CN114106142B - 一种黄鳝生长催乳素抗血清及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种黄鳝生长催乳素抗血清及其制备方法与应用，该抗血清通过构建含有SEQ ID NO:4所示核酸分子的表达质粒，转染细菌获得重组菌，使用异丙基‑β‑D‑硫代半乳糖苷诱导表达，分离纯化得到黄鳝Sml抗原，然后将黄鳝Sml抗原常规免疫试验动物，三次免疫后收集血清，即得黄鳝生长催乳素抗血清。该方法操作简单、制备高效，制备的得到的抗血清效价高，可达到可达1：4096000以上，而且特异性强，不会受到其他垂体激素的干扰。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种黄鳝生长催乳素抗血清及其制备方法与应用。
背景技术
鱼类垂体是重要的内分泌器官，分泌多种蛋白激素，调控生长发育过程。生长催乳素(Sml)是垂体分泌的一种蛋白激素，在鱼类代谢、生长和繁殖过程中都发挥重要作用。黄鳝是中国重要的特色淡水养殖鱼类之一，年产量可达30多万吨，具有极高的经济价值，但相关技术中，对于黄鳝生长调控的相关试剂却极为稀少。
相关技术中，对于鱼类Sml抗血清制备相关的报道极少。传统的方法主要是通过分离纯化垂体中Sml蛋白，然后作为抗原，免疫兔子等获得Sml抗血清。但是，从垂体匀浆中分离Sml蛋白步骤繁琐，难度较大，获取率低，而且不同鱼类之间存在同源性差异较大的问题，尤其是对于黄鳝，其与鲑鱼等常规鱼种的同源性不足80％，序列上存在较大的差异，理化性质也有所不同，因此，不能将制备得到的抗血清有效的沿用至特定鱼种的使用上。
因此，开发一种能够用于检测黄鳝生长催乳素合成和分泌的方法，从而进一步黄鳝生长的控制技术，其对于黄鳝养殖产业具有极为重要的意义。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种黄鳝生长催乳素抗血清及其制备方法与应用，该抗血清具有极好的特异性，能够特异性与黄鳝生长催乳素结合，而不受到其他垂体蛋白激素的干扰，而且效价可达1：4096000以上。
本发明的第一个方面，提供黄鳝生长催乳素的抗原多肽。
根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述抗原多肽的氨基酸序列为：
IPLVCKEEQGSLTRCPSISQEKLLDRVIQHAELIYRVSEESCSLFEEMFVPFPMRLQRNQAGYACITKELPIPSSKSEIQQMSDKWLLHSVLMLVRSWIEPLVYLQTTLDLYDDASEVLLNKTKWVSEKLLSLEQGVMVLIKKMLDEGMLPTTYSEQGLLHNDGQPEMLESVMRDYTLLSCFKKDAHKMETFLKLLKCRQTDIYNCA(SEQ ID NO.1)。
垂体生长催乳素是分泌性蛋白，新生肽含有信号肽，信号肽切除后变为成熟肽。新生肽和成熟肽两者理化性质和分子量接近，难以分离。因此，如果利用常规方法从垂体分离纯化的生长催乳素会是成熟肽和新生肽的混合物，制备的抗血清中也可能存在针对信号肽的抗体，从而降低抗血清的特异性。
本发明的第二个方面，提供编码本发明第一个方面所述抗原多肽的核酸分子。
根据本发明的第二个方面，在本发明的一些实施方式中，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
所述核酸分子片段大小为621bp，经测序鉴定为黄鳝sml基因的第73bp～693bp片段(序列编号XM_020600369.1)。
本发明的第三个方面，提供本发明第二个方面所述核酸分子的制备方法，包括：使用引物对扩增黄鳝生长催乳素基因。
根据本发明的第三个方面，在本发明的一些实施方式中，所述引物对的核苷酸序列为：
上游引物F：
下游引物R：
在上游引物F中标记有下划线且加粗部分为Nco I的酶切位点，而在下游引物R中标记有下划线且加粗部分为BamH I酶切位点。
当然，本领域技术人员也可以根据所述核酸分子的具体核苷酸序列采用其他方法合成或制备得到。
