CN107530427A - 针对用于实体肿瘤的治疗的lhr的car t细胞疗法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了新颖的抗LHR嵌合抗原受体（CAR）、包括其的细胞或组合物、编码抗LHR CAR的载体或质粒、以及用于生产其的方法、或使用其来检测或治疗卵巢癌或前列腺癌的方法。本发明还提供了抗LHR抗体、包括其的组合物、编码其的核酸序列、以及用于检测LHR的试剂盒。

Description

针对用于实体肿瘤的治疗的LHR的CAR T细胞疗法
相关申请的交叉引用
本申请根据35 U.S.C. § 119(e)要求2015年3月27日提交的美国临时申请号62/139,623的优先权，其全文以引用的方式合并入本文中。
技术领域
本申请涉及新颖的促黄体激素受体（luteinizing hormone receptor，LHR）嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor，CAR）、细胞或包含其的组合物、以及使用其来用于包括实体肿瘤的疗法的方法。本申请还提供了包含促黄体激素受体嵌合抗原受体的免疫原性决定簇的分离的肽和融合蛋白。
背景技术
卵巢癌是妇科肿瘤中癌症死亡的最常见原因（Siegel, R. et al. (2012) CACancer J. Clin. 62:10-29）。预期每年在美国大约发生25,000个新病例和14,000例死亡（Siegel, R. et al. (2012) CA Cancer J. Clin. 62:10-29）。卵巢癌的总体生存期在过去30年内似乎有所上升，在20世纪60年代的中位生存期大约是12个月，相比之下当前的是38个月。但是，III期卵巢癌的5年生存率并没有显著改变，仍然是25%。中位生存期的上升可以部分被解释为是由于前线化疗上的改进。对于患有卵巢癌的患者的标准初始化疗涉及基于铂-紫杉醇的方案（Marcus, C.S. et al. (2014) J. Cancer 5:25-30）。大约70%的患者会获得对于该疗法的临床反应。尽管如此，大多数女性都会复发并最终死于其疾病。因此，在减少远程转移、延长复发时间和提高总体生存率的尝试中，确定新的治疗靶标并研发新的药剂是必要的。
因此，有需要研发卵巢癌和其他实体肿瘤（例如前列腺癌）的安全和有效的治疗。本发明满足该需要并提供了相关的优点。
发明内容
由于最近在使用利用基因工程化的嵌合抗原受体（CAR）T细胞进行自体治疗的B细胞淋巴瘤和白血病中获得了空前的效果，所以许多实验室已经开始将该方法应用至包括卵巢癌在内的实体肿瘤。经CAR修饰的T细胞将单克隆抗体的独立于HLA的靶向特异性与被激活的T细胞的溶细胞活性、增殖和归巢性质相结合，但是不响应于检查点抑制。由于其直接杀死表达靶标的抗原的能力，CAR T细胞对于任何抗原阳性的细胞或组织是高度毒性的，这使得有需要通过高度肿瘤特异性的抗体构建CAR。至今，已经针对α-叶酸受体构建了针对卵巢癌的CAR修饰的T细胞，但是这些全部都具有抗原的一些脱靶表达。
本发明提供了用于治疗实体肿瘤的新靶标，所述实体肿瘤包括但不限于卵巢癌和前列腺癌。所述靶标，LHR，是在这些肿瘤中的大多数上高度表达的，但是具有受限的脱靶（off-target）阳性（positivity），并且因此具有理想的安全性。因此，在一个方面，所述组合物特别有用于治疗表达或过度表达LHR的肿瘤或癌细胞。
在一个方面，本发明提供了一种分离的抗体，所述抗体包括重链（HC）免疫球蛋白可变结构域序列和轻链（LC）免疫球蛋白可变结构域序列，其中所述抗体结合至促黄体激素受体（LHR）的表位。在进一步的方面，本发明提供了单独的或与LHR抗原或其片段结合的如本文所述的分离的抗LHR抗体或其片段和可检测的或纯化标签。本发明进一步提供了包括该抗原/抗体复合物的间接体内（ex vivo）细胞。
本发明的方面涉及一种嵌合抗原受体（CAR），其包括：（a）LHR抗体的抗原结合结构域；（b）铰链结构域；（c）跨膜结构域；以及（d）细胞内结构域。本发明的进一步的方面涉及一种嵌合抗原受体（CAR），其包括：（a）LHR抗体的抗原结合结构域；（b）铰链结构域；（c）CD28跨膜结构域；（d）一个或多个共刺激区域，其选自CD28共刺激信号传导区域、4-1BB共刺激信号传导区域、ICOS共刺激信号传导区域、以及OX40共刺激区域；以及（e）CD3ζ信号传导结构域及其替代物。
在进一步的方面，本发明提供了一种嵌合抗原受体（CAR），其包括：（a）抗-促黄体激素受体（“LHR”）抗体的抗原结合结构域；（b）CD8 α铰链结构域；（c）CD8 α跨膜结构域；（d）CD28和/或4-1BB共刺激信号传导区域；以及（e）CD3ζ信号传导结构域及其替代物。
在另一个方面，本发明提供了一种编码所述抗LHR抗体、或所述抗LHR CAR的分离的核酸序列。
在另一个方面，本发明提供了一种包含编码所述抗LHR抗体、或所述抗LHR CAR的分离的核酸序列的载体。
在另一个方面，本发明提供了一种包含编码所述抗LHR抗体、或所述抗LHR CAR的所述分离的核酸序列的载体。
在另一个方面，本发明提供了一种组合物，其包括载体和以下中的一个或多个：所述抗LHR抗体；和/或所述抗LHR CAR；和/或编码所述抗LHR抗体或所述抗LHR CAR的所述分离的核酸序列；和/或包含编码所述抗LHR抗体、或所述抗LHR CAR的所述分离的核酸序列的所述载体；和/或包含所述抗LHR CAR的分离的细胞。
在一个方面，本发明提供了一种组合物，其包括以下、或替代地基本上由以下组成、或进一步由载体和以下中的一个或多个组成：一种抗体或其片段、编码所述抗体或其片段的核酸、包含抗LHR CAR的分离的细胞；和/或编码所述CAR的所述分离的核酸；和/或包含编码所述CAR的所述核酸的所述载体；和/或表达抗LHR CAR的分离的细胞；和/或所述抗LHR抗体。
附图说明
图1A-1C示出了LHR在TOV21G细胞系上的流式细胞仪图（图1A）、间皮素在SKOV3细胞系上的流式细胞仪图（图1B）、以及MUC16在CAOV3细胞系上的流式细胞仪图（图1C）。
图2A-2C示出了LHR抗体在2期浆液性乳头状腺癌上的阳性免疫组化染色图案（图2A）、MUC16抗体在IIIC期子宫内膜样腺癌上的阳性免疫组化染色图案（图2B）、以及间皮素在1C期浆液性乳头状腺癌上的阳性免疫组化染色图案（图2C）。
图3示出了被用来生成LHR-Fc的序列。显示LHR G蛋白的氨基酸结构的序列（框出的区域）被用来生成LHR-Fc，该LHR-Fc被用在免疫和筛选方法中，从而识别有用于生成LHRCAR的可能的LHR结合抗体。
图4示出了LHR-Fc ELISA阳性抗体在ES-2卵巢癌细胞系上的典型流式细胞仪筛选图，证明了仅仅杂交瘤8B7有强反应性。
图5示出了5个候选的LHR抗体亚克隆的流式细胞仪图，其具有对ES-2人卵巢癌细胞系的最高的MFI值。
图6示出了抗LHR CAR的DNA序列、以及其在质膜中的理论结构的示意图。
图7示出了LHR抗体亚克隆的重链和轻链的对齐。
图8A-D示出了LHR阳性癌的分布（图8A）；多个肿瘤组织学群组的LHR强度的分布（图8B）；在患有卵巢癌、腹膜癌或输卵管癌的患者中的LHR染色强度（图8C）；以及通过肿瘤病理分期群组进行的LHR染色强度（图8D）。
图9A-D示出了在组织学、在前列腺癌中的LHR表达（图9A）、在前列腺癌（AD）和去势抗性（CR）前列腺癌中的相对mRNA水平（图9B）以及蛋白免疫印迹（Western blot）（图9C-D）。
图10示出了基因转移载体的骨架是基于HIV的、双顺反子慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreen，其包括HIV-1 5’和3’ 长末端重复（LTR）、包装信号（Ψ）、EF1α启动子、内部核糖体进入位点（IRES）、ZsGreen（一种绿色荧光蛋白）、土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件（WPRE）、以及猿病毒40起源（SV40）。EF-1α启动子的存在，确保了由scFV组成的转基因的组成型表达，该scFV对LHR、CD8铰链和跨膜区域以及CD28、4-1BB和CD3ζ信号传导结构域特异。检测蛋白ZsGreen的表达由IRES区域执行。通过荧光显微镜，通过ZsGreen在细胞中的存在测定载体的整合。
图11示出了LHR CAR T细胞的细胞毒性测定的结果。使用如在方法部分描述的LDH细胞毒性试剂盒来确定表达LHR CAR的T细胞的细胞毒性。在测定之前，使用αCD3/CD8珠粒激活T细胞（Stem Cell Technologies, 30 ul至2 ml的介质）。使用LHR慢病毒颗粒转导被激活的T细胞，然后使用αCD3/CD8床激活T细胞。将未转导的、被激活的T细胞用作对照。每个孔铺3,000个SKOV3细胞。以20:1、10:1、5:1 和1:1 (60,000 – 3000)的比例，将LHR转导的T细胞加入至孔。每个数据点表示一式三份的测量的平均值。
图12示出了LHR CAR在原发性T细胞中的表达。转导有LHR CAR的原发性T细胞显示了LHR mRNA的表达。使用的引物跨越CD8铰链和4-1BB信号传导结构域之间的区域（300bp）。
详细描述
应该理解的是，本发明不被限制至所述特定的方面，因为这些方面当然可能发生改变。还应该理解的是，本文所用的术语仅仅是为了描述特定的方面，并且并非旨在限制，因为本发明的范围将仅仅被附加的权利要求限制。
除非另有定义，否则本文所用的所有技术的和科学的术语都具有如属于本发明的技术领域的普通技术人员通常理解一样的含义。尽管也可以在本发明的实践中或试验中使用与本文所述的类似或等同的任何方法和材料，但是现在描述的是优选的方法和材料。本文提及的所有技术和专利公开其全文都以引用的方式合并入文中。本文的任何描述都不应该被解释为承认通过在先发明本发明无权先于这样的公开。
除非另有说明，否则本技术的实践将采用组织培养、免疫学、分子生物学、微生物学、细胞生物学和重组DNA的常规技术，这是在本领域的技术之内的。参见例如Sambrookand Russell eds. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition;the series Ausubel et al. eds. (2007) Current Protocols in Molecular Biology;the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); MacPherson etal. (1991) PCR 1: A Practical Approach (IRL Press at Oxford UniversityPress); MacPherson et al. (1995) PCR 2: A Practical Approach; Harlow and Laneeds. (1999) Antibodies, A Laboratory Manual; Freshney (2005) Culture ofAnimal Cells: A Manual of Basic Technique, 5th edition; Gait ed. (1984)Oligonucleotide Synthesis; U.S. Patent No. 4,683,195; Hames and Higgins eds.(1984) Nucleic Acid Hybridization; Anderson (1999) Nucleic AcidHybridization; Hames and Higgins eds. (1984) Transcription and Translation;Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press (1986)); Perbal (1984) A PracticalGuide to Molecular Cloning; Miller and Calos eds. (1987) Gene TransferVectors for Mammalian Cells (Cold Spring Harbor Laboratory); Makrides ed.(2003) Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells; Mayer and Walker eds.(1987) Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press,London); 和Herzenberg et al. eds (1996) Weir’s Handbook of ExperimentalImmunology。
所有数字指定（包括范围），例如pH、温度、时间、浓度、以及分子质量，都是在适当时变化（+）或（-）0.1 或1.0、或替代地变化+/- 15 %、或替代地10%、或替代地5%、或替代地2%的增值的近似值。应该理解的是，尽管并非总是明确地声明，但是所有的数字指定都有术语“约”在前。还应该理解的是，尽管并非总是明确地声明，但是本文所述的试剂仅仅是示例性的，并且这些试剂的等效物在本领域是已知的。
在没有明确描述的情况下应该推断、并且除非另有说明，否则当本技术涉及多肽、蛋白、多核苷酸或抗体时，这样的等效物或生物等效物旨在落入本技术的范围之内。
定义
如在本文和在权利要求中使用的，单数形式“一个”、“一种”、以及“所述”包括复数指代，除非文中另外明确规定。例如，术语“一个细胞”包括多个细胞，包括其混合物。
如本文所用的，术语“动物”表示活的多细胞脊椎动物生物，是包括例如哺乳动物和鸟类的类别。术语“哺乳动物”包括人类哺乳动物和非人类哺乳动物。
术语“对象”、“宿主”、“个体”和“患者”在此被可交换地使用，表示人类和兽医对象，例如人类、动物、非人灵长类动物、狗、猫、羊、鼠、马和牛。在一些实施方式中，所述对象是人类。
如本文使用的，术语“抗体”统一指免疫球蛋白或免疫球蛋白样分子，包括例如且不限于IgA、IgD、IgE、IgG和IgM及其组合，以及在任何脊椎动物中在免疫反应期间产生的类似分子，所述脊椎动物例如是哺乳动物（例如人类、山羊、兔和鼠）以及非哺乳动物物种（例如鲨鱼免疫球蛋白）。除非另有具体说明，否则术语“抗体”包括特异性地结合至感兴趣的分子（或感兴趣的高度相似的分子的群组）至实质性排除结合至其他分子的完整的免疫球蛋白和“抗体片段”或“抗原结合片段”（例如，在生物样品中与对其他分子的结合常数相比，对感兴趣的分子的结合常数大至少103 M-1、至少104 M-1或至少105 M-1的抗体和抗体片段）。术语“抗体”还包括遗传工程形式，例如嵌合抗体（例如人源化鼠抗体）、异源偶联抗体（例如双特异性抗体）。还请参见Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995 (PierceChemical Co., Rockford, Ill.); Kuby, J., Immunology, 3rd Ed., W.H. Freeman &Co., New York, 1997。
就抗体结构而言，免疫球蛋白具有通过二硫键互相连接的重（H）链和轻（L）链。存在两种类型的轻链：λ和κ。存在决定抗体分子的功能活性的五种主要的重链类型（或同种型）：IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。每个重链和轻链都包括恒定区域和可变区域（所述区域也被称为“结构域”）。结合起来，重链和轻链可变区域特异性地结合抗原。重链和轻链可变区域包括被三个高度可变区域打断的“框架”区域，所述高度可变区域也被称为“互补决定区域”或“CDR”。框架区域和CDR的范围已经被确定（参见Kabat et al., Sequences of Proteinsof Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services,1991，其以引用的方式合并入本文中）。Kabat数据库现在在线维护。不同的轻链或重链的框架区域的序列在物种之内是相对保守的。抗体的框架区域，即组成的轻链和重链的结合的框架区域，主要采用β折叠构象，而CDR形成环，该环连接所述β折叠结构或者在一些情况中形成所述β折叠的一部分。因此，框架区域作用来形成支架，其用来通过互链、非共价相互作用将CDR定位在正确的朝向中。
CDR主要负责结合至抗原的表位。每个链的CDR通常被称为CDR1、CDR2和CDR3，这是从N末端开始依次进行编号，并且也通常由该特定的CDR所位于的链而确定。因此，VH CDR3位于发现其的抗体的重链的可变结构域，而VL CDR1是来自发现其的抗体的轻链的可变结构域的CDR1。结合LHR的抗体将具有特异性的VH区域和VL区域序列，并因此具有特异性的CDR序列。具有不同的特异性（即对不同抗原的不同结合位点）的抗体具有不同的CDR。虽然抗体与抗体之间不同的是CDR，但是在CDR之内只有数量有限的氨基酸位置直接涉及抗原结合。在CDR之内的这些位置被称为特异性决定残基（SDR）。
如本文使用的，术语“抗原”是指可以被特异性的体液或细胞免疫的产品（例如抗体分子或T细胞受体）特异性地结合的化合物、组合物或物质。抗原可以是任何类型的分子，包括例如半抗原、简单中间代谢物、糖（例如寡糖）、脂质和激素以及大分子（例如复合碳水化合物（例如多糖））、磷脂和蛋白质。常见的抗原的类别包括但不限于病毒抗原、细菌抗原、真菌抗原、原生动物和其他寄生虫抗原、肿瘤抗原、涉及自身免疫性疾病的抗原、过敏和移植物排斥、毒素和其他杂项抗原。
如本文使用的，术语“抗原结合结构域”是指能够特异性地结合至抗原靶标的任何蛋白或多肽结构域。
如本文使用的，术语“嵌合抗原受体”（CAR）是指这样的融合蛋白，其包括能够结合至抗原的细胞外结构域、衍生自与该细胞外结构域衍生自的多肽不同的多肽的跨膜结构域、以及至少一个细胞内结构域。“嵌合抗原受体（CAR）”有时被称为“嵌合受体”、“T-体（T-body）”或“嵌合免疫受体（CIR）”。“能够结合至抗原的细胞外结构域”是指能够结合至某个抗原的任何寡肽或多肽。“细胞内结构域”是指已知用作发送信号来引起细胞内的生物过程的激活或抑制的结构域的任何寡肽或多肽。“跨膜结构域”是指已知跨越细胞膜并且能够作用来连接细胞外结构域和信号传导结构域的任何寡肽或多肽。嵌合抗原受体可以任选地包括“铰链（hinge）结构域”，其用作细胞外结构域和跨膜结构域之间的接头。在本文中公开了编码每个结构域的组分的非限制性的示例性多核苷酸序列，例如：
铰链结构域：IgG1重链铰链序列，SEQ. ID NO: 66：
CTCGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCG
跨膜结构域：CD28跨膜区域，SEQ. ID NO: 67：
TTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTG
细胞内结构域：4-1BB共刺激信号传导区域，SEQ. ID NO: 68：
AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG
细胞内结构域：CD28共刺激信号传导区域，SEQ. ID NO: 69：
AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC
细胞内结构域：CD3ζ信号传导区域，SEQ. ID NO: 70：
AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA。
如本文使用的，术语“抗原结合结构域”是指能够特异性地结合至抗原靶标的任何蛋白或多肽结构域。
每个示例性结构域组分的进一步的实施方式包括与由上述核酸序列编码的蛋白具有至少70%、或替代地至少80%氨基酸序列同一性、优选90%序列同一性、更优选至少95%序列同一性的具有类似的生物功能的其他蛋白。进一步地，在本文中提供了这样的结构域的非限制性例子。
“组合物”通常是指活性剂（例如化合物或组合物）和天然存在或非天然存在的载体的组合，所述载体是惰性的，例如可检测试剂或标签，或者是活性的，例如佐剂、稀释剂、粘合剂、稳定剂、缓冲剂、盐、亲脂性溶剂、防腐剂、佐剂等，并且包括药学上可接受的载体。载体还包括药物赋形剂和添加剂蛋白质、肽、氨基酸、脂质和碳水化合物（例如糖，包括单糖、二寡糖、三寡糖、四寡糖和寡糖；衍生的糖，例如糖醇、醛糖酸、酯化糖等；以及多糖或糖聚合物），其可以单独地或组合地存在，以重量或体积计单独地或组合地包括1-99.99%。示例性的蛋白赋形剂包括血清白蛋白（例如人血清白蛋白（HSA）、重组人白蛋白（rHA））、明胶、酪蛋白等。还具有缓冲能力的代表性的氨基酸/抗体组分包括丙氨酸、精氨酸、甘氨酸、精氨酸、甜菜碱、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、阿斯巴甜等。碳水化合物赋形剂也旨在位于本技术的范围之内，其例子包括但不限于：单糖，例如果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等；二糖，例如乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖等；多糖，例如棉子糖、松三糖、麦芽糖糊精、葡聚糖、淀粉等；以及糖醇，例如甘露糖醇、木糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、木糖醇山梨醇（葡萄糖醇）和肌醇。
如本文使用的，术语“共有序列（consensus sequence）”是指这样的氨基酸或核苷酸序列，其通过对齐一系列的多个序列而确定，并且定义了代表在所述多个序列的每个对应位置处的氨基酸或碱基的主要选择的理想化序列。根据该系列的多个序列的序列，该系列的共有序列可以与这些序列的每一个有零个、一个、几个、或更多个取代基的不同。并且，根据该系列的多个序列的序列，可以对该系列确定一个以上的共有序列。已经对共有序列的生成进行过深入的数学分析。可以使用各种软件程序来确定共有序列。
如本文使用的，术语“促黄体激素受体（LHR）”是指与该名称相关的特定的分子，以及与本文所示的LHR序列具有至少70%、或替代地至少80%氨基酸序列同一性、优选90%序列同一性、更优选至少95%序列同一性的具有类似的生物功能的任何其他分子。与GenBank登录号AAB19917.2 (Homo sapiens)、或AAA39432.1 (Mus musculus)、或AAA41529.1(Rattus norvegicus)相关的蛋白序列提供了LHR的另外的示例性序列。其非限制性的例子包括：
促黄体激素受体[Homo sapiens]，SEQ. ID NO: 53：
MKQRFSALQLLKLLLLLQPPLPRALREALCPEPCNCVPDGALRCPGPTAGLTRLSLAYLPVKVIPSQAFRGLNEVIKIEISQIDSLERIEANAFDNLLNLSEILIQNTKNLRYIEPGAFINLPRLKYLSICNTGIRKFPDVTKVFSSESNFILEICDNLHITTIPGNAFQGMNNESVTLKLYGNGFEEVQSHAFNGTTLTSLELKENVHLEKMHNGAFRGATGPKTLDISSTKLQALPSYGLESIQRLIATSSYSLKKLPSRETFVNLLEATLTYPSHCCAFRNLPTKEQNFSHSISENFSKQCESTVRKVNNKTLYSSMLAESELSGWDYEYGFCLPKTPRCAPEPDAFNPCEDIMGYDFLRVLIWLINILAIMGNMTVLFVLLTSRYKLTVPRFLMCNLSFADFCMGLYLLLIASVDSQTKGQYYNHAIDWQTGSGCSTAGFFTVFASELSVYTLTVITLERWHTITYAIHLDQKLRLRHAILIMLGGWLFSSLIAMLPLVGVSNYMKVSICFPMDVETTLSQVYILTILILNVVAFFIICACYIKIYFAVRNPELMATNKDTKIAKKMAILIFTDFTCMAPISFFAISAAFKVPLITVTNSKVLLVLFYPINSCANPFLYAIFTKTFQRDFFLLLSKFGCCKRRAELYRRKDFSAYTSNCKNGFTGSNKPSQSTLKLSTLHCQGTALLDKTRYTEC
促黄体激素受体[Mus musculus] ，SEQ. ID NO: 54：
MGRRVPALRQLLVLAMLVLKQSQLHSPELSGSRCPEPCDCAPDGALRCPGPRAGLARLSLTYLPVKVIPSQAFRGLNEVVKIEISQSDSLERIEANAFDNLLNLSEILIQNTKNLLYIEPGAFTNLPRLKYLSICNTGIRTLPDVSKISSSEFNFILEICDNLYITTIPGNAFQGMNNESITLKLYGNGFEEVQSHAFNGTTLISLELKENIYLEKMHSGTFQGATGPSILDVSSTKLQALPSHGLESIQTLIATSSYSLKTLPSREKFTSLLVATLTYPSHCCAFRNLPKKEQNFSFSIFENFSKQCESTVREANNETLYSAIFEENELSGWDYDYDFCSPKTLQCTPEPDAFNPCEDIMGYAFLRVLIWLINILAIFGNLTVLFVLLTSRYKLTVPRFLMCNLSFADFCMGLYLLLIASVDSQTKGQYYNHAIDWQTGSGCSAAGFFTVFASELSVYTLTVITLERWHTITYAVQLDQKLRLRHAIPIMLGGWIFSTLMATLPLVGVSSYMKVSICLPMDVESTLSQVYILSILLLNAVAFVVICACYVRIYFAVQNPELTAPNKDTKIAKKMAILIFTDFTCMAPISFFAISAAFKVPLITVTNSKVLLVLFYPVNSCANPFLYAVFTKAFQRDFFLLLSRFGCCKHRAELYRRKEFSACTFNSKNGFPRSSKPSQAALKLSIVHCQQPTPPRVLIQ
