JP2003512022A - 組換えネオスポラ抗原およびその使用 - Google Patents

組換えネオスポラ抗原およびその使用

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、単離された牛ネオスポラ培養物を提供する。さらに、組換えによる免疫優性なネオスポラ抗原を提供する。これら培養物および抗原は、ウシおよび他の動物において、ネオスポラ感染を検出する診断的アッセイを開発するために使用される。さらにまた、ネオスポラ感染の治療および防御のための医薬組成物が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （連邦政府の援助による研究開発） 該当せず。 （関連出願に対するクロス・リファレンス） 本出願は、1996年5月10日に出願されたＵＳＳＮ０８／６４５９５１号の一部
継続出願であり、その全体が本明細書中に参考として援用されている。
【０００２】 （発明の背景） 診断に供されたウシの流産胎児の多くに、巣状非化膿性壊死性脳炎、非化膿性
心筋炎および筋炎からなる独特のパターンの炎症性病巣が観察されている。特に
脳における、このパターンの病巣は、ヒツジのトキソプラズマ・ゴンディー（To xoplasma gondii）感染で認められるものに類似している。しかしながら、ウシ
はT. gondii感染に抵抗性であると報告されている（Dubey, Vet. Parasit. 22:1
77-202(1986)）。１９８８年に、胎児の組織病理学的検査によってシスト形成性
の原虫性寄生虫が初めて同定された（Barr, et al., Vet. Parasit. 27:354-61(
1990)）。この寄生虫は、シストの幾つかが厚い壁を有するという点を除き形態
学的にはトキソプラズマに類似しているが、しかしこれは、Thilsted & Dubey(J
. Vet. Diagnos. Invest. 1:205-9(1989))がニューメキシコの酪農場からの流産
胎児で観察したネオスポラ・カニナム（Neospora caninum）様の原虫に、より類
似していた。
【０００３】 更なる研究によって、カリフォルニアの流産胎児および新生児のウシの炎症病
巣に関連するこの原虫性寄生虫が、Ｎ．カニナム寄生虫（最初は、イヌから単離
された（Dubey, et al., JAVMA 193:1259-63(1988)）に最も類似する微細構造お
よび抗原的特徴を有することが示された。しかしながら、抗血清パネルを用いて
検査したとき、ウシ原虫およびＮ．カニナムの抗原反応性の相違により、それら
は同じ種からのものではないであろうことが示された（Barr, et al, Vet Patho
l. 28:110-16(1991)）。 これらのウシ原虫の正体および生物学的知見をより完全に理解するには、これ
ら寄生虫のin vitro連続培養物を樹立する必要がある。そのような培養物はまた
、ネオスポラ感染の診断的アッセイ並びに、その治療および予防のための医薬組
成物の開発に有用であろう。本発明は、これら及び他の要請を扱う。
【０００４】 （発明の概要） ネオスポラ症の蔓延を抑えるには、改善された診断用検査の開発および本寄生
虫に関する基礎生物学の一層の理解が必要とされる。本発明は、２つの抗原（N
５４およびＮ５７、これらは組換え抗原に基づくＥＬＩＳＡで使用される）を提
供することによって、前記の理解に寄与するものである。既知の疾患状態を有す
るウシからの血清を（下記でより詳細に説明するように）、Ｎ５４に基づくＥＬ
ＩＳＡ、N５７に基づくＥＬＩＳＡ、およびタキゾイト溶解物に基づくＥＬＩＳ
Ａによって検査したとき、組換え抗原に基づくＥＬＩＳＡは、通常の溶解物に基
づくＥＬＩＳＡと比較して、より高い感度および、より高い若しくは同等の特異
性を示した。従って、組換え抗原に基づくＥＬＩＳＡを、ウシのネオスポラ症の
血清学的診断に用いることができる。
【０００５】 更に、本発明は、Ｎ５４ ｃＤＮＡフラグメントを含むＮＣ−ｐ６５を提供す
る。この完全長ｃＤＮＡ、それにコードされるタンパク質およびその機能の発見
は、この破壊的なウシの疾患を排除するのに寄与するワクチンおよび治療法の開
発を可能にする。 具体的には、本発明は、生物学的サンプル（例えばウシの血清）中の、牛ネオ
スポラ抗原と特異的に免疫反応する抗体の存在を検出する方法を提供する。本方
法は、サンプルをネオスポラ抗原と接触させ、それによって抗原／抗体複合体を
形成させ、複合体の存在または不存在を検出することを包含する。ネオスポラ抗
原は、代表的には、単離された遺伝子組換え的に産生された免疫優性のネオスポ
ラ抗原である。幾つかの実施態様では、この抗原は固相表面上に固定され、複合
体は蛍光標識抗ウシ抗体を用いて検出される。
【０００６】 本発明は、更に生物学的サンプル中のネオスポラの存在を検出する方法を提供
する。本方法は、サンプルをネオスポラ抗原と特異的に免疫反応する抗体と接触
させ、それによって抗原／抗体複合体を形成させ、この複合体の存在または不存
在を検出することを包含する。抗体（例えば、モノクローナル抗体）を固相表面
上に固定し、第二の標識抗体を用いて複合体を検出することができる。代表的に
は、生物学的サンプルは、ウシ胎児神経組織である。
【０００７】 本発明の方法は、生物学的サンプル中でネオスポラ特異的核酸の存在を検出す
ることも含み、該方法は、標的のネオスポラ特異的ポリヌクレオチド配列と特異
的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブとサンプルを接触させ、ハ
イブリダイゼーション複合体の存在または不存在を検出することを包含する。本
方法は、更に、この標的ネオスポラ特異的ポリヌクレオチド配列を増幅する工程
を包含し得る。
【０００８】 本発明は更に、医薬的に許容し得る担体および免疫原的有効量の牛ネオスポラ
抗原（例えば、遺伝子組換えにより産生された牛ネオスポラのポリペプチド）を
含む医薬組成物を提供する。 本医薬組成物は、ウシを牛ネオスポラによる感染から防御するために使用され
る。本組成物は、好ましくは、乳牛または妊娠している若い雌牛に投与される。
本医薬組成物は、通常、非経口的に投与される。
【０００９】 （具体的な実施態様の説明） 定義 “抗体”とは、抗原上の特異的エピトープと結合し得る免疫グロブリン分子を
指す。抗体は、ポリクローナル混合物またはモノクローナルのいずれでもよい。
抗体は、天然のソースまたは組換え型ソースに由来する完全な(intact)免疫グロ
ブリンであり得、更に完全な免疫グロブリンの免疫反応性部分であり得る。抗体
は、様々な形態で存在することができ、例えば、Ｆｖ、ＦａｂおよびＦ(ａｂ)2
、並びに単鎖形が含まれる。単鎖形抗体（この場合、重鎖および軽鎖に関する遺
伝子は、一本のコーディング配列に結合されている）も、用いることができる。
【００１０】 “生物学的サンプル”とは、生きているか又は死した生物から得られる任意の
サンプルを指す。生物学的サンプルの例には、生物学的液体および組織標本が含
まれる。組織標本の例には、胎児の脳組織、脊髄、および胎盤が含まれる。生物
学的液体の例には、血液、血清、血漿、尿、腹水、脳脊髄液および胎児体液が含
まれる。 “生物学的に純粋な牛ネオスポラ培養物”とは、ネオスポラのタキゾイトがそ
の中で増殖する宿主細胞以外の他の生物を実質的に含まない、牛ネオスポラ生物
体（例えば、タキゾイト）の持続的なin vitro培養物を指す。（下記で説明する
ように）標準的な回収方法によって、少なくとも約９５％、好ましくは９９％以
上の生物体（例えば、ネオスポラタキゾイト）を含む調製物が得られるならば、
この培養物は、実質的に他の生物体を含まない。
【００１１】 “牛ネオスポラ”とは、ウシの組織および体液中で同定されたか又はそれから
単離された、ネオスポラもしくは“ネオスポラ様”原虫を指す。代表的には、こ
の原虫性寄生虫は、ウシ流産胎児または先天的に感染した仔牛の神経組織から単
離できる。代表的な単離物は、下記に説明するように、アメリカン・タイプカル
チャー・コレクションに寄託された。 牛ネオスポラの“タンパク質”または“ポリペプチド”は、天然のポピュレー
ションで通常見出される対立遺伝子的変異種、および遺伝子組換え技術で導入さ
れる変異種を含む。タンパク質は、アミノ酸の付加、欠失および置換を含む様々
な方法で改変できることを、当業者は認識できる。
【００１２】 “遺伝子組換え的に作製された免疫優性のネオスポラ抗原”とは、１以上の免
疫優性エピトープを含む、遺伝子組換えによって産生されたポリペプチドである
。例示的な本発明の組換え抗原には、配列番号：１０、１２、１４および１９が
