CN109735531B - 一种高gc含量基因的零背景克隆方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高GC含量基因的零背景克隆方法及其应用。本发明通过筛选设计引物，优化扩增体系，运用改良的Slow‑down PCR方法成功克隆出高GC含量的绵羊Kiss1基因的完整CDS区和部分5＇及3＇非翻译区序列并进行生物信息学分析。本发明提供的绵羊Kiss1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。本发明克隆得到的绵羊Kiss1基因在研究抑制肿瘤转移和调控家畜生殖功能方面有广阔的应用前景。本发明为家畜Kisspeptin相关神经肽的研究提供了新的研究对象，本发明提供的克隆方法可以给其他高GC含量的基因克隆提供理论参考。
Description
技术领域
本发明涉及动物基因工程技术领域，具体地说，涉及一种高GC含量的绵羊Kiss1基因的克隆方法，以及该方法得到的绵羊Kiss1基因的用途。
背景技术
Kisspeptin是2001年发现的一种肽类激素，由KiSS1基因编码，在下丘脑中大量表达，可水解产生Kisspeptin-54，Kisspeptin-14、Kisspeptin-13和Kisspeptin-10等不同长度的酰胺化短肽，C端具有精氨酸和苯丙氨酸。最初发现Kisspeptin具有抑制肿瘤转移的功能。2003年，国外的研究机构发现Kisspeptin及其受体在生殖调控中具有重大作用。Kisspeptin受体突变小鼠的表型与性腺类固醇激素分泌缺乏症很相似，突变的雌鼠没有性成熟，不能妊娠，突变的雄鼠睾丸阴茎发育不全，不能产生精子。传统观念认为下丘脑分泌的促性腺激素释放激素(GnRH)是调控生殖功能的关键信号。近年来，由于 Kisspeptin的发现刷新了人们对调控青春期启动及生殖的神经内分泌轴的认识。 Kisspeptin作为下调节丘脑-垂体-性腺轴的关键参与调控GnRH的分泌，在促进促性腺激素(FSH、LH)分泌、青春期的启动及生殖内分泌方面起决定性作用。通过对人类及其他动物的研究发现，Kisspeptin主要存在于下丘脑的漏斗/弓状核。灵长类动物的 Kisspeptin神经元主要位于漏斗区(其他物种位于弓状核)和延髓视前区(POA)。 Kisspeptin可对GnRH脉冲式的控制其分泌，与GnRH受体相互作用，直接作用于GnRH 神经元，并促进GnRH释放。将Kisspeptin-10和Kisspeptin-54直接注射到小鼠侧脑室会导致促卵泡素和促黄体素的分泌增加。给青春期前的母猪脑室注射Kisspeptin类似物同样能增加血浆中促性腺激素的浓度。研究表明Kisspeptin分泌异常与临床上许多生殖疾病密切相关，如多囊卵巢综合症。
在家畜上，对Kiss1基因及Kisspeptin蛋白的研究越来越多，但根据现有文献，绵羊的Kiss1基因尚未被克隆。申请人分析绵羊的Kiss1基因结构发现(如图1所示)，其 GC含量很高，基因的翻译区GC含量平均为74.26％，局部的GC含量甚至超过了90％。因为G、C之间形成三对氢键，解链所需能量较高，故模板较难打开，高GC含量模板扩增过程中面临的最大困难是模板中容易形成稳定的二级结构进而阻碍DNA聚合酶在模板上的结合。因此，推测绵羊Kiss1基因至今未被克隆的原因就是其高GC含量导致的普通RT-PCR扩增无效。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高GC含量基因的零背景克隆方法，以弥补现有技术中至今未克隆获得绵羊Kiss1基因的缺陷。
本发明首先提供一种高GC含量基因的零背景克隆方法，是运用改良后的 Slow-down PCR方法，对目标基因的模板DNA或cDNA进行PCR扩增，PCR所用引物长度在20-30bp之间，GC含量在60％-75％之间，Tm>70℃，Tm差异<1℃。
本发明的高GC含量基因的零背景克隆方法中，所述Slow-down PCR方法的工作程序为：98℃预变性2min；98℃10s，72℃30s，72℃45s，4个循环；98℃10s，71℃ 30s，72℃45s，4个循环；98℃10s，70℃30s，72℃45s，4个循环；98℃10s，69℃ 30s，72℃45s，4个循环；98℃10s，68℃30s，72℃45s，4个循环；98℃10s，67℃ 30s，72℃45s，4个循环；98℃10s，66℃30s，72℃45s，4个循环；98℃10s，65℃ 30s，72℃45s，4个循环；循环结束后72℃10min。
本发明提供的高GC含量基因的零背景克隆方法中，还包括对扩增产物回收纯化后，连接T-Vector载体转化，所述T-Vector载体为零背景克隆载体，无需蓝白斑筛选。
进一步地，本发明提供了一种绵羊Kiss1基因的克隆方法，包括以下步骤：
(1)提取成年绵羊下丘脑组织的mRNA，反转录为cDNA；(2)以所得的cDNA 为模板，进行Slow-down PCR扩增；PCR扩增所用的引物长度在20-30bp之间，GC含量在60％-75％之间，Tm>70℃，Tm差异<1℃；(3)扩增产物回收纯化后，连接载体转化，提质粒测序。优选地，步骤(2)所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示。
优选地，所述Slow-down PCR的工作程序为：98℃预变性2min；98℃10s，72℃30s，72℃45s，4个循环；98℃10s，71℃30s，72℃45s，4个循环；98℃10s，70℃30s， 72℃45s，4个循环；98℃10s，69℃30s，72℃45s，4个循环；98℃10s，68℃30s， 72℃45s，4个循环；98℃10s，67℃30s，72℃45s，4个循环；98℃10s，66℃30s， 72℃45s，4个循环；98℃10s，65℃30s，72℃45s，4个循环；循环结束后72℃10min。优选地，步骤(3)中连接载体为零背景克隆载体T-Vector，无需蓝白斑筛选，连接时间短，能够提高克隆效率。
本发明还提供了上述方法克隆得到的绵羊Kiss1基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示。
经过分析，本发明获得的绵羊Kiss1基因mRNA的翻译区长度为408bp，包含起始密码子ATG和终止密码子TGA，CDS区含A和T各52个，含G和C各152个，占比分别为 12.75％、12.75％、37.25％、37.25％。
