CN102918059A - 抗cd27抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供特异性识别包含未结合半乳糖的O连接型糖链的CD27且与该胞外域结合的单克隆抗体及其使用方法。根据本发明，能够提供特异性识别包含未结合半乳糖的O连接型糖链的CD27且与该胞外域结合的单克隆抗体或该抗体片段、产生该抗体的杂交瘤、编码该抗体的DNA、包含该DNA的载体、对该载体进行转化而得到的转化体、使用该杂交瘤或转化体的抗体或该抗体片段的制造方法以及含有该抗体或抗体片段作为有效成分的CD27相关疾病的诊断剂或治疗剂。

Description

抗CD27抗体
技术领域
本发明涉及一种人源化抗体或该抗体片段，其特异性识别包含未结合半乳糖的O连接型糖链的、由CD27基因编码的多肽且与该多肽的胞外域结合；并且涉及产生该人源化抗体的杂交瘤、编码该人源化抗体的DNA、含有该DNA的载体、对该载体进行转化而得到的转化体、使用该杂交瘤或转化体的人源化抗体或该抗体片段的制造方法以及包含该人源化抗体或抗体片段的诊断剂或者含有该人源化抗体或抗体片段作为有效成分的治疗剂。
背景技术
近年来，报道了如下实例：伴随着各种疾病的发病和病情的发展，附加在与该疾病和病情相关的细胞所表达的蛋白质上的糖链结构发生变化。该实例中，具有代表性的是在超过80%的人类癌症种类中观察到表达的、作为O连接型(丝氨酸苏氨酸型)糖链抗原之一的Tn抗原和在该Tn抗原上附加有涎酸的涎酸化Tn抗原的表达(非专利文献2)。
已知这些糖链抗原在正常细胞中几乎观察不到表达，并且正在进行将其作为癌特异性疫苗疗法的靶分子应用于医疗的研究(非专利文献1)。这些癌特异性糖链抗原的表达通过生物体内存在的构成复杂的糖链生物合成途径和糖链代谢途径的酶活性来进行调控。作为其中一例，已知如下例子：在癌细胞中，编码参与糖链生物合成途径的蛋白质的基因的表达方式发生变化，结果，糖链生物合成途径在中途被阻断；等。
Tn抗原作为正常细胞中的O连接型糖链的生物合成途径的中间产物而已知，其具有：在蛋白质氨基酸序列中的特定的丝氨酸(Ser)残基或苏氨酸(Thr)残基的侧链中存在的羟基上具有α连接的N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)的结构(GalNAcα-Ser/Thr)。
利用核心1β3半乳糖转移酶(core1β3Gal-T，T-合成酶)的活性将一分子半乳糖转移到Tn抗原的非还原末端侧，由此进行正常型O连接型糖链(TF抗原等)的生物合成。认为在多种癌细胞系中，细胞内的核心1β3半乳糖转移酶的活性降低，结果，糖链的生物合成途径被阻断，从而表达Tn抗原或涎酸化Tn抗原。
癌细胞内核心1β3半乳糖转移酶的活性降低的机制较复杂，直到目前也没有完全弄清楚。但是，作为其机制之一，推测为如下机制：编码核心1β3半乳糖转移酶的活性表达所需的特定的伴侣蛋白(Cosmc)的基因发生了突变，结果，细胞内的核心1β3半乳糖转移酶活性大幅度降低(非专利文献6)。
由于在多个癌症种类中共同地观察到Tn抗原的表达，因此认为细胞内的糖链生物合成途径或糖链代谢途径中的异常是使附加在该细胞内表达的大量不同糖蛋白质上的糖链结构产生共同变化的主要原因。
已知糖链结构的变化与病情的发展密切相关的代表性的疾病为癌症。此外，除了癌症以外，作为已知糖链结构的变化与病情的发展密切相关的疾病，已知有IgA肾病。IgA肾病是以作为免疫球蛋白之一的免疫球蛋白A(IgA)颗粒状沉积在肾小球的系膜区的病理所见为特征的慢性肾小球肾炎，于1968年由Berger首次报道(非专利文献2)。
IgA肾病是在日本国内的慢性肾小球肾炎患者中约占半数的代表性的肾炎。据称约四成被诊断为IgA肾病的患者在随后20年以内发展成晚期肾衰竭，因而不得不进行人工透析和肾移植。由此可见，虽然IgA肾病普遍被认为是预后不良的疾病，但在临床上尚未建立有效性得到证明的治疗方法。
在IgA肾病的患者体内，已知两种IgA同种型(IgA1和IgA2)中主要是IgA1沉积于肾脏。此外，作为该沉积的原因之一，有如下报道：存在于IgA1分子中而非IgA2分子中的、附加于铰链区的O连接型糖链的结构从正常型变成Tn抗原或涎酸化Tn抗原(非专利文献3、非专利文献4)。
已经证明，当附加于IgA1铰链区的O连接型糖链缺失半乳糖而变成Tn抗原或涎酸化Tn抗原时，IgA1分子的自身凝集能力亢进，并且IgA1分子在肾系膜区的沉积亢进(非专利文献5)。
进而报道了：在从IgA肾病患者分离出的产生IgA的细胞中，因Cosmc的表达量降低而导致核心1β3半乳糖转移酶活性降低(非专利文献6)。
即，在IgA肾病患者体内的产生IgA的细胞中，糖链生物合成途径在中途被阻断，结果，不能产生具有正常型糖链的IgA1，取而代之，产生糖链缺陷型IgA1。作为IgA肾病的发病机制之一，提出了如下机制：该糖链缺陷型IgA1沉积在肾小球上，结果引发炎症。
一般而言，IgA由血液中的B细胞或由B细胞分化成的浆细胞产生。已知浆细胞是B细胞分化的最终阶段，分布于次级淋巴组织、全身的粘膜组织和骨髓等中并产生大量的抗体，而产生IgA的浆细胞主要分布于粘膜组织。
另一方面还已知，在次级淋巴组织的生发中心，由获得高亲和性IgA抗体产生能力的B细胞克隆分化出记忆B细胞或浆细胞，并分布于全身的靶器官而长期持续地产生抗体。
但是，尚未明确产生与IgA肾病的发病相关的糖链缺陷IgA的细胞在B细胞分化过程的哪个阶段中产生以及产生糖链缺陷IgA的B细胞或浆细胞分布于体内的何种组织。
在作为B细胞或浆细胞上表达的细胞膜表面分子已知的蛋白质中，作为O连接型糖链所结合的分子之一，已知有CD27(非专利文献7)。CD27分子是属于肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族的分子量约为55kDa的I型膜蛋白，以两个单体通过二硫键连接而成的二聚体的形式存在(非专利文献8)。
已知CD27除了表达于浆细胞、B细胞上以外，还表达于一部分T淋巴细胞上，并且已知特别是在B细胞的分化过程中，在分化成记忆B细胞和浆细胞时，表达升高。已知这些分化过程的细胞上表达结合有O连接型糖链的CD27，但尚未明确糖链所结合的氨基酸残基(非专利文献9)。
作为CD27的配体分子，已知有作为TNF家族之一的CD70。已知CD70与一部分B细胞或T细胞上表达的CD27结合而导入细胞增殖信号，或者促进B细胞产生抗体(非专利文献10)。
另外还已知，CD27不仅表达于正常细胞中，而且在一些癌细胞中表达亢进。作为表达CD27的癌症种类，报道了套细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、小淋巴细胞性白血病、伯基特(バ一キツト)淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、粘膜相关淋巴组织淋巴瘤、弥漫性大细胞淋巴瘤和浆细胞瘤等各种非霍奇金淋巴瘤(非专利文献11)。
已知在大部分癌细胞中，如上所述表达Tn抗原或涎酸化Tn抗原等包含糖链的糖链缺陷蛋白质。
作为特异性识别CD27的抗体，报道了：通过免疫从Sezary综合征患者分离出的白血病细胞而得到的S 152抗体(非专利文献8)。但是，S152抗体显示出对正常B细胞和T细胞也具有亲和性。到目前为止，尚未获知特异性识别包含未结合半乳糖的O连接型糖链的CD27分子的抗体。
普遍已知在对人施用非人抗体例如小鼠抗体等时，其作为异物而被识别，由此在人体内诱导出抗小鼠抗体的人抗体(人抗小鼠抗体，Human Anti Mouse Antibody；HAMA)。
已知HAMA与所施用的小鼠抗体反应而引起副作用(非专利文献12~15)，或者，加快小鼠抗体在体内的消失(非专利文献16~18)，降低小鼠抗体的治疗效果(非专利文献19、20)。
为了解决上述问题，正在尝试利用基因重组技术由非人抗体制作人嵌合抗体和人源化抗体。
人源化抗体与小鼠抗体等非人抗体相比，在对人进行施用的方面具有多个优点。例如，据报道，在使用猴进行的实验中，与小鼠抗体相比，其免疫原性降低，血中半衰期延长(非专利文献21、非专利文献22)。即，人源化抗体与非人抗体相比，对人产生的副作用少，并可以期待其治疗效果长期持续。
另外，由于人源化抗体利用基因重组技术来制作，因此，能够制作成多种形式的分子。例如，使用γ1亚类作为人抗体的重链(以下记作H链)恒定区(以下记作C区)(将H链C区记作CH)时，能够制作抗体依赖性细胞毒活性(以下记作ADCC活性)等效应功能高的人源化抗体(非专利文献23)，并且，可以期待其血中半衰期比小鼠抗体延长(非专利文献24)。
特别是在将Tn抗原型CD27阳性细胞从体内除去的治疗中，为了通过抗体使效应细胞蓄积在靶细胞的附近而对靶细胞进行特异性杀伤，抗体的Fc段(抗体重链的铰链区以后的区域)介导的补体依赖性细胞毒活性(以下记作CDC活性)和ADCC活性等细胞毒活性是很重要的。在人的治疗中，为了发挥细胞毒活性，优选使用人嵌合抗体、人源化抗体或人源化抗体(非专利文献25、26)。
而且，随着近来蛋白质工程、基因工程的进步，人源化抗体也可以制作成Fab、Fab’、F(ab’)2、单链抗体(以下记作scFv)(非专利文献27)、二聚体化V区片段(以下记作双价抗体(Diabody))(非专利文献28)、二硫键稳定的V区片段(以下记作dsFv)(非专利文献29)和包含CDR的肽(非专利文献30)等小分子量的抗体片段。这些抗体片段与完整的抗体分子相比，向靶组织的移行性更优良(非专利文献31)。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Crit Rev Oncog.,6,57(1995)
非专利文献2：J Urol Nephrol.,74,694(1968)
非专利文献3：Clin Exp Immunol.,100,470(1995)
非专利文献4：J Am Soc Neph.,7,955(1996)
非专利文献5：Nephrol Dial Transplant.,17,50(2002)
非专利文献6：J Intern Med.,258,467(2005)
非专利文献7：Current Opinion in Immunology 17,275(2005)
非专利文献8：J Immunol.,141,21(1988)
非专利文献9：Eur J Immunol.,22,447(1992))
非专利文献10：Proc.Natl.Acad.Sci.,94.6346(1997)
非专利文献11：Leukemia and Lymphoma.,43,1855(2002)
非专利文献12：Hum.Pathol.,38,564(2007)
非专利文献13：Hum.Pathol.,36,886(2005)
非专利文献14：FEBS Lett.,579,6179(2005)
非专利文献15：Cancer Res.,65,7378(2005)
非专利文献16：Hum.Pathol.,36,886(2005)
非专利文献17：Oncogene,13,2328(2006)
非专利文献18：Virchows Arch.,448,52(2006)
非专利文献19：J.Immunol.,135,1530(1985)
非专利文献20：Cancer Res.,46,6489(1986)
非专利文献21：Cancer Res.,56,1118(1996)
非专利文献22：Immunol.,85,668(1995)
非专利文献23：Cancer Res.,56,1118(1996)
非专利文献24：Immunol.,85,668(1995)
非专利文献25：J.Immunol.,144,1382(1990)
非专利文献26：Nature,322,323(1988)
非专利文献27：Science,242,423(1988)
非专利文献28：Nature Biotechnol.,15,629(1997)
非专利文献29：Molecular Immunol.,32,249(1995)
非专利文献30：J.Biol.Chem.,271,2966(1996)
非专利文献31：Cancer Res.,52,3402(1992)
发明内容
发明所要解决的问题
如上所述，到目前为止，尚未获知特异性识别包含未结合半乳糖的O连接型糖链的CD27分子的抗体。特异性识别包含未结合半乳糖的O连接型糖链的CD27分子的抗体对诊断和治疗与包含未结合半乳糖的O连接型糖链的CD27相关的疾病等是非常有效的。
因此，本发明的目的在于提供特异性识别包含未结合半乳糖的O连接型糖链的CD27且与CD27的胞外域结合的单克隆抗体或其使用方法。
用于解决问题的手段
本发明涉及下述(1)~(23)项。
(1)一种人源化抗体或其抗体片段，其中，抗体的VH为包含序列号58~60表示的CDR1~3的氨基酸序列的VH且抗体的VL为包含序列号61~63表示的CDR1~3的氨基酸序列的VL，所述抗体或其抗体片段识别并结合包含未结合半乳糖的O连接型糖链的、由CD27基因编码的多肽的胞外域。
(2)如(1)所述的人源化抗体或其抗体片段，其中，人源化抗体的VH包含导入有选自下述修饰中的至少一种修饰的氨基酸序列：将序列号96表示的氨基酸序列中的第30位的Ser取代成Asn、将第48位的Val取代成Ile、将第49位的Ser取代成Ala、将第77位的Asn取代成Gly、将第93位的Val取代成Thr、将第97位的Ala取代成Thr以及将第117位的Thr取代成Val；并且，人源化抗体的VL包含导入有选自下述修饰中的至少一种修饰的氨基酸序列：将序列号97表示的氨基酸序列中的第21位的Ile取代成Leu、将第40位的Pro取代成Leu、将第58位的Val取代成Ile、将第85位的Thr取代成Ala以及将第87位的Tyr取代成Phe。
(3)如(1)所述的人源化抗体或其抗体片段，其中，人源化抗体的VH包含序列号96、105和107中任意一个序列表示的氨基酸序列，并且人源化抗体的VL包含序列号97表示的氨基酸序列。
(4)一种DNA，其编码(1)~(3)中任一项所述的人源化抗体或该抗体片段。
(5)一种重组载体，其含有(4)所述的DNA。
(6)一种转化株，其通过将(5)所述的重组载体导入宿主细胞中而得到。
(7)一种人源化抗体或该抗体片段的制造方法，用于制造(1)~(3)中任一项所述的人源化抗体或该抗体片段，其特征在于，将(6)所述的转化株在培养基中进行培养，在培养物中生成并蓄积(1)~(3)中任一项所述的人源化抗体或该抗体片段，并从该培养物中收集抗体或该抗体片段。
(8)一种包含未结合半乳糖的O连接型糖链的CD27的免疫学检测或测定方法，其使用(1)~(3)中任一项所述的人源化抗体或该抗体片段。
(9)一种包含未结合半乳糖的O连接型糖链的CD27的检测试剂，其包含(1)~(3)中任一项所述的人源化抗体或该抗体片段。
(10)一种与包含未结合半乳糖的O连接型糖链的CD27相关的疾病的诊断剂，其包含(1)~(3)中任一项所述的人源化抗体或该抗体片段。
(11)如(10)所述的诊断剂，其中，与包含未结合半乳糖的O连接型糖链的CD27相关的疾病为IgA肾病。
(12)如(10)所述的诊断剂，其中，与包含未结合半乳糖的O连接型糖链的CD27相关的疾病为癌症。
(13)一种与包含未结合半乳糖的O连接型糖链的CD27相关的疾病的治疗剂，其含有(1)~(3)中任一项所述的人源化抗体或抗体片段作为有效成分。
(14)如(13)所述的治疗剂，其中，与包含未结合半乳糖的O连接型糖链的CD27相关的疾病为IgA肾病。
(15)如(13)所述的治疗剂，其中，与包含未结合半乳糖的O连接型糖链的CD27相关的疾病为癌症。
(16)一种与包含未结合半乳糖的O连接型糖链的CD27的相关疾病的诊断方法，其包括：使用(1)~(3)中任一项所述的人源化抗体或该抗体片段，对表达包含未结合半乳糖的O连接型糖链的CD27的细胞进行检测或测定。
(17)一种与包含未结合半乳糖的O连接型糖链的CD27相关的疾病的诊断方法，其包括：使用(1)~(3)中任一项所述的人源化抗体或该抗体片段，对包含未结合半乳糖的O连接型糖链的CD27进行检测或测定。
(18)如(16)或(17)所述的诊断方法，其中，与包含未结合半乳糖的O连接型糖链的CD27相关的疾病为IgA肾病。
(19)如(16)或(17)所述的诊断方法，其中，与包含未结合半乳糖的O连接型糖链的CD27相关的疾病为癌症。
(20)(1)~(3)中任一项所述的人源化抗体或该抗体片段在制造与包含未结合半乳糖的O连接型糖链的CD27相关的疾病的诊断剂中的应用。
(21)(1)~(3)中任一项所述的人源化抗体或该抗体片段在制造与包含未结合半乳糖的O连接型糖链的CD27相关的疾病的治疗剂中的应用。
(22)如(20)或(21)所述的人源化抗体或该抗体片段的应用，其中，与包含未结合半乳糖的O连接型糖链的CD27相关的疾病为IgA肾病。
(23)如(20)或(21)所述的人源化抗体或该抗体片段的应用，其中，与包含未结合半乳糖的O连接型糖链的CD27相关的疾病为癌症。
发明效果
本发明的人源化抗体或该抗体片段是特异性识别包含未结合半乳糖的O连接型糖链的、由CD27基因编码的多肽(以下记作CD27)的胞外域且与该胞外域结合的单克隆抗体。
通过使用本发明的人源化抗体或该抗体片段对糖链缺陷CD27或表达该多肽的细胞进行检测或定量，能够诊断与糖链缺陷CD27相关的疾病。
另外，由于本发明的人源化抗体或该抗体片段能够与糖链缺陷CD27多肽的胞外域结合，因此，可以适合用于检测表达该多肽的细胞。特别是，由于本发明的抗体或该抗体片段能够与糖链缺陷CD27的胞外域结合，因此，可以优选用于对保持天然型立体结构而表达在细胞膜上的CD27进行检测的流式细胞术的分析。
另外，作为本发明的人源化抗体或该抗体片段且具有效应活性的抗体或该抗体片段在体内和体外都能够杀伤表达糖链缺陷CD27多肽的细胞。另外，上述本发明的人源化抗体或该抗体片段能够杀伤生物体内表达糖链缺陷CD27多肽的细胞而使其减少，因此，可以特别有效地用作治疗剂。
附图说明
图1表示包含编码人CD27蛋白的DNA序列的质粒载体pCR2.1CD27的制作方法。
图2表示包含编码人CD27蛋白的胞外域的DNA序列的质粒载体pCR CD27axb的制作方法。
图3表示具有对人IgG4恒定区进行了氨基酸取代的突变型人IgG4Fc段的质粒载体pBShCγ4SP的制作方法。
图4表示包含在突变型人IgG4Fc段的DNA序列插入有限制性酶识别序列的DNA序列的质粒载体pCR IgG4Fc BamHISalI的制作方法。
图5表示插入CD27-Fc的DNA序列的pKANTEX XhoI/SalI的制作方法。
图6表示CD27-Fc蛋白表达载体pKANTEX CD27-hIgG4Fc的制作方法。
图7(a)和(b)表示对以CHO/DG44细胞和Lec8细胞作为宿主细胞进行表达而得到的CD27-Fc蛋白进行SDS-PAGE分析而得到的结果。图7(a)表示未添加β-巯基乙醇的非还原状态，图7(b)表示添加β-巯基乙醇后的还原状态。图7(a)和(b)中，均从左侧起表示标记物、Lec8细胞和CHO/DG44细胞的级分。
图8(a)表示对以CHO/DG44细胞和Lec8细胞作为宿主细胞进行表达而得到的CD27-Fc蛋白进行SDS-PAGE分析而得到的结果。另外，图8(b)表示对以CHO/DG44细胞和Lec8细胞作为宿主细胞进行表达而得到的CD27-Fc蛋白进行蛋白免疫印迹而得到的结果。图8(a)和(b)中，均从左侧泳道起表示标记物、CHO/DG44细胞和Lec8细胞的样品。蛋白免疫印迹中，使用抗RCAS1抗体22-1-1抗体进行染色。
图9表示动物细胞表达用的包含编码CD27蛋白的DNA的质粒载体pCR CD27axc的制作方法。
图10表示动物细胞表达载体pKANTEX CD27的制作方法。
图11(a)和(b)表示抗CD27单克隆抗体对表达CD27的CHO/DG44细胞和表达CD27的Lec8细胞的流式细胞术的结果。图11(a)表示针对CD27/Lec8-4的直方图的结果，图11(b)表示针对CD27/DG44-8的直方图的结果。在所有的直方图中，纵轴均表示细胞数，横轴均表示荧光强度。
图12(a)和(b)表示使用荧光细胞染色法测定抗糖链缺陷CD27单克隆抗体KM4030和KM4031对Lec8细胞、CD27/Lec8-4细胞和CD27/DG44-8细胞的结合活性而得到的结果。图12(a)表示使用ABI细胞检测系统的测定结果，纵轴表示荧光强度，横轴表示反应的抗体。图12(b)表示使用流式细胞仪(FCM)的测定结果，纵轴表示平均荧光强度，横轴表示反应的抗体。
图13(a)和(b)表示抗糖链缺陷CD27单克隆抗体KM4030和KM4031的竞争ELISA的结果。图13(a)表示抗糖链缺陷CD27单克隆抗体KM4030的反应性，图13(b)表示抗糖链缺陷CD27单克隆抗体KM4031的反应性。纵轴表示细胞增殖，横轴表示抗体浓度。
图14(a)和(b)表示抗糖链缺陷CD27单克隆抗体的基因克隆方法。
图15表示抗糖链缺陷CD27嵌合抗体表达载体的制作方法。
图16表示抗糖链缺陷CD27嵌合抗体表达载体的制作方法。
图17表示抗糖链缺陷CD27嵌合抗体表达载体的制作方法。
图18表示抗糖链缺陷CD27嵌合抗体表达载体的制作方法。
图19(A)(a)和(b)表示使用流式细胞仪(FCM)测定各种抗糖链缺陷CD27嵌合抗体嵌合型KM4026(◇)、嵌合型KM4028(△)、嵌合型KM4030(○)、嵌合型KM4031(□)对CD27/Lec8-4细胞的结合活性而得到的结果。另外，图19(A)(b)表示使用流式细胞仪(FCM)测定市售的抗CD27抗体O323(●)对CD27/Lec8-4细胞的结合活性而得到的结果。纵轴表示平均荧光强度，横轴表示反应的抗体的终浓度。
图19(B)(a)表示使用流式细胞仪(FCM)测定各种抗糖链缺陷CD27嵌合抗体嵌合型KM4026(◇)、嵌合型KM4028(△)、嵌合型KM4030(○)、嵌合型KM4031(□)对CD27/DG44-4细胞的结合活性而得到的结果。另外，图19(B)(b)表示使用流式细胞仪(FCM)测定市售的抗CD27抗体O323(●)对CD27/DG44-4细胞的结合活性而得到的结果。纵轴表示平均荧光强度，横轴表示反应的抗体的终浓度。
图19(C)(a)表示使用流式细胞仪(FCM)测定各种抗糖链缺陷CD27嵌合抗体嵌合型KM4026(◇)、嵌合型KM4028(△)、嵌合型KM4030(○)、嵌合型KM4031(□)对Lec8细胞的结合活性而得到的结果。另外，图19(C)(b)表示使用流式细胞仪(FCM)测定市售的抗Tn抗体22-1-1(■)对Lec8细胞的结合活性而得到的结果。纵轴表示平均荧光强度，横轴表示反应的抗体的终浓度。
图20表示各种抗糖链缺陷CD27嵌合抗体嵌合型KM4026(◇)、嵌合型KM4028(△)、嵌合型KM4030(○)和嵌合型KM4031(□)对CD27/Lec8-4细胞的抗体依赖性细胞毒活性(ADCC活性)。纵轴表示细胞毒活性(%)，横轴表示各抗体的终浓度。
图21表示各种抗糖链缺陷CD27嵌合抗体嵌合型KM4026、嵌合型KM4028、嵌合型KM4030和嵌合型KM4031对CD27/Lec8-4细胞的补体依赖性细胞毒活性(CDC活性)。纵轴表示细胞毒活性(%)，横轴表示反应的抗体。
图22表示包含编码食蟹猴CD27蛋白的DNA的质粒载体pCRmfCD27的制作方法。
图23表示包含编码食蟹猴CD27蛋白的DNA的质粒载体mfCD27His的制作方法。
图24表示食蟹猴CD27表达载体pKANTEX mfCD27His的制作方法。
图25表示使用流式细胞仪(FCM)测定各种抗糖链缺陷CD27嵌合抗体嵌合型KM4026、嵌合型KM402、嵌合型KM4030、嵌合型KM4031和市售的抗CD27抗体O323对食蟹猴CD27/Lec8细胞或食蟹猴CD27/DG44细胞的结合活性而得到的结果。纵轴表示平均荧光强度，横轴表示反应的抗体。
图26表示各种抗糖链缺陷CD27嵌合抗体嵌合型KM4026(◆)、嵌合型KM4028(▲)、嵌合型KM4030(●)和嵌合型KM4031(■)对食蟹猴CD27/Lec8细胞的抗体依赖性细胞毒活性(ADCC活性)。纵轴表示细胞毒活性(%)，横轴表示各抗体的终浓度。
图27表示各种抗糖链缺陷CD27嵌合抗体嵌合型KM4030对食蟹猴CD27/Lec8细胞(●)或人CD27/Lec8细胞(○)的抗体依赖性细胞毒活性(ADCC活性)。纵轴表示细胞毒活性(%)，横轴表示各抗体的终浓度。
图28(A)(a)表示抗糖链缺陷CD27抗体KM4026与糖链缺陷CD27-Fc(Tn抗原型CD27-Fc)的结合的BIACORE传感图。图28(A)(b)表示抗糖链缺陷CD27抗体KM4027与糖链缺陷CD27-Fc(Tn抗原型CD27-Fc)的结合的BIACORE传感图。图28(A)(c)表示抗糖链缺陷CD27抗体KM4028与糖链缺陷CD27-Fc(Tn抗原型CD27-Fc)的结合的BIACORE传感图。图28(A)(d)表示抗糖链缺陷CD27抗体KKM4030与糖链缺陷CD27-Fc(Tn抗原型CD27-Fc)的结合的BIACORE传感图。图28(A)(e)表示抗糖链缺陷CD27抗体KM4031与糖链缺陷CD27-Fc(Tn抗原型CD27-Fc)的结合的BIACORE传感图。纵轴表示RU(resonanceunit，共振单位)，横轴表示反应时间(秒)。
图28(B)(a)表示抗糖链缺陷CD27抗体KM4026与涎酸化Tn抗原型CD27-Fc的结合的BIACORE传感图。图28(B)(b)表示各种抗糖链缺陷CD27抗体KM4027与涎酸化Tn抗原型CD27-Fc的结合的BIACORE传感图。图28(B)(c)表示抗糖链缺陷CD27抗体KM4028与涎酸化Tn抗原型CD27-Fc的结合的BIACORE传感图。图28(B)(d)表示抗糖链缺陷CD27抗体KM4030与涎酸化Tn抗原型CD27-Fc的结合的BIACORE传感图。图28(B)(e)表示抗糖链缺陷CD27抗体KM4031与涎酸化Tn抗原型CD27-Fc的结合的BIACORE传感图。纵轴表示RU(共振单位)，横轴表示反应时间(秒)。
图29(a)表示抗糖链缺陷CD27嵌合抗体KM4030与糖链缺陷CD27-Fc(Tn抗原型CD27-Fc)的结合的BIACORE传感图。图29(b)表示人源化抗体HV0LV0与糖链缺陷CD27-Fc(Tn抗原型CD27-Fc)的结合的BIACORE传感图。图29(c)表示人源化抗体HV5LV0与糖链缺陷CD27-Fc(Tn抗原型CD27-Fc)的结合的BIACORE传感图。图29(d)表示人源化抗体HV7LV0与糖链缺陷CD27-Fc(Tn抗原型CD27-Fc)的结合的BIACORE传感图。纵轴表示RU(共振单位)，横轴表示反应时间(秒)。
图30(A)表示使用流式细胞仪(FCM)测定抗糖链缺陷CD27嵌合抗体KM4030(○)和抗糖链缺陷CD27人源化抗体HV0LV0(□)、HV5LV0(△)、HV7LV0(◇)对CD27/Lec8-M19细胞的结合活性而得到的结果。纵轴表示平均荧光强度，横轴表示反应的抗体的终浓度。
图30(B)表示使用流式细胞仪(FCM)测定抗糖链缺陷CD27嵌合抗体KM4030(○)和抗糖链缺陷CD27人源化抗体HV0LV0(□)、HV5LV0(△)、HV7LV0(◇)对CD27/DG44-4细胞的结合活性而得到的结果。纵轴表示平均荧光强度，横轴表示反应的抗体的终浓度。
图31表示抗糖链缺陷CD27嵌合抗体KM4030(○)和抗糖链缺陷CD27人源化抗体HV0LV0(□)、HV5LV0(△)、HV7LV0(◇)对CD27/Lec8-M19细胞的抗体依赖性细胞毒活性(ADCC活性)。纵轴表示细胞毒活性(%)，横轴表示各抗体的终浓度。
图32表示抗糖链缺陷CD27嵌合抗体KM4030(○)和抗糖链缺陷CD27人源化抗体HV0LV0(□)、HV5LV0(△)、HV7LV0(◇)对CD27/Lec8-M19细胞的补体依赖性细胞毒活性(CDC活性)。纵轴表示细胞毒活性(%)，横轴表示反应的抗体。
图33(A)表示使用流式细胞仪(FCM)测定抗糖链缺陷CD27嵌合抗体KM4030(○)和抗糖链缺陷CD27人源化抗体HV0LV0(□)、HV5LV0(△)、HV7LV0(◇)对食蟹猴CD27/Lec8细胞的结合活性而得到的结果。纵轴表示平均荧光强度，横轴表示反应的抗体的终浓度。纵轴表示平均荧光强度，横轴表示反应的抗体。
图33(B)表示使用流式细胞仪(FCM)测定抗糖链缺陷CD27嵌合抗体KM4030(○)和抗糖链缺陷CD27人源化抗体HV0LV0(□)、HV5LV0(△)、HV7LV0(◇)对食蟹猴CD27/DG44细胞的结合活性而得到的结果。纵轴表示平均荧光强度，横轴表示反应的抗体的终浓度。纵轴表示平均荧光强度，横轴表示反应的抗体。
具体实施方式
本发明涉及特异性识别包含未结合半乳糖的O连接型糖链的、由CD27基因编码的多肽(以下也记作CD27)的胞外域且与该胞外域结合的单克隆抗体(以下也称为本发明的人源化抗体、本发明的抗体)。
作为CD27基因，只要是编码CD27的基因则均可，可以列举包含序列号1表示的碱基序列的基因。另外，在严格条件下与包含序列号1表示的碱基序列的DNA杂交并且编码具有CD27的功能的多肽的基因等也包括在本发明的CD27基因中。
在严格条件下杂交的DNA是指以具有序列号1表示的碱基序列的DNA为探针，通过集落杂交法、噬菌斑杂交法、DNA印迹杂交法、DNA微阵列法等得到的能够杂交的DNA。
具体而言，可以列举能够通过如下方法进行鉴定的DNA：使用固定有来源于杂交的集落或噬菌斑的DNA、或者具有该序列的PCR产物或寡聚DNA的过滤器或载玻片，在0.7~1.0摩尔/升的氯化钠存在下在65℃下进行杂交，然后，使用0.1~2倍浓度的SSC溶液(1倍浓度的SSC溶液的组成包括150毫摩尔/升的氯化钠、15毫摩尔/升的柠檬酸钠)，在65℃的条件下清洗过滤器或载玻片，由此进行鉴定。
杂交可以依据[Molecular Cloning,A Laboratory Manual(分子克隆实验指南)，第二版(冷泉港实验室出版社，1989)；Current Protocols inMolecular Biology(最新分子生物学实验方法)(约翰威立父子出版公司，1987-1997)；DNA  Cloning  1:Core Techniques,A PracticalApproach(DNA克隆1：核心技术与实用方法)，第二版(牛津大学，1995)]等中记载的方法来进行。
作为能够杂交的DNA，优选与序列号1表示的碱基序列具有至少60%以上的同源性的DNA，更优选与序列号1表示的碱基序列具有80%以上的同源性的DNA，进一步优选与序列号1表示的碱基序列具有95%以上的同源性的DNA。
编码真核生物的蛋白质的基因的碱基序列中常常可以观察到基因的多态性。本发明中使用的CD27基因也包括碱基序列因基因的多态性而稍有突变的基因。
作为CD27，可以列举：具有序列号2表示的氨基酸序列的多肽；包含在序列号2表示的氨基酸序列中缺失、取代或添加一个以上的氨基酸而成的氨基酸序列且具有CD27的功能的多肽；以及包含与序列号2表示的氨基酸序列具有优选60%以上、更优选80%以上、进一步优选90%以上、最优选95%以上的同源性的氨基酸序列且具有CD27的功能的多肽等。
具有在序列号2表示的氨基酸序列中缺失、取代或添加一个以上的氨基酸而成的氨基酸序列的多肽可以通过如下方法得到：使用[Molecular Cloning,A Laboratory Manual，第二版(冷泉港实验室出版社，1989)；Current Protocols in Molecular Biology(约翰威立父子出版公司，1987-1997)；Nucleic Acids Research,10,6487(1982)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA,79,6409(1982)；Gene,34,315(1985)；Nucleic Acids Research,13,4431(1985)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,488(1985)]等中记载的定点诱变法，在例如编码具有序列号2表示的氨基酸序列的多肽的DNA中导入定点突变。
缺失、取代或添加的氨基酸数没有特别限定，优选为一个至数十个、例如1~20个的氨基酸，更优选为一个至数个、例如1~5个的氨基酸。
