DE69023140T2

DE69023140T2 - Attenuiertes hundeparvovirus (cpv), cpv enthaltender impfstoff und verfahren zur verhütung von infektionen durch cpv bei hunden.

Info

Publication number: DE69023140T2
Application number: DE69023140T
Authority: DE
Inventors: Lynette Lavidis; David MCGAVIN
Original assignee: Arthur Webster Pty Ltd
Current assignee: Fort Dodge Australia Pty Ltd
Priority date: 1989-08-08
Filing date: 1990-08-08
Publication date: 1996-03-21
Anticipated expiration: 2010-08-09
Also published as: WO1991002054A1; DK0485463T3; EP0485463A1; EP0485463A4; ATE129284T1; EP0485463B1; NZ234815A; DE69023140D1

Description

Gebiet der Erfindung
Das canine Parvovirus (CPV-2) ist ein Pathogen für Hunde, welches mit Erbrechen, Diarrhö, Depression, Pyrexie, variabler Leukopenie und rascher Dehydration assoziiert ist. Das Parvovirus erfordert zur Unterstützung seines Wachstums aktiv teilende Wirtszellen, und daher sind Zellen mit einer hohen Turnoverrate am meisten empfänglich, und verschiedene Gewebe können in verschiedenen Entwicklungsstadien empfänglicher sein. Folglich sind eine Myokarditis und, noch wichtiger eine Enterititis, die beiden am häufigsten auftauchenden Krankheitsbilder. Hintergrund der Erfindung
Welpen sind für eine Infektion durch das Virus besonders empfänglich, insbesondere seit dem Bestehen regelmäßig durchgeführter Impfprogramme. Beimpfte Hündinnen übertragen den Welpen eine kurzfristige Immunität als Ergebnis der Übertragung von maternal abgeleitetem Antikörper (MDA). Maternale Antikörper bieten für Welpen während ihrer ersten Wochen einen gewissen passiven Schutz, wobei die Welpen häufig eine Antikörpermenge im Serum aufweisen, die 50 % derjenigen ihres Elternteils entspricht. Die Menge der maternal abgeleiteten Antikörper nimmt jedoch exponentiell ab mit einer Halbwertszeit von etwa 8- 10 Tagen.
Während die exponentielle Reduktion von MDA voranschreitet hat man festgestellt, dab eine Impfung mit handelsüblich erhältlichen Vakzinen während dieser Phase dazu führen kann, daß keine Reaktion auf dem Wege verstärkter Antikörper ausgelöst wird. Dieses Phänomen ist eingehender in verschiedenen wissenschaftlichen Veröffentlichungen beschrieben, wie in Cornell Veterinarian, 1982, 72: 103-119 (Pollock) und Cornell Veterinarian 1981, 71: 408-427 (Carmichael et al.).
Es scheint, daß, obgleich der MDA anhand von Standardverfahren (wie Hämagglutination-Inhibierung (HI), ELISA oder Serumneutralisation etc.) nachweisbar bleibt, die Vakzinen bei der Auslösung einer aktiven Immunantwort in dem Welpen extrem unzuverlässig sind. Der MDA kann noch für eine gewisse Zeit nachgewiesen werden, nachdem seine Menge unterhalb eines Wertes liegt, die als Minimum betrachtet wird, um einen Schutz gegen die Krankheit zu liefern (unter Anwendung des HI-Tests entspricht dies einem Titer von ungefähr 64 Hämagglutination-inhibierenden Einheiten pro 50 ul, oder HIU/50 ul). Demgemäß gibt es eine als "Immunitätslücke" bezeichnete Zeitdauer (typischerweise in einem Alter von 6-14 Wochen), während der die Menge der maternal abgeleiteten Antikörper unterhalb eines Wertes gefallen sind, der als schützend betrachtet wird, und während der eine Impfung nicht eine Reaktion auszulösen vermag. Während dieser Zeitdauer ist der Welpe für eine Infektion anfällig und spricht auf eine Impfung nicht an.
