CN114350633B

CN114350633B - 一种dna甲基转移酶1的抗原肽及其多克隆抗体

Info

Publication number: CN114350633B
Application number: CN202111661755.2A
Authority: CN
Inventors: 邱亚峰; 马志永; 朱琳; 魏建超; 刘珂; 李宗杰; 李蓓蓓; 邵东华
Original assignee: Shanghai Veteromaru Research Institute Caas China Animal Health And Epidemiology Center Shanghan Branch Center
Current assignee: Shanghai Veteromaru Research Institute Caas China Animal Health And Epidemiology Center Shanghan Branch Center
Priority date: 2021-12-31
Filing date: 2021-12-31
Publication date: 2024-04-26
Anticipated expiration: 2041-12-31
Also published as: CN114350633A

Abstract

本发明具体涉及一种DNA甲基转移酶1的抗原肽及其多克隆抗体，属于分子克隆技术领域。本发明根据NCBI公布的预测的猪DNMT1序列，通过RT‑PCR扩增得到了猪的DNMT1基因，利用真核表达系统构建了pFlag14‑DNMT1(cloned)重组质粒，从猪DNMT1蛋白序列开始分析，构建能够得到符合后续检测要求的猪DNMT1蛋白合成肽多克隆抗体。本发明公开多克隆抗体检测灵敏度高、特异性强，适用于人、猪、猴、牛、犬源DNMT1蛋白的快速检测和相关研究。

Description

一种DNA甲基转移酶1的抗原肽及其多克隆抗体

技术领域

本发明属于分子克隆技术领域，具体涉及一种DNA甲基转移酶1的抗原肽及其多克隆抗体、制备方法及应用。

背景技术

DNA甲基转移酶1(DNA methyltransferase 1，DNMT1)是哺乳动物基因组表观遗传修饰中DNA甲基化的关键基因，其编码的蛋白是一种分子量大且功能复杂的酶，具有多种调控功能，参与机体发育过程中干细胞生长、细胞增殖、器官发育、衰老和肿瘤发生等多个生物学过程。一旦生物体内Dnmt活性发生变化，将会引起基因组甲基化水平异常，使5'-CG-3'核苷酸岛局部甲基化水平升高和基因组整体甲基化水平降低，从而导致基因组不稳定，如染色体不稳定、可移动遗传因子激活、原癌基因表达和抑癌基因不表达等。因此分析Dnmt的活性对疾病的预防、治疗和癌症发生机制的研究有着十分重要的运用价值。

中国发明专利CN201210202062.1公开了O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶活性的检测方法，即首次采用生物发光共振能量转移技术和化学发光技术免疫检测O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶活性：将链亲和素-荧光素酶融合蛋白与生物素标记的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶在0～40℃孵育30～60min，再加入荧光染料标记的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶抗体，0～40℃孵育30～60min，然后再加入荧光素底物，4～30℃下静置5～30min，检测670nm处的发光强度，进而计算获得O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶活性。

中国发明专利CN201510595903.3公开了一种基于链置换放大和DNAzyme放大的检测DNA甲基转移酶活性的方法。设计一种三功能双链DNA探针，利用DNA甲基转移酶特异性地识别该三功能双链DNA探针发生甲基化，HpaII限制性内切酶特异性地切割残余的未甲基化的双链DNA，甲基化的双链DNA引发链置换反应，释放大量的8–17DNAzyme，8–17DNAzyme催化大量发夹型分子信标底物的切割，引发显著的荧光增强。

上述检测方法均使用了荧光染料的方式进行了DNA甲基转移酶1的定量分析，但存在特异性较低，分析过程复杂的缺点，因此有必要开发一种能够用来快速检测的抗体，以便通过抗体进一步研究DNMT1的功能。有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明根据NCBI公布的预测的猪DNMT1序列，通过RT-PCR扩增得到了猪的DNMT1基因，利用真核表达系统构建了pFlag14-DNMT1(cloned)重组质粒，从猪DNMT1蛋白序列开始分析，构建能够得到符合后续检测要求的猪DNMT1蛋白合成肽多克隆抗体，为DNMT1蛋白功能及作用机制的研究奠定重要的材料基础，为DNMT1在家畜方面的研究提供了基础资料。

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下:

本发明请求保护一种DNA甲基转移酶1的抗原肽，所述DNA甲基转移酶1的抗原肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.l所示，其对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。该核苷酸序列根据GenBank中的猪DNMT1基因预测序列(XM_021082029.1)上进行选择，猪DNMT1基因预测序列的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明还请求保护一种由所述DNA甲基转移酶1的抗原肽免疫新西兰大白兔制备得到的多克隆抗体。

