CN110317271B

CN110317271B - 一种pinp重组抗体的重/轻链可变区及编码基因和重组抗体

Info

Publication number: CN110317271B
Application number: CN201910591954.7A
Authority: CN
Inventors: 何峰容; 乐鑫; 孙颖; 操媛; 刘勇; 姚新欣; 乐音谱; 严小丽; 姚雯; 李华渊
Original assignee: Cloud-Clone Corp Wuhan
Current assignee: Cloud-Clone Corp Wuhan
Priority date: 2019-07-02
Filing date: 2019-07-02
Publication date: 2021-04-30
Anticipated expiration: 2039-07-02
Also published as: CN110317271A

Abstract

本发明公开了一种PINP重组抗体的重/轻链可变区及编码基因和重组抗体，该抗体的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示、重链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示、轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示、轻链可变区编码基因序列如SEQ ID NO:4所示。重链可变区和轻链可变区分别连接到各自的表达载体再共转染动物细胞，获得重组表达的PINP重组抗体。该重组抗体表达质粒易于保存，重组表达的方式使抗体得率高，该抗体特异性强，稳定性好，在多种检测方法中表现高灵敏度，适合临床大范围使用。

Description

一种PINP重组抗体的重/轻链可变区及编码基因和重组抗体

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种用于检测PINP的重组抗体的轻链可变区、重链可变区以及重组抗体及其在制备体外诊断试剂中的应用。

背景技术

随着全球老龄化人口的增多，骨代谢相关疾病已跃居世界常见疾病前十，因此，骨代谢也成为目前医学研究的热点之一。越来越多的研究者和临床医生开始寻找骨代谢相关疾病的临床诊断标志物。目前，大量研究表明骨形成标志物——PINP，与多种骨代谢及代谢性疾病密切相关。PINP的表达水平可反映新骨的形成，因此可很好地判断骨质疏松症以及治疗后效果；同时，PINP还可用于判断骨代谢相关的恶性疾病，如肿瘤骨转移、多发性骨髓瘤、软骨病、佩吉特氏病(Paget’sdisease)等；另外，在内分泌紊乱疾病以及甲状腺功能亢进和原发性甲状旁腺功能亢进时也有增高。

血清PINP监测之所以可应用于临床诊断，还因为它不容易受其它干扰因素的影响，如PINP对食物及昼夜节律的影响相对不敏感；PINP不受激素影响，对患者进行激素治疗不影响血中PINP的水平；PINP由肝脏代谢清除，肝脏疾病会影响它在血中的浓度，但不受肾功能影响。

因此，PINP是一个优质的新型骨代谢相关疾病的临床诊断标志物。那么，制备PINP特异性单抗就成为研制PINP检测试剂的核心原料。

传统的抗体技术主要包括兔多抗技术以及小鼠杂交瘤技术，其主要弊端在于制备过程依赖动物，不仅无法克服动物个体差异性带来的批间差，而且随着人类对动物保护的认识加强，强制性不使用动物用于制备抗体也将是大势所趋，因此，必须寻找不依赖动物且稳定性良好的抗体制备技术，重组抗体的产生解决了以上难题。

新一代重组抗体技术与传统杂交瘤技术相比有二个明显优势，一是可根本防止杂交瘤细胞容易丢失的缺陷，从而真正达到抗体的“永生化”。另外，可从根本上摆脱动物依赖性，从而防止了因动物批次差异导致的批间差异，保证了产品的“稳定性及一致性”，特别适用于大剂量单抗的工业化使用。

尽管高特异性的抗PINP抗体对于临床研究意义重大且市场需求量大，但是研制出适用于临床应用的抗体PINP抗体并不容易，目前还没有可临床应用的PINP检测重组抗体。

市面上的商业化抗PINP抗体，依然采用传统免疫动物的方法制备获得，不仅无法克服由于动物个体差异引入的批间差，且单批次产量小，并无法避免优质的单克隆株丢失的问题，而不适合用于工业化的抗体产品。

发明内容

研制出适用于临床应用的抗体PINP抗体并不容易，需要考虑诸多因素，包括抗体的特异性，抗体的产量，抗体的一致性，抗体的稳定性以及抗体功能实用性等。本发明旨在解决这一系列问题。

本发明提供了以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种PINP重组抗体，包括重链恒定区、重链可变区、轻链恒定区和轻链可变区，其特征在于：所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Gly

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ala Tyr

Trp Met Gln Trp Leu Arg Gln Ser Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile

Gly Val Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Ala Arg Tyr Thr Gln Lys Phe

Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

Ala Arg Trp Phe His His Asp Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser(SEQ ID NO:1)；

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Lys Ser Met Ser Met Ser Val Gly

Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Gly Thr Tyr

Val Ser Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Glu Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Cys Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala

Glu Asp Leu Ala Asp Tyr His Cys Gly Gln Ile Tyr Asn Tyr Pro Leu

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys(SEQ ID NO:3)。

第二方面，本发明提供了上述PINP重组抗体的重链可变区的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

第三方面，本发明提供了用于扩增上述重链可变区的编码基因的引物(二次扩增引物)，其核苷酸序列如下：

Mu-EcoRI/VH-F1(10053-H20-4-2nd)上游引物：

5’-CGGAATTCGGAGGTGCAACTGCAGCAGTCTGGGGCTG-3’(SEQ ID NO:5)；

Mu-NheI/VH-R1(10053-H20-4-2nd)下游引物：

5’-CTAGCTAGCTGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGG-3’(SEQ ID NO:6)。

