MX2008004860A - Sistemas de vector de virus de rabia y composiciones y metodos de los mismos - Google Patents

Abstract

Se proporcionan composiciones y método de virus de rabia. Se divulga la secuencia de longitud completa de la cepa Evelin Rockitnicki-Abelseth (ERA) de Virus de Rabia. Se proporciona un sistema de genética inverso para producir el virus ERA recombinante y derivados del mismo, junto con composiciones que incluyen los virus de cepa de ERA y/o derivados de ERA,ácidos nucleicos y/o proteínas. En algunos casos, las composiciones son composiciones inmunogénicasútiles para el tratamiento de pre- o pos-exposición del Virus de Rabia.

Description

SISTEMAS DE VECTOR DE VIRUS DE RABIA Y COMPOSICIONES Y MÉTODOS DE LOS MISMOS CAMPO Esta descripción se relaciona al campo de virología. Más específicamente, esta descripción se relaciona a composiciones y métodos que son útiles para la producción de composiciones inmunogénicas para proteger mamíferos de la infección por el virus de rabia . ANTECEDENTES DE LA DESCRIPCIÓN La rabia permanece como una de las enfermedades infecciosas mucho más terrible que afecta a humanos y a animales, a pesar de los avances científicos significantes en su prevención y control. La rabia se presenta como un problema distinto en diferentes partes del mundo. En las Américas, los depósitos de rabia existen en muchas especies de animales silvestres, incluyendo mapaches, zorrillos, zorros y murciélagos (Rupprecht y colaboradores , Emerg. Infect. Dis. 1(4): 107-114, 1995). Los brotes de infecciones de rabia en estos mamíferos terrestres se encuentran en áreas geográficas amplias a través de los Estados Unidos. . Por ejemplo, la rabia de mapache afecta un área de más de 1 millón de kilómetros cuadrados desde Florida a Maine. Aunque la rabia silvestre todavía existe en países desarrollados, se ha hecho progreso en el control y eliminación de la rabia silvestre utilizando inmunización oral de los animales silvestres .' No obstante, la rabia permanece como una amenaza mayor a la salud pública y persiste causando entre 50,000 y 60,000 muertes humanas cada año (World Health Organization, Abril del 2003) . Los humanos consiguen infectarse con el virus de rabia principalmente a través de mordidas de animales domésticos y silvestres rabiosos. En los países en desarrollo, los perros son responsables de aproximadamente 94% de muertes humanas por rabia. La rabia de perro todavía es epizoótica en la mayoría de los países de África, Asia y Sudamérica y en estos países los perros son responsables por la mayoría de muertes humanas a partir de la enfermedad. El control de la infección del virus de rabia en animales domésticos y silvestres, por lo tanto, no solo reduce la mortalidad en estos animales sino también reduce los riesgos de exposición humana. El virus de rabia se transmite a través de la piel rota por la mordida o rasguño de un animal infectado. La exposición al virus de rabia da por resultado su penetración de las terminaciones nerviosas no mielinizadas, periféricas, seguido por la dispersión a través del transporte axonal retrógrado, la replicación que ocurre exclusivamente en las neuronas y finalmente la llegada al sistema nervioso central (CNS) . La infección del CNS causa disfunción celular y muerte (Rupprecht & Dietzschold, Lab Invest, 57:603, 1987). Puesto que el virus de rabia se extiende directamente de célula a célula, éste evade grandemente el reconocimiento inmune (Clark & Prabhakar, Rabies, In: Olson y colaboradores, eds . , Comparative Pathology of Viral Disease. 2:165, Boca Ratón, FL, CRC Press, 1985) . El virus de rabia (RV) es un rabdovirus - un virus de RNA no segmentado con polaridad de sentido negativo. Dentro de la familia Rhabdoviridae , el virus de rabia es el prototipo del género Lyssavirus . El RV se compone de dos componentes estructurales mayores: una nucleocápsida o ribonucleoproteina (RNP) y una envoltura en la forma de una membrana bicapa que circunda el núcleo de la RNP. El componente infeccioso de todos los rabdovirus es el núcleo de la RNP, el cual consiste del genoma de RNA de hebra negativa encapsidado por la nucleoproteina (N) en combinación con la RNA-polimerasa (L) dependiente de RNA y la fosfoproteina (P) . La membrana que circunda la RNP contiene dos proteínas: la glicoproteína de transmembrana (G) y la proteína de matriz (M) , localizada en el sitio interior de la membrana. Así, el genoma viral codifica para estas cinco proteínas: las tres proteínas en la RNP (N, L y P) , la proteína de matriz (M) y la glicoproteína (G) . Los determinantes moleculares de la patogenicidad de varias cepas de virus de rabia no han sido completamente elucidados. La patogenicidad de RV se atribuyó a eventos multigénicos (Yamada y colaboradores, Microbiol . Immunol. 50:25-32, 2006). Por ejemplo, algunos posiciones en el genoma de RV si es mutado, afecta la trascripción o replicación viral, reduciendo la virulencia. Las mutaciones en el residuo de serina 389 del sitio de fosforilación en el gen N (Wu y colaboradores, J. Virol. 76:4153- 161, 2002) o la secuencia del núcleo de GDN de la porción C altamente conservada en el gen L (Schnell y Conzelmann, Virol. 214:522-530, 1995) redujeron notablemente la transcripción y replicación de RV. La proteina G, también referida como proteina de espiga, está involucrada en la unión celular y la fusión de membrana de RV. La región de aminoácidos en la posición 330 a 340 (referida como sitio antigénico III) de la proteina G se ha identificado como importante para la virulencia de ciertas cepas de RV. Varios estudios soportan el concepto de que la patogenicidad de las cepas de RV fijas se determina por la presencia de arginina o lisina en el residuo de aminoácido 333 de la glicoproteina (Dietzschold y colaboradores, Proc. Nati. Acad. ScL USA 80: 70-74, 1983; Tuffereau y colaboradores, Virol. 172: 206-212, 1989). Este fenómeno parece que aplica por lo menos a los virus de rabia fijos tales como CVS, ERA, PV, SAD-B 19 y las cepas HEP-Flury (Anilionis y colaboradores, Wature 294:275- 278, 1981; Morimoto y colaboradores, Virol. 173:465-477, 1989) . Por ejemplo, se describen los virus de la vacuna para la rabia que poseen un aminoácido que difiere de Arg en la posición 333 de la glicoproteina , por ejemplo, en el documento WO 00/32755 (que describe los mutantes de RV en los cuales todos los tres nucleótidos en el codón Arg333 en la proteina G ( se alteran comparados al virus de origen, tal que la Arg en la posición 333 se sustituye con otro aminoácido) ; patente europea 350398 (que describe un mutante SAG1 de RV avirulento derivado de la cepa Bern SAD de RV, en la cual la Arg en la posición 333 de la glicoproteina se ha sustituido a Ser) ; y la solicitud de patente Europea 583998 (que describe un mutante de RV atenuado, SAG2, en el cual la Arg en la posición 333 en la proteina G se ha sustituido por Glu) . Otras cepas, tal como la cepa RC-HL, poseen un residuo de arginina en la posición 333 de la G, pero no causan infección letal en ratones adultos (Ito y colaboradores, Microl. Immunol. 38:479-482, 1994; Ito y colaboradores, J. Virol. 75:9121-9128, 2001). Como tal, la G completa puede contribuir a la virulencia de RV, aunque los factores determinantes o regiones no se han identificado previamente. El gen G codifica la única proteina que induce anticuerpo neutralizante viral. Por lo menos son conocidos tres estados de la glicoproteina del RV: el estado nativo (N) que es responsable por el enlace del receptor; un estado hidrofóbico activo (A) necesario en la etapa inicial en el proceso de fusión de la membrana (Gaudin, J, Cell Biol. 150:601-612, 2000) y una conformación inactiva de fusión (I). El pliegue y maduración correctos de la G desempeñan funciones importantes para el reconocimiento inmune. Las tres posiciones glicosiladas potenciales en el dominio extracelular ERA G ocurre en los residuos Asn37, Asn2" y Asn319 (Wojczyk y colaboradores, Glycobiology. 8: 121-130, 1998), respectivamente. La no glicosilación de G no solo afecta la conformación, sino también inhibe la presentación de la proteina en la superficie celular. Asi, la elucidación de los determinantes moleculares que implican la patogenicidad del virus de rabia presenta un problema complejo. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La secuencia completa de la cepa de virus que corresponde a la vacuna fija de Evelyn-Rokitnicki-Abelseth (ERA) para el virus de rabia se divulga en la presente, junto con métodos para secuenciar esta y otras cepas de lyssavirus. También se describe un sistema genético inverso para el virus de rabia, en particular que utiliza la cepa ERA del virus de rabia como un ejemplar. El uso de una T7 RNA polimerasa, que contiene una señal de localización nuclear de ocho aminoácidos (NLS) en el extremo terminal N facilitó la recuperación del virus. Además de la cepa de virus ERA parental, se describen varios de otros virus derivados, que incluyen ERA- (supresión de la región psi), ERAgreenl (gen de proteina fluorescente verde insertada en la región psi) , ERAgreen2 (gen de proteina fluorescente verde insertado en la región intergénica de la fosfoproteina y la proteina de matriz) , ERA2g (que contiene una copia extra de la glicoproteina en la región psi) , ERAg3 (con una mutación en el aminoácido 333 en la glicoproteina), ERA2g3 (con una copia extra de la glicoproteina alterada en el aminoácido 333 en la región psi), ERA-G (a partir de la cual la glicoproteina se ha suprimido) ERAgm (los genes M y G cambiados en el genoma) y ERAgmg (dos copias de G en la construcción ERAgm rearreglada) . La unidad de transcripción extra se incorporó en el genoma del virus ERA para la expresión eficiente de las Estructuras de Lectura Abiertas (ORFs) . Al optimizar las condiciones de propagación, que se describen en la presente, los virus rescatados alcanzan títulos arriba de 109 ffu/ml en ya sea biorreactores o matraces de tejido estacionarios. También se divulga una línea celular modificada que expresa constitutivamente la glicoproteina ERA. La línea celular, BSR-G, es útil para la producción del virus de rabia recombinante , que incluye atenuado y/o deficiente de replicación. Lo anterior y otros objetivos, características y ventajas de la invención llegarán a ser más evidentes de la siguiente descripción detallada. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS FIG. 1A. Ilustración esquemática del plásmido de transcripción de ERA. Las posiciones de las ribozimas de cabeza de martillo y el genoma ERA antigenómico se indican gráficamente. Las posiciones relativas de las proteínas N, P, G y L se muestran en una dirección 5' a 3' . FIG. IB. Diagrama esquemático de la construcción del plásmido pTMF del cDNA genómico del virus de rabia ERA de longitud completa. Fragmentos Fl, F2 de los productos de RT-PCR, y los sitios de reconocimiento de enzima de restricción (Nhel, Kpnl, Blpl, Pstl y Notl) (no dibujado a escala) . La barra en la izquierda indica una ribozima de cabeza de martillo-RdRz y la barra derecha indica la ribozima del virus delta de hepatit is-HDVRz . El símbolo ? indica que los sitios Kpnl o Psta se suprimieron y la flecha vertical -i indica que los sitios Nhel o Notl se dejaron intactos. FIG. 2. Ilustración esquemática del mecanismo propuesto de la acción de autogen de la NLST7 RNA polimerasa por los plásmidos pNLST7. El complejo de reactivo de transfección de DNA se toma en las células por endocitosis. La mayoría del DNA liberado de los lisosomas y endosomas se retiene en el citoplasma celular. Una cantidad limitada de plásmidos se transfiere al núcleo: 1) a través de un promotor temprano inmediato CMV, el gen NLST7 se transcribe por la RNA polimerasa II celular; 2) el NLST7 mRNA maduro se transporta desde el núcleo al citoplasma para la síntesis de la NLST7 RNA polimerasa; 3) La NLST7 RNA polimerasa recientemente sintetizada se translocaliza al núcleo, mientras que una pequeñísima cantidad de NLST7 permanece en el citoplasma; 4) la NLST7 RNA polimerasa inicia la transcripción a través de un promotor pT7. Mediante las modificaciones postranscripcionales, el NLST7 mRNA adicional se produce para la síntesis de proteínas, incrementando de esta manera la eficiencia de recuperación del virus. FIG. 3. Diagrama esquemático de los diez genomas del virus de ERA derivados. El tamaño de cada gen no se dibuja a escala. El símbolo "*" indica mutaciones de G en el residuo Aa333 y ? es la región Psi. FIG. 4A. Análisis del virus ERA-G recuperado en las células transíectadas , extendido y desarrollado en una línea celular BHK-G. En A, los focos virales ERA-G se restringieron aun después de siete días de postransfección con plásmidos para la recuperación del virus. En B, el virus ERA-G rescatado no se extendió después del pasaje en las células BSR normales. Solo las células individuales se mancharon por DFA. En C,. el virus ERA-G se desarrolló bien en la línea celular BHK-G constitutiva. FIG. 4B. Análisis de la expresión G en una linea celular BHK-G. Mediante el manchado fluorescente indirecto, el virus de rabia ERA G se expresó en el citoplasma en una línea celular estable BHK-G. FIG. 4C. Análisis de mRNA de. G en células infectadas con el virus ERA-G por el manchado de Northern con una sonda G. La franja 2 muestra que el mRNA del gen G se detectó en las células BHK-G infectadas con el virus ERA-G, mientras que el RNA genómico de virus no lo hizo. La franja 1 fue el control del RNA total de las células BHK-G infectadas con el virus de rabia ERA, en las cuales se detectaron tanto el mRNA de G como el RNA genómico viral. FIG. 5. Curva de crecimiento del virus de una etapa. Todas las cepas ERA del virus de rabia recuperadas se desarrollaron a 109 o 1010 ffu/ml, pero el ERA-G solo alcanzó 107 ffu/ml. FIG. 6. Focos verdes en las células BSR infectadas con el virus de rabia ERAgreenl/ERAgreen2. Trans 1 es la unidad transcripcional incorporada en las regiones intergénicas Psi y L. Trans 2 es la unidad transcripcional en la región intergénica P y M. Tanto ERAgreen2 y ERAgreenl expresaron la proteina GFP establemente en las células BSR infectadas con el virus, mientras que la ocurrencia de los focos verdes de ERAgreen2 fue de 48 horas más temprano después de la infección del virus que en ERAgreenl. FIG. 7. Análisis de la expresión del mRNA de G en los virus de rabia ERA rearreglados con G y G, M dobles. En el manchado de Northern con una sonda G, la medición mediante la fotometría de densidad del mRNA de G en ERA2g (franja 1), ERAgm (franja 3) y ERA2g3 (franja 4) representó los niveles de mRNA aumentados, comparado con las células infectadas con el virus (franja 2) . Las relaciones se calcularon mediante el uso del virus ERA como 100%. FIG. 8A. Morbidez inducida mediante inoculación in vivo con el ERA recombinante y derivados. Ratones de tres semanas de edad se inocularon intramuscularmente con los ocho virus recuperados. A 10 días de pos-inoculación, en los grupos ERA, ERA- y ERAgreenl, 50%, 50% y 20% de los ratones mostraron signos clínicos compatibles de rabia, pero no mortalidad, respectivamente. Ningunos signos adversos se observaron en los otros grupos. FIG. 8B . Supervivencia de Pos-estimulación en ratones inoculados con ERA recombinante y derivados. Ratones supervivientes de las pruebas mostradas en la FIG. 8A se estimularon intramuscularmente con un virus de rabia de perro/coyote de Texas. En 5 días de pos-estimulación, en los grupos ERA y ERA-, 40 y 62% de los ratones mostraron signos de rabia y se eutanizaron, respectivamente. En todos los otros grupos, no se observaron signos de rabia. FIG. 8C . Supervivencia después de la inoculación i.c. con virus de ERA recombinante y ERAg3. Se inocularon ratones de tres semanas de edad intracerebralmente con cepas de virus ERA y ERAg3, respectivamente. Todos los ratones sucumbieron 15 días de pos-inoculación en el grupo ERA, mientras que en el grupo ERAg3, todos los ratones sobrevivieron sin signos clínicos. FIG. 8D . Supervivencia después de la inoculación i.c. de los ratones lactantes. Ratones lactantes de dos días de nacidos se inocularon intracerebralmente con las construcciones del virus de ERAg3 y ERA-G, respectivamente. Todos los ratones sucumbieron en el grupo ERAg3, mientras que ninguno de los ratones murió en el grupo ERA-G. FIG. 8E . Titulo de anticuerpo neutralizante en ratones inoculados con virus de ERA recombinante y derivados . Los títulos de anticuerpo de neutralización de ratón se determinaron por el RFFIT, que varía de 1.36 a 5.61 IU por mi entre los grupos inoculados con el virus. FIG. 9A. Supervivencia después de la infección con el virus de Rabia de Murciélago de Alabama. Hámsters se inocularon con virus de Rabia de Murciélago de Alabama vivo, luego se trataron de pos-exposición con ya sea el virus ERAg3 o con globulina inmune de rabia y la vacuna RV inactivada comercialmente disponible. La supervivencia se estimó durante un período de más de tres meses. FIG. 9B . Supervivencia después de la infección con el virus de Rabia de Perro callejero de Tailandia. Hámsters se inocularon con Virus de Rabia de Murciélago de Alabama vivo, luego se trataron de pos-exposición con ya sea virus de ERAg3 o con globulina inmune de la rabia y la vacuna RV inactivada comercialmente disponible. La supervivencia se estimó durante un período de más de tres meses. FIG. 9C . Supervivencia después de la infección con el virus de Rabia de Perro Coyote de Texas. Hámsters se inocularon con virus de Rabia de Murciélago de Alabama vivo, luego se trataron de pos-exposición con ya sea virus de ERAg3 o con globulina inmune de la rabia y la vacuna RV inactivada comercialmente disponible. La supervivencia se estimó durante un período de más de tres meses. LISTADO DE SECUENCIAS Las secuencias de ácido nucleico y aminoácidos listadas en el listado de secuencias acompañante se muestran utilizando abreviaciones de letra estándares para las bases de nucleótidos, y código de tres letras para los aminoácidos, como es definido en 37 C.F.R. 1.822. Solo una hebra de cada secuencia de ácido nucleico es mostrada, pero la hebra complementaria se entiende como incluida por cualquier referencia a la hebra mostrada a menos que el contexto haga claro que solo una hebra se propone. Como es apropiado, será entendido que una secuencia presentada como DNA se puede convertir a RNA al reemplazar los residuos de tiamina con uracilos . SEQ ID NO: 1. Virus del tipo silvestre ERA CDC, 11,931 nucleótidos 1-58 nucleótidos, Región guía 71-1420 nucleótidos, gen N 1514-2404 nucleótidos, gen P 2496-3101 nucleótidos, gen M 3317-4888 nucleótidos, gen G 4964-5362 nucleótidos, región Psi 5417-11797 nucleótidos, gen L 11862- 11931 nucleótidos, región de cola SEQ ID NO: 2. ERACDC: 71 a 1420:450 aa, proteina N. SEQ ID NO: 3. ERACDC: 1514 a 2404: 297 aa, proteina P. SEQ ID NO: 4. ERACDC: 2496 a 3101 :202 aa, proteina M. SEQ ID NO: 5. ERACDC: 3317 a 4888:524 aa, proteina G. SEQ ID NO: 6. ERACDC: 5417 a 11797:2127 aa, proteina L. SEQ ID NO: 7. ERA recombinante (rERA) recuperado mediante el sistema genético inverso es 11,930 nucleótidos. El tracto poli (Ag) especifico entre el gen G y la región psi en la cepa de ERA de tipo silvestre se mutó a un tracto poli(A7) en el sistema genético inverso de ERA recombinante como un marcado de secuencia. En vista de esto, el rERA es un nucleótido más corto que el ERA de tipo silvestre. La mayor parte de la otra información de secuencia es exactamente la misma . SEQ ID NO: 8. al cepa ERAg3 (11,930 nucleótidos), aminoácido en la proteina G (333Aa) ha sido alterada; los ácidos nucleicos correspondientes están en las posiciones 4370 a 4372. SEQ ID NO: 9. El ERA- (11, 577 nucleótidos ) , sin la región psi (pseudo-gen) ; una unidad de transcripción extra se ha introducido en las posiciones de nucleótido 4950 a 5008. SEQ ID NO: 10. El ERA-2G (13,150 nucleótidos ) , esta cepa tiene dos copiad del gen G; la segunda copia se inserta se las posiciones 4988 a 6559. SEQ ID NO: 11. El ERAgreen (12,266 nucleótidos )', esta cepa contiene la secuencia de codificación para el GFP en las posiciones 4993 a 5673; se presenta verde bajo luz UV después de la infección de las células o el tejido. SEQ ID NO: 12. El ERA-G (10,288 nucleót idos ) , esta cepa no tiene el gen G. SEQ ID NO: 13. El ERA-2g3 (13,150 nucleótidos); esta cepa tiene dos copias del gen G (la segunda de las cuales está en las posiciones 4988 a 6559), ambas de las cuales se sustituyen en el aminoácido 333 (que corresponde a las posiciones de nucleótidos 4370-4372 y 6041-6043 en la secuencia mostrada) . SEQ ID NO: 14. El ERA-pt (11, 976 nucleótidos, con una unidad de transcripción extra después del gen P, en las posiciones 2469 a 2521). SEQ ID NO: 15. El ERA-pt-GFP (12,662 nucleótidos, con el gen GFP insertado después del gen P en 2505 a 3185) . SEQ ID NO: 16. El ERAgm (11,914 nucleótidos) las posiciones de los genes G y M se cambian en las posiciones y G en las posiciones 2505-4076 y M en las posiciones 4122-4727, respectivamente. SEQ ID NO: 17. El ERAg3m (11,914 nucleótidos) Las posiciones de los genes G y M se cambian con G en las posiciones 2505-4076 y M en las posiciones 4122-4727, respectivamente. El gen G se muta a la posición de aminoácido 333. SEQ ID NO: 18. El ERAgmg (13,556 nucleótidos), esta cepa tiene dos copias del gen G en las posiciones 2505-4076 y 4943-6514, flanqueando el gen en las posiciones 4122-4727. SEQ ID NO: 19. Los primeros diez nucleótidos de la ribozima de cabeza de martillo que corresponde al extremo 5' del genoma de ERA del virus de rabia. SEQ ID NO: 20. La secuencia de nucleótidos que codifica la señal de localización nuclear del antigeno SV40 T (NLS) . SEQ ID NOs : 21-23. Secuencias Kozak artificiales. SEQ ID NOs: 24-57. Oligonucleótidos sintéticos. SEQ ID NO: 58. Secuencia de aminoácido de la proteina G mutada en la posición de aminoácido 333 (de Arg a Glu) . SEQ ID NOs: 59-65. Oligonucleótidos sintéticos.