含まれる。そのような抗原は、配列番号：９、１１、１３、および１８によって
コードされる。それらをコードする組換え抗原および核酸を説明するために用い
られる用語は、例示した配列と実質的に同一の配列を含むことは当業者に理解さ
れよう。実質的同一性は、下記で説明するように決定できる。
【００１３】 本明細書で用いられるように、“核酸”および“ポリヌクレオチド”は、ＤＮ
ＡでもＲＮＡでもよい。ネオスポラタンパク質の発現に使用するか、または診断
用プローブとして使用する場合には、ポリヌクレオチド配列は同一である必要は
なく、本明細書に開示する配列に実質的に同一であれば良いことは当業者に理解
されよう。特に、挿入したポリヌクレオチド配列が転写、翻訳されて機能的なポ
リペプチドを産生する場合は、コドンの縮重により、多くのポリヌクレオチド配
列が同じポリペプチドをコードすることは当業者に理解されよう。
【００１４】 ２つ以上の核酸またはポリペプチド配列に関連して“同一”またはパーセント
“同一性”という用語は、下記の配列比較アルゴリズムの１つを用いるか又は目
視による検査で測定して、最大の相応関係が得られるように比較および整列させ
たとき、同じであるか又は同じである特定の割合のアミノ酸残基またはヌクレオ
チドを有する２つ以上の配列またはサブ配列を指す。 ２つの核酸またはポリペプチドに関連して、“実質的に同一”という語句は、
下記の配列比較アルゴリズムの１つを用いるか又は目視で検査して測定して、最
大の相応関係が得られるように比較および整列させたとき、少なくとも６０％、
好ましくは８０％、最も好ましくは９０−９５％のヌクレオチドまたはアミノ酸
残基同一性を有する２つ以上の配列またはサブ配列を指す。
【００１５】 配列比較の場合、代表的には、一方の配列は参照配列として機能し、参照配列
に対してテスト配列が比較される。配列比較アルゴリズムを用いるとき、テスト
配列および参照配列をコンピュータにインプットし、必要ならばサブ配列同等物
を選定し、更に配列アルゴリズムプログラムのパラメーターを選定する。続いて
配列比較アルゴリズムによって、参照配列に対するテスト配列のパーセント配列
同一性が、選定したプログラムパラメーターに基づいて計算される。
【００１６】 比較に最適な配列整列は、例えば、局所的相同性アルゴリズム（Smith & Wate
rman, Adv. Appl. Math. 2:482(1981)）によって、相同性整列アルゴリズム（Ne
edleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443(1970)）によって、類似性検索法（Pe
arson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444(1988)）によって、次の
括弧内のアルゴリズム（GAP, BESTFIT, FASTA, TFASTA(Wisconsin Genetics Sof
tware Package, Gernetics Computer Group, 575 Science Dr. , Madison, WI)
によるコンピュータ処理によって、または目視による検査（概説として上掲書（
Ausubel et al.）を参照されたい）によって、実施できる。
【００１７】 有用なアルゴリズムの一例は、ＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、関連性
とパーセント配列同一性を示すために、漸進的対整列を用いて、一群の関連配列
から多くの配列整列を創出する。ＰＩＬＥＵＰはまた、整列を創出するために用
いられるクラスター化関連性を示す樹状図をプロットする。ＰＩＬＥＵＰは、Fe
ng & Doolittle（J. Mol. Evol. 35:351-360(1987)）の漸進的整列法の単純化形
を用いる。使用されるこの方法は、文献に記載された方法（Higgins & Sharp, C
ABIOS 5:151-153(1989)）に類似している。このプログラムは、それぞれ最大長
５０００のヌクレオチドまたはアミノ酸の配列を３００個まで整列させ得る。こ
のマルチ整列法は、２つの最も類似する配列を対毎に整列させて開始し、２つの
整列配列のクラスターを形成する。続いて、このクラスターを、次の最も関連性
を有する配列または整列配列クラスターに対して整列させる。２つの個々の対毎
の整列を単純に伸長することによって、２つのクラスターの配列を整列させる。
このプログラムは、配列比較領域のための特定の配列およびそれらのアミノ酸ま
たはヌクレオチド同等物を選定し、更にプログラムパラメーターを選定すること
によって実行される。例えば、デフォルトギャップ重（３．００）、デフォルト
ギャップ長荷重（０．１０）、および荷重末端ギャップのパラメーターを用いて
、参照配列を他のテスト配列と比較し、％配列同一性関係を決定できる。
【００１８】 パーセント配列同一性および配列類似性の測定に適したアルゴリズムの別の例
はＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、これは文献に報告されている（Altschul et
al., J. Mol. Biol. 215:403-410(1990)）。ＢＬＡＳＴ分析を実施するソフトは
、National Center for Biotechnology Information（ HYPERLINK "http://www.
ncbi.nlm.nih.gov/" http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）から一般に入手できる。
このアルゴリズムは、先ず、高いスコアを有する配列対（ＨＳＰｓ）を質問配列
中の長さＷの短い文字列を同定することによって特定することを含む。前記文字
列は、データベース配列中の同じ長さの１つの文字列と整列させたとき、幾つか
の正の値の閾値スコアＴに適合するか又はこれを満足させる。Ｔは、近傍文字列
スコア閾値（Altschul et al. 上掲書）と称される。これらの最初の近傍文字列
ヒットは、それらを含むより長いＨＳＰｓを見付け出すための検索を開始するシ
ードとして機能する。続いて、文字列ヒットを各配列に沿って両方向に、累積整
列スコアが増加する限り伸長していく。累積スコアは、ヌクレオチド配列につい
ては、パラメーターＭ（適合（マッチ）残基の対のための報償スコア；常に>０）
およびＮ（ミスマッチ残基のためのペナルティスコア；常に<０）を用いて計算
される。アミノ酸配列については、採点マトリックスが、累積スコアを計算する
ために用いられる。各方向の文字列ヒットの伸長は、以下の場合に停止する：累
積整列スコアが、その最大達成値から量Ｘ分だけ減少したとき；累積スコアが、
１つ以上の負のスコアの残基整列の累積により０以下になったとき；又はいずれ
かの配列の末端に到達したとき。核酸またはポリペプチドが本発明の範囲内にあ
るか否かを同定するために、ＢＬＡＳＴプログラムのデフォルトパラメーターは
好適である。（ヌクレオチド配列のための）ＢＬＡＳＴＮプログラムは、デフォ
ルトとして、文字列の長さ（Ｗ）１１、数学的期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝
−４、および両方の鎖の比較を用いる。アミノ酸配列のためには、ＢＬＡＳＴＰ
プログラムは、デフォルトとして、文字列の長さ（Ｗ）３、数学的期待値（Ｅ）
１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコア化マトリックスを用いる（Henikoff & Hen
ikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915(1989)）。
【００１９】 パーセント配列同一性を計算するのに加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２
つの配列間の類似性の統計的分析も行なう（例えば、次の文献を参照されたい：
Karlin & Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787(1993)）。ＢＬ
ＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の測定の１つは、最小合計確率（Ｐ
（Ｎ））で、これは、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の適合が偶然に
よって生起する確率の指標を提供する。例えば、テスト核酸と参照核酸の比較で
最小合計確率が約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは
約０．００１未満の場合、この核酸は参照核酸に類似していると考えられる。
【００２０】 ２つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一であるというまた別の指標
は、下記に述べるように、第一の核酸にコードされるポリペプチドが、第二の核
酸にコードされるポリペプチドと免疫学的に交差反応し得ることである。従って
、例えば、２つのペプチドが同類置換によってのみ相違する場合は、このポリペ
プチドは、代表的には、第二のポリペプチドと実質的に同一である。２つの核酸
配列が実質的に同一であるという別の指標は、下記に述べるように、ストリンジ
ェントな条件下で２つの分子が互いにハイブリダイズすることである。
【００２１】 “選択的にハイブリダイズする”という語句は、ある分子が特定のヌクレオチ
ド配列と、その配列がコンプレックス混合物（例えば、全細胞性）ＤＮＡまたは
ＲＮＡ中に存在するときに、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下
で結合するか、二重らせん化するか、またはハイブリダイズすることを指す。“
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件”という語句は、プローブがそ
の標的サブ配列とハイブリダイズするが、他のいかなる配列ともハイブリダイズ
しない条件をいう。ストリンジェントな条件は配列によって左右され、異なる環
境では異なってくるであろう。より長い配列は、より高温度で特異的にハイブリ
ダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに関する広範な指針は、以下の文献
中に見出される：Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biolog
y-Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of pinciples of hybridiza
tion and the strategy of nucleic acid assays"(1993))。一般に、ストリンジ
ェントな条件は、定められたイオン強度、ｐＨにおいて、特定の配列の熱融解点
（Ｔｍ）より約５−１０℃低くなるように選択される。Ｔｍは、（定められたイ
オン強度、ｐＨおよび核酸濃度の下で）標的に相補的なプローブの５０％が平衡
状態で標的配列にハイブリダイズする温度である（標的配列がＴｍで過剰に存在
するとき、平衡状態でプローブの５０％が占有されている）。ストリンジェント
な条件は、ｐＨ７．０から８．３で塩濃度が約１．０Ｍ未満のナトリウム（また
は他の塩）イオン濃度、代表的には、約０．０１から１．０Ｍのナトリウムイオ
ン濃度であり、短いプローブ（例えば、１０から５０ヌクレオチド）では温度は
少なくとも約３０℃で、長いプローブ（例えば、５０ヌクレオチドより長いもの
）では少なくとも約６０℃というものである。ストリンジェントな条件は、ホル
ムアミドのような脱安定化剤の添加によっても達成できる。
【００２２】 高度にストリンジェントな洗浄条件の例は、７０から８０℃（好ましくは７２
℃）にて、０．１５ＭのＮａＣｌで約１５分間の洗浄である。ストリンジェント
な洗浄条件の例は、約６０から７０℃、好ましくは６５℃で１５分間、０．２×
ＳＳＣによる洗浄である（ＳＳＣ緩衝液については、上掲書（Sambrook）を参照
されたい）。高度にストリンジェントな洗浄は、しばしば、低度にストリンジェ
ントな洗浄を先行させて、バックグラウンドのプローブシグナルを除去する。例
えば、１００ヌクレオチドより大きい二重らせんの中等度にストリンジェントな
洗浄の例は、４０から５０℃、好ましくは４５℃で１５分間の１×ＳＳＣによる
洗浄である。例えば、１００ヌクレオチドより大きいニ重らせんの低度にストリ
ンジェントな洗浄の例は、３５から４５℃、好ましくは４０℃で１５分間の４−
６×ＳＳＣによる洗浄である。一般に、特定のハイブリダイゼーションアッセイ
で無関係のプローブについて観察されるシグナル対ノイズ比より２倍（またはそ
れ以上）の比は、特異的なハイブリダイゼーションの検出を示している。
【００２３】 タンパク質またはペプチドについて、“特異的に免疫反応する”という語句は
、タンパク質と抗体との間の結合反応を指し、これは異種ポピュレーションのタ
ンパク質および他の化合物の存在下で該タンパク質の存在を決定付ける。従って
、指定された免疫アッセイ条件下で、特殊な抗体は特定のタンパク質と結合し、
サンプル中に存在する他のタンパク質とは有意量で結合しない。そのような条件
下での抗体への特異的な結合は、特定のタンパク質に関するその特異性が選択さ
れている抗体を必要とし得る。特定のタンパク質と特異的に免疫反応し得る抗体
を選択するために、様々な免疫アッセイ様式を用いることができ、下記で詳細に
述べる。
【００２４】 ネオスポラのペプチドまたはタンパク質について言及するとき、“実質的に純
粋な”または“単離された”という語句は、ネオスポラ生物体の他の細胞下成分
を含まない化学的組成物を指す。代表的には、サンプルの少なくとも約８５％以
上が１つのポリペプチド骨格を構成するとき、モノマー性タンパク質は実質的に
純粋である。マイナーな変異種または化学的改変は、典型的には同じポリペプチ
ド配列を共有し得る。精製方法に応じて、８５％、好ましくは９５％を超える純
度が可能である。タンパク質の純度または均質性は、当分野で周知の多くの手段
、例えばタンパク質サンプルのポリアクリルアミドゲル電気泳動、続いてポリア
クリルアミドゲル上の単一のポリペプチドバンドを銀染色で可視化することによ
って示され得る。特定の目的のためには、高解像度が必要とされ、精製のために
ＨＰＬＣまたは類似の手段が利用される。
【００２５】序論 本発明のネオスポラ・タキゾイト培養物は、アメリカン・タイプカルチャー・
コレクション（Rockville, Maryland）に1994年3月17日に寄託され、登録番号75
710(BPA１)および75711(BPA6)を得た。 これらの単離物は、ウシ流産胎児および先天的に感染した仔牛の脳および／ま
たは脊髄の組織ホモジネートから得られた。 免疫組織化学を用い、これらの胎児および仔牛の組織内の病巣に関連するタキ
ゾイトおよび／またはシストがネオスポラ寄生虫であると、単離前に同定された
。単離物のタキゾイト期を、ウシ胎児栄養膜、大動脈内皮細胞および／またはマ
クロファージの定常単層培養物中で増殖させた。ＢＰＡ１単離物の超微細構造の
特徴を調べるために電子顕微鏡を用いた。抗原的には、タキゾイトの５個の別々
の単離物が、ネオスポラに対する抗血清と強く反応し、トキソプラズマ・ゴンデ
ィーまたはハンモンディア・ハンモンディ（Hammondia hammondi）とは殆ど又は
全く反応しなかった。これらの超微細構造および抗原的特徴に基づき、これらの
寄生虫は、最も近縁で形態学的に類似する属の原虫であるトキソプラズマ、ハン
モンディアおよびサルコシスティス（Sarcocystis）から区別できる。
【００２６】 更に、ウシのネオスポラ単離物の３つ（BPA1、BPA3およびBPA5）に関する核小
サブユニット（ｎｓｓ）−ｒＲＮＡ遺伝子の５'末端の部分配列（５００−５５
０塩基対）が得られ、同一であることが示された。ＢＰＡ１単離物のｎｓｓ−ｒ
ＲＮＡ遺伝子のより完全な１．８ｋｂの配列を得て、他のコクシジウム寄生生物
中のこの遺伝子に関する配列と比較した。ネオスポラ・カニナム（Neospora can inum ）、クリプトスポリジウム・パルブム（Cryptosporidium parvum）、サルコ
システィス・ムリス（Sarcocystis muris）、およびトキソプラズマ・ゴンディ
ーの公開された配列とこれらの配列を整列させて、このウシのネオスポラ単離物
は遺伝子型として固有であることが判明した。 下記で詳述するように、この単離物を用いて、様々な診断的アッセイ並びに感
染を治療および予防する医薬組成物が開発される。
【００２７】ネオスポラ・ポリペプチドおよび核酸の調製 標準的なタンパク質精製技術を用いて、本明細書で提供する培養物に由来する
タキゾイトまたはブラディゾイトからタンパク質を単離することができる。その
ような技術には、硫酸アンモニウムのような物質を用いた選択的沈殿、カラムク
ロマトグラフィー、免疫精製法などが含まれる。例えば、以下を参照されたい：
R. Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verla
g: New York(1982)。
