ES2263317B2 - Uso del gen ncsag4 para el diagnostico y prevencion de la neosporosis, y como marcador para el analisis de la patogenia. - Google Patents
Uso del gen ncsag4 para el diagnostico y prevencion de la neosporosis, y como marcador para el analisis de la patogenia. Download PDFInfo
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Abstract
Uso del gen NcSAG4 para el diagnóstico y prevención de la neosporosis, y como marcador para el análisis de la patogenia. La invención se refiere al empleo del gen NcSAG4, su RNA mensajero, los oligonucleótidos diseñados en función de su secuencia nucleotídica, o cualquiera de sus fragmentos, así como la proteína NcSAG4 que codifica, o cualquiera de sus formas recombinantes, los vectores de expresión, así como las células hospedadoras que los contengan, para el diagnóstico y la vacunación para la prevención de la neosporosis, así como su uso como marcador específico de la fase de bradizoíto de N. caninum, para el análisis de la patogenia o de la eficacia de las vacunas frente al establecimiento de la infección crónica en el hospedador intermediario.
Description
Uso del gen NcSAG4 para el diagnóstico y
prevención de la neosporosis, y como marcador para el análisis de la
patogenia
La presente invención se establece en el campo
de la sanidad animal y se refiere, según se expresa en el enunciado
de esta memoria descriptiva, al diagnóstico, análisis de la
patogenia y la prevención de la enfermedad producida por el parásito
protozoo Neospora caninum. De forma más concreta la
invención se relaciona con la molécula polinucleotídica
correspondiente al gen NcSAG4 de N. caninum, su RNA
mensajero y el antígeno que codifica, NcSAG4, siendo éste una
proteína específica del estadio de bradizoíto, así como los
oligonucleótidos, los vectores recombinantes, las células
hospedadoras transformadas, y las proteínas expresadas de forma
recombinante, el uso de éstos como reactivos para el diagnóstico de
la enfermedad, su aplicación al desarrollo de técnicas moleculares
que permitan estudiar la patogenia de la enfermedad, además de su
utilidad para la producción de vacunas.
N. caninum es un parásito protozoo
perteneciente al phylum Apicomplexa que incluye otros parásitos
patógenos importantes como Toxoplasma gondii con el que
guarda mucha relación. N. caninum está descrito desde 1989
como agente productor de aborto y mortalidad neonatal en el ganado
bovino (Thilsted and Dubey. 1989. J. Vet. Diagn. Invest. 1,
205-209), aunque es capaz de infectar a un amplio
espectro de especies de mamíferos (Buxton et al. 2002. Trends
Parasitol. 18, 546-552).
La neosporosis bovina está considerada como una
enfermedad parasitaria de distribución cosmopolita y una de las
causas más frecuentes de fallo reproductivo en los diversos países
donde se ha estudiado (Trees et al. 1999. Int. J. Parasitol.
29, 1195-1200; Anderson et al. 2000, Anim.
Reprod. Sci. 60-61, 417-431),
incluido España (González et al. 1999. Vet. Rec. 144,
145-150; Pereira-Bueno et al.
2003. Vet. Parasitol. 111, 143-152). La
manifestación clínica más importante de la infección en las hembras
gestantes es el aborto y generalmente tiene lugar entre el tercer y
noveno mes de gestación, siendo más frecuente en tomo a los
5-6 meses. Los terneros afectados que nacen vivos
pueden presentar problemas neuromusculares, apareciendo los
primeros signos clínicos a los 4-5 días
post-parto, aunque estos se pueden retrasar hasta
dos semanas. Sin embargo, lo más frecuente es el nacimiento de
terneros clínicamente sanos, pero crónicamente infectados (Dubey and
Lindsay. 1996. Vet. Parasitol. 67, 1-59). Así mismo
la neosporosis puede afectar a los perros, su hospedador
definitivo, donde produce polimiositis, encefalitis, parálisis y
puede causar a la muerte (Lindsay and Dubey. 1989. J. Parasitol.
75, 163-165; Buxton et al. 2002. Trends
Parasitol. 18, 546-552).
Como T. gondii, N. caninum tiene un ciclo
de vida que comprende tres estadios. Los esporozoítos, que infectan
al hospedador intermediario por ingestión de los ooquistes
eliminados por el hospedador definitivo. Por otro lado, los
taquizoítos, la forma de replicación rápida, responsables de las
fase aguda de la infección, cuya misión es la diseminación a través
de los tejidos del hospedador. Este proceso finaliza cuando el
hospedador desarrolla inmunidad y se establece entonces una fase
crónica, con una multiplicación lenta del parásito, formándose
quistes tisulares con bradizoítos en su interior, los cuales se han
observado tanto en el tejido nervioso de diversas especies con
infecciones naturales y experimentales (Dubey et al., 1988,
J. Am. Vet. Med. Assoc. 193, 1259-1263; Dubey et
al. 1990. J. Am. Vet. Med. Assoc. 197:
1043-1044; Barr et al. 1992. J. Vet. Diagn.
Invest. 4, 365-367; Kobayashi et al. 2001.
J. Parasitol. 87: 434-436), como en el tejido
muscular esquelético del perro y de la vaca con infecciones
naturales (Peters et al. 2001. Int. J. Parasitol. 31,
1144-1148). Estos bradizoítos permanecen latentes en
los quistes de los tejidos hasta su reactivación (Antony and
Williamson. 2001. New Zeal. Vet. J. 49, 42-47;
Buxton et al. 2002. Trends Parasitol. 18,
546-552). Hoy en día no se conocen los mecanismos
que determinan el paso de taquizoíto a bradizoíto y viceversa en los
parásitos del grupo Apicomplexa como T. gondii o N.
caninum, pero se ha sugerido que la respuesta inmune puede
estar influyendo en la latencia y la reactivación de la infección
en animales infectados de forma crónica (Lyons et al., 2002,
Trends Parasitol. 18, 198-201).
En relación con la transmisión de la enfermedad,
los estudios más recientes indican la importancia relativamente
escasa de la transmisión postnatal y la persistencia, durante toda
la vida, de la infección congénita (Davison et al. 1999. Int.
J. Parasitol. 29, 1683-1689; Hietala and Thurmond.
1999. Int. J. Parasitol. 29, 1669-1676). La
transmisión congénita tiene un papel prominente con porcentajes que
oscilan entre el 50% y el 95% (Wouda et al. 1998.
Theriogenology 49, 1311-1316;
Pereira-Bueno et al. 2000. in: Hemphill and
Gottstein (Eds.) Int. J. Parasitol. 30, 906-909) y
parece jugar un papel relevante en la propagación y mantenimiento de
la enfermedad (Björkman et al. 1996. J. Am. Vet. Med. Assoc.
208, 1441-1444; Paré et al. 1996. Can. J.
Vet. Res. 60, 133-139; Anderson et al. 1997.
J. Am. Vet. Med. Assoc. 210, 1169-1172; Schares
et al. 1998. Vet. Parasitol. 80, 87-98).
En lo que se refiere a la comparación de la
composición antigénica entre el taquizoíto y el bradizoíto de N.
caninum, la información disponible hasta el momento es escasa,
ya que tan solo se ha realizado un estudio en el que se
identificaron antígenos específicos del taquizoíto o compartidos
por ambos estadios (Fuchs et al. 1998. J. Parasitol. 84,
753-758), hecho que contrasta con los estudios
realizados en T. gondii, donde son varios los antígenos
específicos de estadio identificados y caracterizados. Entre los
antígenos de N. caninum, se han descrito dos proteínas de
superficie, NcSAG1 (Hemphill et al. 1997. Parasitology, 115,
371-380), específica de taquizoíto, cuyo gen fue
clonado por Howe et al. (1998. Infect. Immun., 66,
5322-5328) y NcSRS2 (Hemphill et al. 1996.
Parasitol. Res. 82, 497-504), que se expresa de
forma conjunta en los taquizoítos y en los bradizoítos. Estas dos
proteínas de superficie de N. caninum han sido ensayadas
recientemente como vacunas de subunidades en un modelo murino
(Cannas et al. 2003a. Parasitology 126 (Pt. 4),
303-312). Recientemente, se han identificado dos
proteínas de micronemas, NcMIC3 (Sonda et al. 2000. Mol.
Biochem. Parasitol. 108, 39-51) y NcMIC1 (Keller
et al. 2002. Infect. Immun. 70, 3187-3198),
que se expresan en ambos estadios del parásito. Así mismo, se han
incluido en el banco de genes dos secuencias de Neospora
denominadas NcMIC10 y NcMIC11, que podrían codificar
dos proteínas de micronemas, ya que sus secuencias presentan una
homología elevada con las secuencias que codifican las proteínas de
T. gondii TgMIC10 y TgMIC11, respectivamente. Otros genes
que han sido clonados son NcGRA6 y NcGRA7, que
codifican proteínas de gránulos densos del taquizoíto de N.
caninum, en base a las cuales se ha desarrollado un ELISA para
el diagnóstico de la enfermedad (Lally et al.1996. Clin.
