CN108484770A - 重组大鼠抗小鼠cd4单克隆抗体，制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种重组大鼠抗小鼠CD4单克隆抗体，制备方法和应用，包括重链恒定区、重链可变区、轻链恒定区和轻链可变区，其中重链可变区含有CDR1、CDR2、CDR3，编码基因序列依次如SEQ ID NO.6～8，翻译氨基酸序列依次如SEQ ID NO.1～3所示，轻链可变区含有CDR1、CDR2、CDR3，编码基因序列依次如SEQ ID NO.9、9‑1、10，翻译氨基酸序列依次如SEQ ID NO.4、4‑1、5所示。该重组单抗结构明确、效价高、稳定性更好。

Description

重组大鼠抗小鼠CD4单克隆抗体，制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物工程方面单克隆抗体的制备技术领域，具体涉及一种重组大鼠抗小鼠CD4单克隆抗体，制备方法和应用。

背景技术

抗体是生物科学领域的主力，但是它的可靠性一再让研究人员处于窘境。如今，科研者最常遇到的问题主要有：购买的用于检测蛋白X的抗体优先与蛋白Y结合(甚至可能完全不与X结合)；可重复性差，用新抗体重复以前的实验，发现结果无法重复。一个好项目因此搁浅，抗体的不可靠性问题非常让人警醒。同一个抗体在几次平行实验里得出的结果不同，将会产生灾难性的结果，而导致这一结果却可能与抗体的生产过程有关。特异性不足、敏感度和批次差异性等导致了错误的科研发现和大量的科研精力浪费；抗体的不可靠性造成了癌症、代谢、老化、免疫学和细胞信号转导以及任何研究复杂的生物分子领域的巨大损失；因抗体而造成的在时间和资源方面的浪费非常巨大。

传统的抗体制备是通过免疫动物获得单克隆抗体和多克隆抗体，其中多克隆抗体是通过收集经过目标抗原刺激动物获得免疫后的血液而制成的(只要这只动物还活着，就能够一直提供多克隆抗体)；单克隆抗体是通过宿主动物接受目标蛋白免疫，然后提取出能识别并对该抗原发生响应的B细胞，使其与骨髓瘤细胞发生融合，从而成为可永久培养的细胞，不断产生目的抗体。

相比之下，重组抗体不同于传统的单克隆抗体，因为它们的制备只需要前期免疫动物甚至不需要动物参与。可通过检测产生该抗体的基因序列(通过对动物的免疫细胞进行测序、或自己设定序列，检测产生的蛋白是否符合目标蛋白)；再将该基因插入到合适的细胞株中，从而产生抗体。由于抗体是确定的，即使原始细胞株死亡或发生突变，也能通过基因插入，产生需要的细胞株。

越来越多的科学家认为，单克隆抗体和多克隆抗体最终会被“结构更明确”的重组抗体完全取代。许多蛋白质不能被现有的试剂识别，这是因为使用了结构不明确的多克隆抗体，而使用一些基因可识别或存储的试剂能够克服这一点。尽管多克隆抗体具有广泛可用性，是目前研发最便宜的抗体，适用于制备一些研究较少的抗体。但随着目标蛋白结构和功能的不断明确，以及临床转化的需求，重组克隆抗体也将大有可为。

小鼠基因结构、个体发生和发育过程、组织细胞结构和功能与人类相近，它在了解功能基因、疾病基因以及在整体生物水平上研究复杂的生命现象和未知基因的功能方面已成为重要的模式生物，在生物医学领域受到了广泛的应用。由于单抗制备技术的局限性，小鼠作为宿主动物对于自身蛋白存在耐受性，无法产生免疫应答而获得可以用于小鼠模型研究的工具抗体。尽管目前小鼠模型使用广泛，而缺乏针对小鼠的单抗给研究造成了很大困难。为了解决这个问题，本发明利用基因工程抗体技术制备重组大鼠抗小鼠CD4单克隆抗体，解决了传统单克隆抗体指标技术物种局限性，产量低及批量差大的问题。通过检测产生该抗体的基因序列，后将其插入到合适的细胞株中，从而产生抗体。该技术具备抗体结构更为明确，产量大，批间差小，单位生产成本低，可以广泛用于疾病模型研究，临床转化以及治疗等。