在没有特别说明的情况下，本发明中记载的同源性的数值可以是使用本领域技术人员公知的同源性检索程序而计算出的数值，对于碱基序列而言，可以列举：使用BLAST[J.Mol.Biol.,215,403(1990)]中默认的参数而计算出的数值等，对于氨基酸序列而言，可以列举：使用BLAST2[Nucleic AcidsRes.,25,3389(1997)；Genome Res.,7,649(1997)；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Education/BLASTinfo/information3.html]中默认的参数而计算出的数值等。
作为默认的参数，G(起始空位罚分，Cost to open gap)在碱基序列的情况下为5，在氨基酸序列的情况下为11；-E(空位延伸罚分，Cost toextend gap)在碱基序列的情况下为2，在氨基酸序列的情况下为1；-q(核苷酸错配罚分，Penalty for nucleotide mismatch)为-3；-r(核苷酸匹配得分，reward for nucleotide match)为1；-e(期望值，expect value)为10；-W(字长大小，word size)在碱基序列的情况下为11个残基，在氨基酸序列的情况下为3个残基；-y(非空位延伸下降的阈值，Dropoff(X)forblast extensions in bits)在blastn中为20，在blastn以外的程序中为7；-X(空位比对的下降阈值，X dropoff value for gapped alignment in bits)为15；-Z(最终空位比对的下降值，final X dropoff value for gappedalignment in bits)在blastn中为50，在blastn以外的程序中为25(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/html/blastcgihelp.html)。
包含序列号2表示的氨基酸序列的部分序列的多肽可以通过本领域技术人员公知的方法来制作，例如，可以通过使编码序列号2表示的氨基酸序列的DNA的一部分缺失并对导入有包含上述DNA的表达载体的转化体进行培养来制作。
另外，基于这样制作的多肽或DNA，通过与上述同样的方法，可以得到具有在序列号2表示的氨基酸序列的部分序列中缺失、取代或添加一个以上的氨基酸而成的氨基酸序列的多肽。
作为CD27的胞外域，可以列举：与文献[The Journal ofImmunology,147,3165(1991)]中预测的胞外域的第1~171位相当的区域等。
本发明中，包含未结合半乳糖的O连接型糖链的、由CD27基因编码的多肽的胞外域，只要是包含未结合半乳糖的O连接型糖链的CD27则均可。具体而言，可以列举例如：包含未结合半乳糖的O连接型糖链的、由序列号1表示的碱基序列编码的CD27的胞外域。
O连接型糖链是指在蛋白质的丝氨酸(Ser)或苏氨酸(Thr)的氨基酸残基中借助各氨基酸侧链所含的-OH基而结合有糖链的结构。
在O连接型糖链中，将多肽上的Ser或Thr氨基酸侧链的-OH基上结合有N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)的O连接型糖链称为粘蛋白型糖链。作为O连接型糖链的具体例，可以列举：T抗原、涎酸化T抗原、Tn抗原和涎酸化Tn抗原等(表1)。
[表1]
(NeuNAc：N-乙酰神经氨酸)
本发明中，未结合半乳糖的O连接型糖链是指在借助蛋白质的Ser或Thr的氨基酸残基的-OH基而结合的N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)上未结合半乳糖(Gal)的O连接型糖链。具体而言，例如可以列举上述的Tn抗原和涎酸化Tn抗原。
未结合半乳糖的O连接型糖链是正常O连接型糖链的合成途径中的中间体，通常在正常细胞的糖蛋白质中几乎不存在，而在癌症和肾病等某些特定的疾病中确认到表达。
以下，本发明中，有时将未结合半乳糖的O连接型糖链记作异常糖链，将结合有异常糖链的蛋白质记作糖链缺陷蛋白质，并且将结合有异常糖链的CD27记作糖链缺陷CD27。
作为O连接型糖链所结合的多肽中的氨基酸残基，可以列举例如：CD27蛋白的胞外域的氨基酸序列中的丝氨酸(Ser)和苏氨酸(Thr)的氨基酸残基。
另外，对于O连接型糖链所结合的多肽中的氨基酸残基，可以通过使用NetOGlyc3.1Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/)等序列检索软件来确认O连接型糖链结合的共有序列。或者，可以通过对具有O连接型糖链的糖蛋白进行质谱(MS)分析来确定具体的糖链结合位点。
本发明中，作为CD27蛋白上的O连接型糖链所结合的多肽中的氨基酸残基，在CD27蛋白的氨基酸序列中的任意一个Ser或Thr残基上均可以结合O连接型糖链，优选列举包含选自序列号2表示的CD27蛋白中第118位的Thr、第127位的Ser、第129位的Thr、第132位的Ser、第133位的Ser、第137位的Ser、第143位的Thr、第149位的Ser、第156位的Thr、第162位的Thr、第173位的Thr、第175位的Ser和第176位的Thr中的至少一个氨基酸残基的糖链结合位点。
作为每一分子CD27蛋白的胞外域上结合的O连接型糖链数，只要在至少一个Ser残基或Thr残基上结合有O连接型糖链即可，O连接型糖链数没有限定。
作为获得表达本发明的包含未结合半乳糖的O连接型糖链的CD27(以下记作糖链缺陷CD27)的细胞的方法，可以通过例如如下的方法来制作：在使O连接型糖链合成过程中向多肽上的Ser/Thr上结合的N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)上附加Gal的酶、与该酶的活性相关的蛋白质或与尿苷5’-二磷酸半乳糖(UDP-半乳糖)的转运相关的蛋白质等的活性降低或缺失的细胞株中导入编码CD27的DNA，由此制作表达糖链缺陷CD27的细胞。
另外，也可以通过例如使涎酶和半乳糖苷酶等糖链切割酶对表达包含正常O型糖链的CD27的细胞发挥作用来制作表达具有未结合半乳糖的O连接型糖链的CD27的细胞。
作为向多肽上的Ser或Thr上结合的GalNAc上附加Gal的酶的具体例，可以列举β1,3-半乳糖基转移酶[The Journal of BiologicalChemistry,277,178-186(2002)]等。
另外，作为与向多肽上的Ser或Thr上结合的GalNAc上附加Gal的酶的活性相关的蛋白质，可以列举与该酶的蛋白质折叠相关的伴侣Cosmc[Procedings of the National Academy of Sciences of theUnitedStates of America,99,16613-16618(2002)]等。
IgA肾病患者来源的CD27表达细胞，由于编码向多肽上的Ser/Thr上结合的GalNAc上附加Gal的酶、与该酶的活性相关的蛋白质或与UDP-半乳糖的转运相关的蛋白质等的DNA上发生了添加、缺失或取代等而使酶的活性降低或缺失，因此，可以作为CD27表达细胞来利用。
作为与UDP-半乳糖的转运相关的蛋白质，可以列举例如UDP-半乳糖转运蛋白等。作为UDP-半乳糖转运蛋白的活性降低或缺失的细胞系，可以列举例如Lec8细胞[Glycobiology.,1,307-14(1991)]等。
本发明中，作为表达糖链缺陷CD27的细胞，可以列举例如：在人体中内源性存在的细胞、由人体中内源性存在的细胞建立的细胞系或者通过基因重组技术得到的细胞等。
优选列举：如上所述的使在O连接型糖链合成过程中向多肽上的Ser/Thr上结合的GalNAc上附加Gal的酶、与该酶的活性相关的蛋白质或与UDP-半乳糖的转运相关的蛋白质等的活性降低或缺失的细胞系、具有相同的性质并且在人体中内源性存在的细胞等。
作为在人体中内源性存在的细胞，优选在O连接型糖链合成过程中向多肽上的Ser/Thr上结合的GalNAc上附加Gal的酶、与该酶的活性相关的蛋白质或与UDP-半乳糖的转运相关的蛋白质等的活性降低或缺失的细胞系。
具体而言，可以列举例如在IgA肾病患者体内或癌症患者体内表达CD27蛋白的细胞。作为该细胞，可以列举例如通过活组织检查等得到的免疫相关细胞或肿瘤细胞中表达CD27蛋白的细胞。
作为通过基因重组技术得到的细胞，可以列举例如如下细胞：制作使在O连接型糖链合成过程中向多肽上的Ser/Thr上结合的GalNAc上附加Gal的酶、与该酶的活性相关的蛋白质或与UDP-半乳糖的转运相关的蛋白质等的活性降低或缺失的宿主细胞，将包含编码目标多肽的cDNA的表达载体导入宿主细胞中，由此表达糖链缺陷CD27。
作为宿主细胞，具体而言，可以列举例如：UDP-半乳糖转运蛋白的活性降低的Lec8细胞，或者，因β1,3-半乳糖基转移酶或与该酶活性相关的Comsc伴侣蛋白的异常而使酶的活性降低或缺失的IgA肾病患者来源的IgA抗体表达细胞等。
此外，作为制作糖链缺陷CD27蛋白的方法，可以列举例如：使用上述的CD27表达细胞来表达糖链缺陷CD27蛋白并进行纯化的方法等。
作为获得糖链缺陷CD27蛋白的方法，例如可以通过以CD27蛋白与其他物质的融合蛋白的形式进行表达和纯化来获得。
作为与CD27蛋白融合的物质，可以列举例如：抗体恒定区、抗体Fc段、GST标签、组氨酸标签(也称为His标签)和Myc标签等多肽等。该融合蛋白可以通过使用蛋白A、镍柱、特异性抗体柱等亲和层析柱来分离纯化。
本发明的单克隆抗体或该抗体片段对如上得到的糖链缺陷CD27细胞或糖链缺陷CD27具有结合活性。
本发明的抗体或该抗体片段与糖链缺陷CD27蛋白的结合例如可以通过以下方法确认：使用公知的免疫学检测方法、优选荧光细胞染色法等来确认表达特定抗原的细胞与抗特定抗原的抗体的结合性的方法。
另外，也可以将公知的免疫学检测方法[MonoclonalAntibodies-Principles and practice(单克隆抗体的原则与实践)，第三版，美国学术出版社(1996)；Antibodies-A Laboratory Manual(抗体实验指南)，冷泉港实验室(1988)；単クロ一ン抗体実験マニユアル(单克隆抗体实验指南)，講談社サイエンテイフイツク(1987)]等组合来进行确认。
作为本发明的单克隆抗体，可以列举：由杂交瘤生产的抗体、以及由利用包含抗体基因的表达载体进行转化而得到的转化体生产的基因重组抗体。
杂交瘤可以通过例如如下方法来制备：制备表达上述糖链缺陷CD27的细胞等作为抗原，利用经该抗原免疫后的动物诱导出具有抗原特异性的抗体生产细胞，进而，使该抗体生产细胞与骨髓瘤细胞融合。通过对该杂交瘤进行培养或者对动物施用该杂交瘤细胞而使该动物产生癌性腹水并对该培养液或腹水进行分离、纯化，可以获得抗糖链缺陷CD27抗体。
作为进行抗原免疫的动物，只要能够制作杂交瘤则均可以使用，优选使用小鼠、大鼠、仓鼠和兔等。另外，由如下制作的杂交瘤生产的抗体等也包括在本发明的抗体中：从上述动物中获取具有抗体产生能力的细胞，在体外对该细胞实施免疫，然后与骨髓瘤细胞融合而制作杂交瘤。
单克隆抗体是指单一克隆的抗体产生细胞所分泌的抗体，该抗体仅识别一个表位(也称为抗原决定簇)，并且构成单克隆抗体的氨基酸序列(一级结构)一致。
作为表位，可以列举例如：单克隆抗体所识别并结合的单一氨基酸序列、由氨基酸序列构成的立体结构、结合有糖链的氨基酸序列以及由结合有糖链的氨基酸序列构成的立体结构等。作为本发明的单克隆抗体的表位，可以列举糖链缺陷CD27蛋白的立体结构。
作为本发明的单克隆抗体，只要是识别并结合糖链缺陷CD27的胞外域的单克隆抗体，则可以是任意一种抗体，具体而言，可以列举例如：单克隆抗体KM4026、KM4027、KM4028、KM4030和KM4031等。
更具体而言，可以列举例如：由杂交瘤KM4026生产的单克隆抗体KM4026、与单克隆抗体KM4026竞争地与糖链缺陷CD27的胞外域结合的单克隆抗体以及与单克隆抗体KM4026所结合的存在于糖链缺陷CD27胞外域的表位进行结合的单克隆抗体。
作为本发明的单克隆抗体，还可以列举例如：由杂交瘤KM4027生产的单克隆抗体KM4027、与单克隆抗体KM4027竞争地与糖链缺陷CD27的胞外域结合的单克隆抗体以及与单克隆抗体KM4027所结合的存在于糖链缺陷CD27胞外域的表位进行结合的单克隆抗体。
作为本发明的单克隆抗体，还可以列举例如：由杂交瘤KM4028生产的单克隆抗体KM4028、与单克隆抗体KM4028竞争地与糖链缺陷CD27的胞外域结合的单克隆抗体以及与单克隆抗体KM4028所结合的存在于糖链缺陷CD27胞外域的表位进行结合的单克隆抗体。
另外，作为本发明的单克隆抗体，还可以列举例如：由杂交瘤KM4030生产的单克隆抗体KM4030、与单克隆抗体KM4030竞争地与糖链缺陷CD27的胞外域结合的单克隆抗体以及与单克隆抗体KM4030所结合的存在于糖链缺陷CD27胞外域的表位进行结合的单克隆抗体。
另外，作为本发明的单克隆抗体，可以列举：由杂交瘤KM4031生产的单克隆抗体KM4031、与单克隆抗体KM4031竞争地与糖链缺陷CD27的胞外域结合的单克隆抗体以及与单克隆抗体KM4031所结合的存在于糖链缺陷CD27胞外域的表位进行结合的单克隆抗体等。
作为与本发明的单克隆抗体发生竞争反应的单克隆抗体，具体而言，可以列举：如上所述对各种单克隆抗体和存在于糖链缺陷CD27的胞外域的表位具有竞争反应的单克隆抗体。
另外，作为与本发明的单克隆抗体所结合的表位进行结合的单克隆抗体，具体而言，可以列举：如上所述与各种单克隆抗体所识别的存在于糖链缺陷CD27胞外域的表位结合的单克隆抗体。
杂交瘤KM4030于2008年6月5日依照布达佩斯条约保藏于日本独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(305-856，日本茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)，保藏编号为FERM BP-10976。
作为基因重组抗体，包括例如人嵌合抗体、人源化抗体、人抗体和该抗体片段等通过基因重组技术制造的抗体。基因重组抗体中，具有抗原结合活性、抗原性低且血中半衰期延长的基因重组抗体优选作为治疗剂。
人嵌合抗体是指包含非人抗体的重链可变区(以下记作VH)和轻链可变区(以下记作VL)与人抗体的重链恒定区(以下记作CH)和轻链恒定区(以下记作CL)的抗体。
本发明的人嵌合抗体可以如下进行制造。即，由本发明的特异性识别糖链缺陷CD27且与该胞外域结合的单克隆抗体或者产生特异性识别糖链缺陷CD27且与该胞外域结合的单克隆抗体的杂交瘤获取编码VH和VL的cDNA，将它们插入到具有编码人抗体的CH和CL的基因的动物细胞用表达载体中，构建人嵌合抗体表达载体，将其导入动物细胞中使其表达抗体，从而制作人嵌合抗体。
作为人嵌合抗体的CH，只要属于人免疫球蛋白(以下记作hIg)则均可以使用，优选hIgG类的CH，而且，可以使用属于hIgG类的hIgG1、hIgG2、hIgG3和hIgG4等亚类中的任意一种。
另外，作为人嵌合抗体的CL，可以是属于hIg的任意一种CL，可以使用κ类或λ类的CL。
作为本发明的人嵌合抗体，可以列举下述(1)~(5)的人嵌合抗体。
(1)抗体的VH为序列号25表示的氨基酸序列且抗体的VL为序列号35表示的氨基酸序列的人嵌合抗体
(2)抗体的VH为序列号26表示的氨基酸序列且抗体的VL为序列号36表示的氨基酸序列的人嵌合抗体
(3)抗体的VH为序列号27表示的氨基酸序列且抗体的VL为序列号37表示的氨基酸序列的人嵌合抗体
(4)抗体的VH为序列号28表示的氨基酸序列且抗体的VL为序列号38表示的氨基酸序列的人嵌合抗体
(5)抗体的VH为序列号29表示的氨基酸序列且抗体的VL为序列号39表示的氨基酸序列的人嵌合抗体
另外，作为本发明的人嵌合抗体，可以列举下述(1)~(5)的人嵌合抗体。
(1)抗体的VH为包含序列号40~42表示的CDR1~3的氨基酸序列的VH且抗体的VL为包含序列号43~45表示的CDR1~3的氨基酸序列的VL的人嵌合抗体
(2)抗体的VH为包含序列号46~48表示的CDR1~3的氨基酸序列的VH且抗体的VL为包含序列号49~51表示的CDR1~3的氨基酸序列的VL的人嵌合抗体
(3)抗体的VH为包含序列号52~54表示的CDR1~3的氨基酸序列的VH且抗体的VL为包含序列号55~57表示的CDR1~3的氨基酸序列的VL的人嵌合抗体
(4)抗体的VH为包含序列号58~60表示的CDR1~3的氨基酸序列的VH且抗体的VL为包含序列号61~63表示的CDR1~3的氨基酸序列的VL的人嵌合抗体
(5)抗体的VH为包含序列号64~66表示的CDR1~3的氨基酸序列的VH且抗体的VL为包含序列号67~69表示的CDR1~3的氨基酸序列的VL的人嵌合抗体
人源化抗体是指将非人抗体的VH和VL的CDR的氨基酸序列移植到人抗体的VH和VL的适当位置而得到的抗体，也称为人CDR移植抗体、重构抗体(reshaped antibody)。
本发明的人源化抗体可以如下制造：构建编码抗体可变区(以下记作V区)的cDNA，所述抗体可变区是将由产生本发明的特异性识别糖链缺陷CD27蛋白并与该胞外域结合的单克隆抗体的杂交瘤产生的非人抗体的VH和VL的CDR的氨基酸序列移植到任意的人抗体的VH和VL的框架(以下记作FR)中而形成的抗体可变区，将上述cDNA插入到具有编码人抗体的CH和CL的基因的动物细胞用表达载体中，构建人源化抗体表达载体，并将其导入动物细胞中，由此进行表达，从而制造人源化抗体。
本发明的人抗体的VH和VL的FR的氨基酸序列只要是人抗体来源的VH和VL的FR的氨基酸序列，则均可以使用。可以使用例如：蛋白数据库(Protein Data Bank)等数据库中登记的人抗体的VH和VL的FR的氨基酸序列或者Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest(具有免疫学重要性的蛋白序列)，美国卫生与公众服务部(1991)等中记载的人抗体的VH和VL的FR的各亚类的共有氨基酸序列等。
作为本发明的人源化抗体的CH，只要属于hIg则可以是任意一种CH，优选hIgG类的CH。而且，可以使用属于hIgG类的hIgG1、hIgG2、hIgG3和hIgG4等亚类中的任意一种。
另外，作为本发明的人源化抗体的CL，只要属于hIg则可以是任意一种CL，可以使用κ类或λ类的CL。
作为本发明的人源化抗体，可以列举下述(1)~(5)的人源化抗体。
(1)抗体的VH的CDR1~3为序列号40~42表示的氨基酸序列且抗体的VL的CDR1~3为序列号43~45表示的氨基酸序列的人源化抗体
(2)抗体的VH的CDR1~3为序列号46~48表示的氨基酸序列且抗体的VL的CDR1~3为序列号49~51表示的氨基酸序列的人源化抗体
(3)抗体的VH的CDR1~3为序列号52~54表示的氨基酸序列且抗体的VL的CDR1~3为序列号55~57表示的氨基酸序列的人源化抗体
(4)抗体的VH的CDR1~3为序列号58~60表示的氨基酸序列且抗体的VL的CDR1~3为序列号61~63表示的氨基酸序列的人源化抗体
(5)抗体的VH的CDR1~3为序列号64~66表示的氨基酸序列且抗体的VL的CDR1~3为序列号67~69表示的氨基酸序列的人源化抗体
另外，作为本发明的人源化抗体，具体而言，优选包含下述(a)VH和(b)VL中的至少一者的人源化抗体。需要说明的是，下述(a)和(b)中，导入的修饰数量没有限制。
(a)包含序列号96表示的氨基酸序列或者序列号96表示的氨基酸序列中的第30位的Ser、第48位的Val、第49位的Ser、第77位的Asn、第93位的Val、第97位的Ala和第117位的Thr被其他氨基酸残基取代的氨基酸序列的VH
(b)包含序列号97表示的氨基酸序列或者序列号97表示的氨基酸序列中的第21位的Ile、第40位的Pro、第58位的Val、第85位的Thr和第87位的Tyr被其他氨基酸残基取代的氨基酸序列的VL
作为本发明的人源化抗体中所含的VH，可以列举例如包含序列号96表示的氨基酸序列中的第30位的Ser、第48位的Val、第49位的Ser、第77位的Asn和第97位的Ala被其他氨基酸残基取代的氨基酸序列的VH。
其中，作为本发明的人源化抗体所含的VH，优选下述(1)和(2)的VH。
(1)包含序列号96表示的氨基酸序列中的第48位的Val、第49位的Ser和第97位的Ala被其他氨基酸残基取代的氨基酸序列的VH
(2)包含序列号96表示的氨基酸序列中的第30位的Ser和第97位的Ala被其他氨基酸残基取代的氨基酸序列的VH
作为上述VH的氨基酸序列，可以列举例如导入有选自下述修饰中的至少一个修饰的氨基酸序列：将序列号96表示的氨基酸序列中的第30位的Ser取代成Asn、将第48位的Val取代成Ile、将第49位的Ser取代成Ala、将第77位的Asn取代成Gly、将第93位的Val取代成Thr、将第97位的Ala取代成Thr以及将第117位的Thr取代成Val。
作为上述VH的氨基酸序列，具体而言，可以列举例如下述导入有1~7个修饰的氨基酸序列。
作为导入有7个修饰的VH的氨基酸序列，具体而言，可以列举例如：将序列号96表示的氨基酸序列中的第30位的Ser取代成Asn、将第48位的Val取代成Ile、将第49位的Ser取代成Ala、将第77位的Asn取代成Gly、将第93位的Val取代成Thr、将第97位的Ala取代成Thr并且将第117位的Thr取代成Val的氨基酸序列。
作为导入有6个修饰的VH的氨基酸序列，具体而言，可以列举例如下述(1)~(7)的氨基酸序列。
(1)将序列号96表示的氨基酸序列中的第30位的Ser取代成Asn、将第48位的Val取代成Ile、将第49位的Ser取代成Ala、将第77位的Asn取代成Gly、将第93位的Val取代成Thr并且将第97位的Ala取代成Thr的氨基酸序列
(2)将序列号96表示的氨基酸序列中的第30位的Ser取代成Asn、将第48位的Val取代成Ile、将第49位的Ser取代成Ala、将第77位的Asn取代成Gly、将第93位的Val取代成Thr并且将第117位的Thr取代成Val的氨基酸序列
(3)将序列号96表示的氨基酸序列中的第30位的Ser取代成Asn、将第48位的Val取代成Ile、将第49位的Ser取代成Ala、将第77位的Asn取代成Gly、将第97位的Ala取代成Thr并且将第117位的Thr取代成Val的氨基酸序列
(4)将序列号96表示的氨基酸序列中的第30位的Ser取代成Asn、将第48位的Val取代成Ile、将第49位的Ser取代成Ala、将第93位的Val取代成Thr、将第97位的Ala取代成Thr并且将第117位的Thr取代成Val的氨基酸序列
(5)将序列号96表示的氨基酸序列中的第30位的Ser取代成Asn、将第48位的Val取代成Ile、将第77位的Asn取代成Gly、将第93位的Val取代成Thr、将第97位的Ala取代成Thr并且将第117位的Thr取代成Val的氨基酸序列
(6)将序列号96表示的氨基酸序列中的第30位的Ser取代成Asn、将第49位的Ser取代成Ala、将第77位的Asn取代成Gly、将第93位的Val取代成Thr、将第97位的Ala取代成Thr并且将第117位的Thr取代成Val的氨基酸序列
(7)将序列号96表示的氨基酸序列中的第48位的Val取代成Ile、将第49位的Ser取代成Ala、将第77位的Asn取代成Gly、将第93位的Val取代成Thr、将第97位的Ala取代成Thr并且将第117位的Thr取代成Val的氨基酸序列
作为导入有5个修饰的VH的氨基酸序列，具体而言，可以列举例如下述(1)~(21)的氨基酸序列。
(1)将序列号96表示的氨基酸序列中的第49位的Ser取代成Ala、将第77位的Asn取代成Gly、将第93位的Val取代成Thr、将第97位的Ala取代成Thr并且将第117位的Thr取代成Val的氨基酸序列
(2)将序列号96表示的氨基酸序列中的第48位的Val取代成Ile、将第77位的Asn取代成Gly、将第93位的Val取代成Thr、将第97位的Ala取代成Thr并且将第117位的Thr取代成Val的氨基酸序列
(3)将序列号96表示的氨基酸序列中的第48位的Val取代成Ile、将第49位的Ser取代成Ala、将第93位的Val取代成Thr、将第97位的Ala取代成Thr并且将第117位的Thr取代成Val的氨基酸序列
(4)将序列号96表示的氨基酸序列中的第48位的Val取代成Ile、将第49位的Ser取代成Ala、将第77位的Asn取代成Gly、将第97位的Ala取代成Thr并且将第117位的Thr取代成Val的氨基酸序列
(5)将序列号96表示的氨基酸序列中的第48位的Val取代成Ile、将第49位的Ser取代成Ala、将第77位的Asn取代成Gly、将第93位的Val取代成Thr并且将第117位的Thr取代成Val的氨基酸序列
(6)将序列号96表示的氨基酸序列中的第48位的Val取代成Ile、将第49位的Ser取代成Ala、将第77位的Asn取代成Gly、将第93位的Val取代成Thr并且将第97位的Ala取代成Thr的氨基酸序列
(7)将序列号96表示的氨基酸序列中的第30位的Ser取代成Asn、将第77位的Asn取代成Gly、将第93位的Val取代成Thr、将第97位的Ala取代成Thr并且将第117位的Thr取代成Val的氨基酸序列
(8)将序列号96表示的氨基酸序列中的第30位的Ser取代成Asn、将第49位的Ser取代成Ala、将第93位的Val取代成Thr、将第97位的Ala取代成Thr并且将第117位的Thr取代成Val的氨基酸序列
(9)将序列号96表示的氨基酸序列中的第30位的Ser取代成Asn、将第49位的Ser取代成Ala、将第77位的Asn取代成Gly、将第97位的Ala取代成Thr并且将第117位的Thr取代成Val的氨基酸序列
(10)将序列号96表示的氨基酸序列中的第30位的Ser取代成Asn、将第49位的Ser取代成Ala、将第77位的Asn取代成Gly、将第93位的Val取代成Thr并且将第117位的Thr取代成Val的氨基酸序列
(11)将序列号96表示的氨基酸序列中的第30位的Ser取代成Asn、将第49位的Ser取代成Ala、将第77位的Asn取代成Gly、将第93位的Val取代成Thr并且将第97位的Ala取代成Thr的氨基酸序列
(12)将序列号96表示的氨基酸序列中的第30位的Ser取代成Asn、将第48位的Val取代成Ile、将第93位的Val取代成Thr、将第97位的Ala取代成Thr并且将第117位的Thr取代成Val的氨基酸序列
(13)将序列号96表示的氨基酸序列中的第30位的Ser取代成Asn、将第48位的Val取代成Ile、将第77位的Asn取代成Gly、将第97位的Ala取代成Thr并且将第117位的Thr取代成Val的氨基酸序列
(14)将序列号96表示的氨基酸序列中的第30位的Ser取代成Asn、将第48位的Val取代成Ile、将第77位的Asn取代成Gly、将第93位的Val取代成Thr并且将第117位的Thr取代成Val的氨基酸序列
(15)将序列号96表示的氨基酸序列中的第30位的Ser取代成Asn、将第48位的Val取代成Ile、将第77位的Asn取代成Gly、将第93位的Val取代成Thr并且将第97位的Ala取代成Thr的氨基酸序列
(16)将序列号96表示的氨基酸序列中的第30位的Ser取代成Asn、将第48位的Val取代成Ile、将第49位的Ser取代成Ala、将第97位的Ala取代成Thr并且将第117位的Thr取代成Val的氨基酸序列
(17)将序列号96表示的氨基酸序列中的第30位的Ser取代成Asn、将第48位的Val取代成Ile、将第49位的Ser取代成Ala、将第93位的Val取代成Thr并且将第117位的Thr取代成Val的氨基酸序列
(18)将序列号96表示的氨基酸序列中的第30位的Ser取代成Asn、将第48位的Val取代成Ile、将第49位的Ser取代成Ala、将第93位的Val取代成Thr并且将第97位的Ala取代成Thr的氨基酸序列
(19)将序列号96表示的氨基酸序列中的第30位的Ser取代成Asn、将第48位的Val取代成Ile、将第49位的Ser取代成Ala、将第77位的Asn取代成Gly并且将第117位的Thr取代成Val的氨基酸序列
(20)将序列号96表示的氨基酸序列中的第30位的Ser取代成Asn、将第48位的Val取代成Ile、将第49位的Ser取代成Ala、将第77位的Asn取代成Gly并且将第97位的Ala取代成Thr的氨基酸序列
(21)将序列号96表示的氨基酸序列中的第30位的Ser取代成Asn、将第48位的Val取代成Ile、将第49位的Ser取代成Ala、将第77位的Asn取代成Gly并且将第93位的Val取代成Thr的氨基酸序列
作为导入有4个修饰的VH的氨基酸序列，具体而言，可以列举例如下述(1)~(35)的氨基酸序列。
(1)将序列号96表示的氨基酸序列中的第77位的Asn取代成Gly、将第93位的Val取代成Thr、将第97位的Ala取代成Thr并且将第117位的Thr取代成Val的氨基酸序列
(2)将序列号96表示的氨基酸序列中的第49位的Ser取代成Ala、将第93位的Val取代成Thr、将第97位的Ala取代成Thr并且将第117位的Thr取代成Val的氨基酸序列
(3)将序列号96表示的氨基酸序列中的第49位的Ser取代成Ala、将第77位的Asn取代成Gly、将第97位的Ala取代成Thr并且将第117位的Thr取代成Val的氨基酸序列
(4)将序列号96表示的氨基酸序列中的第49位的Ser取代成Ala、将第77位的Asn取代成Gly、将第93位的Val取代成Thr并且将第117位的Thr取代成Val的氨基酸序列
(5)将序列号96表示的氨基酸序列中的第49位的Ser取代成Ala、将第77位的Asn取代成Gly、将第93位的Val取代成Thr并且将第97位的Ala取代成Thr的氨基酸序列
(6)将序列号96表示的氨基酸序列中的第48位的Val取代成Ile、将第93位的Val取代成Thr、将第97位的Ala取代成Thr并且将第117位的Thr取代成Val的氨基酸序列
(7)将序列号96表示的氨基酸序列中的第48位的Val取代成Ile、将第77位的Asn取代成Gly、将第97位的Ala取代成Thr并且将第117位的Thr取代成Val的氨基酸序列
(8)将序列号96表示的氨基酸序列中的第48位的Val取代成Ile、将第77位的Asn取代成Gly、将第93位的Val取代成Thr并且将第117位的Thr取代成Val的氨基酸序列
(9)将序列号96表示的氨基酸序列中的第48位的Val取代成Ile、将第77位的Asn取代成Gly、将第93位的Val取代成Thr并且将第97位的Ala取代成Thr的氨基酸序列
(10)将序列号96表示的氨基酸序列中的第48位的Val取代成Ile、将第49位的Ser取代成Ala、将第97位的Ala取代成Thr并且将第117位的Thr取代成Val的氨基酸序列
(11)将序列号96表示的氨基酸序列中的第48位的Val取代成Ile、将第49位的Ser取代成Ala、将第93位的Val取代成Thr并且将第117位的Thr取代成Val的氨基酸序列
(12)将序列号96表示的氨基酸序列中的第48位的Val取代成Ile、将第49位的Ser取代成Ala、将第93位的Val取代成Thr并且将第97位的Ala取代成Thr的氨基酸序列
(13)将序列号96表示的氨基酸序列中的第48位的Val取代成Ile、将第49位的Ser取代成Ala、将第77位的Asn取代成Gly并且将第117位的Thr取代成Val的氨基酸序列
(14)将序列号96表示的氨基酸序列中的第48位的Val取代成Ile、将第49位的Ser取代成Ala、将第77位的Asn取代成Gly并且将第97位的Ala取代成Thr的氨基酸序列
(15)将序列号96表示的氨基酸序列中的第48位的Val取代成Ile、将第49位的Ser取代成Ala、将第77位的Asn取代成Gly并且将第93位的Val取代成Thr的氨基酸序列
(16)将序列号96表示的氨基酸序列中的第30位的Ser取代成Asn、将第93位的Val取代成Thr、将第97位的Ala取代成Thr并且将第117位的Thr取代成Val的氨基酸序列