Diagn. Lab. Immunol. 3, 275-279). Además de estas
proteínas, otras de gránulos densos de 29 y 67 kDa, denominadas
NcNTPasa-I (Asai et al. 1998. Exp.
Parasitol. 90, 277-285) y NcGRA2 (Ellis et
al. 2000. Parasitology 120 (Pt 4), 383-390),
respectivamente, han sido identificadas y caracterizadas. Por otro
lado, la proteína NcMIC3, localizada en los micronemas de
taquizoítos intracelulares (Naguleswaran et al. 2001.
Infect. Immun. 69, 6483-6494), cuyo gen ha sido
clonado, ha sido expresada como proteína recombinante para ser
utilizada con fines vacunales (Carenas et al. 2003b. J.
Parasitol. 89 (Pt.1) 44-50).
Finalmente, NcSUB1 es el único gen
clonado de N. caninum, que expresa un enzima. NcSUB 1 es una
serin-proteasa de 65 kDa (Louie and Conrad. 1999.
Mol. Biochem. Parasitol. 103, 211-223; Louie et
al. 2002. J. Parasitol. 88, 1113-1119),
localizada en los micronemas del taquizoíto, la cual presenta una
elevada identidad aminoacídica con la proteína de T. gondii
denominada TgSUB1.
En relación a los antígenos específicos del
bradizoíto de Neospora no se ha identificado ninguno hasta
el momento, debido a la dificultad de obtener quistes con
bradizoítos tanto in vitro como in vivo. Sin embargo
en T.gondii sí se han descrito antígenos específicos de
bradizoíto entre los cuales se ha descrito un antígeno de
superficie (SAG4/p18) que es reconocido por un anticuerpo monoclonal
(T83B1) dirigido frente a una proteína de 18 kDa (Tomavo et
al. 1991. Infect. Immun. 59, 3750-3753). El gen
TgSAG4 que codifica esta proteína en T.gondii ha sido
clonado y caracterizado por Ödberg-Ferragut et
al. (1996, Mol. Biochem. Parasitol. 82,
237-244).
El antígeno TgSAG4 T.gondii es una
proteína de membrana anclada por
fosfatidil-inositol-glicanos
(PI-G). La detección de este antígeno específico del
estadio de crecimiento lento, asociado a la infección crónica por
T. gondii, tiene un valor diagnóstico importante como han
puesto de manifiesto recientemente Cultrera et al. (2002,
Mol.Cell. Probes 16, 31-39). Estos autores han
desarrollado una RT-PCR para la detección de la
infección por T. gondi, basada en la detección del mRNA del
gen TgSAG4 en líquido cefalorraquídeo de enfermos de SIDA, en
los que T. gondii puede producir una encefalopatía
fatal.
Así pues, debido a que la transmisión vertical
de la enfermedad parece ser el mejor método de establecimiento de
la enfermedad de forma persistente en las explotaciones y a que la
neosporosis es una de las principales causas de abortos y
mortalidad neonatal en el ganado bovino, con las subsiguientes
pérdidas económicas, el control debe ir encaminado,
fundamentalmente, a reducir la prevalencia de la infección en las
explotaciones, estableciendo medidas de desecho y reposición
selectivas para reducir el efectivo infectado.
El diagnóstico etiológico del aborto en el
ganado bovino es complejo y laborioso. En aquellos casos en los que
se llega a un diagnóstico etiológico, más del 90% corresponden a
agentes infecciosos y parasitarios entre los que, actualmente,
ocupa un lugar destacado N. caninum. En cuanto al diagnóstico
de la infección por N. caninum, es imprescindible la
realización del diagnóstico laboratorial para confirmar la
etiología del aborto, ocupando un lugar destacado las técnicas de
diagnóstico serológico, las cuales proporcionan una información
inicial acerca de la magnitud del problema. En adultos, el
diagnóstico laboratorial se realiza mediante la detección de
anticuerpos específicos en el suero, lo cual es muy útil a la hora
de establecer medidas eficaces para el control de la infección ya
que este tipo de estudios proporciona información muy valiosa sobre
la distribución y frecuencia de la infección en las explotaciones
(seroprevalencia de rebaño) y sobre el riesgo de aborto por
neosporosis en los rebaños infectados (seroprevalencia
intra-rebaño) (Thurmond and Hietala. 1995.
Parasitol. 81, 364-367; Paré et al. 1996.
Can. J. Vet. Res. 60, 133-139).
Por lo tanto, el perfeccionamiento del
diagnóstico es de suma importancia para determinar de forma precisa
el estado sanitario de los animales. En este sentido se han llevado
a cabo una serie de estudios con el objetivo de validar las técnicas
serológicas que se utilizan en la actualidad, esclareciendo algunos
aspectos controvertidos, como la elección del punto de corte en
función de la edad del animal y la técnica utilizada
(Alvarez-García et al. 2003. Vet. Res. 34,
341-352).
Puesto que en la actualidad se están utilizando
diversas técnicas de diagnóstico frente a N. caninum (Ferre
et al. 2003. Res. Adv. Microbiol. 3,
157-167), pero ninguna de éstas permite distinguir
entre una infección reciente y una crónica, la identificación de
antígenos específicos de taquizoíto y bradizoíto, respectivamente,
permite desarrollar técnicas de diagnóstico que aportan más
información sobre el futuro de la explotación respecto a los
abortos y mejoran el control de la enfermedad. La expresión de
estos antígenos como proteínas recombinantes y su utilización para
el diagnóstico serológico de la neosporosis, aportan una herramienta
novedosa muy valiosa. En este sentido, se han desarrollado métodos
de diagnóstico como el ELISA, basados en diversas proteínas de N.
caninum producidas en diferentes tipos de sistemas de expresión
heterólogos (Lally et al. 1996. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 3,
275-279; Louis et al. 1997. Clin. Diagn.
Lab. Immunol. 4 (6), 692-699), pero hasta el
momento ninguno basado en antígenos específicos de bradizoíto. Del
mismo modo el desarrollo de anticuerpos monoclonales y sueros
policlonales monoespecíficos frente a los antígenos específicos de
estadio, representa una alternativa para el diagnóstico mediante el
desarrollo de un ELISA de competición, como el que se ha realizado
frente a una proteína de 65 kDa del taquizoíto de N. caninum
(Baszler et al. 1996. J. Clin. Microbiol. 34 (6),
1423-1428).
Por otro lado, el control farmacológico de la
neosporosis en el ganado bovino es inviable en la actualidad, no se
tiene experiencia en el tratamiento farmacológico de la enfermedad
en bovinos y los datos de que se dispone son poco alentadores. Sin
embargo, los elevados costes de un posible tratamiento, la aparición
de posibles resistencias y los residuos en carne o leche, limitan
la quimioterapia como medida de control. De esta forma a las
medidas de manejo del rebaño habría que añadir la
inmunoprofilaxis.
En este sentido, las investigaciones llevadas a
cabo en los últimos años para la elaboración de una vacuna frente a
N. caninum han incluido la evaluación de vacunas muertas con
resultados variables, encontrando en algunos protección contra la
transmisión vertical en un modelo murino (Liddell et al.,
1999, J.Parasitol. 85: 1072-1075), pero no en un
modelo bovino (Andrianarivo et al., 1999, Int. J. Parasitol.
30: 985-990). También se ha utilizado la
inmunización con vacunas vivas, basadas en aislados menos
virulentos (Atkinson et al. 1999. Parasitology 118:
363-370) o mutantes sensibles a la temperatura
(Lindsay et al. 1999. J. Parasitol. 85:
64-67), en ensayos de vacunación en ratones con el
objetivo de estimular una respuesta inmune protectora frente a una
infección letal por N. caninum, obteniendo resultados
prometedores pero no definitivos, presentando el problema de
originar animales persistentemente infectados. Por otro lado, las
vacunas de subunidades presentan una serie de ventajas respecto a
las vacunas tradicionales (Jenkins. 2001. Vet. Parasitol. 101,
291-310), entre ellas la seguridad y la estabilidad
relativa de las proteínas recombinantes, comparadas con los
parásitos vivos, la flexibilidad de incorporar sólo aquellos
antígenos que inducen una respuesta inmune protectora, así como la
capacidad de establecer una producción a gran escala. El desarrollo
de vacunas de subunidades para la prevención de la infección, el
aborto o la transmisión vertical de la infección, basadas en los
antígenos de N. caninum, aporta un instrumento nuevo para el
control de la misma. Por el momento, son escasos los trabajos
realizados en este sentido. Se han utilizado tan sólo antígenos de
taquizoíto o compartidos por ambos estadios, como proteínas
recombinantes expresadas y purificadas a partir de un sistema
procariota, entre ellos NcMIC3 que indujo inmunidad protectora
frente a la neosporosis cerebral en un modelo murino (Cannas et
al. 2003. J. Parasitol. 89(1), 44-50),
así como NcSAG1 y NcSRS2, dos proteínas de superficie del
taquizoíto, inoculadas en el mismo modelo de forma combinada como
antígenos recombinantes y vacunas de DNA (Cannas et al.
