena de azúcar unida a O normal a partir de la célula obtenida de esta manera.
La proteína CD27 deficiente en cadenas de azúcar, la proteína CD27 que contiene una cadena de azúcar unida a O normal o la célula de expresión obtenida tal como se ha indicado anteriormente, puede utilizarse para el cribado del anticuerpo deseado, y la confirmación de la reactividad del anticuerpo obtenido con un antígeno. El polipéptido utilizado en la presente invención puede producirse mediante la expresión de un ADN codificante del polipéptido en una célula hospedadora utilizando un método descrito en Molecular Cloning, A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997) o similares.
Por ejemplo, el polipéptido utilizado en la presente invención puede producirse utilizando el método siguiente. En primer lugar, se prepara un vector recombinante mediante la introducción de un ADNc de longitud completa cadena abajo de un promotor de un vector de expresión apropiado. En este momento, en caso necesario, puede utilizarse un fragmento de ADN con una longitud apropiada que contenga una región codificante del polipéptido basado en el ADNc de longitud completa y el fragmento de ADN en lugar del ADNc de longitud completa anteriormente indicado. A continuación, puede obtenerse un transformante productor del polipéptido mediante la introducción del vector de expresión en una célula hospedadora adecuada para el vector de expresión.
La célula hospedadora puede ser cualquiera, con la condición de que presente la capacidad de añadir una cadena de azúcar unida a O y pueda expresar el gen de interés e incluye Escherichia coli, una levadura, una célula de insecto, una célula animal y similares.
El vector de expresión incluye vectores que pueden replicarse autónomamente en la célula hospedadora que se utilizará, o vectores que pueden integrarse en un cromosoma que comprende un promotor apropiado en una posición que permite transcribir el ADN codificante del polipéptido.
En el caso de que se utilice un procariota, tal como Escherichia coli, como la célula hospedadora, resulta preferente que el vector recombinante sea autónomamente replicable en el procariota y contenga un promotor, una secuencia de unión ribosómica, el ADN utilizado en la presente invención y una secuencia de terminación de la transcripción. El vector recombinante puede incluir además un gen regulador del promotor.
El vector de expresión incluye, por ejemplo, pBTrp2, pBTac1, pBTac2 (todos fabricados por Roche Diagnostics), pKK233-2 (fabricado por Pharmacia), pSE280 (fabricado por nvitrogen), pGEMEX-1 (fabricado por Promega), pQE- 8 (fabricado por QIAGEN), pKYP10 (solicitud publicada de patente japonesa no examinada n° 110600/83), pKYP200 [Agricultural Biological Chemistry 48:669, 1984], pLSAI [Agric. Biol. Chem. 53:277, 1989], pGELI [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:4306, 1985], pBluescript II Sk(-) (fabricado por Stratagene), pTrs30 [preparado a partir de Escherichia coli JM109/pTrS30 (Fe RM b P-5407)], pTrs32 [preparado a partir de Escherichia coli JM109/pTrS32 (FERM BP-5408)], pGHA2 [preparado a partir de Escherichia coli IGHA2 (FERM BP-400), solicitud publicada de patente japonesa no examinada n° 221091/85], pGKA2 [preparado a partir de Escherichia coli IGKA2 (FERM BP-6798), solicitud publicada de patente japonesa no examinada n° 221091/85], pTerm2 (US4686191, US4939094, US5160735), pSupex, pUB 110, pTP5, pC194, pEG400 [J. Bacteriol. 172:2392, 1990], pGEX (fabricado por Pharmacia), sistema pET (fabricado por Novagen), pME18SFL3 y similares.
Puede utilizarse cualquier promotor, con la condición de que pueda funcionar en la célula hospedadora que debe utilizarse. Entre los ejemplos se incluyen promotores derivados de Escherichia coli, tales como el promotor trp (Ptrp), el promotor lac, el promotor PL, el promotor PR y el promotor T7. Además, pueden utilizarse promotores diseñados y modificados artificialmente, tales como un promotor en el que se unen dos Ptrp en tándem, un promotor tac, un promotor lacT7 y un promotor letl.
Además, el vector recombinante anteriormente indicado preferentemente es un plásmido en el que el espacio entre la secuencia de Shine-Dalgarno, que es la secuencia de unión ribosómica, y el codón de inicio, se ajustan a una distancia apropiada (por ejemplo, 6 a 18 nucleótidos).
En la secuencia de nucleótidos del ADN codificante del polipéptido utilizado en la presente invención, los nucleótidos pueden disponerse de manera que se obtenga un codón adecuado para la expresión en el huésped de manera que puede mejorarse la tasa de producción del polipéptido de interés. Además, la secuencia de terminación de la transcripción no resulta esencial para expresar un gen en el vector recombinante anteriormente indicado; resulta preferente disponer una secuencia de terminación de transcripción inmediatamente cadena abajo del gen estructural.
La célula hospedadora incluye microorganismos pertenecientes a los géneros Escherichia, y entre los ejemplos se incluyen Escherichia coli XL1 -Blue, Escherichia coli XL2-Blue, Escherichia coli DH1, Escherichia coli MC1000, Escherichia coli KY3276, Escherichia coli W1485, Escherichia coli JM109, Escherichia coli HB101, Escherichia coli No. 49, Escherichia coli W3110, Escherichia coli NY49, Escherichia coli DH5a y similares.
Puede utilizarse cualquier método de introducción para el vector recombinante, con la condición de que sea un método para introducir ADN en la célula hospedadora anteriormente indicada, y entre los ejemplos se incluye un método que utiliza un ion de calcio indicado en Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972), métodos descritos en Gene, 17, 107 (1982) y Molecular & General Genetics, 168, 111 (1979) y similares.
En el caso de que se utilice una célula animal como célula hospedadora, un vector de expresión incluye, por ejemplo, pcDNAl, pcDM8 (disponible de Funakoshi), pAGE107 [solicitud publicada de patente japonesa no examinada n° 22979/91; Cytotechnology, 3, 133 (1990)], pAS3-3 (solicitud publicada de patente japonesa no examinada n° 227075/90), pCDM8 [Nature, 329, 840,(1987)], pcDNAI/Amp (fabricado por Invitrogen), pREP4 (fabricado por Invitrogen), pAGE103 [J. Biochemistry, 101, 1307 (1987)], pAGE210, pME18SFL3, pKANTEX93 (documento n° WO 97/10354) y similares.
Puede utilizarse cualquier promotor, con la condición de que pueda funcionar en una célula animal. Entre los ejemplos se incluyen un promotor de gen IE (temprano inmediato) del citomegalovirus (CMV), el promotor temprano del SV40, un promotor de retrovirus, un promotor metalotioneína, un promotor de choque térmico, el promotor SRa, y similares. Además, puede utilizarse un intensificador del gen IE del CMV humano junto con el promotor.
La célula hospedadora puede ser cualquiera, con la condición de que sea una estirpe celular en la que la actividad de un enzima capaz de añadir Gal a N-acetilgalactosamina (GalNAc) unida a Ser/Thr en el polipéptido, una proteína que participa en la actividad del enzima o una proteína que participa en el transporte de la uridín 5'-difosfato-galactosa (UDP-galactosa) se encuentre reducida o anulada, en el procedimiento de síntesis de cadenas de azúcar. Específicamente, la célula hospedadora puede ser un mutante de Lec8 [ACS Symp. Ser 128, 214 (1980)], que es una célula de ovario de hámster chino (CHO) que carece de un transportador de UDP-galactosa.
Además, aunque la célula no es deficiente en una actividad de un enzima que participa en el procedimiento de síntesis de cadenas de azúcar, o una actividad de la proteína transportadora, puede utilizarse una línea en la que la función de un enzima, tal como transportador de UDP-galactosa (también denominado translocador de UDP-galactosa, UGALT) o proteína nuclear 1 sintasa, glucoproteína-n-acetilgalactosamina 3-beta-galactosiltransferasa (C1GALT1, también denominada proteína 1 beta-3-gal-t, t sintasa) o chaperona 1 específica de C1GALT1 (c1galt1c1, también denominado chaperona molecular específica de proteína nuclear 1 beta-3-galactosiltransferasa (COSMC), C1GALT2) o la función de una proteína transportadora se encuentra reducida o anulada.
Entre los ejemplos de célula en la que está implicada una actividad de un enzima en el procedimiento de síntesis de cadenas de azúcar, o una actividad de la proteína transportadora no se encuentra eliminada, se incluyen las células Namalwa, las células COS de simio, las células c Ho de hámster chino, las células HBT5637 (solicitud publicada de patente japonesa no examinada n° 299/88) y similares.
Entre los ejemplos del método para suprimir la función génica se incluye el método antisentido, el método de ribozima [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 96, 1886 (1999)], el método de recombinación homóloga [Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1994), Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993)], el método del oligonucleótido de ARN-ADN (RDO), el método de ARN de interferencia (ARNi) [Nature, 391, 8 0 6 , (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 15502, (1998), Nature, 395, 854, (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 96, 5049, (1999), Cell, 95, 1017, (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 1451, (1999), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 13959, (1998), Nature Cell Biol., 2, 70, (2000)], un método que utiliza retrovirus, un método que utiliza un transposón [Nature Genetics, 25, 35, (2000)], y similares.
Puede utilizarse cualquier método de introducción del vector recombinante, con la condición de que sea un método para introducir ADN en una célula animal, y entre los ejemplos se incluye la electroporación [Cytotechnology, 3, 133 (1990)], el método del fosfato de calcio (solicitud publicada de patente japonesa no examinada n° 227075/90), el método de lipofección [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)], y similares. Como método de expresión del gen, además de dirigir la expresión, producción secretoria, puede utilizarse la expresión de proteína de fusión y similares de acuerdo con el método descrito en Molecular Cloning, A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). En el caso de que se lleve a cabo la expresión en una célula derivada de un eucariota, puede obtenerse un polipéptido al que se ha añadido un azúcar o una cadena de azúcar.
El polipéptido utilizado en la presente invención puede producirse mediante el cultivo del transformante obtenido de esta manera en un medio para formar y acumular el polipéptido en el cultivo, y recuperarlo a partir del cultivo. El método de cultivo del transformante en el medio se lleva a cabo según el método habitual utilizado en el cultivo de huéspedes.
En el caso de que se cultive un microorganismo transformado con un vector recombinante que contiene un promotor inducible como promotor, puede añadirse un inductor al medio, en caso necesario. Por ejemplo, puede añadirse al medio isopropil-p-D-tiogalactopiranósido o similar al cultivar un microorganismo transformado con un vector recombinante utilizando el promotor lac, o puede añadirse al mismo ácido indolacrílico o similar al cultivar un microorganismo transformado con un vector recombinante utilizando el promotor trp.
Al cultivar un transformante obtenido utilizando una célula animal a modo de célula hospedadora, el medio incluye el medio RPMI 1640 generalmente utilizado [The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)], medio MEM de Eagle [Science, 122, 501 (1952)], medio MEM modificado por Dulbecco [Virology, 8 , 396 (1959)] y medio 199 [Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950)], medios a los que se añade suero de feto bovino, etc., y similares.
El cultivo generalmente se lleva a cabo a un pH de entre 6 y 8 a una temperatura de entre 30°C y 40°C durante 1 a 7 días en presencia de 5% de CO2. En caso necesario, puede añadirse al medio un antibiótico, tal como canamicina o ampicilina, durante el cultivo.
De esta manera, el polipéptido utilizado en la presente invención puede producirse mediante el cultivo de un transformante derivado de un microorganismo, una célula animal o similar que comprende un vector recombinante en el que se inserta un ADN codificante del polipéptido utilizado en la presente invención, de acuerdo con un método de cultivo general, formando y acumulando de esta manera el polipéptido y recuperando después el polipéptido a partir del cultivo.
Con respecto al método de expresión génica, además de la expresión directa, puede llevarse a cabo la producción secretoria, la expresión de proteínas de fusión y similares de acuerdo con el método descrito en Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).
El procedimiento para producir el polipéptido incluye un método de expresión intracelular en una célula hospedadora, un método de secreción extracelular a partir de una célula hospedadora, un método para la producción sobre la cubierta externa de la membrana de una célula hospedadora, y similares. El método apropiado puede seleccionarse modificando la célula hospedadora utilizada y la estructura del polipéptido producido.
En el caso de que el polipéptido se produzca en una célula hospedadora o sobre la membrana externa de una célula hospedadora, el producto génico puede ser positivamente secretado extracelularmente según el método de Paulson et al. [J. Biol. Chem. 264:17619, 1989], el método de Lowe et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8227, 1989], Genes Develop. 4:1288, 1990], los métodos descritos en la solicitud publicada de patente japonesa n° 336963 /93 y el documento n° WO 94/23021, y similares. Además, puede incrementarse la cantidad producida de acuerdo con el método descrito en la solicitud publicada de patente japonesa no examinada n° 227075/90 utilizando un sistema de amplificación génica utilizando un gen de dihidrofolato reductasa.
El polipéptido puede aislarse y purificarse a partir del cultivo anteriormente indicado, por ejemplo de la manera siguiente.
En el caso de que el polipéptido se exprese intracelularmente en un estado disuelto, las células después del cultivo se recuperaron mediante centrifugación, se suspendieron en un tampón acuoso y después se rompieron utilizando un ultrasonicador, prensa francesa, homogeneizador Manton Gaulin, molino Dyno-mill o similar con el fin de obtener un extracto libre de células.
El extracto libre de células se centrifugó para obtener un sobrenadante y puede obtenerse una preparación purificada sometiendo el sobrenadante a tecnologías generales de aislamiento y purificación de las proteínas, tales como la extracción con solvente, la precipitación con elevada concentración salina de sulfato amónico, etc., la desalación, la precipitación con un solvente orgánico, la cromatografía de intercambio aniónico utilizando una resina, tal como dietilaminoetil (DEAE)-sefarosa, DIAION HPA-75 (fabricada por Mitsubishi Chemical), la cromatografía de intercambio catiónico utilizando una resina, tal como S-Sepharose FF (fabricada por Pharmacia), la cromatografía hidrofóbica utilizando una resina, tal como butil-sefarosa o fenil-sefarosa, la filtración en gel utilizando un tamiz molecular, la cromatografía de afinidad, el cromatoenfoque, la electroforesis, tal como la electroforesis de enfoque isoeléctrico o similar, que pueden utilizarse individualmente o en combinación.
Al expresar el polipéptido intracelularmente mediante la formación de un cuerpo de inclusión, las células se recogieron, se rompieron y se centrifugaron de la misma manera, y el cuerpo de inclusión del polipéptido se recolectó en forma de una fracción precipitada. Los cuerpos de inclusión recolectados de proteína se solubilizaron con un agente desnaturalizante de proteínas. La proteína se generó en una estructura tridimensional normal mediante la dilución o dialización de la solución solubilizada, obteniendo seguidamente una preparación purificada del polipéptido mediante el mismo método de purificación mediante aislamiento utilizado anteriormente.
Además, puede producirse el polipéptido utilizado en la presente invención mediante un método de síntesis química, tal como el método de Fmoc (fluorenilmetiloxicarbonilo) o el método de tBoc (t-butiloxicarbonilo). Además, puede sintetizarse químicamente utilizando un sintetizador de péptidos fabricado por Advanced ChemTech, Perkin-Elmer, Pharmacia, Protein Technology Instrument, Synthecell-Vega, PerSeptive, Shimadzu Corporation o similar.
(2) Inmunización de animales y preparación de células productoras de anticuerpos
Se inmunizó un ratón, rata o hámster de 3 a 20 semanas de edad con el antígeno preparado anteriormente, y se recolectaron células productoras de anticuerpos a partir del bazo, ganglio linfático o sangre periférica del animal. Además, en el caso de que el incremento de un título de anticuerpos suficiente en el animal anteriormente indicado no se identifique debido a la baja inmunogenicidad, puede utilizarse un ratón con desactivación de CD27 como animal que debe inmunizarse.
La inmunización se lleva a cabo mediante la administración del antígeno en el animal mediante inyección subcutánea, intravenosa o intraperitoneal junto con el adyuvante apropiado (por ejemplo adyuvante de Freund completo, la combinación de gel de hidróxido de aluminio con vacuna pertussis, o similar). En el caso de que el antígeno sea un péptido parcial, se produce un conjugado con una proteína portadora, tal como BSA (albúmina de suero bovino), KLH (hemocianina de lapa americana) o similar, que se utiliza como el antígeno.
La administración del antígeno se lleva a cabo 5 a 10 veces cada semana o cada dos semanas después de la primera administración. El tercer a séptimo día posterior a cada administración, se recogió una muestra de sangre del fondo del ojo, y se sometió a ensayo la reactividad del suero con el antígeno, por ejemplo mediante inmunoensayo enzimático [Antibodies-A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory (1988)] o similar. Un ratón, rata o hámster que mostrase un título de anticuerpos suficiente en el suero contra el antígeno utilizado para la inmunización se utilizó como fuente de suministro de células productoras de anticuerpos.
En la fusión de las células productoras de anticuerpos y las células de mieloma, en el tercer a séptimo días después de la administración final del antígeno, se extrajo tejido que contenía las células productoras de anticuerpos, tal como el bazo del ratón, rata o hámster inmunizado, a fin de recoger las células productoras de anticuerpos. Al utilizar células de bazo, el bazo se recortó y se introdujo en un medio MEM (Nissui Pharmaceutical) y se deshizo con pinzas y se centrifugó (a 1.200 rpm, durante 5 minutos). A continuación, el sobrenadante se descartó y se aplicó un tampón de Tris-cloruro amónico (pH 7,65) durante 1 a 2 minutos para eliminar los eritrocitos. Tras lavar 3 veces con medio MEM, se obtuvieron las células productoras de anticuerpos para la fusión.
(3) Preparación de células de mieloma
Se utiliza una estirpe celular establecida que se ha obtenido de ratones como células de mieloma. Entre los ejemplos se incluye la estirpe celular de mieloma P3-X63Ag8-U1 (P3-U1) de ratón resistente a 8 -azaguanina (derivado de ratón BALB/c) [Current Topics in Microbiology and Immunology 18:1, 1978], P3-NS1/1Ag41(NS-1) [European J. Immunology 6:511, 1976], SP2/0-Ag14(SP-2) [Nature 276:269, 1978], P3-X63-Ag8653(653) [J. Immunology 123:1548, 1979], P3-X63-Ag8(X63) [Nature 256.495:-497, 1975] y similares.
Las estirpes celulares anteriores se subcultivaron en un medio de 8 -azaguanina [un medio en el que se añadió glutamina (1,5 mM), 2-mercaptoetanol (5x10-5 M), gentamicina (10 pg/ml) y suero de feto bovino (FCS) a medio RPMI-1640 (en adelante denominado "medio normal") y se añadió adicionalmente 8 -azaguanina (15 pg/ml)] y se subcultivaron en el medio normal 3 o 4 días antes de la fusión celular para garantizar un número de células de 2 x10 7 o superior el día de la fusión.
(4) Fusión celular
Las células productoras de anticuerpo y células de mieloma anteriormente indicadas se lavaron suficientemente con medio MEM o PBS (1,83 g de hidrogenofosfato disódico, 0,21 g de dihidrogenofosfato potásico, 7,65 g de cloruro sódico, 1 litro de agua destilada, pH 7,2) y se mezclaron para proporcionar una proporción de células productoras de anticuerpos:células de mieloma=5 a 10: 1, seguido de centrifugación (1.200 rpm, 5 minutos). A continuación, se descartó el sobrenadante y el grupo celular precipitado se deshizo suficientemente. A 108 células productoras de anticuerpos, se añadieron 0 , 2 a 1 ml de una solución de mezcla de 2 g de polietilenglicol-1000 (PEG-1000), 2 ml de MEM y 0,7 ml de dimetilsulfóxido bajo agitación a 37°C y se añadieron 1 a 2 ml de medio MEM varias veces cada uno o dos minutos y se añadió medio MEM, proporcionando una cantidad total de 50 ml.
Tras la centrifugación (900 rpm, 5 minutos), se descartó el sobrenadante, se desagregaron suavemente las células y las células se suspendieron suavemente en 100 ml de medio HAT [un medio en el que se añade hipoxantina (10-4 moles/l), timidina (1,5x10-5 moles/l) y aminopterina (4x10-7 moles/l) al medio normal] mediante succión y eliminando mediante aspirado una pipeta de medición. La suspensión se dispensó a razón de 100 pl/pocillo en una placa de cultivo de 96 pocillos y se cultivó en un incubador con 5% de CO2 a 37°C durante 7 a 14 días.
Tras el cultivo, se muestreó una parte del sobrenadante de cultivo y seleccionó un hibridoma que era reactivo con un antígeno que contenía el polipéptido utilizado en la presente invención y que no era reactivo con un antígeno que no contenía el polipéptido seleccionado mediante ensayo de unión tal como se indica posteriormente.
A continuación, la clonación se llevó a cabo dos veces mediante un método de dilución limitante [en primer lugar, se utilizó medio HT (medio HAT del que se ha eliminado la aminopterina) y, en segundo lugar, se utilizó medio normal] y se seleccionó un hibridoma que mostraba un título de anticuerpos establemente elevado como hibridoma productor de anticuerpos monoclonales.
(5) Preparación de anticuerpos monoclonales
Las células de hibridoma productoras de anticuerpo monoclonal anti-CD27 obtenidas en (4) se administraron mediante inyección intraperitoneal en ratones de 8 a 10 semanas de edad o ratones desnudos tratados con pristano (0,5 ml de 2,6,10,14-tetrametilpendecano (pristano)) administrado por vía intraperitoneal, seguido de alimentación durante 2 semanas) a una dosis de 2*106 a 5*107 células/animal. El hibridoma desarrolla tumor ascites en 10 a 21 días.
Se recogió el líquido ascítico de los ratones anteriores, se centrifugó (a 3.000 rpm durante 5 minutos) para eliminar los sólidos, se sometió a precipitación salina con sulfato amónico al 40-50% y después se precipitó con ácido caprílico, se pasó por una columna de DEAE-sefarosa, una columna de proteína A o una columna de filtración en gel para recoger una fracción de IgG o IgM como anticuerpo monoclonal purificado.
La subclase del anticuerpo puede determinarse utilizando un kit de tipado de subclase mediante inmunoensayo enzimático. La cantidad de la proteína puede determinarse mediante el método de Lowry o a partir de la absorbancia a 280 nm.
