JPH05503209A - イヌパルボウイルス（ｃｐｖ）を含む弱毒イヌパルボウイルスワクチンとイヌ科動物におけるｃｐｖ感染予防 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 イヌパルボウイルス（ｃｐｖ）を含む弱毒イスパルボウイルスワクチンとイヌ科 動物におけるｃｐｖ＠染予防 発明の分野 イヌパルボウイルス（ｃｐｖ−２）は、イヌ科動物の寄生体であり、嘔吐、下痢 、気分減退、発熱、種々の白血球減少症、そして急激な脱水を引き起こす。この イヌパルボウイルスは、ウィルスの増殖を助けるような分裂活性の高い宿主細胞 を必要とする。したがって、分裂活性の高い細胞は、ウィルスに対する感受性が もっとも高いものとなる。また、＃Ｉ織は分化の段階で感受性が高い。

したがって、心筋炎や、より重要には腸炎がこのウィルスによるもっとも一般的 な疾患である。

発明の背景 通常のワクチン磨洗の出現により、子犬はイヌパルボウィルスに特に感染しやす い動物である。ワクチン接種されたメス大から生まれた子犬は、母親由来の抗体 （ＭＤＡ）によって短期間ではるがその免疫が受け継がれる。母親由来の抗体は 、生後１週間にわたって受動的防御を与える。しばしば、子犬は、母親の５０％ にあたる血清中抗体１度が認められる。しかし、生後８−１０日になると、母親 由来の抗体の置は指数関数的に半減してしまう。

ＭＤＡが指数関数的に減少していく一方で、この時期に商業的に入手可能なワク チンを接種してもそれによる抗体産生を導くことはできない。この現象は、種々 の科学論文に記載されており、例えばコルネルベテリナリアン（Ｃｏｒｎａｌｌ 　Ｖａｌｅｒｉｎａｒｉａｎ）　１９８２年７２巻１０３−１０９頁（ポロ１り 、Ｐｏ１ｌｏｃｋ）およびフルネルベテリナリア７　（Ｃｏｒｎｅｌｌ　Ｖｅｔ ｅｒｉｎａｒｉａｎ）　１９８１年７１巻４０ｇ−４２７頁（カルミカエル他、 Ｃａｒｕｍｉｃｈａｅｌ　ｅｔ　ａｌ、）。

ＭＤＡが標準的な方法（例えば、血球凝集（Ｈａｅ＠ａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏ ｎ）−抑制（ｌｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）　（ＨＩ）　、エリザ（ＥＬＩＳＡ）また は血清中和等）によって検出可能であるのに対して、ワクチンは子犬に活性免疫 応答を誘導するにはたいへん不安定なものである。ＭＤＡは、病気に対する有効 ！よりも低い濃度に減少したとしても検出されうる。このような検出は、Ｈｌテ ストによってなされるものであり、５０μｌあたり血液Ｍ粟阻害単位（ＨＩ　Ｕ １５０μＬ）が約６４のタイターに値する。したがって、「免疫空白期間（Ｉｓ ■ｕｎｉｔｙ　ｇａｐ）　Ｊと呼ばれる時期（通常、生後８−１４通の間）があ り、この時期は子犬の母親由来抗体量が減少し、防御が不十分なものとなり、ま たワクチン接種による免疫応答も引き出せない時期でもある。よって、この時期 に子犬は感染に対する感受性があり、一方でワクチン接種に対する応答性を示さ ない。

このようなことから、従来のイヌパルボウイルスワクチンよりも抗原性が高いワ クチンが、子犬において母親由来の抗体にもまさり、防御抗体を産生ずる独自の 免疫系を刺激することは自明なことであると考えられて来た。

そして、このことは、ＣＰＶ−２の弱雪株くより一層抗原性がある）の利用によ っである程度達成されるであろうが、この場合、ワクチン接種された動物の便に 接種されたウィルスが潜在することがあり、感染の拡大や、ウィルスの毒性の度 合いが変化する危険性がつきまとう（欧州特許Ｎｏ、　１８９９５８参照）。そ のような株の例として、０２７株１−４０４　（パスツール研究所）がある。現 在、このウィルスは市販されているワクチン「インターベット・ノビバック・パ ルボーＣ」（ＩＮＡＥＲＶＥＴ″Ｎ０ＢＩＶＡＣＰＡＲＶＯ−Ｃ”）　ニ使用さ れティる。