本发明克隆得到的绵羊Kiss1基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。经过分析，所获得的Kiss1基因氨基酸序列长度为135，分子量为14.3074kDa，等电点为11.36，序列组成为：Ala(14.8％),Arg(12.6％),Asn(3.7％),Asp(0.7％),Cys(3.0％),Gln(4.4％), Glu(4.4％),Gly(11.1％),Ile(0.7％),Leu(9.6％),Lys(1.5％),Met(2.2％),Phe(2.2％),Pro (11.9％),Ser(6.7％),Thr(4.4％),Trp(1.5％),Tyr(1.5％),Val(3.0％)。含有九个磷酸化位点 (Ser36,50,89,108,Thr21,34,42,59,Tyr110)。蛋白的二级结构包含20.00％alpha-helix(H), 7.41％beta-sheet(E)和72.59％random coil(C)。
生物信息学分析结果表明，Kiss1基因编码的Kisspeptin蛋白的主要功能是与G蛋白偶联受体(GPR54)结合，参与细胞的信号转导。
含有本发明提供的绵羊Kiss1基因的生物材料属于本申请的保护范围，所述生物材料为表达盒、表达载体、重组菌或细胞系。
本发明提供了上述绵羊Kiss1基因的克隆方法或上述的绵羊Kiss1基因或含有该基因的生物材料在制备抑制肿瘤转移的药物或调控家畜生殖功能药物中的应用。
本发明相对于现有技术具有如下优点及效果：
⑴本发明最先在绵羊上克隆了高GC含量的Kiss1基因的完整CDS区，国内外文献未见相关报道。
(2)本发明提供的引物参数优化方法、PCR扩增体系及扩增程序为其他高GC含量基因的扩增提供了有价值的参考依据。
⑶哺乳动物许多基因的启动子、增强子和其它控制元件在内的大多数重要调控区域由高GC含量DNA序列组成，这些DNA序列因其稳定的二级结构最终导致PCR低效或无效扩增。本发明可为高GC含量的基因调控区的研究提供新的参考。
(4)本发明提供的实验思路并不仅仅局限于Kiss1基因，还适用于其他基因；本发明的研究对象实例为杜泊绵羊，但本发明克隆高GC含量基因的方法并不仅仅适用于绵羊，还适用于其他大动物。
⑸本发明对于绵羊生殖生物学和神经内分泌的研究具有重要科学意义。
附图说明
图1为：绵羊Kiss1基因CDS区GC含量分析图。
图2为：Kiss1基因克隆引物参数图。
图3为：Kiss1基因克隆片段PCR产物凝胶电泳图。
图4为：零背景单菌落图。
图5为：Kiss1基因克隆片段测序峰图。
图6为：Kiss1基因克隆片段NCBI Blast图。
图7为：绵羊Kiss1基因的同源性分析图。
图8为：绵羊Kiss1基因的进化树分析图。
图9为：绵羊Kisspeptin蛋白预测磷酸化位点预测图。
图10为：绵羊Kisspeptin蛋白预测O糖基化位点预测图。
图11为：绵羊Kisspeptin蛋白预测N糖基化位点预测图。
图12为：绵羊Kisspeptin蛋白二级结构预测分析图。
图13为：绵羊Kisspeptin蛋白三级结构预测分析图。
图14为：绵羊Kisspeptin亲/疏水性预测与分析图。
图15为：绵羊Kisspeptin蛋白信号肽分析图。
图16为：绵羊Kisspeptin蛋白细胞组分分析。
图17为：绵羊Kisspeptin蛋白生物过程分析。
图18为：绵羊Kisspeptin蛋白分子功能分析。
图19为引物长度小于20bp时的PCR产物图。
图20为引物长度小于20bp时的引物参数图。
图21为引物长度大于30bp时的PCR产物图。
图22为引物长度大于30bp时的引物参数图。
图23为GC含量小于60％时的PCR产物图。
图24为GC含量小于60％时的引物参数图。
图25为GC含量小于60％时的引物参数图。
图26为GC含量大于于75％时的PCR产物图。
图27为GC含量大于于75％时的引物参数图。
图28为Tm值小于70℃时的PCR产物图。
图29为Tm值小于70℃时的引物参数图。
图30为Tm值小于70℃时的引物参数图。
图31为Tm Difference>1℃的PCR产物图。
图32为Tm Difference>1℃的引物参数图。
图33为采用普通PCR程序时的PCR产物图(退火温度从72℃到57℃)。
图34为采用普通PCR程序时的PCR产物图(退火温度从56℃到51℃)。
图35为采用slow-down PCR方法时不同参数程序的PCR产物图。
图36为采用slow-down PCR方法时不同参数程序的PCR产物图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。若未特别指明，实施例中所用的生化材料均为市售。
实施例1绵羊基因的零背景克隆与生物信息学分析
本研究所用的实验材料取自河北省廊坊市大厂回族自治县屠宰场。采集3只成年杜泊绵羊的下丘脑组织，将采取的组织迅速放入1.5ml EP管(DEPC水已处理过)投入液氮罐，然后保存在-80℃冰箱中。
1.下丘脑组织中总RNA的提取
(1)试验开始前在高温条件下将所有玻璃器皿烤6h灭菌，用0.1％DEPC水将提取RNA 所需的所有EP管、枪头等浸泡12-18h，121℃高压灭菌15min，在60℃的真空干燥箱中烘干备用。特别注意的是：提取RNA操作的所有步骤必须在RNA专用工作室及RNA专用超净工作台中进行，试验中用到的所有移液枪、枪头、等均为RNA专用，溶液的配置均需使用0.1％DEPC水；(2)提前打开低温高速离心机，使其4℃预冷；用DEPC水配制洗 RNA用的75％乙醇并置于4℃冰箱中预冷；(3)从-80℃冰箱中取出样品后迅速称量(约 0.05-0.1g)，使用液氮预冷的研钵进行组织研磨。研磨过程中需要持续间断的添加液氮，直至所有的块状组织研磨成粉末。然后用药匙将研磨好的组织；粉末转移至1.5ml的离心管(此过程要求快速准确)，加入1ml Ttrizol摇晃2～3min使充分裂解；(4)各样品中分别加入200μL氯仿，剧烈摇晃均匀，室温静置10min，12000r/min低温离心15min，4℃，吸上清；(5)加入等体积异丙醇，反复颠倒混匀，室温静置10min，12000r/min低温离心 15min，弃上清，此时在管底可见沉淀；(6)加入500μL 75％的预冷酒精，小心清洗沉淀， 7500r/min低温离心5min，弃乙醇；(7)重复步骤(6)一次；(8)将沉淀于放在通风处，挥发多余酒精，过程约12min，当沉淀由白色转变为近透明为止；再加入30μL DEPC水溶解沉淀，之后用NanoDrop检测总RNA纯度。
2.RNA的反转录
RNA去除基因组，取2μl 5×gDNA Eraser、1μl gDNA Eraser Buffer、1μl DEPC水、6μl RNA，将上述体系放入PCR仪中，42℃反应2min；再加入4μl
Buffer 2、 1μl
RT Enzyme Mix I、1μl RT Primer Mix、4μl DEPC水，PCR仪中37℃反应20min，85℃反应5s，得到cDNA，-20℃保存。试剂盒PrimeScriptTMRT reagent Kit withgDNA Eraser(Perfect Real Time)购自Takara公司。
3.引物的设计与合成
利用Primer Premier 6.0和Oligo 7.0软件设计引物，筛选引物的参数设置为长度在 20-30bp之间，GC含量在60％-75％之间，Tm>70℃，Tm Difference<1℃。