Es ist davon ausgegangen worden, daß eine Vakzine, die antigener als die bekannten caninen Parvovirus-Vakzinen ist, in der Lage wäre, die maternal abgeleiteten Antikörper in Welpen zu überwinden und deren eigenes Ilnrnunsystem zu stimulieren, um schützende Antikörper zu bilden.
In gewissem Umfang ist dies durch Verwendung von weniger attenuierten (und daher antigeneren) Stämmen von CPV-2 erreicht worden, wobei diese Stämme jedoch den schwerwiegenden Nachteil aufweisen, daß sie sehr einfach in den Fäzes geimpfter Tiere abgegeben werden und damit ein Risiko der Ausbreitung und der möglichen Rückbildung zur Virulenz begründen (vgl. Europäische Patentbeschreibung Nr. 189958). Ein Beispiel für einen derartigen Stamm ist der CPV-Stamm 1-404 (Institut Pasteur), von dem angenommen wird, daß er gegenwärtig in einer handelsüblichen Vakzine INTERVET "NOBIVAC PARVO-C" verwendet wird.
Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung haben durch die Auswahl geeigneter Stämme überraschenderweise gefunden, daß es möglich ist, eine Vakzine zum Schutz gegen die durch das canine Parvovirus verursachte Krankheit herzustellen, mit welcher die besonderen Probleme des Standes der Technik, einschließlich des CPV-Stainmes I-404, im Zusammenhang mit der Bereitstellung eines Schutzes von jungen Welpen, die nachweisbare Mengen von zirkulierenden maternal abgeleiteten Antikörpern aufweisen, und das Problem der Abgabe großer Mengen lebender Viren in die Fäzes von geimpften Tieren, welche möglicherweise andere Hunde infizieren können, überwunden werden.
Andere Probleme mit handelsüblich erhältlichen, gegen das Parvovirus gerichteten Vakzinen sind dokumentiert. Beispielsweise sind bestimmte Rassen (breeds) besonders empfänglich für das Phänomen der Immunitätslücke. Auch sprechen bestimmte Tiere auf wiederholte Verabreichung von Vakzine-Dosierungen nicht an, selbst dann, wenn man normalerweise erwarten würde, daß die MDA- Werte nahezu verschwunden sind. Offenbarung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung dient der Bereitstellung einer alternativen CPV-2-Vakzine, welche eine Antikörperantwort bei Hunden in Anwesenheit von maternal abgeleiteten Anti-CPV-2-Antikörpern auslöst und von geringer Virulenz ist.
Nach einem ersten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein attenuiertes canines Parvovirus mit den antigenen und Virulenzeigenschaften von ECACC Zugriffs-Nr. V89042601 (CPV-2 P69).
Nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Parvovirus derart, daß jedes Virus, das von Hunden abgegeben wird, die mit dem attenuierten CPV inokuliert sind, eine niedrige Infektionsrate aufweist.
Der im Rahmen der vorliegenden Beschreibung verwendete Begriff "eine niedrige Infektionsrate" in bezug auf ein Parvovirus bedeutet, daß das Parvovirus derart ist, daß es von infizierten Tieren nicht abgegeben wird, oder daß im Falle seiner Abgabe das abgegebene Parvovirus im wesentlichen nicht in der Lage ist, Hunde, die in Kontakt mit dem abgegebenen Parvovirus geraten, zu infizieren. Nach einer bevorzugten Ausführungsform des ersten Aspektes umfaßt die vorliegende Erfindung ein Stamm des caninen Parvovirus (CPV-2), welcher von den Anmeldern am 26. April 1989 bei der European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), Porton Down, ,Salisbury, GB, unter der Zugriffs-Nr. V89042601 hinterlegt worden ist. Dieser Stamm entspricht der Passage 69 (P69) eines attenuierten caninen Parvovirus-Stammes K3i und wird nachfolgend mit CPV-2 P69 bezeichnet.