【００２８】 標準的な免疫ブロット技術を用いて、分子量が約１０６、４９．５、４８、３
３、３２．５、３０、２８、２６、１９、１８および１７キロダルトン（ｋｄ）
である１１種のタンパク質を同定した。これらタンパク質の全てが、ネオスポラ
に感染したウシの抗体によって特異的に認識される。標準的なタンパク質精製方
法を用いてこれらのタンパク質を精製し、下記で説明する診断的方法で使用する
ためのポリクローナルまたはモノクローナル抗体を作製し得る。これらの抗原の
２つ（約１０６および１９ｋｄ）は、感染したウシ中でネオスポラ特異的抗体を
検出するための酵素結合免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ）に有用であることが示され
た。
【００２９】 培養タキゾイトから直接タンパク質を抽出するのではなく、本発明の免疫優性
抗原（現在、公知のもの及び未知のものの両方）の組換え発現のために、培養物
に由来する核酸を使用し得ることは当業者に理解されよう。これらの方法では、
例えば、ｃＤＮＡライブラリーが培養タキゾイトから作製される。免疫優性抗原
について、例えば、既知の免疫優性抗原をコードする核酸への選択的ハイブリダ
イゼーションによるか、または発現スクリーニングによって、このライブラリー
をスクリーニングする。発現スクリーニングにおいて、ｃＤＮＡライブラリーを
、対象となるタキゾイトに対して作製された抗体を用い、免疫優性抗原の存在に
ついてスクリーニングする。これらの方法を用いることにより、ネオスポラの様
々な培養物または種から免疫優性抗原を同定できる。
【００３０】 候補ｃＤＮＡを同定した後、対象となるタンパク質をコードする核酸を適切な
宿主細胞に導入し、続いて、大量のタンパク質を産生するよう細胞を誘導する。
２つの代表的な核酸の単離は、下記の実施例６で述べる。本発明は、遺伝子組換
え分野でルーチンな技術に依拠し、当業者に周知である。本発明で使用される一
般的な方法を開示する基本的な成書は、以下のものである：Sambrook et al., M
olecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publish., Cold
Spring Harbor, NY 2nd ed.(1989)。
【００３１】 診断用オリゴヌクレオチドプローブとして使用するか、またはタンパク質の組
換え発現のために使用する核酸は、多くの技術を用いて単離できる。例えば、上
記で述べた培養物から単離したタンパク質の一部分を配列決定し、これを用いて
縮重オリゴヌクレオチドプローブをデザインし、ｃＤＮＡライブラリーをスクリ
ーニングすることができる。アミノ酸の配列決定を実施し、オリゴヌクレオチド
プローブを文献（例えば、上掲書（Sambrook et al.））に記載される標準的技
術に従って合成する。或いは、所望の遺伝子の同定に有用なオリゴヌクレオチド
プローブは、他の種の関連する遺伝子の保存領域から調製してもよい。
【００３２】 或いは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を用いて、所望の遺伝子の核酸
配列を、ｍＲＮＡから、ｃＤＮＡから、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライ
ブラリーから直接、増幅させてもよい。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または
他のin vitro増幅方法はまた、例えば、発現させようとするタンパク質をコード
する核酸配列をクローニングしたり、生理学的サンプル中のｍＲＮＡの存在を検
出するプローブとして使用するための核酸を作製したり、核酸を配列決定したり
、または他の目的のために有用であろう。ＰＣＲについての一般的な概説は、以
下の文献を参照されたい：PCR Protocols: A Guide to Methods and Applicatio
ns.(M. Innis, D. Gelfand, J. Sninsky and T. White, eds), Academic Press,
San Diego(1990)。
【００３３】 標準的なトランスフェクション方法を用いて、大量の所望のペプチドを発現す
る原核細胞、哺乳類細胞、酵母または昆虫細胞系を作製する。このポリペプチド
を、続いて、標準的技術（例えば、以下を参照のこと：Colley et al., J. Biol
. Chem. 264:17619-17622(1989); および上掲書（Guide to Protein Purificati
on））を用いて精製する。
【００３４】 宿主細胞のトランスフェクションに用いるヌクレオチド配列は、様々な所望の
特性を有するネオスポラのポリペプチドを得るために改変できる。例えば、特定
の細胞によるポリペプチド発現を促進するために、好ましいコドンが用いられる
。更に、これらのポリペプチドは、一次構造レベルで天然に生じる配列から、ア
ミノ酸の挿入、置換、欠失などによって改変できる。これらの改変は、多くの組
み合わせで用いて、最終的な改造タンパク質鎖を産生できる。
【００３５】 アミノ酸配列変異種は、組換えポリペプチドの精製および調製の促進を含む、
様々な目的を念頭において産生できる。改変されたポリペプチドは、血漿半減期
の改変、治療的効果の改善、および治療中の副作用の重篤度または発生の軽減に
も有用である。アミノ酸配列変異種は、天然には見出されない通常は予め決めら
れた変種型であるが、しかし天然に生じるタンパク質と同じ免疫原的活性を示す
。一般に、ポリペプチドをコードする配列の改変は、周知の様々な技術、例えば
部位指定変異誘発（Giliman & Smith, Gene 8:81-97(1979)；Roberts et al., N
ature 328:731-734(1987)）によって容易に達成できる。
【００３６】 当業者が実施できる改変の例には、以下が含まれる：特定のレセプター分子に
関する親和性が増強されたアミノ酸およびポリペプチド変異種の産生；異なるＴ
細胞間で交差反応性が増強されたポリペプチド変異種の産生；またはサブドミナ
ント抗原の産生（例えば、親和性を高めたが免疫優性の抗原上には存在しない残
基の置換による）。
【００３７】 所望の活性を有するポリペプチドは、必要に応じて改変し（例えば、その変異
種を作製して）、一定の望ましい属性（例えば、薬理学的性質の改善）を提供し
ながら、未改変ポリペプチドの生物学的活性（例えば、所望のＴ細胞の活性化）
の実質的に全てを増強するか、又は少なくとも維持する。更に、所望の活性を欠
くポリペプチドは、その活性を有するように改変することができる。
【００３８】 ポリペプチドは、例えば、アミノ酸の付加または欠失によって、化合物のアミ
ノ酸配列を伸長または減少させて改変することもできる。本発明のポリペプチド
は、一定の残基の順序または組成を変更することによっても改変できる。但し、
生物学的活性に必須の特定のアミノ酸残基、例えば重要な接触部位および保存残
基は、一般に生物学的活性に悪影響を与えることなしに変更し得ないことは容易
に理解しえよう。しかしながら、ある場合には、生物学的活性に“悪影響”をも
たらすペプチドの生成が所望されることもあり得る。
【００３９】 殆どの改変は、所望の特性に関する好適なアッセイにおいて、ルーチンなスク
リーニングにより評価される。例えば、防御免疫反応を誘発するポリペプチドの
能力に対する様々な改変の影響は、in vitroアッセイを用いて容易に測定できる
。例えば、リンパ球増殖、Ｔ細胞毒性、またはサイトカイン産生を誘発するこの
ポリペプチドの能力を、標準的な技術を用いて調べることができる。
【００４０】 様々なアミノ酸模倣物または非天然アミノ酸を含む改変ポリペプチドは、in v
ivoで安定性の増加を示す傾向があり、特に有用である。より具体的には、重要
でないアミノ酸については、タンパク質に天然に存在するもの（例えばＬ−α−
アミノ酸またはそのＤ型異性体）に限定する必要はなく、非天然型アミノ酸も同
様に含むことができる。それらは、例えば、Ｄ−またはＬ−ナフチルアラニン；
Ｄ−またはＬ−フェニルグリシン；Ｄ−またはＬ−２−チエニルアラニン；Ｄ−
またはＬ−１，−２，３−，または４−ピレニルアラニン；Ｄ−またはＬ−３チ
エニルアラニン；Ｄ−またはＬ−（２−ピリジニル）−アラニン；Ｄ−またはＬ
−（３−ピリジニル）−アラニン；Ｄ−またはＬ−（２−ピラジニル）−アラニ
ン；Ｄ−またはＬ−（４−イソプロピル）−フェニルグリシン；Ｄ−（トリフル
オロメチル）−フェニルグリシン；Ｄ−（トリフルオロメチル）−フェニルアラ
ニン；Ｄ−ρ−フルオロフェニルアラニン；Ｄ−またはＬ−ρ−ビフェニルフェ
