TWI840950B

TWI840950B - 用於降低pd-l1表現之寡核苷酸

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Publication number: TWI840950B
Application number: TW111134997A
Authority: TW
Inventors: 萊可佩得森; 海珊傑凡巴克特; 梅蘭妮傑克羅特; 索倫歐特森; 蘇法隆尼盧安賽
Original assignee: 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司
Priority date: 2016-03-14
Filing date: 2017-03-14
Publication date: 2024-05-01

Abstract

本發明係關於能夠降低靶細胞中之PD-L1表現之反義寡核苷酸。該等寡核苷酸雜交至PD-L1 mRNA。本發明另外關於該寡核苷酸之偶聯物及醫藥組合物以及使用該寡核苷酸治療病毒性肝感染(諸如HBV、HCV及HDV)、寄生蟲感染(諸如瘧疾、弓蟲症、利什曼病(leishmaniasis)及錐蟲病)或肝癌或肝中轉移之方法。

Description

用於降低PD-L1表現之寡核苷酸

本發明係關於與程式性死亡配體-1 (PD-L1)互補以降低肝中之PD-L1表現之寡核苷酸(寡聚物)。本發明亦係關於緩解由肝感染或肝癌引起之T細胞耗竭之方法。相關感染係慢性HBV、HCV及HDV及諸如瘧疾及弓蟲症等寄生蟲感染(例如由瘧原蟲屬( Plasmodium)、尤其物種間日瘧原蟲(P. vivax)、三日瘧原蟲( P. malariae)及惡性瘧原蟲( P. falciparum)之原生動物引起)。

由程式性死亡-1 (PD-1)受體及其配體PD-L1 (或B7-H1或CD274)組成之共刺激路徑已知直接促成T細胞耗竭，從而使得在慢性肝感染期間缺乏病毒控制。PD-1路徑亦在自體免疫性中發揮一定作用，此乃因此路徑遭到破壞之小鼠發生自體免疫疾病。已展示，阻斷PD-1與PD-L1之間之相互作用之抗體會增強T細胞反應、尤其CD8+細胞毒性T細胞之反應(參見Barber等人，2006 Nature第439卷第682頁及Maier等人，2007 J. Immunol.第178卷第2714頁)。 WO 2006/042237闡述藉由評價腫瘤中之PD-L1 (B7-H1)表現來診斷癌症之方法且建議向患者遞送干擾PD-1/PD-L1相互作用之藥劑。干擾劑可為抗體、抗體片段、siRNA或反義寡核苷酸。並未提供該等干擾劑之具體實例且並未提及任何慢性肝感染。亦在(例如) WO 2005/007855、WO 2007/084865及US 8,507,663中揭示使用雙鏈RNA (dsRNA、RNAi或siRNA)分子來達成RNA干擾調介之PD-L1抑制。該等專利並未闡述至肝之靶向遞送。 Dolina等人， 2013 Molecular Therapy-Nucleic Acids, 2 e72闡述在活體內將靶向PD-L1之siRNA分子遞送至庫弗氏細胞(Kupffer cell)，由此增強MCMV感染小鼠中之NK及CD8+ T細胞清除。此論文斷定，遞送至肝細胞之靶向PD-L1之siRNA分子不能有效地增強CD8+ T細胞效應物功能。 siRNA方式顯著不同於單鏈反義寡核苷酸方式，此乃因生物分佈及作用模式極為不同。如Xu等人，2003 Biochem. Biophys. Res .Comm.第306卷第712-717頁中所闡述，反義寡核苷酸及siRNA對mRNA中之靶位點具有不同偏好。 WO2016/138278闡述使用兩種或更多種在5’端連接之單鏈反義寡核苷酸來抑制免疫檢查點(包含PD-L1)。本申請案並未提及HBV或至肝之靶向遞送。本發明目標本發明鑑別在肝臟細胞中(在實質細胞(例如肝細胞)及非實質細胞(例如庫弗氏細胞及肝竇狀隙內皮細胞(LSEC))中)極有效降低PD-L1 mRNA之新穎寡核苷酸及寡核苷酸偶聯物。藉由降低或沉默PD-L1，寡核苷酸及寡核苷酸偶聯物降低PD-1介導之抑制且由此促進耗竭T細胞之免疫刺激。緩解肝之慢性病原性感染中之T細胞耗竭使得重獲免疫控制且在肝之慢性病原性感染期間降低血液中之病毒抗原含量。天然殺手(NK)細胞及天然殺手T (NKT)細胞亦可由本發明之寡核苷酸及寡核苷酸偶聯物活化。寡核苷酸偶聯物使得肝臟細胞中之PD-L1發生局部降低且由此降低與PD-L1之全身性消耗有關之自體免疫副效應(例如肺炎、非病毒性肝炎及結腸炎)的風險。

本發明係關於靶向能夠調節PD-L1表現之核酸且治療或預防與PD-L1功能相關之疾病之寡核苷酸或其偶聯物。寡核苷酸或寡核苷酸偶聯物可尤其用於治療針對傳染原之免疫反應已耗竭之疾病。因此，在第一態樣中，本發明提供包括長度為10至30個核苷酸且與PD-L1靶核酸具有至少90%互補性之鄰接核苷酸序列之寡核苷酸。寡核苷酸可為較佳地具有間隙聚體設計之反義寡核苷酸。較佳地，寡核苷酸能夠藉由裂解靶核酸來抑制PD-L1表現。裂解較佳係經由核酸酶招募來達成。在另一態樣中，寡核苷酸偶聯至至少一個靶向去唾液酸醣蛋白受體之偶聯物部分(例如包括至少一個N-乙醯基半乳糖胺(GalNAc)部分之偶聯物部分)。偶聯物部分及寡核苷酸可藉由連接體、尤其生物可裂解連接體連接至一起。在另一態樣中，本發明提供包括本發明之寡核苷酸或寡核苷酸偶聯物及醫藥上可接受之稀釋劑、載劑、鹽及/或佐劑之醫藥組合物。在另一態樣中，本發明提供降低表現PD-L1之靶細胞中之PD-L1表現之方法(活體內或活體外方法)，其係藉由向該細胞投與有效量之本發明之寡核苷酸或組合物來達成。在另一態樣中，本發明提供用於恢復針對病毒或寄生蟲之免疫性之寡核苷酸、寡核苷酸偶聯物或醫藥組合物。在另一態樣中，本發明提供用作藥劑之寡核苷酸、寡核苷酸偶聯物或醫藥組合物。在另一態樣中，本發明提供治療或預防疾病、病症或功能障礙之方法，其係藉由向患有或易患該疾病、病症或功能障礙、尤其選自病毒性肝感染或寄生蟲感染之疾病之個體投與治療或預防有效量之本發明寡核苷酸來達成。在另一態樣中，本發明之寡核苷酸、寡核苷酸偶聯物或醫藥組合物係用於治療或預防病毒性肝感染(例如HBV、HCV及HDV)或寄生蟲感染(例如瘧疾、弓蟲症、利什曼病(leishmaniasis)及錐蟲病)或肝癌或肝中轉移。

定義 寡核苷酸如熟習此項技術者通常所理解，本文所用之術語「寡核苷酸」定義為包括兩個或更多個共價連接之核苷之分子。該等共價結合之核苷亦可稱為核酸分子或寡聚物。寡核苷酸通常係在實驗室中藉由固相化學合成且隨後加以純化來製得。在提及寡核苷酸之序列時，可提及共價連接之核苷酸或核苷之核鹼基部分或其修飾之序列或順序。本發明寡核苷酸係人工製得，且係以化學方式合成，並通常進行純化或分離。本發明寡核苷酸可包括一或多個經修飾核苷或核苷酸。 反義寡核苷酸本文所用之術語「反義寡核苷酸」定義為能夠藉由雜交至靶核酸、尤其靶核酸上之鄰接序列來調節靶基因表現之寡核苷酸。反義寡核苷酸在本質上並非雙鏈且由此並非siRNA。較佳地，本發明之反義寡核苷酸係單鏈。 鄰接核苷酸序列術語「鄰接核苷酸序列」係指寡核苷酸中與靶核酸互補之區域。該術語可在本文中與術語「鄰接核鹼基序列」及術語「寡核苷酸基序序列」互換使用。在一些實施例中，寡核苷酸之所有核苷酸構成鄰接核苷酸序列。在一些實施例中，寡核苷酸包括鄰接核苷酸序列且可視情況包括其他核苷酸(例如可用於將官能基連接至鄰接核苷酸序列之核苷酸連接體區)。核苷酸連接體區可或可不與靶核酸互補。 核苷酸核苷酸係寡核苷酸及多核苷酸之組成單元且出於本發明目的其包含天然及非天然核苷酸。在性質上，核苷酸(例如DNA及RNA核苷酸)包括核糖糖部分、核鹼基部分及一或多個磷酸酯基團(其不存在於核苷中)。核苷及核苷酸亦可互換地稱為「單元」或「單體」。 經修飾核苷本文所用之術語「經修飾核苷」或「核苷修飾」係指與等效DNA或RNA核苷相比藉由引入一或多個糖部分或(核)鹼基部分之修飾而加以修飾之核苷。在一較佳實施例中，經修飾核苷包括經修飾糖部分。術語經修飾核苷亦可在本文中與術語「核苷類似物」或經修飾「單元」或經修飾「單體」互換使用。 經修飾核苷間鏈接如熟習此項技術者通常所理解，術語「經修飾核苷間鏈接」定義為除磷酸二酯(PO)鏈接外之以共價方式將兩個核苷偶合至一起之鏈接。具有經修飾核苷間鏈接之核苷亦稱為「經修飾核苷酸」。在一些實施例中，與磷酸二酯鏈接相比，經修飾核苷間鏈接增加了寡核苷酸之核酸酶抗性。對於天然寡核苷酸而言，核苷間鏈接包含在毗鄰核苷之間產生磷酸二酯鍵之磷酸酯基團。經修飾核苷間鏈接尤其可用於穩定用於活體內應用之寡核苷酸，且可用於防止在本發明寡核苷酸中之DNA或RNA核苷區域中發生核酸酶裂解(例如在間隙聚體寡核苷酸之間隙區內以及在經修飾核苷之區域中)。在一實施例中，寡核苷酸包括一或多個自天然磷酸二酯修飾成(例如)對核酸酶攻擊更具抗性之鏈接之核苷間鏈接。可藉由在血清中培育寡核苷酸或藉由使用核酸酶抗性分析(例如蛇毒磷酸二酯酶(SVPD))來測定核酸酶抗性，此兩種方法在業內已眾所周知。能夠增強寡核苷酸之核酸酶抗性之核苷間鏈接稱為核酸酶抗性核苷間鏈接。在一些實施例中，修飾寡核苷酸或其鄰接核苷酸序列中之至少50%之核苷間鏈接，舉例而言，修飾寡核苷酸或其鄰接核苷酸序列中之至少60%、例如至少70%、例如至少80或例如至少90%之核苷間鏈接。在一些實施例中，修飾寡核苷酸或其鄰接核苷酸序列之所有核苷間鏈接。應認識到，在一些實施例中，將本發明寡核苷酸連接至非核苷酸官能基(例如偶聯物)之核苷可為磷酸二酯。在一些實施例中，寡核苷酸或其鄰接核苷酸序列之所有核苷間鏈接皆係核酸酶抗性核苷間鏈接。經修飾核苷間鏈接可選自包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯及硼烷磷酸酯之組。在一些實施例中，經修飾核苷間鏈接與本發明寡核苷酸之RNaseH招募相容，例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或硼烷磷酸酯。在一些實施例中，核苷間鏈接包括硫(S)，例如硫代磷酸酯核苷間鏈接。硫代磷酸酯核苷間鏈接因核酸酶抗性、有益藥物動力學及製造便利性尤其有用。在一些實施例中，寡核苷酸或其鄰接核苷酸序列中之至少50%之核苷間鏈接係硫代磷酸酯，舉例而言，寡核苷酸或其鄰接核苷酸序列中之至少60%、例如至少70%、例如至少80或例如至少90%之核苷間鏈接係硫代磷酸酯。在一些實施例中，寡核苷酸或其鄰接核苷酸序列之所有核苷間鏈接係硫代磷酸酯。在一些實施例中，寡核苷酸包括一或多個中性核苷間鏈接，尤其係選自磷酸三酯、甲基膦酸酯、MMI、醯胺-3、甲縮醛或硫代甲縮醛之核苷間鏈接。其他核苷間鏈接揭示於WO2009/124238 (以引用方式併入本文中)中。在一實施例中，核苷間鏈接係選自WO2007/031091 (以引用方式併入本文中)中所揭示之連接體。特定而言，核苷間鏈接可選自-O-P(O) ₂-O-、-O-P(O,S)-O-、-O-P(S) ₂-O-、-S-P(O) ₂-O-、-S-P(O,S)-O-、-S-P(S) ₂-O-、-O-P(O) ₂-S-、-O-P(O,S)-S-、-S-P(O) ₂-S-、-O-PO(R ^H)-O-、O-PO(OCH ₃)-O-、-O-PO(NR ^H)-O-、-O-PO(OCH ₂CH ₂S-R)-O-、-O-PO(BH ₃)-O-、-O-PO(NHR ^H)-O-、-O-P(O) ₂-NR ^H-、-NR ^H-P(O) ₂-O-、-NR ^H-CO-O-、-NR ^H-CO-NR ^H-，及/或核苷間連接體可選自由以下組成之群：-O-CO-O-、-O-CO-NR ^H-、-NR ^H-CO-CH ₂-、-O-CH ₂-CO-NR ^H-、-O-CH ₂-CH ₂-NR ^H-、-CO-NR ^H-CH ₂-、-CH ₂-NR ^HCO-、-O-CH ₂-CH ₂-S-、-S-CH ₂-CH ₂-O-、-S-CH ₂-CH ₂-S-、-CH ₂-SO ₂-CH ₂-、-CH ₂-CO-NR ^H-、-O-CH ₂-CH ₂-NR ^H-CO-、-CH ₂-NCH ₃-O-CH ₂-，其中R ^H係選自氫及C1-4-烷基。核酸酶抗性鏈接(例如硫代磷酸酯鏈接)尤其可用於能夠在與靶核酸形成雙螺旋體時招募核酸酶之寡核苷酸區域，例如用於間隙聚體之區域G或頭聚體及尾聚體之未修飾核苷區域。然而，硫代磷酸酯鏈接亦可可用於非核酸酶招募區域及/或親和力增強區域(例如用於間隙聚體之區域F及F’或頭聚體及尾聚體之經修飾核苷區域)中。然而，每一設計區域可包括除硫代磷酸酯外之核苷間鏈接(例如磷酸二酯鏈接)，尤其在經修飾核苷(例如LNA)保護鏈接抵抗核酸酶降解之區域中。納入磷酸二酯鏈接(例如一或兩個鏈接，尤其在經修飾核苷單元之間或毗鄰該等經修飾核苷單元(通常位於非核酸酶招募區域中))可改變寡核苷酸之生物可用性及/或生物分佈-參見WO2008/113832 (以引用方式併入本文中)。在一實施例中，寡核苷酸中之所有核苷間鏈接皆係硫代磷酸酯及/或硼烷磷酸酯鏈接。較佳地，寡核苷酸中之所有核苷間鏈接皆係硫代磷酸酯鏈接。 核鹼基術語核鹼基包含存在於核苷及核苷酸中之在核酸雜交中形成氫鍵之嘌呤(例如腺嘌呤及鳥嘌呤)及嘧啶(例如尿嘧啶、胸腺嘧啶及胞嘧啶)部分。在本發明背景中，術語核鹼基亦涵蓋經修飾核鹼基，該等經修飾核鹼基可不同於天然核鹼基，但在核酸雜交期間具有功能性。在此背景中，「核鹼基」係指天然核鹼基(例如腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸苷、尿嘧啶、黃嘌呤及次黃嘌呤)以及非天然變體。該等變體(例如)闡述於Hirao等人(2012) Accounts of Chemical Research第45卷第2055頁及Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry增刊37 1.4.1。在一些實施例中，藉由將嘌呤或嘧啶變成經修飾嘌呤或嘧啶(例如經取代嘌呤或經取代嘧啶)來修飾核鹼基部分，例如選自異胞嘧啶、假異胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-噻唑并-胞嘧啶、5-丙炔基-胞嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-噻唑并-尿嘧啶、2-硫代-尿嘧啶、2’硫代-胸腺嘧啶、肌苷、二胺基嘌呤、6-胺基嘌呤、2-胺基嘌呤、2,6-二胺基嘌呤及2-氯-6-胺基嘌呤之核鹼基。核鹼基部分可藉由用於每一相應核鹼基之字母代碼(例如A、T、G、C或U)來指示，其中每一字母可視情況包含具有等效功能之經修飾核鹼基。舉例而言，在所例示寡核苷酸中，核鹼基部分係選自A、T、G、C及5-甲基胞嘧啶。視情況，對於LNA間隙聚體而言，可使用5-甲基胞嘧啶LNA核苷。 經修飾寡核苷酸術語經修飾寡核苷酸闡述包括一或多個糖修飾性核苷及/或經修飾核苷間鏈接之寡核苷酸。術語「嵌合」寡核苷酸係在文獻中用於闡述具有經修飾核苷之寡核苷酸之術語。 互補性術語「互補性」闡述核苷/核苷之沃森-克裡克(Watson-Crick)鹼基配對之能力。沃森-克裡克鹼基對係鳥嘌呤(G)-胞嘧啶(C)及腺嘌呤(A) -胸腺嘧啶(T)/尿嘧啶(U)。應理解，寡核苷酸可包括具有經修飾核鹼基之核苷，舉例而言，通常使用5-甲基胞嘧啶代替胞嘧啶，且由此術語互補性涵蓋未修飾核鹼基與經修飾核鹼基之間之沃森-克裡克鹼基配對(例如參見Hirao等人(2012) Accounts of Chemical Research第45卷第2055頁及Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry增刊37 1.4.1)。本文所用之術語「互補%」係指核酸分子(例如寡核苷酸)中在給定位置與單獨核酸分子(例如靶核酸)中給定位置之鄰接核苷酸序列互補(亦即形成沃森-克裡克鹼基對)之核苷酸的數量(以鄰接核苷酸序列之百分比形式)。藉由以下方式來計算百分比：計數在兩個序列之間形成對之比對鹼基數(在比對靶序列5’-3’與3’-5’之寡核苷酸序列時)，除以寡核苷酸中之核苷酸總數且乘以100。在此一對比中，並不對準(形成鹼基對)之核鹼基/核苷酸可視為失配。術語「完全互補」係指100%互補性。下文係與靶核酸(SEQ ID NO: 772)完全互補之寡核苷酸(SEQ ID NO: 5)之一實例。 5’gcagtagagccaatta3’ (SEQ ID NO:772) 3’cgtcatctcggttaat5’ (SEQ ID NO: 5) 一致性本文所用之術語「一致性」係指核酸分子(例如寡核苷酸)中在給定位置與單獨核酸分子(例如靶核酸)中給定位置之鄰接核苷酸序列一致(亦即能夠與互補核苷形成沃森-克裡克鹼基對)之核苷酸的數量(以鄰接核苷酸序列之百分比形式)。藉由以下方式來計算百分比：計數在兩個序列(包含間隙)之間一致之比對鹼基數，除以寡核苷酸中之核苷酸總數且乘以100。百分比一致性= (匹配數× 100)/比對區域長度(含有間隙)。雜交本文所用之術語「雜交(hybridizing或hybridizes)」應理解為兩條核酸鏈(例如寡核苷酸與靶核酸)在相對鏈上之鹼基對之間形成氫鍵，由此形成雙螺旋體。兩條核酸鏈之間之結合親和力係雜交強度。其通常係針對熔融溫度(T _m)來進行闡述，熔融溫度定義為一半寡核苷酸與靶核酸形成雙螺旋體之溫度。在生理學條件下，T _m並不與親和力嚴格成正比(Mergny及Lacroix, 2003, Oligonucleotides13:515-537)。標準態吉布斯自由能(Gibbs free energy) ΔG°係結合親和力之更準確代表且與反應之解離常數(K _d)以ΔG°=-RTln(K _d)形式相關，其中R係氣體常數且T係絕對溫度。因此，寡核苷酸與靶核酸之間之反應之極低ΔG°反映寡核苷酸與靶核酸之間的強雜交。ΔG°係與反應有關之能量，其中水性濃度為1M，pH為7，且溫度為37℃。寡核苷酸至靶核酸之雜交係自發反應且自發反應之ΔG°小於零。可以實驗方式藉由(例如)使用等溫滴定量熱(ITC)方法來量測ΔG°，如Hansen等人，1965, Chem. Comm.36-38及Holdgate等人，2005, Drug Discov Today中所闡述。熟習此項技術者應知曉，商業設備可用於ΔG°量測。亦可在數值上藉由使用最近鄰居模型(如由SantaLucia, 1998, Proc Natl Acad Sci USA.95: 1460-1465所闡述)使用適當導出之熱動力學參數(由Sugimoto等人，1995, Biochemistry34:11211-11216及McTigue等人，2004, Biochemistry43:5388-5405所闡述)來估計ΔG°。為使得可藉由雜交來調節其預期核酸靶，本發明寡核苷酸以低於-10 kcal之估計ΔG°值(對於長10-30個核苷酸之寡核苷酸)雜交至靶核酸。在一些實施例中，藉由標準態吉布斯自由能ΔG°來量測雜交之程度或強度。對於長8-30個核苷酸之寡核苷酸而言，寡核苷酸可以低於-10 kcal範圍(例如低於-15 kcal、例如低於-20 kcal及例如低於-25 kcal)之估計ΔG°值雜交至靶核酸。在一些實施例中，寡核苷酸以(-10 kcal至-60 kcal、例如-12 kcal至-40 kcal、例如-15 kcal至-30 kcal或-16 kcal至-27 kcal、例如-18 kcal至-25 kcal)之估計ΔG°值雜交至靶核酸。 靶核酸根據本發明，靶核酸係編碼哺乳動物PD-L1之核酸且可為(例如)基因、RNA、mRNA及mRNA前體、成熟mRNA或cDNA序列。靶可由此稱為PD-L1靶核酸。本發明寡核苷酸可(例如)靶向哺乳動物PD-L1之外顯子區域，或可(例如)靶向PD-L1 mRNA前體之內含子區域(參見表1)。表1：人類PD-L1外顯子及內含子

人類PD-L1 mRNA前體(SEQ ID NO 1)中之外顯子區域	人類PD-L1 mRNA前體(SEQ ID NO 1)中之內含子區域
ID	起始	末端	ID	起始	末端
e1	1	94	i1	95	5597
e2	5598	5663	i2	5664	6576
e3	6577	6918	i3	6919	12331
e4	12332	12736	i4	12737	14996
e5	14997	15410	i5	15411	16267
e6	16268	16327	i6	16328	17337
e7	17338	20064

適宜地，靶核酸編碼PD-L1蛋白、尤其哺乳動物PD-L1、例如人類PD-L1 (例如參見表2及3，其提供用於人類、猴及小鼠PD-L1之參考mRNA及mRNA前體序列)。在本發明之情形中，mRNA前體亦視為編碼蛋白質之核酸。在一些實施例中，靶核酸係選自由以下組成之群：SEQ ID NO: 1、2及3或其天然變體(例如編碼哺乳動物PD-L1蛋白之序列)。若在研究或診斷中採用本發明寡核苷酸，則靶核酸可為cDNA或衍生自DNA或RNA之合成核酸。對於活體內或活體外應用而言，本發明寡核苷酸通常能夠抑制表現PD-L1靶核酸之細胞中之PD-L1靶核酸表現。本發明寡核苷酸之核鹼基之鄰接序列通常與PD-L1靶核酸互補，如橫跨寡核苷酸之長度所量測，視情況一或兩個失配除外，且視情況排除可將寡核苷酸連接至可選官能基(例如偶聯物)或其他非互補性末端核苷酸之基於核苷酸之連接體區(例如區域D’或D’’)。在一些實施例中，靶核酸可為RNA或DNA，例如信使RNA，例如成熟mRNA或mRNA前體。在一些實施例中，編碼哺乳動物PD-L1蛋白(例如人類PD-L1)之靶核酸係RNA或DNA (例如人類PD-L1 mRNA前體序列(例如揭示為SEQ ID NO 1者)或具有NCBI參考編號NM_014143之人類mRNA序列)。關於實例性靶核酸之其他資訊提供於表2及3中。表2：各物種中之PD-L1之基因體及組合體資訊。

物種	Chr.	鏈	基因體坐標開始末端	組合體	mRNA 之NCBI 參考序列* 登錄號
人類	9	fwd	5450503	5470566	GRCh38:CM000671.2	NM_014143
食蟹猴	15		73560846	73581371	GCF_000364345.1	XM_005581779
小鼠	19	fwd	29367455	29388095	GRCm38:CM001012.2	NM_021893

Fwd =正向鏈。基因體坐標提供mRNA前體序列(基因體序列)。NCBI參考提供mRNA序列(cDNA序列)。 *國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information)參考序列資料庫係參考序列(包含基因體、轉錄物及蛋白質)之綜合性、整合、非冗餘、充分注釋集合。其寄存於www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq。表3：各物種中之PD-L1之序列細節。

物種	RNA 類型	長度 (nt)	SEQ ID NO
人類	mRNA前體	20064	1
食蟹猴	mRNA前體GCF ref	20261	2
食蟹猴	mRNA前體，內部	20340	3
小鼠	mRNA前體	20641	4

靶序列本文所用之術語「靶序列」係指存在於靶核酸中之包括與本發明寡核苷酸互補之核鹼基序列的核苷酸序列。在一些實施例中，靶序列係由靶核酸上與本發明寡核苷酸之鄰接核苷酸序列互補之區域組成。在一些實施例中，靶序列長於單一寡核苷酸之互補序列，且可(例如)代表靶核酸中可由若干本發明寡核苷酸靶向之較佳區域。靶序列可為靶核酸之子序列。在一些實施例中，子序列係選自由a1-a149 (參見表4)組成之群之序列。在一些實施例中，子序列係選自由人類PD-L1 mRNA外顯子(例如選自由以下組成之群之PD-L1人類mRNA外顯子：e1、e2、e3、e4、e5、e6及e7 (參見上表1))組成之群之序列。在一些實施例中，子序列係選自由人類PD-L1 mRNA內含子(例如選自由以下組成之PD-L1人類mRNA內含子群：i1、i2、i3、i4、i5及i6 (參見上表1))組成之群之序列。本發明寡核苷酸包括與靶核酸(例如靶核酸之子序列，例如本文所闡述之靶序列)互補或雜交之鄰接核苷酸序列。寡核苷酸包括具有至少8個核苷酸之與存在於靶核酸分子中之靶序列互補或雜交之鄰接核苷酸序列。鄰接核苷酸序列(及由此靶序列)包括至少8個鄰接核苷酸，例如9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個鄰接核苷酸，例如12-25個鄰接核苷酸，例如14-18個鄰接核苷酸。 靶細胞本文所用之術語「靶細胞」係指表現靶核酸之細胞。在一些實施例中，靶細胞可為活體內或活體外靶細胞。在一些實施例中，靶細胞係哺乳動物細胞，例如齧齒類動物細胞(例如小鼠細胞或大鼠細胞)或靈長類動物細胞(例如猴細胞或人類細胞)。在較佳實施例中，靶細胞表現PD-L1 mRNA (例如PD-L1 mRNA前體或PD-L1成熟mRNA)。PD-L1 mRNA之多腺苷酸尾通常忽視反義寡核苷酸靶向。 天然變體術語「天然變體」係指PD-L1基因或轉錄物之如下變體：其與靶核酸源自相同基因座，但可(例如)因產生多種編碼相同胺基酸之密碼子之基因代碼之簡並性或因mRNA前體之替代剪接或存在多型性(例如單一核苷酸多型性)而有所不同，且係指等位基因變體。基於寡核苷酸之充分互補序列之存在，本發明寡核苷酸可由此靶向靶核酸及其天然變體。在一些實施例中，天然變體與哺乳動物PD-L1靶核酸(例如選自由SEQ ID NO 1、2及3組成之群之靶核酸)具有至少95% (例如至少98%或至少99%)之同源性。已知PD-L1基因中之諸多單一核苷酸多型性，例如揭示於下表中者(人類mRNA前體起始/參考序列係SEQ ID NO 2)

變體名稱	變體等位基因	次要等位基因	次要等位基因頻率	SEQ ID NO: 1 上之起點
rs73397192	G/A	A	0.10	2591
rs12342381	A/G	G	0.12	308
rs16923173	G/A	A	0.13	14760
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rs2890657	G/C	C	0.21	2058
rs3780395	A/G	A	0.21	14050
rs147367592	AG/-	-	0.21	13425
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rs7028894	G/A	G	0.36	10408
rs4742097	C/T	C	0.37	5130
rs1536926	G/T	G	0.37	13486
rs1411262	C/T	T	0.39	8917
rs7041009	G/A	A	0.45	12741

表現調節本文所用之術語「表現調節」欲理解為關於寡核苷酸改變PD-L1量(與投與寡核苷酸之前之PD-L1量相比)之能力之概括性術語。或者，可藉由參照對照實驗來測定表現調節。通常應理解，對照係使用鹽水組合物治療或處理之個體或靶細胞或使用非靶寡核苷酸(模擬)治療或處理之個體或靶細胞。然而，亦可標準護理治療個體。一類調節係寡核苷酸能夠(例如)藉由降解mRNA或阻斷轉錄來抑制、下調、降低、阻抑、去除、停止、阻斷、預防、減弱、減小、避免或終止PD-L1表現。另一類調節係寡核苷酸能夠(例如)藉由修復剪接位點或防止剪接或去除或阻斷抑制機制(例如微RNA阻遏)來恢復、增加或增強PD-L1表現。 高親和力修飾性核苷高親和力修飾性核苷係在納入寡核苷酸中時會增強寡核苷酸對其互補靶之親和力(例如如藉由熔融溫度(T ^m)所量測)之經修飾核苷酸。本發明之高親和力修飾性核苷較佳地使得每一經修飾核苷之熔融溫度增加+0.5℃至+12℃、更佳地+1.5℃至10℃及最佳地+3℃至+8℃。業內已知諸多高親和力修飾性核苷且包含(例如)許多2’取代核苷以及鎖核酸(LNA) (例如參見Freier & Altmann；Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443及Uhlmann；Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213)。 糖修飾本發明寡聚物可包括一或多個具有經修飾糖部分(亦即與DNA及RNA中所發現之核糖糖部分相比之糖部分修飾)之核苷。已製備諸多具有核糖糖部分修飾之核苷，其目的主要在於改良寡核苷酸之某些性質(例如親和力及/或核酸酶抗性)。該等修飾包含核糖環結構(例如)藉由使用以下結構進行代替來修飾者：己糖環(HNA)；或通常在核糖環上之C2碳與C4碳之間具有雙自由基橋之雙環(LNA)；或通常在C2碳與C3碳之間缺乏鍵之未連接核糖環(例如UNA)。其他糖修飾性核苷包含(例如)雙環己糖核酸(WO2011/017521)或三環核酸(WO2013/154798)。經修飾核苷亦包含糖部分經非糖部分代替之核苷，例如在肽核酸(PNA)或嗎啉基核酸之情形下。糖修飾亦包含經由將核糖環上之取代基改變成除氫或DNA及RNA核苷中天然發現之2’-OH基團外之基團而進行之修飾。可(例如)在2’、3’、4’或5’位置引入取代基。具有經修飾糖部分之核苷亦包含2’修飾核苷，例如2’取代核苷。實際上，高度關注研發2’取代核苷，且已發現諸多2’取代核苷在納入寡核苷酸中時具有有益性質(例如增強之核苷抗性及增強之親和力)。 2’ 修飾核苷 .2’糖修飾性核苷係在2’位具有除H或-OH外之取代基(2’取代核苷)或包括2’連接雙自由基之核苷，且包含2’取代核苷及LNA (2’ - 4’雙自由基橋接)核苷。舉例而言，2’修飾糖可向寡核苷酸提供增強之結合親和力及/或增加之核酸酶抗性。2’取代修飾性核苷之實例係2’-O-烷基-RNA、2’-O-甲基-RNA、2’-烷氧基-RNA、2’-O-甲氧基乙基-RNA (MOE)、2’-胺基-DNA、2’-氟-RNA及2’-F-ANA核苷。關於其他實例，請參見(例如) Freier & Altmann；Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443及Uhlmann；Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213及Deleavey及Damha, Chemistry and Biology 2012, 19, 937。下文闡釋一些2’取代修飾性核苷。 鎖核酸核苷 (LNA)。 LNA核苷係在核苷酸之核糖糖環之C2’與C4’之間包括連接體基團(稱為雙基或橋)之經修飾核苷。該等核苷在文獻中亦稱為橋接核酸或雙環核酸(BNA)。在一些實施例中，本發明寡聚物之經修飾核苷或LNA核苷具有式I或II之一般結構：或式I 式II 其中W係選自-O-、-S-、-N(R ^a)-、-C(R ^aR ^b)-，例如在一些實施例中係-O-； B指定核鹼基或經修飾核鹼基部分； Z指定至毗鄰核苷之核苷間鏈接或5'-末端基團； Z*指定至毗鄰核苷之核苷間鏈接或3'-末端基團； X指定選自由以下組成之列表之基團：-C(R ^aR ^b)-、-C(R ^a)=C(R ^b)-、-C(R ^a)=N-、-O-、-Si(R ^a) ₂-、-S-、-SO ₂-、-N(R ^a)-及＞C=Z 在一些實施例中，X係選自由以下組成之群：-O-、-S-、NH-、NR ^aR ^b、-CH ₂-、CR ^aR ^b、-C(=CH ₂)-及-C(=CR ^aR ^b)- 在一些實施例中，X係-O-。 Y指定選自由以下組成之群之基團：-C(R ^aR ^b)-、-C(R ^a)=C(R ^b)-、-C(R ^a)=N-、-O-、-Si(R ^a) ₂-、-S-、-SO ₂-、-N(R ^a)-及＞C=Z 在一些實施例中，Y係選自由以下組成之群：-CH ₂-、-C(R ^aR ^b)-、-CH ₂CH ₂-、-C(R ^aR ^b)-C(R ^aR ^b)-、-CH ₂CH ₂CH ₂-、-C(R ^aR ^b)C(R ^aR ^b)C(R ^aR ^b)-、-C(R ^a)=C(R ^b)-及-C(R ^a)=N- 在一些實施例中，Y係選自由以下組成之群：-CH ₂-、-CHR ^a-、-CHCH ₃-、CR ^aR ^b- 或-X-Y-一起指定二價連接體基團(亦稱為自由基)，一起指定由1、2、3或4個選自由以下組成之群之基團/原子組成之二價連接體基團：-C(R ^aR ^b)-、-C(R ^a)=C(R ^b)-、-C(R ^a)=N-、-O-、-Si(R ^a) ₂-、-S-、-SO ₂-、-N(R ^a)-及＞C=Z，在一些實施例中，-X-Y-指定選自由以下組成之群之雙自由基：-X-CH ₂-、-X-CR ^aR ^b-、-X-CHR ^a-、-X-C(HCH ₃) ^-、-O-Y-、-O-CH ₂-、-S-CH ₂-、-NH-CH ₂-、-O-CHCH ₃-、-CH ₂-O-CH ₂、-O-CH(CH ₃CH ₃)-、-O-CH ₂-CH ₂-、OCH ₂-CH ₂-CH ₂-、-O-CH ₂OCH ₂-、-O-NCH ₂-、-C(=CH ₂)-CH ₂-、-NR ^a-CH ₂-、N-O-CH ₂、-S-CR ^aR ^b-及-S-CHR ^a-。在一些實施例中，-X-Y-指定-O-CH ₂-或-O-CH(CH ₃)-。其中Z係選自-O-、-S-及-N(R ^a)-，且R ^a及(在存在時) R ^b各自獨立地係選自氫、視情況經取代之C _1-6-烷基、視情況經取代之C _2-6-烯基、視情況經取代之C _2-6-炔基、羥基、視情況經取代之C _1-6-烷氧基、C _2-6-烷氧基烷基、C _2-6-烯基氧基、羧基、C _1-6-烷氧基羰基、C _1-6-烷基羰基、甲醯基、芳基、芳基氧基-羰基、芳基氧基、芳基羰基、雜芳基、雜芳基氧基-羰基、雜芳基氧基、雜芳基羰基、胺基、單-及二(C _1-6-烷基)胺基、胺甲醯基、單-及二(C _1-6-烷基)-胺基-羰基、胺基-C _1-6-烷基-胺基羰基、單-及二(C _1-6-烷基)胺基-C _1-6-烷基-胺基羰基、C _1-6-烷基-羰基胺基、脲基、C _1-6-烷醯基氧基、磺醯基、C _1-6-烷基磺醯基氧基、硝基、疊氮基、硫烷基、C _1-6-硫烷基、鹵素，其中芳基及雜芳基可視情況經取代且其中兩個孿位取代基R ^a及R ^b一起可指定視情況經取代之亞甲基(=CH ₂)，其中對於所有對掌性中心而言，不對稱基團可以 R或 S定向發現。其中R ¹、R ²、R ³、R ⁵及R ^5*獨立地選自由以下組成之群：氫、視情況經取代之C _1-6-烷基、視情況經取代之C _2-6-烯基、視情況經取代之C _2-6-炔基、羥基、C _1-6-烷氧基、C _2-6-烷氧基烷基、C _2-6-烯基氧基、羧基、C _1-6-烷氧基羰基、C _1-6-烷基羰基、甲醯基、芳基、芳基氧基-羰基、芳基氧基、芳基羰基、雜芳基、雜芳基氧基-羰基、雜芳基氧基、雜芳基羰基、胺基、單-及二(C _1-6-烷基)胺基、胺甲醯基、單-及二(C _1-6-烷基)-胺基-羰基、胺基-C _1-6-烷基-胺基羰基、單-及二(C _1-6-烷基)胺基-C _1-6-烷基-胺基羰基、C _1-6-烷基-羰基胺基、脲基、C _1-6-烷醯基氧基、磺醯基、C _1-6-烷基磺醯基氧基、硝基、疊氮基、硫烷基、C _1-6-硫烷基、鹵素，其中芳基及雜芳基可視情況經取代，且其中兩個孿位取代基一起可指定側氧基、側硫基、亞胺基或視情況經取代之亞甲基。在一些實施例中，R ¹、R ²、R ³、R ⁵及R ^5*獨立地選自C _1-6烷基(例如甲基)及氫。在一些實施例中，R ¹、R ²、R ³、R ⁵及R ^5*皆係氫。在一些實施例中，R ¹、R ²、R ³皆係氫，且R ⁵及R ^5*中之任一者亦係氫且R ⁵及R ^5*中之另一者不為氫(例如C _1-6烷基，例如甲基)。在一些實施例中，R ^a係氫或甲基。在一些實施例中，在存在時，R ^b係氫或甲基。在一些實施例中，R ^a及R ^b中之一者或兩者係氫。在一些實施例中，R ^a及R ^b中之一者係氫且另一者不為氫。在一些實施例中，R ^a及R ^b中之一者係甲基且另一者係係氫。在一些實施例中，R ^a及R ^b皆係甲基。在一些實施例中，雙自由基-X-Y-係-O-CH ₂-，W係O，且R ¹、R ²、R ³、R ⁵及R ^5*皆係氫。該等LNA核苷揭示於WO99/014226、WO00/66604、WO98/039352及WO2004/046160 (其皆以引用方式併入本文中)中，且包含通常稱為 β-D- 氧基 LNA及 α-L- 氧基 LNA核苷者。在一些實施例中，雙自由基-X-Y-係-S-CH ₂-，W係O，且R ¹、R ²、R ³、R ⁵及R ^5*皆係氫。該等硫代 LNA核苷揭示於WO99/014226及WO2004/046160 (其以引用方式併入本文中)中。在一些實施例中，雙自由基-X-Y-係-NH-CH ₂-，W係O，且R ¹、R ²、R ³、R ⁵及R ^5*皆係氫。該等胺基 LNA核苷揭示於WO99/014226及WO2004/046160 (其以引用方式併入本文中)中。在一些實施例中，雙自由基-X-Y-係-O-CH ₂-CH ₂-或-O-CH ₂-CH ₂- CH ₂-，W係O，且R ¹、R ²、R ³、R ⁵及R ^5*皆係氫。該等LNA核苷揭示於WO00/047599及Morita等人，Bioorganic & Med. Chem. Lett. 12 73-76 (其以引用方式併入本文中)中，且包含通常稱為2’-O-4’C-伸乙基橋接之核酸(ENA)者。在一些實施例中，雙自由基-X-Y-係-O-CH ₂-，W係O，且R ¹、R ²、R ³之全部及R ⁵及R ^5*中之一者係氫，且R ⁵及R ^5*中之另一者不為氫(例如C _1-6烷基，例如甲基)。該等 5’ 取代LNA核苷揭示於WO2007/134181 (其以引用方式併入本文中)中。在一些實施例中，雙自由基-X-Y-係-O-CR ^aR ^b-，其中R ^a及R ^b中之一者或兩者不為氫(例如甲基)，W係O，且R ¹、R ²、R ³之全部及中之一者R ⁵及R ^5*係氫，且R ⁵及R ^5*中之另一者不為氫(例如C _1-6烷基，例如甲基)。該等 雙修飾 LNA 核苷揭示於WO2010/077578 (其以引用方式併入本文中)中。在一些實施例中，雙自由基-X-Y-指定二價連接體基團-O-CH(CH ₂OCH ₃)- (2’O-甲氧基乙基雙環核酸- Seth等人，2010, J. Org. Chem.第75卷(5)第1569-81頁)。在一些實施例中，雙自由基-X-Y-指定二價連接體基團-O-CH(CH ₂CH ₃)- (2’O-乙基雙環核酸- Seth等人，2010, J. Org. Chem.第75卷(5)第1569-81頁)。在一些實施例中，雙自由基-X-Y-係-O-CHR ^a-，W係O，且R ¹、R ²、R ³、R ⁵及R ^5*皆係氫。該等 6’ 取代LNA核苷揭示於WO10036698及WO07090071 (二者皆以引用方式併入本文中)中。在一些實施例中，雙自由基-X-Y-係-O-CH(CH ₂OCH ₃)-，W係O，且R ¹、R ²、R ³、R ⁵及R ^5*皆係氫。該等LNA核苷在業內亦稱為環狀 MOE(cMOE)且揭示於WO07090071中。在一些實施例中，雙自由基-X-Y-指定二價連接體基團-O-CH(CH ₃)-。-呈R-或S-構形。在一些實施例中，雙自由基-X-Y-一起指定二價連接體基團-O-CH ₂-O-CH ₂- (Seth等人，2010, J. Org. Chem)。在一些實施例中，雙自由基-X-Y-係-O-CH(CH ₃)-，W係O，且R ¹、R ²、R ³、R ⁵及R ^5*皆係氫。該等6’甲基LNA核苷在業內亦稱為 cET 核苷，且可為(S)cET或(R)cET立體異構體，如WO07090071 (β-D)及WO2010/036698 (α-L) (二者皆以引用方式併入本文中)中所揭示。在一些實施例中，雙自由基-X-Y-係-O-CR ^aR ^b-，其中R ^a或R ^b皆不為氫，W係O，且R ¹、R ²、R ³、R ⁵及R ^5*皆係氫。在一些實施例中，R ^a及R ^b皆係甲基。該等 6’ 二取代LNA核苷揭示於WO 2009006478 (其以引用方式併入本文中)中。在一些實施例中，雙自由基-X-Y-係-S-CHR ^a-，W係O，且R ¹、R ²、R ³、R ⁵及R ^5*皆係氫。該等 6’ 取代硫代LNA核苷揭示於WO11156202 (其以引用方式併入本文中)中。在一些6’取代硫代LNA實施例中，R ^a係甲基。在一些實施例中，雙自由基-X-Y-係-C(=CH2)-C(R ^aR ^b)- (例如-C(=CH ₂)-CH ₂-或-C(=CH ₂)-CH(CH ₃)-)，W係O，且R ¹、R ²、R ³、R ⁵及R ^5*皆係氫。該等 乙烯基碳LNA核苷揭示於WO08154401及WO09067647 (二者皆以引用方式併入本文中)中。在一些實施例中，雙自由基-X-Y-係-N(-OR ^a)- W係O，且R ¹、R ²、R ³、R ⁵及R ^5*皆係氫。在一些實施例中，R ^a係C _1-6烷基，例如甲基。該等LNA核苷亦稱為N取代LNA且揭示於WO2008/150729 (其以引用方式併入本文中)中。在一些實施例中，雙自由基-X-Y-一起指定二價連接體基團-O-NR ^a-CH ₃- (Seth等人，2010, J. Org. Chem)。在一些實施例中，雙自由基-X-Y-係-N(R ^a)-，W係O，且R ¹、R ²、R ³、R ⁵及R ^5*皆係氫。在一些實施例中，R ^a係C _1-6烷基，例如甲基。在一些實施例中，R ⁵及R ^5*中之一者或兩者係氫且(在取代時)R ⁵及R ^5*中之另一者係C _1-6烷基(例如甲基)。在此一實施例中，R ¹、R ²、R ³可皆係氫，且雙自由基-X-Y-可選自-O-CH2-或-O-C(HCR ^a)- (例如-O-C(HCH3)-)。在一些實施例中，雙自由基係-CR ^aR ^b-O-CR ^aR ^b- (例如CH ₂-O-CH ₂-)，W係O且R ¹、R ²、R ³、R ⁵及R ^5*皆係氫。在一些實施例中，R ^a係C _1-6烷基，例如甲基。該等LNA核苷亦稱為構象限制性核苷酸(CRN)且揭示於WO2013036868 (其以引用方式併入本文中)中。在一些實施例中，雙自由基係-O-CR ^aR ^b-O-CR ^aR ^b- (例如O-CH ₂-O-CH ₂-)，W係O且R ¹、R ²、R ³、R ⁵及R ^5*皆係氫。在一些實施例中，R ^a係C _1-6烷基，例如甲基。該等LNA核苷亦稱為COC核苷酸且揭示於Mitsuoka等人，Nucleic Acids Research 2009 37(4), 1225-1238 (其以引用方式併入本文中)中。應認識到，除非指定，否則LNA核苷可呈β-D或α-L立體異構體形式。 LNA核苷之某些實例呈現於結構圖1中。結構圖1 如實例中所闡釋，在本發明之一些實施例中，寡核苷酸中之LNA核苷係β-D-氧基-LNA核苷。 核酸酶調介之降解核酸酶調介之降解係指在與互補核苷酸序列形成雙螺旋體時能夠調介此一序列之降解之寡核苷酸。在一些實施例中，寡核苷酸可經由靶核酸之核酸酶調介之降解來發揮作用，其中本發明寡核苷酸能夠招募核酸酶、尤其內核酸酶、較佳地內核糖核酸酶(RNase) (例如RNase H)。經由核酸酶調介機制作用之寡核苷酸設計之實例係通常包括至少5或6個DNA核苷之區域且在一側或兩側側接有親和力增強性核苷(例如間隙聚體、頭聚體及尾聚體)的寡核苷酸。 RNase H 活性及招募反義寡核苷酸之RNase H活性係指其在呈與互補RNA分子之雙螺旋體時招募RNase H之能力。WO01/23613提供測定RNaseH活性之活體外方法，該等方法可用於測定招募RNaseH之能力。通常，寡核苷酸在以下情況下可視為能夠招募RNase H：在與互補靶核酸序列一起提供時，其初始速率(如以pmol/l/min形式所量測)為在使用與所測試經修飾寡核苷酸具有相同鹼基序列但僅含有DNA單體且在寡核苷酸中之所有單體間具有硫代磷酸酯鏈接之寡核苷酸且使用由WO01/23613中實例91 - 95 (以引用方式併入本文中)提供之方法時所測定初始速率的至少5% (例如至少10%或大於20%)。 間隙聚體本文所用之術語間隙聚體係指反義寡核苷酸包括招募RNase H之寡核苷酸區域(間隙)，該區域側接(5’及3’)有包括一或多個親和力增強性經修飾核苷之區域(側翼或翼)。本文闡述各種間隙聚體設計且其特徵在於能夠招募RNaseH。頭聚體及尾聚體係缺失一個側翼之能夠招募RNase H之寡核苷酸，亦即僅寡核苷酸之一端包括親和力增強性經修飾核苷。對於頭聚體而言，3’側翼缺失(亦即，5’側翼包括親和力增強性經修飾核苷)，且對於尾聚體而言，5’側翼缺失(亦即，3’側翼包括親和力增強性經修飾核苷)。 LNA 間隙聚體術語LNA間隙聚體係至少一個親和力增強性經修飾核苷係LNA核苷之間隙聚體寡核苷酸。 混合翼間隙聚體術語混合翼間隙聚體或混合側翼間隙聚體係指至少一個側翼區域包括至少一個LNA核苷及至少一個非LNA經修飾核苷(例如至少一個2’取代經修飾核苷，例如2’-O-烷基-RNA、2’-O-甲基-RNA、2’-烷氧基-RNA、2’-O-甲氧基乙基-RNA (MOE)、2’-胺基-DNA、2’-氟-RNA及2’-F-ANA核苷)之LNA間隙聚體。在一些實施例中，混合翼間隙聚體具有一個僅包括LNA核苷(例如5’或3’)之側翼及包括2’取代經修飾核苷及視情況LNA核苷之另一側翼(分別3’或5’)。 間隙中斷體術語「間隙中斷體寡核苷酸」用於係指即使間隙區由非RNaseH招募性核苷(間隙中斷體核苷，E)破壞(從而間隙區包括小於5個連續DNA核苷)亦能夠維持RNAseH招募之間隙聚體。非RNaseH招募性核苷係(例如)呈3’內向構象之核苷，例如核苷之核糖糖環中C2’與C4’之間之橋係呈β構象的LNA，例如β-D-氧基LNA或ScET核苷。間隙中斷體寡核苷酸招募RNaseH之能力通常係序列或甚至化合物特異性-參見Rukov等人，2015 Nucl. Acids Res.第43卷第8476-8487頁，其揭示招募在一些情況下提供靶RNA之更特異性裂解之RNaseH之「間隙中斷體」寡核苷酸。在一些實施例中，本發明寡核苷酸係間隙中斷體寡核苷酸。在一些實施例中，間隙中斷體寡核苷酸包括5’-側翼(F)、間隙(G)3’-側翼(F’)，其中間隙藉由非RNaseH招募核苷(間隙中斷體核苷，E)破壞，從而間隙含有至少3或4個連續DNA核苷。在一些實施例中，間隙中斷體核苷(E)係如下LNA核苷：其中核苷之核糖糖環中C2’與C4’之間之橋係呈β構象且置於間隙區內，從而間隙中斷體LNA核苷側接(5’及3’)有至少3 (5’)及3 (3’)或至少3 (5’)及4 (3’)或至少4(5’)及3(3’)個DNA核苷，且其中寡核苷酸能夠招募RNaseH。間隙中斷體寡核苷酸可由下列各式代表： F-G-E-G-F’；尤其F _1-7-G _3-4-E ₁-G _3-4-F’ _1-7D’-F-G-F’，尤其D’ _1-3-F _1-7-G _3-4-E ₁-G _3-4-F’ _1-7F-G-F’-D’’，尤其F _1-7-G _3-4-E ₁-G _3-4-F’ _1-7-D’’ _1-3D’-F-G-F’-D’’，尤其D’ _1-3-F _1-7-G _3-4-E ₁-G _3-4-F’ _1-7-D’’ _1-3其中區域D’及D’’係如「間隙聚體設計」部分中所闡述。在一些實施例中，間隙中斷體核苷(E)係β-D-氧基LNA或ScET或結構圖1中所展示之另一β-LNA核苷。 偶聯物本文所用之術語偶聯物係指以共價方式連接至非核苷酸部分(偶聯物部分或區域C或第三區域)之寡核苷酸，其亦稱為寡核苷酸偶聯物。本發明寡核苷酸至一或多個非核苷酸部分之偶聯可(例如)藉由影響寡核苷酸之活性、細胞分佈、細胞攝取或穩定性來改良寡核苷酸之藥理學。在一些實施例中，偶聯物部分使寡核苷酸靶向肝。同時，偶聯用於降低寡核苷酸在非靶細胞類型、組織或器官中之活性，例如脫靶活性或非靶細胞類型、組織或器官中之活性。在本發明之一實施例中，本發明之寡核苷酸偶聯物顯示與未偶聯寡核苷酸相比PD-L1在靶細胞中之改良抑制。在另一實施例中，與未偶聯寡核苷酸相比，本發明之寡核苷酸偶聯物在肝與其他器官(例如脾或腎)之間具有改良之細胞分佈(亦即，與脾或腎相比，更多偶聯寡核苷酸去往肝)。在另一實施例中，與未偶聯寡核苷酸相比，本發明之寡核苷酸偶聯物展示偶聯寡核苷酸在肝中之改良之細胞攝取。 WO 93/07883及WO2013/033230提供適宜偶聯物部分，該等專利以引用方式併入本文中。其他適宜偶聯物部分係能夠結合至去唾液酸醣蛋白受體(ASGPr)者。特定而言，三價N-乙醯基半乳糖胺偶聯物部分適於結合至ASGPr，例如參見WO2014/076196、WO2014/207232及WO 2014/179620 (以引用方式併入本文中)。偶聯物部分基本上係反義寡核苷酸偶聯物中並非由核酸構成之部分。寡核苷酸偶聯物及其合成亦報導於以下綜合性綜述中：Manoharan，Antisense Drug Technology, Principles, Strategies, and Applications, S.T. Crooke編輯，第16章，Marcel Dekker, Inc., 2001及Manoharan, Antisense and Nucleic Acid Drug Development, 2002, 12, 103，其中之每一者之全部內容皆以引用方式併入本文中。在一實施例中，非核苷酸部分(偶聯物部分)係選自由以下組成之群：碳水化合物、細胞表面受體配體、藥物物質、激素、親脂性物質、聚合物、蛋白質、肽、毒素(例如細菌毒素)、維他命、病毒蛋白(例如衣殼)或其組合。 連接體鏈接或連接體係兩個原子之間經由一或多個共價鍵連接一個所關注化學基團或區段與另一所關注化學基團或區段之連結。偶聯物部分可直接或經由連接部分(例如連接體或結合體)連接至寡核苷酸。連接體用於以共價方式將第三區域(例如偶聯物部分，區域C)連結至與靶核酸互補之第一區域(例如寡核苷酸或鄰接核苷酸序列，區域A)。在本發明之一些實施例中，本發明之偶聯物或寡核苷酸偶聯物可視情況包括連接體區(第二區域或區域B及/或區域Y)，該區域定位於與靶核酸互補之寡核苷酸或鄰接核苷酸序列(區域A或第一區域)與偶聯物部分(區域C或第三區域)之間。區域B係指包括生理上不穩定鍵或由其組成之生物可裂解連接體，該生理上不穩定鍵可在哺乳動物體內通常所遇到之條件或類似於哺乳動物體內所遇到條件之條件下裂解。生理上不穩定連接體發生化學轉變(例如裂解)之條件包含化學條件，例如pH、溫度、氧化或還原條件或試劑及在哺乳動物細胞中所發現鹽濃度或類似於在哺乳動物細胞中所遇到鹽濃度之鹽濃度。哺乳動物細胞內條件亦包含在哺乳動物細胞中通常存在酶促活性(例如來自蛋白水解酶或水解酶或核酸酶)。在一實施例中，生物可裂解連接體易於發生S1核酸酶裂解。在一較佳實施例中，核酸酶易感連接體包括1至10個含有至少兩個連續磷酸二酯鏈接(例如至少3或4或5個連續磷酸二酯鏈接)之核苷(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷、更佳地2至6個核苷及最佳地2至4個經連接核苷)。較佳地，核苷係DNA或RNA。含有磷酸二酯之生物可裂解連接體更詳細闡述於WO 2014/076195 (以引用方式併入本文中)中。區域Y係指未必生物可裂解但主要用於以共價方式連結偶聯物部分(區域C或第三區域)與與靶核酸互補之寡核苷酸或鄰接核苷酸序列(區域A或第一區域)之連接體。區域Y連接體可包括諸如乙二醇、胺基酸單元或胺基烷基等重複單元之鏈結構或寡聚物。本發明之寡核苷酸偶聯物可由下列區域要素構成：A-C、A-B-C、A-B-Y-C、A-Y-B-C或A-Y-C。在一些實施例中，連接體(區域Y)係胺基烷基，例如C2 - C36胺基烷基，包含(例如) C6 - C12胺基烷基。在一較佳實施例中，連接體(區域Y)係C6胺基烷基。治療本文所用之術語「治療」係指治療現有疾病(例如如本文所提及之疾病或病症)或預防疾病(亦即預防性)。因此應認識到，如本文所提及之治療可在一些實施例中為預防性。針對病原體之免疫反應之恢復將免疫反應分成先天性免疫反應及適應性免疫反應。先天性免疫系統提供立即但非特異性之反應。適應性免疫反應係藉由先天性免疫反應活化且對特定病原體具有高度特異性。在將病原體源抗原呈遞於抗原呈遞細胞表面上時，適應性免疫反應之免疫細胞(亦即T及B淋巴球)經由其抗原特異性受體發生活化，從而產生病原性特異性免疫反應且產生免疫記憶。慢性病毒感染(例如HBV及HCV)與特徵在於病毒特異性T細胞之無反應性之T細胞耗竭有關。已充分研究T細胞耗竭，其綜述可參見(例如) Yi等人，2010 Immunology129, 474-481。慢性病毒感染亦與作為先天性免疫細胞之NK細胞之降低功能有關。增強病毒免疫反應對於慢性感染之清除較為重要。可藉由量測增殖、細胞介素分泌及細胞溶解功能來評價由T細胞及NK細胞調介之針對病原體之免疫反應之恢復(Dolina等人，2013 Molecular Therapy-Nucleic Acids, 2 e72及本文中之實例6)。本發明的詳細敘述本發明係關於反義寡核苷酸及其偶聯物及包括該等物質之醫藥組合物用以恢復針對感染動物、尤其人類之病原體之免疫反應的用途。本發明之反義寡核苷酸偶聯物尤其可用於抵抗感染肝之病原體、尤其慢性肝感染(例如HBV)。該等偶聯物容許靶向分佈寡核苷酸且防止靶核酸之全身性敲低。 本發明寡核苷酸本發明係關於能夠調節PD-L1表現之寡核苷酸。可藉由雜交至編碼PD-L1或涉及PD-L1調控之靶核酸來達成該調節。靶核酸可為哺乳動物PD-L1序列，例如選自由SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2及/或SEQ ID NO: 3組成之群之序列。靶核酸可為mRNA前體、mRNA或任一自支持PD-L1之表現或調控之哺乳動物細胞表現之RNA序列。本發明寡核苷酸係靶向PD-L1之反義寡核苷酸。在本發明之一態樣中，本發明寡核苷酸偶聯至偶聯物部分、尤其靶向去唾液酸醣蛋白受體之偶聯物部分。在一些實施例中，本發明之反義寡核苷酸能夠藉由抑制或下調靶來調節靶表現。較佳地，該調節使得與正常靶表現程度相比抑制至少20%之表現，更佳地與正常靶表現程度相比抑制至少30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%。較佳地，該調節使得與在藉由傳染原攻擊細胞或有機體或使用模擬傳染原攻擊之試劑(例如聚I:C或LPS)處理細胞或有機體時之表現程度相比抑制至少20%之表現，更佳地與在藉由傳染原攻擊細胞或有機體或使用模擬傳染原攻擊之試劑(例如聚I:C或LPS)處理細胞或有機體時之表現程度相比抑制至少30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%。在一些實施例中，在活體外使用KARPAS-299或THP1細胞，本發明寡核苷酸可能夠抑制PD-L1 mRNA之表現程度至少60%或70%。在一些實施例中，在活體外使用KARPAS-299或THP1細胞，本發明化合物可能夠抑制PD-L1蛋白之表現程度至少50%。適宜地，實例提供可用於量測PD-L1 RNA之分析(例如實例1)。藉由寡核苷酸之鄰接核苷酸序列與靶核酸之間之雜交來觸發靶調節。在一些實施例中，本發明寡核苷酸在寡核苷酸與靶核酸之間包括失配。儘管具有失配，但雜交至靶核酸仍可足以展示PD-L1表現之期望調節。源自失配之降低之結合親和力可有利地藉由寡核苷酸中增加數量之核苷酸及/或寡核苷酸序列內所存在增加數量之能夠增加靶結合親和力的經修飾核苷(例如2’修飾核苷，包含LNA)來予以補償。在一些實施例中，本發明之反義寡核苷酸能夠恢復病原體特異性T細胞。在一些實施例中，在與未處理對照或使用標準護理處理之對照相比時，本發明寡核苷酸能夠增加病原體特異性T細胞至少40%、50%、60%或70%。在一實施例中，在與未處理對照或使用標準護理處理之對照相比時，本發明之反義寡核苷酸或偶聯物能夠增加HBV特異性T細胞。適宜地，實例提供可用於量測HBV特異性T細胞之分析(例如T細胞增殖、細胞介素分泌及細胞溶解活性)。在另一實施例中，在與未處理對照或使用標準護理處理之對照相比時，本發明之反義寡核苷酸或偶聯物能夠增加HCV特異性T細胞。在另一實施例中，在與未處理對照或使用標準護理處理之對照相比時，本發明之反義寡核苷酸或偶聯物能夠增加HDV特異性T細胞。在一些實施例中，本發明之反義寡核苷酸能夠降低動物或人類中之HBsAg含量。在一些實施例中，在與治療之前之含量相比時，本發明寡核苷酸能夠降低HBsAg含量至少40%、50%、60%或70%、更佳地至少80%、90%或95%。最佳地，本發明寡核苷酸能夠達成HBsAg在感染HBV之動物或人類中之血清轉化。本發明之一態樣係關於包括與PD-L1靶核酸具有至少90%互補性之長度為10至30個核苷酸之鄰接核苷酸序列之反義寡核苷酸。在一些實施例中，寡核苷酸包括與靶核酸區域至少90%互補、例如至少91%、例如至少92%、例如至少93%、例如至少94%、例如至少95%、例如至少96%、例如至少97%、例如至少98%或100%互補之鄰接序列。在一較佳實施例中，本發明寡核苷酸或其鄰接核苷酸序列與靶核酸區域完全互補(100%互補)，或在一些實施例中可在寡核苷酸與靶核酸之間包括一或兩個失配。在一些實施例中，寡核苷酸包括與存在於SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2中之靶核酸區域至少90%互補(例如完全(或100%)互補)之長度為10至30個核苷酸之鄰接核苷酸序列。在一些實施例中，寡核苷酸序列與存在於 SEQ ID NO: 1及SEQ ID NO: 2中之相應靶核酸區域100%互補。在一些實施例中，寡核苷酸序列與存在於SEQ ID NO: 1及SEQ ID NO: 3於中之相應靶核酸區域100%互補。在一些實施例中，寡核苷酸或寡核苷酸偶聯物包括與相應靶核酸區域至少90%互補(例如100%互補)之長度為10至30個核苷酸之鄰接核苷酸序列，其中該鄰接核苷酸序列與選自由SEQ ID NO: 1上之位置371-3068、5467-12107及15317-19511組成之群之靶核酸的子序列互補。在另一實施例中，靶核酸之子序列係選自由以下組成之群：SEQ ID NO: 1上之位置371-510、822-1090、1992-3068、5467-5606、6470-12107、15317-15720、15317-18083、18881-19494及1881-19494。在一較佳實施例中，靶核酸之子序列係選自由以下組成之群：SEQ ID NO: 1上之位置7300-7333、8028-8072、9812-9859、11787-11873及15690-15735。在一些實施例中，寡核苷酸或寡核苷酸偶聯物包括與存在於SEQ ID NO: 1中之相應靶核酸區域至少90%互補(例如100%互補)之長度為10至30個核苷酸之鄰接核苷酸序列，其中該靶核酸區域係選自由表4中之區域a1至a449組成之群。表4：可使用本發明寡核苷酸靶向之SEQ ID NO 1之區域