(1)引物长度小于20bp的扩增情况见图19，两对引物(参数见图20)均无目的扩增产物；引物长度大于30bp的扩增情况见图21两对引物(参数见图22)也均无目的扩增产物。
(2)GC含量小于60％的扩增情况见图23，六对引物(参数见图24，25)均无目的扩增产物且有拖带；GC含量大于75％的扩增情况见图26，五对引物(参数见图27)也均无目的扩增产物且有拖带。
(3)Tm小于70℃的扩增效果见图28，六对引物(参数见图29，30)均无目的扩增产物。(4)Tm Difference≥1℃的引物扩增效果见图31，六对引物(参数见图32)均无目的扩增产物。
最终筛选引物的参数设置为长度在20-30bp之间，GC含量在60％-75％之间， Tm>70℃，Tm Difference<1℃，选取评分最高的一对引物，引物参数图见图2。引物由北京生工生物有限公司合成，引物序列如下:Kiss1基因：(登录号为NM_001306104.1)
正义链：5'-GCAAGGGCACTTCCAGGACCGGCATC-3'(SEQ ID No.1)；
反义链：5'-AAGGCCCCACCTCGGCGCTCA-3'(SEQ ID No.2)；
4.RT-PCR
扩增体系为：3％DMSO，高保真DNA聚合酶PrimeSTAR MAX DNA Polymerase(R045A，Takara)0.5μl，dNTP mix(2.5mM each)25μl，GC Buffer II(RR02AG， Takara)8μl，Forward primer 1μl，Reverse primer 1μl，cDNA 2μl,11.5μl H2O。
扩增条件为：98℃预变性2min，98℃10s，72℃30s，72℃45s，4个循环；98℃10s， 71℃30s，72℃45s,4个循环；98℃10s，70℃30s，72℃45s,4个循环；98℃10s，69℃30s， 72℃45s,4个循环；98℃10s，68℃30s，72℃45s,4个循环；98℃10s，67℃30s，72℃45s,4 个循环；98℃10s，66℃30s，72℃45s，4个循环；98℃10s，65℃30s，72℃45s,4个循环；循环结束后72℃10min，4℃保存。确定上述扩增条件为本发明的扩增条件。
使用1.5％琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳检测。以反转录出的绵羊下丘脑cDNA为模板进行Kiss1基因的PCR反应，凝胶电泳检测PCR产物并使用凝胶成像仪拍照，结果如图3所示，在450bp左右条带处有单一清晰的亮带与预测产物大小结果一致。图中共4个泳道，自左向右第1和4泳道为5000bp Marker，2、3泳道分别为下丘脑组织和无模板阴性对照组。
对比实验1：采用普通PCR的程序进行时，电泳图见图33，图34。图中：
泳道1：98℃预变性2min，98℃10s，72℃30s，72℃45s，35个循环；循环结束后 72℃10min，4℃保存。
泳道2：98℃预变性2min，98℃10s，71℃30s，72℃45s，35个循环；循环结束后 72℃10min，4℃保存。
泳道3：98℃预变性2min，98℃10s，70℃30s，72℃45s，35个循环；循环结束后 72℃10min，4℃保存。
泳道4：98℃预变性2min，98℃10s，69℃30s，72℃45s，35个循环；循环结束后 72℃10min，4℃保存。
泳道5：98℃预变性2min，98℃10s，68℃30s，72℃45s，35个循环；循环结束后 72℃10min，4℃保存。
泳道6：98℃预变性2min，98℃10s，67℃30s，72℃45s，35个循环；循环结束后 72℃10min，4℃保存。
泳道7：98℃预变性2min，98℃10s，66℃30s，72℃45s，35个循环；循环结束后 72℃10min，4℃保存。
泳道8：98℃预变性2min，98℃10s，65℃30s，72℃45s，35个循环；循环结束后 72℃10min，4℃保存。
泳道9：98℃预变性2min，98℃10s，64℃30s，72℃45s，35个循环；循环结束后 72℃10min，4℃保存。
泳道10：98℃预变性2min，98℃10s，63℃30s，72℃45s，35个循环；循环结束后 72℃10min，4℃保存。
泳道11：98℃预变性2min，98℃10s，62℃30s，72℃45s，35个循环；循环结束后 72℃10min，4℃保存。
泳道12：98℃预变性2min，98℃10s，61℃30s，72℃45s，35个循环；循环结束后 72℃10min，4℃保存。
泳道13：98℃预变性2min，98℃10s，60℃30s，72℃45s，35个循环；循环结束后 72℃10min，4℃保存。
泳道14：98℃预变性2min，98℃10s，59℃30s，72℃45s，35个循环；循环结束后 72℃10min，4℃保存。
泳道15：98℃预变性2min，98℃10s，58℃30s，72℃45s，35个循环；循环结束后 72℃10min，4℃保存。
泳道16：98℃预变性2min，98℃10s，57℃30s，72℃45s，35个循环；循环结束后 72℃10min，4℃保存。
泳道17：98℃预变性2min，98℃10s，56℃30s，72℃45s，35个循环；循环结束后 72℃10min，4℃保存。
泳道18：98℃预变性2min，98℃10s，55℃30s，72℃45s，35个循环；循环结束后 72℃10min，4℃保存。
泳道19：98℃预变性2min，98℃10s，54℃30s，72℃45s，35个循环；循环结束后 72℃10min，4℃保存。
泳道20：98℃预变性2min，98℃10s，53℃30s，72℃45s，35个循环；循环结束后 72℃10min，4℃保存。
泳道21：98℃预变性2min，98℃10s，52℃30s，72℃45s，35个循环；循环结束后 72℃10min，4℃保存。
泳道22：98℃预变性2min，98℃10s，51℃30s，72℃45s，35个循环；循环结束后 72℃10min，4℃保存。
由图33和图34可知，采用普通PCR扩增绵羊Kiss1基因时，扩增后无目的条带或条带拖尾弥散。
对比实验2、采用slow-downPCR方法时，如果退火温度或条件参数不选择本发明确定的参数，效果见图35，图36，可见其电泳图中仍无单一明亮的目的条带，扩增效果欠佳。说明只有采用本发明确定的条件参数，扩增效果最好，才能够实现对高GC含量基因的克隆。
以下各个泳道对应的程序，参数下划线的，为与本发明确定的条件参数不同的参数。