第四方面，本发明提供了一种重组质粒，含有上述PINP重组抗体的重链可变区编码基因。

第五方面，本发明提供了上述PINP重组抗体的轻链可变区的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

第六方面，本发明提供了用于扩增上述轻链可变区的编码基因的引物(二次扩增引物)，其核苷酸序列如下：

Mu-EcoRI/VL-F1(10053-H20-4-2nd)上游：

5’-CGGAATTCAGACATTCAGCTGACCCAGTCTCCCAAATC-3’(SEQ ID NO:7)；

Mu-Xhol/VL-R1(10053-H20-4-2nd)下游：

5’-CCGCTCGAGTTTGATCTCCAGCTTGGTCCCAGCACCGA-3’(SEQ ID NO:8)。

第七方面，本发明提供了一种重组质粒，其含有上述PINP重组抗体的轻链可变区编码基因。

第八方面，本发明还提供了用于扩增上述PINP小鼠重组抗体的轻链可变区的引物，其核苷酸序列如下：

PINP单克隆抗体轻链可变区上游引物：

Vk-mu-F1:5’-GACATTCAGCTGACCCAGTCTCCA-3’；(SEQ ID NO:9)

Vk-mu-F2:5’-GGGAATTCGAYATTGTGMTRACMCARKMTCAA-3’；(SEQ ID NO:10)

Vk-mu-F3:5’-ATGAGGRCCCCTGCTCAGWTTYTTGGIWTCTT-3’；(SEQ ID NO:11)

Vk-mu-F4:5’-AGGAGACAGACACACTCCTGCTAT-3’；(SEQ ID NO:12)

PINP单克隆抗体轻链可变区下游引物：

Vk-mu-R1:5’-GTTAGATCTCCAGCTTGGTCCC-3’；(SEQ ID NO:13)

Vk-mu-R2:5’-GGAAGCTTACTGGATGGTGGGAAGATGGA-3’；(SEQ ID NO:14)

Vk-mu-R3:5’-ATGRAGWCACAKWCYCAGTCTT-3’；(SEQ ID NO:15)

Vk-mu-R4:5’-CCCAAGCTTACTGGATGGTGGGAAATGGA-3’。(SEQ ID NO:16)

本发明还提供了一种体外诊断试剂，其含有以上所述的PINP重组抗体。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供的PINP重组抗体的重链可变区、轻链可变区序列来源于多次免疫及筛选得到的一株高特异性的抗PINP的单克隆株，特异性强，稳定性好，采用上述序列制备重组抗体，将序列的优势通过抗体的优势来体现，更加适用于临床诊断。

本发明涉及的用于检测PINP的重组抗体具备高特异性、高产量、批次差异小、稳定性好并能适用于多种免疫学检测体系，可作为科研用及临床用PINP检测试剂的核心原料。

本发明的重组抗体基因序列模板是通过多次免疫及筛选得到的一株高特异性的抗PINP的单克隆株。重组抗体制备技术的引入，准确地确定了基因序列，保证了抗体的特异性，并使得抗PINP抗体达到“永生化”，可大批量生产，抗体批次差异小，稳定性和一致性高，满足工业化的使用需求。目前，市面上没有商业化抗PINP重组抗体，只有成品PINP检测试剂盒。我们将抗PINP重组抗体制备成试剂盒产品，进行各方面性能比较，数据显示使用本发明的抗PINP重组抗体制备的试剂盒产品在灵敏度，特异性，批间差以及稳定性等各种性能均具备一定优势。

附图说明

图1、小鼠脾脏细胞和SP20融合的杂交瘤细胞总RNA扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果。

图2、总RNA反转录的cDNA用内参基因β-actin为引物扩增所得产物琼脂糖凝胶电泳结果。

图3、PINP单克隆抗体可变区重链和轻链扩增结果，左图：轻链可变区(VL)扩增产物电泳，右图：重链可变区(VH)扩增产物电泳。

图4、T克隆蓝白筛选照片。

图5、PINP单克隆抗体可变区基因T克隆扩增结果，左图：.轻链可变区(VL)T克隆扩增，右图：重链可变区扩增(VH)T克隆扩增。

图6、A.PINP重组抗体轻链可变区基因测序结果，

B.PINP重组抗体重链可变区基因测序结果。

图7、PINP重组抗体轻链可变区序列分析结果。

图8、PINP重组抗体重链可变区序列分析结果。

图9、真核表达并纯化的PINP重组抗体的SDS-PAGE检测结果，左图为还原性(reduced)SDS-PAGE，右图为非还原性(non-reduced)SDS-PAGE。还原性为加入了还原剂的，还原剂如DTT、2-巯基乙醇等。

图10、PINP重组抗体制备流程框图。

图11、PINP重组抗体制备流程示意图。

图12、不同抗体热稳定性检测的标准曲线图。

图13、PINP重组抗体临床样本相关性检测以及与其它商业化抗体数据对比结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明技术方案进行详细的解释和说明，以使本领域技术人员更好地实施本发明。实施例中，VH表示重链可变区，VL表示轻链可变区。