Die Attenuierung der Viruskultur für die erfindungsgemäßen Zwecke erfolgte durch serielle Passage der Viruskultur in einem geeigneten Kultursystem, wie der felinen Nieren (FK)-Zellinie. Das Virus wird unter Anwendung eines Verfahrens der Grenzverdünnung kloniert und passagiert, um das mit Passage 69 (P69) bezeichnete virale Seed-Lot zu ergeben.
Nach einem zweiten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung eine Vakzine, die eine wirksame Menge des oben definierten attenuierten caninen Parvovirus umfaßt.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das attenuierte canine Parvovirus derart, daß jedes Virus, das von Hunden abgegeben wird, die mit der Vakzine inokuliert sind, eine niedrige Infektionsrate aufweist.
Nach einer besonders bevorzugten Ausführungsform betrifft der zweite Aspekt der Erfindung eine Vakzine, welche eine wirksame Menge des bei der ECACC unter der Zugriffs-Nr. V89042601 hinterlegten CPV-Stammes umfaßt, welcher CPV-2 P69 entspricht.
Eine wirksame Menge, wie sie im Rahmen der vorliegenden Beschreibung und der Ansprüche als Angabe verwendet wird, ist eine Menge, die ausreicht, um eine Iinrnunreaktion auszulösen, vorzugsweise mindestens 10&sup4;.&sup8; 50 % Gewebekultur-infektiöse Dosen (TCID&sub5;&sub0;) pro Dosis.
Für die erfindungsgemäße Vakzine kann das neue CPV-2 P69 entweder in lebender Form oder in einer inaktivierten abgetöteten Form verwendet werden. Vorzugsweise umfaßt die erfindungsgemäße Vakzine einen lebenden CPV-2 P69-Stamm oder seine Derivate oder funktionellen Äquivalente.
Die Vakzine kann andere Bestandteile wie Stabilisatoren, Adjuvanzien, Trägerstoffe, andere pharmazeutisch verträgliche Verbindungen oder jedes andere Antigen oder ein Teil davon umfassen. Die Vakzine kann in Form einer lyophilisierten Zubereitung oder als eine Suspension vorliegen, wobei sämtliche dieser Formen auf dem Gebiet der Impfstoffherstellung üblich sind.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform kann die erfindungsgemäße Vakzine mit anderen Viren oder Organismen kombiniert werden, die zur Impfung verwendet werden (wie es bei vielen derzeit im Handel erhältlichen Vakzinen der Fall ist), wie Hundestaupe, infektiöses Hepatitisvirus, canine Parainfluenza oder Bordetella, wobei die Auswahl nicht auf diese Beispiele beschränkt ist.
Erfindungsgemäß ist CPV-2 P69 in einem geeigneten Zellkultursystem, vorzugsweise FK- oder Hundenieren-Zellen (wie MDCK), unter optimalen Bedingungen kultiviert worden, und die Kultur wird unter Anwendung bekannter Techniken zur Formulierung einer Vakzine zur Verabreichung verwendet.
Es ist gefunden worden, daß CPV-2 P69 in eine Vakzine eingearbeitet werden kann, die zur Bereitstellung eines Schutzes gegen die canine Parvovirus-Krankheit erfolgreich ist, selbst bei Anwesenheit von Mengen des maternal abgeleiteten Antikörpers, von denen man normalerweise erwarten würde, daß sie eine Impfung beeinträchtigen.
Der vorliegende virale Stamm V89042601 läßt sich von zuvor bekannten Stämmen von CPV-2 unterscheiden aufgrund seiner serologischen Antwort in sowohl seropositiven als auch seronegativen Hunden, seiner Wachstumseigenschaften in Zellkulturen, der Variationen in seiner DNA-Sequenz wie auch anhand seiner besonderen Eigenschaften der Abgabe von lebenden Viren von Tieren, denen eine Vakzine verabreicht worden ist, die den neuen Stamm umfaßt.
