CN104328130A - 柔嫩艾美耳球虫入侵相关蛋白Et CHP559基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种柔嫩艾美耳球虫基因，该基因为Et CHP559基因，包含SEQ ID NO.1所示的开放阅读框核苷酸序列。本发明的柔嫩艾美耳球虫基因，是柔嫩艾美耳球虫子孢子阶段高表达的新基因，与子孢子入侵宿主细胞相关，对开发抑制子孢子入侵宿主细胞、阻断球虫生活史的新疫苗或新药具有很高的应用价值。

Description

柔嫩艾美耳球虫入侵相关蛋白Et CHP559基因及其应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种柔嫩艾美耳球虫入侵相关蛋白Et CHP559基因及其应用。 

背景技术

鸡球虫病是几种艾美耳球虫寄生肠道所引起的一种危害极其严重的全球性寄生虫病，严重危害鸡的生长发育，是集约化养鸡业危害最大的疾病之一，每年给养鸡业造成巨大的经济损失。柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)是致病性最为严重的鸡球虫之一，它主要寄生于盲肠及其附近区域，能够引起出血性肠炎，对雏鸡危害最大，严重时能引起较高的死亡率。目前控制鸡球虫病的方法主要以在饲料中添加抗球虫药物预防为主，但由于抗球虫药的长期使用，鸡球虫耐药性的产生已成为无法避免的问题，任何一种抗球虫药在使用一定时间后都会引起球虫的耐药性，使得许多抗球虫药的防治效果显著降低，甚至完全失效，即使提高药物浓度也无济于事，仍然爆发球虫病，给养鸡业带来了无法弥补的损失。同时因球虫产生耐药性，使好不容易筛选出来的抗球虫药使用年限大大缩减，新药开发速度已赶不上耐药株出现的速度。而且抗球虫药作为饲料添加剂的潜在危害又逐渐成为人们关注的对象，食品安全日益受到关注，很多曾经效果很好的抗球虫药都被划入禁用之列，因此，人们期待用更理想的方法来替代抗球虫药物的使用。球虫活卵囊疫苗的成功研制和应用提供了一种可以替代药物控制鸡球虫病的技术手段。但活疫苗不可避免地存在难保存、散毒及潜在的致病威胁等缺点，未能在鸡场得到广泛使用，所以迫切需要寻找新的防治手段来控制鸡球虫病。而研制新疫苗和新药物的关键在于寻找到合适的虫体抗原基因或基因产物作为防治球虫病的作用靶标。 

鸡球虫是属于顶复器门(Apicomplexa)艾美耳属(Eimeria)的一类寄生于鸡肠道的原虫。顶复器原虫多数是专一性的细胞内寄生虫，包括疟原虫(Plasmodium)、弓形虫(Toxoplasma)、艾美耳球虫(Eimeria)、隐孢子虫(Cryptosporidium)等，有复杂的生活史，需入侵宿主细胞，完成生活史循环需要更替一个或多个宿主，或更换不同的细胞和组织，因而成功地入侵宿主细胞是这类寄生虫感染建立的前提。虽然顶复器原虫入侵的宿主细胞不同，包括红细胞、淋巴细胞、巨噬细胞和消化道细胞等，但都有一个共同的高度保守的入侵机制，需要顶复器(微线、棒状体和致密颗粒)分泌一系列蛋白参与，这些蛋白相互作用，在宿主细胞膜与虫体表面形成一个高度保守的运动结构(Moving Junction,MJ),对虫体入侵宿主细胞起至关重要的作用。 

发明内容

本发明要解决针对药物防治球虫病极易产生耐药性的问题急需开发新型疫苗和新药的技术问题，提供一种柔嫩艾美耳球虫入侵相关蛋白Et CHP559基因，该Et CHP559在柔嫩艾美耳球虫入侵宿主细胞过程中起着重要作用，对开发防治鸡球虫病的新疫苗或新药具有很高的应用价值。 

此外，还需要提供一种柔嫩艾美耳球虫入侵相关蛋白Et CHP559基因的应用。 

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现: 