促黄体激素受体[Rattus norvegicus] ，SEQ. ID NO: 55：
MGRRVPALRQLLVLAVLLLKPSQLQSRELSGSRCPEPCDCAPDGALRCPGPRAGLARLSLTYLPVKVIPSQAFRGLNEVVKIEISQSDSLERIEANAFDNLLNLSELLIQNTKNLLYIEPGAFTNLPRLKYLSICNTGIRTLPDVTKISSSEFNFILEICDNLHITTIPGNAFQGMNNESVTLKLYGNGFEEVQSHAFNGTTLISLELKENIYLEKMHSGAFQGATGPSILDISSTKLQALPSHGLESIQTLIALSSYSLKTLPSKEKFTSLLVATLTYPSHCCAFRNLPKKEQNFSFSIFENFSKQCESTVRKADNETLYSAIFEENELSGWDYDYGFCSPKTLQCAPEPDAFNPCEDIMGYAFLRVLIWLINILAIFGNLTVLFVLLTSRYKLTVPRFLMCNLSFADFCMGLYLLLIASVDSQTKGQYYNHAIDWQTGSGCGAAGFFTVFASELSVYTLTVITLERWHTITYAVQLDQKLRLRHAIPIMLGGWLFSTLIATMPLVGISNYMKVSICLPMDVESTLSQVYILSILILNVVAFVVICACYIRIYFAVQNPELTAPNKDTKIAKKMAILIFTDFTCMAPISFFAISAAFKVPLITVTNSKILLVLFYPVNSCANPFLYAIFTKAFQRDFLLLLSRFGCCKRRAELYRRKEFSAYTSNCKNGFPGASKPSQATLKLSTVHCQQPIPPRALTH。
如本文使用的，术语“CD8 α铰链结构域”是指与该名称相关的特定的蛋白片段，以及与本文所示的CD8 α铰链结构域序列具有至少70%、或替代地至少80%氨基酸序列同一性、优选90%序列同一性、更优选至少95%序列同一性的具有类似的生物功能的任何其他分子。在Pinto, R.D. et al. (2006) Vet. Immunol. Immunopathol. 110:169-177中提供了人类、小鼠和其他物种的CD8 α铰链结构域的示例性序列。其非限制性的例子包括：
人类CD8 α铰链结构域，SEQ. ID NO:56：
PAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIY
小鼠CD8 α铰链结构域，SEQ. ID NO: 57：
KVNSTTTKPVLRTPSPVHPTGTSQPQRPEDCRPRGSVKGTGLDFACDIY
猫CD8 α铰链结构域，SEQ. ID NO: 58：
PVKPTTTPAPRPPTQAPITTSQRVSLRPGTCQPSAGSTVEASGLDLSCDIY。
如本文使用的，术语“CD8 α跨膜结构域”是指与该名称相关的特定的蛋白片段，以及与本文所示的CD8 α跨膜结构域序列具有至少70%、或替代地至少80%氨基酸序列同一性、优选90%序列同一性、更优选至少95%序列同一性的具有类似的生物功能的任何其他分子。与人类T细胞表面糖蛋白CD8α链的183至203位氨基酸（NCBI参考序列：NP_001759.3）、或者小鼠T细胞表面糖蛋白CD8α链的197至217位氨基酸（NCBI参考序列：NP_001074579.1）、以及大鼠T细胞表面糖蛋白CD8α链的190至210位氨基酸（NCBI参考序列：NP_ 113726.1）相关的片段序列，提供了CD8 α跨膜结构域的其他的示例性序列。与列出的NCBI的每一个相关的序列提供如下：
人类CD8 α跨膜结构域，SEQ. ID NO: 59：
IYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT
小鼠CD8 α跨膜结构域，SEQ. ID NO: 60：
IWAPLAGICVALLLSLIITLI
大鼠CD8 α跨膜结构域，SEQ. ID NO: 61：
IWAPLAGICAVLLLSLVITLI。
如本文使用的，术语“CD28跨膜结构域”是指与该名称相关的特定的蛋白片段，以及与本文所示的CD28跨膜结构域序列具有至少70%、或替代地至少80%氨基酸序列同一性、优选90%序列同一性、更优选至少95%序列同一性的具有类似的生物功能的任何其他分子。与GenBank登录号XM_006712862.2和XM_009444056.1相关的片段序列，提供了CD28跨膜结构域的其他的非限制性的示例性序列。与列出的登录号的每一个相关的序列提供如下：由SEQ ID NO: 69编码的序列。
如本文使用的，术语“4-1BB共刺激信号传导区域（signaling region）”是指与该名称相关的特定的蛋白片段，以及与本文所示的4-1BB共刺激信号传导区域序列具有至少70%、或替代地至少80%氨基酸序列同一性、优选90%序列同一性、更优选至少95%序列同一性的具有类似的生物功能的任何其他分子。在美国申请号US 13/826,258中提供了4-1BB共刺激信号传导区域的示例性序列。与美国申请号US 13/826,258相关的4-1BB共刺激信号传导区域的序列提供如下：
4-1BB共刺激信号传导区域，SEQ. ID NO: 62：
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL。
如本文使用的，术语“CD28共刺激信号传导区域”是指与该名称相关的特定的蛋白片段，以及与本文所示的CD28共刺激信号传导区域序列具有至少70%、或替代地至少80%氨基酸序列同一性、优选90%序列同一性、更优选至少95%序列同一性的具有类似的生物功能的任何其他分子。在美国专利号5,686,281；Geiger, T. L. et al., Blood 98: 2364-2371 (2001)；Hombach, A. et al., J Immunol 167: 6123-6131 (2001)；Maher, J. etal. Nat Biotechnol 20: 70-75 (2002)；Haynes, N. M. et al., J Immunol 169:5780-5786 (2002)；Haynes, N. M. et al., Blood 100: 3155-3163 (2002)中提供了示例性的CD28共刺激信号传导区域。非限制性的例子包括以下CD28序列的114-220残基：MLRLLLALNL FPSIQVTGNK ILVKQSPMLV AYDNAVNLSC KYSYNLFSRE FRASLHKGLDSAVEVCVVYGNYSQQLQVYS KTGFNCDGKL GNESVTFYLQ NLYVNQTDIY FCKIEVMYPPPYLDNEKSNG TIIHVKGKHLCPSPLFPGPS KPFWVLVVVG GVLACYSLLVTVAFIIFWVR SKRSRLLHSD YMNMTPRRPG PTRKHYQPYAPPRDFAAYRS (SEQ ID NO: 64)；及其等效物。
如本文使用的，术语“ICOS共刺激信号传导区域”是指与该名称相关的特定的蛋白片段，以及与本文所示的ICOS共刺激信号传导区域序列具有至少70%、或替代地至少80%氨基酸序列同一性、优选90%序列同一性、更优选至少95%序列同一性的具有类似的生物功能的任何其他分子。在美国公开号2015/0017141A1中提供了ICOS共刺激信号传导区域的非限制性的示例性序列。示例性的多核苷酸序列提供如下：
ICOS共刺激信号传导区域，SEQ ID NO:71：
ACAAAAAAGA AGTATTCATC CAGTGTGCAC GACCCTAACG GTGAATACAT GTTCATGAGAGCAGTGAACA CAGCCAAAAA ATCCAGACTC ACAGATGTGA CCCTA。
如本文使用的，术语“OX40共刺激信号传导区域”是指与该名称相关的特定的蛋白片段，以及与本文所示的OX40共刺激信号传导区域序列具有至少70%、或替代地至少80%氨基酸序列同一性、优选90%序列同一性、更优选至少95%序列同一性的具有类似的生物功能的任何其他分子。在美国公开号2012/20148552A1中公开了OX40共刺激信号传导区域的非限制性的示例性序列，其包括以下提供的示例性序列。
OX40共刺激信号传导区域，SEQ ID NO:72：
AGGGACCAG AGGCTGCCCC CCGATGCCCA CAAGCCCCCT GGGGGAGGCA GTTTCCGGACCCCCATCCAA GAGGAGCAGG CCGACGCCCA CTCCACCCTG GCCAAGATC。
如本文使用的，术语“CD3ζ信号传导结构域”是指与该名称相关的特定的蛋白片段，以及与本文所示的CD3ζ信号传导结构域序列具有至少70%、或替代地至少80%氨基酸序列同一性、优选90%序列同一性、更优选至少95%序列同一性的具有类似的生物功能的任何其他分子。在美国申请号US 13/826,258中提供了CD3ζ信号传导结构域的示例性序列。与CD3ζ信号传导结构域相关的序列列出如下：
CD3ζ信号传导结构域，SEQ. ID NO: 63：
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR。
如本文使用的，术语“B细胞”是指在适应性免疫系统的体液免疫中的一类淋巴细胞。B细胞主要作用来制造抗体、用作抗原呈递细胞、释放细胞因子、以及在抗原相互作用引起的刺激之后开发记忆B细胞。B细胞与其他淋巴细胞（例如T细胞）的不同点在于细胞表面上存在B细胞受体。B细胞可以是被分离的，也可以从商业上可获得的来源得到。商业上可获得的B细胞系的非限制性例子包括AHH-1 (ATCC® CRL-8146™)、BC-1 (ATCC® CRL-2230™)、BC-2 (ATCC® CRL-2231™)、BC-3 (ATCC® CRL-2277™)、CA46 (ATCC® CRL-1648™)、DG-75 [D.G.-75] (ATCC® CRL-2625™)、DS-1 (ATCC® CRL-11102™)、EB-3 [EB3](ATCC® CCL-85™)、Z-138 (ATCC #CRL-3001) 、DB (ATCC CRL-2289) 、Toledo (ATCCCRL-2631) 、Pfiffer (ATCC CRL-2632) 、SR (ATCC CRL-2262) 、JM-1 (ATCC CRL-10421)、NFS-5 C-1 (ATCC CRL-1693)；NFS-70 C10 (ATCC CRL-1694) 、NFS-25 C-3 (ATCC CRL-1695) 、和SUP-B15 (ATCC CRL-1929)细胞系。进一步的例子包括但不限于衍生自间变性和大细胞淋巴瘤的细胞系，例如DEL、DL-40、FE-PD、JB6, Karpas 299、Ki-JK、Mac-2A Ply1、SR-786、SU-DHL-1、-2、-4、-5、-6、-7、-8、-9、-10和-16、DOHH-2、NU-DHL-1、U-937、Granda519、USC-DHL-1、RL；霍奇金淋巴瘤，例如DEV、HD-70、HDLM-2、HD-MyZ、HKB-1、KM-H2、L 428、L540、L1236、SBH-1、SUP-HD1、SU/RH-HD-l。这样的商业上可获得的细胞系的非限制性示例性来源包括美国模式培养物保藏所（American Type Culture Collection）或称ATCC(www.atcc.org/) 以及德国微生物和细胞培养物保藏所（German Collection ofMicroorganisms and Cell Cultures ）(https://www.dsmz.de/)。
如本文使用的，术语“T细胞”是指在胸腺中成熟的一类淋巴细胞。T细胞在细胞介导的免疫中起重要作用，并且与与其他淋巴细胞（例如B细胞）的不同点在于细胞表面上存在T细胞受体。T细胞可以是被分离的，也可以从商业上可获得的来源得到。“T细胞”包括表达CD3的所有类型的免疫细胞，包括T辅助细胞（CD4+细胞）、细胞毒性T细胞（CD8+细胞）、自然杀伤T细胞、T调节细胞（Treg）和γ-δT细胞。“细胞毒性细胞”包括CD8+ T细胞、自然杀伤（NK）细胞和嗜中性粒细胞，这些细胞能够介导细胞毒性反应。商业上可获得的T细胞系的非限制性例子包括BCL2 (AAA) Jurkat (ATCC® CRL-2902™)、BCL2 (S70A) Jurkat (ATCC® CRL-2900™)、BCL2 (S87A) Jurkat (ATCC® CRL-2901™)、BCL2 Jurkat (ATCC®CRL-2899™)、Neo Jurkat (ATCC® CRL-2898™)、TALL-104细胞毒性人类T细胞系(ATCC #CRL-11386) 细胞系。进一步的例子包括但不限于成熟的T细胞系，例如Deglis、EBT-8、HPB-MLp-W、HUT 78、HUT 102、Karpas 384、Ki 225、My-La、Se-Ax、SKW-3、SMZ-1和T34；以及未成熟的T细胞系，例如ALL-SIL、Be13、CCRF-CEM、CML-T1、DND-41、DU.528、EU-9、HD-Mar、HPB-ALL、H-SB2、HT-1、JK-T1、Jurkat、Karpas 45、KE-37、KOPT-K1、K-T1、L-KAW、Loucy、MAT、MOLT-1、MOLT 3、MOLT-4、MOLT 13、MOLT-16、MT-1、MT-ALL、P12/Ichikawa、Peer、PER0117、PER-255、PF-382、PFI-285、RPMI-8402、ST-4、SUP-T1至T14、TALL-1、TALL-101、TALL-103/2、TALL-104、TALL-105、TALL-106、TALL-107、TALL-197、TK-6、TLBR-1、-2、-3和-4、CCRF-HSB-2(CCL-120.1)、J.RT3-T3.5 (ATCC TIB-153)、J45.01 (ATCC CRL-1990)、J.CaM1.6 (ATCCCRL-2063)、RS4;11 (ATCC CRL-1873)、CCRF-CEM (ATCC CRM-CCL-119)；以及皮肤T细胞淋巴瘤细胞系，例如HuT78 (ATCC CRM-TIB-161)、MJ[G11] (ATCC CRL-8294)、HuT102 (ATCCTIB-162)。无白血病（Null leukemia）细胞系，包括但不限于REH、NALL-1、KM-3、L92-221，是免疫细胞的另一种商业上可获得的来源，同样的是衍生自其他白血病和淋巴瘤的细胞系，例如K562红白血病、THP-1单核细胞白血病、U937淋巴瘤、HEL红白血病、HL60白血病、HMC-1白血病、KG-1白血病、U266骨髓瘤。这样的商业上可获得的细胞系的非限制性示例性来源包括美国模式培养物保藏所（American Type Culture Collection）或称ATCC(www.atcc.org/) 以及德国微生物和细胞培养物保藏所（German Collection ofMicroorganisms and Cell Cultures ）(https://www.dsmz.de/)。
如本文使用的，术语“NK细胞”（也被称为自然杀伤细胞）是指起源于骨髓并且在先天免疫系统中起重要作用的一类淋巴细胞。NK细胞提供针对病毒感染的细胞、肿瘤细胞或其他应激细胞的快速免疫反应，即使是细胞表面上不存在抗体和主要组织相容性复合体。NK细胞可以是被分离的，也可以从商业上可获得的来源得到。商业性的NK细胞系的非限制性例子包括NK-92 (ATCC® CRL-2407™)、NK-92MI (ATCC® CRL-2408™)细胞系。进一步的例子包括但不限于HANK1、KHYG-1、NKL、NK-YS、NOI-90和YT NK细胞系。这样的商业上可获得的细胞系的非限制性示例性来源包括美国模式培养物保藏所（American Type CultureCollection）或称ATCC(www.atcc.org/) 以及德国微生物和细胞培养物保藏所（GermanCollection of Microorganisms and Cell Cultures ）(https://www.dsmz.de/)。
如本文使用的，术语“核酸序列”和“多核苷酸”被可互换地使用来指任何长度的核苷酸的聚合形式，核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。因此，该术语包括但不限于单链、双链或多链DNA或RNA、DNA基因组、cDNA、DNA-RNA杂交体、或包含嘌呤和嘧啶碱基或其他天然的、化学的或生物化学修饰的、非天然的或衍生的核苷酸碱基的聚合物。
术语“编码”在被应用至核酸序列时是指，被陈述来“编码”多肽的多核苷酸，以其天然状态或者在通过本领域技术人员熟知的方法操纵时，可以被转录和/或翻译来产生用于该多肽和/或其片段的mRNA。反义链是这样的核酸的补体，并且编码序列可以由此导出。
如本文使用的，术语“载体”是指被设计来用于在不同的宿主之间传送的核酸构建体，其包括但不限于质粒、病毒、粘粒、噬菌体、BAC、YAC等。在一些实施方式中，可以从商业上可获得的载体制备质粒载体。在其他实施方式中，可以根据本领域已知的技术从杆状病毒、逆转录病毒、腺病毒、AAV等制造病毒载体。在一个实施方式中，所述病毒载体是慢病毒载体。
如本文使用的，术语“启动子”是指调节编码序列（例如基因）的表达的任何序列。启动子可以例如是组成型的、可诱导的、可抑制的或组织特异性的。“启动子”是这样的控制序列，它是多核苷酸序列的一个区域，在此控制转录的起始和速率。它可以包括遗传性元件，在此调节蛋白和分子可以结合例如RNA聚合酶和其他转录因子。
如本文使用的，术语“分离的细胞”通常是指细胞基本上和组织的其他细胞分离。“免疫细胞”包括例如衍生自在骨髓中产生的造血干细胞（HSC）的白血细胞（白细胞）、淋巴细胞（T细胞、B细胞、自然杀伤（NK）细胞）和骨髓来源的细胞（嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞）。“T细胞”包括表达CD3的所有类型的免疫细胞，包括T辅助细胞（CD4+细胞）、细胞毒性T细胞（CD8+细胞）、自然杀伤T细胞、T调节细胞（Treg）和γ-δT细胞。“细胞毒性细胞”包括CD8+ T细胞、自然杀伤（NK）细胞和嗜中性粒细胞，这些细胞能够介导细胞毒性反应。
术语“转导”在其被应用至生产嵌合抗原受体细胞时是指，外来核酸序列被引入细胞中的过程。在一些实施方式中，该转导是通过载体完成的。
如本文使用的，术语“自体同源的（autologous）”在涉及细胞时是指，被分离并且被灌注回相同的对象（受体或宿主）的细胞。“同种异体的”是指非自体同源的细胞。
“有效量”是指该量的试剂或合并的量的两种或多种试剂在被施用来治疗哺乳动物或其他个体时，足以影响对疾病的这种治疗。“有效量”将会根据试剂、疾病及其严重程度和要被治疗的对象的年龄、体重等而发生变化。
“实体肿瘤”是通常不包括囊肿或液体区域的异常的组织块。不同类型的实体肿瘤以形成它们的细胞的类型命名。实体肿瘤的例子包括肉瘤、癌和淋巴瘤。
术语“卵巢癌”是指这样的一类型癌症，它在卵巢的组织中形成，并且经历了恶性转化，该恶性转化使得癌症之内的细胞对宿主生物体有病态作用并且具有入侵或扩散至身体的其他部分的能力。本文的卵巢癌包括组织学分级低的I型癌症和组织学分级更高的II型癌症。特别地，卵巢癌包括但不限于上皮癌、浆液性癌、透明细胞癌、性索间质瘤、生殖细胞瘤、无性细胞瘤、混合肿瘤、继发性卵巢癌、低恶性潜在肿瘤。
术语“前列腺癌”是指在男性生殖系统中的腺体前列腺中发展的一类型癌症。本文的前列腺癌包括但不限于腺癌、肉瘤、小细胞癌、神经内分泌肿瘤、移行细胞癌。
如本文使用的，术语“包括”旨在表示组合物和方法包括所述的元素但不排除其他元素。“基本上由……组成”当被用来定义组合物和方法时，应该表示排除对于预期用途的组合来说具有任何实质性作用的其他元素。例如，如本文定义的基本上由该元素组成的组合物，将不会从分离和纯化方法和药学上可接受的载体（例如磷酸盐缓冲盐水、防腐剂等）中排除微量污染物。“由……组成”应该表示排除多于微量元素的其他成分和用于施用本文公开的组合物的实质性方法步骤。通过这些过渡性术语的每一个进行定义的方面都在本发明的范围之内。
如本文使用的，术语“可检测的标记物”是指能够直接或间接制造可检测的信号的至少一个标记物。该标记物的非穷举性的列表包括酶，其例如通过比色、荧光、发光制造可检测的信号，例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、发色团（例如荧光剂、发光染料）、带有通过电子显微镜或通过其电性质（例如电导率、电流分析、伏安法、阻抗）检测的电子密度的基团、可检测的基团，例如其分子具有足够的大小来诱导其物理和/或化学性质上的可检测的修饰，这样的检测可以通过任选的方法完成，例如衍射、表面等离子体共振、表面变化、接触角变化或物理方法（例如原子力谱、隧道效应）、或放射性分子（例如 32 P、35 S或125 I）。
如本发明使用的，术语“纯化标记物”是指可用于纯化或鉴定的至少一个标记物。该标记物的非穷举性的列表包括His、lacZ、GST、麦芽糖结合蛋白、NusA、BCCP、c-myc、CaM、FLAG、GFP、YFP、樱桃、硫氧还蛋白、聚（NANP）、V5，Snap、HA、几丁质结合蛋白、 Softag 1、Softag 3、Strep或S蛋白。合适的直接或间接荧光标记物包括FLAG、GFP、YFP、RFP、dTomato、樱桃、Cy3、Cy 5、Cy 5.5、Cy 7、DNP、AMCA、生物素、地高辛、Tamra、得克萨斯红、罗丹明、Alexa荧光、FITC、TRITC或任何其他荧光染料或半抗原。
如本文使用的，术语“表达”是指多核苷酸被转录成mRNA的过程和/或被转录的mRNA随后被翻译成肽、多肽或蛋白的过程。如果多核苷酸衍生自基因组DNA，则表达可以包括mRNA在真核细胞中的剪接。可以通过测量细胞或组织样品中mRNA或蛋白的量确定基因的表达水平。在一个方面，来自一个样品的基因的表达水平可以直接与来自对照或参照样品的基因的表达水平进行比较。在另一个方面，来自一个样品的基因的表达水平可以在施用化合物之后直接与来自相同样品的该基因的表达水平进行比较。
如本文使用的，当被用在两个或更多个核酸或多肽序列的内容中时，“同源性”或“相同的”、“同一性”或“相似性”百分比是指，两个或更多个序列或子序列是相同的，或者在特定的区域（例如编码本文所述的抗体的核苷酸序列或本文所述的抗体的氨基酸序列）上特定百分比的核苷酸或氨基酸残基是相同的，例如至少60%同一性、优选地至少65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的同一性。可以通过比较为了进行比较而被对齐的每个序列中的位置，确定同源性。当被比较的序列中的位置被相同的碱基或氨基酸占据时，则这些分子在该位置是同源的。序列之间的同源性的程度是这些序列享有的匹配的或同源的位置的数目的函数。可以使用本领域已知的软件程序来确定对齐和同源性或序列同一性百分比，例如在Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel et al., eds. 1987) Supplement 30, section 7.7.18, Table 7.7.1中描述的软件程序。优选地，使用默认参数进行对齐。优选的对齐程序是BLAST，使用默认参数。特别地，优选的程序是BLASTN和BLASTP，使用以下默认参数：遗传密码=标准；筛选=无；链=两个；截点=60；预期=10；矩阵=BLOSUM62；描述=50个序列；排序= HIGH SCORE；数据库=不重复的，GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS translations + SwissProtein +SPupdate + PIR。这些程序的详情可以在以下网址找到：ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST。术语“同源性”或“相同的”、“同一性”或“相似性”百分比还表示、或者可以被应用至测试序列的补体。所述术语还包括具有缺失和/或添加、以及具有取代基的序列。如本文描述的，优选的算法可以解释间隙等。优选地，在长度至少为约25个氨基酸或核苷酸的区域上、或者更优选地在长度至少为50-100个氨基酸或核苷酸的区域上存在同一性。“不相关的”或“非同源的”序列与本文公开的序列中的一个享有少于40%的同一性、或者替代地少于25%的同一性。
短语“一线”或“二线”或“三线”是指患者接受的治疗的顺序。一线治疗方案是首先给出的治疗，而二线或三线疗法是分别在一线疗法之后或在二线疗法之后给出的。美国国家癌症研究所将一线疗法定义为“用于疾病或病症的第一治疗”。在患有癌症的患者中，主要的治疗可以是手术、化疗、放射治疗或这些疗法的组合。一线疗法还被本领域技术人员称为“主要疗法和主要治疗”。参见美国国家癌症研究所的网站www.cancer.gov，最后一次访问是在2008年5月1日。通常，患者被给予后续的化疗方案，因为患者对一线疗法没有显示出阳性的临床或亚临床反应，或者一线疗法已经停止。
在一个方面，术语抗体的“等效物”或“生物等效物”表示抗体如通过ELISA或其他合适的方法测定地选择性地结合其表位蛋白或其片段的能力。生物等效的抗体包括但不限于与参照抗体结合至相同的表位的抗体、肽、抗体片段、抗体变体、抗体衍生物和抗体模拟物。