本発明の研究者は、従来から大きな問題とされてきたイヌパルボウイルスによる 疾患を予防するワクチンの生産を可能とする適当な株を選別する過程において驚 くべき発見をした。すなわち、子犬の母親由来抗体量が検出可能な程度に存在し 、接種された動物で大量の生きたウィルスが潜在することによる他の犬への感染 拡大に対して予防的効果を与えるＣＰＶ株ｌ−４０４などの株を発見した。

パルボウイルスに対する商業的に入手可能なワクチンがかかえる他の間既を記載 した。例えば、ある品種では、免疫空白期間に対して特に感受性が高い。また、 ある動物では、ＭＤＡレベル後でさえも、ワクチンの繰り返し投与量に対して反 応性を示さず、このことは正常な状態で期待される抗体の量が消え失せてしまっ ていることを示している。

発明の開示 本発明は、母体由来の抗ＣＰＶ−２抗体存在下において抗体応答を引き出し、か つ毒性が低いようなＣＰＶ−２ワクチンを提供するものである。

本発明は、毒性が低くて、母体由来の抗ＣＰＶ−２抗体存在下において抗体応答 を引き出すことが可能な弱毒パルボウイルスからなるものである。

本発明の好ましい実施態様では、パルボウイルスは、弱毒パルボウイルスを接橿 された犬から放出されたウィルスからの感染率が非常に匠いことを特徴とする。

この明細書で用いられる言葉「感染率が低い」の意味することは、感染動物から パルボウイルスが放出されないことを意味し、またたとえ放出されたとしてもそ の放出されたパルボウイルスに接触した犬に対して実質的な感染能力がないこと を意味している。

本発明の策−の発明にもとづ〈実施態様は、動物細胞培養ヨーロピア／コレク／ １ン（ＥＣＡＣＣ，英国サリズバリー、ホートドラン；　Ｐｏｒｔｏｎ　Ｄｏｗ ｎ、　５ａｌｓｂｕｒｙ。

［１，１）に寄託されたイヌパルボウイルスのＣＰＶ−２株を含むものである。

寄託番号は、Ｖ８９０４２６０１である。この株は、その弱毒イヌパルボウイル スに３Ｉされたものの６９回継代（ｐａｓｓａｇｅ　６９；　Ｐ６９）されたも ので以下、ｃｐｖ−２株Ｐ６９と呼ぶ。

本発明のための培養ウィルスの弱毒化は、適当な培養系で、ウィルスを継代培養 することによって達成された。この培養系は、例えばネコ腎臓（ＦＫ）細胞系で ある。ウィルスは、限界希釈法を用いてクローン化され、そして継代されたウィ ルスに継代６９　（Ｐ６９）と番号を付けた。

本発明の第二の発明は、弱毒イヌパルボウイルスの有効量を含むワクチンからな るもので、このイヌパルボウイルスは、低毒性を示し、また母体由来の抗ＣＰＶ −２抗体存在下において抗体応答を引き出すことが可能なものである。

コノ発１１ＪＴの好ましい実施態様によれば、弱毒パルボウイルスは、−ワクチ ／を接橿された犬から放出されたウィルスによる感染率が非常に低いことを特徴 とする特に好適な実施態様によれば本発明の第二の発明は、ＣＰＶ−２株Ｐ６９ に該当する動物細胞培養ヨーロビアノコレク７ｇノに寄託された番号Ｖ８９０４ ２６０１の６２７株あるいはこの株と同等なものの有効量を含むものである。

発明の詳細な説明および請求の範囲において言及される有効量とは、免疫応答を 引き出すのに十分な量を意味するものであり、好ましくは５０％組織組織感染投 与量（Ｔｉａｓｕｅ　Ｃｕ１ｌｔｕｒａ　Ｉｎｆｅｃｔｉｖｅ　Ｄｏｓｅｓ；　 ＴＣＩＤ５ｏ）　／投与量の値が少なくとも１０４・ｅである。

本発明のワクチンは、新規なＣＰＶ−２株Ｐ６９を生きた状態で、あるいは不活 性化された致死状態で用いることが可能である。好ましくは、本発明のワクチン は、生ＣＰＶ−２株Ｐ６９を含むか、あるいはその誘導体または機能的に等価な ものを含む。

このようなワクチンは、他の成分を含むことも可能であり、例えばそのような成 分として安定剤、アジ１バント、賦形剤、その他の薬剤学的に許容される化合物 または他の抗原またはその一部分が挙げられる。ワクチンは、既知のワクチン製 造現場において一般的な凍結乾燥試料あるいは懸濁された状態にされる。