本发明还请求保护一种抗DNMT1多克隆抗体的制备方法，包括如下步骤:

a)制备合成肽抗原：人工合成SEQ ID NO.l所示的氨基酸序列，使用KLH载体蛋白进行偶联纯化，得到合成肽抗原；

b)免疫新西兰大白兔：使用生理盐水对抗原肽稀释，按照1:1比例与弗氏佐剂混合乳化后免疫新西兰大白兔，获得包含多克隆抗体的血清；

c)多克隆抗体纯化：采用Protein G亲和层析法对多克隆抗体进行纯化，得到多克隆抗体。

优选地，所述抗DNMT1多克隆抗体的制备方法中，所述步骤b)中免疫方式为皮下注射或肌肉注射，抗原肽的每次免疫量500μg。

优选地，所述抗DNMT1多克隆抗体的制备方法中，所述步骤b)中免疫中每隔14天进行一次加强免疫，免疫六次后的第7天静脉或心脏采血获得包含多克隆抗体的血清。

优选地，所述抗DNMT1多克隆抗体的制备方法中，所述步骤b)中包括抗体效价检测，通过间接ELISA法检测抗体的效价和灵敏度，所述的多克隆抗体的效价大于1:50k。该效价能保证多克隆抗体可以用于DNMT1的Western Blot检测，保证抗体质量。所述抗DNMT1多克隆抗体用含20％甘油的PBS缓冲液储存。

一种所述抗DNMT1多克隆抗体的应用，其用于检测哺乳动物细胞DNMT1蛋白表达检测，优选地，所述的多克隆抗体用于人、猪、猴、牛、犬源的DNMT1蛋白的表达检测，更优选地，所述的哺乳动物细胞为HEK 293T细胞、Marc 145细胞、PAM细胞、MDBK细胞、MDCK细胞。

与现有技术相比，本发明提供一种猪DNMT1合成肽段、多克隆抗体、制备方法及应用，具有以下有益效果:

本发明的有益效果在于:得到满足后续实验需求的DNMT1多克隆抗体，能用于人、猪、猴、牛、犬源DNMT1蛋白的表达检测，并用于鉴别诊断不同品种猪DNMT1蛋白，为DNMT1蛋白功能及作用机制的研究奠定重要的材料基础。

附图说明

为更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实例中利用RT-PCR方法从肺泡巨噬细胞中扩增得到的猪DNMT1基因鉴定结果(5102bp)；其中，M:DNA Maker；泳道1:DNMT1基因片段；

图2为重组质粒pFlag14-DNMT1(cloned)表达的蛋白结果图；

图3为兔抗多克隆抗体交叉反应性验证的蛋白结果图；

图4为所选合成肽序列在不同种属来源DNMT1中的氨基酸同源性比对结果图；

图5为兔抗多克隆抗体对不同品种猪的DNMT1反应性验证的蛋白结果图；

图6为兔抗多克隆抗体对不同猪源细胞的DNMT1反应性验证的蛋白结果图；

图7为不同猪源细胞通过RT-PCR方法扩增的合成肽基因序列测序结果图。

具体实施方式

为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法:所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1猪DNMT1基因的扩增以及真核表达载体的构建

根据GenBank中的猪DNMT1基因预测序列(XM_021082029.1)设计引物，将RNA反转录成cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增，片段条带大小与预期大小一致。

利用BamHI和HindIII将pCMV-Flag14质粒和DNMT1基因分别进行双酶切并进行连接，随后通过测序验证证实己成功构建pFlag14-DNMT1(cloned)重组质粒，其中所述的猪DNMT1基因预测序列的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。图1为本发明实例中利用RT-PCR方法从肺泡巨噬细胞中扩增得到的猪DNMT1基因鉴定结果(5102bp)；其中，M:DNA Maker；泳道1:DNMT1基因片段。

实施例2猪DNMT1多克隆抗体的制备

选取了如SEQ ID NO.l所示，氨基酸序列为SSPVKRPRKEPVDED的多肽片段作为多克隆抗体的抗原肽，偶联在KLH载体蛋白上纯化，之后用生理盐水对抗原肽稀释，并按照1:1比例与弗氏佐剂混合乳化后开始免疫新西兰大白兔，正式免疫前需静脉采血作为阴性对照，免疫方式选用皮下注射或肌肉注射，总量为500ug抗原，每隔14天将抗原肽和弗氏不完全佐剂加强免疫一次，免疫六次后的7天静脉或心脏采血获得多抗血清。通过间接ELISA方法确定多克隆抗体的效价大于1:50k，该效价能保证多克隆抗体可以用于DNMT1的Western Blot检测，保证抗体质量。