Reg. a	SEQ ID NO 1 中之位置	長度	Reg.a	SEQ ID NO 1 中之位置	長度	Reg.a	SEQ ID NO 1 中之位置	長度
起點	終點	起點	終點	起點	終點
a1	51	82	32	a151	6994	7020	27	a301	13092	13115	24
a2	87	116	30	a152	7033	7048	16	a302	13117	13134	18
a3	118	133	16	a153	7050	7066	17	a303	13136	13169	34
a4	173	206	34	a154	7078	7094	17	a304	13229	13249	21
a5	221	287	67	a155	7106	7122	17	a305	13295	13328	34
a6	304	350	47	a156	7123	7144	22	a306	13330	13372	43
a7	354	387	34	a157	7146	7166	21	a307	13388	13406	19
a8	389	423	35	a158	7173	7193	21	a308	13408	13426	19
a9	425	440	16	a159	7233	7291	59	a309	13437	13453	17
a10	452	468	17	a160	7300	7333	34	a310	13455	13471	17
a11	470	484	15	a161	7336	7351	16	a311	13518	13547	30
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a13	503	529	27	a163	7375	7412	38	a313	13603	13620	18
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a149	6906	6954	49	a299	13018	13051	34	a449	19968	20026	59
a150	6969	6992	24	a300	13070	13090	21