2003. Parasitology 126, 303-3.12), obteniendo
buenos resultados. Recientemente se han utilizado plásmidos que
expresan la proteína NcGRA7 o la proteína NcsHSP33, como vacunas de
DNA en un modelo murino, obteniendo una protección parcial frente a
la transmisión congénita de la infección (Liddell et al.
2003. J. Parasitol. 89 (3), 496-500). Sin embargo,
hasta el momento actual el desarrollo de estas vacunas no se ha
basado en antígenos específicos del estadio de bradizoíto, puesto
que el primero que se describe en N. caninum es el producido
por el gen NcSAG4 tal y como se expone en la descripción de
la invención de esta memoria.
Según lo expuesto en estos antecedentes, el
aislamiento de genes que se expresan de forma específica en cada
estadio es de gran interés para el estudio de esta enfermedad y de
los mecanismos moleculares que determinan el establecimiento de la
infección crónica, así como la reactivación de la infección,
mejorando el conocimiento y control de esta enfermedad. En este
sentido, el aislamiento del gen NcSAG4 en N. caninum,
homólogo del gen TgSAG4, que codifica una proteína
específica del estadio de bradizoíto en T. gondii, su
clonación y la expresión del antígeno específico de estadio NcSAG4
como proteína recombinante, según se expone en la descripción de la
invención de esta memoria, aporta una solución de gran utilidad
para el diagnóstico de la neosporosis, así como para el análisis de
la patogenia de la enfermedad, y su uso vacunal representa una
alternativa para el control de la misma.
Uso del gen NcSAG4 para el diagnóstico y
la prevención de la neosporosis, y como marcador para el análisis
de la patogenia.
La invención tiene por objeto proporcionar un
reactivo de utilidad para su empleo con fines diagnósticos y
vacunales frente a N. caninum. Además, facilita un marcador
para el análisis de la patogenia de la neosporosis, principalmente
para el estudio del establecimiento de la fase crónica de la
infección, así como de la reactivación de la misma. De esta forma
se describe una tecnología molecular que ha permitido la
identificación, aislamiento y caracterización del gen NcSAG4
de N. caninum, siendo éste el primer gen específico del
estadio de bradizoíto que se describe en este parásito. Para ello
se amplifican por PCR varios fragmentos de DNA del gen
NcSAG4, utilizando una combinación de cuatro oligonucleótidos
degenerados, diseñados en base a la secuencia de aminoácidos de la
proteína TgSAG4 de T. gondii, uno de los cuales (SEQ ID NO:
1) se describe por Ödberg-Ferragut et al.
(1996, Mol. Biochem. Parasitol. 82, 237-244). Los
otros tres oligonucleótidos diseñados se denominaron
SAG4-2, SAG4-3 y
SAG4-4 siendo identificados en la lista de
secuencias como SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4,
respectivamente. A partir de la secuencia obtenida se diseñan otros
cuatro oligonucleótidos para completar la secuencia del gen,
mediante la técnica del paseo cromosómico. Así, los
oligonucleótidos 1R5SAG4 (SEQ ID NO: 5) y 2R5SAG4 (SEQ ID NO: 6) se
utilizaron para completar el gen en sentido 5'. Los
oligonucleótidos 1F3SAG4 (SEQ ID NO: 7) y 2F3SAG4 (SEQ ID NO: 8) se
utilizaron para completar el gen en sentido 3'.
La presente invención describe un método de
clonación del gen NcSAG4, mediante su amplificación por PCR,
utilizando oligonucleótidos especialmente diseñados para ello y su
posterior digestión con enzimas de restricción. Esta clonación se
realiza en dos tipos de plásmidos, pRSET y pcDNA3.1/His (ambos de
Invitrogen), para la expresión en un sistema procariota y eucariota,
respectivamente. En el plásmido pRSET se inserta una parte del gen
NcSAG4, que codifica desde el aminoácido 29 al 148
incluidos, correspondiente a la secuencia de la proteína NcSAG4
madura, excluyendo las regiones del péptido señal del extremo amino
de la proteína, así como del posible péptido señal del extremo
carboxilo de la misma. Para ello se amplifica por PCR la región
correspondiente del gen NcSAG4 a partir de DNA genómico de
N. caninum, utilizando los oligonucleótidos diseñados a tal
fin denominados F85NcSAG4 (SEQ ID NO: 13) y Re444NcSAG4 (SEQ ID NO:
14). En este sistema, la proteína recombinante pRNcSAG4 se expresa
bajo la dirección del promotor de la RNA polimerasa del fago T7,
como proteína de fusión, unida en su extremo amino a un bloque de
histidinas que facilita su purificación por cromatografía de
afinidad. Para producir la proteína recombinante pRNcSAG4, se
utilizan células de la cepa rosetta(DE3)pLysS de E.
coli (Novagen), que expresan de forma inducida la RNA
polimerasa del fago T7, por adición de IPTG al medio de cultivo,
permitiendo la expresión de las proteínas recombinantes. El uso de
esta proteína recombinante para diagnóstico serológico de la
neosporosis, aporta una herramienta novedosa muy valiosa para el
diagnóstico diferencial de las diferentes fases, aguda y crónica,
de la infección, mediante ELISA, radioinmunoanálisis (RIA), o
cualquier otro método basado en la capacidad antigénica de dichos
polipéptidos, como se demuestra en el desarrollo de esta invención,
mediante la técnica de "western blot" que se describe. De esta
forma se detectan anticuerpos frente a la proteína pRNcSAG4,
separada mediante electroforesis en condiciones desnaturalizantes
en geles de acrilamida-DATD al 15%, en sueros de
fetos y terneros congénitamente infectados de forma natural por
N. caninum. Esto indica la utilidad de esta proteína no sólo
desde el punto de vista del diagnóstico diferencial de la infección
aguda y crónica por N. caninum, sino también desde la
perspectiva de la prevención, mediante su utilización como
vacuna.
Del mismo modo el desarrollo de anticuerpos
monoclonales y sueros policlonales monoespecíficos frente a la
proteína recombinante pRNcSAG4, representa una alternativa para el
diagnóstico mediante el desarrollo de un ELISA de competición
basado en estos. Así mismo estos anticuerpos monoclonales o sueros
policlonales específicos frente a los polipéptidos descritos en esta
invención, se utilizan para el diagnóstico de la infección crónica
por N. caninum en los tejidos de los animales mediante
inmunohistoquímica, inmunofluorescencia o cualquier otro método
basado en la detección del parásito por el citado suero.
Un objetivo de la presente invención es el de
proporcionar vacunas frente a la neosporosis, la transmisión
vertical y el establecimiento de la infección crónica. El sistema
de expresión de genes heterólogos en procariotas, presenta la
ventaja de poder producir a gran escala el antígeno recombinante,
utilizándolo como vacuna de subunidades. Estas vacunas tienen otra
ventaja y es la de ser utilizadas como vacunas marcadas, siendo la
respuesta inmune que producen fácilmente distinguible de la
producida por el parásito en los animales infectados, lo que es de
vital importancia en las campañas de erradicación de las
enfermedades. Además estas vacunas son seguras, lo que representa
un beneficio respecto de las vacunas basadas en vectores
recombinantes como los víricos. Estos últimos sin embargo presentan
la ventaja de su replicación lo que permite la inmunización con
baja dosis.
Sin embargo, este tipo de proteínas
recombinantes utilizadas como vacuna de subunidades, inducen una
respuesta inmune principalmente de tipo humoral. Así, para dirigir
la respuesta inmune también hacia una respuesta de base celular, se
utilizan adyuvantes que orienten esta respuesta. Por otro lado, para
orientar la respuesta de base celular y asegurar el plegamiento
adecuado de las proteínas, se utilizan las vacunas de DNA.