(6 ) Ensayo de unión
Como antígeno, se utilizó una célula en la que se había introducido un gen, o una proteína recombinante obtenida mediante la introducción de un vector de expresión que contenía un ADNc codificante de polipéptido CD27 utilizado en la presente invención en Escherichia coli, una levadura, una célula de insecto, una célula animal o similar, o un polipéptido o péptido parcial purificado obtenido de un tejido humano.
En el caso de que el antígeno sea un péptido parcial, se prepara un conjugado con BSA (albúmina de suero bovino), KLH (hemocianina de lapa americana) o similar.
Tras preparar estos antígenos en una capa sólida mediante dispensación en una placa de 96 pocillos, se dispensó en la misma un suero de un animal que debía inmunizarse, un sobrenadante de cultivo de un hibridoma productor de anticuerpos monoclonales o un anticuerpo purificado, como anticuerpo primario y se dejó reaccionar. Tras lavar a fondo con PBS o PBS-Tween al 0,05%, se dispensó un anticuerpo antiinmunoglobulina marcado con biotina, un enzima, un material quimioluminiscente, un compuesto de radiación o similar como anticuerpo secundario y se dejó reaccionar. Tras lavar a fondo con PBS-Tween, la reacción se llevó a cabo en respuesta al marcaje del anticuerpo secundario.
El anticuerpo que reconoce CD27 que contiene una cadena de azúcar unida a O a la que no se encuentra unida galactosa y compite con el anticuerpo monoclonal para su unión a la región extracelular de CD27 puede prepararse mediante la adición de un anticuerpo que debe someterse a ensayo al sistema de ensayo de unión anteriormente mencionado y llevando a cabo la reacción. Es decir, un anticuerpo monoclonal que compite con el anticuerpo monoclonal obtenido de esta manera para su unión a la región extracelular de CD27 con cadena de azúcar deficiente llevando a cabo un cribado de un anticuerpo por el que resulta inhibida la unión del anticuerpo monoclonal al añadir el anticuerpo que debe someterse a ensayo.
Además, un anticuerpo que se une a un epítopo que resulta reconocido por un anticuerpo monoclonal que reconoce CD27 con cadena de azúcar deficiente y se une a la región extracelular del mismo, puede obtenerse mediante la identificación de un epítopo del anticuerpo obtenido utilizando el sistema de ensayo de unión anteriormente mencionado, y la construcción de un péptido de unión a cadena de azúcar parcial del epítopo identificado, o un péptido de unión a cadena de azúcar que imita la estructura tridimensional del epítopo, seguido de la inmunización.
2. Preparación de anticuerpo recombinante
Como ejemplos de producción de anticuerpos recombinantes, los procedimientos para producir un anticuerpo quimérico humano y un anticuerpo humanizado se muestran a continuación.
(1) Construcción de vector para la expresión de anticuerpos recombinantes
Un vector para la expresión de anticuerpos recombinantes es un vector de expresión para células animales en el que se han insertado ADN codificantes de CH y CL de un anticuerpo humano y se construye mediante clonación de cada uno de los ADN codificantes de CH y CL de un anticuerpo humano en un vector de expresión para células animales.
La región C de un anticuerpo humano puede ser CH y CL de cualquier anticuerpo humano. Entre los ejemplos se incluye CH perteneciente a la subclase y1, CL perteneciente a la clase k y similares. Como ADN codificantes de CH y CL de un anticuerpo humano, puede utilizarse un ADN cromosómico que comprende un exón y un intrón o ADNc.
Como vector de expresión para células animales, puede utilizarse cualquier vector de expresión, con la condición de que pueda insertarse y expresarse en el mismo un gen codificante de la región C de un anticuerpo humano. Entre los ejemplos se incluyen pAGE107 [Cytotechnol.,3:133, 1990], pAGE103 [J. Biochem. 101;1307, 1987], pHSG274 [Gene 27:223, 1984], pKCR [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 1527 (1981)], pSGlbd2-4 [Cytotechnol., 4, 173 (1990)], pSE1UK1Sed1-3 [Cytotechnol., 13, 79 (1993)] y similares.
Entre los ejemplos de un promotor para la utilización en un vector de expresión para células animales se incluye un promotor temprano de SV40 [J. Biochem. 101:1307, 1987], un LTR de virus de la leucemia de Moloney de ratón [Biochem. Biophys. Res. Commun., 149, 960 (1987)], un promotor de cadena H de inmunoglobulina [Cell, 41, 479 (1985)] y similares. Además, ejemplos de intensificador utilizado para un vector de expresión para células animales incluyen intensificador [Cell, 33, 717 (1983)].
El vector para la expresión de anticuerpo recombinante puede ser de un tipo en el que un gen codificante de una cadena H de anticuerpo y un gen codificante de una cadena L de anticuerpo se encuentran en vectores separados o son de un tipo en el que ambos genes se encuentran en el mismo vector (tipo tándem). Con respecto a la facilidad de construcción del vector para la expresión del anticuerpo recombinante, facilidad de introducción en células animales y equilibrio entre las cantidades de expresión de las cadenas H y L de anticuerpo en las células animales, resulta más preferente un tipo tándem de vector para la expresión del anticuerpo recombinante [J. Immunol. Methods, 167, 271 (1994)].
Entre los ejemplos del tipo tándem de vector para la expresión del anticuerpo recombinante se incluyen pKANTEX93 (documento n° WO 97/10354), pEE18 [Hybridoma, 17, 559 (1998)] y similares.
(2) Adquisición de ADNc codificante de la región V de anticuerpo derivado de animales no humanos y análisis de la secuencia de aminoácidos
Los ADNc codificantes de VH y VL de un anticuerpo derivado de un animal no humano se obtienen de la manera siguiente.
Se extrajo el ARNm de las células de hibridoma productoras de un anticuerpo derivado de un animal no humano para sintetizar ADNc. El ADNc sintetizado se clona en un vector, tal como un fago o un plásmido, con el fin de obtener una biblioteca de ADNc. Cada fago recombinante o plásmido recombinante que contenía ADNc codificante de VH o VL se aisló a partir de la biblioteca utilizando ADN codificante de una parte de la región C o la región V de un anticuerpo derivado de un animal no humano a modo de sonda.
Se determinó la longitud completa de las secuencias de nucleótidos de VH y VL de un anticuerpo derivado de un animal no humano de interés en el fago recombinante o plásmido recombinante y se dedujo la longitud completa de las secuencias de aminoácidos de VH y VL deducidas a partir de las secuencias de nucleótidos.
El animal no humano puede ser cualquier animal, tal como un ratón, rata, hámster o conejo, con la condición de que pueda producirse una célula de hibridoma a partir del mismo.
Entre los ejemplos del método para preparar el ARN total a partir de una célula de hibridoma se incluye el método de tiocianato de guanidina-trifluoroacetato de cesio [Methods in Enzymol., 154, 3 (1987)] y similares. Además, entre los ejemplos de un kit para preparar ARN total a partir de una célula de hibridoma se incluye el kit RNA Easy (fabricado por Qiagen) y similares.
Entre los ejemplos del método de preparación de ARNm a partir de ARN total se incluye un método de columna de celulosa con inmovilización de oligos (dT) [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)] y similares. Además, entre los ejemplos de un kit para preparar ARNm a partir de ARN total se incluye el kit de purificación de ARNm Oligo TM-dT30<Super> (fabricado por Takara) y similares.
Además, entre los ejemplos del método para preparar ARNm a partir de una célula de hibridoma se incluyen el kit de aislamiento de ARNm Fast Track (fabricado por Invitrogen), el kit de purificación de ARNm Quick Prep (fabricado por Pharmacia) y similares.
Entre los ejemplos del método para sintetizar ADNc y preparar una biblioteca de ADNc se incluyen métodos conocidos [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press (1989); Current Protocols in Molecular Biology, suplemento 1-34]; un método que utiliza un kit disponible comercialmente, tal como el sistema plásmido Super Script™ para la síntesis de ADNc y la clonación de plásmidos (fabricado por GIBCO BRL), el kit ZAP-cDNA (fabricado por Stratagene), etc., y similares.
El vector, en el que se inserta ADNc sintetizado utilizando ARNm extraído de una célula de hibridoma como molde para preparar una biblioteca de ADNc, puede ser cualquier vector, con la condición de que pueda insertarse ADNc.
Entre los ejemplos del mismo se incluyen ZAP Express [Strategies 5:58, 1992], pBluescript II SK(+) [Nucleic Acids Research 17:9494, 1989], AzapII (fabricado por Stratagene), Agt10 y Agtll [DNA Cloning: A Practical Approach, I, 49, 1985], Lambda BlueMid (fabricado por Clontech), AExCell y pT7T3-18U (fabricado por Pharmacia), pcD2 [Mol. Cell. Biol. 3:280, 1983], pUC18 [Gene 33:103, 1985] o similar.
Puede utilizarse cualquier Escherichia coli para introducir la biblioteca de ADNc construida con un fago o vector plásmido, con la condición de que la biblioteca de ADNc pueda introducirse, expresarse y mantenerse.
Entre los ejemplos del mismo se incluyen XL1-Blue MRF' [Strategies 5:81, 1992], C600 [Genetics 39:440, 1954], Y1088 e Y1090 [Science 222: 778, 1983], NM522 [J. Mol. Biol. 166:1, 1983], K802 [J. Mol. Biol., 16, 118 (1966)], JM105 [Gene, 3 8 , 275 (1985)], y similares.
Puede utilizarse un método de hibridación de colonias o de hibridación de placas que utiliza una sonda marcada con isótopos o fluorescentemente para seleccionar clones de ADNc codificantes de VH y VL de un anticuerpo derivado de un animal no humano de la biblioteca de ADNc [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)].
Además, los ADNc codificantes de VH y VL pueden prepararse mediante una reacción en cadena de la polimerasa [en adelante denominado 'PCR'; Molecular Cloning, A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), Current Protocols in Molecular Biology, suplemento 1-34) mediante la preparación de cebadores y la utilización de ADNc preparado a partir de ARNm o una biblioteca de ADNc como molde.
La secuencia de nucleótidos del ADNc puede determinarse mediante digestión del ADNc seleccionado mediante el método anteriormente indicado con enzimas de restricción adecuados, clonando los fragmentos en un plásmido, tal como pBluescript SK(-) (fabricado por Stratagene), llevando a cabo la reacción mediante un método de análisis de nucleótidos utilizado habitualmente, tal como el método de dideoxi de Sanger F. et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (1977)], y después analizando la secuencia utilizando un analizador automático de secuencias de nucleótidos, tal como el secuenciador de ADN A.L.F. (fabricado por Pharmacia).
Si los ADNc obtenidos codifican las secuencias de aminoácidos completas de VL y puede confirmarse la VL del anticuerpo que contiene una secuencia de señal secretoria mediante la estimación de la longitud completa de las secuencias de aminoácidos de VH y VL a partir de la secuencia de nucleótidos determinada y comparándolas con la longitud completa de las secuencias de aminoácidos de VH y VL de anticuerpos conocidos [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)].
La longitud de la secuencia de señal secretoria y la secuencia de aminoácidos N-terminal puede deducirse mediante la comparación de la longitud completa de las secuencias de aminoácidos de VH y Vl del anticuerpo que comprende una secuencia de señal secretoria con una longitud completa de las secuencias de aminoácidos de VH y VL de anticuerpos conocidos [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)] y también puede ser conocido el subgrupo al que pertenecen.
Además, la secuencia de aminoácidos de cada una de las CDR de VH y VL puede encontrarse mediante comparación de las secuencias de aminoácidos obtenidas con las secuencias de aminoácidos de VH y VL de anticuerpos conocidos [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)].
Además, la novedad de la secuencia puede examinarse llevando a cabo una búsqueda de homología con secuencias en cualquier base de datos, por ejemplo SWISS-PROT, PIR-Protein o similar utilizando la longitud completa de las secuencias de aminoácidos de Vh y VL, por ejemplo según el método BLAST [J. Mol. Biol.
215:403, 1990] o similar.
(3) Construcción de vector para la expresión de anticuerpos quiméricos humanos
Se clonaron los ADNc codificante de VH y VL de anticuerpo de animal no humano cadena arriba de los genes codificantes de CH o CL del anticuerpo humano del vector para la expresión de anticuerpo recombinante mencionado en 2 (1 ) anteriormente, construyendo de esta manera un vector para la expresión de un anticuerpo quimérico humano.
Por ejemplo, con el fin de ligar el extremo 3'-terminal del ADNc codificante de VH y VL de anticuerpo no humano y el extremo 5'-terminal de ADNc codificante de CH y CL de anticuerpo humano, los ADNc de VH y VL diseñados de manera que la secuencia de bases de la parte ligada codifica aminoácidos apropiados y se prepara la secuencia que presenta una secuencia de reconocimiento de enzima de restricción apropiada.
Los ADNc de VH y VL preparados de esta manera se clonaron, respectivamente, de manera que cada uno de ellos se expresase de una forma apropiada cadena arriba del gen codificante de CH y CL del anticuerpo humano del vector para la expresión de anticuerpo humanizado mencionado en 2(1) anteriormente, para construir un vector para la expresión de un anticuerpo quimérico humano.
Además, el ADNc codificante de VH o VL o animal no humano se amplifica mediante PCR utilizando un ADN sintético con una secuencia de reconocimiento de un enzima de restricción apropiado en ambos extremos y cada uno de ellos se clona en el vector de expresión de anticuerpo recombinante mencionado en 2 (1 ), anteriormente. (4) Construcción de ADNc codificante de la región V de anticuerpo humanizado
Los ADNc codificantes de VH o VL de un anticuerpo humanizado pueden obtenerse de la manera siguiente. En primer lugar, se seleccionan las secuencias de aminoácidos de la región marco (en adelante denominada "FR") en VH o VL de un anticuerpo humano en el que se han trasplantado las secuencias de aminoácidos de las CDR en VH o VL de un anticuerpo derivado de un anticuerpo animal no humano. Pueden utilizarse cualesquiera secuencias de aminoácidos de FR en VH o VL de un anticuerpo humano con la condición de que sean humanas. Entre los ejemplos se incluyen secuencias de aminoácidos de FR en VH o VL de anticuerpos humanos registrados en una base de datos, tal como la Protein Data Bank o similares, y secuencias de aminoácidos comunes a subgrupos de FR en VH o VL de anticuerpos humanos [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)], y similares.
Con el fin de inhibir la reducción de la actividad de unión del anticuerpo, se seleccionaron secuencias de aminoácidos de elevada homología (por lo menos 60% o superior) con la secuencia de aminoácidos de FR en VH o VL del anticuerpo original. A continuación, se injertaron secuencias de aminoácidos de CDR de VH o VL del anticuerpo original en la secuencia de aminoácidos seleccionada de FR en VH o VL del anticuerpo humano, respectivamente, a fin de diseñar cada secuencia de aminoácidos de VH o VL de un anticuerpo humanizado. Las secuencias de aminoácidos diseñadas se convirtieron en secuencias de ADN mediante la consideración de la frecuencia de uso de los codones observada en las secuencias de nucleótidos de los genes de anticuerpos [[Sequence of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)], y se diseñó la secuencia de ADN codificante de la secuencia de aminoácidos de VH o VL de un anticuerpo humano.
Basándose en las secuencias de nucleótidos diseñadas, se sintetizaron varios ADN sintéticos con una longitud de aproximadamente 100 nucleótidos y se llevó a cabo la PCR utilizándolos. En este caso, resulta preferente en cada una de las cadenas H y L que se diseñen 6 ADN sintéticos a partir de la eficiencia de reacción de la PCR y las longitudes de los ADN que pueden sintetizarse.
Además, el ADNc codificante de VH o VL de un anticuerpo humanizado puede clonarse fácilmente en el vector para la expresión de anticuerpos humanizados construido en (1 ) de dicho ítem 2 mediante la introducción de la secuencia de reconocimiento de un enzima de restricción apropiado en el extremo 5'-terminal de los ADNc sintéticos existentes en ambos extremos.
Después de la PCR, se clonó un producto amplificado en un plásmido, tal como pBluescript SK(-) (fabricado por Stratagene) o similar, y la secuencia de nucleótidos se determinó según el método descrito en (2) de dicho ítem 2 con el fin de obtener un plásmido con una secuencia de ADN codificante de la secuencia de aminoácidos de VH o VL de un anticuerpo humanizado deseado.
(5) Modificación de secuencia de aminoácidos de la región V de anticuerpo humanizado
Es conocido que al producir un anticuerpo humanizado mediante la simple injertación de únicamente CDR en VH y VL de un anticuerpo derivado de un animal no humano en los FR de VH y VL de un anticuerpo humano, su actividad de unión a antígeno es inferior a la del anticuerpo original derivado de un animal no humano [BIO/TECHNOLOGY, 9, 266 (1991)].
Como motivo, se considera que varios residuos aminoácidos en no sólo los CDR sino también las FR directa o indirectamente están relacionadas con la actividad de unión a antígeno en VH y VL del anticuerpo orignal derivado de un animal no humano, y como resultado de la injertación de las CDR, tales residuos aminoácidos se modifican por diferentes residuos aminoácidos en las FR en Vh y VL de un anticuerpo humano.
Con el fin de resolver el problema, en anticuerpos con injertación de CDR humanos, entre las secuencias de aminoácidos de las FR en VH y VL de un anticuerpo humano, un residuo aminoácido que se relaciona directamente con la unión a un antígeno, o un residuo aminoácido que se relaciona indirectamente con la unión a un antígeno mediante la interacción con un residuo aminoácido en la CDR o mediante el mantenimiento de la estructura tridimensional de un anticuerpo se identifica y se modifica a un residuo aminoácido que se observa en el anticuerpo original derivado de un animal no humano, incrementando de esta manera la actividad de unión a antígeno que se ha reducido [BIO/TECHNOLOGY, 9, 266 (1991)].
En la producción de un anticuerpo humanizado, resulta muy importante cómo identificar eficientemente los residuos aminoácidos relacionados con la actividad de unión a antígeno en la FR, de manera que se construye la estructura tridimensional de un anticuerpo y se analiza mediante cristalografía de rayos X [J. Mol. Biol. 112:535, 1977], modelado por ordenador [Protein Engineering 7:1501, 1994] o similar.
Aunque la información de la estructura tridimensional de anticuerpos ha resultado útil en la producción de un anticuerpo humanizado, no se ha establecido todavía ningún método para producir un anticuerpo humanizado que pueda aplicarse a cualesquiera anticuerpos. Por lo tanto, actualmente pueden resultar necesarios varios intentos, por ejemplo, se producen varios anticuerpos modificados de cada anticuerpo y se examina la correlación entre cada uno de los anticuerpos modificados y su actividad de unión de anticuerpo.
La modificación de la secuencia de aminoácidos de FR en VH y VL de un anticuerpo humano puede llevarse a cabo utilizando diversos ADN sintéticos para la modificación según la PCR tal como se indica en (4) de dicho ítem 2. Con respecto al producto amplificado obtenido mediante la PCR, se determina la secuencia de nucleótidos según el método tal como se describe en (2 ) de dicho ítem 2 de manera que se confirma si se ha llevado a cabo la modificación objetivo.
(6 ) Construcción de vector para la expresión de anticuerpo humanizado
Un vector para la expresión de anticuerpo humanizado puede construirse mediante la clonación de cada ADNc codificante de VH o Vl de un anticuerpo recombinante construido cadena arriba de cada gen codificante de CH o CL del anticuerpo humano en el vector para la expresión de anticuerpo humanizado tal como se indica en (1) de dicho ítem 2.
Por ejemplo, al reconocer secuencias de reconocimiento de enzimas de restricción apropiados en el extremo 5'-terminal de ADN sintéticos situados en ambos extremos de los ADN sintéticos utilizados en la construcción de VH o VL del anticuerpo humanizado en (4) y (5) de dicho ítem 2, la clonación puede llevarse a cabo de manera que se expresan en una forma apropiada cadena arriba de cada gen codificante de CH o CL del anticuerpo humano en el vector para la expresión de un anticuerpo humanizado tal como se indica en (1 ) de dicho ítem 2. (7) Expresión transitoria de anticuerpo recombinante
Con el fin de evaluar eficientemente la actividad de unión a antígeno de diversos anticuerpos humanizados producidos, los anticuerpos recombinantes pueden expresarse transitoriamente utilizando el vector para la expresión de anticuerpo humanizado tal como se indica en (3) y (6 ) de dicho ítem 2 o el vector de expresión modificado del mismo. Puede utilizarse cualquier célula como célula hospedadora con la condición de que la célula hospedadora pueda expresar un anticuerpo recombinante.
Entre ellas, generalmente se utiliza preferentemente las células COS-7 (ATCC n° CRL 1651) en vista de su elevado nivel de expresión Methods in Nucleic Acids Res., CRC Press, 283 (1991)].
Entre los ejemplos del método para introducir el vector de expresión en las células COS-7 se incluye un método de DEAE-dextrano [Methods in Nucleic Acids Res., CRC Press, 283 (1991)], un método de lipofección [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)], y similares.
Tras la introducción del vector de expresión, el nivel de expresión y la actividad de unión a antígeno del anticuerpo recombinante en el sobrenadante de cultivo pueden determinarse mediante inmunoensayo enzimático [en adelante denominado 'ELISA'; Monoclonal Antibodies-Principles and Practice, tercera edición, Academic Press, 1996; Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; Monoclonal Antibody Experiment Manual, Kodansha Scientific, 1987] y similares.
(8 ) Expresión estable de anticuerpos recombinantes
Puede obtenerse un transformante que expresa establemente un anticuerpo recombinante mediante la introducción del vector para la expresión del anticuerpo recombinante indicado en (3) y (6 ) de dicho ítem 2 en una célula hospedadora apropiada.
Entre los ejemplos del método para introducir un vector de expresión en una célula hospedadora se incluyen la electroporación [solicitud publicada de patente japonesa no examinada n° 257891/90; Cytotechnology 3:133, 1990] y similares.
Como célula animal en la que se introduce un vector de expresión de anticuerpo recombinante, puede utilizarse cualquier célula con la condición de que sea una célula animal que pueda producir el anticuerpo recombinante. Entre los ejemplos se incluye la célula SP2/0-Ag14 de ratón (ATCC n° CRL1581), la célula P3X63-Ag8.653 de ratón (ATCC n° CRL1580), la célula CHO/dhfr- (ATCC n° CRL9096) y la célula CHO/DG44 [Somatic Cell and Molecular Genetics, 12,555(1986)], siendo ambos dos tipos de células ovárico de hámster chino, Lec13 de resistencia adquirida a lectina [Somatic Cell and Molecular Genetics, 12, 55 (1986)], células CHO en las que el gen de a1,6-fucosyltransferasa es defectuoso (documentos n°WO 05/35586 y n°WO02/31140), célula YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20 de rata (ATCC n° CRL1662), y similares.