泳道1：98℃预变性2min，98℃10s，72℃30s，72℃45s，3个循环；98℃10s，71℃30s，72℃45s,3个循环；98℃10s，70℃30s，72℃45s,3个循环；98℃10s，69℃30s， 72℃45s,3个循环；98℃10s，68℃30s，72℃45s,3个循环；98℃10s，67℃30s，72℃ 45s,3个循环；98℃10s，66℃30s，72℃45s,3个循环；98℃10s，65℃30s，72℃45s,3 个循环；98℃10s，60℃30s，72℃45s,10个循环；循环结束后72℃10min，4℃保存。
泳道2：98℃预变性2min，98℃10s，72℃30s，72℃45s，2个循环；98℃10s，71℃30s，72℃45s,2个循环；98℃10s，70℃30s，72℃45s,2个循环；98℃10s，69℃30s， 72℃45s,2个循环；98℃10s，68℃30s，72℃45s,2个循环；98℃10s，67℃30s，72℃ 45s,2个循环；98℃10s，66℃30s，72℃45s,2个循环；98℃10s，65℃30s，72℃45s,2 个循环；98℃10s，60℃30s，72℃45s,15个循环；循环结束后72℃10min，4℃保存。
泳道3：98℃预变性2min，98℃10s，72℃30s，72℃45s，1个循环；98℃10s，71℃30s，72℃45s,1个循环；98℃10s，70℃30s，72℃45s,1个循环；98℃10s，69℃30s， 72℃45s,1个循环；98℃10s，68℃30s，72℃45s,1个循环；98℃10s，67℃30s，72℃ 45s,1个循环；98℃10s，66℃30s，72℃45s,1个循环；98℃10s，65℃30s，72℃45s,1 个循环；98℃10s，60℃30s，72℃45s,20个循环；循环结束后72℃10min，4℃保存。
泳道4：98℃预变性2min，98℃10s，72℃25s，72℃45s，3个循环；98℃10s，71℃25s，72℃45s,3个循环；98℃10s，70℃25s，72℃45s,3个循环；98℃10s，69℃25s，72℃45s,3个循环；98℃10s，68℃25s，72℃45s,3个循环；98℃10s，67℃25s，72℃ 45s,3个循环；98℃10s，66℃25s，72℃45s,3个循环；98℃10s，65℃25s，72℃45s,3 个循环；98℃10s，60℃22s，72℃45s,10个循环；循环结束后72℃10min，4℃保存。
泳道5：98℃预变性2min，98℃10s，72℃25s，72℃45s，2个循环；98℃10s，71℃25s，72℃45s,2个循环；98℃10s，70℃25s，72℃45s,2个循环；98℃10s，69℃25s， 72℃45s,2个循环；98℃10s，68℃25s，72℃45s,2个循环；98℃10s，67℃25s，72℃ 45s,2个循环；98℃10s，66℃25s，72℃45s,2个循环；98℃10s，65℃25s，72℃45s,2 个循环；98℃10s，60℃25s，72℃45s,15个循环；循环结束后72℃10min，4℃保存。
泳道6：98℃预变性2min，98℃10s，72℃25s，72℃45s，1个循环；98℃10s，71℃25s，72℃45s,1个循环；98℃10s，70℃25s，72℃45s,1个循环；98℃10s，69℃25s， 72℃45s,1个循环；98℃10s，68℃25s，72℃45s,1个循环；98℃10s，67℃25s，72℃ 45s,1个循环；98℃10s，66℃25s，72℃45s,1个循环；98℃10s，65℃25s，72℃45s,1 个循环；98℃10s，60℃25s，72℃45s,20个循环；循环结束后72℃10min，4℃保存。
泳道7：98℃预变性2min，98℃10s，72℃20s，72℃45s，3个循环；98℃10s，71℃20s，72℃45s，3个循环；98℃10s，70℃20s，72℃45s，3个循环；98℃10s，69℃20s， 72℃45s，3个循环；98℃10s，68℃20s，72℃45s，3个循环；98℃10s，67℃20s，72℃ 45s，3个循环；98℃10s，66℃20s，72℃45s，3个循环；98℃10s，65℃20s，72℃45s，3 个循环；98℃10s，60℃20s，72℃45s，10个循环；循环结束后72℃10min，4℃保存。
泳道8：98℃预变性2min，98℃10s，72℃20s，72℃45s，2个循环；98℃10s，71℃20s，72℃45s，2个循环；98℃10s，70℃20s，72℃45s，2个循环；98℃10s，69℃20s， 72℃45s，2个循环；98℃10s，68℃20s，72℃45s，2个循环；98℃10s，67℃20s，72℃ 45s，2个循环；98℃10s，66℃20s，72℃45s，2个循环；98℃10s，65℃20s，72℃45s，2 个循环；98℃10s，60℃20s，72℃45s，15个循环；循环结束后72℃10min，4℃保存。
泳道9：98℃预变性2min，98℃10s，72℃20s，72℃45s，1个循环；98℃10s，71℃20s，72℃45s，1个循环；98℃10s，70℃20s，72℃45s,1个循环；98℃10s，69℃20s， 72℃45s,1个循环；98℃10s，68℃20s，72℃45s，1个循环；98℃10s，67℃20s，72℃ 45s，1个循环；98℃10s，66℃20s，72℃45s，1个循环；98℃10s，65℃20s，72℃45s，1 个循环；98℃10s，60℃20s，72℃45s,20个循环；循环结束后72℃10min，4℃保存。
泳道10：98℃预变性2min，98℃10s，72℃15s，72℃45s，3个循环；98℃10s，71℃15s，72℃45s,3个循环；98℃10s，70℃15s，72℃45s,3个循环；98℃10s，69℃15s， 72℃45s,3个循环；98℃10s，68℃15s，72℃45s,3个循环；98℃10s，67℃15s，72℃ 45s,3个循环；98℃10s，66℃15s，72℃45s,3个循环；98℃10s，65℃15s，72℃45s,3 个循环；98℃10s，60℃15s，72℃45s,10个循环；循环结束后72℃10min，4℃保存。
泳道11：98℃预变性2min，98℃10s，72℃15s，72℃45s，2个循环；98℃10s，71℃15s，72℃45s,2个循环；98℃10s，70℃15s，72℃45s,2个循环；98℃10s，69℃15s， 72℃45s,2个循环；98℃10s，68℃15s，72℃45s,2个循环；98℃10s，67℃15s，72℃ 45s,2个循环；98℃10s，66℃15s，72℃45s,2个循环；98℃10s，65℃15s，72℃45s,2 个循环；98℃10s，60℃15s，72℃45s,15个循环；循环结束后72℃10min，4℃保存。