在本发明的一个方面，提供了一种柔嫩艾美耳球虫基因，该基因为Et CHP559基因，包含SEQ ID NO.1所示的开放阅读框核苷酸序列。 

优选的，所述基因具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。 

在本发明的另一方面，提供了一种重组载体，包含编码Et CHP559蛋白氨基酸序列的核苷酸序列，所述Et CHP559蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。 

所述重组载体包括重组克隆载体或重组表达载体，重组表达载体包括重组原核表达载体、重组真核表达载体。 

在本发明的另一方面，还提供了一种重组蛋白，该重组蛋白是由上述重组载体经表达而制得。 

在本发明的另一方面，还提供了一种多克隆抗体，该多克隆抗体是用上述重组蛋白免疫兔子而制得。 

在本发明的另一方面，还提供了一种上述柔嫩艾美耳球虫基因的应用，用于制备预防或治疗鸡球虫病的疫苗或药物。 

所述疫苗或药物通过抑制柔嫩艾美耳球虫子孢子入侵宿主细胞而阻断球虫生活史来发挥作用。 

在本发明的另一方面，还提供了一种上述柔嫩艾美耳球虫基因的应用，用于筛选预防或治疗球虫病的药物。 

在本发明的另一方面，还提供了一种疫苗，包含上述重组蛋白，或上述重组载体，该重组载体为真核表达载体。 

在本发明的另一方面，还提供了一种作用靶标为Et CHP559蛋白的抗球虫药物。 

本发明柔嫩艾美耳球虫入侵相关蛋白Et CHP559基因，是柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)的一个新基因。Western-blot分析表明本发明Et CHP559的原核表达产物和真核表达产物都具有良好的免疫原性；免疫荧光定位实验和体外抑制试验结果显示Et CHP559与子孢子的入侵相关，在球虫子孢子入侵宿主细胞时发挥了重要作用。因此，本发明的Et CHP559 基因，为开发抑制子孢子入侵、阻断球虫生活史的新疫苗或新药提供了新思路。 

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。 

图1是本发明实施例1柔嫩艾美耳球虫Et CHP559基因扩增产物电泳鉴定图； 

图2是本发明实施例2实时定量PCR检测Et CHP559基因在柔嫩艾美耳球虫不同发育阶段的表达图； 

图3是本发明实施例3重组原核表达质粒pGEX-4T-Et CHP559的双酶切鉴定图； 

图4是本发明实施例3重组表达质粒pGEX-4T-Et CHP559不同时相表达蛋白的SDS-PAGE电泳图； 

图5是本发明实施例3纯化的Et CHP559重组蛋白分析图； 

图6是本发明实施例3重组原核表达质粒Pcold-TF-Et CHP559的酶切鉴定图； 

图7是本发明实施例3重组原核表达质粒Pcold-TF-Et CHP559的诱导表达图； 

图8是本发明实施例3纯化的His-Et CHP559重组蛋白分析图； 

图9是本发明实施例5的Et CHP559蛋白免疫原性分析图； 

图10是本发明实施例6免疫荧光检测Et CHP559蛋白在柔嫩艾美耳球虫不同发育阶段的分布和定位图； 

图11是本发明实施例7体外抑制试验结果图； 

图12是本发明实施例8重组真核表达质粒pcDNA3.1-flag-Et CHP559的PCR鉴定和双酶切鉴定图； 

图13是本发明实施例8重组真核表达质粒pcDNA3.1-flag-Et CHP559转染DF-1细胞的表达结果图； 

图14是本发明实施例8重组真核表达质粒pcDNA3.1-flag-Et CHP559转染DF-1细胞表达后Western-Blot检测结果图。 

具体实施方式

下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著，黄培堂，汪嘉玺，朱厚础，等译.第3版，北京：科学出版社，2002)中所述的方法进行。 

本发明以柔嫩艾美耳球虫为研究对象，筛选鉴定参与柔嫩艾美耳球虫入侵宿主细胞的相关蛋白。在前期实验室以柔嫩艾美耳球虫顶体膜蛋白1(EtAMA1)为诱饵，筛选柔嫩艾美耳球虫子孢子酵母双杂交cDNA文库获得可能与之相互作用蛋白的EST序列基础上，选择编号为559基因的EST序列，利用RACE(末端快速扩增)技术扩增获得了含一个完整ORF(开 放阅读框)的基因全长序列，在原核表达系统和真核表达系统中成功表达该蛋白，并通过实验表明Et CHP559与子孢子的入侵相关。 

