ES2388416B1 - USO DEL GEN NcSRS9 Y LA PROTEÍNA NcSRS9 PARA LA PREVENCIÓN Y EL DIAGNÓSTICO DE LA NEOSPOROSIS. - Google Patents
USO DEL GEN NcSRS9 Y LA PROTEÍNA NcSRS9 PARA LA PREVENCIÓN Y EL DIAGNÓSTICO DE LA NEOSPOROSIS. Download PDFInfo
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-
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Abstract
Uso del gen NcSRS9 y la proteína NcSRS9 para la prevención y el diagnóstico de la neosporosis. La presente invención se refiere a la molécula polinucleotídica correspondiente al gen NcSRS9 de Neospora caninum y el antígeno que codifica, NcSRS9, proteína expresada durante el estadio de bradizoíto; así mismo, se refiere a los cebadores, los vectores recombinantes, las células hospedadoras transformadas o transfectadas y las proteínas expresadas de forma recombinante que derivan de dicho gen, así como al uso de estos productos y los anticuerpos específicos producidos frente a ellos como reactivos para técnicas de detección directa del parásito, a partir de muestras de los animales infectados, y para la producción de vacunas frente a la enfermedad.
Description
- USO DEL GEN NcSRS9 Y LA PROTEÍNA NcSRS9 PARA LA PREVENCIÓN Y
- EL DIAGNÓSTICO DE LA NEOSPOROSIS
- 5
- RESUMEN
- Uso del gen NcSRS9 y la proteína NcSRS9 para la prevención y el diagnóstico de la
- neosporosis. La presente invención se refiere a la molécula polinucleotídica
- correspondiente al gen NcSRS9 de Neospora caninum y el antígeno que codifica,
- 10
- NcSRS9, proteína expresada durante el estadio de bradizoíto; así mismo, se refiere a
- los cebadores, los vectores recombinantes, las células hospedadoras transformadas o
- transfectadas y las proteínas expresadas de forma recombinante que derivan de dicho
- gen, así como al uso de estos productos y los anticuerpos específicos producidos
- frente a ellos como reactivos para técnicas de detección directa del parásito, a partir de
- 1 S
- muestras de los animales infectados, y para la producción de vacunas frente a la
- enfermedad.
- OBJETO DE LA INVENCiÓN
- La presente invención se establece en el campo de la sanidad animal y se refiere,
- 20
- según se expresa en el enunciado de esta memoria descriptiva, a la prevención y el
- diagnóstico de la enfermedad producida por el protozoo parásito Neospora caninum.
- De forma más concreta, la invención se relaciona con la molécula polinucleotídica
- correspondiente al gen NcSRS9 de N. caninum y el antígeno que codifica, NcSRS9,
- proteína expresada durante el estadio de bradizoíto, así como los oligonucleótidos, los
- 25
- vectores recombinantes, las células hospedadoras transformadas y las proteínas
- expresadas de forma recombinante, así como el uso de estos reactivos para técnicas de
- detección directa del parásito en los animales infectados y para la producción de
- vacunas frente a la enfermedad.
- ANTECEDENTES
- La neosporosis
- Neospora caninum es un parásito protozoo perteneciente al phylum Apicomplexa que
- 5
- incluye otros parásitos patógenos importantes como Toxoplasma gondii. N. caninum
- está descrito desde 1989 como agente productor de aborto y mortalidad neonatal en el
- ganado bovino (Thilstcd and Dubey, 1989. J. Vel. Diagn.lnvesl. 1,205-209), aunque
- también es capaz de infectar a un amplio espectro de especies de mamíferos (Dubey,
- 2003. Korean J. Parasito\. 41,1-16; Gondim el al., 2004. J. Parasito\. 90, \361-1365;
- \O
- Moore, 2005. Vel. Parasito\. 127,87-97).
- La neosporosis bovina está considerada como una enfermedad parasitaria de
- distribución cosmopolita y una de las causas más frecuentes de fallo reproductivo
- (Dubey el al., 2007. Clin. Microbio. Rev. 20, 323-367). La manifestación clínica más
- 15
- importante de la infección en las hembras gestantes es el aborto, que puede ocurrir
- entre el tercer y noveno mes de gestación, siendo más frecuente en tomo a los 5-6
- meses. Los temeros congénitamente infectados que nacen vivos pueden presentar
- problemas neuromusculares, aunque lo más frecuente es el nacimiento de temeros
- infectados pero clínicamente sanos (Buxton el al., 2002. Trends Parasitol. 18, 546
- 20
- 552). Asimismo, la neosporosis puede afectar a los perros, hospedadores definitivos,
- aunque pueden actuar también como hospedadores intermediarios, ocasionando
- polimiositis, encefalitis, parálisis e inclusive la muerte (Lindsay and Dubey, 1989. J.
- Parasito\. 75, 163-165; Buxton el al., 2002. Trends Parasito\. 18, 546-552).
- 25
- N. caninum presenta un ciclo de vida que comprende tres estadios infectan tes (Dubey
- and Lindsay, 1996. Vel. Parasito\. 67, 1-59; Basso el al., 2001. J. Parasito\. 87, 612
- 618). Los esporozoítos infectan al hospedador intermediario por ingestión de los
- ooquistes eliminados en las heces del hospedador definitivo y que esporulan en el
- medio ambiente. En el hospedador intermediario se desarrollan dos fases
- 30
- intracelulares distintas: los taquizoítos, de replicación rápida y responsables de la fase
- aguda de la infección, y los bradizoítos, la forma de multiplicación lenta del parásito,
- que se acantonan dentro de los quistes tisulares localizados fundamentalmente en el
sistema nervioso central y que son responsables de la fase crónica de la infección. Estos bradizoítos permanecen latentes en los quistes hasta su reactivación y conversión a taquizoítos pudiendo desencadenar la recrudescencia de la enfennedad (Antony and Williamson, 2001. New Zea\. Vel. J. 49, 42-47; Buxton el al., 2002 . Trends Parasito\. 18,546-552).
Diversos estudios en N. caninum indican que la diferenciación de taquizoíto a bradizoíto en estos parásitos es un fenómeno inducido por estrés, aunque no se conocen con exactitud los mecanismos moleculares que determinan el paso de una fase del ciclo a otra (Risco~Castillo el al., 2004. 1. Parasitol. 32, 1253-1265; Eastick and Elsheikha, 2010. Parasito\. Res. 106, 1009-1014). Asimismo, se ha sugerido una implicación de la respuesta inmune del hospedador en la latencia y la reactivación de la infección en animales infectados de forma crónica (Hemphill and Gottstein, 2006. Acta Parasitologica. 51, 15-25; Eastick and Elsheikha, 2010. Parasitol. Res. 106, 1009-1014).
Antígenos de N. ca"¡,,um En lo que se refiere a la comparación de la composición antigénica entre el taquizoíto y el bradizoíto de N. caninum, la información disponible hasta el momento es escasa.
En N. caninum se han identificado antígenos específicos del taquizoíto o compartidos por ambos estadios (Fuehs el al., 1998. J. Parasito!. 84, 753-758; Lee el al., 2004. J. Vel. Sei. 5, 139-145; Shin el al., 2004. Proteomies 4, 3600-3609; Shin el al., 2005. Vel. Parasito!. 134,41-52; Kang el al., 2008. Parasito!. Res. 103, 1011-1018). Entre estos antígenos se han descrito dos proteínas de superficie: NcSAG 1 (Hemphill el al., 1997. Parasitology 11 5, 371 -380), específica de taquizoíto, cuyo gen fue clonado por Howe el al. (1998. Infeel. Immun. 66, 5322-5328), Y NeSRS2 (Hemphill el al., 1996. Parasitol. Res. 82,497-504), que se expresa de forma conjunta en los taquizoítos y en los bradizoítos.
También se han identificado seis proteínas de micronemas, NcMIC3 (Sonda el al., 2000. Mo!. Bioehem. Parasito!. 108, 39-51), NeMICI (Keller el al., 2002. Infeel.
Immun. 70,3187-3 I 98), presentes en ambos estadios, y NeMIC2 (Lovett el al., 2000. Mol. Bioehem. Parasitol. 107, 33-43), NeMIC4 (Keller el al., 2004. Infee!. Immun. 72,4791-4800), NeMIC IO (Atkinson el al., 2001. In!. J. Parasitol. 31,67-71 ), así como NeAMAI (Zhang et al., 2007. Mol. Bioehem. Parasito. 151, 205-212)
identificadas a partir de taquizoítos. Asimismo, se ha incluido en el banco de genes una secuencia de N. caninum denominada NcMICll (AF539703), que podría codificar una proteína de micronemas ya que su secuencia presenta una homología elevada con la secuencia que codifica la proteína de T. gondii TgMICII.
Respecto a proteínas de coptrias, hasta el momento tan só lo se ha identificado y clonado la proteína NcROP2, implicada en el proceso de invasión celular por los
taquizoítos (Debache el al., 2008. In!. 1. Parasito. 38, 1455-1463).
Otros genes que han sido clonados son NcGRA6 y NeGRA7, que codifican proteínas de gránulos densos del taquizoíto de N caninum (Lally el al., 1996. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 3, 275-279) Y las denominadas NcGRA2 (Ellis el al., 2000. Parasitology
120 (Pt 4), 383-390) Y NeGRA1 (Lee el al., 2003. Proteomies 3, 2339-2350). Las
proteínas NcGRAl, NcGRA2, y NcGRA7 se localizan no sólo en el estadio de taquizoíto sino también en la pared de los quistes producidos in vi/ro (Vonlaufen el
al., 2004. 72, 576-83).