实施例1小鼠PINP重组抗体的制备

(一)PINP单克隆抗体可变区基因钓取

1、杂交瘤细胞RNA提取及逆转录结果

经多次免疫及筛选，获得一株高特异性的抗PINP的小鼠脾脏细胞和SP20融合的杂交瘤细胞，Trizol法提取杂交瘤细胞RNA，经琼脂糖凝胶电泳可见清晰的28S和18S条带，说明RNA完整性较好。参见图1。RNA浓度和纯度测定结果为D(260nm)/D(280nm)＝1.85，可以满足本实验要求。

以RNA为模板反转录合成cDNA，以cDNA为模板，小鼠内参基因β-actin为引物进行PCR扩增，扩增出长度为380bp的目的条带，参见图2。说明逆转录cDNA可用于后续实验。

2、PINP单克隆抗体可变区PCR扩增

引物序列：

通过多序列比对和简并引物设计算法，在PINP单克隆抗体前导肽和可变区的相对恒定区设计可扩增PINP单克隆抗体可变区基因的引物，序列如下：

PINP单克隆抗体重链可变区扩增引物

上游引物：

VH-mu-F1:5’-AGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG-3’(SEQ ID NO:17)；

VH-mu-F2:5’-GGGAATTCSAGGTSMARCTGCAGSAGTCT-3’(SEQ ID NO:18)。

下游引物：

VH-mu-R1：5’-TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCCAG-3’(SEQ ID NO:19)；

VH-mu-R2：5’-GGAAGCTTAYCTCCACACACAGGRRCCAGTGGATAGAC-3’(SEQ ID NO:20)。

PINP单克隆抗体轻链可变区扩增引物

上游引物：

Vk-mu-F1:5’-GACATTCAGCTGACCCAGTCTCCA-3’(SEQ ID NO:9)；

Vk-mu-F2:5’-GGGAATTCGAYATTGTGMTRACMCARKMTCAA-3’(SEQ ID NO:10)；

Vk-mu-F3:5’-ATGAGGRCCCCTGCTCAGWTTYTTGGIWTCTT-3’(SEQ ID NO:11)；

Vk-mu-F4:5’-AGGAGACAGACACACTCCTGCTAT-3’(SEQ ID NO:12)。

下游引物：

Vk-mu-R1:5’-GTTAGATCTCCAGCTTGGTCCC-3’(SEQ ID NO:13)；

Vk-mu-R2:5’-GGAAGCTTACTGGATGGTGGGAAGATGGA-3’(SEQ ID NO:14)；

Vk-mu-R3:5’-ATGRAGWCACAKWCYCAGTCTT-3’(SEQ ID NO:15)；

Vk-mu-R4:5’-CCCAAGCTTACTGGATGGTGGGAAATGGA-3’(SEQ ID NO:16)。

以上述cDNA为模板，用TaqDNA酶扩增McAbV区基因。将2条VH上游引物与2条VH下游引物以一定比例混合，扩增全套VH基因；将4条VL上游引物和4条VL下游引物以一定比例混合，扩增全套VL基因。扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果参见图3，显示VH基因片段长度约为350-400bp，VL基因片段长度约为350bp，与目的片段长度一致。

3、纯化V区基因与T-载体连接

用胶回收试剂盒纯化PCR产物，将VH基因和VL基因分别与pGEM-T载体连接，转化大肠杆菌。经蓝白筛选挑选白色菌落PCR鉴定(图4)。每一连接物各挑取12个单克隆，用通用引物进行菌落PCR，目的片段大小为500bp左右(图5)，将其中条带明亮6个阳性克隆菌进行测序。

4、步骤3筛选的阳性克隆进行测序后，共获得18条有效序列，从中优选了2条。

mu-anti-huPINP单克隆抗体可变区序列测序结果(从18条有效序列当中优选2条)

4.1PINP单克隆抗体轻链可变区(mu-anti-huPINP-VL)

测序结果如图6A所示。

利用IMGT/QUEST在线分析软件，对轻链基因进行同源性比较，有效序列如下：

gacattcagctgacccagtctcccaaatccatgtccatgtcagtaggagagagggtcaccttgagctgcaaggccagtgaaaatgtgggtacttatgtatcctggtatcaacagagaccagagcagtctcctaaactgctgatatacggggcatccaaccggtgcactggggtccccgatcgcttcacaggcagtggatctggaacagatttcactctgaccataagcagtgtacaggctgaagaccttgcagattatcactgtggacagatttacaactatccgctcacgttcggtgctgggaccaagctggagatcaaac(SEQ ID NO:4)。

序列分析结果如图7所示。

功能性轻链可变区全长为个322个碱基，结构域从第1位碱基开始，编码107个氨基酸，该有功能的轻链均属于MusmusIGKV6-20*01F家族，V区匹配率为94.98％，J区为94.74％。具体结构域划分为：

结构域	FR1	CDR1	FR2	CDR2	FR3	CDR3	FR4
								碱基序号	1..78	79..96	97..147	148..156	157..264	265..291	292..322

4.2PINP单克隆抗体重链可变区(mu-anti-huPINP-VH)