在没有明确描述的情况下应该推断、并且除非另有说明，否则当本技术涉及多肽、蛋白、多核苷酸或抗体时，这样的等效物或生物等效物旨在落入本技术的范围之内。如本文使用的，在指示蛋白、抗体、多肽或核苷酸时，术语“其生物等效物”旨在与“其等效物”是同义的，是指具有最小的同源性，同时仍然保持期望的结构或功能。除非本文具体说明，否则可以预期的是，本文提及的任何多核苷酸、多肽或蛋白还包括其等效物。例如，等效物是指与参照蛋白、多肽或核苷酸具有至少约70%同源性或同一性、或至少80%同源性或同一性和替代地、或至少约85%、或替代地至少约90%、或替代地至少约95%、或替代地98%百分比同源性或同一性并且表现出基本上等效的生物活性。替代地，当指示多核苷酸时，其等效物是在严格条件下与参照多核苷酸或其补体（complement）杂交的多核苷酸。
多核苷酸或多核苷酸区域（或多肽或多肽区域）与另一个序列具有一定百分比（例如80%、85%、90%或95%）的“序列同一性”是指，当被对齐时，该百分比的碱基（或氨基酸）在两个序列的比较中是相同的。可以使用本领域已知的软件程序来确定对齐和同源性或序列同一性百分比，例如在Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds.1987) Supplement 30, section 7.7.18, Table 7.7.1中描述的软件程序。优选地，使用默认参数进行对齐。优选的对齐程序是BLAST，使用默认参数。特别地，优选的程序是BLASTN和BLASTP，使用以下默认参数：遗传密码=标准；筛选=无；链=两个；截点=60；预期=10；矩阵=BLOSUM62；描述=50个序列；排序= HIGH SCORE；数据库=不重复的，GenBank + EMBL + DDBJ+ PDB + GenBank CDS translations + SwissProtein + SPupdate + PIR。这些程序的详情可以在以下网址找到：ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST。
“杂交”是指其中一个或多个多核苷酸反应来形成复合物，并且该复合物通过核苷酸残基的碱基之间的氢键结合而被稳定的反应。可以通过Watson-Crick碱基配对、Hoogstein结合或通过任何其他序列特异性的方式来发生氢键结合。所述复合物可以包括形成双螺旋结构的两条链、形成多链复合物的三条或更多条链、单一的自我杂交的链、或这些的任何组合。杂交反应可以由在更广泛的过程中的步骤组成，例如PCR过程的起始步骤、或者通过核酶进行的多核苷酸的酶裂解步骤。
严格杂交条件的例子包括：约25°C至约37°C的孵育温度；约6x SSC至约10x SSC的杂交缓冲液浓度；约0%至约25%的甲酰胺浓度；以及约4x SSC至约8x SSC的洗涤溶液。中度杂交条件的例子包括：约40°C至约50°C的孵育温度；约9x SSC至约2x SSC的缓冲液浓度；约30%至约50%的甲酰胺浓度；以及约5x SSC至约2x SSC的洗涤溶液。高严格杂交条件的例子包括：约55°C至约68°C的孵育温度；约1x SSC至约0.1x SSC的缓冲液浓度；约55%至约75%的甲酰胺浓度；以及约1x SSC至约0.1x SSC的洗涤溶液、或去离子水。一般来说，杂交孵育时间为5分钟至24小时，具有1、2、或更多个洗涤步骤，并且洗涤孵育时间为约1、2或15分钟。SSC是0.15 M NaCl和15 mM柠檬酸缓冲液。应该理解的是，可以采用使用其他缓冲系统的SSC的等效物。
“与肿瘤组织类型对应的正常细胞”是指来自与肿瘤组织相同的组织类型的正常细胞。非限制性例子是来自患有肺肿瘤的患者的正常肺细胞、或者来自患有结肠肿瘤的患者的正常结肠细胞。
如本文使用的，术语“分离的”是指，分子或生物体或细胞材料基本上不含其他材料。在一个方面，术语“分离的”是指，核酸（例如DNA或RNA）或蛋白或多肽（例如抗体或其衍生物）或细胞或细胞器、或组织或器官与存在于自然来源中的其他DNA或RNA、或蛋白或多肽、或细胞或细胞器、或组织或器官分离。术语“分离的”还指，核酸或肽基本上不含细胞材料、病毒材料、或培养基（当通过重组DNA技术生产时）、或化学前体或其他化学品（当化学合成时）。再者，“分离的核酸”旨在包括天然地不形成为片段并且不会在天然状态下发现的核酸片段。术语“分离的”在本文中还被用来指从其他细胞蛋白分离的多肽，并且旨在包括纯化的和重组的多肽。术语“分离的”在本文中还被用来指从其他细胞分离的细胞或组织，并且旨在包括培养的和工程化的细胞或组织。
如本文使用的，术语“单克隆抗体”是指，通过B淋巴细胞的单一克隆制造的抗体，或者通过其中已经转染了单一抗体的轻链和重链基因的细胞制造的抗体。单克隆抗体是通过本领域技术人员已知的方法制造的，例如通过由骨髓瘤细胞与免疫脾细胞的融合而制造杂交抗体形成细胞。单克隆抗体包括人源化单克隆抗体。
术语“蛋白”、“肽”和“多肽”被可互换地使用，并且以其最广泛的意义来指两个或更多个氨基酸、氨基酸类似物或肽模拟物子单元的化合物。所述子单元可以通过肽键而被连接。在另一个方面，所述子单元可以通过其他键（例如酯键、醚键等）而被连接。蛋白或肽必须包括至少两个氨基酸，并且对于可以组成蛋白或肽的序列的氨基酸的最大数目没有限制。如本文使用的，术语“氨基酸”是指天然的和/或非天然的或合成的氨基酸，包括甘氨酸以及D和L光学异构体、氨基酸类似物和肽模拟物。
术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”被可互换地使用，并且是指任何长度的核苷酸的聚合形式，是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其类似物。多核苷酸可以具有任意的三维结构并且可以进行已知或未知的任何作用。以下是多核苷酸的非限制性例子：基因或基因片段（例如探针、引物、EST或SAGE标签）、外显子、内含子、信使RNA（mRNA）、转移RNA、核糖体RNA、RNAi、核酶、cDNA、重组多核苷酸、支链多核苷酸、质粒、载体、分离的任何序列的DNA、分离的任何序列的RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可以包括经修饰的核苷酸，例如甲基化核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，则对核苷酸结构的修饰可以被施加在多核苷酸的组装之前或之前。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分打断。多核苷酸可以在聚合之后被进一步修饰，例如与标签组分偶联。该术语还指双链分子和单链分子。除非另有说明或者需要，否则本技术的涉及多核苷酸任何方面都包括双链形式以及已知或预测形成双链形式的两个互补的单链形式中的每一个。
如本文使用的，术语“纯化的”不要求绝对的纯度；相反，它旨在作为相对性的的术语。因此，例如，纯化的核酸、肽、蛋白、生物复合物或其他活性化合物是整体地或部分地与蛋白或其他污染物分离的。通常，用于在本发明中使用的基本上纯化的肽、蛋白、生物复合物或其他活性化合物，在该肽、蛋白、生物复合物或其他活性化合物与药物载体、赋形剂、缓冲剂、吸收促进剂、稳定剂、防腐剂、佐剂或其它辅助成分在用于治疗性给药的完整的药物制剂中混合或制备之前，包括多于80%的存在于制剂中的所有大分子物种。更一般地，在与其他制剂成分混合之前，所述肽、蛋白、生物复合物或其他活性化合物被纯化，以代表大于90%、通常大于95%的存在于纯化制剂中的所有大分子物种。在其他情况中，纯化制剂可以是基本上均质的，其中其他大分子物种不能通过常规技术而被检测到。
如本文使用的，术语“特异性结合”是指抗体和抗原之间的接触具有的结合亲和力为至少10−6 M。在一些方面，抗体结合具有的亲和力为至少约10−7 M，并且优选10−8 M、10−9 M、10−10 M、10−11 M或10−12 M。
如本文使用的，术语“重组蛋白”是指通过重组DNA技术制造的多肽，其中通常编码该多肽的DNA被插入进合适的表达载体，该表达载体被用来转化宿主细胞以产生异源蛋白。
如本文使用的，“治疗”在对象中的疾病是指（1）防止症状或疾病在预先有倾向的或尚未显示疾病症状的对象中发生；（2）抑制疾病或阻止其发展；或者（3）改善或消退疾病或疾病的症状。如本领域中理解的，“治疗”是用于获得有益的或期望的结果（包括临床结果）的方法。对于本技术的目的，有益的或期望的结果可以包括但不限于以下中的一种或多种：一个或多个症状的缓解或改善，病症（包括疾病）的程度的降低，病症（包括疾病）的稳定化（即不恶化）状态，病症（包括疾病）的延迟或减缓，病症（包括疾病）、状态和缓解（无论是部分还是全部）的进展、改善或缓解，无论是可检测的还是不可检测的。
如本文使用的，术语“过度表达”是指细胞、组织、或器官表达蛋白的量大于在对照细胞、对照组织、或器官中生产的量。过度表达的蛋白可以对于宿主细胞来说是内源性的或者对于宿主细胞来说是外源性的。
如本文使用的，术语“接头序列”是指任何这样的氨基酸序列，其包括可以被重复1至10、或替代地至约8、或替代地至约6、或替代地约5、或4或替代地3、或替代地2次的1至10个、或替代地8个氨基酸、或替代地6个氨基酸、或替代地5个氨基酸。例如，接头可以包括由重复三次的五肽组成的多达15个氨基酸残基。在一个方面，接头序列是包括gly-gly-gly-gly-ser的三个拷贝的（Glycine4Serine）3柔性多肽接头。
如本文使用的，术语“增强子”是指不管其相对于要被表达的氨基酸序列的位置和朝向，都增强、改善或改良氨基酸序列的转录的序列元件。增强子可以增强来自单个启动子的转录，或者同时增强来自一个以上的启动子的转录。只要保留或基本上保留该改善转录的功能（例如至少70%、至少80%、至少90%或至少95%的野生型活性，即全长序列的活性），则野生型增强子序列的任何截断的、突变的或修饰的变体都同样在上述定义之内。
如本文使用的，术语“WPRE”或“土拨鼠肝炎病毒（WHP）转录后调控元件”是指与该名称相关的特定的核苷酸片段，以及与本文所示的WPRE序列具有至少70%、或替代地至少80%氨基酸序列同一性、优选90%序列同一性、更优选至少95%序列同一性的具有类似的生物功能的任何其他分子。例如，WPRE是指在土拨鼠肝炎病毒基因组序列（GenBank登录号J04514）中出现的类似于人类乙型肝炎病毒转录后调控元件（HBVPRE）的区域，并且该基因组序列的1093位至1684位的592个核苷酸对应于转录后调控区域（Journal of Virology,Vol. 72, p.5085-5092, 1998）。使用逆转录病毒载体的分析显示，被插入至感兴趣的基因的3'末端未翻译区域的WPRE提高了产生的蛋白的量5至8倍。还被报道的是，WPRE的引入抑制了mRNA降解（Journal of Virology, Vol. 73, p.2886-2892, 1999）。在广义上，例如WPRE的通过使mRNA稳定而提高氨基酸翻译的效率的元件也被认为是增强子。
缩写列表
CAR：嵌合抗原受体
HLA：组织相容性淋巴细胞抗原
Ip：腹膜内
IRES：内部核糖体进入位点
LHR：促黄体激素受体
MFI：平均荧光强度
MOI：感染复数
PBMC：外周血单核细胞
PBS：磷酸盐缓冲盐水
scFv：单链可变片段
WPRE：土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件。
与以上列出的GenBank登录号、UniProt参照号、和参考文件中的每一个相关的序列都以引用的方式被合并入本文中。
用于实施本发明的模型
CAR T细胞是遗传工程化的自体T细胞，在其中单链抗体片段（scFv）或配体被连接至能够促进T细胞激活的T细胞信号传导结构域（Maher, J. (2012) ISRN Oncol. 2012:278093；Curran, K.J. et al. (2012) J. Gene Med. 14:405-415；Fedorov, V.D. etal. (2014) Cancer J. 20:160-165；Barrett, D.M. et al. (2014) Annu. Rev. Med.65:333-347）。CAR将单克隆抗体的HLA非依赖靶向特异性与被激活的T细胞的细胞溶解活性和归巢性质相结合。这些性质使得能够通过降低的HLA表达或下调的抗原处理通道识别靶细胞，是被采用来避免宿主免疫反应的两种常见的方法（Jakobsen, M.K. et al. (1995)J. Immunother. Emphasis Tumor Immunol. 17:222-228；Lou, Y. et al. (2008) Clin.Cancer Res. 14:1494–1501；Singh, R. et al. (2007) Cancer Res. 67:1887–1892）。作为在包括卵巢癌的各种疾病中的新的疗法，CAR修饰的T细胞已经显示了在临床前和临床环境中的巨大前景（Chu, C.S. et al. (2008) Expert Rev. Anticancer Ther. 8:243–257；Chekmasova, A.A. et al. (2010) Discov. Med. 9:62–70；Porter, D.L. et al.(2011) NEJM 365:725-733）。迄今，针对间皮素产生的CAR T细胞（Kelly, R.J. et al.(2012) Mol. Cancer Ther. 11:517-525；Beatty, G.L. et al. (2014) CancerImmunol. Res. 2:112-120）目前在美国国家癌症研究所（协议号：120111；NCT01583686）、宾夕法尼亚大学（刚刚招募患者）、以及在中国（完成了4名患者）正在进行临床试验。这些研究是非常初步的，并且除了α-叶酸受体（Kandalaft, L.E. et al. (2012) J. Transl.Med. 10:157-167）和MUC16（Chekmasova, A.A. et al. (2010) Clin. Cancer Res. 16:3594–606；Rao, T.D. et al. (2010) Appl. Immunohistochem. Mol. Morphology 18:462-472）之外，据我们所知没有其他靶标正在进行用于治疗卵巢癌的研发。
如在下文中更详细描述的，发明人已经证明了，LHR是CAR T细胞治疗的有效靶标。如在以下表1和图1中所示，采用9个良好地建立的人类卵巢细胞系的流式细胞术研究显示，与间皮素和MUC16相比，LHR是优秀的靶标，前者仅在被测试的细胞系中的一般或更少中为阳性。如在表2中所示，还通过免疫组织化学在人卵巢癌的多区块载玻片上测试了这些靶标。与流式细胞术结果一致，不管测试的肿瘤的阶段或等级，与间皮素和MUC16阳性相比，通过这些方法更一致地看到LHR阳性。如在图2中所示，每种抗体的免疫组织化学染色图案有些不同。MUC16和间皮素抗体都倾向于染色肿瘤结节的腔表面而不染色所有细胞（特别是在肿瘤结节的周围上更多的细胞）的细胞表面。相反，LHR抗体对细胞质和细胞表面都进行染色，并且倾向于对肿瘤结节的所有细胞都染色。最终，在正常组织的多组织阵列上测试了每种抗体的脱靶染色。这些研究的结果在以下表3中示出，并且显示了所有三种靶标都在正常组织上具有受限的反应性。
与这些原则和发现相一致，本发明提供了以下实施方式。
抗体及其应用
I. 组合物
抗体的大体结构在本领域中是已知的，在此仅将进行简要的概述。免疫球蛋白单体包括通过二硫键连接的两条重链和两条轻链。每条重链都和轻链中的一个配对，它们通过二硫键被直接结合。每条重链包括恒定区域（其根据抗体的同种型而变化）和可变区域。可变区域包括三个高度可变区域（或互补决定区域），其被命名为CDRH1、CDRH2和CDRH3并且被支撑在框架区域之内。每条轻链包括恒定区域和可变区域，可变区域包括三个高度可变区域（命名为CDRL1、CDRL2和CDRL3），其以与重链的可变区域类似的方式被支撑在框架区域中。
每对重链和轻链的高度可变区域相互配合来提供能够结合靶标抗原的抗原结合位点。每对重链和轻链的结合特异性由重链和轻链的CDR1、CDR2和CDR3的序列来界定。因此，一旦确定了引起特定的结合特异性的一组CDR序列（即重链和轻链的CDR1、CDR2和CDR3的序列），则原则上该组CDR序列能够被插入进通过任何抗体恒定区域来连接的任何其他抗体的框架之内的适当位置，从而提供具有相同的抗原结合特异性的不同的抗体。
在一个实施方式中，本发明提供了一种分离的抗体，其包括重链（HC）免疫球蛋白可变结构域序列和轻链（LC）免疫球蛋白可变结构域序列，其中所述抗体结合至促黄体激素受体（LHR）的表位。
在一个方面，所述抗体的所述HC包括以下中的一个或多个、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成：CDR1，其包括GYSITSGYG (SEQ ID NO.: 16)或其每个的等效物的氨基酸序列；和/或CDR2，其包括IHYSGST (SEQ ID NO.: 19)或其每个的等效物的氨基酸序列；和/或CDR3，其包括ARSLRY (SEQ ID NO.: 22)或其每个的等效物的氨基酸序列；和/或所述抗体的所述LC包括、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成：CDR1，其包括SSVNY (SEQ ID NO.:25)或其每个的等效物的氨基酸序列；和/或CDR2，其包括DTS (SEQ IDNO:28)或其每个的等效物的氨基酸序列；和/或CDR3，其包括HQWSSYPYT (SEQ ID NO:31)或其每个的等效物的氨基酸序列。
在一个方面，所述抗体包括的所述HC包括以下中的一个或多个、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成：CDR1，其包括GFSLTTYG (SEQ ID NO.: 17)或其每个的等效物的氨基酸序列；和/或CDR2，其包括IWGDGST (SEQ ID NO.: 20)或其每个的等效物的氨基酸序列；和/或CDR3，其包括AEGSSLFAY (SEQ ID NO.: 23)或其每个的等效物的氨基酸序列；和/或所述抗体的所述LC包括、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成：CDR1，其包括QSLLNSGNQKNY (SEQ ID NO.:26)或其每个的等效物的氨基酸序列；和/或CDR2，其包括WAS (SEQ ID NO:29)或其每个的等效物的氨基酸序列；和/或CDR3，其包括QNDYSYPLT(SEQ ID NO:32)或其每个的等效物的氨基酸序列。
在另一个方面，所述抗体的所述HC包括以下中的一个或多个、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成：CDR1，其包括GYSFTGYY (SEQ ID NO.: 18)或其每个的等效物的氨基酸序列；和/或CDR2，其包括IYPYNGVS (SEQ ID NO.: 21)或其每个的等效物的氨基酸序列；和/或CDR3，其包括ARERGLYQLRAMDY (SEQ ID NO.: 24)或其每个的等效物的氨基酸序列；和/或所述抗体的所述LC包括、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成：CDR1，其包括QSISNN (SEQ ID NO.:27)或其每个的等效物的氨基酸序列；和/或CDR2，其包括NAS (SEQ ID NO:30)或其每个的等效物的氨基酸序列；和/或CDR3，其包括QQSNSWPYT(SEQ ID NO:33)或其每个的等效物的氨基酸序列。
在一个方面，本发明提供了一种分离的抗LHR抗体，它是针对LHR片段而产生的。
在一个实施方式中，所述LHR片段是LHR G蛋白的一部分，其具有以下氨基酸序列(SEQ ID NO: 42)：
REALCPEPCNCVPDGALRCPGPTAGLTRLSLAYLPVKVIPSQAFRGLNEVIKIEISQIDSLERIEANAFDNLLNLSEILIQNTK。
在另一个实施方式中，所述LHR片段是LHR蛋白的N末端，其具有以下氨基酸序列(SEQ ID NO: 43)：
RALREALCPEPCNCVPDGALRCPGPTAGLTRLSLAYLPVKVIPSQAFRGLNEVIKIEISQIDSLERIEANAFDNLLNLSEILIQNTKNLRYIEPGAFINLPRLKYLSICNTGIRKFPDVTKVFSSESNFILEICDNLHITTIPGNAFQGMNNESVTLKLYGNGFEEVQSHAFNGTTLTSLELKENVHLEKMHNGAFRGATGPKTLDISSTKLQALPSYGLESIQRLIATSSYSLKKLPSRETFVNLLEATLTYPS。
在另一个实施方式中，所述抗体是单克隆抗体，其包括：抗LHR重链可变区域，其包括选自SEQ ID NO.:1-4或其每个的等效物的多肽、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成；以及抗LHR轻链可变区域，其包括选自SEQ ID NO.: 5-8或其每个的等效物的多肽、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成。
在另一个方面，所述抗体是嵌合抗体或人源化抗体。
在另一个方面，所述重链可变区域包括具有选自SEQ ID NO.:9-11的共有序列的多肽、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成；并且抗LHR轻链可变区域包括具有选自SEQ ID NO.: 12-15的共有序列的多肽、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成。
在另一个方面，本发明提供了一种分离的核酸，其编码所述分离的抗LHR抗体。在进一步的实施方式中，所述分离的核酸包括选自SEQ ID NO.: 16-23或其每个的等效物的核酸序列、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成。
在一个方面，所述抗体的所述HC包括以下中的一个或多个、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成：CDR1，其包括GYSITSGYG (SEQ ID NO.: 16)或其每个的等效物的氨基酸序列；和/或CDR2，其包括IHYSGST (SEQ ID NO.: 19)或其每个的等效物的氨基酸序列；和/或CDR3，其包括ARSLRY (SEQ ID NO.: 22)或其每个的等效物的氨基酸序列，随后是在羧基末端的另外50个氨基酸、或替代地约40个氨基酸、或替代地约30个氨基酸、或替代地约20个氨基酸、或替代地约10个氨基酸、或替代地约5个氨基酸、或替代地约4、或3、或2或1个氨基酸。
在一些实施方式中，所述抗体的所述轻链可变区域包括以下中的一个或多个、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成：CDR1，其包括SSVNY (SEQ ID NO.:25)或其每个的等效物的氨基酸序列；和/或CDR2，其包括DTS (SEQ ID NO:28)或其每个的等效物的氨基酸序列；和/或CDR3，其包括HQWSSYPYT (SEQ ID NO:31)或其每个的等效物的氨基酸序列，随后是在羧基末端的另外50个氨基酸、或替代地约40个氨基酸、或替代地约30个氨基酸、或替代地约20个氨基酸、或替代地约10个氨基酸、或替代地约5个氨基酸、或替代地约4、或3、或2或1个氨基酸。
在一个方面，所述抗体的所述HC包括以下中的一个或多个、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成：CDR1，其包括GFSLTTYG (SEQ ID NO.: 17)或其每个的等效物的氨基酸序列；和/或CDR2，其包括IWGDGST (SEQ ID NO.: 20)或其每个的等效物的氨基酸序列；和/或CDR3，其包括AEGSSLFAY (SEQ ID NO.: 23)或其每个的等效物的氨基酸序列；和/或所述抗体的所述LC包括以下中的一个或多个、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成：CDR1，其包括QSLLNSGNQKNY (SEQ ID NO.:26)或其每个的等效物的氨基酸序列；和/或CDR2，其包括WAS (SEQ ID NO:29)或其每个的等效物的氨基酸序列；和/或CDR3，其包括QNDYSYPLT (SEQ ID NO:32)或其每个的等效物的氨基酸序列，随后是在羧基末端的另外50个氨基酸、或替代地约40个氨基酸、或替代地约30个氨基酸、或替代地约20个氨基酸、或替代地约10个氨基酸、或替代地约5个氨基酸、或替代地约4、或3、或2或1个氨基酸。
在另一个方面，所述抗体的所述HC包括以下中的一个或多个、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成：CDR1，其包括GYSFTGYY (SEQ ID NO.: 18)或其每个的等效物的氨基酸序列；和/或CDR2，其包括IYPYNGVS (SEQ ID NO.: 21)或其每个的等效物的氨基酸序列；和/或CDR3，其包括ARERGLYQLRAMDY (SEQ ID NO.: 24)或其每个的等效物的氨基酸序列；和/或所述抗体的所述LC包括以下中的一个或多个、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成：CDR1，其包括QSISNN (SEQ ID NO.:27)或其每个的等效物的氨基酸序列；和/或CDR2，其包括NAS (SEQ ID NO:30)或其每个的等效物的氨基酸序列；和/或CDR3，其包括QQSNSWPYT (SEQ ID NO:33)或其每个的等效物的氨基酸序列。