ニルアラニン；Ｄ−またはＬ−ρ−メトキシビフェニルフェニルアラニン；Ｄ−
またはＬ−２−インドール（アルキル）アラニン；およびＤ−またはＬ−アルキ
ルアラニンであり、ここで、アルキル基は置換または非置換メチル、エチル、プ
ロピル、ヘキシル、ブチル、ペンチル、イソプロピル、イソブチル、sec−イソ
チル、イソペンチル、または非酸性アミノ酸である。非天然アミノ酸の芳香環に
は、例えば、チアゾリル、チオフェニル、ピラゾリル、ベンゾイミダゾリル、ナ
フチル、フラニル、ピロリル、およびピリジル芳香環が含まれる。
【００４１】 ペプチド安定性は、多くの方法によってアッセイできる。例えば、ぺプチダー
ゼおよび様々な生物学的媒体（例えば、血漿および血清）が、安定性の検査に用
いられた（例えば、以下を参照されたい：Verhoef et al., Eur. J. Drug Metab
. Pharmacokinetics 11:291(1986)）。本発明のペプチドの半減期は、２５％血
清（ｖ／ｖ）アッセイを用いて、好都合に測定される。このプロトコルは、概略
して以下の通りである：血清（代表的には、ウシ血清）は、使用前に遠心によっ
て脂質を除去する。続いて、この血清をＲＰＭＩ−１６４０または別の好適な組
織培養培地で２５％に稀釈する。予め定めた時間間隔で、少量の反応溶液を取り
出し、６％のトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）水溶液またはエタノールに添加する。白
濁した反応サンプルを１５分間冷却し（４℃）、次に遠心して、沈殿した血清タ
ンパク質をペレット化する。続いて、安定性特異的クロマトグラフィー条件を用
いて、逆相ＨＰＬＣによってポリペプチドの存在を決定する。
【００４２】 ポリペプチド発現のために、遺伝物質を宿主細胞に導入するのに用いられる特
定の手順は、特に重要ではない。外来ヌクレオチド配列を宿主細胞に導入するの
に周知の、いずれの方法も用いることができる。これらの方法には、燐酸カルシ
ウムトランスフェクション、スフェロプラスト、電気穿孔、リポソーム、マイク
ロインジェクション、プラスミドベクター、ウイルスベクターの使用、およびク
ローン化したゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡまたは他の外来遺伝物質を宿
主細胞に導入する任意の他の周知の方法（上掲書（Sambrook et al.）を参照の
こと）が含まれる。ただ１つ必要なことは、使用される特定の手順が、遺伝子を
発現し得る宿主細胞に、少なくとも１つの遺伝子を成功裏に導入し得ることであ
る。
【００４３】 多くの周知の細胞および細胞系のいずれも、本発明のポリペプチド発現に用い
ることができる。例えば、原核細胞（例えば、大腸菌（E. coli））を用いるこ
とができる。真核細胞には、酵母、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞
、ＣＯＳ細胞、および昆虫細胞が含まれる。
【００４４】 細胞に遺伝情報を輸送するのに用いられる特定のベクターも、特に重要ではな
い。原核細胞および真核細胞で組換えタンパク質を発現するのに用いられる、任
意の通常のベクターが使用し得る。哺乳類細胞に関する発現ベクターは、代表的
には、真核細胞のウイルスからの調節性エレメントを含む。
【００４５】 発現ベクターは、代表的には、宿主細胞においてポリペプチドＤＮＡを発現す
るのに必要な全てのエレメントを含む、転写ユニットまた発現カセットを含む。
代表的な発現カセットは、ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に作動可能に連
結されたプロモーター、および転写物の効率的なポリアデニル化に必要なシグナ
ルを含む。本明細書で用いられるように“作動可能に連結された”という用語は
、ＤＮＡ配列から上流にあるプロモーターが、このＤＮＡ配列の転写を成就する
ように前記プロモーターを連結することを指す。好ましくは、このプロモーター
は、その異種の転写開始部位からの距離が、その天然状態における転写開始部位
からの距離とほぼ同じであるように配置される。しかしながら、当分野で公知の
ように、この距離についてある程度の変動が、プロモーターの機能を失うことな
く可能である。
【００４６】 組換え細胞の増殖およびポリペプチドの発現に続いて、分泌されたタンパク質
の精製のために培養培地を回収する。代表的には、この培養培地を遠心または濾
過により細胞または細胞の破片を除去して清澄にし、更に、任意の適切な樹脂に
吸着するか、または硫酸アンモニウム分画、ポリエチレングリコール沈殿または
限外濾過によってタンパク質を濃縮する。ポリペプチドの更なる精製は、標準的
な技術、例えば、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラ
フィー、サイズ排除クロマトグラフィー、Ｈｉｓ6付加およびＮｉ−アガロース
クロマトグラフィー（Dobeli et al., Mol. And Biochem. Parasit. 41:259-268
(1990)）、または均一性を得るための他のタンパク質精製技術によって達成でき
る。続いて、精製タンパク質を用いて、下記に述べるように医薬組成物を産生す
る。 ワクチンとして有用な組換えポリペプチドを調製する別の方法は、組換えウイ
ルス（例えば、ワクシニア）の使用を含む。ワクシニアウイルスは、好適な培養
された哺乳類細胞（例えば、ＨｅＬａＳ３スピナー細胞）中で、文献（Mackett,
Smith and Moss, "The Construction and Characterization of Vaccinia Viru
s Recombinants Expressing Foreign Genes" in "DNA Cloning Vol. II. A pra
ctical approach", Ed. D.M. Glover, IRL Press, Oxford, pp191-211）に記載
されるように増殖させる。
【００４７】抗体産生 本発明の単離されたタンパク質または培養物を用いて、ネオスポラ抗原に特異
的に反応する抗体を産生することができる。単離タンパク質を用いる場合、それ
らは組換え的に産生するか、またはネオスポラ培養物から単離できる。本タンパ
ク質の配列を使用して作製される合成ペプチドも、用いることができる。 ポリクローナル抗体の産生方法は、当業者に公知である。簡単に述べると、免
疫源、好ましくは精製タンパク質をアジュバントと混合し、動物を免疫する。免
疫源に対する好適に高力価の抗体が得られるとき、動物から血液を採取し、抗血
清を調製する。所望ならば、ネオスポラ蛋白質に反応性を有する抗体を濃縮する
ために、抗血清の更なる分画化を実施してもよい。例えば、下記文献を参照され
たい：Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harb
or Pubs., N.Y. (1988)。
【００４８】 ＢＰＡ１およびＢＰＡ３単離物に対するポリクローナル抗血清を作製して、評
価した。このポリクローナル抗体を用いて、感染動物の組織中のネオスポラ・タ
キゾイトおよびブラディゾイト期を、例えば文献に報告された免疫ペルオキシダ
ーゼ検査法（Anderson et al., JAVMA 198:241(1991)およびBarr et al. Vet Pa
thol. 28:110-116(1991)）を用いて同定し、特徴付けた。 モノクローナル抗体は、当業者に周知の様々な技術により得ることができる。
簡単に述べると、所望の抗原で免疫した動物の脾細胞を、通常はミエローマ細胞
との融合（Kohler and Milstein, Eur. J. Immunol. 6:511-519(1976)により、
不朽化する。不朽化の別の方法には、エプスタイン・バーウイルス、オンコジー
ン、もしくはレトロウイルスによる形質転換、または当分野で周知の他の方法が
含まれる。１つの不朽化細胞から生じたコロニーを、抗原に関する所望の特異性
および親和性を有する抗体の産生についてスクリーニングし、そのような細胞に
よって産生されるモノクローナル抗体の収量は、脊椎動物宿主の腹腔への注射を
含む、様々な技術によって高めることができる。
【００４９】 例えば、ＢＰＡ１単離物を用いてマウスを免疫し、ハイブリドーマ産生のため
の感作Ｂ細胞を得た。これらの細胞を用いて、４８ｋｄおよび７０ｋｄのネオス
ポラ蛋白質に対するモノクローナル抗体を得た。作製したモノクローナル抗体は
、例えば、寄生虫侵入のin vitro検査のためのＥＬＩＳＡ診断テスト、免疫組織