测序结果如图6B所示。

利用IMGT/QUEST在线分析软件，对重链可变区基因进行同源性比较，有效序列如下：

gaggtgcaactgcagcagtctggggctgagctggcaagacctgggggttcagtgaagttgtcctgcaaggcttctggctacagctttactgcctactggatgcagtggttaagacagagccctggacggggtctggagtggattggagttatttatcctggagatggtgatgctaggtatactcagaagttccagggcaaggccacattgactgcagataaatcctccagcacagcctacatgcaactcagcagcttggcatctgaggactctgcggtctattactgtgcaagatggttccaccatgactatgttatggactactggggccaagggaccacggtcaccgtctcctcaa(SEQ ID NO:2)。

序列分析结果如图8所示。

功能性重链可变区全长为个358个碱基，结构域从第1位碱基开始，编码119个氨基酸，该有功能的重链均属于MusmusIGHV1-87*01F家族，V区匹配率为92.36％，J区为87％。具体结构域划分为：

结构域	FR1	CDR1	FR2	CDR2	FR3	CDR3	FR4
								碱基序号	1..75	76..99	100..150	151..174	175..288	289..324	325..358

(二)PINP重组抗体全长抗体构建以及真核表达纯化

1.1根据上述经测序确认正确且有功能的重链和轻链可变区基因，结合表达载体的酶切位点以及读码框，设计抗体扩增的二次扩增引物，以相应的T克隆为模板进行二次PCR，PCR产物经限制性内切酶处理后分别连入的载体pFUSEss_CHIg_mG2B和pFUSE2ss_CLIg_mK，完成质粒重组，重组后的质粒转入感受态细胞DH5α后，挑选阳性克隆送公司测序。

小鼠抗体重链恒定区载体pFUSEss-CHIg-mG2B购自美国InvivoGen公司；pFUSEss-CHIg-mG2B是一种表达小鼠igg2b重链恒定区域的克隆质粒。它包含恒定区上游的多克隆位点，以克隆重链可变区。酶切连入重链可变区完成重组。重组质粒的重链基因全长如SEQ IDNO:21所示，其中前60bp为信号肽编码序列，中间的357bp为重链可变区编码基因，之后的1020bp为重链恒定区编码基因。重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示。

小鼠抗体轻链恒定区载体pFUSE2ss-CLIg-mk购自美国InvivoGen公司；pFUSE2ss-CLIg-mk是一种表达小鼠igg2b轻链恒定区域的克隆质粒。它包含恒定区上游的多克隆位点，以克隆轻链可变区。酶切连入轻链可变区完成质粒重组。重组质粒的轻链基因全长如SEQ ID NO:23所示，其中前60bp为信号肽编码序列，中间的321bp为轻链可变区编码基因，之后的324bp为轻链恒定区编码基因。轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示。

二次引物设计序列如下：

重组抗体重链可变区基因二次扩增引物

Mu-EcoRI/VH-F1(10053-H20-4-2nd)上游：

5’-CGGAATTCGGAGGTGCAACTGCAGCAGTCTGGGGCTG-3’(SEQ ID NO:5)；

Mu-NheI/VH-R1(10053-H20-4-2nd)下游：

5’-CTAGCTAGCTGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGG-3’(SEQ ID NO:6)；

重组抗体轻链可变区基因二次扩增引物

Mu-EcoRI/VL-F1(10053-H20-4-2nd)上游：

5’-CGGAATTCAGACATTCAGCTGACCCAGTCTCCCAAATC-3’(SEQ ID NO:7)；

Mu-Xhol/VL-R1(10053-H20-4-2nd)下游：

5’-CCGCTCGAGTTTGATCTCCAGCTTGGTCCCAGCACCGA-3’(SEQ ID NO:8)。

2.2将测序正确质粒对应的菌液扩大培养并提取质粒。将携带重链的质粒和携带轻链基因的质粒以一定比例共转染哺乳动物细胞293F细胞或者CHO-S细胞(可实现反应器大规模培养)，两种质粒在哺乳动物细胞中完成重链和轻链的表达以及聚合，形成PINP重组抗体。5-10天收集培养细胞上清进行proteinAHP亲和层析纯化，纯化后的抗体SDS-PAGE电泳分析结果如图9所示。

实施例2、PINP重组抗体以及PINP天然小鼠单抗用于ELISA法检测结果对比

由于没有商业化抗P1NP抗体可进行对比，因此我们采用实施例1中PINP重组抗体对比杂交瘤细胞接种于小鼠腹腔后，在腹水中纯化得到的天然抗PINP单克隆抗体(以下简称PINP天然小鼠单抗)及商业化ELISA试剂盒产品(NBP2-76465，R&D)，以验证PINP重组抗体的各项性能。

抗体对天然P1NP以及重组P1NP的识别能力检测，ELISA方法：分别将PINP重组抗体以及P1NP天然小鼠单抗作为包被抗体(2μg/ml)包被96孔板，然后用同一个PINP多抗标记HRP作为检测抗体，PINP重组抗体作为标准品，TMB作为底物，进行ELISA检测，结果如下：