好ましい実施態様によれば、本発明のワクチンはワクチン接種に用いられる他の ウィルスまたは生物と組み合わされて使用されることが可能である。そのような 他のウィルスとして例えばイヌジステンパー、感染性へパチチスウイルス、イヌ バライノフルエンザまたはボルデテラなどがあるが、もちろんこれらに限定され るものではない。

本発明によれば：　ＣＰＶ−２株Ｐ６９は最適な条件下で適当な細胞系、好まし くはＦＫまたはイヌ腎臓細胞＜ＬＰ４えばＭＤＣＫ）において増殖する。そして 既知の方法を用いてこの培養されたウィルスをワクチンの製造に用いる。

一般的にワクチン接種の妨害となるほどの量の母親由来の抗体が存在しているに もかかわらず、ワクチンにＣＰＶ−２株Ｐ６９を取り込ませることによって、イ ヌパルボウイルスによる疾患に対する防御を提供することが可能である。

本発明のＶ８９０４２６０１株は既知のＣＰＶ−２株とは興なるもので、血清陽 性および血清陰性のどちらの犬に対しても血清学的な応答を示ｆ０細胞培養系で の増殖特性や、新規な株を含むワクチ／を投与された動物からの生ウイルス放出 特性と同様に、そのＤＮＡ配列変異が認められる。

特に、本発明は、培養細胞系に接種した場合に毒性の度合いが既知のｃｐｖ株ワ クチンと顕著に翼なる。ＣＰｖワクチンの槽々の株間で、翼なるタイプの細胞培 養、例えばネコの細胞培養系とイヌの細胞培養系とで増殖する能力に違いが認め られる。

本明細書中において言及する抗体力価は、二倍希釈を眉いた標準的な血球凝集阻 害試験によフて測定されるもので、豚赤血球細胞の凝集を完全に阻害させるもっ とも高い血清希釈率の逆数によって示す。

図の簡単な説明 第１図は、Ｈｐ　Ｈ−１ニよッテ消化されたＣＰＶ−２株Ｐ６９、ＣＰＶ−２株 Ｐ９８および０２１株１−１０４について、断片の分子量の違いを示すものであ る。

本発明を実施するための最良の形態 １、ＣＰＶ−２の弱毒化 毒性パルボウイルスから単離されたＣＰＶ−２Ｋａ　１株由来のウィルスをオー ストラリアのタウンスピルにあるノェームスクーク大学（Ｊａ胃ｅｓ　Ｃｏｏｋ 　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、　Ｔｏｗｎｇｖｉｌｌｅ、　Ａｕｓｔｒａｌｉｇａ） 　から人手した。このウィルスを既知の継代方法を用いて本願出願人によりネコ 腎臓（ＦＫ）細胞系およびイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞系で内で継代することによ って弱毒化した。

継代６１回目で回収されたウィルスをＩｌｌ的な限界希釈法によって精製した。

さらにこの精製法を２回繰り返して、合計３回の限界希釈による継代を実施した 。

ＦＫ細胞系で３回目の限界希釈による継代から回収されたウィルス（すなわち継 回目）。

２．７クチ／橿ａ　、ト（Ｖａｃｃｉｎｅ　５ｅｅｄ　ＬｏＩ＞の調製１１１表 ：　母親由来抗体に関する実験継代６５回目の精製ウィルスをさらにＦＫ培培養 −接種して４回継代し３７℃で３ないし４日インキュベートすることによって継 代６９回目のウィルスを得た。

これを−７０℃で保存した。このウィルスは、本発明の好ましい実施態様にもと づいたＶ８９０４２６０１と番号が付けられた寄託された株である。

３、Ｐ６９を含むＣＰＶ−２ワクチノの翼製ＦＫ細胞培養系にＰ６ｇを接種し、 そして３７℃で３ないし４日間インキュベートした。おのｉ＠要を既知の標準的 な方法（生ワクチンまたは不活性化ワクチンのどちらをめるかに応じて）を用い て回収してウィルスの塊を得てさらにウィルスの力価（効カンおよび無効果性（ ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ）を調べた。スタビライザーでウィルス塊を形成し、それを −２０”Ｃで保存した。また、ワクチンを必要に応じてさらに凍結乾燥させるこ とも可能である。

４Ａ、生後６週間の６犬に対するワクチン接種の結果生後６週間の６犬（小型フ ォックステリア）に、高力価の陽性血清２ｍｌを腹腔的注射することによって受 動免疫を与えた。前ワクチン接種（後受動免疫）力価を第１表のように決定した 。この表中、抗体レベルは、３２以下であり、疾患に対する防御性がないと思わ れる。しかし、ワクチン接種に対する６犬の応答を妨害することが可能である。