在一个方面，本发明提供了一种分离的抗LHR抗体，它是针对LHR片段而产生的。
在一个实施方式中，针对其而产生了所述抗体的所述LHR片段是LHR蛋白的一部分，其具有以下氨基酸序列(SEQ ID NO: 42)：
REALCPEPCNCVPDGALRCPGPTAGLTRLSLAYLPVKVIPSQAFRGLNEVIKIEISQIDSLERIEANAFDNLLNLSEILIQNTK。
在另一个实施方式中，所述LHR片段是LHR蛋白的N末端，其具有以下氨基酸序列(SEQ ID NO: 43)：
RALREALCPEPCNCVPDGALRCPGPTAGLTRLSLAYLPVKVIPSQAFRGLNEVIKIEISQIDSLERIEANAFDNLLNLSEILIQNTKNLRYIEPGAFINLPRLKYLSICNTGIRKFPDVTKVFSSESNFILEICDNLHITTIPGNAFQGMNNESVTLKLYGNGFEEVQSHAFNGTTLTSLELKENVHLEKMHNGAFRGATGPKTLDISSTKLQALPSYGLESIQRLIATSSYSLKKLPSRETFVNLLEATLTYPS。
在另一个实施方式中，所述抗体是单克隆抗体，其包括抗LHR重链可变区域，其包括选自SEQ ID NO.:1-4或其每个的等效物的多肽、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成。
在另一个实施方式中，所述抗体是单克隆抗体，其包括抗LHR轻链可变区域，其包括选自SEQ ID NO.: 5-8或其每个的等效物的多肽、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成。
在另一个方面，所述抗LHR抗体是嵌合抗体、人类或人源化抗体。
在另一个方面，所述重链可变区域包括具有选自SEQ ID NO.:9-11的共有序列的多肽、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成；并且抗LHR轻链可变区域包括具有选自SEQ ID NO.: 12-15或其每个的等效物的的共有序列的多肽、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成。
在本技术的另一个方面，所述分离的抗体包括以下特征中的一个或多个：
（a）轻链免疫球蛋白可变结构域序列包括与公开的轻链序列中的任一个的轻链可变结构域的CDR至少85%相同的一个或多个CDR；
（b）重链免疫球蛋白可变结构域序列包括与公开的重链序列中的任一个的重链可变结构域的CDR至少85%相同的一个或多个CDR；
（c）轻链免疫球蛋白可变结构域序列与公开的轻链序列中的任一个的轻链可变结构域至少85%相同；
（d）HC免疫球蛋白可变结构域序列与公开的重链序列中的任一个的重链可变结构域至少85%相同；以及
（e）所述抗体结合的表位与由公开的序列中的任一个结合的表位有重叠。
在一个方面，本发明提供了一种分离的抗体，其与本文公开的抗LHR抗体（例如5F4-21、4A7-4、8B7-3或138-2）至少85%相同。
在本文提供的抗体的一些方面，所述抗体结合人类LHR的解离常数（KD）为小于10−4 M、10−5 M、10−6 M、10−7 M、10−8 M、10−9 M、10−10 M、10−11 M或10−12 M。在本文提供的抗体的一些方面，所述抗原结合位点特异性地结合至人类LHR。
在本文提供的抗体的一些方面，所述抗体是可溶性Fab。
在本文提供的抗体的一些方面，所述HC和LC可变结构域序列是相同的多肽链的部件。在本文提供的抗体的一些方面，所述HC和LC可变结构域序列是不同的多肽链的部件。
在本文提供的抗体的一些方面，所述抗体是全长抗体。在其他方面，提供了所述抗体的抗原结合片段。
在本文提供的抗体的一些方面，所述抗体是单克隆抗体。
在本文提供的抗体的一些方面，所述抗体是嵌合的或人源化的。
在本文提供的抗体的一些方面，所述抗体片段选自Fab、F(ab)'2、Fab’、scFv和Fv。
在其他方面，在本文提供的抗体的CDR中的一个或多个氨基酸残基被另一个氨基酸取代。所述取代可以是“保守的”，意思是在相同家族的氨基酸之内的取代。天然存在的氨基酸可以被分为以下四个家族并且保守性取代将在这些家族之内发生：
1）具有碱性侧链的氨基酸：赖氨酸、精氨酸、组氨酸；
2）具有酸性侧链的氨基酸：天冬氨酸、谷氨酸；
3）具有不带电极性侧链的氨基酸：天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸；
4）具有非极性侧链的氨基酸：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、半胱氨酸。
在另一个方面，一个或多个氨基酸残基被添加至抗体的一个或多个CDR或者被从中删除。这样的添加或删除（缺失）发生在CDR的N或C末端或者在CDR之内的位置处。
通过氨基酸的添加、缺失或取代而改变抗体的CDR的氨基酸序列，可以得到各种效果，例如提高对靶标抗原的结合亲和力。
应该理解的是，包括这样的被改变的CDR序列的本发明的抗体仍然通过与被公开的抗体相似的特异性和灵敏度而结合LHR。这可以通过结合测试来进行检测。
抗体的恒定区域也可以被改变。例如，抗体可以设有任何同种型的Fc区域：IgA(IgA1、IgA2)、IgD、IgE、IgG (IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)或IgM。恒定区域序列的非限制性例子包括：
人类IgD恒定区域，Uniprot: P01880 SEQ ID NO: 44
APTKAPDVFPIISGCRHPKDNSPVVLACLITGYHPTSVTVTWYMGTQSQPQRTFPEIQRRDSYYMTSSQLSTPLQQWRQGEYKCVVQHTASKSKKEIFRWPESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTPECPSHTQPLGVYLLTPAVQDLWLRDKATFTCFVVGSDLKDAHLTWEVAGKVPTGGVEEGLLERHSNGSQSQHSRLTLPRSLWNAGTSVTCTLNHPSLPPQRLMALREPAAQAPVKLSLNLLASSDPPEAASWLLCEVSGFSPPNILLMWLEDQREVNTSGFAPARPPPQPGSTTFWAWSVLRVPAPPSPQPATYTCVVSHEDSRTLLNASRSLEVSYVTDHGPMK
人类IgG1恒定区域，Uniprot: P01857 SEQ ID NO: 45
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
人类IgG2恒定区域，Uniprot: P01859 SEQ ID NO: 46
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDISVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
人类IgG3恒定区域，Uniprot: P01860 SEQ ID NO: 47
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYTCNVNHKPSNTKVDKRVELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFKWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTFRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK
人类IgM恒定区域，Uniprot: P01871 SEQ ID NO: 48
GSASAPTLFPLVSCENSPSDTSSVAVGCLAQDFLPDSITLSWKYKNNSDISSTRGFPSVLRGGKYAATSQVLLPSKDVMQGTDEHVVCKVQHPNGNKEKNVPLPVIAELPPKVSVFVPPRDGFFGNPRKSKLICQATGFSPRQIQVSWLREGKQVGSGVTTDQVQAEAKESGPTTYKVTSTLTIKESDWLGQSMFTCRVDHRGLTFQQNASSMCVPDQDTAIRVFAIPPSFASIFLTKSTKLTCLVTDLTTYDSVTISWTRQNGEAVKTHTNISESHPNATFSAVGEASICEDDWNSGERFTCTVTHTDLPSPLKQTISRPKGVALHRPDVYLLPPAREQLNLRESATITCLVTGFSPADVFVQWMQRGQPLSPEKYVTSAPMPEPQAPGRYFAHSILTVSEEEWNTGETYTCVAHEALPNRVTERTVDKSTGKPTLYNVSLVMSDTAGTCY
人类IgG4恒定区域，Uniprot: P01861 SEQ ID NO: 49
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
人类IgA1恒定区域，Uniprot: P01876 SEQ ID NO: 50
ASPTSPKVFPLSLCSTQPDGNVVIACLVQGFFPQEPLSVTWSESGQGVTARNFPPSQDASGDLYTTSSQLTLPATQCLAGKSVTCHVKHYTNPSQDVTVPCPVPSTPPTPSPSTPPTPSPSCCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGVTFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGCAEPWNHGKTFTCTAAYPESKTPLTATLSKSGNTFRPEVHLLPPPSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQGTTTFAVTSILRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRLAGKPTHVNVSVVMAEVDGTCY
人类IgA2恒定区域，Uniprot: P01877 SEQ ID NO: 51
ASPTSPKVFPLSLDSTPQDGNVVVACLVQGFFPQEPLSVTWSESGQNVTARNFPPSQDASGDLYTTSSQLTLPATQCPDGKSVTCHVKHYTNPSQDVTVPCPVPPPPPCCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGATFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGCAQPWNHGETFTCTAAHPELKTPLTANITKSGNTFRPEVHLLPPPSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQGTTTFAVTSILRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRMAGKPTHVNVSVVMAEVDGTCY
人类Igκ恒定区域，Uniprot: P01834 SEQ ID NO: 52
TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
在本文提供的抗体的一些方面，所述抗体包括结构性的修饰，以促进快速结合和细胞摄取和/或缓慢释放。在一些方面，LHR抗体包括在抗体的CH2恒定重链区域中的缺失，以促进快速结合和细胞摄取和/或缓慢释放。在一些方面，Fab片段被使用来促进快速结合和细胞摄取和/或缓慢释放。在一些方面，F(ab)'2片段被使用来促进快速结合和细胞摄取和/或缓慢释放。
所述抗体、片段及其等效物可以与载体（例如药学上可接受的载体或其他试剂）结合，以提供用于使用和/或储存的制剂。
进一步提供的是一种分离的多肽，其包括可用来产生结合至LHR的抗体的LHR的氨基酸序列或其片段、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成，以及编码它们的分离的多核苷酸。在一个方面，所述分离的多肽或多核苷酸进一步包括标记和/或连续的多肽序列（例如匙孔血蓝蛋白（KLH）载体蛋白），或者在多核苷酸的情况下，包括可操作地结合至多肽或多核苷酸的编码该序列的多核苷酸。所述多肽或多核苷酸可以与各种载体（例如磷酸盐缓冲盐水）结合。进一步提供了宿主细胞，例如原核或真核细胞，例如细菌、酵母、哺乳动物（大鼠、类人猿、仓鼠、或人类），其包括所述分离的多肽或多核苷酸。所述宿主细胞可以与载体结合。
进一步提供了编码如本文公开的所述抗体及其片段的分离的核酸。它们可以与载体或合适的宿主细胞、和/或适当的载体结合以用于诊断或治疗用途。在一个方面，所述核酸与宿主细胞容纳在一起，用于多肽和蛋白的重组生产。所述宿主细胞可以是原核或真核的。
II. 用于制备组合物的方法
抗体、它们的制造和用途是广为人知的并且被公开于例如Harlow, E. and Lane, D.,Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ColdSpring Harbor, N.Y., 1999。可以使用本领域已知的标准方法来生产抗体。抗体的例子包括（但不限于）单克隆、单链、和抗体的功能性片段。
可以在一定范围的宿主（例如山羊、兔、大鼠、小鼠、人类等）内制造抗体。可以通过使用具有免疫原性特性的靶标抗原或其片段或寡肽（例如LHR的C末端片段或分离的多肽）进行的注射来使它们免疫。根据宿主种类，可以加入和使用各种佐剂，以提高免疫反应。这样的佐剂包括但不限于弗氏（Freund's）试剂、矿物凝胶（例如氢氧化铝）、以及表面活性物质，例如溶血卵磷脂、普流尼克（pluronic）多元醇、聚阴离子、肽、油乳液、匙孔血蓝蛋白、以及二硝基苯酚。在用于人类的佐剂中，BCG（卡介苗）和小棒杆菌（Corynebacterium parvum）是特别有用的。本发明还提供了分离的多肽和佐剂。
在一些方面，本发明的抗体是多克隆抗体，即具有不同的氨基酸序列的多个类型的抗LHR抗体的混合物。在一个方面，所述多克隆抗体包括具有不同的CDR的多个类型的抗LHR抗体的混合物。因此，培养制造不同的抗体的细胞的混合物，并且可以使用从得到的培养物纯化的抗体（参见WO 2004/061104）。
单克隆抗体生产。可以使用能够通过培养物中的连续细胞系来生产抗体分子的任何技术来制备LHR的单克隆抗体。这样的技术包括但不限于杂交瘤技术（Kohler &Milstein, Nature 256: 495-497 (1975)）；三肿瘤技术；人类B细胞杂交瘤技术（参见例如Kozbor, et al., Immunol. Today 4: 72 (1983)）以及EBV杂交瘤技术以产生人单克隆抗体（参见例如Cole, et al., in: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, AlanR. Liss, Inc., pp. 77-96 (1985)）。人单克隆抗体可以被用在本技术的实践中，并且可以使用人类杂交瘤（参见例如Cote, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 80: 2026-2030(1983)）或者通过用Epstein Barr病毒体外转染人类B细胞（参见例如Cole, et al., in:MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96(1985) ）来生产。例如，可以分离编码抗体的区域的核酸的群体。使用采用衍生自编码抗体的保守区域的序列的引物的PCR，来扩增抗体的来自该群体的部分的序列，然后重建编码来自该被扩增的序列的抗体或其片段（例如可变结构域）的DNA。这样的被扩增的序列也可以被融合至编码其他蛋白（例如噬菌体外壳、或细菌细胞表面蛋白）的DNA，用于表达和展示噬菌体或细菌上的融合多肽。然后可以根据例如被表达的抗体或其片段对于存在于LHR多肽上的抗原或表位的亲和力，表达和进一步选择或分离被扩增的序列。替代地，可以通过例如使用包括LHR的氨基酸序列或其片段、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成的分离的多肽，使对象免疫，然后使用常规方法来从所述对象的脾分离杂交瘤，来制备表达杂交瘤的抗LHR单克隆抗体。参见例如Milstein et al., (Galfre and Milstein, MethodsEnzymol 73: 3-46 (1981))。使用标准方法来筛选杂交瘤将制造不同特异性（即对不同表位的特异性）和亲和力的单克隆抗体。具有期望的特性（例如LHR结合）的选择的单克隆抗体可以（i）被用作通过杂交瘤来表达，（ii）被结合至例如聚乙二醇（PEG）的分子以改变其特性，或（iii）可以通过各种方法来分离、序列化和操纵编码所述单克隆抗体的cDNA。在一个方面，通过杂交瘤来生产抗LHR单克隆抗体，该杂交瘤包括从转基因非人动物（例如转基因小鼠）获得的B细胞，其中该转基因非人动物具有包括被融合至永生化细胞的人类重链转基因和轻链转基因的基因组。杂交瘤技术包括本领域已知的技术，以及在Harlow et al.,Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, Cold SpringHarbor, N.Y., 349 (1988); Hammerling et al., Monoclonal Antibodies And T-CellHybridomas, 563-681 (1981)中教导的技术。
噬菌体展示技术。如上所述，可以通过应用重组DNA和噬菌体展示技术来生产本发明的抗体。例如，可以使用本领域已知的各种噬菌体展示方法来制备抗LHR抗体。在噬菌体展示方法中，功能性抗体结构域被展示在携带编码它们的多核苷酸序列的噬菌体颗粒的表面。通过直接使用抗原进行选择，通常是被结合或者被捕获至固体表面或珠粒的抗原，从全部的或组合的抗体文库（例如人类或鼠类）中选择具有期望的结合特性的噬菌体。在这些方法中使用的噬菌体通常是丝状噬菌体，包括具有Fab、Fv的fd和M13，或者二硫化稳定化的Fv抗体结构域被重组地融合至噬菌体基因III或基因VIII蛋白。此外，方法可以适用于构建Fab表达文库（参见例如Huse, et al., Science 246: 1275-1281, 1989），以允许具有LHR多肽（例如多肽或其衍生物、片段、类似物或同系物）的所需的特异性的单克隆Fab片段的快速和有效的识别。可以被用来制造本发明的分离的抗体的噬菌体展示方法的其他例子包括在以下文献中公开的方法：Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85:5879-5883 (1988)；Chaudhary et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87: 1066-1070 (1990)；Brinkman et al., J. Immunol. Methods 182: 41-50 (1995)；Ames etal., J. Immunol. Methods 184: 177-186 (1995)；Kettleborough et al., Eur. J.Immunol. 24: 952-958 (1994)；Persic et al., Gene 187: 9-18 (1997)；Burton etal., Advances in Immunology 57: 191-280 (1994)；PCT/GB91/01134；WO 90/02809；WO91/10737；WO 92/01047；WO 92/18619；WO 93/11236；WO 95/15982；WO 95/20401；WO 96/06213；WO 92/01047 (Medical Research Council et al.)；WO 97/08320 (Morphosys)；WO 92/01047 (CAT/MRC)；WO 91/17271 (Affymax)；以及美国专利号5,698,426, 5,223,409, 5,403,484, 5,580,717, 5,427,908, 5,750,753, 5,821,047, 5,571,698, 5,427,908, 5,516,637, 5,780,225, 5,658,727和5,733,743。
洛宁的美国专利号6,753,136已经描述了可用于通过经由二硫键来连接多肽而在噬菌体颗粒的表面上显示多肽的方法。如在以上参考文献中描述的，在噬菌体选择之后，编码来自噬菌体的区域的抗体可以被分离并且被用来产生整个抗体（包括人类抗体、或任何其他期望的抗原结合片段），并且被表达在任何期望的宿主（包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌）中。例如，还可以使用本领域中已知的方法来采用重组地产生Fab、Fab′和F(ab′)2片段的技术，例如在WO 92/22324；Mullinax et al., BioTechniques 12:864-869 (1992)；Sawai et al., AJRI 34: 26-34 (1995)；以及Better et al., Science240: 1041-1043 (1988)中公开的。
通常，可以针对合适的抗体来选择被克隆进显示载体的杂交抗体或杂交抗体片段，从而识别维持了良好的结合活性的变体，因为所述抗体或抗体片段将会被呈现在噬菌体或噬菌粒颗粒的表面。参见例如Barbas III et al., Phage Display, A LaboratoryManual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001)。但是，其他载体形式可以被用于该方法，例如将抗体片段文库克隆进溶解性噬菌体载体（被修饰的T7或Lambda Zap系统）以用于选择和/或筛选。
抗体生产的替代性方法。还可以通过诱导淋巴细胞群体中的体内产生，或者通过筛选高度特异性结合试剂的重组免疫球蛋白文库或面板，来产生抗体（Orlandi et al.,PNAS 86: 3833-3837 (1989); Winter, G. et al., Nature, 349: 293-299 (1991)）。
替代地，可以使用用于生产单链抗体的技术。单链抗体（scFv）包括通过接头肽（通常长度为5至25个氨基酸）连接的重链可变区域和轻链可变区域。在scFv中，重链和轻链的可变区域可以衍生自相同的抗体或不同的抗体。可以使用重组技术来合成scFv，例如通过编码该scFv的载体在宿主生物（例如E. coli）中的表达。可以通过以下方法获得编码scFv的DNA：使用部分DNA作为模板进行扩增，其中该部分DNA编码选自编码上述抗体的重链或重链的可变区域的DNA和编码其轻链或轻链的可变区域的DNA的DNA的整个或所需的氨基酸序列，通过使用定义其两个末端的引物对的PCR，并且进一步结合编码多肽接头部分的DNA和定义其两个末端的引物对来进行扩增，从而将接头的两个末端分别连接至重链和轻链。可以根据本领域已知的常规方法来获得含有编码scFv的DNA的表达载体和由该表达载体转化的宿主。
还可以产生抗原结合片段，例如F(ab′)2片段可以通过抗体分子的胃蛋白酶消化来产生，而Fab片段可以通过减少F(ab′)2片段的二硫键而产生。替代地，可以构建Fab表达文库来进行具有期望的特异性的单克隆Fab片段的快速和简单的识别（Huse et al.,Science, 256: 1275-1281 (1989)）。
抗体修饰。本发明的抗体可以被多聚化来提高对抗原的亲和力。要被多聚化的抗体可以是一种抗体或识别相同抗原的多个表位的多种抗体。作为抗体的多聚化的方法，例如可以是将IgG CH3结构域结合至两个scFv分子、结合至链霉亲和素、引入螺旋-转角-螺旋基序等。
本文公开的抗体组合物可以是在这些抗体中的任一个和另一个试剂（免疫偶联物）之间形成的偶联物的形式。在一个方面，本文公开的抗体被偶联至放射性物质。在另一个方面，本文公开的抗体可以被结合至多种分子，例如聚乙二醇（PEG）。
抗体筛选。可以使用多种免疫测试来进行筛选，以识别具有期望的特异性的抗体。使用具有已建立的特异性的多克隆或单克隆抗体进行竞争性结合或免疫放射测试的许多程序在本领域中是已知的。这些免疫测试通常涉及测量在LHR、或其任何片段或寡肽和其特异性抗体之间的复合物形成。可以使用采用对两个非干扰的LHR表位特异的单克隆抗体进行的双位点、基于单克隆的免疫测试，但是也可以采用竞争性结合测试（Maddox et al.,J. Exp. Med., 158: 1211-1216 (1983)）。
可以使用Ventana Medical Systems, Inc (VMSI) Discovery XT和在玻璃载玻片上的福尔马林固定的、石蜡包埋的人体组织，进行可能的抗LHR抗体的自动的免疫组织化学（IHC）筛选。组织样品首先进行去石蜡化、抗原修复，然后加入能的抗LHR抗体和检测抗体。使用来自VMSI的色原检测试剂使检测抗体可视化。在显微镜下手工筛选染色载玻片。具有正确的初级抗体染色图案的样品被选择为可能的抗LHR候选。
抗体纯化。可以将本文公开的抗体纯化至同质化。可以采用常规的蛋白分离和纯化方法，进行抗体的分离和纯化。
仅仅作为例子，可以通过色谱柱、过滤器、超滤、盐析、透析、制备性聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳等的适当选择和组合使用，分离和纯化抗体。Strategies forProtein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual, DanielR. Marshak et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996)；Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring HarborLaboratory (1988)。