1、线性范围

PINP重组抗体线性范围为：7.8pg/mL-1,000pg/mL；

PINP天然小鼠单抗线性范围为：15.6pg/mL-1,000pg/mL。

商业化试剂盒产品(NBP2-76465，R&D)：15.63-1,000pg/ml。

2、标准曲线回归系数R²

PINP重组抗体R²为0.9999；

PINP天然小鼠单抗R²为0.999；

商业化试剂盒产品(NBP2-76465，R&D)：0.9974。

3、灵敏度：

PINP重组抗体灵敏度：2.7pg/mL；

PINP天然小鼠单抗灵敏度：7.4pg/mL；

商业化试剂盒产品(NBP2-76465，R&D)：9.38pg/mL。

此值为20个空白样品(即标准品稀释液)测定的平均值加二倍标准差所对应的浓度。

4、特异性

可以通过与结构类似物和功能类似物的交叉反应情况反映抗体的特异性。

PINP和PIINP/PIIINP序列同源性低

*商业化试剂盒产品无相关验证数据，未在此列出。表格中，PIINP表示人Ⅱ型前胶原氨基端原肽，PIIINP表示人Ⅲ型前胶原氨基端原肽：COL1表示I型胶原，COL1a2表示人I型胶原α2：COL1a1表示人I型胶原α1：CTX1表示人I型胶原交联羧基端肽。

数据显示，PINP天然小鼠单抗和PINP重组抗体用于ELISA法，定量测定PINP时与PINP结构及功能相关联物质无明显交叉，可以特异性识别PINP。

5、精密度

批内差测定：选取高、中、低样品浓度，在同一检测板分别做20次重复检测，CV(％)＝SD/mean×100进行测算，目前批内差＜10％作为合格的标准。

批间差测定：选取高、中、低样品浓度，随机3块不同的检测板，每板分别做8次重复检测，CV(％)＝SD/mean×100进行测算，目前批间差＜12％作为合格的标准。

数据显示，PINP重组抗体的批内差异和批间差异小于PINP天然小鼠单抗，PINP天然小鼠单抗低于和商业化试剂盒产品(NBP2-76465，R&D)。在精密度方面，PINP重组抗体优于PINP天然小鼠单抗和商业化产品。

6、稳定性：高温和反复冻融会影响抗体的活性。抗体的稳定性保障了检测的稳定性。将抗体做热稳定性及反复冻融处理，用于通过实验验证抗体的性能，以证实抗体稳定性，符合临床用检测试剂盒原料的性能要求。

热稳定性考核：将分别3个批次的PINP天然小鼠单抗和PINP重组抗体置于37℃，10天后，每个批次测定标准曲线及8例样本，通过评估标准曲线回归系数R²以及O.D.值下降幅度以及批次间差异性确定抗体活性。

反复冻融考核：分别3个批次的PINP天然小鼠单抗和PINP重组抗体置于-20℃反复冻融5次，每个批次测定标曲及8例样本，通过评估标准曲线回归系数R²以及O.D.值下降幅度以及批次间差异性确定抗体活性。

结果如下：

A.标准曲线和整体O.D.值变化趋势

结果参见图12，系列1：PINP重组抗体未破坏的标准曲线；系列2：PINP重组抗体37℃放置10天后的标准曲线；系列3：PINP重组抗体-20℃反复冻融5次的标准曲线；系列4：PINP天然小鼠单抗未破坏的标准曲线；系列5：PINP天然小鼠单抗37℃放置10天后的标准曲线；系列6：PINP天然小鼠单抗-20℃反复冻融5次的标准曲线。结果显示，37℃放置10天后的PINP重组抗体标准曲线各浓度对应O.D.值相较于未处理平均下降4.3％，而PINP天然小鼠单抗下降5.0％；反复冻融5次后PINP重组抗体标准曲线平均下降6.4％,而PINP天然小鼠单抗下降8.2％。37℃放置10天后或反复冻融5次后，使用重组抗体较天然小鼠单抗整体O.D.值下降幅度更小。

B.评估标准曲线回归系数R²

C.评估3个批次的抗体破坏前和破坏后的精密度。

通过室温37℃放置10天或反复冻融5次破化处理抗体前后的标准曲线和整体O.D.值变化趋势、标准曲线回归系数R²以及精密度可以看出，PINP重组抗体在这三个指标上均优于PINP天然小鼠单抗。结果表明，PINP重组抗体稳定性优于PINP天然小鼠单抗。

结论：通过各种性能测定，包括线性范围，标准曲线回归系数R²，灵敏度，精密度，特异性以及稳定性等方面，PINP重组抗体，PINP天然小鼠单抗均能识别重组及天然P1NP蛋白，且PINP重组抗体的性能优于P1NP天然小鼠单抗，亦优于市面上商业化产品。另外，在高温和反复冻融的情况下，重组抗体的活性不受影响，仍适用于ELISA法定量测定PINP，稳定性佳。

实施例3、PINP重组抗体以及PINP天然小鼠单抗用于CLIA法检测结果对比

临床上常用CLIA法定量测定靶标物。PINP重组抗体以及PINP天然小鼠单抗适用于CLIA法。我们分别将PINP重组抗体以及PINP天然小鼠单抗做为包被抗体(2ug/ml)包被96孔板，然后用同一个PINP多抗标记，噜米诺作为底物，重组PINP作为标准品，检测抗体，进行CLIA检测，结果如下：