化学的テストに使用され、ワクチン開発、タンパク質の単離、更に適切な遺伝子
配列を選択するためのゲノムおよびｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする
ための候補抗原を選択する。
【００５０】ネオスポラ感染の診断 本発明はまた、生物学的サンプル中のネオスポラの存在または不存在を検出す
る方法を提供する。例えば、ネオスポラと特異的に反応する抗体は、本明細書で
開示するタンパク質または単離物を用いて検出できる。本タンパク質または単離
物はまた、サンプル中の抗原を検出するための特異的抗体（モノクローナルまた
はポリクローナル抗体）を作製するために用いることができる。更に、本明細書
に開示し、請求の範囲に記載した核酸を用いて、標準的ハイブリダイゼーション
技術によりネオスポラ特異的配列を検出できる。これらのアッセイの各々は、下
記で詳述する。
【００５１】 Ａ．免疫アッセイ 一般的な免疫学的および免疫アッセイ的手順に関する概説については、下記を
参照されたい：Basic and Clinical Immunology 7th Edition (D. Stites and A
. Terr ed.) 1991。本発明の免疫アッセイは、任意の幾つかの構成で実施できる
。これらは、次の文献に十分に概説されている：Enzyme Immunoassay, E.T. Mag
gio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida(1980); "Practice and Theory of
Enzyme Immunoassays", P. Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry
and Molecular Biology, Elsevier Science Publishers B. V. Amsterdam(1985)
。例えば、本明細書に開示したタンパク質および抗体は、ＥＬＩＳＡ、免疫ブロ
ット分析、および凝集アッセイで好都合に用いられる。特に好ましいアッセイ様
式には、実施例２に記載するような間接蛍光抗体アッセイが含まれる。
【００５２】 簡単に述べると、抗ネオスポラ抗体または抗原を測定する免疫アッセイは、競
合的結合アッセイでも非競合的結合アッセイでもよい。競合的結合アッセイでは
、サンプル中の分析物（例えば、抗ネオスポラ抗体）は、固体表面に結合された
捕獲薬剤（例えば、単離されたネオスポラ蛋白質）上の特異的結合部位に関する
標識分析物（例えば、抗ネオスポラ・モノクローナル抗体）と競合する。捕獲薬
剤と結合した標識分析物の濃度は、サンプル中に存在する遊離の分析物の量に反
比例する。
【００５３】 非競合的アッセイは、代表的には、サンドイッチアッセイであり、この場合、
サンプル中の分析物は２つの分析物特異的結合試薬の間に結合される。この結合
薬剤の一方は捕獲薬剤として用いられ、固体表面に結合される。第二の結合薬剤
は標識され、生じた複合体を用いて、目視により又は装置によって測定または検
出する。
【００５４】 捕獲薬剤と標識結合薬剤の多くの組合わせを用いることができる。例えば、単
離されたネオスポラ蛋白質または培養物を捕獲薬剤として用い、ウシ抗体の定常
領域に特異的な標識した抗ウシ抗体を、標識結合薬剤として用いることができる
。ウシ免疫グロブリンの定常領域（例えば、γまたはμ）に特異的なヤギ、ヒツ
ジ、および他の非ウシ抗体が、当分野で周知である。或いは、抗ウシ抗体は、捕
獲薬剤であり得、抗原は標識され得る。
【００５５】 アッセイの様々な成分（抗原、抗ネオスポラ抗体、または抗ウシ抗体を含む）
は、固体表面に結合されていてもよい。生物学的分子を様々な固体表面に固定す
る多くの方法が、当分野で公知である。例えば、固体表面は、膜（例えばニトロ
セルロース膜）、マイクロタイターディッシュ（例えば、ＰＶＣまたはポリスチ
レン）、またはビーズでもよい。所望の成分は、共有結合により、または非特異
的な結合を介して非共有結合的に結合され得る。
【００５６】 或いは、免疫アッセイは、液相で実施し得、様々な分離方法を用いて、結合標
識成分を非結合標識成分から分離することができる。このような方法は当業者に
周知であり、免疫沈澱、カラムクロマトグラフィー、吸着、結合剤で被覆された
磁性粒子の添加および他の類似の方法が含まれる。
【００５７】 免疫アッセイはまた、分離手順を含まずに液相で実施できる。様々な均質な免
疫アッセイ方法が、現在、タンパク質分析物に関する免疫アッセイに利用されて
いる。このような方法では、結合剤の分析物への結合は、標識によって放出され
るシグナルの変化を生じ、その結果、結合標識成分を非結合標識成分から分離す
ることなく結合を測定し得る。
【００５８】 ウェスタンブロット（免疫ブロット）分析もまた、サンプル中のネオスポラに
対する抗体の存在を検出するために用いることができる。この技術は、サンプル
中に特定のタンパク質に対する抗体の存在を確認するのに、信頼性のある方法で
ある。この技術は一般に、分子量を規準にするゲル電気泳動によってタンパク質
を分離し、この分離されたタンパク質を適切な固体支持体（例えば、ニトロセル
ロースフィルター、ナイロンフィルター、または誘導ナイロンフィルター）に移
し、分離タンパク質とともにサンプルをインキュベートすることを包含する。こ
れによって、サンプル中に存在する特異的な標的抗体が、それぞれの対応するタ
ンパク質と結合する。続いて、標識した抗ウシ抗体を用いて標的抗体を検出する
。
【００５９】 上記に詳述した免疫アッセイ様式は、標識したアッセイ成分を用いる。標識は
、様々な形態であり得る。標識は、当分野で周知の方法に従って、アッセイの所
望の成分に直接的または間接的に結合させることができる。きわめて様々な標識
を用いることができる。成分は、幾つかの方法の任意の１つによって標識できる
。慣用的には、3Ｈ、125Ｉ、35Ｓ、14Ｃ、または32Ｐを組込む放射性標識が用い
られた。非放射性標識は、標識抗体、発蛍光団、化学発光剤、酵素と結合するリ
ガンドおよび、標識リガンドの特異的結合対成分として機能し得る抗体を含む。
標識の選択は、必要とされる感度、化合物との複合体化の容易さ、安定性要件、
および利用可能な装置によって左右される。
【００６０】 標識として対象となる酵素は、主として、加水分解酵素（特に、ホスファター
ゼ、エステラーゼ、およびグリコシダーゼ）、または酸化還元酵素（特に、ペル
オキシダーゼ）であろう。蛍光化合物には、フルオレセインおよびその誘導体、
ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロンなどが含まれる。化
学発光化合物には、ルシフェリンおよび２，３−ジヒドロフタラジンジオン（例
えば、ルミノール）が含まれる。使用できる様々な標識またはシグナル産生系の
概説は、米国特許出願4391904号（この文献は、本明細書中に参考として援用さ
れる）を参照されたい。
【００６１】 非放射性標識は、しばしば間接的手段によって結合される。一般に、リガンド
分子（例えば、ビオチン）が、分子に共有結合される。続いて、このリガンドを
抗リガンド（例えば、ストレプトアビジン）分子に結合させる。後者は、シグナ
ル系に固有の検出可能分子か、またはシグナル系に共有結合される分子、例えば
、検出可能な酵素、発蛍光化合物または化学発光化合物である。多くのリガンド
および抗リガンドを用いることができる。リガンドが天然の抗リガンド（例えば
、ビオチン、チロキシンおよびコルチゾル）を有する場合、標識した天然に生じ
る抗リガンドと共に用いることができる。或いは、任意のハプテン性または抗原
性化合物を抗体と組合せて用いることができる。 幾つかのアッセイ様式は、標識成分の使用を必要としない。例えば、凝集アッ
セイは、標的抗体の存在を検出するために用いることができる。この場合、抗原
で被覆された粒子は、標的抗体を含むサンプルによって凝集される。この様式で
は、成分のいずれも標識する必要がなく、標的抗体の存在は単純な目視検査によ
って検出される。
【００６２】 Ｂ．ネオスポラ核酸の検出 上記のように、本発明はまた、生物学的サンプル中のネオスポラＤＮＡまたは
ＲＮＡの存在を検出する方法を包含する。これらの配列は、ウシ宿主および固有
宿主の両方からの生物学的サンプル中のネオスポラ生活環の全ての段階（例えば
、タキゾイト、ブラディゾイトおよびオオシスト）を検出するために用いられ得
る。核酸ハイブリダイゼーション技術を用いる、特異的ＤＮＡおよびＲＮＡを測
定する様々な方法が当業者に公知である。例えば、上掲書（Sambrook et al.）
を参照されたい。
【００６３】 サンプル中のネオスポラＤＮＡの存在または不存在を決定する方法の１つは、