色谱法的例子包括亲和色谱、离子交换色谱、疏水色谱、凝胶过滤色谱、反相色谱、以及吸附色谱。在一个方面，可以采用液体色谱（例如HPLC或FPLC）进行色谱。
在一个方面，在亲和色谱中可以使用Protein A柱或Protein G。其他示例性的柱包括Protein A柱、Hyper D、POROS、Sepharose F. F. (Pharmacia)等。
III. 使用方法
概述。本文公开的抗体可用于本领域中涉及LHR多肽的定位和/或定量的方法（例如用于测量在适当的生理样品之内的LHR多肽的水平、用于诊断方法、用于使多肽成像等）。本文公开的抗体可用于通过标准技术（例如亲和色谱或免疫沉淀）分离LHR多肽。本文公开的LHR抗体可以促进来自生物样品（例如哺乳动物血清或细胞）的天然LHR多肽以及在宿主系统中表达的重组地制造的LHR多肽的纯化。再者，可以使用LHR抗体来检测LHR多肽（例如在血浆、细胞裂解物或细胞上清液中），从而评估多肽的表达的丰度和模式。可以诊断性地使用本文公开的LHR多肽，以作为临床测试过程的一部分来监控组织中的LHR水平，例如从而确定给定的治疗方案的功效。可以通过将本文公开的LHR抗体结合（即物理地连接）至可检测的物质，以促进检测。
在另一个方面，本文提供了一种组合物，其包括结合至肽的本文公开的抗体或抗原结合片段，所述肽包括例如人类LHR蛋白或其片段。在一个方面，所述肽与细胞相关。例如，所述组合物可以包括采用本文公开的抗体或抗体片段进行标记的被分解的细胞样品，该组合物可用于例如用于分离细胞的亲和色谱方法或基于流式细胞术的细胞分析或细胞分选。作为另一个例子，所述组合物可以包括采用本文公开的抗体或抗体片段进行标记的固定的组织样品或细胞涂片，该组合物可用于例如免疫组织化学或细胞学分析。在另一个方面，所述抗体或抗体片段被结合至固体支撑物，其可用于例如：ELISA；亲和色谱法或免疫沉淀法，用于分离LHR蛋白或其片段、LHR阳性细胞、或含有LHR和其他细胞组分的复合物。在另一个方面，所述肽被结合至固体支撑物。例如，所述肽可以通过对该肽特异的二级抗体而被结合至固体支撑物，其可用于例如夹心ELISA。作为另一个例子，所述肽可以被结合至色谱柱，其可用于例如根据本技术的抗体的分离或纯化。在另一个方面，所述肽被置于溶液中，例如裂解溶液或含有被分馏的细胞的亚细胞组分的溶液，其可用于例如ELISA和亲和色谱法或免疫沉淀法，用于分离LHR蛋白或其片段、或含有LHR和其他细胞组分的复合物。在另一个方面，所述肽与基质相关，例如凝胶电泳凝胶或通常被用于蛋白免疫印迹的基质（例如由硝化纤维素或聚偏二氟乙烯制成的膜），该组合物可用于电泳和/或免疫印迹技术，例如蛋白免疫印迹。
LHR多肽的检测。用于检测生物样品中的LHR多肽的水平的示例性方法涉及从对象获得生物样品，并且将所述生物样品与能够检测LHR多肽的本文公开的LHR抗体相接触。
在一个方面，LHR抗体5F4-21、4A7-4、8B7-3或138-2或其片段被可检测地标记。关于抗体的术语“标记”旨在包括抗体的直接标记和抗体的间接标记，前者通过将可检测的物质结合（即物理地连接）至抗体，而后者通过与被直接地标记的另一种化合物的反应性。间接标记的非限制性例子包括使用荧光标记的二级抗体进行的初级抗体的检测，以及使用生物素进行的DNA探针的末端标记，使得它能够通过荧光标记的链霉亲和素而被检测。
本发明的检测方法可以被用来体外及体内检测生物样品中的LHR多肽的表达水平。用于LHR多肽的检测的体外技术包括酶联免疫吸附测定（ELISA）、蛋白免疫印迹、流式细胞术、免疫沉淀、放射免疫测定和免疫荧光（例如IHC）。进一步地，用于LHR多肽的检测的体内技术包括将被标记的抗LHR抗体引入对象中。仅仅作为例子，可以使用放射性标记物来标记所述抗体，可以通过标准的成像技术来检测该标记物在对象中的存在和位置。在一个方面，所述生物样品包括来自测试对象的多肽分子。
免疫测试和成像。本文公开的LHR抗体可以被用来使用基于抗体的技术测试生物样品（例如人类血浆）中的LHR多肽水平。例如，可以使用经典的免疫组织化学（IHC）染色方法来研究组织中的蛋白表达。 Jalkanen, M. et al., J. Cell. Biol. 101: 976-985(1985)；Jalkanen, M. et al., J. Cell. Biol. 105: 3087-3096 (1987)。可用于检测蛋白基因表达的其他基于抗体的方法包括免疫测试，例如酶联免疫吸附测定（ELISA）和放射免疫测定（RIA）。合适的抗体测试标签在本领域中是已知的并且包括：酶标签，例如葡萄糖氧化酶；以及放射性同位素或其他放射剂，例如碘（125I、121I、131I）、碳（14C）、硫（35S）、氚（3H）、铟（112In）、和锝（99mTc）；以及荧光标签，例如荧光素和罗丹明、以及生物素。
除了在生物样品中测试LHR多肽水平之外，还可以通过成像而在体内检测LHR多肽水平。可以与抗LHR抗体结合以用于LHR多肽水平的体内成像的标签包括能够通过X射线照相、NMR或ESR检测的标签。对于X射线照相，适当的标签包括放射性同位素（例如钡或铯），其发射可检测的辐射但不对对象显著有害。用于NMR和ESR的适当的标记物包括具有可检测的特性螺旋的标记物（例如氘），其可以通过对于相关的scFv克隆的营养素的标记而被结合进LHR抗体。
已经标记有合适的可检测的成像部分（例如放射性同位素（例如131I、112In、99mTc）、不透射线的物质或可通过核磁共振检测的材料）的LHR抗体，被引入（例如肠胃外、皮下或腹膜内）进所述对象。在本领域中将理解的是，对象的大小和使用的成像系统将确定产生诊断图像所需的成像部分的量。在放射性同位素部分的情况中，对于人类对象，注射的放射性的量将通常为约5至20毫居里99mTc。被标记的LHR抗体然后将会优先地积累在含有特异性靶标多肽的细胞的位置。例如，在S. W. Burchiel et al., Tumor Imaging: TheRadiochemical Detection of Cancer 13 (1982)中描述了体内肿瘤成像。
在一些方面，含有促进快速结合和细胞摄取和/或缓慢释放的结构性修饰的LHR抗体可用于体内成像检测方法。在一些方面，LHR抗体包括在抗体的CH2恒定重链区域中的缺失，以促进快速结合和细胞摄取和/或缓慢释放。在一些方面，Fab片段被使用来促进快速结合和细胞摄取和/或缓慢释放。在一些方面，F(ab)'2片段被使用来促进快速结合和细胞摄取和/或缓慢释放。
LHR抗体的诊断性使用。本文公开的LHR抗体组合物可用于诊断和预后方法。因此，本发明提供了用于在对象中的LHR相关的医疗状况的诊断中使用本文公开的抗体的方法。可以选择本文公开的抗体，使得它们具有对LHR多肽的高水平的表位结合特异性和高的结合亲和力。一般来说，抗体的结合亲和力越高，则在免疫测试中可以进行的洗涤条件越严格，以在不移除靶标多肽的情况下移除非特异性结合的材料。相应地，可用于诊断性测试的本技术的LHR抗体通常的结合亲和力为至少10-6、10-7、10-8、10-9、10-10、10-11或10-12M。在一些方面，被用作诊断试剂的LHR抗体具有足够的动力学上的速率（kinetic on-rate），以在至少12小时、至少5小时、至少1小时、或至少30分钟在标准条件下达到平衡。
本技术的一些方法采用抗LHR抗体的多克隆制剂和多克隆的抗LHR抗体组合物作为诊断试剂，而其他方法采用单克隆分离物。在采用根据上述方法而制备的多克隆人类抗LHR抗体的方法中，制剂通常包括LHR抗体的混合物，例如具有对靶标多肽的不同的表位特异性的抗体。本发明的单克隆抗LHR抗体可用于在存在或可能存在紧密相关的抗原的情况下检测单一的抗原。
本发明的LHR抗体可以被用作对于任何类型的生物样品的诊断试剂。在一个方面，本文公开的LHR抗体可用作对于人类生物样品的诊断试剂。LHR抗体可以被用来在多种标准测试方式中检测LHR多肽。这样的方式包括免疫沉淀、蛋白免疫印迹、ELISA、放射免疫测定、流式细胞术、IHC和免疫测定。参见Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Publications, New York, 1988)；美国专利号3,791,932；3,839,153；3,850,752；3,879,262；4,034,074、3,791,932；3,817,837；3,839,153；3,850,752；3,850,578；3,853,987；3,867,517；3,879,262；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074；和4,098,876。可以从对象的任何组织（包括活组织检查）、细胞或体液中获得生物样品。
LHR抗体的预后使用。本发明还提供了预后（或预测）测试，用于确定对象是否有风险发展与提高的LHR多肽表达或活性（例如癌前细胞的检测）相关的医学疾病或病症。这样的测试可以被用于预后或预测目的，从而因此在以LHR多肽表达为特征或与其相关的医学疾病或病症的发作之前，预防性地治疗个体。
本发明的另一个方面提供了用于确定对象中的LHR表达的方法，从而为该对象选择合适的治疗或预防化合物。
替代地，所述预后测试可以被用来识别具有或者有风险发展前列腺癌和卵巢癌的对象。因此，本发明提供了一种识别与提高的LHR多肽表达水平相关的疾病或病症的方法，其中从对象获得测试样品并且检测LHR多肽，其中与对照样品相比LHR多肽的提高的水平的存在，是对象具有或者有风险发展与提高的LHR多肽表达水平相关的疾病或病症的预示。在一些方面，与提高的LHR多肽表达水平相关的疾病或病症选自前列腺癌和卵巢癌。
在另一个方面，本发明提供了用于确定是否能够使用化合物有效地治疗对象的与提高的LHR多肽表达水平相关的疾病或病症的方法，其中从该对象获得生物样品并且使用所述LHR抗体检测LHR多肽。确定在从该对象获得的生物样品中LHR多肽的表达水平，并且与在从不患该疾病的对象获得的生物样品中发现的LHR表达水平相比较。与从健康对象获得的样品相比，在从怀疑患有该疾病或病症的对象获得的样品中的LHR多肽水平的提高，是被测试的该对象中LHR相关的疾病或病症的指示。
有许多疾病状态其中提高的LHR多肽的表达水平被已知指示患有该疾病的对象是否可能响应于对特定类别的疗法或治疗。因此，检测生物样品中的LHR多肽的方法可以被用作预后的方法，例如从而评估该对象将会响应于疗法或治疗的可能性。确定来自对象的合适的组织或体液样品中的LHR多肽的水平，并将其与合适的对照进行比较，所述对照例如是患有相同的疾病但是有利地响应该治疗的对象中的水平。
在一个方面，本发明提供了监控试剂（例如药物、化合物或小分子）对LHR多肽的表达的影响的方法。这样的测试可以被应用在基础药物筛选和临床试验中。例如，可以在显示出提高的LHR的表达的对象（例如被诊断有癌症的对象）的临床试验中，监控试剂降低LHR多肽水平的效力。可以通过施用试剂并观察反应，识别影响LHR多肽的表达的试剂。通过这种方式，LHR多肽的表达模式可以作为标记物，其是对象对试剂的生理反应的指示。相应地，可以在使用该试剂的对象的治疗之前、以及在期间的各种时间点，确定该反应状态。
本发明的进一步的方面涉及用于确定患者是可能响应还是不可能响应LHR CAR疗法的方法。在特定的实施方式中，该方法包括将从所述患者分离的肿瘤样品与有效量的LHR抗体接触，以及检测结合至所述肿瘤样品的任何抗体的存在。在进一步的实施方式中，结合至所述肿瘤样品的抗体的存在表明所述患者可能响应所述LHR CAR疗法，而结合至所述肿瘤样品的抗体的不存在表明所述患者不可能响应LHR疗法。在一些实施方式中，所述方法包括额外的步骤，其中向被确定可能响应LHR CAR疗法的患者施用有效量的LHR CAR疗法。
自动的实施方式。本领域技术人员将会理解，用于使用本文公开的LHR抗体的方法的方面可以是自动的。可以使用各种自动的方法，来进行LHR染色方法的特定的方面。
IV. 试剂盒
如本文所述，本发明提供了用于确定LHR的表达水平的诊断方法。在一个特定的方面，本发明提供了用于执行这些方法的试剂盒，以及用于进行本发明的方法的说明，例如收集组织和/或进行筛选、和/或分析结果。
所述试剂盒包括本文公开的LHR抗体组合物（例如单克隆抗体）以及使用说明、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成。所述试剂盒可用于检测生物样品中LHR多肽的存在，所述生物样品例如是任何体液，包括但不限于例如痰液、血清、血浆、淋巴、囊液、尿液、粪便、脑脊液、腹水或血液并且包括身体组织的活检样品。测试样品也可以是肿瘤细胞、肿瘤附近的正常细胞、对应于肿瘤组织类型的正常细胞、血细胞、外周血淋巴细胞、或其组合。根据测试形式、测试方法的特性和被用作被测试的样品的组织、细胞或提取物，在上述方法中使用的测试样品将会发生改变。用于制备蛋白提取物或细胞的膜提取物的方法在本领域中是已知的，并且可以被容易地适应，从而获得能够与采用的系统兼容的样品。
在一些方面，所述试剂盒可以包括：能够结合生物样品中的LHR多肽的一种或多种LHR抗体（例如具有LHR抗体B7H4 5F6、B7H4 # 33-14或B7H4 #36-1的相同的抗原结合特异性的抗体或其抗原结合片段）；用于确定样品中的LHR多肽的量的装置；以及用于将所述样品中的LHR多肽的量与标准进行比较的装置。所述LHR多肽中的一种或多种可以被标记。所述试剂盒组件（例如试剂）可以被包装在合适的容器中。所述试剂盒可以进一步包括使用该试剂盒来检测LHR多肽的说明。在一些方面，所述试剂盒包括：第一抗体，例如被连接至固体支撑物，其结合至LHR多肽；以及任选地2）第二、不同的抗体，其结合至所述LHR多肽或所述第一抗体，并且被偶联至可检测的标签。
所述试剂盒还可以包括例如缓冲剂、防腐剂或蛋白质稳定剂。所述试剂盒可以进一步包括检测所述可标记的标签（例如酶或底物）必要的组件。所述试剂盒还可以包括对照样品或一系列的对照样品，其可以被检测并且与测试样品相比较。所述试剂盒的每个组件都可以被包裹在单个容器之内，并且所有的各种容器可以与用于解读使用该试剂盒进行的测试的结果的说明一起，处于单一的包装之内。本发明的试剂盒可以包括在所述试剂盒容器之上或之内的书面产品。所述书面产品描述了如何使用被包含在试剂盒之内的试剂。
经得起考验的是， 可以以本领域技术人员习惯使用的方式来包装这些建议的试剂盒组件。例如，这些建议的试剂盒组件可以被提供于溶液中或者作为液体分散体等。
V. 载体
所述抗体或LHR CAR还可以被结合至许多不同的载体。因此，本发明还提供了含有所述抗体和活性或惰性的另一种物质的组合物。熟知的载体的例子包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙、淀粉酶、天然和改性纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂和磁铁矿。所述载体的性质可以是可溶的或不可溶的以用于本发明。本领域技术人员将会知晓用于结合抗体的其他合适的载体、或者将会能够使用常规实验来确定这些载体。
嵌合抗原受体及其用途
I. 组合物
本发明提供了结合至LHR的嵌合抗原受体（CAR），其包括细胞外和细胞内结构域、或基本上由其组成。所述细胞外结构域包括靶标特异性结合元件，或者被称为抗原结合结构域。所述细胞内结构域或细胞质结构域包括共刺激信号传导区域和ζ链部分。所述CAR任选地进一步包括多达300个氨基酸、优选地10至100个氨基酸、更优选地25至50个氨基酸的隔离结构域。
抗原结合结构域。在一些方面，本发明提供了一种CAR，其包括对LHR特异的抗原结合结构域、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成。在一些实施方式中，所述抗原结合结构域包括抗LHR抗体的抗原结合结构域、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成。在进一步的实施方式中，抗LHR抗体的重链可变区域和轻链可变区域包括抗LHR抗体的抗原结合结构域、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成。本文公开了这些抗体及其序列。本领域技术人员将清楚，可以使用本文公开的针对LHR的抗体片段来生成CAR。因此，相关的公开内容被合并入本文中。
在一些实施方式中，所述抗体的重链可变区域包括本文公开的序列（包括其每个的等效物）、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成，和/或包括本文公开的一个或多个CDR区域或其每个的等效物。在一个方面，所述抗体的所述HC包括以下中的一个或多个、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成：CDR1，其包括GYSITSGYG (SEQ IDNO.: 16)或其每个的等效物的氨基酸序列；和/或CDR2，其包括IHYSGST (SEQ ID NO.: 19)或其每个的等效物的氨基酸序列；和/或CDR3，其包括ARSLRY (SEQ ID NO.: 22)或其每个的等效物的氨基酸序列；和/或所述抗体的所述LC包括、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成：CDR1，其包括SSVNY (SEQ ID NO.:25)或其每个的等效物的氨基酸序列；和/或CDR2，其包括DTS (SEQ ID NO:28)或其每个的等效物的氨基酸序列；和/或CDR3，其包括HQWSSYPYT (SEQ ID NO:31)或其每个的等效物的氨基酸序列。
在一个方面，所述HC包括以下中的一个或多个、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成：CDR1，其包括GFSLTTYG (SEQ ID NO.: 17)或其每个的等效物的氨基酸序列；和/或CDR2，其包括IWGDGST (SEQ ID NO.: 20)或其每个的等效物的氨基酸序列；和/或CDR3，其包括AEGSSLFAY (SEQ ID NO.: 23)或其每个的等效物的氨基酸序列；和/或所述抗体的所述LC包括、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成：CDR1，其包括QSLLNSGNQKNY (SEQ ID NO.:26)或其每个的等效物的氨基酸序列；和/或CDR2，其包括WAS(SEQ ID NO:29)或其每个的等效物的氨基酸序列；和/或CDR3，其包括QNDYSYPLT (SEQ IDNO:32)或其每个的等效物的氨基酸序列。
在另一个方面，所述抗体的所述HC包括以下中的一个或多个、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成：CDR1，其包括GYSFTGYY (SEQ ID NO.: 18)或其每个的等效物的氨基酸序列；和/或CDR2，其包括IYPYNGVS (SEQ ID NO.: 21)或其每个的等效物的氨基酸序列；和/或CDR3，其包括ARERGLYQLRAMDY (SEQ ID NO.: 24)或其每个的等效物的氨基酸序列；和/或所述抗体的所述LC包括、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成：CDR1，其包括QSISNN (SEQ ID NO.:27)或其每个的等效物的氨基酸序列；和/或CDR2，其包括NAS (SEQ ID NO:30)或其每个的等效物的氨基酸序列；和/或CDR3，其包括QQSNSWPYT(SEQ ID NO:33)或其每个的等效物的氨基酸序列。
跨膜结构域。跨膜结构域可以衍生自天然的或合成的来源。在所述来源是天然的情况中，所述结构域可以衍生自任何膜结合或者跨膜蛋白。具有在本发明中的特定用途的跨膜区域可以衍生自CD8、CD28、CD3、CD45、CD4、CD5、CDS、CD9、CD 16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD 134、CD137、CD 154、TCR。替代地所述跨膜结构域可以是合成的，在该情况中它将主要包括疏水残基，例如亮氨酸和缬氨酸。优选地，在合成的跨膜结构域的每个末端将会发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。任选地，短的寡肽或多肽接头（优选长度为2至10个氨基酸）可以形成CAR的跨膜结构域和细胞质信号传导结构域之间的连接。甘氨酸-丝氨酸二联体提供了特别合适的接头。
细胞质结构域。CAR的细胞质结构域（胞质域）或细胞内信号传导结构域负责在其中置有CAR的免疫细胞的传统效应器功能中的至少一个的激活。细胞内信号传导结构域是指蛋白的转导效应器功能信号并引导免疫细胞来进行其特异性功能的一部分。可以使用整个信号传导结构域或其截断的部分，只要该截断的部分足够来转导效应器功能信号。TCR和共受体的细胞质序列以及其衍生物或变体能够作用为细胞内信号传导结构域以在CAR中使用。具有在本发明中的特定用途的细胞内信号传导结构域可以衍生自FcR、TCR、CD3、CDS、CD22、CD79a、CD79b、CD66d。因为通过TCR产生的信号单独不足以进行T细胞的完全激活，所以还可能需要二级或共刺激信号。因此，共刺激信号传导分子的细胞内区域包括但不限于CD27、CD28、4- IBB (CD 137)、OX40、CD30、CD40、PD- 1、ICOS、淋巴细胞功能相关的抗原- 1(LFA-1 )、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、或特异性地与CD83结合的配体也可以被包括在CAR的细胞质结构域中。
在一些实施方式中，嵌合抗原受体的细胞激活部分是T细胞信号传导结构域，其包括以下中的一个或多个蛋白或其片段、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成：CD8蛋白、CD28蛋白、4-1BB蛋白、和CD3-ζ蛋白。
在具体的实施方式中，所述CAR包括、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成：抗LHR抗体的抗原结合结构域、CD8 α铰链结构域、CD8 α跨膜结构域、共刺激信号传导区域、以及CD3ζ信号传导结构域。在进一步的实施方式中，所述共刺激信号传导区域包括CD28共刺激信号传导区域和4-1BB共刺激信号传导区域中的一个或两个。
在一些实施方式中，所述CAR可以进一步包括可检测的标记物或纯化标记物。
II. 用于制备CAR的方法
本发明的方面涉及包括LHR CAR的分离的细胞以及制备这样的细胞的方法。所述细胞是原核或真核细胞。在一个方面，所述细胞是T细胞或NK细胞。所述真核细胞可以来源于任何优选的物种，例如动物细胞、哺乳动物细胞，例如人类、猫或犬科动物细胞。
在具体的实施方式中，所述分离的细胞包括外源性CAR、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成，所述CAR包括、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成：抗LHR抗体的抗原结合结构域、CD8 α铰链结构域、CD8 α跨膜结构域、CD28共刺激信号传导区域和/或4-1BB共刺激信号传导区域、以及CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方式中，所述分离的细胞是T细胞，例如动物T细胞、哺乳动物T细胞、猫T细胞、犬T细胞或人T细胞。在一些实施方式中，所述分离的细胞是NK细胞，例如动物NK细胞、哺乳动物NK细胞、猫NK细胞、犬NK细胞或人NK细胞。
在一些实施方式中，公开了生产表达LHR CAR的细胞的方法，所述方法包括、或替代地基本上由其组成：（i）使用编码LHR CAR的核酸序列转导分离的细胞的群体，和（ii）选择已经使用步骤（i）的所述核酸序列成功转导的细胞的亚群体。在一些实施方式中，所述分离的细胞是T细胞，例如动物T细胞、哺乳动物T细胞、猫T细胞、犬T细胞或人T细胞，从而生产LHR CAR T细胞。在一些实施方式中，所述分离的细胞是NK细胞，例如动物NK细胞、哺乳动物NK细胞、猫NK细胞、犬NK细胞或人NK细胞，从而生产LHR CAR NK细胞。
T细胞或NK细胞的来源。在本发明的T细胞的扩增和遗传修饰之前，可以从对象或培养物获得T或NK细胞的来源。T或NK细胞可以获得自对象中的许多来源，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染位点的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。
分离相关细胞的方法在本领域中是熟知的并且可以容易地适用至本申请；在以下例子中描述了示例性的方法。用于与本发明相关的用途的分离方法包括但不限于LifeTechnologies Dynabeads®系统；STEMcell Technologies EasySep™、RoboSep™、RosetteSep™、SepMate™；Miltenyi Biotec MACS™细胞分离试剂盒、以及其他商业上可获得的细胞分离和分隔试剂盒。可以通过使用在对独特的细胞表面标记物特异的这样的试剂盒中可用的珠粒或其他结合试剂，分离免疫细胞的特定的亚群体。例如，MACS™ CD4+和CD8+ MicroBeads可以被用来分离CD4+和CD8+ T细胞。