1、检测范围

PINP重组抗体用于CLIA法检测范围为：1.5pg/mL-10,000pg/mL；

PINP天然小鼠单抗用于CLIA法检测范围为：4.6pg/mL-30,000pg/mL。

2、CLIA法标准曲线回归系数R²

PINP重组抗体R²为0.9999；

PINP天然小鼠单抗R²为0.9984。

3、CLIA法灵敏度：此值为20个空白样品(即标准品稀释液)测定的平均值加二倍标准差所对应的浓度。

PINP重组抗体灵敏度：0.77pg/mL；

PINP天然小鼠单抗灵敏度：1.79pg/mL。

4、CLIA法特异性

表格中，PIINP表示人Ⅱ型前胶原氨基端原肽，PIIINP表示人Ⅲ型前胶原氨基端原肽：COL1表示I型胶原，COL1a2表示人I型胶原α2：COL1a1表示人I型胶原α1：CTX1表示人I型胶原交联羧基端肽。

数据显示，PINP天然小鼠单抗和PINP重组抗体用于CLIA法，定量测定PINP时与PINP结构及功能相关联物质无明显交叉，可以特异性识别PINP。

5、CLIA法精密度

CLIA法精密度验证数据显示，PINP重组抗体和PINP天然小鼠单抗批内差异和批间差异远优于合格标准，PINP重组抗体的批内差异和批间差异小于PINP天然小鼠单抗。在精密度方面，PINP重组抗体优于PINP天然小鼠单抗。

6、CLIA法样本测定

A.选取健康体检者和骨质疏松患者总计100份血清样本，使用实施例1所得的PINP重组抗体用于CLIA法定量测定上述100份样本中PINP，检测结果如下：

PINP重组抗体临床样本相关性检测以及与其它商业化抗体数据对比参见图13。

7、稳定性：高温和反复冻融会影响抗体的活性。抗体的稳定性保障了检测的稳定性。将抗体做热稳定性及反复冻融处理后，用于CLIA法后，评估标准曲线，测值情况以及批次间测样差异性等确定抗体的性能，以证实抗体稳定性，符合临床用检测试剂盒原料的性能要求。

热稳定性考核：将分别3个批次的PINP天然小鼠单抗和PINP重组抗体置于37℃，10天后，每个批次抗体用于CLIA法，测定标曲及8例样本，通过评估标准曲线回归系数R²以及O.D.值下降幅度以及批次间差异性确定抗体活性。

反复冻融考核：分别3个批次的PINP天然小鼠单抗和PINP重组抗体置于-20℃反复冻融5次，每个批次抗体用于CLIA法，测定标曲及8例样本，通过评估标准曲线回归系数R²以及O.D.值下降幅度以及批次间差异性确定抗体活性。结果如下：

A.评估标准曲线整体RLU值变化趋势

结果显示，37℃放置10天后的PINP重组抗体标准曲线各浓度对应RLU值相较于未处理平均下降4.1％，而PINP天然小鼠单抗下降4.3％；反复冻融5次后PINP重组抗体标准曲线平均下降5.2％,而PINP天然小鼠单抗下降8.8％。37℃放置10天后或反复冻融5次后，使用重组抗体较天然小鼠单抗整体RLU值下降幅度更小。

B.评估标准曲线回归系数R²以及整体RLU值变化趋势

C.评估3个批次的抗体破坏前和破坏后的精密度。

通过室温37℃放置10天或反复冻融5次破化处理抗体前后的标准曲线整体RLU值变化趋势、标准曲线回归系数R²以及精密度可以看出，PINP重组抗体在这三个指标上均优于PINP天然小鼠单抗。结果表明，PINP重组抗体稳定性优于PINP天然小鼠单抗。

结论：通过各种性能测定，包括线性范围，标准曲线回归系数R²，灵敏度，精密度，特异性以及稳定性等方面，PINP重组抗体，PINP天然小鼠单抗均能识别重组及天然P1NP蛋白，且PINP重组抗体的性能优于P1NP天然小鼠单抗，亦优于市面上商业化产品。另外，在高温和反复冻融的情况下，重组抗体的活性不受影响，仍适用于CLIA法定量测定PINP，稳定性佳。

序列表

<110> 武汉云克隆科技股份有限公司

<120> 一种PINP重组抗体的重/轻链可变区及编码基因和重组抗体

<160> 24

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ala Tyr

20 25 30

Trp Met Gln Trp Leu Arg Gln Ser Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Val Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Ala Arg Tyr Thr Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Phe His His Asp Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 2

<211> 358

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gaggtgcaac tgcagcagtc tggggctgag ctggcaagac ctgggggttc agtgaagttg 60

tcctgcaagg cttctggcta cagctttact gcctactgga tgcagtggtt aagacagagc 120

cctggacggg gtctggagtg gattggagtt atttatcctg gagatggtga tgctaggtat 180

actcagaagt tccagggcaa ggccacattg actgcagata aatcctccag cacagcctac 240

atgcaactca gcagcttggc atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagatggttc 300

caccatgact atgttatgga ctactggggc caagggacca cggtcaccgt ctcctcaa 358

<210> 3

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Lys Ser Met Ser Met Ser Val Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Gly Thr Tyr

20 25 30

Val Ser Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Glu Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Cys Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Asp Tyr His Cys Gly Gln Ile Tyr Asn Tyr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 4

<211> 322

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gacattcagc tgacccagtc tcccaaatcc atgtccatgt cagtaggaga gagggtcacc 60

ttgagctgca aggccagtga aaatgtgggt acttatgtat cctggtatca acagagacca 120

gagcagtctc ctaaactgct gatatacggg gcatccaacc ggtgcactgg ggtccccgat 180

cgcttcacag gcagtggatc tggaacagat ttcactctga ccataagcag tgtacaggct 240

gaagaccttg cagattatca ctgtggacag atttacaact atccgctcac gttcggtgct 300

gggaccaagc tggagatcaa ac 322

<210> 5

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cggaattcgg aggtgcaact gcagcagtct ggggctg 37