实施例1  柔嫩艾美耳球虫Et CHP559基因全长cDNA的克隆及分析 

1.材料 

虫株和体外培养细胞：柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)是由中国农业科学院上海兽医研究所保存、繁殖提供。DF-1(鸡胚成纤维细胞)细胞用于感染、抑制、免疫荧光试验和转染真核表达重组质粒。 

2.方法 

2.1 总RNA提取 

实验前将干净的金属提取器皿单独使用锡箔纸包好，180℃烤箱内烘烤6h。操作台和离心管架等均用75％酒精消毒，保证无RNase污染。所用移液枪、枪头和离心管均专一用于RNA的提取。 

子孢子总RNA的提取参照Trizol试剂说明书操作，具体详细步骤为： 

1)取保存于液氮中的E.tenella子孢子，加入适量Trizol试剂并充分混匀，室温静置6min。 

2)向步骤1)中加入氯仿(按1mL Trizol加200μL氯仿)，盖紧离心管盖，用手颠倒混匀数次，再室温静置15min。 

3)4℃12000r/min离心15min。 

4)从离心机中小心取出离心管，此时匀浆液分为三层，即：无色的上清液、中间的白色蛋白层及带有颜色的下层有机相。吸取上清液转移至另一新的离心管中(切忌吸出白色中间层)。 

5)向上清中加入等体积的异丙醇，颠倒离心管充分混匀后，在15～30℃下静置10mim。 

6)4℃，12000r/min离心10min，RNA沉于管底。 

7)小心弃上清，缓慢地沿离心管壁加入75％的乙醇l mL(DEPC水配制)，温和振荡沉淀。 

8)4℃，12000r/min离心5min后小心弃去乙醇，沉淀室温干燥至无乙醇气味，用少量DEPC水溶解沉淀。电泳分析，并测定其浓度和分析其纯度。 

2.2 RACE扩增cDNA模板的制备：按照GeneRacer^TMKit(美国Invitrogen公司)说明书操作步骤将提取的柔嫩艾美耳球虫子孢子总RNA反转录合成cDNA第一链，制备扩增5’RACE和3’RACE的cDNA模板，利用RACE技术扩增基因的全长cDNA序列。 

2.3 柔嫩艾美耳球虫Et CHP559基因的5'RACE扩增 

在前期实验室利用柔嫩艾美耳球虫顶体膜蛋白1(EtAMA1)为诱饵，筛选柔嫩艾美耳球虫子孢子酵母双杂交cDNA文库，获得可能相互作用蛋白的ESTs序列基础上，本发明选择其中一个基因的EST序列，该EST序列含3’末端的Ploy(A)尾。Blast分析与柔嫩艾美耳球虫保守的假象蛋白(hypothetical protein，conserved)同源，该EST序列编号为559。 

5’端RACE引物设计合成： 

根据获得含3’端Ploy(A)的EST序列，利用Primer Premier 5.00软件设计5'端的引物，5’端RACE扩增引物见下表1。 

表1  5'端RACE扩增引物序列 

利用此引物扩增5'cDNA末端，将5'RACE PCR扩增产物回收后，与pGEM-T-easy载体连接，转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，挑选白色菌落进行PCR鉴定，如果扩增片段与预期一致，则取500μL菌液送公司测序。对于阳性克隆测序结果，用DNAstar软件查找5'RACE扩增产物序列与原EST序列的重叠部分，拼接获得全长cDNA序列(SEQ ID NO.2)。 

2.4 柔嫩艾美耳球虫Et CHP559基因ORF的克隆和分析 

根据拼接的全长cDNA序列设计两端引物(见下表2)，在上下游引物中分别加入酶切位点Bam HI和Xho I，以5'RACE扩增时反转录合成的cDNA第一链为模板，进行PCR扩增。 