根据本发明的第三个方面，在本发明的一些实施方式中，所述扩增包括但不限于使用高保真PCR扩增。
在本发明的一些优选实施方式中，所述高保真PCR扩增体系为：
| 组分 | 用量 |
| 上游引物F(10μM) | 1μL |
| 下游引物R(10μM) | 1μL |
| 黄鳝垂体组织cDNA | 1μL |
| AccuPrime Taq DNA聚合酶(5U/μL) | 0.1μL |
| Taq DNA聚合酶反应缓冲液(10×) | 2.5μL |
| H2O | 19.4μL |
| 总计 | 25μL |
扩增程序为：94℃预变性1min后PCR扩增30循环，循环参数为94℃,30s；56℃,30s；68℃,1min。
本发明的第四个方面，提供本发明第一个方面所述抗原多肽在下述(1)～(4)任一项中的应用；
(1)制备黄鳝生长催乳素抗血清；
(2)制备黄鳝生长催乳素抗体；
(3)黄鳝生长催乳素定性或定量检测；
(4)制备黄鳝生长催乳素定性或定量检测试剂。
根据本发明的第四个方面，在本发明的一些实施方式中，(2)中所述抗体包括单克隆抗体和多克隆抗体。
本发明的第五个方面，提供本发明第二个方面所述核酸分子在下述(1)～(6)任一项中的应用；
(1)制备黄鳝生长催乳素抗原；
(2)制备含有本发明第二个方面所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组菌；
(3)制备黄鳝生长催乳素抗血清；
(4)制备黄鳝生长催乳素抗体；
(5)黄鳝生长催乳素定性或定量检测；
(6)制备黄鳝生长催乳素定性或定量检测试剂。
根据本发明的第五个方面，在本发明的一些实施方式中，(1)中所述抗原包括使用蛋白载体偶联后得到的抗原。
根据本发明的第五个方面，在本发明的一些实施方式中，(2)中所述表达盒、重组载体或重组菌具体包括：
(1)含有本发明第二个方面所述核酸分子的表达盒；
(2)含有本发明第二个方面所述核酸分子的重组载体；
(3)含有(1)的重组载体；
(4)含有(1)的重组菌；
(5)含有(2)的重组菌；
(6)含有(3)的重组菌。
根据本发明的第五个方面，在本发明的一些实施方式中，(4)中所述抗体包括单克隆抗体和多克隆抗体。
本发明的第六个方面，提供含有本发明第二个方面所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组菌。
根据本发明的第六个方面，在本发明的一些实施方式中，所述表达盒、重组载体或重组菌具体包括：
(1)含有本发明第二个方面所述核酸分子的表达盒；
(2)含有本发明第二个方面所述核酸分子的重组载体；
(3)含有(1)的重组载体；
(4)含有(1)的重组菌；
(5)含有(2)的重组菌；
(6)含有(3)的重组菌。
本发明的第七个方面，提供一种制备黄鳝生长催乳素抗血清的方法，包括如下步骤：
使用权利要求1所述的抗原多肽免疫动物。
根据本发明的第七个方面，在本发明的一些实施方式中，所述制备黄鳝生长催乳素抗血清的方法具体为：
(1)构建含有SEQ ID NO:4所示核酸分子的表达质粒，转染细菌获得重组菌，使用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达，分离纯化得到黄鳝Sml抗原；
(2)将黄鳝Sml抗原常规免疫试验动物，三次免疫后收集血清，即得黄鳝生长催乳素抗血清。
制备黄鳝Sml抗血清将有助于分析Sml合成和调节，探讨其对黄鳝及其它相关鱼类生长代谢调控机制，为养殖业的可持续发展提供支撑。
采用基因工程方法制备黄鳝Sml成熟肽作为抗原，可以避免信号肽对抗血清特异性的潜在影响。另外，基因工程方法制备黄鳝Sml抗原产量高，分离纯化方便。
根据本发明的第七个方面，在本发明的一些实施方式中，所述表达质粒的图谱如说明书附图图1所示。
根据本发明的第七个方面，在本发明的一些实施方式中，所述试验动物包括但不限于小鼠和兔。
本发明的第八个方面，提供一种含有本发明第七个方面所述方法制备得到的黄鳝生长催乳素抗血清的产品。