在一些實施例中，寡核苷酸或鄰接核苷酸序列與靶核酸區域互補，其中靶核酸區域係選自由以下組成之群：a7、a26、a43、a119、a142、a159、a160、a163、a169、a178、a179、a180、a189、a201、a202、a204、a214、a221、a224、a226、a243、a254、a258、269、a274、a350、a360、a364、a365、a370、a372、a381、a383、a386、a389、a400、a427、a435及a438。在一較佳實施例中，寡核苷酸或鄰接核苷酸序列與靶核酸區域互補，其中靶核酸區域係選自由以下組成之群：a160、a180、a221、a269及a360。在一些實施例中，本發明寡核苷酸包括8至35個核苷酸(長度)或由其組成，例如長9至30、例如10至22、例如11至20、例如12至18、例如13至17或14至16個鄰接核苷酸。在一較佳實施例中，寡核苷酸包括16至20個核苷酸(長度)或由其組成。應理解，本文所給出之任一範圍皆包含範圍端點。因此，若提及寡核苷酸包含10至30個核苷酸，則包含10及30個核苷酸。在一些實施例中，鄰接核苷酸序列包括8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個鄰接核苷酸(長度)或由其組成。在一較佳實施例中，寡核苷酸包括16、17、18、19或20個核苷酸(長度)或由其組成。在一些實施例中，寡核苷酸或鄰接核苷酸序列包括選自由表5中所列示序列組成之群之序列或由其組成。在一些實施例中，反義寡核苷酸或鄰接核苷酸序列包括10至30個與選自由SEQ ID NO: 5至743 (參見表5中所列示之基序序列)組成之群之序列具有至少90%一致性、較佳地100%一致性之核苷酸(長度)或由其組成。在一些實施例中，反義寡核苷酸或鄰接核苷酸序列包括10至30個與選自由SEQ ID NO: 5至743及771組成之群之序列具有至少90%一致性、較佳地100%一致性之核苷酸(長度)或由其組成。在一些實施例中，反義寡核苷酸或鄰接核苷酸序列包括10至30個與選自由以下組成之群之序列具有至少90%一致性、較佳地100%一致性之核苷酸(長度)或由其組成：SEQ ID NO: 6、8、9、13、41、42、58、77、92、111、128、151、164、166、169、171、222、233、245、246、250、251、252、256、272、273、287、292、303、314、318、320、324、336、342、343、344、345、346、349、359、360、374、408、409、415、417、424、429、430、458、464、466、474、490、493、512、519、519、529、533、534、547、566、567、578、582、601、619、620、636、637、638、640、645、650、651、652、653、658、659、660、665、678、679、680、682、683、684、687、694、706、716、728、733、734及735。在一些實施例中，反義寡核苷酸或鄰接核苷酸序列包括10至30個與SEQ ID NO: 287具有至少90%一致性、較佳地100%一致性之核苷酸(長度)或由其組成。在一些實施例中，反義寡核苷酸或鄰接核苷酸序列包括10至30個與SEQ ID NO: 342具有至少90%一致性、較佳地100%一致性之核苷酸(長度)或由其組成。在一些實施例中，反義寡核苷酸或鄰接核苷酸序列包括10至30個與SEQ ID NO: 640具有至少90%一致性、較佳地100%一致性之核苷酸(長度)或由其組成。在一些實施例中，反義寡核苷酸或鄰接核苷酸序列包括10至30個與SEQ ID NO: 466具有至少90%一致性、較佳地100%一致性之核苷酸(長度)或由其組成。在一些實施例中，反義寡核苷酸或鄰接核苷酸序列包括10至30個與SEQ ID NO: 566具有至少90%一致性、較佳地100%一致性之核苷酸(長度)或由其組成。在寡核苷酸長於鄰接核苷酸序列(其與靶核酸互補)之實施例中，表5中之基序序列形成本發明之反義寡核苷酸之鄰接核苷酸序列部分。在一些實施例中，寡核苷酸之序列等效於鄰接核苷酸序列(舉例而言，若不添加生物可裂解連接體)。應理解，鄰接核鹼基序列(基序序列)可經修飾以(例如)增加核酸酶抗性及/或對靶核酸之結合親和力。修飾闡述於定義及「寡核苷酸設計」部分中。表5列列示每一基序序列之較佳設計。寡核苷酸設計寡核苷酸設計係指寡核苷酸序列中之核苷糖修飾模式。本發明寡核苷酸包括糖修飾性核苷且亦可包括DNA或RNA核苷。在一些實施例中，寡核苷酸包括糖修飾性核苷及DNA核苷。將經修飾核苷納入本發明寡核苷酸中可增強寡核苷酸對靶核酸之親和力。在該情形下，經修飾核苷可稱為親和力增強性經修飾核苷酸，經修飾核苷亦可稱為單元。在一實施例中，寡核苷酸包括至少1個經修飾核苷，例如至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15或至少16個經修飾核苷。在一實施例中，寡核苷酸包括1至10個經修飾核苷，例如2至8個修飾核苷，例如3至7個經修飾核苷，例如4至6個經修飾核苷，例如3、4、5、6或7個經修飾核苷。在一實施例中，寡核苷酸包括一或多個糖修飾性核苷，例如2’糖修飾性核苷。較佳地，本發明寡核苷酸包括一或多個獨立地選自由以下組成之群之2’糖修飾性核苷：2’-O-烷基-RNA、2’-O-甲基-RNA、2’-烷氧基-RNA、2’-O-甲氧基乙基-RNA、2’-胺基-DNA、2’-氟-DNA、阿拉伯糖核酸(ANA)、2’-氟-ANA及LNA核苷。甚至更佳地，一或多個經修飾核苷係鎖核酸(LNA)。在另一實施例中，寡核苷酸包括至少一個經修飾核苷間鏈接。在一較佳實施例中，鄰接核苷酸序列內之所有核苷間鏈接係硫代磷酸酯或硼烷磷酸酯核苷間鏈接。在一些實施例中，寡核苷酸之鄰接序列中之所有核苷酸間鏈接係硫代磷酸酯鏈接。在一些實施例中，本發明寡核苷酸包括至少一個LNA核苷，例如1、2、3、4、5、6、7或8個LNA核苷，例如2至6個LNA核苷，例如3至7個LNA核苷，4至6個LNA核苷或3、4、5、6或7個LNA核苷。在一些實施例中，寡核苷酸中之至少75%之經修飾核苷係LNA核苷，舉例而言，80%、例如85%、例如90%之經修飾核苷係LNA核苷。在另一實施例中，寡核苷酸中之所有經修飾核苷皆係LNA核苷。在另一實施例中，寡核苷酸可包括β-D-氧基-LNA及下列LNA核苷中之一或多者：硫代-LNA、胺基-LNA、氧基-LNA及/或ENA (呈β-D或α-L構形或其組合)。在另一實施例中，所有LNA胞嘧啶單元皆係5-甲基-胞嘧啶。在一較佳實施例中，寡核苷酸或鄰接核苷酸序列在核苷酸序列之5’端具有至少1個LNA核苷且在3’端具有至少2個LNA核苷。在一些實施例中，本發明寡核苷酸包括至少一個係2’-MOE-RNA核苷之經修飾核苷，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10個2’-MOE-RNA核苷。在一些實施例中，該等經修飾核苷中之至少一者係2’-氟DNA，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10個2’-氟-DNA核苷。在一些實施例中，本發明寡核苷酸包括至少一個LNA核苷及至少一個2’取代經修飾核苷。在本發明之一些實施例中，寡核苷酸包括2’糖修飾性核苷及DNA單元。較佳地，寡核苷酸包括LNA及DNA核苷(單元)。較佳地，LNA及DNA單元之組合總數為8-30 (例如10 - 25、較佳地12-22、例如12 - 18、甚至更佳地11-16)。在本發明之一些實施例中，寡核苷酸之核苷酸序列(例如鄰接核苷酸序列)係由至少一個或兩個LNA核苷組成且剩餘核苷係DNA單元。在一些實施例中，寡核苷酸僅包括LNA核苷及天然核苷(例如RNA或DNA、最佳地DNA核苷)，且視情況包括經修飾核苷間鏈接(例如硫代磷酸酯)。在本發明之一實施例中，本發明寡核苷酸能夠招募RNase H。本發明寡核苷酸之結構設計可選自間隙聚體、間隙中斷體、頭聚體及尾聚體。間隙聚體設計在一較佳實施例中，本發明寡核苷酸具有間隙聚體設計或結構，該間隙聚體設計或結構在本文中亦僅稱為「間隙聚體」。在間隙聚體結構中，寡核苷酸包括至少三個不同結構區域：5’-側翼、間隙及3’-側翼(F-G-F’，以「5 -＞ 3」定向)。在此設計中，在寡核苷酸與靶核酸呈雙螺旋體形式時，側接區F及F’(亦稱為翼區)包括與PD-L1靶核酸互補之經修飾核苷之鄰接序列段，而間隙區G包括能夠招募核酸酶、較佳地內核酸酶(例如RNase，例如RNase H)之核苷酸之鄰接序列段。能夠招募核酸酶、尤其RNase H之核苷可選自由以下組成之群：DNA、α-L-氧基-LNA、2’-氟-ANA及UNA。側接區G之5’及3’端之區域F及F’較佳地包括非核酸酶招募性核苷(具有3’內向結構之核苷)、更佳地一或多個親和力增強性經修飾核苷。在一些實施例中，3’側翼包括至少一個LNA核苷、較佳地至少2個LNA核苷。在一些實施例中，5’側翼包括至少一個LNA核苷。在一些實施例中，5’及3’側接區包括LNA核苷。在一些實施例中，側接區中之所有核苷皆係LNA核苷。在其他實施例中，側接區可包括LNA核苷及其他核苷(混合側翼)，例如DNA核苷及/或非LNA經修飾核苷(例如2’取代核苷)。在此情形下，間隙定義為在5’及3’端側接有由親和力增強性經修飾核苷、較佳地LNA (例如β-D-氧基-LNA)之至少5個RNase H招募性核苷(具有2’內向結構之核苷，較佳係DNA)之鄰接序列。因此，毗鄰間隙區之5’側接區及3’側接區之核苷係經修飾核苷，較佳係非核酸酶招募性核苷。區域F 連接至區域G之‘5端之區域F(5’側翼或5’翼)包括、含有至少一個經修飾核苷(例如至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7個經修飾核苷)或由其組成。在一實施例中，區域F包括1至7個經修飾核苷(例如2至6個經修飾核苷、例如2至5個經修飾核苷、例如2至4個經修飾核苷、例如1至3個經修飾核苷、例如1、2、3或4個經修飾核苷)或由其組成。F區域定義為在該區域之5’端及3’端具有至少一個經修飾核苷。在一些實施例中，區域F中之經修飾核苷具有3’內向結構。在一實施例中，區域F中之一或多個經修飾核苷係2’修飾核苷。在一實施例中，區域F中之所有核苷皆係2’修飾核苷。在另一實施例中，除2’修飾核苷外，區域F亦包括DNA及/或RNA。包括DNA及/或RNA之側翼之特徵在於在F區域之5’端及3’端(毗鄰G區域)具有2’修飾核苷。在一實施例中，區域F包括DNA核苷，例如1至3個鄰接DNA核苷，例如1至3個或1至2個鄰接DNA核苷。側翼中之DNA核苷應較佳地不能招募RNase H。在一些實施例中，F區域中之2’修飾核苷及DNA及/或RNA核苷與1至3個2’修飾核苷及1至3個DNA及/或RNA核苷交替。該等側翼亦可稱為交替側翼。具有交替側翼之寡核苷酸中之5’側翼(區域F)之長度可為4至10個核苷，例如4至8個、例如4至6個核苷，例如4、5、6或7個經修飾核苷。在一些實施例中，僅寡核苷酸之5’側翼係交替性。具有交替核苷之區域F之具體實例如下： 2’ _1-3-N’ _1-4-2’ _1-32’ _1-2-N’ _1-2-2’ _1-2-N’ _1-2-2’ _1-2其中2’指示經修飾核苷且N’係RNA或DNA。在一些實施例中，交替側翼中之所有經修飾核苷皆係LNA且N’係DNA。在另一實施例中，區域F中之一或多個2’修飾核苷係選自2’-O-烷基-RNA單元、2’-O-甲基-RNA、2’-胺基-DNA單元、2’-氟-DNA單元、2’-烷氧基-RNA、MOE單元、LNA單元、阿拉伯糖核酸(ANA)單元及2’-氟-ANA單元。在一些實施例中，F區域包括LNA及2’取代經修飾核苷。該等形式通常稱為混合翼或混合側翼寡核苷酸。在本發明之一實施例中，區域F中之所有經修飾核苷皆係LNA核苷。在另一實施例中，區域F中之所有核苷皆係LNA核苷。在另一實施例中，區域F中之LNA核苷獨立地選自由以下組成之群：氧基-LNA、硫代-LNA、胺基-LNA、cET及/或ENA (呈β-D或α-L構形或其組合)。在一較佳實施例中，區域F在鄰接序列之5’端至少包括1β-D-氧基LNA單元。區域G 區域G(間隙區)較佳地包括、含有至少4個(例如至少5、例如至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15或至少16個)能夠招募上文所提及之核酸酶、尤其RNaseH之連續核苷或由其組成。在另一實施例中，區域G包括、含有5至12或6至10或7至9、例如8個能夠招募上文所提及之核酸酶之連續核苷酸單元或由其組成。區域G中能夠招募核酸酶之核苷單元在一實施例中係選自由以下組成之群：DNA、α-L-LNA、C4’烷基化DNA (如PCT/EP2009/050349及Vester等人，Bioorg. Med. Chem. Lett. 18 (2008) 2296 - 2300 (二者皆以引用方式併入本文中)中所闡述)、阿拉伯糖源核苷(例如ANA及2'F-ANA) (Mangos等人，2003 J. AM. CHEM. SOC. 125, 654-661)、UNA (非鎖定核酸) (如Fluiter等人，Mol. Biosyst., 2009, 10, 1039中所闡述，該文獻以引用方式併入本文中)。UNA係非鎖定核酸，通常其中去除核糖之C2與C3之間之鍵，從而形成非鎖定「糖」殘基。在另一實施例中，區域G中之至少一個核苷單元係DNA核苷單元，例如1至18個DNA單元、例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17個DNA單元、較佳地2至17個DNA單元、例如3至16個DNA單元、例如4至15個DNA單元、例如5至14個DNA單元、例如6至13個DNA單元、例如7至12個DNA單元、例如8至11個DNA單元、更佳地8至17個DNA單元或9至16個DNA單元、10至15個DNA單元或11至13個DNA單元、例如8、9、10、11、12、13、14、15、16、17個DNA單元。在一些實施例中，區域G係由100%之DNA單元組成。在其他實施例中，區域G可由DNA及其他能夠介導RNase H裂解之核苷之混合物組成。區域G可由至少50% DNA、更佳地60%、70%或80% DNA及甚至更佳地90%或95% DNA組成。在另一實施例中，區域G中之至少一個核苷單元係α-L-LNA核苷單元，例如至少一個α-L-LNA、例如2、3、4、5、6、7、8或9個α-L-LNA。在另一實施例中，區域G包括至少一個係α-L-氧基-LNA之α-L-LNA。在另一實施例中，區域G包括DNA及α-L-LNA核苷單元之組合。在一些實施例中，區域G中之核苷具有2’內向結構。在一些實施例中，區域G可包括間隙中斷體核苷，從而產生間隙中斷體寡核苷酸，其能夠招募RNase H。區域F’ 連接至區域G之‘3端之區域F’(3’側翼或3’翼)包括、含有至少一個經修飾核苷(例如至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7個經修飾核苷)或由其組成。在一實施例中，區域F’包括1至7個經修飾核苷(例如2至6個經修飾核苷，例如2至4個經修飾核苷，例如1至3個經修飾核苷，例如1、2、3或4個經修飾核苷)或由其組成。F’區域定義為在該區域之5’端及3’端具有至少一個經修飾核苷。在一些實施例中，區域F’中之經修飾核苷具有3’內向結構。在一實施例中，區域F’中之一或多個經修飾核苷係2’修飾核苷。在一實施例中，區域F’中之所有核苷皆係2’修飾核苷。在一實施例中，區域F’中之一或多個經修飾核苷係2’修飾核苷。在一實施例中，區域F’中之所有核苷皆係2’修飾核苷。在另一實施例中，除2’修飾核苷外，區域F’亦包括DNA或RNA。包括DNA或RNA之側翼之特徵在於在F’區域之5’端(毗鄰G區域)及3’端具有2’修飾核苷。在一實施例中，區域F’包括DNA核苷，例如1至4個鄰接DNA核苷、例如1至3或1至2個鄰接DNA核苷。側翼中之DNA核苷應較佳地不能招募RNase H。在一些實施例中，F’區域中之2’修飾核苷及DNA及/或RNA核苷與1至3個2’修飾核苷及1至3個DNA及/或RNA核苷交替，該等側翼亦可稱為交替側翼。具有交替側翼之寡核苷酸中之3’側翼(區域F’)之長度可為4至10個核苷，例如4至8個、例如4至6個核苷，例如4、5、6或7個經修飾核苷。在一些實施例中，僅寡核苷酸之3’側翼係交替性。具有交替核苷之區域F’之具體實例如下： 2’ _1-2-N’ _1-4-2’ _1-42’ _1-2-N’ _1-2-2’ _1-2-N’ _1-2-2’ _1-2其中2’指示經修飾核苷且N’係RNA或DNA。在一些實施例中，交替側翼中之所有經修飾核苷皆係LNA且N’係DNA。在另一實施例中，區域F’中之經修飾核苷係選自2’-O-烷基-RNA單元、2’-O-甲基-RNA、2’-胺基-DNA單元、2’-氟-DNA單元、2’-烷氧基-RNA、MOE單元、LNA單元、阿拉伯糖核酸(ANA)單元及2’-氟-ANA單元。在一些實施例中，F’區域包括LNA及2’取代經修飾核苷。該等形式通常稱為混合翼或混合側翼寡核苷酸。在本發明之一實施例中，區域F’中之所有經修飾核苷皆係LNA核苷。在另一實施例中，區域F’中之所有核苷皆係LNA核苷。在另一實施例中，區域F’中之LNA核苷獨立地選自由以下組成之群：氧基-LNA、硫代-LNA、胺基-LNA、cET及/或ENA (呈β-D或α-L構形或其組合)。在一較佳實施例中，區域F’在鄰接序列之3’端至少具有2β-D-氧基LNA單元。區域D’及D’’ 區域D’及D’’可分別連接至區域F之5’端或區域F’之3’端。區域D’或D’’係可選的。區域D’或D’’可獨立地包括0至5個(例如1至5個，例如2至4個，例如0、1、2、3、4或5個)可與靶核酸互補或非互補之其他核苷酸。就此而言，在一些實施例中，本發明寡核苷酸可包括在5’及/或3’端側接有其他核苷酸能夠調節靶之鄰接核苷酸序列。該等其他核苷酸可用作核酸酶易感性生物可裂解連接體(參見連接體之定義)。在一些實施例中，其他5’及/或3’端核苷與磷酸二酯鏈接連接，且可為DNA或RNA。在另一實施例中，其他5’及/或3’端核苷係可(例如)經包含以增強核酸酶穩定性或便於合成之經修飾核苷。在一實施例中，本發明寡核苷酸在鄰接核苷酸序列之5’或3’端包括區域D’及/或D’’。在另一實施例中，D’及/或D’’區域係由1至5個與靶核酸不互補之磷酸二酯連接之DNA或RNA核苷構成。本發明之間隙聚體寡核苷酸可由下列各式代表： 5’-F-G-F’-3’；尤其F _1-7-G _4-12-F’ _1-75’-D’-F-G-F’-3’，尤其D’ _1-3-F _1-7-G _4-12-F’ _1-75’-F-G-F’-D’’-3’，尤其F _1-7-G _4-12-F’ _1-7-D’’ _1-35’-D’-F-G-F’-D’-3’’，尤其D’ _1-3-F _1-7-G _4-12-F’ _1-7-D’’ _1-3區域F、G及F’、D’及D’’中之核苷之較佳數量及類型已闡述於上文中。本發明之寡核苷酸偶聯物具有以共價方式連接至寡核苷酸、尤其上文所呈現之間隙聚體寡核苷酸之5’或3’端之區域C。在一實施例中，本發明之寡核苷酸偶聯物包括具有式5’-D’-F-G-F’-3’或5’-F-G-F’-D’’-3’之寡核苷酸，其中區域F及F’獨立地包括1 - 7個經修飾核苷，G係6至16個能夠招募RNaseH之核苷之區域且區域D’或D’’包括1 - 5個磷酸二酯連接之核苷。較佳地，區域D’或D’’存在於涵蓋至偶聯物部分之偶聯之寡核苷酸之末端。具有交替側翼之寡核苷酸之實例可由下列各式代表： 2’ _1-3-N’ _1-4-2’ _1-3-G _6-12-2’ _1-2-N’ _1-4-2’ _1-42’ _1-2-N’ _1-2-2’ _1-2-N’ _1-2-2’ _1-2-G _6-12-2’ _1-2-N’ _1-2-2’ _1-2- N’ _1-2-2’ _1-2F-G _6-12-2’ _1-2-N’ _1-4-2’ _1-4F-G _6-12-2’ _1-2-N’ _1-2-2’ _1-2-N’ _1-2-2’ _1-22’ _1-3-N’ _1-4-2’ _1-3-G _6-12-F’ 2’ _1-2-N’ _1-2-2’ _1-2-N _1-2-2’ _1-2-G _6-12-F’ 其中側翼由F或F’指示，其僅含有2’修飾核苷(例如LNA核苷)。交替區域及區域F、G及F’、D’及D’’中之核苷之較佳數量及類型已闡述於上文中。在一些實施例中，寡核苷酸係由16、17、18、19、20、21、22個核苷酸(長度)組成之間隙聚體，其中在與PD-L1靶核酸呈雙螺旋體形式時，區域F及F’中之每一者獨立地由1、2、3或4個與PD-L1靶核酸互補之經修飾核苷單元組成且區域G係由8、9、10、11、12、13、14、15、16、17個能夠招募核酸酶之核苷單元組成，且區域D’係由2磷酸二酯連接之DNA組成。在另一實施例中，寡核苷酸係間隙聚體，其中區域F及F’中之每一者獨立地由3、4、5或6個經修飾核苷單元(例如含有2’-O-甲氧基乙基-核糖(2’-MOE)之核苷單元或含有2’-氟-去氧核糖之核苷單元及/或LNA單元)組成，且區域G係由8、9、10、11、12、13、14、15、16或17個核苷單元(例如DNA單元或其他核酸酶招募性核苷(例如α-L-LNA)或DNA及核酸酶招募性核苷之混合物)組成。在另一具體實施例中，寡核苷酸係間隙聚體，其中F及F’區域中之每一者區域係各自由兩個LNA單元組成，且區域G係由12、13、14個核苷單元、較佳地DNA單元組成。此性質之特定間隙聚體設計包含2-12-2、2-13-2及2-14-2。在另一具體實施例中，寡核苷酸係間隙聚體，其中F及F’中之每一者區域獨立地由三個LNA單元組成，且區域G係由8、9、10、11、12、13或14個核苷單元、較佳地DNA單元組成。具有此性質之特定間隙聚體設計包含3-8-3、3-9-3 3-10-3、3-11-3、3-12-3、3-13-3及3-14-3。在另一具體實施例中，寡核苷酸係間隙聚體，其中F及F’中之每一者區域各自由4個LNA單元組成，且區域G係由8或9、10、11或12個核苷單元、較佳地DNA單元組成。具有此性質之特定間隙聚體設計包含4-8-4、4-9-4、4-10-4、4-11-4及4-12-4。具有此性質之特定間隙聚體設計包含選自由6核苷間隙及獨立地翼中之1至4個經修飾核苷組成之群的F-G-F’設計，包含1-6-1、1-6-2、2-6-1、1-6-3、3-6-1、1-6-4、4-6-1、2-6-2、2-6-3、3-6-2、2-6-4、4-6-2、3-6-3、3-6-4及4-6-3間隙聚體。具有此性質之特定間隙聚體設計包含選自由7核苷間隙及獨立地翼中之1至4個經修飾核苷組成之群的F-G-F’設計，包含1-7-1、2-7-1、1-7-2、1-7-3、3-7-1、1-7-4、4-7-1、2-7-2、2-7-3、3-7-2、2-7-4、4-7-2、3-7-3、3-7-4、4-7-3及4-7-4間隙聚體。具有此性質之特定間隙聚體設計包含選自由8核苷間隙及獨立地翼中之1至4個經修飾核苷組成之群的F-G-F’設計，包含1-8-1、1-8-2、1-8-3、3-8-1、1-8-4、4-8-1、2-8-1、2-8-2、2-8-3、3-8-2、2-8-4、4-8-2、3-8-3、3-8-4、4-8-3及4-8-4間隙聚體。具有此性質之特定間隙聚體設計包含選自由9核苷間隙及獨立地翼中之1至4個經修飾核苷組成之群的F-G-F’設計，包含1-9-1、2-9-1、1-9-2、1-9-3、3-9-1、1-9-4、4-9-1、2-9-2、2-9-3、3-9-2、2-9-4、4-9-2、3-9-3、3-9-4、4-9-3及4-9-4間隙聚體。具有此性質之特定間隙聚體設計包含選自由10核苷間隙組成之群的F-G-F’設計，包含1-10-1、2-10-1、1-10-2、1-10-3、3-10-1、1-10-4、4-10-1、2-10-2、2-10-3、3-10-2、2-10-4、4-10-2、3-10-3、3-10-4、4-10-3及4-10-4間隙聚體。具有此性質之特定間隙聚體設計包含選自由11核苷間隙組成之群的F-G-F’設計，包含1-11-1、2-11-1、1-11-2、1-11-3、3-11-1、1-11-4、4-11-1、2-11-2、2-11-3、3-11-2、2-11-4、4-11-2、3-11-3、3-11-4、4-11-3及4-11-4間隙聚體。具有此性質之特定間隙聚體設計包含選自由12核苷間隙組成之群的F-G-F’設計，包含1-12-1、2-12-1、1-12-2、1-12-3、3-12-1、1-12-4、4-12-1、2-12-2、2-12-3、3-12-2、2-12-4、4-12-2、3-12-3、3-12-4、4-12-3及4-12-4間隙聚體。具有此性質之特定間隙聚體設計包含選自由13核苷間隙組成之群的F-G-F’設計，包含1-13-1、2-13-1、1-13-2、1-13-3、3-13-1、1-13-4、4-13-1、2-13-2、2-13-3、3-13-2、2-13-4、4-13-2、3-13-3、3-13-4、4-13-3及4-13-4間隙聚體。具有此性質之特定間隙聚體設計包含選自由14核苷間隙組成之群的F-G-F’設計，包含1-14-1、2-14-1、1-14-2、1-14-3、3-14-1、1-14-4、4-14-1、2-14-2、2-14-3、3-14-2、2-14-4、4-14-2、3-14-3、3-14-4、4-14-3及4-14-4間隙聚體。具有此性質之特定間隙聚體設計包含選自由15核苷間隙組成之群的F-G-F’設計，包含1-15-1、2-15-1、1-15-2、1-15-3、3-15-1、1-15-4、4-15-1、2-15-2、2-15-3、3-15-2、2-15-4、4-15-2及3-15-3間隙聚體。具有此性質之特定間隙聚體設計包含選自由16核苷間隙組成之群的F-G-F’設計，包含1-16-1、2-16-1、1-16-2、1-16-3、3-16-1、1-16-4、4-16-1、2-16-2、2-16-3、3-16-2、2-16-4、4-16-2及3-16-3間隙聚體。具有此性質之特定間隙聚體設計包含選自由17核苷間隙組成之群的F-G-F’設計，包含1-17-1、2-17-1、1-17-2、1-17-3、3-17-1、1-17-4、4-17-1、2-17-2、2-17-3及3-17-2間隙聚體。在所有情況下，F-G-F’設計可進一步包含區域D’及/或D’’，該等可具有1、2或3個核苷單元(例如DNA單元，例如2磷酸二酯連接之DNA單元)。較佳地，區域F及F’中之核苷係經修飾核苷，而區域G中之核苷酸較佳係未修飾核苷。在每一設計中，較佳經修飾核苷係LNA 。在另一實施例中，間隙聚體中之間隙中之所有核苷間鏈接皆係硫代磷酸酯及/或硼烷磷酸酯鏈接。在另一實施例中，間隙聚體中之側翼(F及F’區域)中之所有核苷間鏈接皆係硫代磷酸酯及/或硼烷磷酸酯鏈接。在另一較佳實施例中，間隙聚體中之D’及D’’區域中之所有核苷間鏈接皆係磷酸二酯鏈接。對於如本文所揭示之特定間隙聚體而言，在胞嘧啶(C)殘基注釋為5-甲基-胞嘧啶時，在各個實施例中，存在於寡核苷酸中之一或多個C可為未修飾C殘基。在一特定實施例中，間隙聚體係所謂的短聚體，如WO2008/113832 (其以引用方式併入本文中)中所闡述。其他間隙聚體設計揭示於WO2004/046160、WO2007/146511中且以引用方式併入本文中。對於本發明之某些實施例而言，寡核苷酸係選自具有CMP-ID-NO: 5_1至743_1及771_1之寡核苷酸化合物之群。對於本發明之某些實施例而言，寡核苷酸係選自具有以下編號之寡核苷酸化合物之群：CMP-ID-NO 6_1、8_1、9_1、13_1、41_1、42_1、58_1、77_1、92_1、111_1、128_1、151_1、164_1、166_1、169_1、171_1、222_1、233_1、245_1、246_1、250_1、251_1、252_1、256_1、272_1、273_1、287_1、292_1、303_1、314_1、318_1、320_1、324_1、336_1、342_1、343_1、344_1、345_1、346_1、349_1、359_1、360_1、374_1、408_1、409_1、415_1、417_1、424_1、429_1、430_1、458_1、464_1、466_1、474_1、490_1、493_1、512_1、519_1、519_1、529_1、533_1、534_1、547_1、566_1、567_1、578_1、582_1、601_1、619_1、620_1、636_1、637_1、638_1、640_1、645_1、650_1、651_1、652_1、653_1、658_1、659_1、660_1、665_1、678_1、679_1、680_1、682_1、683_1、684_1、687_1、694_1、706_1、716_1、728_1、733_1、734_1及735_1。在本發明之一較佳實施例中，寡核苷酸係CMP-ID-NO: 287_1。在本發明之另一較佳實施例中，寡核苷酸係CMP-ID-NO: 342_1。在本發明之另一較佳實施例中，寡核苷酸係CMP-ID-NO: 640_1。在本發明之另一較佳實施例中，寡核苷酸係CMP-ID-NO: 466_1。在本發明之另一較佳實施例中，寡核苷酸係CMP-ID-NO: 566_1。在本發明之另一實施例中，本發明之寡核苷酸基序及寡核苷酸化合物之鄰接核苷酸序列在鄰接核苷酸序列之5’端包括2至4個其他磷酸二酯連接之核苷(例如區域D’)。在一實施例中，該等核苷用作生物可裂解連接體(參見生物可裂解連接體部分)。在一較佳實施例中，ca (胞苷-腺苷)二核苷酸經由磷酸二酯鏈接連接至鄰接核苷酸序列 (亦即表5中所列示基序序列或寡核苷酸化合物中之任一者)之5’端。在一較佳實施例中，在鄰接核苷酸之其餘部分互補之位置，ca二核苷酸並不與靶序列互補。在本發明之一些實施例中，寡核苷酸或鄰接核苷酸序列係選自由具有SEQ ID NO: 766、767、768、769及770之核苷酸基序序列組成之群。在本發明之一些實施例中，寡核苷酸係選自由具有CMP-ID-NO 766_1、767_1、768_1、769_1及770_1之寡核苷酸化合物組成之群。 碳水化合物偶聯物部分碳水化合物偶聯物部分包含(但不限於)半乳糖、乳糖、n-乙醯基半乳糖胺、甘露糖及甘露糖-6-磷酸鹽。可使用碳水化合物偶聯物來增強多種組織(例如肝及/或肌肉)中之遞送或活性。例如參見EP1495769、WO99/65925、Yang等人，Bioconjug Chem (2009) 20(2): 213-21。Zatsepin & Oretskaya Chem Biodivers. (2004) 1(10): 1401-17。在一些實施例中，碳水化合物偶聯物部分係多價的，舉例而言，2、3或4個相同或不同碳水化合物部分可視情況經由一或多個連接體以共價方式接合至寡核苷酸。在一些實施例中，本發明提供包括本發明寡核苷酸及碳水化合物偶聯物部分之偶聯物。在一些實施例中，偶聯物部分係或可包括甘露糖或甘露糖-6-磷酸鹽。此尤其可用於靶向肌肉細胞，參見例如US 2012/122801。能夠結合至去唾液酸醣蛋白受體(ASGPr)之偶聯物部分尤其可用於靶向肝中之肝細胞。在一些實施例中，本發明提供包括本發明寡核苷酸及靶向去唾液酸醣蛋白受體之偶聯物部分之寡核苷酸偶聯物。靶向去唾液酸醣蛋白受體之偶聯物部分包括一或多個能夠以等於或大於半乳糖之親和力結合至去唾液酸醣蛋白受體之碳水化合物部分(結合ASPGr之碳水化合物部分)。許多半乳糖衍生物對去唾液酸醣蛋白受體之親和力已經研究(參見例如：Jobst, S.T.及Drickamer, K. JB.C. 1996, 271, 6686)或輕易使用業內典型方法測定。本發明之一態樣係包括以下之反義寡核苷酸偶聯物：a)寡核苷酸(區域A)，其包括與PD-L1靶核酸具有至少90%互補性之長度10至30個核苷酸之鄰接核苷酸序列；及b)至少一個靶向去唾液酸醣蛋白受體之偶聯物部分(區域C)，其共價連接至a)中之寡核苷酸。寡核苷酸或鄰接核苷酸序列可如部分「本發明寡核苷酸」、「寡核苷酸設計」及「間隙聚體設計」中之任一者中所述。在一些實施例中，靶向去唾液酸醣蛋白受體之偶聯物部分包括至少一個選自由以下組成之群之結合ASPGr之碳水化合物部分：半乳糖、半乳糖胺、N-甲醯基-半乳糖胺、N-乙醯基半乳糖胺、N-丙醯基-半乳糖胺、N-正丁醯基-半乳糖胺及N-異丁醯基半乳糖胺。在一些實施例中，靶向去唾液酸醣蛋白受體之偶聯物部分係單價、二價、三價或四價(亦即含有1、2、3或4個能夠結合至去唾液酸醣蛋白受體之末端碳水化合物部分)。較佳地，靶向去唾液酸醣蛋白受體之偶聯物部分係二價，甚至更佳地係三價。在一較佳實施例中，靶向去唾液酸醣蛋白受體之偶聯物部分包括1至3個N-乙醯基半乳糖胺(GalNAc)部分(亦稱為GalNAc偶聯物)。在一些實施例中，寡核苷酸偶聯包括三價N-乙醯基半乳糖胺(GalNAc)部分之靶向去唾液酸醣蛋白受體之偶聯物部分。GalNAc偶聯物已與磷酸二酯、甲基膦酸酯及PNA反義寡核苷酸(例如US 5,994517及Hangeland等人，Bioconjug Chem. 1995 Nov-Dec; 6(6):695-701；Biessen等人，1999 Biochem J. 340, 783-792及Maier等人，2003 Bioconjug Chem 14, 18-29 )及siRNA (例如WO 2009/126933、WO 2012/089352及WO 2012/083046)以及LNA及2'-MOE修飾核苷(WO 2014/076196 WO 2014/207232及WO 2014/179620 (以引用方式併入本文中))一起使用。為生成靶向去唾液酸醣蛋白受體之偶聯物部分，使ASPGr結合碳水化合物部分(較佳係GalNAc)經由糖之C-l碳連接至支化劑分子。ASPGr結合碳水化合物部分較佳地經由間隔體連接至支化劑分子。較佳間隔體係撓性親水性間隔體(美國專利5885968；Biessen等人。J. Med. Chern. 1995第39卷第1538-1546頁)。較佳撓性親水性間隔體係PEG間隔體。較佳PEG間隔體係PEG3間隔體(三個乙烯單元)。支化劑分子可為任一允許連接兩個或三個結合ASPGr之末端碳水化合物部分且進一步允許將分支點連接至寡核苷酸之小分子。實例性支化劑分子係二離胺酸。二離胺酸分子含有三個胺基團(經由其可連接三個結合ASPGr之碳水化合物部分)及羧基反應性基團(二離胺酸可經由其連接至寡核苷酸)。替代支化劑分子可為雙倍增體或三倍增體，例如由Glen Research所供應者。在一些實施例中，支化劑可選自由以下組成之群：1,3-雙-[5-(4,4'-二甲氧基三苯甲基氧基)戊基醯胺基]丙基-2-[(2-氰基乙基)-(N,N-二異丙基)]亞磷醯胺(Glen Research目錄號：10-1920-xx)、參-2,2,2-[3-(4,4'-二甲氧基三苯甲基氧基)丙基氧基甲基]乙基-[(2-氰基乙基)-(N,N-二異丙基)]-亞磷醯胺(Glen Research目錄號：10-1922-xx)、參-2,2,2-[3-(4,4'-二甲氧基三苯甲基氧基)丙基氧基甲基]亞甲基氧基丙基-[(2-氰基乙基)-(N,N-二異丙基)]-亞磷醯胺及1-[5-(4,4'-二甲氧基-三苯甲基氧基)戊基醯胺基]-3-[5-茀甲氧基-羰基-氧基-戊基醯胺基]-丙基-2-[(2-氰基乙基)-(N,N-二異丙基)]-亞磷醯胺(Glen Research目錄號：10-1925-xx)。WO 2014/179620及PCT申請案第PCT/EP2015/073331號闡述各種GalNAc偶聯物部分之生成(以引用方式併入本文中)。可將一或多個連接體插入支化劑分子與寡核苷酸之間。在一較佳實施例中，連接體係生物可裂解連接體。連接體可選自「連接體」部分及其子部分中所闡述之連接體。可使用業內已知方法將靶向去唾液酸醣蛋白受體之偶聯物部分、尤其GalNAc偶聯物部分連接至寡核苷酸之3'-端或5'-端。在較佳實施例中，將靶向去唾液酸醣蛋白受體之偶聯物部分連接至寡核苷酸之5’-端。與siRNA遞送相關之藥物動力學調節劑已闡述於WO2012/083046 (以引用方式併入本文中)中。在一些實施例中，碳水化合物偶聯物部分包括選自由以下組成之群之藥物動力學調節劑：具有16或更多個碳原子之疏水性基團、具有16-20個碳原子之疏水性基團、棕櫚醯基、十六-8-烯醯基、油烯基、(9E,12E)-十八-9,12二烯醯基、二辛醯基及C16-C20醯基及膽固醇。在一較佳實施例中，含有藥物動力學調節劑之碳水化合物偶聯物部分係GalNAc偶聯物。較佳碳水化合物偶聯物部分包括一至三個結合ASPGr之末端碳水化合物部分、較佳地N-乙醯基半乳糖胺部分。在一些實施例中，碳水化合物偶聯物部分包括三個經由間隔體連接至支化劑分子之結合ASPGr之碳水化合物部分、較佳地N-乙醯基半乳糖胺部分。間隔體分子可長8至30個原子。較佳碳水化合物偶聯物部分包括三個經由PEG間隔體連接至二離胺酸支化劑分子之末端GalNAc部分。較佳地，PEG間隔體係3PEG間隔體。適宜靶向去唾液酸醣蛋白受體之偶聯物部分展示於圖1中。較佳靶向去唾液酸醣蛋白受體之偶聯物部分展示於圖3中。其他GalNAc偶聯物部分可包含(例如)連接有GalNAc部分之小肽，例如Tyr-Glu-Glu-(胺基己基GalNAc)3 (YEE(ahGalNAc)3；結合至肝細胞上之去唾液酸醣蛋白受體之糖三肽，例如參見Duff等人，Methods Enzymol, 2000, 313, 297)；基於離胺酸之半乳糖簇(例如L3G4；Biessen等人，Cardovasc. Med., 1999, 214)；及基於膽烷之半乳糖簇(例如用於去唾液酸醣蛋白受體之碳水化合物識別基序)。在本發明之一些實施例中，反義寡核苷酸偶聯物係選自由以下組成之群：CPM ID NO: 766_2、767_2、768_2、769_2及770_2。在一較佳實施例中，反義寡核苷酸偶聯物對應於圖4中所表示之化合物。在另一較佳實施例中，反義寡核苷酸偶聯物對應於圖5中所表示之化合物。在另一較佳實施例中，反義寡核苷酸偶聯物對應於圖6中所表示之化合物。在另一較佳實施例中，反義寡核苷酸偶聯物對應於圖7中所表示之化合物。在另一較佳實施例中，反義寡核苷酸偶聯物對應於圖8中所表示之化合物。 連接體 生物可裂解連接體 ( 區域 B)使用偶聯物通常會增強藥物動力學或藥效動力學性質。然而，偶聯物部分之存在可(例如)經由妨礙雜交或核酸酶招募(例如RNAseH)之立體阻礙來干擾寡核苷酸針對其預期靶之活性。在寡核苷酸(區域A或第一區域)與偶聯物部分(區域C或第三區域)之間使用生理上不穩定鍵(生物可裂解連接體)使得因存在偶聯物部分而改良性質，同時確保在靶組織處偶聯基團不妨礙寡核苷酸之有效活性。在含有生理上不穩定鍵之分子到達適當細胞內及/或細胞外環境時，該不穩定鍵自發發生裂解。舉例而言，在分子進入經酸化胞內體時，pH不穩定鍵可發生裂解。因此，pH不穩定鍵可視為胞內體可裂解鍵。酶可裂解鍵可在暴露於酶(例如存在於胞內體或溶酶體中或細胞質中者)時發生裂解。二硫鍵可在分子進入細胞質之較高還原環境時發生裂解。因此，二硫化物可視為細胞質可裂解鍵。如本文中所使用，pH不穩定鍵係在酸性條件(pH＜7)下選擇性斷裂之不穩定鍵。該等鍵亦可稱為胞內體不穩定鍵，此乃因細胞胞內體及溶酶體之pH小於7。對於與用於靶向遞送之偶聯物部分締合之生物可裂解連接體而言，較佳地，靶組織(例如肌肉、肝、腎或腫瘤)中所看到之裂解速率大於發現於血清中者。用於測定靶組織與血清中之裂解或S1核酸酶裂解之程度(%)之適宜方法闡述於「材料及方法」部分中。在一些實施例中，本發明偶聯物中之生物可裂解連接體(亦稱為生理上不穩定連接體或核酸酶易感連接體或區域B)與標準相比至少約20%裂解，例如至少約30%裂解、例如至少約40%裂解、例如至少約50%裂解、例如至少約60%裂解、例如至少約70%裂解、例如至少約75%裂解。在一些實施例中，本發明之寡核苷酸偶聯物包括三個區域：i)第一區域(區域A)，其包括10 - 25個與靶核酸互補之鄰接核苷酸；ii)第二區域(區域B)，其包括生物可裂解連接體；及iii)第三區域(區域C)，其包括偶聯物部分，例如靶向去唾液酸醣蛋白受體之偶聯物部分，其中第三區域共價連接至以共價方式連接至第一區域之第二區域。在本發明之一實施例中，寡核苷酸偶聯物在鄰接核苷酸序列(區域A)與靶向去唾液酸醣蛋白受體之偶聯物部分(區域C)之間包括生物可裂解連接體(區域B)。在一些實施例中，生物可裂解連接體可位於與靶核酸互補之鄰接核苷酸(區域A)之5’端及/或3’端。在一較佳實施例中，生物可裂解連接體位於5’端。在一些實施例中，可裂解連接體易感可(例如)表現於靶細胞中之核酸酶。在一些實施例中，生物可裂解連接體係由2至5個連續磷酸二酯鏈接構成。連接體可為短區域(例如1 - 10，如連接體定義中所詳述)磷酸二酯連接之核苷。在一些實施例中，生物可裂解連接體區B中之核苷(視情況獨立地)選自由以下組成之群：DNA及RNA或其不干擾核酸酶裂解之修飾。不干擾核酸酶裂解之DNA及RNA核苷修飾可為非天然核鹼基。某些糖修飾性核苷亦可容許核酸酶裂解，例如α-L-氧基-LNA。在一些實施例中，區域B中之所有核苷包括(視情況獨立地) 2’-OH核糖糖(RNA)或2’-H糖-亦即RNA或DNA。在一較佳實施例中，區域B之至少兩個連續核苷係DNA或RNA核苷(例如至少3或4或5個連續DNA或RNA核苷)。在一甚至更佳實施例中，區域B之核苷係DNA核苷。較佳地，區域B係由1至5或1至4 (例如2、3、4)個連續磷酸二酯連接之DNA核苷組成。在較佳實施例中，區域B較短以便其不招募RNaseH。在一些實施例中，區域B包括不超過3或不超過4個連續磷酸二酯連接之DNA及/或RNA核苷(例如DNA核苷)。在區域B係由磷酸二酯連接之核苷構成之情形下，區域A及B可一起形成連接至區域C之寡核苷酸。在此背景下，區域A與區域B之不同之處可在於，區域A始於至少一個、較佳地至少兩個對靶核酸具有增加之結合親和力之經修飾核苷(例如LNA或具有2’取代糖部分之核苷)且區域A自身能夠調節靶核酸在相關細胞系中之表現。另外，若區域A包括DNA或RNA核苷，則該等核苷與核酸酶抗性核苷間鏈接(例如硫代磷酸酯或硼烷磷酸酯)連接。另一方面，區域B在DNA與RNA核苷之間包括磷酸二酯鏈接。在一些實施例中，區域B並不與靶核酸互補或相對於靶核酸包括至少50%失配。在一些實施例中，區域B並不與靶核酸序列或與區域A中之靶核酸互補之鄰接核苷酸互補。在一些實施例中，區域B與靶核酸序列互補。就此而言，區域A及B一起可形成與靶序列互補之單一鄰接序列。在本發明之一些態樣中，第一區域(區域A)及第二區域(區域B)之間之核苷間鏈接可視為第二區域之一部分。在一些實施例中，基於存在於靶組織或細胞或子細胞腔室中之主要內核酸酶裂解酶，選擇區域B中之鹼基序列以提供最佳內核酸酶裂解位點。就此而言，藉由自靶組織及非靶組織分離細胞提取物，可基於期望靶細胞(例如肝/肝細胞)中與非靶細胞(例如腎)相比之優先裂解活性來選擇用於區域B中之內核酸酶裂解序列。就此而言，可針對期望組織/細胞最佳化化合物關於靶下調之功效。在一些實施例中，區域B包括序列AA、AT、AC、AG、TA、TT、TC、TG、CA、CT、CC、CG、GA、GT、GC或GG之二核苷酸，其中C可為5-甲基胞嘧啶，及/或T可經U代替。較佳地，核苷間鏈接係磷酸二酯鏈接。在一些實施例中，區域B包括序列AAA、AAT、AAC、AAG、ATA、ATT、ATC、ATG、ACA、ACT、ACC、ACG、AGA、AGT、AGC、AGG、TAA、TAT、TAC、TAG、TTA、TTT、TTC、TAG、TCA、TCT、TCC、TCG、TGA、TGT、TGC、TGG、CAA、CAT、CAC、CAG、CTA、CTG、CTC、CTT、CCA、CCT、CCC、CCG、CGA、CGT、CGC、CGG、GAA、GAT、GAC、CAG、GTA、GTT、GTC、GTG、GCA、GCT、GCC、GCG、GGA、GGT、GGC及GGG之三核苷酸，其中C可為5-甲基胞嘧啶及/或T可經U代替。較佳地，核苷間鏈接係磷酸二酯鏈接。在一些實施例中，區域B包括序列AAAX、AATX、AACX、AAGX、ATAX、ATTX、ATCX、ATGX、ACAX、ACTX、ACCX、ACGX、AGAX、AGTX、AGCX、AGGX、TAAX、TATX、TACX、TAGX、TTAX、TTTX、TTCX、TAGX、TCAX、TCTX、TCCX、TCGX、TGAX、TGTX、TGCX、TGGX、CAAX、CATX、CACX、CAGX、CTAX、CTGX、CTCX、CTTX、CCAX、CCTX、CCCX、CCGX、CGAX、CGTX、CGCX、CGGX、GAAX、GATX、GACX、CAGX、GTAX、GTTX、GTCX、GTGX、GCAX、GCTX、GCCX、GCGX、GGAX、GGTX、GGCX及GGGX之三核苷酸，其中X可選自由以下組成之群：A、T、U、G、C及其類似物，其中C可為5-甲基胞嘧啶及/或T可經U代替。較佳地，核苷間鏈接係磷酸二酯鏈接。應識別到，在提及(天然)核鹼基A、T、U、G、C時，該等核鹼基可經用作等效天然核鹼基之核鹼基類似物(例如具有互補核苷之鹼基對)取代。 其他連接體 ( 區域 Y)連接體可具有至少兩個官能基，一個官能基用於連接至寡核苷酸且另一個用於連接至偶聯物部分。實例性連接體官能基可為親電性以用於與寡核苷酸或偶聯物部分上之親核性基團進行反應，或為親核性以用於與親電性基團進行反應。在一些實施例中，連接體官能基包含胺基、羥基、羧酸、硫醇、胺基磷酸酯、硫代磷酸酯、磷酸酯、亞磷酸酯、不飽和基團(例如雙鍵或三鍵)及諸如此類。一些實例性連接體(區域Y)包含8-胺基-3,6-二氧雜辛酸(ADO)、4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-l-甲酸琥珀醯亞胺基酯(SMCC)、6-胺基己酸(AHEX或AHA)、6-胺基己基氧基、4-胺基丁酸、4-胺基環己基甲酸、琥珀醯亞胺基4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷- l-羧基-(6-醯胺基-己酸酯) (LCSMCC)、間馬來醯亞胺基-苯甲酸琥珀醯亞胺基酯(MBS)、N-e-馬來醯亞胺基-辛酸琥珀醯亞胺基酯(EMCS)、6-(β-馬來醯亞胺基-丙醯胺基)己酸琥珀醯亞胺基酯(SMPH)、琥珀醯亞胺基N-(a-馬來醯亞胺基乙酸酯) (AMAS)、4-(p-馬來醯亞胺基苯基)丁酸琥珀醯亞胺基酯(SMPB)、β -丙胺酸(β-ALA)、苯基甘胺酸(PHG)、4-胺基環己酸(ACHC)、β -(環丙基)丙胺酸(β-CYPR)、胺基十二烷酸(ADC)、伸烷基二醇、聚乙二醇、胺基酸及諸如此類。在一些實施例中，連接體(區域Y)係胺基烷基，例如C2 - C36胺基烷基(包含(例如) C6 - C12胺基烷基)。在一較佳實施例中，連接體(區域Y)係C6胺基烷基。可(例如)使用(例如經保護)胺基烷基胺基磷酸胺基酯烷基酯添加至寡核苷酸(區域A或區域A-B)中以作為標準寡核苷酸合成之一部分。胺基烷基與寡核苷酸之間之鏈接基團可(例如)為硫代磷酸酯或磷酸二酯或本文所提及其他核苷鏈接基團中之一者。胺基烷基以共價方式連接至寡核苷酸之5’或3’端。市售胺基烷基連接體係(例如) 3'-胺基-修飾劑試劑(用於寡核苷酸之3’端處之鏈接)，且對於寡核苷酸之5 '端處之鏈接而言，可使用5'-胺基-修飾劑C6。該等試劑可自Glen Research Corporation (Sterling, Va.)獲得。該等化合物或類似物在Krieg等人，Antisense Research and Development 1991, 1, 161中用於將螢光黃連接至寡核苷酸之5'-末端。業內已知眾多種其他連接體基團且可用於將偶聯物部分連接至寡核苷酸。許多有用連接體基團之綜述可參見(例如) Antisense Research and Applications, S. T. Crooke及B. Lebleu編輯，CRC Press, Boca Raton, Fla., 1993，第303-350頁。其他化合物(例如吖啶)經由聚亞甲基鏈接連接至寡核苷酸之3'-末端磷酸酯基團(Asseline等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1984, 81, 3297)。任一上述基團皆可用作單一連接體(區域Y)或與一或多個其他連接體組合使用(區域Y-Y’或區域Y-B或B-Y)。連接體及其製備寡核苷酸偶聯物之用途已在業內廣泛提供，例如WO 96/11205及WO 98/52614及U.S. Pat. No. 4,948,882；5,525,465；5,541,313；5,545,730；5,552,538；5,580,731；5,486,603；5,608,046；4,587,044；4,667,025；5,254,469；5,245,022；5,112,963；5,391,723；5,510475；5,512,667；5,574,142；5,684,142；5,770,716；6,096,875；6,335,432；及6,335,437；WO 2012/083046，該等案件中之每一者之全部內容皆以引用方式併入本文中。製造方法在另一態樣中，本發明提供製造本發明寡核苷酸之方法，其包括使核苷酸單元進行反應且由此形成包括於寡核苷酸中之以共價方式連接之鄰接核苷酸單元。較佳地，該方法使用亞磷醯胺化學(例如參見Caruthers等人，1987, Methods in Enzymology第154卷，第287-313頁)。在另一實施例中，該方法進一步包括使鄰接核苷酸序列與偶聯物部分(配體)進行反應。在另一態樣中，提供製造本發明組合物之方法，其包括混合本發明之寡核苷酸或偶聯寡核苷酸與醫藥上可接受之稀釋劑、溶劑、載劑、鹽及/或佐劑。醫藥組合物在另一態樣中，本發明提供醫藥組合物，其包括任一上文所提及之寡核苷酸及/或寡核苷酸偶聯物及醫藥上可接受之稀釋劑、溶劑、載劑、鹽及/或佐劑。醫藥上可接受之稀釋劑包含磷酸緩衝鹽水(PBS)且醫藥上可接受之鹽包含(但不限於)鈉鹽及鉀鹽。在一些實施例中，醫藥上可接受之稀釋劑係無菌磷酸鹽緩衝鹽水。在一些實施例中，寡核苷酸以50 - 300µM溶液之濃度用於醫藥上可接受之稀釋劑中。用於本發明中之適宜調配物可參見Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, Pa.，第17版，1985。關於藥物遞送方法之簡要綜述，參見(例如) Langer (Science 249:1527-1533, 1990)。WO2007/031091提供醫藥上可接受之稀釋劑、載劑及佐劑之其他適宜及較佳實例(以引用方式併入本文中)。適宜劑量、調配物、投與途徑、組合物、劑型、與其他治療劑之組合、前藥調配物亦提供於WO2007/031091中。可混合本發明之寡核苷酸或寡核苷酸偶聯物與醫藥上可接受之活性或惰性物質以用於製備醫藥組合物或調配物。組合物及調配醫藥組合物之方法取決於諸多準則，包含(但不限於)投與途徑、疾病程度或擬投與劑量。該等組合物可藉由習用滅菌技術進行滅菌，或可無菌過濾。可將所得水溶液包裝以供按原樣使用或將其凍乾，將凍乾製劑在投與之前與無菌水性載劑組合。製劑之pH通常介於3與11之間，更佳地介於5與9之間或介於6與8之間，且最佳地介於7與8之間(例如7至7.5)。可將呈固體形式之所得組合物包裝成多個單一劑量單元，每一單元含有固定量之上文所提及之一或多種藥劑，例如呈錠劑或膠囊之密封包裝形式。亦可將呈固體形式之組合物包裝成用於撓性量之容器，例如呈設計用於局部施加之乳霜或軟膏之可擠壓管形式。在一些實施例中，本發明之寡核苷酸或寡核苷酸偶聯物係前藥。特定而言，對於寡核苷酸偶聯物而言，在將前藥遞送至作用位點(例如靶細胞)後，偶聯物部分立即與寡核苷酸分離。應用本發明之寡核苷酸或寡核苷酸偶聯物可用作用於(例如)診斷、治療及預防之研究試劑。在研究中，可使用該等寡核苷酸或寡核苷酸偶聯物來特異性調節PD-L1蛋白在細胞(例如活體外細胞培養物)及實驗動物中之合成，由此促進靶之功能分析或其作為用於治療干預之靶之有用性的評價。通常，藉由降解或抑制產生蛋白質之mRNA (由此防止形成蛋白質)或藉由降解或抑制產生蛋白質之基因或mRNA之調節劑來達成靶調節。若在研究或診斷中採用本發明寡核苷酸，則靶核酸可為cDNA或衍生自DNA或RNA之合成核酸。本發明提供調節表現PD-L1之靶細胞中之PD-L1表現之活體內或活體外方法，該方法包括向該細胞投與有效量之本發明之寡核苷酸或寡核苷酸偶聯物。在一些實施例中，靶細胞係哺乳動物細胞、尤其人類細胞。靶細胞可為哺乳動物中之組織之活體外細胞培養物或活體內細胞形成部分。在較佳實施例中，靶細胞存在於肝中。肝靶細胞可選自實質細胞(例如肝細胞)及非實質細胞(例如庫弗氏細胞、LSEC、星形細胞(或Ito細胞)、膽管上皮細胞及肝相關白血球(包含T細胞及NK細胞))。在一些實施例中，靶細胞係抗原呈遞細胞。抗原呈遞細胞在其表面上顯示與種類I或種類II主要組織相容性複合物(MHC)複合之外來抗原。在一些實施例中，抗原呈遞細胞表現種類II MHC (亦即職業性抗原呈遞細胞，例如樹突狀細胞、巨噬球及B細胞)。在診斷中，可使用寡核苷酸藉由北方印漬(北方印漬)、原位雜交或類似技術來檢測及量化細胞及組織中之PD-L1表現。對於治療而言，可將本發明之寡核苷酸或寡核苷酸偶聯物或其醫藥組合物投與懷疑患有疾病或病症之動物或人類，該疾病或病症可藉由降低PD-L1表現、尤其藉由降低肝靶細胞中之PD-L1表現來予以緩解或治療。本發明提供治療或預防疾病之方法，其包括向患有或易感該疾病之個體投與治療或預防有效量之本發明之寡核苷酸、寡核苷酸偶聯物或醫藥組合物。本發明亦係關於用作藥劑之本發明之寡核苷酸、寡核苷酸偶聯物或醫藥組合物。本發明之寡核苷酸、寡核苷酸偶聯物或醫藥組合物通常係以有效量來投與。本發明亦提供本發明之所闡述寡核苷酸或寡核苷酸偶聯物或醫藥組合物之用途，其用以製造用於治療如本文所提及之疾病或病症之藥劑。在一實施例中，該疾病係選自a)病毒性肝感染，例如HBV、HCV及HDV；b)寄生蟲感染，例如瘧疾、弓蟲症、利什曼病及錐蟲病；及c)肝癌或肝中轉移。在一實施例中，本發明係關於用於治療選自病毒或寄生蟲感染之疾病或病症之寡核苷酸、寡核苷酸偶聯物或醫藥組合物。在另一實施例中，該疾病係選自a)病毒性肝感染，例如HBV、HCV及HDV；b)寄生蟲感染，例如瘧疾、弓蟲症、利什曼病及錐蟲病；及c)肝癌或肝中轉移。如本文所提及之疾病或病症與免疫耗竭有關。特定而言，疾病或病症與病毒特異性T細胞反應之耗竭有關。在一些實施例中，可藉由降低PD-L1表現來緩解或治療疾病或病症。本發明方法較佳用於治療或預防與免疫耗竭有關之疾病。在本發明之一實施例中，本發明之寡核苷酸、寡核苷酸偶聯物或醫藥組合物可用於恢復針對肝癌或肝中轉移之免疫反應。在本發明之一實施例中，本發明之寡核苷酸、寡核苷酸偶聯物或醫藥組合物可用於恢復針對病原體之免疫反應。在一些實施例中，病原體可發現於肝中。病原體可為病毒或寄生蟲，尤其係本文所闡述者。在一較佳實施例中，病原體係HBV。本發明另外係關於如本文所定義之寡核苷酸、寡核苷酸偶聯物或醫藥組合物之用途，其用以製造用於恢復針對如本文所提及病毒或寄生蟲感染之免疫性之藥劑。本發明之寡核苷酸或寡核苷酸偶聯物或醫藥組合物可用於治療病毒感染、尤其影響PD-1路徑之肝中之病毒感染(例如參見Kapoor及Kottilil 2014 Future Virol第9卷第565-585頁及Salem及El-Badawy 2015 World J Hepatol第7卷第2449-2458頁)。病毒性肝感染可選自由以下組成之群：肝炎病毒、尤其HBV、HCV及HDV、尤其該等感染之慢性形式。在一實施例中，使用本發明之寡核苷酸或寡核苷酸偶聯物或醫藥組合物來治療HBV、尤其慢性HBV。慢性HBV感染之指標係循環中之高病毒負荷值(HBV DNA)及甚至較高含量之空HBsAg顆粒(＞100倍過量病毒體)。本發明之寡核苷酸或寡核苷酸偶聯物亦可用於治療與HIV共感染發生之病毒性肝感染。可使用本發明之寡核苷酸或寡核苷酸偶聯物或醫藥組合物治療之其他病毒感染係lcmv (淋巴球性脈絡叢腦膜炎病毒)及HIV (呈單菌性感染形式)、HSV-1及HSV-2及其他皰疹病毒。該等病毒並非感染肝細胞傾向性，然而，其可對PDL1下調敏感。在一些實施例中，免疫性或免疫反應之恢復涉及改良T細胞及/或NK細胞反應及/或緩解T細胞耗竭，特定而言，恢復HBV特異性T細胞反應、HCV特異性T細胞反應及或HDV特異性T細胞反應。可(例如)將T細胞反應之改良評價為與對照(例如在治療之前之值或在媒劑治療個體中之值)相比肝中之T細胞增加、尤其CD8+及/或CD4+ T細胞增加。在另一實施例中，病毒特異性CD8+ T細胞與對照相比有所恢復或增加，特定而言，HBV特異性CD8+ T細胞或HCV特異性CD8+ T細胞或HDV特異性CD8+ T細胞與對照相比有所恢復或增加。在一較佳實施例中，在使用本發明之寡核苷酸、寡核苷酸偶聯物或醫藥組合物治療之個體中，與對照相比，HBV s抗原(HBsAg)特異性CD8+ T細胞及/或HBV e抗原(HBeAg)特異性CD8+ T細胞及/或HBV核心抗原(HBcAg)特異性CD8+ T細胞有所增加。較佳地，HBV抗原特異性CD8+ T細胞產生一或多種細胞介素(例如干擾素-γ(IFN-γ)或腫瘤壞死因子α (TNF-α))。尤其在肝中觀察到上述CD8+ T細胞之增加。在與對照相比時，本文所闡述之增加應在統計學上顯著。較佳地，在與對照相比時，增加至少20% (例如25%，例如50%，例如75%)。在另一實施例中，藉由本發明之寡核苷酸或寡核苷酸偶聯物活化天然殺手(NK)細胞及/或天然殺手T (NKT)細胞。本發明之寡核苷酸或寡核苷酸偶聯物或醫藥組合物可用於治療寄生蟲感染、尤其影響PD-1路徑之寄生蟲感染(例如參見Bhadra等人， 2012 J Infect Dis第206卷第125-134頁；Bhadra等人， 2011 Proc Natl Acad Sci U S A第108卷第9196-9201頁；Esch等人， J Immunol第191卷第5542-5550頁；Freeman及Sharpe 2012 Nat Immunol第13卷第113-115頁；Gutierrez等人， 2011 Infect Immun第79卷第1873-1881頁；Joshi等人， 2009 PLoS Pathog第5卷e1000431；Liang等人， 2006 Eur J Immunol第36卷第58-64頁；Wykes等人， 2014 Front Microbiol第5卷第249頁)。寄生蟲感染可選自由以下組成之群：瘧疾、弓蟲症、利什曼病及錐蟲病。瘧疾感染係由瘧原蟲屬、尤其物種間日瘧原蟲、三日瘧原蟲及惡性瘧原蟲之原生動物引起。弓蟲症係由弓蟲( Toxoplasma gondii)引起之寄生蟲疾病。利什曼病係由利什曼原蟲( Leishmania)屬之原生動物寄生蟲引起之疾病。錐蟲病係藉由布魯氏錐蟲( Trypanosoma)屬之原生動物引起。查加斯病(Chaga disease)係由物種克魯斯錐蟲( Trypanosoma cruzi)引起之熱帶形式，且睡眠疾病係由物種布魯氏錐蟲( Trypanosoma brucei)引起。在一些實施例中，免疫性恢復涉及恢復寄生蟲特異性T細胞及NK細胞反應、尤其瘧原蟲屬特異性T細胞反應、弓蟲特異性T細胞及NK細胞反應、利什曼原蟲特異性T細胞及NK細胞反應、克魯斯錐蟲特異性T細胞及NK細胞反應或布魯氏錐蟲特異性T細胞及NK細胞反應。在另一實施例中，恢復寄生蟲特異性CD8+ T細胞及NK細胞反應。投與可局部(例如皮膚、吸入、眼部或耳部)或經腸(例如經口或經由胃腸道)或非經腸(例如靜脈內、皮下、肌內、大腦內、大腦心室內或鞘內)投與本發明之寡核苷酸或醫藥組合物。在一較佳實施例中，藉由非經腸途徑(包含靜脈內、動脈內、皮下、腹膜腔內或肌內注射或輸注、鞘內或顱內(例如大腦內)或心室內、玻璃體內投與)投與本發明之寡核苷酸或醫藥組合物。在一實施例中，經靜脈內投與活性寡核苷酸或寡核苷酸偶聯物。在另一實施例中，經皮下投與活性寡核苷酸或寡核苷酸偶聯物。在一些實施例中，以0.1 - 15 mg/kg (例如0.1 - 10 mg/kg，例如0.2 - 10 mg/kg，例如0.25 - 10 mg/kg，例如0.1 - 5 mg/kg，例如0.2 - 5 mg/kg，例如0.25 - 5 mg/kg)之劑量投與本發明之寡核苷酸、寡核苷酸偶聯物或醫藥組合物。可每週一次、每第2週，每第三週或甚至每月一次進行投與。組合療法在一些實施例中，將本發明之寡核苷酸、寡核苷酸偶聯物或醫藥組合物與另一治療劑用於組合治療。治療劑可為(例如)用於上述疾病或病症之標準護理。為治療慢性HBV感染，推薦使用抗病毒藥物及免疫系統調節劑之組合作為標準護理。有效針對HBV之抗病毒藥物係(例如)核苷(酸)類似物。5種核苷(酸)類似物已經許可用於治療HBV，亦即拉米夫定(lamivudine) (Epivir)、阿德福韋(adefovir) (Hepsera)、替諾福韋(tenofovir) (Viread)、替比夫定(telbivudine) (Tyzeka)、恩替卡韋(entecavir) (Baraclude)，該等藥劑有效阻抑病毒複製(HBV DNA)，但對HBsAg含量並無效應。其他抗病毒藥物包含利巴韋林(ribavirin)及HBV抗體療法(單株或多株)。免疫系統調節劑可為(例如)干擾素α-2a及聚乙二醇化干擾素α-2a (Pegasys)或TLR7激動劑(例如GS-9620)或治療疫苗。IFN-α治療僅展示降低病毒負荷之極輕微效應，但產生一定程度之HBsAg下降，但該下降極低(在48週療法之後＜10%)。本發明之寡核苷酸或寡核苷酸偶聯物亦可與其他有效抵抗HBV之抗病毒藥物(例如闡述於WO2012/145697及WO 2014/179629中之反義寡核苷酸或闡述於WO 2005/014806、WO 2012/024170、WO 2012/2055362、WO 2013/003520及WO 2013/159109中之siRNA分子)進行組合。在組合療法中投與本發明之寡核苷酸或寡核苷酸偶聯物與其他藥劑時，可依序或同時將其投與個體。或者，本發明之醫藥組合物可包括本發明之寡核苷酸或寡核苷酸偶聯物以及如本文所闡述醫藥上可接受之賦形劑及業內已知之另一治療性或預防性藥劑的組合。實施例本發明之下列實施例可與本文所闡述之任一其他實施例組合使用。 1. 一種反義寡核苷酸，其包括長度為10至30個核苷酸之鄰接核苷酸序列或由其組成且能夠降低PD-L1表現。 2. 如實施例1之寡核苷酸，其中該鄰接核苷酸序列與PD-L1靶核酸至少90%互補。 3. 如實施例1或2之寡核苷酸，其中該鄰接核苷酸序列與選自由以下組成之群之靶核酸互補：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2及/或SEQ ID NO: 3。 4. 如實施例1至3之寡核苷酸，其中該鄰接核苷酸序列與SEQ ID NO: 1上之位置1及15720內之區域互補。 5. 如實施例1至4之寡核苷酸，其中該寡核苷酸能夠以低於-10 kcal之ΔG°雜交至選自由以下組成之群之靶核酸：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2及/或SEQ ID NO: 3。 6. 如實施例1至5之寡核苷酸，其中該鄰接核苷酸序列與該靶核酸之子序列互補，其中該子序列係選自由以下組成之群：SEQ ID NO: 1上之位置371至3068、5467至12107、15317至15720、15317-18083、15317至19511及18881至19494。 7. 如實施例6之寡核苷酸，其中該子序列係選自由以下組成之群：SEQ ID NO: 1上之位置7300至7333、8028至8072、9812至9859、11787至11873及15690至15735。 8. 如實施例2至7之寡核苷酸，其中該靶核酸係RNA。 9. 如實施例8之寡核苷酸，其中該RNA係mRNA。 10. 如實施例9之寡核苷酸，其中該mRNA係mRNA前體或成熟mRNA。 11. 如實施例1至10之寡核苷酸，其中該鄰接核苷酸序列包括至少14個鄰接核苷酸、尤其15、16、17、18、19、20、21、22、23或24個鄰接核苷酸或由其組成。 12. 如實施例1至10之寡核苷酸，其中該鄰接核苷酸序列包括16至20個核苷酸或由其組成。 13. 如實施例1至10之寡核苷酸，其中該寡核苷酸包括14至35個核苷酸(長度)或由其組成。 14. 如實施例13之寡核苷酸，其中該寡核苷酸包括18至22個核苷酸(長度)或由其組成。 15. 如實施例1至14之寡核苷酸，其中該寡核苷酸或鄰接核苷酸序列係單鏈。 16. 如實施例1至15之寡核苷酸，其中該鄰接核苷酸序列與該靶核酸之子序列互補，其中該子序列係選自由以下組成之群：A7、A26、A43、A119、A142、A159、A160、A163、A169、A178、A179、A180、A189、A201、A202、A204、A214、A221、A224、A226、A243、A254、A258、269、A274、A350、A360、A364、A365、A370、A372、A381、A383、A386、A389、A400、A427、A435及A438。 17. 如實施例16之寡核苷酸，其中該子序列係選自由以下組成之群：A221、A360、A180、A160及A269。 18. 如實施例1至17之寡核苷酸，其中該寡核苷酸並非siRNA且並不自我互補。 19. 如實施例1至18之寡核苷酸，其中該鄰接核苷酸序列包括選自SEQ ID NO: 5至743或771之序列或由其組成。 20. 如實施例1至19之寡核苷酸，其中該鄰接核苷酸序列包括選自以下之序列或由其組成：SEQ ID NO: 6、8、9、13、41、42、58、77、92、111、128、151、164、166、169、171、222、233、245、246、250、251、252、256、272、273、287、292、303、314、318、320、324、336、342、343、344、345、346、349、359、360、374、408、409、415、417、424、429、430、458、464、466、474、490、493、512、519、519、529、533、534、547、566、567、578、582、601、619、620、636、637、638、640、645、650、651、652、653、658、659、660、665、678、679、680、682、683、684、687、694、706、716、728、733、734及735。 21. 如實施例1至20之寡核苷酸，其中該鄰接核苷酸序列包括選自SEQ ID NO:466、640、342、287及566之序列或由其組成。 22. 如實施例1至21之寡核苷酸，其中該鄰接核苷酸序列與其互補靶核酸相比具有零至三個失配。 23. 如實施例22之寡核苷酸，其中該鄰接核苷酸序列與該靶核酸相比具有一個失配。 24. 如實施例22之寡核苷酸，其中該鄰接核苷酸序列與該靶核酸相比具有兩個失配。 25. 如實施例22之寡核苷酸，其中該鄰接核苷酸序列與該靶核酸序列完全互補。 26. 如實施例1至25之寡核苷酸，其包括一或多個經修飾核苷。 27. 如實施例26之寡核苷酸，其中該一或多個經修飾核苷係高親和力經修飾核苷。 28. 如實施例26或27之寡核苷酸，其中該一或多個經修飾核苷係2’糖修飾性核苷。 29. 如實施例28之寡核苷酸，其中該一或多個2’糖修飾性核苷獨立地選自由以下組成之群：2’-O-烷基-RNA、2’-O-甲基-RNA、2’-烷氧基-RNA、2’-O-甲氧基乙基-RNA、2’-胺基-DNA、2’-氟-DNA、2’-氟-ANA及LNA核苷。 30. 如實施例28之寡核苷酸，其中該一或多個經修飾核苷係LNA核苷。 31. 如實施例30之寡核苷酸，其中該經修飾LNA核苷係氧基-LNA。 32. 如實施例31之寡核苷酸，其中該經修飾核苷係β-D-氧基-LNA。 33. 如實施例30之寡核苷酸，其中該經修飾核苷係硫代-LNA。 34. 如實施例30之寡核苷酸，其中該經修飾核苷係胺基-LNA。 35. 如實施例30之寡核苷酸，其中該經修飾核苷係cET。 36. 如實施例30之寡核苷酸，其中該經修飾核苷係ENA。 37. 如實施例30之寡核苷酸，其中該經修飾LNA核苷係選自β-D-氧基-LNA、α-L-氧基-LNA、β-D-胺基-LNA、α-L-胺基-LNA、β-D-硫代-LNA、α-L-硫代-LNA、(S)cET、(R)cETβ-D-ENA及α-L-ENA。 38. 如實施例30至37之寡核苷酸，其中除該經修飾LNA核苷外存在至少一個2’取代經修飾核苷。 39. 如實施例38之寡核苷酸，其中該2’取代經修飾核苷係選自由以下組成之群：2’-O-烷基-RNA、2’-O-甲基-RNA、2’-烷氧基-RNA、2’-O-甲氧基乙基-RNA (MOE)、2’-胺基-DNA、2’-氟-DNA、2’-氟-ANA。 40. 如實施例1至39中任一項之寡核苷酸，其中該寡核苷酸包括至少一個經修飾核苷間鏈接。 41. 如實施例40之寡核苷酸，其中該經修飾核苷間鏈接係核酸酶抗性。 42. 如實施例40或41之寡核苷酸，其中該鄰接核苷酸序列內之至少50%之該等核苷間鏈接係硫代磷酸酯核苷間鏈接或硼烷磷酸酯核苷間鏈接。 43. 如實施例40或41之寡核苷酸，其中該鄰接核苷酸序列內之所有該等核苷間鏈接皆係硫代磷酸酯核苷間鏈接。 44. 如實施例1至43之寡核苷酸，其中該寡核苷酸能夠招募RNase H。 45. 如實施例44之寡核苷酸，其中該寡核苷酸係間隙聚體。 46. 如實施例44或45之寡核苷酸，其中該寡核苷酸係式5’-F-G-F’-3’之間隙聚體，其中區域F及F’獨立地包括1至7個經修飾核苷或由其組成且G係能夠招募RNaseH之6至16個核苷之區域。 47. 如實施例44或45之寡核苷酸，其中該間隙聚體具有式5’-D’-F-G-F’-3’或5’-F-G-F’-D’’-3’，其中區域F及F’獨立地包括1至7個經修飾核苷，G係能夠招募RNaseH之6至16個核苷之區域且區域D’或D’’包括1至5個磷酸二酯連接之核苷。 48. 如實施例47之寡核苷酸，其中D’或D’’係可選的。 49. 如實施例47之寡核苷酸，其中區域D’係由兩個磷酸二酯連接之核苷組成。 50. 如實施例49之寡核苷酸，其中該等磷酸二酯連接之核苷係ca (胞苷-腺苷)。 51. 如實施例46或47之寡核苷酸，其中該經修飾核苷係獨立地選自由以下組成之群之2’糖修飾性核苷：2’-O-烷基-RNA、2’-O-甲基-RNA、2’-烷氧基-RNA、2’-O-甲氧基乙基-RNA、2’-胺基-DNA、2’-氟-DNA、阿拉伯糖核酸(ANA)、2’-氟-ANA及LNA核苷。 52. 如實施例46至51之寡核苷酸，其中區域F及F’中之該等經修飾核苷中之一或多者係LNA核苷。 53. 如實施例52之寡核苷酸，其中區域F及F’中之所有該等經修飾核苷皆係LNA核苷。 54. 如實施例53之寡核苷酸，其中區域F及F’係由LNA核苷組成。 55. 如實施例52至54之寡核苷酸，其中區域F及F’中之所有該等經修飾核苷皆係氧基-LNA核苷。 56. 如實施例52之寡核苷酸，其中區域F或F’中之至少一者進一步包括至少一個獨立地選自由以下組成之群之2’取代經修飾核苷：2’-O-烷基-RNA、2’-O-甲基-RNA、2’-烷氧基-RNA、2’-O-甲氧基乙基-RNA、2’-胺基-DNA及2’-氟-DNA。 57. 如實施例46至56之寡核苷酸，其中區域G中之該等招募RNaseH之核苷獨立地選自DNA、α-L-LNA、C4’烷基化DNA、ANA及2'F-ANA及UNA。 58. 如實施例57之寡核苷酸，其中區域G中之該等核苷係DNA及/或α-L-LNA核苷。 59. 如實施例57或58之寡核苷酸，其中區域G由至少75%之DNA核苷組成。 60. 如實施例1至59之寡核苷酸，其中該寡核苷酸係選自CMP ID NO: 5_1至743_1及771_1 (表5)中之任一者。 61. 如實施例1至60之寡核苷酸，其中該寡核苷酸係選自由以下組成之群：CMP ID NO: 6_1、8_1、9_1、13_1、41_1、42_1、58_1、77_1、92_1、111_1、128_1、151_1、164_1、166_1、169_1、171_1、222_1、233_1、245_1、246_1、250_1、251_1、252_1、256_1、272_1、273_1、287_1、292_1、303_1、314_1、318_1、320_1、324_1、336_1、342_1、343_1、344_1、345_1、346_1、349_1、359_1、360_1、374_1、408_1、409_1、415_1、417_1、424_1、429_1、430_1、458_1、464_1、466_1、474_1、490_1、493_1、512_1、519_1、519_1、529_1、533_1、534_1、547_1、566_1、567_1、578_1、582_1、601_1、619_1、620_1、636_1、637_1、638_1、640_1、645_1、650_1、651_1、652_1、653_1、658_1、659_1、660_1、665_1、678_1、679_1、680_1、682_1、683_1、684_1、687_1、694_1、706_1、716_1、728_1、733_1、734_1及735_1。 62. 如實施例1至61之寡核苷酸，其中該寡核苷酸係選自由以下組成之群：CMP ID NO:287_1、342_1、466_1、640_1、566_1、766_1、767_1、768_1、769_1及770_1。 63. 一種反義寡核苷酸偶聯物，其包括 a. 如實施例1至62中任一項之寡核苷酸(區域A)；及 b. 至少一個以共價方式連接至該寡核苷酸之偶聯物部分(區域C)。 64. 如實施例63之寡核苷酸偶聯物，其中該偶聯物部分係選自碳水化合物、細胞表面受體配體、藥物物質、激素、親脂性物質、聚合物、蛋白質、肽、毒素、維他命、病毒蛋白質或其組合。 65. 如實施例63或64之寡核苷酸偶聯物，其中該偶聯物部分係含有碳水化合物之部分。 66. 如實施例65之寡核苷酸偶聯物，其中該碳水化合物偶聯物部分包括至少一個共價連接至如實施例1至62中任一項之寡核苷酸之靶向去唾液酸醣蛋白受體之部分。 67. 如實施例66之寡核苷酸偶聯物，其中該靶向去唾液酸醣蛋白受體之偶聯物部分包括至少一個選自由以下組成之群之碳水化合物部分：半乳糖、半乳糖胺、N-甲醯基-半乳糖胺、N-乙醯基半乳糖胺、N-丙醯基-半乳糖胺、N-正丁醯基-半乳糖胺及N-異丁醯基半乳糖胺。 68. 如實施例66或67之寡核苷酸偶聯物，其中該靶向去唾液酸醣蛋白受體之偶聯物部分係單價、二價、三價或四價。 69. 如實施例68之寡聚物偶聯物，其中該靶向去唾液酸醣蛋白受體之偶聯物部分係由二至四個末端GalNAc部分、將每一GalNAc部分連接至支化劑分子之PEG間隔體組成。 70. 如實施例66至69之寡核苷酸偶聯物，其中該靶向去唾液酸醣蛋白受體之偶聯物部分係三價N-乙醯基半乳糖胺(GalNAc)部分。 71. 如實施例66至70之寡核苷酸偶聯物，其中該偶聯物部分係選自圖1中之三價GalNAc部分中之一者。 72. 如實施例71之寡核苷酸偶聯物，其中該偶聯物部分係圖3中之三價GalNAc部分。 73. 如實施例63至72之寡核苷酸偶聯物，其中連接體存在於該寡核苷酸或鄰接寡核苷酸序列與該偶聯物部分之間。 74. 如實施例73之寡核苷酸偶聯物，其中該連接體係生理上不穩定連接體(區域B)。 75. 如實施例74之寡核苷酸偶聯物，其中該生理上不穩定連接體係核酸酶易感連接體。 76. 如實施例74或75之寡核苷酸偶聯物，其中該生理上不穩定連接體係由2至5個連續磷酸二酯鏈接構成。 77. 如實施例76之寡核苷酸偶聯物，其中該生理上不穩定連接體等效於實施例47至50中所呈現之區域D’或D’’。 78. 如實施例63至77中任一項之寡核苷酸偶聯物，其中該寡核苷酸偶聯物係選自CMP ID NO: 766_2、767_2、768_2、769_2及770_2。 79. 如實施例78之寡核苷酸偶聯物，其中該寡核苷酸偶聯物係選自圖4、5、6、7及8中所表示之寡核苷酸偶聯物。 80. 如實施例63至76之寡核苷酸偶聯物，其與未偶聯寡核苷酸相比顯示靶細胞中之PD-L1之改良抑制，或在肝與脾之間顯示改良之細胞分佈，或顯示偶聯寡核苷酸在肝中之改良之細胞攝取。 81. 一種醫藥組合物，其包括如實施例1至62之寡核苷酸或如實施例63至80之偶聯物及醫藥上可接受之稀釋劑、載劑、鹽及/或佐劑。 82. 一種製造如實施例1至62之寡核苷酸之方法，其包括使核苷酸單元進行反應，由此形成包括於該寡核苷酸中之以共價方式連接之鄰接核苷酸單元。 83. 如實施例82之方法，其進一步包括使該鄰接核苷酸序列與非核苷酸偶聯物部分進行反應。 84. 一種製造如實施例81之組合物之方法，其包括混合該寡核苷酸與醫藥上可接受之稀釋劑、載劑、鹽及/或佐劑。 85. 一種調節表現PD-L1之靶細胞中之PD-L1表現之活體內或活體外方法，該方法包括向該細胞投與有效量之如實施例1至62之寡核苷酸或如實施例63-80之偶聯物或如實施例81之醫藥組合物。 86. 一種治療或預防疾病之方法，其包括向患有或易患該疾病之個體投與治療或預防有效量之如實施例1至62之寡核苷酸或如實施例63-80之偶聯物或如實施例81之醫藥組合物。 87. 一種恢復針對病毒或寄生蟲之免疫性之方法，其包括向感染病毒或寄生蟲之個體投與治療或預防有效量之如實施例63至80之寡核苷酸偶聯物或如實施例1至62之寡核苷酸或如實施例81之醫藥組合物。 88. 如實施例87之方法，免疫性之該恢復係在與對照相比時增加肝中之對一或多種HBV抗原具有特異性之CD8+ T細胞。 89. 如實施例1至62之寡核苷酸或如實施例63至80之偶聯物或如實施例81之醫藥組合物，其用作用於治療或預防個體之疾病之藥劑。 90. 一種如實施例1至62之寡核苷酸或如實施例63至80之偶聯物之用途，其用以製備用於治療或預防個體之疾病之藥劑。 91. 如實施例1至62之寡核苷酸或如實施例63至80之偶聯物或如實施例81之醫藥組合物，其用於恢復針對病毒或寄生蟲之免疫性。 92. 如實施例91之用途，其中免疫性之該恢復係在與對照相比時增加肝中之對一或多種HBV抗原具有特異性之CD8+ T細胞。 93. 如實施例92之用途，其中該HBV抗原係HBsAg。 94. 如實施例86至93之方法、寡核苷酸或用途，其中該疾病與PD-L1之活體內活性有關。 95. 如實施例86至94之方法、寡核苷酸或用途，其中該疾病與抗原呈遞細胞中之增加之PD-L1表現有關。 96. 如實施例95之方法、寡核苷酸或用途，其中與未治療或在使用如實施例1至62之寡核苷酸或如實施例63至80之偶聯物或如實施例81之醫藥組合物進行治療之前之表現相比，該PD-L1降低至少30%或至少40%或至少50%或至少60%或至少70%或至少80%或至少90%或至少95%。 97. 如實施例86至95之方法、寡核苷酸或用途，其中該疾病係選自病毒性肝感染或寄生蟲感染。 98. 如實施例98之方法、寡核苷酸或用途，其中該病毒感染係HBV、HCV或HDV。 99. 如實施例86至95之方法、寡核苷酸或用途，其中該疾病係慢性HBV。 100. 如實施例98之方法、寡核苷酸或用途，其中該寄生蟲感染係瘧疾、弓蟲症、利什曼病或錐蟲病。 101. 如實施例86至100之方法、寡核苷酸或用途，其中該個體係哺乳動物。 102. 如實施例101之方法、寡核苷酸或用途，其中該哺乳動物係人類。實例材料及方法 基序序列及寡核苷酸化合物表5：靶向人類PD-L1轉錄物(SEQ ID NO: 1)之寡核苷酸基序序列(由SEQ ID NO指示)、該等序列之設計以及基於基序序列設計之特定反義寡核苷酸化合物(由CMP ID NO指示)之列表。