表2  559号基因扩增引物序列 

反应结束后进行1％琼脂糖凝胶电泳分析(见图1)。在图1中，M：标准DNA分子量(从上到下：2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)；1：扩增的559基因。将回收的PCR产物与pGEM-T-easy载体连接，转化大肠杆菌感受态细胞。挑选白色菌落进行PCR鉴定。将鉴定的阳性菌落送公司测序。测序结果利用常规生物信息学软件对获得的全长cDNA序列及其编码蛋白结构进行预测分析。 

结果: 

根据Et CHP559基因的EST序列，利用5’RACE技术扩增获得了含一个完整开放阅读框(ORF：104-1327bp，SEQ ID NO.1)的全长cDNA序列，该序列全长1746bp(SEQ ID NO.2)，包括5’端的UTR序列，长103bp，含有CAAT序列，没有TATA序列；3’端UTR序列，长419bp，含Ploy(A)尾，没有典型的AATAAA序列；ORF长1224bp，编码407个氨基酸(SEQ ID NO.3)，预测分子量为46.04kDa，等电点为9.12；推测的氨基酸序列含一个信号肽和一个跨膜区。结构功能域分析发现EtCHP559基因编码的蛋白可能含有1个N端糖基化位点，1个cAMP和cGMP依赖的蛋白激酶磷酸化位点，8个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点，5个蛋白激酶C磷酸化位点和1个酪氨酸激酶磷酸化位点。与柔嫩艾美耳球虫基因组数据库(http://www.genedb.org/Homepage/Etenella)比较发现，Et CHP559基因的ORF与保守的假象蛋白(hypothetical protein，conserved，ETH_00024035)100％同源，因此将该基因命名为Et CHP559。 

实施例2  Et CHP 559基因在柔嫩艾美耳球虫不同发育阶段的表达差异分析 

分别提取柔嫩艾美耳球虫4个发育阶段虫体(未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子和第二代裂殖子)的总RNA，以柔嫩艾美耳球虫未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子、第二代裂殖子的cDNA第一链为模板，利用实时荧光定量PCR，选择18s rRNA作为内参，验证EtCHP559基因在柔嫩艾美耳球虫不同发育阶段虫体中的表达情况。表3为实时荧光定量PCR扩增引物序列。结果表明，Et CHP559基因在子孢子发育阶段高效表达(见图2)。图2中，UO代表柔嫩艾美耳球虫未孢子化卵囊；SO为柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊；Spz为柔嫩艾美耳球虫子孢子；Mrz为柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子。 

表3  实时荧光定量PCR扩增引物序列 

实施例3  Et CHP 559基因原核表达重组质粒的构建及重组蛋白的表达 

1.原核表达重组质粒(pGEX-4T-Et CHP559)的构建及重组蛋白的表达 

将之前测序正确的重组克隆质粒pGEM-T-Et CHP559，利用限制性内切酶BamHⅠ和Xho Ⅰ进行双酶切，然后再与用同样限制性内切酶双酶切的原核表达载体pGEX-4T-2连接，构建重组表达质粒pGEX-4T-Et CHP559。转化大肠杆菌TOP10后，经PCR以及双酶切(BamH Ⅰ 和Xho Ⅰ)鉴定，获得与预期大小一致的目的条带(见图3)，表明含Et CHP559基因的原核表达质粒构建成功。图3所示为重组原核表达质粒pGEX-4T-Et CHP559的酶切鉴定图，“1”代表重组表达质粒pGEX-4T-Et CHP559的BamH Ⅰ、Xho Ⅰ双酶切产物。 

将构建成功的pGEX-4T-Et CHP559重组表达质粒，转化大肠杆菌BL21(DE3)，在37℃下经1mmol/L IPTG诱导表达。分别取不同时间段的表达菌，进行SDS-PAGE电泳分析。发现目的条带有表达，大小为72kDa左右，与预测大小一致(Et CHP559预测分子量46kDa，表达的融合蛋白GST标签约26kDa)(见图4)。图4中，M：蛋白质标准分子量(从上至下为94.0kDa、66.2kDa、45.0kDa、35.0kDa、26.0kDa)；1：未加IPTG诱导的0h菌液；2-5：分别为2h、4h、6h、8h的表达产物。 