つぎに、６犬に前記ＣＰＶ−２株Ｐ６９含有ワクチンを接種した。この際、投与 量は茎１表に示すように異なる。抗体力価は、ワクチノ接橿後１５日目で測定し 、東１表に示した。ｌ　Ｏ”　’ＴＣＩＤ、０投与された一匹の犬のみが応答し なかった。

（以下、余白） ワクチン接種量　前ワクチン接種ブリード　ワクチン接種後１０”　１３２　８ １９２−１６３８４ＣＰＶ−２株Ｐ６９ｔたは／ヒバ、、ｒ）ハルボ・シー　（ ＮＯＶＩＶＡＣＰＡＲＶＯ−Ｃハラ＋４５４５、　これはＣＰＶのｌ−４０４） のどちらか一方を含むワクチンを接種された生後６週間目の６犬から得られた血 清学的データを比較した。

妊娠中に不活性ＣＰｖワクチンを接種されたメスから得た生後６遍間目のピーグ ル大に、適当なワクチンからなる単一投与量を接種し、そして生後９Ｊ間目に再 び同一ワクチンを！１種した。

ノビバフクパルボ・シーを受けた６犬と、ＣＰＶ−２株Ｐ６９を受けた６犬とは ひと腹の子同士である。

ＣＰＶ−２株Ｐ６９含有ワクチンは、−回の投与量あたり１０″Ｓ・・ＴＣＩＤ 、。

の力価で用いた。一方、ノビバ、クパルボ・ノーは、−回の投与量あたり１０’ ’ＴＣＩＤ、。の力価で用いた（この力価は購入したパルボ・ン一の力価である ）。

ＣＰｖに対する抗体力価を測定するために生後６．８．９、そして１１週間目に ６犬から血を取った。おｇ　（ｖｈｅｌｐｉｎｇ）時のメス大の力価は、３２か ら１０２４Ｉυ／５ＱｕＬの範囲内にある。生後３３１間目０仔犬は、イヌパル ボウィルスに対する母親由来抗体を持っており、その力価は１６ないし５１２　 ［１１ＬＩ／５ＯｕＬである。

ワクチン接種前後の６犬の血球凝集阻害力価は、第２表に示した。

（以下、余白） 茅２表：子犬に対するワクチン接種前後の血清学的試験結果６犬の齢（遍） １１６４（１６８１９２２０４［１２０４ｅＩＢ　５４　（１６８１９２２０４ ８４０９６２ｇ　１２Ｂ　１６　８１９２　４０９６　４０９６３０　１２Ｂ　 ３２　４０９６　４０９６　２０４［］３１１２Ｂ　１６　４０９６　２０４８ 　４０９６３２　１２Ｂ　３２　２０４８　２０４Ｅｌ　２０４８３３　１２Ｂ 　３２　８１９２　４０９６　２０４８３４　１２Ｂ　１６　２０４８　４０９ ６　２０４８３５　１２Ｂ　１６　２０４８　４０９６　４０９６３Ｅｌ　３２ 　＜’１６　４０９６　２０４８　２０４８４０　１６　＜１６　４０９６　２ ０４８　２０４１１１４１　３２　＜１６　８１９２　２０４８　４０９６４３ １６＜１６　４０９６　２０４８　２０４８４４　３２　＜１６　４０９６　２ ０４８　２０４８４６　２５６；　６４　２０４Ｂ　４０９６　２０４８Ｐａｒ ｖＯ−ｃ　１２　２５６　３２　１６　１６　２０４Ｂ１ｇ　６４　１６　２０ ４８　４０９６　４０９６２１　６４　１６　＜１６　２０４８　４０９６４Ｂ 　２５６　６４　１６　１６　２０４８４ｇ　５１２　６４　３２　３２　４０ ９６第２表中、★および＋は以下のことを示す。

★：　ワクチン接種を２回した。

第一回　生後６週間目 第二回　生後９遍間目 ＋：　ｃｐｖ血球凝集阻害力価；　ｌＩＩ［ｌ１５０ｕＬ生後６週間目（第一回 目のワクチン接種時）の子犬の力価は４〜６倍減少（く１６〜６４）する。３３ 匹中２３匹（７０％）の子犬が母親由来抗体力価を生後６遍時に１６　［１１Ｕ ／５ＯｕＬ以上有していた。

生後６週間目でのワクチン接種後、２４匹中２３匹（９５，８％）の子犬が、生 後８週間目、力価２０４８から１６．３８４ＴＣＰＶ−２株Ｐ６９含有ワクチン に応答した。９匹のうち２匹（２２，２％）のみが同時期にノビバックパルボ・ シー（Ｎｏｂｉｖａｅ　Ｐａｒｙｏ−Ｃ）に応答した。このノビバックパルボ・ シーの力価は、２０４８から４０９６の範囲内にある。

