BR102015026051A2 - Produção dos antígenos tes30 e tes120 de toxocara canis em pichia pastoris para uso como imunobiológico - Google Patents

Abstract

produção dos antígenos tes30 e tes120 de toxocara canis em pichia pastoris para uso como imunobiológico toxocara canis é o principal agente da toxocaríase humana, um problema negligenciado de saúde pública. o antígeno tes é usado no imunodiagnóstico desta parasitose, porém sua obtenção é laboriosa, improdutiva e com baixas taxas de concordância entre diferentes lotes de cultivo de larvas. como alternativa, o uso de antígenos recombinantes baseados em proteínas específicas encontradas no antígeno tes vem se destacando. nesta patente, descrevemos a produção e avaliação da antigenicidade dos antígenos tes30 e tes120 de t. canis produzidos em pichia pastoris. genes sintéticos foram sintetizados e clonados no vetor ppicz(alfa)b, gerando os clones recombinantes ppicz(alfa)b/tes30 e ppicz(alfa)b/tes120. os clones foram cultivados em bmgy e a expressão dos antígenos induzida com 0,5% e 1% de metanol, respectivamente. os antígenos recombinantes foram caracterizados por sds-page e western blot. para testar a sensibilidade e especificidade dos antígenos recombinantes, foi realizado um elisa indireto com um painel de soros humanos padrões e conjugado anti-igg humana. os antígenos rtes30 e rtes120 apresentaram em torno de 40 kda e 70 kda, respectivamente, sugerindo que foram glicosilados. ambos foram reconhecidos por soros positivos para toxocaríase, sugerindo que são antigênicos. no elisa indireto, o rtes30 apresentou especificidade de 97,5% e sensibilidade de 22,5%, enquanto que o rtes120 95% e 30%. os antígenos recombinantes produzidos apresentam potencial de uso como imunobiológicos.

Description

PRODUÇÃO DOS ANTÍGENOS TES30 E TES120 DE TOXOCARA CANIS EM PICHIA PASTORIS PARA USO COMO IMUNOBIOLÓGICO ESTADO DA TÉCNICA

[001] A infecção por Toxocara canis em hospedeiros não habituais, como homem, outros mamíferos e aves ocorre pela ingestão acidental de ovos larvados deste helminto, sendo denominada toxocaríase (Torgerson & Budke, 2006). Estudos indicam uma alta soroprevalênciada da toxocaríase em países em desenvolvimento, principalmente em crianças e adolescentes (Schoenardie et al., 2013). No Brasil, estudos epidemiológicos revelam que a soropositividade para Toxocara spp. varia entre 3,7% até 40% (Chieffi et al. 2009), sendo em algumas regiões constatado valores superiores, atingindo em torno de 50% em crianças de 1-12 anos (Colli et al. 2010; Schoenardie et al., 2013). Embora os levantamentos demonstrem a relevância dessa parasitose, essa doença é negligenciada pelo serviço de saúde brasileiro (Paludo et al., 2007).

[002] O diagnóstico definitivo da toxocaríase baseia-se na detecção de larvas de Toxocara sp. a partir da biópsia de tecidos, mas este ensaio é demorado e difícil de realização. Diante da dificuldade na detecção de larvas de T. canis no organismo humano, métodos imunológicos foram desenvolvidos para o diagnóstico da toxocaríase. Atualmente, o ensaio imunoenzimático (ELISA) utilizando o antígeno de excreção e secreção de T. canis (TES) para pesquisa de IgG anti-T. canis, tem sido utilizado como método padrão (Mohamad et al., 2009). O antígeno TES é obtido a partir do cultivo de larvas de T. canis (Lima et al., 2005), sendo extraído e purificado a partir meio de cultivo das larvas.

[003] As principais proteínas do antígeno TES apresentam 32 kDa (TES-32), 55 kDa (TES-55), 70 kDa (TES-70), 120 kDa (TES-120) e 400 kDa (TES-400) (Maizels et al., 1984). Essas proteínas são glicosiladas, altamente antigênicas e compartilhadas nas diferentes espécies de Toxocara ou mesmo com vários outros ascarídeos (Kayes, 1997).