DESCRIPCIÓN DETALLADA (I) Introducción Las zoonosis virales son difíciles de prevenir. Un paradigma mayor es el control de la rabia silvestre mediante la vacunación oral. Todas las vacunas de rabia orales autorizadas actuales están basadas sobre una fuente común. El virus de rabia fijo (RV) de Evelyn-Rokitnicki-Abelseth (ERA) se derivó de la cepa Street- Alabama-Dufferin (SAD), primero se aisló de un perro rabioso en Alabama (USA) en 1935. La cepa de ERA se derivó después de múltiples pasajes de SAD RV en cerebros de ratón, células de riñon de hámster bebé (BHK) checa, y embriones de pollo. La clonación repetida de ERA en las células BHK resultó eventualmente en un clon B-19, que se nombro SAD-B 19 para los estudios de vacunas. La primera cepa de ' RV recuperada mediante genética inversa fue SAD-B 19. Auque las SAD-B 19 y ERA RV se la llevaron de la misma fuente, diferentes resultado se han observado en varios estudios de vacuna orales animales. Por ejemplo, la ERA no indujo anticuerpos neutralizante obvios en ya sea zorrillos o mapaches per os, mientras que las SAD-B 19 si. Para enlucir las diferencias potenciales entre estas dos cepas de RV, se requiere un sistema de genética inverso para la cepa de ERA RV. La genética inversa presenta una manera factible para modificar los virus de RNA en maneras definidas. Un sistema para la genética inversa de una cepa inicial del virus de rabia se estableció exitosamente en un 1994 (Schnell y colaboradores, The EMBO J. 13, 4195-4203, 1994) . En la década de intervención, las mejoras al sistema se habían hecho, dando por resultado la eficiencia incrementada de la recuperación del virus. Esta eficiencia incrementada ha facilitado la elución patogenicidad del virus, interacciones de proteína-proteína, y proteína-RNA . Dentro del genoma del virus de rabia, se ha propuesto que algunas regiones contengan señales importantes, tales como regiones promotoras distales virales, encapsidación, de nucleoproteína , sitio de iniciación de transcripción de la RNA polimerasa L dependiente de RNA, sitio de poliadenilación y terminación. Estas señales son importantes para asegurar la recuperación eficiente del virus y para designar una unidad de transcripción extra para aceptar una Estructura de Lectura Abierta exógena (ORF) en el genoma del virus de rabia. La descripción proporciona un sistema de genética inverso eficiente, y describe su uso para producir variantes del virus de la cepa ERA. Las modificaciones descritas en la presente han dado por resultado cepas que son candidatos adecuados para aceptar la expresión ORF y el desarrollo de la vacuna . El sistema de genética inverso se compone de un conjunto de plásmidos . Un primer plásmido incluye un cRNA viral de ERA. A fin de crear extremos antigenómico virales auténticos .que excede cDNA viral transcripto, el cDNA genómico de ERA es flanqueado por una ribozima de cabeza de martillo en un extremo 3' y una ribozima del virus delta de hepatitis en el extremo 5' . El cásete antigenómico se fusiona a la señal de iniciación de transcripción del fago T7 de bacterias, que esta opcionalmente bajo también el control del promotor temprano inmediato de citomegalovirus (CMV) . El sistema también incluye una pluralidad de plásmidos ayudante que codifican las proteínas involucradas en la encapsidación viral. Por ejemplo, el sistema incluye típicamente plásmidos auxiliares que codifican la nucleoproteína viral (N) , fosfoproteína (P), polimerasa dependiente de RNA (L) , y opcionalmente la glicoproteína (G) . Los sistemas también incluye un plásmido que codifica la RNA polimerasa del fago T7 (T7), que se puede modificar mediante la adición de una señal de localización nuclear (NLS) para incrementar la expresión de la creciente polimerasa en el núcleo de las células transíectadas . El plásmido de expresión de T7 RNA de polimerasa se construye como un "autogen", que transcribe de longitud completa de cRNA anti genómico viral para la encapsidación de la nucleoproteína después de la transfección en las células. El sistema de genética inverso es útil en el diseño y producción de las composiciones inmunogénicas para el tratamiento (pre y/o post exposición) del virus de rabia, y para producir vectores de ERA del virus de rabia para expresar las Estructuras de Lectura Abiertas exógenas (ORFs). Por ejemplo, una unidad de transcripción extra se puede diseñar, probar e incorporar en el genoma de ERA en ya sea la región Psi y/o en la región intergénica de fosfoproteina (P)-proteina matriz (M) . Esencialmente cualquier ORF de interés se puede expresar en un contexto al vector de ERA, incluyendo ORFs que codifican antigenos de virus y otros patógenos, tales como anfigenos de otros lyssavirus, asi, para expresar otras proteínas de interés terapéutico. Así, los métodos y composiciones divulgados en la presente son útiles para el diseño y producción de composiciones inmunogénica de virus de rabia, incluyendo composiciones adecuadas como vacunas para el tratamiento pre y/o post exposición del virus de rabia. II. Abreviaciones ADE aumento dependiente de anticuerpo Ag-ELISA ELISA de captura de antígeno DNA ácido desoxirribonucleico ERA Cepa Evelyn-Rokitnicki-Abelseth del virus de rabia ELISA ensayo inmunoabsorbente enlazado con | enzima G glicoproteína i.c. intracerebral IFA ensayo de inmuno fluorescencia indirecto i.m. intramuscular L RNA-polimerasa dependiente de RNA M proteína de matriz mAb anticuerpo monoclonal N nucleoproteina ORF estructura abierta P fosfoproteina PCR reacción en cadena de la polimerasa RACE amplificación rápida de 5' de los extremos de cDNA RNA ácido ribonucleico RNP ribonucleoproteína RT-PCR transcripción inversa-reacción en cadena de la polimerasa RV virus de rabia trans 1 unidades de transcripción extra 1 t-rans 2 unidad de transcripción extra 2 III. Términos A menos que se explique de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tiene el mismo significado como es entendido comúnmente por uno de habilidad ordinaria en la técnica a lo cual esta invención pertenece. Similarmente , amenos que de otra manera se note, los términos técnicos se utilizan de acuerdo al uso convencional. Definiciones de términos comunes en la biología molecular se pueden encontrar en Benjamín Lewin, Genes V, publicada por Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew y colaboradores, (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, publicada por Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); y Robert ?. Meyers (ed.), Molecular Biology y Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publicada por VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8) . Los términos singulares ' "un", "una", y "el" incluyen referencias plurales a menos que el contexto lo indique claramente de otra manera. Similarmente, la palabra "o" se propone para incluir "y" a menos que el contexto lo indique claramente de otra manera. Por consiguiente "que comprende A o B" significa que incluye A, o B, o A y B. va ser entendido además que todos los tamaños base o tamaños de aminoácido, y todos los valores de peso molecular o masa molecular, lados para los ácidos nucleicos o polipéptidos son aproximados, y se proporcionan para descripción. A fin de facilitar la revisión de las diversas modalidades de la invención, se proporcionan las siguientes explicaciones de los términos específicos: Adyuvante: Una sustancia que no aumenta específicamente la respuesta inmune a un antígeno. El desarrollo de adyuvantes de vacuna para el uso en humanos se revisa en Singh y colaboradores. (Nat. Biotechnol. 17:1075-1081, 1999), que divulga que, en el tiempo de su aplicación, las sales de aluminio y la microemulsión MF59 son solo los adyuvantes aprobados para el uso humano. Amplificación: Amplificación de una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, una molécula de DNA o RNA) se refiere al uso de una técnica de laboratorio que incrementa el número de copias de una molécula de ácido nucleico en una muestra. Un ejemplo de amplificación es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), en la cual una muestra se pone en contacto con un par de cebadores de oligonucleótidos bajo condiciones que permiten la hibridación de los cebadores a una plantilla de ácido nucleico en la muestra. Los cebadores se extienden bajo condiciones adecuadas, se disocian de la plantilla, se recosen, se extienden, y se disocian para amplificar el número de copias del ácido nucleico. El producto de amplificación se puede caracterizar mediante las técnicas como elect oforesis , patrones de escisión de endonucleasa de restricción, hibridación o ligación de oligonucleótidos y/o secuenciación de ácido nucleico. Otros ejemplos de métodos de amplificación incluyen amplificación y desplazamiento de hebra, o se divulga en la patente norteamericana No. 5,744,311; amplificación isotérmica libre de transcripción, como se divulga en la patente norteamericana No. 6,033,881; amplificación de reacción en cadena de reparación, como se divulga en el documento WO 90/01069; amplificación de reacción en cadena de ligasa, como se divulga en el documento EP-A-320 , 308 ; amplificación de reacción en cadena de ligasa de relleno de espacio, como se divulga en la patente norteamericana No. 5,427,930; y amplificación libre de transcripción de RNA NASBAMR, como se divulga en la patente norteamericana No. 6,025,134. Un método de amplificación se puede modificar, incluyendo por ejemplo mediante etapas adicionales o acoplamiento de la amplificación con otro protocolo. Animal: Organismos vertebrados multi celulares vivientes, una categoría que incluye, por ejemplo, mamíferos y pájaros. El término mamífero incluye mamíferos tanto humanos como no humanos. Similarmente , el térmico "sujetos" incluye sujetos tanto humanos como veterinarios, por ejemplo, humanos, primates no humanos, perros, gatos, caballos, y vacas . Anticuerpo: Una proteína (o complejo de proteína) incluye uno o más polipéptidos sustancialmente codificados por los genes de inmunoglobulina o fragmentos de genes de inmunoglobulina . Los genes de inmunoglobulina reconocidos incluyen los genes de región constante capa, lambda, alfa, gama, delta, epsilón, y mu, así como miles de genes de región variable de inmunoglobulina . Las cadenas ligeras se clasifican como ya sea capa o lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como gama, mu, alfa, delta, o epsilón, a su ves definen las clases de inmunoglobulina, IgG, IgM, IgA, IgD y IgE, respectivamente. La unidad estructural de inmunoglobulina básica (anticuerpo) es generalmente un tetrámero. Cada tetrámero esta compuesto de dos pares idénticos, de cadenas de p'olipéptido, cada par tiene una cadena "ligera" (aproximadamente 25 kDa) y una "pesada" (aproximadamente 50-70 kDa) . La terminal N de cada cadena define una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos principalmente responsables para el reconocimiento del antigeno. Los términos "cadena, ligera variable" (VL) y "cadena pesada variable" (VH) se refieren, respectivamente, a estas cadenas ligeras y pesadas. Como se utiliza en la presente, el término "anticuerpo" incluye inmunoglobulinas intactas asi como un número de fragmentos bien caracterizados. Por ejemplo, los Fabs, Fvs, y los Fvs de cadena individual (SCFvs) que enlazan a la proteina objetivo (o epitope dentro de una proteina o proteina de fusión) también serian agentes de enlace específicos para esa proteína (o epitope) . Estos fragmentos de anticuerpo son como sigue: (1) Fab, el fragmento que contiene un fragmento de enlace de antígeno monovalente de una molécula de anticuerpo producida mediante al digestión del anticuerpo entero con la enzima papaina para producir una cadena ligera intacta en una porción de una cadena pesada; (2) Fab', el fragmento de una molécula de anticuerpo obtenida al tratar el anticuerpo completo con pepsina, seguido por la reducción, para producir una cadena ligera intacta y una porción de la cadena pesada; los fragmentos de Fab' se obtienen por molécula de anticuerpo; (3) (Fab' ) 2/ el fragmento del anticuerpo obtenido al tratar el anticuerpo completo con la enzima pepsina sin reducción subsecuente (4) F(ab' ) 2, un dimero de dos fragmentos de Fab' mantenidos conjuntamente por dos enlaces de disulfuro; (5) Fv, un fragmento genéticamente diseñado que contienen la región variable de la cadena ligera y la región variable de la cadena pesada expresada como dos cadenas; y (6) anticuerpo de cadena individual, una molécula genéticamente diseñada que contiene la región variable de la cadena ligera, la región variable de la cadena pesada, enlazada por un enlazador de polipéptido adecuado como una molécula de cadena individual genéticamente fusionada. Los métodos para hacer estos fragmentos son de rutina (ver, por ejemplo, Harlow y Lañe, Using Antibodies: A Laboratory Manual, CSHL, New York, 1999). Los anticuerpos para el uso en los métodos y composiciones de esta descripción pueden ser monoclonales o policlonales . Meramente a manera de ejemplo, los anticuerpos monoclonales se pueden preparar de hibridomas de murino de acuerdo al método clásico de Kohler y Milstein {Nature 256:495-97, 1975) o métodos derivados de los mismos. Procedimientos detallados para la producción de anticuerpos monoclonal se describen en Harlow y Lañe, Using Antibodies: A Laboratory Manual, CSHL, New York, 1999. Afinidad de enlace de anticuerpo: La resistencia de enlace entre un sitio de enlace de anticuerpo individual y un ligando (por ejemplo, un antigeno o epitope) . En la afinidad de un sitio de enlace de anticuerpo o X para un ligando Y se representa por la constante de disociación (Kd), que es la concentración Y que es requerida para ocupar la mitad de los sitios de enlace de X presentes en una solución. Una (Kd) más pequeña indica una interacción de afinidad más fuerte o más alta entre X e Y y una concentración más baja de ligando es necesaria para ocupar los sitios. En general, la afinidad de enlace de anticuerpo se puede afectar por la alteración o modificación y/o la substitución de uno o más aminoácidos en el epitope reconocido por el parátopo de anticuerpo. En un ejemplo, la afinidad de enlace de anticuerpos se mide por la titulación de punto de extremo en un ensayo de Ag-ELISA. La afinidad de enlace de anticuerpo se disminuye sustancialmente (o se reduce mediblemente ) por la modificación y/o substitución de uno o más aminoácidos en el epitope reconocido por el parátopo de anticuerpo si el titulo de punto de extremo de un anticuerpo especifico para el epítope modificado/sustituido difiere mediante por lo menos 4 veces, tal por lo menos 10 veces, por lo menos 100 veces o más grande, como es comparado al epítope no alterado. Antigeno: Un compuesto, composición, o sustancia que puede estimular la producción de anticuerpos o una respuesta de célula T en un animal, que incluyen composiciones que se inyectan o se absorben en un animal. En un antígeno reacciona con los productos de inmunidad humoral o celular específica, que incluyen aquellos inducidos por los inmunógenos heterólogos. En una modalidad, un antígeno es un antígeno de virus. Atenuado: En el contexto de de un virus vivo, tal como un virus de rabia, el virus es atenuado y su habilidad para infecta una célula o sujeto y/o su habilidad para producir enfermedad que reduce (por ejemplo, eliminada). Típicamente, un virus atenuado retiene por lo menos algo de su capacidad para inducir una respuesta inmune después de la administración a un sujeto inmunocompetente . En algunos casos, un virus atenuado es capaz de inducir una respuesta inmune protectora sin causar ningunos signos o síntomas de infección . Enlace o Enlace Estable: Un enlace de oligonucleótido o enlace estable a un ácido nucleico objetivo sin una cantidad suficiente del oligonucleótido forma pares base o se híbrida a su ácido nucleico objetivo, permite la detección de ese enlace. El enlace se puede detectar mediante ¦ propiedades ya sea físicas o funcionales del complejo de objetivo: oligonucleótido . El enlace entre un objetivo y un oligonucleótido se puede detectar mediante cualquier procedimiento conocido por uno de habilidad en la técnica, incluyendo ensayos de enlace funcionales o físicos. El enlace se puede detectar funcionalmente al determinar si el enlace tiene un efecto observable en un proceso biosintético tal como la expresión de un gen, replicación de DNA, transcripción, traducción y los similares. Métodos físicos para detectar el enlace de hebras completarías de DNA o RNA son bien conocidos en la técnica, e incluyen tales métodos como DNase I o huella química, ensayos de cambio de gen y decisión de afinidad, manchado de Northern, manchado del sur, manchado de puntos y procedimiento de detección de absorción de luz. Por ejemplo, un método que se utiliza ampliamente, debido a que están simple y confiable, involucra observar un cambio en la absorción de luz de una solución que contiene un oligonucleótido (o un análogo) y un ácido nucleico objetivo de 220 a 300 nm conforme la temperatura se incrementa lentamente. Si el oligonucleótido o análogo a enlazado a su objetivo, existe un incremento sorpresivo en la absorción en una temperatura característica conforme el oligonucleótido (o análogo) y el objetivo se desasocian o se funden.

El enlace entre un oligómero y su ácido nucleico objetivo se caracteriza frecuentemente por la temperatura (Tm) en la cual 50% de oligómero se funde de su objetivo. Una Tm más alta significa un complejo más fuerte o más estable relativo a un complejo con una Tra más baja. cDNA (DNA complementario) : Una pieza de DNA que carece de segmentos no de codificación, internos (intrones) y secuencias reguladoras que determinan la transcripción. El cDNA se sintetiza en el laboratorio mediante transcripción inversa del RNA mensajero extraído de las células. Electroforesis : La electroforesis se refiere a la migración de solutos o partículas cargadas en un medio líquido bajo la influencia de un campo eléctrico. Las separaciones electroforéticas se utilizan ampliamente para análisis de macromoléculas . La importancia particular en la identificación de proteínas y secuencias de ácido nucleico. Tales separaciones se pueden basar sobre diferencias en tamaño y/o carga. Las secuencias de nucleótidos tienen una carga uniforme y por lo tanto se separa basado sobre las diferencias en tamaño. La electroforesis se puede realizar en un medio líquido no soportado (por ejemplo, electroforesis capilar), pero más comúnmente el medio líquido viaja a través de un medio de soporte sólido. Los promedios de soporte mucho más ampliamente utilizados son genes, por ejemplo, geles de poliacrilamida y agarosa.