Insbesondere kann die vorliegende Erfindung von vorhandenen Vakzinestämmen von CPV unterschieden werden durch einen Vergleich ihrer viralen Ausbeuten im Falle der Inokulation von Zellkulturen. Es bestehen offensichtliche Unterschiede in der Fähigkeit verschiedener Stämme der CPV-Vakzine, in Zellkulturen von verschiedenen Typen zu wachsen, wie beispielsweise zwischen felinen und caninen Zellkulturen.
Die im Rahmen der vorliegenden Beschreibung genannten Antikörpertiter wurden unter Anwendung eines standardisierten Hämagglutination-Inhibitions-Tests unter Anwendung zweifacher Verdünnungen gemessen und sind als Kehrwert der höchsten Serumverdünnung ausgedrückt, die eine Agglutination von roten Blutkörperchen des Schweines vollständig inhibiert. Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Fig. 1 - Hph-I-Verdau von CPV-2 P69, CPV-2 P98 und CPV-Stamm I-404, die Unterschiede im Molekulargewicht der verschiedenen Fragmente aufzeigen. Bester Weg zur Ausführung der Erfindung 1. Attenuierung von CPV-2
Ein Derivat des CPV-2-Stammes K3i, isoliert aus einem virulenten Fall von Parvovirus, wurde erhalten von der James Cook University, Townsville, Australien. Das Virus wurde von dem Anmelder durch serielle Passage in einer felinen Nieren (FK)- Zellinie und einer Hundenieren (MDCK)-Zellinie unter Anwendung von Standardverfahren zum Passagieren attenuiert.
Die Ernte der Passage 61 wurde gereinigt mittels Standardtechniken zur Grenzverdünnung. Dieses Reinigungsverfahren wurde zweimal für insgesamt 3 Grenzverdünnungspassagen wiederholt. Die Ernte der dritten Grenzverdünnungspassage (d.h. Passage 64) des Virus in FK-Zellen wurde ein weiteres Mal in einem Schritt zur Virusvervielfältigung passagiert (Passage 65). 2. Herstellung von Vakzine-Seed-Lots
Das gereinigte Virus aus Passage 65 wurde vier weitere Male durch Inokulation von FK-Kulturen passagiert und für eine Zeitdauer von jeweils 3 bis 4 Tagen bei 37 ºC inkubiert zum Erhalt der Passage 69, welche bei -70 ºC aufbewahrt wurde und der unter der Bezeichnung V89042601 hinterlegte Stamm gemäß der bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist. 3. Herstellung von CPV-2-Vakzine umfassend P 69
Die FK-Zellkulturen werden mit P68 inokuliert und 3 bis 4 Tage lang bei 37 ºC inkubiert. Die Kultur wird unter Anwendung von bekannten Standardverfahren (in Abhängigkeit davon, ob eine lebende oder inaktivierte Vakzine erwünscht ist) geerntet, wodurch eine Virusmasse erhalten wird, welche nachfolgend auf Virustiter (Potenz) und Sterilität analysiert wird. Die Virusmasse wird zusammen mit einem Stabilisator formuliert und zur Verwendung bei -20 ºC aufbewahrt. Die Vakzine kann gewünschtenfalls durch Gefriertrocknen weiter behandelt werden. 4A. Ergebnisse der Impfung bei 6 Wochen alten Welpen
Sechs Wochen alte Welpen (Mini-Foxterrier) wurden durch intraperitoneale Injektion von 2 ml eines positiven Serums mit hohem Titer passiv immunisiert. Die Titer vor der Impfung (nach der passiven Immunisierung) wurden ermittelt wie in Tabelle 1 dargestellt; die Antikörperwerte von ≤ 32 werden nicht als gegen die Krankheit schützend betrachtet, wobei sie jedoch die Reaktion eines Welpen auf die Impfung beeinträchtigen können.