La presente invención describe una vacuna de DNA
basada en la proteína NcSAG4, que se utiliza o no en combinación
con la proteína recombinante pRNcSAG4, producida en el sistema
procariota descrito anteriormente. Para ello, la región codificante
completa del gen NcSAG4 se amplifica por PCR mediante la
utilización de los oligonucleótidos diseñados a tal fin denominados
FNcSAG4 (SEQ ID NO: 11) y ReNcSAG4 (SEQ ID NO: 12), y se
inserta en un vector de expresión para células de mamífero, el
plásmido pcDNA3.1/His, en los sitios de restricción Bam HI y
Eco RI, obteniendo el plásmido recombinante al que se ha
denominado pCDA10, que se utiliza como vacuna de
DNA.
DNA.
Por otro lado, la presente invención describe la
utilización del gen NcSAG4 como marcador de la fase de
bradizoíto de N. caninum, asociada a la infección crónica.
Este gen es utilizado como marcador mediante el uso de las moléculas
nucleotídicas descritas en esta invención para el diagnóstico de la
infección crónica por N. caninum a partir de tejidos o
fluidos de los animales infectados mediante PCR o
RT-PCR, hibridación in situ con sondas de
DNA, o cualquier otro método de detección basado en los ácidos
nucleicos del parásito. Se detalla un método de detección de la
expresión del gen NcSAG4 en el parásito, mediante
RT-PCR, basada en los oligonucleótidos diseñados
para el aislamiento del gen denominados 1F3SAG4 (SEQ ID NO: 7) y
1R5SAG4 (SEQ ID NO: 5). Esta RT-PCR permite la
utilización del gen NcSAG4 como marcador del cambio de
estadio de N. caninum, en el hospedador intermediario,
siendo una herramienta necesaria para el análisis de los mecanismos
que determinan el establecimiento de la infección crónica, así como
aquellos que están implicados en la reactivación de la infección, en
los animales persistentemente infectados, y de los factores que
influyen en estos procesos, así como para determinar la eficiencia
de los productos vacunales frente a N. caninum, en cuanto a
la protección frente al establecimiento de la infección crónica y la
reactivación. Del mismo modo el uso del promotor del gen
NcSAG4 para expresar genes heterólogos en células de N.
caninum transfectadas gracias a construcciones genéticas
elaboradas con el citado promotor, permite el análisis de los
mecanismos moleculares que determinan la conversión de estadio de
taquizoíto a bradizoíto y a la inversa, tanto en sistemas de
expresión in vitro como in vivo, en cultivos celulares
o en animales de experimentación.
Para complementar la descripción y con objeto de
ayudar a una mejor compresión de las características de la
invención, se acompaña a la presente memoria descriptiva, como
parte integrante de la misma, un juego de dibujos en donde con
carácter ilustrativo y no limitativo, se ha representado lo
siguiente:
Representa la amplificación de las secuencias
Nc175 y Nc312 del genoma de N. caninum, según se explica en
el ejemplo 1 de esta memoria.
Representa el esquema del paseo cromosómico o
"genome walking", según se explica en el ejemplo 1 de esta
memoria.
Representa la inserción del gen NcSAG4 en
plásmidos de expresión. Panel A. PcDNA3.1/His. Panel B: pRSET,
según se explica en el ejemplo 2 de esta memoria y el esquema de la
proteína recombinante pRNcSAG4 (Panel C), según se explica en el
ejemplo 2 de esta memoria.
La figura muestra la selección de los plásmidos
recombinantes por digestión con enzimas de restricción, según se
explica en el ejemplo 2 de esta memoria.
Siendo WM "Molecular weight standards, low
range (Bio-rad)".
Expresión de la proteína recombinante pRNcSAG4
en E. coli, según se explica en el ejemplo 2 de esta
memoria.
Caracterización d,e la inmunogenicidad de la
proteína recombinante pRNcSAG4, según se explica en el ejemplo 3 de
esta memoria.
Detección de la transcripción del gen
NcSAG4 en el estadio de bradizoíto de N. caninum por
RT-PCR, según se explica en el ejemplo 4 de esta
memoria.
La presente invención se ilustra adicionalmente
mediante los siguientes ejemplos, los cuales no son limitativos de
su alcance, que viene definido exclusivamente por la nota
reivindicatoria adjunta.
Para el aislamiento del gen NcSAG4 de
N. caninum se utilizó el método denominado paseo cromosómico
o "genome-walking", que permite amplificar por
PCR fragmentos de DNA cuya secuencia se desconoce pero que flanquean
regiones de DNA conocidas.
Para amplificar la secuencia conocida, se
utilizaron cuatro oligonucleótidos degenerados mejorando los
descritos para clonar el gen TgSAG4 de T. gondii
(Ödberg-Ferragut et al., Mol. Biochem.
Parasitol. 82 (1996) 237-244). Uno de los
oligonucleótidos directos usado fue el oligo la (SEQ ID NO 1),
descrito por estos autores, siendo diseñados los otros tres en base
a las secuencias de aminoácidos codificadas por el gen TgSAG4
de T. gondii presentes en las bases de datos de las
siguientes cepas: RH (AF340224.1), PLK (Z69373.1), Prugniaud
(AF340225.1) y CEP (AF340226.1). Así se diseñó un oligonucleótido
directo, al que se denominó SAG4-2 (SEQ ID NO: 2) y
dos oligonucleótidos inversos a los que se denominó
SAG4-3 (SEQ ID NO: 3) y SAG4-4 (SEQ
ID NO: 4).
Para realizar la PCR se utilizaron 0,4 \mug de
DNA genómico, aislado a partir de taquizoítos de N. caninum.
Para el aislamiento del DNA genómico se utilizó un kit comercial,
siguiendo las indicaciones de uso (GenomicPrep Cells and Tissue
DNA Isolation kit, Amersham Biosciences). Como testigo positivo
se utilizó DNA genómico de T. gondii aislado de la misma
forma. Como DNA polimerasa se utilizó el enzima EcoTaq
(Ecogen) a 2.5 U por reacción, en el tampón correspondiente, en
presencia de Cl_{2}Mg (4 mM), dNTPs (200 \muM) y 40 pmol de cada
oligonucleótido degenerado. Las condiciones de la PCR fueron: 5
minutos de desnaturalización a 94ºC, seguido de 40 ciclos de 1
minuto a 94ºC, 1 minuto de anillamiento en el que se hizo un
gradiente de temperatura, desde 43ºC hasta 56ºC (figura 1, carriles
4-9), 1 minuto a 72ºC, aumentando la elongación un
segundo en cada ciclo, y finalmente una elongación de 10 minutos a
72ºC. Como testigo negativo se utilizó la mezcla de reacción sin DNA
(figura 1, carril 1) o bien DNA genómico procedente de células
MARC-145 sin infectar (figura 1, carriles 2 y
3).
Como resultado de la PCR se amplificaron varios
fragmentos al utilizar la temperatura de anillamiento de 56ºC, que
fueron separados mediante electroforesis en un gel de agarosa al 2%
en TBE al 1x (figura 1), tanto a partir del DNA genómico de N.
caninum (figura 1, carril 9) como de T. gondii (figura 1,
carril 12). De estos fragmentos dos se correspondían con el tamaño
esperado para la combinación de los oligonucleótidos la y
SAG4-3 de 175 pb (Nc175), y la con
SAG4-4 de 312 pb (Nc312). Estos fragmentos de DNA
fueron purificados a partir de un gel de agarosa al 2% en tampón TBE
1x, utilizando un kit comercial (GenomeGENECLEAN®Turbo
nucleic acid purification kit, Q-BIOgene) siguiendo
las indicaciones del fabricante y secuenciados con el
oligonucleótido 1a (Servicio de secuenciación del Instituto de
Investigaciones Biomédicas "Alberto Sols",
CSIC-UAM). La secuencia de nucleótidos resultante se
comparó con las existentes en las bases de datos
(BLASTN-nr, www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/) presentando
una similitud del 82% con la secuencia del gen TgSAG4 de
tres cepas de T. gondii, en 64 pb del fragmento. Así mismo,
al traducir la secuencia Nc175 a las diferentes fases de lectura
posibles, y compararla con la base de datos de T. gondii
(TgGI: TIGR Toxoplasma gondii gene index,
www.tigr.org/tdb/tgi/tggi), mostró una similitud del 68% con
un grupo de secuencias descrito como proteína de superficie
(TC2754), que coincide con las proteínas que codifican las
secuencias del gen TgSAG4 de las cepas anteriormente citadas
(RH, PKL, Prugniaud y CEP) y con un EST descrito a partir de una
genoteca de bradizoítos de la cepa ME49 (Toxoplasma gondii
v3, Parasite Consensus EST Data bases). Por último se comparó la
secuencia Nc175 con la base de datos de N. caninum (NcGI:
TIGR Nespora caninum gene index, www.tigr.org/tdb/tgi) y no
presentó similitud alguna con las secuencias descritas hasta el
momento.