实施例3多克隆抗体的特异性分析

为了验证得到的DNMT1蛋白合成肽多克隆抗体是否能够用于后续Western Blot实验，利用得到的DNMT1蛋白合成肽多克隆抗体检测pFlag-DNMT1(cloned)质粒在HEK 293T细胞中的过表达情况，通过使用鼠抗Flag抗体以及兔抗DNMT1多克隆抗体作为一抗进行检测，图2为重组质粒pFlag14-DNMT1(cloned)表达的蛋白结果图，如图3所示，两种抗体都能够显示出过表达的DNMT1蛋白条带，且与预期大小一致。

实施例4多克隆抗体的交叉反应性分析

为了验证得到的DNMT1蛋白合成肽多克隆抗体是否能够检测不同种属来源细胞的DNMT1蛋白，利用得到的DNMT1蛋白合成肽多克隆抗体检测293T(人)、Marc145(猴)、PAM(猪)、N2A(小鼠)、BHK(仓鼠)、MDBK(牛)、MDCK(犬)细胞中的内源性DNMT1蛋白表达情况，通过使用兔抗DNMT1多克隆抗体作为一抗进行检测，检测结果如图3所示。

结果显示，除N2A(小鼠)和BHK(仓鼠)细胞外，其余细胞都能够显示出DNMT1蛋白条带。此结果与图4所示合成肽序列在不同种属来源DNMT1中的氨基酸同源性比对结果是相符的，经过比对，小鼠和仓鼠中合成肽序列与所选合成肽序列分别有5个氨基酸的差异。

实施例5不同品种猪的DNMT1反应性验证

为了验证由NCBI上报道的猪DNMT1基因序列(NM_001032355.1)所构成的pFlag-DNMT1(NM_001032355.1)质粒是否能够利用得到的DNMT1蛋白合成肽多克隆抗体进行检测，我们将pFlag-DNMT1(NM_001032355.1)质粒和pFlag-DNMT1(cloned)质粒分别转染BHK细胞，通过使用鼠抗Flag抗体以及兔抗DNMT1多克隆抗体作为一抗进行检测，如图5所示，兔抗DNMT1多克隆抗体能够显示出pFlag-DNMT1(cloned)质粒过表达的DNMT1蛋白条带，但不能显示出pFlag-DNMT1(NM_001032355.1)质粒过表达的DNMT1蛋白条带。

实施例6不同猪源细胞的DNMT1反应性验证

为了验证得到的DNMT1蛋白合成肽多克隆抗体是否能够检测不同猪源细胞的内源性DNMT1蛋白，我们利用得到的DNMT1蛋白合成肽多克隆抗体检测PAM、PK15、ST、PIEC细胞中的内源性DNMT1蛋白表达情况，通过使用兔抗DNMT1多克隆抗体作为一抗进行检测，如图6所示，这四种猪源细胞都能够显示出DNMT1蛋白条带。此结果与图7所示在不同猪源细胞通过RT-PCR方法扩增的合成肽基因序列测序结果图是相符的，经过比对，四种猪源细胞扩增的合成肽序列与所选合成肽序列是一致的。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院上海兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心上海分中心）