[004] A detecção de anticorpos específicos é extremamente relevante para confirmar o diagnóstico clínico e para realizar o tratamento das diferentes formas clínicas da toxocaríase humana. Entretanto, existem controvérsias em relação à sensibilidade e especificidade destes testes sorológicos devido à carência de métodos eficazes para a detecção do parasito (CDC, 2014). O uso combinado de TES-ELISA seguido por Western blot é a opção de escolha atual no que diz respeito à sensibilidade e especificidade; no entanto, a dificuldade de diagnosticar a infecção ativa continua a ser um problema, pois a presença de anticorpos residuais na população em geral torna a interpretação de um teste positivo difícil (Fillaux et al., 2013).

[005] Antígenos recombinantes podem ser usados em métodos diagnósticos, buscando um teste de melhor especificidade, sensibilidade e aplicabilidade na rotina laboratorial. Dentre as alternativas para incrementar o diagnóstico da toxocaríase, Fillaux et al. (2013) sugerem detecção de níveis de proteína catiônica eosinofílica, teste de ELISA com imunoglobulinas IgG3/IgG4 ou IgE específica, detecção de antígeno circulante por ELISA sanduíche, métodos de diagnóstico molecular e uso de antígenos recombinantes.

[006] Antígenos recombinantes potencialmente úteis no imunodiagnóstico da toxocaríase já foram testados, como rTES-30 e rTES-120 (Yamasaki et al., 1998; Yamasaki et al., 2000; Norhaid et al., 2008; Mohamad et al., 2009), ambos produzidos em Escherichia coli. Yamasaki et al. (2000) obtiveram como resultado 100% de sensibilidade e 97,9% de especificidade no ELISA, mas foram testados apenas 11 soros positivos para toxocaríase. Resultados mais representativos em relação ao número de amostras de soros positivos para T. canis (26) mostram valores inferiores, ou seja, 92,3% de sensibilidade e 89,6% para a especificidade (Norhaida et al., 2008). Quando foram utilizadas proteínas recombinantes solúveis (rTES26, rTES30USM e rTES120) observa-se 94,4%, 88,0% e 90,8% de especificidade, respectivamente para cada antígeno, bem como a variação de 40 a 93,3% de sensibilidade em relação as diferentes subclasses de IgG (Mohamad et al., 2009). Cabe ressaltar que o sistema de expressão utilizando E. coli geralmente produz a proteína heteróloga em corpos de inclusão (não solúvel) e é incapaz de realizar glicosilação de proteínas (Terpe, 2006), o que pode interferir no reconhecimento da proteína por anticorpos específicos.

[007] Apesar do bom desempenho desses antígenos recombinantes produzidos em E. coli, a utilização de outros sistemas de expressão pode incrementar o diagnóstico da toxocaríase, pois a busca por antígenos recombinantes com características semelhantes aos antígenos nativos podem fornecer resultados mais confiáveis, não só para o diagnóstico de rotina, mas também para levantamentos epidemiológicos da toxocaríase humana (Yamasaki et al., 2000).

DESCRIÇÃO DA ABORDAGEM DO PROBLEMA TÉCNICO E VANTAGENS

[008] A produção do antígeno TES é laboriosa e de baixa produtividade (Mohamad et al., 2009), além de requerer técnicos treinados para sua execução (Peixoto et al., 2011) e disponibilidade de parasitos adultos. Em adição a dificuldade para produção do antígeno, observa-se a reação cruzada desse antígeno com outras infecções helmínticas (Magnaval et al., 1991; Yamasaki et al., 2000). O fracionamento do antígeno e isolamento de suas proteínas diminui a possibilidade de reações cruzadas com outras infecções parasitárias e pode melhorar a especificidade das provas sorológicas atuais (Peixoto et al., 2011).