Una vez aislada la secuencia Nc175 se identificó
el gen NcSAG4 utilizando el método del paseo cromosómico o
"genome walking", en sentido 5' y 3' a partir de la secuencia
Nc175, a partir del DNA genómico de N. caninum, utilizando un
kit comercial (Universal Genome Walker^{TM} kit, BD Biosciences
Clontech). El primer paso para llevar a cabo esta técnica es la
digestión (figura 2, pasol) del DNA genómico con cuatro enzimas de
restricción distintas que producen extremos romos: EcoRV
(1), DraI (2), PvuII (3) y StuI (4), y su
posterior ligación a unos adaptadores (figura 2, paso 2), siguiendo
las instrucciones de la casa comercial. A continuación, con cada
una de las genotecas así obtenidas se realiza una PCR doble
utilizando unos oligonucleótidos que se unen al adaptador (AP1 y
AP2) y los oligonucleótidos específicos del gen, diseñados en
función de la secuencia genómica conocida (figura 2, paso 3). Los
oligonucleótidos diseñados a partir de la secuencia Nc 175 para
realizar el paseo cromosómico en sentido 5' se denominaron 1R5SAG4
(SEQ ID NO: 5) y 2R5SAG4 (SEQ ID NO: 6) y los diseñados para
realizar el paseo cromosómico en sentido 3' se denominaron 1F3SAG4
(SEQ ID NO: 7) y 2F3SAG4 (SEQ ID NO: 8). La primera PCR se realizó
con cada una de las "genotecas de DNA genómico" utilizando los
oligonucleótidos AP1 y 1R5SAG4 ó 1F3SAG4, para realizar el paseo
cromosómico en sentido 5' o 3', respectivamente, siguiendo las
instrucciones de la casa comercial, utilizando una DNA polimerasa
termoestable de larga distancia (Advantage® Genomic PCR kit, BD
Biosciences Clontech). Las condiciones en las que se realizó la PCR
fueron 7 ciclos de 25 segundos a 94º y 3 minutos a 68ºC seguidos de
32 ciclos de 25 segundos a 94ºC y 3 minutos a 64ºC, con una
elongación final a 64ºC durante 7 minutos. La segunda PCR se llevó a
cabo a partir de una dilución 1:50 de los productos de la primera
PCR y se realizó con los oligonucleótidos AP2 y 2R5SAG4 ó 2F3SAG4,
para realizar el paseo cromosómico en sentido 5' ó 3'
respectivamente. Las condiciones en que se realizó la segunda PCR
fueron: 5 ciclos de 25 segundos a 94ºC y 6 minutos a 68ºC, seguidos
de 20 ciclos de 25 segundos a 94ºC y 6 minutos a 64ºC con una
elongación final a 64ºC durante 10 minutos. Los fragmentos de DNA
obtenidos mediante el paseo cromosómico se purificaron como se ha
descrito anteriormente y se secuenciaron (figura 2, paso 4).
De esta forma, al comparar las secuencias de los
diferentes fragmentos amplificados se pudo determinar una secuencia
de 601 nucleótidos (SEQ ID NO: 9). Esta secuencia se denominó
NcSAG4, por su homología con la del gen TgSAG4 de
T. gondii, que codifica una proteína específica de la fase de
bradizoíto. Así mismo, se comprobó la existencia de una fase de
lectura abierta (ORF) de 522 pb, de un tamaño similar a su homóloga
en T. gondii, que codifica una proteína de 173 aminoácidos
(SEQ ID NO: 10). Al hacer la comparación de la secuencia de
aminoácidos que codifica esta ORF, con las secuencias existentes en
las bases de datos (BLASTx, www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/), se
encontró una similitud del 69% con las de la proteína TgSAG4 de las
diferentes cepas de T. gondii.
Una vez identificado el gen NcSAG4, se
insertó la región codificante en vectores de expresión para
producir el antígeno NcSAG4 como proteína recombinante en un
sistema heterólogo. Para el sistema eucariota se eligió el plásmido
de expresión pcDNA3.1/His©-C (Invitrogen) (figura 3, panel A) y para
el sistema procariota el plásmido de expresión
pRSET-C (Invitrogen) (figura 3, panel B). En el
plásmido pcDNA3.1/His©-C se insertó la región codificante completa
del gen NcSAG4 en los sitios BamHI y EcoRI.
Para ello se realizó una PCR a partir del DNA genómico de N.
caninum, utilizando oligonucleótidos diseñados para este fin
(OligoANALYZER 1.0.2.). El oligonucleótido directo se denominó
FNcSAG4 (SEQ ID NO: 11), en cuyo extremo 5' se incluyó un sitio
específico de reconocimiento para BamHI, seguido de un sitio
NcoI, anterior a una secuencia idéntica al extremo 5' de la
ORF del gen NcSAG4. El oligonucleótido inverso se denominó
ReNcSAG4 (SEQ ID NO: 12), en cuyo extremo 5' se incluyó un sitio
específico de reconocimiento para EcoRI, seguido de una
secuencia inversa complementaria al extremo 3' de la ORF del gen
NcSAG4.
Para la expresión en procariotas se insertó una
parte del gen NcSAG4, que codifica una forma truncada de la
proteína, desde el aminoácido 29 al 148 incluidos, en los sitios
BamHI y EcoRI del plásmido pRSET-C.
Para ello se diseñaron dos oligonucleótidos utilizando el programa
de ordenador (OligoANALYZER 1.0.2.). El oligonucleótido directo se
denominó F85NcSAG4 (SEQ ID NO: 13), en cuyo extremo 5' se incluyó
un sitio específico de reconocimiento para BamHI, seguido de
una secuencia idéntica a la ORF del gen NcSAG4 desde el
nucleótido 83 al 100. El oligonucleótido inverso se denominó
Re444NcSAG4 (SEQ ID NO: 14), en cuyo extremo 5' se incluyó un sitio
específico de reconocimiento para EcoRI, seguido de un
triplete de terminación (TAA) y a continuación la secuencia inversa
complementaria de la ORF del gen NcSAG4, desde el nucleótido
328 al 444.
Para realizar la PCR en ambos casos, se
utilizaron 0,1 \mug de DNA genómico por reacción, aislado a
partir de taquizoítos de N. caninum. Como DNA polimerasa se
utilizó EcoStart (Ecogen), 1,25 U por reacción, en un volumen
final de 25 \mul en el tampón correspondiente, en presencia de
2,5 mM de Cl_{2}Mg, dNTPs (200 \muM) y 40 pmol de cada
oligonucleótido. Las condiciones de la PCR fueron 7 minutos de
desnaturalización a 95ºC, seguido de 40 ciclos de 30 segundos a
95ºC, 1 minuto a 53ºC, 4 minutos a 72ºC, aumentando la elongación
un segundo en cada ciclo, y finalmente una elongación de 10 minutos
a 72ºC. Los productos de la PCR fueron visualizados en un gel de
agarosa al 1,5% en tampón TAE 1x, teñido con bromuro de ethidio
(BrEt), observando un tamaño de 542 pb, correspondiente al esperado
para la ORF del gen NcSAG4, y de 385 pb para el gen
truncado. Posteriormente, estos fragmentos de DNA fueron
purificados y digeridos con los enzimas de restricción BamHI
(5U) y EcoRI (6U) en el tampón adecuado (tampón B, Roche) en
un volumen final de 50 \mul, durante cuatro horas a 37ºC en un
baño de agua. Al mismo tiempo y en idénticas condiciones fue
digerido cada vector plasmídico. Estos plásmidos fueron tratados al
final de la digestión con 2 U del enzima fosfatasa alcalina de gamba
(SAP) durante 30 minutos en la misma reacción de digestión a 37ºC.
Posteriormente se inactivó el enzima SAP durante 20 minutos a 65ºC,
en presencia de EDTA 10 mM. Una vez realizada la digestión, tanto
el DNA plasmídico como los productos de PCR fueron visualizados en
un gel de agarosa de bajo punto de fusión al 1,5% en tampón TAE 1x
teñido con BrEt, y posteriormente purificados a partir del
mismo.
mismo.
Para la manipulación de los plásmidos se siguió
básicamente la metodología descrita por Sambrook y cols. (1989).
Una vez purificado cada fragmento de DNA digerido fue ligado a 50
ng del vector correspondiente, siendo el pcDNA3.1/His©-C
(Invitrogen) para la ORF completa del gen NcSAG4 y el
plásmido pRSET-C para el gen truncado, en una
proporción 1:3 vector:inserto, en presencia de 1U del enzima T4DNA
ligasa, en el tampón adecuado y en un volumen final de 15 \mul. La
ligación se realizó en tubos de 0,5 ml (M\multi^{TM}, Sorenson
BioScience), en un termociclador durante 18 horas a 12ºC, siendo
conservada posteriormente a -20ºC hasta su uso.