<120> 一种DNA 甲基转移酶1的抗原肽及其多克隆抗体

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 抗原肽

<400> 1

Ser Ser Pro Val Lys Arg Pro Arg Lys Glu Pro Val Asp Glu Asp

1 5 10 15

<210> 2

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 抗原肽

<400> 2

tccagtcctg tgaaacgccc acggaaggag cctgtggatg aagat 45

<210> 3

<211> 1643

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> DNMT1合成肽段氨基酸序列

<400> 3

Met Val Arg Ala Ala Ser Ala Arg Arg Pro Ser Pro Ser Val Ser Ala

1 5 10 15

Arg Lys Ala Arg Ala Ala Cys Ala Ala Ala Val Ser Ala Ala Pro Ser

20 25 30

Lys Met Pro Ala Arg Thr Ala Pro Ala Arg Val Ala Ala Leu Ala Ser

35 40 45

Arg Ala Phe Ser Leu Pro Asp Asp Val Arg Arg Arg Leu Lys Asp Leu

50 55 60

Glu Arg His Ser Leu Thr Glu Lys Glu Cys Val Lys Glu Lys Leu Asn

65 70 75 80

Leu Leu His Glu Phe Leu Gln Thr Glu Ile Lys Asn Gln Leu Cys Asp

85 90 95

Leu Glu Thr Lys Leu His Lys Glu Glu Leu Ser Glu Glu Gly Tyr Leu

100 105 110

Ala Lys Val Lys Ser Leu Leu Asn Lys Asp Leu Ser Leu Glu Asn Gly

115 120 125

Ala His Ala Phe Ser Arg Glu Val Asn Gly Tyr Leu Glu Asn Gly Ser

130 135 140

Gln Thr Ser Gly Glu Asp Arg Arg Val Glu Met Ala Glu Glu Asn Lys

145 150 155 160

Ser Pro Lys Pro Val Ser Lys Leu Gly Pro Pro Arg Arg Ser Lys Ser

165 170 175

Asp Gly Glu Ala Lys Ser Glu Val Ser Ser Ser Pro Arg Ile Thr Arg

180 185 190

Gln Thr Thr Arg Gln Thr Thr Ile Thr Ser His Phe Thr Arg Gly Pro

195 200 205

Gly Lys Arg Lys Pro Glu Glu Asp Thr Ala Lys Ala Lys Pro Asp Ser

210 215 220

Pro Val Glu Glu Glu Glu Lys Asp Gln Glu Glu Lys Arg Arg Lys Val

225 230 235 240

Thr Ser Arg Asp Ser Val Ala Gly Leu Leu Pro Thr Glu Glu Pro Glu

245 250 255

Arg Val Arg Pro Gly Thr His Met Glu Glu Asp Asp Lys Glu Glu Lys

260 265 270

Arg Leu Arg Ser Gln Thr Lys Glu Leu Thr Pro Lys Gln Lys Ile Lys

275 280 285

Glu Glu Leu Asp Arg Ser Thr Arg Pro Gly Gly Ala Gln Pro Glu Thr

290 295 300

Asn Glu Glu Asp Lys Asp Glu Lys Arg His Arg Ser Gln Pro Lys Asp

305 310 315 320

Leu Ala Gly Lys Arg Arg Pro Glu Glu Lys Glu Pro Glu Arg Ile Lys

325 330 335

Pro Gln Val Ser Asp Glu Lys Asp Glu Asp Glu Lys Glu Glu Lys Arg

340 345 350

Arg Arg Thr Thr Tyr Lys Glu Pro Thr Glu Lys Lys Leu Ala Arg Thr

355 360 365

Lys Thr Ala Val Val Ser Thr Lys Ala Asp Pro Leu Lys Cys Val Gln

370 375 380

Cys Gly Gln Tyr Leu Asp Asp Ala Glu Leu Lys Tyr Glu Gln His Pro

385 390 395 400

Pro Asp Ala Val Glu Glu Ile Gln Leu Leu Thr Asn Glu Arg Leu Ser

405 410 415

Ile Phe Asp Ala Asn Glu Ser Gly Phe Glu Ser Tyr Glu Ala Leu Pro

420 425 430

Gln His Lys Leu Thr Gly Phe Ser Val Tyr Cys Lys Arg Gly His Leu

435 440 445

Cys Pro Ile Asp Thr Gly Leu Ile Glu Lys Asp Val Glu Leu Phe Phe

450 455 460

Ser Gly Ser Ala Lys Pro Ile Tyr Glu Asp Asp Pro Ser Leu Glu Gly

465 470 475 480

Gly Val Asn Gly Lys Asn Leu Gly Pro Ile Asn Glu Trp Trp Ile Thr

485 490 495

Gly Phe Asp Gly Gly Glu Lys Ala Leu Ile Gly Phe Ser Thr Ser Phe

500 505 510

Ala Glu Tyr Ile Leu Met Asp Pro Asn Pro Glu Tyr Ala Pro Leu Phe

515 520 525

Ser Val Met Gln Glu Lys Ile Tyr Ile Ser Lys Ile Val Val Glu Phe

530 535 540