SEQ ID NO	基序序列	設計	寡核苷酸化合物	CMP ID NO	ID NO: 1 上之起點	dG
5	taattggctctactgc	2-11-3	TAattggctctacTGC	5_1	236	-20
6	tcgcataagaatgact	4-10-2	TCGCataagaatgaCT	6_1	371	-19
7	tgaacacacagtcgca	2-12-2	TGaacacacagtcgCA	7_1	382	-19
8	ctgaacacacagtcgc	3-10-3	CTGaacacacagtCGC	8_1	383	-22
9	tctgaacacacagtcg	3-11-2	TCTgaacacacagtCG	9_1	384	-19
10	ttctgaacacacagtc	3-11-2	TTCtgaacacacagTC	10_1	385	-17
11	acaagtcatgttacta	2-11-3	ACaagtcatgttaCTA	11_1	463	-16
12	acacaagtcatgttac	2-12-2	ACacaagtcatgttAC	12_1	465	-14
13	cttacttagatgctgc	2-11-3	CTtacttagatgcTGC	13_1	495	-20
14	acttacttagatgctg	2-11-3	ACttacttagatgCTG	14_1	496	-18
15	gacttacttagatgct	3-11-2	GACttacttagatgCT	15_1	497	-19
16	agacttacttagatgc	2-11-3	AGacttacttagaTGC	16_1	498	-18
17	gcaggaagagacttac	3-10-3	GCAggaagagactTAC	17_1	506	-20
18	aataaattccgttcagg	4-9-4	AATAaattccgttCAGG	18_1	541	-22
19	gcaaataaattccgtt	3-10-3	GCAaataaattccGTT	19_2	545	-18
19	gcaaataaattccgtt	4-8-4	GCAAataaattcCGTT	19_1	545	-20
20	agcaaataaattccgt	4-9-3	AGCAaataaattcCGT	20_1	546	-20
21	cagagcaaataaattcc	4-10-3	CAGAgcaaataaatTCC	21_1	548	-21
22	tggacagagcaaataaat	4-11-3	TGGAcagagcaaataAAT	22_1	551	-19
23	atggacagagcaaata	4-8-4	ATGGacagagcaAATA	23_1	554	-20
24	cagaatggacagagca	2-11-3	CAgaatggacagaGCA	24_1	558	-21
25	ttctcagaatggacag	3-11-2	TTCtcagaatggacAG	25_1	562	-17
26	ctgaactttgacatag	4-8-4	CTGAactttgacATAG	26_1	663	-20
27	aagacaaacccagactga	2-13-3	AAgacaaacccagacTGA	27_1	675	-21
28	tataagacaaacccagac	4-10-4	TATAagacaaacccAGAC	28_1	678	-22
29	ttataagacaaacccaga	4-10-4	TTATaagacaaaccCAGA	29_1	679	-23
30	tgttataagacaaaccc	4-10-3	TGTTataagacaaaCCC	30_1	682	-22
31	tagaacaatggtacttt	4-9-4	TAGAacaatggtaCTTT	31_1	708	-20
32	gtagaacaatggtact	4-10-2	GTAGaacaatggtaCT	32_1	710	-19
33	aggtagaacaatggta	3-10-3	AGGtagaacaatgGTA	33_1	712	-19
34	aagaggtagaacaatgg	4-9-4	AAGAggtagaacaATGG	34_1	714	-21
35	gcatccacagtaaatt	2-12-2	GCatccacagtaaaTT	35_1	749	-17
36	gaaggttatttaattc	2-11-3	GAaggttatttaaTTC	36_1	773	-13
37	ctaatcgaatgcagca	4-9-3	CTAAtcgaatgcaGCA	37_1	805	-22
38	tacccaatctaatcga	3-10-3	TACccaatctaatCGA	38_1	813	-20
39	tagttacccaatctaa	3-10-3	TAGttacccaatcTAA	39_1	817	-19
40	catttagttacccaat	3-10-3	CATttagttacccAAT	40_1	821	-18
41	tcatttagttacccaa	3-10-3	TCAtttagttaccCAA	41_1	822	-19
42	ttcatttagttaccca	2-10-4	TTcatttagttaCCCA	42_1	823	-22
43	gaattaatttcatttagt	4-10-4	GAATtaatttcattTAGT	43_1	829	-19
44	cagtgaggaattaattt	4-9-4	CAGTgaggaattaATTT	44_1	837	-20
45	ccaacagtgaggaatt	4-8-4	CCAAcagtgaggAATT	45_1	842	-21
46	cccaacagtgaggaat	3-10-3	CCCaacagtgaggAAT	46_1	843	-22
47	tatacccaacagtgagg	2-12-3	TAtacccaacagtgAGG	47_1	846	-21
48	ttatacccaacagtgag	2-11-4	TTatacccaacagTGAG	48_1	847	-21
49	tttatacccaacagtga	3-11-3	TTTatacccaacagTGA	49_1	848	-21
50	cctttatacccaacag	3-10-3	CCTttatacccaaCAG	50_1	851	-23
51	taacctttatacccaa	4-8-4	TAACctttatacCCAA	51_1	854	-22
52	aataacctttataccca	3-10-4	AATaacctttataCCCA	52_1	855	-23
53	gtaaataacctttata	3-11-2	GTAaataacctttaTA	53_1	859	-14
54	actgtaaataacctttat	4-10-4	ACTGtaaataacctTTAT	54_1	860	-20
55	atatatatgcaatgag	3-11-2	ATAtatatgcaatgAG	55_1	903	-14
56	agatatatatgcaatg	2-12-2	AGatatatatgcaaTG	56_1	905	-12
57	gagatatatatgcaat	3-10-3	GAGatatatatgcAAT	57_1	906	-15
58	ccagagatatatatgc	2-11-3	CCagagatatataTGC	58_1	909	-19
59	caatattccagagatat	4-9-4	CAATattccagagATAT	59_1	915	-20
60	gcaatattccagagata	4-10-3	GCAAtattccagagATA	60_1	916	-22
61	agcaatattccagagat	3-11-3	AGCaatattccagaGAT	61_1	917	-22
62	cagcaatattccagag	3-9-4	CAGcaatattccAGAG	62_1	919	-22
63	aatcagcaatattccag	4-9-4	AATCagcaatattCCAG	63_1	921	-23
64	acaatcagcaatattcc	4-9-4	ACAAtcagcaataTTCC	64_1	923	-21
65	actaagtagttacacttct	2-14-3	ACtaagtagttacactTCT	65_1	957	-20
66	ctaagtagttacacttc	4-11-2	CTAAgtagttacactTC	66_1	958	-18
67	gactaagtagttacactt	3-12-3	GACtaagtagttacaCTT	67_1	959	-20
68	tgactaagtagttaca	3-9-4	TGActaagtagtTACA	68_1	962	-19
69	ctttgactaagtagtta	4-10-3	CTTTgactaagtagTTA	69_1	964	-19
70	ctctttgactaagtag	3-10-3	CTCtttgactaagTAG	70_1	967	-19
71	gctctttgactaagta	4-10-2	GCTCtttgactaagTA	71_1	968	-21
72	ccttaaatactgttgac	2-11-4	CCttaaatactgtTGAC	72_1	1060	-20
73	cttaaatactgttgac	2-12-2	CTtaaatactgttgAC	73_1	1060	-13
74	tccttaaatactgttg	3-10-3	TCCttaaatactgTTG	74_1	1062	-18
75	tctccttaaatactgtt	4-11-2	TCTCcttaaatactgTT	75_1	1063	-19
76	tatcatagttctcctt	2-10-4	TAtcatagttctCCTT	76_1	1073	-21
77	agtatcatagttctcc	3-10-3	AGTatcatagttcTCC	77_1	1075	-22
78	gagtatcatagttctc	2-11-3	GAgtatcatagttCTC	78_1	1076	-18
79	agagtatcatagttct	2-10-4	AGagtatcatagTTCT	79_1	1077	-18
79	agagtatcatagttct	3-10-3	AGAgtatcatagtTCT	79_2	1077	-19
80	cagagtatcatagttc	3-10-3	CAGagtatcatagTTC	80_1	1078	-18
81	ttcagagtatcatagt	4-10-2	TTCAgagtatcataGT	81_1	1080	-18
82	cttcagagtatcatag	3-9-4	CTTcagagtatcATAG	82_1	1081	-19
83	ttcttcagagtatcata	4-11-2	TTCTtcagagtatcaTA	83_1	1082	-19
84	tttcttcagagtatcat	3-10-4	TTTcttcagagtaTCAT	84_1	1083	-20
85	gagaaaggctaagttt	4-9-3	GAGAaaggctaagTTT	85_1	1099	-19
86	gacactcttgtacatt	2-10-4	GAcactcttgtaCATT	86_1	1213	-19
87	tgagacactcttgtaca	2-13-2	TGagacactcttgtaCA	87_1	1215	-18
88	tgagacactcttgtac	2-11-3	TGagacactcttgTAC	88_1	1216	-18
89	ctttattaaactccat	2-10-4	CTttattaaactCCAT	89_1	1266	-18
90	accaaactttattaaa	4-10-2	ACCAaactttattaAA	90_1	1272	-14
91	aaacctctactaagtg	4-10-2	AAACctctactaagTG	91_1	1288	-16
92	agattaagacagttga	2-11-3	AGattaagacagtTGA	92_1	1310	-16
93	aagtaggagcaagaggc	2-12-3	AAgtaggagcaagaGGC	93_1	1475	-22
94	aaagtaggagcaagagg	4-10-3	AAAGtaggagcaagAGG	94_1	1476	-20
95	gttaagcagccaggag	2-12-2	GTtaagcagccaggAG	95_1	1806	-20
96	agggtaggatgggtag	2-12-2	AGggtaggatgggtAG	96_1	1842	-20
97	aagggtaggatgggta	3-11-2	AAGggtaggatgggTA	97_1	1843	-20
98	caagggtaggatgggt	2-12-2	CAagggtaggatggGT	98_2	1844	-20
98	caagggtaggatgggt	3-11-2	CAAgggtaggatggGT	98_1	1844	-21
99	ccaagggtaggatggg	2-12-2	CCaagggtaggatgGG	99_1	1845	-22
100	tccaagggtaggatgg	2-12-2	TCcaagggtaggatGG	100_1	1846	-20
101	cttccaagggtaggat	4-10-2	CTTCcaagggtaggAT	101_1	1848	-21
102	atcttccaagggtagga	3-12-2	ATCttccaagggtagGA	102_1	1849	-22
103	agaagtgatggctcatt	2-11-4	AGaagtgatggctCATT	103_1	1936	-21
104	aagaagtgatggctcat	3-10-4	AAGaagtgatggcTCAT	104_1	1937	-21
105	gaagaagtgatggctca	3-11-3	GAAgaagtgatggcTCA	105_1	1938	-21
106	atgaaatgtaaactggg	4-9-4	ATGAaatgtaaacTGGG	106_1	1955	-21
107	caatgaaatgtaaactgg	4-10-4	CAATgaaatgtaaaCTGG	107_1	1956	-20
108	gcaatgaaatgtaaactg	4-10-4	GCAAtgaaatgtaaACTG	108_1	1957	-20
109	agcaatgaaatgtaaact	4-10-4	AGCAatgaaatgtaAACT	109_1	1958	-20
110	gagcaatgaaatgtaaac	4-10-4	GAGCaatgaaatgtAAAC	110_1	1959	-19
111	tgaattcccatatccga	2-12-3	TGaattcccatatcCGA	111_1	1992	-22
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651	gcaaatcaactccatc	3-10-3	GCAaatcaactccATC	651_1	15896	-20
652	gtgcaaatcaactcca	3-10-3	GTGcaaatcaactCCA	652_1	15898	-22
653	caattatttctttgtgc	4-10-3	CAATtatttctttgTGC	653_1	15910	-21
654	tggcaacaattatttctt	3-11-4	TGGcaacaattattTCTT	654_1	15915	-21
655	gctggcaacaattatt	3-9-4	GCTggcaacaatTATT	655_1	15919	-21
656	atccatttctactgcc	4-10-2	ATCCatttctactgCC	656_1	15973	-24
657	taatatctattgatttcta	4-11-4	TAATatctattgattTCTA	657_1	15988	-20
658	tcaatagtgtagggca	2-12-2	TCaatagtgtagggCA	658_1	16093	-18
659	ttcaatagtgtagggc	3-11-2	TTCaatagtgtaggGC	659_1	16094	-19
660	aggttaattaattcaatag	4-11-4	AGGTtaattaattcaATAG	660_1	16102	-21
661	catttgtaatccctag	3-10-3	CATttgtaatcccTAG	661_2	16163	-20
661	catttgtaatccctag	3-9-4	CATttgtaatccCTAG	661_1	16163	-22
662	acatttgtaatcccta	3-10-3	ACAtttgtaatccCTA	662_1	16164	-20
663	aacatttgtaatccct	2-10-4	AAcatttgtaatCCCT	663_2	16165	-21
663	aacatttgtaatccct	3-9-4	AACatttgtaatCCCT	663_1	16165	-22
664	taaatttcaagttctg	2-11-3	TAaatttcaagttCTG	664_1	16184	-14
665	gtttaaatttcaagttct	3-11-4	GTTtaaatttcaagTTCT	665_1	16185	-19
666	ccaagtttaaatttcaag	4-10-4	CCAAgtttaaatttCAAG	666_1	16189	-21
667	acccaagtttaaatttc	4-9-4	ACCCaagtttaaaTTTC	667_1	16192	-22
668	catacagtgacccaagttt	2-14-3	CAtacagtgacccaagTTT	668_1	16199	-23
669	acatcccatacagtga	2-11-3	ACatcccatacagTGA	669_1	16208	-21
670	agcacagctctacatc	2-10-4	AGcacagctctaCATC	670_1	16219	-22
671	atatagcacagctcta	3-9-4	ATAtagcacagcTCTA	671_1	16223	-21
672	tccatatagcacagct	3-11-2	TCCatatagcacagCT	672_1	16226	-22
673	atttccatatagcaca	3-9-4	ATTtccatatagCACA	673_1	16229	-20
674	tttatttccatatagca	4-9-4	TTTAtttccatatAGCA	674_1	16231	-22
675	tttatttccatatagc	3-10-3	TTTatttccatatAGC	675_1	16232	-18
676	aaggagaggagattatg	4-9-4	AAGGagaggagatTATG	676_1	16409	-21
677	agttcttgtgttagct	3-11-2	AGTtcttgtgttagCT	677_1	16456	-21
678	gagttcttgtgttagc	2-12-2	GAgttcttgtgttaGC	678_1	16457	-20
679	attaattatccatccac	3-10-4	ATTaattatccatCCAC	679_1	16590	-21
680	atcaattaattatccatc	3-11-4	ATCaattaattatcCATC	680_1	16593	-19
681	agaatcaattaattatcc	3-12-3	AGAatcaattaattaTCC	681_1	16596	-18
682	tgagataccgtgcatg	2-12-2	TGagataccgtgcaTG	682_1	16656	-18
683	aatgagataccgtgca	2-10-4	AAtgagataccgTGCA	683_1	16658	-21
684	ctgtggttaggctaat	3-11-2	CTGtggttaggctaAT	684_1	16834	-19
685	aagagtaagggtctgtggtt	1-17-2	AagagtaagggtctgtggTT	685_1	16842	-21
686	gatgggttaagagtaa	4-9-3	GATGggttaagagTAA	686_1	16854	-19
687	agcagatgggttaaga	3-11-2	AGCagatgggttaaGA	687_1	16858	-20
688	tgtaaacatttgtagc	2-10-4	TGtaaacatttgTAGC	688_1	16886	-19
689	cctgcttataaatgta	3-11-2	CCTgcttataaatgTA	689_1	16898	-19
690	tgccctgcttataaat	4-10-2	TGCCctgcttataaAT	690_1	16901	-23
691	tcttcttagttcaata	2-12-2	TCttcttagttcaaTA	691_1	16935	-15
692	tggtttctaactacat	2-10-4	TGgtttctaactACAT	692_1	16980	-18
693	agtttggtttctaacta	2-12-3	AGtttggtttctaaCTA	693_1	16983	-19
694	gaatgaaacttgcctg	3-10-3	GAAtgaaacttgcCTG	694_1	17047	-18
695	attatccttacatgat	3-10-3	ATTatccttacatGAT	695_1	17173	-17
696	gtacccaattatcctt	2-11-3	GTacccaattatcCTT	696_1	17180	-21
697	tgtacccaattatcct	3-10-3	TGTacccaattatCCT	697_1	17181	-24
698	ttgtacccaattatcc	2-11-3	TTgtacccaattaTCC	698_1	17182	-20
699	tttgtacccaattatc	3-11-2	TTTgtacccaattaTC	699_1	17183	-17
700	agcagcaggttatatt	4-10-2	AGCAgcaggttataTT	700_1	17197	-22
701	tgggaagtggtctggg	3-10-3	TGGgaagtggtctGGG	701_1	17292	-25
702	ctggagagtgataata	3-11-2	CTGgagagtgataaTA	702_1	17322	-17
703	aatgctggattacgtc	4-10-2	AATGctggattacgTC	703_1	17354	-19
704	caatgctggattacgt	2-11-3	CAatgctggattaCGT	704_1	17355	-19
705	ttgttcagaagtatcc	2-10-4	TTgttcagaagtATCC	705_1	17625	-19
706	gatgatttgcttggag	2-10-4	GAtgatttgcttGGAG	706_1	17646	-21
707	gaaatcattcacaacc	3-10-3	GAAatcattcacaACC	707_1	17860	-17
708	ttgtaacatctactac	3-10-3	TTGtaacatctacTAC	708_1	17891	-16
709	cattaagcagcaagtt	3-11-2	CATtaagcagcaagTT	709_1	17923	-17
710	ttactagatgtgagca	3-11-2	TTActagatgtgagCA	710_1	17942	-18
711	tttactagatgtgagc	2-11-3	TTtactagatgtgAGC	711_1	17943	-18
712	gaccaagcaccttaca	3-11-2	GACcaagcaccttaCA	712_1	17971	-22
713	agaccaagcaccttac	3-10-3	AGAccaagcacctTAC	713_1	17972	-22
714	atgggttaaataaagg	2-10-4	ATgggttaaataAAGG	714_1	18052	-15
715	tcaaccagagtattaa	2-12-2	TCaaccagagtattAA	715_1	18067	-13
716	gtcaaccagagtatta	3-11-2	GTCaaccagagtatTA	716_1	18068	-18
717	attgtaaagctgatat	2-11-3	ATtgtaaagctgaTAT	717_1	18135	-14
718	cacataattgtaaagc	2-10-4	CAcataattgtaAAGC	718_1	18141	-16
719	gaggtctgctatttac	2-11-3	GAggtctgctattTAC	719_1	18274	-19
720	tgtagattcaatgcct	2-11-3	TGtagattcaatgCCT	720_1	18404	-20
721	cctcattatactatga	2-11-3	CCtcattatactaTGA	721_1	18456	-19
722	ccttatgctatgacac	2-12-2	CCttatgctatgacAC	722_1	18509	-18
723	tccttatgctatgaca	4-10-2	TCCTtatgctatgaCA	723_1	18510	-22
724	aagatgtttaagtata	3-10-3	AAGatgtttaagtATA	724_1	18598	-13
725	ctgattattaagatgt	2-10-4	CTgattattaagATGT	725_1	18607	-17
726	tggaaaggtatgaatt	2-12-2	TGgaaaggtatgaaTT	726_1	18808	-13
727	acttgaatggcttgga	2-12-2	ACttgaatggcttgGA	727_1	18880	-18
728	aacttgaatggcttgg	3-10-3	AACttgaatggctTGG	728_1	18881	-19
729	caatgtgttactattt	4-10-2	CAATgtgttactatTT	729_1	19004	-16
730	acaatgtgttactatt	3-10-3	ACAatgtgttactATT	730_1	19005	-15
731	catctgctatataaga	4-10-2	CATCtgctatataaGA	731_1	19063	-18
732	cctagagcaaatactt	4-10-2	CCTAgagcaaatacTT	732_1	19223	-20
733	cagagttaataataag	3-10-3	CAGagttaataatAAG	733_1	19327	-13
734	gttcaagcacaacgaa	4-10-2	GTTCaagcacaacgAA	734_1	19493	-18
735	agggttcaagcacaac	2-11-3	AGggttcaagcacAAC	735_1	19496	-18
736	tgttggagacactgtt	2-12-2	TGttggagacactgTT	736_1	19677	-17
737	aaggaggagttaggac	3-11-2	AAGgaggagttaggAC	737_1	19821	-18
738	ctatgccatttacgat	4-10-2	CTATgccatttacgAT	738_1	19884	-21
739	tcaaatgcagaattag	2-12-2	TCaaatgcagaattAG	739_1	19913	-12
740	agtgacaatcaaatgc	2-10-4	AGtgacaatcaaATGC	740_1	19921	-18
741	aagtgacaatcaaatg	2-11-3	AAgtgacaatcaaATG	741_1	19922	-12
742	gtgtaccaagtaacaa	3-11-2	GTGtaccaagtaacAA	742_1	19978	-16
743	tgggatgttaaactga	3-10-3	TGGgatgttaaacTGA	743_1	20037	-20

基序序列代表存在於寡核苷酸中之核鹼基之鄰接序列。設計係指間隙聚體設計F-G-F’，其中每一數值代表連續經修飾核苷(例如2’修飾核苷)之數量(第一數值=5’側翼)，隨後係DNA核苷數量(第二數值=間隙區)，隨後係經修飾核苷(例如2’修飾核苷)之數量(第三數值=3’側翼)，視情況前接或後接有DNA及LNA之其他重複區域，該等重複區域未必係與靶核酸互補之鄰接序列之一部分。寡核苷酸化合物代表基序序列之特定設計。大寫字母代表β-D-氧基LNA核苷，小寫字母代表DNA核苷，所有LNA C皆係5-甲基胞嘧啶，所有核苷間鏈接皆係硫代磷酸酯核苷間鏈接。表6：靶向小鼠PD-L1轉錄物(SEQ ID NO: 4)之寡核苷酸、該等寡核苷酸之設計以及基於基序序列設計之特定寡核苷酸化合物(由CMP ID NO指示)。

SEQ ID NO	基序序列	設計	寡核苷酸化合物	CMP ID NO	SEQ ID NO: 4 上之起點	dG
744	agtttacattttctgc	3-10-3	AGTttacattttcTGC	744_1	4189	-20
745	tatgtgaagaggagag	3-10-3	TATgtgaagaggaGAG	745_1	7797	-19
746	cacctttaaaacccca	3-10-3	CACctttaaaaccCCA	746_1	9221	-23
747	tcctttataatcacac	3-10-3	TCCtttataatcaCAC	747_1	10386	-19
748	acggtattttcacagg	3-10-3	ACGgtattttcacAGG	748_1	12389	-21
749	gacactacaatgagga	3-10-3	GACactacaatgaGGA	749_1	15088	-20
750	tggtttttaggactgt	3-10-3	TGGtttttaggacTGT	750_1	16410	-21
751	cgacaaattctatcct	3-10-3	CGAcaaattctatCCT	751_1	18688	-20
752	tgatatacaatgctac	3-10-3	TGAtatacaatgcTAC	752_1	18735	-16
753	tcgttgggtaaattta	3-10-3	TCGttgggtaaatTTA	753_1	19495	-17
754	tgctttataaatggtg	3-10-3	TGCtttataaatgGTG	754_1	19880	-19

基序序列代表存在於寡核苷酸中之核鹼基之鄰接序列。設計係指間隙聚體設計F-G-F’，其中每一數值代表連續經修飾核苷(例如2’修飾核苷)之數量(第一數值=5’側翼)，隨後係DNA核苷數量(第二數值=間隙區)，隨後係經修飾核苷(例如2’修飾核苷)之數量(第三數值=3’側翼)，視情況前接或後接有DNA及LNA之其他重複區域，該等重複區域未必係與靶核酸互補之鄰接序列之一部分。寡核苷酸化合物代表基序序列之特定設計。大寫字母代表β-D-氧基LNA核苷，小寫字母代表DNA核苷，所有LNA C皆係5-甲基胞嘧啶，所有核苷間鏈接皆係硫代磷酸酯核苷間鏈接。表7：寡核苷酸基序序列及具有5’ ca生物可裂解連接體之反義化合物。

SEQ ID NO	基序序列	具有ca連接體之寡核苷酸化合物	CMP ID NO
755	caagtttacattttctgc	c _oa _oAGTttacattttcTGC	755_1
756	catatgtgaagaggagag	c _oa _oTATgtgaagaggaGAG	756_1
757	cacctttaaaacccca	c _oa _oCACctttaaaaccCCA	757_1
758	catcctttataatcacac	c _oa _oTCCtttataatcaCAC	758_1
759	caacggtattttcacagg	c _oa _oACGgtattttcacAGG	759_1
760	cagacactacaatgagga	c _oa _oGACactacaatgaGGA	760_1
761	catggtttttaggactgt	c _oa _oTGGtttttaggacTGT	761_1
762	cacgacaaattctatcct	c _oa _oCGAcaaattctatCCT	762_1
763	catgatatacaatgctac	c _oa _oTGAtatacaatgcTAC	763_1
764	catcgttgggtaaattta	c _oa _oTCGttgggtaaatTTA	764_1
765	catgctttataaatggtg	c _oa _oTGCtttataaatgGTG	765_1
766	caacaaataatggttactct	c _oa _oACAAataatggttaCTCT	766_1
767	cacagattgatggtagtt	c _oa _oCAGAttgatggtagTT	767_1
768	cacctatttaacatcagac	c _oa _oCCtatttaacatcAGAC	768_1
769	cactaattgtagtagtactc	c _oa _oCTAattgtagtagtaCTC	769_1
770	caataaacatgaatctctcc	c _oa _oATaaacatgaatctCTCC	770_1

大寫字母代表β-D-氧基LNA核苷，小寫字母代表DNA核苷，所有LNA C皆係5-甲基胞嘧啶，下標o代表磷酸二酯核苷間鏈接且除非另外指示，否則其他核苷間鏈接係硫代磷酸酯核苷間鏈接。表8：GalNAc偶聯之反義寡核苷酸化合物。

反義寡核苷酸偶聯物	CMP ID NO
GN2-C6 _oc _oa _oAGTttacattttcTGC	755_2
GN2-C6 _oc _oa _oTATgtgaagaggaGAG	756_2
GN2-C6 _oc _oa _oCACctttaaaaccCCA	757_2
GN2-C6 _oc _oa _oTCCtttataatcaCAC	758_2
GN2-C6 _oc _oa _oACGgtattttcacAGG	759_2
GN2-C6 _oc _oa _oGACactacaatgaGGA	760_2
GN2-C6 _oc _oa _oTGGtttttaggacTGT	761_2
GN2-C6 _oc _oa _oCGAcaaattctatCCT	762_2
GN2-C6 _oc _oa _oTGAtatacaatgcTAC	763_2
GN2-C6 _oc _oa _oTCGttgggtaaatTTA	764_2
GN2-C6 _oc _oa _oTGCtttataaatgGTG	765_2
GN2-C6 _oc _oa _oACAAataatggttaCTCT	766_2
GN2-C6 _oc _oa _oCAGAttgatggtagTT	767_2
GN2-C6 _oc _oa _oCCtatttaacatcAGAC	768_2
GN2-C6 _oc _oa _oCTAattgtagtagtaCTC	769_2
GN2-C6 _oc _oa _oATaaacatgaatctCTCC	770_2

GN2代表圖3中所展示之三價GalNAc簇，C6代表具有6個碳之胺基烷基，大寫字母代表β-D-氧基LNA核苷，小寫字母代表DNA核苷，所有LNA C皆係5-甲基胞嘧啶，下標o代表磷酸二酯核苷鏈接且除非另外指示，否則核苷間鏈接係硫代磷酸酯核苷間鏈接。代表一些分子之化學圖式展示於圖4至8中。 AAV/HBV小鼠模型 巴斯德 (Pasteur) 模型：產生HLA-A2.1-/HLA-DR1-轉基因H-2種類I-/種類II-剔除(在本文中稱為HLA-A2/DR1)小鼠且在巴斯德研究院(Institut Pasteur)處飼餵。該等小鼠代表用於人類免疫功能研究之並無任何小鼠MHC反應干擾之活體內實驗模型(Pajot等人，2004 Eur J Immunol. 34(11):3060-9)。在該等研究中使用攜載可複製HBV DNA基因體之腺相關病毒(AAV)載體AAV血清型2/8。在無菌磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中稀釋AAV-HBV載體(GVPN批號6163)以達到5 × 10 ¹¹vg/mL之效價。在尾部靜脈中經靜脈內(i.v.)向小鼠注射100μL此經稀釋溶液(劑量/小鼠：5 × 10 ¹⁰vg)。在攜帶HBV之小鼠之血液中檢測含有HBV DNA之完整病毒顆粒。在最多一年內檢測肝中之HBcAg以及血液中之HBV循環蛋白質HBeAg及HBsAg。在AAV2/8-HBV轉導小鼠中，HBsAg、HBeAg及HBV DNA在血清中持續至少一年(Dion等人，2013 J Virol 87:5554-5563)。 上海模型 ：在此模型中，感染攜載HBV基因體(AAV/HBV)之重組腺相關病毒(AAV)之小鼠維持穩定病毒血症及抗原血症30週以上(Dan Yang等人， 2014 Cellular & Molecular Immunology 11, 71–78)。自SLAC (Shanghai Laboratory Animal Center of Chinese Academy of Sciences)購買無特定病原體之雄性C57BL/6小鼠(4-6週齡)且飼養於個別通風籠中之動物護理設施中。遵循如由WuXi IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee, WUXI IACUC方案編號R20131126-小鼠)所指示之動物護理及使用導則。使小鼠適應新環境3天且根據實驗設計進行分組。在PBS中稀釋重組AAV-HBV，每一注射使用200 µL。此重組病毒攜載1.3個HBV基因體(基因型D，血清型ayw)之拷貝。在第0天，經由尾部靜脈向所有小鼠注射200 µL AAV-HBV。在AAV注射之後第6、13及20天，下頜下對所有小鼠進行抽血(0.1 ml血液/小鼠)以用於收集血清。在注射後第22天，將患有穩定病毒血症之小鼠備用於寡核苷酸治療。寡核苷酸可未偶聯或偶聯GalNAc。 DNA 疫苗質體DNA無內毒素且由Plasmid-Factory (Germany)製得。pCMV-S2.S ayw編碼HBsAg (基因型D)之preS2及S結構域，且其表現由巨細胞病毒極早期基因啟動子控制(Michel等人，1995 Proc Natl Acad Sci U S A 92:5307-5311)。pCMV-HBc編碼攜載肝炎核心(HBc) Ag之HBV衣殼(Dion等人，2013 J Virol 87:5554-5563)。如本文中所闡述使用DNA疫苗實施治療。在接種疫苗之前5天，向小鼠之肌肉中注射心臟毒素(CaTx, Latoxan refL81-02, 50 µl/肌肉)。CaTx使肌肉纖維去極化以誘導細胞退化，在注射後5天，出現新肌肉纖維且接受DNA疫苗以針對轉染獲得較佳效能。等量混合pCMV-S2.S ayw及pCMVCore (各1 mg/ml)且使小鼠在麻醉下(100 µL 12.5 mg/mL氯胺酮(ketamine)、1.25 mg/mL甲苯噻嗪(xylazine))藉由向經心臟毒素處理之脛骨前肌中進行雙側肌內注射來接受總共100 μg該混合物，如先前在Michel等人，1995 Proc Natl Acad Sci U S A 92:5307-5311中所闡述。抗 PD-L1 抗體此係在Genetech處內部產生之小鼠抗小鼠PD-L1 IgG1抗體純系6E11。其係交叉阻斷阿替珠單抗(atezolizumab)且與在Roche處內部產生之阿替珠單抗具有類似活體外阻斷活性之替代抗體。藉由腹膜腔內(i.p.)注射在12.5 µg/g之劑量下來投與抗體。 寡核苷酸合成業內通常已知寡核苷酸合成。下文係可應用之方案。可藉由針對所使用裝置、載體及濃度略微改變之方法來產生本發明寡核苷酸。在尿苷通用載體上使用亞磷醯胺方式在Oligomaker 48上以1 μmol規模來合成寡核苷酸。在合成結束時，使用氨水溶液在60℃下經5-16小時自固體載體裂解寡核苷酸。藉由反相HPLC (RP-HPLC)或藉由固相萃取純化寡核苷酸且藉由UPLC進行表徵，且藉由ESI-MS進一步證實分子質量。 寡核苷酸之延長 :藉由使用經5’-O-DMT保護之亞醯胺化物於乙腈之0.1 M溶液及於乙腈中之DCI (4,5-二氰基咪唑) (0.25 M)作為活化劑來偶合β-氰基乙基-亞磷醯胺(DNA-A(Bz)、DNA- G(ibu)、DNA- C(Bz)、DNA-T、LNA-5-甲基-C(Bz)L、NA-A(Bz)、LNA- G(dmf)或LNA-T)。對於最終循環而言，可使用具有期望修飾之亞磷醯胺，例如用於連接偶聯物基團之C6連接體或偶聯物基團本身。藉由使用氫化黃元素(0.01 M於9:1乙腈/吡啶中)來實施硫醇化以用於引入硫代磷酸酯鏈接。可使用於7:2:1 THF/吡啶/水中之0.02 M碘來引入磷酸二酯鏈接。其餘試劑係通常用於寡核苷酸合成者。對於後固相合成偶聯而言，可將市售C6胺基連接體亞磷醯胺用於固相合成之最後循環中，且在去保護及自固體載體裂解之後，分離胺基連接之去保護寡核苷酸。經由使用標準合成方法活化官能基來引入偶聯物。或者，可在仍位於固體載體上時藉由使用GalNAc-或GalNAc簇亞磷醯胺將偶聯物部分添加至寡核苷酸，如PCT/EP2015/073331或EP appl. NO. 15194811.4中所闡述。藉由 RP-HPLC 進行之純化 ：藉由製備型RP-HPLC在Phenomenex Jupiter C18 10µ 150×10 mm管柱上來純化粗製化合物。使用0.1 M pH 8乙酸銨及乙腈作為緩衝劑且流速為5 mL/min。凍乾收集部分以得到通常白色固體形式之純化化合物。 縮寫：DCI： 4,5-二氰基咪唑 DCM：二氯甲烷 DMF：二甲基甲醯胺 DMT： 4,4’-二甲氧基三苯甲基 THF：四氫呋喃 Bz：苯甲醯基 Ibu：異丁醯基 RP-HPLC：反相高效液相層析 T _m 分析將寡核苷酸及RNA靶(磷酸酯連接，PO)雙螺旋體在500 ml無RNase水中稀釋至3 mM且與500 ml 2×T _m緩衝液(200mM NaCl、0.2mM EDTA、20mM pH 7.0磷酸鈉)混合。將溶液加熱至95℃保持3 min且然後將其在室溫下退火30 min。在配備有帕耳帖穩定程控器(Peltier temperature programmer) PTP6之λ 40 UV/VIS分光光度計上使用PE Templab軟體(Perkin Elmer)量測雙螺旋體熔融溫度(T _m)。將溫度自20℃斜升至95℃且然後斜降至25℃，且在260 nm下記錄吸收。使用熔融及退火之第一導數及局部最大值來評價雙螺旋體T _m。 組織特異性活體外連接體裂解分析使用相關組織(例如肝或腎)及血清之均質物對具有擬測試生物可裂解連接體(例如DNA磷酸二酯連接體(PO連接體))之經FAM標記之寡核苷酸實施活體外裂解。自適宜動物(例如小鼠、猴、豬或大鼠)收集組織及血清試樣且在均質化緩衝液(0.5% Igepal CA-630、25 mM pH 8.0 Tris、100 mM pH 8.0 NaCl (使用1 N NaOH調節)。向組織均質物及血清中摻加寡核苷酸直至濃度為200 µg/g組織。將試樣在37℃下培育24小時且然後使用苯酚-氯仿萃取試樣。在Dionex Ultimate 3000上使用Dionex DNApac p-100管柱及介於10mM - 1 M過氯酸鈉(pH 7.5)之間之梯度對溶液實施AIE HPLC分析。針對標準使用615 nm下螢光檢測器及260 nm下uv檢測器來測定經裂解寡核苷酸及未裂解寡核苷酸之含量。 S1 核酸酶裂解分析在S1核酸酶提取物或血清中對具有S1核酸酶易感連接體(例如DNA磷酸二酯連接體(PO連接體))之經FAM標記之寡核苷酸實施活體外裂解。藉由S1核酸酶在核酸酶緩衝液(60 U pr.100 µL)中對100 µM寡核苷酸實施活體外裂解20分鐘及120分鐘。藉由將EDTA添加至緩衝液溶液中來停止酶促活性。在Dionex Ultimate 3000上使用Dionex DNApac p-100管柱及介於10mM - 1 M過氯酸鈉(pH 7.5)之間之梯度對溶液實施AIE HPLC分析。針對標準使用615 nm下螢光檢測器及260 nm下uv檢測器來測定經裂解寡核苷酸及未裂解寡核苷酸之含量。 肝單核細胞之製備如下文所闡述且根據由Tupin等人，2006 Methods Enzymol 417:185-201所闡述之方法(具有輕微修改)來製備來自AAV/HBV小鼠之肝臟細胞。在小鼠安樂死之後，經由肝門靜脈使用具有G25針之注射器向肝灌注10 ml無菌PBS。在器官發白時，在漢克氏平衡鹽溶液(Hank's Balanced Salt Solution，HBSS) (GIBCO® HBSS, 24020) + 5 %去補體胎牛血清(FCS)中收穫器官。經由100 μm細胞過濾器(BD Falcon, 352360)輕微壓製所收穫肝且將細胞懸浮於30 ml HBSS + 5 % FCS中。將細胞懸浮液在50 g下離心5 min。然後將上清液在289 g及4℃下離心10 min。在離心之後，棄除上清液且將糰粒在室溫下再懸浮於15 mL 35 %等滲Percoll溶液(稀釋至RPMI 1640 (GIBCO, 31870)中之GE Healthcare Percoll 17-0891-01號)且轉移至15 ml管中。將細胞在1360g及室溫下進一步離心25 min。藉由抽吸棄除上清液且使用HBSS + 5 % FCS將含有單核細胞之糰粒洗滌兩次。在完整培養基(α-最小必需培養基(Gibco, 22571)，其補充有10 % FCS (Hyclone, SH30066號，批號APG21570)、100 U/mL青黴素(penicillin) + 100 μg/mL鏈黴素(streptomycin) + 0.3 mg/mL L-麩醯胺酸(Gibco, 10378)、1X非必須胺基酸(Gibco, 11140)、10 mM Hepes (Gibco, 15630)、1 mM丙酮酸鈉(Gibco, 11360)及50 μM β-巰基乙醇(LKB, 1830))中培養細胞。 細胞之表面標記將細胞接種於U形底96孔板中並使用PBS FACS (含有1 %牛血清白蛋白及0.01%疊氮化鈉之PBS)洗滌。將細胞與5 μL含有大鼠抗小鼠CD16/CD32抗體及可固定黃色存活標記物LD (Thermofisher, L34959)之PBS FACS在4℃下於暗處一起培育10 min。然後，使用25 μL含有針對NK P46 BV421 (大鼠Mab抗小鼠NK P46，Biolegend, 137612)及F4/80 (大鼠Mab抗小鼠F4/80 FITC, BD Biolegend, 123108)之單株抗體(Mab)之PBS FACS將細胞在4℃下於暗處染色20 min且亦添加兩種補充表面標記物：PD1 (大鼠Mab抗小鼠PD1 PE，BD Biosciences, 551892)及PDL1 (大鼠Mab抗小鼠PDL1 BV711，Biolegend, 124319)。 細胞內細胞介素染色 (ICS) 分析對脾細胞及肝單核細胞實施ICS分析。將細胞接種於U形96孔板中。將含有細胞之板在37℃下於僅完整培養基(作為陰性對照)中或與表9中所闡述之肽(在2 μg/ml之濃度下)過夜培育。在培育一小時之後添加2μg/mL佈雷菲德菌素A (Brefeldin A) (Sigma, B6542)。在過夜培養之後，使用PBS FACS洗滌細胞且與5 μL含有大鼠抗小鼠CD16/CD32抗體及可固定黃色存活標記物LD (Thermofisher, L34959)之PBS FACS在4℃下於暗處一起培育10min。然後，使用25 μL含有Mab之PBS FACS將細胞在4℃下於暗處染色20 min。混合物係由針對CD3 (倉鼠Mab抗小鼠CD3-PerCP，BD Biosciences, 553067)、CD8 (大鼠Mab抗小鼠CD8-APC-H7，BD Biosciences, 560182)、CD4 (大鼠Mab抗小鼠CD4-PE-Cy7，BD Biosciences, 552775)及NK細胞 (大鼠Mab抗小鼠NK P46 BV421，Biolegend, 137612)之單株抗體構成。在洗滌數次之後固定細胞且使用Cytofix/Cytoperm在室溫下於暗處滲透20 min，使用Perm/Wash溶液(BD Biosciences, 554714)在4℃下洗滌。在4℃下於暗處使用針對IFNγ (大鼠Mab抗小鼠IFNγ-APC，純系XMG1.2,BD Biosciences, 554413)及腫瘤壞死因子α (TNFα) (大鼠Mab抗小鼠TNFα-FITC，純系MP6-XT22；1/250 (BD Biosciences 554418)之抗體實施細胞內細胞介素染色30 min。在藉由流式細胞術使用MACSQuant分析儀進行分析之前，使用Perm/Wash洗滌細胞且再懸浮於含有1%甲醛之PBS FACS中。選通CD3+CD8+CD4-及細胞CD3+CD8-CD4+且呈現於點狀圖上。定義兩個區域以選通用於每一細胞介素之陽性細胞。將該等閘門中所發現之事件數除以親代群體中之事件總數以得到反應性T細胞之百分比。對於每一小鼠而言，在單獨培養基中所獲得之百分比可視為背景且自使用肽刺激獲得之百分比扣除。根據實驗背景來定義陽性臨限值，亦即在單獨培養基條件中針對每一組所獲得染色細胞之平均百分比+兩個標准偏差。僅代表至少5個事件之細胞介素之百分比可視為陽性。表9：含於HBV核心蛋白及HBsAg之套膜蛋白結構域(S2+S)中之HLA-A2/DR1限制性表位。

蛋白質	起始位置	終止位置	序列	HLA 限制	參考文獻
核心	18	27	FLPSDFFPSV (SEQ ID NO: 773)	A2	Bertoletti等人， Gastroenterology 1997;112:193-199
111	125	GRETVLEYLVSFGVW (SEQ ID NO: 774)	DR1	Bertoletti等人， Gastroenterology 1997;112:193-199
套膜蛋白(S2+S)	114	128	TTFHQTLQDPRVRGL (SEQ ID NO: 775)	DR1	Pajot等人，Microbes Infect 2006;8:2783-2790。
179	194	QAGFFLLTRILTIPQS (SEQ ID NO: 776)	A2 + DR1	Pajot等人，Microbes Infect 2006;8:2783-2790。
183	191	FLLTRILTI (SEQ ID NO: 777)	A2	Sette等人，J Immunol 1994;153:5586-5592。
200	214	TSLNFLGGTTVCLGQ (SEQ ID NO: 778)	A2 + DR1	Pajot等人，Microbes Infect 2006;8:2783-2790。
204	212	FLGGTTVCL (SEQ ID NO: 779)	A2	Rehermann等人，J Exp Med 1995;181: 1047-1058。
335	343	WLSLLVPFV (SEQ ID NO: 780)	A2	Nayersina等人，J Immunol 1993;150: 4659-4671。
337	357	SLLVPFVQWFVGLSPTVWLSV (SEQ ID NO: 781)	A2 + DR1	Loirat等人，J Immunol 2000;165: 4748-4755
348	357	GLSPTVWLSV (SEQ ID NO: 782)	A2	Loirat等人，J Immunol 2000;165: 4748-4755
370	379	SILSPFLPLL (SEQ ID NO: 783)	A2	Mizukoshi等人，J Immunol 2004;173: 5863-5871。

實例1 測試活體外效能在人類PD-L1轉錄物中主要使用16至20具體間隙聚體來實施基因步移。在活體外實驗中於人類白血病單核球細胞系THP1及人類非何傑金氏K淋巴瘤(non-Hodgkin's K lymphoma)細胞系(KARPAS-299)中實施效能測試。 細胞系THP1及Karpas-299細胞系最初係購自European Collection of Authenticated Cell Cultures (ECACC)且如由供應商所推薦在37℃及5% CO ₂下維持於加濕培育器中。 寡核苷酸效能將THP-1細胞(3.104 in RPMI-GLutamax, 10% FBS, 1% Pen-Strep (Thermo Fisher Scientific)添加至96孔圓底板中之寡核苷酸(4-5 ul)中且以100 µl/孔之最終體積培養6天。在一種單一濃度(20 µM)下及在自25 µM至0.004 µM之劑量範圍濃度(1:3稀釋於水中)來篩選寡核苷酸。根據製造商說明書使用MagNA Pure 96 Cellular RNA大體積套組在MagNA Pure 96系統(Roche Diagnostics)上來提取總mRNA。對於基因表現分析而言，使用TaqMan RNA-to-ct 1-Step套組(Thermo Fisher Scientific)在QuantStudio機器(Applied Biosystems)上利用靶向人類PDL1之預設計Taqman引子及用作內源性對照之ACTB (Thermo Fisher Scientific)來實施RT-qPCR。使用2(-Delta Delta C(T))方法計算相對PD-L1 mRNA表現程度且將抑制百分比(呈%形式)與對照試樣(未處理細胞)進行比較。在RPMI 1640、2 mM麩醯胺酸及20% FBS (Sigma)中培養Karpas-299細胞。將細胞以10000個細胞/孔平鋪於96孔板中，培育24小時，然後添加溶於PBS中之寡核苷酸。單一劑量中之寡核苷酸之最終濃度為5 µM，最終培養體積為100 µl/孔或以於100 µL培養體積中自50 µM、15.8 µM、5.0 µM、1.58 µM、0.5 µM、0.158 µM、0.05 µM至0.0158 µM之劑量反應範圍來添加。在添加寡核苷酸化合物之後3天收穫細胞且根據製造商說明書使用PureLink Pro 96 RNA純化套組(Ambion)來提取RNA。根據製造商說明書使用M-MLT逆轉錄酶、隨機十聚體RETROscript、RNase抑制劑(Ambion)及100 mM dNTP組(Invitrogen，PCR等級)來合成cDNA。對於基因表現分析而言，使用TaqMan Fast Advanced Master Mix (2×) (Ambion)以雙螺旋體設置利用TaqMan引子分析針對PD-L1 (Applied Biosystems；Hs01125299_m1)及TBP (Applied Biosystems；4325803)來實施qPCR。相對PD-L1 mRNA表現程度以對照試樣(經PBS處理細胞)之%形式展示於表10中。表10：抗PD-L1化合物在THP1及KARPAS-299細胞系中之活體外效能(來自n=3個實驗之平均值)。將PD-L1 mRNA含量正規化至KARPAS-299細胞中之TBP或THP1細胞中之ACTB且展示為對照% (經PBS處理之細胞)。