泳道12：98℃预变性2min，98℃10s，72℃15s，72℃45s，1个循环；98℃10s，71℃15s，72℃45s,1个循环；98℃10s，70℃15s，72℃45s,1个循环；98℃10s，69℃15s， 72℃45s,1个循环；98℃10s，68℃15s，72℃45s,1个循环；98℃10s，67℃15s，72℃ 45s,1个循环；98℃10s，66℃15s，72℃45s,1个循环；98℃10s，65℃15s，72℃45s,1 个循环；98℃10s，60℃15s，72℃45s,20个循环；循环结束后72℃10min，4℃保存。
泳道13：98℃预变性2min，98℃10s，72℃30s，72℃40s，3个循环；98℃10s，71℃30s，72℃40s,3个循环；98℃10s，70℃30s，72℃40s,3个循环；98℃10s，69℃30s，72℃40s,3个循环；98℃10s，68℃30s，72℃40s,3个循环；98℃10s，67℃30s，72℃ 40s,3个循环；98℃10s，66℃30s，72℃40s,3个循环；98℃10s，65℃30s，72℃40s,3 个循环；98℃10s，60℃30s，72℃40s,10个循环；循环结束后72℃10min，4℃保存。
泳道14：98℃预变性2min，98℃10s，72℃30s，72℃40s，2个循环；98℃10s，71℃30s，72℃40s,2个循环；98℃10s，70℃30s，72℃40s,2个循环；98℃10s，69℃30s， 72℃40s,2个循环；98℃10s，68℃30s，72℃40s,2个循环；98℃10s，67℃30s，72℃ 40s,2个循环；98℃10s，66℃30s，72℃40s,2个循环；98℃10s，65℃30s，72℃40s,2 个循环；98℃10s，60℃30s，72℃40s,15个循环；循环结束后72℃10min，4℃保存。
泳道15：98℃预变性2min，98℃10s，72℃30s，72℃40s，1个循环；98℃10s，71℃30s，72℃40s,1个循环；98℃10s，70℃30s，72℃40s,1个循环；98℃10s，69℃30s， 72℃40s,1个循环；98℃10s，68℃30s，72℃40s,1个循环；98℃10s，67℃30s，72℃ 40s,1个循环；98℃10s，66℃30s，72℃40s,1个循环；98℃10s，65℃30s，72℃40s,1 个循环；98℃10s，60℃30s，72℃40s,20个循环；循环结束后72℃10min，4℃保存。
泳道16：98℃预变性2min，98℃10s，72℃30s，72℃35s，3个循环；98℃10s，71℃30s，72℃35s,3个循环；98℃10s，70℃30s，72℃35s,3个循环；98℃10s，69℃30s， 72℃35s,3个循环；98℃10s，68℃30s，72℃35s,3个循环；98℃10s，67℃30s，72℃ 35s,3个循环；98℃10s，66℃30s，72℃35s,3个循环；98℃10s，65℃30s，72℃35s,3 个循环；98℃10s，60℃30s，72℃35s,10个循环；循环结束后72℃10min，4℃保存。
泳道17：98℃预变性2min，98℃10s，72℃30s，72℃35s，2个循环；98℃10s，71℃30s，72℃35s,2个循环；98℃10s，70℃30s，72℃35s,2个循环；98℃10s，69℃30s， 72℃35s,2个循环；98℃10s，68℃30s，72℃35s,2个循环；98℃10s，67℃30s，72℃ 35s,2个循环；98℃10s，66℃30s，72℃35s,2个循环；98℃10s，65℃30s，72℃35s,2 个循环；98℃10s，60℃30s，72℃35s,15个循环；循环结束后72℃10min，4℃保存。
泳道18：98℃预变性2min，98℃10s，72℃30s，72℃35s，1个循环；98℃10s，71℃30s，72℃35s,1个循环；98℃10s，70℃30s，72℃35s,1个循环；98℃10s，69℃30s， 72℃35s,1个循环；98℃10s，68℃30s，72℃35s,1个循环；98℃10s，67℃30s，72℃ 35s,1个循环；98℃10s，66℃30s，72℃35s,1个循环；98℃10s，65℃30s，72℃35s,1 个循环；98℃10s，60℃30s，72℃35s,20个循环；循环结束后72℃10min，4℃保存。
泳道19：98℃预变性2min，98℃10s，72℃30s，72℃30s，3个循环；98℃10s，71℃30s，72℃30s,3个循环；98℃10s，70℃30s，72℃30s,3个循环；98℃10s，69℃30s， 72℃30s,3个循环；98℃10s，68℃30s，72℃30s,3个循环；98℃10s，67℃30s，72℃ 30s,3个循环；98℃10s，66℃30s，72℃30s,3个循环；98℃10s，65℃30s，72℃30s,3 个循环；98℃10s，60℃30s，72℃30s,10个循环；循环结束后72℃10min，4℃保存。
泳道20：98℃预变性2min，98℃10s，72℃30s，72℃30s，2个循环；98℃10s，71℃30s，72℃30s,2个循环；98℃10s，70℃30s，72℃30s,2个循环；98℃10s，69℃30s， 72℃30s,2个循环；98℃10s，68℃30s，72℃30s,2个循环；98℃10s，67℃30s，72℃ 30s,2个循环；98℃10s，66℃30s，72℃30s,2个循环；98℃10s，65℃30s，72℃30s,2 个循环；98℃10s，60℃30s，72℃30s,15个循环；循环结束后72℃10min，4℃保存。
泳道21：98℃预变性2min，98℃10s，72℃30s，72℃30s，1个循环；98℃10s，71℃30s，72℃30s,1个循环；98℃10s，70℃30s，72℃30s,1个循环；98℃10s，69℃30s， 72℃30s,1个循环；98℃10s，68℃30s，72℃30s,1个循环；98℃10s，67℃30s，72℃ 30s,1个循环；98℃10s，66℃30s，72℃30s，1个循环；98℃10s，65℃30s，72℃30s，1 个循环；98℃10s，60℃30s，72℃30s，20个循环；循环结束后72℃10min，4℃保存。
泳道22：98℃预变性2min，98℃10s，72℃30s，72℃25s，3个循环；98℃10s，71℃30s，72℃25s，3个循环；98℃10s，70℃30s，72℃25s，3个循环；98℃10s，69℃30s， 72℃25s，3个循环；98℃10s，68℃30s，72℃25s，3个循环；98℃10s，67℃30s，72℃ 25s,3个循环；98℃10s，66℃30s，72℃25s,3个循环；98℃10s，65℃30s，72℃25s,3 个循环；98℃10s，60℃30s，72℃25s,10个循环；循环结束后72℃10min，4℃保存。