替代地，细胞可以通过商业上可用的细胞培养物而获得，其包括但不限于：对T细胞，BCL2 (AAA) Jurkat (ATCC® CRL-2902™)、BCL2 (S70A) Jurkat (ATCC® CRL-2900™)、BCL2 (S87A) Jurkat (ATCC® CRL-2901™)、BCL2 Jurkat (ATCC® CRL-2899™)、Neo Jurkat (ATCC® CRL-2898™)细胞系；以及对于NK细胞，NK-92 (ATCC® CRL-2407™)、NK-92MI (ATCC® CRL-2408™)细胞系。
载体。可以使用载体制备CAR。在以下例子中详细地讨论了使用所述载体来制备示例性的载体和生产表达CAR的细胞。总的来说，通常通过将编码CAR多肽或其部分的核酸可操作地连接至启动子，并且将构建体结合进表达载体，实现编码CAR的天然的或合成的核酸的表达。所述载体可以适于复制和整合真核生物。
用于生产包括载体和/或外源性核酸的细胞的方法在本领域中是熟知的。参见例如Sambrook et al. (2001 , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold SpringHarbor Laboratory, New York)。不管被用来将外源性核酸引入宿主细胞或将细胞暴露至本发明的抑制剂的方法如何，为了确认重组DNA序列在宿主细胞中的存在，可以进行多种测试。这样的测试包括：例如本领域技术人员熟知的“分子生物学”测定，例如Southern和Northern印迹、RT-PCR和PCR；“生物化学”测定，例如检测特定的肽是否存在，例如通过免疫学手段（ELlSA和蛋白免疫印迹）或者通过本文描述的测试来识别落入本发明的范围之内的试剂。
在一些实施方式中，所述分离的核酸序列编码CAR，其包括、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成：抗LHR抗体的抗原结合结构域、CD8 α铰链结构域、CD8 α跨膜结构域、CD28共刺激信号传导区域和/或4-1BB共刺激信号传导区域、以及CD3ζ信号传导结构域。在具体的实施方式中，所述分离的核酸序列包括编码以下的序列、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成：（a）抗LHR抗体的抗原结合结构域、随后的（b）CD8 α铰链结构域、（c）CD8 α跨膜结构域、随后的（d）CD28共刺激信号传导区域和/或4-1BB共刺激信号传导区域、随后的（e）CD3ζ信号传导结构域。
在一些实施方式中，所述分离的核酸序列包括位于编码抗LHR抗体的抗原结合结构域的序列的上游的Kozak共有序列、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成。在一些实施方式中，所述分离的核酸包括赋予抗生素抗性的多核苷酸。
在一些实施方式中，所述分离的核酸序列被包括在载体中。在一些实施方式中，所述载体是质粒。在其他实施方式中，所述载体是病毒载体。在具体的实施方式中，所述载体是慢病毒载体。
在以下例子中详细地讨论了示例性的载体的制备和使用所述载体来生产表达CAR的细胞。总的来说，通常通过将编码CAR多肽或其部分的核酸可操作地连接至启动子，并且将构建体结合进表达载体，实现编码CAR的天然的或合成的核酸的表达。所述载体可以适于复制和整合真核生物。用于生产包括载体和/或外源性核酸的细胞的方法在本领域中是熟知的。参见例如Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory, New York)。
在一个方面，术语“载体”是指这样的重组载体，其保留了感染和转导不分裂和/或缓慢分裂的细胞并整合到靶细胞的基因组中的能力。在一些方面，所述载体衍生自或者基于野生型病毒。在进一步的方面。所述载体衍生自或者基于野生型慢病毒。这样的例子包括但不限于人类免疫缺陷病毒（HIV）、马传染性贫血病毒（EIAV）、猿猴免疫缺陷病毒（SIV）和猫免疫缺陷病毒（FIV）。替代地，应该理解的是，其他逆转录病毒可以被用作载体骨架的基础，例如鼠白血病病毒（MLV）。很明显，根据本发明的病毒载体不必被局限于特定病毒的组件。所述病毒载体可以包括衍生自两种或更多种不同病毒的组件，并且还可以包括合成的组件。载体组件可以被操纵来获得所需的特性，例如靶细胞特异性。
本发明的重组载体衍生自灵长类和非灵长类。灵长类慢病毒的例子包括人类免疫缺陷病毒（HIV）、人类获得性免疫缺陷综合征（AIDS）的致病因子、以及猿猴免疫缺陷病毒（SIV）。非灵长类慢病毒群组包括 “慢病毒”原型visna/maedi病毒（VMV）、以及相关的山羊关节炎脑炎病毒（CAEV）、马传染性贫血病毒（EIAV）和更近期地被描述的猫免疫缺陷病毒（FIV）和牛免疫缺陷病毒（BIV）。现有技术的重组慢病毒载体在本领域中是已知的，例如参见美国专利号6,924,123；7,056,699；7,07,993；7,419,829和7,442,551，其以引用的方式合并入本文中。
美国专利号6,924,123公开了某些逆转录病毒序列促进整合进靶细胞基因组。该专利教导了每个逆转录病毒包括被称为gag、pol和env的基因，其编码病毒粒子蛋白和酶。这些基因通过被称为长末端重复（LTR）的区域而被处于两个末端的侧翼。所述LTR负责前病毒整合和转录。它们也用作增强子-启动子序列。换句话说，LTR能够控制病毒基因的表达。逆转录病毒RNA的封装通过位于病毒基因组的5'末端的psi序列而发生。LTR自身是可以被分为三种元件的相同的序列，其被称为U3、R和U5。U3衍生自对RNA的3'末端独特的序列。R衍生自在RNA的两个末端重复的序列，而U5衍生自RNA的5'末端独特的序列。在不同的逆转录病毒之间这三种元件的尺寸可以发生较大的变化。对于病毒基因组，聚合（A）加成（终止）的位点是在LRT右手边的R和U5之间的边界处。U3含有前病毒的大多数转录控制元件，其包括启动子和多重增强子序列，它们响应细胞（在某些情况下为病毒）转录激活蛋白。
关于结构基因gag、pol和env自身，gag编码病毒的内部结构蛋白。gag蛋白被蛋白水解地处理成成熟蛋白MA（基质）、CA（衣壳）和NC（核衣壳）。pol基因编码逆转录酶（RT），其包括DNA聚合酶、相关的RNA酶H和整合酶（IN），它们介导基因组的复制。
对于病毒载体颗粒的生产，载体RNA基因组被表达自在宿主细胞中的编码它的DNA构建体。通过在宿主细胞中表达的其他核酸序列（“包装系统”，其通常包括gag/pol和env中的一个或两个），以反式的形式提供不被所述载体基因组编码的颗粒的部件。可以通过瞬时转染将生产病毒载体颗粒所需的一组序列引入宿主细胞，或者它们可以被整合进宿主细胞基因组、或者它们可以以混合物的方式而被提供。涉及的技术对于本领域技术人员来说是已知的。
用于在本发明中使用的逆转录病毒载体包括但不限于：Invitrogen的pLenti系列版本4、6和6.2 “ViraPower”系统，由Lentigen Corp.制造；pHIV-7-GFP，由City of HopeResearch Institute实验室生成和使用；“Lenti-X” 慢病毒载体，pLVX，由Clontech制造；pLKO.1-puro，由Sigma-Aldrich制造；pLemiR，由Open Biosystems制造；以及pLV，由Virology (CBF), Berlin, Germany 的Charité Medical School, Institute实验室生成和使用。
不管被用来将外源性核酸引入宿主细胞或将细胞暴露至本发明的抑制剂的方法如何，为了确认重组DNA序列在宿主细胞中的存在，可以进行多种测试。这样的测试包括：例如本领域技术人员熟知的“分子生物学”测定，例如Southern和Northern印迹、RT-PCR和PCR；“生物化学”测定，例如检测特定的肽是否存在，例如通过免疫学手段（ELlSA和蛋白免疫印迹）或者通过本文描述的测试来识别落入本发明的范围之内的试剂。
包装载体和细胞系。可以通过使用包装载体和细胞系，将CAR包装进逆转录病毒包装系统。包装质粒包括但不限于逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体和腺相关病毒载体。包装载体包括促进遗传物质递送进细胞的元件和序列。例如，逆转录病毒构建体是这样的包装质粒，其包括至少一种逆转录病毒辅助DNA序列，其衍生自复制缺陷型逆转录病毒基因组，其以反式的方式编码包装复制缺陷型逆转录病毒载体所需的所有病毒粒子蛋白，并且用于生产能够以高滴度包装复制缺陷型逆转录病毒载体而不会产生复制完整型辅助病毒的病毒粒子蛋白。逆转录病毒DNA序列缺少编码病毒的病毒性5′ LTR的天然增强子和/或启动子的区域，并且缺少负责包装辅助基因组的psi功能序列和3′ LTR，但是编码外来的聚腺苷酸化位点（例如SV40聚腺苷酸化位点）、以及引导其中需要病毒生产的细胞类型中的有效转录的外来增强子和/或启动子。所述逆转录病毒是白血病病毒，例如莫洛尼鼠白血病病毒（MMLV）、人类免疫缺陷病毒（HIV）、或长臂猿白血病病毒（GALV）。所述外来增强子和/或启动子可以是人类巨细胞病毒（HCMV）即刻早期（IE）增强子和启动子、莫洛尼鼠肉瘤病毒（MMSV）的增强子和启动子（U3区域）、Rous肉瘤病毒（RSV）的U3区域、脾病灶形成病毒（SFFV）的U3区域、或连接到天然莫洛尼鼠白血病病毒（MMLV）启动子的HCMV IE增强子。逆转录病毒包装质粒可以由两个逆转录病毒辅助DNA序列组成，它们由基于质粒的表达载体编码，例如其中第一辅助序列包括编码嗜亲性MMLV 或GALV 的gag和pol蛋白的cDNA，并且第二辅助序列包括编码env蛋白的cDNA。Env基因，其确定宿主范围，可以衍生自编码以下的基因：嗜异性的、双嗜性的、嗜亲性、多嗜性的（貂病灶形成）或10A1鼠白血病病毒env蛋白、或长臂猿白血病病毒（GALV）env蛋白、人类免疫缺陷病毒env（gp160）蛋白、水泡性口炎病毒（VSV）G蛋白、人类T细胞白血病（HTLV）I型和II型env基因产物，或嵌合包膜基因，其衍生自前述env基因或编码前述env基因产物的细胞质和跨膜结构域的嵌合包膜基因中的一个或多个以及针对在所需的靶细胞上的特异性表面分子的单克隆抗体的组合。
在包装过程中，包装质粒和表达LHR的逆转录病毒载体被瞬时地共转染进能够产生病毒的哺乳动物细胞的第一群体中，该细胞例如是人类胚胎肾细胞，例如293细胞（ATCCNo. CRL1573, ATCC, Rockville, Md.），从而生产高滴度的含有重组逆转录病毒的上清液。在本发明的另一种方法中，该细胞的瞬时转染的第一群体然后与哺乳动物靶细胞（例如人类淋巴细胞）共培养，从而以高效率转导具有外来基因的靶细胞。在本发明的另一种方法中，来自上述细胞的瞬时转染的第一群体的上清液与哺乳动物靶细胞（例如人类淋巴细胞或造血干细胞）一起孵育，从而以高效率转导具有外来基因的靶细胞。
在另一个方面，在能够产生病毒的哺乳动物细胞（例如人类胚胎肾细胞，例如293细胞）的第一群体中稳定地表达包装质粒。通过使用可选择的标记物进行共转染或者使用假型病毒进行感染，将逆转录病毒或慢病毒载体引入细胞中。在两种情况中，载体都发生整合。替代地，载体可以被引入游离基因地（episomally）维持的质粒中。生产了高滴度的含有重组逆转录病毒的上清液。
T细胞的激活和扩增。无论是在表达所需的CAR的T细胞的遗传修饰之前还是之后，都可以使用通常已知的方法来通常地激活和扩增T细胞，这些方法例如是在美国专利号6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7, 144,575；7,067,318；7, 172,869；7,232,566；7, 175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041中描述的方法。使用B7-4抗原离体刺激能够激活并扩增表达所选的CAR的T细胞亚群体。替代地，可以通过与LHR抗原相互作用，体内激活T细胞。
激活相关细胞的方法在本领域中是熟知的并且可以容易地适用至本申请；在以下例子中描述了示例性的方法。用于与本发明相关的用途的分离方法包括但不限于LifeTechnologies Dynabeads®系统激活和扩增试剂盒；BD Biosciences Phosflow™激活试剂盒、Miltenyi Biotec MACS™激活/扩增试剂盒、以及对相关细胞的激活部分特异性的其他商业上可获得的细胞试剂盒。可以通过使用在这样的试剂盒中可用的珠粒或其他试剂，激活或扩增免疫细胞的特定的亚群体。例如，α-CD3/α-CD28 Dynabeads®可以被用来激活和扩增分离的T细胞的群体。
如上所述，嵌合抗原受体包括抗原识别部分和细胞激活部分。本发明的方面涉及一种嵌合抗原受体（CAR），其包括对LHR特异的抗原结合结构域。
在一个实施方式中，本发明的CAR的特征在于其包括、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成：抗-促黄体激素受体（“LHR”）抗体的抗原结合结构域、CD8 α铰链结构域；CD8 α跨膜结构域；CD28和/或4-1BB共刺激信号传导区域；以及CD3ζ信号传导结构域。
在另一个实施方式中，抗LHR抗体的抗原结合结构域包括抗LHR重链可变区域和抗LHR轻链可变区域。本领域技术人员清楚的是，具有详细的元件的抗体也落入本发明的范围之内。
在一个方面，所述重链可变区域包括来自5F4-21、4A7-4、138-2和8B7-3的任何LHR抗体亚克隆的重链氨基酸序列、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成，并且所述轻链可变区域包括来自5F4-21、4A7-4、138-2和8B7-3的任何LHR抗体亚克隆的轻链氨基酸序列、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成，具体如下：
LHR抗体#5F4-21重链氨基酸序列，SEQ ID NO.: 1
EVQLQESGPDLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSGYGWHWIRQFPGNKLEWMGYIHYSGSTTYNPSLKSRISISRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYYCARSLRYWGQGTTLTVSS
LHR抗体#4A7-4重链氨基酸序列，SEQ ID NO.: 2
QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTTYGVSWVRQPPGKGLEWLGVIWGDGSTYYHSALISRLSISKDNSKSQVFLKLNSLQTDDTATYYCAEGSSLFAYWGQGTLVTVSA
LHR抗体#138-2重链氨基酸序列，SEQ ID NO.: 3
EVQLEQSGGGLVQPGGSRKLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPEKGLEWVAYISSGSSTLHYADTVKGRFTISRDNPKNTLFLQMKLPSLCYGLLGSRNLSHRLL
LHR抗体#8B7-3重链氨基酸序列，SEQ ID NO.: 4
QVKLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFTGYYMHWVKQSHGNILDWIGYIYPYNGVSSYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCARERGLYQLRAMDYWGQGTSVTVSS
LHR抗体#5F4-21轻链氨基酸序列，SEQ ID NO.: 5
DIVMTQTPAIMSASPGQKVTITCSASSSVNYMHWYQQKLGSSPKLWIYDTSKLAPGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAASYFCHQWSSYPYTFGSGTKLEIK
LHR抗体#4A7-4轻链氨基酸序列，SEQ ID NO: 6
DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRQSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDXAVYYCQNDYSYPLTFGSGTKLEIK
LHR抗体#138-2轻链氨基酸序列，SEQ ID NO: 7
DIVLTQTPSSLSASLGDTITITCHASQNINVWLFWYQQKPGNIPKLLIYKASNLLTGVPSRFSGSGSGTGFTLTISSLQPEDIATYYCQQGQSFPWTFGGGTKLEIK
LHR抗体#8B7-3轻链氨基酸序列，SEQ ID NO: 8
DIVLTQTPATLSVTPGDSVSLSCRASQSISNNLHWYQQKSHESPRLLIKNASQSISGIPSKFSGSGSGTDFTLRINSVETEDFGMYFCQQSNSWPYTFGSGTKLEIK。
在另一个方面，5F4-21、4A7-4、138-2和8B7-3的抗体亚克隆的重链和轻链氨基酸序列与ClustalW2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)对齐，从而使用Boxshade (http://www.ch.embnet.org/software/BOX_form.html)确定重链和轻链的共有序列。在图7中示出了对齐和共有序列分析结果。相应地，所述重链可变区域包括具有选自SEQ ID NO.:9-11的共有序列的多肽、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成，并且抗LHR轻链可变区域包括具有选自SEQ ID NO.: 12-15（或其等效物）的共有序列的多肽、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成，具体如下：
SEQ ID NO: 9
ISISRDNSK
SEQ ID NO: 10
VFLQLNSLTTEDTATYYCARGS
SEQ ID NO: 11
LRYWGQGTLVTV
SEQ ID NO: 12
SPGDKVTITCHASQSINN
SEQ ID NO: 13
YLHWYQQKPGNSPKLLIY
SEQ ID NO: 14
LSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSV
SEQ ID NO: 15
QSYPYTFGSGTKLEIK。
在一个方面，所述重链可变区域包括、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成：CDR1，其包括GYSITSGYG (SEQ ID NO.: 16)或其每个的等效物的氨基酸序列；和/或CDR2，其包括IHYSGST (SEQ ID NO.: 19)或其每个的等效物的氨基酸序列；和/或CDR3，其包括ARSLRY (SEQ ID NO.: 22)或其每个的等效物的氨基酸序列；和/或所述轻链可变区域包括、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成：CDR1，其包括SSVNY (SEQ ID NO.:25)或其每个的等效物的氨基酸序列；和/或CDR2，其包括DTS (SEQ ID NO:28)或其每个的等效物的氨基酸序列；和/或CDR3，其包括HQWSSYPYT (SEQ ID NO:31)或其每个的等效物的氨基酸序列。如本文所述，其他氨基酸可以被添加至羧基末端。
在另一个方面，所述重链可变区域包括、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成：CDR1，其包括GFSLTTYG (SEQ ID NO.: 17)或其每个的等效物的氨基酸序列；和/或CDR2，其包括IWGDGST (SEQ ID NO.: 20)或其每个的等效物的氨基酸序列；和/或CDR3，其包括AEGSSLFAY (SEQ ID NO.: 23)或其每个的等效物的氨基酸序列；和/或所述轻链可变区域包括、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成：CDR1，其包括QSLLNSGNQKNY(SEQ ID NO.:26)或其每个的等效物的氨基酸序列；和/或CDR2，其包括WAS (SEQ ID NO:29)或其每个的等效物的氨基酸序列；和/或CDR3，其包括QNDYSYPLT (SEQ ID NO:32)或其每个的等效物的氨基酸序列。如本文所述，其他氨基酸可以被添加至羧基末端。
在另一个方面，所述重链可变区域包括、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成：CDR1，其包括GYSFTGYY (SEQ ID NO.: 18)或其每个的等效物的氨基酸序列；和/或CDR2，其包括IYPYNGVS (SEQ ID NO.: 21)或其每个的等效物的氨基酸序列；和/或CDR3，其包括ARERGLYQLRAMDY (SEQ ID NO.: 24)或其每个的等效物的氨基酸序列；和/或所述轻链可变区域包括、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成：CDR1，其包括QSISNN (SEQID NO.:27)或其每个的等效物的氨基酸序列；和/或CDR2，其包括NAS (SEQ ID NO:30)或其每个的等效物的氨基酸序列；和/或CDR3，其包括QQSNSWPYT (SEQ ID NO:33)或其每个的等效物的氨基酸序列。如本文所述，其他氨基酸可以被添加至羧基末端。
在另一个实施方式中，所述CAR包括位于所述抗LHR重链可变区域和所述抗LHR轻链可变区域之间的接头多肽、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成。
在本发明的一些方面，所述LHR CAR进一步包括可检测的标记物或纯化标记物、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成。
在一些实施方式中，所述LHR CAR进一步包括衍生自针对MUC-16或间皮素的抗体的抗原结合结构域、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成。
在一个实施方式中，本发明提供了一种分离的核酸序列，其包括选自以下的多核苷酸中的一个或一个以上的核酸序列或其等效物、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成：LHR抗体#5F4-21重链DNA序列、LHR抗体#5F4-21轻链DNA序列、LHR抗体#4A7-4重链DNA序列、LHR抗体#4A7-4轻链DNA序列、LHR抗体#138-2重链DNA序列、LHR抗体#138-2轻链DNA序列、LHR抗体#8B7-3重链DNA序列、LHR抗体#8B7-3轻链DNA序列，具体如下：
LHR抗体#5F4-21重链DNA序列，SEQ ID NO: 34
GAAGTGCAGCTGCAGGAGTCAGGACCTGACCTGGTGAAACCTTCTCAGTCACTTTCACTCACCTGCACTGTCACCGGCTACTCCATCACCAGTGGTTATGGCTGGCACTGGATCCGGCAGTTTCCAGGAAACAAACTGGAGTGGATGGGCTACATACACTACAGTGGTAGCACTACCTACAACCCATCTCTCAAAAGTCGAATCTCTATCTCTCGAGACACATCCAAGAATCAGTTCTTCCTGCAGTTGAATTCTGTGACTACTGAGGACACAGCCACATATTACTGTGCAAGATCCTTACGCTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA
LHR抗体#5F4-21轻链DNA序列，SEQ ID NO: 35
GATATTGTGATGACACAGACTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGCAGAAAGTCACCATAACCTGCAGTGCCAGTTCAAGTGTAAATTACATGCACTGGTACCAGCAGAAGCTAGGATCCTCCCCCAAACTCTGGATTTATGACACATCCAAACTGGCTCCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCTCTTATTTCTGCCATCAGTGGAGTAGTTACCCATATACGTTCGGATCGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA
LHR抗体#4A7-4重链DNA序列，SEQ ID NO: 36
CAGGTGCAGCTGAAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCATCACATGCACTGTCTCAGGGTTCTCATTAACCACCTATGGTGTAAGCTGGGTTCGCCAGCCTCCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTGACGGGAGCACATATTATCATTCAGCTCTCATATCCAGACTGAGCATCAGCAAGGATAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAACTGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCACTTACTACTGTGCGGAAGGTAGTAGCCTCTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCG
LHR抗体#4A7-4轻链DNA序列，SEQ ID NO: 37
GACATTGTGATGACACAGTCTCCATCCTCCCTGACTGTGACAGCAGGAGAGAAGGTCACTATGAGCTGCAAGTCCAGTCAGAGTCTGTTAAACAGTGGAAATCAAAAGAACTACTTGACCTGGTACCAACAGAAACCAGGGCAGCCTCCTAAACTGTTGATCTACTGGGCATCCACTAGGCAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGAACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCNGGCAGTTTATTACTGTCAGAATGATTATAGTTATCCTCTCACGTTCGGATCGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA
LHR抗体#138-2重链DNA序列，SEQ ID NO: 38
GAGGTGCAGCTGGAGCAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGCAGCCTGGAGGGTCCCGGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGCTTTGGAATGCACTGGGTTCGTCAGGCTCCAGAGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGCATACATTAGTAGTGGCAGTAGTACCCTCCACTATGCAGACACAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATCCCAAGAACACCCTGTTCCTGCAAATGAAACTACCCTCACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTC
LHR抗体#138-2轻链DNA序列，SEQ ID NO: 39
GACATTGTGCTGACACAGACTCCATCCAGTCTGTCTGCATCCCTTGGAGACACAATTACCATCACTTGCCATGCCAGTCAGAACATTAATGTTTGGTTATTCTGGTACCAGCAGAAACCAGGAAATATTCCTAAACTTTTGATCTATAAGGCTTCCAATTTGCTCACAGGCGTCCCATCAAGGTTTAGTGGCAGTGGATCTGGAACAGGTTTCACATTAACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGACATTGCCACTTACTACTGTCAACAGGGTCAAAGTTTTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA
LHR抗体#8B7-3重链DNA序列，SEQ ID NO: 40
CAGGTTAAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGTTACTCATTCACTGGCTACTACATGCACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGAAATATCCTCGATTGGATTGGATATATTTATCCTTACAATGGTGTTTCTAGCTACAACCAGAAATTCAAGGGCAAGGCCACATTGACTGTAGACAAGTCCTCTAGCACAGCCTACATGGAGCTCCGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGAGAGAGGGGATTATATCAACTACGGGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA
LHR抗体#8B7-3轻链DNA序列，SEQ ID NO: 41
GACATTGTGCTGACACAGACTCCAGCCACCCTGTCTGTGACTCCAGGAGATAGCGTCAGTCTTTCCTGCAGGGCCAGCCAAAGTATTAGCAACAACCTACACTGGTATCAACAAAAATCACATGAGTCTCCAAGGCTTCTCATCAAGAATGCTTCCCAGTCCATCTCTGGGATCCCCTCCAAGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACTCTCAGAATCAACAGTGTGGAGACTGAAGATTTTGGAATGTATTTCTGTCAACAGAGTAACAGCTGGCCGTATACGTTCGGATCGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA。
在一些实施方式中，所述分离的核酸进一步包括位于抗LHR抗体的抗原结合结构域的上游的Kozak共有序列、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成。
在本发明的一些方面，所述分离的核酸序列进一步包括编码抗生素抗性标记物的多核苷酸、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成。
在另一个实施方式中，本发明提供了一种载体，其包括编码以上公开的抗LHR CAR多肽的分离的核酸序列或其补体、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成。在进一步的方面，所述多核苷酸可以被整合进载体。这样的非限制性的例子包括逆转录病毒载体、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体和腺相关病毒载体。
在一个实施方式中，本发明是一种分离的细胞，其包括、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成：编码如上所述的抗LHR CAR的外源性地添加的多核苷酸，单独地或与如上所述的载体一起；和/或如上所述的外源性地添加的抗LHR CAR。
在本发明的一个方面，所述分离的细胞可以是T细胞或自然杀伤（NK）细胞。
III. 使用方法
治疗应用。本发明的CAR T细胞可以被用来治疗肿瘤和癌症。本发明的CAR T细胞可以被单独地施用，或者与稀释剂、已知的抗癌疗法、和/或与其他组分（例如细胞因子或免疫刺激性的其他细胞群体）一起施用。
本发明的方法方面涉及用于在有需要的对象中抑制肿瘤的生长的方法、和/或用于治疗有需要的癌症患者的方法。在一些实施方式中，所述肿瘤是实体肿瘤。在一些实施方式中，所述肿瘤/癌症是甲状腺、乳腺、卵巢或前列腺肿瘤/癌症。在一些实施方式中，所述肿瘤或癌症表达或过度表达LHR。在一些实施方式中，这些方法包括向所述对象或患者施用有效量的所述分离的细胞、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成。在进一步的实施方式中，该分离的细胞包括LHR CAR。在更进一步的实施方式中，所述分离的细胞是T细胞或NK细胞。在一些实施方式中，所述分离的细胞对于被治疗的所述对象或患者来说是自体同源的。在进一步的方面，所述肿瘤表达LHR抗原，并且所述对象已经通过诊断（例如本文所述的一种）而被选择进行治疗。
本文公开的CAR细胞可以被单独地施用，或者与稀释剂、已知的抗癌治疗剂、和/或与其他组分（例如细胞因子或免疫刺激性的其他细胞群体）一起施用。它们可以是一线、二线、三线、四线、或进一步的疗法。它们可以与其他疗法一起组合。这些的非限制性的例子包括化学疗法或生物制剂。合适的治疗方案将由治疗医师或兽医确定。
可以以适于要被治疗或预防的疾病的方式，施用包括本发明的LHR CAR的药物组合物。虽然可以通过临床试验确定合适的剂量，但是施用的量和频率将由例如患者的情况、以及患者的疾病的种类和严重性等因素确定。
在另一个方面，本发明提供了一种在有需要的对象中抑制实体肿瘤的生长的方法，所述方法包括向所述对象施用有效量的抗LHR CAR T细胞的分离的细胞。在一个实施方式中，所述分离的T细胞对于正被治疗的所述对象来说是自体同源的。在另一个实施方式中，所述肿瘤是卵巢肿瘤或前列腺癌肿瘤。抑制肿瘤的生长的方法可以被使用至的对象包括但不限于人、狗、猫、马和其他物种。
在另一个方面，本发明提供了一种治疗有需要的癌症患者的方法，所述方法包括向该对象施用有效量的抗LHR T细胞的分离的细胞、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成。所述分离的T细胞对于正被治疗的所述对象来说可以是自体同源的。所述肿瘤是卵巢癌或前列腺癌。在一个实施方式中，被治疗癌症的所述对象是人类患者。
在一个实施方式中，本发明提供了一种用于确定患者是可能响应还是不可能响应抗LHR CAR疗法的方法，所述方法包括、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成：将从所述患者分离的肿瘤样品与有效量的抗LHR抗体接触，以及检测结合至所述肿瘤样品的任何抗体的存在，其中结合至所述肿瘤样品的抗体的存在表明所述患者可能响应抗LHRCAR疗法，而结合至所述肿瘤样品的抗体的不存在表明所述患者不可能响应抗LHR CAR疗法。在另一个实施方式中，所述方法进一步包括向被确定可能响应所述抗LHR CAR疗法的所述患者施用有效量的抗LHR CAR疗法。在该方法中，所述患者可以患有卵巢癌或前列腺癌。
本发明还提供了用于检测LHR的表达水平的诊断方法。在一个特定的方面，本发明提供了用于执行这些方法的试剂盒、以及用于进行本发明的方法的说明，例如收集组织和/或进行筛选、和/或分析结果。
在一个实施方式中，本发明提供了一种检测生物样品中的LHR的方法，所述方法括、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成：将所述样品与抗LHR抗体接触、或者与能够结合包括SEQ ID NO: 42和SEQ ID NO: 43的肽的抗原结合片段接触，以及检测由所述抗体或抗原结合片段结合至LHR而形成的复合物。
在一个方面，所述样品包括细胞样品或组织样品。
在一个方面，所述样品从被诊断患有、被怀疑患有、或有风险患有癌症的对象获得。
在另一个方面，所述癌症是前列腺癌或卵巢癌。在进一步的方面，所述癌症细胞或肿瘤细胞表达或过度表达LHR。
在一个方面，所述检测包括免疫组织化学（IHC）、蛋白免疫印迹、流式细胞术或ELISA中的一种或多种、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成。
在一个方面，所述方法包括从所述对象分离所述生物样品、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成。
在一个方面，所述对象是哺乳动物。
在另一个方面，所述哺乳动物选自：人类、动物、非人灵长类动物、狗、猫、羊、鼠、马或牛。
在一个实施方式中，本发明提供了一种检测从对象分离的样品中的病理性细胞的方法，所述方法包括、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成：（a）通过检测由抗LHR抗体或能够结合包括SEQ ID NO: 42和SEQ ID NO: 43的肽的抗原结合片段形成的复合物，检测来自所述对象的生物样品中的LHR的水平；以及（b）将在步骤（a）中观察到的LHR的水平与在对照生物样品中观察到的LHR的水平进行比较；其中当LHR的水平与在对照生物样品中观察到的相比提高的时候，检测到病理性细胞。
在一个方面，所述对象的生物样品包括从前列腺和卵巢分离的样品中的一个或多个、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成。
在另一个方面，所述检测包括免疫组织化学（IHC）、蛋白免疫印迹、流式细胞术或ELISA中的一种或多种、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成。
在一个方面，所述方法包括从所述对象分离所述生物样品、或替代地基本上由其组成、或进一步地由其组成。
在一个方面，所述对象是哺乳动物。
在另一个方面，所述哺乳动物选自：人类、动物、非人灵长类动物、狗、猫、羊、鼠、马或牛。
I. 载体
本发明的其他方面涉及组合物，其包括载体和在本文公开的实施方式中描述的产品中的一种或多种，例如包括HLA-G CAR的分离的细胞、分离的核酸、载体、任何抗-HLA-G抗体的分离的细胞或CAR细胞、抗-HLA-G。
简单来说，包括但不限于本发明的组合物中的任何一种的本发明的药物组合物，可以包括本文所述的靶细胞群体、以及一种或多种药学上或生理上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。这样的组合物可以包括：缓冲液，例如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸，例如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，例如EDTA或谷胱甘肽；佐剂（例如氢氧化铝）；以及防腐剂。本发明的组合物可以被配制用于口服、静脉内、局部、肠内和/或肠胃外给药。在一些实施方式中，本发明的组合物被配制用于静脉给药。
简单来说，包括但不限于本发明的组合物中的任何一种的本发明的药物组合物，可以包括本文所述的靶细胞群体、以及一种或多种药学上或生理上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。这样的组合物可以包括：缓冲液，例如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸，例如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，例如EDTA或谷胱甘肽；佐剂（例如氢氧化铝）；以及防腐剂。本发明的组合物优选被配制用于静脉给药。
可以以适于要被治疗或预防的疾病的方式，施用包括本发明的药物组合物。虽然可以通过临床试验确定合适的剂量，但是施用的量和频率将由例如患者的情况、以及患者的疾病的种类和严重性等因素确定。
以下实施例被提供来进行说明，而不限制本发明。
实施例
实施例1-小鼠抗LHR单克隆抗体的产生
通过使用被基因工程处理过的LHR-Fc反复免疫4周龄的BALB/c和NIH Swiss小鼠，产生针对LHR的富含赖氨酸的细胞外激素结合结构域的抗体。如在以下的图3所示，使用人类LHRG蛋白的前导序列和第一部分来产生在免疫和筛选方法中使用的LHR-Fc，以产生和识别高结合的抗体。因为先前已经显示了流式细胞术是用于CAR生产的功能性抗体的最好的预测方法，所以该方法被用来从在实验室进行的超过7种融合物中识别潜在的候选抗体。使用ES-2卵巢癌细胞系，在以下的图4中示出了杂交瘤阳性的典型流式细胞仪筛选，其通过使用涂布了LHR-Fc的培养板的初始ELISA筛选进行。如在该图中的杂交瘤8B7所示，仅仅少有的LHR杂交瘤被显示出通过流式细胞术产生高MFI。这些非常少的候选杂交瘤然后通过在9孔板中的稀释而被亚克隆，并且被扩增以在小瓶中进行冷冻。在通过流式细胞术进行的进一步筛选之后，选择特异性的亚克隆来使用2L容器（GRrex, 100L, Wolfson）进行大规模生产。然后将被过滤的上清液进行抗体纯化，其中使用tandon蛋白A或G以及在实验室中常规进行的离子交换色谱法。纯化之后，标记为8B7-3、5F4-21、5B1-1、2H11-37和138-2的5种抗体亚克隆被测序，以便于用于构建下述LHR CAR的单链基因的工程化。为了进行比较，通过流式细胞术在ES-2人卵巢癌细胞系上测试了所选的5中杂交瘤亚克隆，以证明它们的相对平均荧光强度（MIF）（图5）。
实施例2-检测到在卵巢癌中的LHR的表达的抗LHR单克隆抗体
总体假设是，可以使用LHR嵌合抗原受体修饰的T细胞有效且安全地治疗卵巢癌。作为靶标，LHR比其他靶标有显著优势，这是由于其在卵巢癌上的常见表达以及其缺少在正常人类组织上的表达。在体外和体内制造LHR CAR T细胞，以识别潜在的临床候选，进行后续的临床试验或与双靶标CAR修饰的T细胞一起使用。
构建和合成单链LHR抗体基因
通过MCLAB（South San Francisco, CA）对所述5种高结合的抗LHR抗体（8B7-3、5F4-21、5B1-1、2H11-37和138-2）的DNA序列进行测序。对五种抗体全部都进行测试，以确定哪种抗体在下文描述的测试中产生最有效的CAR。如在以下的图6所示，构建了第三代CAR载体，其包括以下串联基因：kozak共有序列；CD8信号肽；抗LHR重链可变区域；（甘氨酸4丝氨酸）3柔性多肽接头；各自的抗LHR轻链可变区域；CD8铰链和跨膜结构域；以及CD28、4-1BB和CD3ζ细胞内共刺激信号传导区域。铰链、跨膜和信号传导结构域DNA序列在本领域中是已知的（参见美国专利申请号20130287748 A1）。可以在含有β-内酰胺酶（“bla”）基因的pUC57载体骨架之内合成抗LHR CAR基因，其对载体宿主赋予氨苄青霉素抗性。pUC57载体序列参照GeneBank登录号Y14837，而β-内酰胺酶基因的序列被公开在列出的GeneBank登录号中。与列出的GeneBank登录号相关的序列通过引用的方式合并入本文中。
CAR基因亚克隆进慢病毒质粒
使用抗LHR质粒cDNA转化NovaBlue Singles™化学感受态的大肠杆菌细胞。在被转化的大肠杆菌细胞生长之后，纯化CAR质粒，并使用合适的限制酶进行消化，从而通过过夜T4DNA连接酶反应（New England Biosciences; Ipswich, MA）被插入进基于HIV-1的慢病毒载体，该载体包括HIV-1长末端重复（LTR）、包装信号（Ψ）、EF1α启动子、内部核糖体进入位点（IRES）和土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件（WPRE）。然后使用得到的含有抗LHR的慢病毒质粒，转化NovaBlue Singles™化学感受态的大肠杆菌细胞。
慢病毒颗粒的生产
在转染之前，在10 mL完全-Tet-DMEM中在4.0 × 106个细胞/100 mm组织培养物处理过的板上接种HEK293T细胞，并且在加湿的5% CO2培养器中在37oC下过夜孵育。一旦80-90%融合，则使用CAR-基因慢病毒质粒和含有形成慢病毒包膜和衣壳组分所需的基因的慢病毒包装质粒，共转染HEK293T细胞，以促进结合HEK293T细胞的含有质粒的纳米颗粒的形成。在37ºC下孵育被转染的HEK293T细胞培养物4小时之后，将转染培养基替换为10 mL新鲜的完全Tet DMEM。然后再孵育HEK293T细胞48小时，然后收获细胞上清液，并通过针对p24这一主要慢病毒衣壳蛋白的夹心ELISA测试慢病毒颗粒。将含有慢病毒的上清液进行等分，并储存在–80ºC，直至用于靶标CD4+和CD8+ T细胞的转导。
人类CD4+和CD8+外周血T细胞的纯化、活化和富集
回收使用Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare; Little Chalfont,Buckinghamshire, UK)进行密度梯度离心而富集的外周血单核细胞（PBMC），并通过离心进行洗涤，该洗涤程序使用含有0.5%牛血清白蛋白（BSA）和2mM EDTA的PBS。可以使用MACSCD4+ 和CD8+ MicroBeads (Miltenyi Biotec; San Diego, CA)试剂盒来分离这些人类T细胞亚群，其中使用磁激活的LS柱来主动选择CD4+ 和CD8+ T细胞。然后从磁性MACS分离器中移除磁结合的T细胞，从LS柱中冲刷，并在新鲜的完全培养基中洗涤。通过使用LifeTechnologies Acoustic Attune®细胞仪进行的流式细胞术评估CD4+ 和CD8+ T细胞的纯度，并在有需要的情况下通过在USC的流式细胞术核心设施进行的荧光活化细胞分选而进行富集。在合适的细胞培养容器中在补充有100 IU/mL IL-2的完全培养基中将CD4+ 和CD8+ T细胞维持1.0 × 106个细胞/mL的密度，其中α-CD3/α-CD28人类T细胞戴诺磁珠（LifeTechnologies; Carlsbad, CA）被加入来激活被培养的T细胞。在5% CO2培养器中在37ºC下孵育T细胞2天，然后使用CAR慢病毒颗粒进行转导。
CD4+ 和CD8+ T细胞的慢病毒转导
收集活化的T细胞，并通过Ficoll-Hypaque密度梯度离心或使用MACS死细胞移除试剂盒（Miltenyi Biotec; San Diego, CA），移除死细胞。在6孔板中，以1.0 × 106个细胞/mL完全培养基的密度将活化的T细胞进行铺板。对于各个孔，以各种感染复数（MOI）（例如1、5、10和50）将含有LHR CAR的慢病毒颗粒加入至细胞悬浮液。以4 µg/mL的终浓度加入聚凝胺，它是一种阳离子聚合物，通过促进慢病毒颗粒和靶细胞表面之间的相互作用而辅助转导。在32ºC下以800 × g将培养板离心1小时。在离心之后，对含有慢病毒的培养基进行抽吸，并将细胞丸粒重悬在具有100 IU/mL IL-2的新鲜完全培养基中。在37ºC将细胞置于5%CO2加湿的培养器中过夜。在转导之后三天，将细胞丸粒化并重悬在具有IL-2和400 µg/mL遗传霉素（G418硫酸盐）（Life Technologies; Carlsbad, CA）的新鲜完全培养基中。通过流式细胞术和southern印迹分析来评估LHR CAR修饰的T细胞，以证明转导过程成功。在体外和体内测试之前，使用FACS富集LHR CAR T细胞并1:1混合以进行体内研究。
通过钙黄素释放细胞毒性测定进行CAR功效的体外评估
收集LHR抗原阳性和阴性靶细胞，洗涤，并以1.0 x 106个细胞/mL的浓度重悬在完全培养基中。以15 µM的浓度将钙荧光素乙酰氧（AM）加入至靶细胞样品，然后在5% CO2加湿的培养器中在37oC下孵育30分钟。将被染色的阳性和阴性靶细胞洗涤两次，并通过离心重悬在完全培养基中，并以1.0 × 104个细胞/孔的密度将其加入至90孔板。以50:1、5:1和1:1的效应与靶细胞的比例，将LHR CAR T细胞加入至完全培养基中的板。悬浮在完全培养基和具有2% triton X-100的完全培养基中的被染色的靶细胞分别作为自发对照和最大释放对照。在365 x g和20ºC下将培养板离心2分钟，然后放置回培养器中3小时。然后将板离心10分钟，并将细胞上清液等分至黑色聚苯乙烯96孔板上的各个孔，并分别在485/20 nm和528/20 nm的激发和发射波长在Bio-Tek® Synergy™ HT酶标仪上评估荧光度。
通过Luminex生物测定进行的人细胞因子的定量
使用本领域中已知的标准程序，测量LHR CAR修饰的T细胞和LHR阳性和阴性肿瘤细胞系的上清液的细胞因子分泌，作为CAR T细胞激活的测量。将数据与单独的培养基进行比较，并且与使用未激活的人类T细胞的培养物进行比较，以识别背景活性。在孵育过程期间，随着时间推移测量IL-2、IFN-g、IL-12和其他相关细胞因子的浓度。
在两个异种移植卵巢癌模型中体内评估CAR T细胞功效
使用两个不同的人类卵巢细胞异种移植肿瘤模型，进一步体内评估LHR CAR T细胞。在第一个模型中，通过注射5 x 106个LHR阳性卵巢癌细胞系或LHR阴性卵巢癌细胞系，在裸小鼠中皮下地建立固体人类卵巢肿瘤。当肿瘤的直径达到0.5 cm时，使用1或3 x 107个人类T细胞（作为阴性对照），或者使用根据体外研究结果从最活性的LHR抗体构建的LHR CAR，静脉注射小鼠群（n=5）。然后使用卡尺3X /周测量肿瘤体积，并生成体积增长曲线，以证明实验处理对对照的效果。在修改自Chekmasova et al. (Chekmasova, A.A. et al. (2010)Clin. Cancer Res. 16:3594–606)的第二个肿瘤模型中，NOD/SCID/γ-链-/- 6-8周龄的雌性小鼠（Jackson Laboratories, Inc.）的群组（n=5），被腹腔内注射来自LHR阳性或阴性（对照）人类细胞系的3 x 106个GFP转染的肿瘤细胞。与在植入之后7天处理小鼠的Chekmasova et al. (Chekmasova, A.A. et al. (2010) Clin. Cancer Res. 16:3594–606)不同，直至植入后3周腹水形成才开始CAR T细胞治疗。在这时，腹腔内注射1或3 X 107LHR CAR T细胞制剂，并且此后每周通过荧光成像监控肿瘤体积。在合适的时间处死显示出肿瘤进展的小鼠，以减轻发病率。从数据中生成小鼠生存率的Kaplan Meier曲线，从而比较对照和实验处理群组的生存率。在处死时，使用人类特异性抗体和流式细胞术分析血液和腹水中存在的CAR T细胞。此外，通过Luminex珠粒测定（Life Technologies, Inc.）量化细胞因子分泌中的1型和2型细胞因子，作为CAR T细胞激活的测量。
双表达CAR修饰的T细胞的研究