根据本发明的第八个方面，在本发明的一些实施方式中，所述产品包括但不限于：
(1)黄鳝生长催乳素抗体试剂；
(2)黄鳝生长催乳素定性或定量检测试剂。
本发明的有益效果是：
1.本发明提供了一种制备黄鳝Sml抗原和抗血清的方法，该方法具有简单、方便、高效等特点，所获得抗血清特异性高，将可用于黄鳝Sml表达和功能研究，并推动相关研究从mRNA表达层面进入蛋白质表达层面，有助于阐明黄鳝生长发育的调节机制，为黄鳝养殖产业可持续发展提供理论支撑，具有显著社会效益。
2.本发明中制备的得到的抗血清效价高，可达到可达1：4096000以上，而且特异性强，不会受到其他垂体激素的干扰。
附图说明
图1为本发明实施例中的重组质粒pET-32a-eSml的图谱。
图2为本发明实施例中的重组黄鳝Sml抗原诱导表达结果电泳图，其中，泳道1为蛋白分子量Marker；泳道2为IPTG诱导前重组菌中总蛋白；泳道3为IPTG诱导后重组菌中总蛋白；泳道4为IPTG诱导后重组菌可溶性蛋白；泳道5为IPTG诱导后重组菌不溶性蛋白(诱导表达的重组黄鳝Sml抗原在重组菌中主要以可溶状态存在)。
图3为本发明实施例中的重组黄鳝Sml抗原纯化结果电泳图，其中，泳道1为蛋白分子量Marker；泳道2为纯化的黄鳝Sml抗原。
图4为ELISA法测定本发明实施例中的兔抗黄鳝Sml抗血清的效价对比图。
图5为Western blot检测本发明实施例中的兔抗黄鳝Sml抗血清与黄鳝垂体蛋白激素的交叉反应，样品分别为：Sml，生长催乳素；Prl，催乳素；Gh，生长激素；Fshb，促滤泡激素beta亚基；Lhb，促黄体激素beta亚基；Tshb，促甲状腺激素beta亚基；Cga，垂体糖蛋白激素alpha亚基。
图6为使用本发明实施例中的兔抗黄鳝Sml抗血清对雄性黄鳝垂体中Sml免疫组化分析光镜图，其中，A为Sml阳性细胞在垂体中的分布情况；B和C分别为A中虚线框部分的放大图；D为使用Sml抗原封闭抗血清后的光镜图；标尺均为50μm。
具体实施方式
为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。
所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。
本发明实施例中的黄鳝均购自广州黄沙水产品交易市场。
抗原的制备
1)黄鳝垂体组织RNA的获得：
取黄鳝(雌性，10条)的垂体组织，直接放入装有0.5mL Trizol试剂的1.5mL的离心管中，使用1mL带针注射器(0.45×16；广州花山医用塑料厂)充分匀浆1～2min。室温放置5min，使其充分裂解。12000rpm离心5min，取上清，按200μL氯仿/mL Trizol的量加入氯仿，振荡混匀后室温放置15min。4℃，12000rpm离心15min。吸取上层水相，加入与水相等体积的异丙醇，混匀，室温放置5～10min。4℃，12000rpm离心10min，除去上清，即得RNA。
2)cDNA的制备：
使用反转录试剂盒(Revert-Aid First Strand cDNA Synthesis Kit，购自Thermo Scientific,USA)，参考试剂盒使用说明书中的操作，将步骤1)获得的黄鳝垂体组织RNA反转录为黄鳝垂体组织cDNA。
3)重组质粒的构建：
以步骤2)获得的黄鳝垂体组织cDNA为模板，参考表1所示体系进行高保真PCR扩增。
表1扩增体系中各组分含量关系
| 组分 | 用量 |
| 上游引物F(10μM) | 1μL |
| 下游引物R(10μM) | 1μL |
| 黄鳝垂体组织cDNA | 1μL |
| AccuPrime Taq DNA聚合酶(5U/μL) | 0.1μL |
| Taq DNA聚合酶反应缓冲液(10×) | 2.5μL |
| H2O | 19.4μL |
| 总计 | 25μL |
扩增程序为：94℃预变性1min后PCR扩增30循环，循环参数为94℃,30s；56℃,30s；68℃,1min。
其中，上游引物F和下游引物R的核苷酸序列具体为：
上游引物F：