发明内容

本发明的目的在于提供一种重组大鼠抗小鼠CD4单克隆抗体，制备方法和应用。该重组抗体结构明确、效价高、稳定性更好。

本发明提供的重组大鼠抗小鼠CD4单克隆抗体，包括重链恒定区、重链可变区、轻链恒定区和轻链可变区，其重链可变区含有CDR1、CDR2、CDR3，其氨基酸序列依次如SEQ IDNO.1～3所示，轻链可变区含有CDR1、CDR2、CDR3，其氨基酸序列依次如SEQ ID NO.4、4-1、5所示。

优选的，上述重组大鼠抗小鼠CD4单克隆抗体中，所述重链可变区CDR1、CDR2、CDR3的编码基因依次如SEQ ID NO:6～8所示。

本发明还提供了一种含有以上所述的编码基因(重链可变区CDR1、CDR2、CDR3的编码基因)的表达载体。

优选的，上述表达载体中，所述重链可变区的编码基因如SEQ ID NO.12所示。

优选的，上述重组大鼠抗小鼠CD4单克隆抗体中，轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3的编码基因依次如SEQ ID NO:9、9-1、10所示。

本发明还提供了一种含有以上所述的编码基因(轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3的编码基因)的表达载体。

优选的，上述表达载体中，所述轻链可变区的编码基因如SEQ ID NO.11所示。

本发明还提供了一种以上任一所述的重组大鼠抗小鼠CD4单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：

(1)用小鼠CD4抗原免疫大鼠，获得大鼠脾脏细胞，大鼠脾脏细胞与SP20融合获得杂交瘤细胞，提取RNA，逆转录获得cDNA；

(2)设计引物，以cDNA为模板，扩增含有权利要求1～3任一所述的重链可变区和轻链可变区的编码基因；

(3)获得的重链可变区编码基因转入含有重链恒定区基因的表达载体，轻链可变区编码基因转入含有轻链恒定区基因的表达载体，完成质粒重组，重组后的质粒转入DH5α感受态细胞后，挑选阳性克隆测序；

(4)将测序正确的质粒对应的菌液扩大培养并提取质粒，将携带重链和轻链基因的质粒共转染哺乳动物细胞293F细胞或者CHO-S细胞，4-5天收集培养细胞上清进行蛋白纯化，即为重组大鼠抗小鼠CD4单克隆抗体。

优选的，上述重组大鼠抗小鼠CD4单克隆抗体，可用于制备检测小鼠CD4的试剂。

本发明的大鼠重组单抗具有以下有益效果：

1、抗体蛋白质和基因结构均明确，稳定性好，即使该抗体的表达细胞株不存在了也可以重新制备能够表达该抗体的新细胞株。

2、抗体对小鼠CD4抗原表位识别度高，结合特异性高，无论自然抗原还是重组抗原均能有效识别。

3、抗体效价高。

4、抗体产量高。

5、单位生产成本低。

6、摆脱传统单抗制备技术的局限，可制备抗小鼠靶蛋白的单克隆抗体，对比多克隆抗体，特异性更高。

7、抗体批间差小。

附图说明

图1、大鼠脾脏细胞和SP20融合的杂交瘤细胞总RNA(A)和cDNA内参扩增琼脂糖凝胶电泳(B)。

图2、重组大鼠抗小鼠CD4单克隆抗体可变区基因扩增结果。

图3、T克隆蓝白筛选结果。

图4、重组大鼠抗小鼠CD4单克隆抗体可变区基因T克隆扩增产物电泳图。

图5、重组大鼠抗小鼠CD4单克隆抗体轻链可变区基因测序结果(A)及重链可变区基因测序结果(B)。

图6、IMGT/QUEST在线分析软件分析轻链可变区基因同源性比较结果(A)及重链可变区基因同源性比较结果(B)