取20mL IPTG诱导表达后的菌液，4℃离心获得菌体沉淀后，加入适量PBS缓冲液，悬浮均匀，经超声裂解后，离心。分别取适量上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳分析，结果显示，表达的融合蛋白GST-Et CHP559以包涵体形式存在。经过一系列诱导条件的改变，该融合蛋白仍然以包涵体形式存在，后采用切胶纯化方法对其纯化，SDS-PAGE电泳结果显示获得了纯化的蛋白(见图5)。图5中，M：蛋白质标准分子量(从上至下为94.0kDa、66.2kDa、45.0kDa、35.0kDa、26.0kDa)；1：切胶纯化的重组GST-Et CHP559蛋白。 

2.原核表达重组质粒的构建(Pcold-TF-Et CHP559)及可溶重组蛋白的制备 

为了获得可溶性蛋白，本发明采用低温冷休克表达载体Pcold-TF表达可溶的重组蛋白。将之前测序正确的pGEM-T-Et CHP559转化菌提取质粒，利用限制性内切酶BamH Ⅰ和Sal Ⅰ进行双酶切，然后再与用同样限制性内切酶双酶切的表达载体Pcold-TF连接，构建重组表达质粒。经过PCR以及双酶切鉴定后，获得与预期大小一致的目的条带(见图6)。表明含Et CHP559基因的原核表达重组质粒Pcold TF-Et CHP559构建成功。图6所示为重组原核表达质粒Pcold-TF-Et CHP559的酶切鉴定图，在图6中，“1”代表重组表达质粒Pcold-TF-Et CHP559的BamHⅠ、SalⅠ双酶切产物。 

将鉴定正确的重组表达质粒(Pcold-TF-Et CHP559)转化大肠杆菌BL21(DE3)，在16℃下经0.5mmol/L IPTG诱导表达24h。取20ml诱导表达后的菌液，4℃离心获得菌体沉淀后，加入适量PBS缓冲液，悬浮均匀，经超声裂解后，离心。分别取适量上清和沉淀与0h菌体进行SDS-PAGE电泳分析(见图7)。Et CHP559预测分子量46kDa，采用以大肠杆菌伴侣蛋白Trigger Factor(TF)作为可溶性标签的融合型冷休克表达系统，表达的融合蛋白带有分子量为48kDa的TF分子和分子量为3.5kDa的His标签，重组表达质粒Pcold-TF-Et CHP559表达的重组蛋白分子量大约为98kDa。SDS-PAGE结果表明重组表达质粒Pcold-TF-Et CHP559表达的融合蛋白与预测的大小基本一致，且有可溶性表达。在图7中，M：蛋白质标准分子 量(从上至下为94.0kDa、66.2kDa、45.0kDa、35.0kDa、26.0kDa)；1：未加IPTG诱导的0h菌液；2：24h菌液超声后上清；3：24h菌液超声后沉淀。 

由于His-Et CHP559重组蛋白存在可溶性表达形式，直接利用His Resin亲和层析柱纯化重组蛋白，SDS-PAGE分析表明纯化的重组蛋白纯度较高(图8)。图8中，M：蛋白质标准分子量；1：纯化的His-Et CHP559重组蛋白。 

实施例4  多克隆抗体制备 

取纯化后的重组蛋白GST-Et CHP559，BCA测定浓度后，以每只兔子200μg蛋白的剂量与弗氏完全佐剂按1:1的比例混合装入EP管中，然后利用银汞调合器震荡乳化，吸入1mL的注射器中，在兔子腹股沟皮下多点注射，进行一免。两周后用相同剂量的蛋白与弗氏不完全佐剂按1:1的比例混合乳化，相同方式进行二免，以后每隔一周进行一次免疫，待五免7天后，从兔颈动脉采血，收集血清，分装后于-20℃冻存。 