泳道23：98℃预变性2min，98℃10s，72℃30s，72℃25s，2个循环；98℃10s，71℃25s，72℃30s,2个循环；98℃10s，70℃30s，72℃25s,2个循环；98℃10s，69℃30s， 72℃25s,2个循环；98℃10s，68℃25s，72℃30s,2个循环；98℃10s，67℃30s，72℃ 25s,2个循环；98℃10s，66℃25s，72℃30s,2个循环；98℃10s，65℃25s，72℃30s，2 个循环；98℃10s，60℃30s，72℃25s，15个循环；循环结束后72℃10min，4℃保存。
泳道24：98℃预变性2min，98℃10s，72℃30s，72℃25s，1个循环；98℃10s，71℃30s，72℃25s，1个循环；98℃10s，70℃30s，72℃25s，1个循环；98℃10s，69℃30s， 72℃25s，1个循环；98℃10s，68℃25s，72℃30s，1个循环；98℃10s，67℃30s，72℃ 25s，1个循环；98℃10s，66℃30s，72℃25s，1个循环；98℃10s，65℃30s，72℃25s，1 个循环；98℃10s，60℃25s，72℃30s，20个循环；循环结束后72℃10min，4℃保存。
泳道25：98℃预变性2min，98℃10s，72℃25s，72℃40s，3个循环；98℃10s，71℃25s，72℃40s，3个循环；98℃10s，70℃25s，72℃40s，3个循环；98℃10s，69℃25s， 72℃40s，3个循环；98℃10s，68℃25s，72℃40s，3个循环；98℃10s，67℃25s，72℃ 40s，3个循环；98℃10s，66℃25s，72℃40s，3个循环；98℃10s，65℃25s，72℃40s，3 个循环；98℃10s，60℃25s，72℃40s，10个循环；循环结束后72℃10min，4℃保存。
泳道26：98℃预变性2min，98℃10s，72℃25s，72℃40s，2个循环；98℃10s，71℃25s，72℃40s，2个循环；98℃10s，70℃25s，72℃40s，2个循环；98℃10s，69℃25s， 72℃40s，2个循环；98℃10s，68℃25s，72℃40s，2个循环；98℃10s，67℃25s，72℃ 40s，2个循环；98℃10s，66℃25s，72℃40s，2个循环；98℃10s，65℃25s，72℃40s，2 个循环；98℃10s，60℃25s，72℃40s，15个循环；循环结束后72℃10min，4℃保存。
泳道27：98℃预变性2min，98℃10s，72℃25s，72℃40s，1个循环；98℃10s，71℃25s，72℃40s，1个循环；98℃10s，70℃25s，72℃40s，1个循环；98℃10s，69℃25s， 72℃40s,1个循环；98℃10s，68℃25s，72℃40s，1个循环；98℃10s，67℃25s，72℃ 40s，1个循环；98℃10s，66℃25s，72℃40s，1个循环；98℃10s，65℃25s，72℃40s，1 个循环；98℃10s，60℃25s，72℃40s，20个循环；循环结束后72℃10min，4℃保存。
泳道28：98℃预变性2min，98℃10s，72℃20s，72℃30s，3个循环；98℃10s，71℃20s，72℃30s，3个循环；98℃10s，70℃20s，72℃30s,3个循环；98℃10s，69℃20s， 72℃30s,3个循环；98℃10s，68℃20s，72℃30s,3个循环；98℃10s，67℃20s，72℃ 30s,3个循环；98℃10s，66℃20s，72℃30s,3个循环；98℃10s，65℃20s，72℃30s,3 个循环；98℃10s，60℃20s，72℃30s,10个循环；循环结束后72℃10min，4℃保存。 5.PCR产物纯化
电泳后将凝胶置于紫外灯下，用刀片将目的条带分离出来，然后回收提纯DNA，操作如下：(1)在紫外灯下分离目的凝胶片段，置于干净EP管中，称其质量。胶块体积换算公式:1μL＝lmg。(2)向EP管内加入3倍体积的DR-1Buffer，震荡混合后放入45℃水浴锅中使胶块充分溶解，时间为8-10min。(3)取出平衡柱Spin Column和收集管Collection Tube，并按要求正确安置好。将(2)中溶液转入Spin Column管内，而后12000rpm离心1min，重复离心一次。(4)吸取Rinse A 500μL加入到Spin Column中，离心条件同上。(5)吸取已添加过无水乙醇Rinse B 700μL加入Spin Column，离心条件同上，弃滤液，重复离心一次。 (6)继续离心，条件不变，时间为2min。(7)取一新的Collection Tube，将Spin Cohmm安放好，并向SpinColumn中加入Rnase-free ddH2025μL，室温条件下静置1-2min。
(8)12000rpm离心1min使得DNA洗脱到Collection Tube中，-20℃保存。
6.连接与转化
(1)取一干净的EP管，使用移液器向其滴加T-Vector(CV17,Aidlab)1μL，InsertDNA 8μL，10X Enhancer 1μL。混合均匀后常温反应3分钟。(2)将(1)的连接产物加到100μLDH5α感受态细胞中，轻微震荡后置于冰中30min左右，取出后42℃水浴1min，而后放置冰中约2min。(3)向(2)管内添加750ml LB液体培养基(不含Amp)，使用枪头靠管壁轻轻吹打混匀，而后置于37℃恒湿箱内150r/min培养60min。(4)取出后直接离心，2000rpm离心 2min，抽取上清液使管内保留100μL左右，并用移液器吹打管内液体使其混匀。(5)将上述菌液涂抹在固体培养板上(含Amp)，37℃培养12-16h。(6)选取培养基上的单个菌落，零背景单菌落图见图4，将其接种于含Amp的LB液体培养中，37℃培养12h左右。
7.质粒提取
(1)将携带目的质粒的大肠杆菌接种于含10～15ul基础培养基/氨苄西林培养介质的 50ml培养瓶中。(2)室温下5000×g离心10min。(3)弃去上清，剩余沉淀物中加入500ul的 SolutionⅠ/RNase A，彻底混匀。(4)将混悬液移至新的2ml离心管中，加入500ulSolutionⅡ，轻柔彻底混匀，可得清亮的细菌裂解物，室温下孵育2min(混匀时用力过大，可破碎出染色体DNA，使目的质粒纯度下降)。(5)向4中液体加入250ul预冷的Buffer N3，轻柔、彻底混匀，直到出现白色絮状沉淀，4℃≥12000×g离心10min(可室温，最好4℃)(Buffer 应彻底混匀，若混合物粘稠呈棕色或呈球状，应多混匀几次以中和溶液，溶液的彻底中和对于获得好的产出是必要的)。(6)小心吸取并将上清液转移进新的1.5ml离心管1：0.1 的比例向上清液中加入ETR Solution混匀溶液并于冰上孵育10min，孵育过程中颠倒几次以混匀(加入ETR Solution后，细菌裂解物将出现浑浊，但冰上孵育后将变澄清)(勿用2ml离心管收集上清，因为2ml离心管中有太多液体时，ETR Solution将悬浮于溶液中)。(7)将(6)中液体于42℃孵育5min，溶液将再次变浑。