Con base en varios de estos antígenos se han desarrollado diversos ELISAs recombinantes para el diagnóstico de la infección por N caninum y se ha probado la utilidad de diversas vacunas de subunidades basadas en algunas de estas proteínas en modelos murinos de infección (revisado en: Dubey and Schares el al., 2006. Vet.
Parasito!. 140, 1-34; Ellis el al., 2009. Int.!. Parasito!. 39, 1173-1187).
Finalmente, se han clonado genes que expresan enzimas en N caninum: el gen que codifica para la NcNTPasa-l, localizada en los gránulos densos (Asai el al., 1998. Exp. Parasitol. 90, 277-285); NcSUBI, que expresa una serin-proteasa de 65 kDa localizada en los micronemas del taquizoíto (Louie and Conrad, 1999. Mol. Biochem.
Parasito!. 103,211-223; Louie el al., 2002. J. Parasitol. 88, 1113-11 19); un gen que
codifica una superóxido dismutasa (Fe-SOO) que se expresa tanto en el estadio de taquizoíto como en el de bradizoíto (Cho et al., 2004. J. Parasitol. 90, 278-85) Y el gen que codifica una disulfuro isomerasa (NcPDI) específica del taquizoíto e implicada en la interacción del parásito con la célula hospedadora (Naguleswaran el al., 2005. Int. J. Parasitol. 35,1459-1472).
En relación con los antígenos específicos del bradizoíto de N. caninum, tan sólo los genes NcSAG4 (ES2263317B2) y NcBSR4 (ES2325701B1) han sido identificados, clonados y caracterizados, siendo el primero de expresión temprana y el segundo de expresión tardía en el estadio de bradizoíto (Femández-García el al., 2006. Mol. Biochem. Parasitol. 146,89-97; Risco-Castillo el al., 2007. Int. 1. Parasitol. 37, 887896). Por otro lado, recientemente se han identificado diversas proteínas reguladas durante el proceso de diferenciación de taquizoíto a bradizoíto mediante un abordaje proteómico, destacando la detección de enzimas implicadas en metabolismo energético así como proteínas de choque térmico, entre otras (Marugán-Hemández et al., 2010. Proteomics, 10, 1740-1750 ).
Diagnóstico de la neosporosis El diagnóstico de la infección por N caninum así como del aborto por neosporosis en el ganado bovino es complejo y laborioso. Además de los datos epidemiológicos y clínicos de la explotación (historial y patrón de abortos, principalmente), se emplean diversas técnicas de diagnóstico laboratorial (Dubey el al., Clin. Microbio!. Rev. 203, 23-367; Ortega-Mora el al., Acta Parasitol. 51, 1-14; Álvarez-García el al., 2007. In Ortega-Mora el al. (Eds.). Oxfordshire, UK, pp 89-122).
En el caso del diagnóstico del aborto por N caninum, en el feto se aplican las técnicas histológicas, para la observación de lesiones compatibles con neosporosis, examinando la severidad y la extensión de las mismas, y las técnicas de detección del parásito por PCR o inmunohistoquímica, principalmente en el sistema nervioso central (SNC). Este diagnóstico directo debe ir acompañado del análisis serológico tanto fetal como maternal.
En cuanto al diagnóstico de la infección por N caninum en el bovino tcas el nacimiento, el diagnóstico de laboratorio se realiza principalmente mediante la detección de anticuerpos específicos en el suero sanguíneo o en la leche, tanto a nivel individual como de explotación, habiéndose desarrollado diversas técnicas serológicas
5 a lo largo de los últimos años entre las que destacan la inmunofluorescencia indirecta y el EUSA (revisado en Dubey and Sehares, 2006. Vet.Parasilol. 140, 1-34).
Las técnicas de ELISA más comúnmente utilizadas son las que emplean como antígeno un extracto de proteínas solubles o un extracto completo de los taquizoÍtos de ION. caninum. Estos ELISAs son herramientas muy valiosas para conocer el estatus infectivo a nivel individual (infectado/no infectado) así como para estudios de prevalencia de la infección y de relación de la misma con el aborto (Ortega-Mora el al. 2006. Acta Parasilol. 51, 1-14; Dubey el al., 2007. Clin. Mierobiol. Rev. 20, 323367; Álvarez-García el al., 2007. In Ortega-Mora el al. (Eds.). Oxfordshire, UK, pp
Asimismo, como variante al ELlSA convencional basado en un extracto de proteínas de los taquizoítos o en la proteína purificada por afinidad p38, se ha desarrollado el ELISA de avidez, que permite diferenciar animales con una primo-infección de
20 animales con una infección crónica y nos orienta sobre la ruta de transmisión predominante en la explotación (Bjorkman el al. 1999.1. Vet. Diagn. Invest. 11,4144; Aguado-Martínez el al., 2005. J. Veto Diagn. Invest. 17,442-450; Bjorkman el al., 2006. Vet. Parasitol. 140,273-280; Sehares et al., 2002. Vet. Parasitol. 106,293-305).
25 Por otro lado, el EUSA convencional se ha estandarizado también para su aplicación a muestras de leche obteniéndose correlaciones muy buenas con las muestras de suero (Bjorkman el al., 1997. Vet. Parasilol. 68, 251-260; Sehares el al., 2005. J. Vet. Med. B Infect. Dis. Vet. Public Health. 52, 45-48). Del mismo modo~ se ha aplicado a muestras de tanque de leche en las cuales, si bien la sensibilidad de esta técnica es
30 menor (detección de anticuerpos en tanque a partir de prevalencia intra-rebaños del 10%), es útil para el seguimiento serológico de las explotaciones seropositivas sometidas a programas de control (Schares el al., 2004. Parasitology. 129,301-309;
Wapeoaar el al., 2007. Can. Vet J. 48, 493-499; Chanluo el al., 2006. Ve!. Parasitol. 136,3-4; Bartels el al., 2007. Prevo Ve!. Med. 81, 265-273).
En los últimos años, y como alternativa a los ELISAs convencionales, se han desarrollado diversos ELISAs basados en el uso de antígenos recombinantes (revisado en: Ortega-Mora el al. 2006. Acta Parasitol. 51, 1-14; Dubey and Schares, 2006. Vet.Parasitol. 140, 1-34), Y se han descrito recientemente técnicas de diagnóstico basadas en la detección de anticuerpos anti-rNcGRA 7 y anti-rNcSAG4, que pennitirían diferenciar animales con infección aguda de aquellos con infección crónica, sugiriéndose que la detección de ambos anticuerpos sería indicativa de una recrudescenc"ia o re-infección asociadas con aborto y/o transmisión transplacentaria en explotaciones con un patrón endémico de abortos asociados a N. caninum, mientras que la detección de anticuerpos anti-rNcGRA 7 y la no detección de anticuerpos antirNcSAG4 sería indicativo de aborto epidémico, muy claro a nivel de rebaño (Aguado-MartÍnez el al., 2008. Ve!. Parasitol. 157, 182-195).
Prevención de la neosporosis En cuanto al control de la enfermedad, las medidas deben ir encaminadas, fundamentalmente, a reducir la prevalencia de la infección en las explotaciones ya que la neosporosis es una de las principales causas de aborto y mortalidad neonatal en el ganado bovino. Así, el establecimiento de un programa adecuado de desvieje y reposición selectivas para reducir el efectivo infectado evitaría la transmisión vertical de la enfermedad, que parece ser la vía principal de establecimiento de la enfermedad de forma persistente en las explotaciones. Además, dado que se ha demostrado que la infección postnatal por ingestión de ooquistes puede tener lugar en las explotaciones (Dijkstra el al., 2001. lo!. J. Parasitol. 31 , 209-215; Schares el al., 2002. Ve!. Parasitol. 106, 293-305), se deberían aplicar también medidas de bioseguridad como el control del acceso de los perros a la explotación, que actúan como hospedadores definitivos, y la ingestión por su parte de placentas y otros tejidos fetaJes (Reichel and Ellis. 2002.
N. Z. Ve!. J. 50, 86-92; Dubey el al. 2007. Clin. Microbio!. 20, 323-367).
Por otro lado, el control farmacológico de la neosporosis en el ganado bovino es inviable en la actualidad, tanto porque no se tiene experiencia de su tratamiento en bovinos como porque los datos disponibles son poco alentadores. Cabe señalar que los elevados costes de un posible tratamiento, la aparición de posibles resistencias y los residuos en carne o leche limitan la quimioterapia como medida de control. Oc esta forma, a las medidas de manejo del rebaño habría que añadir la inmunoprofilaxis,
5 medida considerada económicamente viable (Innes el al. 2002. Trends Parasitol. 18, 497-504; Nishikawa el al. 2002. J. Vet. Med. Sci. 64, 1-5; Moore el al., 2005. Rev. Argent. Microbiol. 37, 217-228; ElIis el al., 2006. Vet. Parasitol. 142, 23-34).