图7、重组大鼠抗小鼠CD4单克隆抗体恒定区基因扩增结果。

图8、小鼠重链恒定区载体pFUSEss-CHIg-mG2B基因图谱(载体改造模板)。

图9、小鼠轻链恒定区载体pFUSE2ss-CLIg-mk基因图谱(载体改造模板)。

图10、重组大鼠抗小鼠CD4单克隆抗体轻链恒定区基因测序结果。

图11、重组大鼠抗小鼠CD4单克隆抗体重链恒定区基因测序结果。

图12、真核表达并纯化的重组大鼠抗小鼠CD4单克隆抗体的SDS-PAGE检测结果。

图13、WB检测重组大鼠抗小鼠CD4单克隆抗体与小鼠脾脏和重组小鼠CD4抗原的结合活性电泳图。

图14、FCM检测重组大鼠抗小鼠CD4单克隆抗体与PBMC的结合活性检测结果。

图15、ELISA检测重组大鼠抗小鼠CD4单克隆抗体与重组小鼠CD4抗原的结合活性检测结果。

图16、重组大鼠抗小鼠CD4单克隆抗体制备流程图。

图17、重组大鼠抗小鼠CD4单克隆抗体制备流程图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

生物材料来源：

大鼠脾脏细胞：武汉云克隆科技股份有限公司；

SP2/0：武汉云克隆科技股份有限公司；

pGEM-T载体：北京全式金生物技术(TransGen Biotech)有限公司；

小鼠重链恒定区载体pFUSEss-CHIg-mG2B(载体改造模板)：美国InvivoGen公司；

小鼠轻链恒定区载体pFUSE2ss-CLIg-mk(载体改造模板)：美国InvivoGen公司；

大鼠重链恒定区载体pFUSEss_CHIg_ratG2B：改造小鼠重链恒定区载体pFUSEss-CHIg-mG2B获得；

大鼠轻链恒定区载体pFUSE2ss_CLIg_ratK：改造小鼠轻链恒定区载体pFUSE2ss-CLIg-mk获得。

实施例中所使用的其他生物材料及试剂均为可直接购买的商品。如无特殊说明，实施例中所述的技术方法也均为本领域常规技术手段。

实施例1重组大鼠抗小鼠CD4单克隆抗体的制备

图16和17为重组大鼠抗小鼠CD4单克隆抗体制备流程图。

一、重组大鼠抗小鼠CD4单克隆抗体可变区基因钓取

1、杂交瘤细胞RNA提取及逆转录结果

先通过小鼠CD4抗原免疫大鼠，获得大鼠脾脏细胞，大鼠脾脏细胞与SP20融合获得杂交瘤细胞，Trizol法提取杂交瘤细胞RNA，经琼脂糖凝胶电泳可见清晰的28S和18S条带，说明RNA完整性较好。RNA浓度和纯度测定结果为D(260nm)/D(280nm)＝1.85，可以满足本实验要求。以RNA为模板反转录合成cDNA，以cDNA为模板，大鼠内参基因β-actin为引物进行PCR扩增，扩增出长度为380bp的目的条带，说明逆转录cDNA可用于后续实验。参见图1，为大鼠脾脏细胞和SP20融合的杂交瘤细胞总RNA(A)和cDNA内参扩增琼脂糖凝胶电泳(B)。

2、重组大鼠抗小鼠CD4单克隆抗体可变区PCR扩增

引物序列：通过多序列比对和简并引物设计算法，在重组大鼠抗小鼠CD4单克隆抗体前导肽和可变区的相对恒定区设计可扩增重组大鼠抗小鼠CD4单克隆抗体可变区基因的引物。

以cDNA为模板，用TaqDNA酶扩增McAb V区(单克隆抗体可变区)基因。扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果显示：VH(重链可变区)基因片段长度约为350-400bp，VL(轻链可变区)基因片段长度约为350bp(参见图2)，与目的片段长度一致。