[009] Vários autores relataram que os antígenos recombinantes de TES são potencialmente úteis para o desenvolvimento de diagnóstico sorológico confiável para toxocaríase (Yamasaki et al., 2000; Fong et al., 2003; Fong & Lau, 2004; Norhaida et al., 2008; Mohamad et al., 2009); isso não aplica-se apenas para o diagnóstico de rotina, mas também para realização de inquéritos soroepidemiológicos da toxocaríase em humanos, e, consequentemente, estabelecimento da relevância dessa parasitose na população.

[010] A levedura metilotrófica Pichia pastoris é capaz de processar a maioria das modificações pós-traducionais, incluindo processamento proteolítico e glicosilação, conservando características antigênicas das proteínas originais, tornando-a uma plataforma eficiente para produção de antígenos recombinantes mais complexos (Cereghino & Cregg, 2000). Este sistema foi utilizado para expressar o antígeno TES-120 de T. canis, o qual mostrou alta especificidade em diagnóstico por Western blot (Fong & Lau, 2004), contudo, nesse estudo a proteína recombinante foi encontrada no pellet, o que torna mais complexo o seu processo de purificação.

[011] Neste contexto, os eventos descritos a seguir apresentam a invenção baseada nas proteínas TES30 e TES120 de Toxocara canis produzidas na levedura Pichia pastoris, com potencial para uso como imunobiológico.

RELAÇÃO DAS FIGURAS

[012] Figura 1:Dot blotting do sobrenadante do clone recombinante pPICZαB/TES30 cultivado em BMMY e induzido com 0,5% de metanol. Indicado em vermelho a reação positiva frente ao anti-6xHis conjugado à peroxidase (1:6000). Linhas: 1 - Clone de rTES30; 2 - Controle positivo; 3 - Controle negativo. Colunas: 1 a 5 - dias de indução de metanol; 6 - proteínas concentradas usadas como controle da reação.

[013] Figura 2:Dot blotting do sobrenadante e produto da lise do pellet dos clones recombinantes de pPICZaB/TES120 (clone 12 e 13) frente a histidina (1:6000). Linhas A e C: sobrenadante; B e D: pellet; colunas indicam o número de horas do processo de indução.

[014] Figura 3: Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) 12% corado com Comassie Brilliant Blue R-250, demonstrando a expressão da proteína rTES30 em modelo procarioto (A) e em Pichia pastoris (B) purificadas por cromatografia de afinidade. A- Coluna 1, marcador de proteína; coluna 3 - rTES30 expressa em modelo procarioto. B - Coluna 1, marcador de proteína; coluna 3 - rTES30 expressa em P. pastoris.

[015] Figura 4: Dot blotting da proteína recombinante rTES-30 presente no produto de lise do pellet da fermentação de pPICZaB/TES-30, frente a MAb anti-6xHis conjugado à peroxidase (1:6000), indicando as diferentes horas de cultivo em biorreator.

[016] Figura 5: Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) 10% corado com Comassie Brilliant Blue R-250, demonstrando a expressão da proteína rTES120 em modelo procarioto (A) e em Pichia pastoris (B) purificadas por cromatografia de afinidade. A- Coluna 1 - marcador de proteína; coluna 3 - rTES120 expressa em modelo procarioto. B - Coluna 1 - marcador de proteína; coluna 3 - rTES120 expressa em P. pastoris.

[017] Figura 6: Western blotting com anticorpos presentes em soros humanos positivos para Toxocara canis. A - Coluna 1 - Antígeno TES nativo, coluna 3 -rTES30; B - Coluna 1 - rTES120, coluna 3 - Antígeno TES nativo.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

[018] Por conveniência o significado de alguns termos empregados nas especificações estão descritos abaixo.

[019] Antígeno TES- são antígenos de secreção e excreção produzidos por larvas de terceiro estágio de Toxocara canis em meio de cultivo.

[020] rTES30 - é uma proteína recombinante semelhante a proteína de 32 kDa encontrada no antígeno TES. Tal proteína não existe naturalmente, tendo sido projetada in silico e produzida mediante tecnologia do DNA recombinante. A molécula possui ainda uma cauda composta por 6 resíduos de histidina em sua extremidade N-terminal.