下游引物R：
在上游引物F中标记有下划线且加粗部分为Nco I的酶切位点，而在下游引物R中标记有下划线且加粗部分为BamH I酶切位点。
扩增产物片段大小为621bp，经测序鉴定为黄鳝sml基因的第73bp～693bp片段(序列编号XM_020600369.1)。扩增产物的具体核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示：
5’-ATCCCATTAGTCTGTAAGGAGGAGCAGGGCAGCCTCACCCGCTGCCCCTCCATCTCCCAAGAGAAGCTTCTAGACCGAGTCATCCAGCATGCTGAGCTCATCTACCGTGTCTCAGAAGAATCATGCTCTTTGTTTGAGGAGATGTTTGTCCCCTTTCCAATGCGACTCCAGAGGAATCAGGCTGGCTATGCATGCATCACCAAAGAATTACCCATCCCTAGCTCCAAAAGTGAAATCCAACAGATGTCTGACAAATGGTTGCTCCACTCTGTGCTCATGCTGGTCCGGTCATGGATCGAGCCTTTGGTTTACCTGCAGACTACGCTAGATCTCTATGATGATGCTTCTGAAGTGCTGCTCAACAAGACCAAGTGGGTCTCTGAGAAACTACTCAGTCTGGAGCAAGGGGTGATGGTCCTTATCAAAAAGATGCTGGATGAGGGAATGCTACCCACAACCTACAGTGAGCAAGGCCTATTACATAATGATGGGCAGCCAGAGATGCTGGAATCTGTTATGAGAGACTATACCTTACTCAGCTGTTTCAAGAAAGATGCCCATAAGATGGAGACCTTCCTCAAGCTTCTCAAGTGTCGACAAACTGACATATATAACTGTGCA-3’(SEQ ID NO：4)；
IPLVCKEEQGSLTRCPSISQEKLLDRVIQHAELIYRVSEESCSLFEEMFVPFPMRLQRNQAGYACITKELPIPSSKSEIQQMSDKWLLHSVLMLVRSWIEPLVYLQTTLDLYDDASEVLLNKTKWVSEKLLSLEQGVMVLIKKMLDEGMLPTTYSEQGLLHNDGQPEMLESVMRDYTLLSCFKKDAHKMETFLKLLKCRQTDIYNCA(SEQ ID NO：1)。
使用Nco I、BamH I酶切上述PCR扩增产物以及pET-32a载体，胶回收酶切产物，将双酶切PCR产物连接到双酶切的pET-32a载体(购自广州苏玛生物科技有限公司)，构建成重组表达质粒pET-32a-eSml，并测序确认其是否构建成功。
构建得到的重组表达质粒pET-32a-eSml的图谱如图1所示。在T7启动子的驱动下，表达质粒所表达的目标蛋白在N端含有一个由109个氨基酸构成的硫氧还蛋白(Trx)。
4)抗原的获得：
将步骤3)构建成功的重组质粒pET-32a-eSml通过本领域常规手段转染至大肠杆菌BL21(DE3)(购自广州苏玛生物科技有限公司)中。大肠杆菌BL21(DE3)用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体(如pET系列)的基因。T7噬菌体RNA聚合酶位于λ噬菌体DE3区，该区整合于BL21的染色体上，因此，该菌可适用于表达非毒性蛋白。
将转染完成的重组菌在37℃、250rpm摇菌条件下培养3～5h，至OD600为0.6～0.8，然后向培养基中加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达3h。