En la actualidad, sólo hay disponible una vacuna comercial en algunos países basada
lOen taquizoítos ¡nactivados (NeoGuard de lntervel) sin embargo sólo protege del aborto en el 50% de los casos (Romero et al., 2004. Vet. ParasitoJ. 123, 149·59). Por lo general, las vacunas vivas han mostrado los mejores resultados respecto a la protección frente a la neosporosis, tanto en ensayos realizados en modelos murinos como bovinos (Reichel y Ellis, 2009. Int. J. Parasitol. 39, 1173·87). Se ha observado
15 que dosis subletales con taquizoítos vivos de N. caninum son capaces de conferir inmunidad protectora frente a la neosporosis murina (Lunden el al., 2002. Int. J. ParasitoL 32, 867·76), aunque por otro lado el empleo de aislados vivos puede conllevar problemas de seguridad debido al posible acantonamiento del aislado vacunal y su posterior reactivación durante la gestación. Por ello, se ha propuesto
20 como una estrategia interesante el empleo de aislados de baja virulencia, capaces de generar una respuesta inmune protectora pero cuya persistencia en el hospedador quede seriamente comprometida. Entre los aislados de baja virulencia cabe destacar el papel de aquellos atenuados naturalmente, cuya transmisión en ratón o en bovinos se ha visto reducida de manera importante (Nc-Nowra y Nc-Spain 1 H; Miller et aL,
25 2002. Aust. Vet. J. 80, 620-5; Rojo-Montejo et al., 2009a. Vet. Parasitol. 159,7-16; Rojo·Montejo et al., 2009b. Vet. Res. 40, 49, respectivamente) y que han mostrado protección frente a la transmisión vertical del parásito en modelos murinos (Nc· SweBI y Nc·Nowra; Atkinson el al, 1999. Parasitology 118,363-370; MiIler et aL, 2005. Int. 1. ParasitoL 35, 821-828, respectivamente) así como en modelos bovinos
30 (Nc-Nowra; Williams et al., 2007. Infee! Immun. 75, 1343-1348). Conforme a esto, otros métodos de atenuación del parásito han sido llevados a cabo, presentando también resultados prometedores al ser utilizados como vacuna. Así es el caso del
empleo de mulantes vivos sensibles a temperatura, incapaces de persistir o crear patología en ratones (Lindsay el al., 1999. J. Parasitol. 85,64-67), parásitos vivos cuya multiplicación ha sido suprimida mediante el empleo de irradiación y (Ramamoortby y col, 2006. J. Eukaryot. Microbio!. 53, 151-6) Y atenuación mediante mantenimiento prolongado en cultivo celular (Bartley el aL, 2008. Parasitology. 135 (PI 1), 13-21; Bartley el al., 2009. Parasite Immunol 3 1, 392-40 1).
Por otro lado, diversas investigaciones proponen nuevas estrategias para el desarrollo de vacunas de nueva generación frente a la neosporosis, tales como las vacunas de proteínas recombinantes y las vacunas ADN, junto con nuevas técnicas de adyuvantación que incrementarían la capacidad protectiva del inmun6geno. Las vacunas de nueva generación presentan una serie de ventajas respecto a las vacunas tradicionales, entre ellas la seguridad y la estabilidad relativa de las proteínas recombinantes, comparadas con los parásitos vivos, la flexibilidad de incorporar sólo aquellos antígenos que inducen una respuesta inmune protectora, así como la capacidad de establecer una producción a gran escala (Jenkins. 2001. Vet. Parasitol. 10 1, 29 I -3 I O).
Hasta el momento, la mayoría de ensayos vacunales frente a la neosporosis se han realizado con antígenos de taquizoíto o compartidos por ambos estadios, inoculados como proteínas recombinantes, como vacunas ADN o como combinación de ambos sistemas (Reichel y Ellis, 2009. Int. J. Parasitol. 39, 1173-87). Los ensayos realizados hasta el momento han utilizado modelos murinos, algunos de ellos gestantes para medir la transmisión congénita. Se han utilizado las siguientes proteínas recombinantes con resultados muy variables: NcMJC3 (Cannas el al., 2003a. J. Parasitol. 89,44-50; Debaehe el al., 2009. In!. J. Parasitol. 39, 1373-1384), NeMICI (Alaeddine el al., 2005. J. Parasitol. 91, 657-65; Debaehe el al., 2009. In!. J. Parasitol. 39, 1373-1384), NeMIC4 (Srinivasan el al., 2007. J. Parasitol. 93, 1046-1055), NeROP2 (Debaehe el a/., 2008 . In!. J. Parasitol. 38, 1455-1463; Debaehe el al., 2009. Inl. J. Parasitol. 39, 1373-1384 ; Debaehe el al., 2010. Parasitology. 137,229-240), NeGRAI y NeGRA2 (Ellis el al., 2008. Vaecine. 26, 5989-5996), NcGRA6 (Cho el al., 2005. Korean J. Parasitol. 43, 19-25), NcGRA7 (Liddell el al. 2003. J. Parasitol.
89,496-500; Jenkins el al., 2004. Infect. Immun. 72, 1817-9 ; Nishikawa el al., 2009. Clin Vaccine Immuno/' 16,792-797), NcsHSP33 (Liddell el al., 2003. J. Parasitol. 89, 496-500), NcPDI y NcMAGI (Debache et al., 2010. Parasitology. 137, 229-240), NcAMA I (Zhang el al., 2010. Exp. Parasitol. 125, 130-136), NcSAGI (Cannas el al., 2003b. Parasitology 126, 303-312; Cho el al. 2005. Korean J. Parasitol. 43, 19-25) Y NcSRS2 (Cannas el al., 2003b. Parasitology 126, 303-312; Pinitkiatisakul el al., 2007. Vaccine. 25, 3658-3668; Zhao el al. , 2009. Acta Vel. Hung 57:51-62). Estas dos
últimas proteínas de la superficie del taquizoíto junto con rNcROP2 son con las que se han obtenido mejores resultados de inmunoprotección. Trabajos recientes han utilizado diversas combinaciones de antígenos recombinantes, observándose mayor protección in vilro e in vivo con la combianción NcSRS2/ NeGRA 7 que con la
combinación NcSAGI/NcSRS2/NcGRA6/NcGRA7 (Cho el al. 2005. Korean J.
Parasitol. 43, 19·25), Y lográndose la inducción de una protección parcial con la combinación MICIO/p24B respecto a la combinación de las proteínas recombinantes
de NeGRAI, NcGRA2, NcMICIO, y p24B (Ellis el al., 2008. Vaccine. 26,5989
5996). Además, la expresión de NcSRS2 pero no de NeGRA 7 utilizando la cepa recombinante RB51 de Brucella aborlus también ha mostrado conferir cierta protección frente a la infección cerebral por N. caninum en ratón (Vemulapalli el al., 2007. Vet. Parasitol. 148,2 19-230). Por otro lado, se ha ensayado un virus "vaccinia" recombinante para expresar NcSAG l y NcSRS2 en la prevención de la neosporosis cerebral y de la transmisión vertical de N. caninllm en un modelo murino obteniéndose resultados esperanzadores (Nishikawa el al., 2001 a. Vaccine 19, 1381-1390;
Nishikawa et al., 2001 b. Vaccine 19, 1710-1716).
Los únicos genes que se han descrito en N. caninllm hasta la fecha que codifican proteínas específicas del estadio de bradizoíto son NcSAG4 (ES2263317B2) y NcBSR4 (ES232570IBl). Recientemente, la proteína recombinante rNcSAG4 ha sido evaluada en una prueba vacunal en el modelo murino gestante en el que, si bien indujo un ligero retraso de la mortalidad de las crías, no mostró resultados significativos de inmunoprotección (Aguado-Martínez et al., 2009b. Vaccine. 27, 7331-7338).
En este sentido, el aislamiento del gen NcSRS9 de N. caninum, su clonación y expresión como proteína recombinante, según se expone en la descripción de la invención de esta memoria, aporta una solución de gran utilidad para el desarrollo de vacunas frente a la neosporosis. La inmunización con la proteína recombinante rNcSRS9 da lugar a la producción de anticuerpos específicos que, además, se relacionaron con un retraso de la mortalidad en las crías de los ratones infectados con
N. caninurn. Ambos hechos convierten a este gen y la proteína que codifica en candidatos ideales para ser incorporados en preparaciones vacunales y composiciones inmunogénicas por su potencial acción inmunoprotectora.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Uso del gen NcSRS9 y la proteína NcSRS9 para la prevención y el diagnóstico de la neosporosis. La invención proporciona un reactivo de utilidad para su empleo con fines vacunales o inmunogénicos frente a N caninum. Ensayos vacunales en ratones gestantes con la proteína recombinante rNcSRS9 muestran la inducción de una respuesta inmune humoral asociada a un retraso de la mortalidad en las crías de los ratones vacunados e infectados con N. caninum. Estos hechos convierten al gen NcSRS9 y a la proteína codificada por él, en su fonna nativa o recombinante, en buenas herramientas para ser incorporadas en preparaciones vacunales o inmunogénicas por la potencial capacidad inmunoprotectora de la forma recombinante.