(17)将序列号96表示的氨基酸序列中的第30位的Ser取代成Asn、将第77位的Asn取代成Gly、将第97位的Ala取代成Thr并且将第117位的Thr取代成Val的氨基酸序列
(18)将序列号96表示的氨基酸序列中的第30位的Ser取代成Asn、将第77位的Asn取代成Gly、将第93位的Val取代成Thr并且将第117位的Thr取代成Val的氨基酸序列
(19)将序列号96表示的氨基酸序列中的第30位的Ser取代成Asn、将第77位的Asn取代成Gly、将第93位的Val取代成Thr并且将第97位的Ala取代成Thr的氨基酸序列
(20)将序列号96表示的氨基酸序列中的第30位的Ser取代成Asn、将第49位的Ser取代成Ala、将第97位的Ala取代成Thr并且将第117位的Thr取代成Val的氨基酸序列
(21)将序列号96表示的氨基酸序列中的第30位的Ser取代成Asn、将第49位的Ser取代成Ala、将第93位的Val取代成Thr并且将第117位的Thr取代成Val的氨基酸序列
(22)将序列号96表示的氨基酸序列中的第30位的Ser取代成Asn、将第49位的Ser取代成Ala、将第93位的Val取代成Thr并且将第97位的Ala取代成Thr的氨基酸序列
(23)将序列号96表示的氨基酸序列中的第30位的Ser取代成Asn、将第49位的Ser取代成Ala、将第77位的Asn取代成Gly并且将第117位的Thr取代成Val的氨基酸序列
(24)将序列号96表示的氨基酸序列中的第30位的Ser取代成Asn、将第49位的Ser取代成Ala、将第77位的Asn取代成Gly并且将第97位的Ala取代成Thr的氨基酸序列
(25)将序列号96表示的氨基酸序列中的第30位的Ser取代成Asn、将第49位的Ser取代成Ala、将第77位的Asn取代成Gly并且将第93位的Val取代成Thr的氨基酸序列
(26)将序列号96表示的氨基酸序列中的第30位的Ser取代成Asn、将第48位的Val取代成Ile、将第97位的Ala取代成Thr并且将第117位的Thr取代成Val的氨基酸序列
(27)将序列号96表示的氨基酸序列中的第30位的Ser取代成Asn、将第48位的Val取代成Ile、将第93位的Val取代成Thr并且将第117位的Thr取代成Val的氨基酸序列
(28)将序列号96表示的氨基酸序列中的第30位的Ser取代成Asn、将第48位的Val取代成Ile、将第93位的Val取代成Thr并且将第97位的Ala取代成Thr的氨基酸序列
(29)将序列号96表示的氨基酸序列中的第30位的Ser取代成Asn、将第48位的Val取代成Ile、将第77位的Asn取代成Gly并且将第117位的Thr取代成Val的氨基酸序列
(30)将序列号96表示的氨基酸序列中的第30位的Ser取代成Asn、将第48位的Val取代成Ile、将第77位的Asn取代成Gly并且将第97位的Ala取代成Thr的氨基酸序列
(31)将序列号96表示的氨基酸序列中的第30位的Ser取代成Asn、将第48位的Val取代成Ile、将第77位的Asn取代成Gly并且将第93位的Val取代成Thr的氨基酸序列
(32)将序列号96表示的氨基酸序列中的第30位的Ser取代成Asn、将第48位的Val取代成Ile、将第49位的Ser取代成Ala并且将第117位的Thr取代成Val的氨基酸序列
(33)将序列号96表示的氨基酸序列中的第30位的Ser取代成Asn、将第48位的Val取代成Ile、将第49位的Ser取代成Ala并且将第97位的Ala取代成Thr的氨基酸序列
(34)将序列号96表示的氨基酸序列中的第30位的Ser取代成Asn、将第48位的Val取代成Ile、将第49位的Ser取代成Ala并且将第93位的Val取代成Thr的氨基酸序列
(35)将序列号96表示的氨基酸序列中的第30位的Ser取代成Asn、将第48位的Val取代成Ile、将第49位的Ser取代成Ala并且将第77位的Asn取代成Gly的氨基酸序列
作为导入有3个修饰的VH的氨基酸序列，具体而言，可以列举例如下述(1)~(35)的氨基酸序列。
(1)将序列号96表示的氨基酸序列中的第30位的Ser取代成Asn、将第48位的Val取代成Ile并且将第49位的Ser取代成Ala的氨基酸序列
(2)将序列号96表示的氨基酸序列中的第30位的Ser取代成Asn、将第48位的Val取代成Ile并且将第77位的Asn取代成Gly的氨基酸序列
(3)将序列号96表示的氨基酸序列中的第30位的Ser取代成Asn、将第48位的Val取代成Ile并且将第93位的Val取代成Thr的氨基酸序列
(4)将序列号96表示的氨基酸序列中的第30位的Ser取代成Asn、将第48位的Val取代成Ile并且将第97位的Ala取代成Thr的氨基酸序列
(5)将序列号96表示的氨基酸序列中的第30位的Ser取代成Asn、将第48位的Val取代成Ile并且将第117位的Thr取代成Val的氨基酸序列
(6)将序列号96表示的氨基酸序列中的第30位的Ser取代成Asn、将第49位的Ser取代成Ala并且将第77位的Asn取代成Gly的氨基酸序列
(7)将序列号96表示的氨基酸序列中的第30位的Ser取代成Asn、将第49位的Ser取代成Ala并且将第93位的Val取代成Thr的氨基酸序列
(8)将序列号96表示的氨基酸序列中的第30位的Ser取代成Asn、将第49位的Ser取代成Ala并且将第97位的Ala取代成Thr的氨基酸序列
(9)将序列号96表示的氨基酸序列中的第30位的Ser取代成Asn、将第49位的Ser取代成Ala并且将第117位的Thr取代成Val的氨基酸序列
(10)将序列号96表示的氨基酸序列中的第30位的Ser取代成Asn、将第77位的Asn取代成Gly并且将第93位的Val取代成Thr的氨基酸序列
(11)将序列号96表示的氨基酸序列中的第30位的Ser取代成Asn、将第77位的Asn取代成Gly并且将第97位的Ala取代成Thr的氨基酸序列
(12)将序列号96表示的氨基酸序列中的第30位的Ser取代成Asn、将第77位的Asn取代成Gly并且将第117位的Thr取代成Val的氨基酸序列
(13)将序列号96表示的氨基酸序列中的第30位的Ser取代成Asn、将第93位的Val取代成Thr并且将第97位的Ala取代成Thr的氨基酸序列
(14)将序列号96表示的氨基酸序列中的第30位的Ser取代成Asn、将第93位的Val取代成Thr并且将第117位的Thr取代成Val的氨基酸序列
(15)将序列号96表示的氨基酸序列中的第30位的Ser取代成Asn、将第97位的Ala取代成Thr并且将第117位的Thr取代成Val的氨基酸序列
(16)将序列号96表示的氨基酸序列中的第48位的Val取代成Ile、将第49位的Ser取代成Ala并且将第77位的Asn取代成Gly的氨基酸序列
(17)将序列号96表示的氨基酸序列中的第48位的Val取代成Ile、将第49位的Ser取代成Ala并且将第93位的Val取代成Thr的氨基酸序列
(18)将序列号96表示的氨基酸序列中的第48位的Val取代成Ile、将第49位的Ser取代成Ala并且将第97位的Ala取代成Thr的氨基酸序列
(19)将序列号96表示的氨基酸序列中的第48位的Val取代成Ile、将第49位的Ser取代成Ala并且将第117位的Thr取代成Val的氨基酸序列
(20)将序列号96表示的氨基酸序列中的第48位的Val取代成Ile、将第77位的Asn取代成Gly并且将第93位的Val取代成Thr的氨基酸序列
(21)将序列号96表示的氨基酸序列中的第48位的Val取代成Ile、将第77位的Asn取代成Gly并且将第97位的Ala取代成Thr的氨基酸序列
(22)将序列号96表示的氨基酸序列中的第48位的Val取代成Ile、将第77位的Asn取代成Gly并且将第117位的Thr取代成Val的氨基酸序列
(23)将序列号96表示的氨基酸序列中的第48位的Val取代成Ile、将第93位的Val取代成Thr并且将第97位的Ala取代成Thr的氨基酸序列
(24)将序列号96表示的氨基酸序列中的第48位的Val取代成Ile、将第93位的Val取代成Thr并且将第117位的Thr取代成Val的氨基酸序列
(25)将序列号96表示的氨基酸序列中的第48位的Val取代成Ile、将第97位的Ala取代成Thr并且将第117位的Thr取代成Val的氨基酸序列
(26)将序列号96表示的氨基酸序列中的第49位的Ser取代成Ala、将第77位的Asn取代成Gly并且将第93位的Val取代成Thr的氨基酸序列
(27)将序列号96表示的氨基酸序列中的第49位的Ser取代成Ala、将第77位的Asn取代成Gly并且将第97位的Ala取代成Thr的氨基酸序列
(28)将序列号96表示的氨基酸序列中的第49位的Ser取代成Ala、将第77位的Asn取代成Gly并且将第117位的Thr取代成Val的氨基酸序列
(29)将序列号96表示的氨基酸序列中的第49位的Ser取代成Ala、将第93位的Val取代成Thr并且将第97位的Ala取代成Thr的氨基酸序列
(30)将序列号96表示的氨基酸序列中的第49位的Ser取代成Ala、将第93位的Val取代成Thr并且将第117位的Thr取代成Val的氨基酸序列
(31)将序列号96表示的氨基酸序列中的第49位的Ser取代成Ala、将第97位的Ala取代成Thr并且将第117位的Thr取代成Val的氨基酸序列
(32)将序列号96表示的氨基酸序列中的第77位的Asn取代成Gly、将第93位的Val取代成Thr并且将第97位的Ala取代成Thr的氨基酸序列
(33)将序列号96表示的氨基酸序列中的第77位的Asn取代成Gly、将第93位的Val取代成Thr并且将第117位的Thr取代成Val的氨基酸序列
(34)将序列号96表示的氨基酸序列中的第77位的Asn取代成Gly、将第97位的Ala取代成Thr并且将第117位的Thr取代成Val的氨基酸序列
(35)将序列号96表示的氨基酸序列中的第93位的Val取代成Thr、将第97位的Ala取代成Thr并且将第117位的Thr取代成Val的氨基酸序列
作为导入有2个修饰的VH的氨基酸序列，具体而言，可以列举例如下述(1)~(21)的氨基酸序列。
(1)将序列号96表示的氨基酸序列中的第30位的Ser取代成Asn并且将第48位的Val取代成Ile的氨基酸序列
(2)将序列号96表示的氨基酸序列中的第30位的Ser取代成Asn并且将第49位的Ser取代成Ala的氨基酸序列
(3)将序列号96表示的氨基酸序列中的第30位的Ser取代成Asn并且将第77位的Asn取代成Gly的氨基酸序列
(4)将序列号96表示的氨基酸序列中的第30位的Ser取代成Asn并且将第93位的Val取代成Thr的氨基酸序列
(5)将序列号96表示的氨基酸序列中的第30位的Ser取代成Asn并且将第97位的Ala取代成Thr的氨基酸序列
(6)将序列号96表示的氨基酸序列中的第30位的Ser取代成Asn并且将第117位的Thr取代成Val的氨基酸序列
(7)将序列号96表示的氨基酸序列中的第48位的Val取代成Ile并且将第49位的Ser取代成Ala的氨基酸序列
(8)将序列号96表示的氨基酸序列中的第48位的Val取代成Ile并且将第77位的Asn取代成Gly的氨基酸序列
(9)将序列号96表示的氨基酸序列中的第48位的Val取代成Ile并且将第93位的Val取代成Thr的氨基酸序列
(10)将序列号96表示的氨基酸序列中的第48位的Val取代成Ile并且将第97位的Ala取代成Thr的氨基酸序列
(11)将序列号96表示的氨基酸序列中的第48位的Val取代成Ile并且将第117位的Thr取代成Val的氨基酸序列
(12)将序列号96表示的氨基酸序列中的第49位的Ser取代成Ala并且将第77位的Asn取代成Gly的氨基酸序列
(13)将序列号96表示的氨基酸序列中的第49位的Ser取代成Ala并且将第93位的Val取代成Thr的氨基酸序列
(14)将序列号96表示的氨基酸序列中的第49位的Ser取代成Ala并且将第97位的Ala取代成Thr的氨基酸序列
(15)将序列号96表示的氨基酸序列中的第49位的Ser取代成Ala并且将第117位的Thr取代成Val的氨基酸序列
(16)将序列号96表示的氨基酸序列中的第77位的Asn取代成Gly并且将第93位的Val取代成Thr的氨基酸序列
(17)将序列号96表示的氨基酸序列中的第77位的Asn取代成Gly并且将第97位的Ala取代成Thr的氨基酸序列
(18)将序列号96表示的氨基酸序列中的第77位的Asn取代成Gly并且将第117位的Thr取代成Val的氨基酸序列
(19)将序列号96表示的氨基酸序列中的第93位的Val取代成Thr并且将第97位的Ala取代成Thr的氨基酸序列
(20)将序列号96表示的氨基酸序列中的第93位的Val取代成Thr并且将第117位的Thr取代成Val的氨基酸序列
(21)将序列号96表示的氨基酸序列中的第97位的Ala取代成Thr并且将第117位的Thr取代成Val的氨基酸序列
作为导入有1个修饰的VH的氨基酸序列，具体而言，可以列举例如下述(1)~(7)的氨基酸序列。
(1)将序列号96表示的氨基酸序列中的第30位的Ser取代成Asn的氨基酸序列
(2)将序列号96表示的氨基酸序列中的第48位的Val取代成Ile的氨基酸序列
(3)将序列号96表示的氨基酸序列中的第49位的Ser取代成Ala的氨基酸序列
(4)将序列号96表示的氨基酸序列中的第77位的Asn取代成Gly的氨基酸序列
(5)将序列号96表示的氨基酸序列中的第93位的Val取代成Thr的氨基酸序列
(6)将序列号96表示的氨基酸序列中的第97位的Ala取代成Thr的氨基酸序列
(7)将序列号96表示的氨基酸序列中的第117位的Thr取代成Val的氨基酸序列
作为更具体的本发明的人源化抗体的VH的氨基酸序列，可以列举序列号96、105和107表示的氨基酸序列。
作为本发明的人源化抗体所含的VL，可以列举例如包含序列号97表示的氨基酸序列中的第21位的Ile、第40位的Pro、第58位的Val、第85位的Thr和第87位的Tyr被其他氨基酸残基取代的氨基酸序列的VL。
其中，作为本发明的人源化抗体所含的VL，优选序列号97表示的氨基酸序列中的第40位的Pro、第58位的Val和第87位的Tyr被其他氨基酸残基取代的氨基酸序列。
作为上述VL的氨基酸序列，可以列举例如导入有选自下述修饰中的至少一个修饰的氨基酸序列：将序列号97表示的氨基酸序列中的第21位的Ile取代成Leu、将第40位的Pro取代成Leu、将第58位的Val取代成Ile、将第85位的Thr取代成Ala以及将第87位的Tyr取代成Phe。
作为上述VL的氨基酸序列，具体而言，可以列举例如下述导入有1~5个修饰的氨基酸序列。
作为导入有5个修饰的VL的氨基酸序列，具体而言，可以列举例如将序列号97表示的氨基酸序列中的第21位的Ile取代成Leu、将第40位的Pro取代成Leu、将第58位的Val取代成Ile、将第85位的Thr取代成Ala并且将第87位的Tyr取代成Phe的氨基酸序列等。
作为导入有4个修饰的VL的氨基酸序列，具体而言，可以列举例如下述(1)~(5)的氨基酸序列。
(1)将序列号97表示的氨基酸序列中的第40位的Pro取代成Leu、将第58位的Val取代成Ile、将第85位的Thr取代成Ala并且将第87位的Tyr取代成Phe的氨基酸序列
(2)将序列号97表示的氨基酸序列中的第21位的Ile取代成Leu、将第58位的Val取代成Ile、将第85位的Thr取代成Ala并且将第87位的Tyr取代成Phe的氨基酸序列
(3)将序列号97表示的氨基酸序列中的第21位的Ile取代成Leu、将第40位的Pro取代成Leu、将第85位的Thr取代成Ala并且将第87位的Tyr取代成Phe的氨基酸序列
(4)将序列号97表示的氨基酸序列中的第21位的Ile取代成Leu、将第40位的Pro取代成Leu、将第58位的Val取代成Ile并且将第87位的Tyr取代成Phe的氨基酸序列
(5)将序列号97表示的氨基酸序列中的第21位的Ile取代成Leu、将第40位的Pro取代成Leu、将第58位的Val取代成Ile并且将第85位的Thr取代成Ala的氨基酸序列
作为导入有3个修饰的VL的氨基酸序列，具体而言，可以列举例如下述(1)~(9)的氨基酸序列。
(1)将序列号97表示的氨基酸序列中的第21位的Ile取代成Leu、将第40位的Pro取代成Leu并且将第58位的Val取代成Ile的氨基酸序列
(2)将序列号97表示的氨基酸序列中的第21位的Ile取代成Leu、将第40位的Pro取代成Leu并且将第85位的Thr取代成Ala的氨基酸序列
(3)将序列号97表示的氨基酸序列中的第21位的Ile取代成Leu、将第40位的Pro取代成Leu并且将第87位的Tyr取代成Phe的氨基酸序列
(4)将序列号97表示的氨基酸序列中的第21位的Ile取代成Leu、将第58位的Val取代成Ile并且将第85位的Thr取代成Ala的氨基酸序列
(5)将序列号97表示的氨基酸序列中的第21位的Ile取代成Leu、将第58位的Val取代成Ile并且将第87位的Tyr取代成Phe的氨基酸序列
(6)将序列号97表示的氨基酸序列中的第21位的Ile取代成Leu、将第85位的Thr取代成Ala并且将第87位的Tyr取代成Phe的氨基酸序列
(7)将序列号97表示的氨基酸序列中的第40位的Pro取代成Leu、将第58位的Val取代成Ile并且将第85位的Thr取代成Ala的氨基酸序列
(8)将序列号97表示的氨基酸序列中的第40位的Pro取代成Leu、将第58位的Val取代成Ile并且将第87位的Tyr取代成Phe的氨基酸序列
(9)将序列号97表示的氨基酸序列中的第58位的Val取代成Ile、将第85位的Thr取代成Ala并且将第87位的Tyr取代成Phe的氨基酸序列
作为导入有2个修饰的VL的氨基酸序列，具体而言，可以列举例如下述(1)~(10)的氨基酸序列。
(1)将序列号97表示的氨基酸序列中的第21位的Ile取代成Leu并且将第40位的Pro取代成Leu的氨基酸序列
(2)将序列号97表示的氨基酸序列中的第21位的Ile取代成Leu并且将第58位的Val取代成Ile的氨基酸序列
(3)将序列号97表示的氨基酸序列中的第21位的Ile取代成Leu并且将第85位的Thr取代成Ala的氨基酸序列
(4)将序列号97表示的氨基酸序列中的第21位的Ile取代成Leu并且将第87位的Tyr取代成Phe的氨基酸序列
(5)将序列号97表示的氨基酸序列中的第40位的Pro取代成Leu并且将第58位的Val取代成Ile的氨基酸序列
(6)将序列号97表示的氨基酸序列中的第40位的Pro取代成Leu并且将第85位的Thr取代成Ala的氨基酸序列
(7)将序列号97表示的氨基酸序列中的第40位的Pro取代成Leu并且将第87位的Tyr取代成Phe的氨基酸序列
(8)将序列号97表示的氨基酸序列中的第58位的Val取代成Ile并且将第85位的Thr取代成Ala的氨基酸序列
(9)将序列号97表示的氨基酸序列中的第58位的Val取代成Ile并且将第87位的Tyr取代成Phe的氨基酸序列
(10)将序列号97表示的氨基酸序列中的第85位的Thr取代成Ala并且将第87位的Tyr取代成Phe的氨基酸序列
作为导入有1个修饰的VL的氨基酸序列，具体而言，可以列举：将序列号97表示的氨基酸序列中的第21位的Ile取代成Leu的氨基酸序列、将第40位的Pro取代成Leu的氨基酸序列、将第58位的Val取代成Ile的氨基酸序列、将第85位的Thr取代成Ala的氨基酸序列以及将第87位的Tyr取代成Phe的氨基酸序列。
作为更具体的本发明的人源化抗体的VL，可以列举序列号97表示的氨基酸序列。
另外，作为本发明的人源化抗体的具体例，可以列举下述(1)~(5)的抗体。
(1)含有包含序列号96表示的氨基酸序列的可变区的H链和包含序列号97表示的氨基酸序列的可变区的L链中的至少一者的人源化抗体
(2)含有包含序列号101表示的氨基酸序列的可变区的H链和包含序列号97表示的氨基酸序列的可变区的L链中的至少一者的人源化抗体
(3)含有包含序列号103表示的氨基酸序列的可变区的H链和包含序列号97表示的氨基酸序列的可变区的L链中的至少一者的人源化抗体
(4)含有包含序列号105表示的氨基酸序列的可变区的H链和包含序列号97表示的氨基酸序列的可变区的L链中的至少一者的人源化抗体
(5)含有包含序列号107表示的氨基酸序列的可变区的H链和包含序列号97表示的氨基酸序列的可变区的L链中的至少一者的人源化抗体
人抗体原本是指人体中内源性存在的抗体，也包括从利用最近的基因工程、细胞工程、发育工程的技术进步而制作的人抗体噬菌体文库和产生人抗体的转基因动物中得到的抗体等。
作为人体中内源性存在的抗体，例如可以如下获得：分离出人末梢血淋巴细胞，使其感染EB病毒等而永生化，并进行克隆，由此可以培养产生该抗体的淋巴细胞，并可以从培养上清中纯化出该抗体。
人抗体噬菌体文库是通过将由人B细胞制备的抗体基因插入到噬菌体基因中而使Fab、scFv等抗体片段在噬菌体表面进行表达而得到的文库。可以以抗体片段对固定有抗原的底物的结合活性为指标，从该文库中回收在表面表达具有期望的抗原结合活性的抗体片段的噬菌体。该抗体片段还可以进一步通过基因工程方法转变为包含两条完整的H链和L链的人抗体分子。
产生人抗体的转基因动物是指细胞内重组有人抗体基因的动物。具体而言，例如，向小鼠ES细胞中导入人抗体基因，将该ES细胞移植入小鼠的早期胚胎中，然后使其发育，由此可以制作产生人抗体的转基因小鼠。
由产生人抗体的转基因动物制作人抗体的方法中，通过通常的在人以外的动物中实施的杂交瘤制作方法获取产生人抗体的杂交瘤并进行培养，由此，可以在培养上清中产生并蓄积人抗体。
在构成上述抗体或抗体片段的氨基酸序列中缺失、添加、取代或插入一个以上的氨基酸并且具有与上述抗体或其抗体片段相同的活性的抗体或其抗体片段也包括在本发明的抗体或其抗体片段中。
缺失、取代、插入和/或添加的氨基酸数为一个以上，其数量没有特别限定，为利用分子克隆第二版、最新分子生物学实验方法、NucleicAcids Research,10,6487(1982)、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,79,6409(1982)、Gene,34,315(1985)、Nucleic Acids Research,13,4431(1985)、Proc.Natl.Acad.Sci USA,82,488(1985)等中记载的定点诱变法等公知的技术能够缺失、取代或添加的程度的数量。例如为一个至数十个，优选为1~20个，更优选为1~10个，进一步优选为1~5个。
在上述抗体的氨基酸序列中缺失、取代、插入或添加一个以上的氨基酸残基表示如下含义。即，意味着在同一序列中的任意且一个或多个氨基酸序列中，存在一个或多个氨基酸残基的缺失、取代、插入和/或添加。另外，既存在同时发生缺失、取代、插入或添加的情况，也存在被取代、插入或添加的氨基酸残基为天然型和非天然型中的任意一种的情况。
作为天然型氨基酸残基，可以列举例如：L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸和L-半胱氨酸等。
以下示出可相互取代的氨基酸残基的优选例。同一组中所含的氨基酸残基可以相互取代。
A组：亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、缬氨酸、正缬氨酸、丙氨酸、2-氨基丁酸、蛋氨酸、O-甲基丝氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、环己基丙氨酸
B组：天冬氨酸、谷氨酸、异天冬氨酸、异谷氨酸、2-氨基己二酸、2-氨基辛二酸
C组：天冬酰胺、谷氨酰胺
D组：赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、2,4-二氨基丁酸、2,3-二氨基丙酸
E组：脯氨酸、3-羟基脯氨酸、4-羟基脯氨酸
F组：丝氨酸、苏氨酸、高丝氨酸
G组：苯丙氨酸、酪氨酸
作为本抗体的效应活性，可以列举例如：ADCC活性、CDC活性、抗体依赖性吞噬活性(antibody dependent cellular phagocytosis，ADCP)和调理作用等，可以通过各种方法进行调控。
作为调控效应活性的方法，可以列举例如：对结合在抗体的Fc段上的糖链进行调控的方法、对抗体的Fc段的氨基酸残基进行氨基酸修饰的方法等。
作为对结合在抗体的Fc段上的糖链进行调控的方法，可以列举例如：通过将IgG抗体的第297位的糖链除去而降低ADCC、CDC活性的方法[Molecular Immunology,32,1311,(1995)，国际公开第2008/030564号]和使半乳糖与抗体的Fc段的结合减少而降低CDC活性的方法等。
另外，作为对结合在抗体的Fc段上的糖链进行调控的方法，可以列举例如如下方法：生产在IgG抗体的Fc段的第297位的天冬酰胺上结合的N连接型糖链中包含在糖链所结合的基部的N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)上未结合岩藻糖的糖链的抗体的方法(US7,214,775、US6,946,292)；生产包含结合有平分型(bisecting)GlcNAc的糖链的抗体的方法[Nature Biotechnology,17,176,(1999)]；生产具有结合有与非还原末端结合的半乳糖(Gal)的糖链的抗体的方法[Hum.Antibod.Hybridomas,5,143-151,(1994)]；等。
作为对抗体的Fc段的氨基酸残基进行氨基酸修饰的方法，可以列举例如如下方法：通过进行抗体的Fc段的氨基酸修饰来调控效应活性的方法(J.B.C.,277,26733-26740,2002、US6,737,056、US7,297,775、US2007/0020260、国际公开第2005/070963号)；以及通过进行抗体的Fc段的各亚类之间的结构域交换来调控效应活性的方法(国际公开第2007/011041号)等。
作为本发明的抗体片段，可以列举：Fab、Fab’、F(ab’)2、scFv、双价抗体和dsFv等。
作为本发明的抗体片段，可以列举：Fab、F(ab’)2、Fab’、scFv、双价抗体、dsFv和包含CDR的肽等。
Fab是将IgG用蛋白分解酶木瓜蛋白酶进行处理而得到的片段中(在H链的第224位的氨基酸残基处切断)、N末端侧约一半的H链与整个L链通过二硫键结合而成的分子量约为5万的具有抗原结合活性的抗体片段。
本发明的Fab可以通过将本发明的特异性识别糖链缺陷CD27蛋白且与该胞外域结合的单克隆抗体用蛋白分解酶木瓜蛋白酶进行处理而得到。或者，可以通过将编码该抗体的Fab的DNA插入到原核生物用表达载体或真核生物用表达载体中并将该载体导入原核生物或真核生物中使其进行表达来制造。
F(ab’)2是将IgG的铰链区的两个二硫键的下部用胃蛋白酶分解而得到的、两个Fab区在铰链部分结合而构成的、分子量约为10万的具有抗原结合活性的片段。
本发明的F(ab’)2可以通过将本发明的特异性识别糖链缺陷CD27蛋白且与该胞外域结合的单克隆抗体用蛋白分解酶胃蛋白酶进行处理而得到。或者，可以通过使下述Fab’以硫醚键结合或以二硫键结合来制作。
Fab’是将上述F(ab’)2的铰链区的二硫键切断而得到的分子量约为5万的具有抗原结合活性的抗体片段。
本发明的Fab’可以通过将本发明的特异性识别糖链缺陷CD27蛋白且与该胞外域结合的F(ab’)2用还原剂二硫苏糖醇进行处理而得到。或者，可以通过将编码该抗体的Fab’片段的DNA插入到原核生物用表达载体或真核生物用表达载体中并将该载体导入原核生物或真核生物中使其进行表达来制造。
scFv是使用适当的肽接头(以下记作P)将一条VH与一条VL连接而形成的VH-P-VL或VL-P-VH多肽，并且是具有抗原结合活性的抗体片段。
本发明的scFv可以通过如下方法制造：获取编码本发明的特异性识别糖链缺陷CD27蛋白且与该胞外域结合的单克隆抗体的VH和VL的cDNA，构建编码scFv的DNA，将该DNA插入到原核生物用表达载体或真核生物用表达载体中，并将该表达载体导入原核生物或真核生物中，由此进行表达。
双价抗体为scFv二聚体化而得到的抗体片段，并且是具有二价抗原结合活性的抗体片段。二价抗原结合活性可以相同，也可以使其中一者具有不同的抗原结合活性。
本发明的双价抗体可以通过如下方法制造：获取本发明的特异性识别糖链缺陷CD27蛋白且与该胞外域结合的单克隆抗体，以P的氨基酸序列长度为8个残基以下的方式构建编码scFv的DNA，将该DNA插入到原核生物用表达载体或真核生物用表达载体中，并将该表达载体导入原核生物或真核生物中，由此进行表达。
dsFv是指使VH和VL中各一个氨基酸残基取代为半胱氨酸残基的多肽借助该半胱氨酸残基之间的二硫键结合而得到的抗体片段。取代为半胱氨酸残基的氨基酸残基可以根据Reiter等人公开的方法[Protein Engineering,7,697(1994)]基于抗体的立体结构预测来进行选择。
本发明的dsFv可以通过如下方法制造：获取编码本发明的特异性识别糖链缺陷CD27蛋白且与该胞外域结合的单克隆抗体的VH和VL的cDNA，构建编码dsFv的DNA，将该DNA插入到原核生物用表达载体或真核生物用表达载体中，并将该表达载体导入原核生物或真核生物中，由此进行表达。
包含CDR的肽包含VH或VL的CDR中的至少一个区域以上而构成。包含多个CDR的肽可以直接进行结合或者借助肽接头而进行结合。
本发明的包含CDR的肽可以通过如下方法制造：构建编码本发明的特异性识别糖链缺陷CD27蛋白且与该胞外域结合的单克隆抗体的VH和VL的CDR的DNA，将该DNA插入到原核生物用表达载体或真核生物用表达载体中，并将该表达载体导入原核生物或真核生物中，由此进行表达。
另外，包含CDR的肽也可以通过Fmoc法(芴甲氧羰基法)和tBoc法(叔丁氧羰基法)等化学合成法来制造。
本发明中包括：利用化学方法或基因工程方法在本发明的特异性识别糖链缺陷CD27蛋白且与该胞外域结合的单克隆抗体或抗体片段上结合药剂、蛋白质、放射性同位素等而得到的与抗体的结合物。
本发明的结合物通过利用化学方法[抗体工学入門(抗体工程入门)，金光修著，地人书馆(1994)]在本发明的特异性识别糖链缺陷CD27蛋白且与该胞外域结合的单克隆抗体或其抗体片段的H链或L链的N末端侧或C末端侧、抗体或其抗体片段中的适当的取代基或侧链以及抗体或其抗体片段中的糖链等上结合药剂、蛋白质、放射性同位素等来制造。
另外，也可以通过基因工程方法来制造，即，使编码本发明的特异性识别糖链缺陷CD27蛋白且与该胞外域结合的单克隆抗体或其抗体片段的DNA与编码要结合的蛋白质的DNA连接后插入表达载体中，并将该表达载体导入原核生物或真核生物的宿主细胞中。
作为药剂，可以列举例如：化疗剂、抗体药品、免疫刺激剂和高分子药剂等。
作为蛋白质，可以列举例如：细胞因子、增殖因子和毒蛋白等。
此外，与抗体或该抗体片段结合的药剂可以为前药的形式。本发明中的前药是指利用存在于肿瘤环境中的酶等进行化学修饰而转变为具有杀伤癌细胞的作用的物质的药剂。
作为化疗剂，例如包括烷化剂、亚硝基脲剂、代谢拮抗剂、抗癌性抗生素、植物来源的生物碱、拓扑异构酶抑制剂、激素疗法制剂、激素拮抗剂、芳香化酶抑制剂、P糖蛋白抑制剂、铂络合物衍生物、M期抑制剂和激酶抑制剂等任何的化疗剂。