Los geles de cribado (por ejemplo, agarosa) impiden el flujo de moléculas. El tamaño de poro del gel determina el tamaño de una molécula que puede fluir libremente a través de gel. La cantidad de tiempo para viajar a través del gel se incrementa conforme el tamaño de la molécula se incrementa. Como resultado, las moléculas pequeñas viajan a través del gel más rápidamente que las moléculas grandes y asi progresan adicionalmente del área de aplicación en la muestra que las moléculas más grandes, en un periodo de tiempo dado. Tales geles se utilizan para la separaciones basadas en tamaño de la secuencias de nucleótido. Los fragmentos del DNA lineal migran a través de los geles de agarosa con una movilidad que es inversamente proporcional al logi0 de su peso . molecular . Al utilizar geles con concent ación diferentes de agarosa, los tamaños diferentes de fragmentos de DNA se pueden resolver. Las concentraciones más altas de agarosa facilitan la separación de los DNAs pequeños, mientras que las concentraciones de agarosa bajas permiten la resolución de DNAs más grandes. Epitope: Un determinante antigénico. Estos grupos químicos particulares, tal como secuencias de péptidos contiguas o no contiguas, o una molécula que es antigénica, esto es, que induce una respuesta inmune especifica. Un anticuerpo enlaza un epitope antigénico particular basado sobre la estructura tridimensional del anticuerpo y la igualación de la estructura tridimensional (o cognado) del epitope. Un "epitope sustituido" comprende por lo menos una sustitución estructural en el epitope, tal como una sustitución de un aminoácido por otro. Hibridación: Los oligonucleótidos y sus análogos se hibridan por el enlace de hidrogeno, que incluye el enlace de hidrogeno de Watson-Crick, Hoogsteen o Hoogsteen inverso, entre las bajas complementarias. Generalmente, ácido nucleico consiste de bases nitrogenosas que son ya sea pirimidinas (citosina (C) , uracilo (U) , y timina (T) ) o purinas (adenina (A) y guanina (G) ) . Estas bases nitrogenosas forman enlaza e hidrogeno entre una pirimidina y una purina, y el enlace de la pirimidina a la purina es referido como "emparejamiento base". Más específicamente, A enlazará hidrógeno a T o U, y G enlazará a C. "Complementariamente" se refiere al emparejamiento base que ocurre entre las secuencias de ácido nucleico distintas o dos regiones distintas del amino secuencia de ácido nucleico. "Específicamente hibridable" y "específicamente complementaria" son términos que indican un grado suficiente de complementariedad tal que el enlace estable y específico ocurre entre el oligonucleotido (o su análogo) y el objetivo de DNA o RNA. El oligonucleotido o análogo de oligonucleotido no necesita ser 100% complementario a sus secuencia objetivo JJ a ser específicamente hibridable. Un oligonucleótido o análogo es específicamente hibridable cuando el enlace del oligonucleótido o análogo al DNA objetivo o molécula de RNA interfiere con la función normal del DNA objetivo o RNA, y existe un grado suficiente de complementariedad para evitar el enlace no específico del oligonucleótido o análogo a las secuencias no objetivos bajo condiciones donde el enlace específico es deseado, por ejemplo bajo condiciones fisiológicas en el caso de ensayos o sistemas in vivo. Tal enlace es referido como hibridación específica. Las condiciones de hibridación que dan por resultado grados particulares de severidad variarán dependiendo de la naturaleza del método de hibridación de elección y la composición y longitud de la hibridación de las secuencias de ácido nucleico. Generalmente, la temperatura de hibridación y la resistencia iónica (especialmente la concentración Na+ y/o Mg++) de la solución reguladora de hibridación determinarán la severidad de hibridación, a través de tiempos de lavado también de severidad de influencia. Las calculaciones con respecto a las condiciones de hibridación requeridas para estimar los grados particulares de severidad se discuten por Sambrook y colaboradores, (ed.), Molecular Cloning: A Lahoratory Manual, 2nd ed., vol . 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, capítulos 9 y 11; y Ausubel y colaboradores. Short Protocols in Molecular Biology, 4 ed., John Wiley & Sons, Inc., 1999. Para propósitos de la presente descripción, "condiciones severas" abarca las condiciones bajo las cuales la hibridación no ocurrirá si existe menos del 25% de desigualdad entre la molécula de hibridación y la secuencia objetivo. "Condiciones severas" puede ser rota en niveles particulares de severidad para definición más precisa. Asi, como se utiliza en la presente, condiciones de "severidad moderada" son aquellas bajo las cuales las moléculas con más de 25% de desigualdad de secuencia no se hibridarán; condiciones de "severidad media" son aquellas bajo las cuales las moléculas con más de 15% de desigualdad no se hibridarán, y las condiciones de "severidad alta" son. aquellas bajo las cuales las secuencias con más de 10% de desigualdad no se hibridarán.. Las condiciones de "severidad muy alta" son aquellas bajo las cuales las secuencias con más de 6% de desigualdad no se hibridarán. "Hibridación específica" Se refiere al enlace, duplexasamiento, o hibridación de una molécula sola o sustancialmente sola a una secuencia de nucleótidos particular cuando esa secuencia esta presente en una mezcla compleja (por ejemplo, DNA o RNA celular total) . La hibridación específica también puede ocurrir bajo condiciones de severidad variante.

Composición inmunoestimulante : Un término utilizado en la presente para dar entender una composición útil para simular o inducir una respuesta inmune especifica (o respuesta inmunogénica ) en un vertebrado. La composición inmunoestimulante puede ser un antigeno de proteina o vector de plásmido utilizado para expresar un antigeno de proteina. En algunas modalidades, la respuesta inmunogénica es protectora o proporciona inmunidad protectora, en que permite para animal vertebrado a resistir mejor la infección con o progresión de enfermedad del organismo contra el cual la composición inmunoestimulante es dirigida. Sin que sea relacionado por una teoría específica, se cree que una respuesta inmunogénica inducida por una composición inmunoestimulante puede surgir de la generación de un anticuerpo específico a uno o más de los epítopes proporcionados en la composición inmunoestimulante. Alternativamente, la respuesta puede comprender una respuesta basada en célula T ayudante o citotóxica a uno o más de los epítopes proporcionados en la composición inmunoestimulante. 0 a las tres de estas respuestas pueden originarse de células nativas o de memoria. Un ejemplo específico de un tipo de composición inmunoestimulante es una vacuna. En algunas modalidades, una "cantidad efectiva" o "cantidad inmunoestimulante" de una composición inmunoestimulante es una cantidad que, cuando se administra un sujeto, es suficiente para engendrar una respuesta inmunodetectable . Tal respuesta puede comprender, por ejemplo, generación de un anticuerpo especifico a uno o más de los epitopes proporcionados en la composición inmunoestimulante. Alternativamente, la respuesta puede comprender una respuesta ayudante T o basada en CTL a uno o más de los epitopes proporcionados en la composición inmunoestimulante. Todas las tres de estas respuestas pueden originarse se células nativas o de memoria. En otras modalidades, una "cantidad efectiva protectora" de una composición inmunoestimulante es una. cantidad que, cuando se administra a un sujeto, es suficiente para conferir en unidad protectora en el sujeto. Inhibición o tratamiento de una enfermedad: La inhibición del desarrollo completo de una enfermedad o condición, por ejemplo, en un sujeto quien esta en un riesgo por una enfermedad. Un ejemplo especifico de enfermedades es rabia. "tratamiento" se refiere a una intervención terapéutica que mejora un signo o un síntoma de una enfermedad o condición patológica después de que ha comenzado a desarrollarse. Como se utiliza en la presente, el término "mejorados" con referencia a una enfermedad, condición patológica o síntoma, se refiere a cualquier efecto benéfico conservable del tratamiento. El efecto benéfico se puede evidenciar, por ejemplo, mediante un principio retardado de síntomas clínicos de la enfermedad en un sujeto susceptible, una reducción en severidad de algo o todos los síntomas clínicos de la enfermedad, una progresión más lenta de la enfermedad, una reducción en el numero de incidencias de la enfermedad, una mejora en la salud o bienestar total del sujeto, o mediante otros parámetros bien conocidos en la técnica que son específicos a la enfermedad particular. Aislado: Un componente biológico "aislado" o "purificado" (tal como un ácido nucleico, péptido, proteína, complejo de proteína o partícula) ha sido sustancialmente separado, producido aparte de, o purificado lejos de otros componentes biológicos en la célula del organismo en el cual el componente ocurre naturalmente, esto es, otros DNA y RNA cromosomales y extracromosomales , y proteínas. Los ácido a nucleicos, péptidos y proteínas que han sido "aislados" o "purificados" así incluyen ácidos nucleicos y proteínas purificados mediante métodos de purificación estándares. El término también abarca ácidos nucleicos, péptidos y proteínas preparados mediante la expresión recombinante en un célula hospedera, así como ácidos nucleicos o proteínas químicamente sintetizados. El término "aislado" o "purificado" no requiere pureza absoluta; más bien, se propone como un término relativo. Así, por ejemplo, un componente, ponente biológico aislado es uno en el que el componente biológico esta más enriquecido que el componente biológico que esta en su medio ambiente naturalmente de una célula, u otro recipiente de producción. Preferiblemente, una preparación se purifica tal que el componente biológico representa por lo menos 50%, tal como por lo menos 70%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, o mayor, del contenido del componente biológico total de la preparación. Marca: Un compuesto o composición detectable que se conjuga directa o indirectamente a otra molécula para facilitar la detección de esa molécula. Ejemplos no limitativos, específicos de marcas incluyen marcas fluorescentes, enlaces enzimáticos e isótopos radioactivos. Molécula de ácido nucleico: Una forma polimérica de nucleótidos, que pueden incluir hebras tanto de sentido como antisentido de RNA, cDNA, DNA genómico, y formas sintéticas y polímeros mezclados de lo anterior. Un nucleótido se refiere a un ribonucleótido , desoxinucleótido o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido. El término "molécula de ácido nucleico" como se utiliza en la presente es sinónimo con "ácido nucleico" y "polinucleótidos" . Una molécula de ácido nucleico es usualmente por lo menos 10 bases en longitud de, a menos que de otra menear las especifique. El término incluye formas de una hebra y dos hebras de DNA. Un polinucleótido puede incluir ya sea o ambos nucleótidos que ocurren naturalmente y modificados enlazados conjuntamente mediante enlaces de nucleótidos que ocurren naturalmente y/o que ocurren no naturalmente. Oligonucleótido : Una molécula de ácido nucleico que comprende generalmente una longitud de de 300 bases o pocas, El término se refiere frecuentemente a desoxirribonucleótidos de una hebra, pero · puede referirse a también a ribonucleótidos de una o dos hebras, híbridos de RNA:DNA y DNAs de dos hebras, entre otros. El término "oligonucleótido" también incluye oligonucleótidos (esto es, un oligonucleótidos menos el fosfato) y cualquier otro polímero base orgánico. En algunos ejemplos, los oligonucleótidos son aproximadamente 10 a aproximadamente 90 bases en longitud, por ejemplo, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 bases en longitud. Otros oligonucleótidos son aproximadamente 25, aproximadamente 30, aproximadamente 35, aproximadamente 40, aproximadamente 45, aproximadamente 50, aproximadamente 55, aproximadamente 60 bases, aproximadamente 65 bases, aproximadamente 70 bases, aproximadamente 75 bases o aproximadamente 80 bases en longitud. Los oligonucleótidos pueden ser de una hebra, por ejemplo, para el uso como sondas o cebadores, o pueden ser de dos hebras, por ejemplo, para el uso en la construcción de un gen mutante. Los oligonucleótidos pueden ser ya sea oligonucleótidos de sentido o antisentido. Un oligonucleótidos se puede modificar como es discutido en lo anterior en referencia a las moléculas de ácido nucleico. Los oligonucleót idos se pueden obtener de fuentes de ácido nucleico existentes (por ejemplo, genómico o cDNA) , pero también puede ser sintético (por ejemplo, producidos mediante laboratorio o síntesis de oligonucleót ido in vitro) . Estructura de Lectura Abierta (ORF) : Una serie de tripletos de nucleótido (codones) que codifican para los aminoácidos sin ninguno de los codones de terminación internos. Estas secuencias son usualmente traducibles en un pépt ido/polipépt ido /proteína /poliproteína . Se reconoce la técnica que los siguientes codones (mostrados para el RNA) se pueden utilizar intercambiablemente para codificar cada aminoácido específico o terminación: Alanina (Ala o A) GCU, GCG, GCA, o GCG; Arginina (Arg o R) CGU, CGC, CGA, CGG, AGA, o AGG; Asparagina (Asn o N) AAU o AAC; Ácido Aspártico (Asp o D) GAU o GAC; Cisteína (Cys o C) UGU o UGC; Ácido Glutámico (Glu o E) GAA o GAG; Glutamina (Gb o Q) CAA o CAG; Glicina (Gly o G) GGU, GGC, GGA, o GGG; Histidina (His o H) CAU o CAC; Isoleucina (He o I) AUU, AUC, o AUA; Leucina (Leu o L) UUA, UUG, CUU, CUC, CUA, o CUG; Lisina (Lys o K) AAA o AAG; Metionina (Met o M) AUG; Fenilalanina ( Phe o F) UUU o UUC; Prolina (Pro o P) CCU, CCC, CCA, o CCG; Serina (Ser o S) UCU, UCC, UCA, UCG, AGU, o AGC; codón de terminación UAA (ocre) o UAG (ámbar) o UGA (ópalo) ; Treonina (Thr o T) ACU, ACC, ACA, o ACG; Tirosina (Tyr o Y) UAU o UAC; Triptófano (Tip o W) UGG; y Valina (Val o V) GUU, GUC, GUA, o GUG . Los codones correspondientes para el DNA tienen T substituido por U en cada caso. Operablemente enlazado: Una primera secuencia de ácido nucleico se enlaza operablemente con una segunda secuencias de ácido nucleico cuando la primera secuencia de ácido nucleico se coloca en una relación funcional con la segunda secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor se enlaza operablemente a una _ secuencia de codificación que es el promotor que afecta la transcripción o expresión de la secuencia de codificación. Generalmente, las secuencias de DNA operablemente enlazadas son contiguas y, donde es necesario para unir dos regiones que codifican proteínas, en la misma estructura de lectura. Si los intrones están presentes,, las secuencias de DNA operablemente enlazadas pueden no ser contiguas. Parátopo: Esa porción de un anticuerpo que es responsable para su enlace a un determinante antigénico (epítope) o un antígeno. Portadores Farmacéuticamente Aceptables: Los portadores farmacéuticamente aceptables útiles en esta descripción son convencionales. Remington' s Phar aceutical Sciences, by E. . Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15th Edition (1975), describe composiciones y formulaciones adecuadas para el suministro farmacéutico de uno o más compuestos terapéuticos o moléculas, tal como una o más moléculas de ácido nucleico SARS-CoV, proteínas o anticuerpos que enlazan estas proteínas y agentes farmacéuticos adicionales . En general, la naturaleza del portador dependerá sobre modo particular de administ ación que se emplea. Por ejemplo, las formulaciones parenterales comprenden usualmente fluidos inyectables que incluyen fluidos farmacéutica y fisiológicamente aceptables tales como agua, solución salina fisiológica, soluciones de sal balanceadas, dextrosa acuosa, glicerol o los similares como un vehículo. Para las composiciones sólidas (por ejemplo, polvo, pastilla, tableta o formas de cápsulas), los portadores sólidos no tóxicos convencional pueden incluir, por ejemplo, grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, o estearato de magnesio. Además de los portadores biológicamente neutros, las composiciones farmacéuticas ha de ser administradas pueden contener calidades menores de sustancias auxiliares no toxicas, tal como agentes humectantes o emulsificantes , conservadores, y agentes reguladores de pH y los similares, por ejemplo, acetato de sodio o monolaurato de sorbitan. Polipéptido : Un polímero en el cual los monómeros son residuos de aminoácidos unidos conjuntamente a través de enlace de amida. Cuando los aminoácidos son alfa-aminoácidos, ya sea el isómero óptico L o el isómero óptico D se puede utilizar, los isómeros L , se prefieren para muchos usos biológicos. Los términos "polipéptido" o "proteína" como se utiliza en la presente se proponen para abarcar cualquier molécula de aminoácido e incluyen moléculas de aminoácido modificadas. El término "polipéptido" se propone específicamente para cubrir las proteínas que ocurren naturalmente, así como aquellas que se producen recombinante o sintéticamente. Las sustituciones de aminoácidos conservadoras son aquellas instituciones que, cuando se hacen, interfieren por lo menos las propiedades de la proteína original, esto es, la estructura y especialmente la función de la proteína se conserva y no cambia significantemente por tales sustituciones. Ejemplos de sustituciones conservadoras' se muestran enseguida.