CMP ID NO	KARPAS-299 細胞 5 µM CMP	THP1 細胞 20 µM CMP	化合物(CMP)	SEQ ID NO 1 上之起點
% mRNA of control	sd	% mRNA of control	s d
5_1	50	1	32	11	TAattggctctacTGC	236
6_1	25	5	9	6	TCGCataagaatgaCT	371
7_1	29	2	15	5	TGaacacacagtcgCA	382
8_1	27	7	3	1	CTGaacacacagtCGC	383
9_1	23	4	11	3	TCTgaacacacagtCG	384
10_1	32	3	19	6	TTCtgaacacacagTC	385
11_1	57	5	39	16	ACaagtcatgttaCTA	463
12_1	75	5	37	12	ACacaagtcatgttAC	465
13_1	22	2	10	3	CTtacttagatgcTGC	495
14_1	33	4	23	11	ACttacttagatgCTG	496
15_1	33	7	21	6	GACttacttagatgCT	497
16_1	41	6	18	10	AGacttacttagaTGC	498
17_1	96	14	40	7	GCAggaagagactTAC	506
18_1	22	2	9	3	AATAaattccgttCAGG	541
19_1	34	6	21	9	GCAAataaattcCGTT	545
19_2	51	4	27	11	GCAaataaattccGTT	545
20_1	38	5	23	7	AGCAaataaattcCGT	546
21_1	73	8	56	15	CAGAgcaaataaatTCC	548
22_1	83	8	65	10	TGGAcagagcaaataAAT	551
23_1	86	6	80	8	ATGGacagagcaAATA	554
24_1	44	4	30	2	CAgaatggacagaGCA	558
25_1	63	10	40	11	TTCtcagaatggacAG	562
26_1	31	1	39	5	CTGAactttgacATAG	663
27_1	60	4	56	19	AAgacaaacccagacTGA	675
28_1	36	4	34	10	TATAagacaaacccAGAC	678
29_1	40	4	28	13	TTATaagacaaaccCAGA	679
30_1	30	2	18	6	TGTTataagacaaaCCC	682
31_1	77	3	67	10	TAGAacaatggtaCTTT	708
32_1	81	17	20	14	GTAGaacaatggtaCT	710
33_1	29	5	14	8	AGGtagaacaatgGTA	712
34_1	32	1	43	20	AAGAggtagaacaATGG	714
35_1	70	4	35	13	GCatccacagtaaaTT	749
36_1	83	2	66	21	GAaggttatttaaTTC	773
37_1	18	2	15	5	CTAAtcgaatgcaGCA	805
38_1	64	7	35	10	TACccaatctaatCGA	813
39_1	69	1	49	13	TAGttacccaatcTAA	817
40_1	49	5	26	9	CATttagttacccAAT	821
41_1	23	7	8	2	TCAtttagttaccCAA	822
42_1	24	6	12	3	TTcatttagttaCCCA	823
43_1	51	7	40	5	GAATtaatttcattTAGT	829
44_1	71	9	45	3	CAGTgaggaattaATTT	837
45_1	60	5	45	17	CCAAcagtgaggAATT	842
46_1	63	1	37	15	CCCaacagtgaggAAT	843
47_1	31	3	29	12	TAtacccaacagtgAGG	846
48_1	44	3	27	0	TTatacccaacagTGAG	847
49_1	38	3	26	6	TTTatacccaacagTGA	848
50_1	20	4	7	1	CCTttatacccaaCAG	851
51_1	22	3	6	2	TAACctttatacCCAA	854
52_1	28	1	29	16	AATaacctttataCCCA	855
53_1	80	11	48	10	GTAaataacctttaTA	859
54_1	54	4	37	14	ACTGtaaataacctTTAT	860
55_1	81	4	53	15	ATAtatatgcaatgAG	903
56_1	86	12	70	15	AGatatatatgcaaTG	905
57_1	56	8	27	7	GAGatatatatgcAAT	906
58_1	28	7	13	5	CCagagatatataTGC	909
59_1	88	13	69	23	CAATattccagagATAT	915
60_1	29	3	14	6	GCAAtattccagagATA	916
61_1	25	3	14	3	AGCaatattccagaGAT	917
62_1	29	4	17	2	CAGcaatattccAGAG	919
63_1	27	3	14	3	AATCagcaatattCCAG	921
64_1	23	6	12	6	ACAAtcagcaataTTCC	923
65_1	53	9	43	15	ACtaagtagttacactTCT	957
66_1	32	5	14	6	CTAAgtagttacactTC	958
67_1	35	4	31	6	GACtaagtagttacaCTT	959
68_1	64	10	55	14	TGActaagtagtTACA	962
69_1	62	11	57	16	CTTTgactaagtagTTA	964
70_1	42	9	59	13	CTCtttgactaagTAG	967
71_1	81	6	56	12	GCTCtttgactaagTA	968
72_1	27	3	39	9	CCttaaatactgtTGAC	1060
73_1	75	5	36	7	CTtaaatactgttgAC	1060
74_1	35	6	43	13	TCCttaaatactgTTG	1062
75_1	57	4	79	25	TCTCcttaaatactgTT	1063
76_1	53	6	28	6	TAtcatagttctCCTT	1073
77_1	26	4	9	2	AGTatcatagttcTCC	1075
78_1	74	5	39	12	GAgtatcatagttCTC	1076
79_1	49	5	35	6	AGagtatcatagTTCT	1077
79_2	74	6	36	8	AGAgtatcatagtTCT	1077
80_1	19	2	19	13	CAGagtatcatagTTC	1078
81_1	23	2	26	2	TTCAgagtatcataGT	1080
82_1	35	3	36	11	CTTcagagtatcATAG	1081
83_1	24	6	20	7	TTCTtcagagtatcaTA	1082
84_1	20	2	16	2	TTTcttcagagtaTCAT	1083
85_1	33	4	37	10	GAGAaaggctaagTTT	1099
86_1	42	2	35	18	GAcactcttgtaCATT	1213
87_1	50	4	54	8	TGagacactcttgtaCA	1215
88_1	50	8	28	8	TGagacactcttgTAC	1216
89_1	61	4	33	6	CTttattaaactCCAT	1266
90_1	71	8	43	12	ACCAaactttattaAA	1272
91_1	62	5	42	9	AAACctctactaagTG	1288
92_1	22	3	12	5	AGattaagacagtTGA	1310
93_1	46	3	ND	ND	AAgtaggagcaagaGGC	1475
94_1	42	4	60	24	AAAGtaggagcaagAGG	1476
95_1	86	15	46	10	GTtaagcagccaggAG	1806
96_1	66	6	82	27	AGggtaggatgggtAG	1842
97_1	83	19	62	36	AAGggtaggatgggTA	1843
98_1	60	9	69	5	CAAgggtaggatggGT	1844
98_2	76	13	34	7	CAagggtaggatggGT	1844
99_1	65	8	76	28	CCaagggtaggatgGG	1845
100_1	61	2	75	17	TCcaagggtaggatGG	1846
101_1	83	4	82	13	CTTCcaagggtaggAT	1848
102_1	45	3	52	14	ATCttccaagggtagGA	1849
103_1	29	2	17	7	AGaagtgatggctCATT	1936
104_1	26	3	22	1	AAGaagtgatggcTCAT	1937
105_1	34	6	22	2	GAAgaagtgatggcTCA	1938
106_1	41	5	21	5	ATGAaatgtaaacTGGG	1955
107_1	40	8	29	6	CAATgaaatgtaaaCTGG	1956
108_1	24	3	16	4	GCAAtgaaatgtaaACTG	1957
109_1	30	4	20	6	AGCAatgaaatgtaAACT	1958
110_1	44	4	34	14	GAGCaatgaaatgtAAAC	1959
111_1	18	1	13	3	TGaattcccatatcCGA	1992
112_1	69	8	35	8	AGaattatgaccaTAT	2010
113_1	77	7	38	10	AGGtaagaattatGACC	2014
114_1	97	10	56	13	TCAGgtaagaattaTGAC	2015
115_1	69	8	54	21	CTTCaggtaagaatTATG	2017
116_1	91	7	115	42	TCTTcaggtaagaATTA	2019
117_1	88	6	104	36	CTTCttcaggtaaGAAT	2021
118_1	85	6	118	17	TCTTcttcaggtaaGAA	2022
119_1	105	14	102	9	TCTtcttcaggtaAGA	2023
120_1	37	2	76	18	TGGtctaagagaaGAAG	2046
121_1	46	6	81	11	GTTGgtctaagagAAG	2049
122_1	74	11	64	4	AGTtggtctaagAGAA	2050
123_1	74	9	55	21	CAgttggtctaagAGAA	2050
124_1	65	9	95	21	GCAgttggtctaagagAA	2050
125_1	63	7	ND	ND	CAGTtggtctaagaGA	2051
126_1	65	6	ND	ND	GCagttggtctaagaGA	2051
127_1	67	14	104	34	GCagttggtctaaGAG	2052
128_1	22	6	10	3	CTcatatcagggCAGT	2063
129_1	50	4	46	9	CACAcatgttctttaAC	2087
130_1	22	4	12	12	TAAatacacacatgTTCT	2092
131_1	24	2	43	28	GTAAatacacacatgTTC	2093
132_1	33	3	20	12	TGTAaatacacacaTGTT	2094
133_1	73	17	57	21	GATCatgtaaatacACAC	2099
134_1	47	5	28	14	AGATcatgtaaataCACA	2100
135_1	35	6	26	11	CAAAgatcatgtaaatACAC	2101
136_1	30	2	14	3	ACAAagatcatgtaaaTACA	2102
137_1	52	6	24	18	GAATacaaagatcaTGTA	2108
138_1	33	5	20	6	AGAAtacaaagatcATGT	2109
139_1	37	1	22	15	CAGAatacaaagatCATG	2110
140_1	85	6	53	8	GCAGaatacaaagATCA	2112
141_1	79	4	40	6	AGGCagaatacaaagAT	2114
142_1	56	2	53	20	AAGGcagaatacaaAGA	2115
143_1	28	5	20	5	ATTagtgagggacGAA	2132
144_1	26	2	22	10	CAttagtgagggaCGA	2133
145_1	29	6	16	4	GAgggtgatggatTAG	2218
146_1	45	6	22	5	TTaggagtaataAAGG	2241
147_1	65	7	44	9	TTAatgaatttggtTG	2263
148_1	84	8	43	10	CTttaatgaatttgGT	2265
149_1	32	0	15	3	CATGgattacaactAA	2322
150_1	33	2	20	4	TCatggattacaaCTA	2323
151_1	29	1	11	3	GTCatggattacaaCT	2324
152_1	64	2	40	9	CAttaaatctagTCAT	2335
153_1	97	8	63	22	GACAttaaatctagTCA	2336
154_1	92	7	ND	ND	AGGGacattaaatcTA	2340
155_1	35	4	25	15	CAAAgcattataaCCA	2372
156_1	34	3	24	6	ACttactaggcaGAAG	2415
157_1	102	6	113	18	CAGAgttaactgtaCA	2545
158_1	102	10	103	15	CCAGagttaactgtAC	2546
159_1	88	7	95	18	GCcagagttaactgTA	2547
160_1	78	10	ND	ND	TGggccagagttaaCT	2550
161_1	59	5	26	5	CAgcatctatcagaCT	2576
162_1	78	8	42	10	TGAaataacatgagTCAT	2711
163_1	31	6	ND	ND	GTGaaataacatgAGTC	2713
164_1	18	2	11	3	TCTGtttatgtcacTG	2781
165_1	56	5	29	9	GTCTgtttatgtcaCT	2782
166_1	37	8	12	5	TGgtctgtttatGTCA	2784
167_1	39	1	19	3	TTGGtctgtttatgTC	2785
168_1	41	3	35	14	TCacccattgtttaAA	2842
169_1	18	3	14	4	TTcagcaaatatTCGT	2995
170_1	36	8	13	2	GTGtgttcagcaaATAT	2999
171_1	18	2	11	4	TCTattgttaggtATC	3053
172_1	67	4	26	12	ATtgcccatcttacTG	3118
173_1	71	2	33	9	TATtgcccatcttaCT	3119
174_1	47	4	20	5	AAatattgcccatCTT	3122
175_1	74	4	34	7	ATAaccttatcataCA	3174
176_1	98	19	44	12	TAtaaccttatcaTAC	3175
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178_1	72	38	28	5	TTTataaccttatCAT	3177
179_1	47	6	34	6	ACtgctattgctaTCT	3375
180_1	41	3	23	6	AGgactgctattgCTA	3378
181_1	32	6	27	7	GAGgactgctattgCT	3379
182_1	83	1	46	20	ACgtagaataataaCA	3561
183_1	94	4	52	9	CCaagtgatataATGG	3613
184_1	49	2	16	3	TTagcagaccaaGTGA	3621
185_1	96	3	26	5	GTttagcagaccaaGT	3623
186_1	78	3	46	10	TGacagtgattataTT	3856
187_1	88	5	45	21	TGTCcaagatattgAC	3868
188_1	46	6	23	6	GAAtatcctagatTGT	4066
189_1	79	3	45	14	CAaactgagaataTCC	4074
190_1	63	5	27	8	GCAaactgagaataTC	4075
191_1	77	9	37	11	TCCtattacaatcgTA	4214
192_1	74	10	36	9	TTCCtattacaatcGT	4215
193_1	91	8	51	28	ACtaatgggaggatTT	4256
194_1	95	14	67	24	TAgttcagagaataAG	4429
195_1	86	5	47	16	TAacatatagttcAGA	4436
196_1	87	4	81	20	ATAacatatagttcAG	4437
197_1	101	6	67	20	CAtaacatatagttCA	4438
198_1	91	6	60	13	TCataacatatagtTC	4439
199_1	61	3	31	10	TAGCtcctaacaatCA	4507
200_1	79	12	49	11	CTCCaatctttgtaTA	4602
201_1	74	2	58	13	TCTCcaatctttgtAT	4603
202_1	53	3	33	10	TCtatttcagccaaTC	4708
203_1	25	4	30	9	CGGaagtcagagtGAA	4782
204_1	32	5	21	7	TTAAgcatgaggaaTA	4798
205_1	34	10	26	11	TGAttgagcacctCTT	4831
206_1	81	12	62	12	GACtaattatttcgTT	4857
207_1	57	7	37	7	TGActaattatttCGT	4858
208_1	26	5	21	6	GTGactaattattTCG	4859
209_1	48	3	33	13	CTGCttgaaatgtgAC	4870
210_1	32	1	34	13	CCtgcttgaaatgTGA	4871
211_1	60	5	50	19	ATcctgcttgaaATGT	4873
212_1	111	8	110	26	ATTataaatctatTCT	5027
213_1	107	1	67	12	GCtaaatactttcATC	5151
214_1	26	3	19	6	CAttgtaacataCCTA	5251
215_1	33	2	20	4	GCattgtaacatacCT	5252
216_1	89	8	53	16	TAatattgcaccaaAT	5295
217_1	25	2	29	9	GAtaatattgcacCAA	5297
218_1	27	1	27	6	AGataatattgcacCA	5298
219_1	79	6	45	11	GCcaagaagataATAT	5305
220_1	159	16	68	14	CACAgccacataaaCT	5406
221_1	90	2	72	12	TTgtaattgtggaaAC	5463
222_1	10	2	11	5	TGacttgtaattgTGG	5467
223_1	82	1	67	18	TCtaactgaaatagTC	5503
224_1	30	1	32	9	GTGgttctaactgaAA	5508
225_1	53	7	53	15	CAatatgggacttgGT	5522
226_1	44	1	33	10	ATGacaatatgggaCT	5526
227_1	49	1	41	14	TATGacaatatgggAC	5527
228_1	77	1	54	15	ATATgacaatatggGA	5528
229_1	100	3	98	29	CTtcacttaataaTTA	5552
230_1	90	12	80	19	CTGCttcacttaatAA	5555
231_1	91	0	79	23	AAgactgcttcacTTA	5559
232_1	49	8	77	34	GAATgccctaattaTG	5589
233_1	17	7	88	33	TGGaatgccctaatTA	5591
234_1	40	5	35	10	GCAaatgccagtagGT	5642
235_1	81	6	72	25	CTAatggaaggattTG	5673
236_1	97	17	87	25	AAtatagaacctaaTG	5683
237_1	98	4	83	21	GAAagaatagaatGTT	5769
238_1	93	2	102	26	ATGggtaatagattAT	5893
239_1	110	24	44	14	GAaagagcacagggTG	6103
240_1	66	5	36	10	CTACatagagggaaTG	6202
241_1	70	4	34	8	GCttcctacataGAGG	6207
242_1	64	NA	33	6	TGCTtcctacatagAG	6208
243_1	30	NA	19	7	TGggcttgaaataTGT	6417
244_1	88	6	69	15	CATtatatttaagaAC	6457
245_1	8	2	5	2	TCggttatgttaTCAT	6470
246_1	18	9	12	4	CActttatctggTCGG	6482
247_1	37	2	19	5	AAAttggcacagcGTT	6505
248_1	46	12	29	8	ACCGtgacagtaaATG	6577
249_1	31	2	25	2	TGggaaccgtgacagTA	6581
250_1	17	2	23	9	CCacatataggtcCTT	6597
251_1	15	6	23	7	CAtattgctaccaTAC	6617
252_1	4	2	9	2	TCAtattgctaccATA	6618
253_1	65	12	85	14	CAATtgtcatatTGCT	6624
254_1	20	2	51	7	CATtcaattgtcataTTG	6626
255_1	48	8	91	41	TTTCtactgggaaTTTG	6644
256_1	11	5	23	8	CAAttagtgcagcCAG	6672
257_1	43	7	62	13	GAATaatgttcttaTCC	6704
258_1	28	2	36	19	CACAaattgaataatgtTCT	6709
259_1	64	4	78	22	CATGcacaaattgaaTAAT	6714
260_1	53	8	104	73	ATCctgcaatttcaCAT	6832
261_1	54	5	59	14	CCaccatagctgatCA	6868
262_1	42	8	52	22	ACcaccatagctgaTCA	6868
263_1	68	5	118	66	CAccaccatagctgaTC	6869
264_1	40	2	73	20	TAgtcggcaccaccAT	6877
265_1	64	6	72	35	CttgtagtcggcaccAC	6880
266_1	56	4	82	35	CttgtagtcggcacCA	6881
267_1	41	5	46	21	CGcttgtagtcggcAC	6883
268_1	51	4	33	14	TCAataaagatcagGC	6942
269_1	61	2	49	10	TGgacttacaagaaTG	6986
270_1	45	7	40	9	ATGgacttacaagaAT	6987
271_1	51	12	36	12	GCTCaagaaattggAT	7073
272_1	17	0	14	5	TACTgtagaacatgGC	7133
273_1	15	3	11	3	GCAAttcatttgaTCT	7239
274_1	64	11	ND	ND	TGaagggaggagggacAC	7259
275_1	52	6	50	28	AGtggtgaagggaggAG	7265
276_1	79	7	ND	ND	TAgtggtgaagggaggAG	7265
277_1	81	6	ND	ND	AtagtggtgaagggaggAG	7265
278_1	70	9	ND	ND	TAgtggtgaagggagGA	7266
279_1	84	9	ND	ND	ATagtggtgaagggagGA	7266
280_1	40	6	64	53	TAGtggtgaagggaGG	7267
281_1	42	10	ND	ND	ATAgtggtgaagggaGG	7267
282_1	63	7	ND	ND	GAtagtggtgaagggaGG	7267
283_1	27	7	38	11	ATAGtggtgaagggAG	7268
284_1	60	22	ND	ND	GAtagtggtgaaggGAG	7268
285_1	23	3	97	54	GAgatagtggtgAAGG	7271
286_1	51	6	72	19	CATGggagatagtgGT	7276
287_1	7	1	21	9	ACAAataatggttaCTCT	7302
288_1	66	8	48	20	ACACacaaataatgGTTA	7306
289_1	67	6	58	20	GAGggacacacaaaTAAT	7311
290_1	46	2	50	21	ATATagagaggcTCAA	7390
291_1	22	6	ND	ND	TTgatatagagaGGCT	7393
292_1	11	2	17	3	GCATttgatatagAGA	7397
293_1	70	18	44	8	TTtgcatttgataTAG	7400
294_1	30	1	30	9	CTGgaagaataggtTC	7512
295_1	53	5	42	10	ACTGgaagaataggTT	7513
296_1	56	2	41	15	TACTggaagaatagGT	7514
297_1	80	8	53	13	TGGCttatcctgtaCT	7526
298_1	73	6	52	14	ATggcttatcctGTAC	7527
299_1	75	7	89	25	TATGgcttatcctgTA	7528
300_1	52	5	50	11	GTAtggcttatccTGT	7529
301_1	27	3	31	6	ATgaatatatgccCAGT	7547
302_1	41	8	33	9	GAtgaatatatgCCCA	7549
303_1	8	2	ND	ND	CAAgatgaatataTGCC	7551
304_1	32	5	37	14	GACAacatcagtaTAGA	7572
305_1	28	5	30	23	CAAGacaacatcAGTA	7576
306_1	47	5	41	9	CACtcctagttccTTT	7601
307_1	39	6	33	7	AACactcctagttCCT	7603
308_1	68	3	42	14	TAacactcctagtTCC	7604
309_1	115	5	69	22	CTaacactcctagtTC	7605
310_1	97	16	57	14	TGataacataactgTG	7637
311_1	36	1	23	10	CTgataacataaCTGT	7638
312_1	38	5	24	5	TTTGaactcaagtgAC	7654
313_1	42	3	39	5	TCCTttacttagcTAG	7684
314_1	15	2	14	3	GAgtttggattagCTG	7764
315_1	49	28	ND	ND	TGggatatgacagGGA	7838
316_1	34	6	ND	ND	TGTGggatatgacaGG	7840
317_1	47	3	37	8	ATATggaagggataTC	7875
318_1	11	3	ND	ND	ACAggatatggaaGGG	7880
319_1	48	4	ND	ND	ATTTcaacaggatATGG	7885
320_1	18	2	16	4	GAgtaatttcaacAGG	7891
321_1	74	6	44	5	AGGGagtaatttcAACA	7893
322_1	38	5	56	28	ATTAgggagtaatTTCA	7896
323_1	66	9	32	11	CTtactattaggGAGT	7903
324_1	13	1	15	5	CAgcttactattaGGG	7906
325_1	26	4	20	9	TCAgcttactattAGG	7907
326_1	43	4	17	2	ATTtcagcttactaTTAG	7908
327_1	54	5	57	16	TTcagcttactaTTAG	7908
328_1	28	3	8	2	CAGAtttcagcttaCT	7913
329_1	43	4	37	16	GACtacaactagagGG	7930
330_1	45	12	36	10	AGACtacaactagaGG	7931
331_1	99	8	94	32	AAgactacaactagAG	7932
332_1	59	4	52	19	ATGAtttaattctagtCAAA	7982
333_1	100	2	84	23	TTTaattctagtcAAA	7982
771_1	91	9	60	19	GATTtaattctaGTCA	7984
334_1	74	6	50	5	TGAtttaattctaGTCA	7984
335_1	73	5	54	12	ATGAtttaattctagTCA	7984
336_1	15	1	26	3	GATGatttaattctagtCA	7984
337_1	71	22	49	16	GAtttaattctaGTCA	7984
338_1	43	5	30	11	GATGatttaattctaGTC	7985
339_1	98	5	90	27	TGatttaattctagTC	7985
340_1	87	21	86	2	GAGAtgatttaatTCTA	7988
341_1	92	5	85	27	GAGatgatttaatTCT	7989
342_1	7	1	7	1	CAGAttgatggtagTT	8030
343_1	7	2	24	11	CTcagattgatgGTAG	8032
344_1	3	1	14	9	GTTagccctcagaTTG	8039
345_1	14	5	20	7	TGtattgttagcCCTC	8045
346_1	10	2	11	5	ACttgtattgttAGCC	8048
347_1	52	4	52	17	AGCcagtatcagggAC	8191
348_1	33	3	18	8	TTgacaatagtgGCAT	8213
349_1	7	2	13	5	ACAagtggtatctTCT	8228
350_1	63	8	44	15	AATCtactttacaaGT	8238
351_1	36	2	ND	ND	CAcagtagatgcctGATA	8351
352_1	24	2	30	9	GAacacagtagatGCC	8356
353_1	23	4	103	14	CTTGgaacacagtagAT	8359
354_1	20	2	45	2	ATAtcttggaacaCAG	8364
355_1	25	3	24	6	TCTttaatatcttgGAAC	8368
356_1	39	2	41	10	TGatttctttaatatCTTG	8372
357_1	54	5	88	43	TGatgatttctttaaTATC	8375
358_1	31	4	45	27	AGGctaagtcatgaTG	8389
359_1	18	3	43	20	TTGAtgaggctaagTC	8395
360_1	6	2	11	2	CCAggattatactcTT	8439
361_1	43	5	40	14	GCcaggattataCTCT	8440
362_1	56	8	73	13	CTGccaggattataCT	8442
363_1	23	1	33	7	CAGAaacttatactttaTG	8473
364_1	49	8	45	14	AAGCagaaacttaTACT	8478
365_1	39	6	37	4	GAAgcagaaacttaTACT	8478
366_1	26	4	45	13	TGGaagcagaaacttataCT	8478
367_1	21	4	44	5	TGGaagcagaaacttaTAC	8479
368_1	97	4	70	22	AAgcagaaacttaTAC	8479
369_1	34	3	32	11	TGGaagcagaaactTATA	8480
370_1	71	7	46	19	AAGGgatattatggAG	8587
371_1	51	9	79	38	TGccggaagatttcCT	8641
372_1	45	6	52	25	ATGGattgggagtaGA	8772
373_1	27	7	30	8	AGatggattgggagTA	8774
374_1	13	3	28	6	AAGatggattgggaGT	8775
375_1	42	10	44	11	ACaagatggattGGGA	8777
375_2	41	3	45	14	ACaagatggattggGA	8777
376_1	83	9	88	32	AGAaggttcagaCTTT	8835
377_1	40	5	33	3	GCAgaaggttcagaCT	8837
377_2	28	5	20	4	GCagaaggttcagACT	8837
378_1	70	2	43	8	TGCAgaaggttcagAC	8838
379_1	23	3	55	17	AGtgcagaaggttCAG	8840
379_2	51	6	41	8	AGTGcagaaggttcAG	8840
380_1	34	6	35	7	AAGTgcagaaggttCA	8841
381_1	44	11	24	6	TAagtgcagaagGTTC	8842
382_1	37	5	45	9	TCtaagtgcagaAGGT	8844
383_1	75	5	147	26	CTCaggagttctactTC	8948
384_1	90	10	141	55	CTCaggagttctaCTT	8949
385_1	73	8	234	116	AtggaggtgactcaggAG	8957
386_1	33	4	42	7	ATggaggtgactcagGA	8958
387_1	24	3	29	14	ATggaggtgactcAGG	8959
388_1	37	2	65	15	TAtggaggtgactcAGG	8959
389_1	50	10	81	19	ATatggaggtgactcaGG	8959
390_1	42	5	61	10	TATGgaggtgactcAG	8960
391_1	36	2	76	50	ATatggaggtgacTCAG	8960
392_1	52	6	64	6	CAtatggaggtgactcAG	8960
393_1	63	5	57	6	ATAtggaggtgacTCA	8961
394_1	53	7	64	12	CAtatggaggtgacTCA	8961
395_1	51	5	56	24	CAtatggaggtgACTC	8962
396_1	23	3	41	34	GCatatggaggtgacTC	8962
397_1	34	3	54	10	TGcatatggaggtgacTC	8962
398_1	54	5	71	24	TtgcatatggaggtgacTC	8962
399_1	61	11	59	13	TttgcatatggaggtgacTC	8962
400_1	25	2	30	6	GCatatggaggtgaCT	8963
401_1	34	4	25	9	TGcatatggaggtgaCT	8963
402_1	25	4	31	20	TTGcatatggaggtgaCT	8963
403_1	51	6	37	11	TttgcatatggaggtgaCT	8963
404_1	26	1	33	5	TGCatatggaggtgAC	8964
405_1	25	2	69	19	TTGcatatggaggtGAC	8964
406_1	26	4	24	4	TTTGcatatggaggtgAC	8964
407_1	19	3	20	7	TTTGcatatggaggtGA	8965
408_1	16	5	46	16	TTtgcatatggaGGTG	8966
409_1	9	2	9	6	AAgtgaagttcaaCAGC	8997
410_1	26	8	109	52	TGggaagtgaagTTCA	9002
411_1	31	5	24	5	ATgggaagtgaagTTC	9003
412_1	49	9	19	10	GATGggaagtgaaGTT	9004
413_1	28	10	17	9	CTGtgatgggaagtGAA	9007
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417_1	5	1	16	3	GTGataattgagtGAA	9125
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419_1	86	6	64	13	CAagaaaggtgcAATA	9156
420_1	75	19	64	14	ACAAgaaaggtgcaAT	9157
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422_1	21	8	23	6	CTgttaggttcaGCGA	9235
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424_1	11	4	15	5	CTcattgaaggtTCTG	9281
425_1	87	3	52	8	CTAatctcattgaaGG	9286
426_1	95	1	85	13	CCtaatctcattgaAG	9287
427_1	31	7	22	7	ACTttgatctttcAGC	9305
428_1	64	7	49	16	ACtatgcaacacttTG	9315
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432_1	75	8	43	7	GATCcaaatagcttTA	9339
433_1	67	11	32	8	ATgatccaaataGCTT	9341
434_1	53	5	43	6	TATGatccaaatagCT	9342
435_1	97	9	66	29	TAAAcagggctggGAAT	9408
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437_1	58	10	30	12	ACacttaaacagGGCT	9414
438_1	87	38	41	3	GAACacttaaacAGGG	9416
439_1	70	4	59	33	AGAGaacacttaaACAG	9418
440_1	83	17	28	9	CTACagagaacaCTTA	9423
441_1	49	12	27	4	ATGctacagagaaCACT	9425
442_1	53	10	24	13	ATAAatgctacagagAACA	9427
443_1	23	6	20	10	AGataaatgctacaGAGA	9430
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446_1	38	5	ND	ND	CAATatactagataGAGA	9445
447_1	52	3	31	1	TACAcaatatactagATAG	9448
448_1	65	6	48	11	CTAcacaatatacTAG	9452
449_1	67	9	29	2	GCTAcacaatatACTA	9453
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452_1	19	4	9	1	ATGAtatgatatgCTAC	9464
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454_1	68	6	43	10	CTAggaggagagagACA	9500
455_1	72	7	79	25	TATTctaggaggagAGA	9504
456_1	31	3	29	9	TTATattctaggagGAG	9507
457_1	38	5	62	17	GTTtatattctaGGAG	9510
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464_1	15	6	30	9	TGCtccagtgtaccCT	9755
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466_1	9	2	7	3	CTAattgtagtagtaCTC	9818
467_1	52	3	32	6	TGctaattgtagTAGT	9822
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470_1	91	9	ND	ND	GAGGaaatgaactaattTA	9881
471_1	92	5	ND	ND	CAGGaggaaatgaacTA	9886
472_1	67	5	42	6	CCctagagtcattTCC	9902
473_1	35	5	20	8	ATCttacatgatgaAGC	9925
474_1	13	1	20	5	GACacactcagatttcAG	9967
475_1	24	4	20	2	AGacacactcagatttcAG	9967
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477_1	26	6	19	4	AGacacactcagattTCA	9968
478_1	28	4	32	13	AAGacacactcagattTCA	9968
479_1	31	8	37	6	AAagacacactcagatTTCA	9968
480_1	63	7	51	26	GAAagacacactcagatTTC	9969
481_1	37	10	ND	ND	AAGAcacactcagatTTC	9969
482_1	41	4	ND	ND	AAAGacacactcagaTTTC	9969
483_1	19	5	48	14	TGAAagacacactcagatTT	9970
484_1	60	8	68	10	TGaaagacacactcaGATT	9971
485_1	42	8	63	22	TGAaagacacactcaGAT	9972
486_1	48	9	41	20	ATTGaaagacacacTCA	9975
487_1	27	6	27	12	TCattgaaagacaCACT	9977
488_1	88	13	121	33	TTCcatcattgaAAGA	9983
489_1	80	12	ND	ND	ATAAtaccacttaTCAT	10010
490_1	13	4	27	15	TTacttaatttcttTGGA	10055
491_1	32	5	60	24	TTAgaactagctttaTCA	10101
492_1	58	10	55	17	GAGgtacaaatatAGG	10171
493_1	4	1	12	3	CTTatgatacaacTTA	10384
494_1	37	6	35	5	TCttatgatacaaCTT	10385
495_1	30	0	27	6	TTCttatgatacaaCT	10386
496_1	27	8	18	3	CAgtttcttatgaTAC	10390
497_1	25	10	25	6	GCAgtttcttatgaTA	10391
498_1	77	6	72	29	TACAaatgtctattagGTT	10457
499_1	66	5	69	17	TGTAcaaatgtctatTAG	10460
500_1	27	10	20	4	AGCatcacaattagTA	10535
501_1	31	10	25	5	CTAatgatagtgaaGC	10548
502_1	21	7	30	8	AGCtaatgatagtgAA	10550
503_1	35	5	39	8	ATGCcttgacatatTA	10565
504_1	64	11	79	26	CTCAagattattgACAC	10623
505_2	25	4	83	32	ACctcaagattaTTGA	10626
505_1	94	7	22	6	ACCtcaagattaTTGA	10626
506_1	31	6	34	10	AACCtcaagattatTG	10627
507_1	55	6	62	17	CACAaacctcaagattaTT	10628
508_1	66	12	40	4	GTActtaattagACCT	10667
509_1	78	5	80	10	AGTActtaattagACC	10668
510_1	36	5	42	15	GTATgaggtggtaaAC	10688
511_1	40	4	48	22	AGgaaacagcagaAGTG	10723
512_1	27	7	13	6	GCacaacccagaggAA	10735
513_1	54	5	ND	ND	CAAgcacaacccagAG	10738
514_1	35	7	ND	ND	TTCaagcacaaccCAG	10740
515_1	49	6	52	15	AAttcaagcacaACCC	10742
516_1	72	4	106	49	TAATaattcaagcacaaCC	10743
517_1	43	4	57	21	ACTAataattcaaGCAC	10747
518_1	37	3	60	12	ATAAtactaataattcAAGC	10749
519_1	9	3	6	1	TAgatttgtgagGTAA	11055
520_1	59	10	31	5	AGCCttaattctccAT	11091
521_1	41	4	34	9	AATGatctagagcCTTA	11100
522_1	34	6	34	7	CTAatgatctagaGCC	11103
523_1	52	6	52	17	ACTaatgatctaGAGC	11104
524_1	60	4	54	10	CATtaacatgttctTATT	11165
525_1	57	4	55	8	ACAAgtacattaacatGTTC	11170
526_1	53	6	44	5	TTACaagtacattaaCATG	11173
527_1	54	11	49	17	GCTTtattcatgtTTAT	11195
528_1	34	7	17	5	GCTttattcatgttTA	11196
529_1	11	2	21	4	AGAgctttattcatgtTT	11197
530_1	22	4	33	7	ATAAgagctttattCATG	11200
531_1	30	5	32	15	CATAagagctttaTTCA	11202
532_1	77	8	24	4	AGCAtaagagctTTAT	11205
533_1	8	3	15	6	TAGattgtttagtGCA	11228
534_1	4	2	10	2	GTagattgtttaGTGC	11229
535_1	41	6	33	11	GACAattctagtaGATT	11238
536_1	50	1	37	7	CTGacaattctaGTAG	11241
537_1	49	7	36	6	GCTGacaattctagTA	11242
538_1	59	2	42	11	AGgattaagatacgTA	11262
539_1	28	11	28	4	CAggattaagataCGT	11263
540_1	96	5	20	6	TCAggattaagataCG	11264
541_1	70	11	59	11	TTcaggattaagATAC	11265
542_1	53	5	28	4	AGGAagaaagtttgATTC	11308
543_1	92	13	59	12	TCAAggaagaaagtTTGA	11311
544_1	44	3	67	7	CTCAaggaagaaagTTTG	11312
545_1	43	4	32	4	TGCtcaaggaagaAAGT	11315
546_1	41	7	44	20	AATTatgctcaaggaAGA	11319
547_1	11	4	26	8	TAGGataccacattatGA	11389
548_1	25	4	26	12	CAtaatttattccattcCTC	11449
549_1	64	6	ND	ND	TGCAtaatttattcCAT	11454
550_1	48	17	49	7	ACTGcataatttatTCC	11456
551_1	91	10	92	15	CTAAactgcataattTATT	11458
552_1	85	8	38	9	ATaactaaactgCATA	11465
553_1	86	4	ND	ND	TTAttaataactaaaCTGC	11468
554_1	91	13	92	21	TAGTacattattaataaCT	11475
555_1	50	4	37	7	CATAactaaggacgTT	11493
556_1	41	5	30	7	TCataactaaggaCGT	11494
557_1	80	7	55	13	CGTCataactaaggAC	11496
558_1	86	3	59	11	TCgtcataactaagGA	11497
559_1	51	9	33	12	ATcgtcataactAAGG	11498
560_1	91	6	65	26	GTtagtatcttacATT	11525
561_1	30	3	41	8	CTCtattgttagtATC	11532
562_1	59	8	18	6	AGTatagagttacTGT	11567
563_1	65	11	41	11	TTCCtggtgatactTT	11644
564_1	57	13	45	13	GTTCctggtgatacTT	11645
565_1	57	15	30	7	TGttcctggtgataCT	11646
566_1	17	4	35	4	ATaaacatgaatctCTCC	11801
567_1	16	3	30	4	CTTtataaacatgaaTCTC	11804
568_1	60	5	45	11	CTGtctttataaaCATG	11810
569_1	20	2	19	5	TTgttataaatctgTCTT	11820
570_1	68	9	44	4	TTAaatttattcttgGATA	11849
571_1	76	8	48	12	CTtaaatttattctTGGA	11851
572_1	62	5	66	5	CTTCttaaatttattctTG	11853
573_1	28	4	44	10	TATGtttctcagtAAAG	11877
574_1	29	6	36	11	GAAttatctttaaACCA	11947
575_1	74	6	34	7	CCCttaaatttctaCA	11980
576_1	37	8	30	9	ACACtgctcttgtaCC	11995
577_1	45	14	27	6	TGAcaacactgctCTT	12000
578_1	2	1	12	5	TACAtttattgggcTC	12081
579_1	65	14	39	9	GTacatttattgGGCT	12082
580_1	34	4	53	12	TTGgtacatttatTGG	12085
581_1	41	7	35	6	CATGttggtacattTAT	12088
582_1	11	4	12	5	AATCatgttggtacAT	12092
583_1	96	16	48	9	AAatcatgttggtaCA	12093
584_1	71	15	42	13	GACaagtttggattAA	12132
585_1	46	34	39	6	AAtgttcagatgCCTC	12197
586_1	37	26	28	12	GCttaatgttcagaTG	12201
587_1	75	8	43	12	CGTAcatagcttgaTG	12267
588_1	41	10	28	5	GTGaggaattaggaTA	12753
589_1	41	5	27	9	GTAacaatatggttTG	12780
590_1	67	10	37	7	GAaatattgtagaCTA	13151
591_1	97	10	80	12	TTGaaatattgtagAC	13153
592_1	64	10	47	9	AAgtctagtaatTTGC	13217
593_1	84	7	60	9	GCTCagtagattatAA	13259
594_1	42	8	32	9	CATacactgttgcTAA	13296
595_1	101	6	79	17	ATGgtctcaaatcATT	13314
596_1	53	14	46	7	CAATggtctcaaatCA	13316
597_1	47	6	36	6	TTCCtattgattgaCT	13568
598_1	97	12	41	6	TTTCtgttcacaacAC	13600
599_1	85	1	49	11	AGgaacccactaaTCT	13702
600_1	56	3	34	7	TAAatggcaggaacCC	13710
601_1	15	4	24	8	GTAAatggcaggaaCC	13711
602_1	40	6	26	8	TTgtaaatggcagGAA	13713
603_1	59	12	26	6	TTatgagttaggCATG	13835
604_1	62	2	42	10	CCAggtgaaactttAA	13935
605_1	77	9	55	18	CCCttagtcagctCCT	13997
606_1	82	13	42	11	ACccttagtcagCTCC	13998
607_1	74	1	39	10	CAcccttagtcagCTC	13999
608_1	76	9	30	8	TCTcttactaggcTCC	14091
609_1	82	5	50	13	CCtatctgtcatcATG	14178
610_1	82	1	48	12	TCCtatctgtcatcAT	14179
611_1	41	6	50	13	GAGaagtgtgagaaGC	14808
612_1	70	5	84	19	CATCcttgaagtttAG	14908
613_1	64	14	61	16	TAAtaagatggctCCC	15046
614_1	85	2	51	14	CAAggcataataagAT	15053
615_1	47	1	35	10	CCaaggcataatAAGA	15054
616_1	74	8	53	11	TGatccaattctcaCC	15151
617_1	63	4	41	11	ATGatccaattctCAC	15152
618_1	46	7	42	9	CGCttcatcttcacCC	15260
619_1	104	4	15	4	TAtgacactgcaTCTT	15317
620_1	8	3	8	5	GTAtgacactgcaTCT	15318
621_1	21	3	27	10	TGtatgacactgCATC	15319
622_1	37	7	38	11	TTCTcttctgtaagTC	15363
623_1	49	7	36	11	TTctacagaggaACTA	15467
624_1	47	1	32	10	ACTacagttctacAGA	15474
625_1	78	8	69	6	TTCCcacaggtaaaTG	15561
626_1	70	7	ND	ND	ATTAtttgaatatactCATT	15594
627_1	73	7	49	25	TGGGaggaaattatTTG	15606
628_1	80	5	64	11	TGACtcatcttaaaTG	15621
629_1	71	6	66	19	CTGactcatcttaaAT	15622
630_1	31	6	41	6	TTTactctgactcATC	15628
631_1	88	2	68	18	TATtggaggaattaTT	15642
632_1	53	2	27	6	GTAttggaggaattAT	15643
633_1	23	3	39	7	TGgtatacttctctaagTAT	15655
634_1	42	9	33	3	GATCtcttggtataCT	15666
635_1	38	1	30	16	CAgacaactctataCC	15689
636_1	10	2	19	3	AACAtcagacaacTCTA	15693
637_1	13	1	11	3	TAACatcagacaacTC	15695
638_1	14	2	27	2	TTTAacatcagacaACTC	15695
639_1	101	14	81	16	ATttaacatcagacAA	15698
640_1	14	1	17	1	CCtatttaacatcAGAC	15700
641_1	65	2	ND	ND	TCCctatttaacaTCA	15703
642_1	41	6	42	12	TCAAcgactattgGAAT	15737
643_1	37	2	29	5	CTTAtattctggcTAT	15850
644_1	31	7	35	4	ATCCttatattctgGC	15853
645_1	13	3	8	1	GAtccttatattCTGG	15854
646_1	25	5	20	4	TGAtccttatattCTG	15855
647_1	33	6	54	10	ATTGaaacttgaTCCT	15864
648_1	43	3	27	6	ACtgtcattgaaACTT	15870
649_1	54	7	32	12	TCTtactgtcattgAA	15874
650_1	12	1	25	2	AGgatcttactgtCATT	15877
651_1	13	4	11	3	GCAaatcaactccATC	15896
652_1	10	5	16	3	GTGcaaatcaactCCA	15898
653_1	7	0	36	18	CAATtatttctttgTGC	15910
654_1	21	3	31	7	TGGcaacaattattTCTT	15915
655_1	75	9	73	24	GCTggcaacaatTATT	15919
656_1	21	6	39	6	ATCCatttctactgCC	15973
657_1	25	3	38	8	TAATatctattgattTCTA	15988
658_1	14	2	11	5	TCaatagtgtagggCA	16093
659_1	11	4	10	3	TTCaatagtgtaggGC	16094
660_1	18	1	32	12	AGGTtaattaattcaATAG	16102
661_1	33	7	25	10	CATttgtaatccCTAG	16163
661_2	64	14	31	8	CATttgtaatcccTAG	16163
662_1	48	6	34	6	ACAtttgtaatccCTA	16164
663_2	29	6	23	5	AAcatttgtaatCCCT	16165
663_1	30	6	18	6	AACatttgtaatCCCT	16165
664_1	49	1	26	6	TAaatttcaagttCTG	16184
665_1	17	3	30	10	GTTtaaatttcaagTTCT	16185
666_1	22	7	40	9	CCAAgtttaaatttCAAG	16189
667_1	89	11	ND	ND	ACCCaagtttaaaTTTC	16192
668_1	60	16	87	8	CAtacagtgacccaagTTT	16199
669_1	65	9	50	12	ACatcccatacagTGA	16208
670_1	83	8	103	4	AGcacagctctaCATC	16219
671_1	80	9	150	36	ATAtagcacagcTCTA	16223
672_1	57	14	ND	ND	TCCatatagcacagCT	16226
673_1	53	10	106	8	ATTtccatatagCACA	16229
674_1	78	3	96	14	TTTAtttccatatAGCA	16231
675_1	77	9	31	7	TTTatttccatatAGC	16232
676_1	32	6	ND	ND	AAGGagaggagatTATG	16409
677_1	32	5	24	6	AGTtcttgtgttagCT	16456
678_1	19	4	17	4	GAgttcttgtgttaGC	16457
679_1	14	3	25	3	ATTaattatccatCCAC	16590
680_1	11	2	20	6	ATCaattaattatcCATC	16593
681_1	31	5	40	11	AGAatcaattaattaTCC	16596
682_1	8	3	30	10	TGagataccgtgcaTG	16656
683_1	11	3	ND	ND	AAtgagataccgTGCA	16658
684_1	15	3	33	10	CTGtggttaggctaAT	16834
685_1	45	7	38	7	AagagtaagggtctgtggTT	16842
686_1	24	5	ND	ND	GATGggttaagagTAA	16854
687_1	11	2	ND	ND	AGCagatgggttaaGA	16858
688_1	ND	ND	51	7	TGtaaacatttgTAGC	16886
689_1	83	1	54	11	CCTgcttataaatgTA	16898
690_1	103	4	73	14	TGCCctgcttataaAT	16901
691_1	104	2	64	22	TCttcttagttcaaTA	16935
692_1	ND	ND	60	9	TGgtttctaactACAT	16980
693_1	ND	ND	94	22	AGtttggtttctaaCTA	16983
694_1	8	2	17	5	GAAtgaaacttgcCTG	17047
695_1	98	6	51	9	ATTatccttacatGAT	17173
696_1	48	4	18	4	GTacccaattatcCTT	17180
697_1	94	2	48	9	TGTacccaattatCCT	17181
698_1	31	5	42	13	TTgtacccaattaTCC	17182
699_1	41	4	39	6	TTTgtacccaattaTC	17183
700_1	63	0	28	12	AGCAgcaggttataTT	17197
701_1	99	6	43	12	TGGgaagtggtctGGG	17292
702_1	103	2	28	5	CTGgagagtgataaTA	17322
703_1	52	6	27	9	AATGctggattacgTC	17354
704_1	67	3	37	7	CAatgctggattaCGT	17355
705_1	36	10	80	12	TTgttcagaagtATCC	17625
706_1	19	9	47	9	GAtgatttgcttGGAG	17646
707_1	44	NA	60	9	GAAatcattcacaACC	17860
708_1	46	9	32	9	TTGtaacatctacTAC	17891
709_1	56	0	79	17	CATtaagcagcaagTT	17923
710_1	30	9	46	7	TTActagatgtgagCA	17942
711_1	29	4	36	6	TTtactagatgtgAGC	17943
712_1	41	13	41	6	GACcaagcaccttaCA	17971
713_1	36	19	49	11	AGAccaagcacctTAC	17972
714_1	30	6	34	7	ATgggttaaataAAGG	18052
715_1	70	2	24	8	TCaaccagagtattAA	18067
716_1	11	4	26	8	GTCaaccagagtatTA	18068
717_1	126	56	26	6	ATtgtaaagctgaTAT	18135
718_1	73	1	42	10	CAcataattgtaAAGC	18141
719_1	23	9	55	18	GAggtctgctattTAC	18274
720_1	50	1	42	11	TGtagattcaatgCCT	18404
721_1	79	3	39	10	CCtcattatactaTGA	18456
722_1	27	6	30	8	CCttatgctatgacAC	18509
723_1	26	7	50	13	TCCTtatgctatgaCA	18510
724_1	59	1	48	12	AAGatgtttaagtATA	18598
725_1	54	2	50	13	CTgattattaagATGT	18607
726_1	92	10	84	19	TGgaaaggtatgaaTT	18808
727_1	24	8	61	16	ACttgaatggcttgGA	18880
728_1	8	4	51	14	AACttgaatggctTGG	18881
729_1	35	4	35	10	CAATgtgttactatTT	19004
730_1	36	9	53	11	ACAatgtgttactATT	19005
731_1	70	2	41	11	CATCtgctatataaGA	19063
732_1	38	NA	42	9	CCTAgagcaaatacTT	19223
733_1	102	15	15	4	CAGagttaataatAAG	19327
734_1	37	10	8	5	GTTCaagcacaacgAA	19493
735_1	13	1	38	11	AGggttcaagcacAAC	19496
736_1	49	NA	36	11	TGttggagacactgTT	19677
737_1	48	NA	32	10	AAGgaggagttaggAC	19821
738_1	36	NA	64	11	CTATgccatttacgAT	19884
739_1	105	19	66	19	TCaaatgcagaattAG	19913
740_1	44	NA	41	6	AGtgacaatcaaATGC	19921
741_1	107	NA	68	18	AAgtgacaatcaaATG	19922
742_1	102	4	27	6	GTGtaccaagtaacAA	19978
743_1	110	10	30	16	TGGgatgttaaacTGA	20037

實例2-以劑量反應曲線測試活體外效能在實例1中所闡述之活體外效能分析中於KARPAS-299細胞中使用於PBS中之半對數連續稀釋液(50 µM、15.8µM、5.0µM、1.58µM、0.5µM、0.158µM、0.05µM至0.0158µM寡核苷酸)來測試來自表10之所選寡核苷酸。評價寡核苷酸之IC 50及最大抑制(殘餘PD-L1表現%)。在GraphPad Prism6中實施EC50計算。IC50及最大PD-L1敲低量展示於表11中(以經對照(PBS)處理之細胞之%形式)。表11：KARPAS-299細胞系中之最大抑制(呈鹽水之%形式)及EC50。

CMP ID NO	最大抑制 ( 殘餘PD-L1 表現% ；經鹽水處理結果之%)	EC50 (µM)	化合物 CMP	SEQ ID NO: 1 上之起點
Avg	SD	Avg	SD
6_1	11	3.3	0.69	0.11	TCGCataagaatgaCT	371
8_1	29	1.7	0.06	0.01	CTGaacacacagtCGC	383
9_1	19	1.7	0.23	0.02	TCTgaacacacagtCG	384
13_1	14	4.7	0.45	0.12	CTtacttagatgcTGC	495
41_1	10	1.8	0.19	0.02	TCAtttagttaccCAA	822
42_1	17	1.3	0.19	0.02	TTcatttagttaCCCA	823
58_1	23	1.5	0.17	0.01	CCagagatatataTGC	909
77_1	24	2.4	0.16	0.02	AGTatcatagttcTCC	1075
92_1	12	2.4	0.25	0.03	AGattaagacagtTGA	1310
111_1	3	2.0	0.27	0.03	TGaattcccatatcCGA	1992
128_1	11	1.8	0.25	0.03	CTcatatcagggCAGT	2063
151_1	16	2.7	0.28	0.05	GTCatggattacaaCT	2324
164_1	19	1.6	0.15	0.01	TCTGtttatgtcacTG	2781
166_1	36	1.7	0.11	0.02	TGgtctgtttatGTCA	2784
169_1	10	1.6	0.22	0.02	TTcagcaaatatTCGT	2995
171_1	12	2.0	0.21	0.02	TCTattgttaggtATC	3053
222_1	1	2.0	0.21	0.02	TGacttgtaattgTGG	5467
233_1	1	4.3	0.89	0.17	TGGaatgccctaatTA	5591
245_1	4	2.0	0.17	0.02	TCggttatgttaTCAT	6470
246_1	7	2.1	0.25	0.03	CActttatctggTCGG	6482
250_1	0	2.5	0.23	0.03	CCacatataggtcCTT	6597
251_1	0	2.8	0.75	0.10	CAtattgctaccaTAC	6617
252_1	3	2.2	0.19	0.02	TCAtattgctaccATA	6618
256_1	5	2.2	0.32	0.03	CAAttagtgcagcCAG	6672
272_1	1	3.2	0.69	0.10	TACTgtagaacatgGC	7133
273_1	3	2.8	0.28	0.04	GCAAttcatttgaTCT	7239
287_1	1	1.4	0.13	0.01	ACAAataatggttaCTCT	7302
292_1	2	2.1	0.21	0.02	GCATttgatatagAGA	7397
303_1	0	1.2	0.21	0.01	CAAgatgaatataTGCC	7551
314_1	3	2.1	0.39	0.04	GAgtttggattagCTG	7764
318_1	3	1.4	0.14	0.01	ACAggatatggaaGGG	7880
320_1	2	2.4	0.22	0.03	GAgtaatttcaacAGG	7891
324_1	0	2.4	0.44	0.05	CAgcttactattaGGG	7906
336_1	0	2.5	0.21	0.03	GATGatttaattctagtCA	7984
342_1	1	2.2	0.12	0.01	CAGAttgatggtagTT	8030
343_1	4	1.8	0.11	0.01	CTcagattgatgGTAG	8032
344_1	0	0.9	0.12	0.01	GTTagccctcagaTTG	8039
345_1	0	2.3	0.36	0.04	TGtattgttagcCCTC	8045
346_1	1	2.1	0.22	0.02	ACttgtattgttAGCC	8048
349_1	4	2.9	0.21	0.03	ACAagtggtatctTCT	8228
359_1	6	2.9	0.39	0.05	TTGAtgaggctaagTC	8395
360_1	0	1.7	0.18	0.02	CCAggattatactcTT	8439
374_1	5	1.7	0.33	0.03	AAGatggattgggaGT	8775
408_1	3	1.8	0.21	0.02	TTtgcatatggaGGTG	8966
409_1	0	1.8	0.21	0.02	AAgtgaagttcaaCAGC	8997
415_1	0	1.4	0.23	0.02	AAttgagtgaatCCAA	9120
417_1	7	0.9	0.15	0.01	GTGataattgagtGAA	9125
424_1	6	3.2	0.19	0.03	CTcattgaaggtTCTG	9281
429_1	5	2.5	0.48	0.05	CAAatagctttatCGG	9335
430_1	1	2.7	0.68	0.09	CCaaatagctttATCG	9336
458_1	0	4.1	0.35	0.07	TGgagtttatattcTAGG	9512
464_1	0	4.1	0.56	0.10	TGCtccagtgtaccCT	9755
466_1	1	2.1	0.21	0.02	CTAattgtagtagtaCTC	9818
474_1	0	2.4	0.27	0.03	GACacactcagatttcAG	9967
490_1	0	1.9	0.29	0.03	TTacttaatttcttTGGA	10055
493_1	3	1.8	0.20	0.02	CTTatgatacaacTTA	10384
512_1	0	3.3	0.63	0.10	GCacaacccagaggAA	10735
519_1	5	1.5	0.15	0.01	TAgatttgtgagGTAA	11055
529_1	0	2.7	0.24	0.03	AGAgctttattcatgtTT	11197
533_1	6	1.5	0.14	0.01	TAGattgtttagtGCA	11228
534_1	5	0.9	0.06	0.00	GTagattgtttaGTGC	11229
547_1	1	1.6	0.26	0.02	TAGGataccacattatGA	11389
566_1	0	3.0	0.40	0.06	ATaaacatgaatctCTCC	11801
567_1	2	2.5	0.34	0.04	CTTtataaacatgaaTCTC	11804
578_1	2	1.3	0.09	0.01	TACAtttattgggcTC	12081
582_1	1	1.6	0.20	0.02	AATCatgttggtacAT	12092
601_1	1	2.1	0.47	0.05	GTAAatggcaggaaCC	13711
619_1	4	3.4	0.44	0.08	TAtgacactgcaTCTT	15317
620_1	1	1.2	0.12	0.01	GTAtgacactgcaTCT	15318
636_1	0	1.3	0.19	0.01	AACAtcagacaacTCTA	15693
638_1	0	2.2	0.36	0.04	TAACatcagacaacTC	15695
637_1	0	2.1	0.21	0.02	TTTAacatcagacaACTC	15695
640_1	2	3.3	0.42	0.06	CCtatttaacatcAGAC	15700
645_1	1	2.9	0.34	0.04	GAtccttatattCTGG	15854
650_1	0	2.4	0.24	0.03	AGgatcttactgtCATT	15877
651_1	4	3.4	0.33	0.05	GCAaatcaactccATC	15896
652_1	0	1.3	0.16	0.01	GTGcaaatcaactCCA	15898
653_1	4	2.0	0.09	0.01	CAATtatttctttgTGC	15910
658_1	3	1.6	0.32	0.02	TCaatagtgtagggCA	16093
659_1	5	1.4	0.20	0.01	TTCaatagtgtaggGC	16094
660_1	4	2.1	0.22	0.02	AGGTtaattaattcaATAG	16102
665_1	3	1.8	0.18	0.02	GTTtaaatttcaagTTCT	16185
678_1	3	2.1	0.43	0.04	GAgttcttgtgttaGC	16457
679_1	0	3.5	0.31	0.05	ATTaattatccatCCAC	16590
680_1	4	1.6	0.12	0.01	ATCaattaattatcCATC	16593
682_1	3	2.4	0.27	0.03	TGagataccgtgcaTG	16656
683_1	0	3.2	0.16	0.03	AAtgagataccgTGCA	16658
684_1	2	2.3	0.25	0.03	CTGtggttaggctaAT	16834
687_1	5	1.3	0.13	0.01	AGCagatgggttaaGA	16858
694_1	0	1.7	0.16	0.02	GAAtgaaacttgcCTG	17047
706_1	15	3.6	0.27	0.06	GAtgatttgcttGGAG	17646
716_1	10	2.1	0.15	0.02	GTCaaccagagtatTA	18068
728_1	5	1.2	0.09	0.01	AACttgaatggctTGG	18881
733_1	0	12.7	8.01	3.62	CAGagttaataatAAG	19327
734_1	0	14.6	3.49	2.39	GTTCaagcacaacgAA	19493
735_1	0	2.5	0.30	0.04	AGggttcaagcacAAC	19496

在實例1中所闡述之活體外效能分析中在THP-1中使用1:3連續水溶液(25 µM至0.004 µM)來測試來自表6之所選寡核苷酸。評價寡核苷酸之IC 50及最大抑制(殘餘PD-L1表現百分比)。在GraphPad Prism6中實施EC50計算。IC50及最大PD-L1敲低量展示於表12中(以經對照(PBS)處理之細胞之%形式)。表12：THP1細胞系中之最大抑制(呈鹽水之%形式)及EC50。

CMP ID NO	最大抑制 ( 殘餘PD-L1 表現% ；鹽水之%)	EC50 (µM)	化合物 CMP	SEQ ID NO: 1 上之起點
Avg	SD	Avg	SD
6_1	12	11.5	0.73	0.38	TCGCataagaatgaCT	371
8_1	6	5.6	0.11	0.04	CTGaacacacagtCGC	383
9_1	1	14.3	0.36	0.27	TCTgaacacacagtCG	384
13_1	2	12.4	0.49	0.31	CTtacttagatgcTGC	495
41_1	14	14.6	0.38	0.27	TCAtttagttaccCAA	822
42_1	21	10.4	0.22	0.10	TTcatttagttaCCCA	823
58_1	6	19.8	0.97	0.81	CCagagatatataTGC	909
77_1	5	4.8	0.14	0.04	AGTatcatagttcTCC	1075
92_1	0	12.9	0.57	0.39	AGattaagacagtTGA	1310
128_1	15	10.1	0.23	0.13	CTcatatcagggCAGT	2063
151_1	9	14.4	0.18	0.15	GTCatggattacaaCT	2324
164_1	16	22.0	0.57	0.60	TCTGtttatgtcacTG	2781
166_1	13	11.9	0.17	0.11	TGgtctgtttatGTCA	2784
169_1	0	9.3	0.22	0.11	TTcagcaaatatTCGT	2995
171_1	11	12.9	0.28	0.20	TCTattgttaggtATC	3053
222_1	16	19.7	0.68	0.64	TGacttgtaattgTGG	5467
245_1	14	6.1	0.26	0.08	TCggttatgttaTCAT	6470
246_1	28	7.3	0.10	0.20	CActttatctggTCGG	6482
252_1	19	8.0	0.29	0.12	TCAtattgctaccATA	6618
272_1	3	9.7	0.25	0.14	TACTgtagaacatgGC	7133
314_1	13	9.6	0.31	0.15	GAgtttggattagCTG	7764
344_1	11	8.0	0.14	0.06	GTTagccctcagaTTG	8039
349_1	12	12.5	0.18	0.14	ACAagtggtatctTCT	8228
415_1	11	9.6	0.26	0.12	AAttgagtgaatCCAA	9120
493_1	15	16.5	0.48	0.34	CTTatgatacaacTTA	10384
512_1	43	14.1	0.31	0.68	GCacaacccagaggAA	10735
519_1	9	12.2	0.45	0.26	TAgatttgtgagGTAA	11055
533_1	11	13.6	0.29	0.21	TAGattgtttagtGCA	11228
534_1	9	6.5	0.09	0.03	GTagattgtttaGTGC	11229
582_1	0	12.3	0.33	0.23	AATCatgttggtacAT	12092
619_1	8	10.4	0.32	0.18	TAtgacactgcaTCTT	15317
620_1	12	24.6	1.10	1.08	GTAtgacactgcaTCT	15318
638_1	2	5.4	0.00	0.00	TAACatcagacaacTC	15695
645_1	20	29.6	1.10	1.50	GAtccttatattCTGG	15854
651_1	0	11.2	0.14	0.09	GCAaatcaactccATC	15896
658_1	11	13.8	0.48	0.32	TCaatagtgtagggCA	16093
659_1	0	8.2	0.11	0.06	TTCaatagtgtaggGC	16094
733_1	0	69.6	11.03	26.95	CAGagttaataatAAG	19327
734_1	36	16.8	2.84	2.12	GTTCaagcacaacgAA	19493

表7及8中之結果亦展示於圖2中(與其靶向SEQ ID NO: 1之PD-L1 mRNA前體之位置相關)。自此圖可看到，幾乎所有化合物皆具有低於1 µM之EC50值及低於25%之對照細胞(經鹽水處理)中之PD-L1表現程度之靶敲低。實例3 -聚(I:C)誘導之小鼠中使用裸及GalNAc偶聯之PD-L1反義寡核苷酸之活體外功效及效能及活體內PD-L1降低在活體外實驗之劑量-反應研究中於MCP-11細胞中使用表6中之寡核苷酸來實施效能及功效測試。在聚(I:C)誘導之C57BL/6J雌性小鼠中於活體內測試相同寡核苷酸以及GalNAc偶聯形式(表8 CMP ID NO 755_2 - 765_2)降低PD-L1 mRNA及蛋白質表現之能力。 活體外分析將懸浮於DMEM (Sigma目錄編號D0819，補充有10%馬血清、2 mM L-麩醯胺酸、0.025 mg/ml慶大黴素(gentamicin)及1 mM丙酮酸鈉)中之MCP-11細胞(最初購自ATCC)以8000細胞/孔之密度添加至96孔圓底板中之寡核苷酸(10µl)中且以200 µl/孔之最終體積在37℃及5% CO ₂下於加濕培育器中培養3天。以劑量範圍濃度(50 µM、15.8 µM、5.0 µM、1.58 µM、0.5 µM、0.158 µM、0.05 µM及0.0158 µM)篩選寡核苷酸。根據製造商說明書使用PureLink Pro 96 RNA純化套組(Ambion)來提取總RNA。根據製造商說明書使用M-MLT逆轉錄酶、隨機十聚體RETROscript、RNase抑制劑(Ambion)及100 mM dNTP組(Invitrogen，PCR等級)來合成cDNA。對於基因表現分析，使用TaqMan Fast Advanced Master Mix (2×) (Ambion)以雙螺旋體設置利用TaqMan引子分析針對PD-L1 (Thermo Fisher Scientific；FAM-MGB Mm00452054-m1)及Gusb (Thermo Fisher Scientific; VIC-MGB-PL Mm01197698-m1)來實施qPCR。相對PD-L1 mRNA表現程度以殘餘PD-L1表現%於PBS對照試樣(經PBS處理細胞)之%示於表9中。在GraphPad Prism6中實施EC50計算。EC50及最大PD-L1敲低量以對照(PBS)細胞之%示於表13中。 活體內分析 向C57BL/6J雌性小鼠(20-23 g；5隻小鼠/組)經皮下注射5 mg/kg靶向小鼠PD-L1之未偶聯寡核苷酸或2.8 mg/kg靶向小鼠PD-L1之GalNAc偶聯之寡核苷酸。3天後，小鼠經靜脈內注射10 mg/kg聚(I:C) (LWM, Invivogen)。在聚(I:C)注射之後5 h將小鼠處死且將肝試樣置於RNAlater (Thermo Fisher Scientific)中用於RNA提取或冷凍於乾冰上用於蛋白質提取。根據製造商說明書使用PureLink Pro 96 RNA純化套組(Ambion)自均質化肝試樣來提取總RNA。根據製造商說明書使用M-MLT逆轉錄酶、隨機十聚體RETROscript、RNase抑制劑(Ambion)及100 mM dNTP組(Invitrogen，PCR等級)來合成cDNA。對於基因表現分析，使用TaqMan® Fast Advanced Master Mix TaqMan Fast Advanced Master Mix (2×) (Ambion)以雙螺旋體設置利用TaqMan引子分析針對PD-L1 mRNA (Thermo Fisher Scientific；FAM-MGB Mm00452054-m1)及TBP (Thermo Fisher Scientific; VIC-MGB-PL Mm00446971_m1)來實施qPCR。相對PD-L1 mRNA表現程度示於表13中(以使用鹽水及聚(I:C)注射之小鼠之對照試樣之%)。藉由在2 ml/100 mg組織之T-PER®組織蛋白提取試劑(Thermo Fisher Scientific) (與1× Halt蛋白酶抑制劑混合劑混合，無EDTA (Thermo Fisher Scientific))中均質化肝試樣來製備肝均質物。根據製造商說明書使用Coomassie Plus (Bradford)分析試劑(Thermo Scientific)來量測肝均質物中之蛋白質濃度。在4-12% Bis-Tris Plus聚丙烯醯胺凝膠(Thermo Fisher Scientific)上於1×MOPS運行緩衝液中分離肝均質物(40 µg蛋白質)且根據製造商說明書使用iBLOT乾燥印漬系統(Thermo Fisher Scientific)轉移至硝基纖維素膜中。在64 kDa帶處將每一印漬水平切割成兩個部分。在含有5%脫脂奶粉及0.05% Tween20之TBS中阻斷後，將膜與兔單株抗紐蛋白(Abcam目錄編號ab129002，以1:10000稀釋於含有5%脫脂奶粉及0.05% Tween20之TBS中，上膜)或山羊多株抗mPD-L1 (R&D Systems目錄編號AF1019，以1:1000稀釋，下膜)一起在4℃下於培育過夜。在含有0.05% Tween20之TBS中洗滌膜，且在室溫下暴露與HRP偶聯之豬抗兔IgG (DAKO，以1:3000稀釋於含有5%脫脂奶粉及0.05% Tween20之TBS中，上膜)或HRP偶聯之兔抗山羊IgG (DAKO，以1:2000稀釋) 1 h。在洗滌膜後，使用ECL select (Amersham GE Healthcare)檢測反應性。對於使用寡核苷酸治療之每一組小鼠而言，藉由與注射有鹽水及聚(I:C) (對照)之小鼠之PD-L1/紐蛋白帶強度進行比較來評估與紐蛋白帶相關之PD-L1帶的強度。結果展示於表13中，且使用裸寡核苷酸及偶聯寡核苷酸之對之西方印漬展示於圖9 A-E中。表13：靶向小鼠PD-L1之寡核苷酸之活體外及活體內效能