Una vez realizada la ligación ésta fue utilizada
para transformar células de la cepa DH5\alpha de E.coli
competentes congeladas, mediante electroporación. Para transformar
las bacterias por electroporación se siguieron básicamente las
indicaciones de la casa comercial del electroporador
(GenePulser^{TM}, Bio-rad). Se utilizaron cubetas
de electroporación de 2 mm (Equibio) previamente enfriadas en
hielo. Las bacterias competentes se descongelaron y se mantuvieron
en hielo, hasta añadir 5 \mul de la ligación. Una vez
transcurrido un minuto en hielo se sometieron a un pulso de 2,5 kV
a 25 \muFD y 200 Ohm, durante 4-5 segundos.
Inmediatamente las bacterias transformadas se resuspendieron en 500
\mul de medio SOC (MgSO_{4} 10 mM, MgCl_{2} 10 mM y glucosa
20 mM añadidos a medio SOB: bactotriptona 2%, extracto de levadura
al 0,5%, NaCl 10 mM y KCl 2,5 mM) y se crecieron durante una hora a
37ºC y finalmente 200 \mul de la suspensión celular fueron
plaqueados en medio LB-agar (1,5% de agar noble) en
presencia de 100 \mug/ml de Ampicilina, antibiótico frente al que
presentan resistencia los plásmidos utilizados. Las bacterias
transformadas con los plásmidos fueron seleccionadas tras su
crecimiento en las placas con el medio adecuado, durante 18 horas a
37ºC. Se seleccionaron 10 clones de cada una y se crecieron toda la
noche a 37ºC en 3 ml de medio LB líquido con 100 \mug/de
Ampicilina, para el posterior aislamiento del DNA plasmídico. Este
DNA fue obtenido por el método de lisis alcalina y posteriormente
visualizado en un gel de agarosa al 0,8% en tampón TAE 1x, para
seleccionar aquellos clones con el plásmido del tamaño esperado.
Los plásmidos de interés se denominaron pCDA, numerado del 1 al 10
según el clon, al plásmido construido por inserción de la ORF
completa del gen NcSAG4 en el plásmido pcDNA3.1/His©-C, cuyo
tamaño esperado era de 6.028 pb. El plásmido obtenido por inserción
de la forma truncada del gen NcSAG4, del nucleótido 83 al
444, en el pRSET-C (3.235 pb), se denominó pRC, del
1 al 10, según el clon. Según el tamaño observado se seleccionaron
cuatro clones de cada uno para su caracterización por enzimas de
restricción (figura 4). Así se digirieron los plásmidos obtenidos
con los enzimas de restricción BamHI (5U) y EcoRI (6U)
en el tampón adecuado (tampón B, Roche) en un volumen final de 20
\mul, durante dos horas a 37ºC en un baño de agua. El DNA
plasmídico digerido se separó en un gel de agarosa al 0,8% en
tampón TBE 0,5%, observando la liberación de un fragmento del
tamaño adecuado en cada uno de los plásmidos construidos. Así, los
plásmidos pCDA5, pCDA6, pCDA9 y pCDA10 liberaron un fragmento de
528 pb (figura 4, panel A, carriles 1 al 4 respectivamente), siendo
el fragmento de 371 pb en los plásmidos pRC6, pRC7, pRC9 y pRC10
(figura 4, panel B, carriles 3 al 6 respectivamente). Además, se
cortaron los vectores pcDNA3.1/His©-C (figura 4, panel A, carril 5
y 6) y pRSET-C (figura 4, panel B, carril 1) y se
utilizaron como testigos de la digestión. En el gel de agarosa se
cargó también el plásmido pRSET-C (figura 4, panel
B, carril 2) sin digerir. Los plásmidos pCDA10 y pRC10 fueron
secuenciados utilizando el oligonucleótido comercial T7, confirmado
la inserción de los fragmentos en el vector de expresión de forma
correcta.
La proteína recombinante pRNcSAG4 (SEQ ID NO:
15) comprende desde el aminoácido 29 hasta el 148, codificados por
la ORF del gen NcSAG4, descrita en esta invención y se
corresponde con la secuencia aminoacídica de la posible proteína
NcSAG4 madura, en la que faltarían el péptido señal del extremo
amino así como el posible péptido señal del extremo carboxilo,
según los criterios revisados por Gerber et al. (1992. JBC
267. 12168-12173), unido en el extremo amino a un
bloque de aminoácidos que incluye 6 histidinas, lo que permite su
purificación por cromatografía de afinidad, el péptido
T7-tag así como una zona de reconocimiento de la
enteroquinasa. En la figura 3, panel C se presenta un esquema de la
proteína recombinante pRNcSAG4.
Para expresar la proteína recombinante en el
sistema procariota, células de la cepa
Rosetta(DE3)pLysS de E. coli (Novagen) fueron
transformadas con el plásmido pRC10, siguiendo las indicaciones de
la casa comercial. Las células transformadas con el plásmido pRC10,
fueron plaqueadas en medio LB-agar con ampicilina
(100 \mug/ml) y cloranfenicol (34 \mug/ml) y crecidas toda la
noche a 37ºC. Al día siguiente se seleccionaron 6 colonias de las
placas y se crecieron durante la noche a 37ºC en 3 ml del mismo
medio líquido de selección. Al día siguiente se diluyó el cultivo
1:10 en el mismo medio de crecimiento y se mantuvo en idénticas
condiciones hasta alcanzar una A_{600} de 0,9 OD. A continuación,
se indujo la expresión de la proteína recombinante en presencia de
IPTG 1 mM, durante 4 horas en agitación a 250 rpm y 37ºC.
Finalmente las células fueron recogidas por centrifugación a 3.500
xg durante 15 minutos. Una vez retirado el sobrenadante los
sedimentos fueron conservados a -80ºC hasta su uso.
Para caracterizar la expresión de las proteínas
recombinantes, los sedimentos celulares, recogidos anteriormente,
se lisaron en una solución de rotura comercial denominada BugBuster
(Novagen), al 1x en Tris 20 mM pH 7,98 a una concentración de 5
m11gr de sedimento celular. Se incubaron en agitación suave y
temperatura ambiente, en presencia del enzima Benzonasa (Novagen,
1U/ml de Bugbuster 1x), durante 40 min. A continuación se separó la
fracción soluble del sedimento, donde se encuentran los cuerpos de
inclusión, por centrifugación a 20.000 xg durante 15 minutos para
determinar la localización de la proteína de interés.
Posteriormente se lavaron los cuerpos de inclusión según las
indicaciones de la casa comercial. Finalmente se separaron las
proteínas, solubilizadas en tampón de carga de Laemmli 1x (Laemmli.
1970. Nature 227, 680-685), en una proporción de 50
\mul/ml de cultivo original, mediante electroforesis en
condiciones desnaturalizantes en geles de
acrilamida-DADT al 15% (figura 5). Se separaron las
proteínas tanto de un extracto total de las bacterias recogidas
antes de la inducción (Figura 5, carril 1), como después de la
inducción (Figura 5, carril 2), así como el sobrenadante (Figura 5,
carril 3) y el sedimento, recogidos anteriormente (Figura 5, carril
4), y también los cuerpos de inclusión tras los lavados (figura 5,
carril 5). De esta forma se confirmó la expresión de la proteína
recombinante pRNcSAG4 en las células
Rosetta(DE3)pLysS de E. coli (Novagen), con la
masa molecular aparente esperada de 17,2 kDa y su localización en
cuerpos de inclusión.