Residuo Original Sustituciones Conservadoras Ser Arg Lys Asn Gln, His Asp Glu Cys Ser Gln Asn Glu Asp His Asn; Gln He Leu, Val Leu lie; Val Lys ) Arg; Gln; Glu Met Leu; lie Phe Met; Leu; Tyr Ser Thr Thr Ser Trp Tyr Tyr Trp; Phe Val lie; Leu Las sustituciones conservadoras mantienen generalmente (a) la estructura de la cadena principal del polipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo, como una lámina o conformación helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio objetivo o (c) el volumen de la cadena lateral.. Los aminoácidos se clasifican típicamente en una o más categorías, incluyendo, polar, hidrofóbicos , acídicos, básicos, y aromáticos, de acuerdo a sus cadenas laterales. Ejemplos de aminoácidos polares incluyen aquellos que tienen los grupos funcionales de cadena lateral, tal como hidroxilo, sulfihidrilo, y amida, así como los aminoácidos acídicos y básicos. Los aminoácidos polares incluyen, sin limitación, asparagina, cisteína, glutamina, histidina, selenocisteína, serina, treonina, triptófano y tirosina. Ejemplos de aminoácidos hidrofóbicos o no polares incluyen aquellos residuos que tienen cadenas laterales alifáticas no polares, tales, sin limitación, leucina, isoleucina, valina, glicina, alanina, prolina metionina y fenilalanina . Ejemplos de residuos de aminoácido básicos incluyen aquellos que tienen una cadena lateral básica, tal como un grupo amino o guanidina. Residuos de aminoácidos básicos incluyen, sin limitación,, arginina, homo lisina y lisina. Ejemplos de residuos de aminoácidos acidicos incluyen aquellos que tienen un grupo funcional de cadena lateral acidica, tal como grupo carboxi. Residuos de aminoácido acidicos incluyen, sin limitación ácido aspártico y ácidos glutámico. Aminoácidos aromáticos incluyen aquellos que tienen un grupo de cadena lateral aromática. Ejemplos de aminoácidos aromáticos incluyen, sin limitación, bifenilalanina, histidina, 2-naftilalananina, pentafluorofenilalanina , fenilalanina , triptófano y tirosina. Se nota que algunos aminoácidos se clasifican en más de un grupo, por ejemplo, histidina, triptófano y tirosina se clasifican tanto como aminoácidos polares como aromáticos. Aminoácidos adicionales que se clasifican en cada uno de los grupos anteriores son conocidos por aquellos de habilidad ordinaria en la técnica. Las sustituciones que en general se esperan que produzcan los cambios más grandes en las propiedades de la proteina no serán conservadores, por ejemplo los cambios en los cuales (a) un residuo hidrofilico, por ejemplo, serilo o treonilo, se sustituye por (o mediante) un residuo hidrofóbico, por ejemplo, leucilo, isoleucilo, fenilalanilo , valilo o alanilo; (b) una cisteina o prolina se sustituye por (o mediante) cualquier otro residuo; (c) un residuo que tiene una cadena lateral electropositiva, por ejemplo, lisilo, arginilo, o histadilo, se sustituye por (o mediante) un residuo electronegativo, por ejemplo, glutamilo o aspartilo; o (d) un residuo que tiene una cadena lateral voluminosa, por ejemplo, fenilalanina , se sustituye por (o mediante) una que no tiene una cadena lateral, por ejemplo, lisina. Sondas y cebadores: Una sonda comprende una molécula de ácido nucleico aislada unida a una marca detectable u otra molécula reportadora. Las marcas típica incluyen isótopos radioactivos, sustratos de enzimas, cofactores, ligandos, agentes quimioluminiscentes y fluorescentes, haptenos y enzimas. Métodos para marcar y guía en la elección de marcas apropiadas para varios propósitos se discuten, por ejemplo, Sambrook y colaboradores. (ed.), Molecular Cloning: ñ Laboratory Manual, 2nd ed., vol . 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 and Ausubel y colaboradores . Short Protocols in Molecular Biology, 4th ed. , John Wiley & Sons, Inc., 1999. Los cebadores son moléculas de ácido nucleico cortas, por ejemplo oligonucleótidos de DNA de 6 nucleótidos o más en longitud, pro ejemplo que hibridan a nucleótidos complementarios contiguos o a una secuencia que se amplifica. Oligonucleótidos de DNA más largos pueden ser de aproximadamente 10, 12, 15, 20, 25, 30, o 50 nucleótidos o más en longitud. Los cebadores se pueden recocer a una hebra de DNA objetivo complementaria mediante la hibridación de ácido nucleico para formar un híbrido entre el cebador y la hebra de DNA objetivo, y luego el cebador se extiende a lo largo de la hebra de DNA objetivo por una enzima de DNA polimerasa. Los pares de cebadores se pueden utilizar para la amplificación de una secuencia de ácido nucleico, por ejemplo, mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) u otros métodos de amplificación de ácido nucleico conocidos en la técnica. Otros ejemplos de amplificación incluyen amplificación de desplazamiento de hebra, como se divulga en la patente norteamericana No. 5,744,311; amplificación isotérmica libre de transcripción, como se divulga en la patente norteamericana No. 6,033,881; amplificación de reacción de cadena de reparación, como se divulga en el documento WO 90/01069; amplificación de reacción de cadena de ligasa, como se divulga en el documento EP-A-320 308; amplificación de reacción den cadena de ligasa de relleno de espacio, como se divulga en 5,427,930; y amplificación libre de transcripción de RNA de NASBA™, como se divulga en la patente norteamericana No. 6,025,134. Métodos para preparar y utilizar las sondas y cebadores de ácido nucleico se describen, por ejemplo, en Sambrook y colaboradores. (ed.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol . 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989; Ausubel y colaboradores. Short Protocole in Molecular Biology, 4th ed. , John Wiley & Sons, Inc., 1999; y Innis y colaboradores PCR Protocols , A Guide to Methods and Applications , Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1990. Los pares de cebadores de amplificación se pueden derivar de una secuencia conocida, por ejemplo, al utilizar programas de computadora propuestos para ese propósito tal como cebador (Versión 0.5, © 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, A) . Uno de habilidad ordinaria en la técnica apreciará que la especificidad de una sonda o cebador particular se incrementa con su longitud. Asi, a fin de obtener sondas y cebadores, específicamente mayores se pueden seleccionar de aquellos que comprenden por lo menos 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más nucleótidos consecutivos de unas secuencias de nucleótidos obj etivos . Proteina: Una molécula biológica, particularmente un polipéptido, expresado por un gen y comprendido de de aminoácidos . Purificado: El término "purificado" no requiere pureza · absoluta; más bien, se propone como un término relativo. Así, por ejemplo, una preparación de proteína purificada es una en la que la proteína sujeto es más pura que en su medio ambiente natural, dentro de una célula. Generalmente, una preparación de proteína se purifica tal que la proteína representa por lo menos 50% del contenido de proteína total de al preparación. Ácido nucleico recombinante : Una molécula de ácido nucleico que no ocurre naturalmente o tiene una secuencia que se hace mediante una combinación artificial de dos segmentos de otra manera separados de secuencia. Esta combinación artificial se logra mediante la síntesis química o, más comúnmente, mediante la manipulación artificial de los segmentos aislados de los ácidos nucleicos, por ejemplo, mediante técnicas de ingeniería genética tales como aquellos descritos en Sambrook y colaboradores. (ed.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol . 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989. El término recombinante incluye ácidos nucleicos que han sido alterados únicamente por la adición, sustitución, o supresión de una porción de una molécula de ácido nucleico natural. Secuencias o elementos reguladores: Estos términos se refieren generalmente a una clase de secuencias de DNA que influencian o controlan la expresión de los genes. Se incluyen en el término promotores, potenciadores , regiones de control de sitio (LCRs), elementos aisladores/de límite, silenciadores, regiones adhesión de matriz, (MARs, también referida como regiones de adhesión de estructura) , represores, terminadores transcripcionales , orígenes de replicación, centrómeros, y puntos calientes de recombinación meiótica. Los promotores son secuencias de DNA cerca del extremo 5' de un gen que actúa como un sitio de enlace para la RNA polimerasa dependiente de DNA, y partir de la cual la transcripción se inicia. Los potenciadores son elementos de control que elevan el nivel de transcripción de un promotor, usualmente de manera independiente de la orientación o distancia del potenciador del promotor. Las LCRs confieren expresión especifica de tejido y temporalmente ' regulada a los genes a los cuales se enlazan. Las LCRs funcionan independientemente de su posición en relación al gen, pero son dependientes del número de copias. Se cree que funcionan para abrir la estructura del nucleosoma, hacia otros factores pueden enlazarse el DNA. Las LCRs también pueden afectar el tiempo de replicación y el uso de origen. Los aisladores (también conocidos como segmentos de limite) son secuencias de DNA que previenen la activación (o inactivación) de la transcripción de un gen, al bloquear los efectos de la cromatina circundante. Los silenciadores y represores son elementos de control que suprimen la expresión del gen; actúan sobre un gen independientemente de su orientación o distancia del gen. Las MARs son secuencias dentro del DNA que enlazan a la estructura nuclear; pueden afectar la transcripción, posiblemente al separar los cromosomas en los dominios reguladores. Se cree que las MARs median en el orden superior, las estructuras de bucle dentro de los cromosomas. Los terminadores transcripcionales son regiones dentro de la vecindad del gen donde la RNA polimerasa se libera de la plantilla. Los orígenes de la replicación son regiones del genoma que, durante la síntesis de DNA o pases de replicación de la división celular, que es el proceso de replicación del DNA. Los puntos calientes de recombinación meiótica son regiones del genoma que se recombinan mas frecuentemente que el promedio durante la meiosis. Replicón: Cualquier elemento genético (por ejemplo, plásmido, cromosoma, virus) que funciona como una unidad de autoreplicación, autónoma de replicación de DNA in vivo. Muestra: Una porción, pieza, o segmento que es representativa de un total. Este término abarca cualquier material, que incluye, por ejemplo muestras obtenidas de un animal, una planta o el medio ambiente. Una "muestra ambiental" incluye una muestra obtenida de objetivos inanimados o depósitos dentro de un medio ambiente interior o exterior.' Muestras ambientales incluyen, pero no se limitan a: suelo, agua, polvo, y muestras de aire; muestras de volumen, que incluyen materiales de construcción, muebles y contenidos de vertederos; y otras muestras de depósito tales como desechos animales, granos cosechados y artículos alimenticios. Una "muestra biológica" es una muestra obtenida de una planta o sujeto animal. Como se utiliza en la presente, las muestras biológicas incluyen todas las muestras útiles para la detección de la infección viral en sujetos, que incluyen, pero no se limitan a: células, tejidos, y fluidos corporales, tales como sangre; derivados y fracciones de sangre (tal como suero); y el extraída; tejido biopsiado o quirúrgicamente removido, que incluyen tejidos que son, por ejemplo, no fijos, congelados, fijos en formalina y/o incrustados en parafina; lágrimas; leche; trozos de piel; lavados de superficie; orina; esputo; fluido cerebroespinal; fluido de próstata; pus; aspiratos de medula ósea; BAL; saliva; torundas cervicales; torundas vaginales; y lavado orofaríngeo . Identidad de secuencia: La similaridad entre dos secuencias de ácido nucleico, o dos secuencias de aminoácidos, se expresan términos de similaridad entre las secuencias, de otra manera referidas como identidad de secuencia. La identidad de secuencias se mide frecuentemente en términos de identidad de porcentaje (o similaridad u homología); mientras más alto es el porcentaje, más similares son las dos secuencias. Métodos de alineación de secuencias para la comparación son bien conocidos en la técnica. Varios programas y algoritmos de alineación se describen en: Smith y aterman (Adv. Appl . Math., 2:482, 1981); Needleman y Wunsch (J. Mol Biol., 48:443, 1970); Pearson y Lipman (Proc. Nati. Acad. ScL, 85:2444, 1988); Higgins y Sharp (Gene, 73:237-44, 1988); Higgins y Sharp (CABIOS, 5: 151-53, "1989); Corpet y colaboradores. [Nuc. Acids Res., 16:10881-90, 1988); Huang y colaboradores. (Comp. Appls. Biosci., 8:155-65, 1992); y Pearson y colaboradores. (Meth. Mol. Biol., 24:307-31, 1994). Altschul y colaboradores. {Nature Genet . , 6:119-29, 1994) presenta una consideración detallada de métodos de alineación de secuencia y calculaciones de homología. Las herramientas de alineación ALIGN (Myers y Miller, CABIOS 4: 11-17, 1989) o LFASTA (Pearson y Lipman, 1988) se pueden utilizar para realizar las comparaciones de secuencia (Internet Program © 1996, . R. Pearson and the University of Virginia, "fasta20u63" versión 2.0u63, fecha de liberación Diciembre de 1996) . El ALIGN compara las secuencias completas contra otras, mientras que el LFASTA compara las regiones de similaridad local. Estas herramientas de alineación y sus tutoriales respectivos son disponibles en el Internet en el sitio de internet NCSA. Alternativamente, para comparaciones de secuencia de aminoácidos de mayor que aproximadamente 30 aminoácidos, la función de "secuencias Blast 2" se pueden emplear utilizando el conjunto de matriz BLOSUM62 predeterminado a los parámetros predeterminados, (costo de existencia de espacio de 11 y un costo de espacio por residuo de 1) . Al alinear los péptidos cortos (más pocos que alrededor de 30 aminoácidos), la alineación se debe realizar utilizando la función "secuencias Blast 2", empleando el conjunto de matriz PAM30 a los parámetros predeterminados (espacio abierto 9, penalidades 1 de espacio de extensión) . El sistema de comparación de secuencia BLAST está disponible, por ejemplo, del sitio de internet NCBI; ver también Altschul y colaboradores., J. Mol. Biol, 215:403-10, 1990; Gish y States, Nature Genet, 3:266-72, 1993; Madden y colaboradores, Meth . Enzymol, 266:131-41, 1996; Altschul y colaboradores, Nucleic ñcids Res., 25:3389-402, 1997; y Zhang y Madden, Genome Res., 7:649-56, 1997. Ortólogos (equivalentes a proteínas de otras especies) de proteínas son en algunos casos caracterizados por la posesión de mayor que 75% de identidad de secuencia contadas sobre la alineación de longitud completa con la secuencia de aminoácidos de la proteína específica utilizando un conjunto ALIGN a los parámetros predeterminados. Las proteínas con similaridad aun mayor a una secuencia de referencia mostrarán identidades de porcentaje de incremento cuando se estimaron mediante este método, tal como por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 92%, por lo menos 95% o por lo menos 98% de identidad de secuencia. Además, la identidad de secuencia se puede comparar sobre la longitud completa de uno o ambos dominios de enlace de las proteínas de fusión divulgadas. Cuando significante menor que la secuencia completa esta siendo comparada para la identidad de secuencia, las secuencias homologas poseerán típicamente por lo menos 80% de identidad de secuencia sobre ventanas cortas de 10-20, y pueden poseer identidades de secuencias de por lo menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, o por lo menos 99% dependiendo de su similaridad a la secuencia de referencial. La identidad de secuencia sobre tales ventanas cortas se puede determinar utilizando LFASTA; los métodos se describen en el sitio de internet NCSA. Uno de habilidad en la técnica apreciará que estos intervalos de identidad de secuencia se proporcionan para guía solamente; es completamente posible que los homólogos fuertemente significantes podrían ser obtenidos que caen fuera de los intervalos proporcionados. Los conceptos de homología similares aplican para los ácidos nucleicos como se describen para las proteínas. Una indicación alternativa de que dos moléculas de ácido nucleico se relacionan estrechamente es que las dos moléculas se hibridan entre sí bajo condiciones severas. Las secuencias de ácido nucleico que no muestran un grado alto de identidad no obstante pueden codificar secuencias de aminoácidos similares, debido a la degeneración del código genético. Se cree que los cambios en la secuencia de ácido nucleico se puede hacer utilizando esta degeneración para producir múltiples secuencias de ácido nucleico que cada una codifica sustancialmente la misma proteína. Agente de enlace especifico: un agente que enlaza sustancialmente solo a un objetivo definido. Asi un agente de enlace especifico de proteina se enlaza sustancialmente solo a la proteina definida, o a una región especifica dentro de la proteina definida, o una región especifica dentro de la proteina. Como se utiliza en la presente, los agentes de enlace específicos de proteína incluyen anticuerpos y otros agentes que enlazan sustancialmente a un polipéptido especificado. Los anticuerpos pueden ser anticuerpos monoclonales o policlonales que son específicos para el polipéptido así como porciones inmunológicamente efectiva ("fragmentos") de los mismos. La determinación de que un agente particular enlaza sustancialmente solo a un polipéptido específico puede ser hecha al utilizar o adaptar procedimientos de rutina. Ejemplos de ensayos in vitro adecuados que hace uso del procedimiento del manchado de Western incluyen IFA y Ag-ELISA, y se describen en muchos textos estándares, que incluyen Harlow y Lañe, Using Antibodies : A Laboratory Manual, CSHL, Nueva York, 1999. Transformada: Una célula "transformada" es una célula en la cual se ha introducido una molécula de ácido nucleico mediante técnicas de biología molecular. El término abarca todas las técnicas mediante la cual una molécula de ácido nucleico podría ser introducida en tal célula, incluyendo la transfección con vectores virales, transformación con vectores de plásmido, e introducción de DNA desnudo mediante la electroporacion, lipofección, y aceleración con pistola de partículas. Vector: Una molécula de ácido nucleico como introducida en una célula hospedera, para de esta manera producir una célula hospedera transformada. Un vector puede incluir secuencias de ácido nucleico que permiten replicar en una célula hospedera, tal como un origen de replicación (secuencias de DNA que participan en la síntesis de DNA de iniciación) . Un vector también puede incluir uno o más genes marcadores seleccionables y otros elementos genéticos conocidos en la técnica. Virus: Organismo infeccioso microscópico que produce células vivientes interiores. Un virus consiste típicamente de manera esencial de un núcleo de un ácido nucleico individual circundado por un recubrimiento de proteína, y tiene la habilidad de replicarse solo dentro de una célula viviente "replicación viral" es la producción de virus adicionales mediante la ocurrencia de por lo menos un ciclo de vida viral. Un virus puede subvertir las funciones normales de las células hospederas, causando a la célula comportarse de una manera determinada por el virus. Por ejemplo, una infección viral puede dar por resultado una célula que produce una citocina, o que responde a una citocina, cuando la célula no infectada normalmente no lo hace . Aunque los métodos y materiales similares equivalentes a aquellos descritos en la presente se pueden utilizar en la práctica o prueba de la presente invención, los métodos y materiales adecuados se describen enseguida'. Todas las publicaciones, solicitudes de patente, patentes, y otras referencias mencionadas en la presente se incorporan por referencia en su totalidad. En caso de conflicto, la presente especificación, que incluye explicaciones de términos, lo controlarán. Además, los materiales, métodos y ejemplos son ilustrativos solo y no se proponen ser limitativos . IV. Vista General de Varias Modalidades Se proporciona en la presente una primera modalidad de un genoma del virus de rabia recombinante que comprende el ácido nucleico como se expone en SEQ ID NO: 1 (secuencia de ERA de longitud completa) . También se proporcionan proteínas del virus de rabia aisladas codificadas por ese genoma que incluyen proteínas específicas que comprenden una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 2 (proteína N) ; SEQ ID NO: 3 (proteína P) ; SEQ ID NO: 4 (proteína M) ; SEQ ID NO: 5 (proteína G) o SEQ ID NO: 6 (proteína L) ; y moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican tales proteínas. A manera de ejemplo, tales moléculas de ácido nucleico aisladas comprenden una secuencia de nucleótidos como se expone en: nucleótidos 71-1423 de SEQ ID NO: 1 (proteina N) ; nucleótidos 1511-2407 de SEQ ID NO: 1 (proteína P) ; nucleótidos 2491-3104 de SEQ ID NO: 1 (proteína ) ; nucleótidos 3318-4892 de SEQ ID NO: 1 (proteína G) ; o nucleótidos 5418-1 1,801 de SEQ ID NO: 1 (proteína L) . También se proporciona un genoma del virus recombinante con la secuencia de ácido nucleico como se expone en SEQ ID NO: 7, que difiere de SEQ ID NO: 1 por la virtud de una supresión de un residuo de adenosina en el tracto poliA entre el gen G y la región psi. SEQ ID NO: 7 también codifica las proteínas mostradas como SEQ ID NOs : 2-6. También se proporcionan genomas de derivados de la cepa de virus ERA, como se muestra en SEQ ID NOs: 8-18. En ciertas modalidades, los genomas están presentes en un vector, tal como un plásmido. Todavía otra modalidad descrita es un sistema para secuenciar el genoma del virus de rabia de longitud competa utilizando un método como se describe en la presente. Los sistemas de vector viral para la expresión de las proteínas heterologas también se describen. Otra modalidad proporciona composiciones que comprenden una o más moléculas de ácido nucleico, una o más proteínas, proporcionadas en la presente. Opcionalmente, tales composiciones contienen un portador farmacéuticamente aceptable, un adyuvante o una combinación de dos o más de los mismos . También se proporciona un método para inducir una respuesta inmune contra un epitope antigénico en un sujeto, que comprende introducir en el sujeto una composición que comprende un nucleótido, péptido, o polipéptido descrito en la presente, para de esta manera inducir una respuesta inmune en el sujeto. Otro aspecto de la descripción se relaciona a un sistema de vector para producir virus de rabia recombinante . El sistema de vector incluye un primer vector (vector de transcripción) que contiene un DNA antigenómico de virus de rabia de longitud completa (o un derivado del mismo) y un conjunto de vectores auxiliares que contienen ácido nucleico que codifican por lo menos una proteina ERA de la cepa del virus de rabia. La expresión de los vectores en una célula hospedera transfectada da por resultado la producción de un virus de rabia recombinante vivo. En ciertas modalidades, el DNA antigenómico es de la cepa de ERA (por ejemplo, SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 7) o un derivado del mismo, tal como uno de SEQ ID NOs : 8-18. En ciertas modalidades, los vectores son plásmidos. Para facilitar la recuperación del RNA viral de longitud completa, el vector de transcripción puede incluir, en una dirección 5' a 3' : una ribozima de cabeza de martillo; un cDNA antigenóraico del virus de rabia; y una ribozima del virus delta de hepatitis. Los nucleótidos de la ribozima de cabeza de martillo se seleccionan para ser complementarios a la secuencia genómica antisentido del virus de rabia. La transcripción del cDNA antigenómico está bajo en control regulador de transcripción de por lo menos uno del promotor de CMV y el promotor de RNA polimerasa de fago T7 y comúnmente bajo el control de ambos de estos promotores. Los vectores auxiliares incluyen típicamente un vector que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica una proteína N del virus de rabia; un vector que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica una proteína P del virus de rabia; un vector que comprende una secuencia de polinucleótido que codifica una proteína M del virus de rabia; un vector que comprende una secuencia de polinucleótido que codifica una proteína L del virus de rabia; y un vector que comprende una secuencia de polinucleótido que codifica una RNA polimerasa de fago T7. En una modalidad la T7 RNA polimerasa comprende una señal de localización nuclear (NLS) . Opcionalmente , el sistema de vector también incluye un vector que comprende una secuencia de polinucleótido que codifica una proteína G del virus de rabia . La transcripción de una o más de las secuencias de polinucleótidos que codifica la proteína P, M, L o G del virus de rabia o la T7 polimerasa está bajo el control regulador de transcripción de tanto el promotor de CMV como el promotor de T7. En contraste, la transcripción de la secuencia de polinucleótido que codifica la proteina N del virus de rabia está bajo el control regulador de transcripción del promotor T7 y la transcripción es independiente de terminación. Todavía más modalidades son vacunas de rabia vivas, cada una que comprende un genoma del virus de rabia recombinante como se proporciona en la presente. Ejemplos de tales genomas de rabia recombinantes comprenden la secuencia mostrada como ERA G333 (SEQ ID NO: 13) ; la secuencia mostrada como ERA 2G (SEQ ID NO: 8); y la secuencia mostrada en la presente como ERA 2G333 (SEQ ID NO: 10) . Opcionalmente, la vacuna de rabia está atenuada. También se proporciona un método para producir un virus de rabia vivo (por ejemplo, para el uso en una composición inmunogénica , tal como una vacuna) al introducir el sistema de vector en una célula hospedera. Después de la transfección del sistema de vector en una célula hospedera adecuada, el virus vivo y opcionalmente atenuado se recupera. La producción y administración de una vacuna de rabia viva producida por tales métodos también se contempla en la presente . También se divulga un método para vacunar a un sujeto contra la rabia, el método que comprende administrar una cantidad efectiva de la vacuna de rabia viva de acuerdo a la descripción proporcionada a un sujeto, tal que las células del sujeto se infectan en la vacuna de rabia, en donde una respuesta inmune antirrábica se produce en el sujeto. En una modalidad, el sujeto es un humano. En otra modalidad, el sujeto es un animal no humano. Por ejemplo, el animal no humano en algunos casos es un gato, perro, rata, ratón, murciélago, zorro, mapache, ardilla, zarigüeya, coyote o lobo . En ciertas modalidades, la vacuna de rabia se administra enteralmente . Por ejemplo, la administración enteral en algunos casos comprende la administración oral. La administración oral incluye la administración a través de bocados de alimento diseñados para vacunar las poblaciones animales silvestres, por ejemplo. Las composiciones farmacéuticas que incluyen las vacunas de rabia vivas descritas (por ejemplo, una vacuna de rabia viva atenuada) y un portador o excipiente farmacéutica mente aceptable también se proporcionan. V. Método para Secuenciar el Genoma de Lyssavirus Entero Para facilitar la secuenciación del genoma de ERA de longitud completa, se desarrolló un método para secuenciar un virus de RNA de hebra negativa de longitud completa. Este método es aplicable a la secuenciación de un lyssavirus, tal como un virus de rabia, asi como otros virus de RNA de hebra negativa. El virus de rabia en un virus de RNA de una hebra negativo con un genoma alrededor de 12 kb, con el intervalo entre bases de 11,918 (lyssavirus de murciélago Australiano) y 11,940 (virus Mokola) . Las secuencias de ácido nucleico virales de rabia disponibles en el GENBANK se enfocan principalmente sobre las secuencias que codifican las proteínas - proteína nucleocápsida (N) , glicoproteína (G) , fosfoproteína (P) y los genes de la proteína de matriz (M) , que se aproximan al extremo 3' del genoma. Previo al análisis filogenético se basa principalmente sobre los genes N y G. Pero, para las cepas virales de rabia remotamente relacionadas, el gen de la RNA polimerasa (L) dependiente de RNA es el candidato mucho más adecuado para el análisis filogenético. Desafortunadamente, pocas secuencias del gen L son disponibles en las bases de datos en el gen público. Además, se ha propuesto que las regiones tanto guía como de cola en las terminales virales de rabia desempeñan funciones muy importantes para (regulación de) la transcripción viral y la replicación. Esto podría ser que las regiones conservadas para la encapsidación de, la nucleoproteína o los sitios de enlace para las proteínas de L/P, por ejemplo. También las regiones intergénicas entre la región del pseudo gen, N, N-P, P-M, M-G, guía y G-L sirve como las sales para la iniciación de la transcripción viral. Asi, no solo las regiones de codificación, sino también las regiones de no codificación dentro del genoma viral, podrían ser aplicadas al análisis filogenético o investigación de una evolución. Estas secuencias todas se pueden analizar más fácilmente utilizando los métodos de secuenciación de genoma completo proporcionado en la presente. El método incluye una transcripción inversa de una sola etapa y una clonación de dos etapas en un vector adecuado. Este método produce un genoma fácilmente secuenciada en el vector, sin la necesidad de realizar las reacciones de RT-PCR repetidas propensas al error. La explotación de la repetición invertida encontrada en los extremos del genoma de la rabia (y los genomas de otros lyssavirus), los cebadores universales se han diseñado y se describen en la presente para el uso en los procedimientos de secuenciación de genoma completo rápidos descritos en la presente . Las regiones guía y de cola en el virus de rabia contienen señales para la transcripción viral y la replicación. Basados sobre los análisis de la secuencia del genoma disponibles del GenBank, los nucleótidos 11 terminales se conservan estrictamente en el virus de rabia o el virus relacionado a la rabia, que incluyen el virus Mokola. El razonamiento para- los métodos de secuenciación proporcionados en la presente se basa sobre los nucleótidos complementarios 11 terminales. Debido a que estas dos secuencias del nucleótido 11 son complementarias, podrían no ser utilizados en las reacciones de PCR de seguimiento. Será entendido que otros virus con repeticiones invertidas se pueden amplificar similarmente utilizando cebadores que corresponden a las secuencias de aquellas repeticiones. Los nucleótidos 11 de sentido de antigenoma se diseñaron como cebadores de transcripción de inversión para el genoma de ERA purificado, cuya integridad se verificó mediante la comparación de tamaño y los manchados del norte. El cDNA del genoma completo también se confirmó por el manchado de Northern con las sondas del gen N, P, M, G, L y los nucleótidos 11 como una sonda de oligonucleótido, que el cual solo enlazó el RNA genómico, el mRNA no viral. Es razonablemente factible invertir el genoma completo viral de la rabia transcrito en una reacción, utilizando cebadores que corresponden a la secuencia terminal conservados cuidadosamente diseñados, con la condición de que la calidad de la preparación del genoma viral sea alta. La secuencia del ERA se relaciona estrechamente a aquella de SAD, que es uno de sus derivados. Esto no es sorprendente, debido a que el ERA se envío de CDC en 1970 a Suiza, donde los investigadores lo adaptaron para cultivarlo en las células, antes de enviarlas a Alemania, donde se lo llevaron adicionalmente, y el derivado se secuencia completamente en -1990. Hasta ahora, el virus de rabia y relacionado a la rabia se ha clasificado en siete tipos diferentes: tipo 1 de virus de rabia clásico (ERA se incluye), tipo 2 (murciélago de Lagos), tipo 3 (Mokola), tipo 4 (Duvenhage), tipo 5 (lyssavirus de murciélago Europeo [EBL] I, tipo 6 (EBL II) y tipo 7 (virus de murciélago Australiano) de acuerdo a los estudios de protección y genética cruzados de suero. El análisis de secuencia desempeña una función importante en la filogenética, la investigación de evolución, los estudios predictivos de función de genes y otras áreas relacionadas, que incluyen las regiones reguladoras de transcripción y replicación virales de ubicación, y por consiguiente la bioinformática hacia los fármacos terapéuticos potenciales. Con el desarrollo de las técnicas en la reacción en cadena de la polimerasa transcripcional inversa (RT-PCR) , que son conocidos por aquellos de habilidad ordinaria en la técnica, ahora es relativamente fácil transcribir en inversión tanto como 12 kb o más de RNA a cDNA en una reacción. Bajo condiciones optimizadas, la PCR puede amplificar objetivos de más de 30 kb en una reacción. Con la provisión en la presente de métodos para generar secuencias de genoma de virus de longitud completa, y particularmente secuencias de genoma de rabia, ahora llega a ser práctico analizar y diferir cepas de virus. El diseño efectivo del virus atenuado, por ejemplo para el uso en la inmunización o producción de composiciones y vacunas inmunoestimulantes , también se habilitan utilizando los genomas de longitud completa resultantes. No hay genoma del virus de rabia "general", pero estos genomas se relacionan. Las similaridades varían de 60% a 100% en tipos diferentes. Algunas regiones tal como el gen L, parece ser más conservado, mientras que otros, tal como la región psi que no codifica un polinucleótido, son más variables. No solo los virus de rabia y relacionados a la rabia se desplazarán, sino también cualquiera de los virus de RNA cambiaran a través del tiempo. Como los virus se adaptan y emergen, es una pregunta abierta. Por esta razón, el análisis de secuencia de genoma completo es importante par a los estudios evolucionarlos, de patogenicidad y función de genes . Este sistema descrito en la presente es el primero para el virus de rabia el cual concierne a la secuenciación del genoma completo. Se cree que es adecuado para otros virus de RNA, particularmente en el género lyssavirus. En la actualidad, para los estudios filogenéticos del virus de rabia, " los científicos solo hacen uso de los genes N, P, o G que son mucho más abundantes en las células infectadas o tejidos. Es sabido que para la comparación de la cepa remota, el gen L que comprende más de la mitad del genoma puede ser un sitio candidato ideal, que debe ser utilizado. Desafortunadamente, tales comparaciones evolucionarías no son posibles debido a los datos muy limitados disponibles, mucho menos la secuencia del genoma completa. También para los estudios de transcripción y replica.ción viral, se supone que las regiones guía y de cola localizadas en las extremidades 3' y 5' del genoma desempeñan funciones importantes. Las regiones intergénicas también son las señales para dos estudios trans y cis virales. Todos estos datos son muy limitados, debido a que no se incluyen en el mRNA. Solo la secuencia de genoma completa puede proporcionar la información necesaria en este nivel. La secuenciación del genoma completa es útil no solo para el desarrollo de la vacuna, también es aplicable para los estudios de transcripción y replicación de virus básicos. También es aplicable para el desarrollo de la terapia de siRNA y genes también . VI. Secuencia del Genoma del ERA Utilización de método descrito en la presente, la secuencia única del genoma del virus de rabia ERA se ha generado. Esta secuencia se muestra en SEQ ID NO: 1. Las cinco proteínas del virus de rabia ERA (SEQ ID NOs : 2-6) se codifican en las siguientes posiciones del genoma: N, 71-1423; P, 1511- 2407; M, 2491-3104 ; G, 3318-4892; y L, 5418- 11801. La homología entre el ERA y SAD-B19 son: N 99.56%, P 98.65%, 96.53%, G 99.05% y L 99.20%, respectivamente. Una diferencia específica entre el ERA y SAD-B 19 es la región intergénica entre G y el pseudo-gene, con la señal de detección/poliadenilación de transcripción de SAD-B19 G destruida . La secuencia del genoma completa del virus de rabia ERA es el prerequisito para el desarrollo de la vacuna y los estudios de patogenicidad utilizando la genética inversa. VII. Sistema Optimizado para la Producción del Virus Los ejemplos 6 y 7 proporcionan un conjunto optimizado de condiciones para la producción del virus de ERA, en el que los títulos alcanzan tal alto como 1010 ffu por mi. En bioreactores , el virus recuperado puede crecer a -109 a 1010 ffu/ml. Tales niveles altos de producción son de importancia superior para el desarrollo de la vacuna oral, de esta manera el material de vacuna suficiente se puede producir en una cantidad razonable de tiempo con distribución de recursos razonables. La condiciones de crecimiento proporcionadas pueden producir establemente el tal título de virus alto para la cepas de ERA tanto parentales como recombinantes . Estos datos de producción son muy importantes para el desarrollo de la vacuna oral de rabia potencial. VIII. Linea celular BSR-G para la Producción del Virus -G Aunque las cepas de RV con supresiones de la proteina G se han rescatado previamente de las células BHK, esto no fue posible con el virus de la cepa ERA que carece de la proteina G. Después de la inoculación de los ratones intracerebralmente o intramuscularmente con el ERA-P, ninguno de los ratones murieron o mostraron ningunos síntomas de rabia . El ERA-G (sin gl icoproteína ) solo puede crecer en células con la suplementación de la glicoproteína . De otra manera, el virus mutado no se puede extender. Para ayudar al crecimiento del ERA-G, se estableció una línea celular BSR-G, la cual expresó constitutivamente la glicoproteína de ERA. La producción de esta línea celular se describe en los ejemplos enseguida. Esta línea celular es útil para la recuperación de las cepas de RV tal como ERA-G que son refractarias para recuperar en ausencia de G, así como para optimizar la recuperación de otra cepa. IX Sistema de Genética Inversa para el Diseño de Vacunas de Virus de Rabia y Expresión de las Proteínas Heterólogas El RNA no se puede manipular fácilmente de manera directa mediante métodos biológicos moleculares. Las vacunas del virus de RNA tradicionales son de aislados naturalmente atenuados, que son difíciles de controlar y proporcionan resultados impredecibles . La tecnología de la genética inversa hace posible manipular el virus de RNA como DNA, que se puede mutar, suprimir o reconstruir de acuerdo a diseños deliberados. Cada función de gen se puede estudiar cuidadosamente, independientemente, y con untamente, lo cual beneficia el desarrollo de la vacuna. La genética inversa involucra la transcripción inversa del genoma viral de RNA en cDNA, y la clonación en un vector, tal como un plásmido. Después de la transfección de las células hospederas, el vector se transcribe en RNA, a ser encapsidado por las proteínas estructurales, que también se pueden suministrar por los plásmidos. El RNA encapsidado forma n complejo de ribonucleoproteína , que da por resultado viriones que se pueden recuperar. Aunque se han publicado tres sistemas para la genética inversa del virus de rabia (RV) (Schnell y colaboradores, The EMBO J. 13, 4195-4203, 1994; Inoue y colaboradores., J. Virol. Method. 107, 229-236, 2003; Ito y colaboradores, Microbiol. Immunol. 47, 613-617, 2003), estos sistemas no son fácilmente aceptables para otras cepas. En la actualidad, ninguna cepa del virus de rabia ha sido recuperada con la ayuda de los plásmidos auxiliares de una cepa diferente, aun cuando las cepas se relacionan estrechamente. Así, para una mutación de la cepa del virus específica o desarrollo de vacuna se debe desarrollar un sistema específicamente a la medida. La cepa de ERA es un buen candidato para el desarrollo de la vacuna oral de rabia, pero su patogenicidad residual es obvio. Durante los 1970, el ERA RV se sometió al desarrollo de vacuna extensivo (Black y Lawson, Can. J. Comp. Med. 44:169-176, 1980; Charlton y Casey, Can. J. Vet. Res. 20:168-172, 1978; Lawson y Crawley, Can. J. Vet. Res. 36: 339-344, 1972) . Tanto ERA como SAD-B 19 se derivan de SAD. En experimentos de vacuna oral primario, el SAD-B 19 fue efectivo en tanto mapaches como zorrillos, mientras que el ERA no lo fue. Adicionalmente, el ERA extermina ratones de dos semanas de edad administrados intra cerebralmente (i.e.), como se demostró en las prueba de animales. Estas observaciones plantean preguntas de la relación entre estas dos cepas de RV y los efectos potenciales de las alteraciones sutiles. A partir de la comparación de secuencia de genoma viral completa, el ERA y SAD-B19 comparten identidad de nucleótidos extremadamente alta y homologías de aminoácido. Para poner en claro la base genética de la inmunogenicidad y patogenicidad de estas cepas altamente relacionadas del virus de rabia, se desarrolló un sistema de genética inversa eficiente para el ERA, que difiere de los sistemas de genética inversa previamente reportados para el virus de rabia . El sistema de genética inversa de rabia divulgado en la presente es sutil para una variedad de propósitos, incluyendo: (1) para atenuar el virus de ERA en una manera definida para el desarrollo de vacuna; (2) para producir los vectores de virus de ERA para expresar las ORFs (por ejemplo, en el contexto de las composiciones terapéuticas, tales como vacunas y terapia de genes); (3) para definir la base genética de la patogénesis de ERA RV; y (4)· para determinar los efectos biológicos de las diferencias genéticas entre los virus de ERA y SAD. El sistema de genética inversa tiene algo o todo de las siguientes características, esquemáticamente ilustradas en el FIG. 1A que utilizan el cDNA antigenómico de la cepa ERA ejemplar. Este sistema está basado en un plásmido de transcripción de longitud completa más una pluralidad de plásmidos auxiliares (por ejemplo, cinco plásmidos auxiliares). Los plásmidos auxiliares codifican las proteínas N, P, L y opcionalmente la proteína G, así como la T7 polimerasa. Aunque la proteína G no es necesaria para el rescate del virus, mejora la eficiencia de recuperación del virus o el desarrollo del virus cando se incluyen a transfección . La transcripción involucra tanto la RNA polimerasa II dependiente de RNA celular, que es disponible en las células de mamífero, y la T7 RNA polimerasa, que se suministra por los plásmidos pNLST7. Las polimerasas dobles dan por resultado que la eficiencia de recuperación del virus sea tanto alta como estable. En el plásmido de transcripción, las ribozimas de de cabeza de martillo y el virus delta de hepatitis flanquean un cDNA antigenómico de virus de rabia (por ejemplo, cepa de ERA) , que permiten la producción de los extremos 5' y 3' auténticos del vRNA antigenómico por la transcripción. Los primeros diez nucleótidos de la secuencia de de cabeza de martillo se diseñan para ser complementarios a los primero diez nucleótidos de la secuencia genómica antisentido. Por ejemplo, los primeros diez nucleótidos de la secuencia de de cabeza de martillo para el cDNA antigenómico de ERA son: TGTTAAGCGT (SEQ ID NO: 19) . Se han establecido dos construcciones de T7 RNA polimerasa modificada, que soportan la recuperación del virus más eficientemente que la T7 RNA polimerasa de tipo silvestre aplicada previamente. Una T7 RNA polimerasa ha sido mutada del primer ATG a A . La segunda T7 RNA polimerasa tiene una señal de localización nuclear de ocho aminoácido (NLS) derivado del antigeno T grande virus SV40 fusionado después del primer ATG de T7 parental: ATG CCA AAA AAG AAG AGA AAG GTA GAA (SEQ ID NO: 20) . El NLS es subrayado. La adición del NLS da por resultado la T7 RNA polimerasa que está presente predominantemente en el núcleo. Después del mecanismo de transfección del plásmido modificado con NLS, el complejo de reactivo de DNA/transfección se enlaza a la superficie de célula. A través de la endocitosis, el complejo se toma en el endosoma/lisosoma , y el DNA se libera en el citosol. En la ausencia del NLS, la mayoría de los plásmidos transíectados son retenidos en el citosol y solo un porcentaje pequeño del DNA liberado alcanza el núcleo, donde se transcribe en RNA. Después de la síntesis de proteína, la NLST7 RNA polimerasa se transporta de regreso al núcleo celular, y los plásmidos auxiliares (con promotores T7/CMV) en el núcleo serán transcritos por tanto la NLST7 como la polimerasa celular II. Así, más mRNAs de los plásmidos auxiliares y cRNA de pTMF de longitud completa o sus derivados se sintetizaron y dieron por resultado eficiencia alta de la recuperación del virus. Después de la expresión inicial del NLST7 por el promotor de CMV, la NLST7 polimerasa se enlaza a pT7 para la transcripción del gen NLST7. A través de la modificación de los transcriptos en el núcleo, se sintetiza más NLST7 mRNA, dando por resultado más expresión de la NLST7 polimerasa. La pT7 de la NLST7 polimerasa así como también de la unidad de transcripción antigenómica de longitud completa está bajo el control de la NLST7 polimerasa, que actúa como un "autogen". El mecanismo de autogen de la NLST7 RNA polimerasa se ilustra en la FIG. 2. Después de la expresión de la T7 RNA polimerasa en el núcleo, las construcciones de T7 transfectadas continúan transcribiendo la plantilla de RNA de longitud completa para la encapsidación de la proteína N y/o el enlace de la proteína L, que aumenta la eficiencia de recuperación del virus. La T7 polimerasa, y todos los otros plásmidos, excepto el plásmido pTN que codifica la proteína N, se colocan bajo control de los elementos reguladores transcripcionales tanto CMV como T7. El ácido nucleico que codifica la proteína N está bajo el control de un promotor T7 y se traduce en manera independiente de terminación basada sobre un IRES (Sitio de Entrada De Ribosoma Interno) . La RNA polimerasa II celular sola puede ayudar a la recuperación del RV si todos los plásmidos se clonaron bajo el control del promotor de CMV (19). En el sistema de genética inversa de ERA divulgado en la presente, solo el pTN está bajo el control del promotor de T7 y se tradujo en una manera independiente de terminación. Todas las otras construcciones están bajo el control de los elementos reguladores transcripcionales tanto de CMV como el T7. Típicamente, el RV, la síntesis N es abundante y la relación entre N, P y L es de aproximadamente 50:25:1. Para imitar la transcripción del tipo silvestre y ensamble en la genética inversa de RV; la expresión N debe ser la más alta. Con la ayuda de al NLST7 polimerasa y el modo de traducción de IRES, la proteína N se expresó eficientemente después de la transfección del plásmido. Esto reduce la competición para transcripción con los genes de mantenimiento en las células hospederas, debido a que la señal de iniciación de transcripción T7 no existe en las células de mamífero y da por resultado la eficiencia incrementada de la transcripción de T7. Para aumentar la producción de las proteínas virales, los plásmidos auxiliares se pueden construir para incorporar una secuencia Kozak que ha sido optimizada para la eficiencia de traducción para cada secuencia de codificación de proteínas. Las secuencias Kozak optimizadas ejemplares se muestran en la Tabla 2. Tabla 2: Secuencias Kozak optimizadas.