[021] rTES120 - é uma proteína recombinante semelhante a proteína de 120 kDa encontrada no antígeno TES. Tal proteína não existe naturalmente, tendo sido projetada in silico e produzida mediante tecnologia do DNA recombinante. A molécula possui ainda uma cauda composta por 6 resíduos de histidina em sua extremidade N-terminal

[022] Na presente invenção a escolha dos antígenos presentes nas proteínas recombinantes rTES30 e rTES120 foi baseada na análise da literatura a respeito do assunto. As proteínas passaram por processo inventivo in silico, onde foram desenhadas com auxílio do software Vector NTI 11 (Invitrogen). Após desenhados in silico, os genes TES30 e TES120 foram sintetizados pela empresa Epoch Biolabs, Inc.

[023] O fragmento sintético TES30 possui uma sequência codificadora de setecentos e quarenta e oito pares de base (645 pb) (SEQ 1 - Tab. 1) que codificam para duzentos e vinte e seis (215) aminoácidos (SEQ 3 - Tab. 1), os quais originam uma proteína de 30 kDa.

[024] O fragmento sintético TES120 possui uma sequência codificadora de setecentos e cinquenta pares de base (510 pb) (SEQ 2 - Tab. 1) que codificam para cento de setenta e seis (170) aminoácidos (SEQ 4 - Tab. 1), os quais originam uma proteína de 75 kDa.

[025] Tabela 1 - Sequência de nucleotídeos e gene sintético utilizados para expressão das proteínas recombinantes rTES30 e rTES120

[026] Com base na sequência de nucleotídeos dos genes TES30 e TES120 (SEQ 1 e 2, respectivamente), seguiram os processos de clonagem, expressão, purificação e avaliação do potencial imunobiológico deste antígeno, segundo os procedimentos a seguir:

[027] Passo 1: Os genes TES30 e TES120 foram obtidos através de síntese química (Epoch Life Science, USA) e foram otimizados para conter códons preferenciais de P. pastoris e ausência de estruturas secundárias.

[028] Passo 2: A clonagem dos genes foi realizada conforme descrito por Sambrook e Russell (2001). Os genes sintéticos tes30 e tes120 foram clonados em fase no vetor de expressão pPICZαB (Invitrogen) em P. pastoris. Esse vetor permite a expressão da proteína recombinante fusionada a uma cauda de seis resíduos de histidina em sua porção C-terminal, bem como a secreção da proteína para o meio de cultivo da levedura.

[029] Passo 3: Um clone recombinante de cada vetor foi linearizado com a enzima de restrição PmeI, otimizando a integração do vetor no cromossomo da levedura através de recombinação homóloga. Pichia pastoris cepa KM71H (MutS) foi cultivada em meio YPD (extrato de levedura 1%, peptona 2% e D-glucose 2%) por 18 horas em agitador orbital a 28°C e 120 rpm. Células competentes foram transformadas por eletroporação (25 F, 200, 2 kV) com 10 μg do vetor recombinante linearizado (pPICZαB/tes30 e pPICZαB/tes120), segundo protocolo descrito pela Invitrogen (EasySelectTM Pichia Expression Kit, Version G). Após 1 h de incubação em agitador orbital (28°C e 200 rpm), 100 e 200 μl do volume de células foram plaqueadas em meio YPDS contendo 500 μg/mL de Zeocina (Invitrogen) e, por fim, incubados a 28°C durante 4 dias. Os clones recombinantes foram selecionados em agar YPDS contendo 500 μg/mL de zeocina, após incubação durante quatro dias em estufa a 28°C.

[030] Passo 4: Para seleção dos transformantes com expressão positiva, clones recombinantes foram cultivados em BMMY (1% de extrato de levedura, 2% peptona, 1,34% de YNB (Yeast Nitrogen Base), 4x10-5% de biotina, 1% de metanol e 100 mM Tampão Fosfato de Potássio, pH 6,0), incubados por 6 dias em estufa a 28°C e induzidos com 0,5% metanol a cada 24 h. Para realização do Colony blot, as colônias foram transferidas para a membrana de nitrocelulose, a qual foi bloqueada com solução de leite em pó a 5% e em seguida tratada com anticorpo monoclonal (MAb) anti-6xHis conjugado à peroxidase (Sigma) (1:6000). Após foi adicionado o conjugado anti-camundongo (1:4000), que foi deixado em agitação por 1 h. A reação foi revelada com SIGMA FAST™ DAB (Sigma-Aldrich). Para confirmação da presença do plasmídeo nas colônias positivas no Colony blot foi realizado PCR de colônia, com primers AOX (EasySelectTM Pichia Expression Kit, Version G).