Anschließend wurden die Welpen mit einer CPV-2 P69 umfassenden Vakzine wie beschrieben geimpft, wobei gemäß Tabelle 1 verschiedene Dosierungspläne angewendet wurden. 15 Tage nach der Impfung wurden die in Tabelle 1 dargestellten Antikörpertiter gemessen. Lediglich ein Hund, dem (10&sup4;.¹TCID&sub5;&sub0;) verabreicht worden war, zeigte keine Reaktion. Tabelle 1 Experiment zum maternalen Antikörper4B. Vergleich von caninen Parvovirus-Vakzinen bei seropositiven Welken
Es wurden die serologischen Daten von 6 Wochen alten seropositiven Welpen verglichen, die mit einer Vakzine geimpft worden waren, welche entweder CPV-2 P69 oder NOBIVAC PARVO-C Batch 4545 (von der angenommen wird, daß sie den CPV-Stamm 1-404 enthält) enthielt.
Sechs Wochen alte Beagle-Welpen von Hündinnen, die während der Tragezeit mit einer inaktivierten CPV-Vakzine geimpft worden waren, wurden geimpft mit einer Einzeldosis der passenden Vakzine und wiederholt geimpft mit derselben Vakzine im Alter von 9 Wochen.
Die Welpen, die NOBIVAC PARVO C erhalten hatten, stammten alle aus demselben Wurf wie einige der Welpen, die CPV-2 P69 erhalten hatten, d.h. sie waren zueinander passende Gruppen.
Die Vakzine, welche CPV-2 P69 beinhaltete, wurde mit einem Titer von 10&sup5;.&sup8;TCID&sub5;&sub0; pro Dosis verwendet. Nobivac Parvo-C wurde mit einem Titer von 10&sup5;.&sup4;TCID&sub5;&sub0; pro Dosis (dies war der Titer von Parvo-C wie bezogen) verwendet.
Den Welpen wurde im Alter von 3, 6, 8, 9 und 11 Wochen Blut abgenommen, um die Antikörpertiter gegen CPV zu messen.
Die Titer der Hündinnen zum Zeitpunkt des Werfens betrug zwischen 32 und 1024 HIU/50 ul. Die Welpen wiesen im Alter von 3 Wochen eine Menge an maternal abgeleitetem Antikörper gegen das canine Parvovirus auf, welche zwischen 16 und 512 HIU/50 ul betrugen. Diese Titer entsprachen etwa 50 % derjenigen des Muttertieres.
Die Hämagglutination-Inhibitions-Titer der Welpen vor und nach der Impfung sind in Tabelle 2 angegeben. TABELLE 2 ERGEBNISSE VON SEROLOGISCHEN TESTS BEI WELPEN VOR UND NACH DER IMPFUNG
Die Titer bei den Welpen waren im Alter von 6 Wochen (zum Zeitpunkt der ersten Impfung) 4- bis 8fach abgesenkt (< 16 bis 64). 23 von 33 (70 %) Welpen wiesen im Alter von 6 Wochen maternale Antikörpermengen von > 16 HIU/50 ul auf.
Nach der Impfung im Alter von 6 Wochen sprachen 23 von 24 (95,8 %) Welpen im Alter von 8 Wochen auf die CPV-2 P69 enthaltende Vakzine mit Titern im Bereich von 2048 bis 16 384 an. Lediglich zwei von neun (22,2 %) Welpen hatten in derselben Zeitdauer auf die Impfung mit Nobivac Parvo-C angesprochen. Die Titer für Nobivac Parvo-C lagen im Bereich von 2048 bis 4096.
Sämtliche Welpen beider Gruppen, die nicht auf die Impfung im Alter von 6 Wochen ansprachen, reagierten auf eine zweite Impfung, die im Alter von 9 Wochen vorgenommen wurde. Die Stärke der Reaktion bei diesen Welpen war gleich derjenigen von Welpen, die auf die erste Impfung ansprachen.
Die serologischen Ergebnisse in Tabelle 2 zeigen, daß die attenuierte lebende canine Parvovirus P69-Vakzine in hohem Maße immunogen ist. 23 von 24 Welpen mit Werten für passiv erworbene Antikörper im Bereich von < 16 bis 64 zeigten eine Antikörperreaktion von mindestens 2048 HIU/50 ul, wenn sie im Alter von 6 Wochen mit einer Vakzine geimpft wurden, die CPV-2 P69 enthielt.