CMV/T7 simboliza el promotor de CMV adelante de un promotor de pT7. El HdRz indica una ribozima de de cabeza de martillo y HDVRz es la ribozima del virus delta de hepatitis. El pTMF es el plásmido de longitud completa, y el pTN, pMP, pMG, pML y pNLST7 son plásmidos auxiliares. Después de cinco días de postransfección en el sistema de genética inversa de ERA, el virus rescatado se desarrolla confiable y repetidamente a 10 ffu/ml sin amplificación adicional. X. Virus Derivados El mecanismo completo de la patogenicidad del virus de rabia no ha sido caracterizado completamente, haciendo el diseño de vacuna racional problemático. Por ejemplo, la glicoproteina de RV surge para desempeñar una función tanto en la patogenicidad e inmunogenicidad del virus de rabia. Las mutaciones (tal como en la posición 333 de la glicoproteina) da por resultado el virus que no causa infección letal en ratones adultos (Ito y colaboradores, Microl . Immunol. 38, 479-482, 1994; Ito y colaboradores, J. Virol. 75, 9121-9128, 2001). Sin embargo, la sobreexpresión de la glicoproteina de RV ha sido mostrada que conduce al aumento de la apoptosis y respuesta inmune antiviral (Faber y colaboradores, J. Virol. 76, 3374-3381, 2002). Asi la cepa de virus de ERA con una proteina G modificada (por ejemplo, suprimida, sustituida con aminoácido) podría ser una cepa particular para el desarrollo de la vacuna. Los virus de rabia recombinantes con propiedades favorables se pueden diseñar utilizando el sistema de genética inversa divulgado en la presente. Los virus recombinantes ejemplares divulgados en la presente incluyen, además de la cepa de ERA parental, el ERA sin la región Psi (ERA-), ERAgreenl (gen fluorescente verde insertado en la región de Psi), ERAgreen2 (gen fluorescente verde clonado en la región intergénica P-M) , ERA2g (que contiene una copia extra de G en la región de Psi) , ERAg3 (G mutado en el aminoácido 333) , ERA2g3 (que contiene una copia extra de G mutado en la región de Psi), ERAgm (genes M y G cambiados en el genoma) , y ERAgmg (dos copias de G en la construcción de ERAgm rearreglada ) . Estas cepas ejemplares se ilustran esquemáticamente en la FIG. 3. Las cepas modificadas que tienen las glicoproteinas suprimidas y/o mutadas son particularmente adecuadas para el uso como composiciones inmunogénicas para el tratamiento pre y post exposición el virus de rabia debido a que tales virus son incapaces de extenderse entre las células y causar enfermedad. Adicionalmente, los virus modificados tal como ERA2g3, que sobreexpresan la proteina G debido a una duplicación de las secuencias que codifican una glicoproteina mutada se predice la apóptosis aumentada e inducen una respuesta inmune antiviral incrementada. Por ejemplo, después de la inoculación intracerebral e intramuscular de los ratones con una supresión de G (ERA-G) , no se observaron eventos adversos. Por otra parte, el ERA-G protegió a los ratones del cambio letal por una cepa de RV callejera. Asi, el ERA-G surge para ser una cepa más segura que el ERA para el desarrollo de la vacuna. Adicionalmente, la mutación de arginina en la posición 333 del aminoácido de la ERA G a ácido glutámico (de los nucleótidos AGA ao GAG, como en las cepas ERAg3 y ERA2g3) da por resultado un virus atenuado. La atenuación se confirmó por la vía de pruebas de inoculación animal. Debido a la sobreexpresión de RV G da por resultado el aumento de la apóptosis y las respuestas inmunes antivirales, los virus atenuados tal como ERA2g3 que posee múltiples copias de G son particularmente favorables como candidatos de vacuna. El sistema para el desarrollo de la vacuna de rabia descrita en el presente no limita a modificaciones del gen G, pero es similarmente aplicable a cada una de las proteínas virales. Para facilitar un procedimiento sistemático para modificar los diversos componentes de proteína, el mapeo detallado de la patogenicidad se puede resolver mediante la genética inversa basada sobre los datos de secuencia presentados en la presente. El sistema de genética inversa descrita en la presente también permite a un sistema vector de virus de rabia para la expresión del gen extraño (heterólogo) . La modalidad no limitativa, descrita se basa sobre el virus ERA. Una unidad de transcripción extra se muestra en la presente que es funcional en dos ubicaciones diferentes después de la incorporación en el genoma de ERA RV . En una modalidad, una unidad de transcripción extra se incorpora en la posición de la región de psi (trans 1) . En una modalidad alternativa, una unidad de transcripción extra se inserta en la región intergénica RV P-M. En los virus de RNA negativos de una hebra, las secuencias distales 3' del genoma sirven principalmente como un promotor de transcripción, mientras que las secuencias de terminal 5' del genoma sirven como un promotor de replicación (Conzelmann y Schnell, J. Virol. 68:713-719, 1994; Finke y colaboradores, J, Virol. 71 :7281-7288, 1997) . Asi, la trans 2 ocupa una posición que da por resultado la transcripción más fuerte para conducir la expresión de ORFs que la trans 1. Asi, los vectores divulgados en la presente se pueden utilizar para modular la expresión de un ORFs heterólogo a un nivel deseado, simplemente al seleccionar la posición en la cual el ORF se inserta en el vector. Por ejemplo, cuando los niveles altos de expresión de una proteina son deseados, la trans 2 es típicamente una posición ideal para la inserción del ORF heterólogo. Similarmente , sin más niveles moderados de expresión son deseados, el ORF heterólogo se puede insertar en la trans 1. Los niveles de expresión óptimos para cada ORF y para aplicaciones particulares se pueden determinar por uno de habilidad en la técnica sin la experimentación indebida. Así, los vectores virales proporcionados en la presente son excelentes construcciones para la inserción del gen extraño y la expresión, como se demuestra en la presente con respecto a la expresión del gen de proteina fluorescente verde. Aunque la utilidad y eficacia de los vectores divulgados se demuestra con respecto al GFP, debe ser notado que los vectores son igualmente adecuados para expresar cualquier gen u ORF de interés. Como se nota, el sistema de expresión heterólogo basado en rabia proporcionado en la presente se puede utilizar para expresar cualquier proteina (s) extraña (heteróloga ) . Se contempla particularmente, a manera de ejemplo, que tales genes heterólogos son de otro organismo patogénico, tal como otros virus patogénicos, por ejemplo el virus de SARS, virus de Nipah, etc. Además, los vectores divulgados se pueden utilizar para el suministro de otros genera terapéuticos, que incluyen, por ejemplo, que codifican las proteínas del valor terapéutico o las moléculas de RNA funcionales, tales como siRNAs. XI. Composiciones Farmacéuticas e Inmunoestimulantes y Usos de las Mismas Las composiciones farmacéuticas que incluyen virus rescatados atenuados o fijos, secuencias de ácido nucleico de virus o polipéptidos de virus que comprenden por lo menos un epítope de virus también se abarcan por la presente descripción. Estas composiciones farmacéuticas incluyen una cantidad terapéuticamente efectiva de uno o más compuestos activos, tal como un virus atenuado o fijo, unos polipéptidos de virus que comprenden por lo meno un epitope de virus, una o más moléculas de ácido nucleico que codifican estos polipéptidos , en conjunción con un portador farmacéuticamente aceptable. Se contempla que en ciertas modalidades, las secuencias de ácido nucleico de virus o los polipéptidos de virus que comprenden múltiples epitopes de virus serán útiles en preparar las composiciones farmacéuticas de la descripción. Se divulgan en la presente sustancias adecuada para el uso como composiciones inmunoestimulantes para la inhibición o tratamiento (ya sea pre-exposición o posexposición) de una infección de virus, por ejemplo, una infección de virus de rabia. En una modalidad, una composición inmunoestimulante contiene un virus rescatado atenuado o fijo ( recombinante) . En otra modalidad, la composición contiene un polipéptido de virus aislado o recombinante que incluye por lo menos un epitope de virus (tal como una proteina G de virus de rabia) . En una modalidad adicional, la composición inmunoestimulante contiene un vector de ácido nucleico que incluye por lo menos una molécula de ácido nucleico de virus descrito en la presente, o que incluye una secuencia de ácido nucleico que codifica por lo menos un epitope de virus. En un ejemplo no limitativo, especifico, una secuencia de ácido nucleico que codifica por lo menos un epitope de virus se expresa en una unidad transcripcional , tal como aquellas descritas en la solicitud de PCT publicada Nos. PCT/US99/12298 y PCT/US02/10764 (ambas de las cuales se incorporan en la presente en su totalidad) . Los virus inmunoestimulantes , polipéptidos de virus, construcciones o vectores que codifican tales polipéptidos, se combinan con un portador o vehículo farmacéuticamente aceptable para la administración como una composición inmunoestimulante a sujetos humano o animal. Las formulaciones inmunogénicas se pueden presentar convenientemente en forma de dosificación unitarias y se preparan utilizando técnicas farmacéuticas convencionales. Tales técnicas incluyen la etapa de llevar en asociación el ingrediente activo' y el portador (es) o excipiente ( s ) farmacéutico ( s ) . En general, las formulaciones se preparan al llevar uniforme íntimamente en asociación el ingrediente activo con portadores líquidos. Las formulaciones adecuadas para la administración parenteral incluyen soluciones de inyección estériles acuosas y no acuosas que pueden contener antioxidantes, soluciones reguladoras, bacterioestatos y solutos que vuelven a la formulación isotónica con la sangre del recipiente propuesto; y las suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión y agentes espesantes. Las formulaciones pueden estar presentes en contenedores de dosis unitaria o de multidosis, por ejemplo, ampolletas y frasquitos de vidrio sellados, y se pueden almacenar en una condición deshidratada por congelación ( liofilizada ) que requiere solo la adición de un portador liquido estéril, por ejemplo, agua para inyecciones, inmediatamente previo al uso. Las soluciones de inyección extemporáneas y suspensiones se pueden preparar de polvos estériles, gránulos y tabletas comúnmente utilizados por uno de habilidad ordinaria en la técnica. En ciertas modalidades, las formulaciones de dosificación unitaria son aquellas que contienen una dosis o unidad, o una fracción apropiada de la misma, del ingrediente administrado. Debe ser entendido que además de los ingredientes particularmente mencionados en lo anterior, las formulaciones abarcadas en la presente pueden incluir otros agentes comúnmente utilizados por una de habilidad ordinaria en la técnica. Las composiciones proporcionadas en la presente, que incluyen aquellas para el uso como composiciones inmunoestimulantes , se pueden administrar a través de rutas diferente, tales como oral, que incluyen bucal y sublingual., rectal, parenteral, aerosol, nasal, intramuscular, subcutánea, intradérmica y tópica. Se pueden administrar en formas diferentes, que incluyen pero no se limitan a soluciones, emulsiones y suspensiones, microesferas , partículas, micropartículas, nanopartículas y liposomas.