收集诱导表达的重组蛋白。表达得到的重组蛋白在大肠杆菌的细胞质内以可溶物的形式存在，因此，需要进行分离提取。具体提取方法为：12000rpm离心细菌培养基，收集细菌(沉淀)，用STE缓冲液(0.1M NaCl，10mM Tris×HCl，1mM EDTA，pH8.0)洗涤细菌沉淀2次，然后用0.1M Tris-HCl(pH 8.0)重悬，冰浴超声(300W,开3s停3s，共10min)破碎，再次离心(10000×g)10min，取上清即为重组蛋白粗提液。使用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对重组蛋白粗提液进行电泳分离，电泳完毕后剥离凝胶，放入0.5M KCl染色液中1～3min，可见特异的白色目的条带。将白色目的条带切出，放入蒸馏水浸泡至无色，然后放入装有100～200μl蒸馏水的1.5mL离心管中，4℃过夜析出蛋白，回收目的蛋白，即得纯化的黄鳝Sml抗原。
对提取前后的目的蛋白进行电泳，结果如图2和3所示。
图2给出了重组黄鳝Sml抗原诱导表达前后的电泳图，其中，在该电泳图中，泳道1为蛋白分子量Marker，用于对照；泳道2为IPTG诱导前从重组菌中提取得到的总蛋白；泳道3为IPTG诱导后从重组菌中提取得到的总蛋白；泳道4为IPTG诱导后重组菌可溶性蛋白；泳道5为IPTG诱导后重组菌不溶性蛋白。可以发现，在IPTG诱导后，重组菌能够表达黄鳝Sml抗原，说明重组菌构建成功，且能够稳定表达黄鳝Sml抗原。基因重组黄鳝Sml抗原以可溶状态存在于重组菌中。
图3则为纯化重组黄鳝Sml抗原与蛋白分子量Marker的对比电泳图，纯化后的重组黄鳝Sml抗原的分子量约为40kDa，与理论中预期的黄鳝Sml抗原的分子量一致，说明上述实施例中的方法能够稳定且正确的表达出黄鳝Sml抗原。
黄鳝生长催乳素抗血清的制备
取300μL上述实施例中得到的纯化黄鳝Sml抗原(1μg/μL)，加入等体积弗氏完全佐剂，充分混匀后进行振荡乳化(需完全乳化，乳化产物滴在水面上不扩散)，得到初次免疫抗原。将初次免疫抗原通过背部皮内多点注射新西兰大白兔(广东省医学实验动物中心)，每点约50μL，以进行初次免疫。在初次免疫后第3天进行再次免疫，抗原准备过程、抗原注射量及免疫方法同首次免疫。在初次免疫后第28天进行第三次免疫，取300μL上述实施例中得到的纯化黄鳝Sml抗原(1μg/μL)，加入等体积弗氏不完全佐剂充分乳化，通过背部皮内多点注射新西兰大白兔(广东省医学实验动物中心)，每点约50μL。
在初次免疫后第35天，进行兔耳缘静脉取血，离心分离血浆，酶联免疫分析法测定抗血清效价。
结果如图4所示。
可以发现，以上述实施例中制备得到的纯化黄鳝Sml抗原制备得到的黄鳝生长催乳素抗血清具有极高的效价，可以达到1：4096000以上，具有极好的黄鳝Sml抗性。
取抗血清效价高的试验兔进行颈动脉取血，4℃静置分离抗血清，分装抗血清至1.5mL离心管，-80℃冻存；或冷冻干燥抗血清至干粉，-20℃或-80℃保存。
黄鳝生长催乳素抗血清的特异性测试
在本实施例中，为了验证上述实施例中制备得到的黄鳝生长催乳素抗血清(兔抗黄鳝Sml抗血清)的特异性，采用本领域中常规的Western blot方法对兔抗黄鳝Sml抗血清与黄鳝各种垂体蛋白激素的交叉反应进行检测。
其中，Western blot方法中，一抗均为上述实施例中制备得到的黄鳝生长催乳素抗血清(1：1000)，二抗为羊抗兔IgG(1：5000)，以超敏ECL化学发光试剂(购自碧云天)进行检测。垂体蛋白激素包括生长催乳素(Sml)，催乳素(Prl)，生长激素(Gh)，促滤泡激素beta亚基(Fshb)，促黄体激素beta亚基(Lhb)，促甲状腺激素beta亚基(Tshb)，垂体糖蛋白激素alpha亚基(Cga)。
检测结果如图5所示。
可以发现，在使用上述实施例中制备得到的黄鳝生长催乳素抗血清的交叉反应中只能检测到的Sml抗原蛋白，大小约为40kDa(预测大小为40kDa)，且该抗血清与垂体其它基因重组激素蛋白没有交叉反应。说明上述实施例中制备得到的黄鳝生长催乳素抗血清仅对黄鳝各种垂体蛋白激素中的生长催乳素(Sml)具有特异性。
为了进一步验证，发明人又使用了Sml抗原封闭黄鳝生长催乳素抗血清后再次进行Western blot，发现目的条带消失，说明所制备的兔抗黄鳝Sml抗血清具有较高的特异性。
黄鳝生长催乳素抗血清的实际使用效果