[031] Passo 5: O transformante pPICZαB/tes30 com expressão positiva confirmado por Colony blot e PCR foi repicado em caldo BMGY (1% de extrato de levedura, 2% peptona, 1,34% de YNB (Yeast Nitrogen Base), 4x10-5% de biotina, 1% de glicerol e 100 mM Tampão Fosfato de Potássio, pH 6,0) e incubado em agitador orbital (100 RPM, 28°C) até atingir DO600=4. Nesse momento, a cultura foi centrifugada e o pellet ressuspendido em BMMY contendo 0,5% de metanol. Durante 6 dias foi adicionado 0,5% de metanol a cada 24 h. Amostras de sobrenadante e pellet foram coletadas diariamente. Para uso como controle negativo foi realizado cultivo de P. pastoris Km71H nativa, e para controle positivo foi utilizado clone recombinante da proteína gD de herpesvirus bovino - rgD- (Dummer et al., 2009); ambos nas mesmas condições de cultivo descritas anteriormente. Os níveis de expressão foram analisados no sobrenadante e pellet por Dot Blot (figura 1), sendo colocado 5 μL de cada amostra sobre membrana de nitrocelulose. Após a secagem em temperatura ambiente das amostras na membrana, essa foi bloqueada com solução de leite em pó a 5% por 1 h a temperatura ambiente, sob agitação e em seguida tratada com anticorpo monoclonal (MAb) anti-6xHis conjugado à peroxidase (Sigma) (1:6000), por uma 1 h a temperatura ambiente, sob agitação. Após foi adicionado o conjugado anti-camundongo (1:4000), que foi deixado em agitação por 1 h a temperatura ambiente. A cada nova etapa foram realizadas 3 lavagens com PBS acrescido de 0,5% de Tween 20 (PBS-T). A reação foi revelada com SIGMA FAST™ DAB (Sigma-Aldrich).

[032] Passo 6: Os transformantes pPICZaB/tes120 (clones 12 e 13) com expressão positiva confirmado por Colony blot e PCR foram repicados em caldo BMGY (1% de extrato de levedura, 2% peptona, 1,34% de YNB (Yeast Nitrogen Base), 4x10-5% de biotina, 1% de glicerol e 100 mM Tampão Fosfato de Potássio, pH 6,0) e incubados em agitador orbital (100 RPM, 28°C) até atingir DO600=4. Nesse momento, as culturas foram separadamente centrifugadas e os pellets ressuspendidos em BMMY contendo 0,5% de metanol. Durante 3 dias foi adicionado 1% de metanol aos cultivos, em intervalo de 24 h. Amostras de sobrenadante e pellet foram coletadas diariamente. Para uso como controle negativo foi realizado cultivo de P. pastoris Km71H nativa, e para controle positivo foi utilizado clone recombinante da proteína gD de herpesvirus bovino (rgD); ambos nas mesmas condições de cultivo descritas anteriormente. Os níveis de expressão foram analisados no sobrenadante e pellet por Dot Blot (figura 2), sendo colocado 5 μL de cada amostra sobre membrana de nitrocelulose. Após a secagem das amostras na membrana, em temperatura ambiente, essa foi bloqueada com solução de leite em pó a 5% por uma 1 h a temperatura ambiente, sob agitação e em seguida tratada MAb anti-6xHis conjugado à peroxidase (Sigma) (1:6000), por uma 1 h a temperatura ambiente, sob agitação. Após foi adicionado o conjugado anti-camundongo (1:4000), que foi deixado em agitação por 1 h a temperatura ambiente. A cada nova etapa foram realizadas 3 lavagens com PBS acrescido de 0,5% de Tween 20 (PBS-T). A reação foi revelada com SIGMA FAST™ DAB (Sigma-Aldrich). Como demonstrado na figura 2, a proteína rTES120 encontra-se no sobrenadante do clone 12, sendo concentrada através de Centriprep 10WUltracel 10K membrane(Millipore), sendo realizadas centrifugações seriadas a 3000 g, por 20 min à 20°C e visualizada em SDS-PAGE 10% com aproximadamente 75 kDa, conforme figura 3.