Además de las células hospedadoras anteriormente indicadas, las células hospedadoras en las que se introduce la actividad de una proteína, tal como un enzima relacionada con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa, una proteína tal como un enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa está unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor del enlace a en una cadena de azúcar unida a N-glucósido de tipo complejo, o una proteín arelacionada con el transporte de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa, hasta el cuerpo de Golgi, se encuentran reducidos o anuladas, preferentemente también pueden utilizarse células CHO en las que el gen de a1,6-fucosiltransferasa es defectuoso tal como se indica en los documentos n° WO 05/35586, n° WO 02/31140 o similar.
Tras la introducción del vector de expresión, se seleccionan transformantes que expresan un anticuerpo recombinante establemente de acuerdo con el método dado a conocer en la solicitud publicada de patente japonesa no examinada n° 257891/90, mediante el cultivo en un medio para el cultivo de células animales que contienen un agente, tal como sulfato de G418 (en adelante denominado 'G418', fabricado por SigMA) o similares.
Entre los ejemplos del medio para el cultivo de células animales se incluyen el medio RPMI1640 (fabricado por Invitrogen), el medio GIT (fabricado por Nissui Pharmaceutical), el medio EX-CELL301 (fabricado por JRH), el medio IMDM (fabricado por Invitrogen), el medio Hybridoma-SFM (fabricado por Invitrogen), y medios obtenidos mediante la adición de diversos aditivos, tales como el suero de feto bovino (en adelante denominado 'FCS'), a dichos medios, y similares.
El anticuerpo recombinante puede producirse y acumularse en un sobrenadante de cultivo mediante el cultivo de los transformantes obtenidos en un medio. El nivel de expresión y actividad de unión a antígeno del anticuerpo recombinante en el sobrenadante de cultivo puede medirse mediante ELISA o similar. Además, en el transformante, la cantidad de expresión del anticuerpo recombinante puede incrementarse mediante la utilización del sistema de amplificación de dhfr o similar según el método dado a conocer en la solicitud publicada de patente japonesa no examinada n° 257891/90.
El anticuerpo recombinante puede purificarse a partir del sobrenadante de cultivo del transformante mediante la utilización de una columna de proteína A [Monoclonal Antibodies-Principles and Practice, tercera edición, Academic Press, 1996), Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory,1988].
Puede utilizarse cualesquiera otros métodos convencionales para la purificación de proteínas. Por ejemplo, el anticuerpo recombinante puede purificarse mediante una combinación de filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico, ultrafiltración y similares.
El peso molecular de la cadena H o de la cadena L del anticuerpo recombinante purificado o de la molécula de anticuerpo globalmente se determina mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (en adelante denominado 'SDS-pAg E') [Nature, 227, 680 (1970)], transferencia western [Monoclonal Antibodies-Principles and Practice, tercera edición, Academic Press (1996), Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)], y similares.
3. Evaluación de actividad del anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la presente invención
La especificidad de reacción del anticuerpo o fragmento de anticuerpo purificado de la presente invención puede evaluarse en el procedimiento siguiente.
Utilizando una célula que expresa una cadena de azúcar normal y una estirpe celular en la que una actividad de un enzima capaz de añadir Gal a GalNAc unido a Ser/Thr en el polipéptido, el nivel de una proteína implicada en la actividad del enzima o una proteína implicada en el transporte de la uridín 5'-difosfato-galactosa (UDP-galactosa) se encuentra reducido o anulado, en el procedimiento de síntesis de cadena de azúcar unida a O, como huésped, pueden construirse respectivamente células expresantes de CD27 que expresan la secuencia de nucleótidos codificante de CD27 (SEC ID n° 1).
De esta manera, puede construirse una célula que expresa CD27 con una cadena de azúcar unida a O normal y una célula que expresa CD27 con cadena de azúcar deficiente y puede estimarse la reactividad de las estirpes celulares que expresan cada CD27 con el anticuerpo purificado, mediante ELISA, una técnica de anticuerpos fluorescentes [Cancer Immunol. Immunother. 36:373, 1993] o similares.
Alternativamente, la región extracelular de CD27 se expresa como forma soluble, tal como una proteína de fusión en cada una de las células hospedadoras anteriormente indicadas, y purificarse bajo condiciones apropiadas para preparar proteínas solubles CD27 respectivas que retienen una estructura tridimensional.
Entre los ejemplos de la proteína de fusión puede incluirse una fusión de la proteína CD27 con otro polipéptido, tal como una región constante de anticuerpo (también denominada Fc), etiqueta GST, etiqueta histidina (también denominada etiqueta His) o etiqueta Myc. La proteína de fusión puede separarse y purificarse mediante la utilización de una columna de afinidad, tal como proteína A, columna de níquel, columna de anticuerpo específico o similares.
La reactividad de la proteína soluble CD27 purificada con el anticuerpo purificado puede medirse mediante BIAcore™ con asistencia de resonancia del plasmón superficial (SPR), ELISA, inmunoprecipitación o método similar [Monoclonal Antibodies-Principles and Practice, tercera edición, Academic Press (1996), Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)].
La actividad citotóxica en la estirpe celular en cultivo que expresa CD27 con cadena de azúcar deficiente puede evaluarse mediante la medición de la actividad de CDC, actividad de ADCC o similar, de acuerdo con un método conocido [Cancer Immunol. Immunother. 36:373 (1993)].
4. Método para diagnosticar una enfermedad utilizando un anticuerpo monoclonal o un fragmento de anticuerpo de la presente invención que reconoce específicamente CD27 con cadena de azúcar deficiente y que también se une a la región extracelular del mismo
Puede diagnosticarse una enfermedad relacionada con CD27 con cadena de azúcar deficiente mediante la detección o cuantificación de CD27 con cadena de azúcar deficiente o una célula que expresa el polipéptido, utilizando el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la presente invención.
La enfermedad relacionada con CD27 con cadena de azúcar deficiente puede ser cualquiera con la condición de que sea una enfermedad en la que se observe in vivo una célula expresante de polipéptido CD27 con cadena de azúcar deficiente. Específicamente, puede ser nefropatía de IgA o cáncer. Entre los ejemplos del cáncer se incluye cáncer derivado de procesos de diferenciación de las células B o T.
Específicamente, entre los ejemplos se incluye una diversidad de linfomas no de Hodgkin, comprendiendo linfoma de células del manto, leucemia linfocítica crónica, leucemia linfocítica pequeña, linfoma de Burkitt, linfoma folicular, linfoma MALT, linfoma de células B grandes difusas, plasmacitoma y similares.
La muestra de cuerpo vivo que debe utilizarse para la detección o medición de un polipéptido CD27 con cadena de azúcar deficiente en la presente invención no se encuentra particularmente limitada, con la condición de que presente una posibilidad de contener el polipéptido, tal como células de tejido, sangre, plasma sanguíneo, suero, jugos pancreáticos, orina, materia fecal, líquido tisular o medio de cultivo.
Entre las enfermedades relacionadas con CD27 con cadena de azúcar deficiente, por ejemplo, puede llevarse a cabo el diagnóstico de la nefropatía de IgA de la manera siguiente.
En el cuerpo vivo, muestras recogidas de dos o más de los cuerpos vivos de personas sanas, la cantidad expresada del polipéptido en las muestras de cuerpo vivo de personas sanas se confirma llevando a cabo la detección o medición de un polipéptido CD27 con cadena de azúcar deficiente mediante los medios inmunológicos siguientes utilizando el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la presente invención o derivados del mismo.
Mediante el examen de la cantidad expresada del polipéptido también en las muestras de cuerpo vivo de la persona que debe analizarse de la misma manera, se compara la cantidad expresada con la cantidad expresada en personas sanas. En el caso de que la cantidad expresada del polipéptido en la persona que debe analizarse se encuentre incrementada en comparación con la observada en personas sanas, puede diagnosticarse que es positiva para cáncer.
Entre las enfermedades relacionadas con CD27 con cadena de azúcar deficiente, por ejemplo, puede llevarse a cabo el diagnóstico de un cáncer de la manera siguiente.
En el cuerpo vivo, muestras recogidas de dos o más de los cuerpos vivos de personas sanas, la cantidad expresada del polipéptido en las muestras de cuerpo vivo de personas sanas se confirma llevando a cabo la detección o medición de un polipéptido CD27 con cadena de azúcar deficiente mediante los medios inmunológicos siguientes utilizando el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la presente invención o derivados del mismo.
Mediante el examen de la cantidad expresada del polipéptido también en las muestras de cuerpo vivo de la persona que debe analizarse de la misma manera, se compara la cantidad expresada con la cantidad expresada en personas sanas. En el caso de que la cantidad expresada del polipéptido en la persona que debe analizarse se encuentre incrementada en comparación con la observada en personas sanas, puede diagnosticarse que es positiva para cáncer.
El agente diagnóstico que contiene el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la presente invención o derivados del mismo puede contener además un reactivo para llevar a cabo una reacción de antígeno-anticuerpo o un reactivo para la detección de la reacción según el método diagnóstico deseado. El reactivo para llevar a cabo la reacción de antígeno-anticuerpo puede incluir un tampón, una sal y similar.
El reactivo para la detección incluye un reactivo utilizado para la detección inmunológica o inmunoensayo común, tal como un anticuerpo o fragmento de anticuerpo del mismo, derivados de los mismos, anticuerpo secundario marcado para reconocer el anticuerpo, fragmento de anticuerpo o derivados de los mismos y sustrato correspondiente al marcaje.
Como método para la detección o determinación de la cantidad de CD27 deficiente en cadena de azúcar en la presente invención, puede incluirse cualquier método conocido. Por ejemplo, a título de ejemplo se proporciona un método de detección inmunológica o inmunoensayo.
Un método de detección inmunológica o inmunoensayo es un método en el que se detecta o se determina una cantidad de anticuerpo o de antígeno utilizando un antígeno o anticuerpo marcado. Son ejemplos de la detección inmunológica o inmunoensayo un método de inmunoanticuerpos marcado con sustancia radiactiva (RAI), un inmunoensayo enzimático (EIA o ELISA), un inmunoensayo fluorescente (FIA), un inmunoensayo luminiscente, un método de transferencia western, medios físicoquímicos (tales como TIA, LAPIA y PCIA) y similares.
Entre los ejemplos del método de inmunoanticuerpos marcados con una sustancia radiactiva (RIA) se incluye un método en el que el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la presente invención se deja reaccionar con un antígeno o una célula que expresa un antígeno, después el anticuerpo antiinmunoglobulina se somete a marcaje radioactivo o se deja que un fragmento de unión del mismo reaccione con él, seguido de la determinación utilizando un contador de centelleo o similar.
Entre los ejemplos del inmunoensayo enzimático (EIA o ELISA) se incluyen un método en el que el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la presente invención se deja reaccionar con un antígeno o una célula que expresa un antígeno o similar, y después un anticuerpo antiinmunoglobulina o un fragmento de unión del mismo se somete a marcaje del anticuerpo y se deja reaccionar con el mismo y el pigmento de color se mide con un espectrofotómetro y, por ejemplo, puede utilizarse un ELISA de tipo sándwich.
Como marcaje utilizado en el inmunoensayo enzimático, puede utilizarse cualquier marcaje enzimático conocido (Enzyme Immunoassay, editado por Eiji Ishikawa, et al., publicado por Igaku Shoin) tal como ya se ha indicado. Entre los ejemplos se incluyen el marcaje de fosfatasa alcalina, el marcaje de peroxidasa, el marcaje de luciferasa, el marcaje de biotina y similares.
El ELISA de tipo sándwich es un método en el que se une un anticuerpo a una fase sólida, el antígeno que debe detectarse o medirse se atrapa y se deja que otro anticuerpo reaccione con el antígeno atrapado. En el ELISA, se preparan dos tipos de anticuerpos que reconocen el antígeno que debe detectarse o medirse o fragmentos de anticuerpo de los mismos en los que el sitio de reconocimiento de antígeno es diferente, y un anticuerpo o fragmento de anticuerpo se adsorbe previamente sobre una placa (tal como una placa de 96 pocillos) y otro anticuerpo o fragmento de anticuerpo se marca con una sustancia fluorescente, tal como FITC, un enzima tal como peroxidasa, o biotina.
La placa en la que se adsorbe el anticuerpo anteriormente indicado se deja reaccionar con las células separadas del cuerpo vivo o suspensión de células fragmentadas del mismo, tejido o solución desintegrada del mismo, células en cultivo, suero, efusión pleural, líquido ascítico, solución oftalmológica o similar, y después se deja reaccionar con el anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo marcado y se lleva a cabo una reacción de detección correspondiente a la sustancia marcada.
Al medir una concentración de antígeno en la muestra que debe someterse a ensayo mediante el método anteriormente indicado, la concentración de antígeno en la muestra que debe someterse a ensayo puede calcularse a partir de una curva de calibración preparada mediante una dilución escalonada de antígeno de concentración conocida.
Como anticuerpo utilizado para el ELISA de tipo sándwich, puede utilizarse cualquiera de un anticuerpo policlonal y un anticuerpo monoclonal o fragmentos de anticuerpo, tales como Fab, Fab' y F(ab)2. Como combinación de dos tipos de anticuerpo utilizados en un ELISA de tipo sándwich, puede utilizarse una combinación de anticuerpos monoclonales o fragmentos de anticuerpo que reconocen diferentes epítopos o una combinación de anticuerpo policlonal con anticuerpo monoclonal o fragmentos de anticuerpo.
Un inmunoensayo fluorescente (FIA) incluye un método descrito en la literatura [Monoclonal Antibodies Principies and Practice, tercera edición, Academic Press, 1996; Manual for Monoclonal Antibody Experiments, Kodansha Scientific, 1987] y similares.
Como marcaje para el inmunoensayo fluorescente, puede utilizarse cualquiera de los marcajes fluorescentes conocidos (Fluorescent Immunoassay, by Akira Kawao, Soft Science) tal como ya se ha indicado. Entre los ejemplos se incluye el marcaje de FITC, el marcaje de RITC y similares.
El inmunoensayo luminiscente puede llevarse a cabo utilizando los métodos descritos en Monoclonal Antibodies -Principles and Practice, tercera edición, Academic Press (1996); Manual for Monoclonal Antibody Experiments, Kodansha Scientific (1987) y similares.
Como marcaje utilizado para el inmunoensayo luminiscente, puede incluirse cualquiera de los marcajes luminiscentes conocidos [Bioluminescence and Chemical Luminescence, Hirokawa Shoten; Rinsho Kensa, 42 (1998)], tal como se ha indicado anteriormente. Entre los ejemplos se incluye el uso del marcaje de éster de acridinio, del marcaje de lofina o similar.
La transferencia western es un método en el que un antígeno o una célula que expresa un antígeno se fracciona mediante electroforesis en SDS-gel de poliacrilamida [Antibodies-A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)], el gel se transfiere a membrana de PVDF o membrana de nitrocelulosa, se deja que reaccione la membrana con anticuerpo o fragmento de anticuerpo que reconoce el antígeno, se deja que reaccione adicionalmente con un anticuerpo o fragmento de anticuerpo anti-IgG de ratón que se marca con una sustancia fluorescente, tal como FITC, un marcaje enzimático, tal como peroxidasa, un marcaje de biotina, o similar, y el marcaje se visualiza para confirmar la reacción. Se describe posteriormente un ejemplo de la transferencia western.
Las células o tejidos en los que se expresa un polipéptido con la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 2 se disuelven en una solución y, bajo condiciones reductoras, se someten a electroforesis 0,1 a 30 |jg de cantidad de proteína por carril mediante un método de SDS-PAGE. La proteína sometida a electroforesis se transfiere a una membrana de PVDF y se deja reaccionar con PBS que contiene 1% de BSA (en adelante denominada 'BSA-PBS') a temperatura ambiente durante 30 minutos para el bloqueo.
En la presente memoria, el anticuerpo monoclonal de la presente invención se deja reaccionar, se lava con PBS que contiene Tween-20 al 0,05% (en adelante denominado 'Tween-PBS') y se deja reaccionar con anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón marcado con peroxidasa a temperatura ambiente durante 2 horas. Se lavó con Tween-PBS y se detectó una banda a la que se había unido el anticuerpo monoclonal utilizando reactivos de detección de transferencia western ECLTM (fabricados por Amersham) o similar, detectando de esta manera un polipéptido con la secuencia de aminoácidos representados por la SEC ID n° 2.
Como anticuerpo utilizado para la detección en la transferencia western, se utiliza un anticuerpo que puede unirse a un polipéptido que no presenta estructura tridimensional de un tipo natural.
El método físicoquímico se lleva a cabo específicamente utilizando el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la presente invención haciendo reaccionar CD27 como el antígeno con el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la presente invención para formar un agregado y detectar este agregado.
Entre otros ejemplos de los métodos físicoquímicos se incluye un método capilar, un método de inmunodifusión unidimensional, una inmunoturbidimetría y una inmunoturbidimetría de látex [Handbook of Clinical Test Methods, Kanehara Shuppan, 499 (1988)].
Por ejemplo, en un método de inmunodifusión de látex, puede utilizarse un portador, tal como látex de poliestireno con un tamaño de partícula de aproximadamente 0 , 1 a 1 jm sensibilizado con anticuerpo o antígeno y al llevar a cabo una reacción de antígeno-anticuerpo utilizando el antígeno o anticuerpo correspondiente, se incrementa la luz dispersada en la solución de reacción, mientras que se reduce la luz transmitida. Al detectar este cambio como absorbancia o turbidez esférica integral, ahora resulta posible medir la concentración de antígeno, etc. en la muestra que debe someterse a ensayo.
Debido a que el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la presente invención es capaz de unirse a una región extracelular del polipéptido CD27 con cadena de azúcar deficiente, se utiliza preferentemente para detectar una célula que expresa el polipéptido. Para la detección de la célula que expresa el polipéptido, pueden utilizarse métodos de detección inmunológica conocidos, y preferentemente se utiliza un método de inmunoprecipitación, un método de tinción de células fluorescentes, un método de tinción de tejidos inmunológicos y similares. Además, puede utilizarse un método de tinción inmunofluorescente utilizando el sistema FMAT 8100 HTS (Applied Biosystem) y similares.
Un método de inmunoprecipitación es un método en el que una célula que expresa el polipéptido se deja reaccionar con el anticuerpo monoclonal o fragmento de anticuerpo de la presente invención y después se añade un portador con capacidad de unión específica a inmunoglobulina, tal como proteína G-sefarosa, de manera que precipita un complejo de antígeno-anticuerpo. Además, puede llevarse a cabo el método siguiente.
El anticuerpo o fragmento de anticuerpo anteriormente indicado de la presente invención se adsorbe en fase sólida en una placa de 96 pocillos para ELISA y después se bloquea con BSA-PBS. En el caso de que el anticuerpo se encuentre en un estado no purificado, tal como un sobrenadante de cultivo de células de hibridoma, se adsorbe previamente inmunoglobulina antiratón o inmunoglobulina de rata o proteína A o G o similar sobre una placa de 96 pocillos para ELISA y se bloquea con BSA-PBS y se dispensa en la misma un sobrenadante de cultivo de células de hibridoma para la unión.
Tras descartar BSA-PBS y lavar suficientemente el residuo con PBS, se lleva a cabo la reacción con una solución disuelta de células o tejidos que expresan el polipéptido con la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 2. Se extrae un precipitado inmunológico de la placa de pocillos lavados con un tampón para muestras para SDS-PAGE y se detecta mediante la transferencia western anteriormente indicada.
Un método de tinción de células inmunológicas y un método de tinción de tejidos inmunológicos son métodos de tinción inmunofluorescente (una citometría de flujo) en la que las células o tejidos en los que se expresa el antígeno se tratan, en caso necesario, con un surfactante o metanol para permitir que un anticuerpo permee fácilmente por las células o tejidos, y después el anticuerpo de la presente invención se deja reaccionar con los mismos, se dejar reaccionar adicionalmente con un anticuerpo antiinmunoglobulina o fragmento de unión del mismo sometido a marcaje fluorescente, tal como FITC, marcaje enzimático, tal como peroxidasa o marcaje de biotina, y el marcaje se visualiza y se observa bajo un microscopio o se deja que las células reaccionen con un anticuerpo marcado fluorescentemente y se analizan con un citómetro de flujo.
Esto puede llevarse a cabo mediante los métodos descritos en, por ejemplo, la literatura Monoclonal Antibodies -Principles and Practice, tercera edición, Academic Press (1996), Manual for Experiments of Monoclonal Antibodies, Kodansha Scientific (1987)].
Particularmente, debido a que el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la presente invención se une a la estructura tridimensional de una región extracelular de CD27 con cadena de azúcar deficiente, puede utilizarse preferentemente para la detección de una célula que expresa el polipéptido que mantiene una estructura tridimensional de tipo natural, mediante citometría de flujo.
Además, mediante la utilización del sistema FMAT8100HTS (fabricado por Applied Biosystems), que utiliza el principio de tinción de anticuerpos fluorescentes, puede medirse la cantidad de antígeno o la cantidad de anticuerpo sin separar el complejo anticuerpo-antígeno formado y el anticuerpo o antígeno libre que no participa en la formación del complejo de anticuerpo-antígeno.
5. Método para el diagnóstico de enfermedades utilizando el anticuerpo monoclonal o fragmento de anticuerpo de la presente invención que reacciona con un polipéptido CD27 con cadena de azúcar deficiente
El anticuerpo monoclonal o el fragmento de anticuerpo de la presente invención que reconoce específicamente el polipéptido CD27 con cadena de azúcar deficiente y se une a la región extracelular del mismo puede utilizarse para tratar una enfermedad relacionada con el polipéptido CD27 con cadena de azúcar deficiente.
La enfermedad relacionada con el polipéptido CD27 con cadena de azúcar deficiente puede ser cualquiera, con la condición de que sea una enfermedad en la que se detecte in vivo una célula que expresa el polipéptido. Por ejemplo, puede ser nefropatía de IgA, cáncer o similar.
Además, la enfermedad puede comprender además una enfermedad que se manifiesta con síndrome nefrósico o insuficiencia renal que da como resultado el desarrollo de nefropatía de IgA.
Entre los ejemplos de cáncer pueden incluirse un tumor derivado de órgano hematopoyético (también denominado cáncer hematológico) o un cáncer sólido derivado de células epiteliales.