CMP ID NO	化合物 CMP	最大抑制(PBS%)	EC50 (µM)	PD-L1 mRNA ( 對照 %)	PD-L1 蛋白 ( 相對於對照 )
744_1	AGTttacattttcTGC	9.1	0.56	86	++
746_1	CACctttaaaaccCCA	5.0	0.46	181	nd
747_1	TCCtttataatcaCAC	4.4	0.52	104	++
748_1	ACGgtattttcacAGG	1.8	0.26	102	+++
749_1	GACactacaatgaGGA	7.6	1.21	104	nd
750_1	TGGtttttaggacTGT	12.4	0.74	84	nd
751_1	CGAcaaattctatCCT	9.9	0.69	112	nd
752_1	TGAtatacaatgcTAC	10.5	1.11	142	+++
753_1	TCGttgggtaaatTTA	5.7	0.53	116	+++
754_1	TGCtttataaatgGTG	5.2	0.35	98	nd
755_2	5'-GN2-C6-caAGTttacattttcTGC	nd	nd	58	+
757_2	5'-GN2-C6-caCACctttaaaaccCCA	nd	nd	62	nd
758_2	5'-GN2-C6-caTCCtttataatcaCAC	nd	nd	53	+
759_2	5'-GN2-C6-caACGgtattttcacAGG	nd	nd	66	+
760_2	5'-GN2-C6-caGACactacaatgaGGA	nd	nd	101	nd
761_2	5'-GN2-C6-caTGGtttttaggacTGT	nd	nd	99	nd
762_2	5'-GN2-C6-caCGAcaaattctatCCT	nd	nd	84	nd
763_2	5'-GN2-C6-caTGAtatacaatgcTAC	nd	nd	93	+++
764_2	5'-GN2-C6-caTCGttgggtaaatTTA	nd	nd	53	+
765_2	5'-GN2-C6-caTGCtttataaatgGTG	nd	nd	106	nd

+++：類似於對照之PD-L1/紐蛋白帶強度；++：弱於對照之PD-L1/紐蛋白帶強度；+：遠弱於對照之PD-L1/紐蛋白帶強度；nd=未測定。自表13中之數據可看到，寡核苷酸之GalNAc偶聯明顯改良活體內PD-L1降低。mRNA之降低通常與PD-L1蛋白之降低相關。除CMP ID NO: 754_1外，在寡核苷酸偶聯至GalNAc後，低活體外EC50值通常反映良好活體內PD-L1 mRNA降低。實例4 -來自聚(I:C)誘導之小鼠中之經分選肝細胞及非實質細胞中之活體內PK/PD 在自聚(I:C)誘導之小鼠分離之肝細胞及非實質細胞中探究裸寡核苷酸及GalNAc偶聯之寡核苷酸之分佈以及PD-L1 mRNA降低。向C57BL/6J雌性小鼠(n=3隻/組)經皮下注射靶向小鼠PD-L1 mRNA之5 mg/kg未偶聯寡核苷酸(748_1)或7 mg/kg GalNAc偶聯之寡核苷酸(759_2)。2天後，向小鼠經腹膜腔內注射15 mg/kg聚(I:C) (LWM, Invivogen)。在聚(I:C)注射之後將小鼠麻醉18-20 h且使用含有15 mM Hepes及0.38 mM EGTA之漢克氏平衡鹽溶液經由腔靜脈以7 ml/min之流速灌注肝5 min，隨後使用膠原酶溶液(含有0.17 mg/ml膠原酶類型2 (Worthington 4176)、0.03% BSA、3.2 mM CaCl ₂及1.6 g/l NaHCO ₃之漢克氏平衡鹽溶液)灌注12 min。在灌注後，取出肝且打開肝囊，經由70 µm細胞過濾器使用威廉E培養基(William E medium)過濾肝懸浮液且取出細胞懸浮液之等分試樣(=混合肝臟細胞)以用於隨後分析。將其餘細胞懸浮液在50×g下離心3 min。收集上清液以用於非實質細胞之隨後純化。將糰粒再懸浮於25 ml威廉E培養基(Sigma目錄編號W1878，補充有1× Pen/Strep、2 mM L-麩醯胺酸及10% FBS (ATCC 30-2030號))中，與含有90% percoll之25 ml威廉E培養基混合且藉由在50×g下離心10 min來沈澱肝細胞。在威廉E培養基中洗滌2次後，將沈澱之肝細胞再懸浮於威廉E培養基中。將含有非實質細胞之上清液在500×g下離心7 min且將細胞再懸浮於4 ml RPMI培養基中並經由兩層percoll (25%及50% percoll)在1800×g下離心30 min。在收集兩個percoll層之間之非實質細胞後，洗滌細胞且再懸浮於RPMI培養基中。根據製造商說明書使用PureLink Pro 96 RNA純化套組(Ambion)自純化肝細胞、非實質細胞及總肝懸浮液(未分級分離之肝臟細胞)來提取總RNA。根據製造商說明書使用M-MLT逆轉錄酶、隨機十聚體RETROscript、RNase抑制劑(Ambion)及100 mM dNTP組(Invitrogen，PCR等級)來合成cDNA。對於基因表現分析而言，使用TaqMan Fast Advanced Master Mix (2×) (Ambion)以雙螺旋體設置利用TaqMan引子分析針對PD-L1 (Thermo Fisher Scientific；FAM-MGB Mm00452054-m1)及TBP (Thermo Fisher Scientific; VIC-MGB-PL Mm00446971_m1)。相對PD-L1 mRNA表現程度展示於表10中(以來自使用鹽水及聚(I:C)注射之小鼠之對照試樣之%形式)。使用ELISA採用利用序列5´-TACCGT-s-Bio-3'之生物素化捕獲探針及利用序列5´- DIG-C12-S1-CCTGTG - 3´之地高辛偶聯檢測探針來實施寡核苷酸含量分析。該等探針僅由具有磷酸二酯主鏈之LNA組成。將肝試樣(大約50 mg)在含有一種5mm不銹鋼珠粒之2 mL埃彭道夫管(Eppendorf tube)中於1.4 mL MagNa純裂解緩衝液(Roche目錄編號03604721001)中均質化。將試樣在Retsch MM400均質器(Merck Eurolab)上均質化直至獲得均勻裂解物為止。將試樣在室溫下培育30 min。藉由將未偶聯反義寡核苷酸化合物(CMP ID NO 748_1)以界定濃度摻加至未處理肝試樣中且將其處理為試樣來生成標準。選擇摻加濃度以匹配預期試樣寡核苷酸含量(在約10倍內)。將均質化試樣在5 × SSCT緩衝液(750 mM NaCl及75 mM檸檬酸鈉，含有0.05 % (v/v) Tween-20，pH 7.0)中稀釋最少10倍且使用捕獲-檢測溶液(於5×SSCT緩衝液中之35 nM捕獲探針及35 nM檢測探針)製備經6次2倍稀釋之一系列稀釋液並在室溫下培育30 min。將試樣轉移至96孔鏈黴抗生物素蛋白(Streptavidin)塗覆板(Nunc目錄編號436014)中且使每孔含有100 µL。將板在室溫及輕微攪動下培育1小時。使用2 × SSCT緩衝液洗滌三次且向每一孔中添加以1:4000稀釋於PBST (磷酸鹽緩衝鹽水，含有0.05 % (v/v) Tween-20，pH 7.2，新製)中之100 μL抗DIG-AP Fab片段(Roche Applied Science，目錄編號11 093 274 910)，並在室溫及輕微攪動下培育1小時。使用2 × SSCT緩衝液洗滌三次且添加100 μL鹼性磷酸酶(AP)受質溶液(藍磷基質(Blue Phos Substrate)，KPL產品代碼50-88-00，新製)。在培育30分鐘之後於輕微攪動下以分光光度方式在615 nm下量測色彩強度。將原始數據自讀數器(Gen5 2.0軟體)輸出為excel格式且在excel中進一步分析。使用GraphPad Prism 6軟體及邏輯4PL回歸模型生成標準曲線。表14：來自使用未偶聯寡核苷酸及GalNAc偶聯之寡核苷酸治療之聚(I:C)小鼠(n=3)之總肝懸浮液、肝細胞及非實質細胞中的PD-L1表現及寡核苷酸含量。

細胞類型	CMP ID no	PD-L1 表現 ( 鹽水- 聚(I:C) 之%)	寡核苷酸含量 (ng/10 ⁵ 個細胞 )
Avg	SD	Avg	SD
總肝臟細胞	748_1	31	12.4	2.3	0.3
759_2	28	5.3	8.3	1.1
肝細胞	748_1	33	8.0	5.1	3.7
759_2	7	1.0	43.8	18.9
非實質細胞	748_1	31	10.1	2.2	0.7
759_2	66	1.6	1.7	0.9

結果展示，裸(CMP ID NO: 748_1)及偶聯(CMP ID NO: 759_2)寡核苷酸同等程度地降低總肝臟細胞中之PD-L1 mRNA。在經分離肝細胞中，偶聯寡核苷酸之效應幾乎強於裸寡核苷酸之效應5倍，而裸寡核苷酸展示其效應強於非實質細胞中之GalNAc偶聯之寡核苷酸兩倍。在肝細胞及非實質細胞中， PD-L1 mRNA表現之降低在一定程度上與該等細胞類型中之寡核苷酸含量相關。實例5 -使用裸及GalNAc偶聯之PD-L1反義寡核苷酸之AAV/HBV小鼠中之活體內PD-L1敲低在本發明研究中，使用裸或GalNAc偶聯之PD-L1反義寡核苷酸治療AAV/HBV小鼠，且在肝中評估PD-L1 mRNA表現及HBV基因表現。在第-1週使用媒劑(鹽水)、裸PD-L1反義寡核苷酸(CMP ID NO 752_1，在5 mg/kg下，經皮下)及GalNAc PD-L1反義寡核苷酸(CMP ID NO 763_2，在7 mg/kg下，經皮下)預處理5-8週齡雌性HLA-A2/DR1小鼠(5隻動物/組)，該等劑量對應於等莫耳濃度之寡核苷酸。在第0週藉由5× 10 ¹⁰vg AAV-HBV轉導小鼠(關於其他細節，參見材料及方法部分中之AAV/HBV小鼠模型闡述)。自AAV-HBV轉導後W1至W4，使小鼠接受4次PD-L1寡核苷酸或媒劑(鹽水溶液)之其他皮下注射且相隔一週給予。在轉導之前一週及在每一注射之後一週獲取血樣。在最後注射之後兩週將小鼠處死且在PBS灌注後取出其肝。將肝切割成較小切片且直接冷凍。為量測HBV基因表現，利用Qiagen Biorobot使用 the QIAamp One for all核酸套組(目錄編號965672)自血清提取DNA，將血清以1:20稀釋度稀釋於PBS中，在200ul緩衝液AL中裂解總共100 µl。自套組在100 µl中洗脫DNA。對於實時qPCR而言，將TaqMan Gene Expression Master Mix (目錄編號4369016，Applied Biosystems)與藉由添加1:1:0.5之下列引子F3_core、R3_core、P3_core (Integrated DNA Technologies，皆各自以100uM重構)來製得之引子混合物一起使用：正向(F3_core)：CTG TGC CTT GGG TGG CTT T (SEQ ID NO: 784) 反向(R3_core)：AAG GAA AGA AGT CAG AAG GCA AAA(SEQ ID NO: 785) 探針(P3_core)：56-FAM-AGC TCC AAA/ZEN/TTC TTT ATA AGG GTC GAT GTC CAT G-3IABkFQ(SEQ ID NO: 786) 使用10倍稀釋液(始於1×10 ⁹個拷貝/µl至1個拷貝/µl且以5µl/反應使用)製得使用HBV質體(基因型D，GTD)之標準曲線。對於每一反應而言，添加10µl Gene Expression Master Mix、4.5µl水、0.5µl引子混合物及5µl試樣或標準且運行qPCR。對於分析而言，使用標準曲線計算拷貝數/ml/孔。結果展示於表15中。使用qPCR量測PD-L1 mRNA表現。自添加至含有陶瓷珠粒(Lysing Matrix D管，116913500, mpbio)及1ml Trizol之2ml管中之經冷凍肝切片提取mRNA。使用Precellys組織破碎器將肝切片均質化。將200µl氯仿添加至均質物中，渦旋且在4℃及10000rpm下離心20min。將含有RNA之澄清相(大約500ul)轉移至新管中且添加相同體積之70% EtOH。在充分混合之後，將溶液轉移至RNeasy自旋管柱上且遵循RNeasy套組之人工RNeasy微型套組(目錄編號74104，Qiagen) (包含RNA消解RNase-free DNase Set，目錄編號79254) 進一步提取RNA。在50µl H ₂O中洗脫。對於所有試樣而言，量測最終RNA濃度且調節至100ng/ul。根據製造商說明書在7.5µl RNA下使用Taqman RNA-to-ct 1-step套組(目錄編號4392938，Thermo Fisher)實施qPCR。所用引物混合物含有PD-L1_1-3 (引物編號Mm00452054_m1、Mm03048247_m1及Mm03048248_m1)及內源性對照(ATCB Mm00607939_s1、CANX Mm00500330_m1、YWHAZ Mm03950126_s1及GUSB Mm01197698_m1) 使用2^-ddct方法分析數據。使用所有4種內源性對照之平均值來計算dct值。PD-L1表現係相對於內源性對照之平均值且以鹽水之%形式表15：使用未偶聯及GalNAc偶聯之寡核苷酸治療之AAV/HBV小鼠(n=5)中之PD-L1 mRNA表現及HBV DNA。

	CMP ID no	PD-L1 mRNA 表現 ( 鹽水之%)	HBV DNA 表現 ( 鹽水之 %)
Avg	SD	Avg	SD
裸	752_1	55	35	72	16
GalNAc偶聯	763_2	34	3	79	9

自該等結果可看到，裸寡核苷酸及GalNAc偶聯之寡核苷酸能夠降低AAV/HBV小鼠之肝中之PD-L1 mRNA表現，其中GalNAc偶聯之寡核苷酸略微較佳。兩種寡核苷酸亦使得血清中之HBV DNA略有降低。實例6 -對AAV/HBV小鼠中之T細胞反應之活體內效應在本發明研究中，使用靶向PD-L1之抗體或反義寡核苷酸治療來自巴斯德之AAV/HBV小鼠。反義寡核苷酸係裸反義寡核苷酸或偶聯至GalNAc。在治療期間，使用針對HBs及HBc抗原之DNA疫苗對動物實施免疫(參見材料及方法部分)以確保T細胞由抗原呈遞細胞有效引發。評估該治療如何影響肝及脾中之細胞群體以及該等群體上之PD-L1表現及是否可鑑別HBV特異性T細胞反應。 治療方案 ：根據下文方案來治療雌性HLA-A2/DR1小鼠。在兩個單獨子研究中實施研究，其中投與方案略有差異，如下表16及17中所指示。如材料及方法部分中所闡述來投與DNA疫苗及抗PD-L1抗體。所用反義寡核苷酸係5 mg/kg CMP ID NO 748_1 (裸)及7mg/kg CMP ID NO: 759_2 (GalNAc偶聯)，二者皆係以皮下注射(s.c.)形式來投與。表16：使用DNA疫苗及DNA疫苗+抗PD-L1抗體之AAV/HBV小鼠治療方案，每組6隻小鼠

天	媒劑 (第10組)	DNA疫苗 (第11組)	DNA疫苗+抗PDL-1 Ab (第13組)
0	AAV/HBV
29*	動物隨機化
34	鹽水+同型	-	Ab
41	鹽水+同型	-	Ab
48	鹽水+同型	-	Ab
50	-	CaTx	CaTx
55*	PBS+同型	DNA	DNA+Ab
62	鹽水+同型	-	Ab
69	PBS+同型	DNA	DNA+Ab
76*	鹽水+同型	-	Ab
83	鹽水+同型	-	Ab
97*	處死

同型=小鼠IgG對照Ab，CaTx =心臟毒素，DNA = DNA疫苗，Ab=抗PD-L1 Ab且*=血清收集表17：使用DNA疫苗及DNA疫苗+裸或偶聯PD-L1寡核苷酸(ASO)之AAV/HBV小鼠治療方案，每組7隻小鼠

天	媒劑 (第1組)	DNA疫苗 (第2組)	DNA疫苗 + PDL-1 ASO (第7組)	DNA疫苗 + GN-PDL-1 ASO (第8組)
0	AAV/HBV
29*	動物隨機化
39	鹽水	鹽水
41		鹽水	ASO	GN-ASO
46	鹽水	鹽水
49		鹽水	ASO	GN-ASO
53	鹽水	鹽水
55	CaTx	CaTx	CaTx	CaTx
56		鹽水	ASO	GN-ASO
59	PBS+鹽水	DNA+PBS	DNA	DNA
62*		鹽水	ASO	GN-ASO
67	鹽水	鹽水
70		鹽水	ASO	GN-ASO
74	PBS+鹽水	DNA+PBS	DNA	DNA
77		鹽水	ASO	GN-ASO
81	鹽水	鹽水
84*		鹽水	ASO	GN-ASO
88	鹽水	鹽水
91		鹽水	ASO	GN-ASO
102	處死

DNA = DNA疫苗，CaTx =心臟毒素，Ab=抗PD-L1 Ab，ASO=裸PDL-1寡核苷酸，GN-ASO= GalNAc-PDL-1寡核苷酸且*=血清收集在處死時，收集來自每一組之每一小鼠之血液、脾及肝單核細胞且消耗紅血球(裂解緩衝液，BD biosciences, 555899)。肝單核細胞需要如材料及方法部分中所闡述之特定製備。 細胞群體 ：在肝中，藉由肝單核細胞上之表面標記(參見材料及方法)使用細胞術來分析細胞群體。與對照組(亦即媒劑及DNA免疫化組)相比，經治療小鼠之脾及肝中之NK細胞頻率並未發現顯著變化。表18展示，在肝中，使用裸PD-L1寡核苷酸(CMP ID NO 748_1)及GalNAc偶聯之PD-L1寡核苷酸(CMP ID NO: 759_2)治療之組之T細胞數與亦呈現於圖10 A中的任一對照組(亦即媒劑及DNA免疫化組)相比顯著增加。此增加係源於CD4+及CD8+ T細胞群體有所增加(分別在表18及圖10B及10C中)。表18：在治療後之肝中之T細胞(以百萬個細胞之形式)

	T細胞 (百萬)	CD4+ T細胞 (百萬)	CD8+ T細胞 (百萬)
Avg	Std	Avg	Std	Avg	Std
媒劑(組1)	0.77	0.44	0.51	0.35	0.11	0.05
DNA疫苗(組2)	0.90	0.24	0.58	0.16	0.16	0.08
DNA疫苗+ 抗PD-L1 Ab (組13)	1.98	0.90	1.40	0.81	0.41	0.23
媒劑(組10)	1.73	0.87	1.13	0.55	0.40	0.25
DNA疫苗(組11)	1.27	0.97	0.79	0.58	0.32	0.32
DNA疫苗+ PD-L1 ASO(組7)	3.78	1.31	2.46	0.72	0.79	0.39
DNA疫苗+ GN-PD-L1 ASO(組8)	3.33	0.66	2.18	0.40	0.67	0.17

PD-L1 表現：在處死時，在來自脾及肝之巨噬球、B及T細胞上評估PD-L1蛋白之表現。PD-L1抗體在表面標記抗體混合物(參見材料及方法)中之存在使得可藉由細胞術量化PD-L1表現細胞。在脾中，據觀察，在治療之間表現PD-L1之巨噬球、B細胞及CD4+ T細胞之%並無顯著差異。使用裸PD-L1寡核苷酸(CMP ID NO 748_1)及GalNAc偶聯之PD-L1寡核苷酸(CMP ID NO: 759_2)治療之小鼠中之表現PD-L1之CD8+ T細胞的%低於其他治療(數據未展示)。在肝中，PD-L1主要以32%之平均頻率表現於CD8+ T細胞上且在對照組(分別係兩個媒劑及DNA接種疫苗組組合，圖11A)中為41%。使用裸PD-L1寡核苷酸或GalNAc PD-L1寡核苷酸進行治療使得表現PD-L1之CD8+ T細胞之頻率有所降低(參見表19及圖11A)。亦在ASO治療之後針對B細胞及CD4+ T細胞觀察到表現PD-L1之細胞%具有顯著差異，但該等細胞類型表現顯著小於CD8+ T細胞之PD-L1 (參見表19及圖11B及C)。使用抗PD-L1 Ab進行治療亦使得所有細胞類型中之PD-L1表現明顯降低。然而，此降低可能係由於PD-L1表位由用於治療之抗PD-L1抗體部分地阻斷，從而防止表面標記抗體混合物中之PD-L1檢測抗體預防結合至PD-L1。因此，藉由用於治療之抗PD-L1抗體所達成之PD-L1下調似乎可為治療抗體與檢測抗體之間之表位競爭的結果。表19：具有PD-L1表現之肝臟細胞群體之%

	CD8+ T細胞之%	CD4+ T細胞之%	B細胞之%
	Avg	Std	Avg	Std	Avg	Std
媒劑(組10)	35.5	4.7	0.75	0.52	5.9	1.5
DNA疫苗 (第11組)	36.8	7.7	0.61	0.08	5.5	1.1
DNA疫苗+ 抗PD-L1 Ab (第13組)	18.6	12.3	0.33	0.10	2.9	1.7
媒劑 (第1組)	28.5	11.5	0.64	0.21	5.9	1.7
DNA疫苗 (第2組)	44.9	14.4	1.43	0.69	8.7	3.1
DNA疫苗+ PD-L1 ASO (第7組)	9.6	2.4	0.37	0.21	2.9	0.8
DNA疫苗+ GN-PD-L1 ASO (第8組)	14.6	3.3	0.31	0.11	2.8	0.8

HBV 特異性 T 細胞反應：使用檢測IFNγ及TNFα產生之細胞內細胞介素染色分析(參見材料及方法部分)檢測產生促發炎性細胞介素之NK細胞及CD4+及CD8+ T細胞。在脾中，在處死時，未檢測到分泌IFNγ-及TNFα之NK細胞且可檢測到少量CD4+ T細胞(頻率＜ 0.1%)。在使用裸PD-L1寡核苷酸或GalNAc PD-L1寡核苷酸治療之小鼠以及此研究中僅接受DNA疫苗之小鼠中檢測靶向兩種HBV抗原之產生IFNγ的CD8+ T細胞(數據未展示)。在DNA免疫化HBV攜載小鼠之肝中，在處死時並未檢測到產生IFNγ之NK細胞，而在少數DNA免疫化小鼠之肝中以低頻率檢測到對核心或S2+S具有特異性之產生IFNγ之CD4+ T細胞(＜ 0.4%，數據未展示)。在大部分DNA免疫化小鼠中檢測到產生IFNγ之HBV S2+S 特異性CD8+ T細胞。在使用DNA疫苗及裸PD-L1寡核苷酸或GalNAc PD-L1寡核苷酸之組合治療之小鼠中，分泌IFNγ之CD8+ T細胞之頻率有所增加，而使用抗PD-L1抗體之治療並不向DNA接種疫苗增加任何明顯額外效應(圖12)。在大部分DNA免疫化組(除抗PD-L1抗體外)中檢測到靶向套膜蛋白及核心抗原之產生IFNγ之CD8+ T細胞(圖12B)。大部分S2-S特異性T細胞產生IFNγ及TNFα (圖12C)。結果亦展示於表20中。表20：來自總IFNγ或IFNγ + TNFα細胞群體之HBV抗原(S2-S或核心)特異性CD8+ T細胞之%

	PreS2-S特異性T細胞 (IFNγ細胞之%)	核心特異性T細胞 (IFNγ細胞之%)	S2-S特異性T細胞 (IFNγ + TNFα之%)
	Avg	Std	Avg	Std	Avg	Std
媒劑 (第10組)	0.15	0.37	0.18	0.43	0.00	0.00
DNA疫苗 (第11組)	1.48	1.10	0.47	0.53	0.42	1.02
DNA疫苗+ 抗PDL-1 Ab	1.18	0.95	0	0	0.38	0.49
媒劑 (第1組)	0.17	0.45	0.11	0.28	0.00	0.00
DNA疫苗 (第2組)	1.70	1.02	0.27	0.51	0.98	0.90
DNA疫苗+ PDL-1 ASO	2.56	1.60	0.78	0.80	1.44	1.55
DNA疫苗+ GN-PDL-1 ASO	3.83	2.18	0.68	1.16	2.62	1.62

實例7 -對AAV/HBV小鼠血清中之HBV抗原及HBV DNA之活體內效應在本發明研究中，使用GalNAc偶聯之PD-L1反義寡核苷酸CMP ID NO 759_2治療來自上海之AAV/HBV小鼠(參見材料及方法部分)。評估該治療與媒劑治療動物相比如何影響血清中之HBe及HBs抗原及HBV DNA含量。 治療方案 ：在此研究中使用如在材料及方法部分中之上海模型下所闡述感染攜載HBV基因體(AAV/HBV)之重組腺相關病毒(AAV)之雄性C57BL/6小鼠。經8週每週一次向小鼠(6小鼠/組)注射5 mg/kg反義寡核苷酸CMP ID NO: 759_2或媒劑(鹽水)，其中二者皆係如皮下注射(s.c.)所投與。在治療期間每週以及在治療後6週收集血樣。如下文所闡述在血清試樣中量測HBV DNA、HBsAg及HBeAg含量。前10週之結果展示於表21及圖13中。在歸檔時研究仍在進行，因此，剩餘4週之數據尚未獲得。 HBsAg 及 HBeAg 檢測：在經感染AAV-HBV小鼠中使用HBsAg化學發光免疫分析(CLIA)及HBeAg CLIA套組(Autobio diagnostics Co. Ltd., Zhengzhou,China，目錄編號分別為CL0310-2及CL0312-2)根據製造商方案在血清中來測定血清HBsAg及HBeAg含量。簡言之，將50 μl血清轉移至各別抗體塗覆微量滴定板中且添加50 μl酶偶聯物試劑。將板在室溫下於振盪器上培育60 min，然後利用洗滌緩衝液使用自動洗滌器將所有孔洗滌6次。向每一孔中添加25 μl受質A且然後添加25 μl受質B。將板在室溫下培育10 min，然後使用Envision發光讀數儀量測發光。以單位IU/ml給出HBsAg；其中1 ng HBsAg =1.14 IU。以單位NCU/ml血清給出HBeAg。 HBV DNA 提取及 qPCR ：首先，使用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)將小鼠血清稀釋10倍(1:10)。使用MagNA Pure 96 (Roche)機器人提取DNA。將50μl經稀釋血清在處理柱中與200ul MagNA Pure 96外部裂解緩衝液(Roche，目錄編號06374913001)一起混合且培育10分鐘。然後使用「MagNA Pure 96 DNA及Viral Nucleic Acid Small Volume Kit」 (Roche，目錄編號06543588001)及「Viral NA Plasma SV external lysis 2.0」方案提取DNA。DNA洗脫體積為50 μl。使用Taqman qPCR機器(ViiA7, life technologies)來量化所提取HBV DNA。一式兩份在PCR中測試每一DNA試樣。將5μl DNA試樣添加至384孔板中含有10 μl TaqMan Gene Expression Master Mix (Applied Biosystems，目錄編號4369016)、0.5 μl PrimeTime XL qPCR引子/探針(IDT)及4.5μl蒸餾水之15μl PCR標準混合物中且使用下列設置實施PCR：UDG培育(2min, 50℃)，酶活化(10min, 95℃)及PCR (40個循環，其中在95℃下變性15sec且在60℃下退火及延伸1min)。自C _t值基於HBV質體DNA標準曲線藉由ViiA7軟體來計算DNA拷貝數。用於TaqMan引子及探針(IDT)之序列：正向核心引子(F3_core)：CTG TGC CTT GGG TGG CTT T(SEQ ID NO: 784) 反向引子(R3_core)：AAG GAA AGA AGT CAG AAG GCA AAA (SEQ ID NO: 785) Taqman探針(P3_core)：56-FAM/AGC TCC AAA /ZEN/TTC TTT ATA AGG GTC GAT GTC CAT G/3IABkFQ (SEQ ID NO: 786)。表21：在使用GalNAc偶聯之PD-L1反義寡核苷酸治療後來自AAV/HBV小鼠之血中之清HBV-DNA、HBsAg及HBeAg含量。

	鹽水	CMP ID NO: 759_2 ，在5 mg/kg 下
	HBV-DNA	HBsAg	HBeAg	HBV-DNA	HBsAg	HBeAg
天數	Avg	Std	Avg	Std	Avg	Std	Avg	Std	Avg	Std	Avg	Std
0	7.46	0.35	3.96	0.48	3.23	0.14	7.44	0.29	3.87	0.40	3.17	0.13
7	7.53	0.23	4.17	0.45	3.35	0.10	7.53	0.20	3.91	0.42	3.19	0.18
14	7.57	0.24	4.12	0.49	3.19	0.11	7.45	0.22	3.90	0.50	2.99	0.27
21	7.47	0.27	3.93	0.51	3.12	0.05	7.33	0.47	3.71	0.76	2.78	0.26
28	7.68	0.26	3.88	0.67	3.18	0.13	7.45	0.46	3.65	0.93	2.67	0.38
35	7.69	0.21	4.03	0.54	2.95	0.08	7.13	0.75	2.98	1.05	2.04	0.38
42	7.58	0.23	3.89	0.65	3.34	0.10	6.69	0.89	2.60	1.05	1.98	0.45
49	7.77	0.17	3.54	1.06	3.08	0.26	6.56	1.26	2.19	0.70	1.47	0.37
56	7.71	0.24	3.99	0.86	3.28	0.05	6.21	1.48	2.28	0.84	1.38	0.30
63	7.59	0.28	3.67	1.07	3.25	0.13	6.08	1.39	2.08	0.71	1.35	0.30

自此研究可看到，在治療6週之後，GalNAc偶聯之PD-L1反義寡核苷酸CMP NO 759_2對血清中之HBV-DNAH、BsAg及HBeAg含量降低具有顯著效應，且在治療之後持續至少2週之效應已終止。實例8 -使用GalNAc偶聯之PD-L1寡核苷酸之人類原代肝細胞中之活體外PD-L1敲低使用基因體學探究GalNAc偶聯之PD-L1反義寡核苷酸化合物降低原代人類肝細胞中之PD-L1轉錄之能力。 細胞培養物將經冷藏保存之人類肝細胞以大約5 × 10 ⁶個細胞/ml之密度懸浮於補充有10%胎牛血清、青黴素(100 U/ml)、鏈黴素(0.1 mg/ml)及L-麩醯胺酸(0.292 mg/ml)之WME中且以2 × 10 ⁵細胞/孔之密度接種至膠原塗覆之24孔板中(Becton Dickinson AG, Allschwil, Switzerland)。在開始使用寡核苷酸以100 µM之最終濃度進行處理之前，將細胞預培養4h以使得連接至細胞培養板。所用寡核苷酸展示於表21及表8中，媒劑係PBS。將接種培養基更換為315 µl無血清WME (補充有青黴素(100 U/ml)、鏈黴素(0.1 mg/ml)、L-麩醯胺酸(0.292 mg/ml))且將35 µl於PBS中之1 mM寡核苷酸儲備溶液添加至細胞培養物中並在細胞上保留24小時或66小時。 文庫製備使用Illumina Stranded mRNA化學在Illumina測序平臺上利用2 × 51 bp配對端讀數及每一樣品中30M之最小讀取深度之測序策略(Q squared EA)來描述轉錄物表現。藉由添加350 µl Qiagen RLT緩衝液來在孔中裂解細胞且登錄於隨機化方案中。使用Qiagen RNeasy微型套組純化mRNA。量化mRNA且使用Agilent生物分析儀評價完整性。在經分離RNA之初始品質評價後，據觀察，所有試樣皆符合100ng之輸入品質度量且RIN評分＞7.0。使用Illumina TruSeq Stranded mRNA文庫製備自100 ng總RNA開始來生成用於所有試樣之測序文庫。使用Agilent生物分析儀(DNA 1000套組)分析最終cDNA文庫之大小分佈，藉由qPCR (KAPA Library Quant套組)量化且在製備中正規化至2 nM以用於測序。使用標準簇生成套組v5來使cDNA文庫以等溫方式結合至流動槽表面及cBot以將連接cDNA構築體各自擴增至最高約1000個拷貝之純系簇。藉由邊合成邊測序技術使用TruSeq SBS套組測定DNA序列。 數據處理使用GSNAP短讀數比對程式將長2×51 bp之Illumina配對端測序讀數定位於人類參考基因體hg19上。使用SAMTOOLS程式將SAM格式比對轉換成分選比對BAM格式檔案。基於來自NCBI RefSeq之外顯子注釋(由hg19之相應GTF檔案指定)來估計PD-L1之基因讀取計數。使用DESeq2 R套件應用考慮每一試樣之不同文庫大小之正規化步驟。在與GalNAc偶聯之PD-L1反義寡核苷酸化合物一起培育之後之PD-L1轉錄降低展示於表22中。表22：在使用GalNAc偶聯之寡核苷酸處理後原代一級肝細胞中之PD-L1轉錄降低，n=4

化合物	PD-L1 表現程度，24 h ( 文庫大小調節之計數)	PD-L1 表現程度，66 h ( 文庫大小調節之計數)
媒劑	259	156
159	168
192	136
202	211
767_2	7	7
11	14
22	9
28	15
766_2	16	13
15	10
17	11
29	13
769_2	15	21
18	18
25	18
26	25
768_2	41	25
27	48
31	25
34	22
770_2	21	16
44	62
67	51
38	63

在培育24及66小時之後，在與使用媒劑處理之試樣相比時，所有5種GalNAc偶聯之反義化合物皆展示顯著PD-L1轉錄降低。實例9 -偶聯及裸PD-L1反義寡核苷酸在HBV感染之ASGPR-HepaRG細胞中之EC50 在HBV感染之ASGPR-HepaRG細胞中比較兩種裸及等效GalNAc偶聯PD-L1反義寡核苷酸之功效。 細胞系將HepaRG細胞(Biopredic International, Saint-Gregoire, France)培養於威廉E培養基(補充有10% HepaRG生長補充物(Biopredic))中。自此細胞系，使用慢病毒方法生成穩定過度表現人類ASGPR1及ASGPR2之HepaRG細胞系。以MOI 300使用由Sirion biotech按需產生之編碼人類ASGPR1及2之慢病毒(CLV-CMV-ASGPR1-T2a_ASGPR2-IRES-Puro)在CMV啟動子及嘌呤黴素抗性基因之控制下來轉導增殖HepaRG細胞。使用1µg/ml嘌呤黴素經11天選擇轉導細胞且然後維持於相同濃度之抗生素中以確保轉基因之穩定表現。在mRNA層面下藉由RT-qPCR (ASGPR1：8560倍對非轉導，ASGPR2：2389倍對非轉導)及在蛋白質層面下藉由流式細胞術分析來證實ASGPR1/2過度表現。在感染之前使用1.8% DMSO分化細胞至少2週。HBV基因型D係衍生自HepG2.2.15細胞培養上清液且使用PEG沈澱濃縮。為評估測試化合物針對HBV之活性，使用HBV以20至30之MOI感染96孔板中之分化ASGPR-HepaRG細胞20 h，然後使用PBS將細胞洗滌4次以去除HBV接種物。 寡核苷酸功效將下列寡核苷酸

裸PD-L1 ASO	等效GalNAc 偶聯PD-L1 ASO
CPM ID NO: 640_1	CPM ID NO: 768_2
CPM ID NO: 466_1	CPM ID NO: 769_2

在感染後第7天及第10天使用25µM至0.4 nM之連續稀釋液(於PBS中以1:4稀釋)添加至HBV感染之ASGPR-HepaRG細胞中。在感染後第13天收穫細胞。根據製造商說明書使用MagNA Pure 96 Cellular RNA大體積套組在MagNA Pure 96系統(Roche Diagnostics)上來提取總mRNA。對於基因表現分析而言，如實例5中所闡述來實施RT-qPCR。使用2^-ddct方法分析數據。使用肌動蛋白B作為內源性對照以計算dct值。PD-L1表現係相對於內源性對照及鹽水媒劑。在GraphPad Prism6中實施EC50計算且展示於表23中。表23：ASGPR-HepaRG HBV感染細胞中之EC50，n=4。

CMP ID NO	EC50 (µM)
640_1	2.25
768_2	0.10
466_1	5.82
769_2	0.13

該等數據明確展示，PD-L1反義寡核苷酸之GalNAc偶聯物顯著改良EC50值。實例10 -衍生自慢性HBV患者之PBMC中之T細胞功能刺激探究在末梢血單核細胞(PBMC)之離體HBV抗原刺激之後裸PD-L1反義化合物是否可增加慢性感染HBV (CHB)患者之T細胞功能。將來自三名慢性HBV感染患者之冷凍PBMC解凍且以200’000個細胞/孔之密度接種於100µl培養基(RPMI1640 + GlutaMax+ 8%人類血清+ 25mM Hepes + 1% PenStrep)中。第二天，使用1µM PepMix HBV大套膜蛋白或1µM PepMix HBV核心蛋白(參見表9)使用或不使用5µM CMP ID NO: 466_1或CMP ID NO: 640_1在100µl含有100pg/ml IL-12及5ng/ml IL-7之培養基中刺激細胞(在第8天僅施加伴刀豆球蛋白(Concanavalin)刺激)。4天後，使用含有50IU IL-2之培養基更新PD-L1反義寡核苷酸處理。在第一刺激之後第8天，使用PepMix或5µg/ml伴刀豆球蛋白A以及PD-L1反義寡核苷酸再刺激細胞24h。對於最後5h刺激而言，添加0.1 µl佈雷菲德菌素A (佈雷菲德菌素A)、0.1µl莫能菌素(monensin)及3µl抗人類CD-107 (APC)。在24h之後，使用染色緩衝液(PBS + 1% BSA + 0.09%疊氮化鈉+ EDTA)洗滌細胞且在4℃下施加表面染色30min [抗人類CD3 (BV 605)、抗人類CD4 (FITC)、抗人類CD8 (BV711)、抗人類PDL1 (BV421)、抗人類PD1 (PerCP-Cy5.5)及活及死亡染色(BV510) (BD Biosciences)]。將細胞在4℃下固定於BD固定緩衝液中保持15min。次日早上，使用BD Perm/Wash緩衝液將細胞在4℃下滲透15min且在4℃下實施細胞內染色30mi [抗人類INF( (PE)]。在Perm/Wash緩衝液中洗滌之後，將細胞溶於250µl染色緩衝液中。在BD Fortessa (BD Biosciences)上實施FACS量測。對於分析而言，首先將整個細胞群體選通於活細胞上(活及死亡染色，BV510)，且然後選通於CD3+ (BV605)細胞上。然後將CD3+細胞繪圖為CD107a+ (APC)對IFNγ+ (PE)。結果展示於表24中。表24：PD-L1 ASO處理對來自分離自三名慢性HBV感染患者之PBMC之CD3+ T細胞之效應。

	無抗原刺激	套膜蛋白抗原	核心抗原
鹽水	CMP 466_1	CMP 640_1	鹽水	CMP 466_1	CMP 640_1	鹽水	CMP 466_1	CMP 640_1
INFγ-/ CD107+	1.16	4.95	4.81	4.7	9.12	8.62	3.84	9.66	7.31
2.7	3.59	2.74	2.57	3.69	3.2	3.25	3.34	2.92
3	3.87	3.98	4.59	12.5	10.9	9.23	6.11	6.88
INFγ+/ CD107+	0.12	1.03	1.15	3.19	17.3	18.9	2.38	15.1	5.75
0.49	3.12	1.75	2.73	7	5.34	1.63	2.35	1.9
0.24	1.13	1.5	1.6	8.16	3.06	1.68	1.9	1.91
INFγ+/ CD107-	0.33	1.43	1.08	5.11	7.74	9.47	3.14	7.76	2.83
0.61	2.9	2.26	7.84	5.79	5.78	2.33	2.82	2.95
0.17	1.57	1.72	1.22	2.58	0.99	0.1	0.61	1.04

自該等數據可看到，抗原刺激本身能夠誘導CHB患者(n=3)之PBMC中之T細胞活化(增加表現INFγ(及/或CD107a之CD3+細胞之%)。添加PD-L1反義寡核苷酸CMP 466_1或640_1使得額外增加CD3+ T細胞反應。此增加主要於HBV套膜蛋白刺激組中觀察到。

圖 1：圖解說明實例性反義寡核苷酸偶聯物，其中將寡核苷酸表示為波浪線(A-D)或「寡核苷酸」 (E-H)或T ₂(I)且靶向去唾液酸醣蛋白受體之偶聯物部分係三價N-乙醯基半乳糖胺部分。化合物A至D包括二離胺酸支化劑分子、PEG3間隔體及三個末端GalNAc碳水化合物部分。在化合物A及B中，寡核苷酸無需連接體即直接連接至靶向去唾液酸醣蛋白受體之偶聯物部分。在化合物C及D中，寡核苷酸經由C6連接體直接連接至靶向去唾液酸醣蛋白受體之偶聯物部分。化合物E-I包括三倍增體支化劑分子及具有不同長度及結構之間隔體及三個末端GalNAc碳水化合物部分。圖 2：圖形展示實例2中所測試化合物與其在靶核酸上之位置相關之EC50 (A)及PD-L1敲低 (以鹽水%形式) (B)。測試化合物之細胞系係THP1(●)及Karpas ( )。圖 3：三價GalNAc簇(GN2)之結構式。GN2可用作本發明中之偶聯物部分。波浪線圖解說明簇至(例如) C6胺基連接體或直接至寡核苷酸之偶聯位點。圖 4：CMP ID NO 766_2之結構式。圖 5：CMP ID NO 767_2之結構式。圖 6：CMP ID NO 768_2之結構式。圖 7：CMP ID NO 769_2之結構式。圖 8：CMP ID NO 770_2之結構式。圖 9：檢測來自在使用鹽水及所指示CMP ID NO治療後之聚(IC)誘導動物之肝中之PD-L1蛋白表現的西方印漬(Western blot)。每一印漬展示裸寡核苷酸與相同寡核苷酸之GalNAc偶聯形式，印漬A) CMP ID NO 744_1及755_2，B) CMP ID NO 747_1及758_2，C) CMP ID NO 748_1及759_2，D) CMP ID NO 752_1及763_2及E) CMP ID NO 753_1及764_2。上帶係紐蛋白載量對照，下帶係PD-L1蛋白。每一印漬中之第一泳道展示並無聚(IC)誘導之鹽水治療小鼠。該等小鼠表現極少PD-L蛋白。圖 10：在使用●媒劑(組10及1)、◆ DNA疫苗(組11及2)、○抗PD-L1抗體(組12)、▲裸PD-L1 ASO + DNA疫苗(組7)或ΔGalNAc偶聯之PD-L1 ASO + DNA疫苗(組8)治療之後肝中之單核細胞之群體，表示每一組之個別動物且藉由每一組之垂直線指示平均值(參見表18)。評價DNA疫苗組與三個治療組之間之統計學顯著性且在存在時其由組間之*指示(* = P＜0.05，*** = P＜ 0.001且**** = P＜0.0001)。A)代表在治療後肝中之T細胞數。B)代表CD4+ T細胞部分且C)代表CD8+ T細胞部分。圖 11：在使用●媒劑(組10及1)、◆ DNA疫苗(組11及2)、○抗PD-L1抗體(組12)、▲裸PD-L1 ASO + DNA疫苗(組7)或ΔGalNAc偶聯之PD-L1 ASO + DNA疫苗(組8)治療之後肝中之PD-L1陽性細胞之調節，表示每一組之個別動物且藉由每一組之垂直線指示平均值(參見表19)。評價DNA疫苗組與三個治療組之間之統計學顯著性且在存在時其由組間之*指示(* = P＜0.05且**** = P＜0.0001)。A)代表在治療後肝中之表現PD-L1之CD8+ T細胞之百分比。B)代表在治療後肝中之表現PD-L1之CD4+ T細胞之百分比且C)代表在治療後肝中之表現PD-L1之B細胞之百分比。圖 12：在使用●媒劑(組10及1)、◆ DNA疫苗(組11及2)、○抗PD-L1抗體(組12)、▲裸PD-L1 ASO + DNA疫苗(組7)或ΔGalNAc偶聯之PD-L1 ASO + DNA疫苗(組8)治療之後肝中之HBV抗原特異性CD8+細胞介素分泌細胞，表示每一組之個別動物且藉由每一組之垂直線指示平均值(參見表20)。評價DNA疫苗組與三個治療組之間之統計學顯著性且在存在時其由組間之*指示(* = P＜0.05)。A)代表在治療後肝中之HBV PreS2+S抗原特異性IFN-γ分泌性CD8+ T細胞之百分比。B)代表在治療後肝中之HBV核心抗原特異性IFN-γ分泌性CD8+ T細胞之百分比，且C)代表在治療後肝中之HBV PreS2+S抗原特異性IFN-γ及TNF-α分泌性CD8+ T細胞之百分比。圖 13：與媒劑(■)相比，在使用GalNAc偶聯之PD-L1反義CMP NO: 759_2 (▼)治療後AAV/HBV小鼠中之HBV-DNA、HBsAg及HBeAg。垂直線指示治療終點。