Demgegenüber zeigten lediglich 3 von 9 im Alter von 6 Wochen mit Nobivac Parvo-C geimpfte Welpen einen Anstieg des Antikörpertiters. Die 3 Welpen, die im Anschluß an die erste Impfung einen Anstieg des Antikörpertiters aufwiesen, hatten alle vor der Impfung Titer von 16. Die verbleibenden 6 Welpen hatten Titer von 32 und 64, und keine Antikörperreaktion konnte gefunden werden.
Die serologischen Daten zeigen, daß CPV-2 P69 Mengen von passiv erworbenen Antikörpern in Welpen, die mit im Stand der Technik vorhandenen Vakzinen gegen das canine Parvovirus interferieren, überwinden. 5A. Rückbildung zur Virulenz
Um jegliches von geimpften Hunden abgegebene Virusmaterial auf Virulenz oder Rückbildung zur Virulenz zu untersuchen, wurden von den geimpften Hunden (Passage 1) Fäzesproben gesammelt und an zuvor CPV-naive Hunde oral verabreicht (Passage 2). Weitere Fäzesproben von den letztgenannten Hunden wurden genommen und über weitere ungeimpfte Hunde passagiert (vgl. Tabelle 3).
Ein Passagieren des Virus wurde mit Ausnahme von 2 Hunden der Gruppe 2B (vgl. Tabelle 3), die am Tage 14 nachweisbar Antikörper entwickelt hatten, nicht beobachtet. Das Virus konnte jedoch weder in Fäzes der Hunde 18 noch in Fäzes der Hunde 2B nachgewiesen werden. Weitere Anzeichen für eine Virusabgabe wurden nicht gefunden. TABELLE 3 Versuch zur Rückbildung zur Virulenz - Ergebnisse
2 Hunde wurden pro Passage inokuliert.
Hunde der Passage 1 - Impfung mit P69 caninem Parvovirus, 10 ml subkutan und 1 ml oral.
Hunde der Passaae 2 - Orale Verabreichung von 5 ml einer Fäzessuspension (entsprechend 2 g Fäzes), erhalten von Hunden der Passage 1.
Hunde der Passage 3 - Orale Verabreichung von 10 ml einer Fäzessuspension (= 3 g), erhalten von Hunden der Passage 2.
Hunde der wiederholten Passage 2 - Orale Verabreichung von 10 ml einer Fäzessuspension (= 3 g) (aufbewahrt bei -30 ºC) von Hunden der Passage 1.
Hunde der Passage 1B - Impfung mit P69 caninem Parvovirus, 10 ml subkutan und 1 ml oral.
Hunde der Passage 2B - Orale Verabreichung von 10 ml einer Fäzessuspension (= 3 g), erhalten von Hunden der Passage 1B.
Hunde der Passage 3B - Verabreichung von 30 ml einer Fäzessuspension (= 15 g), erhalten von Hunden der Passage 2B.
Hunde der Passage 4B - Verabreichung von 30 ml einer Fäzessuspension (= 15 g), erhalten von Hunden der Passage 3B.
Hunde der Passage 5B - Verabreichung von 30 ml einer Fäzessus- Pension (= 15 g), erhalten von Hunden der Passage 4B. 5B. Veruleich von Parvovirus Vakzine-Stämmen in seronegativen Welken
Ein Vergleich der viralen Abgabeeigenschaften und Serologie in Welpen im Anschluß an eine Verabreichung von entweder CPV-2 P69 oder CPV-Stamm 1-404 wurde durchgeführt.
Welpen im Alter von 8 bis 11 Wochen wurden zufällig in vier Gruppen eingeteilt und entweder mit CPV-2 P69 mit einem Titer von 10&sup6;.&sup0;TCID&sub5;&sub0; pro Dosis oder mit CPV-Stamm I-404 mit derselben Dosis wie in Tabelle 4 dargestellt inokuliert.