Entre los ejemplos de cáncer hematológico se incluyen, específicamente, leucemia, linfoma (linfoma de Hodgkin, linfoma no de Hodgkin), mieloma múltiple y similares.
Entre los ejemplos específicos de linfoma no de Hodgkin se incluyen el linfoma de células del manto, leucemia linfocítica crónica, leucemia linfocítica pequeña, linfoma de Burkitt, linfoma folicular, linfoma MALT, linfoma de células B grandes difusas, plasmacitoma y similares.
Entre los ejemplos específicos del cáncer sólido se incluyen cáncer de mama, cáncer uterino, cáncer colorrectal, cáncer de estómago, cáncer ovárico, cáncer pulmonar, cáncer renal, cáncer rectal, cáncer de tiroides, cáncer del cuello uterino, cáncer del intestino delgado, cáncer de próstata, cáncer pancreático y similares.
El agente terapéutico de la presente invención incluye un agente terapéutico para el cáncer que comprende el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la presente invención a modo de principio activo. El agente terapéutico de la presente invención incluye además un agente terapéutico para el cáncer que presenta actividad efectora, tal como actividad de ADCC y actividad de CDC, un agente terapéutico para el cáncer mediante una actividad inductora de apoptosis y similares.
Debido a que el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la presente invención puede reconocer un polipéptido CD27 con cadena de azúcar deficiente expresado sobre la membrana celular, puede reconocer una célula que expresa in vivo un polipéptido CD27 con cadena de azúcar deficiente.
De acuerdo con lo anterior, entre los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo de la presente invención, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo del mismo con actividad efectora puede dañar la célula que expresa un polipéptido CD27 con cadena de azúcar deficiente in vivo e in vitro.
Además, debido a que el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la presente invención puede dañar y, de esta manera, reducir las células que expresan un polipéptido CD27 con cadena de azúcar deficiente in vivo, resulta particularmente eficaz como agente terapéutico.
El agente terapéutico que comprende el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la presente invención o derivados del mismo puede ser únicamente el anticuerpo o fragmento de anticuerpo o derivados del mismo como principio activo, y preferentemente se suministra como preparación farmacéutica producida mediante un método apropiado bien conocido en el campo farmacéutico técnico, mediante la mezcla del mismo con uno o más portadores farmacéuticamente aceptables.
Resulta preferente seleccionar una vía de administración que resulte más eficaz en el tratamiento. Entre los ejemplos se incluyen la administración oral y la administración parenteral, tal como la administración bucal, traqueal, rectal, subcutánea, intramuscular o intravenosa. En el caso de una formulación de anticuerpos o péptidos, resulta preferente la administración intravenosa.
La forma de administración incluye espráis, cápsulas, comprimidos, gránulos, jarabes, emulsiones, supositorios, inyecciones, pomadas, cintas y similares.
Entre los ejemplos de la preparación farmacéutica adecuados para la administración oral se incluyen emulsiones, jarabes, cápsulas, comprimidos, polvos, gránulos y similares. Pueden producirse preparaciones líquidas, tales como emulsiones y jarabes, utilizando, a modo de aditivos, agua, azúcares tales como sacarosa, sorbitol y fructosa, glicoles tales como polietilenglicol y propilenglicol; aceites tales como aceite de sésamo, aceite de oliva y aceite de soja; antisépticos tales como ésteres de ácido p-hidroxibenzoico, saborizantes tales como saborizante de fresa o de menta-piperita, y similares.
Se producen cápsulas, comprimidos, polvos, gránulos y similares utilizando, como aditivos, excipientes tales como lactosa, glucosa, sacarosa o manitol; agentes desintegrantes tales como almidón y alginato sódico; lubricantes tales como estearato de magnesio y talco; ligantes tales como alcohol polivinílico, hidroxipropilcelulosa y gelatina; surfactantes tales como éster de ácido graso, plastificadores tales como la glicerina, y similares.
Entre los ejemplos de preparación farmacéutica adecuada para la administración parenteral se incluyen inyecciones, supositorios, espráis y similares. Las inyecciones se preparan utilizando un portador, tal como una solución salina, una solución de glucosa, una mezcla de ambas. Pueden prepararse supositorios utilizando un portador, tal como manteca de cacao, grasa hidrogenasa o ácido carboxílico. Pueden prepararse espráis utilizando el anticuerpo o fragmento de anticuerpo sin modificación o utilizándolo junto con un portador que no estimula la membrana mucosa bucal o de las vías respiratorias del paciente y puede facilitar la absorción del compuesto mediante la dispersión del mismo como partículas finas.
Entre los ejemplos del portador se incluyen lactosa, glicerol y similares. Dependiendo de las propiedades del anticuerpo y el portador, resulta posible producir preparaciones farmacéuticas, tales como aerosoles y polvos secos. Además, los componentes ejemplificados como aditivos para preparaciones orales también pueden añadirse a las preparaciones parenterales.
Aunque la dosis clínica o la frecuencia de administración varía dependiendo del efecto terapéutico objetivo, del método de administración, del periodo de tratamiento, de la edad, del peso corporal y similares, habitualmente es de entre 10 pg/kg y 8 mg/kg al día por adulto. La presente invención se describe a continuación mediante ejemplos; sin embargo, la presente invención no se encuentra limitada a los ejemplos siguientes.
Ejemplos
[Ejemplo 1]
Construcción de dominio extracelular de CD27 soluble que contiene una cadena de azúcar unida a O a la que no se encuentra unida galactosa (en adelante con frecuencia denominada "CD27 con cadena de azúcar deficiente").
(1) Clonación de gen de CD27 humano
De acuerdo con el procedimiento siguiente, se aisló un gen codificante de CD27 a partir de una biblioteca de ADNc derivada de sangre periférica humana obtenido de Clontech. Se llevó a cabo una PCR mediante la preparación de 50 pl de una solución de reacción que contenía una concentración de 1 vez de tampón de PCR BD Advantage (fabricada por Clontech) y una concentración de 1 vez de dNTP unidos, 25 ng de ADNc monocatenario derivado de monocitos sanguíneos periféricos humanos, 0,2 pmoles/l de CD27fw (SEC ID n° 3), 0,2 pmoles/l de CD27809B (SEC ID n° 4) y concentración de 1 vez de mezcla de polimerasa de PCR Advantage 2 (fabricado por Clontech).
Se llevó a cabo la PCR bajo las condiciones de reacción siguientes: 30 ciclos, consistiendo cada uno en una reacción a 98°C durante 15 segundos y la reacción a 6 8 °C durante 30 segundos. La solución de reacción se separó mediante electroforesis en gel de agarosa al 2% y el producto de PCR de aproximadamente 1 kpb se insertó en un vector pCR-2.1 utilizando un kit de clonación TOPO TA (fabricado por Invitrogen) siguiendo las instrucciones adjuntas al mismo. Se transformó Escherichia coli con un plásmido que presentaba el fragmento amplificado por PCR insertado en el mismo y se prepararon los plásmidos obtenidos de los clones respectivos, seguido de secuenciación del ADN. Se obtuvo pCR 2.1 CD27 con la secuencia de ADN representada por la SEC ID n° 1 (figura 1).
(2) Construcción de plásmido en el que se clonó un gen con la región extracelular de CD27 humana
Se aisló un ADNc codificante de CD27 con eliminación de una región transmembrana en el lado C-terminal siguiendo el procedimiento de PCR siguiente. A una solución de reacción que contenía 0,2 mmoles/l de dNTP y 1 mmol/l de cloruro de magnesio, se añadió 1 ng de pCR 2.1 CD27, 1 pmol/l de CD27-A (SEC ID n° 5), 1 pmol/l de CD27-B (SEC ID n° 6 ) y 2,5 unidades de polimerasa KOD (fabricada por Toyobo) y el volumen final se ajustó a 50 pl, seguido de PCR bajo las condiciones de reacción siguientes: 25 ciclos, consistiendo cada uno en una reacción a 98°C durante 15 segundos y la reacción a 6 8 °C durante 30 segundos.
Se separó la solución de reacción mediante electroforesis en gel de agarosa al 2% y se introdujo el producto de PCR de aproximadamente 600 pb en un vector pCR-Blunt utilizando un kit de clonación de PCR Zero Blunt (fabricado por Invitrogen) siguiendo las instrucciones adjuntas al mismo. El plásmido resultante en el que se había clonado un gen con la región extracelular de CD27 humano se denominó pCRCD27axb (figura 2).
(3) Construcción de vector pBShCy4SP con la región IgG4Fc humana mutante.
Utilizando un plásmido pBShCy4 con un ADNc codificante de una región de C de una subclase de IgG4 de tipo salvaje tal como se indica en el documento n° WO97/10354, se construyó el plásmido pBShCY4SP que presentaba una región C de subclase IgG4 humana de tipo mutante con una sustitución de Ser en la posición 108 por Pro en la región C (región bisagra) de la subclase IgG4 humana de tipo salvaje. Esta modificación es conocido que resulta en la estabilización de los dímeros mediante la región bisagra de la IgG (Molecular Immunology, 30, 105, 1993).
Como molde, se prepararon 50 pl de una solución de reacción [Tris-HCl 10 mM (pH 8,3), cloruro potásico 50 mM, cloruro de magnesio 1,5 mM, gelatina al 0,001%, dNTP 200 pM, cebador 10,5 pM (SEC ID n° 7), cebador 20,5 pM (SEC ID n° 8 ) y 2 unidades de ADN polimerasa Taq TaKaRa Ex] que contiene 1 ng de plásmido pBShCY4, seguido de PCR utilizando un sistema de PCR GeneAmp 9700 (fabricado por Perkin-Elmer): 30 ciclos, consistiendo cada uno en una reacción a 94°C durante 2 minutos, una reacción a 55°C durante 2 minutos y una reacción a 72°C durante 2 minutos.
La solución de reacción se purificó utilizando un kit de purificación de PCR QIAquick (fabricado por Qiagen) siguiendo las instrucciones adjuntas al mismo, se trató con el enzima de restricción EcoT14I (fabricado por Takara Bio) y se separó mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,8% y el fragmento amplificado seguidamente se recuperó utilizando un kit de extracción de gel QIAquick (fabricado por Qiagen) siguiendo las instrucciones adjuntas al mismo.
El plásmido pBShCY4 se cortó con el enzima de restricción Eco T14I, seguido del tratamiento con fosfatasa alcalina (fabricada por Takara Bio) para eliminar el fosfato 5'-terminal. De manera similar, se llevó a cabo la separación mediante electroforesis en gel de agarosa al 0 ,8 % y el fragmento de plásmido resultante se recuperó utilizando un kit de extracción de gel QIAquick siguiendo las instrucciones adjuntas al mismo. El fragmento amplificado recuperado y el plásmido derivado del plásmido pBShCY4 se ligó para construir el plásmido pBShCY4SP que comprendía un ADNc deseado (figura 3).
(4) Clonación de ADNc que comprende una secuencia parcial de IgG4Fc humano
Se amplificó un fragmento de ADN codificante de IgG4Fc humano con el sitio de enzima de restricción BamHI en el extremo 5'-terminal y un sitio de enzima de restricción SalI en el extremo 3'-terminal siguiendo el procedimiento de PCR a continuación. A una solución de reacción que contenía 0,2 mmoles/l de dNTP y 1 mmol/l de cloruro de magnesio, se añadieron 25 ng de pBShCY4SP construido en la sección (3), 1 pmol/l de g4A (SEC ID n° 9), 1 pmol/l de g4B (SEC ID n° 10) y 2,5 unidades de polimerasa KOD (fabricada por Toyobo) y se ajustó el volumen final a 50 pl, seguido de PCR.
Las condiciones de reacción fueron las siguientes: 25 ciclos, consistiendo cada uno en una reacción a 98°C durante 15 segundos y la reacción a 6 8 °C durante 30 segundos. Se separó la solución de reacción mediante electroforesis en gel de agarosa al 2% y se introdujo el producto de PCR de aproximadamente 700 pb en un vector pCR-Blunt utilizando un kit de clonación de PCR Zero Blunt (fabricado por Invitrogen) siguiendo las instrucciones adjuntas al mismo. El plásmido resultante se denominó pCRIgG4FcBamHISalI (figura 4).
(5) Construcción de vector de expresión para pKANTEX XhoI/SalI de células animales
El vector de expresión de anticuerpos humanizados pKANTEX93 tal como se describe en el documento n° WO97/10354 se digirió con los enzimas de restricción XhoI (fabricado por Takara Bio) y SalI (fabricado por Takara Bio) y se separó mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,8% y el fragmento de plásmido de aproximadamente 9,8 kpb se recuperó utilizando un kit de extracción de gel (fabricado por Qiagen). Los extremos 5'- y 3'-terminales del fragmento de ADN recuperado se ligaron utilizando un kit de ligación de ADN (fabricado por Takara Bio) y a continuación se transformó Escherichia coli DH5a (fabricado por Toyobo) con el ADN plasmídico recombinante resultante.
Se aisló el ADN plasmídico recombinante a partir de una pluralidad de colonias resistentes a ampicilina obtenidas utilizando un kit miniprep QIAprep Spin (fabricado por Qiagen) y después se confirmó la exclusión de la unidad de expresión de la cadena L de anticuerpo mediante la digestión con los enzimas de restricción NotI (fabricado por Takara Bio) y KpnI (fabricado por Takara Bio). El plásmido resultante se denominó pKANTEX XhoI/SalI (figura 5).
(6 ) Construcción del plásmido pKANTEX CD27IgG4Fc que expresa el dominio extracelular de CD27 soluble El fragmento de aproximadamente 600 pb obtenido mediante digestión con NotI y BamHI de pCR2.1 CD27 axb construido en la sección (2) y el fragmento de ADN de aproximadamente 700 pb obtenido mediante digestión con BamHI y SalI de pCRIgG4FcBamHISalI construido en la sección (3) se ligaron en el fragmento de ADN de aproximadamente 8 , 8 kpb obtenido mediante la digestión con NotI y SalI de pKANTEX XhoI/SalI construido en la sección (5), obteniendo de esta manera un plásmido pKANTEX CD27IgG4Fc para la expresión de CD27-Fc (figura 6 ).
Una secuencia de nucleótidos de la proteína de fusión soluble CD27-Fc (en adelante con frecuencia denominada "CD27-Fc") que está codificada por el plásmido anteriormente indicado se describe como SEC ID n° 11 y una secuencia de aminoácidos de la misma se describe como SEC ID n° 12. Escherichia coli transformado con dicho vector de expresión se sembró en 100 ml de un medio LB, se cultivó durante la noche y se recogió y el plásmido se purificó utilizando un kit QIAfilter Plasmid Midi (fabricado por Qiagen) de acuerdo con los protocolos adjuntos al mismo.
Tras completar la purificación, se linealizaron 30 pg del vector plásmido mediante digestión con un enzima de restricción AatII. Después de la linealización se realizó la extracción con fenol/cloroformo, la precipitación con etanol, la disolución en una concentración de 0,1 veces de tampón TE (Tris-HCl 1 mM, EDTa 0,1 mM) y la medición de la concentración de ADN. Se proporcionó para la introducción génica.
(7) Expresión de CD27-Fc
De acuerdo con la electroporación [Cytotechnology, 3, 133 (1990)], la introducción del plásmido de expresión de CD27-Fc, pKANTEX CD27IgG4Fc, en las células CHO/dG44 (Somatic Cell and Molecular Genetics, 12, 555 (1986), en adelante denominado "DG44") o en las células Lec8 se llevó a cabo de la manera siguiente.
En primer lugar, las células DG44, subcultivadas en un medio base [medio de Dulbecco modificado por Iscove (fabricado por Invitrogen) complementado con suero de feto bovino dializado al 10% (fabricado por Invitrogen), 50 pg/ml de gentamicina (fabricada por Nacalai Tesque) y suplemento 1xHT (fabricado por Invitrogen)] se suspendieron a una densidad de 8*106 células/ml en un tampón de K-PBS [una suspensión de 137 mmoles/l de KCl, 2,7 mmoles/l de NaCI, 8,1 mmoles/l de Na2 HPO4 , 1,5 mmoles/l de KH2 PO4 , 4,0 mmoles/l de MgCy para preparar una suspensión celular.
Con 10 |jg del plásmido linealizado pKANTEX CD27IgG4Fc construido en la sección (6 ), se mezclaron 200 |jl (1,8x106 células) de la suspensión celular. El subcultivo de células Lec8 se llevó a cabo en un medio base (en adelante denominado "medio HT") sin adición de suplemento de 1xHT.
La mezcla de células/ADN se transfirió a una cubeta Gene Pulser (distancia entre electrodos: 2 mm, fabricada por Bio-Rad) y se llevó a cabo la transferencia génica utilizando un dispositivo GenePulser (Bio-Rad) a un voltaje de pulso de 0,35 KV y una capacidad eléctrica de 250 jF.
La suspensión celular se mezcló con un medio HT [10 ml de medio de Dulbecco modificado por Iscove (fabricado por Invitrogen) complementado con suero de feto bovino al 10% (fabricado por Invitrogen) y 50 jg/ml de gentamicina (fabricada por Nacalai Tesque)], se sembró en un matraz de cultivo tisular de 75 cm2 (fabricado por Greiner) y se cultivó en un incubador con 5% de CO2 a 37°C. Tres días después del cultivo, se añadió al mismo G418 (fabricado por Sigma), proporcionando una concentración final de 0,5 mg/ml, seguido del cultivo durante 10 días adicionales.
Diez días después, las células se subcultivaron en un matraz de cultivo tisular de 182 cm2 (fabricado por Greiner), seguido del cultivo continuo hasta la confluencia. Tras intercambiar el medio de cultivo con medio libre de suero EXCELL 301 (fabricado por JRH Bioscience) en el punto de confluencia, las células se cultivaron durante una semana y se recogió el sobrenadante de cultivo y se purificó de acuerdo con el método siguiente. (8 ) Purificación de CD27-Fc
El sobrenadante de cultivo obtenido del cultivo de la sección (7) se centrifugó a 3.000 rpm y a 4°C durante 10 minutos. El sobrenadante resultante se recuperó y se filtró a través de una membrana PES de 0,22 jm de tamaño de poro (fabricada por Asahi Techno Glass). En una columna de 0,8 cm de diámetro, se empaquetaron 0,5 ml de Mab Select (fabricado por Amersham Pharmacia Biotech) y después se pasaron secuencialmente por la misma 3,0 ml de agua purificada y 3,0 ml de ácido bórico 0,2 M-tampón de NaCl 0,15 M (pH 7,5, en adelante denominado "tampón de borato").
Además, se equilibró el portador mediante lavado secuencial con 2,0 ml de tampón de citrato 0,1 M (pH 3,5) y 1,5 ml de tampón de borato. A continuación, el sobrenadante de cultivo se pasó por la columna, que después se lavó con 3,0 ml de tampón de borato. Tras el lavado, los anticuerpos adsorbidos al portador se eluyeron con 1,25 ml de tampón de citrato 0,1 M (pH 3,5).
La elución se llevó a cabo para obtener cinco fracciones divididas, cada una de las cuales consistía en 250 jl. A continuación, las fracciones purificadas obtenidas se sometieron a análisis de SDS-PAGE y las fracciones a partir de las que se confirmó la elución de la proteína deseada se agruparon y se dializaron frente a tampón de PBS a 4°C durante la noche.
Tras completar la diálisis, se recuperó la solución de CD27-Fc y se sometió a filtración esterilizante utilizando Millex g V 0,22 jm (Millipore). A continuación, se midió la absorbancia (DO280 nm) utilizando un espectrofotómetro Shimadzu UV-1700 y se calculó la concentración de CD27-Fc (0,68 mg/ml considerando la DO280nm=1,0; calculada a partir de eM=134655 y MW=92840).
A partir de aproximadamente 300 ml de sobrenadante de cultivo libre de suero de las células expresantes de CD27-Fc derivadas de las células hospedadoras respectivas, se obtuvieron 3,6 mg de CD27-Fc derivadas de Lec8 y 2,2 mg de CD27-Fc derivado de CHO/DG44. Para las proteínas respectivas, los resultados del análisis de SDS-PAGE de las fracciones de elución se proporcionan en la figura 7.
Como resultado, bajo condiciones reductoras, se observó CD27-Fc con un peso molecular de aproximadamente 65 kDa para DG44 como huésped, y un peso molecular de aproximadamente 48 kDa para Lec8 como huésped. Por otra parte, bajo condiciones no reductoras, se observaron bandas individuales en posiciones correspondientes a un peso molecular aproximadamente dos veces superior a los obtenidos bajo condiciones reductoras, confirmando de esta manera que CD27-Fc se encuentra presente en forma de dímero.
(9) Confirmación de la estructura de las cadenas de azúcar
A 16 j l de una dilución de 10 veces de CD27-Fc purificado de la sección (8 ) en PBS se añadieron 4 j l de un tampón para muestras de SDS concentrado 5 veces, seguido del tratamiento a 90°C durante 5 minutos, seguido de SDS-PAGE. La electroforesis se llevó a cabo utilizando el gel de SDS-poliacrilamida al 5-20% e-PAGEl (fabricado por ATTO, n° de cat. E-T520L) en una celda de electroforesis RAPIDAS Mini-Slab (ATTO) bajo una corriente de 20 mA/gel durante 90 minutos.
La transferencia a una membrana de PVDF (fabricada por Millipore Immobilon, n° de cat. IPVH304F0) se llevó a cabo utilizando un filtro ATTO Holize, a 180 mA durante 90 minutos. Se sumergió membrana post-transferencia en PBS que contenía BSA al 10% (en adelante denominado "BSA al 10%-PBS") y se dejó en reposo a 4°C durante la noche para el bloqueo.
Después, se añadieron 5 pg/ml de anticuerpo anti-RCASI clon 22-1-1 (fabricado por MBL, n° de cat. D060-3) preparados utilizando BSA al 1%-PBS, seguido de la reacción a temperatura ambiente durante 2 horas. La membrana se lavó con Tween-20 al 0,05%-PBS (fabricado por Wako Pure Chemical, n° de cat. 167-11515) a temperatura ambiente durante 30 minutos y se dejó reaccionar con una dilución de 2.000 veces de un anticuerpo secundario de conejo marcado con peroxidasa anti-inmunoglobulina de ratón (fabricado por DAKO, n° de cat. P0161) en BSA al 1%-PBS a temperatura ambiente durante 1 hora.