Leu Gln Asn Asn Pro Asp Ser Thr Tyr Glu Asp Leu Ile Asn Lys Ile

545 550 555 560

Glu Thr Thr Val Pro Pro Ser Val Leu Asn Leu Asn Arg Phe Thr Glu

565 570 575

Asp Ser Leu Leu Arg His Ala Gln Phe Val Val Glu Gln Val Glu Ser

580 585 590

Tyr Asp Gln Ala Gly Asp Ser Asp Glu Gln Pro Ile Phe Leu Thr Pro

595 600 605

Cys Met Arg Asp Leu Ile Lys Leu Ala Gly Val Thr Leu Gly Lys Arg

610 615 620

Arg Ala Glu Arg Arg Arg Thr Ile Gly His Ser Thr Lys Glu Lys Asp

625 630 635 640

Lys Gly Pro Thr Lys Ala Thr Thr Thr Lys Leu Val Tyr Gln Ile Phe

645 650 655

Asp Thr Phe Phe Ala Glu Gln Ile Glu Lys Asp Asp Lys Glu Asp Lys

660 665 670

Glu Asn Ala Phe Lys Arg Arg Arg Cys Gly Val Cys Glu Val Cys Gln

675 680 685

Gln Pro Glu Cys Gly Lys Cys Lys Ala Cys Lys Asp Met Val Lys Phe

690 695 700

Gly Gly Ser Gly Arg Ser Lys Gln Ala Cys Gln Glu Arg Arg Cys Pro

705 710 715 720

Asn Met Ala Met Lys Glu Ala Asp Asp Asp Glu Glu Val Asp Asp Asn

725 730 735

Ile Pro Glu Met Pro Ser Pro Lys Lys Met His Gln Gly Lys Lys Lys

740 745 750

Lys Gln Asn Lys Asp Arg Ile Ser Trp Ile Gly Glu Ala Val Lys Thr

755 760 765

Asp Gly Lys Lys Ile Tyr Tyr Lys Lys Val Cys Ile Asp Ser Glu Thr

770 775 780

Leu Glu Val Gly Asp Cys Val Ser Val Ile Pro Asp Asp Ser Ser Lys

785 790 795 800

Pro Leu Tyr Leu Ala Arg Val Thr Ala Leu Trp Glu Asp Ser Ser Asn

805 810 815

Gly Gln Met Phe His Ala His Trp Phe Cys Ala Gly Ile Asp Thr Val

820 825 830

Leu Gly Ala Thr Ser Asp Pro Leu Glu Leu Phe Leu Val Asp Glu Cys

835 840 845

Glu Asp Met Gln Leu Ser Tyr Ile His Ser Lys Val Lys Val Ile Tyr

850 855 860

Lys Pro Pro Ser Glu Asn Trp Ala Leu Glu Gly Gly Met Asp Pro Glu

865 870 875 880

Ala Leu Met Ser Lys Asp Asp Gly Lys Thr Tyr Phe Tyr Gln Leu Trp

885 890 895

Tyr Asp Gln Glu Tyr Ala Arg Phe Glu Ser Pro Pro Lys Thr Gln Pro

900 905 910

Thr Glu Asp Asn Lys Phe Lys Phe Cys Val Ser Cys Ala Arg Leu Ala

915 920 925

Glu Met Arg Gln Lys Glu Val Pro Arg Val Met Glu Gln Leu Glu Asp

930 935 940

Leu Asp Gly Arg Val Leu Tyr Ser Ser Ala Thr Lys Asn Gly Ile Gln

945 950 955 960

Tyr Arg Val Gly Asp Gly Val Tyr Leu Pro Pro Glu Ala Phe Thr Phe

965 970 975

Asn Ile Lys Leu Ser Ser Pro Val Lys Arg Pro Arg Lys Glu Pro Val

980 985 990

Asp Glu Asp Leu Tyr Pro Glu His Tyr Arg Lys Tyr Ser Asp Tyr Ile

995 1000 1005

Lys Gly Ser Asn Leu Asp Ala Pro Glu Pro Tyr Arg Ile Gly Arg

1010 1015 1020

Ile Lys Glu Ile Phe Cys Thr Lys Lys Ser Asn Gly Lys Pro Asn

1025 1030 1035

Glu Thr Asp Ile Lys Ile Arg Leu Asn Lys Phe Tyr Arg Pro Glu

1040 1045 1050

Asn Thr His Lys Ser Thr Pro Ala Ser Tyr His Ala Asp Ile Asn

1055 1060 1065

Leu Leu Tyr Trp Ser Asp Glu Glu Ala Val Val Asp Phe Lys Ser

1070 1075 1080

Val Gln Gly Arg Cys Thr Val Glu Tyr Gly Glu Asp Leu Pro Glu

1085 1090 1095

Cys Leu Gln Asp Phe Ser Ala Gly Gly Pro Asp Arg Phe Tyr Phe

1100 1105 1110

Leu Glu Ala Tyr Asn Ala Lys Ser Lys Ser Phe Glu Asp Pro Pro

1115 1120 1125

Asn His Ala Arg Ser Pro Gly Asn Lys Gly Lys Gly Lys Gly Lys

1130 1135 1140

Gly Lys Ser Arg Thr Lys Ser Gln Thr Cys Glu Pro Ser Glu Leu

1145 1150 1155

Glu Thr Glu Ile Lys Leu Pro Lys Leu Arg Thr Leu Asp Val Phe