<![CDATA[<110]]>>  瑞士商赫孚孟拉羅股份公司(F. Hoffmann-La Roche AG)]]&gt;
          <br/><![CDATA[        
          <![CDATA[<120>  用於降低PD-L1表現之寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<130>  TW106108305]]>
          <![CDATA[<150>  EP16160149.7]]>
          <![CDATA[<151>  2016-03-14]]>
          <![CDATA[<160>  786   ]]>
          <![CDATA[<170>  PatentIn version 3.5]]>
          <![CDATA[<210>  1]]>
          <![CDATA[<211>  20064]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  1]]>
          ggcgcaacgc tgagcagctg gcgcgtcccg cgcggcccca gttctgcgca gcttcccgag       60
          gctccgcacc agccgcgctt ctgtccgcct gcaggtaggg agcgttgttc ctccgcgggt      120
          gcccacggcc cagtatctct ggctagctcg ctgggcactt taggacggag ggtctctaca      180
          ccctttcttt gggatggaga gaggagaagg gaaagggaac gcgatggtct agggggcagt      240
          agagccaatt acctgttggg gttaataaga acaggcaatg catctggcct tcctccaggc      300
          gcgattcagt tttgctctaa aaataattta tacctctaaa aataaataag ataggtagta      360
          taggataggt agtcattctt atgcgactgt gtgttcagaa tatagctctg atgctaggct      420
          ggaggtctgg acacgggtcc aagtccaccg ccagctgctt gctagtaaca tgacttgtgt      480
          aagttatccc agctgcagca tctaagtaag tctcttcctg cgctaagcag gtccaggatc      540
          cctgaacgga atttatttgc tctgtccatt ctgagaaccc aaaggagtcc taaaagagga      600
          atggaggagc ctaagaataa aaatagtata ataaaacatt tcttagacac attgaccttg      660
          gcctatgtca aagttcagtc tgggtttgtc ttataacaca aggagtaaaa gtaccattgt      720
          tctacctctt tttttaatac ttgaaaaaaa tttactgtgg atgcttttct atgaattaaa      780
          taaccttcta aaaaatgttt tcattgctgc attcgattag attgggtaac taaatgaaat      840
          taattcctca ctgttgggta taaaggttat ttacagtggt tctgtcttag ccattcactg      900
          aactcattgc atatatatct ctggaatatt gctgattgtt tccttcaagt aaacttagaa      960
          gtgtaactac ttagtcaaag agcctgaata ttttaaaggc cttttgaaga aaactgaaaa     1020
          tgctttccag aaaggatgta tcagttgaca atgacagtcg tcaacagtat ttaaggagaa     1080
          ctatgatact ctgaagaaaa acttagcctt tctcagtaaa agtaggtagg cagaggccac     1140
          atgacagcag ttagagtgtg gtcttcaagg aagtcacaga aatactgtgg ggaattgaaa     1200
          ccccatgtgg aaaatgtaca agagtgtctc agtgtgactg agaaggaggt tgggcatggg     1260
          gtttcatgga gtttaataaa gtttggtcac ttagtagagg tttaataaat caactgtctt     1320
          aatctttgat cctacttaag aatttttttt ttgtttttgt agagatgggg ctcttgttat     1380
          gttgcccagg ctgttctcga actcctagcc tcaggcgatc ctccctcctc aggctccaga     1440
          agtcctggga ttactggcgg gagccaccat gcaggcctct tgctcctact tttgagaaag     1500
          gaagtttaac cggttttttt tgtctttttt tttttttttt tgagacagag tctcactctg     1560
          ttgcccatgc tggagtgcag tggtgcaatc tcagctcact gcctcccggg ttcaagtgat     1620
          tctcctgcct cagcctcccg agtagctggg actacaggca cctgccacca cgcccagcta     1680
          atttttgtat ttttagtaga aatggggttt caccatattg gccaggctga tctcgaactc     1740
          ctgacctcag gtgatccgcc tgcctcggcc tcccaaagtg ctgggattac aggcatgagc     1800
          cactgctcct ggctgcttaa ctttttctct atctcatcct cctacccatc ctacccttgg     1860
          aagatagaga agtagtatta gttccatagt gttatactgg gcttccccca gggacaaacc     1920
          cacttcccca acctgaatga gccatcactt cttccccagt ttacatttca ttgctcttta     1980
          aatgtctcca ttcggatatg ggaattcaca tatggtcata attcttacct gaagaagatg     2040
          tcagtcttct tctcttagac caactgccct gatatgaggt ttagaggtta aagaacatgt     2100
          gtgtatttac atgatctttg tattctgcct tttcgtccct cactaatgac agctgcaccc     2160
          caaggaaatg gagctgtgga agagagggtt tgataagaaa ttaagtaaat attggatcta     2220
          atccatcacc ctccaggaag cctttattac tcctaaaaat ttcaaccaaa ttcattaaag     2280
          gacaagaact ccaccagagt aggccataaa cattggcaaa attagttgta atccatgact     2340
          agatttaatg tccctttgtt ttattcccat atggttataa tgctttgctt ggcattaggg     2400
          gtattttaag ttttcttctg cctagtaagt gaatttgtgt ttataataca ataatcataa     2460
          aatatcacat taatatttta taactgtaca gttataaaat attttataag taatatttat     2520
          attttataag taatatttta taactgtaca gttaactctg gcccaaggaa aagatagtct     2580
          gatagatgct gcagccccat tttagcaaat gtgacctcac aggcctgaat gccatcgcta     2640
          ttccacatct acaggataga cggaaaggaa agaaataaaa aaataggtac ctaacactgg     2700
          caagaggatg atgactcatg ttatttcact taaccttttt atcttttaac atgaaggact     2760
          catacaggtt gataagaaac cagtgacata aacagaccaa aaaatgatca gatctttcaa     2820
          attagcaaaa aaataatatt ttttaaacaa tgggtgaaaa tacagtgtaa cagtaccaat     2880
          tatcaacatg tgttgagaac cagaaaaatg ttctttttct ttgatcagca acactatttg     2940
          ggaaaatcta tcctcagggc ctagcctggg gccctggcac acagtaggca ctcaacgaat     3000
          atttgctgaa cacacaaata cttatgatat tttaaaaaat tggcaacaat ctgataccta     3060
          acaatagagg gattaaatat tatggaactg ttaaataaga tgcttatgaa taccatgcag     3120
          taagatgggc aatatttatg ccataagctt taatgaaaca aatgggtatt aaatgtatga     3180
          taaggttata aattactttt taaaagatta cagggaaaaa aattgaaaga tatacactga     3240
          aatgtttttt gctcacagtg gtgacaaggt ttctcagcac tggcactgtt gacgttttag     3300
          gctgtatgtc tttgctgtgg gaggctggcc tgtgcactgc agggtgtttg gcagcactct     3360
          tggcctctgc ccctagatag caatagcagt cctccctcaa ccagcccaat tttgacaacc     3420
          aaaaatgttt ccaggcatca ccagatgctc cctgggtgag agtgatgaaa tagtagggga     3480
          ttttcccctt cttttcttat tttctgtaat tccattatat tactttaata ataaagaaaa     3540
          aaacataaaa aataaacgaa tgttattatt ctacgtcagt ttggatgttt ggactccatt     3600
          ttggggttct ttccattata tcacttggtc tgctaaacat tctacggttt ggtaaggtga     3660
          agtgattcat gaaattttgg ttttattttt ttcctgatac taaaaataaa acattctttc     3720
          acttggaaat ttggacacag aacaccaaaa aaaatccata atctcatctc tctttttctg     3780
          tcttttcctt ccttttttcc ctttaaaaac aataaagagt gaaacctacc tgttctccct     3840
          ctaatttaat tcctaaatat aatcactgtc aatatcttgg acatttcctg tgtctaaaca     3900
          cacacacaca cttttttttt tcagcaaaag tggatttctg ctacatgtag tgttctgcaa     3960
          cttactttct atgtgtttac aaaatcagta catgtacata tgctgaattc agtccttaat     4020
          ggtattatat tttgtgaata taccaaaatt tgtttaacca cttagacaat ctaggatatt     4080
          ctcagtttgc tgttatgagc aatgctcttc ctttacatat acagacatat atatatatat     4140
          gtgtgtgtgt gtgtttttgt tttagtagga tagatttcta ggagagggtg aaaggtctta     4200
          tgacatccgc atttacgatt gtaataggaa gtatcaaagt gccccctaaa gaaaaaaatc     4260
          ctcccattag tgggtaagaa agcctatttg ttcatatctt cacaaacact aaatattaga     4320
          aatatttaca attgtggtca agctcataag tgaaaatggt atttcatatc ttatattttt     4380
          tattgtgaga ttgaacatct ttcatatgtt tacatgtcac ctgtatttct tattctctga     4440
          actatatgtt atgacctttc actttttttc ctcatgggtt atgtgtagtt tgtatagttg     4500
          tcttattgat tgttaggagc tatttatata ttaggaacat taatctcctg tcttatatat     4560
          acgtggcatc gattagttga tcatttgtga gttcatgtct gtatacaaag attggagagg     4620
          cactaagagg gaaaacttac ctctttctta tcaaagtttg taaatatatg tataacagaa     4680
          gagggagaaa atattaataa atgcacagat tggctgaaat agagtataaa tcttttactc     4740
          ccctacttca acataaactg caaaaggaga gtgacttttc tttcactctg acttccgtat     4800
          tcctcatgct taaaatagtg cctagcacag aagaggtgct caatcagtgt ttgctaaacg     4860
          aaataattag tcacatttca agcaggatga ctaaatgaag aatagaatct aggcagatac     4920
          tctggaagag tggctgtgag tcattcatat cttagtatga attagtcaaa tccaactctc     4980
          tccccttccc actccccact gttagtagaa gaatctgttt attgagagaa tagatttata     5040
          atttagaata agtgagaggg gcagaagagg agattttgaa ggatggcacc tgaaggagga     5100
          ctagcatggc tgagacagtg aagtggaagc cttgaatagc taaagggtaa gatgaaagta     5160
          tttagctgta gggggaaaaa gcattgacag gttggaaaag taaaagtcag attctccttg     5220
          ctctgaaatt ttgtacaggg caggttctac taggtatgtt acaatgcaga aaaaacatga     5280
          aataattgag aggaatttgg tgcaatatta tcttcttggc ttcttttgag tgggcagatt     5340
          tttttcacgg cctgtaacta taataaattt gaaacttctc atcttttagt aacttttttc     5400
          acttaagttt atgtggctgt gggcaatgga atgaagatat tgaacttcca attccctgtt     5460
          gggtttccac aattacaagt caatcatgac tggttattag aagactattt cagttagaac     5520
          caccaagtcc catattgtca tattgtatgt ttaattatta agtgaagcag tcttcttttc     5580
          gtgttttcca taattagggc attccagaaa gatgaggata tttgctgtct ttatattcat     5640
          gacctactgg catttgctga acggtaagac accaaatcct tccattaggt tctatatttt     5700
          aaatatttta accatgagtt taaaactaaa atgatcattt aaaatgcatg caattttctt     5760
          atagagagaa cattctattc tttcttctac tttacacaat ggcaaagtct tctttctact     5820
          ttacgcaatg ataaagttac ctgtgtcatt ttgtaaaaat atagagaata tagacaaatt     5880
          gaaagacaca aaataatcta ttacccattt cccagggtta actactgaaa atatctgggg     5940
          aaatggcctg tatgtataca tttatttgtt tgctttcaac aaggccaaga tcctttgatc     6000
          tttcagtctt ggttgctctg tgacatgcct ttcctgatga ggatacttta aggaagaatt     6060
          gtaagataca tggaaaatgt caggctaaca cagtactggc atcaccctgt gctctttcct     6120
          gaactccata ccaatgtact tcttgccaga aaactgatca aaagtttagg gaagtaaaaa     6180
          gagatgactg ttagaatcta ccattccctc tatgtaggaa gcaaataggt gtcctgtcaa     6240
          aggacattct ggggatgtct acatgaaacc aagtctccct ggttgtaagg actccatctc     6300
          catataatat ttatacagta atatatgttt ataaattgtg ggggcaactt gtttagctaa     6360
          ttttattatt ctgctattgg gacactgtgt ctcagcatga gatatagtgt cccaaaacat     6420
          atttcaagcc cattggataa aatatgtgtt tagcaagttc ttaaatataa tgataacata     6480
          accgaccaga taaagtgatt tataaacgct gtgccaattt tgtaaatgtt tcgaggaatt     6540
          ttcccttttc tgaagattgt ccttctttct ttttagcatt tactgtcacg gttcccaagg     6600
          acctatatgt ggtagagtat ggtagcaata tgacaattga atgcaaattc ccagtagaaa     6660
          aacaattaga cctggctgca ctaattgtct attgggaaat ggaggataag aacattattc     6720
          aatttgtgca tggagaggaa gacctgaagg ttcagcatag tagctacaga cagagggccc     6780
          ggctgttgaa ggaccagctc tccctgggaa atgctgcact tcagatcaca gatgtgaaat     6840
          tgcaggatgc aggggtgtac cgctgcatga tcagctatgg tggtgccgac tacaagcgaa     6900
          ttactgtgaa agtcaatggt aagaattatt atagatgaga ggcctgatct ttattgaaaa     6960
          catattccaa gtgttgaaga cttttcattc ttgtaagtcc atacttattt tcaaacagaa     7020
          cagcatagtc tgttcattca ttcattcaat tcatgaattc attcacataa ttatccaatt     7080
          tcttgagcac ctatttgata gtcactggaa atccagagac aaacaacaca gagccatgtt     7140
          ctacagtatg tacagttttc caaaaagaat ttctagtctt tactttttta ttacaaatgg     7200
          aatacgtata cttgcaaata attcagatac tgtggaagag atcaaatgaa ttgcaaaagt     7260
          gtccctcctc ccttcaccac tatctcccat ggcatgcaga gagagtaacc attatttgtg     7320
          tgtccctcca gaaatttttt tattcaacta ctattttttt attttattag gtccgtcagt     7380
          tttccttttt tgagcctctc tatatcaaat gcaaataaat atattcagaa caaaccccac     7440
          tgtaaggttc acattaaaaa agacttgaag tcaccctatg aagacaaaaa ataatcacat     7500
          taagtgtgaa agaacctatt cttccagtac aggataagcc atacttactg ggcatatatt     7560
          catcttgaaa atctatactg atgttgtctt ggggaattga aaaggaacta ggagtgttag     7620
          ttcctcggta ttgacccaca gttatgttat caggtcactt gagttcaaag ttttgtgttg     7680
          gcactagcta agtaaaggaa aacacctctg ctttcattgt tgagtttcac agaattgaga     7740
          gctgaaagga tcccaggcag gagcagctaa tccaaactcc cacaaagaac aaaaatcccc     7800
          cagaggatct tctgttctta tatttcctgc aatggcgtcc ctgtcatatc ccacaatggc     7860
          ctccctgcca tttggatatc ccttccatat cctgttgaaa ttactcccta atagtaagct     7920
          gaaatctgcc cctctagttg tagtcttggg attatttcat ttacatgatg accttttaat     7980
          atttgactag aattaaatca tctccccttg gtctttccat tcctgggcta actaccatca     8040
          atctgagggc taacaataca agtagaaaaa gtatacattt gtcactgatc actgatcaat     8100
          tattaatcaa tgatcactga taactataaa ctcaaaaaca aaatcatgtg gggattaaga     8160
          gaaatgtatc agttttatgt tgtatttctg gtccctgata ctggctcagg taatgccact     8220
          attgtcaaga agataccact tgtaaagtag atttaatttt cattatattt taccatatgc     8280
          ttctccattc atgacatctc ttgagatgtt gtggtttata ctttcagttt ttctccagtc     8340
          catccgcaaa tatcaggcat ctactgtgtt ccaagatatt aaagaaatca tcatgactta     8400
          gcctcatcaa cagcattgct agatctggga tggaaaggaa gagtataatc ctggcagtca     8460
          ggaagaaggc agcataaagt ataagtttct gcttccaaaa aaggtctctc atcagcctgt     8520
          agggagtgtg tagggaaggg acagctgtcc ttgtagtagg gaagggtttt attcaggtcg     8580
          tctgggctcc ataatatccc ttgtgtatct gcagtctcct ttgccatgga tcaacacaat     8640
          aggaaatctt ccggcactga tggtttttcc aagggggagt tcttcctgga gcaaagcaaa     8700
          tgaccaacca ggtttgagga cctgatttgt ttgacaattc cattttgtat tgtaaattac     8760
          ttaattggca ttctactccc aatccatctt gtcatttgca tacagtggtt ttgggattga     8820
          gttcagctat accaaaagtc tgaaccttct gcacttagaa caaggcaacc accaagcttc     8880
          acttgcactg aggccgtgtc tccaatggaa atgaggcagc tggcttgcag gagcttccca     8940
          actcagggaa gtagaactcc tgagtcacct ccatatgcaa atgatttcac agtaatgctg     9000
          ttgaacttca cttcccatca cagcaaatgt gtggtaacat agcttcccca caggagttta     9060
          ctcaccatgg tattttaaag gtgaaacatt tcaaaactga aatttgaaag aatttagttt     9120
          tggattcact caattatcac tatcacttcg ggtgttattg cacctttctt gtttgtgagt     9180
          ttaaatgcca gactctcagg ccactaactt tcaattaaaa gtgtttttct ttaatcgctg     9240
          aacctaacag cagggaaaac gaaatgttca ttcagacttt cagaaccttc aatgagatta     9300
          ggcagctgaa agatcaaagt gttgcatagt tgtcccgata aagctatttg gatcatatgg     9360
          accaaatcga ctgctgtcat tccccaccaa ccccatctct ccccaaaatt cccagccctg     9420
          tttaagtgtt ctctgtagca tttatctcta tctagtatat tgtgtagcat atcatatcat     9480
          acttttctgt tttgtttatt gtctctctcc tcctagaata taaactccac aagcacaaag     9540
          atttgggcct gttttataat attgttgcat ccccagggcc tgatatacag cagagtggtg     9600
          gtacgaaaag agcacacaaa aaaatatttg ttgagtcaat gaatgaatga tttcctcaaa     9660
          taggattagc ctaaaatttt ggaaacatga acagatttgg atatgtgaaa atttatttcc     9720
          agactgttca tcaggaactg ttagcagctt ctaaagggta cactggagca gcagtagtaa     9780
          aaggaggaag aggagcagct ctgctactgc tactatcgag tactactaca attagcactt     9840
          gcttattctg tgtgttaggc cctgtactga acactctgtc taaattagtt catttcctcc     9900
          tggaaatgac tctagggggt aagtgcttca tcatgtaaga tgagtatttt tcacattttg     9960
          ttgtgtctga aatctgagtg tgtctttcaa tgatggaatc tttgattcca tgataagtgg    10020
          tattattccc attttaagga tgaggaaact gaggtccaaa gaaattaagt aatttgccca    10080
          aattcaccca gcctagaaaa tgataaagct agttctaaac ccaagcagat tagctctgaa    10140
          gtctgggccc ttaataacca ctttttattg cctatatttg tacctctggt gtacgtatca    10200
          agttatatgt tgacttcaaa actatcatga ccttttcttg gttttgattg tccaacatta    10260
          gtatagtgtt ctgggtctgc aaaaattttg attactcatc tcatctgtaa aacattttga    10320
          actcgtgtgt ttgtgcatgc acatttgtgt gtaattataa aaattttact ttctgttaat    10380
          atataagttg tatcataaga aactgccgtt tttgaagagc aaaaaaaggt tgaatgttac    10440
          cagttacatc tggttcaacc taatagacat ttgtacaaaa acagacattt taagaggttg    10500
          aaataaaaat ttaataaaca atattttcag tttttactaa ttgtgatgct tcactatcat    10560
          tagctaatat gtcaaggcat aatatacctt agggtgaact ttatcattaa caaaggtgga    10620
          tggtgtcaat aatcttgagg tttgtgtttt tttatataac actgcgaggt ctaattaagt    10680
          acttactgtt taccacctca tacagtggcc gataaaaagt gtcacttctg ctgtttcctc    10740
          tgggttgtgc ttgaattatt agtattatct tcagtcctca gtttctttgt gggaaacttt    10800
          ttaattagtt gtttaatttt gtaagatggt tagtttagtc aaaattagat aagagaattt    10860
          gaaaatccgt agctacccca aagcaaccta cacataagaa ctattatttt tgtgttttga    10920
          aatcataatt ttattgattt ccagtgtttc cactggtagt ggtttcattg atataggagt    10980
          atcaaaacat cactcattat ttatttcagt ttcatttgat cctagccgtt ttgtattaac    11040
          tctctgtgaa gaaattacct cacaaatcta ttgctgtcct tggtaaagga atggagaatt    11100
          aaggctctag atcattagtg gttacactat agtattagaa gtaaaaaaaa gattatacca    11160
          acaaaataag aacatgttaa tgtacttgta atgaataaac atgaataaag ctcttatgct    11220
          atataggtgc actaaacaat ctactagaat tgtcagcaaa ctacgtatct taatcctgaa    11280
          agggtcccaa accaatgatc taaaattgaa tcaaactttc ttccttgagc ataattactt    11340
          aaatgattta ttaaaatagc cagcatttaa aagcttaaaa tgtaaatatc ataatgtggt    11400
          atcctagata gcatcccaga acagaaaaag gatattaggg aaaaactgga ggaatggaat    11460
          aaattatgca gtttagttat taataatgta ctaacgtcct tagttatgac gattgtacca    11520
          tggtaatgta agatactaac aatagaggaa accgggtaag gagtatacag taactctata    11580
          ctatctttgc aacttttttg taaatttaaa acttctaaaa taaagaacaa atttaaacat    11640
          taaaaagtat caccaggaac atatatcact gtttacagat gaaatactat gtattttcat    11700
          atctaatttc tgatcattga cttcaaatca gaaaagtgaa tgacacctca aaatcaggtt    11760
          ttctgtttac tgaagtctaa gaaaagaaag cataccagct ggagagattc atgtttataa    11820
          agacagattt ataacaacaa aaataaaata tccaagaata aatttaagaa gaagcacttt    11880
          actgagaaac atatgaaaac ctgaacaaat ggagagggat attttgtatt tgaatagaaa    11940
          gacttctggt ttaaagataa ttctctttaa attatttttt gtagaaattt aaggggtaca    12000
          agagcagtgt tgtcacatgg atatattaca tagtggtgaa gtctggggtt ttagtgtaaa    12060
          ttaatcttta cattttgttt gagcccaata aatgtaccaa catgattttt atagaaagat    12120
          agtcattcct attaatccaa acttgtccca actttgaatt gaattgaggc agagctagca    12180
          ggtgttcccc acggctgagg catctgaaca ttaagcatat ccctctgaga accagcctgc    12240
          attgatactc tttctaatgt ggacagcatc aagctatgta cgtagttctg tgctcagcaa    12300
          aagccctgac ttctttttgt ttatgtccta gccccataca acaaaatcaa ccaaagaatt    12360
          ttggttgtgg atccagtcac ctctgaacat gaactgacat gtcaggctga gggctacccc    12420
          aaggccgaag tcatctggac aagcagtgac catcaagtcc tgagtggtaa gaccaccacc    12480
          accaattcca agagagagga gaagcttttc aatgtgacca gcacactgag aatcaacaca    12540
          acaactaatg agattttcta ctgcactttt aggagattag atcctgagga aaaccataca    12600
          gctgaattgg tcatcccagg taatattctg aatgtgtcca ttaaaatatg tctaacactg    12660
          tcccctagca cctagcatga tgtctgccta tcatagtcat tcagtgattg ttgaataaat    12720
          gaatgaatga ataacactat gtttacaaaa tatatcctaa ttcctcacct ccattcatcc    12780
          aaaccatatt gttacttaat aaacattcag cagatattta tggaatatac cttttgttcc    12840
          atgcattgta gtactcattg gatacacata gaataataag actcagttca cactcttcag    12900
          gaaacagata aaaaactaag aaacaaacaa aaaacaggca atccaacacc atgtgggaaa    12960
          tgctttcata gccgggaaac ctggggaata cctgagagga atactcaatt caggccttgt    13020
          ttcaggaatc caaatcctgg cacatcagag ctgcttccct ctttccaggg tggcaggaaa    13080
          taaatggaac atatttttct atcttatgcc aaacatgagg gaccctttct ccccggtgcc    13140
          tctcccaagg tagtctacaa tatttcaact ctagcagtct gcttagtgca tagaacatga    13200
          ggctgtgtgt ccctgggcaa attactagac ttctgtgtgc ttcactttcc ctgtaggatt    13260
          ataatctact gagcaagctt attgtaaggg tcagattagc aacagtgtat gaaaatgatt    13320
          tgagaccatt gcctgcacaa attcaactat ttttttttat ctcactactc tacagaagta    13380
          ggtagggtgg gagacagagt ctgatgagag gctcagaatg tgaaagaaag tgaggcgagt    13440
          gagcatgata tttaatataa acacaaagat attctgagaa gagctgctca ctgccccctc    13500
          ccccaataca tgttgatagg aaaatgccac gtacttcagc aaaaacaact gaaaaattag    13560
          atagaaaagt caatcaatag gaaaagataa tccaggacgg tgttgtgaac agaaagaggg    13620
          ggaaaaaact ttagaaaatg atggggatgc tcttactggg gtacgagtcc tcaggtattg    13680
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          caacttactt gttgggtggc ctacagtaac tcacctaact gcactgagtc tgtttcctca    13800
          tctgtaaatt ggggattttt ttttaaatac ctggcatgcc taactcataa agttgttctg    13860
          aaactgaaat aaaacatacg tgaacaggca ttgtaaactg taagttacgg aaaaagctgg    13920
          ctgttgttgt gtctttaaag tttcacctgg gtagtcaaag atggatcatg ggtctcagtg    13980
          gagagctgag ccaggcagga gctgactaag ggtgagaggt gggagttagc agcctctgaa    14040
          catctgtgta ccatgggacc ccctttcctc ctgcatggta ccccagacaa ggagcctagt    14100
          aagagatact aatggcttgt tgtccagaga tgttcaaact gcagagaaag ataagacaac    14160
          aagcattggc ctccaatcat gatgacagat aggaggaggt gggagctcct tagcagtgct    14220
          ggttggcctt ccatgttcta ctgtgggcca tctctgccat gtactgtagg ctactagctt    14280
          ctatattaaa gaatgcaaga ggggccagga gcggaggctc atgcctgtaa tctcagcact    14340
          ttgggaggcc aaggtgggca gatcacttga ggtcaggagt ttgtgaccag cctggccaac    14400
          atggtgaaac tctgccttta ctaaaaatat aaaaattagc tgggtgtggt ggtgtgcacc    14460
          tgtaatccca gctactcggg agactgaggc acaagaattg cttgaacctg ggaggcggaa    14520
          gttgcagtga gcccagattg cgccactgca ctccaccctg ggcaacagag aaagactctg    14580
          cctcaaaaaa aaaaaaaaaa agcaagagga agtgaaataa tcaaggccgc catttaatag    14640
          tgagcagcca ctccatgtgg tactgtgcaa gcacattata aatattagcc tcacaagaaa    14700
          tgtattagca tttgtatttt gtacactggt taagtatctt gcccaagacc tcaaaactgg    14760
          ttaagggcag cagaatttag ccccagcacc accttttcaa agcctgggct tctcacactt    14820
          ctccatgctg ttcccatttt aacacaggta tctcgccatt ccagccactc aaactttggc    14880
          atttaagaaa attatcctaa agctaaacta aacttcaagg atgaccattc tcctgacccc    14940
          ttcccatcaa aattttatct ttagtcagtt tgttttcgtt ttgttttgtt tttcagaact    15000
          acctctggca catcctccaa atgaaaggac tcacttggta attctgggag ccatcttatt    15060
          atgccttggt gtagcactga cattcatctt ccgtttaaga aaaggtagta tttccttaat    15120
          tgcagtggtc tccactgggg gtgaggaagg ggtgagaatt ggatcatggc tgcaaggaaa    15180
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          gaagctgagt gggatcactg ggtgaagatg aagcgtaagg ggtgaggggc aggagaatgg    15300
          gtatggatgg aggtagaaga tgcagtgtca tacagttttt ttctatcatg aaaataacca    15360
          cagacttaca gaagagaaag agctaaaatg cccgtcattt tcagttgcat tttagtcttg    15420
          cattagttgc aaccagctgg tttctgggta ccctaagtaa taaaaatagt tcctctgtag    15480
          aactgtagta tgtttaccat agagtatttt gcaaaatttt tggtagagga tgttacataa    15540
          tttgcatgtg ttcatttctc catttacctg tgggaacaat taaaatccag gaaaatgagt    15600
          atattcaaat aatttcctcc catttaagat gagtcagagt aaataattcc tccaatactt    15660
          agagaagtat accaagagat ccagtgatgg tatagagttg tctgatgtta aatagggaag    15720
          tagaatatgg aaggggattc caatagtcgt tgaaaaattc cccataaccc cttacatggg    15780
          ggaaagtagt gttaactgag agagtagaga taagctgttt ccaaaaatta tattcttaac    15840
          aggactgaga tagccagaat ataaggatca agtttcaatg acagtaagat cctgagatgg    15900
          agttgatttg cacaaagaaa taattgttgc cagcatgcat tttgaatatt tctctggaaa    15960
          aaaagattag ttggcagtag aaatggatag aaatcaatag atattaaaat acctcagaat    16020
          ttggttcatc tctgggaaaa gatgaaaaat aaaagtgtat actcctcaag aacatctagg    16080
          atcaaaagca tgtgccctac actattgaat taattaacct cataagttgg gacctgtgga    16140
          ataaggatgt ccaccagact tcctagggat tacaaatgtt tcacagaact tgaaatttaa    16200
          acttgggtca ctgtatggga tgtagagctg tgctatatgg aaataaaaat gatttctttt    16260
          tctcaaggga gaatgatgga tgtgaaaaaa tgtggcatcc aagatacaaa ctcaaagaag    16320
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          gatcccatgg gagatggttg gaaaatctcc acttcatcct ccaagccatt caagtttcct    18900
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          tctactcagt ctattcctaa gtcctaactc ctccttgtgg tgttggattt gtaaggcact    19860
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          gtaaaatcaa ggtgcgttca gatgttggct tgttgtaaat ttctgtttat attaataaca       60
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          atgaaagaat tagtaacatt tcaagcagga tgactaaatg aagaatagaa tctaggcaga     5040
          tactctggaa gagtgactgt gagtcattca tggtcttggt atgaattagt caaatccagc     5100
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          aaatatttta accatgagtt taaaactaaa atgataattt aaaatgcatg caattttctt     5880
          atagagagaa tattctcttc tttcttctac tttacacaat gacaaagtct ttcttctgct     5940
          ttacacaatg ataaagttcc ctgtgtcatt gtgtaaaaat atagagaata tagacaaatt     6000
          gaaagacaca aaataatcta ttacccattt cccagggtta actactgaaa atatctgggg     6060
          aaatggcctg tatgtatata tttatttgtt tgttttcaac aaggccagga tctttcaatc     6120
          tttcaatctt ggttgctctg tgacatgcct ttcctgatga gaatactcta aggaagaatt     6180
          gtaggataca tggaaaatgt cagggtaaca cagtactggc accaccctgc ggtcctttct     6240
          gaactccata ccaatgtact tcttgccaga aaactgatca aaagtttagg gaagtaaaaa     6300
          gagatgttag aatctaccat tccctctatg taggaagcaa ataggtgtcc agtcaaagga     6360
          cattctgggg atgtctacat gaaaccaagt ctcctggttg taagtactcc atctccatat     6420
          aatatttcta cagtaatata tgtttataaa ttgtgggggc aacttgttta gctaatttta     6480
          ttattctgtt attgggacac tatgtctctg catgagacat agtgtcccaa aacatatttc     6540
          aagcccattg gataaaatat gtatttagca agttcttaaa tataatgata acataactga     6600
          ccagataagg tgatttttaa atgctgtgcc aactttataa atgttttgag gaattttccc     6660
          ttttctgaag gttattcttc tttcttttta gcatttactg tcacggttcc caaggaccta     6720
          tatgtggtag agtatggcag caatatgaca attgaatgca aattcccagt agaaaaacaa     6780
          ttagacctga cttcactaat tgtctattgg gaaatggagg ataagaacat tattcaattt     6840
          gtgcatggag aggaagacct gaaggttcag catagtaact acagacagag ggcccagctg     6900
          ttgaaggacc agctctccct gggaaatgct gcacttcgga tcacagatgt gaaattgcag     6960
          gatgcagggg tttaccgctg catgatcagc tatggtggtg ccgactacaa gcggattacc     7020
          gtgaaagtca atggtaagaa ttattataga tgagaggcct gatctttata gaaaacatat     7080
          tctaagtgtt gaagactttt cattcttata agtccatact tattttcaaa cagaatagca     7140
          tagtctcttc attcattcat tcagttcatg aattcattca cgtaagtctc caattagcat     7200
          ttcttgagca cctatatgat agtcattgga aatccagaga caacacagag ccatgttcta     7260
          cggtatgtac agttttccaa aaataattcc tagtctttac ttttttatta taaatgtaat     7320
          acatatactt gcaaagaatt cagatactat ggaagagatc aaatgaattg caaaagtgtc     7380
          cctcctccct tcaccactat ctcccatgag ataaccaaga gacactccaa gagagtaacc     7440
          attatttgtg tgtccctcca gaaccttttt tattcaacta ccattttttt attttattag     7500
          gtctgtcagt tttccttttt tgagcctctc tatatcaaat gctaataaat atattcagat     7560
          caaaccccac tgtaaggttc atattaaaaa agacttgaag tctccctatg aagacaaaaa     7620
          ataatcatat taagtgtaaa agaacttatt cttccagtac agtataaact atactcactg     7680
          ggcatatatt catcttgaaa atctatactg atgttgtctt ggggaattga agaggaacta     7740
          ggagtgtcaa ttcctgggaa ctgacccaca gttatgtcat caggtcactt gagttcgaag     7800
          ttttgtgttg gcactagcta agtaaaggaa aacacctctg ctttcattgt tgagtttcat     7860
          agaattgaga gctgaaagga tcccaggcag gagcgactaa tccaaactcc cacaaagaac     7920
          aaaaatcccc cagaggatct tctgttcata tatttcctgc agtggcatcc ctgtcatatc     7980
          ccacaatggc atccctgcca tttggactcc ccttccatat cctgttgaaa ttactcccta     8040
          atagtaagct gaaatctgcc cctctagttg tagttttgga attatttcat ttccatgatg     8100
          accttttaat atttgactag aattaaatca tctccccttg gtatttccat tcctggacta     8160
          actaccatca atctgagggc taacaataca agtagaaaaa gtctacactt gtcattgatc     8220
          actgatcaat gattaatcaa tgatcactga taattataaa ctcaaaaaca aaatcatgta     8280
          gggattaaga gaaatgtatc agttttatgt tgtatttctg gtccctgatt ctggctcaaa     8340
          taatgctact attgtcaaga agatatcact tgtaaagtag atttaatttt cattatattt     8400
          taccatgtgc ttctccattc acggcatttc ttgagatgtt gtggtttata ctttcagttt     8460
          ttctccagtc catcagcaaa tatcaggcat ctactgtgtt ccaagatatt aaagaaatca     8520
          tcatgactta gcctcatcaa cagcattgct agatctggga tggaaaagaa gagtataatc     8580
          ctggcagtca ggaagaaggc tgcataaagt ataagtttct gcttccaaag aagatctctc     8640
          atcagcctgt agggagtgta tagggagggg acagctgtcc ttgtagtagc aaagggtttt     8700
          attcaggtca tctgggctcc ataatatccc ttgtgtatct gcagtctcct ttgccatgga     8760
          tcaacacaat aggaaatctt ccggcactga tggtttttcc aagggggagt tcttcaggga     8820
          gcaaagcaaa tgaccaacca ggtttgagga cctgatttga caattccatt ttgtatttta     8880
          aattagttaa tttgcattct agtcccaatc catcttgtca tttgcagaca gtggttttgg     8940
          ggttgagttg agctatacca aaagtctgaa ccttctgcac ttagaacaag gaaggcaacc     9000
          accaagcttc acttgcactg aggcagtgtc tccaatggaa acgaggtagc tggcttgcag     9060
          aagctttcca actcagggaa gtagaactcc tgagtcacct ccatatgcaa ataatttcac     9120
          agtactgctg ttgaacttca cttcccatca cagcaaatgt gtggtaacat agctttgcca     9180
          caggagttta ctcaccatgg gattttaaag gtgaaacatt tcaaaactga aatttgaaag     9240
          aatttagttt tggattcact caattatcat gatcactttg ggtgttattg cacctttcat     9300
          gtttgtgagt ttaaatacca gactctcagg cctctaactt tcaattaaaa gtgtttttct     9360
          ttaatcactg aacctaatag tagggaaaac gaaatgttca ttcagacttt caggaccttc     9420
          aatgagatga ggcagctgaa agatcaaagt gttgcatagt tatcccagta aagctatttg     9480
          gatcgtatgg accagatcaa ctgctgtcat tccccaccaa ccccatcttt ccccaaaatt     9540
          cccagccctg tttaagtgtt ctctgtagca tttatctcta tctagtatat tgtgtagcat     9600
          atcatatcat acttttctat tttgtttatt gtctctctcc tcctagaata taaactccac     9660
          aagcacagag atttgggtct gttttttaat attgttgtat ccccagggct tgacgtaaag     9720
          cagagtggta gtatgacaaa agcacacaaa aaaatatttg ttgagtcaat gaatgaatga     9780
          tttcctcaaa taggattagc ctaaaatttt ggaaacatga acagacttgg atatatgaaa     9840
          atttatttcc aaaactgttc atcaggaact gttagcacct tctaaagggt acactgaagc     9900
          agcagtagta aaaggaggag gaggagaagc agctctgcta ctactattat cgagtactac     9960
          tacaactatc gagtactact acaactatcg agtactacta caattagcac ttgcttattc    10020
          tgtgtgttag gtcctgtact gaacattctg cctaaattag ttcatttcct cctggaaatg    10080
          actctgtggg gtaggtgctt catcatgtaa gatgagtatt tttcacactt cactgtctct    10140
          gaaatctgag tgtgtctttc aatgatggaa tctttgattt catgataagt ggtattattc    10200
          ccattttaag gatgaggaaa ctggggtcca aagaaattaa gtaatttgcc caaattcacc    10260
          tagcctcgta aatgataaag ctagttctaa atccaagcag attggctctg aagtctgggc    10320
          ccttaataac cacttattgc ctgtatttgc acctctggtg tatgtatcaa gttatatatt    10380
          ggcttcaaaa ctatcatgac cttttcttga ttttgattgt tcaatattag tatagtgttc    10440
          tagatctagt agaccagggg tctgcaaaaa attttgatta ctcacctcat ctgtaaaaca    10500
          ttttaaactt gtgtgtctgt gcaggcacat ttgtgtgtaa ttataaaaaa tttactatct    10560
          attaatatat aggttgtacc gtaagaaaaa ttgccatttt tgaagagcaa aaaaggttga    10620
          atattaccag tttcatctgg ttcaacctaa tagacatttg tacaaaaaca gacattttaa    10680
          gaggatgaaa taaaaattta ataaacaata ttttcaattt ttactaattg tgacgcttca    10740
          ctattgttag ctaatatgtc aaggcatgat ataccttagg gtggaattta tcattaacaa    10800
          aggtggatag tgtcaataat cttgaggttt gtgttttttt atataacact gtgaggtcta    10860
          attaagtact taattgttta caacctcata cagtcgccaa taataagtgt cacttctgct    10920
          gtttcctctg ggttgtgctt gaattattag tattatcttc aatcctcagt ttctttgtgg    10980
          aaaacttttt aattagttgt ttaattttgt aagatggtta gtttagtcaa aattagataa    11040
          gagaatctga aaatccataa ttaccccaaa gcaacccact cataagaact attatttttg    11100
          tgttttgaaa tcataatttt attgatttcc agtgtttcca ctggtagtgg tttcattgat    11160
          gtaggagtat caaaacatca ctaattattt atttcagttt tgtttgatcc tagctgtttt    11220
          gtgttaactt tgaagaaatt acatcacaga tctattgttg tccttggtaa aggaatggag    11280
          agttaaggct ctagatcatt agtggttatg ctgtagtatt aggagtaaaa aaaaagatta    11340
          tatcaacaaa ataagaacat gttaatgtac ttgtaataga taaacatgaa taaagctctt    11400
          atgctatata gatgcactga acaatctact agaattgtca gcaaacggta tcttaatcct    11460
          aaaagggtcc caaaccaatg atctaaaatt gaatcaaact ttcttccttg agcataatta    11520
          tttaagtgat ttattaaaat agccagcatt taaaagctta aaatataagt atcataatgt    11580
          ggtatcctag atagatccca gaacagagaa aggatattag ggaaaaactg gaggaatgga    11640
          ataaattatg cagtttagtt attaataatg tactaatgtc cttagttatg accattgtac    11700
          catggtaaag taagatacta acaatagagg aaattgggta aggggtatat gtaactctat    11760
          actatctttg caattttttt gtaaatttaa aacttctaaa ataaagaaca aatttgaaca    11820
          ttaaaaagtg tcgccaggaa catgtatcac tgtttacaga tgaaacagta tgtattttta    11880
          tatctaattt ctgatcattg gcttcaaatc agaaaagtga atgacacatc aagatcaggt    11940
          tttctgttta ctaaataaag tctaagaaaa caaagcatac cagctggaga gattcatgtt    12000
          tataaagaca gatttataac aacaaaaata aaatatccaa gaataaattt aagaagaaat    12060
          agggcactat gtaaaaagta tagcacttta ctgagaaaca tatgaaaacc tgaatacatg    12120
          gagagaggta ttttatattt gaatagaaag attgctggtt taaagataat tctctttaaa    12180
          ttttttttgt agaaatttaa gaggtacaag agcagttttg tcacacggat atattacata    12240
          gtggtgaagt ctggggtttt agtgtaaatt aatctttaca ttttgtttga gcccaataaa    12300
          tgtaccaaca tgatttttat agcaagatag tcattcctat taacccaaac ttgtcccaac    12360
          tttgaactga actgaggcag agctagcagg tgttccccac tgctgaggca tctgaacatt    12420
          aagcgtatcc ctctgagaac cagcctgcat tgatcctctt tctaatgtag acagcatcaa    12480
          gctatatatc tagttctgtg ctcagcaaaa gccctgactt ctttttgctt atgtcctagc    12540
          tccatacaac aaaatcaacc aaagaatttt ggttgtcgat ccagtcacct ctgaacatga    12600
          actaacatgt caggctgagg gctaccccaa ggccgaagtc atttggacaa gcagtgacca    12660
          tcaagtcctg agtggtaaga ccaccaccac caattccaag agagaggaga agcttttaaa    12720
          tgtgaccagc acactgagaa tcaacacaac agctaatgag attttctact gcatttttag    12780
          gagattagat cctgaggaaa accatacagc tgaattggtc atcccaggta atattctgaa    12840
          tgtgtccatt aaaatatgtc taacactgtc ccctagcacc tagtatgatg tctgcctatc    12900
          atagtcattc agtgtttgtt gaataaatga attaatgaat aacattatat ttacaaaatg    12960
          tatcctaatt cctcacttcc attcatccaa atcatattgt tacttaataa acattcacca    13020
          aatatttatt gaatatgcct tttgttccat gcattgtagt actcatttga cacacataga    13080
          ataataagac tcacgttcac actcttcagg aaacagataa aaaacaaatg aacaaacaaa    13140
          aaacaggcaa tccaatacca tgtgggaaat gctttcatac catgtgggaa acctggggga    13200
          atacctgaga ggaatattca attcaggcca tgtttcagga atccaaatcc tggcacatca    13260
          gagccgcctc cttcttacta gggtttctgt ggcaggaaat aaatggaacg tatttttcta    13320
          tcttatgcca aacaggaggg accctttctc ccctgtgcct ctcccaaggt agtctacaat    13380
          atttcaacgc tagcagtctg tttagtgcac aggacatgag gctgtgtatc cctgggcaaa    13440
          ttgctacact tctgtgtgct tcactttctc tgtaggatta taacctactg agcaaggtta    13500
          ttgtgggggt caaattagca acagtgtatg aaaatgattt gagaccagtg cctgcacaaa    13560
          ttcaactatt tttttttatc tcactactct atagaagtag gtaggatggg agacagagtc    13620
          tgatgggagg ctcagaatgt gaaagtaagt gaggtgagtg agcatgatat ttcatataaa    13680
          cacaaagata ctctgagaag agcttctcac ttcccccgcc cccaatagat gttgacagga    13740
          aaatgccatg tacttcagca aaaacagctg aaaaattaga cataaaagtc aatcaatagg    13800
          aaaagataat ccaggatggt cttgtgaaca gaaagaggga aaaaaaaagt ttagaaaatg    13860
          atggggatgc tcttactggg gtatgagtcc tcaggtattc aactggcttt cagaaaaagc    13920
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          ctacagtaac tcacttaact gtgctgagtc tgtttcctca tctgtaaatt ggggattttt    14040
          taaaataact ggcatgccta actcataaag ttgttctgaa actgaaataa aacatatatg    14100
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          ggccgggagt ggaggctcat gcctgtaatc tcagcacttt gggaggccaa ggtgggcaga    14580
          tcacttgagg tcaggagttt gtaaccagcc tggccaacat ggtgaatctc tgcctctact    14640
          aaaaatacaa aaattagcca gatgtggtgg cgtgcacccg taatcccagc tactcgggaa    14700
          gctgaggcac gagaattgct tgaacctggg aggcggaggt tgcagtgagc caagattgtg    14760
          ccactgccct ccagcctggg caacagagaa agactttgcc tcaaaaataa ataaataaat    14820
          aaataaataa ataaataaat aaatggaagt gaaataatca aggccaccat ttaatactga    14880
          gtagccactc catgtggtac tgtgctaagc acattataaa atattagcct cacaagaaat    14940
          gtattagcat ttgtattttg tacactggtt aagtatcttg cccaagacct caaaactggt    15000
          taaggggcag cagaatttaa ccccagcgcc accttttcaa agtctgggct tcttacactt    15060
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          cccttcccat caaaatttta tctttagtca gtttgttttt gttttgtttt gtttttcaga    15240
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          tttactcctt ggtgtagcac tgacattcat cttctattta agaaaaggta gtatttcctt    15360
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          aaggaaacct gacttaacct ctgcagggtg gtgcaaaggc attccactat tcaacagtaa    15480
          ttatattgaa gctgcatggg atcactgggt gaagatgagg tgtaaggggt gagggacagg    15540
          agaatgggta tggatggagg tagaagatgc agtgtcatac aatttttttc tatcatgaaa    15600
          ataaccacag acttactgta aagaaggagc taaaatgcct gtcattttca gttgcatttt    15660
          agttttgcat tagttgcacc cagctggttt ctgggtactc taagtaataa aaatagttcc    15720
          tctgtagaac tgtagtattt tcaccataga gtattttgta aaattattgg tagaggatgt    15780
          tacataattt gcatgtgttc ctttctccat ttacctgtgg gaacaattaa aatccaggaa    15840
          aatgagtata ttcaaataat ttcctcccat ttatgatgat tcagagtaaa taattcctct    15900
          gatacttaga gaagtatacc aagagatcca gtgattgtat agagttgtct gatgttaaat    15960
          agggaagtag aatatggaag ggaattccaa tagtcgttga aaaattcccc acaacccctt    16020
          acatggggga aagtggtgtt aactgagata gtagagataa gctgttacca aaaattatgt    16080
          tcttaacagg attgagatag ccagaatata aggatcaagt ttcaatgaca gtaagatcct    16140
          gagatgcagt tgatttgcac aaagaaataa ttgttgccag cttgcatttt gaatatttct    16200
          ctggaaaaag agattagttg gcagtagaaa tgaatagaaa tcaatagata ttaaaatacc    16260
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          atctgggatc aaaagcatgg gccttaccct attgaattaa ttaacctcag aagttgggaa    16380
          ctgtggaata aggatgtcca ccagacttcc tagggattac aaatgtttca tagaacttga    16440
          aatttaaact tgggtcactg tatgggatgt agagctgtgc tatatggaaa taaaaatgat    16500
          ttctttttct caagggagaa tgatggatat gaaaaaatgt ggcattcgag ttacaaactc    16560
          aaagaagcaa cgtggtaaga atatcagaag gaattgggaa gtagaaggca aaggaaacaa    16620
          aaagctaaag caataacaaa gagaaatcca ttagtcataa tctcctctcc ttttaaagaa    16680
          tgctggttcc cctttgcctc acaactaata caagaacttc tccaccatct caggaagttt    16740
          agggatggcc ttcaagagta gagagtaggg agcagctctg tggagagagg agaggagcag    16800
          ggaaggggaa ggagtcagct tctctttgct aatctgttgc cctgcaccct agcagctccc    16860
          tgcagcaggg gacaaggttg acttaggtgg atggataatt aattgattct aaaatattgt    16920
          gtgtcagtat tgtatattgt aatactatgt taactgcgcc atgcacggta tctcatttaa    16980
          tcccccaccc cttgccatta ccaaaaagag agagagaaaa atactagaat tatcctcatt    17040
          ttacagtaga gaaaacagag ggtcaagaag ataaagtaaa gtgcccaaga acacacaact    17100
          gatcacaaat atcaagcttg gggtccatta gcctaaccac agacccttac tcttaaccca    17160
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          aggcaagttt cattctgtgg cctgtagcat catctgtgtt gtaaagctaa gtagcaaatg    17400
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          aggatatcat gtaaggataa ttgggtacaa atataacctg cttctttctc tcatttcaaa    17520
          tttatcattt atcatctcag caactatgag ttatgttttt tattagattt cttgttactt    17580
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          tcagttcctg cagaagtgcc ctttgcctcc actcaatgcc tcaatttgtt ttctgcgtga    18060
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          agtagatgtt acaattttgt cgccaaacta aacttgatgc ttaatgactt gctcacatct    18240
          agtaaaacat ggagtatttg taaggtgctt ggtctcctct ataactacaa gtacacattg    18300
          gaagcataaa gatcaaaccg ttgatttgta taggatgtca cctttattta acccattaat    18360
          actctgattg acttaatctt attctcagac ctcaagtgtc tgtgcagtat ctgttccatt    18420
          taaatatcag ctttataatt atgtggtacc atacacacat aatctccttt catcgctgta    18480
          accaccctgt tgtgatgacc actattattt tacccattgt acagctgagg aagcaaacag    18540
          attaagtaac ttgccaaaac cagtaaatag cagagctcag actgccaccc actgtccttt    18600
          tataatacaa tttacagcta tattttactt taagcaattc atttattcaa aacccattta    18660
          ttaagtgccc ttgcaatatc aatcactgta ccaggcattg aatctacaga tgtgagcaag    18720
          agaaagtacc tgtcctcaag gagcttggag tataataagg agattaataa gaaaatatat    18780
          tattacaatc tagtccagtg tcatagcata aggatgatgt gaggagaaaa gctgagcagt    18840
          gttgccaaga ggaggaaata ggccaatgtg gtctgggaca gttgaatgta tttaaacatc    18900
          ttaataatca aagtaatttt catttacaaa gagaagtcag tacttaaaat aaccctgaaa    18960
          aataacactg gaattccttt tctagcatta tatttatccc tgatttgcct ttgccataca    19020
          atctaatgct tgtttatata gtgtctgata ttgtttaaca gttctgtctt ttctattcaa    19080
          atgctattaa attttaaatt catacctttc catgattcaa aattcaaaag atcccatggg    19140
          agatggtttg aaaatctcca cttcatcctc caagccattc aagtttcctt tccagaagca    19200
          actgctactg ccttttattc atatgttctt ctaaagatag tctacatttg gaaatgtatg    19260
          ttaaaagcat atatttttaa atttttttcc ctaaatagta acacattata tgtctgctgt    19320
          gcactttgct atttttattt attgtagtgt ttcttatgta gcagatggaa tgaatttgaa    19380
          gctcccaagg gtcaggacac atgccttctt tgtttctaag ttatctttcc catagctttt    19440
          cataatcttt catatgattt agtacatgtt aaatatgtgc tacatataca tttagacaac    19500
          cagcatttgt taagtatttg ctctaggact gagtttggat ttatgtttgc tcaaaaggag    19560
          acccatgggc tctccagggt gcactgagtc aatctagtcc taaaaagcaa tcttattatt    19620
          aactctgtat gacagaatca tatctggaac ttttgttttc tgctttctgt caagtataaa    19680
          cttcactttg atgctgtact tgcaaaatca cattttcttt ctggaaattc cagtagtgta    19740
          ccttgactgc tagttaccct gtgccagaaa agcctcattc gttgtgcttg aaccctttaa    19800
          tgccaccagc tgtcatcact acacaggcct cctaagaggc ttcctggagg ttttgagatt    19860
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          ctgaaagctt ccccgattcc gccgaaggtc aggaaagtcc aatgccgggc aaactggatt       60
          tgctgccttg cgcagaggtg ggcgggaccc cgcctccggg ccgggcgcca agttgagcag      120
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          ccgcaccagc cgcgcttctc tctgcctgca ggtagggagc gttgttcctc cgcaggtgcc      240
          cacggcccag catctctggc taactcgctg ggcaccttag gacggaggat ctctacaccc      300
          tttctttggg atggagagag gaggagggaa agggaaggcg atggtctagg gggcagtaga      360
          gccaattacc tgttggggtt aataagaaca ggcaatgcat ctgggcttcc tccagcgcaa      420
          ttcagttttg ctctaaaaat aatttatacc tctaaaaata aataaggtgg gtagtatagg      480
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          catcccagct gcagcagata agtaagtctc ttcctgcgct aagcacgtcc aggacccctg      660
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          aggagcctaa gaataaaaat agtataataa aacatttctt agacaggttg accttggcct      780
          atgtcaaagt tcagtctggg tttgtcttat aacataagga gtaaaagtac cattgttcta      840
          cctctttttt taatacttga aaaaaaattt actgtagatg cttttctatt aattaaataa      900
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          caagctggag tgcagtggtg ccatctcagc tcacagcnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn     1680
          nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn     1740
          nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn     1800
          nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn     1860
          nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ngactttttc tctatctctt ccttctaccc atcctaccct     1920
          tggaagatag agaagtaata tcagttccat cgtgttatac tgggcttccc ccagggacaa     1980
          acccacttcc ccaacctgaa tgagccatca cttcttcccc agtttacatt tcattgctct     2040
          ttgaatgtct ccgttcggat atgggaattc acatgtggtc ataattctta cctgaagaag     2100
          actgacgtct tcttctctta gaccaactgc cctgatgtga ggtttagagg ttaaagaaca     2160
          tgtgtgtatt tacatgatct ttgtattctg ccttttcgtc cctcactaat gacagctgaa     2220
          ccccaaggaa atagagctgt ggaggagagg gtttgatgag aaagtaggta aatattggat     2280
          ctaatccatc atcttccagg aaacctccat tacttctaaa aatttcaacc aaattcgtta     2340
          aaggacaaga actccaccag agtagggcca taaacattgg caaaattagt tgtaatctat     2400
          gactagattt aatgtccctt tgttttattc acatatggtt ataatgcttt gcttggaatt     2460
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          ataaaatatc acattaatat tttataactg tacagttaac tctggcccaa ggaaaagata     2580
          gtccggtaga tgctgcagcc tgattttgta tctaaccctg gcaagaggat aatgactcat     2640
          gttatttcac ttaccctttt tatcttttaa catgaagggc tcatataggt caataagaaa     2700
          ccagtgatat aaacagacca aaaaatgatc agatctttca cnnnnanana aaaaaaatat     2760
          ttttaaacaa tacccaactg ggtgaaaata caatgtaaca gtaccaaata tcaacatgtg     2820
          tcaagaacca gaaaaatgtt tgttttcttt gatcagcaac actatttgag gaaatctatc     2880
          ctcagggcct agcctggggc ctggcacaca gtaggcactg aacaaatatt tgctgaacac     2940
          acacatactt atgatatttt taaaattggc aacaatccaa tacccaataa tagaggaatt     3000
          aaatattata gaactgttca ataagatgct tacgaatatc atgcagtaag atgggcaata     3060
          tttatatcat aagcttaaat gaaacaaatg ggtattaaag gtatggtaag gttataaatt     3120
          actttttaag agattaaagg gaaaagactg aaagatatat actgaaatgc tcacagtggt     3180
          gacaaggttc cccagccttg gcactattga cattttgggc tatgtctttg ctgtgggagg     3240
          ctggcctgtg ctctgcagga ggtttggcag cactcttggt ttctacccct agatagcagt     3300
          agcaaccctc cctcaaccag cccaattttg acaaccaaaa atgtttccag gcatcaccag     3360
          attctccctg ggtgagagtg atgaaacagt aggtgatttt ccccttcttt tctcattttc     3420
          tgtaattttg tcacattacg ttaataataa ggaaaaaaca taaaaaatag atgaatttat     3480
          tattctacct cagtttggat gtttggactc cctttggggg ttctttccat tatatcactt     3540
          ggtctgctaa acagtctatg gtttggcaag gtgaaatgat tcatgaaatt ttgtttttat     3600
          tttttacctg atactaaaag taaaacattc attcgcttga aaatttggac acagaacacc     3660
          aaaaaaaatc cataatctca tctctctttt tctgtctttt ccttcctttt ttccctttaa     3720
          aaacaagagt gaaaacctac cggttctccc tccaatttaa ttcctaaata taatcactgt     3780
          taacatcttg gacatttcct gtgtctaaac acacatactc actttttctt ttttttagca     3840
          aaaagtggat ttctgctaca tgtagtgttc cgcaacttcc tacatgttta caaaatcagt     3900
          acatttacat acgctgaatt cagtccttaa tggtattata ttttgtgaat ataacaaaat     3960
          ttatttaacc acttagacaa tctaagatat tctcagtttg ctgttatgag caatgctctt     4020
          cctttacata tacatatata tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtt     4080
          ttagtaggat agatttctag gagagggcga aatgtcatat gacatccaca tttacaattg     4140
          taataggaag tatcaaagtg ccccctaaaa aaaaaaattc ctcccattag tgtgtgagaa     4200
          agcctatttg ttcatatctt cacaaacact aaatattaga aatatttaca attgtgttca     4260
          agctaagaag tgaaaaatgg tatttcatat cttataattt ttgttgtgag attgaacata     4320
          tttcctatgt ttacatgtca cctgtatttc ttattctctg aactatacgt tatgaccttt     4380
          cacttatttt cctcatgggt tatgtgtagt ttgtgtagtt gtcttattga ttgttaggag     4440
          ctatttatat attaggaaca ttaatctcct gtcttatatg tatgtggcat tgattagttg     4500
          atcatttgtg agttcatgtc tgtatacaaa gattagagag gcagtaagag ggaaaactta     4560
          cctctttctt atcaaagttt gtaaatatat gtataacaga agagagagaa aacattaata     4620
          aatgctgaaa taaagtataa atttttactc cactacttca acataaacta caaaaggaga     4680
          gtgacttttc tttcatgctg acttccatat tccccatgcc taaaatagtg cctagcacag     4740
          aagaggtgct caatcagtgt ttgnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn     4800
          nnaaatgaag aatagaatct aggcagatac tctggaagag tgactgtgag tcattcatgg     4860
          tcttggtatg aattagtcaa atccagcttt ctccccttcc cactccccac tgttagtaga     4920
          ataatctgtt tattgagaga atagatttat aatttagaat aagaggggca gaagaggaga     4980
          ttttgaagga tggcacctga aggaggacta gcatggctga gatagtgaag tggaagtctt     5040
          ggaaagctaa agggtaagat gaaagtattt agccgtaggg ggaaaaagca ttgacaggtt     5100
          ggaaatgtaa aagtcagatt ctccttgctt tgaaattttg tacagggcag gttctactag     5160
          gtatgttaca atgcagaaaa aacatgaaat agttgagagg aatttggtga aatattatct     5220
          tcctggcttc ttttgagtga gcagattttt ttcagggcct gtaactataa taaatttgaa     5280
          acttctcatc ttttagtaac ttttttcact taagtttatg tggctgtggg caatggaatg     5340
          aaggtattga acttcctatt ccctgctggg tttccacaat tacaagtcaa tcatgactgg     5400
          ttattagaag actatttcaa ttagaaccac caagtcccat aatgtcatat tgtgtgttta     5460
          attattaagt aaagcagtct tctttttgtg ttttccataa ttagcacatt ccagaaagat     5520
          gaggatattt gctgtcttta tattcacgat ctactggcat ttgctgaatg gtaagacacc     5580
          aaatccttcc attaggttct atattttaaa tattttaacc atgagtttaa aactaaaatg     5640
          ataatttaaa atgcatgcaa ttttcttata gagagaatat tctcttcttt cttctacttt     5700
          acacaatgac aaagtctttc ttctgcttta cacaatgata aagctccctg tgtcattgtg     5760
          taaaaatata gagaatatag acaaattgaa agacacaaaa taatctatta cccatttccc     5820
          agggttaact actgaaaata tctggggaaa tggcctgtat gtatatattt atttgtttgt     5880
          tttcaacaag gccaggatct ttcaatcttt caatcttggt tgctctgtga catgcctttc     5940
          ctgatgagaa tactctaagg aagaattgta ggatacatgg aaaatgtcag ggtaacacag     6000
          tactggcacc accctgcggt cctttctgaa ctccatacca atgtacttct tgccagaaaa     6060
          ctgatcaaaa gtttagggaa gtaaaaagag atgttagaat ctaccattcc ctctatgtag     6120
          gaagcaaata ggtgtccagt caaaggacat tctggggatg tctacatgaa accaagtctc     6180
          ctggttgtaa gtactccatc tccatataat atttctacag taatatatgt ttataaattg     6240
          tgggggcaac ttgtttagct aattttatta ttctgttatt gggacactat gtctctgcat     6300
          gagacatagt gtcccaaaac atatttcaag cccattggat aaaatatgta tttagcaagt     6360
          tcttaaatat aatgataaca taactgacca gataaggtga tttttaaatg ctgtgccaac     6420
          tttataaatg ttttgaggaa ttttcccttt tctgaaggtt attcttcttt ctttttagca     6480
          tttactgtca cggttcccaa ggacctatat gtggtagagt atggcagcaa tatgacaatt     6540
          gaatgcaaat tcccagtaga aaaacaatta gacctgactt cactaattgt ctattgggaa     6600
          atggaggata agaacattat tcaatttgtg catggagagg aagacctgaa ggttcagcat     6660
          agtaactaca gacagagggc ccagctgttg aaggaccagc tctccctggg aaatgctgca     6720
          cttcggatca cagatgtgaa attgcaggat gcaggggttt accgctgcat gatcagctat     6780
          ggtggtgccg actacaagcg gattaccgtg aaagtcaatg gtaagaatta ttatagatga     6840
          gaggcctgat ctttatagaa aacatattct aagtgttgaa gacttttcat tcttataagt     6900
          ccatacttat tttcaaacag aatagcatag tctcttcatt cattcattca gttcatgaat     6960
          tcattcacgt aagtctccaa ttagcatttc ttgagcacct atatgatagt cattggaaat     7020
          ccagagacaa cacagagcca tgttctacgg tatgtacagt tttccaaaaa taattcctag     7080
          tctttacttt tttattataa atgtaataca tatacttgca aagaattcag atactatgga     7140
          agagatcaaa tgaattgcaa aagtgtccct cctcccttca ccactatctc ccatgagata     7200
          accaagagac actccaagag agtaaccatt atttgtgtgt ccctccagaa ccttttttat     7260
          tcaactacca tttttttatt ttattaggtc tgtcagtttt ccttttttga gcctctctat     7320
          atcaaatgct aataaatata ttcagatcaa accccactgt aaggttcata ttaaaaaaga     7380
          cttgaagtct ccctatgaag acaaaaaata atcatattaa gtgtaaaaga acttattctt     7440
          ccagtacagt ataaactata ctcactgggc atatattcat cttgaaaatc tatactgatg     7500
          ttgtcttggg gaattgaaga ggaactagga gtgtcaattc ctgggaactg acccacagtt     7560
          atgtcatcag gtcacttgag ttcgaagttt tgtgttagca ctagctaagt aaaggaaaac     7620
          acctctgctt tcattgttga gtttcataga attgagagct gaaaggatcc caggcaggag     7680
          cgactaatcc aaactcccac aaagaacaaa aatcccccag aggatcttct gttcatatat     7740
          ttcctgcagt ggcatccctg tcatatccca caatggcatc cctgccattt ggactcccct     7800
          tccatatcct gttgaaatta ctccctaata gtaagctgaa atctgcccct ctagttgtag     7860
          ttttggaatt atttcatttc catgatgacc ttttaatatt tgactagaat taaatcatct     7920
          ccccttggta tttccattcc tggactaact accatcaatc tgagggctaa caatacaagt     7980
          agaaaaagtc tacacttgtc attgatcact gatcaatgat taatcaatga tcactgataa     8040
          ttataaactc aaaaacaaaa tcatgtaggg attaagagaa atgtatcagt tttatgttgt     8100
          atttctggtc cctgattctg gctcaaataa tgctactatt gtcaagaaga tatcacttgt     8160
          aaagtagatt taattttcat tatattttac catgtgcttc tccattcacg gcatttcttg     8220
          agatgttgtg gtttatactt tcagtttttc tccagtccat cagcaaatat caggcatcta     8280
          ctgtgttcca agatattaaa gaaatcatca tgacttagcc tcatcaacag cattgctaga     8340
          tctgggatgg aaaagaagag tataatcctg gcagtcagga agaaggctgc ataaagtata     8400
          agtttctgct tccaaagaag atctctcatc agcctgtagg gagtgtatag ggaggggaca     8460
          gctgtccttg tagtagcaaa gggttttatt caggtcatct gggctccata atatcccttg     8520
          tgtatctgca gtctcctttg ccatggatca acacaatagg aaatcttccg gcactgatgg     8580
          tttttccaag ggggagttct tcagggagca aagcaaatga ccaaccaggt ttgaggacct     8640
          gatttgacaa ttccattttg tattttaaat tagttaattt gcattctagt cccaatccat     8700
          cttgtcattt gcagacagtg gttttggggt tgagttgagc tataccaaaa gtctgaacct     8760
          tctgcactta gaacnnnnaa ggcaaccacc aagcttcact tgcactgagg cagtgtctcc     8820
          aatggaaacg aggtagctgg cttgcagaag ctttccaact cagggaagta gaactcctga     8880
          gtcacctcca tatgcaaata atttcacagt actgctgttg aacttcactt cccatcacag     8940
          caaatgtgtg gtaacatagc tttgccacag gagtttactn nnnnccatgg gattttaaag     9000
          gtgaaacatt tcaaaactga aatttgaaag aatttagttt tggattcact caattatcat     9060
          gatcactttg ggtgttattg cacctttcat gtttgtgagt ttaaatacca gactctcagg     9120
          cctctaactt tcaattaaaa gtgtttttct ttaatcactg nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn     9180
          nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn     9240
          nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnctgtcat     9300
          tccccaccaa ccccatcttt ccccaaaatt cccagccctg tttnnnnngt ttttctttaa     9360
          tcactgaacc taatagtagg gaaaacgaaa tgttcattca gactttcagg accttcaatg     9420
          agatgaggca gctgaaagat caaagtagtt gcatagttat cccagtaaag ctatttggat     9480
          cgtatggacc agatcaactg ctgtcattcc ccaccaaccc catctttccc caaaattccc     9540
          agccctgttt aagtgttctc tgtagcattt atctctatct agtatattgt gtagcatatc     9600
          atatcatact tttctatttt gtttattgtc tctctcctcc tagaatataa actccacaag     9660
          cacagagatt tgggtctgtt ttttaatatt gttgtatccc cagggcttga cgtaaagcag     9720
          agtggtagta tgacaaaagc acacaaaaaa tatttgttga gtcaatgaat gaatgatttc     9780
          ctcaaatagg attagcctaa aatttggaaa catgaacaga cttggatata tgaaaatttn     9840
          nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnttctaa agggtacact gaagcagcag     9900
          tagtaaaagg aggaggagga gaagcagctc tgctactact attatcgagt actactannn     9960
          nnnnnnnnnn nnnctacaac tatcgagtac tactacaatt agcacttgct tattctgtgt    10020
          gttaggtcct gtactgaaca ttctgcctaa attagttcat ttcctcctgg aaatgactct    10080
          gtggggtagg tgcttcatca tgtaagatga gtatttttca cacttcactg tctctgaaat    10140
          ctgagtgtgt ctttcaatga tggaatcttt gatttcatga taagtggtat tattcccatt    10200
          ttaaggatga ggaaactggg gtccaaagaa attaagtaat ttgcccaaat tcacctagcc    10260
          tcgtaaatga taaagctagt tctaaatcca agcagattgg ctctgaagtc tgggccctta    10320
          ataaccactt attgcctgta tttgcacctc tggtgtatgt atcaagttat atattggctt    10380
          caaaactatc atgacctttt cttgattttg attgttcaat attagtatag tgttctnnnn    10440
          nnnnnnnnnn nngggtctgc aaaaaatttt gattactcac ctcatctgta aaacatttta    10500
          aacttgtgtg tctgtgcagg cacatttgtg tgtaattata aaaaatttac tatctattaa    10560
          tatataggtt gtaccgtaag aaaaattgcc atttttgaag agncaaaaaa ggttgaatat    10620
          taccagtttc atctggttca acctaataga catttgtaca aaaacagaca ttttaagagg    10680
          atgaaataaa aatttaataa acaatatttt caatttttac taattgtgac gcttcactat    10740
          tgttagctaa tatgtcaagg catgatatac cttagggtgg aatttatcat taacaaaggt    10800
          ggatagtgtc aataatcttg aggtttgtgn ttttttatat aacactgtga ggtctaatta    10860
          agtacttaat tgtttacaac ctcatacagt cgccaataat aagtgtcact tctgctgttt    10920
          cctctgggtt gtgcttgaat tattagtatt atcttcaatc ctcagtttct ttgtggaaaa    10980
          ctttttaann nnnnnnnnnn nnnnnnaaga tggttagttt agtcaaaatt agataagaga    11040
          atctgaaaat ccataattac cccaaagcaa cccactcata agaactatta tttttgtgtt    11100
          ttggnnnnnn nnnnnnnnnn nntttccagt gtttccactg gtagtggttt cattgatgta    11160
          ggagtatcaa aacatcacta attatttatt tcagttttgt ttgatcctag ctgttttgtg    11220
          ttaactttga agaaattaca tcacagatct attgttgtcc ttggtaaagg aatggagagt    11280
          taaggctcta gatcattagt ggttatgctg tagtattagg agtaaaaaaa agattatatc    11340
          aacaaaataa gaacatgtta atgtacttgt aatagataaa catgaataaa gctcttatgc    11400
          tatatagatg cactgaacaa tctactagaa ttgtcagcaa acggtatctt aatcctnaaa    11460
          agggtcccaa accaatgatc taaaattgaa tcaaactttc ttccttgagc ataattattt    11520
          aagtgattta ttaaaatagc cagcatttaa aagcttaaaa tataagtatc ataatgtggt    11580
          atcctagata gatcccagaa cagagaaagg atattaggga aaaactggag gaatggaata    11640
          aattatgcag tttagttatt aataatgtac taatgtcctt agttatgacc attgtaccat    11700
          ggtaaagtaa gatactaaca atagaggaaa ttgggtaagg ggtatatgta actctatact    11760
          atctttgcaa tttttttgta aatttaaaac ttctaaaata aagaacaaat ttgaacatta    11820
          aaaagtgtcg ccaggaacat gtatcactgt ttacagatga aacagtatgt atttttatat    11880
          ctaatttctg atcattggct tcaaatcaga aaagtgaatg acacatcaag atcaggtttt    11940
          ctgtttacta aataaagtct aagaaaacaa agcataccag ctggagagat tcatgtttat    12000
          aaagacagat ttataacaac aaaataaaat atccaagaat aaatttaaga agaaataggg    12060
          cactatgtaa aaagtatagc actttactga gaaacatatg aaaacctgaa tacatggaga    12120
          gaggtatttt atatttgaat agaaagattg ctggtttaaa gataattctc tttaaatttt    12180
          ttttgttaga aatttaagag gtacaagagc agttttgtca cacggatata ttacatagtg    12240
          gtgaagtctg gggttttagt gtaaattaat ctttacattt tgtttgagcc caataaatgt    12300
          accaacatga tttttatagc aagatagtca ttcctattaa cccaaacttg tcccaacttt    12360
          gaactgaact gaggcagagc tagcaggtgt tccccactgc tgaggcatct gaacattaag    12420
          cgtatccctc tgagaaccag cctgcattga tcctctttct aatgtagaca gcatcaagct    12480
          atatatctag ttctgtgctc agcaaaagcc ctgacttctt tttgcttatg tcctagctcc    12540
          atacaacaaa atcaaccaaa gaattttggt tgtcgatcca gtcacctctg aacatgaact    12600
          aacatgtcag gctgagggct accccaaggc cgaagtcatt tggacaagca gtgaccatca    12660
          agtcctgagt ggtaagacca ccaccaccaa ttccaagaga gaggagaagc ttttaaatgt    12720
          gaccagcaca ctgagaatca acacaacagc taatgagatt ttctactgca tttttaggag    12780
          attagatcct gaggaaaacc atacagctga attggtcatc ccaggtaata ttctgaatgt    12840
          gtccattaaa atatgtctaa cactgtcccc tagcacctag tatgatgtct gcctatcata    12900
          gtcattcagt gtttgttgaa taaatgaatt aatgaataac attatattta caaaatgtat    12960
          cctaattcct cacttccatt catccaaatc atattgttac ttaataaaca ttcaccaaat    13020
          atttattgaa tatgcctttt gttccatgca ttgtagtact catttgacac acatagaata    13080
          ataagactca cgttcacact cttcaggaaa cagataaaaa acaaatgaac aaacaaaaaa    13140
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          cctgagagga atattcaatt caggccatgt ttcaggaatc caaatcctgg cacatcagag    13260
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          tatgccaaac aggagggacc ctttctcccc tgtgcctctc ccaaggtagt ctacaatatt    13380
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          tataaacttc actttgatgc tgtacttgca aaatcacatt ttctttctgg aaattccagt    19740
          agtgtacctt gactgctagt taccctgtgc cagaaaagcc tcattcgttg tgcttgaacc    19800
          ctttaatgcc accagctgtc atcactacac aggcctccta agaggcttcc tggaggtttt    19860
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          acagagctcc ttgtgttatc tgtttgtaca tgtgcatttg tacagtaatt tgtgtgacag    20040
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          gcctcatgcc aggctgcact tgcacgtcgc gggccagtct cctcgcctgc aggtaaggga       60
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          gtgtgtttat ggatcttgtg ggtaggtagc tgggtcagaa gagatgaatt aattggtcct      240
          agcgcgactt gactgtttgc tagcaatgac tgggtctttc cacttgaagc atctccggag      300
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          tgtttgagtg tctgaaaggc ctttgtgtag aaaaaaaaaa aacaacaacc tgagaataca      780
          ttccagaaag tatccgcagc tgatgatgat agtgaccaag cggtgtttaa ggagaacttt      840
          atacagggaa aatattcacc tttcccagct gagcatcata gataggaaga catgatagtg      900
          gttatatgct gctctaagga gggatggaga agggatggat ttgagcacag ggttcaggat      960
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          tttataacaa caccaacaat atccaaccat aaaaataaac tgaaatggtc actctacctc     3000
          agtgacaacg tctgagctcc gtttcagggt ccctcacaag aaattcgata ggtgtaatga     3060
          tttatttttc ctaataagta aaatgattat tcactcattt gaaaattgga cacacacaca     3120
          aaaaaatgaa gaaaaaattt gctatttcat ctctcctttt ctatctcttt ccctttaaaa     3180
          aaagtataaa tgtgggctaa agagatggct cagcagttaa gagcactggc tgctcttccg     3240
          gaggtactga gttcaaactg caccaaccac atggtggctc acaaccatct gtaatgggat     3300
          ctgatgccct cttctggtgt gtctagagac agtgacagtg tactcacata cataaaataa     3360
          gtaaaaaaaa aaaaaacaaa actttttttt aagtataaat gtgtaagaac ttacctgtct     3420
          tccctataaa agccacaatt acctttgcag ataatcactg tcaggcagtg tcttcaagag     3480
          aagtggggtt gttctacgac acaagaatat ttttgtttat atactaccct ctaagctcct     3540
          tcctacttct ctgcaaactc atcccctgtg catatactga aatctatccg tcacggtatt     3600
          ttgagtatac acagttatcc gtcacggtat tttgagtata cacagtttta ttagctaata     3660
          catggggtat ttcaagtctg ggactgttgt tggctgtgtc atctctgtta catatgactt     3720
          atattttcta agatgaattt ccaagacagg aatagagaga tcatacgaca tgcacagtta     3780
          aagttttaag agattacaaa attgaccttt aagaagctat acaatttcac atcctttcca     3840
          ggaaaggtca agaaatccct gtatcttcac taatgctacc tatgaggagt ctgtaatttt     3900
          ggtagagcag aaggtccaaa tggtatcaca gatcctccat ggactttctt atcgagagcg     3960
          ttctttccgc ttttattgat tatccttcga gctatgtgag actctcatcc gtcttcctct     4020
          tgaccgatgt atagttttct cactgagttc agaggctagg atgcagaagc cgtcctcgtc     4080
          agctttatac acctttcaga ttgactgtga atgagcacac aggtcagaga gacggtaagg     4140
          gaagacctac tctcccatga acgttgtaaa catgcgaata acacagaagc agaaaatgta     4200
          aactattaga ctggctggaa tgtagcgctc acctttgagc ccactccttt agacaccggt     4260
          ttcatggaag aatggctcct gtttcccacc tgctgcttca gcagtgcccc aaatagtgcc     4320
          agattcagag gagatactca gtgtttgccg agtgaattag gaaagtgttc agcggagggg     4380
          acactagcat tcagacatcc agaccttaga gtaaccgggc cagatggaag tctccttcct     4440
          tcccatagct gttaccactg tactgtcttt actggggaaa agatttatca tgtggaatag     4500
          gtgcgaggca gaggtgagat tttaatgggg aggaagcatt gaaaagtgaa agtgaaaatt     4560
          ggatgctctt tgctttgaag ctttgcctaa agcaggtttt agctttcaaa tacgtttcaa     4620
          tgttgaaaga acgcatgata catatggagg ggggcctggg gggggtcctt ggctgagttt     4680
          gaatgtacat taacaatctg gggggctaat aactcaatgt aaagctgctg atcccatcat     4740
          actgacttct ttccacttgg ttctacatgg ctttgagtta caaaatgaaa gcattgaatt     4800
          ttgaactgtt cagctgtgtt tccacacttg caaatcggtt gttggccagc cctcagaatt     4860
          gcttcagtta cagctggctc gtctgctctt tccagactgg cttttagggc ttatgtatat     4920
          atgagaagga cacatttact agtgtctcct tgctctgcta ttgaaattaa gcagacctct     4980
          ctgtgtttcc cgttactaga tagttcccaa aacatgagga tatttgctgg cattatattc     5040
          acagcctgct gtcacttgct acggggtaag tcaccaaatc ttttcagtgg gttctatatt     5100
          ttcaatattt tagctatgaa ttaaaaatgg aagtaatttg tggggtgtgt atgtgtgtgt     5160
          atatgtgtgt gtagaggggg gtctgtgtgt atgtgcagtt gctaggcaca cataaagcgt     5220
          tcataggaca acctagagct tagtcctcac cttctacctt gtttgagaca aggtctctta     5280
          tttgttgtac attgctgagt cctgtagttc ggctagctca gaacctcctg ggggctctcc     5340
          tgtctccacc tcccagtcca ctgagattgt aggcacatgc tactgcacct ggcttctacc     5400
          tggtctctgg ggatttgaac ttgggtccat gggctacaca gcaagtcgtt tacttactgg     5460
          gcaatcactc catcccctaa gataattata aggaatatac cttgcttatc caaacacatt     5520
          ctcattctcc tttgccataa ataagttact tggcaaatat attgtatgta tttttaataa     5580
          ataaataaaa tcttaaaaat aaataaaatt atttgtgaag acaaaaaaaa taagttactt     5640
          ggaaaggatg aaggaaaata ctggagcttt gggtgtggtt tagtagtaga acacttggct     5700
          gatgtaaaaa aaaagcccta ggtgcaatcc caacaccaga aacaaatgaa ggaatgaaca     5760
          acaaccgccc ccacccccca ggggatgaat ataaaaatat caggtaatac agaactaaca     5820
          ggtgatccgt ttcctatgaa taactactga acattcccag ggaggtggcc cactgataat     5880
          atatttttat ttattggttc cttttaaaca agactgggaa tatattatct agcttgcatc     5940
          accaccacca ccccccaccc ccgccccatg aagttatttc aaagaagaat tttagtgttc     6000
          atgtgattcc ctaaataaaa tgatagtaac cttttaccca ggttttcaga tgtgtttgga     6060
          ggagttttct gtcttctgag ggctggtcct ctttcctttt cagcgtttac tatcacggct     6120
          ccaaaggact tgtacgtggt ggagtatggc agcaacgtca cgatggagtg cagattccct     6180
          gtagaacggg agctggacct gcttgcgtta gtggtgtact gggaaaagga agatgagcaa     6240
          gtgattcagt ttgtggcagg agaggaggac cttaagcctc agcacagcaa cttcaggggg     6300
          agagcctcgc tgccaaagga ccagcttttg aagggaaatg ctgcccttca gatcacagac     6360
          gtcaagctgc aggacgcagg cgtttactgc tgcataatca gctacggtgg tgcggactac     6420
          aagcgaatca cgctgaaagt caatggtaag aattaccctg gatggggaag gcttcatccg     6480
          tatttaaaac agctccctaa tgttgagagc tcttcattct tgagagttcg cacgcacttc     6540
          tcacagaaca acagcagcct gttcttctcg ctcgtttgtt cattcgttcg ttcacacact     6600
          tcaccagtga aaaagcctag cactgtgtgt ttgatagtaa cttgagattc agtaccagat     6660
          aatactcagc catgctttgc agtcagtacc atgatcttgc aaaggtgaaa tgccaggtgt     6720
          ttgtttctta tcataaatgc aatatataat atattacata gatgtataga tataactgtg     6780
          taacatgcaa taagatataa tatgcatata tttcatataa cataatgtat aatatataat     6840
          gtataataat atatactaca atatatagtt atatgcatag ttatatattg catttatgat     6900
          aaaaagcaaa cacctggcat ttcacttttg caagcttttt gaattacttg taaatatata     6960
          tacatgcaaa catacataca cacacatgtt tttttacaag taatttgaat gtcatggaaa     7020
          gaaatagaat cataaaaatg tccctcctcc ctaactacca tcttctaagc ataaatatac     7080
          agtaactact atttgtacat ccctccatga ctttttgatt ggattactgt ttatatttaa     7140
          tctatcaggc ttagcacatt ttctttcctt tgaatacctc catacaaaat tcaatgtgtg     7200
          tttatatata tatgtatata tatagttata tcatatcata tatcatacaa agttttatat     7260
          atgtatacat atataaacac acatatctac acatacatac acatttttta tatatataca     7320
          caatatataa tgtatatgtg tgtgtgtgtg catatacctc tatatctatc tatctatcta     7380
          tctatctatc tatctatcta tctatctatc tatagcttct actgtaaggg tcacttttta     7440
          aaaaattaag gttaatctat gaaggatgag aagtgaagat cttaagtgta gaagaagccg     7500
          ttcttccaca gagatggtac aggctacact cagcaggcat gcattcattt tcagggcctg     7560
          catctctggg agtgctgagg aggaactatg agtgtaagtt cctgggtaac gagccacaga     7620
          aatgtcatca ggtcccttga gttcacggtt ctgggttgga actaactaag ggaaggaaaa     7680
          caccttgcta accacccctg ctttcactgt tgggttgcat agacctgaga gcttcactca     7740
          tcgcaggcgt gcacacagcc agcccagttg cccaccagga ctggaaatcc ccaaggctct     7800
          cctcttcaca tacctcccac agtggtgtcc ctcgaatcag gtccctttcg tggtctgcgg     7860
          aaacttcacc ttgatggaca ctgagccgaa ccccgtcttc tccaggcaga cgttgcagat     7920
          ggtctgcctg ctccttttcg gttttcataa taactttaaa actatttggc tagaatcaga     7980
          tagtctcctt cgatcttttt actcctaaac tagtgtgaag ctcaatatta tacataggaa     8040
          aaattcacat tcctcataag ggatcacggc agttattaac gcaatcttat gtagagatta     8100
          ggaaaaatgt gtccattcga cagtttatta atgggtctgt gatggtgggt cgcttagagc     8160
          ttatgaagat gccacttgcc ttatttcggt gcttggctct aacttccatt accttttact     8220
          tacaattctt catttgtgac actcatgaaa ggagactcgg gatatggttg ttaatatctt     8280
          gagcagctgt tagtacatca gcaaatatga ggctcctgtt tggttccaag atttttaaag     8340
          acattgtgaa gctggaaggc catgagcagt caaagttgct ggacctgggg cactggaagg     8400
          agctcaaggc gggcagtcag gaagaaggga gcagggtgta agcctctgtg acaagaggtc     8460
          tctcatggct tgttaggagt aggtgactct ggtaaggagg aatttactct agattatgtg     8520
          ctcagtgata tctctgatac caaagacaat cttttggagc gcacggcttc tccacggagg     8580
          gacctgtgat gcggcaaagc tggtatccaa gcagtcttga aggcctgctt gactattttg     8640
          ttttcttaca gaaatcacta cgtcgatatt ttactcccag ttcaccttgc catttgcatg     8700
          cacgttagct ggtctaggcc aagagtctga accttggttg tggctcaaat ctgtaatctc     8760
          agctatgtgg gaagctgagg caggagaatc gcgcaattag gacttgtctg agctacgaac     8820
          atatagcagg ttcaagagca gcctgggcaa tttggcaaga tccgttctca aagacataca     8880
          tacatacata tatttggcaa gatccgttct caaagacata catacataca tacatttggc     8940
          aagatccgtt ctcaaagaca tacatacatg catgcatgca taaatacatg tataaatgaa     9000
          tataaaatta aaataggaac aggactgagg acatgcccag tgatgtacag gaccctggtt     9060
          tcagtttcta gcaccatggt cgctggcatg caaaagcttt ccatgtcaag gaagtagaac     9120
          tcctgaattc tgtgctatgc aaatgacttc acagcaaggt tccttcccat cactgcaagt     9180
          gtgtggtggt gaagcagccc tacagggagt tcactcgcca tggggtttta aaggtgaatt     9240
          atttcaaaac tgaaatctga aagagtgtag ttttggatta actcagtttt tattatctct     9300
          ttggataatg ttctaccttc aaaggtttac agaagaccct caggcatcag gcttttaatt     9360
          gaaaaatatt cagctttaat cactgacctc aatatcagaa aagaatgaag tgtccattta     9420
          gtagtcctcg gaccgtagat ggcattaagc agctgtaaga aacacgctca tcacatggtt     9480
          caacaattaa ggattgccat ggtgcacccg atcccccagc tctgtttaaa ccttttctct     9540
          gtcatctatg cctatctaag atgtctcagc atatcatgct tattgtctct ttccttctct     9600
          tgaacacaag ctctaggggt aggggctttg gtcagtttta ttgttggacc tgttggcctt     9660
          gacgtattat gaaggggcag tgtaataaga aaagaaaacc gtgtttgttg atggaatggt     9720
          ttaaaaaaaa attagcttaa aatgtatgct atacgaacgg gcatgaatct gggagatttt     9780
          agactgttcc ttgtgagccg taggaacttt cttgtttctg tgttcacagt cctccgcagc     9840
          tgtgctcatg gtcctccaca tctgcctaac aacagcaggg gtagatgtta taattaacac     9900
          tcacagaaca cctgatatgt gagaggttgt gccctgggct tcttgctcat atgaattcat     9960
          ttcatcttta acataactct tcgggggagg cacttgccca tgaccatggc ttgttttctt    10020
          tcctatcgac tatctttcaa atcggaatgt gtctttccct aggtgacatc tcagattcaa    10080
          tgttacacag cactgctgtg cccattttca ggcattaaaa atgcgatccg cctaaattcc    10140
          accccgataa aattatgcag ccaggttcgg aacccaacta gcccatctct aaaaatctat    10200
          gcccttccta gcctcgcttt gttgcctgtc tttgtacctc tggagtgggt atcaaggaac    10260
          agaatggctt taaacatgat ttgaactttt cctggttttt gatcacagca gtaacagagt    10320
          gttctagaga taagccagag gtttgaaaac aaacagaact tgtctttgag gtgttataaa    10380
          catgtgtgtg attataaagg atatatctgg tgccaatagg tatagcttat attataagaa    10440
          atggccattg tgaagatcag aaggagataa ctcactgatt tcaggtggtt gattcaatct    10500
          aacacatgat atattctgaa actgtacaaa aaagatattc aaaagaagaa acacatggaa    10560
          caaagagtat atggaaattc tgacaactca gaatcagtgt atgttaagat gaagttcatg    10620
          attaacaaat ggagatggtc gcagtcatcc tgaagcttat tttagccaat gctttatcac    10680
          atccaactca atcttcgttt tttttttttc agatggatct tcccattttt aattaacctt    10740
          atcatgatag cccctagtaa ggcatgtcct gacatttctt ttcttttttt ttatagctta    10800
          tgtttctttt tttaaaaatt tttttactac atattttcct caattacatt tccaatgcta    10860
          tcccaaaagt cccccatacc ctcctccccc actcccctac ccacccactc ccactttttg    10920
          gccctggggt tcccctgtac tgggggatat aaagtctgcg tgtccaatgg gcctctcttt    10980
          ccagtgatgg cctactaggc catcttttga tacatatgca gcttgagtca agagctccgg    11040
          ggtactggtt agttcatagt gttgttccac ctatagggtt gcagatccct ttagttcctt    11100
          gggtgctttc tctagcttct ccattgggag ccctgtgatc catccaatag ctgactgtga    11160
          gcatccactt ctgtgtttgc taggtcccgg ccaagtctca caagagacag ctatttcagg    11220
          gtcctttcag catatgcttg ctagtgtatg caatggtgtc atcgtttgga ggctaattat    11280
          gggatggctc cctggatatg gcagtctcta aatggtccat ccttttgtct cagctccaaa    11340
          ctttgtctct gtaactcctt tcaatcttcg tttttaatgt ccgaaaatga ctggtaacgt    11400
          cactgcttac atttcccttt gctttgtgtt gaattgtgag ctttatcttt gatctggagt    11460
          ttctttaaga agactttgta atgtgcttat ttttaaagat ggtgaattca attaaagata    11520
          gacaagaggg acgggtctgt atttcatctg gtagagtgct tacctgccat tcatgaagtt    11580
          ctggttcgat ccccggcaca gcatagaacc acatgcggtg gcaactcagt tgcctgtgac    11640
          cccagcactc aggagctaga ggcaggttac ctttgactac acagcaagtt caaggctagc    11700
          ctggtctaca tgcaactctt cctcaaaggg aaaacaaaac aaaaatagac aggagaattg    11760
          gaaacatcca tagaaaccca aatatgaatc aatagactcc cctcttcctg tgtcagacat    11820
          tcagactcag tgacagccgt caccgtttat gaggcatgac tgattttaca gatcctagag    11880
          caagcgtgca caattctggt gtttcctgcc tgcgtcctca cacacacgct caccttaggg    11940
          acggaggcag cggaggtcta gtcagtttca gacgaatcca ctcatcagct gctcaccatg    12000
          gtcttctagg tgaagcagaa ctctccttcc atcagcaccc gtgaaaaaca aaagtggaaa    12060
          gcagatattt cactccgaat gctttatcat tggcagtgat ttcaaattta aaccactaat    12120
          ttcccagaag aattaggtca cgggccatgt ggcattagac cctattgtgg tgacattatt    12180
          tcctgatgtg cctatttaat aatgtatagt ggtctcatct ttatttagtt ggtcttgaat    12240
          gtgataaata caagactggg caagtgttca tcaaagctgt tacttgaaat tgtaattata    12300
          cctattttgt tggtggtgtt ttttcttggt tcatggacaa ccaaacacat tacggctttg    12360
          ctttgtctta gctactctgt gtcaagttcc tgtgaaaata ccgtattaca gtgctcttat    12420
          tacatctttg gtaatgaagt agtcacctaa gcccctatcc tgggctctct atggctcact    12480
          aaagaatcgt aagttggata atgattgctg aagaaataga tatgttttat ttacattgag    12540
          gtagaaagac ctgtggtttc taggtaacag tttacttaac ttagttgcta catctagttt    12600
          gcactcagta aacaccctgg tgtggttttt acaacaacaa ggttgttcct gaagcccaaa    12660
          catggcccag atttgaatag aagacctgag gcagactaac actcactccc tgctgccaaa    12720
          gtagcagagc cggggacata tttctccaat agccagcccg agttgatgct ctttgtaagc    12780
          agacaccaca aagccacacg gctagcccta agatgggaga gccctgacct ctctttgctt    12840
          ctgacctagc cccataccgc aaaatcaacc agagaatttc cgtggatcca gccacttctg    12900
          agcatgaact aatatgtcag gccgagggtt atccagaagc tgaggtaatc tggacaaaca    12960
          gtgaccacca acccgtgagt gggaagagaa gtgtcaccac ttcccggaca gaggggatgc    13020
          ttctcaatgt gaccagcagt ctgagggtca acgccacagc gaatgatgtt ttctactgta    13080
          cgttttggag atcacagcca gggcaaaacc acacagcgga gctgatcatc ccaggtgagt    13140
          tgcctaactc gtccccggat tcctagcacg atggccatcc gccatagtca tttagcagta    13200
          gttggccgag tgtatgaata catgaaactt acattggcta gacgtattct agttcctctt    13260
          tctcttgcgt gcaagccata atgctacttg gtcaacactc agcaagaatt aagtgtttgc    13320
          tcctgacaga cagtatgtta gtcattgagt attcgtggct ggataggaca taagttactc    13380
          tgctccagga aacaggtgac agtcgcatgt aggagatgct cttgtaactt gggcaccacg    13440
          ggcaacgtga gagcaagctt atgcttcagg aatgtaaacc tttgtcacat caaagctgcc    13500
          ctcttccctc ccgggctgct gtagtagaaa gcaaatgcat tgcctttttt tgtatcttat    13560
          attcaacagg aagaatcctt tcttcccata ctcctcttca gggcattccc tgatacttca    13620
          actccaggaa gtctgcctgt gcatagaaca cgaggctgat gcctatgggc aaccgactag    13680
          ctgggttgta actcaccagg ccagggcatt gtagggatag aatgagctgc acgaaaatga    13740
          ttgtaggaaa atcgtttgag aattcagctg tctttaaaat tcatttacct tacagaaata    13800
          gggccacagg agacagtttg gtgagaggct cagagcatta tatgaatatg aacccagagg    13860
          tactcactct gaggagggtt gcttctgcct ccatcgacac ccctttccca atgtatgtca    13920
          acagtacatt gatgtctaga gatagctctg tgaagtttag agaagatata taaaactaca    13980
          ttaaaaagtc aaccaatatg aaaaatgaag cccaggatgg gcgtggagcc aaaaggagca    14040
          cacaagtttg gaaaaatgta aaataaaaag gaagacactc taactagaat tggacttttc    14100
          cataaaagct atattgttgg tttcctacca ttaaatgttt tatggggctg gagacgttgt    14160
          agctcagttg ggagagtact tgcctagcat ccacaatgct ctgaccccag cgccatataa    14220
          acgtatatag ggctcaccta tagtctaaac actttggtgg tggaagccgg agggtcagtt    14280
          caaggtcatc ctcagcttca tagcaagttc aaggccagta tggactgact acaagagacc    14340
          ctgcctcaaa gacaaaacaa gcaaacatca tcataataaa acagcaaaaa gctgttctct    14400
          ggccatttct ttgtaggaca tcctggagta acttaaccac tctgagtgtc tcttctcatc    14460
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          agcaatctca gagcatccca gagccctggg acccattttt ctctttctca aaactccagg    14580
          cagagaaaca gggagatgtt aatgactgga gtgcccaaga gtctcagaca tggaagaaac    14640
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          ccatgttcgg gagttggcct tccacaccaa gtcagccatt actgtctata ttaatgagtg    14760
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          atgtcacagg cctggagttc ttctctgtgc tgctcccagt ttcttaggag atctgtcttc    14880
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          tatatttcag gagtcatcat tcccctgact atggcgcagc aaagccttac cttccatcag    15000
          cttctcttta tccttttcca gaactgcctg caacacatcc tccacagaac aggactcact    15060
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          aaaggtgctg ccctccattc cctgggcttg ctttcagtta cacagagtaa gttttaacag    15360
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          ctaccttgga gctcggtgtt ggaccctgtt gtaatatgaa gaggtatcag ttggacaagg    15480
          gcgtagggaa gctaaaagac ttagctttca aggcgtgggg gagggggagg gcattgtgag    15540
          gttccctgtt cagcggttca gagtaaagct gggcagcaca caagtttaga caacaaggaa    15600
          gatgctctaa ctggggttgg aggtcaatgg tgcagggata ggtagcaatg gaggctaaag    15660
          aagaaagcca taaggtttct ttctacagac tctgaagaca gagcactgtg gtgcctattg    15720
          gtctcaggtg aactcaagtc ttgtgttcct tacaccacct attgagctgg gttctggata    15780
          ccctaagtgg aaaaacactt ctgtctaaaa agagctgtgg catctttacc acaaagcact    15840
          tttttttttt gcaagatttc tgaagacgaa atgacacagt ttttaaaata atttccatat    15900
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          cataccaagt gagccaatga tgcatggact tgtgtgaagc caaatgggga aatagaatat    16080
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          tgggaaaagt gttgtaactg gggcggtagc gaccagctgc ttccaaagaa taagccctga    16200
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          atgtacccta aattgttgaa taattaactt tgcggcgtgg gatctggaat aaggaagttc    16500
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          aaatcgagtc cctgtgggtt gtagtagcat cttgctataa ggaattaaga ttgatttctt    16620
          cttctttagt gagaatgcta gatgtggaga aatgtggcgt tgaagataca agctcaaaaa    16680
          accgaaatgg taagtgtgag taacgaggga ggggcaagcc gagggaatga gtgggacaga    16740
          gcagccaagc agggtcctgc aagggctgca gttccagcgc tctgtaggct gaggcagggg    16800
          gatagggagt tccaggccag caaccacaca gccaaaacaa aacaaacaaa acaaaaaaca    16860
          aagcaaaagg aagagcagaa aaagctactg ttaccaacaa gagacatact ttagccgtga    16920
          tctcctctcc ttccaaagga agctgtttgt gggggctgct ggttcctctg cctaaggatc    16980
          gccacatctg agaaaactct gggtttgctg ctgcggtgtc tgtgtggtag ccctgcaacc    17040
          agggacgctg ttgacttatt tgaatgggca tttgattaag caaatgattc tgctgtgtgg    17100
          ttagctgtta actgtttcat gtgtatgata tggcatttca tttcatcatc ctgcccccaa    17160
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          tgcgaggtgc ctaagaacac acagacttgc taccacagac gtccgttctt tgctaggtgc    17280
          ttcaatctat gctgctacta atgtctgtat ttataagagt agaaaactct gcccgggcgt    17340
          tggtggccca cgcctttaat cccagcactc gggaggcaga ggtagtcgga tttctgagtt    17400
          tgaggccagc ctggtctaca gagtgagttc caggacagcc aggctacaca gagaaaccct    17460
          gtctcgaaaa aaatcaaaaa agaaaaaaga acaagaaaac tctaactgaa ctatcttgta    17520
          gtaaattaca gtgtgttcta attcatttta gtgttgttag aaaccaaaca gtaaggccag    17580
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          accatttatt ctgctgagtc accctgagga accggcctgg cttgctcaag actgaggatt    17700
          tctcagccat gaacactttc cattttaaaa ctagggcagt cccggacaag caaggatggt    17760
          tagtcatcct tcatcatgta agggtagtca gacataggta gtatctgtct ctgtcttacg    17820
          gcaacgttac tatctgctct agcaaacatc ccatttgttt atcttacata tcatacgttt    17880
          cccccccaca tattccctgc ccctgtgaaa ttattatact atgatcactc tccagataca    17940
          caattcgagg agacgtaagc agtgttgaac cctctgatcg tcgattggca gcttgtggtc    18000
          tgtgaaagaa agggcccatg ggacatgagt ccaaagactc aagatggaac ctgagggaga    18060
          gaaccaagaa agtgttggga gaggagcctg gaacaacgga cattttttcc agggagacac    18120
          tgctaagcaa gttgcccatc agtcgtcttg ggaaatggat tgagggttcc tggcttagca    18180
          gctggtcctt gcacagtgac cttttcctct gctcagtgcc gggatgagag atggagtcat    18240
          gagtgttgaa gaataagtgc cttctattta ttttgagtct gtgtgttctc actttgggca    18300
          tgtaattatg actggtgaat tctgacgaca tgatagatct taagatgtag tcaccaaact    18360
          caactgctgc ttagcatcct ccgtaactac tgatacaagc agggaacaca gaggtcacct    18420
          gcttggtttg acaggctctt gctgtctgac tcaaataatc tttatttttc agtcctcaag    18480
          gctcttcgat agcagttgtt ctgtatcagc cttataggtg tcaggtatag cactcaacat    18540
          ctcatctcat tacaatagca accctcatca ccatagcaac agctaacctc tgttatcctc    18600
          acttcatagc caggaagctg agcgactaag tcacttgccc acagagtatc agctctcaga    18660
          tttctgttct tcagccactg tcctttcagg atagaatttg tcgttaagaa attaatttaa    18720
          aaactgatta ttgagtagca ttgtatatca atcacaacat gccttgtgca ctgtgctggc    18780
          ctctgagcat aaagatgtac gccggagtac cggtcggaca tgtttatgtg tgttaaatac    18840
          tcagagaaat gttcattaac aaggagcttg cattttagag acactggaaa gtaactccag    18900
          ttcattgtct agcattacat ttacctcatt tgctatcctt gccatacagt ctcttgttct    18960
          ccatgaagtg tcatgaatct tgttgaatag ttcttttatt ttttaaatgt ttctatttaa    19020
          atgatattga catctgaggc gatagctcag ttggtaaaac cctttcctca caagtgtgaa    19080
          accctgagtc ttatccctag aacccacata aaaaacagtt gcgtatgttt gtgcatgctt    19140
          ttgatcccag cactagggag gcagaggcag gcagatcctg agctctcatt gaccacccag    19200
          cctagcctac atggttagct ccaggcctac aggagctggc agagcctgaa aaacgatgcc    19260
          tagacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacaccat gtactcatag    19320
          acctaagtgc accctcctac acatgcacac acatacaatt caaacacaaa tcaacaggga    19380
          attgtctcag aatggtcccc aagacaaaga agaagaaaaa caccaaacca gctctattcc    19440
          ctcagcctat cctctctact ccttcctaga agcaactact attgtttttg tatataaatt    19500
          tacccaacga cagttaatat gtagaatata tattaaagtg tctgtcaata tatattatct    19560
          ctttctttct ttcttccttt ctttctttct ttctttcttt ctttctttct ttctttcttt    19620
          ctttcttcct tccttccttc cttccttcct tccttccttc ctttctttct ttctttcttt    19680
          ttttctgtct atctgtacct aaatggttgc tcactatgca ttttctgtgc tcttcgccct    19740
          ttttatttaa tgtatggata tttatgctgc ttccagaatg gatctaaagc tctttgtttc    19800
          taggttttct cccccatcct tctaggcatc tctcacactg tctaggccag acaccatgtc    19860
          tgctgcctga atctgtagac accatttata aagcacgtac tcaccgagtt tgtatttggc    19920
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          taccaagggg gagccttgtt tgtgtctcca tggcagaagc aggcctggag ccattttggt    20040
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          ggaatgtcag cattgctcct tgactgctgg ctgccctgga aggagcccat tagctctgtg    20160
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          a                                                                    20641
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          taattggctc tactgc                                                       16
          <![CDATA[<210>  6]]>
          <![CDATA[<211>  16]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  6]]>
          tcgcataaga atgact                                                       16
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          <![CDATA[<212>  DNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          tgaacacaca gtcgca                                                       16
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          ctgaacacac agtcgc                                                       16
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          <![CDATA[<400>  9]]>
          tctgaacaca cagtcg                                                       16
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          ttctgaacac acagtc                                                       16
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          <![CDATA[<400>  11]]>
          acaagtcatg ttacta                                                       16
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          acacaagtca tgttac                                                       16
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          cttacttaga tgctgc                                                       16
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          ccaacagtga ggaatt                                                       16
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          tgaattccca tatccga                                                      17
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          <![CDATA[<400>  112]]>
          agaattatga ccatat                                                       16
          <![CDATA[<210>  113]]>
          <![CDATA[<211>  17]]>
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          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
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          aggtaagaat tatgacc                                                      17
          <![CDATA[<210>  114]]>
          <![CDATA[<211>  18]]>
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          tcaggtaaga attatgac                                                     18
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          cttcttcagg taagaat                                                      17
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          caaagatcat gtaaatacac                                                   20
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          aaggcagaat acaaaga                                                      17
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          attagtgagg gacgaa                                                       16
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          acgtagaata ataaca                                                       16
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          <![CDATA[<210>  757]]>
          <![CDATA[<211>  16]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  寡核苷酸基序]]>
          <![CDATA[<400>  757]]>
          cacctttaaa acccca                                                       16
          <![CDATA[<210>  758]]>
          <![CDATA[<211>  18]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  寡核苷酸基序]]>
          <![CDATA[<400>  758]]>
          catcctttat aatcacac                                                     18
          <![CDATA[<210>  759]]>
          <![CDATA[<211>  18]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  寡核苷酸基序]]>
          <![CDATA[<400>  759]]>
          caacggtatt ttcacagg                                                     18
          <![CDATA[<210>  760]]>
          <![CDATA[<211>  18]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  寡核苷酸基序]]>
          <![CDATA[<400>  760]]>
          cagacactac aatgagga                                                     18
          <![CDATA[<210>  761]]>
          <![CDATA[<211>  18]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  寡核苷酸基序]]>
          <![CDATA[<400> ]]> 761
          catggttttt aggactgt                                                     18
          <![CDATA[<210>  762]]>
          <![CDATA[<211>  18]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  寡核苷酸基序]]>
          <![CDATA[<400>  762]]>
          cacgacaaat tctatcct                                                     18
          <![CDATA[<210>  763]]>
          <![CDATA[<211>  18]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  寡核苷酸基序]]>
          <![CDATA[<400>  763]]>
          catgatatac aatgctac                                                     18
          <![CDATA[<210>  764]]>
          <![CDATA[<211>  18]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  寡核苷酸基序]]>
          <![CDATA[<400>  764]]>
          catcgttggg taaattta                                                     18
          <![CDATA[<210>  765]]>
          <![CDATA[<211>  18]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  寡核苷酸基序]]>
          <![CDATA[<400>  765]]>
          catgctttat aaatggtg                                                     18
          <![CDATA[<210>  766]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  寡核苷酸基序]]>
          <![CDATA[<400>  766]]>
          caacaaataa tggttactct                                                   20
          <![CDATA[<210>  767]]>
          <![CDATA[<211>  18]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  寡核苷酸基序]]>
          <![CDATA[<400>  767]]>
          cacagattga tggtagtt                                                     18
          <![CDATA[<210>  768]]>
          <![CDATA[<211>  19]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  寡核苷酸基序]]>
          <![CDATA[<400>  768]]>
          cacctattta acatcagac                                                    19
          <![CDATA[<210>  769]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  寡核苷酸基序]]>
          <![CDATA[<400>  769]]>
          cactaattgt agtagtactc                                                   20
          <![CDATA[<210>  770]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>]]>  DNA
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  寡核苷酸基序]]>
          <![CDATA[<400>  770]]>
          caataaacat gaatctctcc                                                   20
          <![CDATA[<210>  771]]>
          <![CDATA[<211>  17]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  寡核苷酸基序]]>
          <![CDATA[<400>  771]]>
          tgatttaatt ctagtca                                                      17
          <![CDATA[<210>  772]]>
          <![CDATA[<211>  16]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  靶序列]]>
          <![CDATA[<400>  772]]>
          gcagtagagc caatta                                                       16
          <![CDATA[<210>  773]]>
          <![CDATA[<211>  10]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  HBV表位]]>
          <![CDATA[<400>  773]]>
          Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val 
          1               5                   10  
          <![CDATA[<210>  774]]>
          <![CDATA[<211>  15]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  HBV表位]]>
          <![CDATA[<400>  774]]>
          Gly Arg Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp 
          1               5                   10                  15  
          <![CDATA[<210>  775]]>
          <![CDATA[<211>  15]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  HBV表位]]>
          <![CDATA[<400>  775]]>
          Thr Thr Phe His Gln Thr Leu Gln Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu 
          1               5                   10                  15  
          <![CDATA[<210>  776]]>
          <![CDATA[<211>  16]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  HBV表位]]>
          <![CDATA[<400>  776]]>
          Gln Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser 
          1               5                   10                  15      
          <![CDATA[<210>  777]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  HBV表位]]>
          <![CDATA[<400>  777]]>
          Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile 
          1               5                   
          <![CDATA[<210>  778]]>
          <![CDATA[<211>  15]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  HBV表位]]>
          <![CDATA[<400>  778]]>
          Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Thr Thr Val Cys Leu Gly Gln 
          1               5                   10                  15  
          <![CDATA[<210>  779]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  HBV表位]]>
          <![CDATA[<400>  779]]>
          Phe Leu Gly Gly Thr Thr Val Cys Leu 
          1               5                   
          <![CDATA[<210>  780]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  HBV表位]]>
          <![CDATA[<400>  780]]>
          Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val 
          1               5                   
          <![CDATA[<210>  781]]>
          <![CDATA[<211>  21]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  HBV表位]]>
          <![CDATA[<400>  781]]>
          Ser Leu Leu Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr 
          1               5                   10                  15      
          Val Trp Leu Ser Val 
                      20      
          <![CDATA[<210>  782]]>
          <![CDATA[<211>  10]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  HBV表位]]>
          <![CDATA[<400>  782]]>
          Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu Ser Val 
          1               5                   10  
          <![CDATA[<210>  783]]>
          <![CDATA[<211>  10]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  HBV表位]]>
          <![CDATA[<400>  783]]>
          Ser Ile Leu Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu 
          1               5                   10  
          <![CDATA[<210>  784]]>
          <![CDATA[<211>  19]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  引子]]>
          <![CDATA[<400>  784]]>
          ctgtgccttg ggtggcttt                                                    19
          <![CDATA[<210>  785]]>
          <![CDATA[<211>  24]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213]]>>  人工]]&gt;
          <br/>
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;220&gt;]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;223&gt;  引子]]&gt;
          <br/>
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;400&gt;  785]]&gt;
          <br/><![CDATA[aaggaaagaa gtcagaaggc aaaa                                              24
          <![CDATA[<210>  786]]>
          <![CDATA[<211>  25]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  引子]]>
          <![CDATA[<400>  786]]>
          ttctttataa gggtcgatgt ccatg                                             25