La membrana se lavó con Tween-20 al 0,05%-PBS a temperatura ambiente durante 30 minutos, seguido de la detección utilizando un reactivo de detección de transferencia western ECL (fabricado por Amersham Pharmacia Biotech, n° de cat. RPN2106). Se muestran los resultados en la figura 8.
A partir de los resultados de análisis de SDS-PAGE, se demostró que un peso molecular de CD27-Fc derivado de DG44 es mayor que el de CD27-Fc derivado de Lec8 y no existen diferencias de estructura de la cadena de azúcar de unión a CD27-Fc según la célula hospedadora, DG44 y Lec8.
Además, el anticuerpo 22-1-1 anti-RCAS1 aparentemente reconoce un antígeno Tn que es una cadena de azúcar unida a O y es conocido como anticuerpo anti-Tn [J.B.C., 27822998-23007 (2003)).
El anticuerpo anti-RCAS-1 clon 22-1-1, que es un anticuerpo anti-Tn, no se unía a CD27-Fc derivado de DG44 pero se unía específicamente a CD27-Fc derivado de Lec8. Se confirmó que el antígeno Tn, que es una cadena de azúcar unida a O a la que no se encuentra unida galactosa, se unía a CD27-Fc producido por Lec8.
[Ejemplo 2]
Preparación de células CHO que expresan CD27 sobre la membrana celular
(1) Construcción del plásmido de expresión de CD27 pKANTEX CD27
A partir de pCR2.1 CD27 construido en el ejemplo 1, se construyó un fragmento de ADNc con eliminación de una parte de ADNc no necesaria para la expresión génica de acuerdo con el procedimiento de PCR siguiente.
Se llevó a cabo una PCR mediante la preparación de 50 pl de una solución de reacción que contenía 0,2 mmoles/l de dNTP, 1 mmol/l de cloruro de magnesio, 1 ng de pCR2.1 CD27, 1 pmol/l de CD27-A (SEC ID n° 5), 1 pmol/l de CD27-C (SEC ID n° 13) y 2,5 unidades de polimerasa KOD (fabricada por Toyobo). Se llevó a cabo la PCR.
Las condiciones de reacción fueron las siguientes: 25 ciclos, consistiendo cada uno en una reacción a 98°C durante 15 segundos y la reacción a 6 8 °C durante 30 segundos. La solución de reacción se separó mediante electroforesis en gel de agarosa al 2% y se introdujo el producto de PCR de aproximadamente 800 pb en un vector pCR-Blunt utilizando un kit de clonación de p Cr Zero Blunt (fabricado por Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones adjuntas al mismo, obteniendo de esta manera pCR27axc con la secuencia de ADN indicada en la SEC ID n° 1 (figura 9).
A continuación, el fragmento de ADN de aproximadamente 780 pb obtenido mediante digestión de pCR27axc con los enzimas de restricción NotI y SalI se ligó con el fragmento de ADN de aproximadamente 8,9 kpb obtenido mediante digestión con los enzimas de restricción NotI y SalI de pKANTEX Xho/SalI construido en el ejemplo 1, construyendo de esta manera el plásmido pKANTEX CD27 para la expresión de CD27 (figura 10).
La secuencia de nucleótidos de CD27 codificada por este plásmido se muestra en la SEC ID n° 1 y la secuencia de aminoácidos traducida a partir de ella se muestra en la SEC ID n° 2. Se sembraron Escherichia coli transformadas con el vector de expresión construido de esta manera, en 100 ml de medio LB, seguido del cultivo durante la noche. Tras completar el cultivo, se recuperaron las bacterias y se purificó el plásmido utilizando un kit QIAfilter Plasmid Midi (fabricado por Qiagen) siguiendo las instrucciones adjuntas al mismo.
Después, se linealizaron 30 pg del vector plásmido mediante digestión con el enzima de restricción AafII. Después de la linealización se realizó la extracción con fenol/cloroformo, la precipitación con etanol, la disolución en una concentración de 0,1 veces de tampón TE (Tris-HCl 1 mM, EDTA 0,1 mM), la medición de la concentración de ADN y la introducción génica.
(2) Introducción del plásmido de expresión de CD27, pKANTEX CD27
Las células Lec8 y DG44 expresantes de CD27 se establecieron mediante la introducción génica del plásmido expresante de CD27, pKANTEX CD27, construido en la sección (1), en células Lec8 y CHO/DG44. La introducción génica se llevó a cabo de la misma manera que en el ejemplo 1, excepto en que se utilizó pKANTEX CD27 como el plásmido para la introducción.
Las células tras la introducción génica se suspendieron en 30 ml de un medio HT y se sembraron 100 pl/pocillo de la suspensión celular en placas de 96 pocillos por triplicado. Dos días después de la siembra, se intercambió el medio de cultivo por un medio de subcultivo que contenía 500 pg/ml de G4l8, seguido del cultivo durante 10 días. Tras 10 días, se intercambió el medio de cultivo por un medio HT que contenía MTX 50 nM (fabricado por Sigma Aldrich) y se obtuvo la estirpe celular resistente a MTX. La estirpe celular expresante de CD27 derivada de Lec8 se denominó CD27/Lec8-4 y la célula expresante de CD27 derivada de DG44 se denominó CD27/DG44-8.
(3) Confirmación de la célula expresante de CD27
Con el fin de confirmar la expresión de CD27 de las células expresantes de CD27 construidas en la sección (2), el análisis se llevó a cabo de la manera siguiente, utilizando un citómetro de flujo (CMF).
En un tubo de 15 ml (fabricado por Becton, Dickinson and Company), se dispensaron 1 a 5x106 células expresantes de CD27 y se centrifugaron a 1.500 rpm durante 5 minutos. Tras descartar el sobrenadante, el residuo se suspendió en tampón de PBS que contenía 50 pl de albúmina de suero bovino al 1% (BSA) [en adelante denominado "BSA al 1%-PBS", fabricado por Kohjin Bio].
A la suspensión, se le añadieron 10 pl de anticuerpos monoclonales de ratón anti-CD27 marcados con PC5 (fabricados por Beckman Coulter, n° de cat. 6607107) o 10 pl de control de isotipo IgG1 de ratón marcado con PC5 (Beckman Coulter, n° de cat. 6607012) como anticuerpo primario, seguido de la reacción a la temperatura del hielo durante 60 minutos. Tras completar la reacción, las células se lavaron dos veces con 1 ml de BSA al 1%-PBS y se suspendieron en 500 pl de BSA al 1%-PBS y se midió la intensidad de la fluorescencia utilizando un citómetro de flujo (CMF, fabricado por Becton, Dickinson and Company).
Se muestran los resultados en la figura 11. Tal como se muestra en la figura 11, se confirmó que CD27/Lec8-4 y CD27/DG44-8 muestran sustancialmente el mismo nivel de expresión de CD27 sobre la membrana celular.
[Ejemplo 3]
Construcción de anticuerpo monoclonal para CD27 que contiene una cadena de azúcar unida a O a la que no se encuentra unida galactosa (en adelante denominado "anticuerpo monoclonal anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente")
(1) Preparación de inmunógeno
Junto con 2 mg de un adyuvante de hidróxido de aluminio Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, p99, 1988) y 1*109 células de una vacuna pertussis (fabricada por Chiba Serum Institute), se administraron 50 pg de CD27-Fc producido por Lec8 obtenidos en el ejemplo 1, en ratas SD hembra de 4 semanas de edad (n=3).
Dos semanas después de la administración, se administraron 50 pg de CD27-Fc producido por Lec8 en los animales una vez a la semana, tres veces en total. Se recolectó parcialmente sangre a partir de las venas caudales de los animales y se midió la actividad de unión de los antisueros obtenidos mediante tinción de células fluorescentes utilizando el sistema de detección celular ABI8200 (fabricado por Applied Biosystems) o un citómetro de flujo (Cytomics FC500 MPL, fabricado por Beckman Coulter). Se extrajo el bazo de un ratón que mostraba un título suficiente de anticuerpos, tres días después de la inmunización final.
Se trituró el bazo en trozos pequeños en un medio esencial mínimo (MEM, fabricado por Nissui Pharmaceutical), se deshizo utilizando un par de pinzas, y se centrifugó (1.200 rpm, 5 minutos). Se añadió tampón de Tris-cloruro amónico (pH 7,6) para tratar la fracción precipitada resultante durante 1 a 2 minutos, eliminando de esta manera los glóbulos rojos. La fracción precipitada resultante (fracción celular) se lavó con MEM tres veces y se utilizó para la posterior fusión celular.
(2) ELISA de unión
Se utilizaron CD27-Fc producido por Lec8 y CD27-Fc producido por DG44, respectivamente, como antígenos en un ELISA de unión. A continuación, se dispensaron 5 pg/ml de cada proteína CD27-Fc hasta proporcionar una concentración de 50 pl/pocillo en una placa de ELISA de 96 pocillos (Greiner) y se dejaron en reposo a 4°C durante la noche para la adsorción.
Tras lavar la placa, se añadieron 100 pl/pocillo de BSA al 1%-PBS a la placa, que seguidamente se dejó en reposo a temperatura ambiente durante 1 hora, de manera que se bloquearon los grupos activos restantes. A continuación, se descartó BSA al 1%-PBS, se dispensaron en la placa 50 pl/pocillo del antisuero del animal inmunizado o sobrenadante de cultivo de hibridoma como anticuerpo primario que a continuación se dejó en reposo durante 2 horas.
La placa se lavó con monolaurato de polioxietilén (20) sorbitán al 0,05% (el equivalente del nombre comercial de ICI, Tween-20, fabricado por Wako Pure Chemicals)]-PBS (en adelante denominado "Tween-PBS") y se añadieron a la placa 50 pl/pocillo de una inmunoglobulina de conejo antirata marcado con peroxidasa (fabricado por Zymed) como anticuerpo secundario, y se dejó en reposo a temperatura ambiente durante 1 hora.
La placa se lavó con Tween-PBS y se reveló el color mediante la adición de una solución de sustrato de 2,2-azinobis(ácido 3-etilbenzotiazol-6-sulfónico) (ABTS) amonio [ABTS 1 mmol/l-tampón de citrato 0,1 moles/l (pH 4,2), H2O2 al 0,1%]. Se midió la absorbancia (DO415 nm) utilizando un lector de placas (Emax; Molecular Devices).
(3) Tinción de células fluorescentes (ABI8200, análisis del sistema de detección celular)
Como células de ensayo se utilizaron CD27/Lec8-4 y CD27/DG44-8 construidas en el ejemplo 2. Las CD27/Lec8-4 y CD27/DG44-8, que se subcultivaron en un medio de subcultivo complementado con MTX 50 nM y 500 ng/ml de G418, se desprendieron utilizando una solución de tripsina al 0,05% (fabricada por Invitrogen) y se sembraron en una placa de 96 pocillos negra ABI8200 a una densidad de 1x104 células/100 pl de medio/pocillo, seguido del cultivo durante la noche.
A continuación, se dispensaron en la placa 10 pl/pocillo del antisuero de rata inmunizada o el sobrenadante de cultivo de hibridoma como anticuerpo primario y se añadieron 100 pl/pocillo de inmunoglobulina G(H+L) antirata marcada con ALEXA647 (fabricada por Invitrogen) como anticuerpo secundario, seguido de reposo en la sombra durante 4 horas. Se midió la fluorescencia bajo excitación a 650 a 685 nm con un láser de He/Ne de 633 nm mediante el sistema de detección celular ABI8200 (fabricado por Applied Biosystems).
(4) Tinción de células fluorescentes (análisis de citometría de flujo)
Como células de ensayo se utilizaron CD27/Lec8-4 y CD27/DG44-8 construidas en el ejemplo 2. Las CD27/Lec8-4 y CD27/DG44-8, que se subcultivaron en un medio HT complementado con MTX 50 nM y con 500 pg/ml de g418, se desprendieron utilizando una solución de EDTA al 0,02% (fabricada por Nacalai Tesque) y se lavaron las células respectivas con PBS.
Tras el lavado, se suspendieron 1 a 5x105 células en 50 pl de BSA al 1%-PBS y se dispensaron 50 pl/pocillo del antisuero de rata inmunizada o el sobrenadante del cultivo de hibridoma como anticuerpo primario, seguido de la reacción a la temperatura del hielo durante 30 minutos.
Además, simultáneamente se dejaron reaccionar las células con albúmina de suero bovino (BSA), control de isotipo de IgG1 de ratón (fabricado por Cosmo Bio) y control de isotipo de IgG2a de rata (fabricado por Cosmo Bio) como control negativo y anticuerpo anti-RCAS1 22-1-1 (fabricado por MBL) y anticuerpo monoclonal de ratón anti-CD27 (fabricado por Beckman Coulter) como control positivo.
Tras completar la reacción, se lavaron las células mediante centrifugación con PBS dos veces y se añadieron 50 pl/pocillo de anticuerpo anti-inmunoglobulina G(H+L) de rata marcado con ALEXA488 (fabricado por Invitrogen) como anticuerpo secundario, seguido de la reacción a la temperatura del hielo bajo la sombra durante 30 minutos. Después de lavar las células nuevamente mediante centrifugación con PBS dos veces, las células se suspendieron en 500 pl de BSA al 1%-PBS y se midió la fluorescencia bajo excitación a 510 a 530 nm con un láser de argón de 488 nm, mediante un citómetro de flujo (fabricado por Beckman Coulter, Cytomics FC500 MPL).
(5) Preparación de células de mieloma de ratón
Se cultivó la estirpe celular de mieloma de ratón resistente a 8 -azaguanina, P3X63Ag8U.1 (P3-U1, obtenida de la ATCC) utilizando un medio normal (medio de FCS al 10%-RPMI) y se guardaron 2x107 o más células en el momento de la fusión celular y se sometieron a la fusión celular igual que la estirpe celular parental.
(6 ) Preparación de hibridoma
Las células de bazo de ratón obtenidas en el ejemplo (1) y las células de mieloma obtenidas en (5), anteriormente, se mezclaron en una proporción de 10;1 y se centrifugaron (250xg, 5 minutos). Tras deshacer a fondo un grupo de células de la fracción precipitada obtenida de esta manera, se añadió a la misma una solución mixta de 1 g de polietilenglicol-1000 (PEG-1000), 1 ml de medio MEM y 0,35 ml de dimetilsulfóxido, en una cantidad de 0,5 ml por cada 108 células de bazo de ratón, a 37°C bajo agitación, se añadió 1 ml del medio MEM a la suspensión varias veces a intervalos de 1 a 2 minutos y después se ajustó el volumen total a 50 ml mediante la adición de medio MEM.
La suspensión se centrifugó (900 rpm, 5 minutos), se deshicieron suavemente las células de la fracción precipitada obtenida de esta manera y después las células se suspendieron suavemente en 10 0 ml de un medio HAT [un medio preparado mediante la adición de suplemento de medio HAT (fabricado por Invitrogen) a suero de feto bovino al 10%-complementado con medio RPMI) mediante aspirado repetido y descarga a partir de una pipeta de medición.
La suspensión se dispensó a razón de 200 pl/pocillo en una placa de cultivo de 96 pocillos y se cultivó en un incubador con 5% de CO2 a 37°C durante 8 a 10 días. Tras el cultivo, se muestreó el sobrenadante de cultivo y se seleccionó un pocillo que era reactivo con CD27/Lec8-4 y no era reactivo con las células CD27/DG44-8 y Lec8 utilizando la tinción de células fluorescentes descrita en (3) y (4), anteriormente. A continuación, a partir de las células contenidas en el pocillo seleccionado de esta manera, se llevó a cabo la clonación dos veces mediante un método de dilución limitante y se obtuvo un clon de células individuales.
Como resultado, se establecieron los hibridomas KM4030 y KM4031, que producen los anticuerpos monoclonales KM4030 y KM4031, respectivamente, de unión específica a CD27 con cadena de azúcar deficiente (figura 12). De la misma manera, se establecieron los hibridomas KM4026, KM4027 y KM4028, que producen los anticuerpos monoclonales KM4026, KM4027 y KM4028, respectivamente, haciendo reaccionar específicamente CD27 con cadena de azúcar deficiente.
Estos hibridomas que producen el anticuerpo monoclonal de unión específica a CD27 con cadena de azúcar deficiente se obtuvieron mediante la construcción de células recombinantes cada una de las cuales expresan CD27 con cadena de azúcar normal y CD27 con cadena de azúcar deficiente utilizando la estirpe celular DG44 sin deficiencia en una actividad de un enzima que participa en el procedimiento de síntesis de la cadena de azúcar, una proteína transportadora y una estirpe celular Lec8 en la que se ha reducido o anulado la actividad del transportador de UDP-galactosa; el diseño de un sistema que permite el cribado de un anticuerpo monoclonal que no se une a células expresantes de CD27 que contienen cadena de azúcar normal o una estirpe celular Lec8 , pero que sólo se unen específicamente a células expresantes de CD27 con cadena de azúcar deficiente y después llevando a cabo un ensayo de cribado a escala de aproximadamente 6 . 0 0 0 pocillos.
(7) Purificación de anticuerpos monoclonales
Las células de hibridoma obtenidas en (6 ), anteriormente, se administraron mediante inyección intraperitoneal en ratones desnudos hembra de 7 semanas de edad (ICR) tratados con pristano a una dosis de 5 a 20x106 células/animal. Se recolectó el líquido ascítico (1 a 8 ml/animal) de ratones en los que el hibridoma desarrolló tumor ascítico en 10 a 21 días y después se filtró a través de un filtro de jeringa (tamaño de poro: 5 pm) para eliminar los sólidos.
Se obtuvo un anticuerpo monoclonal IgG purificado mediante purificación con el método de precipitación con ácido caprílico [Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)]. La determinación de la subclase del anticuerpo monoclonal se llevó a cabo mediante un ELISA de unión utilizando un kit de tipado de subclase (kit de isotipado de anticuerpos monoclonales de rata, fabricado por DS Pharma Biomedical).
Como resultado, se demostraron las determinaciones de subclase de cada anticuerpo: el anticuerpo monoclonal anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente KM4026 es de la clase IgG2a de rata; el anticuerpo monoclonal anti-CD27 de cadena de azúcar deficiente KM4027 es de la clase IgG2b de rata; el anticuerpo monoclonal anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente KM4028 es de la clase IgG1 de rata; el anticuerpo monoclonal anti-CD27 de cadena de azúcar deficiente KM4030 es de la clase IgG2a de rata, y el anticuerpo monoclonal anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente KM4031 es de clase IgG1 de rata, respectivamente.
[Ejemplo 4]
Examen de la reactividad del anticuerpo monoclonal específico anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente
Utilizando el sistema de ELISA competitivo siguiente, se examinó la especificidad de reacción de los anticuerpos monoclonales anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente KM4030 y KM4031. En primer lugar, se dispensaron 5 pg/ml/50 pl/pocillo de CD27-Fc producido por Lec8 obtenidos en el ejemplo 1, en una placa de ELIAS de 96 pocillos (fabricada por Greiner), se siguió y se dejó en reposo a 4°C durante la noche para la adsorción.
Tras lavar la placa, se añadieron 200 pl/pocillo de BSA al 1%-PBS a la placa, que seguidamente se dejó en reposo a temperatura ambiente durante 1 hora, de manera que se bloquearon los grupos activos restantes. A continuación, se descartó el BSA al 1%-PBS, se dispensaron 50 pl/pocillo de anticuerpo monoclonal anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente KM4030 diluido purificado o anticuerpo KM4031 purificado en la placa como anticuerpo primario.
Simultáneamente, se añadió proteína CD27-Fc producida por Lec8 , proteína CD27-Fc producida por DG44 o inmunoglobulina humana como material de unión competitiva a la concentración de 2 0 , 2 , 0 , 2 y 0 , 02 pg/ml, de manera que coexistía el anticuerpo y el material de unión competitiva,
La placa se dejó en reposo a temperatura ambiente durante 2 horas. La placa se lavó con monolaurato de polioxietilén (20) sorbitán al 0,05% [(el equivalente del nombre comercial de ICI, Tween-20, fabricado por Wako Pure Chemicals)]-PBS (en adelante denominado "Tween-PBS") y se añadieron a la placa 50 pl/pocillo de una inmunoglobulina de conejo antirata marcado con peroxidasa (fabricado por Zymed) como anticuerpo secundario, y se dejó en reposo a temperatura ambiente durante 1 hora.
La placa se lavó con Tween-PBS y se reveló el color mediante la adición de una solución de sustrato de 2,2-azinobis(ácido 3-etilbenzotiazol-6-sulfónico) (ABTS) amonio [ABTS 1 mmol/l-tampón de citrato 0,1 moles/l (pH 4,2), H2O2 al 0,1%]. Se midió la absorbancia (DO415 nm) utilizando un lector de placas (Emax; Molecular Devices).
La figura 13 muestra los resultados del ELISA competitivo de los anticuerpos monoclonales anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente, KM4030 y KM4031. Como resultado, se demostró que CD27-Fc producido por DG44 e inmunoglobulina humana no inhibían la unión entre los anticuerpos monoclonales anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente KM4030 y KM4031 y CD27-Fc unido al antígeno Tn, pero inhibían CD27-Fc unido a antígeno Tn.
Además, se obtuvieron los mismos resultados para los anticuerpos monoclonales anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente KM4026, KM4027 y KM4028. A partir de lo anteriormente expuesto, se demostró que los anticuerpos monoclonales anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente KM4026, KM4027, KM4028, KM4030 y KM4031 dados a conocer en la presente memoria reconocen específicamente CD27 con cadena de azúcar deficiente.
Las figuras 28(A) y 28(B) muestran que los resultados de evaluación basados en Biacore de actividad de unión de los anticuerpos quiméricos monoclonales anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente KM4026, KM4027, KM4028, KM4030 y KM4031 a CD27-Fc con cadena de azúcar deficiente. Se sometió a ensayo la actividad de unión mediante el método de resonancia del plasmón superficial (método SPR) utilizando un Biacore T100 (fabricado por GE Healthcare Bio-Sciences).
El anticuerpo anti-IgG4 humano (fabricado por Pharmingen) se inmovilizó sobre un chip sensor CM5 (fabricado por GE Healthcare Bio-Sciences) mediante acoplamiento de aminas utilizando un kit de acoplamiento de aminas (fabricado por Biacore) siguiendo las instrucciones adjuntas al mismo.