[033] Passo 7: Para expressão de rTES-30 também foi utilizado um Biorreator BioFlo 110 Benchtop (New Brunswick) em um volume de trabalho de 7 litros. O volume total do pré-inóculo foi adicionado ao meio de sais, este contendo % de sais e % de glicerol (Brady et al., 2001, com modificações), a temperatura de 28°C. A agitação (200-1000 rpm) foi controlada pelo nível de oxigênio dissolvido, mantido constante a 30% após o início da indução. Após o consumo de glicerol, a indução da expressão foi realizada com 0,5% de metanol. Amostras de sobrenadante e pellet foram coletadas a 0 h, 19 h, 27 h, 42 h, 52 h, 68 h, 77 h, 83 h e 113 h do início do cultivo. A densidade e viabilidade celular foram estipuladas através da contagem das unidades formadoras de colônias em ágar YPD. A avaliação da expressão da proteína a partir das amostras de pellet e sobrenadante foi realizada por Dot Blot com MAb anti-6xHis conjugado à peroxidase, conforme descrito anteriormente, sendo resultado demostrado na figura 4. Para análise da expressão das proteínas presentes no pellet foi realizada lise de células do cultivo, conforme protocolo Invitrogen (EasySelectTM Pichia Expression Kit, Version G). A partir de amostras da fermentação de pPICZaB/TES-30, foi centrifugado 1,5 mL do cultivo à 13.000 rpm, por 5 min. O sobrenadante foi descartado, o pellet ressuspendido com 100 μl de tampão de lise (50 mM fosfato de sódio, pH 7.4;1 mM PMSF; 1 mM EDTA; 5% glicerol) e adicionado ao tubo o mesmo volume de pérolas de vidro 0,5 mm. Colocou-se as amostras 30 seg no vórtex e após 30 seg no gelo, sendo repetido 8 vezes. Foi realizada centrifugação por 10 min a 13.000 rpm, sendo reservado o sobrenadante transparente. A purificação do produto de lise do pellet foi realizada mediante cromatografía de afinidade segundo as instruções do fabricante (His GraviTrap, GE Healthcare), conforme demonstrado na figura 5.

[034] Passo 8: A expressão das proteínas recombinantes rTES30 e rTES120 foi também confirmada através da técnica de Western blotting (WB), conforme Sambrook & Russell (2001), utilizando soros humanos positivos para T. canis na diluição 1:160 (Figura 8), anticorpo secundário anti-IgG humano (1:5000) e posterior revelação com SIGMA FAST™ DAB (Sigma-Aldrich).