实施例5  Et CHP559蛋白免疫原性分析 

将纯化的重组蛋白GST-Et CHP559进行SDS-PAGE后，再转移至PVDF膜上，重组蛋白分别用柔嫩艾美耳球虫可溶性蛋白免疫兔子制备的抗血清、兔抗GST抗体和兔子阴性血清作为一抗做Western-blot。二抗用HRP标记的羊抗兔IgG进行Western-blot分析。结果重组蛋白有反应条带，分子量与预期大小一致(见图9)，表明该重组蛋白具有一定的免疫原性。图9中，M：预染的蛋白质标准分子量(从上至下为：170kDa、130kDa、95kDa、72kDa、55kDa、43kDa、34kDa、26kDa、17kDa)；1：柔嫩艾美耳球虫卵囊全蛋白免疫兔子的抗血清；2：抗GST血清；3：兔子阴性血清。 

实施例6  免疫荧光检测Et CHP559蛋白在柔嫩艾美耳球虫不同发育阶段的分布和定位 

利用实施例4制备的兔抗GST-Et CHP559多克隆抗体和绿色荧光标记的羊抗兔二抗，分别观察Et CHP559蛋白在柔嫩艾美耳球虫子孢子以及子孢子体外感染鸡胚成纤维细胞DF-1后不同发育阶段的表达分布和定位，包括PBS孵育1h的子孢子、完全培养基(CM)孵育1h的子孢子和子孢子接入DF-1细胞后2h、24h、48h、72h、82h后不同发育阶段Et CHP559蛋白的分布情况。结果如图10所示，发现该蛋白主要位于子孢子的表面(A)；当子孢子在完全培养基(CM)孵育后，该蛋白的表达量上升，趋向于顶端，且荧光强度加强(B)；当子孢子加入DF-1细胞2h后，发现该蛋白主要位于虫体的顶端(C)；在入侵DF-1细胞24h后，蛋白的表达增加，且逐渐往虫体的后端分泌(D)；当虫体发育至未成熟裂殖体和成熟 裂殖体时，蛋白均匀的分布于整个虫体(E-G)；当虫体发育为裂殖子时，表达量下将(H)。 

实施例7  体外抑制试验分析Et CHP559是否与子孢子入侵宿主细胞有关 

免疫荧光检测发现Et CHP559蛋白主要位于子孢子的表面，且当子孢子加入完全培养基(CM)后，该蛋白在子孢子顶端分泌加强，当加入DF-1细胞2h后，该蛋白主要位于顶端，因此推测该蛋白可能与柔嫩艾美耳球虫入侵宿主细胞有关。本实施例利用体外抑制试验验证Et CHP559蛋白是否是入侵相关蛋白。 

提取新鲜的子孢子，用CFDA SE细胞增殖和示踪检测剂标记子孢子。利用Protein A+G Agarose纯化兔抗GST-Et CHP559抗血清的IgG，将纯化的IgG分别以浓度25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL量与子孢子在37℃水浴锅中孵育2h；同时取一健康兔IgG作为阴性对照，在相同的条件下，用相同浓度的抗体作用子孢子；另设空白对照，不加抗体。最后分别接种DF-1细胞中，培养14h后，收集DF-1细胞，用流式细胞分析仪进行分析。 

结果显示：兔抗GST-Et CHP559抗体作用子孢子后，与对照组相比子孢子入侵DF-1细胞的能力明显下降，且随着抗体浓度的不断增大，作用后子孢子入侵力逐渐降低，抗体抑制率逐渐升高，当抗体浓度为300μg/mL，抑制率高达70％(见图11)，说明Et CHP559蛋白在柔嫩艾美耳球虫入侵宿主细胞过程中发挥重要功能。 

实施例8  Et CHP559基因在真核表达系统中的表达 

1.重组真核质粒pcDNA3.1-flag-Et CHP 559的构建 

将鉴定正确的重组质粒pGEM-Teasy-Et CHP559和真核表达载体pcDNA3.1-flag分别用BamH Ⅰ和Xhol Ⅰ进行双酶切，电泳后将Et CHP559目的条带和酶切开的pcDNA3.1-flag载体分别进行胶回收，然后4℃连接过夜，将连接产物转化到大肠杆菌Top10感受态细胞中，经PCR鉴定为阳性的菌液提质粒进行双酶切鉴定(见图12)，结果显示：成功构建了真核表达重组质粒pcDNA3.1-flag-Et CHP559。图12中，M：标准DNA分子量(从上到下：2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)；1：重组质粒pcDNA3.1-flag-Et CHP559的菌液PCR鉴定结果；2：重组质粒pcDNA3.1-flag-Et CHP559的BamH Ⅰ、Xho Ⅰ双酶切产物。 