Para CD27-Fc producido por DG44 obtenido en el ejemplo 1(7), CD27-Fc de tipo antígeno Tn o CD27-Fc de tipo antígeno sialil-Tn, tratados con un enzima digestivo de cadenas de azúcar utilizando sialidasa A o (3(1-4) galactosidasa de un kit de desglucosilación enzimática Prozyme Glyco (fabricado por Prozyme) y ProO-Link Extender Deglycosylation Plus (fabricado por Prozyme) de acuerdo con los protocolos adjuntos a los mismos, se añadió para la captura sobre un chip con anticuerpo anti-IgG4 humano inmovilizados para conseguir 200 a 250 UR (unidades de resonancia).
Después, se dejaron migrar muestras de ensayo (anticuerpos monoclonales anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente KM4026, KM4027, KM4028, KM4030 y Km 4031) diluido a partir de 20.000 ng/ml en cinco etapas para migrar a un caudal de 30 pl/min sobre el chip, y el sensograma correspondiente a cada concentración se obtuvo y se analizó utilizando un software de análisis Biacore T100 Evaluation (fabricado por Biacore) instalado en el aparato.
Como resultado, se demostró que el anticuerpo monoclonal anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente mostraba la actividad de unión a CD27-Fc de tipo antígeno Tn y CD27-Fc de tipo antígeno sialil-Tn. A partir de lo anteriormente expuesto, se demostró que todos los anticuerpos monoclonales anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente de la presente invención se unen a los antígenos Tn y sialil-Tn.
[Ejemplo 5]
Aislamiento y análisis de ADNc codificante de las regiones variables de anticuerpo monoclonal anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente
(1) Preparación de ARNm a partir de célula de hibridoma productor de anticuerpo monoclonal anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente
A partir de 5x107 a 1x108 células de los hibridomas respectivos KM4026, KM4027, KM4028, KM4030 y KM4031 obtenidos en el ejemplo 3, se preparó ARNm de los anticuerpos monoclonales anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente respectivos utilizando el minikit RNAeasy (fabricado por Qiagen) y el kit de purificación de ARNm Oligotex™ -dT30<Super> (fabricado por Takara) de acuerdo con las instrucciones adjuntas a los mismos.
(2) Clonación génica de regiones variables de cadena H y cadena L de anticuerpo monoclonal anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente
Utilizando un kit de amplificación de ADNc BD SMART RACE (fabricado por BD Biosciences) siguiendo las instrucciones adjuntas al mismo, se obtuvo ADNc obtenido a partir de ARNm del anticuerpo monoclonal obtenido en el ejemplo 5(1).
Se amplificaron los fragmentos de ADNc de regiones variables de cadena pesada (en adelante denominados "VH") llevando a cabo una PCR utilizando el ADNc obtenido de esta manera como molde y utilizando un cebador específico de IgG1 de rata (SEC ID n° 14), cebador específico de IgG2a de rata (s Ec ID n° 15), cebador específico de IgG2 b de rata (SeC ID n° 16) o cebador específico de CHI de rata (SEC iD n° 17).
Además, se amplificaron fragmentos de ADNc de regiones variables de cadena ligera (en adelante denominadas "VL") de los anticuerpos respectivos llevando a cabo una PCR utilizando cebadores específicos de Ig(K) de rata (SEC ID n° 18) y (SEC ID n° 19) en lugar de los cebadores específicos de subclase respectivos del anticuerpo. La PCR para amplificar VL y VH de KM4026, KM4030 y KM4031 se llevó a cabo utilizando un kit de PCR Advantage 2 (fabricado por Clontech) de acuerdo con las instrucciones adjuntas al mismo, mientras que la PCR para amplificar VL y VH de KM4027 y KM4028 se llevó a cabo utilizando una polimerasa KOD Plus (fabricada por Toyobo) de acuerdo con las instrucciones adjuntas al mismo.
A continuación, con el fin de determinar la secuencia de nucleótidos mediante clonación, se separaron los productos de PCR obtenidos, mediante electroforesis en gel de agarosa, y cada uno de los productos de PCR derivados de KM4026, KM4030 y KM4031 se insertó en un vector pCR utilizando un kit de clonación TOPO TA (fabricado por Invitrogen) siguiendo las instrucciones adjuntas al mismo, mientras que se insertaron los productos de PCR derivados de KM4027 y KM4028 en un vector pCR utilizando un kit de clonación de PCR Zero Blunt TOPO para secuenciación (fabricado por Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones adjuntas al mismo.
Se transformaron Escherichia coli con un plásmido que presentaba el fragmento amplificado por PCR insertado en el mismo y se prepararon los plásmidos obtenidos de los clones respectivos, seguido de la secuenciación del ADN. Como resultado, se obtuvo un plásmido que comprendía el ADNc de VH de longitud completa y un plásmido que comprendía ADNc de VL de longitud completa en el que se encontraba presente una secuencia ATG considerada el codón de inicio en el extremo 5'-terminal del ADNc. Se muestra un esquema de la clonación en la figura 14.
(3) Análisis de la secuencia génica de la región variable del anticuerpo monoclonal anti-CD27
Las secuencias de nucleótidos completas de VH de los anticuerpos monoclonales anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente KM4026, KM4027, KM4028, KM4030 y KM4031 contenidas en el plásmido obtenido en el ejemplo 5(2) se representan mediante las SEC ID n° 20 a 24; las secuencias de aminoácidos completas de VH que incluían una secuencia de señal deducida a partir de estas secuencias de nucleótidos se representan mediante las SEC ID n° 25 a 29; las secuencias de nucleótidos completas de VL contenidas en el plásmido se representan mediante las SEC ID n° 30 a 34 y la secuencia de aminoácidos completa de VL que incluye una secuencia de señal deducida a partir de estas secuencias de nucleótidos se representan mediante las SEC ID n° 35 a 39, respectivamente.
Además, basándose en la composición con las secuencias de aminoácidos de los anticuerpos convencionales, se identificaron las CDR de VH y VL de los anticuerpos monoclonales respectivos. Las secuencias de aminoácidos de las CDR1, CDR2 y CDR3 de VH del anticuerpo monoclonal anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente KM4026 se representan mediante las SEC ID n° 40, SEC ID n° 41 y SEC ID n° 42, respectivamente, mientras que las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 de VL se representan mediante SEC ID n° 43, SeC ID n° 44 y SEC ID n° 45, respectivamente.
Las secuencias de aminoácidos de las CDR1, CDR2 y CDR3 de VH del anticuerpo monoclonal anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente KM4027 se representan mediante las SEC ID n° 46, SEC ID n° 47 y SEC ID n° 48, respectivamente, mientras que las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 de VL se representan mediante SEC ID n° 49, SeC ID n° 50 y SEC ID n° 51, respectivamente.
Las secuencias de aminoácidos de las CDR1, CDR2 y CDR3 de VH del anticuerpo monoclonal anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente KM4028 se representan mediante las SEC ID n° 52, SEC ID n° 53 y SEC ID n° 54, respectivamente, mientras que las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 de VL se representan mediante SEC ID n° 55, SeC ID n° 56 y SEC ID n° 57, respectivamente.
Las secuencias de aminoácidos de las CDR1, CDR2 y CDR3 de VH del anticuerpo monoclonal anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente KM4030 se representan mediante las SEC ID n° 58, SEC ID n° 59 y SEC ID n° 60, respectivamente, mientras que las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 de VL se representan mediante SEC ID n° 61, SeC ID n° 62 y SEC ID n° 63, respectivamente.
Las secuencias de aminoácidos de las CDR1, CDR2 y CDR3 de VH del anticuerpo monoclonal anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente KM4031 se representan mediante las SEC ID n° 64, SEC ID n° 65 y SEC ID n° 6 6 , respectivamente, mientras que las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 de VL se representan mediante SEC ID n° 67, SeC ID n° 6 8 y SEC ID n° 69, respectivamente.
[Ejemplo 6]
Preparación de anticuerpo quimérico anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente
(1) Construcción de vector de expresión de anticuerpo quimérico anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente El anticuerpo quimérico preparado de acuerdo con la presente invención es un anticuerpo quimérico en el que se ligó una región constante de cadena H de IgG1 humana y una región constante de cadena L de k humana, dados a conocer en el documento n° US97/10354, con las regiones variables de las cadenas H y L, respectivamente, del anticuerpo monoclonal de rata anti-CD27 obtenido en el ejemplo 5(3).
Con este fin, utilizando un vector pCR que comprendía VL o VH de cada anticuerpo monoclonal obtenido en el ejemplo 5(3), y un vector de expresión de anticuerpos pKANTEX93 que comprendía la región constante de cadena H de la IgG1 humana y la región constante de cadena L de k humana dada a conocer en el documento n° US97/10354, se construyó un vector de expresión de anticuerpo quimérico anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente de acuerdo con el procedimiento siguiente (figuras 15, 16, 17 y 18).
Utilizando 10 ng de un vector pCR que comprendía VL o VH de KM4026, KM4027, KM4028, KM4030 o KM4031 como molde, se preparó un total de 20 pl de una solución que contenía 2 pl de tampón 10x KOD Plus, 2 pl de dNTP 2 mmoles/l, 1 pl de sulfato de magnesio 25 mmoles/l, 1 pl de polimerasa KOD Plus (fabricada por Toyobo), 1 pl de cada polímero 10 pmoles/l específico de VL y VH de cada anticuerpo monoclonal anti-CD27. Utilizando la solución preparada de esta manera, se llevó a cabo la PCR de la manera siguiente: calentamiento a 94°C durante 5 minutos, seguido de 30 ciclos, en donde cada uno consistía en una reacción a 94°C durante 1 minutos y una reacción a 6 8 °C durante 2 minutos.
Los cebadores de VL de KM4026 están representados por las SEC ID n° 70 y 71, y los cebadores de VH de KM4026 están representados por las SEC ID n° 72 y 73; los cebadores de VL de KM4027 están representados por las SEC ID n° 74 y 75, y los cebadores de VH de KM4027 están representados por las SEC ID n° 76 y 77; los cebadores de VL de KM4028 están representados por las SEC ID n° 78 y 79, y los cebadores de VH de KM4028 están representados por las SEC ID n° 80 y 81; los cebadores de VL de KM4030 están representados por las SEC ID n° 82 y 83, y los cebadores de v H de KM4030 están representados por las SEC ID n° 84 y 85; los cebadores de VL de KM4031 están representados por las SEC ID n° 86 y 87, y los cebadores de VH de KM4031 están representados por las SEC ID n° 88 y 89, respectivamente.
Se separó cada producto de PCR mediante electroforesis en gel de agarosa al 1%. Se recolectó una banda específica amplificada por PCR y se insertó en un vector pCR Blunt-TOPO utilizando un kit de clonación por PCR Zero Blunt TOPO para la secuenciación (fabricado por Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones adjuntas al mismo.
Se digirió la VL de cada anticuerpo obtenido, con los enzimas de restricción EcoRI (fabricado por New England Biolabs) y BsWI (fabricado por New England Biolabs), obteniendo de esta manera el fragmento EcoRI-Bs/WI de VL. Además, se digirió la VH de cada anticuerpo con los enzimas de restricción NotI (fabricado por New England Biolabs) y ApaI (fabricado por New England Biolabs), obteniendo de esta manera un fragmento NotI-ApaI.
Cada fragmento EcoRI-BsWI de VL de los anticuerpos monoclonales anti-CD27 KM4026, KM4027, KM4028, KM4030 y KM4031 se ligó en un fragmento de a Dn obtenido mediante digestión de pKANTEX93 con los enzimas de restricción EcoRI y Bs/WI utilizando un kit Ligation High (fabricado por Toyobo) de acuerdo con las instrucciones adjuntas al mismo.
Se transformaron Escherichia coli DH5a (fabricadas por Toyobo) con el fragmento de ADN ligado y se prepararon los plásmidos obtenidos a partir de los clones respectivos y se dejaron reaccionar utilizando un kit BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction (fabricado por PE Biosystems) de acuerdo con las instrucciones adjuntas al mismo y después se analizaron sus secuencias de nucleótidos con un secuenciador de la misma compañía, ABI PRISM3700.
Como resultado, se obtuvo pKANTEX93 en el que se había insertado un ADNc codificante de VL de los anticuerpos monoclonales anti-CD27 KM4026, KM4027, KM4028, KM4030 o KM4031.
A continuación, el fragmento Notl-Apal de VH del anticuerpo monoclonal anti-CD27 KM4026, KM4027, KM4028, KM4030 o KM4031 se ligó en un fragmento de ADN obtenido mediante digestión de pKANTEX93 con una inserción de cada VL del anticuerpo monoclonal anti-CD27 con los enzimas de restricción Notl y Apal utilizando un kit Ligation High (fabricado por Toyobo) de acuerdo con las instrucciones adjuntas al mismo.
Se transformaron Escherichia coli DH5a (fabricadas por Toyobo) con el fragmento de ADN ligado y se prepararon los plásmidos obtenidos a partir de los clones respectivos y se dejaron reaccionar utilizando un kit BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction (fabricado por PE Biosystems) de acuerdo con las instrucciones adjuntas al mismo y después se analizaron sus secuencias de nucleótidos con un secuenciador de la misma compañía, ABI PRISM3700.
Como resultado, se obtuvo un vector de expresión de anticuerpo quimérico anti-CD27 con una inserción de cada ADNc codificante de VL y VH de los anticuerpos monoclonales anti-CD27 KM4026, KM4027, KM4028, KM4030 o KM4031.
(2) Expresión de anticuerpo quimérico anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente en células animales Utilizando el vector de expresión de anticuerpo quimérico anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente obtenido en la sección (1), se llevó a cabo la expresión del anticuerpo quimérico anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente en células animales mediante un método convencional [Antibody Engineering, A Practical Guide, W.H. Freeman and Company (1992)] con el fin de obtener transformantes que producen los anticuerpos quiméricos anti-CD27 con cadena de azúcar (KM4026 quimérico, KM4028 quimérico, KM4030 quimérico y KM4031 quimérico).
Como célula animal para la expresión del anticuerpo deseado, se utilizó una estirpe celular CHO/DG44 en la que se había desactivado doblemente un gen de a1,6-fucosiltransferasa (FUT8 ) (en adelante denominada "célula CHO con desactivación de FUT8 "). Es conocido que no se añade fucosa al núcleo de una cadena de azúcar unida a N compleja del anticuerpo expresada en esta célula hospedadora (documento n° WO2002/31140).
(3) Preparación de anticuerpos quiméricos purificados
Tras cultivar cada uno de los transformantes KM4026 quimérico, KM4028 quimérico, KM4030 quimérico y KM4031 quimérico obtenidos en la sección (2) mediante un método de cultivo general, se recuperaron las suspensiones celulares y se centrifugaron a 3.000 rpm y a 4°C durante 20 minutos para recuperar los sobrenadantes de cultivo y después los sobrenadantes de cultivo se filtraron a esterilidad utilizando un filtro Millex GV de 0,22 pm de tamaño de poro.
Los anticuerpos quiméricos anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente KM4026 quimérico, KM4028 quimérico, KM4030 quimérico y KM4031 quimérico se purificaron a partir de los sobrenadantes de cultivo obtenidos de esta manera, de la misma manera que en el ejemplo 1(7), utilizando Mab Select.
(4) Determinación del contenido de fucosa del anticuerpo quimérico con cadena de azúcar deficiente
De acuerdo con el método descrito en el documento n° WO2002/31140, una proporción de cadenas de azúcar en las que la posición 1 es fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace a en la cadena de azúcar unida a N compleja de la región Fc de cada anticuerpo quimérico anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente. Se resumen los resultados en la tabla 2, a continuación.
[Tabla 2]
Figure imgf000060_0001
Figure imgf000061_0002
Tal como se muestra en la tabla 2, se ha demostrado que la fucosa no se añade al anticuerpo quimérico construido en el ejemplo 6(3).
[Ejemplo 7]
Evaluación de la actividad del anticuerpo quimérico anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente
En las secciones (1) a (3) a continuación, se evaluó la actividad de los anticuerpos quiméricos anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente obtenidos en el ejemplo 6 , para KM4026 quimérico, KM4028 quimérico, KM4030 quimérico y KM4031 quimérico.
(1) Evaluación basada en Biacore de la actividad de unión del anticuerpo quimérico anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente a CD27-Fc con cadena de azúcar deficiente humano.
Con el fin de analizar cinéticamente la actividad de unión de los anticuerpos quiméricos con cadena de azúcar deficiente CD27, KM4026 quimérico, KM4028 quimérico y KM4030 quimérico a CD27-Fc con cadena de azúcar deficiente humano, se midió la actividad de unión mediante el método de la resonancia del plasmón superficial (método SPR). Todas las manipulaciones siguientes se llevaron a cabo utilizando un Biacore T100 (fabricado por GE Healthcare Bio-Sciences).
El CD27-Fc derivado de Lec8 obtenido en el ejemplo 1(7) se inmovilizó sobre un chip sensor CM5 (fabricado por GE Healthcare Bio-Sciences) mediante acoplamiento de aminas. Las muestras de ensayo (KM4026 quimérico, KM4028 quimérico, KM4030 quimérico y KM4031 quimérico) se diluyeron en serie 3 veces a partir de 9 pg/ml, proporcionando 5 concentraciones diferentes, se añadieron secuencial y continuamente al chip con CD27-Fc inmovilizado en orden creciente de concentración, de acuerdo con un programa automatizado (Single Kinetix), seguido de las mediciones.
Utilizando el software de análisis, software Biacore T100 Evaluation (fabricado por Biacore) instalado en el aparato, se llevó a cabo el análisis utilizando el modelo de analito bivalente para calcular de esta manera la constante de tasa de asociación ka y la constante de tasa de disociación kd de cada anticuerpo para CD27-Fc con cadena de azúcar deficiente humano.
La constante de tasa de asociación ka1, la constante de tasa de disociación kd1 y la constante de disociación KD (kd1/kal) de cada anticuerpo obtenido de esta manera se proporcionan en la tabla 3, a continuación.
[Tabla 3]
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Tal como se muestra en la tabla 3, la totalidad de KM4026 quimérico, KM4028 quimérico, KM4030 quimérico y KM4031 quimérico mostró una elevada afinidad en el intervalo de 1 *10 ' 8 a 1*Í0 ' 9 moles/l para CD27-Fc con cadena de azúcar deficiente humano.
(2) Evaluación de la especificidad de reacción del anticuerpo quimérico anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente mediante tinción de células fluorescentes (análisis de citometría de flujo)
Las células CD27/DG44-4, CD27/Lec8-4 y Lec8 construidas de la misma manera que en el ejemplo 2 se utilizaron a modo de células de ensayo. CD27/DG44-4 subcultivado en un medio de hT suplementado con 500 pg/ml de G418 y CD27/Lec8-4 subcultivado en un medio de HT complementado con 50 nmoles/l de MTX y 500 pg/ml de G418 se desprendieron utilizando una solución de EDTA al 0,02% y después se lavaron con PBS. Tras el lavado, se suspendieron 5x105 células en 50 pl de BSA al 1%-PBS, cada solución de anticuerpo de los anticuerpos quiméricos anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente (KM4026 quimérico, KM4028 quimérico, KM4030 quimérico y KM4031 quimérico se prepararon para proporcionar las concentraciones 0,02, 0,2, 2 y 10 pg/ml y después se dispensaron 50 pl/pocillo de cada solución de anticuerpo en la placa como anticuerpo primario, seguido de la reacción a la temperatura del hielo durante 1 hora.
Como control positivo, se utilizó el anticuerpo de ratón anti-RCASI 22-1-1 (fabricado por MBL) y el anticuerpo de ratón anti-CD27 O323 (fabricado por Santa Cruz Biotechnology), los cuales son anticuerpos anti-Tn.
Tras completarse la reacción, se llevó a cabo la centrifugación dos veces con PBS y anticuerpo antiinmunoglobulina G(H+L) humana marcado con ALEXA Fluoro 488, anticuerpo anti-inmunoglobulina G(H+L) de ratón marcado con ALEXA Fluoro 488 o anticuerpo anti-inmunoglobulina M(|j) humana marcado con ALEXA Fluoro 488 a modo de anticuerpo secundario, a una concentración de 50 jl/pocillo, seguido de la reacción a la temperatura del hielo en la sombra durante 30 minutos.
Nuevamente, se repitió la centrifugación dos veces utilizando PBS y las células se lavaron y se suspendieron en 500 j l de BSA al 1%-PBS. Se midió la fluorescencia bajo excitación a 510 a 530 nm con un láser de argón de 488 nm, medida con un citómetro de flujo (fabricado por Beckman Coulter, Cytomics FC500 MPL). Se muestran los resultados en las figuras 19(A) a (C).
Como resultado, la totalidad de los anticuerpos quiméricos anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente no se unían a las células Lec8 ni a las células CD27/DG44-4, sino que mostraron unión únicamente a las células CD27/Lec8-4 que expresaban CD27 con cadena de azúcar deficiente.
A partir de estos resultados se ha demostrado que los anticuerpos quiméricos anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente, KM4026 quimérico, KM4028 quimérico, KM4030 quimérico y KM4031 quimérico de la presente exposición reconocen específicamente CD27 con cadena de azúcar deficiente que se expresa sobre la superficie celular.
(3) Evaluación de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (actividad ADCC) de anticuerpos quiméricos anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente
Se midió la actividad de ADCC de los anticuerpos quiméricos anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente, KM4026 quimérico, KM4028 quimérico, KM4030 quimérico y KM4031 quimérico en las células CD27/Lec8-4 construidas en el ejemplo 2 , de la manera siguiente.
(3)-1 Preparación de suspensión de células diana
Las células CD27/Lec8-4 subcultivadas en un medio HT complementado con 50 nmoles/l de MTX y 500 jg/ml de G418 se desprendieron utilizando una solución de EDTA al 0,02%, se lavaron con PBS, se lavaron con medio RPMI1640 libre de rojo fenol (fabricado por Invitrogen, en adelante denominado "medio ADCC") que contenía suero de feto bovino dializado al 5% (dFBS, fabricado por Invitrogen) y después se suspendieron en el mismo medio, proporcionando una concentración óptima y se utilizaron como la suspensión de células diana.
(3)-2 Preparación de suspensión de células efectoras
A partir de sangre periférica humana sana, se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de la manera siguiente. A partir de voluntarios sanos, se recolectaron 50 ml de sangre periférica humana sana con una jeringa a la que se habían añadido 0,5 ml de heparina sódica (fabricada por Shimizu Pharmaceutical).