3、纯化V区基因与T-载体连接

用胶回收试剂盒纯化PCR产物，将VH基因和VL基因分别与pGEM-T载体连接，转化大肠杆菌。经蓝白筛选挑选白色菌落PCR鉴定(参见图3)。每一连接物各挑取12个单克隆，用通用引物进行菌落PCR，目的片段大小为500bp左右(图4)，将其中条带明亮的6个阳性克隆菌送基因测序公司测序。

4、重组大鼠抗小鼠CD4单克隆抗体的可变区序列测序结果

从步骤3中6个阳性克隆的9条有效序列当中优选2条，一条轻链可变区，一条重链可变区，分别标记为Rat-anti-mu-CD4-1602-C17-VL和Rat-anti-mu-CD4-1602-C17-VH。

4.1Ra-anti-mu-CD4-1602-C17-VL测序结果如图5(A)所示。

利用IMGT/QUEST在线分析软件，对轻链基因进行同源性比较，有效序列如下：

gatgttgtgctgacccagactccagtgtctttgtcagttgccattggacaaccagcctcc

atctcttgcaagtcaagtcagagcctcgtacatagtgatggagagacatatttgaattgg

ttattacagaggcccggccagtctccaaagcgactgatctatctggtgtccaaactggac

tctgggattcctgataggttcagtggcagtggatcagagacagattttactcttaaaatc

agcagagtggaagctgatgatttgggagtttattactgcttgcaaggtacacattttccg

tgggcgttcggtggaggcaccaggctggagttgaaac(SEQ ID NO.11)。

软件分析结果参见图6(A)。功能性轻链可变区全长为337个碱基，结构域从第1位碱基开始，编码112个氨基酸，该有功能的轻链均属于Ratnor IGKV1S18*01F家族，V区匹配率为98.98％，J区为92.11％。具体结构域划分为：

重组大鼠抗小鼠CD4单克隆抗体，轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3的编码基因依次如SEQ ID NO:10～12所示。

CDR1：cagagcctcgtacatagtgatggagagacatat (SEQ ID NO.9)；

CDR2：ctggtgtcc (SEQ ID NO.9-1)；

CDR3：ttgcaaggtacacattttccgtgggcg (SEQ ID NO.10)。

重组大鼠抗小鼠CD4单克隆抗体，轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3的编码基因翻译成氨基酸序列依次如SEQ ID NO:4～6所示

CDR1：QSLVHSDGETY (SEQ ID NO.4)；

CDR2：LVS (SEQ ID NO.4-1)；

CDR3：LQGTHFPWA (SEQ ID NO.5)。

4.2Ra-anti-mu-CD4-1602-C17-VH测序结果如图5(B)所示。

利用IMGT/QUEST在线分析软件，对重链可变区基因进行同源性比较，有效序列如下：

gaagtgaagctgttagaatctgggggaggcttagtgcagcctggaaggtccctgaaactc

tcctgtgcgggctcaggattcactttcagtgactataacatggcctgggtccgccaggct

ccaaagaagggtctggaatgggtcgcaactattagttatgatggtactagaacttactat

cgagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagataacgcaaagagcaccctatac

ctgcaaatggacagtctgaggtctgaggacgcggccacttatcactgtgcaagtcctggg

tttgcttactggggccaaggcaccacggtcaccgtctcctccc(SEQ ID NO.12)。

软件分析结果参见图6(B)。功能性重链可变区全长为343个碱基，结构域从第1位碱基开始，编码114个氨基酸，rat-anti-mu-CD4单抗有功能的重链均属于Ratnor IGHV5-7*01F家族，V区匹配率为94.79％，J区为78％。具体结构域划分为：