生後６週間目時のワクチン接種に対しては応答しなかったそれぞれの群に含まれ るすべての子犬は、生後９週間目に実施された２回目のワクチン接種に対しては 応答した。これらの子犬での応答の程度は、最初のワクチン接種で応答した個体 のものと同程度であった。

弱毒生イヌパルボウイルスＰ６９ワクチンが高い免疫原性を有することが軍２表 に示された血清学的結果によって明らかにされた。＜１６から６４にある受動的 に獲得した抗体力価を有する２４匹の子犬のうち２３匹が、生後６週間目でＣＰ Ｖ−２株Ｐ・６９含有ワクチンを接種された時点で少なくとも２０４８旧Ｕ１５ ０ｕＬからなる抗体応答を生み出した。

これとは対照的に、／ビバノクパルヂ・ノーを生後６週で接種された９匹の子犬 中たった３匹だけが抗体力価の増加が認められたにすぎない。第一回目のワクチ ン接種後に抗体力価の上昇を示した３匹の子犬は、すべて前ワクチン接種力価が １６であつた。残りの６匹の子犬は、力価が３２から６４であσ、抗体応答が認 められなかった。

血清学的データによれば、ＣＰＶ−２株Ｐ６９は、既知のイヌノ（ルボウイルス と干渉する受動的に獲得した抗体の力価を克服する。

５Ａ、毒性の変化 ワクチン接種された犬から生じたウィルス性物質の毒性および毒性の変化を調べ るために、ワクチン接種された犬（Ｉ！代１回）から糞を採取し、前ＣＰｖナイ ーブな犬（ｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙ　ＣＰＶ−ｎａｉｖｅ　ｄｏｇｓ）に経口投与 した（継代２回目）。さらに、これらの犬から糞試料を採取し、さらにワクチン 接種されていない犬蓼こ継代した（第３表を見よ）。

１４４日目検出可能な抗体を産生じ７：２匹の犬からなるＢ群（第３表）を除ｔ ）で、ウィルスの継代が認められなかった。

（以下、余白） 箪３表：毒性変化試験の結果 イヌ継代Ｎｏ、　ＨＩ力価（旧１１／Ｓｏｕｌ）（Ｄｏｇ　ｐａｓｓａｇｅ　Ｎ ｏ、）　０日目（ＰＩ）　７日目（ＰＩ）　１４４日目Ｐｌ）（表中、　Ｐａｓ ｓａｇｅｌ！継代、　Ｒｅｐｅａｔ　Ｐａｓｓａｇｅは繰り返し継代を意味する ）各継代につき、２匹の犬に接種した。

継代ｌ（Ｐｉｓｉａｇａ　ｌ）の犬：イヌパルボウイルスを皮下より１０ｍ１、 経口より１ｍｌ接種した。

継代２　（Ｐａｓｓａｇｅ　２）の犬：継代ｌの犬から得た糞懸濁液（２ｇの糞 と等しい）を５ｍｌ経口投与した。

継代３　（Ｐａｓｓａｇｅ　３）の犬：継代２の犬から得た糞懸濁液（＝３ｇ） （−３０℃）をｌ　Ｏｍ＋経口投与。

１１代Ｉ　Ｂ　（Ｐａｓｓａｇｅ　ＩＢ）の犬・Ｐ６９イヌＩイルボウイルスを 皮下より１０ｍ１、経口より１ｍｌ接種した。

継代２　Ｂ　（Ｐａｓｓａｇｅ　２Ｂ）の犬、ｍ代１Ｂの犬から得た糞懸濁液（ ２ｇの糞と等しい）をｌｏｍ＋経口投与した。

継代３　Ｂ　（Ｐａｓｓａｇｅ　３Ｂ）の犬・継代２の犬から得た糞懸濁液（＝ １５ｇ）を３０ｍ！投与。

継代４　Ｂ　（Ｐａｓｓａｇｅ　４Ｂ）の大：！１代３Ｂから得た糞懸濁液（＝ 　１５　ｇ）を３０ｍ１投与。

継代５　Ｂ　（Ｐａｓｓａｇｅ　５Ｂ）の犬：継代４Ｂから得た糞懸濁液（＝１ ５ｇ）を３０　ｍ　ｌ投与。

５Ｂ、血清陰性の子犬における１＜ルポウイルス株の比較ＣＰＶ株ｌ−４０４ま たはＣＰＶ−２株Ｐ６９の投与による子犬のウィルス放出特性および血清学的特 徴について比較検討した。