<210> 6

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ctagctagct gaggagacgg tgaccgtggt cccttgg 37

<210> 7

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cggaattcag acattcagct gacccagtct cccaaatc 38

<210> 8

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ccgctcgagt ttgatctcca gcttggtccc agcaccga 38

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gacattcagc tgacccagtc tcca 24

<210> 10

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gggaattcga yattgtgmtr acmcarkmtc aa 32

<210> 11

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

atgaggrccc ctgctcagwt tyttggwtct t 31

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

aggagacaga cacactcctg ctat 24

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gttagatctc cagcttggtc cc 22

<210> 14

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ggaagcttac tggatggtgg gaagatgga 29

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

atgragwcac akwcycagtc tt 22

<210> 16

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

cccaagctta ctggatggtg ggaaatgga 29

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

aggtsmarct gcagsagtcw gg 22

<210> 18

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gggaattcsa ggtsmarctg cagsagtct 29

<210> 19

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

tgaggagacg gtgaccgtgg tcccttggcc ccag 34

<210> 20

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

ggaagcttay ctccacacac aggrrccagt ggatagac 38

<210> 21

<211> 1437

<212> DNA

<213> 人工序列(2384-E13-VH1a)

<400> 21

atgtacagga tgcaactcct gtcttgcatt gcactaagtc ttgcacttgt cacgaattcg 60

gaggtgcaac tgcagcagtc tggggctgag ctggcaagac ctgggggttc agtgaagttg 120

tcctgcaagg cttctggcta cagctttact gcctactgga tgcagtggtt aagacagagc 180

cctggacggg gtctggagtg gattggagtt atttatcctg gagatggtga tgctaggtat 240

actcagaagt tccagggcaa ggccacattg actgcagata aatcctccag cacagcctac 300

atgcaactca gcagcttggc atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagatggttc 360

caccatgact atgttatgga ctactggggc caagggacca cggtcaccgt ctcctcagct 420

agcagcgcta aaacaacacc cccatcagtc tatccactgg cccctgggtg tggagataca 480

actggttcct ctgtgactct gggatgcctg gtcaagggct acttccctga gtcagtgact 540

gtgacttgga actctggatc cctgtccagc agtgtgcaca ccttcccagc tctcctgcag 600

tctggactct acactatgag cagctcagtg actgtcccct ccagcacctg gccaagtcag 660

accgtcacct gcagcgttgc tcacccagcc agcagcacca cggtggacaa aaaacttgag 720

cccagcgggc ccatttcaac aatcaacccc tgtcctccat gcaaggagtg tcacaaatgc 780

ccagctccta acctcgaggg tggaccatcc gtcttcatct tccctccaaa tatcaaggat 840

gtactcatga tctccctgac acccaaggtc acgtgtgtgg tggtggatgt gagcgaggat 900

gacccagacg tccggatcag ctggtttgtg aacaacgtgg aagtacacac agctcagaca 960

caaacccata gagaggatta caacagtact atccgggtgg tcagtgccct ccccatccag 1020

caccaggact ggatgagtgg caaggagttc aaatgcaagg tcaacaacaa agacctccca 1080

tcacccatcg agagaaccat ctcaaaaatt aaagggctag tcagagctcc acaagtatac 1140

atcttgccgc caccagcaga gcagttgtcc aggaaagatg tcagtctcac ttgcctggtc 1200

gtgggcttca accctggaga catcagtgtg gagtggacca gcaatgggca tactgaggag 1260

aactacaagg acaccgcacc agtcctggac tctgacggtt cttacttcat atacagcaag 1320

ctcgatataa aaacaagcaa gtgggagaaa acagattcct tctcatgcaa cgtgagacac 1380

gagggtctga aaaattacta cctgaagaag accatctccc ggtctccggg taaatga 1437

<210> 22

<211> 478

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu

1 5 10 15

Val Thr Asn Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala

20 25 30

Arg Pro Gly Gly Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser

35 40 45

Phe Thr Ala Tyr Trp Met Gln Trp Leu Arg Gln Ser Pro Gly Arg Gly

50 55 60

Leu Glu Trp Ile Gly Val Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Ala Arg Tyr

65 70 75 80

Thr Gln Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser

85 90 95

Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala

100 105 110

Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Phe His His Asp Tyr Val Met Asp Tyr

115 120 125

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Ser Ala Lys

130 135 140

Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Cys Gly Asp Thr

145 150 155 160

Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro

165 170 175

Glu Ser Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Ser Val

180 185 190

His Thr Phe Pro Ala Leu Leu Gln Ser Gly Leu Tyr Thr Met Ser Ser

195 200 205

Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Thr Val Thr Cys

210 215 220

Ser Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Thr Val Asp Lys Lys Leu Glu

225 230 235 240

Pro Ser Gly Pro Ile Ser Thr Ile Asn Pro Cys Pro Pro Cys Lys Glu

245 250 255

Cys His Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe

260 265 270

Ile Phe Pro Pro Asn Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Thr Pro

275 280 285

Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val

290 295 300

Arg Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr

305 310 315 320

Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Ile Arg Val Val Ser Ala

325 330 335

Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys

340 345 350

Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser

355 360 365

Lys Ile Lys Gly Leu Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Ile Leu Pro Pro