室温下12000×g离心3min，ETRSolution将于离心管底部形成蓝色层。(8)将上层水相转移入新的2ml离心管中，按1：0.5的比例加入无水乙醇(室温，96～100％)，轻柔混匀，室温下孵育1～2min。(9)将8中的溶液取700ul到柱子中，组装收集管，室温下1000×g离心1min，弃去收集管中通过柱子的液体，柱子和收集管重复利用。(10)重复9中步骤，直到收集的细菌裂解物全部用完。 (11)将500ul Buffer HB加入柱子中，室温下10000×g离心1min，弃去收集管中废液(目的：将残存的蛋白污染物除去，是获得高质量DNA所必需的)。(12)向柱子中加入混有乙醇的700ulDNAWash Buffer，室温下10000×g离心1min，弃去收集管中液体。(13)重复12中的步骤。(14)弃去收集管中液体，空管在最大转速(≥13000×g)离心3min以干燥柱子(对于移除柱子中残留的乙醇是必须的)。(15)将柱子放入新的1.5ml离心管中，直接向柱子中的白色网状物上加入Endotoxin-Free Elution Buffer 80～100ul(依终产物浓度而定，可每次30ul×2次)，室温下放置2min，≥13000×g离心1min，以洗提DNA(将提取约70～85％柱子中收集的DNA，可再重复一次以提取完全，但因再次加入洗提液，会使终产物浓度下降)。质粒送北京三博远志公司进行测序。
克隆片段的测序峰图如图5所示，所得序列长度为463bp，序列如SEQ ID NO.3所示。第39-41bp位和第444-446bp位分别为起始和终止密码子，结果如下：(序列方向为5'-3'，序列表中SEQ ID No.3)，所得序列与NCBI绵羊的Kiss1(NM_001306104.1)基因进行Blast 比对，结果如图6所示，序列相似性为99％。氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
8.生物信息学分析
(1)绵羊Kiss1基因的同源性和进化树分析
将克隆得到的绵羊Kiss1基因序列和NCBI上已公布(含预测序列)其他物种Kiss1基因进行同源性比对，结果表明，绵羊Kiss1基因核苷酸序列同牛(XM_002693903.5)、山羊(NM_001285710.2)、马(NM_001289144.1)、人(NM_002256.3)、小鼠(NM_178260.3)和猪(NM_001134964.1)的mRNA序列的相似性分别达到93.35％、97.21％、78.34％、76.67％、67.41％和78.54％(如图7)。系统进化树分析表明，绵羊与山羊和牛的亲缘关系最近，和小鼠的亲缘关系最远，物种之间同源性较高(如图8)。
(2)绵羊Kisspeptin蛋白序列基本理化特性分析
利用ProtParam在线软件预测绵羊Kisspeptin蛋白序列基本理化特性，结果如下表所示。序列组成为：Ala(14.8％),Arg(12.6％),Asn(3.7％),Asp(0.7％),Cys(3.0％),Gln (4.4％),Glu(4.4％),Gly(11.1％),Ile(0.7％),Leu(9.6％),Lys(1.5％),Met(2.2％),Phe (2.2％),Pro(11.9％),Ser(6.7％),Thr(4.4％),Trp(1.5％)，Tyr(1.5％),Val(3.0％)。
表1
| 等电点(PI) | 11.36 |
| 分子量 | 14307.40 |
| 负电荷残基数(Asp+Glu) | 7 |
| 正电荷残基数(Arg+Lys) | 19 |
| 分子式 | C<sub>617</sub>H<sub>1001</sub>N<sub>201</sub>O<sub>178</sub>S<sub>7</sub> |
| 不稳定系数(Ⅱ) | 45.65 |
| 脂肪系数(AI) | 63.85 |
(3)绵羊Kisspeptin蛋白修饰预测分析
利用NetPhos 3.1Server进行潜在磷酸化位点预测，结果见图9。由图9可知，阈值为 0.5时，Kisspeptin存在9个潜在的磷酸化位点，其中包括4个丝氨酸(Ser,位于肽链的第36,50,89,108位氨基酸处)、4个苏氨酸(Thr，位于肽链的第21,34,42,59位氨基酸处)和1个酪氨酸(Tyr,位于肽链的第110位氨基酸处)。利用软件NetOGlyc 4.0和NetNGlyc 1.0进行潜在O、N糖基化位点预测，结果见图10、11。由图可知，Kisspeptin存在3个O－糖基化位点，没有N－糖基化修饰。
(4)绵羊Kisspeptin蛋白二级结构和三级结构预测分析
利用SOPMA软件进行蛋白二级结构预测，结果见图12。由图12可知，Kisspeptin蛋白含20.00％α－螺旋(Hh)、7.41％延伸链(Ee)和72.59％无规则卷曲(Cc)。利用 SWISS-MODEL在线软件预测绵羊Kisspeptin蛋白三级结构，结果见图13。由图13可知，绵羊Kisspeptin主要是由α－螺旋和无规则卷曲组成，与二级结构预测结果相一致。
(5)绵羊Kisspeptin亲/疏水性预测与分析
根据蛋白质亲水性/疏水性分析原理，利用ExPASy的ProtScale程序，对Kiss1基因编码产物的亲/疏水性进行分析，Kisspeptin疏水性图谱见图14。由图14可知，纵坐标0值以上为疏水区，其分值越高，疏水性越强；0值以下为亲水区。该氨基酸序列内超过半数为亲水性残基，整条多肽链表现为亲水性，平均疏水指数-0.473。
(6)绵羊Kisspeptin蛋白信号肽分析
用SignalP 4.1Server软件对绵羊Kisspeptin蛋白的信号肽结构进行预测分析,预测结果如图15所示。图中的C-score表示剪切位点分值,Y-score表示综合剪切点分值,S-score 表示信号肽分值。信号肽剪切位点预测通过Y最大值来判断,是否为分泌蛋白通过S平均值来判断。结果显示,Kisspeptin蛋白的S平均值为0.839(>0.5),属于分泌蛋白,信号肽剪切位点位于第17和18个氨基酸之间。
(7)绵羊Kisspeptin蛋白的功能预测分析
利用在线网站PredictProtein对绵羊Kiss1基因编码的Kisspeptin蛋白参与的细胞组分、生物学过程和功能进行综合分析，见图16，17和18，结果显示，绵羊Kisspeptin 蛋白主要存在于胞外区和细胞质基质中，主要与G蛋白偶联受体结合，参与细胞的信号转导，这与文献中所报道的不同物种中该蛋白的细胞生物学功能一致，其作为G蛋白偶联受体GPR54的内源配体参与调节促性腺激素的释放，KiSS1/GPR54系统是调控哺乳动物下丘脑-垂体-性腺轴的的关键因素。