作为化疗剂，可以列举例如：阿米福汀(氨磷汀)、顺铂、达卡巴嗪(DTIC)、更生霉素、二氯甲基二乙胺(氮芥)、链脲霉素、环磷酰胺、异环磷酰胺、卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)、多柔比星(阿霉素)、阿霉素脂质体(多喜)、表柔比星、吉西他滨(健择)、柔红霉素、柔红霉素脂质体(DaunoXome)、丙卡巴肼、丝裂霉素、阿糖胞苷、依托泊苷、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、氟尿嘧啶、长春碱、长春新碱、博来霉素、道诺霉素、培洛霉素、雌莫司汀、紫杉醇(泰素)、多西紫杉醇(多西他奇)、阿地白介素、天冬酰胺酶、白消安、卡铂、奥沙利铂、奈达铂、克拉屈滨、喜树碱、CPT-11、10-羟基-7-乙基-喜树碱(SN38)、5-氟脱氧尿苷、氟达拉滨、羟基脲、异环磷酰胺、伊达比星、美司那、依立替康、拓扑替康(ノギテカン)、米托蒽醌、托泊替康、亮丙瑞林、甲地孕酮、美法仑、巯基嘌呤、羟基脲、普卡霉素、密妥坦、培门冬酶、喷司他丁、哌泊溴烷、链脲霉素、他莫昔芬、戈舍瑞林、亮丙瑞林、氟他胺、替尼泊苷、睾内酯、硫鸟嘌呤、塞替派、乌拉莫司汀、长春瑞滨、苯丁酸氮芥、氢化可的松、泼尼松龙、甲基泼尼松龙、长春地辛、尼莫司汀、司莫司汀、卡培他滨、雷替曲塞、氮胞苷、UFT、奥沙利铂、吉非替尼(易瑞沙)、伊马替尼(STI571)、厄洛替尼、Flt3抑制剂、血管内皮生长因子受体(VEGFR)抑制剂、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)抑制剂、表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂(例如易瑞沙、特罗凯等)、根赤壳菌素、17-烯丙基氨基-17-去甲氧基格尔德霉素、雷帕霉素、安吖啶、全反式维甲酸、沙利度胺、阿那曲唑、法曲唑、来曲唑、依西美坦、硫代苹果酸金、D-青霉胺、布西拉明、硫唑嘌呤、咪唑立宾、环孢素、雷帕霉素、氢化可的松、蓓萨罗丁(例如塔革雷汀)、他莫昔芬、地寒米松、孕激素类、雌激素类、阿那曲唑(例如瑞宁德)、利普安、阿司匹林、吲哚美辛、塞来昔布、硫唑嘌呤、青霉胺、硫代苹果酸金、马来酸氯苯那敏、氯苯那敏、氯马斯汀、维甲酸、蓓萨罗丁、砷、硼替佐米、别嘌呤醇、吉妥单抗、替伊莫单抗、131托西莫单抗、塔革雷汀、奥唑米星、克拉霉素、瘤可维、异环磷酰胺、酮康唑、氨鲁米特、苏拉明、甲氨蝶呤和类美登醇(Maytansinoid)及其衍生物等。
作为使化疗剂与抗体结合的方法，可以列举例如：通过戊二醛使化疗剂与抗体的氨基之间结合的方法；以及通过水溶性碳二亚胺使化疗剂的氨基与抗体的羧基结合的方法等。
作为抗体药品，可以列举例如：对通过抗体的结合诱导凋亡的抗原、与肿瘤的病态形成相关的抗原或调节免疫功能的抗原、与病变部位的血管新生相关的抗原具有抗性的抗体。
作为通过抗体的结合诱导凋亡的抗原，可以列举例如：分化抗原(Cluster of differentiation，以下记作CD)19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD37、CD53、CD72、CD73、CD74、CDw75、CDw76、CD77、CDw78、CD79a、CD79b、CD80(B7.1)、CD81、CD82、CD83、CDw84、CD85、CD86(B7.2)、II类人类白细胞抗原(HLA)和EGFR等。
作为与肿瘤的病态形成相关的抗原或调节免疫功能的抗原，可以列举例如：CD4、CD40、CD40配体、B7家族分子(例如CD80、CD86、CD274、B7-DC、B7-H2、B7-H3和B7-H4等)、B7家族分子的配体(例如CD28、CTLA-4、ICOS、PD-1和BTLA等)、OX-40、OX-40配体、CD137、肿瘤坏死因子(TNF)受体家族分子(例如DR4、DR5、TNFR1和TNFR2等)、TNF相关的凋亡诱导配体受体(TRAIL)家族分子、TRAIL家族分子的受体家族(TRAIL-R1、TRAIL-R2、TRAIL-R3、TRAIL-R4)、核因子κB受体活化因子配体(RANK)、RANK配体、CD25、叶酸受体4、细胞因子[例如白细胞介素-1α(以下将白细胞介素记作IL)、IL-1β、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、转化生长因子(TGF)β和TNFα等]、上述细胞因子的受体、趋化因子(例如SLC、ELC、I-309、TARC、MDC和CTACK等)以及上述趋化因子的受体。
作为抑制病变部位的血管新生的抗体的抗原，可以列举例如：血管内皮生长因子(VEGF)、血管生成素、成纤维细胞生长因子(FGF)、EGF、血小板源性生长因子(PDGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、促红细胞生成素(EPO)、TGFβ、IL-8、Ephilin和SDF-1等以及它们的受体。
作为免疫刺激剂，可以是作为免疫佐剂已知的天然物，作为具体例，使免疫亢进的药剂可以列举：β-1,3-葡聚糖(例如香菇多糖和西佐糖等)、α-半乳糖神经酰胺(KRN7000)、菌体粉末(例如溶链菌和BCG等)、菌体提取物(例如云芝多糖等)。
作为高分子药剂，可以列举例如：聚乙二醇(以下记作PEG)、白蛋白、右旋糖酐、聚环氧乙烷、苯乙烯马来酸共聚物、聚乙烯吡咯烷酮、吡喃共聚物、羟丙基甲基丙烯酰胺等。
通过使这些高分子药剂与抗体或抗体片段结合，可以期待发挥如下效果：(1)提高对化学性、物理性或生物性的各种因素的稳定性；(2)显著延长血中半衰期；(3)抑制免疫原性消失并抑制抗体产生；等[バイオユンジユゲ一ト医薬品，广川书店(1993)]。
作为使PEG与抗体结合的方法，可以列举例如与PEG化修饰试剂进行反应的方法等[バイオユンジユゲ一ト医薬品，广川书店(1993)]。作为PEG化修饰试剂，可以列举例如：赖氨酸的ε-氨基的修饰剂(日本特开昭61-178926号公报)、天冬氨酸和谷氨酸的羧基的修饰剂(日本特开昭56-23587号公报)和精氨酸的胍基的修饰剂(日本特开平2-117920号公报)等。
作为细胞因子或增殖因子，只要是使NK细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞等细胞亢进的细胞因子或增殖因子则均可，可以列举例如：干扰素(以下记作IFN)-α、INF-β、INF-γ、IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)等。
作为毒蛋白，可以列举例如：蓖麻毒素、白喉毒素和ONTAK等，还包括为调节毒性而向蛋白质中引入突变而得到的蛋白毒素。
作为放射性同位素，可以列举例如：131I、125I、90Y、64Cu、199Tc、77Lu、211At、Re186、Re188和In111等。放射性同位素可以通过氯胺T法等直接与抗体进行结合。另外，也可以在抗体上结合用于螯合放射性同位素的物质。作为螯合剂，可以列举甲基苯基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)等。
本发明中，可以将本发明中使用的抗体与一种以上的其他药剂组合来施用，或者也可以与放射线照射组合。作为其他药剂，可以列举上述的化疗剂、抗体药品、免疫刺激剂、细胞因子或增殖因子等。
作为放射线照射，包括：X射线和γ射线等光子(电磁波)照射；电子束、质子束和重粒子束等粒子束照射等。
作为组合施用的方法，可以与本发明中使用的抗体同时施用，或者也可以在施用本发明中使用的抗体前后施用。
本发明的检测方法、定量方法、检测试剂、定量试剂或诊断剂中，可以列举将特定的标记物标记到本发明的抗体上来使用的方法。作为标记物，可以列举通常的免疫学检测或测定方法中使用的标记物，可以列举：碱性磷酸酶、过氧化物酶、荧光素酶等酶；吖啶
Figure BDA00002064662600571
酯、洛酚碱等发光物质；异硫氰酸荧光素(FITC)、三甲基罗丹明(RITC)等荧光物质；等。
以下，对本发明的抗体的制造方法进行具体说明。
1.单克隆抗体的制造方法
(1)抗原的制备
通过下述中记载的方法，将包含编码全长或部分长度CD27的cDNA的表达载体导入到在O连接型糖链合成过程中向多肽上的Ser/Thr上结合的GalNAc上附加Gal的酶、与该酶的活性相关的蛋白质或与UDP-半乳糖的转运相关的蛋白质等的活性降低或缺失的酵母、昆虫细胞、动物细胞等中，由此，能够得到作为抗原的糖链缺陷CD27或表达糖链缺陷CD27的细胞。
另外，也可以使用通过从在细胞膜上或培养液中大量表达糖链缺陷CD27的各种人来源的培养细胞、人组织等中纯化出糖链缺陷CD27来制备抗原的方法，或者，制备具有糖链缺陷CD27的部分序列的合成肽并作为抗原使用。此外，可以通过在试管内向使用不具有糖链附加能力的大肠杆菌等原核生物进行表达、纯化而得到的CD27上附加糖链来得到糖链缺陷CD27。
另外，通过以同样的方式向具有正常的O连接型糖链合成过程的酵母、昆虫细胞、动物细胞等宿主细胞中导入包含编码全长或部分长度CD27的cDNA的表达载体，可以获得表达具有正常O连接型糖链的CD27的细胞，并可以从该细胞中纯化出具有正常O连接型糖链的CD27蛋白。
如上得到的糖链缺陷CD27、具有正常O连接型糖链的CD27蛋白或表达细胞可以用于目标抗体的筛选、确认所获得的抗体对抗原的反应性。
作为本发明中使用的多肽，可以通过使用Molecular Cloning,ALaboratory Manual,第二版，冷泉港实验室出版社(1989)和CurrentProtocols IN Molecular Biology，约翰威立父子出版公司(1987-1997)等中记载的方法等使编码该多肽的DNA在宿主细胞中进行表达来制造。
例如，可以通过下述方法来制造。首先，将编码全长多肽的cDNA插入到适当的表达载体的启动子的下游，由此制作重组载体。此时若有需要，也可以基于全长cDNA来制备包含编码多肽的部分的适当长度的DNA片段，并使用该DNA片段来代替上述全长cDNA。接着，将该重组载体导入到适合于该表达载体的宿主细胞中，由此可以得到生产多肽的转化体。
作为宿主细胞，只要是大肠杆菌、酵母、昆虫细胞和动物细胞等具有附加O连接型糖链的能力并且能够表达目的基因的宿主细胞，则均可以使用。
作为表达载体，使用能够在所使用的宿主细胞中进行自主复制或者能够整合到染色体中并且在能够转录编码多肽的DNA的位置含有适当的启动子的表达载体。
在使用大肠杆菌等原核生物作为宿主细胞的情况下，含有编码本发明中使用的多肽的DNA而构成的重组载体优选为在原核生物中能够进行自主复制并且包含启动子、核糖体结合序列、本发明中使用的DNA和转录终止序列的载体。该重组载体可以进一步含有调控启动子的基因。
作为表达载体，可以列举例如：pBTrp2、pBTac1、pBTac2(均为罗氏诊断公司制造)、pKK233-2(Pharmacia公司制造)、pSE280(英杰公司制造)、pGEMEX-1(Promega公司制造)、pQE-8(QIAGEN公司制造)、pKYP10(日本特开昭58-110600号公报)、pKYP200[AgriculturalBiological Chemistry,48,669(1984)]、pLSA1[Agric.Biol.Chem.,53,277(1989))、pGEL1[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,4306(1985)]、pBluescript II SK(-)(Stratagene公司制造)、pTrs30[由大肠杆菌JM109/pTrS30(FERM BP-5407)制备]、pTrs32[由大肠杆菌JM109/pTrS32(FERM BP-5408)制备]、pGHA2[由大肠杆菌IGHA2(FERM BP-400)制备，日本特开昭60-221091号公报]、pGKA2[由大肠杆菌IGKA2(FERM BP-6798)制备，日本特开昭60-221091号公报]、pTerm2(US4686191,US4939094,US5160735)、pSupex、pUB 110、pTP5、pC194、pEG400[J.Bacteriol.,172,2392(1990)]、pGEX(Pharmacia公司制造)、pET系统(Novagen公司制造)、pME18SFL3等。
作为启动子，只要是能够在所使用的宿主细胞中发挥功能的启动子则均可使用。可以列举例如：trp启动子(Ptrp)、lac启动子、PL启动子、PR启动子和T7启动子等来源于大肠杆菌或噬菌体等的启动子。另外，也可以使用两个Ptrp串联而成的串联启动子、tac启动子、lac T7启动子、let I启动子等经过人为设计修饰而得到的启动子等。
另外，作为上述重组载体，优选使用将作为核糖体结合序列的夏因-达尔加诺(Shine-Dalgarno)序列与起始密码子的间隔调节至适当距离(例如6~18个碱基)而得到的质粒。
编码本发明中使用的多肽的DNA的碱基序列中，可以对碱基进行取代以形成最适于在宿主内表达的密码子，由此，能够提高目标多肽的生产率。此外，上述重组载体中的基因的表达不一定需要转录终止序列，但优选在紧邻结构基因的下游配置转录终止序列。
作为宿主细胞，可以列举属于埃希氏菌属等的微生物，例如大肠杆菌XL1-Blue、大肠杆菌XL2-Blue、大肠杆菌DH1、大肠杆菌MC1000、大肠杆菌KY3276、大肠杆菌W1485、大肠杆菌JM109、大肠杆菌HB101、大肠杆菌No.49、大肠杆菌W3110、大肠杆菌NY49和大肠杆菌DH5α等。
作为重组载体的导入方法，只要是向上述宿主细胞中导入DNA的方法则均可以使用，可以列举例如：使用钙离子的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,69,2110(1972)]、Gene,17,107(1982)和Molecular&GeneralGenetics,168,111(1979)中记载的方法等。
在使用动物细胞作为宿主的情况下，作为表达载体，可以列举例如：pcDNAI、pcDM8(由フナユシ公司销售)、pAGE107[日本特开平3-22979号公报；Cytotechnology,3,133,(1990)]、pAS3-3(日本特开平2-227075号公报)、pCDM8[Nature,329,840,(1987)]、pcDNAI/Amp(英杰公司制造)、pcDNA3.1(英杰公司制造)、pREP4(英杰公司制造)、pAGE103[J.Biochemistry,101,1307(1987)]、pAGE210、pME18SFL3、pKANTEX93[国际公开第97/10354号]等。
作为启动子，只要是能够在动物细胞中发挥功能的启动子则均可以使用，可以列举例如：巨细胞病毒(CMV)的IE(即刻早期)基因的启动子、SV40的早期启动子、逆转录病毒的启动子、金属硫蛋白启动子、热休克启动子、SRα启动子、莫洛尼小鼠白血病病毒(moloney murineleukemia virus)的启动子和增强子等。另外，也可以将人CMV的IE基因的增强子与启动子一同使用。
作为宿主细胞，只要是在糖链合成途径中向多肽上的Ser/Thr上结合的N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)上附加Gal的酶、与该酶的活性相关的蛋白质或与尿苷5’-二磷酸半乳糖(UDP-半乳糖)的转运相关的蛋白质等的活性降低或缺失的细胞系，则均可以使用。具体而言，可以列举：作为UDP-半乳糖转运蛋白缺失的中国仓鼠细胞(CHO细胞)的Lec8突变体[ACSSymp.Ser.128,214(1980)]。
此外，可以使用在与糖链合成途径相关的酶、转运蛋白的活性未缺失的细胞中使UDP-半乳糖转运蛋白(别名：UDP-半乳糖转位蛋白，UGALT)或者核心1合酶即糖蛋白-N-乙酰半乳糖胺3-β-半乳糖基转移酶(C1GALT1，别名：核心1-β-3-gal-t，t合酶)或C1GALT1-特异伴侣蛋白1(c1galt1c1，别名：核心1β-3-半乳糖基转移酶-特异分子伴侣(COSMC)，C1GALT2)等酶、转运蛋白的功能降低或缺失的细胞系。
作为与糖链合成途径相关的酶、转运蛋白的活性未缺失的细胞，可以列举例如：那马瓦(Namalwa)细胞、作为猴细胞的COS细胞、作为中国仓鼠细胞的CHO细胞、HBT5637(日本特开昭63-299号公报)等。
作为成为上述对象的酶组，可以列举等。
作为降低基因功能的方法，可以列举例如：反义法、核酶法[Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,96,1886(1999)]、同源重组法[Manipulating theMouse Embryo A Laboratory Manual(小鼠胚胎操作实验指南)，第二版，冷泉港实验室出版社(1994)；Gene Targeting,A Practical Approach(基因寻靶：实践探讨)，牛津大学出版社旗下的IRL出版社(1993)]、RNA-DNA寡核苷酸(RDO)法、RNA干扰(RNAi)法[Nature,391,806,(1998)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95,15502,(1998)；Nature,395,854,(1998)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA,96,5049,(1999)；Cell,95,1017,(1998)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA,96,1451,(1999)；roc.Natl.Acad.Sci.USA,95,13959,(1998)；Nature Cell Biol.,2,70,(2000)]、使用逆转录病毒的方法和使用转座子的方法[Nature Genetics,25,35,(2000)]等。
作为载体的导入方法，只要是向动物细胞中导入DNA的方法则均可以使用，可以列举例如：电穿孔法[Cytotechnology,3,133(1990)]、磷酸钙法(日本特开平2-227075号公报)和脂质体转染法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84,7413(1987)]等。
作为基因的表达方法，除了直接表达以外，还可以根据MolecularCloning,A Laboratory Manual,第二版，冷泉港实验室出版社(1989)中记载的方法等进行分泌生产和融合蛋白表达等。在真核生物来源的细胞中进行表达的情况下，可以得到附加有糖或糖链的多肽。
将如上得到的转化体在培养基中进行培养，在培养物中生成并蓄积该多肽，并从该培养物中进行收集，由此可以制造多肽。将该转化体在培养基中进行培养的方法可以根据宿主的培养中使用的通常的方法来进行。
对利用使用诱导性启动子作为启动子的重组载体进行转化后的微生物进行培养时，可以根据需要向培养基中添加诱导物。例如，对利用使用lac启动子的重组载体进行转化后的微生物进行培养时，可以向培养基中添加异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷等，对利用使用trp启动子的重组载体进行转化后的微生物进行培养时，可以向培养基中添加吲哚丙烯酸等。
作为用于培养以动物细胞为宿主而得到的转化体的培养基，可以使用普遍使用的RPMI1640培养基[The Journal of the American MedicalAssociation,199,519(1967)]、伊戈尔(Eagle)的MEM培养基[Science,122,501(1952)]、杜尔贝科改良MEM培养基[Virology,8,396(1959)]、199培养基[Proc.Soc.Exp.Biol.Med.,73,1(1950)]或者向这些培养基中添加FCS等而得到的培养基等。
培养通常在pH6~8、30~40℃、5%CO2存在下等条件下进行1~7天。另外，在培养中，可以根据需要向培养基中添加卡那霉素、青霉素等抗生素。
如上所述，将包含重组有编码本发明中使用的多肽的DNA的重组载体的来源于微生物、动物细胞等的转化体根据通常的培养方法进行培养，生成并蓄积该多肽，并从该培养物中进行收集，由此可以制造本发明中使用的多肽。
作为基因的表达方法，除了直接表达以外，还可以根据MolecularCloning,Alaboratory Manual,第二版，冷泉港实验室出版社(1989)中记载的方法等进行分泌生产、融合蛋白表达等。
作为多肽的生产方法，有如下方法：在宿主细胞内生产的方法、分泌到宿主细胞外的方法以及在宿主细胞外膜上生产的方法，可以通过改变所使用的宿主细胞和所生产的多肽的结构来选择适当的方法。
在宿主细胞内或宿主细胞外膜上生产多肽的情况下，通过使用鲍尔森等人的方法[J.Biol.Chem.,264,17619(1989)]、罗等人的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,86,8227(1989)；Genes Develop.,4,1288(1990)]或者日本特开平05-336963号公报和国际公开第94/23021号等中记载的方法，可以使该基因产物分泌到宿主细胞外。另外，还可以根据日本特开平2-227075号公报中记载的方法，利用使用二氢叶酸还原酶基因等的基因扩增系统来提高生产量。
多肽可以通过例如如下方式进行分离和纯化。
多肽在细胞内以溶解状态进行表达的情况下，培养结束后通过离心分离来回收细胞，悬浮于水性缓冲液中后，利用超声波破碎机、法式压滤壶、MANTON-GULIN匀浆器、卧式砂磨机等将细胞破碎，从而得到无细胞提取液。
将上述无细胞提取液进行离心分离，从所得到的上清中利用通常的酶的分离纯化法得到纯化制备品，即，单独或组合使用溶剂提取法、利用硫酸铵等的盐析法、脱盐法、利用有机溶剂的沉淀法、使用二乙氨基乙基(DEAE)-琼脂糖、DIAION HPA-75(三菱化学公司制造)等树脂的阴离子交换层析法、使用S-Sepharose FF(Pharmacia公司制造)等树脂的阳离子交换层析法、使用丁基琼脂糖、苯基琼脂糖等树脂的疏水层析法、使用分子筛的凝胶过滤法、亲和层析法、聚焦层析法以及等电点电泳等电泳法等方法。
另外，多肽在细胞内形成包涵体而进行表达的情况下，同样地将细胞回收后进行破碎，并进行离心分离，由此，以沉淀级分的形式回收该多肽的包涵体。利用蛋白变性剂使回收的该多肽的包涵体可溶化。通过对该可溶化液进行稀释或透析，使该多肽恢复至正常的立体结构，然后，通过与上述同样的分离纯化方法得到多肽的纯化制备品。
另外，本发明中使用的多肽也可以通过Fmoc法(芴甲氧羰基法)和tBoc法(叔丁氧羰基法)等化学合成法来制造。另外，还可以利用Advanced ChemTech公司、パ一キン·エルマ一公司、Pharmacia公司、Protein Technology Instrument公司、Synthecell-Vega公司、PerSeptive公司、岛津制作所等的肽合成仪进行化学合成。
(2)动物的免疫和抗体产生细胞的制备
对3~20周龄的小鼠、大鼠或仓鼠进行如上制备的抗原的免疫，收集该动物的脾脏、淋巴结、末梢血中的抗体产生细胞。另外，在免疫原性低因而在上述动物中未观察到充分的抗体效价升高的情况下，还有使用CD27敲除动物作为被免疫动物的方法。
免疫通过将抗原连同适当的佐剂[例如，完全弗氏佐剂(CompleteFreund’s Adjuvant)以及氢氧化铝凝胶和百日咳菌疫苗等]一同施用到动物的皮下、静脉内或腹腔内来进行。
在抗原为部分肽的情况下，与BSA(牛血清白蛋白)或KLH(钥孔
Figure BDA00002064662600651
血蓝蛋白，Keyhole Limpet Hemocyanin)等载体蛋白制成结合物，将其作为免疫原使用。
关于抗原的施用，在第一次施用之后，每隔1~2周施用5~10次。每次施用后第3~7天从眼底静脉丛采血，利用酶免疫测定法[Antibodies-A Laboratory Manual，冷泉港实验室,1988]等考察其血清与抗原的反应。将其血清对免疫所用的抗原显示出充分的抗体效价的小鼠、大鼠或仓鼠供作脾细胞的供给源。
在供于脾细胞与骨髓瘤细胞的融合时，在抗原物质的末次施用后第3~7天从免疫后的小鼠、大鼠或仓鼠中摘除脾脏并收集脾细胞。将脾脏在MEM培养基(日水制药公司制造)中细细切碎，用镊子搅散并离心分离(1200rpm、5分钟)，然后，弃去上清，用Tris-氯化铵缓冲液(pH7.65)处理1~2分钟以除去红细胞，并用MEM培养基洗涤3次，从而提供融合用脾细胞。
(3)骨髓瘤细胞的制备
作为骨髓瘤细胞，使用由小鼠得到的确立细胞系。可以使用例如：8-氮杂鸟嘌呤抗性小鼠(BALB/c来源)骨髓瘤细胞系P3-X63Ag8-U1(P3-U1)[Current Topics in Microbiology and Immunology,18,1(1978)]、P3-NS1/1-Ag41(NS-1)[European  J.Immunology,6,511(1976)]、-SP2/O-Ag 14(SP-2)[Nature,276,269(1978)]、P3-X63-Ag8653(653)[J.Immunology,123,1548(1979)]、P3-X63-Ag8(X63)[Nature,256,495(1975)]等。
上述细胞系使用8-氮杂鸟嘌呤培养基[向在RPMI-1640培养基中添加有谷氨酰胺(1.5mM)、2-巯基乙醇(5×10-5M)、庆大霉素(10μg/mL)和胎牛血清(FCS)的培养基(以下称为正常培养基)中进一步添加8-氮杂鸟嘌呤(15μg/mL)而得到的培养基]进行传代，在细胞融合的3~4天之前传代到正常培养基中，以确保融合当天达到2×107个以上的细胞数。
(4)细胞融合
将上述抗体产生细胞和骨髓瘤细胞用MEM培养基或PBS(磷酸氢二钠1.83g、磷酸二氢钾0.21g、食盐7.65g、蒸馏水1升、pH7.2)充分洗涤，以使细胞数达到抗体产生细胞:骨髓瘤细胞=5~10:1的方式进行混合，离心分离(1200rpm、5分钟)后，弃去上清，将沉淀的细胞群充分搅散后，在搅拌的同时在37℃下以0.2~1mL/108个抗体产生细胞的量加入2g聚乙二醇-1000(PEG-1000)、2mL MEM和0.7mL二甲亚砜的混合溶液，并每隔1~2分钟加入1~2mL的MEM培养基，重复数次后，加入MEM培养基至总量达到50mL。
离心分离(900rpm、5分钟)后，弃去上清，轻轻地将细胞搅散后，通过用刻度吸管吸入并吹出，轻轻地将细胞悬浮于100mL HAT培养基[在正常培养基中添加有次黄嘌呤(10-4摩尔/升)、胸腺嘧啶核苷(1.5×10-5摩尔/升)和氨基蝶呤(4×10-7摩尔/升)的培养基]中。将该悬浮液以100μL/孔分注到96孔培养板中，在5%CO2培养箱中在37℃下培养7~14天。
培养后，取一部分培养上清，通过后述的结合分析等选出与包含本发明中使用的多肽的抗原发生反应而不与不含多肽的抗原发生反应的细胞。
然后，利用有限稀释法重复进行两次克隆[第一次使用HT培养基(从HAT培养基中除去氨基蝶呤而得到的培养基)，第二次使用正常培养基]，选出稳定地观察到强抗体效价的细胞作为产生单克隆抗体的杂交瘤株。
(5)单克隆抗体的制备
对姥鲛烷处理[腹腔内施用0.5mL的2,6,10,14-四甲基十五碳烷(姥鲛烷)，饲养2周]后的8~10周龄的小鼠或裸鼠以2×106~5×107个细胞/只的量腹腔内注射(4)中得到的产生抗CD27单克隆抗体的杂交瘤细胞。在10~21天内杂交瘤产生癌性腹水。
从上述小鼠中收集腹水，离心分离(3000rpm、5分钟)除去固体成分后，用40~50%的硫酸铵进行盐析，然后，利用辛酸沉淀法、DEAE-琼脂糖柱、蛋白A柱或凝胶过滤柱进行纯化，收集IgG或IgM级分，作为纯化的单克隆抗体。
抗体亚类的确定使用亚类分型试剂盒通过酶免疫测定法来进行。蛋白量的定量通过劳里法和280nm下的吸光度来计算。
(6)结合分析
作为抗原，使用：通过本项(1)中记载的方法将包含编码本发明中使用的CD27多肽的cDNA的表达载体导入大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞等中而得到的基因导入细胞或重组蛋白、或者由人组织得到的纯化多肽或部分肽。
在抗原为部分肽的情况下，与BSA(牛血清白蛋白)和KLH(钥孔
Figure BDA00002064662600681
血蓝蛋白，Keyhole Limpet Hemocyanin)等载体蛋白制成结合物，并使用该结合物。
将上述抗原分注到96孔板中并使其固相化，然后，分注被免疫动物血清、产生单克隆抗体的杂交瘤的培养上清或纯化抗体作为第一抗体，并使其进行反应。用PBS或PBS-0.05%吐温充分洗涤后，分注由生物素、酶、化学发光物质或放射线化合物等标记的抗免疫球蛋白抗体作为第二抗体，并使其进行反应。用PBS-吐温充分洗涤后，进行与第二抗体的标记物质对应的反应。
与识别包含未结合半乳糖的O连接型糖链的CD27且与该胞外域结合的单克隆抗体产生竞争的抗体，可以通过向上述结合分析系统中添加受试抗体并使其反应来获得。即，筛选出在加入受试抗体时单克隆抗体的结合受到抑制的抗体，由此可以获得在向糖链缺陷CD27的胞外域上结合时与获得的单克隆抗体产生竞争的单克隆抗体。
另外，与识别糖链缺陷CD27且与该胞外域结合的单克隆抗体所识别的表位结合的抗体，可以通过如下方法获得：对在上述结合分析系统中获得的抗体的表位进行鉴定，制作所鉴定出的表位的部分糖链结合肽或者模拟表位的立体结构的糖链结合肽等，并进行免疫。
2.基因重组抗体的制作
作为基因重组抗体的制作例，以下示出人嵌合抗体和人源化抗体的制作方法。
(1)基因重组抗体表达用载体的构建
基因重组抗体表达用载体是指重组有编码人抗体的CH和CL的DNA的动物细胞用表达载体，可以通过将编码人抗体的CH和CL的DNA分别克隆到动物细胞用表达载体中来进行构建。
人抗体的C区可以使用任意的人抗体的CH和CL。可以列举例如：人抗体的γ1亚类的CH和κ类的CL等。作为编码人抗体的CH和CL的DNA，可以使用包含外显子和内含子的染色体DNA，也可以使用cDNA，优选使用cDNA。
作为动物细胞用表达载体，只要是能够重组并表达编码人抗体的C区的基因的载体则均可以使用。可以列举例如：pAGE107[Cytotechnol.,3,133(1990)]、pAGE103[J.Biochem.,101,1307(1987)]、pHSG274[Gene,27,223(1984)]、pKCR[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,78,1527(1981)]、pSG1bd2-4[Cytotechnol.,4,173(1990)]和pSE1UK1Sed1-3[Cytotechnol.,13,79(1993)]等。
作为动物细胞用表达载体中使用的启动子，可以列举例如：SV40的早期启动子[J.Biochem.,101,1307(1987)]、莫洛尼小鼠白血病病毒的LTR[Biochem.Biophys.Res.Commun.,149,960(1987)]、免疫球蛋白H链的启动子[Cell,41,479(1985)]。另外，作为动物细胞用表达载体中使用的增强子，可以列举例如增强子[Cell,33,717(1983)]等。
基因重组抗体表达用载体可以使用抗体H链和L链存在于不同载体上的类型或者存在于同一载体上的类型(串联型)中的任意一种，从基因重组抗体表达载体构建的容易度、向动物细胞中导入的容易度以及抗体H链与L链在动物细胞内的表达量的平衡均衡等观点出发，优选串联型基因重组抗体表达用载体[J.Immunol.Methods,167,271(1994)]。
作为串联型基因重组抗体表达用载体，可以列举例如：pKANTEX93[国际公开第97/10354号]和pEE18[Hybridoma,17,559(1998)]等。
(2)编码人以外的动物来源的抗体的V区的cDNA的获得和氨基酸序列的分析
编码非人抗体的VH和VL的cDNA可以如下获得。
从产生非人抗体的杂交瘤细胞中提取mRNA，并合成cDNA。将合成的cDNA克隆到噬菌体和质粒等载体中，制作cDNA文库。使用编码小鼠抗体的C区部分或V区部分的DNA作为探针，从该文库中分别分离出具有编码VH或VL的cDNA的重组噬菌体或重组质粒。
分别确定重组噬菌体或重组质粒上的目标小鼠抗体的VH或VL的全长碱基序列，由碱基序列分别推测出VH或VL的全长氨基酸序列。
作为人以外的动物，只要能够制作小鼠、大鼠、仓鼠、兔等的杂交瘤细胞则均可以使用。
作为由杂交瘤细胞制备总RNA的方法，可以列举例如异硫氰酸胍-三氟乙酸铯法[Methods in Enzymol.,154,3(1987)]等。另外，作为试剂盒，可以列举例如RNAeasy试剂盒(QIAGEN公司制造)等。
作为由总RNA制备mRNA的方法，可以列举例如固定有寡聚(dT)的纤维素柱法[Molecular Cloning,A Laboratory Manual,第二版(冷泉港实验室出版社,1989)]等。另外，作为试剂盒，可以列举例如OligoTM-dT30<Super>mRNA纯化试剂盒(Takara公司制造)等。
作为由杂交瘤细胞制备mRNA的试剂盒，可以列举例如：FastTrackmRNA分离试剂盒(英杰公司制造)和QuickPrep mRNA纯化试剂盒(Pharmacia公司制造)等。