2.重组真核表达质粒pcDNA3.1-flag-Et CHP559转染DF-1细胞 

将处于对数生长期的DF-1细胞用胰酶消化后，按每孔60万细胞置于6孔细胞培养板中传代培养，24h后开始转染，转染步骤按照Lipofectamine2000操作说明书进行，一组转染真核重组表达质粒pcDNA3.1-flag-Et CHP559，一组转染空载体pcDNA3.1-flag作为对照。细胞在37℃含5％CO₂的细胞培养箱中培养48h后，利用兔抗GST-Et CHP559蛋白的多抗为一抗，FITC标记(绿 色荧光)的山羊抗兔抗体为二抗，对真核表达重组质粒pcDNA3.1-flag-Et CHP 559转染48h后的DF-1细胞进行免疫荧光检测。结果显示：pcDNA3.1-flag-Et CHP 559转染的DF-1细胞检测到明显的绿色荧光，而pcDNA3.1-flag转染的DF-1细胞未见绿色荧光，表明真核表达重组质粒pcDNA3.1-flag-Et CHP 559成功转染DF-1细胞，且能在DF-1细胞中表达(见图13)。图13中，1：pcDNA3.1-flag-Et CHP 559转染DF-1细胞；2：pcDNA3.1-flag转染DF-1细胞；3：正常DF-1细胞。 

同时收集转染的DF-1细胞，加入Western及IP细胞裂解液提取蛋白，SDS-PAGE电泳后转移至PVDF膜上，进行Western-Blot检测蛋白是否表达，一抗为兔抗GST-Et CHP559蛋白多抗血清，二抗为近红外荧光羊抗兔IgG。结果显示，在转染重组质粒pcDNA3.1-flag-Et CHP 559的DF-1细胞提取蛋白中，可以检测到大小为46kDa的蛋白质条带；而在转染空载体质粒的DF-1细胞提取蛋白中，未检测到相应的目的条带(图14)。表明pcDNA3.1-flag-Et CHP 559重组质粒在DF-1细胞中成功表达。图14中，M：预染蛋白质分子量标准(从上至下为：170kDa、130kDa、95kDa、55kDa、43kDa、34kDa、26kDa、17kDa)；1：转染重组质粒pcDNA3.1-flag-Et CHP 559的DF-1细胞；2：转染空载体pcDNA3.1-flag的DF-1细胞。 

结果表明Et CHP559在真核表达系统中能成功表达，可用于筛选新型疫苗(包括DNA疫苗、重组蛋白疫苗)和新型药物的靶标。 

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。 

Claims (10)

1.一种柔嫩艾美耳球虫基因，其特征在于，所述基因为Et CHP559基因，包含SEQ ID NO.1所示的开放阅读框核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的柔嫩艾美耳球虫基因，其特征在于，所述基因具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

3.一种重组载体，其特征在于，包含编码Et CHP559蛋白氨基酸序列的核苷酸序列，所述Et CHP559蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

4.一种重组蛋白，其特征在于，该重组蛋白是由权利要求3所述重组载体经表达而制得。

5.一种多克隆抗体，其特征在于，该多克隆抗体是用权利要求4所述重组蛋白免疫兔子而制得。

6.权利要求1所述柔嫩艾美耳球虫基因的应用，其特征在于，用于制备预防或治疗鸡球虫病的疫苗或药物。

7.权利要求1所述柔嫩艾美耳球虫基因的应用，其特征在于，用于筛选预防或治疗鸡球虫病的药物。

8.权利要求4所述重组蛋白的应用，其特征在于，用于制备预防或治疗鸡球虫病的疫苗或药物。

9.一种疫苗，其特征在于，包含权利要求4所述重组蛋白，或权利要求3所述重组载体，该重组载体为真核表达载体。

10.一种作用靶标为Et CHP559蛋白的抗球虫药物。