Se describe una tecnología molecular que ha permitido la identificación, aislamiento y caracterización del gen NcSRS9 de N. caninum (SEQ ID NO: 13, incluido en SEQ ID NO: 14) y que codifica la proteína NcSRS9 de N. caninum (SEQ ID NO: 15). Para ello se ha utilizado la técnica del paseo cromosómico que permitió obtener una secuencia polinucleotídica localizada a 1.867 bases del extremo 3' de la región codificante de NcBSR4 y que codifica una proteína que presentó un 43% de identidad con la proteína codificada por el gen TgSRS9 de Toxoplasma gondii, previamente existente (gen TGGTl 121100, ToxoDB 4.3, USA) en bases de datos (BLASTX v.2.2.19, NCBI, USA; BLASTX v. 2.0, ToxoDB 4.3, USA). Así, los oligonucleótidos F3.2BSR4 (SEQ ID NO: 1), F4.2BSR4 (SEQ ID NO: 2), SECFI (SEQ ID NO: 3), SECF2 (SEQ ID NO: 4), F5BSR4 (SEQ ID NO: 5), F6BSR4 (SEQ ID NO: 6), F7BSR4 (SEQ ID NO: 7) y F8BSR4 (SEQ ID NO: 8) se utilizaron para completar y confirmar el gen en sentido 3'. Los oligonucleótidos adaptadores APly AP2, proporcionados por el Universal Genome Walker kit de Clontech, se utilizaron para completar y confirmar el gen en sentido 5'. Asimismo, se confirmó la conservación de este gen mediante su amplificación por PCR usando los oligonucleótidos NcSRS9F (SEQ ID NO: 9) y NcSRS9R2 (SEQ ID NO: 10) en ADN extraído de varios aislados de N. caninum, entre los que no se observó la existencia de polimorfismos.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a la clonación del gen NcSRS9, mediante su amplificación por peR, utilizando oligonucleótidos especialmente diseñados para ello y la posterior digestión con enzimas de restricción de los productos de la PCR. Esta clonación se realiza en un plásmido de expresión en un sistema procariota en el que se inserta el gen NcSRS9 o una parte del mismo. Preferentemente se utilizan sistemas en los que la propia expresión de la proteína recombinante rNcSRS9, bajo el control del promotor T7, facilita su purificación mediante métodos habituales, como es el caso del plásmido pET-45b(+). Otra opción es insertar en el plásmido seleccionado el fragmento del gen NcSRS9 que codifica desde el aminoácido 40 al 375 incluidos, correspondiente a la secuencia de la proteína madura NcSRS9, excluyendo la región del péptido señal del extremo amino de la misma y la región correspondiente al anclaje de glicosil-fosfatidil-inositol (gpi) de su extremo carboxilo. Para ello se amplifica por PCR la región codificante del gen NcSRS9, o la región correspondiente que se quiere clonar, a partir de ADN genómico de N caninum, puesto que dicho gen carece de intrones, utilizando los oligonucleótidos diseñados a tal fin que, en el caso del fragmento que codifica la secuencia correspondiente a la proteína madura, fueron los denominados FoSRS9KpnI (SEQ ID NO: 11) y ReSRS9Sacl (SEQ ID NO: 12).
Para producir la proteína recombinante rNcSRS9 (SEQ ID NO: 16), se utilizan células que permiten la expresión de las proteínas recombinantes y que inducen dicha
- expresión. Preferentemente se utiliza la cepa rosetta(DE3)pLysS de E. coli (Novagen),
- que expresa de forma inducida la ARN polimerasa del fago T7, e induce la expresión
- de la proteína recombinanle rNcSRS9 por adición de IPTG al medio de cultivo.
- Pueden utilizarse también formas truncadas de la proteína NcSRS9, así como
- 5
- proteínas recombinantes que incluyan NcSRS9, proteínas homólogas a NcSRS9,
- proteínas homólogas a NcSRS9 con modificaciones químicas o enzimáticas, o
- proteínas codificadas por moléculas polinucleotídicas homólogas al gen NcSRS9,
- siempre que conserven las características antigénicas de esta proteína.
- lO
- En la presente invención, se entiende por proteínas homólogas y moléculas
- polinucJeotídicas homólogas aquellas que presentan un porcentaje de identidad igualo
- superior al 90% con respeclo a la proleÍna NcSRS9, o formas truncadas de la misma
- que mantienen la antigenicidad de NcSRS9, y un porcentaje de identidad igual o
- superior al 95% con respecto al gen NcSRS9, respectivamente. Por ejemplo, en el caso
- 15
- de la proteína NcSRS9 madura sin el péptido sefial del extremo amino tenninal ni la
- secuencia correspondiente al anclaje gpi del extremo carboxi, tal y como se describe
- en el ejemplo 2, se consideran proteínas homólogas aquellas que presentan un
- porcentaje de identidad igualo superior al 90% con dicho fragmento de la proteína
- NcSRS9. El algoritmo utilizado para calcular el porcentaje de identidad ha sido el
- 20
- BLAST (Basic Local Ali gnment Search Tool) desarrollado por Gish, W. (1996-2006)
- (htto:! /bIas!. wustl.edu).
- Por otro lado, en la presente invención también se describe la detección de
- N caninum, en tejidos animales infectados, mediante amplificación por PCR del gen
- 25
- NcSRS9 de N. caninum previamente descrito en esta invención. Igualmente, se
- describe el desarrollo de sueros policlonales monoespecíficos frente a la proteína
- recombinante rNcSRS9 así como su aplicación efectiva en inmunofluorescencia sobre
- cultivos celulares infectados con N. caninum o en inmunohistoquímica sobre tejidos
- animales infectados con dicho parásito, demostrándose su interés como reactivos para
- 30
- su empleo en cualquier otra técnica basada en la detección serológica o en técnicas
- para la detección directa de N. caninum en los tejidos de los animales.
La presente invención proporciona, igualmente, un reactivo de gran utilidad para el desarrollo de composiciones inmunogénicas y formulaciones vacunales frente a la neosporosis, la transmisión vertical de la infección y el establecimiento de la infección crónica. Por un lado, se demuestra mediante la técnica de western blot, basado en la proteína recombinante rNcSRS9, el desarrollo de anticuerpos específicos frente a NcSRS9 en bovinos naturalmente infectados por N caninum, lo cual sugiere la naturaleza inmunogénica de la proteína nativa NcSRS9. Por otro lado, el sistema de expresión de genes heterólogos en procariotas presenta la ventaja de poder producir a gran escala el antígeno recombinante, utilizándolo así en preparaciones inmunogénicas o vacunales. Este tipo de vacunas son muy seguras, lo que representa un beneficio respecto de las vacunas basadas en otros vectores recombinantes como los víricos.
Este tipo de proteínas recombinantes utilizadas como vacuna de subunidades, inducen una respuesta inmune principalmente de tipo humoral. Así, para dirigir la respuesta inmune también hacia una de base celular se utilizan adyuvantes que la orientan en este sentido como, por ejemplo, diversas citoquinas en solitario o junto a otros adyuvantes, partículas no infecciosas similares a la cápside vírica (VLP; J;:irus-b,ike E.artic/es) o la encapsulación de la proteína en biopolímeros, como la poly-epsiloncaprolactona (peLl, coo propiedades bioadhesivas, biodegradables y biocompatibles, capaces de mejorar la presentación del antígeno a los componentes del sistema inmune, permitir su liberación lenta en el organismo y potenciar la respuesta inmune celular (Eldrige el al., 1991. Mol Immuool. 28:287-290; Aguilar el al, 2007. Vaccine.
- 25:
- 3752-62; Murillo el al., 200I.Vaccioe.19:4099-4l06; Floriodo et al., 2009. Biomaterials. 30, 879-891 ; Da Costa Martins et al., 2009. Vaccine. Epub ahead of print). En este sentido, se describe en la presente memoria la incorporación de la proteína recombinante rNcSRS9 a un adyuvante nanoparticulado basado en la PCL, comprobándose el mantenimiento de la integridad y antigenicidad propia de rNcSRS9 tras la encapsulación. La inmunización de ratones BALBJc con estas nanopartículas genera una respuesta inmune humoral específica frente a rNcSRS9, detectable mediante western blot, y se observa un ligero incremento de la supervivencia de las crías nacidas de las ratonas inmunizadas y desafiadas con un aislado virulento de
- N.
- caninum durante la gestación en comparación con las hembras no inmunizadas e infectadas.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Para complementar la descripción y con objeto de ayudar a una mejor comprensión de las características de la invención, se acompaña a la presente memoria descriptiva, como parte integrante de la misma, un juego de figuras en donde, con carácter ilustrativo y no limitativo, se ha representado lo siguiente:
Panel A: Representa el esquema de clonación de NcSRS9 en el plásmido de expresión,
según se explica en el ejemplo 2 de esta memoria. Panel B: Representa el esquema de
la proteína recombinante rNcSRS9, según se explica en el ejemplo 2 de esta memoria.
Figura 2.
La figura muestra la selección de los plásmidos recombinantes por digestión con
enzimas de restricción, según se explica en el ejemplo 2 de esta memoria. Los
plásmidos recombinantes pSRS9.9 (carril 2) y pSRS9.ll (carril 3) liberaron un
fragmento del tamaño esperado (1017 pb). El plásmido si n digerir de pSRS9.11 se
visualizó en el mismo gel (carril 4). Además, se digirió el vector pET-45b(+) como
control de la digestión (carril 5). El carril 1 muestra un plásmido digerido en el que el
fragmento de interés no llegó a insertarse. Corno marcador del tamaño molecular (L)
se utilizó "1 Kb Plus DNA ladder" (Invitrogen).
Figura 3.
Panel A: Expresión de la proteína recombinante rNcSRS9 en E. eoli (clon
pSRS9.11.3). según se explica en el ejemplo 2 de esta memoria. Sobrenadante
(carriles 1-3) y cuerpos de inclusión (carriles 4-6) de 3 lotes diferentes de rNcSRS9,
siendo K "Precision Plus Protein Standards Kaleidoscope (Bio-rad)".
Panel B: Fracciones 4, 5 Y 6 de rNcSRS9 purificada (carriles 1-3) por cromatografia de afinidad (lMAC) a partir de los cuerpos de inclusión desnaturalizados (carril 4), según se explica en el ejemplo 2 de esta memoria, siendo K "Precision Plus Proteio Standards Kaleidoscope" (Bio-rad) y carriles 5-7 una curva estándar de albúmina sérica bovina.