重组大鼠抗小鼠CD4单克隆抗体，重链可变区CDR1、CDR2、CDR3的编码基因依次如SEQ ID NO:7～9所示。

CDR1：ggattcactttcagtgactataac (SEQ ID NO.6)；

CDR2：attagttatgatggtactagaact (SEQ ID NO.7)；

CDR3：gcaagtcctgggtttgcttac (SEQ ID NO.8)。

重组大鼠抗小鼠CD4单克隆抗体，重链可变区CDR1、CDR2、CDR3的编码基因翻译成氨基酸序列依次如SEQ ID NO:1～3所示：

CDR1：GFTFSDYN (SEQ ID NO.1)；

CDR2：ISYDGTRT (SEQ ID NO.2)；

CDR3：ASPGFAY (SEQ ID NO.3)。

二、大鼠载体改造

1、引物设计

大鼠单抗恒定区基因扩增：Trizol法提取大鼠脾细胞RNA，以RNA为模板反转录合成cDNA，设计大鼠单抗恒定区引物，以大鼠脾细胞cDNA为模板进行重链和轻链的扩增，重链1014bp，轻链327bp，结果如图7所示。

2、载体改造

分别以小鼠重链恒定区载体pFUSEss-CHIg-mG2B和小鼠轻链恒定区载体pFUSE2ss-CLIg-mk为骨架，将以上大鼠抗体重链和轻链恒定区的扩增产物胶回收之后分别连入小鼠重链恒定区载体pFUSEss-CHIg-mG2B(图8)和小鼠轻链恒定区载体pFUSE2ss-CLIg-mk(图9)。

2.1轻链恒定区改造：用Xho I和NheI双酶切载体pFUSE2ss-CLIg-mk，得到3524bp和338bp大小两条带；扩增大鼠轻链Igk恒定区基因，用Xho I和NheI双酶切后连入3524bp的目的带，测序鉴定确认。基因测序结果见图10。

GCAGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCATGGAACAGTTAACATCTGGAGGTGCCACAGTCGTGTGCTTCGTGAACAACTTCTATCCCAGAGACATCAGTGTCAAGTGGAAGATTGATGGCAGTGAACAACGAGATGGTGTCCTGGACAGTGTTACTGATCAGGACAGCAAAGACAGCACGTACAGCATGAGCAGCACCCTCTCGTTGACCAAGGTTGAATATGAAAGGCATAACCTCTATACCTGTGAGGTTGTTCATAAGACATCATCCTCACCCGTCGTCAAGAGCTTCAACAGGAATGAGTGTTAGGCTAGC(SEQ ID NO.13)。

将以上序列与携带大鼠单抗轻链恒定区的商业化载体pFUSE2ss_CLIg_ratK比对，同源性为100％，说明大鼠轻链恒定区载体改造成功。

2.2重链恒定区改造：pFUSEss-CHIg-mG2B载体上含有两个SacI酶切位点，不能直接将pFUSEss-CHIg-mG2B用NheI和SacI进行双酶切。对于重链的改造可进行两步酶切法后与大鼠重链恒定区基因连接：先将pFUSEss-CHIg-mG2B用NheI进行单酶切得到4535bp的线性化载体，跑胶回收(有未切开的)；再用SacI将线性化载体进行酶切，理论上可得到以下几种条带：4535bp(未切开的线性化载体)，3513bp和1022bp的条带(期望条带)，3825bp和710bp的条带，312bp的条带。回收3513bp的条带与扩增回收的大鼠重链恒定区基因连接，测序鉴定，结果参见图11及如下序列：