サザン転移を含む。簡単に述べると、消化されたＤＮＡを緩衝液中のアガロース
・スラブゲル上で泳動し、膜に移す。同様な方法で、ＲＮＡサンプル中のネオス
ポラｍＲＮＡの検出のためにノーザン転移を用いることができる。ハイブリダイ
ゼーションは、ネオスポラ核酸と特異的にハイブリダイズする標識オリゴヌクレ
オチドプローブを用いて実施される。この目的に用いられる標識は、一般に免疫
アッセイに関して記載したものと同じである。ハイブリダイズした部分の可視化
によって、ネオスポラ遺伝子の存在または不存在の定性的測定が可能になる。
【００６４】 様々な他の核酸ハイブリダイゼーション様式が、当業者に公知である。例えば
、一般的な様式には、サンドイッチアッセイ、および競合または置換アッセイが
含まれる。ハイブリダイゼーション技術は、一般に、以下の文献に記載されてい
る："Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach," Ed. B.D. Hades a
nd S.J. Higgins, IRL Press, 1985; Gall & Pardue, Proc. Natl. Acad. Sci.,
USA, 63:378-383(1969); およびJohn et al., Nature 223:582-587(1969)。
【００６５】 サンドイッチアッセイは、核酸配列の検出または単離に有用な市販されている
ハイブリダイゼーションアッセイである。そのようなアッセイは、固体支持体に
共有結合によって固定された“捕獲(capture)”核酸および溶液中の標識“シグ
ナル”核酸を利用する。生物学的サンプルは、標的核酸を提供する。“捕獲”核
酸および“シグナル”核酸プローブは、標的核酸とハイブリダイズして、“サン
ドイッチ”ハイブリダイゼーション複合体を形成する。有効であるためには、シ
グナル核酸は、捕獲核酸とハイブリダイズすることはできない。
【００６６】 ハイブリダイゼーションアッセイの感度は、検出される標的核酸を増加させる
核酸増幅系を用いることにより強化し得る。そのような増幅系の例には、ポリメ
ラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）系およびリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）系が含まれる。
当分野で最近報告された他の方法は、核酸配列に基づく増幅法（NASBA(登録商標
)、Cangene, Mississauga, Ontario）およびＱベータレプリカ―ゼ系である。 ネオスポラ核酸を検出する代替的な手段は、in situハイブリダイゼーション
である。In situハイブリダイゼーションアッセイは周知であり、以下の文献に
概説されている：Angerer et al., Methods Enzymol., 152:649-660(1987)。In
situハイブリダイゼーションアッセイは、固体支持体（代表的には、スライドグ
ラス）に固定された細胞または組織を用いる。ＤＮＡがプローブされる場合、細
胞は熱またはアルカリで変性させる。続いて、細胞を中等度の温度でハイブリダ
イゼーション溶液と接触させ、標識ネオスポラ特異的プローブとアニールさせる
。プローブは、好ましくは、放射性同位元素または蛍光性レポーターで標識され
る。
【００６７】 上記のアッセイで使用される代表的な核酸配列には、本明細書に開示するｎｓ
ｓ−ｒＲＮＡ配列由来の配列が含まれる。例えば、実施例４に開示したプライマ
ーおよびプローブ配列を用いて、血液、脳脊髄液および胎児体液、並びに凍結ま
たはホルマリン固定した組織中の牛ネオスポラ核酸を増幅および同定することが
できる。これらのプライマーは、様々な動物宿主におけるネオスポラ症の診断お
よびネオスポラ寄生虫の発育段階（タキゾイト、ブラディゾイトおよびオオシス
ト）の源の同定に特に有用である。
【００６８】ネオスポラを含む医薬組成物 本発明は、生物学的に純粋な牛ネオスポラ培養物を提供する。そのような２つ
の培養物をＡＴＣＣに寄託し、ＡＴＣＣ登録番号７５７１０（ＢＰＡ１）、およ
びＡＴＣＣ登録番号７５７１１（ＢＰＡ６）を得た。 抗ネオスポラ・モノクローナル抗体またはそのフラグメント、並びにネオスポ
ラタンパク質またはそれらの免疫原性等価物を用いて調製した医薬組成物は、ネ
オスポラ感染の治療および／または予防のための様々な医薬調製物に用いること
ができる。 本医薬組成物は、代表的には、ネオスポラに感染したウシ、ヒツジ、ヤギ、お
よび他の動物のワクチン接種に用いられる。本発明の組成物はまた、オオシスト
の放出および、それに続くウシへの伝播を予防するよう固有宿主の治療に用いる
ことができる。ウシまたは固有宿主に投与される組成物は、タキゾイトおよび／
またはブラディゾイト抗原を含むことができる。
【００６９】 弱毒化ネオスポラワクチンは、免疫された動物のミルクまたは組織を万一消費
したとしても、ヒトが感染する危険性がないように使用できる。従って、好まし
いワクチンは、牛ネオスポラの抗原に対して抗体および細胞仲介免疫（ＣＭＩ）
を誘発するサブユニットワクチンである。実験的証拠によって、ＣＭＩはウシの
防御免疫反応の重要な成分であることが示された。選択した抗原に対するヘルパ
ーＴ細胞および細胞障害性Ｔ細胞反応の特異性をin vitroで評価する様々な方法
を用いることができる。更に、下記で示すように、培養物由来タキゾイトを用い
て感染させた乳牛は、防御免疫反応を開始し、胎児の経胎盤感染を予防する。
【００７０】 本発明のワクチンは、代表的には、経口的または非経口的に、通常は筋肉内ま
たは皮下に投与される。非経口投与のためには、抗原は好適な担体と混合され得
る。例えば、抗原は水、食塩水、または緩衝化ビヒクル中で様々なアジュバント
または免疫調節剤を付加し、または付加せずに投与できる。アジュバントは、例
えば、水酸化アルミニウム、燐酸アルミニウム、硫酸カリウムアルミニウム（ミ
ョウバン）、硫酸ベリリウム、シリカ、カオリン、炭素、油中水エマルション、
水中油エマルション、ムラミルジペプチド、細菌性内毒素、脂質、百日咳菌など
である。そのようなアジュバントは、様々な供給元から市販されている（例えば
、メルクアジュバント６（Merck and Company, Inc., Rahway, N.J.））。他の
適切なアジュバントは、ＭＰＬ＋ＴＤＭエマルション（RIBBI Immunochem Resea
rch Inc. USA）である。他の免疫刺激物質には、インターロイキン１、インター
ロイキン２およびインターフェロンγが含まれる。これらのタンパク質は、前記
ワクチン、またはワクシニアウイルスのような組換えワクチン系とともに機能的
オペロンとして提供されるそれらの対応する遺伝子配列と共に提供できる。抗原
とアジュバントの割合は、両者が有効量で存在する限り、広範囲にわたり変化し
得る。
【００７１】 本発明のワクチン組成物は、感染しやすいまたは感染のリスクのあるウシ、ヒ
ツジ、またはヤギに投与して抗原に対する免疫反応を誘発し、このようにして、
動物自身の免疫応答能力を高める。そのような量は、“免疫原的有効量”と定義
される。この使用において、正確な量は処方する獣医の判断によって変化し、更
に動物の健康状態、体重、投与方法、製剤の特性などが考慮されるであろう。一
般に１回の投与当たり、ネオスポラ抗原の濃度は、約１μｇから約１００ｍｇ／
ウシ宿主の範囲であり得る。ウシに投与するために好ましい範囲は、単位用量当
たり約１００μｇから約１ｍｇである。好適な投与サイズは、約１−１０ｍＬ、
好ましくは、１．０ｍＬである。従って、皮下注射のための代表的な投与量は、
例えば、０．１から１０ｍｇの抗原を含む１から２ｍＬを含むであろう。
【００７２】 様々なワクチン接種計画が、ウシおよび他の動物を免疫するのに有効であり得
る。好ましくは、雌ウシ（未経産雌牛および乳牛）を交配直前または交配時にワ
クチン接種して、流産を予防し、先天性感染の可能性を減少させる。第２回目の
免疫は、最初の免疫から２−４週間後に実施する。所望ならば、仔牛および雄の
成熟牛も、ワクチン接種され得る。既にネオスポラに曝露された動物または母牛
から初乳抗体を得た動物には、ブースター注射が必要であろう。ブースター注射
は、好ましくは、最大チャレンジおよび／または流産の危険性の時期と一致する
よう時間調節される。別の免疫計画も、獣医の判断に従って採用し得る。
【００７３】 本発明のワクチンは、ネオスポラタキゾイト、ブラディゾイトまたは他の発育
期のものの粗抽出物を含むことができる。化学的に固定された寄生虫または細胞
も用いることができる。上記のように、好ましいワクチンは、部分精製または完