作为cDNA的合成和cDNA文库的制作方法，可以列举例如常规方法[Molecular Cloning,A Laboratory Manual,第二版(冷泉港实验室出版社,1989)；Current Protocols in Molecular Biology,附录1-34]。另外，可以列举使用市售试剂盒例如用于cDNA合成和质粒克隆的SuperScriptTM质粒系统(英杰公司制造)以及ZAP-cDNA合成试剂盒(Stratagene公司制造)的方法等。
在制作cDNA文库时，用于重组以由杂交瘤细胞提取出的mRNA为模板而合成的cDNA的载体只要是能够重组该cDNA的载体则均可以使用。
可以使用例如：ZAP Express[Strategies,5,58(1992)]、pBluescript IISK(+)[Nucleic Acids Research,17,9494(1989)]、λZAPII(Stratagene公司制造)、λgt10、λgt11(1985)、λBlueMid(Clontech公司制造)、λExCell、pT7T318U(Pharmacia公司制造)、pcD2[Mol.Cell.Biol.,3,280(1983)]和pUC18[Gene,33,103(1985)]等。
作为用于导入由噬菌体或质粒载体构建的cDNA文库的大肠杆菌，只要是能够导入、表达和保持该cDNA文库的大肠杆菌则均可以使用。
可以使用例如：XL1-Blue MRF’[Strategies,5,81(1992)]、C600[Genetics,39,440(1954)]、Y 1088、Y 1090[Science,222,778(1983)]、NM522[J.Mol.Biol.,166,1(1983)]、K802[J.Mol.Biol.,16,118(1966)]和JM105[Gene,38,275(1985)]等。
作为从cDNA文库中筛选编码非人抗体的VH或VL的cDNA克隆的方法，可以通过使用同位素或荧光标记的探针的克隆杂交法或噬菌斑杂交法[Molecular Cloning,A Laboratory Manual,第二版(冷泉港实验室出版社,1989)]来进行筛选。
另外，也可以制备引物并以由mRNA合成的cDNA或cDNA文库为模板，通过聚合酶链反应[以下记作PCR法；Molecular Cloning,ALaboratory Manual,第二版，冷泉港实验室出版社(1989)；CurrentProtocolsin Molecular Biology,附录1-34]来制备编码VH或VL的cDNA。
将通过上述方法筛选出的cDNA利用适当的限制性酶等进行切割后，克隆到pBluescript SK(-)(Stratagene公司制造)等质粒中，进行通常使用的碱基序列分析方法例如桑格(Sanger,F.)等人的双脱氧法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74,5463(1977)]等的反应，并使用碱基序列自动分析装置例如A.L.F.DNA测序仪(Pharmacia公司制造)等进行分析，由此，可以确定该cDNA的碱基序列。
由确定出的碱基序列分别推测VH和VL的全长氨基酸序列，与已知抗体的VH和VL的全长氨基酸序列[Sequences of Proteins ofImmunological Interest，美国卫生与公众服务部(1991)]进行比较，由此，可以分别确认所获得的cDNA是否编码包含分泌信号序列的抗体的VH和VL的完整氨基酸序列。
关于包含分泌信号序列的抗体的VH和VL的完整氨基酸序列，通过与已知抗体的VH和VL的全长氨基酸序列[Sequences of Proteinsof Immunological Interest，美国卫生与公众服务部(1991)]进行比较，可以推测出分泌信号序列的长度和N末端氨基酸序列，进而可以获知它们所属的亚类。
另外，VH和VL的各CDR的氨基酸序列也可以通过与已知抗体的VH和VL的氨基酸序列[Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，美国卫生与公众服务部(1991)]进行比较来找出。
进而，使用VH和VL的完整氨基酸序列，对任意的数据库例如SWISS-PROT和PIR-Protein等进行BLAST法[J.Mol.Biol.,215,403(1990)]等序列同源性检索，从而可以确认使用的氨基酸序列是否是新的氨基酸序列。
(3)人嵌合抗体表达载体的构建
将编码非人抗体的VH或VL的cDNA分别克隆到本项2的(1)中记载的基因重组抗体表达用载体的编码人抗体的CH或CL的各基因的上游，从而可以构建人嵌合抗体表达载体。
例如，为了使编码非人抗体的VH或VL的cDNA的3’末端侧与人抗体的CH或CL的5’末端侧连接，制作以如下方式设计的VH和VL的cDNA：连接部分的碱基序列编码适当的氨基酸并且成为适当的限制性酶识别序列。
将所制作的VH和VL的cDNA分别克隆到本项2的(1)中记载的人源化抗体表达用载体的编码人抗体的CH或CL的各基因的上游，以使它们以适当的形式进行表达，从而可以构建人嵌合抗体表达载体。
另外，也可以使用在两端具有适当的限制性酶的识别序列的合成DNA，通过PCR法对编码非人抗体VH或VL的cDNA分别进行扩增，并将它们分别克隆到本项2的(1)中记载的基因重组抗体表达用载体中。
(4)编码人源化抗体的V区的cDNA的构建
编码人源化抗体的VH或VL的cDNA可以如下构建。首先，分别选择用于移植非人抗体的VH或VL的CDR的氨基酸序列的人抗体的VH或VL的框架区(以下记作FR)的氨基酸序列。作为选择的FR的氨基酸序列，只要是人抗体来源的氨基酸序列则均可以使用。
可以列举例如：蛋白数据库(Protein Data Bank)等数据库中登记的人抗体的FR的氨基酸序列、人抗体的FR的各亚类的共有氨基酸序列[Sequences of Proteins of Immunological Interest，美国卫生与公众服务部(1991)]等。
为了抑制抗体的结合活性的降低，选择与原来的抗体的VH或VL的FR的氨基酸序列具有尽量高的同源性(至少60%以上)的FR的氨基酸序列。接着，向选择好的人抗体的VH或VL的FR的氨基酸序列中分别移植原抗体的CDR的氨基酸序列，从而分别设计出人源化抗体的VH或VL的氨基酸序列。
在考虑抗体基因的碱基序列中出现的密码子的使用频率[Sequences of Proteins of Immunological Interest，美国卫生与公众服务部(1991)]的基础上，将设计好的氨基酸序列转换为DNA序列，从而分别设计出编码人源化抗体的VH或VL的氨基酸序列的DNA序列。
基于设计好的DNA序列，合成多条包含约100个碱基长度的合成DNA，使用这些合成DNA进行PCR法。这种情况下，从PCR中的反应效率和能够合成的DNA的长度考虑，优选对于H链、L链均设计6条合成DNA。
另外，通过在位于两端的合成DNA的5’末端导入适当的限制性酶的识别序列，可以容易地将编码人源化抗体的VH或VL的cDNA克隆到本项2的(1)中构建的人源化抗体表达用载体中。
PCR反应后，将扩增产物分别克隆到pBluescript SK(-)(Stratagene公司制造)等质粒中，通过本项2的(2)中记载的方法来确定碱基序列，从而获得具有编码期望的人源化抗体的VH或VL的氨基酸序列的DNA序列的质粒。
(5)人源化抗体的V区的氨基酸序列的修饰
已知：仅将非人抗体的VH和VL的CDR移植到人抗体的VH和VL的FR中时，人源化抗体的抗原结合活性与原来的非人抗体相比降低[BIO/TECHNOLOGY,9,266(1991)]。
认为其原因在于，原来的非人抗体的VH和VL中，不仅CDR与抗原结合活性相关，而且FR内的氨基酸残基也直接或间接地与抗原结合活性相关，因此，通过人源化使非人抗体的FR的氨基酸残基取代为人抗体的FR的氨基酸残基时，抗原结合活性降低。
为了解决该问题，实施如下方法：在人源化抗体中，鉴定出人抗体的VH和VL的FR的氨基酸序列中直接与抗原的结合相关的氨基酸残基、与CDR的氨基酸残基相互作用的氨基酸残基以及维持抗体的立体结构并间接与抗原的结合相关的氨基酸残基，将这些氨基酸残基取代为原来的非人抗体的氨基酸残基，由此使降低的抗原结合活性升高[BIO/TECHNOLOGY,9,266(1991)]。
人源化抗体的制作中，为了解决如何能够有效地鉴定出这些与抗原结合活性相关的FR的氨基酸残基的问题，利用X射线晶体分析[J.Mol.Biol.,112,535(1977)]或计算机建模[Protein Engineering,7,1501(1994)]等进行抗体的立体结构的构建和分析。
上述抗体的立体结构的信息给人源化抗体的制作带来了很多有益的信息，而另一方面，尚未建立能够适用于所有抗体的人源化抗体的制作方法，就现状而言，需要进行针对各个抗体制作多种修饰体并研究它们与抗原结合活性的相关性等各种尝试。
人抗体的VH和VL的FR的氨基酸残基可以通过使用修饰用合成DNA进行本项2的(4)中记载的PCR法来进行修饰。对于PCR后的扩增产物，通过本项2的(2)中记载的方法来确定碱基序列，从而确认已实施了目标修饰。
(6)人源化抗体表达载体的构建
将构建好的编码基因重组抗体的VH或VL的cDNA分别克隆到本项2的(1)中记载的基因重组抗体表达用载体的编码人抗体的CH或CL的各基因的上游，从而可以构建人源化抗体表达载体。
例如，通过向本项2的(4)和(5)中构建人源化抗体的VH或VL时使用的合成DNA中、位于两端的合成DNA的5’末端导入适当的限制性酶的识别序列，可以将构建好的VH或VL的cDNA分别克隆到本项2的(1)中记载的人源化抗体表达用载体的编码人抗体的CH或CL的各基因的上游，以使它们以适当的形式进行表达。
(7)基因重组抗体的瞬时表达
为了有效地评价所制作的多种人源化抗体的抗原结合活性，可以使用本项2的(3)和(6)中记载的基因重组抗体表达载体或者对上述载体进行修饰后的表达载体，进行基因重组抗体的瞬时表达。作为用于导入表达载体的宿主细胞，只要是能够表达基因重组抗体的宿主细胞则可以使用任何细胞。
其中，从表达量高的观点出发，一般优选使用COS-7细胞(ATCCCRL1651)[Methods in Nucleic Acids Res.,CRC press,283(1991)]。
作为将表达载体导入COS-7细胞的方法，可以列举例如：DEAE-右旋糖酐法[Methods in Nucleic Acids Res.,CRC出版社,283(1991)]、脂质体转染法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84,7413(1987)]等。
导入表达载体后，培养上清中的基因重组抗体的表达量和抗原结合活性可以通过酶联免疫吸附法[以下记作ELISA法；MonoclonalAntibodies-Principles and practice，第三版，美国学术出版社(1996)；Antibodies-A Laboratory Manual,冷泉港实验室(1988)；単クロ一ン抗体実験マニユアル，講談社サイエンテイフイツク(1987)]等来测定。
(8)基因重组抗体的稳定表达
通过将本项2的(3)和(6)中记载的基因重组抗体表达载体导入到适当的宿主细胞中，可以得到稳定表达基因重组抗体的转化株。
作为将表达载体导入宿主细胞的方法，可以列举电穿孔法[日本特开平2-257891号公报；Cytotechnology,3,133(1990)]等。
作为用于导入基因重组抗体表达载体的宿主细胞，只要是能够表达基因重组抗体的宿主细胞则可以使用任何细胞。
可以列举例如：小鼠SP2/0-Ag14细胞(ATCC CRL1581)、小鼠P3X63-Ag8.653细胞(ATCC CRL1580)、两种中国仓鼠卵巢细胞CHO/dhFr-细胞(ATCC CRL9096)和CHO/DG44细胞[Somatic Cell andMolecular Genetics,12,555(1986)]、获得了凝集素抗性的Lec13[SomaticCell and Molecular genetics,12,55(1986)]、α1,6-岩藻糖转移酶基因缺失的CHO细胞(国际公开第05/35586号、国际公开第02/31140号)以及大鼠YB2/3HL.P2.G 11.16Ag.20细胞(ATCC CRL 1662)等。
除了上述宿主细胞以外，还可以使用与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖的合成相关的酶等蛋白质、与在N-糖苷键复合糖链的还原末端的N-乙酰葡糖胺的6位上使岩藻糖的1位进行α连接的糖链修饰相关的酶等蛋白质或者与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖向高尔基体的转运相关的蛋白质等的活性降低或缺失的宿主细胞，优选使用国际公开第05/35586号、国际公开第02/31140号等中记载的α1,6-岩藻糖转移酶基因缺失的CHO细胞等。
导入表达载体后，根据日本特开平2-257891号公报中公开的方法，在含有G418硫酸盐(以下记作G418，SIGMA公司制造)等药剂的动物细胞培养用培养基中进行培养，由此可以筛选出稳定表达基因重组抗体的转化株。
作为动物细胞培养用培养基，可以使用：RPMI1640培养基(英杰公司制造)、GIT培养基(日本制药公司制造)、EX-CELL301培养基(JRH公司制造)、IMDM培养基(英杰公司制造)、杂交瘤SFM培养基(英杰公司制造)或者在这些培养基中添加有胎牛血清(以下记作FCS)等各种添加物的培养基等。
通过将所得到的转化株在培养基中进行培养，可以在培养上清中表达并蓄积基因重组抗体。培养上清中的基因重组抗体的表达量和抗原结合活性可以通过ELISA法等来测定。另外，可以根据日本特开平2-257891号公报中公开的方法，利用DHFR扩增系统等使转化株的基因重组抗体的表达量升高。
基因重组抗体可以使用蛋白A层析柱从转化株的培养上清中进行纯化[Monoclonal Antibodies-Principles and practice，第三版，美国学术出版社(1996)；Antibodies-ALaboratory Manual，冷泉港实验室(1988)]。
另外，除此以外，可以使用蛋白纯化中通常使用的纯化方法。例如，可以将凝胶过滤、离子交换层析和超滤等组合来进行纯化。
纯化后的基因重组抗体的H链、L链或整个抗体分子的分子量可以通过聚丙烯酰胺凝胶电泳[以下记作SDS-PAGE；Nature,227,680(1970)]和蛋白免疫印迹法[Monoclonal Antibodies-Principles andpractice，第三版，美国学术出版社(1996)；Antibodies-A LaboratoryManual,冷泉港实验室(1988)]等来测定。
3.本发明的抗体或抗体片段的活性评价
纯化后的本发明的抗体或抗体片段的反应特异性可以如下进行评价。
将表达正常型糖链的细胞和在O连接型糖链合成过程中向多肽上的Ser/Thr上结合的GalNAc上附加Gal的酶、与该酶的活性相关的蛋白质或与尿苷5’-二磷酸半乳糖(UDP-半乳糖)的转运相关的蛋白质等的活性降低或缺失的细胞系作为宿主，可以分别制作表达编码CD27的碱基序列(序列号1)的CD27表达细胞。
这样，可以制作出表达具有正常O连接型糖链的CD27的细胞、表达糖链缺陷CD27的细胞，并可以通过ELISA法和荧光抗体法[CancerImmunol.Immunother.,36,373(1993)]等测定表达各CD27的细胞系与纯化抗体的反应性。
另外，通过将CD27的胞外域以融合蛋白等可溶物的形式分别在上述宿主细胞中进行表达并在适当的条件下进行纯化，可以分别制备保持立体结构的可溶型CD27蛋白。
作为融合蛋白，可以列举：使CD27蛋白与抗体恒定区(也称为Fc)、GST标签、组氨酸标签(也称为His标签)或Myc标签等其他多肽融合而得到的蛋白。该融合蛋白可以通过使用蛋白A、镍柱、特异性抗体柱等亲和层析柱来进行分离纯化。
也可以通过利用表面等离子体共振(SPR)的BIAcoreTM、ELISA法和免疫沉淀法等来测定这些纯化的可溶型CD27蛋白与纯化抗体的反应性[Monoclonal Antibodies-Principles and practice，第三版，美国学术出版社(1996)；Antibodies-A Laboratory Manual，冷泉港实验室(1988)]。
对表达糖链缺陷CD27的培养细胞系的细胞毒活性可以通过使用公知的方法[Cancer Immunol.Immunother.,36,373(1993)]测定CDC活性和ADCC活性等来进行评价。
4.使用本发明的特异性识别糖链缺陷CD27且与该胞外域结合的单克隆抗体或其抗体片段的疾病诊断方法
通过使用本发明的抗体或该抗体片段对糖链缺陷CD27或表达该多肽的细胞进行检测或定量，可以诊断与糖链缺陷CD27相关的疾病。
作为与糖链缺陷CD27相关的疾病，只要是在生物体内发现表达糖链缺陷CD27多肽的细胞的疾病则均包括在内。具体而言，可以列举IgA肾病或癌症。作为癌症，可以列举例如来源于B细胞或T细胞分化过程的癌症。
具体而言，可以列举例如：套细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、小淋巴细胞性白血病、伯基特(バ一キツト)淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、粘膜相关淋巴组织淋巴瘤、弥漫性大细胞淋巴瘤和浆细胞瘤等各种非霍奇金淋巴瘤等。
本发明中，作为糖链缺陷CD27多肽的检测或测定对象的生物试样，只要是组织细胞、血液、血浆、血清、胰液、尿液、粪便、组织液和培养液等可能包含该多肽的试样则没有特别限定。
与糖链缺陷CD27相关的疾病中，例如，IgA肾病的诊断可以如下进行。
对于从多名健康人的体内收集到的生物试样，使用本发明的抗体或该抗体片段或者它们的衍生物，利用下述的免疫学方法，进行糖链缺陷CD27多肽的检测或测定，从而确认健康人的生物试样中的该多肽的表达量。
对受试者的生物试样也同样考察该多肽的表达量，将其表达量与健康人的表达量进行比较。在受试者的该多肽的表达量与健康人相比增加的情况下，可以诊断为IgA肾病或者将来患IgA肾病的可能性高。
与糖链缺陷CD27相关的疾病中，例如，癌症的诊断可以如下进行。
对于从多名健康人的生物体内收集到的生物试样，使用本发明的抗体或该抗体片段或者它们的衍生物，利用下述的免疫学方法，进行糖链缺陷CD27的检测或测定，从而确认健康人的生物试样中的该多肽的表达量。
对受试者的生物试样也同样考察该多肽的表达量，将其表达量与健康人的表达量进行比较。在受试者的该多肽的表达量与健康人相比增加的情况下，可以诊断癌症为阳性。
含有本发明的抗体或该抗体片段或者它们的衍生物的诊断剂中，根据目标诊断方法，可以含有用于进行抗原抗体反应的试剂、该反应的检测用试剂。作为用于进行抗原抗体反应的试剂，可以列举例如：缓冲剂和盐等。
作为检测用试剂，可以列举：识别抗体或该抗体片段或者它们的衍生物的衍生物的标记的二次抗体、标记物的底物等通常的免疫学检测或测定方法中使用的试剂。
作为本发明中检测或测定糖链缺陷CD27的量的方法，可以列举任意的公知方法。例如，可以列举免疫学检测和测定方法等。
免疫学检测或测定方法是指使用实施过标记的抗原或抗体来检测或测定抗体量或抗原量的方法。作为免疫学检测或测定方法，可以列举：放射免疫测定法(RIA)、酶免疫测定法(EIA或ELISA)、荧光免疫测定法(FIA)、发光免疫测定法(luminescent immunoassay)、蛋白免疫印迹法和物理化学方法(例如TIA、LAPIA和PCIA等)等。
作为放射免疫测定法(RIA)，可以列举例如下述方法：使本发明的抗体或该抗体片段与抗原或表达抗原的细胞等反应，进而使实施过放射线标记的抗免疫球蛋白抗体或结合片段进行反应，然后，利用闪烁计数仪等进行测定。
作为酶免疫测定法(EIA或ELISA)，可以列举例如下述方法：使本发明的抗体或该抗体片段与抗原或表达抗原的细胞等反应，进而使实施过标记的抗免疫球蛋白抗体或结合片段进行反应，然后，利用吸光光度计来测定发光色素；可以使用例如夹心ELISA法等。
作为酶免疫测定法中使用的标记物，可以使用如上所述的任意公知(石川荣次等编，酶免疫测定法，医学书院)的酶标记。例如，可以使用：碱性磷酸酶标记、过氧化物酶标记、荧光素酶标记、生物素标记等。
夹心ELISA法为如下方法：将抗体结合在固相上后，使其捕获要检测或测定的抗原，并使第二抗体与被捕获的抗原反应。该ELISA法中，准备两种识别要检测或测定的抗原的抗体或抗体片段，其抗原识别部位不同，预先使其中一种抗体或抗体片段吸附到板(例如，96孔板)上，并将第二抗体或抗体片段用FITC等荧光物质、过氧化物酶等酶、生物素等预先进行标记。
在吸附有上述抗体的板上，使从生物体内分离出的细胞或其破碎液、组织或其破碎液、细胞培养上清、血清、胸水、腹水、眼液等进行反应，然后，使标记后的单克隆抗体或抗体片段反应，并进行与标记物质相对应的检测反应。
在利用上述方法测定受试样品中的抗原浓度的情况下，可以由将浓度已知的抗原进行梯度稀释而制作的标准曲线计算出受试样品中的抗原浓度。
作为夹心ELISA法中使用的抗体，可以使用例如多克隆抗体、单克隆抗体中的任意一种，也可以使用Fab、Fab’、F(ab’)2等抗体片段。作为夹心ELISA法中使用的两种抗体的组合，可以是识别不同表位的单克隆抗体或抗体片段的组合，也可以是多克隆抗体与单克隆抗体或抗体片段的组合。
作为荧光免疫测定法(FIA)，可以列举文献[MonoclonalAntibodies-Principles and practice，第三版，美国学术出版社(1996)；単クロ一ン抗体実験マニユアル，講談社サイエンテイフイツク(1987)]等中记载的方法。
作为荧光免疫测定法中使用的标记物，可以使用如上所述的任意公知(川生明著，荧光抗体法，ソフトサイエンス公司)的荧光标记。例如，可以使用FITC标记和RITC标记等。
作为发光免疫测定法(luminescent immunoassay)，可以使用例如[Monoclonal Antibodies-Principles and practice，第三版，美国学术出版社(1996)；単クロ一ン抗体実験マニユアル，講談社サイエンテイフイツク(1987)]等中记载的方法来进行。
作为发光免疫测定法中使用的标记物，可以列举如上所述的任意公知[今井一洋编，生物发光和化学发光，广川书店；临床检查42(1998)]的发光物标记。例如，可以使用吖啶
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酯标记和洛酚碱标记等。
蛋白免疫印迹法为如下方法：将抗原或表达抗原的细胞等用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳[Antibodies-A Laboratory Manual(冷泉港实验室，1988)]进行级分分离后，将该凝胶印迹到PVDF膜或硝酸纤维素膜上，使识别抗原的抗体或抗体片段与该膜进行反应，进而使实施过FITC等荧光物质、过氧化物酶等酶标记、生物素标记等的抗小鼠IgG抗体或结合片段进行反应，然后，使该标记可见化，由此来进行确认。以下示出蛋白免疫印迹法的一例。
使表达具有序列号2表示的氨基酸序列的多肽的细胞或组织溶解，在还原条件下使每个泳道的蛋白量为0.1~30μg，通过SDS-PAGE法进行电泳。将电泳后的蛋白转印到PVDF膜上，在含有1%BSA的PBS(以下记作BSA-PBS)中在室温下反应30分钟，进行封闭操作。
在此，使本发明的单克隆抗体进行反应，用含有0.05%的吐温-20的PBS(以下记作吐温-PBS)进行洗涤，并使过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG在室温下反应2小时。用吐温-PBS洗涤，使用ECLTM蛋白免疫印迹检测试剂(Amersham公司制造)等对结合有单克隆抗体的条带进行检测，由此，可以检测出具有序列号2表示的氨基酸序列的多肽。
作为蛋白免疫印迹法的检测中使用的抗体，可以使用能够与未保持天然型立体结构的多肽结合的抗体。
物理化学方法具体而言可以如下进行：使用本发明的抗体或该抗体片段，使作为抗原的结合半乳糖缺失的O型糖链的CD27与本发明的抗体或该抗体片段结合，由此形成凝集体，并对该凝集体进行检测。
除此以外，作为物理化学方法，可以列举例如：毛细管法、一维免疫扩散法、免疫比浊法和乳胶免疫比浊法等[临床检查法提要，金原出版，499(1998)]。
例如，乳胶免疫比浊法中，使用以抗体或抗原致敏的粒径约0.1μm~约1μm的聚苯乙烯乳胶等载体，利用对应的抗原或抗体引起抗原抗体反应时，反应液中的散射光增加，透射光减少。将该变化以吸光度或积分球浊度的形式进行检测，由此可以测定受试样品中的抗原浓度等。
由于本发明的抗体或该抗体片段能够与糖链缺陷CD27多肽的胞外域结合，因此，可以适合用于检测表达该多肽的细胞。在表达该多肽的细胞的检测中，可以使用公知的免疫学检测方法，优选使用免疫沉淀法、免疫细胞染色法和免疫组织染色法等。另外，也可以应用使用FMAT8100HTS系统(美国应用生物系统公司制造)的荧光抗体染色法等。
免疫沉淀法是指如下方法：使表达该多肽的细胞等与本发明的单克隆抗体或抗体片段反应，然后，加入蛋白G-琼脂糖等对免疫球蛋白具有特异性结合能力的载体而使抗原抗体复合物沉淀。或者，也可以通过如下方法来进行。
使上述本发明的抗体或该抗体片段固相化于ELISA用96孔板上，然后，利用BSA-PBS进行封闭。在抗体为未纯化的状态例如杂交瘤培养上清等未纯化状态的情况下，使抗小鼠免疫球蛋白或大鼠免疫球蛋白或者蛋白A或G等预先固相化于ELISA用96孔板上，用BSA-PBS封闭后，分注杂交瘤培养上清而使其进行结合。
弃去BSA-PBS，用PBS充分洗涤后，使表达具有序列号2表示的氨基酸序列的多肽的细胞或组织的溶解液进行反应。用SDS-PAGE用样品缓冲液从充分洗涤后的板上提取出免疫沉淀物，通过上述蛋白免疫印迹法进行检测。
免疫细胞染色法和免疫组织染色法是指如下的荧光抗体染色法：将表达抗原的细胞或组织等根据需要用表面活性剂和甲醇等进行处理以增加抗体的透过性，然后使本发明的抗体进行反应，进而使实施过FITC等荧光标记、过氧化物酶等酶标记、生物素标记等的抗免疫球蛋白抗体或结合片段进行反应，然后，使该标记可见化并利用显微镜进行显微观察，或者使细胞与荧光标记的抗体反应并利用流式细胞仪进行分析(流式细胞术)。
例如，可以使用文献[Monoclonal Antibodies-Principles and practice，第三版，美国学术出版社(1996)；単クロ一ン抗体実験マニユアル，講談社サイエンライフイツク(1987)]等中记载的方法来进行。
特别是，由于本发明的抗体或该抗体片段能够与糖链缺陷CD27的胞外域结合，因此，可以优选用于对保持天然型立体结构而表达在细胞膜上的CD27进行检测的流式细胞术的分析。
另外，通过使用利用荧光抗体染色法原理的FMAT8100HTS系统(美国应用生物系统公司制造)，可以在无需将所形成的抗体-抗原复合物与未参与抗体-抗原复合物形成的游离抗体或抗原进行分离的情况下测定抗原量或抗体量。
5.使用本发明的特异性识别并结合糖链缺陷CD27多肽的单克隆抗体或该抗体片段的疾病治疗方法
本发明的特异性识别糖链缺陷CD27多肽且与该胞外域结合的单克隆抗体或其抗体片段可以用于治疗与糖链缺陷CD27多肽相关的疾病。
作为与糖链缺陷CD27多肽相关的疾病，只要是在生物体内发现表达该多肽的细胞的疾病则可以为任何疾病，可以列举例如IgA肾病和癌症等。
此外，作为疾病，还可以列举患有IgA肾病并表现肾病综合征的疾病和表现肾衰竭的疾病。
作为癌症，可以列举例如造血器官起源的肿瘤(也称为血液癌)和上皮起源的实体癌。
作为血液癌，具体而言，可以列举例如：白血病和淋巴瘤(霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤)、多发性骨髓瘤等。
作为具体的非霍奇金淋巴瘤，可以列举例如：套细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、小淋巴细胞性白血病、伯基特淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、粘膜相关淋巴组织淋巴瘤、弥漫性大细胞淋巴瘤和浆细胞瘤等。
作为实体癌，具体而言，可以列举例如：乳腺癌、子宫癌、大肠癌、胃癌、卵巢癌、肺癌、肾癌、直肠癌、甲状腺癌、子宫颈癌、小肠癌、前列腺癌和胰腺癌等。
作为本发明的治疗剂，可以列举以本发明的抗体或该抗体片段作为有效成分的癌治疗剂。具有ADCC活性和CDC活性等效应活性的癌治疗剂以及利用凋亡诱导作用的癌治疗剂等也包括在本发明的治疗剂中。
本发明的抗体或该抗体片段能够识别在细胞膜上表达的糖链缺陷CD27多肽，因此，能够识别生物体内存在的表达糖链缺陷CD27多肽的细胞。
因此，作为本发明的抗体或该抗体片段且具有效应活性的抗体或该抗体片段能够在体内和体外杀伤表达糖链缺陷CD27多肽的细胞。
另外，上述本发明的抗体或该抗体片段能够杀伤生物体内的表达糖链缺陷CD27多肽的细胞而使其减少，因此，可以特别有效地用作治疗剂。
含有本发明的抗体或该抗体片段或者它们的衍生物的治疗剂可以仅含有作为有效成分的该抗体或该抗体片段或者它们的衍生物，通常优选以与药理学上可容许的一种以上的载体一同混合并通过制剂学技术领域中公知的任意方法制造而成的医药制剂的形式来提供。
施用途径优选使用治疗时最有效的途径，可以列举：经口施用或者口腔内、气管内、直肠内、皮下、肌肉内和静脉内等非经口施用。在抗体或肽制剂的情况下，可以优选列举静脉内施用。
作为施用形式，可以列举例如：喷雾剂、胶囊剂、片剂、颗粒剂、糖浆剂、乳剂、栓剂、注射剂、软膏和胶带剂等。
作为适于经口施用的制剂，可以列举例如：乳剂、糖浆剂、胶囊剂、片剂、散剂、颗粒剂等。乳剂和糖浆剂这样的液体制备物可以使用如下成分作为添加剂来制造：水、蔗糖、山梨醇和果糖等糖类，聚乙二醇和聚丙二醇等二醇类，芝麻油、橄榄油和大豆油等油类，对羟基苯甲酸酯等防腐剂，草莓香料和薄荷等香料类。
胶囊剂、片剂、散剂和颗粒剂等可以使用如下成分作为添加剂来制造：乳糖、葡萄糖、蔗糖和甘露醇等赋形剂，淀粉和海藻酸钠等崩解剂，硬脂酸镁和滑石等润滑剂，聚乙烯醇、羟丙基纤维素和明胶等粘结剂、脂肪酸酯等表面活性剂、以及甘油等增塑剂等。
作为适于非经口施用的制剂，可以列举例如：注射剂、栓剂和喷雾剂等。注射剂使用包含氯化钠溶液、葡萄糖溶液以及两者的混合物的载体等来制备。栓剂使用可可脂、氢化脂肪或羧酸等载体来制备。另外，喷雾剂使用该抗体或抗体片段本身以及不刺激接受者的口腔和气管粘膜并且使该抗体或抗体片段分散为微细粒子而容易吸收的载体等来制备。
作为载体，具体可以例示乳糖、甘油等。根据抗体或抗体片段和使用的载体的性质，可以为气溶胶和干粉等制剂。另外，也可以向这些非经口剂中添加在经口剂中作为添加剂而例示的成分。
施用量或施用次数根据目标治疗效果、施用方法、治疗时间、年龄、体重等而不同，通常成人每天为10μg/kg~8mg/kg。
以下，通过实施例更具体地对本发明进行说明，但本发明不受下述实施例的限定。
实施例
[实施例1]包含未结合半乳糖的O连接型糖链的可溶型CD27胞外域的制作(以下有时也记作糖链缺陷CD27)
(1)人CD27基因的克隆
按照以下的步骤从购自クロンテツク公司的人末梢血来源的cDNA文库中分离出编码CD27的基因。在含有1倍浓度的BD Advantage PCR缓冲液(クロンテツク公司制造)和1倍浓度的附带的dNTP的反应液中使用25ng人末梢血单核细胞来源的单链cDNA、0.2微摩尔/升cd27fw(序列号3)、0.2微摩尔/升cd27809B(序列号4)和1倍浓度的Advantage 2PCR聚合酶混合物(クロンテツク公司制造)，调节至总计50μL，进行PCR反应。
反应条件为：以98℃下15秒、68℃下30秒为1次循环，进行30次循环。将该反应液用2%的琼脂糖凝胶电泳进行分离，然后，使用TOPO TA克隆试剂盒(英杰公司制造)依照附带的使用说明书将约1kbp的PCR产物插入pCR-2.1载体中。使用插入有PCR扩增片段的质粒对大肠杆菌进行转化，制备由各克隆得到的质粒，并对DNA序列进行确认，结果，获得具有序列号1所示的DNA序列的pCR 2.1CD27(图1)。