Die Antikörpertiter im Serum wurden vor der Inokulation und 6 sowie 13 Tage nach Inokulation gemessen. Beginnend am Tag 2 nach der Inokulation wurden von jedem Welpen über eine Zeitdauer von insgesamt 12 Tagen täglich Fäzesproben genommen. Jede Fäzesprobe wurde in Dulbeccos Phosphatpuffer (1 : 10) resuspendiert, zur Entfernung von Bakterien filtriert und felinen Nierenzellen inokuliert. TABELLE 4 SEROKONVERSION IM ANSCHLUß AN EINE INOKULATION MIT CANINEN PARVOVIRUS-STÄMMEN
Im Anschluß an die subkutane Inokulation sprachen 100 % der Welpen, die CPV-2 P69 erhalten hatten, 6 Tage nach der Inokulation mit Titern von ≥ 1024 HIU/50 ul an. Demgegenüber zeigten lediglich 60 % (3 von 5) der Welpen, die den CPV-Stamm I-404 erhalten hatten, 6 Tage nach Inokulation mit Titern von ≥ 1024 HIU/50 ul) eine Reaktion.
1 von 3 Welpen, die mit CPV-2 P69 inokuliert worden waren, zeigten 6 Tage nach einer oralen Inokulation eine Serokonversion. Am Tage 13 zeigten lediglich 2 von 3 eine Serokonversion. Beide Welpen, denen der CPV-Stamm I-404 oral verabreicht worden war, zeigten 6 Tage nach Inokulation eine Serokonversion.
Das canine Parvovirus wurde in den Fäzes von allen inokulierten Welpen wie in Tabelle 5 angegeben nachgewiesen. TABELLE 5 FÄZESABGABE DES VIRUS NACH INOKULATION
Die mit CPV-2 P69 inokulierten Welpen gaben das Virus früher und über eine kürzere Zeitdauer ab als diejenigen Welpen, welche mit dem CPV-Stamm I-404 inokuliert worden waren. Ferner breitete sich der CPV-Stamm I-404 auf die Kontrolle in der subkutan inokulierten Gruppe aus, wohingegen CPV-2 P69 keine der Kontrollen infizierte. 6. Vergleich des CPV-Wachstums in verschiedenen Zellkulturen
CPV-2 P69 zeigt im Falle der Kultivierung in verschiedenen Zellkulturen im Vergleich zu zuvor veröffentlichten CPV-Stämmen unterschiedliche Eigenschaften.
Im Rahmen der vorliegenden Studie wurden vier getrennte Zellinien zum Vergleich des Wachstums von CPV-2 P69 eingesetzt. Diese waren: Madin Darby Canine Nieren (MDCK)-Zellen, Crandell Feline Nieren (CrFK)-Zellen, Feline Nieren (FK)-Zellen, und A72- Zellen.
Jeweils zwei 5 x 10&sup4;-Zellen/cm² enthaltende Kolben wurden entweder mit CPV-2 P69 oder mit Nobivac Parvo C Batch (von welchem angenommen wird, daß er den CPV-Stamm 1-404 enthält) mit einem Inokulumwert zwischen 10&sup4;.&sup7; - 10&sup5;.² TCID&sub5;&sub0; inokuliert.