第４表に示すように、生後８週間目から１１週間目の子犬を、ラノダムζこ４つ のグループにふるいわけ、ＣＰＶ−２株Ｐ６９（力価＋　０６’ＴＣＩＤ５゜／ 投与ｆｆ１）またはＣＰＶ株１−４０４　（力価ｌＯ°’ＴＣＩＤ５０／投与置 ）のどちら力）一方を接種した。

血清抗体力価は、接種前と、接種後６日および３００日目測定した。それぞれの 子犬から接種後２日目から全体で１２日間にわたり毎日糞試料を採取した。それ ぞれの糞試料をダルベノフリノ酸緩衝液に１川の割合で懸濁し、細菌除去のため に濾過し、そしてネコ腎臓（Ｆ　Ｋ）細胞に接種した。

（以下、余白） 箪４表：イヌパルボウイルス各株の接種による血清の変化ｃｐｖ血球凝集阻害力 価（［１Ｉｔｌ／５ＯｕＬ）接種群　子犬番号 ０８目　６日目　１３３日 目２　（８１５３６８１９２ （対照群）　３０　＜８　＜’８　＜ｅＣＦ’Ｖ　ｌ−４０４★　０７　＜８　 ４０９６　８１９２１９　＜８　２５６　２０４８ ３１　＜Ｂ　（８８１９２ （対照群）　１５　＜８　＜ｓ　（ａ ＣＰ”２　Ｐ”　１１　＜８　３８４　１６３８４（対照群）１０　４Ｂ　＜　 ８　Ｎｏｔ　ｔｅｓｔｅｄＣＰＶ　ｌ−４［＋４＋　１６　Ｚ　８　６４　１６ ３８４第４表中、★および＋は以下のことを示す。

★：　子犬−匹あたり１０’ＴＣＩ　Ｄ、。を皮下接種。

＋：　子犬−匹あたりｔ　ｏ”ｒｃ　ｒ　Ｄ５゜を経口接種。

なお、対照群は滅菌処理された希釈液を接種された。

皮下接種によって、ＣＰＶ−２株Ｐ６９を受けた子犬の１００％が１０２４ＨＩ Ｕ１５０ｕＬ以下の力価による接種後６日目で応答した。一方、ｃｐｖ株■−４ ０４を受けた子犬の６０％のみ（５匹中３匹）が１０２４Ｈ１■／５ＯｕＬ以下 の力価による接種後６日目で応答した。

経口接種によって、ＣＰＶ−２株Ｐ６９を受けた子犬３匹中１匹が、接種後６日 目で血清タイプの変換が生じた。１３３日目は、３匹中２匹のみが血清タイプの 変換が生じた。０２７株１−４０４を投与されたどちらの場合の子犬も、接種後 ６日で血清変換が生じた。

第５図に示すように、ワクチン接種されたすべての子犬の真中にイヌパルボウイ ルスが検出された。

（以下、余白） 第５表：接種後における糞中ウィルス潜在接種群　子犬番号　接種後ウィルス検 出（日）ＣＰＶ−２株　Ｐ６９”　Ｅｌ　−−＋　＋　＋　−−−−−−−（対 ｐｙ群）　３０　−　−　−　−　−　−　−　−　−　−　−　−ｃｐｖ株１ −４０４’　？−−−＋＋＋−−−−−−ｃｐｖ−２株　ｐ６ｇ−−１１、−＋ ＋＋＋＋−−−−−−（対照ｇＦ）　１０　−　−　−　−　−　−　−　−　 −　−　−　−ｃｐｖ株１−４０４”″１６−−−−十＋＋−−−−−３３　＝ 　＋＋十＋＋−−−＋　−− （対照ｇ＄）　６　−　−　＋　−−−−−−−−−ａ　：　子犬−匹あたりｌ ＯｏＴＣＩＤ、。を皮下接種。

１１、子犬−匹あたりＩ　０６ＴＣＩ　Ｄ、ｏを経口接種。

真中にウィルスが検出されるのは、０２７株１−４０４よりもＣＰＶ−２株Ｐ６ ９を接種されたほうの子犬が早くて期間が短い。また、ｃｐｖ株１−４０４は、 皮下接種された群の対照群に広がった。一方、ｃｐｖ−ｚ株Ｐ６９は対照群には 感染しなかった。