GCTAGCGCTCAAACAACAGCCCCATCTGTCTATCCACTGGCTCCTGGATGTGGTGATACAACCAGCTCCACGGTGACTCTGGGATGCCTGGTCAAGGGCTATTTCCCTGAGCCAGTCACCGTGACCTGGAACTCTGGAGCCCTGTCCAGCGATGTGCACACCTTTCCAGCTGTCCTGCAGTCTGGGCTCTACACTCTCACCAGCTCAGTGACCTCCAGCACCTGGCCCAGCCAGACCGTCACCTGCAACGTAGCCCACCCGGCCAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCGCAGAAATGGCGGCATTGGACACAAATGCCCTACATGCCCTACATGTCACAAATGCCCAGTTCCTGAACTCTTGGGTGGACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCAAAGCCCAAGGACATCCTCTTGATCTCCCAGAACGCCAAGGTCACGTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCGAGGAGGAGCCGGACGTCCAGTTCAGCTGGTTTGTGAACAACGTAGAAGTACACACAGCTCAGACACAACCCCGTGAGGAGCAGTACAACAGCACCTTCAGAGTGGTCAGTGCCCTCCCCATCCAGCACCAGGACTGGATGAGCGGCAAGGAGTTCAAATGCAAGGTCAACAACAAAGCCCTCCCAAGCCCCATCGAGAAAACCATCTCAAAACCCAAAGGGCTAGTCAGAAAACCACAGGTATACGTCATGGGTCCACCGACAGAGCAGTTGACTGAGCAAACGGTCAGTTTGACCTGCTTGACCTCAGGCTTCCTCCCTAACGACATCGGTGTGGAGTGGACCAGCAACGGGCATATAGAAAAGAACTACAAGAACACCGAGCCAGTGATGGACTCTGACGGTTCTTTCTTCATGTACAGCAAGCTCAATGTGGAAAGGAGCAGGTGGGATAGCAGAGCGCCCTTCGTCTGCTCCGTGGTCCACGAGGGTCTGCACAATCACCACGTGGAGAAGAGCATCTCCCGGCCTCCGGGTAAATGAGAGCTC(SEQ ID NO.14)。

将以上序列与携带大鼠单抗重链恒定区的商业化载体pFUSEss_CHIg_ratG2B比对，同源性为100％，说明大鼠重链恒定区载体改造成功。

三、重组大鼠抗小鼠CD4单克隆抗体构建以及真核表达纯化：

3.1根据上述经测序确认正确且有功能的重链和轻链可变区基因，结合表达载体的酶切位点以及读码框，设计抗体扩增的二次扩增引物，以相应的T克隆为模板进行二次PCR，PCR产物经限制性内切酶处理后分别连入改造成功的pFUSEss_CHIg_ratG2B和pFUSE2ss_CLIg_ratK，完成质粒重组，重组后的质粒转入DH5α感受态细胞后，挑选阳性克隆测序。

3.2将测序正确的质粒对应的菌液扩大培养并提取质粒。将携带重链和轻链基因的质粒以一定比例共转染哺乳动物细胞293F细胞或者CHO-S细胞，4-5天收集培养细胞上清进行proteinL HP亲和层析纯化，纯化后的抗体SDS-PAGE电泳分析结果如图12。纯化后的抗体命名为重组大鼠抗小鼠CD4单克隆抗体。

四、重组大鼠抗小鼠CD4单克隆抗体活性检测及应用。

4.1Western Blot：待测样本为小鼠脾脏和重组小鼠CD4，以5μg/ml浓度的重组大鼠抗小鼠CD4单克隆抗体孵育，二抗为HRP-羊抗大鼠IgG(0.5μg/ml)，结果表明重组大鼠抗小鼠CD4单克隆抗体可以很好地识别天然样本(55kd)和原核表达的重组蛋白(47kd)。参见图13，其中泳道A样本为小鼠脾脏，泳道B样本为重组小鼠CD4。

4.2流式细胞术检测重组大鼠抗小鼠CD4单克隆抗体与小鼠PBMC的结合特性：取小鼠眼球血，ACK裂解红细胞并进行封闭处理后将细胞重悬至10⁶个/100μL，孵育一抗重组大鼠抗小鼠CD4单克隆抗体(10μg/ml)和二抗APC-羊抗大鼠IgG(10μg/ml)进行流式检测，结果如图14所示。