(2)克隆有具有人CD27胞外域的基因的质粒的构建
接着，通过进行如下所示的PCR反应，分离出编码将存在于C末端侧的跨膜区除去后的CD27的cDNA。在含有0.2毫摩尔/升dNTPs、1毫摩尔/升氯化镁的反应液中使用1ng的pCR 2.1CD27、1微摩尔/升CD27-A(序列号5)、1微摩尔/升CD27-B(序列号6)和2.5单位的KOD聚合酶(东洋纺公司制造)，调节至总计50μL，在下述条件下进行PCR反应：以98℃下15秒、68℃下30秒为1次循环，进行25次循环。
将上述反应液用2%的琼脂糖凝胶电泳进行分离，然后，使用ZeroBlunt PCR克隆试剂盒(英杰公司制造)，依照附带的使用说明书将约600bp的PCR产物导入pCR-Blunt载体中。将克隆有该具有人CD27胞外域的基因的质粒记作pCRCD27axb(图2)。
(3)具有突变型人IgG4Fc段的载体pBShCγ4SP的构建
使用国际公开第97/10354号中记载的具有编码野生型人IgG4亚类的C区的cDNA的质粒pBShCγ4，构建具有将野生型人IgG4亚类的C区(铰链区)的第108位的Ser取代成Pro的突变型人IgG4亚类的C区的质粒pBShCγ4SP。已知通过进行该修饰，使借助IgG铰链区进行的二聚体形成变得稳定(分子免疫学，30,105,1993)。
制备含有1ng质粒pBShCγ4作为模板的50μL的反应液[10mMTris-HCl(pH8.3)、50mM氯化钾、1.5mM氯化镁、0.001%明胶、200μMdNTPs、0.5μM引物1(序列号7)、0.5μM引物2(序列号8)和2单位的TaKaRa Ex Taq DNA聚合酶]，使用GeneAmp PCR系统9700(パ一キンエルマ一公司制造)，以94℃下2分钟、55℃下2分钟、72℃下2分钟为1次循环，进行30次循环。
使用QIAquick PCR纯化试剂盒(キアゲン公司制造)，依照附带的使用说明书对反应液进行纯化，然后，用限制性酶EcoT14I(タカラバイオ公司制造)进行处理，利用0.8%的琼脂糖凝胶电泳进行分离，然后，使用QIAquick凝胶提取试剂盒(キアゲン公司制造)，依照附带的使用说明书回收扩增片段。
将质粒pBShCγ4用限制性酶EcoT14I切割后，通过碱性磷酸酶(タカラバイオ公司制造)处理而除去5’末端的磷酸，同样地用0.8%的琼脂糖凝胶电泳进行分离，然后，使用QIAquick凝胶提取试剂盒，依照附带的使用说明书回收质粒片段。将回收的扩增片段与质粒pBShCγ4来源的质粒片段连接，构建包含目标cDNA的质粒pBShCγ4SP(图3)。
(4)包含人IgG4Fc的部分序列的cDNA的克隆
通过进行以下所示的PCR反应，对在5’末端具有限制性酶BamHI位点且在3’末端具有SalI限制性酶的编码人IgG4Fc的DNA片段进行扩增。在含有0.2毫摩尔/升dNTPs、1毫摩尔/升氯化镁的反应液中使用25ng上述(3)中构建的pBShCγ4SP、1微摩尔/升g4A(序列号9)、1微摩尔/升g4B(序列号10)和2.5单位的KOD聚合酶(东洋纺公司制造)，调节至总计50μL，进行PCR反应。
反应条件为：以98℃下15秒、68℃下30秒为1次循环，进行25次循环。将该反应液利用2%的琼脂糖凝胶电泳进行分离，然后，使用Zero Blunt PCR克隆试剂盒(英杰公司制造)，依照附带的使用说明书将约700bp的PCR产物导入pCR-Blunt载体中。将该质粒记作pCRIgG4FcBamHISalI(图4)。
(5)动物细胞用表达载体pKANTEX XhoI/SalI的构建
将国际公开第97/10354号中记载的人源化抗体表达载体pKANTEX93用限制性酶XhoI(タカラバイオ公司制造)和限制性酶SalI(タカラバイオ公司制造)进行消化，然后，利用0.8%的琼脂糖凝胶电泳进行分离后，使用凝胶提取试剂盒(キアゲン公司制造)回收约9.8kbp的质粒片段。使用DNA连接试剂盒(タカラバイオ公司制造)将回收的DNA片段的5’末端与3’末端连接，使用所得的重组质粒DNA对大肠杆菌DH5α株(东洋纺织公司制造)进行转化。
使用QIAprep Spin小量提取试剂盒(キアゲン公司制造)从所得的多个氨苄西林抗性菌落中分离出重组质粒DNA，并利用限制性酶NotI(タカラバイオ公司制造)和KpnI(タカラバイオ公司制造)消化来确认抗体L链的表达单元已被除去。将该质粒命名为pKANTEX XhoI/SalI(图5)。
(6)可溶型CD27胞外域表达质粒pKANTEX CD27IgG4Fc的制作
使将上述(2)中制作的pCR 2.1CD27axb用NotI和BamHI消化而得到的约600bp的片段和将上述(3)中制作的pCRIgG4FcBamHISalI用BamHI和SalI消化而得到的约700bp的DNA片段与将上述(5)中得到的pKANTEX XhoI/SalI用NotI和SalI消化而得到的约8.8kbp的DNA片段连接，由此得到用于表达CD27-Fc的质粒pKANTEXCD27IgG4Fc(图6)。
将上述质粒所编码的可溶型CD27-Fc融合蛋白(以下有时也记作CD27-Fc)的基因序列记作序列号11，将该可溶型CD27-Fc融合蛋白的氨基酸序列记作序列号12。将使用该表达载体转化后的大肠杆菌接种到100mL的LB培养基中，培养过夜后进行回收，使用Qiafilter质粒中量纯化试剂盒(Qiafilter Plasmid midi kit)(キアゲン公司制造)，依照附带的规程对质粒进行纯化。
纯化后，将30μg的质粒载体用限制性酶AatII进行消化，由此使其线性化。线性化之后，进行苯酚/氯仿抽提和乙醇沉淀，溶解于1/10浓度的TE缓冲液(1mM Tris HCl,0.1mM EDTA)后，测定DNA浓度，并供于基因导入。
(7)CD27-Fc的表达
CD27-Fc表达质粒pKANTEX CD27IgG4Fc向CHO/DG44细胞(Somatic Cell and Molecular Genetics,12,555(1986)；以下记作DG44)或Lec8细胞中的导入可以依据电穿孔法[サイトテクノロジ一,3,133(1990)]按照以下步骤进行。
首先，将在基础培养基[添加有10%胎牛透析血清(英杰公司)、50μg/mL庆大霉素(ナカライテスク公司)和1×HT添加剂(英杰公司制造)的伊思考夫改良的杜尔贝科培养基(Iscove’s Modified Dulbecco’sMedium)(英杰公司)]中传代的DG44细胞悬浮于K-PBS缓冲液[137毫摩尔/升KCl、2.7毫摩尔/升NaCl、8.1毫摩尔/升Na2HPO4、1.5毫摩尔/升KH2PO4、4.0毫摩尔/升MgCl2]中，使其达到8×106个/mL，制备细胞悬浮液。
将200μL(1.8×106个)制备好的细胞悬浮液与10μg上述(6)中制备的线性化质粒pKANTEXCD27IgG4Fc混合。但是，Lec8细胞的传代在未添加1×HT添加剂的基础培养基(以下记作HT-培养基)中进行。
将该细胞DNA混合液转移到Gene Pulser电击杯(电极之间的距离为2mm)(BIO-RAD公司)中，然后，使用基因导入装置GenePulser(BIO-RAD公司)，在脉冲电压为0.35KV、电容为250μF的条件下进行基因导入。
将该细胞悬浮液混合到10mL的HT-培养基[添加有10%胎牛透析血清(英杰公司制造)和50μg/mL庆大霉素(ナカライテスク公司)的伊思考夫改良的杜尔贝科培养基(英杰公司制造)]中，接种到75cm2的贴壁细胞用烧瓶(葛莱娜公司制造)中，在37℃、5%CO2的培养箱内进行培养。培养3天后，添加G418(西格玛公司制造)使终浓度达到0.5mg/mL，再培养10天。
10天后，传代到182cm2的贴壁细胞用烧瓶(葛莱娜公司制造)中，继续培养至铺满。在达到铺满的时刻，将培养基更换为无血清培养基EXCELL301(JRH Bioscience公司制造)，培养一周后，回收培养上清，通过以下记载的方法进行纯化。
(8)CD27-Fc的纯化
将(7)中进行培养而得到的培养上清在3000rpm、4℃的条件下进行10分钟的离心分离，回收上清后，使用孔径为0.22μm的PES膜(旭テクノグラス公司制造)对上清进行过滤。向内径为0.8cm的柱中填充0.5mL的Mab Select(Amersham Pharmacia Biotech公司制造)，依次使3.0mL纯化水和3.0mL的0.2M硼酸-0.15M NaCl缓冲液(pH7.5)(以下记作硼酸缓冲液)过柱。
进而，依次用2.0mL 0.1M柠檬酸缓冲液(pH3.5)和1.5mL硼酸缓冲液进行洗涤，由此进行载体的平衡化。接着，使上述培养上清过柱，然后，用3.0mL硼酸缓冲液进行洗涤。洗涤后，使用1.25mL 0.1M柠檬酸缓冲液(pH3.5)对吸附在载体上的抗体进行洗脱。
洗脱时，获得每个级分各为250μL的5个级分。接着，对所得的纯化级分进行SDS-PAGE分析，将确认到洗脱出目的蛋白的级分合并，使用PBS缓冲液在4℃下透析一昼夜。
透析后，回收CD27-Fc溶液，使用孔径为0.22μm的Millex GV(密理博公司)进行灭菌过滤，然后，使用吸光光度计(SHIMADZU UV-1700)测定280nm的吸光度(OD280nm)，并计算出CD27-Fc的浓度(OD280nm=1.0时，换算为0.68mg/mL；由εM=134655，MW=92840计算)。
从各宿主细胞来源的CD27-Fc表达细胞的约300mL无血清培养液上清中得到3.6mg的Lec8来源的CD27-Fc、2.2mg的CHO/DG44来源的CD27-Fc。将对各蛋白质的洗脱级分进行SDS-PAGE分析而得到的结果示于图7中。
结果，在还原条件下，以DG44作为宿主的情况下，在分子量约65kDa的位置处观察到CD27-Fc，以Lec8作为宿主的情况下，在分子量约48kDa的位置处观察到CD27-Fc。另一方面，在非还原条件下，在分子量约为还原条件下观察到的条带的2倍的位置处观察到各自的条带，因此能够确认，CD27-Fc以二聚体的形式存在。
(9)糖链结构的确认
向16μL将上述(8)中纯化的CD27-Fc用PBS稀释至10倍的溶液中添加4μL 5倍浓度的SDS样品缓冲液，然后，在90℃下进行5分钟处理，将所得物供于SDS-PAGE。电泳中，使用5-20%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶e-PAGEL(ATTO公司制造，目录号E-T520L)，在ATTOラピダス·ミニスラブ电泳槽中，以20mA/片的电流进行90分钟的电泳。
向PVDF膜(Millipore Immobilon公司制造，目录号IPVH304F0)上的转印使用ATTOホライズブロツト，在180mA、90分钟的条件下进行。将转印后的膜浸渍到含有10%BSA的PBS(以下记作10%BSA-PBS)中，在4℃下静置过夜，由此进行封闭。
然后，加入使用1%BSA-PBS制备成5μg/mL的抗RCAS1抗体克隆22-1-1(MBL公司制造，目录号D060-3)，在室温下反应2小时。用0.05%吐温-20-PBS(和光纯药公司制造，目录号167-11515)在室温下洗涤30分钟后，使用以1%BSA-PBS稀释2000倍后的二次抗体过氧化物酶标记的兔抗小鼠免疫球蛋白(DAKO公司制造，目录号P0161)在室温下反应1小时。
用0.05%吐温-20-PBS在室温下洗涤30分钟，然后，使用ECL蛋白免疫印迹检测试剂(Amersham Pharmacia Biotech公司制造，目录号RPN2106)进行检测。将其结果示于图8中。
由SDS-PAGE分析的结果可以明确，DG44来源的CD27-Fc的分子量大于Lec8来源的CD27-Fc的分子量，通过以DG44细胞和Lec8细胞作为宿主细胞，使与CD27-Fc结合的糖链结构不同。
另外可以明确，抗RCAS1抗体22-1-1识别作为O连接型糖链的Tn抗原，其作为抗Tn抗体而已知[J.B.C.,278,22998-23007,(2003)]。
作为抗Tn抗体的抗RCAS-1抗体克隆22-1-1完全不与DG44来源的CD27-Fc结合，但与Lec8来源的CD27-Fc特异性结合。确认到由Lec8生产的CD27-Fc上结合有作为未结合半乳糖的O型糖链的Tn抗原。
[实施例2]
在细胞膜上表达CD27的CHO细胞的制作
(1)CD27表达质粒pKANTEX CD27的构建
通过以下所示的PCR反应，由实施例1中制成的pCR 2.1CD27制作将基因表达中不需要的cDNA部分除去后的cDNA片段。
在含有0.2毫摩尔/升dNTPs、1毫摩尔/升氯化镁的反应液中使用1ng的pCR 2.1CD27、1微摩尔/升CD27-A(序列号5)、1微摩尔/升CD27-C(序列号13)和2.5单位的KOD聚合酶(东洋纺公司制造)，调节至总计50μL，进行PCR反应。
反应条件为：以98℃下15秒、68℃下30秒为1次循环，进行25次循环。将该反应液用2%的琼脂糖凝胶电泳进行分离，然后，使用ZeroBlunt PCR克隆试剂盒(英杰公司制造)，依照附带的使用说明书将约800bp的PCR产物导入pCR-Blunt载体中，从而获得具有序列号1所示的DNA序列的pCR27axc(图9)。
接着，使将pCR27axc用限制性酶NotI和限制性酶SalI消化而得到的约780bp的DNA片段与将实施例1中制作的pKANTEX XhoI/SalI用限制性酶NotI和限制性酶SalI消化而得到的约8.9kbp的DNA片段连接，由此，构建用于表达CD27的质粒pKANTEX CD27(图10)。
将该质粒所编码的CD27基因序列记作序列号1，将由该基因翻译而成的氨基酸序列记作序列号2。将使用该表达载体转化后的大肠杆菌接种到100mL的LB培养基中，培养过夜。培养后，回收菌体，使用Qiafilter质粒中量纯化试剂盒(キアゲン公司制造)，依照附带的规程对质粒进行纯化。
纯化后，将30μg的质粒载体用限制性酶AatII进行消化，由此使其线性化。线性化之后，进行苯酚/氯仿抽提和乙醇沉淀，溶解于1/10浓度的TE缓冲液(1mM Tris HCl,0.1mM EDTA)后，测定浓度，并进行基因导入。
(2)CD27表达质粒pKANTEX CD27的导入
将上述(1)中制作的CD27表达质粒pKANTEX CD27基因导入到Lec8细胞和CHO/DG44细胞中，由此，建立用于表达CD27的Lec8细胞和DG44细胞。除了使用pKANTEXCD27作为导入的质粒以外，通过实施例1中记载的方法实施。
但是，基因导入后的细胞悬浮于30mL的HT-培养基中，以100μL/孔的量接种到3块96孔板中。接种2天后，更换为含有500μg/mL G418的传代用培养基，进行10天的培养。10天后，更换为含有50nMMTX(Sigma aldrich公司制造)的HT-培养基，从而获得MTX抗性株。将Lec8株来源的CD27表达株命名为CD27/Lec8-4，另一方面，将DG44细胞来源的CD27表达细胞命名为CD27/DG44-8。
(3)CD27表达细胞的确认
为了确认(2)中制作的CD27表达细胞的CD27表达，使用流式细胞仪(FCM)如下进行分析。
分取1~5×106个CD27表达细胞至15mL管(BD公司制造)中，离心分离(1500rpm、5分钟)后，除去上清，悬浮于50μL的含有1%牛血清白蛋白的PBS缓冲液[以下记作1%BSA-PBS(ユ一ジンバイオ公司制造)]中。
添加10μL由PC5标记的抗CD27小鼠单克隆抗体(贝克曼库尔特公司制造，目录号6607107)或PC5标记的小鼠IgG1同种型对照(贝克曼库尔特，目录号6607012)作为一次抗体，在冰温下反应60分钟。反应后，用1mL的1%BSA-PBS洗涤两次，然后，将细胞悬浮于500μL的1%BSA-PBS中，利用流式细胞仪(FCM)(BD公司制造)测定荧光强度。
将其结果示于图11中。如图11所示，确认到：CD27/Lec8-4和CD27/DG44-8以大致相同的程度在细胞膜上表达CD27。
[实施例3]
抗包含未结合半乳糖的O连接型糖链的CD27的单克隆抗体(以下记作抗糖链缺陷CD27单克隆抗体)的制作
(1)免疫原的制备
将50μg实施例1中得到的Lec8株生产的CD27-Fc与2mg氢氧化铝佐剂(Antibodies-A Laboratory Manual，冷泉港实验室，第99页，1988)和1×109个细胞的百日咳疫苗(千叶县血清研究所制造)一起施用给3只4周龄的雌性SD大鼠。
从施用2周后开始，每周施用一次50μg的Lec8株生产的CD27-Fc，共计施用3次。从尾静脉进行部分采血，通过使用ABI8200细胞检测系统(美国应用生物公司制造)或流式细胞仪(Cytomics FC500MPL，贝克曼库尔特公司制造)进行的荧光细胞染色法测定所得的抗血清的结合活性，在末次免疫3天后，从显示出足够抗体效价的小鼠中摘除脾脏。
将脾脏在MEM(最小必需培养基)培养基(日水制药公司制造)中细细切碎，用镊子搅散，并离心分离(1200rpm，5分钟)。向所得的沉淀级分中添加Tris-氯化铵缓冲液(pH7.6)，处理1~2分钟，由此除去红细胞。将所得的沉淀级分(细胞级分)用MEM培养基洗涤3次，用于细胞融合。
(2)结合ELISA
用于结合ELISA的抗原分别使用实施例1中得到的Lec8株生产的CD27-Fc和DG44细胞生产的CD27-Fc。将5μg/mL上述CD27-Fc蛋白以50μL/孔分注到96孔ELISA用板(葛莱娜公司)中，在4℃下放置过夜以使其吸附。
将该板洗涤后，以100μL/孔加入1%BSA-PBS，在室温下放置1小时，对残余的活性基团进行封闭。放置后，弃去1%BSA-PBS，向该板中以50μL/孔分注被免疫动物抗血清或杂交瘤培养上清作为一次抗体，放置2小时。
将该板用0.05%的聚氧乙烯(20)失水山梨醇单月桂酸酯[(与ICI公司的商标“吐温20”相当的产品，和光纯药公司制造)]-PBS(以下记作吐温-PBS)洗涤后，以50μL/孔加入过氧化物酶标记的兔抗大鼠免疫球蛋白(Zymed公司)作为二次抗体，在室温下放置1小时。
将该板用吐温-PBS洗涤后，添加ABTS[2,2-连氮基双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)铵]底物液[1毫摩尔/升ABTS-0.1摩尔/升柠檬酸缓冲液(pH4.2)、0.1%H2O2]使其显色，使用酶标仪(Emax；分子仪器公司)测定OD415nm的吸光度。
(3)荧光细胞染色法(ABI8200细胞检测系统分析)
使用实施例2中制作的CD27/Lec8-4和CD27/DG44-8作为分析用细胞。将使用添加有50nM MTX和500ng/mL G418的传代用培养基进行传代的CD27/Lec8-4和CD27/DG44-8用0.05%的胰蛋白酶溶液(英杰公司制造)剥离，以每孔为1×104个/100μL培养基的量接种到ABI8200用黑色96孔板中，并培养过夜。
向该板中以10μL/孔分注被免疫大鼠抗血清或杂交瘤培养上清作为一次抗体，以100μL/孔加入ALEXA647标记的抗大鼠免疫球蛋白G(H+L)(英杰公司制造)作为二次抗体，避光放置4小时。使用ABI 8200细胞检测系统(应用生物公司制造)测定由激光633He/Ne激发的650~685nm的荧光。
(4)荧光细胞染色法(流式细胞术分析)
使用实施例2中制作的CD27/Lec8-4和CD27/DG44-8作为分析用细胞。将使用添加有50nM MTX和500μg/mL G418的HT-培养基进行传代的CD27/Lec8-4和CD27/DG44-8用0.02%的EDTA溶液(ナカライテスク公司制造)剥离，然后，将各细胞用PBS进行洗涤。
洗涤后，将1~5×105个细胞悬浮于50μL的1%BSA-PBS中，然后，以50μL/孔分注被免疫大鼠抗血清或杂交瘤培养上清作为一次抗体，并在冰温下反应30分钟。
另外，使用牛血清白蛋白、小鼠IgG1同种型对照(ユスモバイオ公司制造)和大鼠IgG2a同种型对照(ユスモバイオ公司制造)作为阴性对照，使用抗RCAS1抗体22-1-1(MBL公司制造)和抗CD27小鼠单克隆抗体(贝克曼库尔特公司制造)作为阳性对照，使它们同时进行反应。
反应后，使用PBS进行两次离心分离来洗涤细胞，以50μL/孔加入ALEXA488标记的抗大鼠免疫球蛋白G(H+L)(英杰公司制造)作为二次抗体，在冰温下避光反应30分钟。再次使用PBS进行两次离心分离来洗涤细胞，然后，悬浮于500μL的1%BSA-PBS中，使用流式细胞仪(贝克曼库尔特公司制造，Cytomics FC500MPL)测定由488nm的氩激光激发的510~530nm的荧光。
(5)小鼠骨髓瘤细胞的制备
将8-氮杂鸟嘌呤抗性小鼠骨髓瘤细胞系P3X63Ag8U.1(P3-U1；购自ATCC)在正常培养基(10%FCS RPMI培养基)中进行培养，确保细胞融合时达到2×107个以上的细胞，并作为亲本株供于细胞融合。
(6)杂交瘤的制作
将上述(1)中得到的小鼠脾细胞与上述(5)中得到的骨髓瘤细胞以10:1的比例进行混合，并离心分离(250×g，5分钟)。将所得沉淀级分的细胞群充分搅散，然后，在搅拌的同时在37℃下以每108个小鼠脾细胞为0.5mL的量加入1g聚乙二醇-1000(PEG-1000)、1mL MEM培养基和0.35mL二甲亚砜的混合溶液，并每隔1~2分钟向该悬浮液中加入1mL MEM培养基，重复数次后，进一步加入MEM培养基至总量达到50mL。
将该悬浮液进行离心分离(900rpm、5分钟)，轻轻地将所得沉淀级分的细胞搅散后，通过用刻度吸管吸入并吹出，轻轻地将细胞悬浮于100mL HAT培养基[在添加有10%胎牛血清的RPMI培养基中加入HAT培养基添加剂(英杰公司制造)而得到的培养基]中。
将该悬浮液以200μL/孔分注到96孔培养用板中，在5%CO2培养箱中在37℃下培养8~10天。培养后，使用上述(3)和上述(4)中记载的荧光细胞染色法，筛选出培养上清与CD27/Lec8-4反应且不与CD27/DG44-8和Lec8细胞反应的孔，利用有限稀释法由该孔中含有的细胞进行两次克隆，获得单细胞克隆。
结果，建立了产生与糖链缺陷CD27特异性结合的单克隆抗体KM4030或KM4031的杂交瘤KM4030和KM4031(图12)。通过同样的方法，建立了产生与糖链缺陷CD27特异性反应的单克隆抗体KM4026、KM4027或KM4028的杂交瘤KM4026、KM4027和KM4028。
上述产生与糖链缺陷CD27特异性结合的单克隆抗体的杂交瘤通过如下方法获得：通过利用与糖链合成途径相关的酶、转运蛋白的活性未缺失的DG44株和UDP-半乳糖转运蛋白的活性降低或缺失的Lec8株，制作分别表达正常糖链CD27和糖链缺陷CD27的重组细胞，设计出能够筛选不与表达正常糖链CD27的细胞和Lec8株结合而仅与表达糖链缺陷CD27的细胞特异性结合的单克隆抗体的系统，进行约6000孔规模的筛选分析。
(7)单克隆抗体的纯化
将上述(6)中得到的杂交瘤株以5~20×106个细胞/只的量对姥鲛烷处理后的7周龄雌性小鼠(ICR)进行腹腔内注射。10~21天后，杂交瘤产生癌性腹水，由此，从积存有腹水的小鼠中收集腹水(1~8mL/只)。将该腹水用针筒过滤器(孔径为5μm)过滤，除去固体成分。
纯化的IgG单克隆抗体通过利用辛酸沉淀法[Antibodies-ALaboratory Manual，冷泉港实验室(1988)]进行纯化而获得。单克隆抗体的亚类的确定通过使用亚类分型试剂盒(大鼠单克隆抗体同种型分型试剂盒，DSファ一マバイオメデイカル公司制造)的结合ELISA来进行。
结果表明，就各抗体的亚类而言，抗糖链缺陷CD27单克隆抗体KM4026为大鼠IgG2a类，抗糖链缺陷CD27单克隆抗体KM4027为大鼠IgG2b类，抗糖链缺陷CD27单克隆抗体KM4028为大鼠IgG1类，抗糖链缺陷CD27单克隆抗体KM4030为大鼠IgG2a类，抗糖链缺陷CD27单克隆抗体KM4031为大鼠IgG1类。
[实施例4]
抗糖链缺陷CD27特异性单克隆抗体的反应性的研究
使用以下所示的竞争ELISA系统来研究抗糖链缺陷CD27单克隆抗体KM4030和KM4031的反应特异性。将实施例1中得到的Lec8株生产的CD27-Fc在5μg/mL的浓度下以50μL/孔分注到96孔ELISA板(葛莱娜公司制造)中，在4℃下放置过夜以使其吸附。
将该板洗涤后，以200μL/孔加入1%BSA-PBS，在室温下放置1小时，对残余的活性基团进行封闭。放置后，弃去1%BSA-PBS，向该板中以50μL/孔分注稀释后的抗糖链缺陷CD27单克隆抗体KM4030纯化抗体或KM4031纯化抗体作为一次抗体。
同时，以20μg/mL、2μg/mL、0.2μg/mL、0.02μg/mL的浓度加入Lec8生产的CD27-Fc蛋白、DG44生产的CD27-Fc蛋白或人免疫球蛋白作为结合竞争物质，并使抗体与结合竞争物质共存。
将板在室温下放置2小时后，用0.05%的聚氧乙烯(20)失水山梨醇单月桂酸酯[(与ICI公司的商标“吐温20”相当的产品，和光纯药公司制造)]-PBS(以下记作吐温-PBS)洗涤后，以50μL/孔加入过氧化物酶标记的兔抗大鼠免疫球蛋白(Zymed公司制造)作为二次抗体，在室温下放置1小时。
将该板用吐温-PBS洗涤后，添加ABTS[2,2-连氮基双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)铵]底物液[1毫摩尔/升ABTS-0.1摩尔/升柠檬酸缓冲液(pH4.2)、0.1%H2O2]使其显色，然后，使用酶标仪(Emax；分子仪器公司)测定OD415nm的吸光度。
图13中示出了抗糖链缺陷CD27单克隆抗体KM4030和KM4031的竞争ELISA的结果。由该结果表明，DG44生产的CD27-Fc和人免疫球蛋白不抑制抗糖链缺陷CD27单克隆抗体KM4030和KM4031与结合Tn抗原的CD27-Fc的结合，但结合Tn抗原的CD27-Fc抑制上述结合。
另外，对抗糖链缺陷CD27单克隆抗体KM4026、KM4027和KM4028也得到了同样的结果。由上述结果表明，本发明的抗糖链缺陷CD27单克隆抗体KM4026、KM4027、KM4028、KM4030和KM4031特异性地识别糖链缺陷CD27。
图28(A)和(B)中示出了利用BIACORE对抗糖链缺陷CD27单克隆抗体KM4026、KM4027、KM4028、KM4030和KM4031与抗糖链缺陷CD27嵌合抗体的糖链缺陷CD27-Fc结合的活性进行评价而得到的结果。结合活性的测定通过使用BiacoreT100(GE医疗集团生命科学部门制造)并利用表面等离子体共振法(SPR法)来进行。
使用胺偶联试剂盒(BIACORE公司制造)，依照附带的规程，通过胺偶联法将抗人IgG4抗体(Pharmingen公司制造)固定到CM5传感芯片(GE医疗集团生命科学部门制造)上。
添加使用Prozyme Glyco酶去糖基化试剂盒(Prozyme公司制造)和ProO-Link Extender去糖基化添加物(Prozyme公司制造)的涎酸酶A或β(1-4)半乳糖苷酶、依照附带的规程对实施例1(7)中得到的DG44产生的CD27-Fc进行糖链消化酶处理而得到的Tn抗原型CD27-Fc或涎酸化Tn抗原型CD27-Fc，将其捕获到固定有抗人IgG4抗体的芯片上以达到200-250RU(resonance unit，共振单位)。
然后，使从20000ng/mL开始以五个梯度进行稀释后的测定样品(抗糖链缺陷CD27单克隆抗体KM4026、KM4027、KM4028、KM4030和KM4031)以30μL/分钟的流速在芯片上流过，获得各浓度的传感图，并使用装置附带的分析软件BiacoreT100评价软件(Biacore公司制造)进行分析。
结果表明，抗糖链缺陷CD27单克隆抗体对Tn抗原型CD27-Fc和涎酸化Tn抗原型CD27-Fc显示出结合活性。由以上结果表明，本发明的抗糖链缺陷CD27单克隆抗体均与Tn抗原和涎酸化Tn抗原结合。
[实施例5]
编码抗糖链缺陷CD27单克隆抗体的可变区的cDNA的分离、分析
(1)由产生抗糖链缺陷CD27单克隆抗体的杂交瘤细胞制备mRNA
使用RNAeasy小量提取试剂盒(QIAGEN公司制造)和OligotexTM-dT30<Super>mRNA纯化试剂盒(TaKaRa公司制造)，依照各自附带的使用说明书分别由实施例3中获得的5×107~1×108个细胞的各杂交瘤KM4026、KM4027、KM4028、KM4030和KM4031制备各抗糖链缺陷CD27单克隆抗体的mRNA。
(2)抗糖链缺陷CD27单克隆抗体的H链和L链的可变区的基因克隆
使用BD SMART RACE cDNA扩增试剂盒(BD Biosciences公司制造)，依照附带的使用说明书由实施例5(1)中获得的单克隆抗体的mRNA获得cDNA。
以获得的cDNA为模板，使用大鼠IgG1特异性引物(序列号14)、大鼠IgG2a特异性引物(序列号15)、大鼠IgG2b特异性引物(序列号16)或大鼠CH1特异性引物(序列号17)，分别进行PCR反应，从而扩增出各抗体的重链可变区(以下记作VH)的cDNA片段。
另外，使用大鼠Ig(κ)特异性引物(序列号18)和(序列号19)代替抗体的各亚类特异性引物来进行PCR，扩增出各抗体的轻链可变区(以下记作VL)的cDNA片段。
用于扩增KM4026、KM4030、KM4031的VL和VH的PCR反应使用Advantage 2PCR试剂盒(Clontech公司制造)依照附带的使用说明书进行，用于扩增KM4027、KM4028的VL和VH的PCR反应使用KOD Plus聚合酶(东洋纺公司制造)依照附带的使用说明书进行。
接着，为了进行克隆并确定碱基序列，利用琼脂糖凝胶电泳对所得的PCR产物进行分离，然后，使用TOPO TA克隆试剂盒(英杰公司制造)依照附带的使用说明书将KM4026、KM4030、KM4031来源的PCR产物插入到pCR载体中，使用测序用Zero Blunt TOPO PCR克隆试剂盒(英杰公司制造)依照附带的使用说明书将KM4027、KM4028来源的PCR产物插入到pCR载体中。
使用插入有PCR扩增片段的质粒对大肠杆菌进行转化，制备由各克隆得到的质粒，并确认DNA序列。结果，获得了包含在cDNA的5’末端存在被推测为起始密码子的ATG序列的全长VH的cDNA的质粒和包含在cDNA的5’末端存在被推测为起始密码子的ATG序列的全长VL的cDNA的质粒。克隆的简要过程示于图14中。
(3)抗CD27单克隆抗体可变区的基因序列的分析
实施例5(2)中得到的质粒所含的抗糖链缺陷CD27单克隆抗体KM4026、KM4027、KM4028、KM4030和KM4031的VH的全长碱基序列由序列号20~序列号24表示，由该序列推测出的包含信号序列的VH的全长氨基酸序列由序列号25~序列号29表示，另外，实施例5(2)中得到的质粒所含的抗糖链缺陷CD27单克隆抗体KM4026、KM4027、KM4028、KM4030和KM4031的VL的全长碱基序列由序列号30~序列号34表示，由该序列推测出的包含信号序列的VL的全长氨基酸序列由序列号35~序列号39表示。
另外，通过将各单克隆抗体的VH和VL的CDR与已知抗体的氨基酸序列进行比较来进行鉴定。抗糖链缺陷CD27单克隆抗体KM4026的VH的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别由序列号40、序列号41和序列号42表示，抗糖链缺陷CD27单克隆抗体KM4026的VL的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别由序列号43、序列号44和序列号45表示。
抗糖链缺陷CD27单克隆抗体KM4027的VH的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别由序列号46、序列号47和序列号48表示，抗糖链缺陷CD27单克隆抗体KM4027的VL的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别由序列号49、序列号50和序列号51表示。
抗糖链缺陷CD27单克隆抗体KM4028的VH的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别由序列号52、序列号53和序列号54表示，抗糖链缺陷CD27单克隆抗体KM4028的VL的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别由序列号55、序列号56和序列号57表示。