Figura 4. Panel A: Caracterización de la proteína NcSRS9 mediante inmunofluorescencia (IF), según se explica en el ejemplo 4 de esta memoria. La figura muestra un cultivo in vilro de N. caninum con taquizoítos transformados en bradizoítos tras 7 días de estrés, que reaccionan por IF doble, en verde frente a un suero policlonal de conejo específico producido frente a la proleína rNcSRS9 (Figura:; S y e del panel S, en verde) y en rojo frente a la proteína NcSAG 1 específica del estadio de taquizoíto (Figuras A y e del panel B, en rojo). Panel S: Reactividad del suero policlonaI de conejo anti-rNcSRS9 mediante irununohistoquímica (IHQ) frente a bradizoítos producidos in vivo, según se explica en el ejemplo 4 de esta memoria. En la figura podemos observar un quiste tisular conteniendo bradizoítos de N caninum que, tras haber sido sometidos a una linción por IHQ, han reaccionado frente al suero anti-rNcSRS9 producido en conejo, observándose el inmunomarcado específico de la superficie de los parásitos. Panel C: Reactividad de muestras de 8 sueros de vacas reproductoras con infección natural (carriles 1-8) y de 11 temeros precalostrales con infección congénita por
N. caninum (carriles 9-19) mediante western blo! utilizando la proteína rNcSRS9, según se explica en el ejemplo 4 de esta memoria. Como control se llevó a cabo otro western blOf utilizando la proteína rNcSSR4 enfrentada a los mismos sueros para confinnar su inmunoreaclividad frente a una proteína específica de bradizoítos de expresión tardía.
Figura 5. Panel A: Reactividad de muestras de suero de vacas infectadas naturalmente con N caninum mediante western blOf utilizando la proteína rNcSRS9 nanoencapsulada
según se explica en el ejemplo 6 de esta memoria. Los pesos moleculares (kDa) se
indican a la izquierda. La flecha indica la proteína rNcSRS9.
Panel B: Irnmunoblol de rNcSRS9 con muestras de suero de ratones inmunizados COIl
rNcSRS9 nanoencapsulada (G3) y ratones sin inmunizar (GI). Los pesos moleculares
(kDa) se indican a la derecha.
Panel C: Curvas de supervivencia Kaplan-Meier de neonatos nacidos de madres
inmunizadas con rNcSRS9 nanoencapsulada (03) y del grupo testigo no inmunizado
infectado (02) durante los 10 primeros días postparte.
MODO DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos, los
cuales no son limitativos de su alcance, que viene definido exclusivamente por la nota
reivindicatoria adjunta.
Ejemplo 1: aislamiento y caracterización del gen NcSRS9
Para el aislamiento del gen NcSRS9 de N. caninum se utilizó el método denominado
paseo cromosómico o genome-walking, que permite amplificar mediante PCR
fragmentos de AON cuya secuencia se desconoce pero que flanquean regiones de
ADN conocidas.
Para diseñar los oligonuc1eótidos necesarios para el paseo cromosómico se utilizó la
secuencia correspondiente a NcBSR4 que expresa un antígeno específico de la fase de
bradizoíto de N caninum. Se utilizó el AON gcnómico de N caninum y un kit
comercial (Universal Genome Walker™ kit, SO Siosciences Clontech) para realizar
el paseo cromosómico en sentido 3' a partir de esta secuencia. El primer paso para
llevar a cabo esta técnica consistió en la digestión del AON genómico con cuatro
enzimas de restricción distintas que producen extremos romos: EcoRV, DraI, PvuII y
Stul, y su posterior ligación a unos oligonucleótidos adaptadores, siguiendo las
instrucciones de la casa comercial. A continuación, con cada una de las genotecas así
obtenidas se realizó una PCR doble utilizando unos oligonucleótidos que se unen al
adaptador (APl y AP2, respectivamente) y al oligonucleótido específico del gen,
diseñado en función de la secuencia genómica conocida.
,.
Los oligonucleótidos diseñados para realizar el paseo cromosómico en el extremo 3' a partir del gen NcBSR4 se denominaron: F3.2BSR4 (SEQ 10 NO: 1), F4.2BSR4 (SEQ 10 NO: 2), SECFI (SEQ 10 NO: 3), SECF2 (SEQ ID NO: 4), F5BSR4 (SEQ 10 NO: 5), F6BSR4 (SEQ 10 NO: 6), F7BSR4 (SEQ 10 NO: 7) y F8BSR4 (SEQ ID NO: 8). La amplificación se realizó mediante una PCR anidada, utilizando una AON polimerasa tennoestable de largo recorrido (Ecotaq Plus, Ecogen), en el tampón correspondiente, en presencia de ChMg (2 mM), 200 11M de cada dNTP y 10 p.M de cada oligonucleótido junto con su oligonucJeótido complementario (APl 6 AP2, según corresponda), en un volumen de reacción de 50 Ill.
La primera PCR se realizó con cada una de las genotecas de ADN genómico utilizando los oligonucleótidos F3.2BSR4, SECFI, F5BSR4 ó F7BSR4, junto con el adaptador API, siguiendo las instrucciones de la casa comercial. Las condiciones en las que se realizó la PCR fueron: 7 ciclos de 25 segundos a 94°C y 3 minutos a 72°C seguidos de 32 ciclos de 25 segundos a 94°C y 3 minutos a 67°C, con una elongación final a 67°C durante 7 minutos. La segunda PCR se llevó a cabo a partir de 1 ~l de una dilución 1 :50 de los productos de la primera PCR y se realizó con los oligonucleótidos F4.2BSR4, SECF2, F6BSR4 Ó F8BSR4, junto con el adaptador AP2, para continuar el paseo cromosómico. Las condiciones en que se realizó la segunda PCR fueron: 5 ciclos de 25 segundos a 94°C y 3 minutos a 72°C, seguidos de 20 ciclos de 25 segundos a 94°C y 3 minutos a 67°C con una elongación final a 67°C durante 7 minutos.
Los fragmentos de ADN obtenidos mediante el pasco cromosómico se purificaron utilizando un kit comercial (GENECLEAN Turbo nucleic acid purification kit, QBIOgene) y se secuenciaron empleando el analizador de DNA 3730 (Applied Biosystems). Finalmente, para confinnar la secuencia interna por PCR y secuenciación, se diseñaron dos parejas de oligonucJeótidos denominados: NcSRS9F (SEQ 10 NO: 9) y NcSRS9R2 (SEQ ID NO: 10). La PCR se realizó utilizando un enzima de alta fidelidad (Expand High Fidelity Plus PCR System, Roche), siguiendo las indicaciones de la casa comercial. utilizando las siguientes condiciones: una desnaturalización inicial de 2 minutos a 94°C seguida de 10 ciclos de 15 segundos a 94°C, 30 segundos 58°C y 1 minuto a 72°C, seguidos de 20 ciclos de 15 segundos a 94°C y 30 segundos 58°C y 1 minuto a 72°C incrementando 5 segundos en cada ciclo, con una elongación final a 72°C durante 7 minutos.
De esta fanna, al comparar las secuencias de los diferentes fragmentos amplificados se pudo determinar una secuencia de 6411 nucleótidos (SEQ ID NO: 14), y dentro de ella se comprobó la existencia de una fase de lectura abierta (ORF) de 1191 pb (SEQ ID NO: 13), que codifica una preproproteína de 396 aminoácidos, denominada NcSRS9 y expresada en la fase de bradizoíto (SEQ ID NO: 15). Al hacer la comparación de la secuencia de aminoácidos que codifica esta ORF, se encontró una similitud del 43%, con un total de 160 residuos similares, con la proteína TgSRS9 de
T. gondii, codificada por el gen TgSRS9 (gen TGGTl _ 121 100), existente en la base de datos del ToxoDB 4.3 (USA) (BLASTP y BLASTX); asimismo, se observó una similitud de hasta el 63% con secuencias que, de acuerdo a diversas bases de datos tales como ToxoOB y TIGR (BLASTX), se encuentran dentro del locus SRS9 de
T. gondii y flanquean el gen TgBSR4 en su extremo 3'.
Ejemplo 2: expresión de la proteína NcSRS9 como proteína recombinantc y su purificación. Una vez identificado el gen NcSRS9, para su expresión en procariotas se insertó una parte del gen (desde el nucleótido 118 hasta el 1125) que codifica la proteína madura sin el péptido señal ni la región correspondiente al anclaje GPI, desde el aminoácido 40 al 375, en los sitios Kpn! y Sac! del plásmído pET-45b(+) (Novagen, EMD Biosciences) (Figura lA). Para ello se realizó una PCR a partir del AON genómico de
N. caninum, utilizando oligonucleótidos diseñados para este fin: FoSRS9KpnI (SEQ ID NO: 11), el oligonucleótido directo, localizado desde el nucleótido 1976 al 1999 de SEQ JO NO:14, en cuyo extremo 5' se incluyó un sitio específico de reconocimiento para la enzima de restricción Kpnf entre los nucleótidos 4 y 10, seguido de una secuencia idéntica a la del gen NcSRS9; y ReSRS9Sacl (SEQ ID NO: 12), el oligonucleótido inverso y, por lo tanto, diseñado como secuencia inversa complementaria de SEQ ID NO: 14, localizado desde el nucleótido 2979 al 3000 de SEQ ID NO: 14, en cuyo extremo 5' se incluyó un sitio específico de reconocimiento para la enzima de restricción SacI entre los nucleótidos 4 y 9, seguido del triplete tta para la tenninación de la traducción de la proteína rccombinantc y, a continuación, del extremo 3' de la ORF del gen NcSRS9,.
Para realizar la peR, se utilizaron 0, 1 J.lg de ADN genómico por reacción, aislado a partir de taquizoítos de N. caninum, utilizando un enzima de alta fidelidad (Expand High Fidelity Plus PCR System, Roche), siguiendo las indicaciones de la casa comercial, en las condiciones previamente descritas en el ejemplo 1 de esta memoria descriptiva. El ADN amplificado fue purificado (GENECLEAN Turbo nudeie acid purification kit, Q-BIOgene) y digerido con los enzimas Kpnl (20U) y Sacl (20U) en el tampón adecuado durante 14 horas. Al mismo tiempo y en idénticas condiciones fue digerido el vector plasmídico pETA5b( +). Finalmente se purificaron ambos productos de la digestión (GENECLEAN Turbo nudeic acid purification kit, Q-BIOgene). Una vez purificado el fragmento de ADN digerido fue ligado a 500g del vector plasmídico linearizado en una proporción 1;3 vector:inserto, en presencia de 1 U del enzima T4ADN ligasa, en el tampón adecuado y en un volumen final de 20 ~L La ligación se realizó en tubos de O,5ml (M~ltiTM, Sorenson BioScience), en un tennociclador durante 16 horas a 16°C, siendo conservada posterionnente a -20°C hasta su uso.