为了验证上述实施例中制备得到的黄鳝生长催乳素抗血清的实际使用效果，发明人使用该抗血清对雄性黄鳝垂体切片进行免疫组织化学分析。在免疫组织化学分析中，一抗均为上述实施例中制备得到的黄鳝生长催乳素抗血清(1：1500)，二抗为羊抗兔IgG(1：1000)，显色方法采用二氨基联苯胺法(DAB)显色法。
结果如图6所示。
可以发现，Sml阳性信号分布在垂体吻端靠近神经垂体的腺垂体细胞上(图6A、B和C)，用Sml抗原封闭上述黄鳝生长催乳素抗血清后，阳性信号消失(图6D)，说明该抗血清特异性好，可用于定位黄鳝垂体中合成和分泌Sml的细胞。此外，也间接说明了上述黄鳝生长催乳素抗血清还可以用于免疫组织化学方法和Western blot方法对垂体中Sml浓度进行定量，也可以进一步用上述黄鳝生长催乳素抗血清建立酶联免疫测定方法，分析黄鳝血液、黄鳝垂体碎片培养液、黄鳝垂体原代细胞培养液中Sml浓度。
发明人还基于上述方法对小鼠进行免疫，获得的黄鳝生长催乳素抗血清(小鼠抗黄鳝Sml抗血清)也具有相同的使用效果。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中山大学
<120> 一种黄鳝生长催乳素抗血清及其制备方法与应用
<130>
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 207
<212> PRT
<213> Monopterus albus
<400> 1
Ile Pro Leu Val Cys Lys Glu Glu Gln Gly Ser Leu Thr Arg Cys Pro
1 5 10 15
Ser Ile Ser Gln Glu Lys Leu Leu Asp Arg Val Ile Gln His Ala Glu
20 25 30
Leu Ile Tyr Arg Val Ser Glu Glu Ser Cys Ser Leu Phe Glu Glu Met
35 40 45
Phe Val Pro Phe Pro Met Arg Leu Gln Arg Asn Gln Ala Gly Tyr Ala
50 55 60
Cys Ile Thr Lys Glu Leu Pro Ile Pro Ser Ser Lys Ser Glu Ile Gln
65 70 75 80
Gln Met Ser Asp Lys Trp Leu Leu His Ser Val Leu Met Leu Val Arg
85 90 95
Ser Trp Ile Glu Pro Leu Val Tyr Leu Gln Thr Thr Leu Asp Leu Tyr
100 105 110
Asp Asp Ala Ser Glu Val Leu Leu Asn Lys Thr Lys Trp Val Ser Glu
115 120 125
Lys Leu Leu Ser Leu Glu Gln Gly Val Met Val Leu Ile Lys Lys Met
130 135 140
Leu Asp Glu Gly Met Leu Pro Thr Thr Tyr Ser Glu Gln Gly Leu Leu
145 150 155 160
His Asn Asp Gly Gln Pro Glu Met Leu Glu Ser Val Met Arg Asp Tyr
165 170 175
Thr Leu Leu Ser Cys Phe Lys Lys Asp Ala His Lys Met Glu Thr Phe
180 185 190
Leu Lys Leu Leu Lys Cys Arg Gln Thr Asp Ile Tyr Asn Cys Ala
195 200 205
<210> 2
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gagaccatgg gcatcccatt agtctgtaag gaggagc 37
<210> 3