结论：重组大鼠抗小鼠CD4单克隆抗体与天然样本有很好的结合活性，可以很好地用于流式检测。

4.3ELISA效价测定：用重组小鼠CD4(1μg/m1)包板，用间接ELISA法检测，加入以梯度稀释(1：100到1：3276800稀释)的重组大鼠抗小鼠CD4单克隆抗体，结果显示，重组大鼠抗小鼠CD4单克隆抗体与重组小鼠CD4蛋白可特异性结合，具有较好的量效关系，结果如表1所示。在抗体稀释1638400倍时，仍可识别小鼠CD4表位，预测该重组大鼠抗小鼠CD4单克隆抗体效价为1,600,000。

表1.ELISA检测重组大鼠抗小鼠CD4单克隆抗体与重组小鼠CD4的结合效价

	稀释倍数	OD值	稀释倍数	OD值
					A	100	3.667	25600	2.294
B	200	3.798	51200	1.437
					C	400	3.511	102400	0.834
D	800	3.498	204800	0.485
					E	1600	3.101	409600	0.329
F	3200	2.995	819200	0.259
					G	6400	2.798	1638400	0.156
H	12800	2.562	blank	0.056

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

序列表

<110> 武汉云克隆科技股份有限公司

<120> 重组大鼠抗小鼠CD4单克隆抗体，制备方法和应用

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Asn

1 5

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Ile Ser Tyr Asp Gly Thr Arg Thr

1 5

<210> 3

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Ala Ser Pro Gly Phe Ala Tyr

1 5

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Gln Ser Leu Val His Ser Asp Gly Glu Thr Tyr

1 5 10

<210> 5

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Leu Gln Gly Thr His Phe Pro Trp Ala

1 5

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggattcactt tcagtgacta taac 24

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

attagttatg atggtactag aact 24

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gcaagtcctg ggtttgctta c 21

<210> 9

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cagagcctcg tacatagtga tggagagaca tat 33

<210> 10

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ttgcaaggta cacattttcc gtgggcg 27

<210> 11

<211> 337

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gatgttgtgc tgacccagac tccagtgtct ttgtcagttg ccattggaca accagcctcc 60

atctcttgca agtcaagtca gagcctcgta catagtgatg gagagacata tttgaattgg 120

ttattacaga ggcccggcca gtctccaaag cgactgatct atctggtgtc caaactggac 180

tctgggattc ctgataggtt cagtggcagt ggatcagaga cagattttac tcttaaaatc 240

agcagagtgg aagctgatga tttgggagtt tattactgct tgcaaggtac acattttccg 300

tgggcgttcg gtggaggcac caggctggag ttgaaac 337

<210> 12

<211> 343

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gaagtgaagc tgttagaatc tgggggaggc ttagtgcagc ctggaaggtc cctgaaactc 60

tcctgtgcgg gctcaggatt cactttcagt gactataaca tggcctgggt ccgccaggct 120

ccaaagaagg gtctggaatg ggtcgcaact attagttatg atggtactag aacttactat 180

cgagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagata acgcaaagag caccctatac 240

ctgcaaatgg acagtctgag gtctgaggac gcggccactt atcactgtgc aagtcctggg 300

tttgcttact ggggccaagg caccacggtc accgtctcct ccc 343

<210> 13

<211> 327

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gcagatgctg caccaactgt atccatcttc ccaccatcca tggaacagtt aacatctgga 60

ggtgccacag tcgtgtgctt cgtgaacaac ttctatccca gagacatcag tgtcaagtgg 120

aagattgatg gcagtgaaca acgagatggt gtcctggaca gtgttactga tcaggacagc 180

aaagacagca cgtacagcat gagcagcacc ctctcgttga ccaaggttga atatgaaagg 240

cataacctct atacctgtga ggttgttcat aagacatcat cctcacccgt cgtcaagagc 300

ttcaacagga atgagtgtta ggctagc 327

<210> 14

<211> 1014

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gctagcgctc aaacaacagc cccatctgtc tatccactgg ctcctggatg tggtgataca 60