Sobre un medio de resolución Mono-poly (fabricado por DS Pharma Biomedical), se aplicaron suavemente en capas 3,5 ml de la sangre periférica recogida, 3 ml de los cuales se dispensaron en cada tubo de 15 ml. A continuación, se separó la capa mononuclear mediante centrifugación a 400xg, sin freno, y a temperatura ambiente durante 20 minutos. La fracción mononuclear obtenida de esta manera se lavó dos veces con un medio ADCC y después se suspendió en el mismo medio, proporcionando un recuento celular óptimo y se utilizó como suspensión de células efectoras.
(3)-3 Medición de la actividad ADCC
Se midió la actividad ADCC de la manera siguiente, utilizando un ensayo citotóxico de LDH Wako (fabricado por Wako) de acuerdo con las instrucciones adjuntas al mismo.
En primer lugar, se dispensaron 50 jl/pocillo de una solución de anticuerpo en la que cada anticuerpo se había diluido 10 veces a partir de 30 jg/ml para proporcionar una concentración de 0,003 jg/ml, en una placa de fondo en U de 96 pocillos (fabricada por Falcon). A continuación, se dispensaron en la misma 1x104 células/50 jl/pocillo de la suspensión de células diana preparada en la sección (3)-1. Finalmente, se dispensaron en la misma 2,5x105 células/50 jl/pocillo de la suspensión de células efectoras preparada en la sección (3)-2, proporcionando un volumen total de 150 jl, seguido de la reacción a 37°C durante 4 horas. Por lo tanto, se llevó a cabo el experimento en una proporción 25:1 de células efectoras (E):células diana (T). Se calculó la actividad ADCC mediante la fórmula a continuación. Se muestran los resultados en la figura 20.
(Fórmula)
actividad ADCC(%)={([absorbancia de muestraHabsorbancia de liberación espontánea célula diana]-[absorbancia liberación espontánea céls. efectoras])/([absorbancia de liberación total de céls.dlana]-[absorbancia liberación espontánea de céls. diana])} x 100
Como resultado, la totalidad de los anticuerpos quiméricos anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente, KM4026 quimérico, KM4028 quimérico, KM4030 quimérico y KM4031 quimérico, en los que no se une fucosa nuclear a la cadena de azúcar unida a N compleja de la región Fc del anticuerpo, mostró una elevada actividad ADCC sobre las células CD27/Lec8-4.
A partir de estos resultados se demostró que la totalidad de los anticuerpos quiméricos anti-CD27 con cadena de azúcar, KM4026 quimérico, KM4028 quimérico, KM4030 quimérico y KM4031 quimérico de la presente exposición presentaba una elevada actividad de ADCC sobre las células que expresaba CD27 con cadena de azúcar deficiente.
(4) Evaluación de citotoxicidad dependiente del complemento (actividad CDC) del anticuerpo quimérico anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente.
Se midió la actividad de CDC de los anticuerpos quiméricos anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente, KM4026 quimérico, KM4028 quimérico, KM4030 quimérico y KM4031 quimérico en las células CD27/Lec8-4 construidas en el ejemplo 2 , de la manera siguiente.
Las células CD27/Lec8-4 se lavaron con PBS, se lavaron con un medio RPMI1640 complementado con dFBS al 1 0 % y después se suspendieron en el mismo medio, proporcionando una concentración óptima y se utilizaron como suspensión de células diana. La suspensión de células diana se dispensó en una placa de fondo plano de 96 pocillos (fabricada por Greiner), proporcionando una densidad de 5x104 células/50 pl/pocillo.
Además, la solución de anticuerpo quimérico anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente preparada para presentar una concentración apropiada y el complemento humano (fabricado por Sigma) se añadieron a la misma para proporcionar un volumen total de 150 pl/pocillo. Además, se preparó un pocillo de reacción sin anticuerpo (pocillo de 0 % citotoxicidad) a modo de control negativo y un pocillo de reacción sin células (pocillo de 100% de citotoxicidad) a modo de control positivo, respectivamente. La reacción se llevó a cabo en un incubador con 5% de CO2 a 37°C durante 2 horas.
Tras completarse la reacción, se añadieron 15 pl de un reactivo WST-1 (fabricado por Roche) a los pocillos de reacción respectivos, seguido de la reacción a 37°C durante aproximadamente 4 horas. Se midió la absorbancia (DO450 nm-DO690 nm) de cada pocillo utilizando un lector de placas (Emax). A partir de la absorbancia de cada pocillo se calculó la actividad de CDC (citotoxicidad [%}) mediante la fórmula a continuación. Se muestran los resultados en la figura 2 1.
(Fórmula)
actividad CDC (citotoxicidad [%])={1-(absorbancia de pocilio de reacción-absorbancia de pocillo lisis)/(absorbancia de pocillo 0% lisis-absorbancia de pocilio 100% Iisis)}x100
Como resultado, la totalidad de los anticuerpos quiméricos anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente, KM4026 quimérico, KM4028 quimérico, KM4030 quimérico y KM4031 quimérico, obtenidos de acuerdo con la presente exposición mostró una actividad de CDC.
[Ejemplo 8]
Construcción de células CHO que expresan CD27 de Cynomolgus sobre la membrana celular
(1) Clonación del gen de CD27 de Cynomolgus
A partir del ARN derivado de sangre periférica de Cynomolgus, se aisló el gen codificante de CD27 siguiendo el procedimiento siguiente. Se preparó un total de 5 pl de solución que contenía 3,3 pg de ARN aislado a partir de sangre periférica de Cynomolgus utilizando Trizol (fabricado por Invitrogen) como molde y 1 pl de oligo-dT y 1 pl de mezcla de dNTP adjuntos a un kit de primera cadena SuperScript III (fabricado por Invitrogen).
La solución preparada de esta manera se dejó reaccionar a 65°C durante 5 minutos y se desactivó sobre hielo durante 1 minuto. A continuación, se añadieron a la misma 2 pl de tampón 10x RT, 2 pl de DTT, 1 pl de ARNasa OUT y 1 pl de RT adjuntos en el kit de primera cadena SuperScript III, seguido de la reacción inversa a 50°C durante 50 minutos.
Tras completar la reacción, se calentó la solución de reacción a 85°C durante e5 minutos para desactivar la transcriptasa inversa y se añadió 1 j l de ARNasa H adjunta en el kit de primera cadena SuperScript III, seguido de la reacción a 37°C durante 20 minutos para degradar por completo el ARN. Este ADNc monocatenario derivado de sangre periférica de Cynomolgus se almacenó a -20°C hasta la utilización.
Se preparó un total de 25 j l de una solución que contenía 1,25 j l del ADNc monocatenario derivado de sangre periférica de Cynomolgus anteriormente preparado, a modo de molde, 2,5 j l de tampón 10x KOD Plus, 2,5 j l de dNTP 2 mmoles/l, 1 j l de sulfato de magnesio 25 mmoles/l, 0,5 j l de polimerasas KOD Plus (fabricada por Toyobo), 20 pmoles de mfCD27_5UTR (SEC ID n° 90) diseñado a partir de la secuencia de región 5' no traducida de CD27 del mono Rhesus y 20 pmoles de mfCD27_3UTR (SEC ID n° 91) diseñada a partir de la secuencia de la región 3' no traducida de CD27 del mono Rhesus.
La solución preparada de esta manera se calentó a 94°C durante 5 minutos y se llevó a cabo la PCR bajo las condiciones de reacción siguientes: 30 ciclos, consistiendo cada uno de la reacción a 94°C durante 30 segundos y la reacción a 68°C durante 2 minutos. Se separó la solución de reacción mediante electroforesis en gel de agarosa al 1% y se insertó el producto de PCR de aproximadamente 800 pb en un vector pCR Blunt-TOPO utilizando un kit de clonación de PCR Zero Blunt TOPO para la secuenciación (fabricado por Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones adjuntas en el mismo.
Se transformaron Escherichia coli DH5a (fabricadas por Toyobo) con el vector en el que se había insertado el fragmento amplificado por PCR, y se prepararon los plásmidos obtenidos de los clones respectivos y se dejaron reaccionar utilizando un kit BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction (fabricado por PE Biosystems) de acuerdo con las instrucciones adjuntas en el mismo, y después se analizaron sus secuencias de nucleótidos con un secuenciador de la misma compañía, ABI PRISM3700. Como resultado, se obtuvo un plásmido pCR mfCD27 en el que se clonó el ADNc codificante de CD27 de Cynomolgus (SEC ID n° 92) (figura 22).
(2) Construcción de plásmido expresante de CD27 de simio, pKANTEX mfCD27His.
Se construyó el vector expresante de CD27 de Cynomolgus, pKANTEX mfCD27His que presenta una etiqueta de His unida al extremo C-terminal, siguiendo el procedimiento siguiente.
Se preparó un total de 50 j l de una solución que contenía 10 ng de pCR mfCD27 como molde, 5 j l de tampón 10 x KOD Plus, 5 j l de dNTP 2 mmoles/l, 2 j l de sulfato de magnesio 25 mmoles/l, 1 j l de polimerasa KOD Plus (fabricada por Toyobo), 0,2 j l de mfCD27toKAN_5 100 jmoles/l (SEC ID n° 93) y 0,2 j l de mfCD27HisKAN_3 100 jmoles/l (SEC ID n° 94).
La solución preparada de esta manera se calentó a 94°C durante 5 minutos y se llevó a cabo la PCR bajo las condiciones de reacción siguientes: calentamiento a 94°C durante 5 minutos, seguido de 30 ciclos, consistiendo cada uno en la reacción a 94°C durante 30 segundos y la reacción a 68°C durante 2 minutos. Se separó la solución de reacción mediante electroforesis en gel de agarosa al 1% y se insertó el producto de PCR de aproximadamente 800 pb en un vector pCR Blunt-TOPO utilizando un kit de clonación de PCR Zero Blunt TOPO para la secuenciación (fabricado por Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones adjuntas en el mismo.
Se transformaron Escherichia coli DH5a (fabricadas por Toyobo) con el vector en el que se había insertado el fragmento amplificado por PCR, y se prepararon los plásmidos obtenidos de los clones respectivos y se dejaron reaccionar utilizando un kit BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction (fabricado por PE Biosystems) de acuerdo con las instrucciones adjuntas en el mismo, y después se analizaron sus secuencias de nucleótidos con un secuenciador de la misma compañía, ABI PRISM3700.
Como resultado se obtuvo el plásmido pCR mfCD27His en el que se clonó un ADNc (SEC ID n° 95) codificante de CD27 de Cynomolgus con una etiqueta de His unida al extremo C-terminal del mismo (figura 23).
El fragmento de ADN de aproximadamente 800 pb obtenido mediante digestión de pCR mfCD27His con los enzimas de restricción NotI y SalI (fabricados por Takara Bio) se ligó en el fragmento de ADN de aproximadamente 10 kpb obtenido mediante digestión de pKANTEX CD27 construido en el ejemplo 2 con los enzimas de restricción NotI y SalI (fabricados por Takara Bio) utilizando un kit Ligation High (fabricado por Toyobo) de acuerdo con las instrucciones adjuntas al mismo.
Se transformaron Escherichia coli DH5a (fabricadas por Toyobo) con el fragmento de ADN ligado y se prepararon los plásmidos obtenidos a partir de los clones respectivos y se dejaron reaccionar utilizando un kit BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction (fabricado por PE Biosystems) de acuerdo con las instrucciones adjuntas al mismo y después se analizaron sus secuencias de nucleótidos con un secuenciador de la misma compañía, ABI PRISM3700.
Como resultado, se obtuvo el plásmido pKANTEX mfCD27His para la expresión de CD27 de Cynomolgus que presenta una etiqueta de His unida al extremo C-terminal del mismo (figura 24).
Se sembraron Escherichia coli DH5a trasformadas con pKANTEX mfCD27His en 200 ml de medio LB, seguido del cultivo durante la noche. Tras completar el cultivo, se recuperaron las bacterias y se purificó el plásmido utilizando un kit QIAfilter Plasmid Midi (fabricado por Qiagen) siguiendo las instrucciones adjuntas al mismo. A continuación, se linearon 50 |jg del plásmido purificado mediante digestión con el enzima de restricción AatlI (fabricado por New England Biolabs).
(3) Introducción de plásmido expresante de CD27 de simio, pKANTEX mfCD27His.
Las células Lec8 y DG44 expresantes de CD27 se establecieron mediante la introducción génica del plásmido expresante de CD27 de Cynomolgus, pKANTEX mfCD27His, construido en la sección (2), en células Lec8 y CHO/DG44.
La introducción génica se llevó a cabo de la misma manera que en el ejemplo 1(6), excepto en que se utilizó pKANTEX mfCD27His como el plásmido para la introducción. Las células tras la introducción génica se suspendieron en 30 ml de un medio HT y se sembraron 100 jl/pocillo de la suspensión celular en placas de 96 pocillos por triplicado.
Un día después de la siembra, se intercambió el medio de cultivo por un medio de subcultivo que contenía 500 jg/ml de G418, seguido del cultivo durante 10 días. A continuación, se obtuvo un clon resistente a G418. La estirpe celular expresante de C27 de Cynomolgus derivada de Lec8 se denominó célula CD27/Lec8 de Cynomolgus, mientras que la estirpe celular expresante de CD27 de Cynomolgus derivada de DG44 se denominó célula CD27/DG44 de Cynomolgus.
[Ejemplo 9]
Evaluación de la reactividad cruzada del anticuerpo quimérico anti-CD27 con cadena de azúcar y la proteína CD27 de simio
Se utilizaron como células de ensayo las células CD27/DG44-4 de Cynomolgus y las células CD27/Lec8 de Cynomolgus construidas en el ejemplo 8.
(1) Evaluación de la reactividad del anticuerpo quimérico anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente con células expresantes de CD27 de simio mediante tinción de células fluorescentes (análisis de citometría de flujo).
Se midió la actividad de unión de cada uno de los anticuerpos quiméricos anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente, KM4026 quimérico, KM4028 quimérico, KM4030 quimérico y KM4031 quimérico con las células expresantes de CD27 de Cynomolgus siguiendo el procedimiento siguiente.
Las células CD27/DG44 de Cynomolgus y CD27/Lec8 de Cynomolgus, que se subcultivaron en un medio de HT complementado con 500 jg/ml de G418, se desprendieron utilizando una solución de EDTA al 0,02% y se lavaron las células respectivas con PBS.
Tras el lavado, se suspendieron 5x105 células en 50 j l de BSA al 1%-PBS y se dispensaron 50 jl/pocillo de cada solución de anticuerpo preparados para contener 10 jg/ml de anticuerpos quiméricos anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente (KM4026 quimérico, KM4028 quimérico, KM4030 quimérico y KM4031 quimérico) como anticuerpo primario, seguido de la reacción a la temperatura del hielo durante 1 hora.
Como control positivo, se utilizó el anticuerpo de ratón anti-CD270323. Tras completar la reacción, las células se lavaron mediante centrifugación con p Bs dos veces y se añadieron 50 jl/pocillo de anticuerpo antiinmunoglobulina G(H+L) humano marcado con ALEXA Fluoro 488 o anticuerpo anti-inmunoglobulina G(H+L) de ratón marcado con ALEXA 488 (todos fabricados por BioLegend) como anticuerpo secundario, seguido de la reacción a la temperatura del hielo en la oscuridad durante 30 minutos.
Después de lavar las células nuevamente mediante centrifugación con PBS dos veces, las células se suspendieron en 500 j l de BSA al 1%-PBS y se midió la fluorescencia bajo excitación a 510 a 530 nm con un láser de argón de 488 nm, mediante un citómetro de flujo (fabricado por Beckman Coulter, Cytomics FC500 MPL). Se muestran los resultados obtenidos en la figura 25.
Como resultado, se demuestra que los anticuerpos quiméricos anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente y KM4030 quimérico y KM4031 quimérico reaccionan con las células CD27/Lec8 de Cynomolgus que expresa CD27 con cadena de azúcar deficiente.
Por otra parte, la reactividad de los anticuerpos quiméricos anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente KM4026 quimérico y KM4028 quimérico con las células CD27/Lec8 de Cynomolgus resultaba insignificante. Además, se confirmó que la totalidad de los anticuerpos quiméricos anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente no se unía a las células CD27/DG44 de Cynomolgus.
(2) Evaluación de la actividad ADCC de anticuerpo quimérico anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente sobre células expresantes de CD27 de simio
Las células CD27/Lec8 de Cynomolgus, que se subcultivaron en un medio HT complementado con 500 pg/ml de G418, se desprendieron utilizando una solución de EDTA al 0,02%, se lavaron con PBS, se lavaron con medio de ADCC y después se suspendieron en el mismo medio, proporcionando una concentración óptima y se utilizaron como la suspensión de células diana. Además, la preparación de una suspensión de células efectoras y la medición de la actividad de ADCC se llevó a cabo de la misma manera que en el ejemplo 7. Se muestran los resultados en la figura 26.
Como resultado, la totalidad de los anticuerpos quiméricos anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente KM4026 quimérico, KM4028 quimérico, KM4030 quimérico y KM4031 quimérico mostraba actividad de ADCC sobre las células CD27/Lec8 de Cynomolgus que contenían una cadena de azúcar unida a O a la que no se encuentra unida galactosa (célula CD27 de Cynomolgus con cadena de azúcar deficiente).
A partir de lo anteriormente expuesto, se demostró que la totalidad de los anticuerpos quiméricos anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente KM4026 quimérico, KM4028 quimérico, KM4030 quimérico y KM4031 quimérico según la presente exposición mostraba reactividad cruzada con las células CD27 de Cynomolgus con cadena de azúcar deficiente. Se sugirió que cada uno de los anticuerpos quiméricos anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente mostraba un nivel de reactividad con CD27 de Cynomolgus con cadena de azúcar deficiente y diferencias en el tipo de epítopos que serán reconocidos.
Además, la actividad de ADCC del anticuerpo quimérico anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente KM4030 quimérico se midió utilizando las células en las que se confirmó que el nivel de expresión de CD27 sobre la superficie celular era prácticamente igual mediante análisis de citometría de flujo, entre las células CD27/Lec8 humanas construidas en el ejemplo 2 y las células CD27/Lec8 de Cynomolgus construidas en el ejemplo 8. Se preparó la suspensión de células efectoras a partir de la misma sangre periférica humana sana. Se muestran los resultados en la figura 27.
Como resultado, se sugería que el anticuerpo quimérico anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente KM4030 quimérico mostraba una actividad de ADCC igual sobre las células CD27/Lec8 de Cynomolgus y las células CD27/Lec8 humanas.
Ejemplo 10
Preparación de anticuerpo humanizado
(1) Diseño de secuencias de aminoácidos de VH y VL del anticuerpo humanizado anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente
Se diseñó una secuencia de aminoácidos de VH de un anticuerpo humanizado anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente de la manera siguiente.
En primer lugar, se seleccionó la secuencia de aminoácidos de FR de la VH de un anticuerpo humano para la injertación de las secuencias de aminoácidos de CDR1 a CDR3 del anticuerpo monoclonal de rata anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente KM4030VH representado por las SEC ID n° 58, 59 y 60, respectivamente.
Utilizando un paquete GCG (fabricado por el Genetics Computer Group) como sistema de análisis de secuencias, basándose en la base de datos de secuencias de aminoácidos de proteínas convencionales mediante el método BLASTP [Nucleic Acids Res., 25, 3389 (1997)], se buscó un anticuerpo humano con una homología elevada con el anticuerpo monoclonal de rata anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente KM4030. Al comparar la puntuación de homología con la homología de una secuencia de aminoácidos real, n° de acceso BAH04525 de la base de datos SWISSPROT, el repertorio de anticuerpos monoclonales neutralizadores contra los virus influenza H3N2 en el ser humano (en adelante denominado "BAH04525") mostraba una homología de 83,9% y era un anticuerpo humano que presentaba la homología más alta, por lo tanto se seleccionó la secuencia de aminoácidos de FR de este anticuerpo.
Una secuencia de aminoácidos de CDR de VH del anticuerpo monoclonal de rata anti-CD27 de cadena de azúcar KM4030 representado por la SEC ID n° 58 a 60 se injertó en una posición apropiada de la secuencia de aminoácidos determinada de esta manera de FR del anticuerpo humano. De esta manera, se diseñó una secuencia de aminoácidos HV0 de la VH del anticuerpo humanizado anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente representada por la SEC ID n° 96.
A continuación, se diseñó una secuencia de aminoácidos de VL del anticuerpo humanizado anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente de la manera siguiente.
Se seleccionó una secuencia de aminoácidos de FR de la VL de un anticuerpo humano para la injertación de las secuencias de aminoácidos de CDR1 a CDR3 del anticuerpo monoclonal de rata anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente KM4030VL representado por las SEC ID n° 61 a 63, respectivamente.
Kabat et al. han clasificado las VL de los diversos anticuerpos humanos conocidos convencionalmente en cuatro subgrupos (HSG I a IV) basándose en la homología de sus secuencias de aminoácidos y han informado de las secuencias de consenso para cada uno de los subgrupos [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1991]. De acuerdo con lo anterior, se examinó la homología entre las secuencias de aminoácidos de FR de las secuencias de consenso de los subgrupos I a IV de la VL del anticuerpo humano y las secuencias de aminoácidos de FR de la VL del anticuerpo de rata anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente KM4030.
Como resultado del análisis de homologías, la homología de HSGI, HSGII, HSGIII y HSGIV era de 86,3%, 60,0%, 73,8% y 73,8%, respectivamente. Por lo tanto, la secuencia de aminoácidos de la FR de KM4030VL presentaba la homología más alta con el subgrupo I.
Basándose en estos resultados, la secuencia de aminoácidos de la CDR de VL del anticuerpo monoclonal de rata anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente KM4030 se injertó en una posición apropiada de una secuencia de aminoácidos de FR de las secuencias de consenso del subgrupo I de VL del anticuerpo humano.
Sin embargo, debido a que Leu en la posición 124 en la secuencia de aminoácidos de VL del anticuerpo monoclonal de rata anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente KM4030 representado por la SEC ID n° 38 no es el residuo aminoácido con la frecuencia de uso más alta en la región que corresponde a la secuencia de aminoácidos de FR de anticuerpo humano citado en Kabat, aunque es un residuo aminoácido que se utiliza con una frecuencia relativamente elevada, se utilizaron los residuos aminoácidos anteriormente mencionados que son reconocidos en la secuencia de aminoácidos del anticuerpo monoclonal de rata anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente KM4030.