Para la manipulación del plásmido se siguió básicamente la metodología recomendada por la casa comercial (Invitrogen). Una vez realizada la ligación ésta fue utilizada para transfonnar células de la cepa Nova8lue (Novagen, EMD Biosciences) químicamente competentes, mediante choque ténnico en las condiciones indicadas por la casa comercial. Las bacterias competentes se descongelaron y se mantuvieron en hielo hasta su utilización, momento en el que se añadió 1 ¡..tI de la ligación. Una vez transcurridos 5 minutos en hielo se incubaron a 42°C en baño de agua durante 30 segundos y se colocaron inmediatamente en hielo durante 2 minutos.
Inmediatamente las bacterias transformadas se resuspendieron en 250 ~I de medio SOC (bactotriptona 2%, extracto de levadura 0,5%, NaCl 10 mM, KCI 2,5mM, MgS04 10 mM, MgCI2 10 mM y glucosa 20 mM), y se cultivaron 50 ~I de la suspensión celular en medio LB-agar (1,5% de agar noble) en presencia de 100 ~g/ml de ampicilina, antibiótico frente al que presentan resistencia las bacterias en las que el plásmido utilizado se ha insertado. Después de 18 horas de incubación a 37° e, se seleccionaron 16 colonias (clones) y se incubaron en 3 mi de medio LB líquido con 100 )JgI de ampicilina durante toda la noche a 37°C, para el posterior aislamiento del ADN plasmídico. Este AON fue obtenido mediante un kit de miniprep (Quiagen) y posterionnente visualizado en un gel de agarosa al 0,8% en tampón T AE 1 x, para seleccionar aquellos clones con el plásmido del tamaño esperado.
Los plásmidos de interés se denominaron pSRS9, numerados del 1 al 16. Sobre todos ellos se realizó un análisis de restricción con las enzimas de restricción Kpnf (SU) y SacI (SU) en el tampón adecuado, en un volumen final de 20 ¡.d, durante dos horas a 37°C en un baño de agua. El ADN plasmídico digerido se separó en un gel de agarosa al 0,8% en tampón TAE al 1% (Figura 2, carriles 2 y 3 respectivamente). De entre aquellos plásmidos que liberaron un inserto del tamaño esperado se seleccionaron dos clones (pSRS9.7 y pSRS9.11) para llevar a cabo la secuenciación de dicho inserto. Únicamente el plásmido pSRS9.1l integró un inserto con la secuencia correcta del gen NcSRS9. El plásmido pSRS9.11 sin digerir se visualizó en el mismo gel (Figura 2, carril 4). Además, se digirió el vector pET-45b(+) (Figura 2, carril 5) y se utilizó como control de la digestión.
La secuencia clonada en el plásmido pET-45b(+) fue expresada como proteína recombinante en las células Rosetta (DE3) pLysS de Escherichia coli (Novagen, EMD Biosciences) y se denominó rNcSRS9 (SEQ ID NO: 16). La proteína recombinante rNcSRS9 comprende desde el aminoácido 40 hasta el 375 de la proteína NcSRS9, y se corresponde con la secuencia aminoacídica de la misma carente del péptido señal en el extremo amino y del anclaje de GPI en el extremo carboxilo. La rNcSRS9 es una proteína de fusión unida en su extremo amino a un bloque de aminoácidos provenientes del vector que incluye seis histidinas, lo que pennite su purificación por cromatografia de afinidad. El plásmido presenta además el promotor T7/lac que controla más eficientemente la transcripción del gen, y un sitio de unión a ribosoma (rbs) que promueve una traducción más eficiente y exacta del ARN mensajero en
procariotas. En la figura 1, panel B se presenta un esquema de la proteína recombinante rNcSRS9.
Para expresar la proteína recombinante en el sistema procariota, se transfonnaron células de la cepa Rosetta(DE3)pLysS de E. coli (Novagen, EMD Biosciences) con el plásrnido pSRS9.11, siguiendo las indicaciones de la casa comercial. Las células transfonnadas con el plásmido, fueron cultivadas en medio LB-agar con un 1% de glucosa, ampicilina (100 J-lg/rnl) y c1oranfenicol (34 ~g/ml) e incubadas toda la noche a 37°C. Al día siguiente se seleccionaron 5 colonias (numeradas de 11.1 a 11.5) de las placas y se incubaron durante 5 horas a 250 rpm y 37°C en 3 mi del mismo medio líquido de selección. A continuación, se diluyó el cultivo iniciador 1 :10 en el mismo medio de crecimiento y se mantuvo en idénticas condiciones hasta alcanzar una A600 mayor a 0,6 OO. Posteriormente, se indujo la expresión de la proteína recombinante en presencia de IPTG 1 mM, durante toda la noche en agitación a 250 rpm y 20°C. Finalmente, las células fueron recogidas por centrifugación a 3.500 xg durante 15 minutos. Una vez retirado el sobrenadante los sedimentos fueron conservados a -80°C hasta su uso.
Finalmente. las proteínas contenidas en el extracto bacteriano fueron solubilizadas en tampón de carga de Laernmli Ix (Laemmli. 1970. Nature 227, 680-685) en una proporción de 50 ¡.tI por mi de cultivo original, fueron separadas mediante electroforesis en condiciones desnaturalizantes en geles de acrilamida-OADT al 15 % y se tiñ.eron con tinción de azul Coomassie. Se compararon las proteínas de un extracto total de las bacterias recogidas antes y después de su inducción. El clon rNcSRS9.l1.3 fue seleccionado en base a una mayor abundancia de rNcSRS9 visualizada en el gel. Se procedió, a continuación, a la lisis de los sedimentos celulares de dicho c1on, mediante resuspensión en un tampón de lisis (tampón fosfato conteniendo 40 mM de imidazol, 5% de glicerol y 0,5% de Triton-XIOO) a una concentración de 15 mi por gramo de sedimento celular, en presencia de la enzima benzonasa (1 U/mI de muestra, Novagen), lisozima (1 KU! mi de muestra) e inhibidores de proteasas (Calbiochem, l mil 20 g de bacterias). Posterionnente, la suspensión fue incubada en agitación suave (lOO rpm) a 20°C durante toda la noche y, finalmente, fue sonicada. Más tarde, se separaron la fracción soluble de aquella donde se encuentran los cuerpos de inclusión, mediante centrifugación a 16.000 xg y 4°C durante 20 minutos, para detenninar la localización de la proteína de interés.
Posterionncnte, se lavaron los cuerpos de inclusión en un tampón de lavado (tampón fosfato conteniendo 0,5% de Triton·XIOO) cuatro veces. Finalmente, se separaron las proteínas en las condiciones descritas anteriormente. De esta forma se confinn6 la expresión de la proteína recombinantc rNcSRS9 en las células Rosetta(DE3)pLysS y su localización en cuerpos de inclusión (Figura 3, panel A, carril 4-6).
Para la purificación de la proteína rNcSRS9 por cromatografia de afinidad por metales inmovilizados (IMAC) se cultivó el clon pSRS9.11.3 en un mayor volumen y en las condiciones descritas anteriormente (volumen final de inducción de 500 mI). Para la solubilización de la proteína, los cuerpos de inclusión lavados se solubilizaron en 40 mI de un tampón de desnaturalización (pH 7,4) que contenía sales de fosfalO sódico (20 mM), cloruro sódico (500 mM), imidazol (40 mM) y urea (8M), en agitación suave (250 rpm) y temperatura ambiente durante toda la noche. Finalmente, se centrifugaron a 12.000 xg durante 15 minutos a 4°e y el sobrenadante se conservó a _80oe hasta su uso.
La purificación por IMAC se llevó a cabo utilizando las columnas HisTrap HP de I mI (GE Healthcare) en el sistema Akta Prime Plus (GE Healthcare), siguiendo las indicaciones de la casa comercial. Para e llo se prepararon 4 lotes a partir de los 40 mi descritos anteriormente y se inyectaron 10 mI en la columna tras un equilibrado inicial con el tampón de desnaturalización, a continuación se renaturalizó la proteína adherida a la columna utilizando un gradiente decreciente de urea hasta terminar lavando con un tampón similar al de desnaturalización pero sin urea y conteniendo glicerol y glucosa con el fin de evitar la precipitación de la proteína. Finalmente, la recuperación de la proteína se llevó a cabo mediante un gradiente creciente de imidazol hasta alcanzar 500mM, concentraci6n a la que la proteína fue eluida de la columna. Una muestra de la proteína obtenida se separó mediante electroforesis en las condiciones descritas anteriormente (Figura 3, panel S, caniles 1-3), y su concentración se detenninó por regresión lineal conforme a un patrón de diferentes concentraciones de seroalbúmina bovina (BSA) en el mismo gel (Figura 3, panel B, carriles 5-7).