Se determinó la inmunogenicidad de la proteína
recombinante pRNcSAG4 mediante "western blot" (figura 6),
utilizando sueros de origen bovino procedentes de animales
infectados de forma natural con N. caninum. La infección de
estos sueros había sido diagnosticada previamente por la técnica de
ELISA e inmunofluorescencia indirecta (IFI), presentando títulos de
anticuerpos específicos elevados. Se realizaron tres lavados de los
cuerpos de inclusión donde se localiza la proteína pRNcSAG4,
utilizando una solución BugBuster al 0,1x, según indica la casa
comercial. A continuación se separaron las proteínas en geles de
acrilamida-DATD al 15%, mediante electroforesis en
condiciones desnaturalizantes, y finalmente se realizó la
electrotransferencia a una membrana de nitrocelulosa de 0,2 \mum
(Bio.rad), a 400 mA durante una hora sumergida en tampón de
transferencia enfriado previamente (Tris 25 mM, glicina 192 mM pH
8,5 y metanol al 20%). Los sueros de origen bovino que se
utilizaron fueron de diferentes orígenes. Así se utilizaron sueros
de animales en los que posiblemente se esté instaurando la infección
crónica, desarrollando bradizoítos, como aquellos procedentes de
animales nacidos con una infección congénita, que muestran
seropositividad precalostral, o aquellos fluidos corporales
procedentes de fetos abortados durante el último tercio de
gestación. Por otro lado se usaron sueros procedentes de vacas que
habían abortado, representativos de una posible reactivación de la
infección por N. caninum, que motiva el aborto. Así, se
utilizaron los sueros precalostrales de tres terneros (figura 6,
paneles A y B, carriles 1, 2 y 3), con títulos elevados frente a
N. caninum por IFI. Del mismo modo se utilizó líquido
abdominal, con título de anticuerpos frente a N. caninum
elevados por IFI, de fetos abortados durante el segundo (figura 6,
paneles A y B, carril 4) y tercer tercio de gestación (figura 6,
paneles A y B, carriles 5 y 6) procedentes de vacas que habían
abortado, seropositivas a N. caninum (Figura 6, paneles A y
B, carriles 7 y 8). Por último se utilizó el suero de otras dos
vacas que habían abortado (Figura 6, paneles A y B, carriles 9 y
10), seropositivas a N. caninum por IFI, con un título de
anticuerpos elevado.
Como testigo de la técnica, se realizó el
"western blot" en paralelo con los mismos sueros, en una
membrana a la que se transfirió un extracto soluble procedente de
taquizoítos de N. caninum producidos "in vitro",
utilizando los mismos sueros. Para producir el extracto soluble,
así como para realizar el "western blot", se siguió
básicamente el protocolo descrito anteriormente (Álvarez et
al. 2002. Vet. Parasitol. 107, 17-27). Así, se
bloquearon las membranas con BSA al 3% en TBS con
Tween-20 al 0,05% (TBS-T) durante
una hora en agitación a temperatura ambiente. A continuación se
incubaron las membranas con los sueros de origen bovino, a una
dilución 1:20 en TBS-T con BSA al 0,3%, durante dos
horas en agitación a 37ºC. Tras tres lavados rápidos con
TBS-T, seguidos de uno de 15 minutos y dos de 5
minutos, las membranas se incubaron con un anticuerpo monoclonal de
ratón anti-IgG de bovino conjugado con peroxidasa
(Hipra), a una dilución 1:200 en TBS-T con BSA al
0,3%, durante una hora en agitación a 37ºC. Tras otra serie de
lavados en las condiciones anteriores, se reveló con una solución de
sustrato preparada inmediatamente antes de su uso (60 mg de
4-Cloro-1-Naphtol
disuelto en 20 ml de metanol, 100 ml de TBS y 0,060 ml de peróxido
de hidrógeno), durante 15 minutos a temperatura ambiente en
oscuridad y en agitación.
Mediante el "western blot" se detectó una
respuesta evidente frente a la proteína recombinante en aquellos
sueros precalostrales procedentes de los terneros infectados
congénitamente por N. caninum (figura 6, panel A, carriles 1,
2 y 3), así como en el líquido abdominal de un feto abortado
durante el último tercio de la gestación (figura 6, panel A, carril
6). Estos animales mostraron una respuesta evidente frente a los
antígenos inmunodominantes del estadio de taquizoíto (figura 6,
panel B, carriles 1-3 y 6), a excepción de dos de
los fetos abortados (figura 6, panel B, carriles 4 y 5). Sin
embargo no se detectó una respuesta evidente en las vacas que
habían abortado (figura 6, panel A, carriles 7-10),
en las que sin embargo hubo una respuesta evidente frente a los
antígenos inmunodominantes del estadio de taquizoíto (figura 6,
panel B, carriles 7-10).
Estos resultados confirman la existencia de una
respuesta frente a la proteína NcSAG4, en el animal infectado de
forma natural, en aquellos casos en los que se puede estar
instaurando la forma crónica de la infección, es decir aquellos
casos en los que se produce la transformación del taquizoíto al
bradizoíto, lo que confirma la especificidad de la proteína NcSAG4
de esta fase de crecimiento lento del parásito, como ocurre con su
homóloga en T. gondii (TgSAG4). La falta de respuesta frente
a la pRNcSAG4 en aquellos animales con infección aguda, en los que
es característico el estadio de taquizoíto, que sin embargo
presentan una respuesta evidente frente al extracto de taquizoíto,
confirma nuevamente la especificidad de la proteína NcSAG4 del
estadio de bradizoíto.
Para determinar la especificidad de estadio de
la transcripción del gen NcSAG4 de N. caninum, se ha
desarrollado una RT-PCR realizada a partir del RNA
total extraído de bradizoítos cultivados in vitro. Para la
producción de los bradizoítos en cultivos celulares se siguió el
método descrito por Risco-Castillo et al.
(2003) J. Parasitol., enviado para publicar). Para ello se
utilizaron taquizoítos de N. caninum (Barber et al.
1995. Parasitol. 111, 563-568), para infectar
monocapas de células MARC-145 (Kim et al.
1993. Arch. Virol. 133, 477-483), a una dosis
hospedador-parásito de 2:1. Los cultivos celulares
infectados se mantuvieron en DMEM suplementado con suero fetal
bovino al 10% en presencia de Hepes (pH 7.2) 15 mM, glutamina (2
mM), penicilina (10 U/ml), estreptomicina (10 \mug/ml), fungizona
(25 ng/ml) e incubadas a 37ºC y 5% CO_{2}.
Para inducir la conversión de estadio, se
trataron los cultivos infectados con nitroprusiato sódico (SNP) a
una concentración de 70 \muM en el medio de cultivo durante 7
días tras la infección, siendo reemplazado cada dos días. Como
testigo negativo, se mantuvieron los cultivos infectados sin
tratamiento con SNP, para la producción de taquizoítos. Una mezcla
de taquizoítos y bradizoítos fue recogida por raspado del tapiz
celular infectado y tratado con SNP, centrifugando a 1350 xg
durante 15 min a 4ºC. Los taquizoítos producidos en los cultivos
infectados sin tratar con SNP se recogieron de la misma forma. Tras
dos lavados en PBS en las mismas condiciones, los zoítos se
resuspendieron utilizando una aguja de 25G y se purificaron
utilizando columnas de sephadex^{TM} G25 (PD-10,
Amersham Biosciences), para eliminar los restos celulares. Para
ello, tras equilibrar la columna con 5 ml de PBS, se dejó fluir por
gravedad la suspensión de zoítos en 5 ml de PBS. Tras dos lavados
con el mismo volumen de PBS, se recogieron los zoítos por
centrifugación a 1350 xg durante 15 min. a 4ºC. Los zoítos recogidos
se mantuvieron congelados a -80ºC hasta su uso.
Para la extracción del RNA total se utilizaron
sedimentos de 10^{7} taquizoítos o una mezcla de taquizoítos y
bradizoítos, producidos según se describe anteriormente. Para ello
se utilizó el kit comercial NucleoSpin RNA II (BD Biosciences
Clontech), siguiendo las indicaciones de la casa comercial. El RNA
total obtenido se separó mediante electroforesis en un gel de
agarosa al 0,8% en tampón TAE1x, para comprobar su calidad.
Para llevar a cabo la RT-PCR en
un solo tubo, se emplearon 100 ng del RNA total de cada origen,
taquizoíto o bradizoíto, y se utilizó un kit comercial denominado
"Qiagen® One-step RT-PCR kit"
(Qiagen), siguiendo las indicaciones de la casa comercial (figura
7). Para ello se emplearon los oligonucleótidos denominados 1R5SAG4
(SEQ ID NO: 5) y 1F3SAG4 (SEQ ID NO: 7). La RT se llevó a cabo a
50ºC durante 30 minutos. Las condiciones de la PCR fueron 15 minutos
de desnaturalización a 95ºC, seguido de 40 ciclos de 30 segundos a
94ºC, 1 minuto a 61ºC, 1 minuto a 72ºC y finalmente una elongación
de 10 minutos a 72ºC. Los productos de la PCR fueron visualizados
en un gel de agarosa de alta resolución al 3% en tampón TBE 0,5x,
teñido con bromuro de ethidio (BrEt). Como resultado de la
RT-PCR se confirmó la ausencia de transcripción del
RNA mensajero (mRNA) de NcSAG4 en los taquizoítos (Figura 7,
carril 2) y la presencia del citado mRNA en los bradizoítos (Figura
7, carril 3). Como testigo positivo de la PCR se utilizaron 100 ng
de DNA genómico obtenido a partir de taquizoítos de N.
caninum (Figura 7, carril 4) y como control negativo de la PCR
se utilizó agua ultrapura, en lugar de muestra (Figura 7, carril
1). De esta forma se confirma la especificidad de la transcripción
del gen NcSAG4, del estadio de bradizoíto de N.
caninum, al igual que sucede en su homólogo TgSAG4 de
T. gondii.
<110> Universidad Complutense de
Madrid
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\vskip0.400000\baselineskip
<120> Uso del gen NcSAG4 para el
diagnóstico y la prevención de la neosporosis, y como marcador para
el análisis de la patogenia.