De esta manera, se diseñó una secuencia de aminoácidos LV0 de VL de un anticuerpo humanizado anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente representada por la SEC ID n° 97.
La secuencia de aminoácidos HV0 de VH y la secuencia de aminoácidos LV0 de VL del anticuerpo humanizado anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente diseñado anteriormente son secuencias en las que la secuencia de aminoácidos de la CDR del anticuerpo monoclonal de rata anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente KM4030 únicamente se injertó en la secuencia de aminoácidos de la FR del anticuerpo humano seleccionado.
Sin embargo, en general, al preparar un anticuerpo humanizado, su actividad de unión se reduce frecuentemente en el caso de meramente una simple injertación de secuencia de aminoácidos de CDR de un anticuerpo de rata en una FR de anticuerpo humano. Por estos motivos, con el fin de evitar la reducción de la actividad de unión, se llevan a cabo modificaciones de los residuos aminoácidos que se considera que presentan una influencia sobre la actividad de unión, entre los residuos aminoácidos de la FR que son diferentes en anticuerpos humanos y anticuerpos de rata, junto con la injertación de la secuencia de aminoácidos de la CDR.
De esta manera, los residuos aminoácidos de la FR que se considera que presentan una influencia sobre la actividad de unión se identificaron en el presente ejemplo de la manera siguiente.
En primer lugar, se construyó una estructura tridimensional de una región V de anticuerpo (HV0LV0) que comprendía la secuencia de aminoácidos HV0 de VH y la secuencia de aminoácidos LV0 de VL del anticuerpo humanizado anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente diseñado anteriormente, utilizando una técnica de modelado por ordenador. Además, se llevó a cabo la preparación de las coordenadas de la estructura tridimensional y la visualización de la misma utilizando el software Discovery Studio (fabricado por Accelrys) siguiendo las instrucciones adjuntas al mismo.
Además, también se construyó de la misma manera un modelo de ordenador de la estructura tridimensional de la región V del anticuerpo monoclonal de rata anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente KM4030. Además, construyendo de manera similar un modelo de estructura tridimensional que comprendía una secuencia de aminoácidos en la que los residuos aminoácidos en las secuencias de aminoácidos de FR de VH y VL de HV0LV0, que son diferentes de los del anticuerpo de rata anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente KM4030 se seleccionaron y se modificaron por los residuos aminoácidos del anticuerpo monoclonal de rata anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente KM4030.
Las estructuras tridimensionales de las regiones V del anticuerpo monoclonal de rata anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente KM4030, HV0LV0 y el producto modificado se compararon, de manera que se identificaron los residuos aminoácidos que se predecía que presentaban una influencia sobre la actividad de unión del anticuerpo. Como resultado, como residuos aminoácidos de entre los residuos aminoácidos de la FR de HV0LV0 que se considera que modifican la estructura tridimensional de la región de unión a antígeno y, por lo tanto, que presentan una influencia sobre la actividad de unión del anticuerpo, se seleccionaron, respectivamente, Ser en la posición 30, Val en la posición 48, Ser en la posición 49, Asn en la posición 77, Val en la posición 93, Ala en la posición 97 y Thr en la posición 117 en la secuencia HV0, e Ile en la posición 21, Pro en la posición 40, Val en la posición 58, Thr en la posición 85 y Tyr en la posición 87 en la secuencia LV0.
Mediante la modificación de por lo menos una de las secuencias de aminoácidos de estos residuos aminoácidos seleccionados por residuos aminoácidos que se encuentran presentes en las mismas posiciones de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo monoclonal de rata anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente KM4030, se diseñó VH y VL de un anticuerpo humanizado que presentaba diversas modificaciones.
Específicamente, respecto a VH del anticuerpo, se introdujo por lo menos una modificación de entre las modificaciones de aminoácidos de sustitución de Ser en la posición 30 por Asn, Val en la posición 48 por Ile, Ser en la posición 49 por Ala, Asn en la posición 77 por Gly, Val en la posición 93 por Thr, Ala en la posición 97 por Thr y Thr en la posición 117 por Val en la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID n° 96.
Además, respecto a VL del anticuerpo, se introdujo por lo menos una modificación de entre las modificaciones de aminoácidos de sustitución de Ile en la posición 21 por Leu, Pro en la posición 40 por Leu, Val en la posición 58 por Ile, Thr en la posición 85 por Ala, y Tyr en la posición 87 por Phe en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 97.
Mediante el diseño de las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de HV2LV0, HV3LV0, HV5LV0 y HV7LV0 con modificaciones de por lo menos un residuo aminoácido presente en la FR de HV0LV0, las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de cadena H HV2, HV3, HV5 y HV7 están representadas por las SEC ID n° 101, 103, 105 y 107, respectivamente.
(2) Preparación y evaluación del anticuerpo humanizado anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente
El ADN codificante de la secuencia de aminoácidos de la región variable del anticuerpo humanizado anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente se construyó en células de mamífero utilizando un codón que se utiliza una frecuencia elevada, al llevar a cabo una o más modificaciones de aminoácidos utilizando un codón que se utiliza como ADN codificante de la secuencia de aminoácidos de VH o VL del anticuerpo monoclonal de rata anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente KM4030.
Las secuencias de ADN codificantes de la secuencia de aminoácidos de HV0 y LV0 del anticuerpo humanizado anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente están representadas, respectivamente, por las SEC ID n° 98 y 99, mientras que las secuencias de ADN codificantes de las secuencias de aminoácidos de las regiones variables HV2, HV3, HV5 y HV7 en las que se realizan una o más modificaciones de aminoácidos están representadas por las SEC ID n° 100, 102, 104 y 106, respectivamente.
(3) Construcción de ADNc codificante de VH del anticuerpo humanizado anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente
Se preparó mediante síntesis total un ADNc codificante de la secuencia de aminoácidos HV0, HV5 o HV7 de la VH del anticuerpo humanizado anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente representado por la SEC ID n° 98, 104 o 106 diseñada en (1) anteriormente del presente ejemplo.
(4) Construcción de ADNc codificante de VL del anticuerpo humanizado anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente
Se preparó mediante síntesis total un ADNc codificante de la secuencia de aminoácidos LV0 de la VL del anticuerpo humanizado anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente representado por la SEC ID n° 99 diseñada en (1) del presente ejemplo.
(5) Construcción de vector de expresión de anticuerpo humanizado anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente Se construyeron diversos vectores de expresión de anticuerpo humanizado anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente mediante la inserción de un ADNc codificante de una cualquiera de entre HV0, HV5 y HV7 y un ADNc codificante de LV0, obtenido en (2) y (3), anteriormente, del presente ejemplo, en posiciones apropiadas del vector de expresión de anticuerpo humanizado pKANTEX93 indicado en el documento n° WO97/10354.
(6) Expresión estable de anticuerpo humanizado anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente utilizando células animales y preparación de anticuerpos purificados
Se llevó a cabo la expresión estable del anticuerpo humanizado anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente utilizando células animales y la purificación del anticuerpo a partir del sobrenadante de cultivo, de la misma manera que los métodos indicados en los ejemplos 6(2) y (3).
Como resultado, se preparó un anticuerpo humanizado anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente HV0LV0 en el que la VH del anticuerpo consistía en HV0, y VL de LV0, HV5LV0, en el que VH del anticuerpo consiste en HV5, y VL de LV0 y HV7LV0, en el que VH del anticuerpo consiste en HV7, y VL de LV0, tres tipos en total.
[Ejemplo 11]
Evaluación de la actividad del anticuerpo humanizado anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente En (1) a (5), a continuación, se llevó a cabo la evaluación de la actividad del anticuerpo quimérico anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente KM4030 obtenido en el ejemplo 6 y los anticuerpos humanizados anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente HV0LV0, HV5LV0 y HV7LV0 obtenidos en el ejemplo 10.
(1) Evaluación de la actividad de unión del anticuerpo quimérico y anticuerpo humanizado anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente a CD27-Fc humano con cadena de azúcar deficiente
Con el fin de analizar la actividad de unión del anticuerpo humanizado anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente a CD27 humano con cadena de azúcar deficiente, se midió la reacción cinéticamente de la misma manera que en el ejemplo 7(1) utilizando BIACORE T100 (fabricado por BIACORE).
La constante de la tasa de unión Ka1, la constante de la tasa de disociación Kd1 y la constante de disociación KD (Kd1/Ka1) obtenidos como resultados se muestran en la figura 29.
Tal como se muestra en la tabla 4, cada uno de los anticuerpos humanizados HV0LV0, HV5LV0 y HV7LV0 mostraba una afinidad elevada, de 2x10-9 moles/l se mantuvo una actividad de unión a antígeno similar a la del anticuerpo quimérico anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente.
[Tabla 4]
Figure imgf000069_0001
(2) Evaluación de la especificidad de reacción del anticuerpo humanizado anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente mediante un método de tinción de células fluorescentes (análisis de citometría de flujo)
Se midió la especificidad de reacción del anticuerpo humanizado anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente de la misma manera que en el ejemplo 7(2). Con respecto a las estirpes celulares, las células CD27/DG44-4 y las células CD27/Lec8-M19, que presentaban prácticamente la misma cantidad de expresión de antígeno, preparadas mediante el mismo método del ejemplo 2, se utilizaron como células de ensayo.
Se ajustó el anticuerpo humanizado anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente HV0LV0, HV5LV0 o HV7LV0 a una concentración final de 0,0001, 0,001, 0,003, 0,01, 0,03, 0,1, 1 o 10 pg/ml y se utilizó como el anticuerpo primario. Se muestran los resultados en la figura 30(A) y en la figura 30(B).
Como resultado, la totalidad de los anticuerpos humanizados anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente HV0LV0, HV5LV0 y HV7LV0 no se unió a las células CD27/DG44-4 y se observó su unión únicamente a las células CD27/Lec8-M19 que expresaban CD27 con cadena de azúcar deficiente. Además, la reactividad de los anticuerpos humanizados anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente con las células CD27/Lec8-M19 que expresaban CD27 con cadena de azúcar deficiente era prácticamente igual a la del anticuerpo quimérico anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente KM4030.
(3) Evaluación de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (actividad ADCC) de anticuerpos humanizados anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente
Se midió la actividad ADCC de los anticuerpos humanizados anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente HV0LV0, HV5LV0 y HV7LV0 de la misma manera que en el ejemplo 7(3). Como células diana se utilizaron las células CD27/DG44-4 y CD27/Lec8-M19 mediante el mismo método del ejemplo 2. Además, el ensayo se llevó a cabo a una proporción de células efectoras (E)/células diana (T) de 12,5:1. Se muestran los resultados en la figura 31.
Como resultado, la actividad ADCC del anticuerpo humanizado HV0LV0 era ligeramente inferior a la del anticuerpo quimérico anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente KM4030, aunque la actividad de los anticuerpos humanizados anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente HV5LV0 y HV7LV0 mostraba una actividad ADCC prácticamente igual o superior a la del anticuerpo quimérico anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente KM4030. (4) Evaluación de la citotoxicidad dependiente del complemento (actividad CDC) de los anticuerpos humanizados anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente
Se midió la actividad CDC de los anticuerpos humanizados anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente HV0LV0, HV5LV0 y HV7LV0 de la misma manera que en el ejemplo 7(4). Se ajustó la concentración de cada anticuerpo a una concentración final de 100 pg/ml.
Como resultado, los anticuerpos humanizados anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente HV0LV0, HV5LV0 y HV7LV0 mostraban una actividad CDC más elevada que la del anticuerpo quimérico anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente KM4030.
(5) Evaluación de la reactividad cruzada del anticuerpo humanizado anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente con la proteína CD27 de mono.
Se midió la actividad de unión de los anticuerpos humanizados anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente HV0LV0, HV5LV0 y HV7LV0 para las células de expresión de CD27 de Cynomolgus mediante un método de tinción de células fluorescentes (análisis de citometría) de la misma manera que en el ejemplo 9(1). Se utilizaron células CD27/DG44 de Cynomolgus y CD27/Lec8 de Cynomolgus preparadas en el ejemplo 8 como células de expresión de CD27 de Cynomolgus. Se muestran los resultados en la figura 33(A) y en la figura 33(B).
Como resultado, los anticuerpos humanizados anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente HV0LV0, HV5LV0 y HV7LV0 no se unían a las células CD27/DG44 de Cynomolgus. Por otra parte, los anticuerpos humanizados anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente HV0LV0, HV5LV0 y HV7LV0 reaccionaron con CD27/Lec8 de Cynomolgus expresante de CD27 con cadena de azúcar deficiente de la misma manera que en el caso del anticuerpo quimérico anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente KM4030. Basándose en lo anterior, se reveló que cada uno de los anticuerpos humanizados anti-CD27 con cadena de azúcar deficiente HV0LV0, HV5LV0 y HV7LV0 mostraba reactividad cruzada con la célula CD27 de Cynomolgus con cadena de azúcar deficiente. Aplicabilidad industrial
La presente divulgación puede proporcionar un anticuerpo monoclonal o un fragmento de anticuerpo del mismo, que reconoce específicamente un polipéptido codificado por el gen CD27 que contiene una cadena de azúcar unida a O a la que no se encuentra unida la galactosa y se une a su región extracelular; un hibridoma que produce el anticuerpo; un ADN que codifica el anticuerpo; un vector que comprende el ADN; un transformante obtenible mediante transformación del vector; un procedimiento para producir un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo del mismo utilizando el hibridoma o el transformante, y un agente diagnóstico que utiliza el anticuerpo o el transformante y un agente diagnóstico o un agente terapéutico que comprende el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo del mismo como principio activo.
Referencia al material biológico depositado
IPOD FREM BP-10976
Texto libre del listado de secuencias
SEC ID n° 1. Secuencia de nucleótidos de CD27 humano
SEC ID n° 2. Secuencia de aminoácidos de CD27 humano
SEC ID n° 3. Descripción de secuencia artificial: Cebador directo de CD27
SEC ID n° 4. Descripción de secuencia artificial: CD27809B
SEC ID n° 5. Descripción de secuencia artificial: Cebador CD27-A
SEC ID n° 6. Descripción de secuencia artificial: Cebador CD27-B
SEC ID n° 7. Descripción de secuencia artificial: cebador 1
SEC ID n° 8. Descripción de secuencia artificial: cebador 2
SEC ID n° 9. Descripción de secuencia artificial: cebador g4A
SEC ID n° 10. Descripción de secuencia artificial: cebador g4B
SEC ID n° 11. Descripción de secuencia artificial: Secuencia de nucleótidos de la proteína CD27-Fc SEC ID n° 12. Descripción de secuencia artificial: Secuencia de aminoácidos de la proteína CD27-Fc SEC ID n° 13. Descripción de secuencia artificial: Cebador CD27-C
SEC ID n° 14. Descripción de secuencia artificial: cebador específico para IgG1 de rata
SEC ID n° 15. Descripción de secuencia artificial: cebador específico para IgG2a de rata
SEC ID n° 16. Descripción de secuencia artificial: cebador específico para IgG2b de rata
SEC ID n° 17. Descripción de secuencia artificial: cebador específico para CH1 de rata
SEC ID n° 18. Descripción de secuencia artificial: cebador específico para Ig(K) 1 de rata
SEC ID n° 19. Descripción de secuencia artificial: cebador específico para Ig(K) 2 de rata
SEC ID n° 20. Secuencia de nucleótidos de VH de KM4026
SEC ID n° 21. Secuencia de nucleótidos de VH de KM4027
SEC ID n° 22. Secuencia de nucleótidos de VH de KM4028
SEC ID n° 23. Secuencia de nucleótidos de VH de KM4030
SEC ID n° 24. Secuencia de nucleótidos de VH de KM4031
SEC ID n° 25. Secuencia de aminoácidos de VH de KM4026
SEC ID n° 26. Secuencia de aminoácidos de VH de KM4027
SEC ID n° 27. Secuencia de aminoácidos de VH de KM4028
SEC ID n° 28. Secuencia de aminoácidos de VH de KM4030
SEC ID n° 29. Secuencia de aminoácidos de VH de KM4031
SEC ID n° 30. Secuencia de nucleótidos de VL de KM4026
SEC ID n° 31. Secuencia de nucleótidos de VL de KM4027
SEC ID n° 32. Secuencia de nucleótidos de VL de KM4028
SEC ID n° 33. Secuencia de nucleótidos de VL de KM4030
SEC ID n° 34. Secuencia de nucleótidos de VL de KM4031
SEC ID n° 35. Secuencia de aminoácidos de VL de KM4026
SEC ID n° 36. Secuencia de aminoácidos de VL de KM4027
SEC ID n° 37. Secuencia de aminoácidos de VL de KM4028
SEC ID n° 38. Secuencia de aminoácidos de VL de KM4030
SEC ID n° 39. Secuencia de aminoácidos de VL de KM4031
SEC ID n° 40. CDR1 de VH de KM4026
SEC ID n° 41. CDR2 de VH de KM4026
SEC ID n° 42. CDR3 de VH de KM4026
SEC ID n° 43. CDR1 de VL de KM4026
SEC ID n° 44. CDR2 de VL de KM4026
SEC ID n° 45. CDR3 de VL de KM4026
SEC ID n° 46. CDR1 de VH de KM4027
SEC ID n° 47. CDR2 de VH de KM4027
SEC ID n° 48. CDR3 de VH de KM4027
SEC ID n° 49. CDR1 de VL de KM4027
SEC ID n° 50. CDR2 de VL de KM4027
SEC ID n° 51. CDR3 de VL de KM4027
SEC ID n° 52. CDR1 de VH de KM4028
SEC ID n° 53. CDR2 de VH de KM4028
SEC ID n° 54. CDR3 de VH de KM4028
SEC ID n° 55. CDR1 de VL de KM4028
SEC ID n° 56. CDR2 de VL de KM4028
SEC ID n° 57. CDR3 de VL de KM4028
SEC ID n° 58. CDR1 de VH de KM4030
SEC ID n° 59. CDR2 de VH de KM4030
SEC ID n° 60. CDR3 de VH de KM4030
SEC ID n° 61. CDR1 de VL de KM4030
SEC ID n° 62. CDR2 de VL de KM4030
SEC ID n° 63. CDR3 de VL de KM4030
SEC ID n° 64. CDR1 de VH de KM4031
SEC ID n° 65. CDR2 de VH de KM4031
SEC ID n° 66. CDR3 de VH de KM4030
SEC ID n° 67. CDR1 de VL de KM4031
SEC ID n° 68. CDR2 de VL de KM4031
SEC ID n° 69. CDR3 de VL de KM4031
SEC ID n° 70. Descripción de secuencia artificial: cebador 1 de quimera de VL de KM4026 SEC ID n° 71. Descripción de secuencia artificial: cebador 2 de quimera de VL de KM4026 SEC ID n° 72. Descripción de secuencia artificial: cebador 1 de quimera de VH de KM4026 SEC ID n° 73. Descripción de secuencia artificial: cebador 2 de quimera de VH de KM4026

Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Anticuerpo humanizado o fragmento de anticuerpo del mismo, que reconoce y se une a una región extracelular de un polipéptido codificado por el gen de CD27 que contiene una cadena de azúcar unida a O a la que no se encuentra unida la galactosa; en el que el anticuerpo o el fragmento comprende una VH que comprende las secuencias de aminoácidos de CDR1 a 3 representadas por SEC ID n° 58 a 60, respectivamente, y el anticuerpo o fragmento comprende una VL que comprende las secuencias de aminoácidos de CDR1 a 3 representadas por SEC ID n° 61 a 63, respectivamente, en el que la VH del anticuerpo humanizado o fragmento comprende la secuencia de aminoácidos representada por cualquiera de SEC ID n° 96, 105 y 107, y la VL del anticuerpo humanizado o fragmento comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEC iD n° 97.
2. ADN que codifica el anticuerpo humanizado o el fragmento de anticuerpo del mismo según la reivindicación 1.
3. Vector recombinante que comprende el ADN según la reivindicación 2.
4. Transformante obtenible introduciendo el vector recombinante según la reivindicación 3 en una célula hospedadora.
5. Procedimiento para producir el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo del mismo según la reivindicación 1, que comprende cultivar el transformante según la reivindicación 4 en un medio para formar y acumular el anticuerpo humanizado o el fragmento de anticuerpo del mismo según la reivindicación 1 en el cultivo y recoger a continuación el anticuerpo humanizado o el fragmento de anticuerpo del mismo del cultivo.
6. Método in vitro o ex vivo para detectar o medir inmunológicamente CD27 que contiene una cadena de azúcar unida a O a la que no se encuentra unida la galactosa, que comprende utilizar el anticuerpo humanizado o el fragmento de anticuerpo del mismo según la reivindicación 1.
7. Reactivo para detectar CD27 que contiene una cadena de azúcar unida a O a la que no se encuentra unida la galactosa, que comprende el anticuerpo humanizado o el fragmento de anticuerpo del mismo según la reivindicación 1.
8. Agente para la utilización en el diagnóstico o el tratamiento de una enfermedad relacionada con CD27 que contiene una cadena de azúcar unida a O a la que no se encuentra unida la galactosa, que comprende el anticuerpo humanizado o el fragmento de anticuerpo del mismo según la reivindicación 1, en el que la enfermedad relacionada con CD27 que contiene una cadena de azúcar unida a O a la que no se encuentra unida galactosa es la nefropatía de IgA.
9. Composición farmacéutica que comprende el anticuerpo humanizado o el fragmento de anticuerpo del mismo según la reivindicación 1 o el agente según la reivindicación 8 y un portador farmacéuticamente aceptable.
10. Utilización del anticuerpo humanizado o el fragmento de anticuerpo del mismo según la reivindicación 1 para la preparación de un agente para diagnosticar o tratar una enfermedad relacionada con CD27 que contiene una cadena de azúcar unida a O a la que no se encuentra unida la galactosa, en la que la enfermedad relacionada con CD27 que contiene una cadena de azúcar unida a O a la que no se encuentra unida la galactosa es la nefropatía de IgA.
11. Anticuerpo humanizado o fragmento de anticuerpo del mismo según la reivindicación 1 para la utilización en un método de diagnóstico o tratamiento de una enfermedad relacionada con CD27 que contiene una cadena de azúcar unida a O a la que no se encuentra unida la galactosa, en el que la enfermedad relacionada con CD27 que contiene una cadena de azúcar unida a O a la que no se encuentra unida la galactosa es la nefropatía de IgA.
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