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gagaggatcc ctatgcacag ttatatatgt cagtttgt 38
<210> 4
<211> 621
<212> DNA
<213> Monopterus albus
<400> 4
atcccattag tctgtaagga ggagcagggc agcctcaccc gctgcccctc catctcccaa 60
gagaagcttc tagaccgagt catccagcat gctgagctca tctaccgtgt ctcagaagaa 120
tcatgctctt tgtttgagga gatgtttgtc ccctttccaa tgcgactcca gaggaatcag 180
gctggctatg catgcatcac caaagaatta cccatcccta gctccaaaag tgaaatccaa 240
cagatgtctg acaaatggtt gctccactct gtgctcatgc tggtccggtc atggatcgag 300
cctttggttt acctgcagac tacgctagat ctctatgatg atgcttctga agtgctgctc 360
aacaagacca agtgggtctc tgagaaacta ctcagtctgg agcaaggggt gatggtcctt 420
atcaaaaaga tgctggatga gggaatgcta cccacaacct acagtgagca aggcctatta 480
cataatgatg ggcagccaga gatgctggaa tctgttatga gagactatac cttactcagc 540
tgtttcaaga aagatgccca taagatggag accttcctca agcttctcaa gtgtcgacaa 600
actgacatat ataactgtgc a 621
Claims (2)
1.一种制备黄鳝生长催乳素抗血清的方法，包括以下步骤：
（1）构建含有抗原多肽的表达质粒，转染细菌获得重组菌，使用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达，分离纯化得到黄鳝生长催乳素抗原，所述抗原多肽的核苷酸序列如SEQ IDNO:4所示；
（2）将纯化的黄鳝生长催乳素抗原免疫试验动物，三次免疫后收集血清，即得黄鳝生长催乳素抗血清；所述动物为新西兰大白兔或小鼠；
所述步骤（2）具体如下：将300μL黄鳝生长催乳素抗原加入等体积弗氏完全佐剂，充分混匀后进行振荡乳化，得到初次免疫抗原；将初次免疫抗原通过背部皮内多点注射新西兰大白兔，每点约50μL，以进行初次免疫；在初次免疫后第3天进行再次免疫，抗原准备过程、抗原注射量及免疫方法同首次免疫；在初次免疫后第28天进行第三次免疫，取300μL纯化黄鳝生长催乳素抗原，加入等体积弗氏不完全佐剂充分乳化，通过背部皮内多点注射新西兰大白兔，每点约50μL；在初次免疫后第35天，收集血清，即得到黄鳝生长催乳素抗血清；所述黄鳝生长催乳素抗原的浓度为1μg/μL；
所述SEQ ID NO:4所示核酸序列使用如下引物对通过PCR扩增得到；
所述引物对的核苷酸序列为：
上游引物F：5’-GAGACCATGGGCATCCCATTAGTCTGTAAGGAGGAGC-3’；
下游引物R：5’-GAGAGGATCCCTATGCACAGTTATATATGTCAGTTTGT-3’。
2.权利要求1所述的黄鳝生长催乳素抗血清在下述（1）或（2）中的应用：
（1）制备黄鳝生长催乳素抗体；
（2）制备黄鳝生长催乳素定性或定量检测试剂。
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Also Published As
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