本发明的意义在于首次克隆出了绵羊Kisspeptin蛋白的编码基因Kiss1，绵羊是季节性发情的动物，Kisspeptin决定了其促性腺激素的水平，进而影响了其发情和排卵，在家畜生产中，已有利用外源Kisspeptin对动物进行超数排卵的报道，我们成功克隆出高GC含量的Kiss1使得科研人员能够在分子生物学水平上对该基因进行基因编辑(比如利用CRISPR/Cas9进行Knock in和Knock out)，这为大动物的分子育种提供了良好的材料，也为Kisspeptin蛋白在哺乳动物中的真核表达提供了有价值的参考，同时，利用PCR扩增Kiss1简单有效，节约成本，省去了公司进行化学合成的昂贵费用，另外，我们除了克隆出Kiss1基因的CDS区外，还扩出了该基因的部分5′非翻译区 (5‘-untranslated region，5’-UTR)和3′非翻译区(3'-untranslated region，3‘-UTR)，这为该基因增强子、启动子、转录因子和microRNA的研究奠定了基础。
序列表
<110> 中国农业大学
<120> 一种高GC含量基因的零背景克隆方法及其应用
<130> KHP181116303.4
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcaagggcac ttccaggacc ggcatc 26
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aaggccccac ctcggcgctc a 21
<210> 3
<211> 463
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgcaagggca cttccaggac cggcatcttc tcaccaggat gaacgtgctg ctttcccggc 60
agctgatgct cttcctttgt gccaccgcct tcagggagac cttggaaaac gtggcgccca 120
tggagaatcc tagaaccaca ggctcgcagc tcggacccgc gacgctccgg gcgccctggg 180
agcagagccc gcggtgcgcg gcggggaagc ccacagcggc cgggcctcgg cctcgggggg 240
ccgcgctctg cccctctgag agctccgccg gcccccggca gccgggcccg tgcgccccgc 300
gcagccgcct gatcccggct ccgaggggcg ccgcgctggt gcagcgggag aaggacgtgt 360
ccgcctacaa ctggaactcc ttcggcctgc gctacggcag gcggcaggcg gcgctgcccg 420
ggggccgcgg cggcgcgcgg ggctgagcgc cgaggtgggg cct 463
<210> 4
<211> 135
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Asn Val Leu Leu Ser Arg Gln Leu Met Leu Phe Leu Cys Ala Thr
1 5 10 15
Ala Phe Arg Glu Thr Leu Glu Asn Val Ala Pro Met Glu Asn Pro Arg
20 25 30
Thr Thr Gly Ser Gln Leu Gly Pro Ala Thr Leu Arg Ala Pro Trp Glu
35 40 45
Gln Ser Pro Arg Cys Ala Ala Gly Lys Pro Thr Ala Ala Gly Pro Arg
50 55 60
Pro Arg Gly Ala Ala Leu Cys Pro Ser Glu Ser Ser Ala Gly Pro Arg
65 70 75 80
Gln Pro Gly Pro Cys Ala Pro Arg Ser Arg Leu Ile Pro Ala Pro Arg
85 90 95
Gly Ala Ala Leu Val Gln Arg Glu Lys Asp Val Ser Ala Tyr Asn Trp
100 105 110
Asn Ser Phe Gly Leu Arg Tyr Gly Arg Arg Gln Ala Ala Leu Pro Gly
115 120 125
Gly Arg Gly Gly Ala Arg Gly
130 135
Claims (5)
1.一种高GC含量基因的零背景克隆方法，其特征在于，运用Slow-down PCR方法，对目标基因的模板DNA或cDNA进行PCR扩增，PCR所用引物长度在20-30bp之间，GC含量在60％-75％之间，Tm>70℃，Tm差异<1℃；
所述Slow-down PCR方法的工作程序为：98℃预变性2min；
98℃10s，72℃30s，72℃45s，4个循环；
98℃10s，71℃30s，72℃45s，4个循环；
98℃10s，70℃30s，72℃45s，4个循环；
98℃10s，69℃30s，72℃45s，4个循环；
98℃10s，68℃30s，72℃45s，4个循环；
98℃10s，67℃30s，72℃45s，4个循环；
98℃10s，66℃30s，72℃45s，4个循环；
98℃10s，65℃30s，72℃45s，4个循环；
循环结束后72℃10min。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括对扩增产物回收纯化后，连接T-Vector载体转化，所述T-Vector载体为零背景克隆载体，无需蓝白斑筛选。
3.一种绵羊Kiss1基因的克隆方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取成年绵羊下丘脑组织的mRNA，反转录为cDNA；
(2)以所得的cDNA为模板，进行Slow-down PCR扩增；PCR扩增所用的引物长度在20-30bp之间，GC含量在60％-75％之间，Tm>70℃，Tm差异<1℃；
所述Slow-down PCR方法的工作程序为：98℃预变性2min；
98℃10s，72℃30s，72℃45s，4个循环；
98℃10s，71℃30s，72℃45s，4个循环；
98℃10s，70℃30s，72℃45s，4个循环；
98℃10s，69℃30s，72℃45s，4个循环；
98℃10s，68℃30s，72℃45s，4个循环；
98℃10s，67℃30s，72℃45s，4个循环；
98℃10s，66℃30s，72℃45s，4个循环；
98℃10s，65℃30s，72℃45s，4个循环；
循环结束后72℃10min；
(3)扩增产物回收纯化后，连接载体转化，提质粒测序。
4.如权利要求3所述的克隆方法，其特征在于，步骤(2)所述引物的核苷酸序列如SEQID NO.1-2所示。
5.权利要求3-4任一所述的克隆方法在制备抑制肿瘤转移的药物或调控家畜生殖功能药物中的应用。
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