370 375 380

Pro Ala Glu Gln Leu Ser Arg Lys Asp Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

385 390 395 400

Val Gly Phe Asn Pro Gly Asp Ile Ser Val Glu Trp Thr Ser Asn Gly

405 410 415

His Thr Glu Glu Asn Tyr Lys Asp Thr Ala Pro Val Leu Asp Ser Asp

420 425 430

Gly Ser Tyr Phe Ile Tyr Ser Lys Leu Asp Ile Lys Thr Ser Lys Trp

435 440 445

Glu Lys Thr Asp Ser Phe Ser Cys Asn Val Arg His Glu Gly Leu Lys

450 455 460

Asn Tyr Tyr Leu Lys Lys Thr Ile Ser Arg Ser Pro Gly Lys

465 470 475

<210> 23

<211> 705

<212> DNA

<213> 人工序列(10053-H20-VK)

<400> 23

atgtacagga tgcaactcct gtcttgcatt gcactaagtc ttgcacttgt cacgaattca 60

gacattcagc tgacccagtc tcccaaatcc atgtccatgt cagtaggaga gagggtcacc 120

ttgagctgca aggccagtga aaatgtgggt acttatgtat cctggtatca acagagacca 180

gagcagtctc ctaaactgct gatatacggg gcatccaacc ggtgcactgg ggtccccgat 240

cgcttcacag gcagtggatc tggaacagat ttcactctga ccataagcag tgtacaggct 300

gaagaccttg cagattatca ctgtggacag atttacaact atccgctcac gttcggtgct 360

gggaccaagc tcgagatcaa acgggcagat gctgcaccaa ctgtatccat cttcccacca 420

tccagtgagc agttaacatc tggaggtgcc tcagtcgtgt gcttcttgaa caacttctac 480

cccaaagaca tcaatgtcaa gtggaagatt gatggcagtg aacgacaaaa tggcgtcctg 540

aacagttgga ctgatcagga cagcaaagac agcacctaca gcatgagcag caccctcacg 600

ttgaccaagg acgagtatga acgacataac agctatacct gtgaggccac tcacaagaca 660

tcaacttcac ccattgtcaa gagcttcaac aggaatgagt gttag 705

<210> 24

<211> 234

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu

1 5 10 15

Val Thr Asn Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Lys Ser Met Ser

20 25 30

Met Ser Val Gly Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Glu Asn

35 40 45

Val Gly Thr Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Glu Gln Ser Pro

50 55 60

Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Cys Thr Gly Val Pro Asp

65 70 75 80

Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

85 90 95

Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr His Cys Gly Gln Ile Tyr

100 105 110

Asn Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

115 120 125

Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln

130 135 140

Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr

145 150 155 160

Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln

165 170 175

Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

180 185 190

Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg

195 200 205

His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro

210 215 220

Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys

225 230

Claims

1.一种PINP重组抗体，包括重链恒定区、重链可变区、轻链恒定区和轻链可变区，其特征在于：所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

2.权利要求1所述PINP重组抗体的重链可变区的编码基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.用于扩增权利要求2所述重链可变区的编码基因的引物，其特征在于，核苷酸序列如下：

Mu-EcoRI/VH-F1（10053-H20-4-2nd）上游引物：

5’-CGGAATTCG GAGGTGCAACTGCAGCAGTCTGGGGCTG-3’；

Mu-NheI/VH-R1（10053-H20-4-2nd）下游引物：

5’-CTAGCTAGC TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGG-3’。

4.权利要求1所述PINP重组抗体的轻链可变区的编码基因，其特征在于，所述核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

5.用于扩增权利要求4所述轻链可变区的编码基因的引物，其特征在于，核苷酸序列如下：

Mu-EcoRI/VL-F1（10053-H20-4-2nd）上游：

5’-CGGAATTCA GACATTCAGCTGACCCAGTCTCCCAAATC-3’；

Mu-Xhol/VL-R1（10053-H20-4-2nd）下游：

5’-CCGCTCGAG TTTGATCTCCAGCTTGGTCCCAGCACCGA-3’。

6.一种重组质粒，其特征在于，含有权利要求2和4所述的编码基因。

7.用于扩增权利要求1所述PINP重组抗体的轻链可变区的引物，其特征在于，核苷酸序列如下：

PINP单克隆抗体轻链可变区上游引物：

Vk-mu-F1: 5’-GACATTCAGCTGACCCAGTCTCCA-3’；

Vk-mu-F2: 5’-GGGAATTCGAYATTGTGMTRACMCARKMTCAA-3’；

Vk-mu-F3: 5’-ATGAGGRCCCCTGCTCAGWTTYTTGGIWTCTT-3’；

Vk-mu-F4: 5’-AGGAGACAGACACACTCCTGCTAT-3’；

PINP单克隆抗体抗体轻链可变区下游引物：

Vk-mu-R1:5’-GTTAGATCTCCAGCTTGGTCCC-3’；

Vk-mu-R2:5’-GGAAGCTTACTGGATGGTGGGAAGATGGA-3’；

Vk-mu-R3:5’-ATGＲAGWCACAKWCYCAGTCTT-3’；

Vk-mu-R4:5’-CCCAAGCTTACTGGATGGTGGGAAATGGA-3’。