６、異なる細胞培養系におけるＣＰｖ増殖の比較ＣＰＶ−２株Ｐ６９は、異なる 細胞培養系におい増殖する場合に既知のＣＰＶの株と翼なった特性を示す。

本研究では、４つの異なった細胞培養系を用いてＣＰＶ−２株Ｐ６９の増殖を比 較した。これらの細胞培養系は、マジノダービー（Ｍａｄｉｎ　Ｄａｒｂｙ）大 賢Ｍｌｌ＋ｃｆ）細胞、フラノデル（Ｃｒａｎｄｅｌｌン猫腎１！　（ＣｒＦＫ ）　ｌｉＥ胞、ネコ腎ＩＩ　（Ｆｒ）　１Ｂ胞、モしてＡ７２細胞である。

５Ｘ、１０’細胞／平方センチメートル含むフラスコを２つ用意し、それぞれＣ ＰＶ−２株Ｐ６９またはノビバブクパルボ・ン一（ｃｐｖ株１−４０４を含むと 思われる）のどちらか一方を１０４７〜１０５・２ＴＣＩＤ、、接種した。

接種後に細胞培養系に対する細胞変性効果（ＣＰＥ）について真ぺた（茶６表参 照）。どのウィルスでもひとつの細胞型に対して１００％ＣＰＥを示した場合、 その細胞型のすべてのフラスコから細胞を回収して凍結し、かつ粉砕した。回収 産物をＣｒＦＫ細胞で滴定した（第６８！Ｉおよび第６Ｃ表参照）。茅６Ａ表な いし第６Ｃ表に示された結果から明らかなように、ＣＰＶ−２株Ｐ６９はノビバ ブクバルポ・／−に比べて、細胞培養系に感染して細胞変性効果（ＣＰＥ）を示 す時期が早い。また、細胞培養系によって略染性ウィルスの産量に違いがある。

どちらのウィルス株もＣｒＦＫ懸濁培養と比較してＣｒＦＫ単層培養での滴定の 方が力価がより低くなっていた。この力価測定系の遅いによる違いは、／ビバノ クパルボ・７−の場合の方が大きかった。さらに、ウィルス株間の違い＋ｔ、Ｈ 著であった（ｐ＜ｏ、０１）。

（以下、余白） ＊６　Ａｌ１　；　Ｘなる細胞培養系でのｃｐｖ各株による細胞変性効果接種後 の時間−ＣＰＥスコア９ 細胞型　ウィルスの株　２２　４５　７２　９４”Ｉｌｌ胞変性効果（ＣＰＥ） スコア。

−零　ＣＰＥ認められず ＋／−＝　ＣＰＥ痕跡ｊＩ度 ＋　＝　識別可能なＣＰＥ　隈られた範囲＋＋＝　明らかなＣＰＥ　培養の５０ ％＋＋＋＝　明らかなＣＰＥ　培養の７５％＋＋＋＋　＝　１００％ＣＰＥ 簗６Ｂ表：ｌｌ々の細胞培養系で増殖するｃｐｖ各株の力価ＣｒＦＫ懸濁細胞培 養での滴定 細胞型 ウィルス株間 ＣＰＶ−２Ｐ６９　４．６５”　４．８　４．６５　５．５Ｎｏｂｉｖａｃ　Ｐ ａｒｖｏ−Ｃ４，５５５，６５５，０５，６５ｊｌｌｒ６ｃ表：Ｎ々の細胞培養 系で増殖するＣＰＶ各様の力価ＣｒＦＫＩ１１層細胞培養での滴定 細胞型 ライｔ、２６）　株ＭＤＣＫ　ＦＫ　ＣｒＦＫ　Ａ７２ＣＰＶ−２Ｐ６９　４． ２”　４．５　４．３　４．５Ｎｏｂｉｖａｃ　Ｐａｒｖｏ−Ｃ３，６４，５３ ，５４，５”Ｔ　ＣＩ　Ｄ５゜ｍ　Ｌ ７、ＤＮＡ分析 自己複製するパルボウイルスのゲノムは、重複し、かつ遺伝子をコードしない領 域を含むものである。このような両行きは、４５１３番目のヌクレオチドと５０ １１の番目のヌクレオチドの間にある。この領域は約５００のヌクレオチドから なり、１２００塩基対からなるＨａｅｌｌｒ断片を含む。ＣＰＶゲノムにおける ヌクレオチド４５１３と５０１１の間にあるこの領域の割合は、ＣＰｖ株！−４ ０４と同様に、ＣＰＶ−２株Ｐ６９およびＣＰＶ−２株Ｐ　９２　ニラＬ１ｒｇ へらＣＰＶ−２Ｐ６９　ＴＡＴ　ＣＡＡＣＴＡＣＰＶ−２Ｐ９８　ＴＡＴ　ＣＡ ＡＣＴＡｃｐｖ株ｒ−４０４ＴＣＴＴＣＡＡＣＴＡ４５９５°　４６０４” ０おおよそのヌクレオチド領域 さらに、藁１図を参照すると、ｃｐｖ株のＨｐｈ−１による消化は、ｃｐｖ−２ 株Ｐ６９に見出される箪三バッドは、ＣＰＶ−２株Ｐ９２およびｃｐｖ株■−４ ０４の対応するバンドと比較して分子量が大きい（筆１図：橿準は、ラムダＢＳ 　Ｔ　Ｅ　ＩＩ　（Ｓｔｄ−ＬＡＭＢＤＡ　ＢＳＴ　Ｅｌ＋）　）。