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<160> 15
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<210> 1
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<211> 23
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<212> DNA
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<213> Neospora caninum
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<220>
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<222> 6
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<223> i
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<400> 1
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\hskip-.1em\dddseqskiptggacntayg ayttyaaraa rgc
\hfill23
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<212> DNA
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<222> 18
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<223> i
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<223> i
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<400> 2
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\hskip-.1em\dddseqskipaaraargara tnatnacncc ngg
\hfill23
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<213> Neospora caninum
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\hfill23
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\hfill24
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\hskip-.1em\dddseqskiptgtcgcctgt tgggttgta
\hfill19
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<400> 7
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\hskip-.1em\dddseqskipgaaacaagaa aagagactat ctca
\hfill24
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<210> 8
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<400> 8
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\hfill20
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<210> 9
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<211> 601
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<213> Neospora caninum
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<400> 9
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\newpage
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<212> proteína
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<400> 10
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\hfill26
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<213> Neospora caninum
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<400> 13
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\hfill28
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<400> 14
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\hfill30
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<210> 15
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<212> Proteína
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<213> Neospora caninum
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
Claims (18)
1. Molécula polinucleotídica de 601 nucleótidos
aislada de Neospora caninum y caracterizada por SEQ
ID NO: 9, correspondiente al gen NcSAG4, que comprende una
ORF de 522 nucleótidos que codifica la proteína antigénica NcSAG4
de 173 aminoácidos y caracterizada por SEQ ID NO: 10.
2. Molécula polinucleotídica que comprende la
secuencia de la ORF del gen NcSAG4 según reivindicación 1,
incluida en un vector de expresión, y preferentemente el plásmido
pcDNA3.1-His-C (Invitrogen), por
inserción de la misma amplificada por PCR utilizando los
oligonucleótidos FNcSAG4 y ReNcSAG4 caracterizados por SEQ
II) NO: 11 y SEQ ID NO: 12 respectivamente.
3. Molécula polinucleotídica que comprende la
secuencia que incluye desde el nucleótido 83 hasta el 444 de la ORF
del gen NcSAG4 descrita en la reivindicación 1, incluida en
un vector de expresión, y preferentemente el plásmido
pRSET-C, por inserción de la misma amplificada por
PCR utilizando los oligonucleótidos F85NcSAG4 y Re444NcSAG4,
caracterizados por SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 14,
respectivamente.
4. Molécula polinucleotídica seleccionada del
conjunto de secuencias constituido por el gen NcSAG4 de
Neospora caninum, caracterizado por SEQ ID NO: 9, por
secuencias homólogas a NcSAG4 (SEQ ID NO: 9) que codifican el
antígeno NcSAG4 y por fragmentos de NcSAG4 (SEQ ID NO: 9)
que codifican polipéptidos que conservan las características
antigénicas de NcSAG4.
5. El uso de los oligonucleótidos:
SAG4-2, SAG4-3,
SAG4-4, 1R5SAG4, 2R5SAG4, 1F3SAG4 y 2F3SAG4,
FNcSAG4, ReNcSAG4, F85NcSAG4, Re444NcSAG4 caracterizados por
SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 11, 12, 13 y 14, para la detección
de N. caninum por PCR o RT-PCR, para su
utilización como sondas de DNA, o para la amplificación por PCR de
cualquier fragmento de la secuencia descrita en la reivindicación
1.
6. Un vector recombinante que comprenda la
secuencia nucleotídica caracterizada por SEQ ID NO: 9 según
reivindicaciones 1 a 4.
7. Las células eucariotas hospedadoras
transfectadas con los vectores recombinantes de la reivindicación
6.
8. Las células procariotas hospedadoras
transformadas con los vectores recombinantes de la reivindicación
6.
9. Un polipéptido sustancialmente purificado o
aislado seleccionado de (a) la proteína antigénica NcSAG4 de N.
caninum, caracterizada por SEQ ID NO: 10 según
reivindicación 1; (b) secuencias modificadas química o
enzimáticamente derivadas de homólogas a la proteína NcSAG4 (SEQ ID
NO: 10) que conservan sus características antigénicas; (c)
polipéptidos derivados de NcSAG4 (SEQ ID NO: 10) que conservan sus
características antigénicas; o (d) proteínas recombinantes que
incluyen NcSAG4 (SEQ ID NO: 10) o incluyen polipéptidos derivados
de NcSAG4 (SEQ ID NO: 10) que conservan sus características
antigénicas.
10. El uso del promotor del gen NcSAG4
para expresar genes heterólogos en células de N. caninum
transfectadas por construcciones genéticas elaboradas con el citado
promotor.
11. Uso de las moléculas polinucleotídicas
descritas en las reivindicaciones 1 a 5 para el diagnóstico de la
infección crónica por N. caninum a partir de tejidos o
fluidos de los animales infectados mediante PCR o
RT-PCR, hibridación in situ con sondas de
DNA o cualquier otro método de detección basado en los ácidos
nucleicos del parásito.
12. Uso de los polipéptidos descritos en la
reivindicación 9 para el diagnóstico serológico de la infección
crónica por N. caninum mediante enzimoinmunoanálisis
(ELISA), radioinmunoanálisis (RIA), inmunoblot o cualquier otro
método basado en la capacidad antigénica de dichos polipéptidos.
13. Uso de anticuerpos monoclonales o suero
policlonal específico frente a los polipéptidos descritos en la
reivindicación 9, para el diagnóstico serológico de la infección
crónica por N. caninum mediante un ELISA de competición.
14. Uso de anticuerpos monoclonales o suero
policlonal específico frente a los polipéptidos descritos en la
reivindicación 9, para el diagnóstico de la infección crónica por
N. caninum en los tejidos de los animales mediante
inmunohistoquímica, inmunofluorescencia o cualquier otro método
basado en la detección del parásito por el citado suero.
15. Una composición inmunogénica que comprenda:
(a) un polipéptido descrito en la reivindicación 9; (b) una
molécula polinucleotídica según reivindicaciones 1 a 4; (c) un
vector recombinante como el descrito en la reivindicación 6; (d) las
células hospedadoras transfectadas según reivindicación 7; o (e)
las células hospedadoras transformadas según reivindicación 8,
formulada como vacuna contra la neosporosis.
16. Una composición inmunogénica según la
reivindicación 15, que comprenda un adyuvante o una o varias
citoquinas.
17. Un método de preparación de una composición
inmunogénica que comprenda una combinación: (a) un polipéptido
según la reivindicación 9; (b) una molécula polinucleotídica que
contenga una secuencia que codifique el polipéptído de la
reivindicación 9; (c) un vector recombinante como los descritos en
las reivindicación 6; (d) las células hospedadoras transfectadas
según reivindicación 7; (e) las células hospedadoras transformadas
según reivindicación 8, formulada como vacuna contra la
neosporosis.
18. Un kit de vacunación para mamíferos contra
la neosporosis que comprenda un contenedor que incluya una
composición inmunogénica formulada como vacuna según
reivindicaciones 15, 16 y 17.
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Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| BOHNE, W. et al., "Bradyzoite-specific genes.", CURR. TOP. MICROBIOL. IMMUNOL., 1996, Vol. 219, páginas 81-91. Todo el documento. * |
| FUCHS, N. et al., "Differential expression of cell surface- and dense granule-associated Neospora caninum proteins in tachyzoites and bradyzoites.", J. PARASITOL., 1998, Vol. 84, No. 4, páginas 753-758. Todo el documento. * |
| ÖDBERG-FERRAGUT, C. et al., "Molecular cloning of the Toxoplasma gondii SAG4 gene encoding a 18kDa bradyzoite-specific surface protein.", MOL. BIOCHEM. PARASITOL., 1996, Vol. 82, No. 2, páginas 237-244. Todo el documento. * |
| SCHARES, G. et al., "Neospora caninum: identification of 19-, 38- , and 40-kDa surface antigens and a 33-kDa dense granule antigen using monoclonal antibodies.", EXP. PARASITOL., 1999, Vol. 92, No. 2, páginas 109-119. Todo el documento. * |
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