[035] Passo 9: Para avaliação dos antígenos recombinantes rTES30 e rTES120, microplacas de poliestireno de 96 cavidades foram sensibilizadas com 0,25 μgχmL-1 de proteína recombinante rTES30 ou rTES120, em tampão carbonato bicarbonato 0,05 M e pH 9,6, a 37°C por 2 h e posteriormente a 4°C por 18 h. As placas foram lavadas 3 vezes (5 min por lavagem) com tampão PBS acrescido de 0,5% de Tween 20 (PBS-T) e bloqueadas com PBS-T com BSA 1% (albumina de soro bovino 1%) por 1 h a 37 °C. Após 3 lavagens com PBS-T (5 min por lavagem), adicionou-se os soros humanos reconhecidamente positivos e negativos frente ao antígeno TES nativo, na diluição 1:80 em PBS-T, incubou-se por 40 min a 37 °C. Foram utilizados como controle dois (2) soros padrão positivo, três (3) soros padrões não reagente, um (1) soro limiar de reatividade e triplicata do branco. Foram testados 40 soros não reagentes, 40 soros reagentes frente ao antígeno TES nativo, 40 soros positivos para outras parasitoses (9 soros positivos para Ascaris lumbricoides, 2 para Trichuris trichiura, 4 para Ancylostoma spp., 16 para Strongyloides stercoralis, 6 para Hymenolepis nana e 3 para Fasciola hepatica) Após foi realizada nova lavagem das placas com PBS-T(3 vezes, 5 min por lavagem), adicionando-se posteriormente o soro anti-imunoglobulina G humano conjugado com peroxidase (Sigma A - 6029) na diluição 1:5.000 em PBS-T, incubando por 40 min a 37 °C. Após 3 lavagens com PBS-T (5 min por lavagem) foi adicionado o solução de revelação TMB Novex (Lifetech), incubou-se por 10 min a temperatura ambiente (± 21°C) em local escuro. A reação foi parada com ácido sulfúrico 2N e foi feita a leitura da densidade óptica a 450 nm, em leitor de ELISA. As amostras de soro de foram avaliadas em duplicata no ELISA. Os resultados referentes a este experimento foram avaliados pela curva ROC, mostrando para a rTES30 valores de especificidade de 97,5% e sensibilidade de 22,50% e para a rTES120, 95% e 30%, respectivamente.

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Claims (9)