第１図 ’５ｔ（１＝ラムダＢＳＴ　Ｅ　ＩＩ 国際調査報告 ＡＩＪｈ’ＥＮ丁Ｏｗ、１１１１ＥＩｔＮＡＴＩαａ　５ＥＡＲＯＩ　ＲＥＰα ＩＴｃＮ涌ラル五困にｐＰうｌいＴ工Ｊ搬二にψ些下四り聾ＷＯｅ４０２１１４ ７　ｃｐ　１１７０６３　１Ｌ　７０７０４ＥＮＤ　ＣＦ　ＡＩ量在ス トラリア国　２７６３　ニュー　サウス　ウエールズ　クラニーヒル　キャラン ドラ　アベニュ　６

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. １．弱毒イヌバルボウイルスであって、該弱毒イヌバルボウイルスは毒性が低く 、また母親由来イヌバルボウイルス（ＣＰＶ）抗体を有する仔犬において免疫応 答を引き出すことが可能であることを特徴とする弱毒イヌバルボウイルス。
2. ２．請求の範囲第１項記載の弱毒イヌバルボウイルスであって、該弱毒イヌバル ボウイルスは、きらに前記弱毒イヌバルボウイルスを接種された動物から放出さ れたウイルスがどれでも感染率が低くいことを特徴とする弱毒イヌバルボウイル ス。
3. ３．請求の範囲第１項または第２項のいずれか一項記載の弱毒イヌバルボウイル スであって、該弱毒イヌバルボウイルスは、ＥＣＡＣＣ寄託番号Ｖ８９０４２６ ０１号（ＣＰＶ−２株Ｐ６９）の抗原性および毒性特性を有することを特徴とす る弱毒イヌバルボウイルス。
4. ４．イヌバルボウイルスであって、該イヌバルボウイルスはＥＣＡＣＣ寄託番号 Ｖ８９０４２６０１号のウイルスであることを特徴とするイヌバルボウイルス。
5. ５．ワクチンであって、該ワクチンは請求の範囲第１項または第４項のいずれか 一項記載の弱毒イヌバルボウイルスを有効量含むことを特徴とするワクチン。
6. ６．請求の範囲第５項記載のワクチンであって、該ワクチンに含まれるＣＰＶの 有効量は、投与量あたりの５０％組織培養阻害投与量（ＴＣＩＤ５０）が少なく とも１０４．８であること特徴とするワクチン。
7. ７．請求の範囲第５項または第６項のいずれか一項記載のワクチンであって、該 ワクチンはＣＰＶを生のかたちで、あるいは不活化のかたちで、あるいはその両 方のかたちで含むことを特徴とするワクチン。
8. ８．請求の範囲第５項ないし第７項のいずれか一項記載のワクチンであって、該 ワクチンはきらに他の薬剤学的に許容される化合物または抗原またその一部分ま たはウイルスまたはウイルス粒子を含むことを特徴とするワクチン。
9. ９．請求の範囲第５項ないし第８項のいずれか一項記載のワクチンであって、該 ワクチンはさらに凍結乾燥調製物または懸濁液のかたちにあることを特徴とする ワクチン。
10. １０．イヌにおいてイヌバルボウイルスからの感染を防ぐための方法であって、 該方法は、請求の範囲第１項ないし第４項のいずれか一項記載の弱毒ウイルスを 有効量含むワクチンをイヌに投与することを含むことを特徴とするイヌバルボウ イルス感染防御方法。
11. １１．イヌにおいてＣＰＶからの感染を防ぐための方法であって、該方法は請求 の範囲第５項ないし第９項のいずれか一項記載のワクチンをイヌに投与すること を含むことを特徴とするイヌバルボウイルス感染防御方法。