抗糖链缺陷CD27单克隆抗体KM4030的VH的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别由序列号58、序列号59和序列号60表示，抗糖链缺陷CD27单克隆抗体KM4030的VL的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别由序列号61、序列号62和序列号63表示。
抗糖链缺陷CD27单克隆抗体KM4031的VH的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别由序列号64、序列号65和序列号66表示，抗糖链缺陷CD27单克隆抗体KM4031的VL的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别由序列号67、序列号68和序列号69表示。
[实施例6]
抗糖链缺陷CD27嵌合抗体的制作
(1)抗糖链缺陷CD27嵌合抗体表达载体的构建
本发明中制作的嵌合抗体是在实施例5(3)中得到的抗CD27大鼠单克隆抗体的重链和轻链的可变区上分别连接有US97/10354中公开的人IgG1的重链恒定区和人κ的轻链恒定区的嵌合抗体。
作为方法，使用实施例5(3)中得到的包含各单克隆抗体的VL或VH的pCR载体以及US97/10354中记载的包含人IgG1的重链恒定区和人κ的轻链恒定区的抗体表达载体pKANTEX93，以下述方式构建抗糖链缺陷CD27嵌合抗体表达载体(图15、图16、图17、图18)。
制备如下溶液：使用10ng包含KM4026、KM4027、KM4028、KM4030、KM4031的VL或VH的pCR载体作为模板，含有2μL 10×KODPlus缓冲液、2μL 2毫摩尔/升的dNTP、1μL 25毫摩尔/升的硫酸镁、1μLKOD Plus聚合酶(东洋纺公司制造)以及各1μL的10微摩尔/升的各抗CD27单克隆抗体的VL和VH特异性引物，并且总量为20μL。使用该制备溶液进行如下PCR反应：在94℃下加热5分钟后，以94℃下1分钟、68℃下2分钟为1次循环，进行30次循环。
KM4026的VL的引物由序列号70和71表示，VH的引物由序列号72和73表示；KM4027的VL的引物由序列号74和75表示，VH的引物由序列号76和77表示；KM4028的VL的引物由序列号78和79表示，VH的引物由序列号80和81表示；KM4030的VL的引物由序列号82和83表示，VH的引物由序列号84和85表示；KM4031的VL的引物由序列号86和87表示，VH的引物由序列号88和89表示。
将各PCR反应产物用1%的琼脂糖凝胶电泳进行分离后，回收特异性PCR扩增条带，使用测序用Zero Blunt TOPO PCR克隆试剂盒(英杰公司制造)，依照附带的使用说明书将上述特异性PCR扩增条带插入到pCR Blunt-TOPO载体中。
将所得的各抗体的VL用限制性酶EcoRI(New England Biolabs公司制造)和BsiWI(New England Biolabs公司制造)进行消化，得到VL的EcoRI-BsiWI片段。另外，将各抗体的VH用限制性酶NotI(New EnglandBiolabs公司制造)和ApaI(New England Biolabs公司制造)进行消化，得到NotI-ApaI片段。
使用Ligation High(东洋纺公司制造)，依照附带的使用说明书将抗CD27单克隆抗体KM4026、KM4027、KM4028、KM4030或KM4031的VL的各EcoRI-BsiWI片段与将pKANTEX93用限制性酶EcoRI和BsiWI消化而得到的DNA片段连接。
使用连接后的DNA片段对大肠杆菌DH5α(东洋纺公司制造)进行转化，制备由各克隆得到的质粒，使用BigDye终止底物循环测序FSReady反应试剂盒(PEバイオシステムズ公司制造)依照附带的使用说明书进行反应，然后，利用该公司的测序仪ABI PRISM3700来分析碱基序列。
结果，获得了插入有编码抗CD27单克隆抗体KM4026、KM4027、KM4028、KM4030或KM4031的VL的cDNA的pKANTEX93。
接着，使用Ligation High(东洋纺公司制造)，依照附带的使用说明书将抗CD27单克隆抗体KM4026、KM4027、KM4028、KM4030或KM4031的VH的各NotI-ApaI片段与将插入有抗CD27单克隆抗体的各VL的pKANTEX93用限制性酶NotI和ApaI消化而得到的DNA片段连接。
使用连接后的DNA片段对大肠杆菌DH5α(东洋纺公司制造)进行转化，制备由各克隆得到的质粒，使用BigDye终止底物循环测序FSReady反应试剂盒(PEバイオシステムズ公司制造)依照附带的使用说明书进行反应，然后，利用该公司的测序仪ABI PRISM3700来分析碱基序列。
结果，获得了分别插入有编码抗CD27单克隆抗体KM4026、KM4027、KM4028、KM4030或KM4031的VL和VH的cDNA的抗CD27嵌合抗体表达载体。
(2)使用动物细胞进行的抗糖链缺陷CD27嵌合抗体的表达
使用上述(1)中得到的抗糖链缺陷CD27嵌合抗体表达载体，通过常规方法[Antibody Engineering,A Practical Guide(抗体工程实践指南)，威廉H·弗里曼公司(1992)]进行抗糖链缺陷CD27嵌合抗体在动物细胞中的表达，从而获得了产生抗糖链缺陷CD27嵌合抗体(嵌合型KM4026、嵌合型KM4028、嵌合型KM4030和嵌合型KM4031)的转化株。
作为进行表达的动物细胞株，使用α1,6-岩藻糖转移酶(FUT8)基因双敲除的CHO/DG44细胞株(以下记作FUT8敲除CHO细胞)。已知在该宿主细胞株中表达的抗体的N-连接型复合糖链的核心部分未附加岩藻糖(国际公开第2002/31140号)。
(3)纯化嵌合抗体的获得
通过通常的培养方法对上述(2)中得到的转化株嵌合型KM4026、嵌合型KM4028、嵌合型KM4030和嵌合型KM4031进行培养，然后，回收细胞悬浮液，在3000rpm、4℃的条件下进行20分钟的离心分离，回收培养上清后，通过孔径为0.22μm的Millex GV过滤器进行过滤灭菌。
通过与实施例1(7)同样的方法，使用MabSelect从所得的培养上清中纯化出抗糖链缺陷CD27嵌合抗体嵌合型KM4026、嵌合型KM4028、嵌合型KM4030和嵌合型KM4031。
(4)抗糖链缺陷CD27嵌合抗体的岩藻糖含量的测定
根据国际公开第2002/31140号中记载的方法，考察在各抗糖链缺陷CD27嵌合抗体的Fc段的N连接型复合糖链的还原末端存在的N-乙酰葡糖胺的6位上未与岩藻糖的1位进行α连接的糖链的比例。将结果示于表2中。
[表2]抗糖链缺陷CD27嵌合抗体的岩藻糖含量
Figure BDA00002064662601111
如表2所示，可知在实施例6(3)中制作的嵌合抗体中未附加岩藻糖。
[实施例7]
抗糖链缺陷CD27嵌合抗体的活性评价
在以下的(1)~(3)中，对实施例6中得到的抗糖链缺陷CD27嵌合抗体嵌合型KM4026、嵌合型KM4028、嵌合型KM4030和嵌合型KM4031进行活性评价。
(1)利用BIACORE评价抗糖链缺陷CD27嵌合抗体与人糖链缺陷CD27-Fc的结合活性
为了在反应速度学上分析抗糖链缺陷CD27嵌合抗体嵌合型KM4026、嵌合型KM4028和嵌合型KM4030对人糖链缺陷CD27-Fc的结合活性，使用表面等离子体共振法(SPR法)进行结合活性的测定。以下的操作全部使用BiacoreT100(GE医疗集团生命科学部门制造)来进行。
通过胺偶联法将实施例1(7)中得到的Lec8来源的CD27-Fc固定到CM5传感芯片(GE医疗集团生命科学部门制造)上。基于单一反应动力学的自动程序，将从9μg/mL开始以3倍稀释的方式进行梯度稀释而制备成五个浓度的测定样品(嵌合型KM4026、嵌合型KM4028、嵌合型KM4030和嵌合型KM4031)从低浓度开始依次连续添加到固定有CD27-Fc的芯片上，由此进行测定。
使用装置附带的分析软件Biacore T100评价软件(Biacore公司制造)，用双价分析物(Bivalent Analyte)模型进行分析，计算出各抗体对人糖链缺陷CD27-Fc的结合速度常数ka和解离速度常数kd。
结果，所得的各抗体的结合速度常数ka1、解离速度常数kd1和解离常数KD(kd1/ka1)示于表3中。
[表3]
Figure BDA00002064662601121
如表3所示，嵌合型KM4026、嵌合型KM4028、嵌合型KM4030和嵌合型KM4031均对人糖链缺陷CD27-Fc显示出1×10-81×10-9摩尔/升的高亲和性。
(2)利用荧光细胞染色法(流式细胞术分析)评价抗糖链缺陷CD27嵌合抗体的反应特异性
使用通过与实施例2同样的方法制作的CD27/DG44-4细胞、CD27/Lec8-4细胞和Lec8细胞作为分析用细胞。将使用添加有500μg/mL G418的HT-培养基进行传代的CD27/DG44-4和使用添加有50纳摩尔/升MTX和500μg/mL G418的HT-培养基进行传代的CD27/Lec8-4用0.02%的EDTA溶液剥离，然后，将各细胞用PBS洗涤。
洗涤后，将5×105个细胞悬浮于50μL的1%BSA-PBS中，然后，以50μL/孔分注将抗糖链缺陷CD27嵌合抗体(嵌合型KM4026、嵌合型KM4028、嵌合型KM4030和嵌合型KM4031)制备成0.02μg/mL、0.2μg/mL、2μg/mL和10μg/mL而得到的抗体液作为一次抗体，在冰温下反应1小时。
作为阳性对照，使用作为抗Tn抗体的抗RCAS 1小鼠抗体22-1-1(MBL公司制造)和抗CD27小鼠抗体O323(Santa Cruzbiotechnology公司制造)。
反应后，使用PBS进行两次离心分离来洗涤细胞，以50μL/孔加入ALEXA Fluoro 488标记的抗人免疫球蛋白G(H+L)、ALEXA Fluoro488标记的抗小鼠免疫球蛋白G(H+L)或ALEXA Fluoro 488标记的抗人免疫球蛋白M(μ)作为二次抗体，在冰温下避光反应30分钟。
再次使用PBS进行两次离心分离来洗涤细胞，然后，悬浮于500μL的1%BSA-PBS中，使用流式细胞仪(贝克曼库尔特公司制造，CytomicsFC500MPL)测定由488nm的氩激光激发的510~530nm的荧光。将结果示于图19(A)~(C)中。
结果，抗糖链缺陷CD27嵌合抗体均未与Lec8细胞和CD27/DG44-4细胞结合，而观察到仅与表达糖链缺陷CD27的CD27/Lec8-4细胞结合。
由以上结果表明，本发明的抗糖链缺陷CD27嵌合抗体嵌合型KM4026、嵌合型KM4028、嵌合型KM4030和嵌合型KM4031特异性地识别在细胞表面上表达的糖链缺陷CD27。
(3)抗糖链缺陷CD27嵌合抗体的抗体依赖性细胞毒活性(ADCC活性)的评价
根据以下所示的方法测定抗糖链缺陷CD27嵌合抗体嵌合型KM4026、嵌合型KM4028、嵌合型KM4030和嵌合型KM4031对实施例2中制作的CD27/Lec8-4细胞的ADCC活性。
(3)-1靶细胞悬浮液的制备
将使用添加有50纳摩尔/升MTX和500μg/mL G418的HT-培养基进行传代的CD27/Lec8-4细胞用0.02%的EDTA溶液剥离，然后，用PBS进行洗涤，用含有5%经透析的胎牛血清(dFBS)(英杰公司制造)且不含酚红的RPMI1640培养基(英杰公司制造)(以下记作ADCC用培养基)进行洗涤，并用该培养基制备成最适浓度，从而制成靶细胞悬浮液。
(3)-2效应细胞悬浮液的制备
通过以下所示的方法从健康人末梢血中分离出末梢血单核细胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)。使用加有0.5mL日本药典收录的肝素钠注射液“シミズ”(清水制药公司制造)的注射器从健康人采集50mL的健康人末梢血。
将3.5mL所采集的末梢血轻轻地层叠到在15mL管中各分注3mL的单核-多形核分离溶液(DSファ一マバイオメデイカル公司制造)上，在400×g、制动关闭、室温的条件下离心分离20分钟，分离出单核细胞层。将这样得到的单核细胞级分用ADCC用培养基洗涤两次，并用该培养基制备成最适的细胞数，从而制成效应细胞悬浮液。
(3)-3ADCC活性的测定
使用LDH-Cytotoxic Test Wako(Wako公司制造)，依照附带的说明书按以下步骤进行测定。
向96孔U形底板(FALCON公司制造)的各孔中分注50μL将各抗体从30μg/mL开始以10倍稀释的形式稀释至0.003μg/mL的浓度的抗体液，接着，以1×104个细胞/50μL/孔分注(3)-1中制备的靶细胞悬浮液，最后，以2.5×105个细胞/50μL/孔分注(3)-2中制备的效应细胞悬浮液，调节至总量为150μL，并在37℃下反应4小时。由此，在效应细胞(E)与靶细胞(T)之比为25:1的条件下进行实验。ADCC活性通过下式求出。将结果示于图20中。
(式)
ADCC活性(%)={([样本的吸光度]-[靶细胞自然游离的吸光度]-[效应细胞自然游离的吸光度])/([靶细胞全部游离的吸光度]-[靶细胞自然游离的吸光度])}×100
结果，抗体的Fc段的N连接型复合糖链上未结合核心岩藻糖的抗糖链缺陷CD27嵌合抗体嵌合型KM4026、嵌合型KM4028、嵌合型KM4030和嵌合型KM4031均对CD27/Lec8-4细胞显示出高ADCC活性。
由以上结果表明，本发明的抗糖链缺陷CD27嵌合抗体嵌合型KM4026、嵌合型KM4028、嵌合型KM4030和嵌合型KM4031均对表达糖链缺陷CD27的细胞具有高ADCC活性。
(4)抗糖链缺陷CD27嵌合抗体的补体依赖性细胞毒活性(CDC活性)的评价
根据以下所示的方法测定抗糖链缺陷CD27嵌合抗体嵌合型KM4026、嵌合型KM4028、嵌合型KM4030和嵌合型KM4031对实施例2中制作的CD27/Lec8-4细胞的CDC活性。
将CD27/Lec8-4细胞用PBS洗涤后，用含有10%dFBS的RPMI1640培养基洗涤，并用该培养基制备成最适浓度，从而制成靶细胞悬浮液。将靶细胞悬浮液以50μL/孔分注到96孔平底板(葛莱娜公司制造)中，使每孔达到5×104个细胞，再添加制备成适当浓度的抗糖链缺陷CD27嵌合抗体溶液和人补体(SIGMA公司制造)，制备成总量为150μL/孔。
另外，准备不含抗体的反应孔(0%细胞毒活性孔)作为阴性对照，准备不含细胞的反应孔(100%细胞毒活性孔)作为阳性对照。在37℃、5%CO2的培养箱中进行2小时反应。
反应结束后，向各反应孔中加入15μL的WST-1试剂(罗氏公司制造)，在37℃下反应约4小时，使用酶标仪(Emax)测定各孔中的吸光度(OD450nm-OD690nm)。使用下式由各孔的吸光度计算出CDC活性(细胞毒活性[%])。将结果示于图21中。
(式)
CDC活性(细胞毒活性[%])={1-(反应孔的吸光度-100%细胞裂解孔的吸光度)/(0%细胞裂解孔的吸光度-100%细胞裂解孔的吸光度)}×100
结果，本发明中获得的抗糖链缺陷CD27嵌合抗体嵌合型KM4026、嵌合型KM4028、嵌合型KM4030和嵌合型KM4031均显示出CDC活性。
[实施例8]
细胞膜上表达食蟹猴CD27的CHO细胞的制作
(1)食蟹猴CD27基因的克隆
按照以下步骤由食蟹猴末梢血来源的RNA分离出编码CD27的基因。制备如下溶液：使用3.3μg利用Trizol(英杰公司制造)从食蟹猴末梢血中分离出的RNA作为模板，并且含有SuperScriptIII第一链合成试剂盒(英杰公司制造)所附带的寡聚dT 1μL、dNTP混合物1μL，总量为5μL。
将该制备的溶液在65℃下反应5分钟后，在冰上急冷1分钟，然后，添加SuperScriptIII第一链合成试剂盒所附带的10×RT缓冲液2μL、DTT 2μL、RNase OUT 1μL、RT 1μL，在50℃下进行50分钟的逆转录反应。
反应后，在85℃下加热5分钟以使逆转录酶失活，然后，添加1μLSuperScriptIII第一链合成试剂盒所附带的RNase H，在37℃下反应20分钟，使RNA完全分解。在使用之前将该食蟹猴末梢血来源的单链cDNA在-20℃下保存。
制备如下溶液：使用1.25μL上述中制作的食蟹猴末梢血来源的单链cDNA为模板，并且含有2.5μL 10×KOD Plus缓冲液、2.5μL 2毫摩尔/升的dNTP、1μL 25毫摩尔/升的硫酸镁、0.5μL KOD Plus聚合酶(东洋纺公司制造)、各20皮摩尔的由猕猴CD27的5’侧非翻译区序列设计出的mfCD27_5UTR(序列号90)和由猕猴CD27的3’侧非翻译区序列设计出的mfCD27_3UTR(序列号91)，总量为25μL。
使用该制备溶液进行如下PCR反应：在94℃下加热5分钟后，以94℃下30秒、68℃下2分钟为1次循环，进行30次循环。将该反应液用1%的琼脂糖凝胶电泳进行分离，然后，使用测序用Zero BluntTOPO PCR克隆试剂盒(英杰公司制造)，依照附带的使用说明书将约800bp的PCR产物插入到pCR Blunt-TOPO载体中。
使用插入有PCR扩增片段的载体对大肠杆菌DH5α(东洋纺公司制造)进行转化，制备由各克隆得到的质粒，使用BigDye终止底物循环测序FS Ready反应试剂盒(PEバイオシステムズ公司制造)，依照附带的使用说明书进行反应，然后，利用该公司的测序仪ABI PRISM3700来分析碱基序列。结果，获得了克隆有编码食蟹猴CD27的cDNA(序列号92)的质粒pCR mfCD27(图22)。
(2)猴CD27表达质粒pKANTEX mfCD27His的构建
通过以下的方法制作在C末端附加有His标签的食蟹猴CD27表达载体pKANTEX mfCD27His。
制备如下溶液：使用10ng的pCR mfCD27作为模板，并且含有5μL10×KOD Plus缓冲液、5μL 2毫摩尔/升的dNTP、2μL 25毫摩尔/升的硫酸镁、1μL KOD Plus聚合酶(东洋纺公司制造)、各0.2μL的100微摩尔/升的mfCD27toKAN_5(序列号93)和mfCD27HisKAN_3(序列号94)，总量为50μL。
使用该制备溶液进行如下PCR反应：在94℃下加热5分钟后，以94℃下30秒、68℃下2分钟为1次循环，进行30次循环。将该反应液用1%的琼脂糖凝胶电泳进行分离，然后，使用测序用Zero BluntTOPO PCR克隆试剂盒(英杰公司制造)，依照附带的使用说明书将约800bp的PCR产物插入到pCR Blunt-TOPO载体中。
使用插入有PCR扩增片段的载体对大肠杆菌DH5α(东洋纺公司制造)进行转化，制备由各克隆得到的质粒，使用BigDye终止底物循环测序FS Ready反应试剂盒(PEバイオシステムズ公司制造)，依照附带的使用说明书进行反应，然后，利用该公司的测序仪ABI PRISM3700来分析碱基序列。
结果，获得了克隆有编码在C末端附加有His标签的食蟹猴CD27的cDNA(序列号95)的质粒pCR mfCD27His(图23)。
使用Ligation High(东洋纺公司制造)，依照附带的使用说明书使将pCR mfCD27His用限制性酶NotI和SalI(タカラバイオ公司制造)消化而得到的约800bp的DNA片段与将实施例2中制作的pKANTEX CD27用限制性酶NotI和SalI(タカラバイオ公司制造)消化而得到的约10kbp的DNA片段连接。
使用连接后的DNA片段对大肠杆菌DH5α(东洋纺公司制造)进行转化，制备由各克隆得到的质粒，使用BigDye终止底物循环测序FSReady反应试剂盒(PEバイオシステムズ公司制造)，依照附带的使用说明书进行反应，然后，利用该公司的测序仪ABI PRISM3700来分析碱基序列。
结果，获得了用于表达在C末端附加有His标签的食蟹猴CD27的质粒pKANTEX mfCD27His(图24)。
将使用pKANTEX mfCD27His进行转化而得到的DH5α(东洋纺公司制造)接种到200mL的LB培养基中，培养过夜。在培养后回收菌体，使用QIAfilter质粒中量提取试剂盒(キアゲン公司制造)，依照附带的使用说明书对质粒进行纯化。将50μg纯化后的质粒用限制性酶AatII(NewEngland Biolabs公司制造)进行消化，由此使其线性化。
(3)猴CD27表达质粒pKANTEX mfCD27His的导入
将上述(2)中制作的食蟹猴CD27表达质粒pKANTEX mfCD27His基因导入到Lec8细胞和CHO/DG44细胞中，由此，建立表达食蟹猴CD27的Lec8细胞和DG44细胞。
除了使用pKANTEX mfCD27His作为导入的质粒以外，通过实施例1(6)记载的方法实施。但是，基因导入后的细胞悬浮于30mL的HT-培养基中，以100μL/孔的量接种到3块96孔板中。
接种1天后，更换为含有500μg/mL G418的传代用培养基，进行10天的培养，从而获得G418抗性克隆株。将Lec8株来源的食蟹猴CD27表达株记作食蟹猴CD27/Lec8细胞，另一方面，将DG44细胞来源的食蟹猴CD27表达细胞记作食蟹猴CD27/DG44细胞。
[实施例9]
抗糖链缺陷CD27嵌合抗体与猴CD27蛋白的交叉反应性评价
使用实施例8中制作的食蟹猴CD27/DG44细胞、食蟹猴CD27/Lec8细胞作为分析用细胞。
(1)利用荧光细胞染色法(流式细胞术分析)评价抗糖链缺陷CD27嵌合抗体与猴CD27表达细胞的反应性
根据以下的方法测定抗糖链缺陷CD27嵌合抗体嵌合型KM4026、嵌合型KM4028、嵌合型KM4030和嵌合型KM4031对食蟹猴CD27表达细胞的结合活性。
将使用添加有500μg/mL G418的HT-培养基进行传代的食蟹猴CD27/DG44细胞和食蟹猴CD27/Lec8细胞用0.02%的EDTA溶液剥离，然后，将各细胞用PBS洗涤。
洗涤后，将5×105个细胞悬浮于50μL的1%BSA-PBS中，然后，以50μL/孔分注将抗糖链缺陷CD27嵌合抗体(嵌合型KM4026、嵌合型KM4028、嵌合型KM4030和嵌合型KM4031)制备成10μg/mL而得到的抗体液作为一次抗体，在冰温下反应1小时。
作为阳性对照，使用抗CD27小鼠抗体O323。反应后，使用PBS进行两次离心分离来洗涤细胞，以50μL/孔加入ALEXA Fluoro 488标记的抗人免疫球蛋白G(H+L)或ALEXA Fluoro 488标记的抗小鼠免疫球蛋白G(H+L)(均为BioLegend公司制造)作为二次抗体，在冰温下避光反应30分钟。
再次使用PBS进行两次离心分离来洗涤细胞，然后，悬浮于500μL的1%BSA-PBS中，使用流式细胞仪(贝克曼库尔特公司制造，CytomicsFC500MPL)测定由488nm的氩激光激发的510~530nm的荧光。将结果示于图25中。
结果表明，抗糖链缺陷CD27嵌合抗体嵌合型KM4030和嵌合型KM4031与表达糖链缺陷CD27的食蟹猴CD27/Lec8细胞反应。
另一方面，抗糖链缺陷CD27嵌合抗体嵌合型KM4026和嵌合型KM4028与食蟹猴CD27/Lec8细胞的反应性较小。另外确认到，抗糖链缺陷CD27嵌合抗体均不与食蟹猴CD27/DG44细胞结合。
(2)抗糖链缺陷CD27嵌合抗体对猴CD27表达细胞的ADCC活性的评价
将使用添加有500μg/mL G418的HT-培养基进行传代的食蟹猴CD27/Lec8细胞用0.02%的EDTA溶液剥离后，用PBS进行洗涤，然后用ADCC用培养基进行洗涤，并用该培养基制备成最适浓度，从而制成靶细胞悬浮液。另外，效应细胞悬浮液的制备和ADCC活性的测定通过与实施例7同样的方法进行。将结果示于图26中。
结果，抗糖链缺陷CD27嵌合抗体嵌合型KM4026、嵌合型KM4028、嵌合型KM4030和嵌合型KM4031均对包含未结合半乳糖的O连接型糖链的食蟹猴CD27/Lec8细胞(糖链缺陷食蟹猴CD27细胞)显示出ADCC活性。
由以上结果表明，本发明的抗糖链缺陷CD27嵌合抗体嵌合型KM4026、嵌合型KM4028、嵌合型KM4030和嵌合型KM4031均对糖链缺陷食蟹猴CD27细胞显示出交叉反应性。观察到各抗糖链缺陷CD27嵌合抗体对糖链缺陷食蟹猴CD27的反应性有强有弱，暗示了所识别的表位存在差异。
另外，使用实施例2中制作的人CD27/Lec8细胞和实施例8中制作的食蟹猴CD27/Lec8细胞中通过流式细胞术分析确认细胞表面上的CD27表达量大致相同的细胞，测定抗糖链缺陷CD27嵌合抗体嵌合型KM4030的ADCC活性。效应细胞悬浮液由同一健康人末梢血制备。将结果示于图27中。
结果暗示，糖链缺陷CD27嵌合抗体嵌合型KM4030对食蟹猴CD27/Lec8细胞和人CD27/Lec8细胞显示出同等程度的ADCC活性。
[实施例10]
人源化抗体的制作
(1)抗糖链缺陷CD27人源化抗体的VH和VL的氨基酸序列的设计
如下设计出抗糖链缺陷CD27人源化抗体的VH的氨基酸序列。
首先，选择用于移植分别由序列号58、59和60表示的抗糖链缺陷CD27大鼠单克隆抗体KM4030VH的CDR1~3的氨基酸序列的人抗体的VH的FR的氨基酸序列。
使用GCG软件包(Genetics Computer Group公司制造)作为序列分析系统，通过BLASTP法[Nucleic Acid Res.,25,3389(1997)]，在现有蛋白的氨基酸数据库中检索与抗糖链缺陷CD27大鼠单克隆抗体KM4030具有高度同源性的人抗体。
对同源性得分和实际的氨基酸序列的同源性进行比较，结果，SWISSPROT数据库登记号：BAH04525的抗H3N2人流感病毒的中和单克隆抗体(以下称为BAH04525)的抗体谱显示出83.9%的同源性，是同源性最高的人抗体，因此，选择该抗体的FR的氨基酸序列。
将序列号58~60表示的抗糖链缺陷CD27大鼠单克隆抗体KM4030的VH的CDR的氨基酸序列移植到如上确定的人抗体的FR的氨基酸序列的适当位置。这样，设计出序列号96表示的抗糖链缺陷CD27人源化抗体的VH的氨基酸序列HV0。
接着，如下设计出抗糖链缺陷CD27人源化抗体的VL的氨基酸序列。
选择用于移植分别由序列号61~63表示的抗糖链缺陷CD27大鼠单克隆抗体KM4030VL的CDR1~3的氨基酸序列的人抗体的VL的FR的氨基酸序列。
卡巴特(Kabat)等人将已知的各种人抗体的VL根据其氨基酸序列的同源性分成四个亚组(HSG I~IV)，并报道了上述各亚组的共有序列[Sequences of Proteins of Immunological Interest，美国卫生与公众服务部(1991)]。因此，对人抗体的VL的亚组I~IV的共有序列的FR的氨基酸序列与抗糖链缺陷CD27大鼠抗体KM4030的VL的FR的氨基酸序列实施了同源性检索。
同源性检索的结果是，HSGI、HSGII、HSGIII和HSGIV的同源性分别为86.3%、60.0%、73.8%、73.8%。因此，KM4030的VL的FR的氨基酸序列与亚组I具有最高的同源性。
根据以上结果，将抗糖链缺陷CD27大鼠单克隆抗体KM4030的VL的CDR的氨基酸序列移植到人抗体的VL的亚组I的共有序列的FR的氨基酸序列的适当位置。
但是，序列号38所示的抗糖链缺陷CD27大鼠单克隆抗体KM4030的VL的氨基酸序列中第124位的Leu虽然并不是在卡巴特等人列举的人抗体FR的氨基酸序列的相应部位处使用频率最高的氨基酸残基，但也是使用频率比较高的氨基酸残基，因此，决定使用在抗糖链缺陷CD27大鼠单克隆抗体KM4030的氨基酸序列中出现的上述氨基酸残基。
这样，设计出序列号97表示的抗糖链缺陷CD27人源化抗体的VL的氨基酸序列LV0。
上述设计好的抗糖链缺陷CD27人源化抗体的VH的氨基酸序列HV0和VL的氨基酸序列LV0是仅将抗糖链缺陷CD27大鼠单克隆抗体KM4030的CDR的氨基酸序列移植到选择好的人抗体的FR的氨基酸序列中而得到的序列。
但是，一般而言，制作人源化抗体时，仅单纯地将大鼠抗体的CDR的氨基酸序列移植到人抗体的FR中时，结合活性大多会降低。因此，为了避免结合活性的降低，在移植CDR的氨基酸序列的同时，对人抗体与大鼠抗体不同的FR的氨基酸残基中认为给结合活性带来影响的氨基酸残基进行修饰。
因此，本实施例中，也以如下方式对认为给结合活性带来影响的FR的氨基酸残基进行了鉴定。
首先，使用计算机建模的方法，构建包含上述设计好的抗糖链缺陷CD27人源化抗体的VH的氨基酸序列HV0和VL的氨基酸序列LV0的抗体V区(HV0LV0)的三维结构。使用软件Discovery Studio(Accelrys公司制造)，依照附带的使用说明书制作三维结构坐标并显示三维结构。
另外，以同样的方式构建抗糖链缺陷CD27大鼠单克隆抗体KM4030的V区的三维结构的计算机模型。进而，在HV0LV0的VH和VL的FR的氨基酸序列中，选择与抗糖链缺陷CD27大鼠抗体KM4030不同的氨基酸残基，制作修饰成抗糖链缺陷CD27大鼠单克隆抗体KM4030的氨基酸残基的氨基酸序列，并同样地构建三维结构模型。
将上述制成的抗糖链缺陷CD27大鼠单克隆抗体KM4030、HV0LV0和修饰体的V区的三维结构进行比较，鉴定出预测给抗体的结合活性带来影响的氨基酸残基。
结果，作为HV0LV0的FR的氨基酸残基中认为改变抗原结合部位的三维结构而给抗体的结合活性带来影响的氨基酸残基，分别筛选出：HV0中第30位的Ser、第48位的Val、第49位的Ser、第77位的Asn、第93位的Val、第97位的Ala和第117位的Thr，LV0中第21位的Ile、第40位的Pro、第58位的Val、第85位的Thr和第87位的Tyr。
将这些筛选出的氨基酸残基中的至少一个以上的氨基酸序列修饰成在抗糖链缺陷CD27大鼠单克隆抗体KM4030的相同部位处存在的氨基酸残基，从而设计出具有各种修饰的人源化抗体的VH和VL。
具体地，对于抗体VH而言，导入下述氨基酸修饰中的至少一种修饰：将序列号96表示的氨基酸序列的第30位的Ser取代成Asn、将第48位的Val取代成Ile、将第49位的Ser取代成Ala、将第77位的Asn取代成Gly、将第93位的Val取代成Thr、将第97位的Ala取代成Thr以及将第117位的Thr取代成Val。
另外，对于VL而言，导入下述氨基酸修饰中的至少一种修饰：将序列号97表示的氨基酸序列的第21位的Ile取代成Leu、将第40位的Pro取代成Leu、将第58位的Val取代成Ile、将第85位的Thr取代成Ala以及将第87位的Tyr取代成Phe。
设计出对HV0LV0的FR中存在的至少一个氨基酸残基进行修饰而得到的HV2LV0、HV3LV0、HV5LV0和HV7LV0的可变区的氨基酸序列，H链可变区HV2、HV3、HV5和HV7的氨基酸序列分别由序列号101、103、105和107表示。
(2)抗糖链缺陷CD27人源化抗体的制作和评价
在利用编码抗糖链缺陷CD27大鼠单克隆抗体KM4030的VH或VL的氨基酸序列的DNA中使用的密码子对编码抗糖链缺陷CD27人源化抗体的可变区的氨基酸序列的DNA进行氨基酸修饰的情况下，使用在哺乳动物细胞中使用频率高的密码子来制作。
编码抗糖链缺陷CD27人源化抗体的HV0和LV0的氨基酸序列的DNA序列分别由序列号98、99表示，另外，编码进行氨基酸修饰而得到的可变区HV2、HV3、HV5和HV7的氨基酸序列的DNA序列分别由序列号100、102、104和106表示。
(3)编码抗糖链缺陷CD27人源化抗体的VH的cDNA的构建
通过全长合成来制作编码本实施例(1)中设计的序列号98、104和106表示的抗糖链缺陷CD27人源化抗体的VH的氨基酸序列HV0、HV5和HV7的cDNA。
(4)编码抗糖链缺陷CD27人源化抗体的VL的cDNA的构建
通过全长合成来制作编码本实施例(1)中设计的序列号99表示的抗糖链缺陷CD27人源化抗体的VL的氨基酸序列LV0的cDNA。
(5)抗糖链缺陷CD27人源化抗体表达载体的构建
将编码本实施例(2)和(3)中得到的HV0、HV5、HV7中的任意一种的cDNA以及编码LV0的cDNA插入到国际公开第97/10354号中记载的人源化抗体表达用载体pKANTEX93的适当位置，从而构建各种抗糖链缺陷CD27人源化抗体表达载体。
(6)使用动物细胞进行的抗糖链缺陷CD27人源化抗体的稳定表达和纯化抗体的获得