El volumen de administración variará dependiendo de la ruta de administración. A manera de ejemplo, las inyecciones intramusculares pueden variar de aproximadamente 0.1 mi a aproximadamente 1.0 mi. Aquellos de habilidad ordinaria en la técnica sabrán los volúmenes aproximados para las rutas diferentes de administración. Un desarrollo relativamente resiente en el campo de los compuestos inmunoestimulantes (por ejemplo, vacunas) es la inyección directa de las moléculas de ácido nucleico que codifican antigenos de péptido (ampliamente descrito en Janeway & Travers, Immunobiology: The Immune System In Health and Disease, página 13.25, Garland Publishing, Inc., Nueva York, 1997; y McDonnell & Askari, N. Engl. J. Med. 334:42-45, 1996) . Los vectores que incluyen las moléculas de ácido nucleico descritas en la presente, o que incluyen una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de virus que comprende por lo menos un epitope de virus se puede utilizar en tales métodos de vacunación de DNA. Asi, el término "composición inmunoestimulante" como se utiliza en la presente también incluye vacunas de ácido nucleico en las cuales una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de virus que comprende por lo menos un epitope de virus se administra a un sujeto en una composición farmacéutica. Para la inmunización genética, los métodos de suministro adecuados conocidos por aquellos de habilidad en la técnica incluyen inyección directa del DNA de plásmido en los músculos (Wolff y colaboradores, Hum. Mol. Genet. 1:363, 1992), suministro de DNA formado en complejo con portadores de proteina específicos (Wu y colaboradores, J. Biol. Chem. 264: 16985, 1989), co-precipitación de DNA con fosfato de calcio (Benvenisty y Reshef, Proc. Nati Acad. Sci 83:9551, 1986), encapsulación de DNA en liposomas (Kaneda y colaboradores, Science 243:375, 1989), bombardeo de partículas (Tang y colaboradores, Nature 356:152, 1992; Eisenbraun y colaboradores, DNA Cell Biol. 12:791, 1993), e infección in vivo utilizando vectores retrovirales clonados (Seeger y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci 81:5849, 1984). Similarmente, las preparaciones de vavuna de ácido nucleico se pueden administrar por la vía del portador viral. La cantidad de compuesto inmunoestimulante en cada dosis de una composición inmunoestimulante se seleccionan como una cantidad que induce una respuesta inmunoestimulante o inmunoprotectora sin efectos secundarios adversos, significantes. Tal cantidad variará dependiendo de que inmunógeno específico se emplea y como se presenta. Las inyecciones iniciales pueden variar de aproximadamente 1 µq a aproximadamente 1 mg, con algunas modalidades que tiene un intervalo de aproximadamente 10 ^ig a aproximadamente 800 ug, y todavía otras modalidades varían de aproximadamente 25 ^ig a aproximadamente 500 ?^ . Después de una administración inicial de la composición inmunoestimulante, los sujetos pueden recibir una o varias administraciones de refuerzo, adecuadamente espaciadas. Las administraciones de refuerzo pueden variar de aproximadamente 1 µ? a aproximadamente 1 mg, con otras modalidades que tienen un intervalo de aproximadamente 10 µg a aproximadamente 750 µg, y todavía otras varían de aproximadamente 50 µ? a aproximadamente 500 µ? . Los refuerzos periódicos en intervalos de 1-5 años, por ejemplo tres años, pueden ser deseables para mantener los niveles deseados de inmunidad protectora. También se . contempla que las moléculas y composiciones inmunoestimulantes proporcionadas se pueden administrar en un sujeto indirectamente, al estimular primero una célula in vitro, la célula que se estimula después de administra al sujeto para inducir una respuesta inmune. Adicionalmente, las composiciones farmacéuticas o inmunoestimulantes o métodos de tratamiento se puede administrar en combinación con otros tratamientos terapéuticos. La preparación de los bocados de alimentos que contienen composiciones inmunoestimulantes también están dentro de la habilidad ordinaria de aquellos en la técnica. Por ejemplo, la preparación de bocados de alimentos que contienen vacunas de RV vivo se divulgan en Wandeler y colaboradores. (Rev. Infect. Dis. 10 (suppl. 4):649-653, 1988), Aubert y colaboradores (página 219-243,. in Lyssaviruses (Rupprecht y colaboradores, eds . ) , Springer-Verlag, Nueva York, 1994) y Fu y colaboradores . (páginas 607-617, in New Generation Vaccines (2nd Edit.) (Levine y colaboradores, eds.), Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1997), las descripciones completas de cada una de las cuales se incorporan en la presente por referencia. XII. Equipos También se proporcionan en la presente equipos útiles en la detección y/o diagnosis de la infección del virus, por ejemplo la infección con un virus de rabia u otro lyssavirus. Un ejemplo de un equipo de ensayo proporcionado en la presente es un polipéptido de virus recombinante (o fragmento del mismo) como un antigeno y un anticuerpo antihumano conjugado con enzima como un segundo anticuerpo. Ejemplos de tales equipos también pueden incluir uno o más sustratos enzimáticos. Tales equipos se pueden utilizar para probar si una muestra de un sujeto contiene anticuerpos contra una proteina específica de virus. En tal equipo, una cantidad apropiada de un polipéptido de virus (o fragmento del mismo) se proporciona en uno o más contenedores, o se mantiene sobre un sustrato. Un polipéptido de virus se puede proporcionar en una solución acuosa o como un polvo deshidratado por congelación o liofilizado, por ejemplo. El(s) contenedor ( es ) en el cual el polipéptido ( s ) de virus se suministra o puede ser cualquier contenedor convencional que sea capaz de contener la forma suministrada, por ejemplo, tubos de microfuga, ampolletas o botellas. La cantidad de cada polipéptido suministrado en el equipo puede ser cualquier cantidad apropiada, y puede depender del mercado al cual el producto se dirige. Por ejemplo, si el equipo está adaptado para el uso de investigación o clínico, la cantidad de cada polipéptido proporcionado probablemente será una cantidad suficiente para varios ensayos. Las guías generales para determinar las cantidades apropiadas se pueden encontrar, por ejemplo, en Ausubel y colaboradores, (eds.), Short Protocols ín Molecular Biology, John Wiley y Sons, Nueva York, NY, 1999 y Harlow y Lañe, Using Antibodies: A Laboratoiy Manual, CSHL, Nueva York, 1999. Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar ciertas características y/o modalidades particulares. Estos ejemplos no deben ser considerados para limitar la invención a las características o modalidades particulares descritas. EJEMPLOS Ejemplo 1: Secuenciación del ERA RV Este ejemplo proporciona una descripción de un método para secuenciar el genoma de longitud completa de un rabdovirus, particularmente en este caso un virus de rabia.