1160 1165 1170

Ser Gly Cys Gly Gly Leu Ser Glu Gly Phe His Gln Ala Gly Ile

1175 1180 1185

Ser Glu Thr Leu Trp Ala Ile Glu Met Trp Asp Pro Ala Ala Gln

1190 1195 1200

Ala Phe Arg Leu Asn Asn Pro Gly Ser Thr Val Phe Thr Glu Asp

1205 1210 1215

Cys Asn Val Leu Leu Lys Leu Val Met Ala Gly Glu Val Thr Asn

1220 1225 1230

Ser Arg Gly Gln Lys Leu Pro Gln Lys Gly Asp Val Glu Met Leu

1235 1240 1245

Cys Gly Gly Pro Pro Cys Gln Gly Phe Ser Gly Met Asn Arg Phe

1250 1255 1260

Asn Ser Arg Thr Tyr Ser Lys Phe Lys Asn Ser Leu Val Val Ser

1265 1270 1275

Phe Leu Ser Tyr Cys Asp Tyr Tyr Arg Pro Arg Tyr Phe Leu Leu

1280 1285 1290

Glu Asn Val Arg Asn Phe Val Ser Phe Lys Arg Ser Met Val Leu

1295 1300 1305

Lys Leu Thr Leu Arg Cys Leu Val Arg Met Gly Tyr Gln Cys Thr

1310 1315 1320

Phe Gly Val Leu Gln Ala Gly Gln Tyr Gly Val Ala Gln Thr Arg

1325 1330 1335

Arg Arg Ala Ile Ile Leu Ala Ala Ala Pro Gly Glu Gln Leu Pro

1340 1345 1350

Leu Phe Pro Glu Pro Leu His Val Phe Ala Pro Arg Ala Cys Gln

1355 1360 1365

Leu Ser Val Val Val Asp Asp Lys Lys Phe Val Ser Asn Ile Thr

1370 1375 1380

Arg Leu Ser Ser Gly Pro Phe Arg Thr Ile Thr Val Arg Asp Thr

1385 1390 1395

Met Ser Asp Leu Pro Glu Ile Arg Asn Gly Ala Ser Ala Gln Glu

1400 1405 1410

Ile Ser Tyr Asn Gly Glu Pro Gln Ser Trp Phe Gln Arg Gln Leu

1415 1420 1425

Arg Gly Ser Gln Tyr Gln Pro Ile Leu Arg Asp His Ile Cys Lys

1430 1435 1440

Asp Met Ser Ala Leu Val Ala Ala Arg Met Arg His Ile Pro Leu

1445 1450 1455

Ala Pro Gly Ser Asp Trp Arg Asp Leu Pro Asn Ile Glu Val Arg

1460 1465 1470

Leu Ser Asp Gly Thr Leu Ala Arg Lys Leu Arg Tyr Asn Tyr His

1475 1480 1485

Asp Lys Lys Asn Gly Cys Ser Ser Thr Gly Ala Leu Arg Gly Val

1490 1495 1500

Cys Ser Cys Val Glu Val Gly Lys Ala Cys Asp Pro Ala Ala Arg

1505 1510 1515

Gln Phe Asn Thr Leu Ile Pro Trp Cys Leu Pro His Thr Gly Asn

1520 1525 1530

Arg His Asn His Trp Ala Gly Leu Tyr Gly Arg Leu Glu Trp Asp

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Gly Phe Phe Ser Thr Thr Val Thr Asn Pro Glu Pro Met Gly Lys

1550 1555 1560

Gln Gly Arg Val Leu His Pro Glu Gln His Arg Val Val Ser Val

1565 1570 1575

Arg Glu Cys Ala Arg Ser Gln Gly Phe Pro Asp Thr Tyr Arg Leu

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Phe Gly Asn Ile Leu Asp Lys His Arg Gln Val Gly Asn Ala Val

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Pro Pro Pro Leu Ala Lys Ala Ile Gly Leu Glu Ile Lys Arg Cys

1610 1615 1620

Met Leu Ala Lys Ala Arg Glu Ser Ala Ser Val Lys Val Lys Glu

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<210> 4

<211> 5102

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<220>

<223> DNMT1合成肽段的核苷酸序列

<400> 4

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cagtgtggta cgtcccgcct tcccccacgc ctgggccggg atggtacgcg ctgcctccgc 120

tcgccgcccc tccccatcgg tttccgcgcg aaaagccagg gctgcctgtg ctgctgctgt 180

ctctgctgca ccttccaaga tgcctgcccg taccgcccca gcgcgggtgg ccgctttggc 240

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taaggaggag ctagacagaa gcacgaggcc tggaggagct caacctgaaa cgaatgaaga 1020