Ejemplo 3: Empleo del gen NcSRS9 para la detección de ADN de N. caninum en tejidos animales infectados con N. call;lIum mediante PCR Se emplearon 2 muestras de tejido proveniente del sistema nervioso central de dos ratones experimentalmente infectados con 2 x 106 taquizoítos del aislado Nc-Liv de Neospora caninum y 2 muestras de tejido de sistema nervioso central de un ratón libre de la infección por N. caninum. El ADN total de dichos tejidos se extrajo empleando un método comercial (ONeasy Blood & Tissue Kit de Qiagen). Para la reacción de amplificación de NcSRS9 se emplearon los oligonucleótidos NcSRS9F (SEQ ID NO: 9) y NcSRS9R2 (SEQ ID NO: 10), diseñados a partir de la ORF de NcSRS9 según se describe en el ejemplo 1. Como enzima se utilú;ó la DNA polimerasa Expand High Fidclity de Roche Applied Science. Las condiciones de la reacción fueron 940 e durante 2 min, 30 ciclos a 940 C durante 15 s, 600 C durante 30 s y 720 e durante l min, y una fase de elongación final de 720 C durante 7 min. Los productos de la PCR fueron visualizados mediante electroforesis en gel de agarosa. En paralelo se llevó a cabo la amplificación del gen ITS-l de N caninum mediante PCR anidada (Buxton et al., 1998. J. Comp. Pathol. 118,267-279) como control de la presencia del parásito en las muestras.
Los productos de la PCR se purificaron empleando el "GENECLEAN Turbo nudeic acid purification kit" (Q-BIOgene) y se secuenciaron mediante ABI Prism 377 DNA sequencer (Applied Biosystems) con el fin de comprobar la amplificación correcta de la ORF de NcSRS9 mediante alineamiento de secuencias empleando el software Bioedit v3.
Tras el análisis de las muestras se comprobó la amplificación de la ORF del gen NcSRS9 en las muestras de tejido infectadas por N caninum y positivas mediante PCR anidada del gen ITS-I, detectándose un 100% de identidad con respecto a la ORF de
NcSRS9 identificada a partir de taquizoítos obtenidos in vitro mediante paseo cromosómico.
Ejemplo 4: producción de sueros policlonales frente a rNcSRS9 y su uso en la detección directa de bradizoítos de N. caninum. Para la obtención de sueros policlonales se utilizaron conejos de la raza New Zealand hembras de 2,5 Kg de peso vivo. Los animales se mantuvieron con comida yagua ad libifum en jaulas individuaJes. La proteína rNcSRS9 purificada según se describe en el ejemplo 2 de esta memoria se emulsionó con el adyuvante Titermax (Sigma Aldrich, USA) siguiendo la metodología recomendada por la casa comercial. Se realizaron 3 inmunizaciones por vía subcutánea con intervalos de 3 semanas, inoculando 100 J.1g en 200 IJI repartidos en 2 puntos de inoculación (50 J-lg de proteína! punto de inmunización) por conejo. El suero de los animales fue recogido a las 2 semanas de la última inmunización y fue comprobado mediante western blol frente a la proteína recombinante rNcSRS9 detectándose el desarrollo de anticuerpos específicos frente a la misma. El suero policlonal se denominó anti-rNcSRS9.
Con el fin de valorar la expresión de NcSRS9 en el estadio de bradizoíto, se llevó a cabo una inmunofluorescencia (JF) doble con el suero policlonal de conejo antirNcSRS9, descrito previamente en este ejemplo, junto con el anticuerpo monodonal de ratón desarrollado frente al antígeno específico de taquizoíto NcSAG l (Figura 4, Panel A). Para ello, se prepararon cultivos celulares infectados con taquizoítos en cristales de 12 mm de diámetro y se trataron con nitroprusiato sódico (SNP) a una concentración de 70 J-lM en el medio de cultivo durante 7 días tras la infección, siendo reemplazado diariamente, de acuerdo a lo descrito por Risco-Castillo el al. (2004. 1. Parasitol. 90, 466-70). Los cristales fijados fueron incubados con anti-NcSAGl (1:1000) y anti-rNcSRS9 (1:500) y, a continuación, con los conjugados Alexa 594 y Alexa 488 (Molecular Probes), respectivamente. Los núcleos de la célula hospedadora y de los parásitos fueron marcados con 4' ,6-diamidino-2-phenylindole (DAPl). Los resultados obtenidos demostraron que el anticuerpo anti-rNcSRS9 marca los bradizoítos obtenidos en el cultivo siguiendo W1 patrón predominantemente superficial, obteniendo hasta un 9,3% de vacuolas marcadas al día 7 postestrés.
Por otro lado, se detenninó la reactividad del suero anti-rNcSRS9 utilizando bradizoítos maduros de N. caninum producidos in vivo. Para ello, se confirmó mediante inmunofluorescencia la seropositividad de un ternero infectado naturalmente con N. caninum y se examinaron secciones parafinadas de tejido cerebral con quistes tisulares de N caninum mediante inmunohistoquímica (IHQ), incubando con el suero policlonal de conejo anti-rNcSRS9 (dilución 1: 100) y siguiendo el método de estreptavidin-biotin-peroxidasa descrito por Pereira-Bueno el aL (2003 . Vet. Parasitol. 111 , 143-152). Esta técnica demostró un reconocimiento del suero anti-rNcSRS9 por los bradizoítos contenidos en el quiste tisular, observándose dicho reconocimiento en la superficie de los parásitos, tal como se esperaba para un antígeno de superficie (Figura 4, Panel B).
Tal y como demuestran estos experimentos, el suero policlonal producido frente a la proteína recombinante rNCSRS9 es útil en el reconocimiento de la proteína nativa en bradizoítos Y. por lo tanto, en la detección directa de N caninum.
Ejemplo 5: determinación de la capacidad de inducción de anticuerpos específicos de la proteína NcSRS9 en bovinos naturalmente infectados con N. caninllm Se determinó la inducción de anticuerpos específicos frente a NcSRS9, mediante wes!ern blof basado en la proteína recombinante rNcSRS9, en 8 vacas reproductoras con infección crónica natural y 11 temeros precalostrales infectados congénitamente con N. caninum. Previamente, en estos animales, se había detectado anticuerpos específicos frente a extracto soluble de taquizoítos de N caninum por las técnicas de ELISA y weSfern blof (Álvarez-Garcia et al., 2002. Velo Parasitol. 107(1-2), 15-27; Álvarez-Garcia et al., 2003. Velo Res. 34(3),341-352) Y frente a la proteina rNcSAG4, específica de bradizoíto, de expresión temprana y marcador de infección crónica, mediante ELISA (Aguado-Martinez et al., 2008. Velo Parasitol. 157(3-4), 182-195). En paralelo, se midió la presencia de anticuerpos frente a NcBSR4 y NcSRS9 en estos mismos sueros mediante western bID! empleando las proteínas recombinantes rNcBSR4 y rNcSRS9, la primera de ellas proteína específica de bradizoíto de N.
caninum de expresión tardía (Risco-Castillo el al., 2007. Int. J. ParasitoL 37, 887-896). Para realizar el western blOI, ambas proteínas recombinantes se utilizaron purificadas por IMAC a una l:oncenlración de 0,1 ¡.tg/¡.tl en geles de acrilarnida-DA TD al 15%, mediante electroforesis en condiciones desnaturalizantes, y finalmente se realizó la electrotransferencia a una membrana de nitrocelulosa de 0,2 ¡.tm (Biorad), a 400 mA durante una hora sumergida en tampón de transferencia previamente enfriado (Tris 25 mM, glicina 192 mM pH 8,5 Y metanol al 20%).
Para realizar el weslern blol se siguió básicamente el protocolo descrito anteriormente (Álvarez el al. 2002. Vet. Parasitol. 107, 17-27). Así, se bloquearon las membranas con leche desnatada al 5% en TBS con Tween-20 al 0,05% (TBS-T) durante toda la noche a 4°C. A continuación se incubaron las membranas con los sueros de origen bovino, a una dilución 1 :20 en TBS-T con leche desnatada al 0,5%, durante 1 hora en agitación a 37° C. Tras tres lavados rápidos con TBS-T, seguidos de uno de 15 minutos y dos de 5 minutos, las membranas se incubaron con un anticuerpo monoclonal de ratón anti-IgG de bovino conjugado con peroxidasa (Hipra), a una dilución 1 :400 en TBS-T con leche desnatada al 0,5%, durante una hora en agitación a 37°C. Tras otra serie de lavados en las condiciones anteriores, se reveló con una solución de sustrato preparada inmediatamente antes de su uso (60 mg de 4-Cloro-l-Naphtol disuelto en 20 mI de metanol, 100 mI de TBS y 0,060 mI de peróxido de hidrógeno), a temperatura ambiente en oscuridad y en agitación.
De los 8 sueros de vacas con infección crónica seropositivos frente al extracto soluble de N. caninum y frente a la proteína rNcSAG4 (marcador de infección crónica) 4 presentaron anticuerpos específicos frente a rNcSRS9 y rNcBSR4. Respecto a los ti sueros procedentes de terneros precalostrales con infección congénita seropositivos frente al extracto soluble de N. caninum, 2 sueros reconocieron rNcSRS9 y 1 reconoció rNcBSR4 (figura 4, panel C). Al mismo tiempo, el suero negativo utilizado corno control no mostró reacción, como era de esperar.
2.
Los resultados obtenidos por la técnica arriba descrita demuestran que la proteína NcSRS9 tiene carácter antigénico de tipo humoral tanto en vacas adultas como en temeros precalostrales infeClados naturalmente con N caninum.