La cepa ERA de virus de rabia se obtuvo del archivo CDC y se propagó en células de riñon de hámster bebé (BHK-21) . El virus se recolectó de cuatro días de infección a 37°C, en una incubadora de CO2 al 5% y se purificó. Brevemente, el sobrenadante celular se recolectó y se centrifugó a 2,000 rpm durante 15 minutos para remover los restos celulares. El sobrenadante claro se sometió a centrifugación adicional a 18,000 rpm durante 1 hora. La pelotilla se resuspendió en PBS y se sometió a la extracción de RNA genómico de rabia. El RNA total de las células BHK21 infectadas con ERA se extrajo con reactivo de Trizol (GIBCO Invitrogen) de acuerdo al protocolo recomendado por el fabricante. El RNA genómico de ERA se purificó del sobrenadante del virus de ERA concentrado con un equipo de RNA viral puro alto de Roche. La integridad del RNA genómico de ERA purificado se verificó mediante la electroforesis en y el manchado de Northern por las sondas de hibridación N, P, G, y M. Brevemente, 5 µ? del RNA genómico se cargó en un gel de RNA desnaturalizado y se transfirió a una membrana de nylon para la hibridación. La sonda se marcó utilizando el equipo de marcación de DNA Dig de Roche, de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Los 11 nucleótidos conservados del antigenoma 5' del virus de rabia se designaron como un cebador para la transcripción inversa. La reacción de RT se llevó a cabo con un equipo de síntesis de cDNA de una primera hebra de Invitrogen. El cDNA completo del genoma de ERA se confirmó por el manchado de Northern utilizando la hibridación de sonda N, P, M, y G así como los nucleótidos conservados 11 como las sondas de oligonucleótidos marcadas pro Digoxin. Dos conjuntos de cebadores se eligieron para las reacciones de PCR, las cuales amplifican el genoma de ERA completo en dos fragmentos contiguos. Un conjunto de cebadores se compone de los nucleótidos 11 en el extremo del antígeno 5', Le5: ACGCTTAACAA (SEQ ID NO: 24) y BLp3: GTCGCTTGCTAAGCACTCCTGGTA (SEQ ID NO: 25) . Otro conjunto contiene los nucleótidos complementarios 11 en el extremo de genoma 5' Le3: TGCGAATTGTT (SEQ ID NO: 26) y BLp5 CCAG GAGTGCTTAGCAAGCGACCT (SEQ ID NO: 27) . Los cebadores Blp3 y Blp5 se localizan en una región relativamente conservada en el genoma del virus de rabia. Los fragmentos de PCR se purificaron y se clonaron en el vector TOPO adquirido de Invitrogen. La secuenciación se condujo en un secuenciador ABI 310 y la secuencia se ensambló por el software BioEdit o el software SeqMerge de Accelrys en el medio ambiente de GCG . La secuencia alineada completa del genoma de ERA se proporciona en SEQ ID NO: 1. Las posiciones de las secuencias de codificación de proteínas individuales se proporcionan en la Tabla 3, con referencia a SEQ ID NO: 1. Las secuencias de aminoácido de las proteínas N, P, M, G y L se proporcionan en SEQ ID NOs : 2 al 6, respecti amente. Tabla 3: Posiciones de las secuencias de codificación de las proteínas de la cepa ERA del virus de rabia Este método se puede utilizar para el virus tanto de rabia como relacionados a la rabia. Los virus de rabia y relacionados a la rabia tiene por lo menos siete tipos de especies putativas. El método de secuencia proporcionado se puede utilizar también para otros virus de RNA de hebra negativa. Esto es debido a que casi todos los genomas del virus de RNA de hebra negativa tienen aproximadamente 12 nucleótidos conservados en ambos extremos distales, que pueden servir similarmente como cebadores para RT-PCR. Los cebadores por supuesto serán diferentes para las especies virales diferentes, y la secuencia de los cebadores específicos se puede determinar por uno de habilidad ordinaria basados sobre las enseñanzas en la presente. Ejemplo 2 : Construcción de los plásmidos para un sistema de genética inversa para el virus de rabia Este ejemplo describe el diseño y el desarrollo de un sistema de genética inversa para el virus de rabia. La cepa ERA del virus de rabia se obtuvo del ATCC y se preparó como se describe (Wu y colaboradores, J. Virol. 76, 4153-4161, 2002). Para obtener el cDNA del virus de longitud completa de genoma del virus, las células BSR (un clon de las células BHK, de riñon de hámster bebé) se infectaron con la cepa del virus de ERA y se cultivaron en el medio esencial mínimo de Dulbecco suplementado con 10% de suero bovino fetal. Los sobrenadantes se recuperaron y se sometieron a centrifugación a 22,000 g durante 1 hora. Las pelotillas del virus se recolectaron para la purificación de RNA genómico viral mediante el uso de un equipo de extracción del virus de RNA adquirido de Qiagen (Valencia, CA) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. La integridad del RNA genómico viral se confirmó mediante la electroforesis con gel. El cDNA genómico viral se transcribió con el equipo de síntesis de de primera hebra de Invitrogen (Carlsbad, CA) . La mezcla de reacción de transcripción inversa (RT) se aplicó a la amplificación mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para la síntesis del cDNA genómico viral de longitud completa, genes N, P, G y L, respectivamente. Para ensamblar el cDNA genómico del virus de longitud completa, se construyó un plásmido de pTMF en cuatro etapas secuénciales como se ilustra esquemáticamente en la FIG. IB. La transcriptasa inversa Superscript III y la polimerasa pfx de platino de lectura de prueba (Invitrogen, Carlsbad, CA) se aplicaron para la síntesis transcripta de cDNA y las amplificaciones de PCR consecutivas. Para las reacciones de transcripción inversa, 1 µ? de RNA genómico purificado se utilizó en la mezcla de reacción de RT y se incubó a 50°C durante 80 min, seguido por el calentamiento a 85°C durante 5 minutos para inactivar el Superscript III. Después de la reacción de RT, 1 unidad de RNaseH se adicionó para digerir el RNA de plantilla en los híbridos de cDNA-RNA. Para generar el cDNA de virus de longitud completa, los fragmentos de sobreposición se amplificaron mediante la RT-PCR como sigue: Fragmento 1 (Fl) fue RT-PCR amplificado con los cebadores: Le5-Kpn ( CCGGGTACCACGCTTAAC AACCAGATCAAAGA; SEQ ID NO: 28, el sitio de reconocimiento Kpn 1 subrayado) y Le3-Blp (TAGGTCGCTTGCTAAGCACTCCTGGTAGGAC ; SEQ ID NO: 29, sitio de reconocimiento Blpl subrayado) . Fragmento 2 (F2) fe el RT-PCR amplificado con los cebadores: Tr5-Blp (GTCCTACC GGAGTGCTTAGCAAGCGACCTA ; SEQ ID NO: 30, sitio de reconocimiento de Blpl subrayado) y Tr3-Pst (AAAACTGCAGACGCTTAACAAATAAACAACAAAA; SEQ ID NO: 31, sitio de reconocimiento Pstl subrayado) . Después de la síntesis exitosa de los fragmentos anteriores, el Fl digerido por las enzimas de restricción pnl y Blpl se sometió a la purificación con gel y se clonó al fagemido pBluescriptIISK (+) (Stratagene, La Jolla, CA) para formar el plásmido pSKFl . El fragmento F2 purificado en gel, cortado por Blpl y Pstl se clonó consecutivamente al plásmido pSKFl para formar el cDNA antigenómico viral de longitud completa. La ribozima de cabeza de martillo (oligol, CAAGGCTAGCTGTTAAGCGTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACTATAGGAAAGGAAT TCCTATAGTCGGTACCACGCT : SEQ ID NO: 32, sitios de reconocimiento de Nhel y Kpnl subrayados; Oligo2, AGCGTGGTACCGACTATAGGAATTCCTTTCCTATAGTTTCGTCCTCACGGACTCATCAGA CGCTTAACAGCTAGCCTTG ; SEQ ID NO: 33, sitios de reconocimiento de Kpnl y Nhel subrayados) se sintetizaron conteniendo un sitio de reconocimiento Nhel en el extremo 5' y un sitio Kpn 1 en el extremo 3' . Esto se fusionó adelante del extremo 5' del fragmento Fl . Una ribozima del virus delta de hepatitis (oligo3, GACCTGCAGGGGTCGGCATGGCATCTCCACCTCCTCGCGGTCCGACCTGGGCATCCGAA GGAGGACGCACGTCCACTCGGATGGCTAAGGGAGGGCGCGGCCGCACTC: SEQ ID NO: 34, sitios de reconocimiento de Pstl y Notl subrayados; Oligo4 , GAGTGCGGCCGCGCCCTCCCTTAGCCATCCGAGTGGACGTGCGTCCTCCTTCGGATGCC CAGGTCGGACCGCGAGGAGGTGGAGATGCCATGCCGACCCCTGCAGGTC: SEQ ID NO: , sitios de reconocimiento de Notl y Pstl subrayados) (Symons, Annu. Rev. Biochem. 61: 641-671, 1992) se sintetizó, teniendo un sitio Pstl en su extremo 5' y un sitio Notl en su extremo 3', y se fusionó al extremo 3' del fragmento F2. El sitio de reconocimiento Kpnl conectivo, entre la ribozima de cabeza de martillo y del fragmento Fl, y el sitio Pstl entre el fragmento F2 y la ribozima del virus delta de hepatitis, se suprimieron por la mutagénesis dirigida de sitio. El cDNA antigenómico viral de longitud completa se intercaló por la ribozima de cabeza de martillo y del virus delta de hepatitis. Este se removió y se clonó al fagemido pBluescriptIISK (+) para hacer una construcción de pSKF. El cDNA antigenómico viral completo con dos ribozimas se fusionó corriente abajo del sitio de iniciación de transcripción T7 bajo el control del promotor temprano inmediato de CMV en el plásmido pcDNA3.1/Neo (+) (Invitrogen, Carlsbad, CA) . Esta última etapa terminó la construcción del plásmido pTMF. El genoma viral de ERA de tipo silvestre incluye un tracto de poliA de ocho residuos (poliA8) en la región intergénica entre las regiones G y Psi. Para distinguir el virus ERA (rERA) de la cepa parental, un estiramiento de siete A (poli A7) se introdujo a la construcción de pTMF mediante la supresión de un A en lugar del poli A8. Después de que el virus rERA se recuperó, el RT-PCR se realizó y los datos de secuencia subsecuentes confirmaron la existencia del marcador de secuencia poli A7 introducido. Plásmido pTN: El gen N se amplificó por la RT-PCR con los cebadores (5N: ACCACCATGGATGCCGACAAGATTG : SEQ ID NO: 36, sitio de reconocimiento de Ncol y el codón de inicio subrayado; y 3N : . GGCCCATGG rTATGAGTCACTCGAATATGTCTT : SEQ ID NO: 37, sitio de reconocimiento de Ncol y el codón de retención subrayado) y se clonó al plásmido pCITE-2a(+) (Cap-Independent Translation Enhancer) (Novagen, Madison WI). Plásmido pMP : El gen P se amplificó mediante la RT- PCR con los cebadores (5P: TTGGJLACCACCATGAGCAAGATCTTTGTCAATC; SEQ ID NO: 38, sitio de reconocimiento de Kpnl y el codón de inicio subrayado; y 3P: GGAGAGGAATTC riAGCAAGATGTATAGCGATTC : SEQ ID NO: 39, sitio de reconocimiento de EcoRl y el codón de detección subrayado) y se clonó al plásmido pcDNA3.1/Neo (+) . Plásmido pMG: El gen G se amplificó mediante la RT-PCR con los cebadores (5G: TTGGTACCACGArGGTTCCTCAGGCTCTCCTG : SEQ ID NO: 40, sitio de reconocimiento de Kpnl y codón de tensión subrayado; y 3G: AAAACTGCAG rCACAGTCTGGTCTCACCCCCAC : SEQ ID NO: 41, sitio de reconocimiento Pstl y codón de tensión subrayado) y se clonó al plásmido pcDNA3.1/Neo ( + ) · Plásmido pML: El gen L se amplificó mediante la RT-PCR con los cebadores (5L: ACCGCTAGCACCACCATGCTCGATCCTGGAGAGGTC : SEQ ID NO: 42, sitio de reconocimiento Nhel y codón de tensión subrayado; y 3L: AAAACTGCAG rCACAGGCAACTGTAGTCTAGTAG : SEQ ID NO: 43, sitio de reconocimiento Pstl y codón de tensión subrayado) y se clonó al plásmido pcDNA3,l/Neo (+) . Plásmdio pT7 : DNA genómico de las bacterias BL-21 (Novagene, Madison, WI) se extrajo con el Equipo de Tejido de Dneasy (Qiagen, Valencia, CA) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. El gen de T7 RNA polimerasa se amplificó del DNA genómico purificado mediante la PCR con los cebadores (5T7: TCGCTAGCACCACCAFGAACACGATTAACATCGCTAAG : SEQ ID NO: 44, sitio de reconocimiento Nhel y codón de tensión subrayado; y 3T7: GATGAATTC rrACGCGAACGCGAAGTCCGACTC : SEQ ID NO: 45, sitio de reconocimiento EcoRl y codón de tensión subrayado) y se clonó al plásmido pcDNA3.1/Neo (+) . Plásmido pNLST7 : Una señal de ubicación nuclear de ocho aminoácido (NLS) , derivada del antigeno T grande SV40, se adicionó a la terminal N de la T7 RNA polimerasa mediante la amplificación con PCR, utilizando el plásmido pT7 como la plantilla, con los cebadores (5T7NLS: TCGCTAGCCACCATGCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTAGAAAACACGATTAACATCGCTA AGAAC; SEQ ID NO: 46, NLS subrayado y cebador 3T7) . El fragmento amplificado se designó NLST7 y se clonó al pcDNA3.1/Neo (+) para formar la construcción pNLST7. Plásmido pGFP: El Plásmido de Protein Fluorescente Verde onster (GFP) phMGFP se adquirió de Promega (Madison, WI) . El gen GFP se amplificó por la PCR con los cebadores (GFP5: AAAACTGCAGGCCACCArGGGCGTGATCAAG ; SEQ ID NO: 47, sitio de reconocimiento Pstl y codón de inicio subrayado; y GFP3: CCGCTCGGTACCTA!Z /IGCCGGCCTGGCGGG; SEQ ID NO: 48, sitio de reconocimiento Kpnl y codón de tensión subrayado) y se clonó al plásmido pcDNA3.1/Neo (+) . Todas las construcciones de plásmido se secuenciaron por lo menos tres veces para confirmar la ausencia de mutaciones o supresiones inesperadas después de la clonación, la mutagénesis directa de sitio, o la supresión del gen. Adicionalmente , la presencia de una secuencia marcadora que consiste de un tractor de poliA que tiene siete residuos de adenosina antes que los ocho residuos observados en el genoma del ERA de tipo silvestre entre la glicoproteina y la región Psi se confirmó. Ejemplo 3: Expresión de la T7 RNA polimerasa en las células BSR Este ejemplo demuestra que la adición de una señal de localización nuclear a la polimerasa RNA de fago T7 dirige la expresión de la polimerasa en el núcleo de las células transíectadas . La transfección de las células BSR se realizó como se describe por Wu, y colaboradores, (J. Virol. 76, 4153-4161, 2002). Brevemente, las células BSR cerca del 80% de confluencia en una placa de seis cavidades se transfectó con 0.5 µg del plásmido pT7 o pNLST7 por cavidad, respectivamente. A 48 horas después de la transfección, las células se fijaron con 80% de acetona enfriada durante 1 hora y secada a temperatura ambiente. El anticuerpo monoclonal de ratón contra la T7 RNA polimerasa y el conjugado de IgG-FITC de anti-ratón de cabra se adicionaron sucesivamente, y se lavaron en el procedimiento de manchado fluorescente indirecto de dos etapas. Los resultados se registraron después de la microscopía de UV. La T7 RNA polimerasa expresada de pT7 sin una señal de localización nuclear se observó primeramente en el citosol, mientras que la NLST7 polimerasa que incluye una señal de localización nuclear estuvo presente predominantemente en el núcleo de las células. Estos resultados indicaron que la adición de un NLS dirigió efectivamente la T7 RNA polimerasa al núcleo de las células transíectadas . Ejemplo 4: Establecimiento de la linea celular BSR de glicoproteina de ERA constitutivamente expresada Este ejemplo describe el diseño y producción de una línea celular BHK que expresa constitutivamente la glicoproteina de ERA. Una línea celular BHK que expresa la glicoproteina de ERA se construyó utilizando el sistema Flp-In™ (Invitrogen, Carlsbad, CA) . Brevemente, las células Flp-In™-BHK (que contiene un sitio objetivo de recombinación Flp integrado solo) se desarrollaron aproximadamente 20% de confluencia en una placa de seis cavidades y se mantuvo en medio de D EM común, suplementario con 100 µ?/p?? de Zeocina, antes de la transfección . El gen G de ERA se amplificó mediante la PCR utilizando el plásmido pMG como plantilla con los cebadores EF5G5 (CACCATGGTTCCTCAGGCTCTCCTG; SEQ ID NO: 49) y EF5G3 (TCACAGTCTGGTCTCACCCCCAC; SEQ ID NO: 50), y se clonó a un vector pEF5/FRT/V5-D-TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA) para crear la construcción pEFG. El plásmido pOG44 que expresa la FIp recombinasa conjuntamente con pEFG en la relación de 10: se co-transfectó a las células BHK-FIp-In™. Después de la transfección, las células se mantuvieron en DMEM sin Zeocina, pero con higromicina B a 400 µq/ml. Después de 48 horas, las células se separaron para que no más de 20% de confluencia ocurriera al siguiente día. Las células se desarrollaron en el medio selectivo de higromicina B a 37 °C durante aproximadamente una semana. La expresión de ERA G objetivo se detectó por el manchado fluorescente indirecto con el anticuerpo monoclonal anti-G humando y el conjugado IgG-FITC de cabra. La linea celular que expresa constitutivamente se designó como BHK-G, y se utilizó para el crecimiento del virus de ERA-G. Ejemplo 5: Modificación Definida de la Cepa Evelyn-Rokitnicki-Abelseth (ERA) del Virus de Rabia Además de la cepa del virus de ERA parental descrito en lo anterior, la cepa de virus derivadas se desarrollaron utilizando el sistema de genética inversa divulgado en la presente. Varios virus modificados ejemplares se produjeron, particularmente ERA- (supresión de la región de psi completa), ERAgreenl (gen de proteina fluorescente verde insertado en la región psi del genoma viral de ERA ) , ERAgreen2 (gen de proteina fluorescente verde insertado en ,1a región intergénica de la fosfoproteina y la proteina de matriz), ERA2g (que contiene una copia extra de glicoproteina en la región psi), ERAg3 (con una mutación en el aminoácido 333 en la glicoproteina) , ERA2g3 (con una copia extra de glicoproteina mutada a Aa333 en la región psi) , ERA-G (con la glicoproteina suprimida) ERAgm (genes M y G cambiados en el genoma) y ERAgmg (dos copias de G en la construcción de ERAgm rearreglada ) . Estos derivados se ilustran esquemáticamente en la FIG. 3. AL optimizar las condiciones de crecimiento como se describe, todos los virus rescatados se obtienen en los títulos de virus de 109 a 1010 ffu/ml en tanto los matraces de cultivo de tejido como los bioreactores. Supresión del gen en mutagénesis dirigida de sitio en el sistema de genética inversa Supresión de la región Psi del genoma del ERA del virus de rabia La región Psi completa del genoma de ERA del virus de rabia se suprimió como sigue: El fragmento 3' ?? se amplificó utilizando el pTMF como plantilla mediante la PCR con los cebadores ( 5?? : CCCTCTGCAGTTTGGTACCGTCGAGAAAAAAACATTAGATCAGAAG: S EQ I D NO : 51, sitio de reconocimiento Pstl y Kpnl subrayados; y el cebador Le3-Blp) y se clonó al vector pCR-BluntlI - TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA) para la construcción del plásmido ???5?. El fragmento 5'?? se amplificó utilizando la misma plantilla mediante la PCR con los cebadores (SnaB5: ATGAACTTTCTACGTAAGATAGTG : SEQ ID NO: 52, sitio de reconocimiento SnaBl subrayado; y 3??: CAAACTGCAGAGGGGTGTTAGTTTTTTTCAAAAAGAACCCCCCAAG : SEQ ID NO: 53, sitio de reconocimiento Pstl subrayados) se clonó exitosamente para la parte superior del plásmido ???5? para terminar la construcción del plásmido ????. El fragmento recuperado por la digestión de la enzima de restricción SnaBl y Pstl del plásmido ???? sustituyó la contraparte en la construcción de pSKF para ser el plásmido ??????. El fragmento de DNA completo que contiene el cDNA genómico de ERA, digerido por el Nhel y Notl del plásmido pSKFA , se volvió a clonar al plásmido pcDNA3.1/Neo (+) para finalizar la construcción de ??????. Para la verificación de la cepa rescatada que carece de Psi, los cebadores Era-, diseñados que cubren la región Psi se aplicaron en la RT-PCR con el RNA total de las células BSR infectadas con ERA. Un fragmento de 400bp que corresponde a la región Psi se amplificó solo del virus de rERA, pero no de era. Los datos de secuencia verificaron la supresión completa de la región Psi. Supresión del gen de glicoproteína en el genoma de ERA del virus de rabia : El fragmento 5'??? se amplificó utilizando pSKF como plantilla mediante la PCR con los cebadores (SnaB5 y 3Ag: CAAACTGCAGAGGGGTGTTAGTTTTTTTCACATCCAAGAGGATC ; SEQ ID NO: 54) . Después de la digesión por las enzimas de restricción SnaBl y Pstl, este fragmento recuperado se clonó para reemplazar su contraparte en la construcción pSKFA . El fragmento 3'??? se amplificó utilizando la misma plantilla mediante la PCR con los cebadores (5Ag: CCTCTGCAGTTTGGTACCTTGAAAAAAACCTGGGTTCAATAG; SEQ ID NO: 55, y el cebador Le3-BIp) , y se clonó consecutivamente al pSKFA modificado, para reemplazar su contraparte. El fragmento final, recuperado por las enzimas de restricción SnaBl y Blpl se cortaron de este ?=?G?? sin el gen G, se volvieron a clonar al plásmido pcDNA3.1/Neo (+) para formar la construcción pTMFAg para la recuperación del virus. Mutagénesis dirigida de sitio del gen de glicoproteína : La mutagénesis dirigida de sitio para introducir un cambio de tres nucleótidos de AGA a GAG en la posición de aminoácidos 333 de la glicoproteína se realizó como se describe previamente (Wu y colaboradores, J. Virol. 76: 4153-4161, 2002). Los cebadores en la reacción de mutagénesis fueron el cebador M5G: CTCACTACAAGTCAGTCGAGACTTGGAATGAGATC (SEQ ID NO: 56, los tres nucleótidos mutados en negrita) y el cebador 3G: GACTGACTTTGAGTGAGCATCGGCTTCCATCAAGG (SEQ' ID NO: 57). Para la cepa recuperada (ERAg3), el nucleótido tres cambia de AGA a GAG en la posición del aminoácido 333 (aa333) se confirmaron mediante la secuenciación después de la RT-PCR con los cebadores 5G y 3G. Después de la confirmación por la secuenciación de DNA, el G mutado se clonó nuevamente al plásmido pTMF para hacer la construcción pTMFg3 para la recuperación del virus. La glicoproteina codificada por este gen mutado se representa por SEQ ID NO: 58. Incorporación de un ORF exógeno en el genoma de virus de rabia de ERA Para expresar los ORFs exógenos en RV, una unidad de transcripción extra con los sitios de reconocimiento Pstl y Kpnl se crearon y se incorporaron en las regiones intergénicas del gen de Psi o P-M, respectivamente. En breve, para la creación de una unidad de transcripción extra en la región de Psi, las mismas etapas se siguieron, excepto para la etapa de amplificación del fragmento 5'??, el cebador 3?? se cambió a SA^fcis: CCAAACTGCAGCGAAAGGAGGGGTGTTAGTTTTTTTCATGATGAACCCCCCAAGGGGAGG (SEQ ID NO: 59) . La construcción final sin la región Psi, pero con una unidad de transcripción extra, se designó como pMTFApcis. El GFP , ERA G, o G mutado en losa residuos de aminoácido 333 se clonaron a esta unidad transcripcional para formar las construcciones pMTFgfpl, pMTF2g , pMTFg3, pMTF2g3, respectivamente, para el rescate del virus. Para incorporar una unidad de transcripción extra a la región intergénica P- , el fragmento cisp5 se amplificó utilizando pMTF como plantilla con los cebadores cis55: GACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCTGTTAAG (SEQ ID NO: 60), cis53 : CAAACTGCAGCGAAAGGAGGGGTGTTAGTTTTTTTCATGTTGACTTTAGGACATCTCG G (SEQ ID NO: 61), y se clonó en sustitución de su contraparte en el plásmido pMTF. El fragmento cisp3 se amplificó y se clonó de manera similar con los cebadores cis35: CCTTTCGCTGCAGTTTGGTACCGTCGAGAAAAAAACAGGCAACACCACTGATAAAATG AAC (SEQ ID NO: 62) y cis33: CCTCCCCTTCAAGAGGGCCCCTGGAATCAG (SEQ ID NO: 63) . Después del ensamble de los fragmentos cisp5 y cisp3 conjuntamente, la construcción final se designó como pMTFcisp, para aceptar los ORFs . La construcción recombinante que contiene el gen GFP se llamó pTMFgfp2 pra la recuperación del virus. Para producir un derivado de ERA, el ERAgm diseñado, en el cual la secuencia de codificación de glicoproteina se invirtió a fin de que con la secuencia de codificación de proteínas de matriz, el gen de glicoproteina se suprimió como se describiera en lo anterior. El gen G (amplificado como se divulga en lo anterior) luego se insertó entre los genes P y M, produciendo un genoma de virus de rabia en el orden de N-P-G-M-L. Similarmente, La misma estrategia se amplió para producir el derivado de ERAg3m, en el cual la glicoproteina tiene una mutación de nucleótido triple en el residuo de aminoácido 333 (de AGA a GAG) al sustituir el gen G producido por la mutagénesis directa de sitio como se describe en lo anterior. Para producir la construcción de ERAgmg, cualquier copia extra del gen de glicoproteina se insertó entre los genes P y M, y se hicieron el genoma del virus de rabia en el orden de N-P-G-M-G-L. Una unidad de transcripción extra se modificó y se incorporó en dos regiones diferentes del genoma ERA, aproximadamente la región psi y la región intergénica de P-M. Cuando los ORFs heterólogos se incorporan en estas unidades de transcripción, se designan trans 1 y trans 2, respectivamente, la producción eficiente de los resultados del producto codificado. La secuencia de la unidad de transcripción es: CTAACACCCCTCCTTTCGCTGCAGTTTGGTACCGTCGAGAAAAAAA (SEQ ID NO: 64, Pstl y Kpnl se subrayaron) . Ejemplo 6 : Recuperación de los virus parentales y derivados Este ejemplo describe la recuperación del virus ERA parental y los derivados ejemplares utilizando el sistema de genética inversa divulgado en la presente. Las células BSR se transfectaron a casi 80% de confluencia en las placas de seis cavidades con el plásmido pTMF de transcripción de longitud completa viral (pTMFA , pTMFg3, pTMF2g, pTMF2g3, pTMFgfpl, I 10 pTMFgfp2 , pTMFAg, pTMFgm, o pTMFgmg, respectivamente) a 3 µg/ca idad, con untamente con cinco plásmidos auxiliares: pTN (1 µg/ca idad) , pMP (0.5 , pMG (0.5 µg/ca idad) y pNLST7 (1 µ?/?ß?????) por el reactivo TransIT-LTl (Minis, Madison, WI) después del protocolo recomendado por el fabricante. Cuatro días después de la transíección , 1 mi de suspensión de célula BSR fresca (células de aproximadamente 5xl05) se adicionó a cada cavidad. Las células se incubaron a 37°C, C02 al 5% durante 3 días. Los sobrenadantes celulares se recolectaron para la titulación del virus. Para titular el virus recuperado, las monocapas de células BSR en las placas de ocho cavidades LAB-TEK (Naperville, IL) se infectaron con las diluciones de 10 veces de serie del sobrenadante del virus y se incubaron a 37°C, C02 al 0.5% durante 48 h. Las células se fijaron en 80% de acetona enfriada a temperatura ambiente durante 1 hora y se mancharon con el anticuerpo monoclonal N del virus de antirrábico marcado con FITC a 37 °C durante 30 minutos. Después de tres enjuagues de las placas con PBS, los focos manchados se contaron utilizando la microscopía fluorescente directa. Los detalles para el ensayo fluorescente de RV directo (DFA) se pueden encontrar en la web mundial cdc . gov/ncidod/dvrd/rabies/professiona1/publicatións /DFA-diagnosis/DFAj rotocol . htm.