为了提高LHR CAR修饰的T细胞的特异性，制备了具有MUC-CD或间皮素单链的双LHRCAR T细胞。已经在使用ERB/2和MUC1 (Wilkie, S. et al. (2012) J. Clin. Immunol.32:1059–1070)、间皮素和α-叶酸受体(Lanitis, E. et al. (2013) Cancer Immunol.Res. 1:45-53) 治疗乳腺癌、以及PSMA和PSCA治疗前列腺癌(Kloss, C.C. et al. (2013)Nat. Biotechnol. 31:71–75)中，成功地测试了双靶向CAR T细胞的原理。MUC16是一种粘蛋白家族成员，它在大部分卵巢癌上过度表达，并且是卵巢癌的进展和检测的已确立的替代血清标记物（CA125）。MUC16由CA125组成，它是会裂开的较大的结构域，并且是保留的结构域（MUC-CD），其包括细胞外片段、跨膜结构域和细胞质尾巴（Rao, T.D. et al. (2010)Appl. Immunohistochem. Mol. Morphology 18:462-472）。MUC16还在子宫、子宫内膜、输卵管、管、卵巢和腹部和胸腔的浆膜中以低水平表达。CAR修饰的MUC-CD靶向的T细胞在体外显示出针对人类卵巢癌细胞系的高效的MUC-CD特异性细胞溶解活性，并且成功根除在SCID-Beige小鼠中已确立的腹膜卵巢肿瘤（Chekmasova, A.A. et al. (2010) Clin.Cancer Res. 16:3594–606）。因此，MUC-CD是CAR疗法的可行的靶标，并且是双靶向CAR修饰的T细胞的优秀的选择，以降低潜在的中靶但偏离肿瘤的效应。MUC-CD和间皮素CAR修饰的T细胞都显示出是有效的，并且如果需要最佳的临床使用，与LHR一起可以提供更安全的替代方案。
数据和统计分析计划
对于体外钙黄绿素释放测定，使用单向ANOVA，然后进行适当的多重比较测试，测试是否在单向ANOVA中发现显著性（p < 0.05），从而比较裂解的靶细胞的百分比。为了比较在腹水异种移植模型中在用于实验的CAR T细胞和对照群组之间的生存率，构建了KaplanMeier曲线，并且使用log rank测试来测试显著性（p < 0.05）。对于皮下肿瘤模型，使用ANOVA来比较肿瘤大小曲线，然后进行适当的多重比较测试，测试是否在ANOVA中发现显著性（p < 0.05）。
表1.使用流式细胞仪测试三个潜在的细胞表面靶标（LHR、间皮素、MUC16）在九个人卵巢细胞系上的表达。
表2.LHR、MUC16和间皮素在人类卵巢肿瘤和组织微阵列的面板上的免疫组织化学表达。
表3.通过免疫组织化学测定的LHR、间皮素和MUC-16的正常组织反应性。
表4
表5 – 在正常组织中的LHR染色
实施例3-抗LHR CAR T细胞
CAR慢病毒构建体的构建
CAR由结合LHR的细胞外抗原结合部分或scFV组成。所述scFV通过CD8铰链区域被连接至细胞质信号传导区域，由CD8跨膜区域、以及来自CD28、4-1BB和CD3z的信号传导结构域组成。通过Genewiz基因合成服务（Piscataway, NJ）合成地合成包括信号传导结构域的整个CAR序列（图10）。纯化质粒，并使用合适的限制酶进行消化，从而通过过夜T4 DNA连接酶反应（New England Biosciences; Ipswich, MA）被插入进基于HIV-1的双顺反子慢病毒载体（pLVX-IRES-ZsGreen, Clontech, Signal Hill, CA），该载体包括HIV-1 5’和3’长末端重复（LTR）、包装信号（Ψ）、EF1α启动子、内部核糖体进入位点（IRES）、土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件（WPRE）、和猿病毒40起源（SV40）。然后使用得到的含有抗LHR的慢病毒质粒，转化NovaBlue Singles™化学感受态的大肠杆菌细胞。
慢病毒颗粒的生产
在转染之前，在补充有10%透析过的FCS的20 mL DMEM中在4.0 × 106个细胞/150 cm2组织培养物处理过的烧瓶接种HEK 293T细胞，并且在加湿的5% CO2培养器中在37oC下过夜孵育。一旦80-90%融合，则在37oC加湿的5% CO2培养器中在补充有1-%透析过的FCS的且不含青霉素/链霉素的20 mL DMEM中孵育HEK 293T细胞两小时。使用特异性的pLVX-CAR质粒和含有形成慢病毒包膜和衣壳组分所需的基因的慢病毒包装质粒，共转染HEK293T细胞。还加入了专有的反应缓冲液和聚合物，以促进结合HEK 293T细胞的含有质粒的纳米颗粒的形成。在37ºC下孵育被转染的HEK 293T细胞培养物24小时之后，将转染培养基替换为20 mL新鲜的完全DMEM。每24小时收集慢病毒上清液至三天，并且在4oC以1,250 rpm将上清液减速旋转5分钟，然后过滤灭菌并在4oC以20,000 g在超离心中离心2小时。将被浓缩的慢病毒重悬在含有7％海藻糖和1％BSA的PBS中，以作长期储存。将慢病毒进行等分，并储存在–80ºC，直至用于靶标CD4+和CD8+ T细胞的转导。24小时之后收获细胞上清液，并通过针对p24这一主要慢病毒衣壳蛋白的夹心ELISA测试慢病毒颗粒。转染效率由蛋白标记物ZsGreen的表达确定，其通过在荧光显微镜下的可视化而被估算在20%-50%之间。
人类CD4+和CD8+外周血T细胞的纯化、活化和富集
回收使用Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare; Little Chalfont,Buckinghamshire, UK)进行密度梯度离心而富集的外周血单核细胞（PBMC），并通过离心进行洗涤，该离心使用含有0.5%牛血清白蛋白（BSA）和2mM EDTA的PBS。使用T细胞富集试剂盒（Stem Cell Technologies）来磁性地分离这些人类T细胞亚群，其中对于CD4+ 和CD8+ T细胞使用阳性选择。通过使用Life Technologies Acoustic Attune®细胞仪进行的流式细胞术评估CD4+ 和CD8+ T细胞的纯度，并且通过荧光活化细胞分选而进行富集。在合适的细胞培养容器中在补充有100 IU/mL IL-2的完全50% Click's培养基/50% RPMI-1640培养基中将1:1混合的CD4+ 和CD8+ T细胞维持1.0 × 106个细胞/mL的密度，其中α-CD3/α-CD28人类T细胞激活珠粒（Stem Cell Technologies）被加入来激活被培养的T细胞。在5% CO2培养器中在37ºC下孵育T细胞2天，然后使用CAR慢病毒颗粒进行转导。
CD4+ 和CD8+ T细胞的慢病毒转导
收集活化的T细胞，并通过Ficoll-Hypaque密度梯度离心或使用MACS死细胞移除试剂盒（Miltenyi Biotec; San Diego, CA），移除死细胞。在6孔板中，以1.0 × 106个细胞/mL完全培养基的密度将活化的T细胞进行铺板。使用补充有Lentiblast（一种细胞转染辅助试剂）（Oz Biosciences, San Diego, CA）的慢病毒颗粒转导细胞。在加湿的5% CO2培养器中在37oC下孵育被转导的细胞24小时。然后通过离心和更换培养基，使细胞丸粒化，然后加入T细胞激活珠粒（Stem Cell Technologies, San Diego, CA）。
mRNA表达的RT-PCR
使用Nucleospin RNA试剂盒（Clontech, Signal Hill, CA）分离来自被转导的T细胞的mRNA。使用OneTaq One Step RNA试剂盒（New England Biolabs, Boston, MA）运行RT-PCR，其中使用以下引物：5' CGCCTGTGATATCTACATCTGGGC 3' (SEQ ID NO: 73)和5'ATCGGCAGCTACAGCCATCT 3' (SEQ ID NO: 74)。在1%琼脂糖凝胶上运行样品。
细胞毒性测定
使用乳酸脱氢酶（LDH）细胞毒性试剂盒（Thermo Scientific, Carlsbad, CA），确定CAR T细胞的细胞毒性。收集被激活的T细胞，并使用合适的上述的CAR慢病毒构建体来转导1 x 106个细胞。使用T细胞激活珠粒（Stem Cell Technologies, San Diego,CA）来激活细胞两天，然后进行细胞毒性测试。根据厂家的说明来确定靶细胞的最佳数目。为了测试，在5% CO2培养器中在37oC下在96孔板中一式三份地将合适的靶细胞进行铺板24小时，然后以20:1、10:1、5:1和1:1的比率加入被激活的CAR T细胞，并在5% CO2培养器中在37oC下孵育24小时。然后在37oC下裂解细胞45分钟，并以1,250 rpm离心5分钟。将上清液转移至新鲜的96孔板，然后加入反应混合物30分钟。使用停止溶液来停止反应，并在450nm对培养板进行读数，使用在650 nm的吸光度来修正读数。
体内肿瘤消退测试
使用SKOV3注射Foxn1缺陷小鼠，它是表达LHR的卵巢癌细胞系。使用0.2 mL接种器将在200ul的磷酸盐缓冲盐水中的2 x 106个细胞注射进小鼠的左侧腹部。使用αCD3/CD28激活复合物（Stem Cell Technologies, San Diego, CA）激活幼稚T细胞2天。然后使用上述的pLVX-LHR-CAR慢病毒颗粒，转染被激活的T细胞，并激活2天。在肿瘤接种之后第7天，将2.5x 106个被激活的表达LHR CAR的T细胞静脉内注射入小鼠。使用游标卡尺每周两次评估肿瘤尺寸，并计算体积。
LHR CAR T细胞的细胞毒性
使用SKOV3卵巢癌细胞系作为靶细胞，检验LHR CAR-T细胞的细胞溶解活性。FACS 分析显示SKOV3表达LHR。以20:1、10:1、5:1和1:1的效应细胞与靶细胞的比率，将CAR T细胞加入至SKOV3。孵育24小时之后，在10:1的比率时，LHR CAR T细胞有效地裂解SKOV3，裂解率为30%（图11）。相比之下，在所使用的效应细胞的任何比率下，未诱导的T细胞都没有显示出任何细胞毒活性。
LHR CAR的RNA表达
使用分离自转导有LHR CAR的T细胞的mRNA的RT-PCR显示了嵌合CAR的mRNA表达（图12）。进行RT-PCR所使用的引物跨过CD8铰链和4-1BB信号传导结构域之间的嵌合CAR，因此对于CAR的表达是高度特异的。
等效物
除非另有定义，否则本文所用的所有的技术和科学的术语都具有如本发明的所属领域中的普通技术人员中的一个通常所理解的相同的含义。
可以在缺少在本文没有具体公开的任何元素或限制的情况下，适当地实施本文说明性地描述的本技术。因此，例如，术语“包括”、“包含”、“含有”等应该被广泛且没有限制地理解。此外，本文采用的术语和表达已经被用作描述而非限制，在这些术语和表达的使用中，没有意图排除所示和所述特征或其部分的任何等效物，但是应该认识到，在本发明技术的范围之内各种变化都是可能的。
因此，应该理解的是，在此提供的材料、方法和例子是优选的方面的代表，是示例性的，并且不旨在作为对本技术的范围的限制。
本文广泛地和一般地描述了本技术。落入一般性描述之内的较窄的种类和亚属分组中的每一个也都形成本技术的一部分。这包括了具有从该属中移除任何主题的附带条件或负面限制的本技术的一般性描述，无论被删除的材料是否在本文中被具体描述。
此外，在以马库什组描述本技术的特征或方面的情况中，本领域技术人员将认识到，还借此以该马库什组中的任何单独成员或成员的亚组描述了本技术。
在本文中提及的所有公开文献、专利申请、专利和其他参考文献，其整体都以引用的方式明确地合并入本文中，至如同每个都单独地以引用的方式合并的相同程度。如发生冲突，以本说明书（包括定义）为准。
在以下权利要求中阐述了其他方面。

Claims (69)

1.一种分离的抗体，其包括重链（HC）免疫球蛋白可变结构域序列和轻链（LC）免疫球蛋白可变结构域序列，其中所述抗体结合至促黄体激素受体（LHR）的表位。
2.根据权利要求1所述的抗体，其中所述HC包括以下中的一个或多个：
（a）CDR1，其包括GYSITSGYG (SEQ ID NO.: 16)或其每个的等效物的氨基酸序列；和/或
（b）CDR2，其包括IHYSGST (SEQ ID NO.: 19)或其每个的等效物的氨基酸序列；和/或
（c）CDR3，其包括ARSLRY (SEQ ID NO.: 22)或其每个的等效物的氨基酸序列；和/或
所述LC包括以下中的一个或多个：
（a）CDR1，其包括SSVNY (SEQ ID NO.:25)或其每个的等效物的氨基酸序列；和/或
（b）CDR2，其包括DTS (SEQ ID NO:28)或其每个的等效物的氨基酸序列；和/或
（c）CDR3，其包括HQWSSYPYT (SEQ ID NO:31)或其每个的等效物的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的抗体，其中所述HC包括以下中的一个或多个：
（a）CDR1，其包括GFSLTTYG (SEQ ID NO.: 17)或其每个的等效物的氨基酸序列；和/或
（b）CDR2，其包括IWGDGST (SEQ ID NO.: 20)或其每个的等效物的氨基酸序列；和/或
（c）CDR3，其包括AEGSSLFAY (SEQ ID NO.: 23)或其每个的等效物的氨基酸序列；和/或
所述LC包括以下中的一个或多个：
（a）CDR1，其包括QSLLNSGNQKNY (SEQ ID NO.:26)或其每个的等效物的氨基酸序列；和/或
（b）CDR2，其包括WAS (SEQ ID NO:29)或其每个的等效物的氨基酸序列；和/或
（c）CDR3，其包括QNDYSYPLT (SEQ ID NO:32)或其每个的等效物的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的抗体，其中所述HC包括以下中的一个或多个：
（a）CDR1，其包括GYSFTGYY (SEQ ID NO.: 18)或其每个的等效物的氨基酸序列；和/或
（b）CDR2，其包括IYPYNGVS (SEQ ID NO.: 21)或其每个的等效物的氨基酸序列；和/或
（c）CDR3，其包括ARERGLYQLRAMDY (SEQ ID NO.: 24)或其每个的等效物的氨基酸序列；和/或
所述LC包括以下中的一个或多个：
（a）CDR1，其包括QSISNN (SEQ ID NO.:27)或其每个的等效物的氨基酸序列；和/或
（b）CDR2，其包括NAS (SEQ ID NO:30)或其每个的等效物的氨基酸序列；和/或
（c）CDR3，其包括QQSNSWPYT (SEQ ID NO:33)或其每个的等效物的氨基酸序列。
5.根据权利要求1所述的抗体，其中所述HC可变区域包括选自SEQ ID NO.:1-4或其每个的等效物的多肽。
6.根据权利要求1所述的抗体，其中所述LC可变区域包括选自SEQ ID NO.:5-8或其每个的等效物的多肽。
7.根据权利要求1所述的抗体，其中所述HC可变区域包括具有选自SEQ ID NO.:9-11或其每个的等效物的共有序列的多肽。
8.根据权利要求1所述的抗体，其中所述LC可变区域包括具有选自SEQ ID NO.:12-15或其每个的等效物的共有序列的多肽。
9.根据权利要求1-8的任一项所述的抗体，其中所述抗体选自单克隆抗体、嵌合抗体或人源化抗体。
10.根据权利要求1-9的任一项所述的抗体，其中所述抗体包括选自Fab、F(ab’)2、Fab’、scFv和Fv的抗原结合片段。
11.根据权利要求1-10的任一项所述的抗体，其中所述抗体是针对SEQ ID NO: 42或其等效物的LHR片段而产生的。
12.根据权利要求1-10的任一项所述的抗体，其中所述抗体是针对SEQ ID NO: 43或其等效物的LHR片段而产生的。
13.根据权利要求2-8、11和12的任一项所述的抗体，其中等效物包括与该多肽具有至少80%的氨基酸同一性的多肽，或者由在严格条件下与编码该多肽的多核苷酸的补体杂交的多核苷酸编码的多肽。
14.一种嵌合抗原受体（CAR），其包括：（a）抗-促黄体激素受体（“LHR”）抗体的抗原结合结构域，（b）CD8 α铰链结构域；（c）CD8 α跨膜结构域；（d）4-1BB共刺激信号传导区域；以及（e）CD3ζ信号传导结构域。
15.根据权利要求14所述的CAR，其中所述抗LHR抗体的抗原结合结构域包括抗LHR重链（HC）可变区域和抗LHR轻链（LC）可变区域。
16.根据权利要求15所述的CAR，其进一步包括位于所述抗LHR HC可变区域和所述抗LHR LC可变区域之间的接头多肽。
17.根据权利要求15或16所述的CAR，其中所述HC包括：
（a）CDR1，其包括GYSITSGYG (SEQ ID NO.: 16)或其每个的等效物的氨基酸序列；和/或
（b）CDR2，其包括IHYSGST (SEQ ID NO.: 19)或其每个的等效物的氨基酸序列；和/或
（c）CDR3，其包括ARSLRY (SEQ ID NO.: 22)或其每个的等效物的氨基酸序列；和/或
所述LC包括
（a）CDR1，其包括SSVNY (SEQ ID NO.:25)或其每个的等效物的氨基酸序列；和/或
（b）CDR2，其包括DTS (SEQ ID NO:28)或其每个的等效物的氨基酸序列；和/或
（c）CDR3，其包括HQWSSYPYT (SEQ ID NO:31)或其每个的等效物的氨基酸序列。
18.根据权利要求15或16所述的CAR，其中所述HC包括
（a）CDR1，其包括GFSLTTYG (SEQ ID NO.: 17)或其每个的等效物的氨基酸序列；和/或
（b）CDR2，其包括IWGDGST (SEQ ID NO.: 20)或其每个的等效物的氨基酸序列；和/或
（c）CDR3，其包括AEGSSLFAY (SEQ ID NO.: 23)或其每个的等效物的氨基酸序列；和/或
所述LC包括
（a）CDR1，其包括QSLLNSGNQKNY (SEQ ID NO.:26)或其每个的等效物的氨基酸序列；和/或
（b）CDR2，其包括WAS (SEQ ID NO:29)或其每个的等效物的氨基酸序列；和/或
（c）CDR3，其包括QNDYSYPLT (SEQ ID NO:32)或其每个的等效物的氨基酸序列。
19.根据权利要求15或16所述的CAR，其中所述HC包括
（a）CDR1，其包括GYSFTGYY (SEQ ID NO.: 18)或其每个的等效物的氨基酸序列；和/或
（b）CDR2，其包括IYPYNGVS (SEQ ID NO.: 21)或其每个的等效物的氨基酸序列；和/或
（c）CDR3，其包括ARERGLYQLRAMDY (SEQ ID NO.: 24)或其每个的等效物的氨基酸序列；和/或
所述LC包括
（a）CDR1，其包括QSISNN (SEQ ID NO.:27)或其每个的等效物的氨基酸序列；和/或
（b）CDR2，其包括NAS (SEQ ID NO:30)或其每个的等效物的氨基酸序列；和/或
（c）CDR3，其包括QQSNSWPYT (SEQ ID NO:33)或其每个的等效物的氨基酸序列。
20.根据权利要求15或16所述的CAR，其中所述抗LHR重链可变区域包括选自SEQ IDNO.:1-4或其每个的等效物的多肽。
21.根据权利要求15或16所述的CAR，其中所述抗LHR轻链可变区域包括选自SEQ IDNO.:5-8或其每个的等效物的多肽。
22.根据权利要求15或16所述的CAR，其中所述抗LHR重链可变区域包括具有选自SEQID NO.:9-11或其每个的等效物的共有序列的多肽。
23.根据权利要求15或16所述的CAR，其中所述抗LHR轻链可变区域包括具有选自SEQID NO.:12-15或其每个的等效物的共有序列的多肽。
24.根据权利要求17至23所述的CAR，其中等效物包括与该多肽具有至少80%的氨基酸同一性的多肽，或者由在严格条件下与编码该多肽的多核苷酸的补体杂交的多核苷酸编码的多肽。
25.根据权利要求14-24的任一项所述的CAR，其进一步包括可检测标记物或纯化标记物。
26.根据权利要求14-25的任一项所述的CAR，其进一步包括衍生自针对MUC-16的抗体或针对间皮素的抗体的抗原结合结构域。
27.一种分离的核酸序列，其编码权利要求1-13的任一项所述的抗体、或权利要求14至26的任一项所述的CAR。
28.根据权利要求27所述的分离的核酸序列，其中所述核酸序列包括选自SEQ ID NO.:34-41的任一个或其每个的等效物的序列。
29.根据权利要求27和28所述的分离的核酸序列，其进一步包括位于所述抗LHR抗体的抗原结合结构域的上游的Kozak共有序列、或增强子。
30.根据权利要求27至29的任一项所述的分离的核酸序列，其进一步包括抗生素抗性的多核苷酸。
31.一种载体，其包括权利要求27至30的任一项所述的分离的核酸序列。
32.根据权利要求31所述的载体，其中所述载体是质粒。
33.根据权利要求31所述的载体，其中所述载体选自逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体和腺相关病毒载体。
34.一种分离的细胞，其包括权利要求14至26的任一项所述的CAR；和/或权利要求27至30的任一项所述的分离的核酸序列；和/或权利要求31至33的任一项所述的载体。
35.根据权利要求34所述的分离的细胞，其中所述细胞是T细胞。
36.根据权利要求34所述的分离的细胞，所述分离的细胞是自然杀伤（NK）细胞。
37.一种组合物，其包括载体和以下中的一个或多个：权利要求1至13的任一项所述的抗体；和/或权利要求14至26的任一项所述的CAR；和/或权利要求27至30的任一项所述的分离的核酸序列；和/或权利要求31-33的任一项所述的载体；和/或权利要求34-36的任一项所述的分离的细胞。
38.根据权利要求37所述的组合物，其进一步包括能够结合包括SEQ ID NO: 42 和SEQID NO: 43的肽的抗原结合片段。
39.根据权利要求38所述的组合物，其中所述肽是LHR蛋白。
40.根据权利要求38或39所述的组合物，其中所述肽与细胞相关。
41.根据权利要求38或39所述的组合物，其中所述肽被结合至固体支撑物。
42.根据权利要求38或39所述的组合物，其中所述肽被置于溶液中。
43.根据权利要求38或39所述的组合物，其中所述肽与基质相关。
44.一种生产抗LHR CAR T细胞的方法，其包括：
（i）将编码权利要求14至26的任一项所述的CAR的核酸序列引入T细胞的群体；以及
（ii）选择已经使用步骤（i）的所述核酸序列成功转导的T细胞的亚群体，从而生产抗LHR CAR T细胞。
45.一种在有需要的对象中抑制肿瘤的生长的方法，所述方法包括向所述对象施用有效量的权利要求35所述的T细胞的分离的细胞。
46.根据权利要求45所述的方法，其中分离的T细胞对于正被治疗的所述对象来说是自体同源的。
47.根据权利要求45和46所述的方法，其中所述肿瘤表达或过度表达LHR。
48.根据权利要求45和46所述的方法，其中所述肿瘤是卵巢肿瘤或前列腺癌肿瘤。
49.一种治疗有需要的癌症患者的方法，所述方法包括向该对象施用有效量的权利要求35所述的T细胞的分离的细胞。
50.根据权利要求49所述的方法，其中分离的T细胞对于被治疗的所述对象来说是自体同源的的。
51.根据权利要求49和50所述的方法，其中所述肿瘤是卵巢癌或前列腺癌。
52.根据权利要求44至51的任一项所述的方法，其中所述对象包括人类、动物、非人灵长类动物、狗、猫、羊、鼠、马或牛。
53.一种用于确定患者是可能响应还是不可能响应抗LHR CAR疗法的方法，所述方法包括将从所述患者分离的肿瘤样品与有效量的权利要求1至13的任一项所述的抗体接触，以及检测结合至所述肿瘤样品的任何抗体的存在，其中结合至所述肿瘤样品的抗体的存在表明所述患者可能响应所述抗LHR CAR疗法，而结合至所述肿瘤样品的抗体的不存在表明所述患者不可能响应所述抗LHR CAR疗法。
54.根据权利要求53所述的方法，所述方法进一步包括向被确定可能响应所述抗LHRCAR疗法的患者施用有效量的权利要求14至26所述的抗LHR CAR。
55.根据权利要求53或54所述的方法，其中所述患者患有卵巢癌或前列腺癌。
56.一种用于检测LHR的试剂盒，其包括权利要求1至13的任一项所述的抗体、以及使用说明。
57.根据权利要求56所述的试剂盒，其中所述抗体能够结合生物样品中的LHR多肽。
58.根据权利要求56或57所述的试剂盒，所述试剂盒进一步包括用于确定生物样品中的LHR多肽的量的装置，以及用于将所述样品中的LHR多肽的量与标准进行比较的装置。
59.一种检测生物样品中的LHR的方法，所述方法包括将所述样品与权利要求1-13的任一项所述的抗体接触、或者与能够结合包括SEQ ID NO: 42和SEQ ID NO: 43的肽的抗原结合片段接触，以及检测由所述抗体或所述抗原结合片段结合至LHR而形成的复合物。
60.根据权利要求59所述的方法，其中所述样品包括细胞样品或组织样品。
61.根据权利要求59所述的方法，其中所述样品从被诊断患有、被怀疑患有、或有风险患有癌症的对象获得。
62.根据权利要求61所述的方法，其中所述癌症是前列腺癌或卵巢癌。
63.根据权利要求59所述的方法，其中所述检测包括免疫组织化学（IHC）、蛋白免疫印迹、流式细胞术或ELISA中的一种或多种。
64.一种检测从对象分离的样品中的病理性细胞的方法，所述方法包括
（a）通过检测由权利要求1-13的任一项所述的抗体或能够结合包括SEQ ID NO: 42和SEQ ID NO: 43的肽的抗原结合片段形成的复合物，检测来自所述对象的生物样品中的LHR的水平；以及
（b）将在步骤（a）中观察到的LHR的水平与在对照生物样品中观察到的LHR的水平进行比较；
其中当LHR的水平与在对照生物样品中观察到的相比提高的时候，检测到病理性细胞。
65.根据权利要求64所述的方法，其中所述对象的生物样品包括从前列腺和卵巢分离的样品中的一个或多个。
66.根据权利要求64所述的方法，其中所述检测包括免疫组织化学（IHC）、蛋白免疫印迹、流式细胞术或ELISA中的一种或多种。
67.根据权利要求64-66的任一项所述的方法，其进一步包括从所述对象分离所述生物样品。
68.根据权利要求67所述的方法，其中所述对象是哺乳动物。
69.根据权利要求68所述的方法，其中所述哺乳动物选自：人类、动物、非人灵长类动物、狗、猫、羊、鼠、马或牛。
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