1. Processo de produção de antígenos recombinantes TES30 e TES120 de Toxocara canis em Pichia pastoris, dito processo caracterizado por obter mediante síntese química ou PCR a sequência de nucleotídeos codificadora para as proteínas TES30 e TES120, sequência contendo códons preferenciais de Pichia pastoris e ausência de estruturas secundárias. Sendo o gene sintético tes30 constituído por 645 nucleotídeos incluindo: 5’GGATCCGGAATTCAGTGTGCTACTAACAACGATTGTGGTATCTTCCAAGTCTGCGTCAACAACGTTTGTGTTGCCAACAACCAGGGTTGCAACCCACCATGCGTCCCTCCACAGGTTTGTGTCGCTCCTATGTGCGTCGCCCCACCACCTGCCGCCACCACTACTGCTGCTCCAGGAGTCACTACTACCCGTCCACGTGCTTGCCCACCAAACTGGACCCCATTCAACAACAACTGCTACATCGCTTCCCTCCCAGGTAGATTCTTGTTCAACCAGGCTTCCGACTGGTGTACTCAAACTGGATCTAGAGTTGTTTGGTTCGACCAGTCCACTGTTGGAAACTTCGGTTCTGAGTTGAACTTCGTCAACTCTTTCGCTTTGGGTCGTGGTGTTACCAGATACTGGATCGGTGTTAACAGACAATTCGGTCAATGGGTTTTCACCAACGGTTCTCCAGTTATTTTCTCTAACTGGAGACCATCTCAACCAGACGGTTGTTGTGGTTCCAACGTTACCTGTGCTTTCGTCAACTACGCGAACTTCTTGGGTCAATGGGACGACGCCCCATGTGGTTCCTTGTTCACCACCCCTCAAGGTTTCGTTTGTAAGAGACCTTTGCATCACCATCACCACCATTGAGGTACC; e o gene sintético tes120 constituído por 511 nucleotídeos incluindo: 5’GGGATCCGGAATTCAGATGTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCCCCTTCCACTTCCTCTTCCTCCGCCTCCACCTCCTCCTCCTCTGCCTCCACCTCCTCTTCCTCTGCTTCTACTTCCTCCTCTTCTGCGTCTACTTCTTCTTCTCCAGCCTCCACTTCTTCCTCTTCCGCCTCTACTTCTTCTATGGCTGGTTCTACTTCTACCGCTGCTGGTCCAACCTCCTCTTCCTCTGTCTCTACTTCTACTCCAGCCGTCATGACTACTACCCCAGCTTGTATCGACACCGCTAACGACTGTCAATTGTTCACCCCTCTCTGTTTCGTCCAACCATACTCTAGAGCTATTCAGGGTAGATGTAGACGTACCTGTAACATCTGTTCCTGCCAAGACTCCGCTAACGATTGCGCTAACTTCGTTTCCGTTTGTTTGAACCCAACCTACCAGCCAGTTTTGCGTTCTAGATGCCCATTGACCTGTGGATTCTGCCACCACCACCATCATCATTGAGGTACC.
2. Processo de produção de antígenos recombinantes TES30 e TES120 de Toxocara canis em Pichia pastoris, dito processo caracterizado por clonar a sequência nucleotídica obtida na reivindicação 1 em vetor de expressão procarioto ou eucarioto, efetuando posteriormente transformação por eletroporação ou choque térmico de bactérias, leveduras ou células mamíferas.
3. Processo de produção de antígenos recombinantes TES30 e TES120 de Toxocara canis em Pichia pastoris, dito processo caracterizado por cultivar os clones recombinantes em agitador orbital ou biorreator e induzir a expressão das proteínas rTES30 e rTES120, utilizando meios de cultivo e indutores adequados para este fim. Sendo que a sequência da proteína rTES30 compreende 215 aminoácidos, incluindo:
   GSGIQCATNNDCGIFQVCVNNVCVANNQGCNPPCVPPQVCVAPMCVAPPPAATTAAPGVTTTRPRACPPNWTPFNNNCYIASLPGRFLFNQASDWCTQTGSRVVWFDQSTVGNFGSELNFVNSFALGRGVTRYWIGVNRQFGQWVFTNGSPVIFSNWRPSQPDGCCGSNVTCAFVNYANFLGQWDDAPCGSLFTTPQGFVCKRPLHHHHHHGT; e a proteína rTES120 compreende 170 aminoácidos, incluindo GSGIQMSSSSSSSPSTSSSSASTSSSSASTSSSSASTSSSSASTSSSPASTSSSSASTSSMAGSTSTAAGPTSSSSVSTSTPAVMTTTPACIDTANDCQLFTPLCFVQPYSRAIQGRCRRTCNICSCQDSANDCANFVSVCLNPTYQPVLRSRCPLTCGFCHHHHHHGT
4. Processo de produção de antígenos recombinantes TES30 e TES120 de Toxocara canis em Pichia pastoris, dito processo caracterizado por obter as proteínas recombinantes rTES30 e rTES120 solúveis no sobrenadante ou no pellet celular, purificando-as mediante cromatografía de afinidade pelo Ni+2
5. Processo de produção de antígenos recombinantes TES30 e TES120 de Toxocara canis em Pichia pastoris, dito processo caracterizado por conservar as proteínas recombinantes obtidas na reivindicação 4 mediante refrigeração, congelamento, dessecação a vácuo ou liofilização.
6. Composição para diagnóstico de infecção por Toxocara spp., dita composição caracterizada por conter um reagente que se liga a componentes específicos do patógeno, que podem ser anticorpos contra as proteínas rTES30 e/ou rTES120.
7. Kit para diagnóstico de infecção por Toxocara spp., dito kit caracterizado por ser útil na detecção de anticorpos contra as proteínas TES30 e/ou TES120 de Toxocara spp., ou funcionalmente equivalentes as mesmas.
8. Formulações com potencial vacinal à base das proteínas recombinantes rTES30 e/ou rTES120 de Toxocara spp. em suas diferentes construções, caracterizada por composição farmacêutica utilizada para induzir resposta imune contra Toxocara spp., que corresponde a uma quantidade imunologicamente eficaz de proteína purificada ou sequências funcionalmente equivalentes, em um veículo farmaceuticamente aceitável, que pode ou não conter um adjuvante.
9. Formulações com potencial vacinal à base de anticorpos anti-rTES30 e/ou anti-rTES120 de Toxocara spp. a partir de suas diferentes construções, caracterizada por composição farmacêutica utilizada para induzir resposta imune contra Toxocara spp., que corresponde a uma quantidade imunologicamente eficaz de anticorpos que se ligam a peptídeos ou sequências funcionalmente equivalentes do mesmo, em um veículo farmaceuticamente aceitável, que pode ou não conter um adjuvante.

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