agacaaagat gaaaagaggc acagaagtca acctaaagat ctagctggca aacggagacc 1080

tgaagaaaaa gaacctgaaa gaataaaacc acaagtttct gatgagaaag atgaggatga 1140

aaaggaggag aagagacgta gaactacata caaagaacca actgagaaga aactggctcg 1200

aaccaaaacg gcagtagtgt ccaccaaggc cgaccctctg aagtgcgttc agtgtggaca 1260

gtacctggat gatgctgaac taaaatatga acagcatcct cctgatgcag tagaagagat 1320

acagttgttg acaaacgaga gactgtccat cttcgatgcc aatgaatctg gctttgaaag 1380

ttacgaagct cttccccaac acaaactgac cggcttcagc gtgtactgta aacgtggtca 1440

cctgtgcccg atcgacactg gcctcatcga gaaagatgtc gagctcttct tttctggttc 1500

agcaaagcca atatatgagg atgacccgtc tcttgaaggt ggtgttaatg gcaaaaatct 1560

tggccccata aatgaatggt ggatcactgg ctttgatggg ggtgaaaagg cgctcatagg 1620

cttcagcacc tcatttgccg agtatatttt gatggatccc aacccagagt atgcaccact 1680

gttcagcgtg atgcaggaga agatctacat aagtaagata gtggttgagt tcctgcagaa 1740

caaccctgac tcgacctatg aagacttgat caataagatt gagaccactg ttcctccttc 1800

tgtgctcaac ctgaatcgat tcacagagga ttctctcctt cgacacgccc agtttgtggt 1860

ggaacaagta gagagttatg atcaagctgg ggacagtgac gagcagccca tcttcctgac 1920

gccctgcatg agagacctga tcaagttggc cggggtcacc ctggggaaaa ggcgagctga 1980

aaggcggcgg accattgggc attctaccaa ggagaaggac aaaggcccca ccaaagccac 2040

cactaccaag ttggtctacc agatctttga tactttcttt gcggaacaaa ttgaaaagga 2100

tgacaaagaa gacaaggaga atgcttttaa acgccggcgg tgtggcgttt gtgaggtttg 2160

tcaacagcct gagtgcggaa agtgtaaagc ctgtaaggat atggttaaat ttggtggtag 2220

cggacgcagc aaacaagctt gccaagagag aaggtgtccc aatatggcca tgaaggaggc 2280

agacgatgat gaagaagttg atgacaatat tccagagatg ccgtcaccca aaaagatgca 2340

tcaagggaag aagaaaaaac agaacaagga ccggatctct tggattggag aagctgtcaa 2400

gactgatggg aagaagattt actacaagaa ggtatgcatt gactcagaaa ccctggaagt 2460

gggggactgt gtctctgtta ttccagatga ttcttcaaaa ccgctctact tagccagggt 2520

cacagctctg tgggaggaca gcagcaacgg gcagatgttt catgcccact ggttctgtgc 2580

tgggatagat acggtcctcg gggccacatc ggaccccctg gagctgttcc tggtagacga 2640

atgtgaggac atgcagcttt catacattca tagcaaagtg aaggtcatct ataaacctcc 2700

gtcagagaac tgggccttgg agggaggcat ggaccccgag gcactgatgt cgaaggatga 2760

tgggaagacc tatttctacc agctgtggta tgaccaagag tatgcaaggt ttgagtcccc 2820

tccaaaaact cagccaacgg aggacaacaa gttcaagttc tgcgtaagct gtgcgcgcct 2880

ggctgaaatg agacagaaag aagttcccag ggtcatggag cagcttgagg acctggatgg 2940

ccgggttctc tacagctcag ccaccaagaa cggcatccag tatcgagtgg gtgatggcgt 3000

gtacctcccc cctgaggcct tcacgttcaa cattaagctg tccagtcctg tgaaacgccc 3060

acggaaggag cctgtggatg aagatctgta cccagaacac taccggaaat actctgacta 3120

catcaaaggc agcaacctgg atgcccctga gccctaccga attggccgca taaaagagat 3180

cttctgcacc aaaaagagca atggcaagcc caatgagacc gacatcaaga tcagactcaa 3240

caagttctac aggccagaga acacccacaa gtccacccca gcgagttacc atgcagatat 3300

caacctgctt tactggagtg acgaggaggc cgtggtggac ttcaagtctg tgcagggccg 3360

atgcaccgtc gagtatggcg aggaccttcc tgagtgcctc caggacttct cagctggtgg 3420

ccccgaccgc ttctacttcc ttgaggccta taatgccaag agcaaaagct ttgaagatcc 3480