accagctcca cggtgactct gggatgcctg gtcaagggct atttccctga gccagtcacc 120

gtgacctgga actctggagc cctgtccagc gatgtgcaca cctttccagc tgtcctgcag 180

tctgggctct acactctcac cagctcagtg acctccagca cctggcccag ccagaccgtc 240

acctgcaacg tagcccaccc ggccagcagc accaaggtgg acaagaaagt tgagcgcaga 300

aatggcggca ttggacacaa atgccctaca tgccctacat gtcacaaatg cccagttcct 360

gaactcttgg gtggaccatc tgtcttcatc ttcccgccaa agcccaagga catcctcttg 420

atctcccaga acgccaaggt cacgtgtgtg gtggtggatg tgagcgagga ggagccggac 480

gtccagttca gctggtttgt gaacaacgta gaagtacaca cagctcagac acaaccccgt 540

gaggagcagt acaacagcac cttcagagtg gtcagtgccc tccccatcca gcaccaggac 600

tggatgagcg gcaaggagtt caaatgcaag gtcaacaaca aagccctccc aagccccatc 660

gagaaaacca tctcaaaacc caaagggcta gtcagaaaac cacaggtata cgtcatgggt 720

ccaccgacag agcagttgac tgagcaaacg gtcagtttga cctgcttgac ctcaggcttc 780

ctccctaacg acatcggtgt ggagtggacc agcaacgggc atatagaaaa gaactacaag 840

aacaccgagc cagtgatgga ctctgacggt tctttcttca tgtacagcaa gctcaatgtg 900

gaaaggagca ggtgggatag cagagcgccc ttcgtctgct ccgtggtcca cgagggtctg 960

cacaatcacc acgtggagaa gagcatctcc cggcctccgg gtaaatgaga gctc 1014

Claims (9)

1.重组大鼠抗小鼠CD4单克隆抗体，包括重链恒定区、重链可变区、轻链恒定区和轻链可变区，其特征在于：重链可变区含有CDR1、CDR2、CDR3，其氨基酸序列依次如SEQ ID NO.1～3所示，轻链可变区含有CDR1、CDR2、CDR3，其氨基酸序列依次如SEQ ID NO.4、4-1、5所示。

2.根据权利要求1所述的重组大鼠抗小鼠CD4单克隆抗体，其特征在于，重链可变区CDR1、CDR2、CDR3的编码基因依次如SEQ ID NO:6～8所示。

3.含有权利要求2所述的编码基因(重链可变区CDR1、CDR2、CDR3的编码基因)的表达载体。

4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述重链可变区的编码基因如SEQ IDNO.12所示。

5.根据权利要求1所述的重组大鼠抗小鼠CD4单克隆抗体，其特征在于，轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3的编码基因依次如SEQ ID NO:9、9-1、10所示。

6.含有权利要求5所述的编码基因(轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3的编码基因)的表达载体。

7.根据权利要求6所述的表达载体，其特征在于，所述轻链可变区的编码基因如SEQ IDNO.11所示。

8.权利要求1-3任一所述的重组大鼠抗小鼠CD4单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)用小鼠CD4抗原免疫大鼠，获得大鼠脾脏细胞，大鼠脾脏细胞与SP20融合获得杂交瘤细胞，提取RNA，逆转录获得cDNA；

(2)设计引物，以cDNA为模板，扩增含有权利要求1～3任一所述的重链可变区和轻链可变区的编码基因；

(3)获得的重链可变区编码基因转入含有重链恒定区基因的表达载体，轻链可变区编码基因转入含有轻链恒定区基因的表达载体，完成质粒重组，重组后的质粒转入DH5α感受态细胞后，挑选阳性克隆测序；

(4)将测序正确的质粒对应的菌液扩大培养并提取质粒，将携带重链和轻链基因的质粒共转染哺乳动物细胞293F细胞或者CHO-S细胞，4-5天收集培养细胞上清进行蛋白纯化，即为重组大鼠抗小鼠CD4单克隆抗体。

9.权利要求1、2、5任一所述的重组大鼠抗小鼠CD4单克隆抗体在制备检测小鼠CD4的试剂中的应用。