Claims

一種具式GN2-C6_oc_oa_oCTAattgtagtagtaCTC之反義寡核苷酸偶聯物，其中C6代表具有6個碳之胺基烷基，大寫字母代表β-D-氧基LNA核苷，小寫字母代表DNA核苷，所有LNA C皆係5-甲基胞嘧啶，下標o代表磷酸二酯核苷鏈接，且除非另外指示，否則核苷間鏈接係硫代磷酸酯核苷間鏈接，且其中GN2代表圖3中所示之三價GalNAc簇，進一步其中圖3中之波浪線圖解說明該簇至該C6胺基烷基之偶聯位點。
如請求項1之反義寡核苷酸偶聯物，其中該寡核苷酸偶聯物為CMP ID NO：769_2。
一種反義寡核苷酸偶聯物，其係如圖7所示。
一種醫藥組合物，其包含如請求項1至3中任一項之反義寡核苷酸偶聯物及醫藥上可接受之稀釋劑、溶劑、載劑、鹽及/或佐劑。
如請求項4之醫藥組合物，其中該醫藥上可接受之稀釋劑為無菌磷酸鹽緩衝鹽水。
如請求項4或5之醫藥組合物，其中該醫藥上可接受之鹽為鈉鹽。
如請求項4或5之醫藥組合物，其中該醫藥上可接受之鹽為鉀鹽。
一種調節表現PD-L1之靶細胞中PD-L1表現之活體外方法，該方法包括向該細胞投與有效量之如請求項1至3中任一項之反義寡核苷酸偶聯物或如請求項4至7中任一項之醫藥組合物。
一種如請求項1至3中任一項之反義寡核苷酸偶聯物或如請求項4至7中任一項之醫藥組合物之用途，其用以製備用於調節PD-L1表現之醫藥品。
一種如請求項1至3中任一項之反義寡核苷酸偶聯物或如請求項4至7中任一項之醫藥組合物之用途，其用以製備用於恢復針對病毒之免疫反應之醫藥品。
如請求項10之用途，其中該病毒為HBV。
一種如請求項1至3中任一項之反義寡核苷酸偶聯物或如請求項4至7中任一項之醫藥組合物之用途，其用以製備用於恢復針對寄生蟲之免疫反應之醫藥品。
如請求項10至12中任一項之用途，其中該免疫反應之恢復係在與對照相比時肝中特異性針對一或多種HBV抗原之CD8+ T細胞增加。
一種如請求項1至3中任一項之反義寡核苷酸偶聯物或如請求項4至7 中任一項之醫藥組合物之用途，其用以製備用於治療或預防HBV感染之醫藥品。
一種如請求項1至3中任一項之反義寡核苷酸偶聯物之醫藥上可接受之鹽。
一種如請求項1至3中任一項之反義寡核苷酸偶聯物之醫藥上可接受之鈉鹽。
一種如請求項1至3中任一項之反義寡核苷酸偶聯物之醫藥上可接受之鉀鹽。