tccaaatcat gcccgtagcc ctggaaacaa agggaaaggg aaggggaaag ggaaaagcag 3540

gacaaagtct caaacatgtg agccgagcga actggagaca gaaataaaac tgcctaagct 3600

gcggaccctg gatgtgtttt ctggctgtgg gggattgtca gaaggattcc accaagcagg 3660

catctcggaa acgctgtggg ccattgagat gtgggaccct gcagcccagg ccttccggct 3720

aaataatcct gggtccacgg tgttcacgga ggactgcaat gtcctgctga agctagtcat 3780

ggccggggag gtgaccaact cccgtggcca gaagctgcct cagaagggag atgtggagat 3840

gctatgcggt gggccaccct gccaaggctt tagcggcatg aaccgcttca attctcgtac 3900

ctattccaag ttcaagaact ccctagtggt ctccttcctc agctactgtg actactaccg 3960

accccggtac ttcctcctgg agaacgtcag gaatttcgtc tccttcaagc gctccatggt 4020

cctgaagctc acgctccgct gcctggtccg catgggctac cagtgcacct ttggcgtctt 4080

gcaggctggt cagtatggcg tggcccagac gaggaggcgg gccatcatcc tggccgcggc 4140

ccccggagag cagctcccgc tgttcccaga gccactacac gtgttcgcac cccgggcctg 4200

tcagctgagc gtcgtggtcg atgataagaa gtttgtcagc aacatcacta ggttgagctc 4260

gggtcccttc cgaaccatca ctgtgcggga cacaatgtcc gaccttcccg agatccggaa 4320

tggagcatcg gcgcaggaga tctcgtacaa tggagagcct cagtcctggt tccaaaggca 4380

gctccggggc tcgcagtacc agcccatcct cagggaccac atctgtaagg acatgagcgc 4440

cttggtggcc gcccgtatgc ggcacatccc tctggcccca ggctcagact ggcgggacct 4500

accaaacatt gaggtgcggc tctcagacgg caccttggcc aggaagctgc ggtacaacta 4560

ccacgacaag aagaatggct gcagcagcac cggggccctc cgtggggtct gctcctgcgt 4620

ggaagtgggc aaagcctgtg accctgcggc cagacaattc aataccctca ttccctggtg 4680

cttgccccac accgggaaca ggcacaacca ctgggctggc ctctatggac ggcttgagtg 4740

ggatggcttt ttcagcacaa ctgtcaccaa ccctgagccc atgggcaagc agggccgcgt 4800

gctccacccg gaacagcacc gtgtggtgag cgtgcgggag tgtgcccgct cccagggctt 4860

ccccgacacc taccggttgt tcggcaacat cctggacaag caccggcagg tgggtaatgc 4920

tgtgccacca ccgctggcca aagccattgg cttagagatc aagcgctgta tgttggccaa 4980

agcacgagag agcgcctcag ttaaagtcaa ggaagagact acgaaggact agttttgccc 5040

tcccatcgcc tttgtttctg gcaccaggga tccccaacgt gcactgatat tgtattttta 5100

ac 5102

Claims

1. 一种DNA 甲基转移酶1的抗原肽，所述DNA 甲基转移酶1的抗原肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.l 所示，其对应的核苷酸序列如 SEQ ID NO.2 所示。

2. 根据权利要求1所述的DNA 甲基转移酶1的抗原肽，其特征在于，其核苷酸序列选自猪 DNMT1 基因预测序列，猪 DNMT1 基因预测序列的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

3. 一种抗 DNMT1 多克隆抗体的制备方法，包括如下步骤:

a)制备合成肽抗原：人工合成 SEQ ID NO.l 所示的氨基酸序列，使用KLH 载体蛋白进行偶联纯化，得到合成肽抗原；

c)多克隆抗体纯化：采用 Protein G 亲和层析法对多克隆抗体进行纯化，得到多克隆抗体。

4. 根据权利要求3所述的抗 DNMT1 多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤b）中免疫方式为皮下注射或肌肉注射，抗原肽的每次免疫量500 μg。

5. 根据权利要求3所述的抗 DNMT1 多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤b）中免疫中每隔14天进行一次加强免疫，免疫六次后的第7天静脉或心脏采血获得包含多克隆抗体的血清。

6. 根据权利要求3所述的抗 DNMT1 多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述抗DNMT1 多克隆抗体的制备方法中，所述步骤b）中包括抗体效价检测，通过间接 ELISA 法检测抗体的效价和灵敏度，所述的多克隆抗体的效价大于1:50k，所述抗 DNMT1 多克隆抗体用含20% 甘油的 PBS 缓冲液储存。

7. 一种权利要求3所述的抗 DNMT1 多克隆抗体的应用，其用于哺乳动物细胞DNMT1蛋白表达检测，所述的多克隆抗体用于人、猪、猴、牛、犬源的DNMT1 蛋白的表达检测。

8. 根据权利要求7所述的抗 DNMT1 多克隆抗体的应用，其特征在于，所述的哺乳动物细胞为HEK 293T 细胞、Marc 145细胞、PAM细胞、MDBK细胞、MDCK细胞。