Todos los virus excepto el ERA-G se recuperaron en el titulo alto de las células BSR cultivadas con se indica en la Tabla 3. Sorprendentemente, el rearreglo y cambio del gen G con el gen M no impidió la recuperación del virus ERA derivado recombinante . El rearreglo del gen G en los genomas de RV no se creyó previamente factible debido a la muerte celular de la sobreexpresión de la proteina G (Faber y colaboradores, J. Virol. 76:337 -3381, 2002). Sin embargo, estos resultados demuestran que el rearreglo es posible en la cepa de ERA. Por consiguiente, es probable que el movimiento del gen RV sea posible no solo para el gen G, sino también para los otros genes también. El virus de ERA-G (sin G) se recuperó después de la transfección del plásmido siguiendo el mismo procedimiento como para el rescate de otras construcciones virales, pero los focos del virus fueron muy limitados y restringidos en las áreas locales después de la primera vuelta de la transfección. El virus rescatado no fue capaz de extenderse adicionalmente a las células BSR casi saludables (FIG. 4A) aun después de una semana de la incubación a 37 °C, CO2 al 5%. La infección de las células .BSR normales con los sobrenadantes de transfección anteriores presentaron manchado célula individual en la prueba de DFA, la cual sugirió que el virus recuperado fue incapaz de extenderse. Para amplificar el virus de ERA-G, una linea de célula BHK que expresa constitutivamente el ERA G se estableció como se describe en el Ejemplo 4 (designado BHK-G) . Mediante la clasificación e ensayo fluorescente indirecto, una acumulación de células BHK que expresan G se seleccionaron y se mantuvieron para la amplificación del virus de ERA-G virus (FIG. 4B) . Con la ayuda de la linea celular BHK-G, el virus de ERA-G se desarrolló a 107 ffu/ml. El RNA total de las células BHK-G infectadas con el virus ERA-G se extrajo para el análisis del manchado de Northern (FIG. 4C) con una sonda de gen G. El gen G estuvo ausente en el RNA genómico viral, sin embargo, el MRNA de G se detectó el cual provino de las células BHK-G soportadas infectadas. En el RNA genómico viral de ERA-G purificado, no se detectó señal de hibridación por la sonda G, indicando la supresión del gen G en el genoma de ERA. Ejemplo 7: Crecimiento del virus de ERA rescatado y sus derivados al titulo alto en un bioreactor En un desarrollo de la vacuna oral, el titulo de virus alto se requiere típicamente para inducir la inmunidad confiable después . de la administración. Este ejemplo demuestra que el virus de ERA y los derivados se pueden desarrollar a titulo alto en un bioreactor en volumen aplicables a la mejora comercial. Todos los 10 virus de ERA rescatados se amplificaron en un bioreactor, CELLine AD1000 (IBS Integra Bioscience, Chur, Suiza) a los títulos que varían de 107 a 1010 ffu/ml. En breve, las células BSR se transfectaron con los vectores de transcripción de antigenoma ejemplares y los vectores auxiliares, como se describe en elo anterior. Las células se inocularon a una multiplicidad de infección de 1 virión por célula, en una concentración de 106 células/ml en una decena del volumen de recipiente del bioreactor. Las células transfectadas se cultivaron a 37°C, Co2 al 5% en DMEM suplementado con 10% de suero bovino fetal. El sobrenadante se recolectó cada tres a cinco días por entre dos y tres cosechas. El ERA-G deficiente se cultivó menor bien comparado con otros virus, con solo 108ffu/ml para el ERA-G (TABLA 3 y FIG. 5) . Tabla 3. Construcciones de plásmido de longitud completa y virus rescatados correspondientes E emplo 8 : Expresión de las proteínas exógenas de las unidades transcripcionales extras en el virus de rabia Este ejemplo demuestra la expresión de las proteínas recombinantes de ORF heteróloga insertado en un vector de virus de rabia. En este ejemplo, el vector de virus de ERA se utiliza como un vector de virus de rabia prototipo. Para construir el virus de ERA como un vector para aceptar los ORFs, una unidad transcripcional de RV conservadora entre los genes N y P se modificó y se introdujo en el genoma de ERA en dos ubicaciones diferentes: 1) en la región psi (trans 1), y 2) en la región intergénica P-M (trans 2) . La unidad de transcripcional se diseñó para poseer dos sitios de reconocimiento de enzima de restricción únicos para facilitar la introducción de las secuencias de polinucleótidos heterólogas : (TTTTTTTGATTGTGGGGAGGAAAGCGACGTCAAACCATGGCAGCTCTTTTTTT : SEQ ID NO: 65, sitios Pstl y Kpnl subrayados) . En un primer ejemplo, el gen GFP se clonó es esta unidad para la recuperación del virus, puesto que la expresión de GFP podría ser observada directamente bajo un microscopio de UV cuando las células BSR transfectadas todavía estuvieron' incubándose. La expresión de la proteína GFP fue directamente visible mediante la microscopía fluorescente con un filtro de excitación de 470+20nm. El ERAgreen2 (gen de GFP insertado después del gen P en el genoma de RV-trans 2)- las células infectadas mostraron focos verdes claros después de tres días de la transfección del plásmido, mientras que el ERAgreenl (gen de GFP insertado I 15 después de el gen G en la región ? "tradicional" -trans 1) no presentó focos verdes obvios hasta cinco días pos-transfección (FIG. 6). La unidad transcripcional introducida fue funcional en el genoma de RV en ambas ubicaciones, aunque la expresión y acumulación fue evidente más rápidamente cuando el GFP se expresó de trans 2. Asi, estos resultados también' indican que el nivel de expresión del ORF heterólogo se puede modular al seleccionar la unidad de transcripción en la cual el ORF se clona. En otros ejemplos, 1) una copia adicional de ERA G; o 2) una copia adicional de ERA G con una sustitución de aminoácidos en la posición 333, se incorporó en el genoma viral de ERA. Los virus exitosamente rescatados se nombraron ERA2g y ERA2g3, respectivamente. Puesto que la cuantificación de la expresión G viral no fue práctica, el incremento relativo en los niveles de expresión de G en las células infectadas con ERA2g y ERA2g3 se confirmó con el manchado de Northern con una sonda G. En breve, la sonda del gen de ERA G se marcó utilizando el equipo de marcación de DNA Dig (Roche, Indianapolis , IN) y se representó en el Equipo de Detección de ácido nucleico Dig (Roche, Indianapolis, IN) y se midió mediante la espectrofotometria de densidad (FIG. 7) . Los genes G enlazados en tándem en los virus recuperados también se confirmaron por la RT-PCR con los cebadores 5G y 3G. Una banda predominante que indica una sola copia de G se observó a 1.5 kb . Además, una segunda banda más débil se observó a aproximadamente 3.0 kb indicativa de los dos Gs en un arreglo de tándem. Estos resultados demuestran que la introducción de las unidades de transcripción en el genoma de era se puede utilizar para expresar diversas proteínas heterólogas de los ORFs introducidos. Además, la expresión de la proteína codificada por la ORF heteróloga se modula por la posición en la cual la ORF se inserta. Así, el virus de ERA es un vector ampliamente adaptable para la expresión de las proteínas recombinantes . Ejemplo 9: Respuesta inmune in vivo a los virus diseñados Este ejemplo demuestra los efectos in vivo de inoculación con el virus de ERA diseñado y los derivados ejemplares. Todo el cuidado animal y los procedimientos experimentales se realizaron de conformidad con las Guías de Cuidado y Uso Animal Institucionales DC . Ocho ratones de tres semanas de edad se dividieron en 8 grupos de 10 cada uno para la administración intramuscular (i.m) de los virus recuperados (106 ffu de virus por ratón) . Diez ratones saludables se mantuvieron como controles mock no infectados. Para las construcciones de ERA y ERAg3, las inyecciones intracerebrales adicionales (i.c) de la misma dosis de los virus se aplicaron a otro grupo de diez ratones de tres semanas de edad. En ratones lactantes de dos días de edad, solo los virus de ERAg3 y ERA-G se inocularon intracerebralmente, con la misma dosis. Los animales se verificaron diariamente por enfermedad. III animales se eutanizaron mediante intoxicación con CO2 y los cerebros se removieron para el diagnóstico del virus de rabia. Diez días después de la infección, la sangre se recolectó mediante la ruta retro-orbital y los sueros obtenidos para los ensayos de anticuerpos neutralizantes, después de la prueba de inhibición de foco fluorescente rápido estándar (RFFIT) (Smith y colaboradores, Bulletin of the World Health Organization . 48: 535-541, 1973). Un mes después de la infección, los animales sobrevivientes se estimularon con una dosis letal de virus de rabia callejero (homogenizado de la glándula salival de perro/coyote) (Orciari y colaboradores, Vaccine. 19:4511- 518, 2001). El anticuerpo monoclonal de ratón (Mab 523-11) contra el virus G de rabia se mantuvo en CDC (Hamir y colaboradores, Vet Rec. 136, 295-296, 1995) y el anticuerpo monoclonal anti-N conjugado con FITC se adquirió de Centocor (Horsham, PA) . El anticuerpo monoclonal de T7 RNA polimerasa fue de Novagen (Madison, WI) . El conjugado de IgG-FITC de antiratón de cabra se adquirió de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) . El anticuerpo monoclonal G del antivirus de rabia (Mab 1-909) se mantuvo en CDC en el conjugado de IgG-FITC antihumano de cabra se adquirió de Sigma-Aldrich (St. Louis, I 18 MO) . Entre los ratones de tres semanas de edad inoculados intramuscularmente por las ocho construcciones del virus diferentes, 50% de los ratones inoculados con ERA (rERA) o ERA- y 20% de los ratones inoculados con ERAgreenl mostraron signos neurológicos leves a 10 días después de la inoculación. Ningunos de los otros grupos mostraron ningún signo sugestivo de virus de rabia (FIG. 8A) . Los sueros se recolectaron para la titulación del anticuerpo neutralizante antes de la estimulación. Los ERA2g (5.60 IU) y ERA2g3 (5.61 IU) indujeron títulos más altos que las construcciones del virus G de una sola copia (FIG. 8E) . Los ratones que sobreviven un mes después de la inoculación se sometieron a la estimulación con un virus callejero de perro/coyote letal (0.05 mi, mantenido en CDC para pruebas de estimulación de animal estándares) . En los grupos de ERA y ERA-, 40 a 62% de los ratones mostraron signos de rabia leves, respectivamente, y se eutanizaron. Todos los otros grupos sobrevivieron sin ningunos signos de rabia (FIG. 8B) . En los grupo de i.c, los ratones de tres semanas de edad sobrevivieron después de la inoculación con ERAg3, pero sucumbieron después de la inyección de ERA (FIG. 8C) . La construcción de ERA-G no exterminó el ratón lactante de 2 días de edad, sin embargo, el ERAg3 fue virulento suficiente para exterminar a todos los ratones lactantes infectados (FIG. 8D) . Títulos de anticuerpo ejemplares se muestran en la Tabla 4. Tabla 4: Producción de los anticuerpos específicos de rabia Grupo Titulo Promedio ERA 433 G333 468 2G 560 2G333 561 _PSI 490 GFP 437 verde G 833 menos G 136 Contoles <l/5 Estos datos demuestran que todos los virus basados en ERA fueron capaces de inducir una respuesta inmune después de la inoculación. Como se espera, el virus de ERA parental fue virulento, dando por resultado morbidez y mortalidad sustancial en los animales infectados.- En contraste, los diversos derivados ejemplares indujeron una respuesta inmune protectora cuando los ratones se inocularon previos a la estimulación . Además de la evaluación de pre-exposición descrita en lo anterior, la habilidad de los derivados de virus de ERA para inducir una respuesta inmune protectora después de la infección con el virus de rabia virulento se determinó. En breve, grupos de hámster se infectaron con una de las tres cepas diferentes de virus de rabia (n=9 por grupo) , y cualquiera dio la vacuna recombinante (ERA-g333) , o la globulina inmune a la rabia más las vacunas de rabia comerciales inactivadas. Aproximadamente 80-100% de los animales de control sucumbieron, mientras que aproximadamente 60-100% de los animales vacunados sobreviven como se muestra en las FIGS. 9A-C. Estos resultados demuestran que la administración de pos-exposición del virus de rabia derivado confiere protección sustancial contra las diferentes cepas de virus de rabia. En vista de las muchas modalidades posibles a las cuales los principios de la invención divulgada se pueden aplicar, será reconocido que las modalidades ilustradas son solo ejemplos preferidos de la invención y no deben ser tomadas como limitativas del alcance de la invención. Más bien, el alcance de la invención se define por las siguientes reivindicaciones. Los inventores por lo tanto reclaman como su invención todo lo que se origina dentro del alcance y espíritu de estas reivindicaciones.

Claims (40)

1. REIVI DICACIONES 1. Un sistema de vector, caracterizado porque comprende : un primer vector que comprende un DNA antigenómico de virus de rabia de longitud completa, en donde el DNA antigenómico de longitud completa, se selecciona de un DNA antigenómico de virus de rabia de longitud completa o un derivado del mismo; y una pluralidad de vectores ayudantes que comprenden ácidos nucleicos que codifican por lo menos una proteina de la cepa de ERA del virus de rabia, en donde la expresión de la pluralidad de vectores en una célula hospedera transfectada da por resultado la producción de un virus de rabia recombinante .
2. 2. El sistema de vector de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el DNA antigenómico de longitud completa comprende un DNA antigenómico de cepa de ERA o un derivado del mismo.
3. 3. El sistema de vector de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el DNA antigenómico de longitud completa se selecciona de SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 o SEQ ID NO: 18.
4. 4. El sistema de vector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque los vectores son plásmidos.
5. 5. El sistema de vector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque el primer vector comprende en una dirección de 5' a 3' : una ribozima de cabeza de martillo; un cDNA antigenómico de virus de rabia; y una ribozima de virus delta de hepatitis en donde una pluralidad de nucleótidos de la ribozima de cabeza de martillo son complementarios a la secuencia genómica antisentido del virus de rabia.
6. 6. El sistema de vector de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la transcripción del cDNA antigenómico está bajo el control regulador de transcripción de por lo menos uno del promotor de CMV y el promotor de RNA polimerasa de fago T7.
7. 7. El sistema de vector de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la transcripción del cDNA antigenómico está bajo el control regulador de transcripción de tanto el promotor de CMV como el promotor de RNA polimerasa de fago T7.
8. 8. El sistema de vector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque la pluralidad de vectores ayudantes comprende: un vector que comprende una secuencia de polinucleótido que codifica una proteina N del virus de rabia ; un vector que comprende una secuencia de polinucleótido que codifica una proteina P del virus de rabia; un vector que comprende una secuencia de polinucleótido que codifica una proteina M del virus de rabia ; un vector que comprende una secuencia de polinucleótido que codifica una proteina L del virus de rabia; y un vector que comprende una secuencia de polinucleótido que codifica una RNA polimerasa de fago T7.
9. 9. El sistema de vector de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque además comprende un vector que comprende una secuencia de polinucleótido que codifica una proteina G del virus de rabia.
10. 10. El sistema de vector de conformidad con la reivindicación 8 o 9, caracterizado porque la T7 RNA polimerasa comprende una señal de localización nuclear (NLS) .
11. 11. El sistema de vector de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la transcripción de la secuencia de polinucleótido que codifica la proteina N del virus de rabia está bajo el control regulador de transcripción del promotor T7 y en donde la transcripción es independiente de terminación.
12. 12. El sistema de vector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8-11, caracterizado porque la transcripción de una o más de las secuencias de polinucleótidos que codifica la proteina P, M, L o G del virus de rabia o la T7 polimerasa están bajo el control regulador de transcripción de tanto el promotor de CMV como el promotor T7.
13. 13. Un genoma de virus recombinante, caracterizado porque comprende el ácido nucleico como se expone en SEQ ID NO: 1.
14. 14. Un genoma de virus recombinante, caracterizado porque comprende el ácido nucleico como se expone en SEQ ID NO: 7, o derivado del mismo.
15. 15. El genoma de virus recombinante de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el genoma de virus derivado comprende SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 o SEQ ID NO: 18.
16. 16. El genoma del virus recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13-15, caracterizado porque además comprende un vector.
17. 17. El genoma de virus recombinante de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el vector es un plásmido.
18. 18. Un virus recombinante, caracterizado porque comprende un genoma como se expone de conformidad con la reivindicación 14 o 15.
19. 19. El virus recombinante de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el virus es un virus atenuado .
20. 20. Una vacuna de rabia viva, caracterizada porque comprende por lo menos un genoma del virus de rabia recombinante, en donde por lo menos un genoma de rabia recombinante comprende: la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 8 ; la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 10; o la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 13.
21. 21. La vacuna de rabia de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada porque está atenuada.
22. 22. Una proteina aislada, caracterizada porque comprende la secuencia de aminoácidos como se expone en: SEQ ID NO: 2 (proteina N); SEQ ID NO: 3 (proteina P) ; SEQ ID NO: 4 (proteina M) ; SEQ ID NO: 5 (proteina G) ; SEQ ID NO: 6 (proteina L) ; o SEQ ID NO: 58 (proteina G Aa333) .
23. 23. Una molécula de ácido nucleico aislada, caracterizada porque codifica cualquiera de las proteínas de conformidad con la reivindicación 22.
24. 24. La molécula de ácido nucleico aislada de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada porque comprende una secuencia de nucleótidos como se expone en: a) nucleótidos 71-1423 de SEQ ID NO: 1 (proteina N) ; b) nucleótidos 1511-2407 de SEQ ID NO: 1 (proteina P) ; c) nucleótidos 2491-3104 de SEQ ID NO: 1 (proteina M) ; d) nucleótidos 3318-4892 de SEQ ID NO: 1 (proteina G) ; e) nucleótidos 5418-11,801 de SEQ ID NO: 1 (proteina L) , o f) una secuencia de nucleótidos que difiere de uno de a) al e) debido solamente a la degeneración del código genético .
25. 25. La molécula de ácido nucleico aislada de confbrmidad con la reivindicación 23, caracterizada porque comprende una secuencia de nucleótido como se expone en los nucleótidos 3317-4888 de SEQ ID NO: 8, o una secuencia de nucleótidos que difiere de la misma debido solamente en la generación del código genético.
26. 26. Una composición, caracterizada porque comprende por lo menos una proteína aislada de conformidad con la reivindicación 22.
27. 27. La composición de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada porque además comprende un portador farmacéuticamente aceptable, un adyuvante, o una combinación de dos o más de los mismos.
28. 28. Un método para inducir una respuesta inmune contra un epitope antigénico en un sujeto, caracterizado porque comprende introducir en el sujeto la composición de conformidad con la reivindicación 26, para de esta manera inducir una respuesta inmune en el sujeto.
29. 29. Un método para secuenciar el genoma del virus de rabia de longitud completa, caracterizado porque comprende : transcripción inversa de un genoma del virus de rabia para producir una hebra de DNA complementaria; amplificar una primera porción en una segunda porción de la hebra de DNA complementaria para producir un primero y segundo segmento genómico del virus de rabia amplificado; clonar el primero y el segundo segmentos genómicos de virus de rabia amplificados en un vector para producir un antigenoma de virus de rabia contiguo; y secuenciar el antigenoma del virus de ' rabia de longitud completa.
30. 30. Un método para producir una vacuna de virus de rabia vivo, caracterizado porque comprende introducir al sistema de vector de cualquiera de las reivindicaciones 8-19 en una célula hospedera y recuperar el virus de rabia recombinante vivo.
31. 31. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque el virus de rabia recombinante vivo recuperado es adecuado para el uso como una vacuna de virus de rabia vivo.
32. 32. Una vacuna de virus de rabia vivo, caracterizado porque se produce mediante el método de conformidad con la reivindicación 31.
33. 33. Un método para vacunar a un sujeto contra la rabia, caracterizado porque comprende administrar una cantidad efectiva de la vacuna de rabia vivo de conformidad con la reivindicación 20 o reivindicación 32 a un sujeto, tal que las células del sujeto se infectan con la vacuna de rabia, en donde una respuesta inmune antirrábica se produce en el sujeto.
34. 34. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque el sujeto es un humano.
35. 35. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque el sujeto es un animal no humano.
36. 36. El método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque el animal no humano es un gato, perro, rata, ratón, murciélago, zorro, mapache, ardilla, zarigüeya, coyote o lobo.
37. 37. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 34-36, caracterizado porque la administración comprende la administración oral.
38. 38. El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque la administración oral comprende la administración a través de bocados de alimentos diseñados para vacunar las poblaciones de animales silvestres.
39. 39. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende la vacuna de rabia viva de conformidad con la reivindicación 20 o reivindicación 32 y un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable.
40. 40. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 39, caracterizada porque la vacuna de rabia está atenuada.