Ejemplo 6: Estudio de la respuesta inmune y de la protección frente a la neosporosis generada en ratones y su progenie por la proteína recombinante NcSRS9. La proteína recombinante rNcSRS9 fue producida y purificada según el ejemplo 2 de esta patente y se procedió a su encapsulación utilizando el método de doble emulsión con el polímero Poly-épsilon-caprolactona (PCL). El método, en resumen, consistió en una primera fase acuosa, donde se encuentra rNcSRS9 disuelta en el tampón de purificación y mezclada con el detergente Pluoronic F68 al 6%. Ésta se añade a una fase orgánica con el polímero PCL al 5% disuelto en triclorometano, se emulsiona mediante sonicación y, posteriormente, se le añade una segunda fase acuosa con el tensioactivo poly-vinilalcohol (PVA) al 0,5%, volviendo a sonicar para producir una segunda emulsión. La doble emulsión resultante se mantiene en agitación magnética hasta la evaporación completa del triclorometano utilizado en el proceso y [oonándose, así, las partículas con la proteína encapsulada en su interior (rNcSRS9
peL).
Se determinó el tamaño y la polidispersión (pdl) de las nanopartículas con la proteína encapsulada mediante espectroscopia de correlación fotónica, dando un tamaño medio de 479,4 nm y una pdl de 0,604 nm. A continuación, se comprobó el éxito de la encapsulación cuantificando las partículas por SDS-PAGE y se continnó la antigenicidad de las mismas mediante western blOI utilizando suero de vacas infectadas naturalmente (Fig. 5, panel A), con el fin de ser empleadas en un ensayo vacunal en un modelo murino.
Se estudió la capacidad de protección frente a la infección por N. caninum de esta proteína recombinante en dos modelos murinos: gestante y no gestante. Para ello, se inmunizó un grupo de 29 ratones hembra de la estirpe BALB/c con 40 J.lg de rNcSRS9 encapsulada (03), distribuida en 2 inmunizaciones con un intervalo de 21 días, mientras los grupos control G 1 Y 02 (de 29 ratones hembra cada uno) fueron inoculados con el mismo volumen de PBS. A los 15 días, 24 ratones hembra de cada grupo fueron cubiertas con los machos tras la inducción del efecto Whitten. El desafío mediante la inoculación de 2 X 106 taquizoítos de un aislado virulento de N. caninum se llevó a cabo en todas las hembras cubiertas del 02 y 03 a los 21 días después de la última inmunización que, en el caso de las gestantes, coincidió con los días 7-10 de gestación. Las hembras no gestantes se mantuvieron hasta el día JO p.i. fecha en la cual fueron sacrificadas. En el caso de las gestantes, las crías se mantuvieron con sus madres hasta el día 30 postparto cuando tanto madres corno crías supervivientes fueron sacrificadas.
Cinco ratones de cada grupo fueron sacrificados ClllCO días después de la última inmunización para el estudio de la respuesta inmune humoral. Para ello se analizaron los sueros aplicándose las técnicas de ELISA y weslern blof (Fig. 5 panel B), confinuándose que en todos los ratones inmunizados se generaron anticuerpos específicos frente a la proteína recombinante rNcSRS9.
Además, se estudió la protección frente a la infección valorando morbilidad y mortalidad en las hembras no gestantes y en las madres y sus crías. Las hembras no gestantes no desarrollaron síntomas, mientras que en el grupo de hembras gestantes se observaron signos clínicos en todas las camadas de los grupos infectados tales como retraso en el crecimiento, parálisis, torneo e inactividad, apareciendo más tarde en el grupo inoculado con la proteína encapsulada. En cuanto a la mortalidad de las crías (Fig. 5, panel C), se observa un ligero retraso significativo durante los diez primeros días de vida de las crías vacunadas con rNcSRS9 encapsulada (P<O,05) (G3) respecto al grupo testigo de la infección (G2).
TEXTO LIBRE DE LA LISTA DE SECUENCIAS El texto libre utilizado en la lisia de secuencias se corresponde en español a las siguientes características:
SEQ ID NO: 11
Cebador basado en SEQ ID NO: 14 de Neospora caninum desde el nucleótido 1976 al
1999.
Nuc1eótidos del4 al 10: Sitio de reconocimiento para la enzima de restricción KpnL
SEQ ID NO: 12
Cebador basado en la secuencia inversa de la hebra complementaria del fragmento
2979 al 3000 de SEQ ID NO: 14 de Neospora caninum.
Nucleótidos del 4 al 9: Sitio de reconocimiento para la enzima de restricción SacI.
Nucle6tidos del 10 al 12: Codón de terminación insertado en el cebador para
detenninar la terminación de la traducción de la proteína recombinante.
SEQ ID NO: 14
Nucle6tidos del 240 al 266: Sitio del cebador caracterizado por SEQ ID NO: l.
Nuc1eótidos del 270 al 293: Sitio del cebador caracterizado por SEQ ID NO: 2.
Nucleótidos del 906 al 928: Sitio del cebador caracterizado por SEQ ID NO: 3.
Nucleótidos del 1551 al 1569: Sitio del cebador caracterizado por SEQ ID NO: 4.
Nuc1eótidos del 1843 al 1865: Sitio del cebador caracterizado por SEQ ID NO: 9.
Nuc1eótidos dcl 1976 al 1999: Sitio del cebador caracterizado por SEQ ID NO: 11.
Nucleótidos del 2186 al 2209: Sitio del cebador caracterizado por SEQ ID NO: 5.
Nuc1eótidos del 2248 al 2274: Sitio del cebador caracterizado por SEQ ID NO: 6.
Nuc1eótidos del 2839 al 2863: Sitio del cebador caracterizado por SEQ ID NO: 7.
Nuc1eótidos del 2877 al 2902: Sitio del cebador caracterizado por SEQ ID NO: 8.
Nucleótidos del 2979 al 3000: Secuencia inversa y en la hebra complementaria del
sitio del cebador caracterizado por SEQ ID NO: 12.
Nucleótidos del 3071 al 3093: Secuencia inversa y en la hebra complementaria del
sitio del cebador caracterizado por SEQ ID NO: 10.
SEQ ID NO: 16
Proteína recombinante basada en NcSRS9 de Neospora caninum.
Aminoácidos del 1 al 11: Bloque de aminoácidos provenientes del vector pET-45b(+)
que incluye seis histidinas.
Aminoácidos del 12 al 347: Fragmento de la proteína NcSRS9 desde el aminoácido 40 01375 de SEQ ID NO: 15.
Claims (15)
- REIVINDICACIONES
- 1.
- Molécula polinucleotídica caracterizada por SEQ ID NO: 13 que consiste en el gen NcSRS9 de Neospora caninum y codifica la proteína NcSRS9 de Neospora canjnum caracterizada por SEQ ID NO: 15.
-
- 2.
- Molécula polinucleotidica caracterizada por SEQ ID NO: 14 que comprende la secuencia polinucletídica definida en la reivindicación 1.
-
- 3.
- Molécula polinucleotídica con al menos un 95% de identidad con las moléculas polinucleótídicas definidas en las reivindicaciones 1 Ó 2.
-
- 4.
- Método para detectar N caninum a partir de tejidos animales mediante PCR o RTPCR o mediante sondas de ADN que incluye cualquiera de los oligonucle6tidos F3.2BSR4, F4.2BSR4, SECFI, SECF2, F5BSR4, F6BSR4, F7BSR4, F8BSR4, NcSRS9F, NcSRS9R2, FoSRS9Kpnl y ReSRS9SacI, caracterizados por SEQ ID NO: 1, 2,3,4,5,6,7,8,9, 10, 11 Y12, como cebadores o como sondas.
-
- 5.
- Vector recombinante que comprende una secuencia nucleotídica definida en las reivindicaciones 1,2 ó 3.
-
- 6.
- Células eucariotas hospedadoras transfectadas con los vectores recombinantes de la reivindicación 5.
-
- 7.
- Células procariotas hospedadoras transformadas con los vectores recombinantes de la reivindicación 5.
-
- 8.
- Polipéptido sustancialmente purificado o aislado seleccionado de (a) la proteína antigénica NcSRS9 de N caninum, caracterizada por SEQ ID NO:15; (b) polipéptidos derivados o fOnTIas truncadas con al menos un 90% de identidad con la proteína NcSRS9 (SEQ ID NO: 15) y que conservan sus características antigénicas; o (c)
proteínas recombinantes que incluyen NcSRS9 (SEQ ID NO: 15) o incluyen polípéptidos derivados de NcSRS9 y que conservan sus características antigénicas. -
- 9.
- Polipéptido según la reivindicación 8 que incluye desde el aminoácido 40 al aminoácido 375 de SEQ ID NO: 15.
-
- 10.
- Método para producir un polipéptido que comprende el cultivo de las células hospedadoras de las reivindicaciones 6 Ó 7 en condiciones que penniten la expresión de un polipéptido definido en cualquiera de las reivindicaciones 8 6 9.
-
- 11.
- Anticuerpos monoclonales o policlonales específicos frente a los polipéptidos definidos en las reivindicaciones 8 y 9.
-
- 12.
- Método para la detección de N caninum a partir de tejidos animales mediante inmunohistoquímica O inmunofluorescencia O cualquier otra técnica basada en la detección directa del parásito mediante anticuerpos que incluye anticuerpos monoclonales o policlonales específicos definidos en la reivindicación 11.
-
- 13.
- Composición inmunogénica o formulación vacuna! que comprende: (a) un polipéptido definido en las reivindicaciones 8 y 9; (b) una molécula polinucleotídica según las reivindicaciones 1-3; (c) un vector recombinante como el definido en la reivindicación 5; (d) las células hospedadoras transfectadas según reivindicación 6; o
(e) las células hospedadoras transformadas según reivindicación 7. -
- 14.
- Composición inmunogénica o formulación vacunal según la reivindicación 13, que comprende un adyuvante. una o varias citoquinas o partículas no infecciosas similares a las cápsides víricas (VLP).
-
- 15.
- Kit de vacunación para mamíferos contra la neosporosis que comprende un contenedor que incluye una composición inmunogénica o formulación vacunal según cualquiera de las reivindicaciones 13 ó 14.
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