使用动物细胞进行的抗糖链缺陷CD27人源化抗体的稳定表达和从培养上清中的抗体纯化通过与实施例6(2)和(3)中记载的方法同样的方法进行。
结果，制作出抗体的VH为HV0、VL为LV0的抗糖链缺陷CD27人源化抗体HV0LV0；抗体的VH为HV5、VL为LV0的HV5LV0以及抗体的VH为HV7、VL为LV0的HV7LV0这三种抗体。
[实施例11]
抗糖链缺陷CD27人源化抗体的活性评价
在以下(1)~(5)中，对实施例6中得到的抗糖链缺陷CD27嵌合抗体KM4030以及实施例10中得到的抗糖链缺陷CD27人源化抗体HV0LV0、HV5LV0和HV7LV0进行活性评价。
(1)利用BIACORE评价抗糖链缺陷CD27嵌合抗体和人源化抗体与人糖链缺陷CD27-Fc的结合活性
为了在反应速度学上分析抗糖链缺陷CD27人源化抗体对人糖链缺陷CD27的结合活性，使用BIACORE T100(BIACORE公司制造)与实施例7(1)同样地进行测定。
结果，所得的各抗体的结合速度常数Ka1、解离速度常数Kd1和解离常数KD(Kd1/Ka1)示于表4中。另外，传感图示于图29中。
如表4所示，人源化抗体HV0LV0、HV5LV0和HV7LV0均显示出2×10-9摩尔/升的高亲和性，保持了与抗糖链缺陷CD27嵌合抗体KM4030同等程度的抗原结合活性。
[表4]
抗糖链缺陷CD27嵌合抗体和人源化抗体与人糖链缺陷CD27-Fc的结合活性
Figure BDA00002064662601281
(2)利用荧光细胞染色法(流式细胞术分析)评价抗糖链缺陷CD27人源化抗体的反应特异性
与实施例7(2)同样地测定抗糖链缺陷CD27人源化抗体的反应性特异性。细胞株使用通过与实施例2同样的方法制作的抗原表达量大致相同的CD27/DG44-4细胞和CD27/Lec8-M19细胞作为分析用细胞。
一次抗体使用抗糖链缺陷CD27人源化抗体HV0LV0、HV5LV0或HV7LV0，制备成终浓度为0.0001μg/mL、0.001μg/mL、0.003μg/mL、0.01μg/mL、0.03μg/mL、0.1μg/mL、1μg/mL和10μg/mL。将其结果示于图30(A)和图30(B)中。
结果，抗糖链缺陷CD27人源化抗体HV0LV0、HV5LV0和HV7LV0均未与CD27/DG44-4细胞结合，而观察到仅与表达糖链缺陷CD27的CD27/Lec8-M19细胞结合。另外，抗糖链缺陷CD27人源化抗体对表达糖链缺陷CD27的CD27/Lec8-M19细胞的反应性与抗糖链缺陷CD27嵌合型KM4030抗体基本相同。
(3)抗糖链缺陷CD27人源化抗体的抗体依赖性细胞毒活性(ADCC活性)的评价
与实施例7(3)同样地测定抗糖链缺陷CD27人源化抗体HV0LV0、HV5LV0和HV7LV0的ADCC活性。靶细胞使用通过与实施例2同样的方法制作的CD27/DG44-4细胞和CD27/Lec8-M19细胞。另外，在效应细胞(E)与靶细胞(T)之比为12.5:1的条件下进行实验。将其结果示于图31中。
结果，与抗糖链缺陷CD27嵌合型KM4030抗体相比，人源化抗体HV0LV0的ADCC活性稍微降低，但抗糖链缺陷CD27人源化抗体HV5LV0和HV7LV0显示出与抗糖链缺陷CD27嵌合型KM4030抗体基本相同或高于抗糖链缺陷CD27嵌合型KM4030抗体的ADCC活性。
(4)抗糖链缺陷CD27人源化抗体的补体依赖性细胞毒活性(CDC活性)的评价
通过与实施例7(4)同样的方法测定抗糖链缺陷CD27人源化抗体HV0LV0、HV5LV0和HV7LV0的CDC活性。抗体制备成终浓度为100μg/mL。将其结果示于图32中。
结果，本发明中获得的抗糖链缺陷CD27人源化抗体HV0LV0、HV5LV0和HV7LV0显示出比抗糖链缺陷CD27嵌合型KM4030抗体强的CDC活性。
(5)抗糖链缺陷CD27人源化抗体与猴CD27蛋白的交叉反应性评价
利用荧光细胞染色法(流式细胞术分析)与实施例9(1)同样地测定抗糖链缺陷CD27人源化抗体HV0LV0、HV5LV0和HV7LV0对食蟹猴CD27表达细胞的结合活性。食蟹猴CD27表达细胞使用实施例8中制作的食蟹猴CD27/DG44细胞、食蟹猴CD27/Lec8细胞。将其结果示于图33(A)和图33(B)中。
结果，抗糖链缺陷CD27人源化抗体HV0LV0、HV5LV0和HV7LV0均未与食蟹猴CD27/DG44细胞结合。另一方面，抗糖链缺陷CD27人源化抗体HV0LV0、HV5LV0和HV7LV0与抗糖链缺陷CD27嵌合型KM4030抗体同样地与表达糖链缺陷CD27的食蟹猴CD27/Lec8细胞反应。由以上结果表明，抗糖链缺陷CD27人源化抗体HV0LV0、HV5LV0和HV7LV0均对糖链缺陷食蟹猴CD27细胞显示出交叉反应性。
本申请基于2009年12月29日提出的美国临时专利申请61/290542，将其内容以参考的形式并入本说明书中。
产业上的可利用性
根据本发明，能够提供特异性识别包含未结合半乳糖的O连接型糖链的CD27且与该胞外域结合的单克隆抗体或该抗体片段、产生该抗体的杂交瘤、编码该抗体的DNA、包含该DNA的载体、对该载体进行转化而得到的转化体、使用该杂交瘤或转化体的抗体或该抗体片段的制造方法以及含有该抗体或抗体片段作为有效成分的CD27相关疾病的诊断剂或治疗剂。
保藏编号
IPOD FREM BP-10976
序列表自由文本
序列号1-人CD27碱基序列
序列号2-人CD27氨基酸序列
序列号3-人工序列的记载：CD27正向引物
序列号4-人工序列的记载：CD27809B
序列号5-人工序列的记载：CD27-A引物
序列号6-人工序列的记载：CD27-B引物
序列号7-人工序列的记载：引物1
序列号8-人工序列的记载：引物2
序列号9-人工序列的记载：g4A引物
序列号10-人工序列的记载：g4B引物
序列号11-人工序列的记载：CD27-Fc蛋白碱基序列
序列号12-人工序列的记载：CD27-Fc蛋白氨基酸序列
序列号13-人工序列的记载：CD27-C引物
序列号14-人工序列的记载：大鼠IgG1特异性引物
序列号15-人工序列的记载：大鼠IgG2a特异性引物
序列号16-人工序列的记载：大鼠IgG2b特异性引物
序列号17-人工序列的记载：大鼠CH1特异性引物
序列号18-人工序列的记载：大鼠Ig(κ)特异性引物1
序列号19-人工序列的记载：大鼠Ig(κ)特异性引物2
序列号20-KM4026VH碱基序列
序列号21-KM4027VH碱基序列
序列号22-KM4028VH碱基序列
序列号23-KM4030VH碱基序列
序列号24-KM4031VH碱基序列
序列号25-KM4026VH氨基酸序列
序列号26-KM4027VH氨基酸序列
序列号27-KM4028VH氨基酸序列
序列号28-KM4030VH氨基酸序列
序列号29-KM4031VH氨基酸序列
序列号30-KM4026VL碱基序列
序列号31-KM4027VL碱基序列
序列号32-KM4028VL碱基序列
序列号33-KM4030VL碱基序列
序列号34-KM4031VL碱基序列
序列号35-KM4026VL氨基酸序列
序列号36-KM4027VL氨基酸序列
序列号37-KM4028VL氨基酸序列
序列号38-KM4030VL氨基酸序列
序列号39-KM4031VL氨基酸序列
序列号40-KM4026VH CDR1
序列号41-KM4026VH CDR2
序列号42-KM4026VH CDR3
序列号43-KM4026VL CDR1
序列号44-KM4026VL CDR2
序列号45-KM4026VL CDR3
序列号46-KM4027VH CDR1
序列号47-KM4027VH CDR2
序列号48-KM4027VH CDR3
序列号49-KM4027VL CDR1
序列号50-KM4027VL CDR2
序列号51-KM4027VL CDR3
序列号52-KM4028VH CDR1
序列号53-KM4028VH CDR2
序列号54-KM4028VH CDR3
序列号55-KM4028VL CDR1
序列号56-KM4028VL CDR2
序列号57-KM4028VL CDR3
序列号58-KM4030VH CDR1
序列号59-KM4030VH CDR2
序列号60-KM4030VH CDR3
序列号61-KM4030VL CDR1
序列号62-KM4030VL CDR2
序列号63-KM4030VL CDR3
序列号64-KM4031VH CDR1
序列号65-KM4031VH CDR2
序列号66-KM4030VH CDR3
序列号67-KM4031VL CDR1
序列号68-KM4031VL CDR2
序列号69-KM4031VL CDR3
序列号70-人工序列的记载：KM4026VL嵌合引物1
序列号71-人工序列的记载：KM4026VL嵌合引物2
序列号72-人工序列的记载：KM4026VH嵌合引物1
序列号73-人工序列的记载：KM4026VH嵌合引物2
序列号74-人工序列的记载：KM4027VL嵌合引物1
序列号75-人工序列的记载：KM4027VL嵌合引物2
序列号76-人工序列的记载：KM4027VH嵌合引物1
序列号77-人工序列的记载：KM4027VH嵌合引物2
序列号78-人工序列的记载：KM4028VL嵌合引物1
序列号79-人工序列的记载：KM4028VL嵌合引物2
序列号80-人工序列的记载：KM4028VH嵌合引物1
序列号81-人工序列的记载：KM4028VH嵌合引物2
序列号82-人工序列的记载：KM4030VL嵌合引物1
序列号83-人工序列的记载：KM4030VL嵌合引物2
序列号84-人工序列的记载：KM4030VH嵌合引物1
序列号85-人工序列的记载：KM4030VH嵌合引物2
序列号86-人工序列的记载：KM4031VL嵌合引物1
序列号87-人工序列的记载：KM4031VL嵌合引物2
序列号88-人工序列的记载：KM4031VH嵌合引物1
序列号89-人工序列的记载：KM4031VH嵌合引物2
序列号90-人工序列的记载：引物mfCD2_75UTR
序列号91-人工序列的记载：引物mfCD2_73UTR
序列号92-食蟹猴CD27cDNA序列
序列号93-人工序列的记载：引物mfCD27toKAN_5
序列号94-人工序列的记载：引物mfCD27HisKAN_3
序列号95-人工序列的记载：带His标签的食蟹猴CD27cDNA序列
序列号96-人工序列的记载：KM4030HV0氨基酸序列
序列号97-人工序列的记载：KM4030LV0氨基酸序列
序列号98-人工序列的记载：KM4030HV0碱基序列
序列号99-人工序列的记载：KM4030LV0碱基序列
序列号100-人工序列的记载：KM4030HV2碱基序列
序列号101-人工序列的记载：KM4030HV2氨基酸序列
序列号102-人工序列的记载：KM4030HV3碱基序列
序列号103-人工序列的记载：KM4030HV3氨基酸序列
序列号104-人工序列的记载：KM4030HV5碱基序列
序列号105-人工序列的记载：KM4030HV5氨基酸序列
序列号106-人工序列的记载：KM4030HV7碱基序列
序列号107-人工序列的记载：KM4030HV7氨基酸序列
Figure IDA00002064663300011
Figure IDA00002064663300031
Figure IDA00002064663300041
Figure IDA00002064663300061
Figure IDA00002064663300081
Figure IDA00002064663300111
Figure IDA00002064663300121
Figure IDA00002064663300131
Figure IDA00002064663300141
Figure IDA00002064663300151
Figure IDA00002064663300161
Figure IDA00002064663300171
Figure IDA00002064663300181
Figure IDA00002064663300191
Figure IDA00002064663300201
Figure IDA00002064663300211
Figure IDA00002064663300221
Figure IDA00002064663300241
Figure IDA00002064663300251
Figure IDA00002064663300261
Figure IDA00002064663300271
Figure IDA00002064663300281
Figure IDA00002064663300311
Figure IDA00002064663300321
Figure IDA00002064663300341
Figure IDA00002064663300351
Figure IDA00002064663300371
Figure IDA00002064663300381
Figure IDA00002064663300391
Figure IDA00002064663300401
PCT/RO/134表
Figure QDA00002064662900011

Claims (23)

1.一种人源化抗体或其抗体片段，其中，
抗体的VH为包含序列号58~60表示的CDR1~3的氨基酸序列的VH且抗体的VL为包含序列号61~63表示的CDR1~3的氨基酸序列的VL，
所述抗体或其抗体片段识别并结合包含未结合半乳糖的O连接型糖链的、由CD27基因编码的多肽的胞外域。
2.如权利要求1所述的人源化抗体或其抗体片段，其中，
人源化抗体的VH包含导入有选自下述修饰中的至少一种修饰的氨基酸序列：
将序列号96表示的氨基酸序列中的第30位的Ser取代成Asn、将第48位的Val取代成Ile、将第49位的Ser取代成Ala、将第77位的Asn取代成Gly、将第93位的Val取代成Thr、将第97位的Ala取代成Thr以及将第117位的Thr取代成Val，并且，
人源化抗体的VL包含导入有选自下述修饰中的至少一种修饰的氨基酸序列：
将序列号97表示的氨基酸序列中的第21位的Ile取代成Leu、将第40位的Pro取代成Leu、将第58位的Val取代成Ile、将第85位的Thr取代成Ala以及将第87位的Tyr取代成Phe。
3.如权利要求1所述的人源化抗体或其抗体片段，其中，人源化抗体的VH包含序列号96、105和107中任意一个序列表示的氨基酸序列，并且人源化抗体的VL包含序列号97表示的氨基酸序列。
4.一种DNA，其编码权利要求1~3中任一项所述的人源化抗体或该抗体片段。
5.一种重组载体，其含有权利要求4所述的DNA。
6.一种转化株，其通过将权利要求5所述的重组载体导入宿主细胞中而得到。
7.一种抗体或该抗体片段的制造方法，用于制造权利要求1~3中任一项所述的抗体或该抗体片段，其特征在于，将权利要求6所述的转化株在培养基中进行培养，在培养物中生成并蓄积权利要求1~3中任一项所述的人源化抗体或该抗体片段，并从该培养物中收集抗体或该抗体片段。
8.一种包含未结合半乳糖的O连接型糖链的CD27的免疫学检测或测定方法，其使用权利要求1~3中任一项所述的人源化抗体或该抗体片段。
9.一种包含未结合半乳糖的O连接型糖链的CD27的检测试剂，其包含权利要求1~3中任一项所述的人源化抗体或该抗体片段。
10.一种与包含未结合半乳糖的O连接型糖链的CD27相关的疾病的诊断剂，其包含权利要求1~3中任一项所述的人源化抗体或该抗体片段。
11.如权利要求10所述的诊断剂，其中，与包含未结合半乳糖的O连接型糖链的CD27相关的疾病为IgA肾病。
12.如权利要求10所述的诊断剂，其中，与包含未结合半乳糖的O连接型糖链的CD27相关的疾病为癌症。
13.一种与包含未结合半乳糖的O连接型糖链的CD27相关的疾病的治疗剂，其含有权利要求1~3中任一项所述的人源化抗体或抗体片段作为有效成分。
14.如权利要求13所述的治疗剂，其中，与包含未结合半乳糖的O连接型糖链的CD27相关的疾病为IgA肾病。
15.如权利要求13所述的治疗剂，其中，与包含未结合半乳糖的O连接型糖链的CD27相关的疾病为癌症。
16.一种与包含未结合半乳糖的O连接型糖链的CD27相关的疾病的诊断方法，其包括：使用权利要求1~3中任一项所述的人源化抗体或该抗体片段，对表达包含未结合半乳糖的O连接型糖链的CD27的细胞进行检测或测定。
17.一种与包含未结合半乳糖的O连接型糖链的CD27相关的疾病的诊断方法，其包括：使用权利要求1~3中任一项所述的人源化抗体或该抗体片段，对包含未结合半乳糖的O连接型糖链的CD27进行检测或测定。
18.如权利要求16或17所述的诊断方法，其中，与包含未结合半乳糖的O连接型糖链的CD27相关的疾病为IgA肾病。
19.如权利要求16或17所述的诊断方法，其中，与包含未结合半乳糖的O连接型糖链的CD27相关的疾病为癌症。
20.权利要求1~3中任一项所述的人源化抗体或该抗体片段在制造与包含未结合半乳糖的O连接型糖链的CD27相关的疾病的诊断剂中的应用。
21.权利要求1~3中任一项所述的人源化抗体或该抗体片段在制造与包含未结合半乳糖的O连接型糖链的CD27相关的疾病的治疗剂中的应用。
22.如权利要求20或21所述的人源化抗体或该抗体片段的应用，其中，与包含未结合半乳糖的O连接型糖链的CD27相关的疾病为IgA肾病。
23.如权利要求20或21所述的人源化抗体或该抗体片段的应用，其中，与包含未结合半乳糖的O连接型糖链的CD27相关的疾病为癌症。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018059465A1 (zh) * 2016-09-29 2018-04-05 江苏恒瑞医药股份有限公司 抗cd27抗体、其抗原结合片段及其医药用途
WO2019196117A1 (en) * 2018-04-13 2019-10-17 Dingfu Biotarget Co., Ltd. Anti-cd27 antibodies and use thereof

Families Citing this family (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20110039220A (ko) * 2008-06-30 2011-04-15 교와 핫꼬 기린 가부시키가이샤 항ｃｄ27 항체
SI2686347T1 (en) 2011-03-16 2018-08-31 Argenx Bvba Antibodies against CD70
JP6487839B2 (ja) * 2012-03-15 2019-03-20 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド ヒト抗ｃｄ２７抗体、方法、及び使用
US10391168B1 (en) 2014-08-22 2019-08-27 University Of Bern Anti-CD70 combination therapy
US9616114B1 (en) 2014-09-18 2017-04-11 David Gordon Bermudes Modified bacteria having improved pharmacokinetics and tumor colonization enhancing antitumor activity
KR102659538B1 (ko) 2014-09-28 2024-04-22 더 리전트 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 자극성 및 비자극성 골수성 세포의 조절
WO2017009842A2 (en) 2015-07-16 2017-01-19 Biokine Therapeutics Ltd. Compositions and methods for treating cancer
EP3471754A1 (en) 2016-06-20 2019-04-24 Kymab Limited Anti-pd-l1 antibodies
JOP20190055A1 (ar) 2016-09-26 2019-03-24 Merck Sharp & Dohme أجسام مضادة ضد cd27
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
US11180535B1 (en) 2016-12-07 2021-11-23 David Gordon Bermudes Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria
CN108239659B (zh) 2016-12-23 2020-03-03 百奥赛图江苏基因生物技术有限公司 人源化基因改造动物模型的制备方法及应用
WO2018113774A1 (en) * 2016-12-23 2018-06-28 Beijing Biocytogen Co., Ltd Genetically modified non-human animal with human or chimeric cd27
US11166985B2 (en) 2017-05-12 2021-11-09 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for engineering cells and uses thereof in immuno-oncology
WO2019097305A2 (en) 2017-05-12 2019-05-23 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for engineering cells and uses thereof in immuno-oncology
BR112020011833A2 (pt) 2017-12-12 2020-11-24 Pionyr Immunotherapeutics, Inc. anticorpos anti-trem2 e métodos relacionados
GB201800649D0 (en) 2018-01-16 2018-02-28 Argenx Bvba CD70 Combination Therapy
CA3099364A1 (en) 2018-05-11 2019-11-14 Crispr Therapeutics Ag Methods and compositions for treating cancer comprising engineered t cells comprising modified chimeric antigen receptors
US20210251994A1 (en) 2018-06-15 2021-08-19 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Increasing immune activity through modulation of postcellular signaling factors
TW202038958A (zh) 2018-12-18 2020-11-01 比利時商阿根思公司 Ｃｄ７０組合治療
JP2022531185A (ja) 2019-04-30 2022-07-06 クリスパー セラピューティクス アクチェンゲゼルシャフト 遺伝子改変ｔ細胞を標的化するｃｄ１９を使用するｂ細胞悪性病変の同種細胞療法
EP3962493A2 (en) 2019-05-03 2022-03-09 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Methods of modulating immune activity/level of irf or sting or of treating cancer, comprising the administration of a sting modulator and/or purinergic receptor modulator or postcellular signaling factor
US20230114107A1 (en) 2019-12-17 2023-04-13 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Combination anti-cancer therapies with inducers of iron-dependent cellular disassembly
EP4172323A1 (en) 2020-06-29 2023-05-03 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Viruses engineered to promote thanotransmission and their use in treating cancer
US20220325287A1 (en) 2021-03-31 2022-10-13 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Thanotransmission polypeptides and their use in treating cancer
AU2022303363A1 (en) 2021-06-29 2024-01-18 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Immune cells engineered to promote thanotransmission and uses thereof
CA3241438A1 (en) 2021-12-23 2023-06-29 Sana Biotechnology, Inc. Chimeric antigen receptor (car) t cells for treating autoimmune disease and associated methods
US20240174732A1 (en) 2022-10-05 2024-05-30 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Nucleic acid molecules encoding trif and additional polypeptides and their use in treating cancer

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007079783A1 (en) * 2006-01-13 2007-07-19 Institut Pasteur Enzymatic large-scale synthesis of mucin glyconjugates, and immunogenic applications thereof

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5229289A (en) * 1988-03-11 1993-07-20 The Biomembrane Institute Monoclonal antibodies and vaccine development directed to human cancer-associated antigens by immunization with animal and human and with synthetic carbohydrate-carrier conjugates
AU2003231554A1 (en) * 2002-04-30 2003-11-17 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Antibody to human insulin-like growth factor
EP2014302A1 (en) * 2007-07-12 2009-01-14 Institut Curie An antibody specific for the Tn antigen for the treatment of cancer
KR20110039220A (ko) * 2008-06-30 2011-04-15 교와 핫꼬 기린 가부시키가이샤 항ｃｄ27 항체

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007079783A1 (en) * 2006-01-13 2007-07-19 Institut Pasteur Enzymatic large-scale synthesis of mucin glyconjugates, and immunogenic applications thereof

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ARNE ENGELSBERG ET AL: "The golgi protein RCAS1 controls cell surface expression of tumor-associated O-linked glycan antigens.", 《THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY》, vol. 278, no. 25, 20 June 2003 (2003-06-20), pages 22998 - 23007, XP008141356, DOI: doi:10.1074/jbc.M301361200 *
DONG H ET AL: "CD148 and CD27 are expressed in B cell lymphomas derived from both memory and naive B cells", 《LEUKEMIA AND LYMPHOMA》, vol. 43, 30 September 2002 (2002-09-30), pages 1855 - 1858, XP008141423 *
LOENEN W.ET AL: "The CD27 membrane receptor,a lymphocyte-specific member of the nerve growth factor receptor family, gives rise to a soluble form by protein processing that does not involve receptor endocytosis", 《EUR.J.IMMUNOL》, vol. 22, 29 February 1992 (1992-02-29), pages 447 - 455, XP008141357, DOI: doi:10.1002/eji.1830220224 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018059465A1 (zh) * 2016-09-29 2018-04-05 江苏恒瑞医药股份有限公司 抗cd27抗体、其抗原结合片段及其医药用途
WO2019196117A1 (en) * 2018-04-13 2019-10-17 Dingfu Biotarget Co., Ltd. Anti-cd27 antibodies and use thereof
CN111971303A (zh) * 2018-04-13 2020-11-20 苏州丁孚靶点生物技术有限公司 抗cd27抗体及其用途
CN111971303B (zh) * 2018-04-13 2022-05-17 苏州丁孚靶点生物技术有限公司 抗cd27抗体及其用途
US11795230B2 (en) 2018-04-13 2023-10-24 Dingfu Biotarget Co., Ltd. Anti-CD27 antibodies and use thereof

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