Die Zellkulturen wurden hinsichtlich cytophatischer Effekte (CPE) im Anschluß an die Inokulation überwacht (vgl. Tabelle 6A). Wenn einer der Viren in einer Zelltype 100 % CPE verursachte, wurden sämtliche Kolben dieses Zelltyps durch Einfrieren und Auftauen geerntet. Die Ernte wurde in CrFK-Zellen titriert (vgl. Tabellen 6B und 6C). Aus den Ergebnissen der Tabellen 6A-6C wird deutlich, daß CPV-2 P69 Zellkulturen infiziert und cytopathische Effekte (CPE) zu einem früheren Zeitpunkt auslöst als bei Kulturen, die mit Nobivac Parvo-C gemäß nächstkommendem Stand der Technik infiziert worden waren. Die Unterschiede in den Ausbeuten infektiöser Viren aus den verschiedenen Zellkulturen wurden ermittelt. Die Titer von beiden Virusstämmen waren im Falle der Titration von CrFK-Monolayer-Kulturen geringer als im Falle der Titration von CrFK-Suspensionskulturen. Die Abweichung der Titer zwischen den beiden Titrationssystemen war im Falle von Nobivac Parvo-C größer. Dieser Unterschied zwischen Virusstämmen war in hohem Maße signifikant (p < 0,01). TABELLE 6A CYTOPATHISCHER EFFEKT VON CPV-STÄMMEN IN VERSCHIEDENEN ZELLKULTUREN TABELLE 6B TITER VON IN VERSCHIEDENEN ZELLKULTUREN KULTIVIERTEN CPV-STÄMMEN - TITRATION IN CrFK-SUSPENSIONSZELLKULTUREN TABELLE 6C TITER VON IN VERSCHIEDENEN ZELLKULTUREN KULTIVIERTEN CPV-STÄMMEN - TITRATION IN CrFK MONOLAYER-ZELLKULTUREN7. DNA-Analyse
Ein Merkmal von autonom replizierenden Parvoviren ist, daß das Genom eine Region umfaßt, welche dupliziert und nicht-kodierend ist. Diese Region des Genoms liegt zwischen den Nukleotiden 4513 und 5011. Diese Region von ungefähr 500 Nukleotiden ist in einem HaeIII-Fraginent von 1200 Basen enthalten. Ein Teil dieser Region zwischen den Nukleotiden 4465 und 5011 im CPV- Genom ist für CPV-2 P69 und CPV-2 P98 sowie für den CPV-Stamm I-404 sequenziert worden.
Basenunterschiede wurden ungefähr am Nukleotid 4600 wie folgt lokalisiert:
CPV-2 P69 TAT_CAACTA CPV-2 P98 TAT_CAACTA CPV-Stamm 1-404 TCTTCAACTA 4595* 4604*
*ungefähre Nukleotidregion
Ferner zeigte ein Verdau des CPV-Stammes mit Hph-I unter Bezugnahme auf Fig. 1 deutlich, daß die dritte Bande von CPV-2 P69 ein höheres Molekulargewicht aufwies als die korrespondierende Bande von sowohl CPV-2 P98 als auch vom CPV-Stamm I-404 (Fig. 1 - Std = LAABDA BST EII).
1. Attenuiertes canines Parvovirus mit den antigenen und Virulenzeigenschaften von ECACC Zugriffs-Nr. V89042601 (CPV- 2 P69).
2. Attenuiertes CPV nach Anspruch 1, ferner dadurch gekennzeichnet, daß jedes Virus, das von Tieren abgegeben wird, die mit dem attenuierten CPV inokuliert sind, eine niedrige Infektionsrate aufweist, wie sie im vorhergehenden definiert ist.
3. Canines Parvovirus ECACC V89042601.
4. Vakzine umfassend eine wirksame Menge eines attenuierten caninen Parvovirus gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3.
5. Vakzine nach Anspruch 4, in der die Menge an CPV mindestens 10&sup4;.&sup8; 50 % Gewebekultur-infektiöse Dosen (TCID&sub5;&sub0;) pro Dosis beträgt.
6. Vakzine nach einem der Ansprüche 4 oder 5, in der das CPV entweder in einer lebenden oder attenuierten Form oder in beiden Formen vorliegt.
7. Vakzine nach einem der Ansprüche 4 bis 6, ferner umfassend andere pharmazeutisch verträgliche Verbindungen, oder jedwedes Antigen oder Teil davon oder Virus oder Viruspartikel.
8. Vakzine nach einem der Ansprüche 4 bis 7 in Form eines lyophilisierten Präparates oder einer Suspension.
9. Verwendung eines attenuierten Virusstammes gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei der Prävention einer Infektion von Hunden mit caninem Parvovirus.
10. Verwendung nach Anspruch 9, wobei das Medikament eine Vakzine gemäß einem der Ansprüche 4 bis 6 ist.