全精製されたネオスポラタンパク質の調製物を含む。組換えＤＮＡ技術によって
作製した抗原は、他の源よりも経済的で、より容易に大量に精製できるので好ま
しい。 組換え発現システムでの使用の他に、単離したネオスポラ遺伝子配列はまた、
動物中の宿主細胞をトランスフェクトするウイルスを形質転換するのに用いるこ
とができる。生きた弱毒化ウイルス（例えば、ワクシニアまたはアデノウイルス
）は、生産が安価であり、輸送および投与が容易であるので、ワクチンとして好
都合な代替物である。
【００７４】 本発明の使用に適したウイルスには、ポックスウイルス（例えば、カプリポッ
クスウイルスおよび牛痘ウイルス）、ワクシニアウイルス、アルファウイルス、
アデノウイルスおよび他の動物ウイルスが含まれるが、但し、これらに限定され
ない。組換えウイルスは、当分野で周知の方法によって、例えば、相同組換えま
たは２つのプラスミド連結によって産生できる。組換えカナリア痘または牛痘ウ
イルスは、例えば、ネオスポラタンパク質またはそのフラグメントをコードする
ＤＮＡを、それらＤＮＡが両端でウイルス配列にフランキングされるようにプラ
スミドに挿入して作製され得る。続いて、相同組換えによって、ネオスポラポリ
ペプチドをコードするＤＮＡをウイルスゲノムに挿入する。 好ましくは、組換えワクシニアウイルス用いるウイルスワクチンが用いられる
。ワクシニアウイルスに組込まれたネオスポラタンパク質をコードする遺伝子を
利用して調製したワクチンは、組換えウイルスのストックを含み、ネオスポラタ
ンパク質をコードする遺伝子は、遺伝子発現に適した形態でウイルスのゲノムに
統合される。
【００７５】 （実施例） 実施例１ 本実施例は、ウシ流産胎児からのネオスポラの単離およびin vitro培養につい
て述べる。これら２つの培養株（BPA1およびBPA2）の単離は、文献に報告されて
いる（Conrad et al., Parasitol. 106:239-249(1993)。更に別の培養株（BPA３
−6）も、同じ技術を用いて単離された。但し、後者の場合は、１ｍｌ（２ｍｌ
ではなく）の脳または脊髄ホモジネートをトリプシン処理し、続いて一晩ではな
く２−４時間、細胞単層上でインキュベートした。更に、ウシの大動脈内皮細胞
系（ＣＰＡＥ：American Tissue Culture Collection #CCL209）は、牛ネオスポ
ラの培養に最良の単層細胞であることが判明した。これらの培養株の１つ（ＢＰ
Ａ６）は、マウスでブラディゾイトシストを誘発することが示された。
【００７６】 材料および方法 胎児組織の病理学的検査および免疫組織化学： California Veterinary Diagnostic Laboratory Systemに送られたウシ流産胎
児を、標準的技術を用いて剖検した。原虫感染が疑われる胎児の脳を、頭蓋から
無菌的に取り出した。脳の半分を、１０００Ｕ／ｍＬのペニシリンＧおよび１０
０μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含む無菌食塩水（０．８５％ｗ／ｖ）（抗
生物質添加食塩水）に取り出し、原虫感染の診断で確認が得られるまで４ＥＣで
保存した（原虫感染を確認したとき、in vitro培養のために処理される）。多く
の組織（脳、肝、腎、心、肺、脾、胃腸管、骨格筋、副腎、気管および胸腺の一
部分を含む）を各胎児から採取し、１０％の中性緩衝ホルマリン中で２４時間固
定した。固定された組織をトリミングし、パラフィン包埋して切片を作製し、ヘ
マトキシリンおよびエオシンで染色し、先に記載したように（Barr et al., Vet
. Pathol. 27:354-61(1990)）病巣および寄生虫の存在について光学顕微鏡で調
べた。
【００７７】 脳内に多病巣性ミクログリオーシスおよび／または壊死が認められる（原虫感
染を示唆する）胎児の脳組織切片で、寄生虫の存在について、抗ウサギ血清を用
いてアビジン−ビオチンペルオキシダーゼ複合体法により免疫組織化学的に更に
調べ、ウサギのポリクローナル抗Ｎ．カニナム血清の組織結合を検出した。用い
た免疫ペルオキシダーゼ法は、基本的には先に記載した通りである（Barr et al
., J. Vet. Diag. Invest. 3:39-46(1991)）が、但し、組織切片はマイクロプロ
ーブシステム（FisherBiotech, Pittsburgh, PA, USA）およびプローブ・オン（
Probe-On）スライドグラス（FisherBiotech）を用いて処理した。アミノエチル
カルバゾール（A.E.C. Substrate System, Dako, Santa Barbara, CA, USA）が
、色素源であった。
【００７８】 更に別のアピコンプレキサ門の原虫性寄生虫に対する抗血清との反応性を検査
するために、６６番目および９３番目の胎児（これ以降、胎児６６および９３と
呼ぶ）の脳の組織切片中の寄生虫を、同じ免疫組織化学的方法で更に特徴付けた
。組織切片を、以下の抗血清の最適希釈物とともに室温で１時間インキュベート
した：Ｎ．カニナムタキゾイトに対する１：１０００稀釈の抗血清（Lindsay &
Dubey, Am. J. Vet. Res. 50:1981-3(1989)）；ハンモンディア・ハンモンディ
組織シストに対する1：５０稀釈の抗血清およびＴ．ゴンディーに対する４つの
異なる抗血清（Ｔｇ１−４）。抗血清Ｔｇ１は、Ｔ．ゴンディーのＭＥ−４９株
（Lindsay & Dubey, 上掲書）の生きた胞子形成オオシストでウサギを感染させ
て得られ、１：４００希釈で用いた。トキソプラズマ・ゴンディー抗血清Ｔｇ２
（Dr. J.C. Boothroyd, Stanford University）は、Ｔ．ゴンディーのＲＨ株の
タキゾイト溶解物でウサギを免疫して得られ、１：３００の稀釈で用いた。抗血
清Ｔｇ３（BioGenex Laboratories, Dublin, CA, USA）およびＴｇ４（I.C.N. I
mmunobiologicals, Lisle, IL, USA）は、それぞれＲＨおよびＨ４４株のタキゾ
イトでウサギを免疫して作製された。抗血清Ｔｇ３は、製造元から供給された状
態で使用し、Ｔｇ４は１：８０稀釈で用いた。各抗血清について選択した最適稀
釈は、それぞれの陽性コントロール寄生虫に対して強い陽性反応を生じ、非特異
的なバックグラウンド染色はほとんど見られなかった。コントロール組織は、以
下のパラフィン包埋切片から成った：Ｎ．カニナムのタキゾイトを有するネズミ
脳、Ｔ．ゴンディーのシストを有するネズミ脳、Ｔ．ゴンディーのタキゾイトを
有するネズミ脾臓、Ｈ．ハンモンディのシストを有するネズミ骨格筋およびサル
コシスチス・クルジ（Sarcocystis cruzi）のシスト（Barr et al Vet. Path. 2
8:110-116(1991)）を有するウシ舌。
【００７９】 寄生虫の培養： ウシの心肺大動脈内皮細胞（ＣＰＡＥ：ATCC#CCL209）およびＭ６１７ウシマ
クロファージ（Speer et al., Infect. and Immun. 50:566-71(1985)）の定常単
層培養物を、ダルベッコ最少必須培地（ＤＭＥＭ：GIBCO Laboratories, Grand
Island, NY, USA）中で維持した。前記培地は、１０％（ｖ／ｖ）熱不活化ウシ
胎児血清（ＦＢＳ）または熱不活化成熟ウマ血清（ＨＳ）、２ｍＭのＬ−グルタ
ミン、５０Ｕ／ｍＬのペニシリンおよび５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを
補足されている（ＤＭＥＭ−ＦＢＳまたはＤＭＥＭ−ＨＳ）。ウシ胎児栄養膜細
胞（８７−３）を、既に報告（Munson et al., Tissue Cult. Methods 11:123-8
(1988)）されたようにＤＭＥＭ中で増殖させた。前記ＤＭＥＭには以下が補足さ
れていた：１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、５μｇ／ｍＬのトランスフェリン、５μｇ
／ｍＬのインスリン、５ｎｇ／ｍＬのセレン、１０ｎｇ／ｍＬの表皮増殖因子、
１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリンおよび０
．２５μｇ／ｍＬのアンホテリシンＢ（ＤＭＥＭ−ＦＢＳ*）。Ｔ．ゴンディー
のコントロール培養物（ＲＨ株、Dr. J. Boothroyd提供）およびＮ．カニナム（
ＮＣｌ；Dubey et al., J. Am. Vet. Med. Assoc. 193:1259-1263(1988)）は、
ＣＰＡＥおよびＭ６１７単層培養物中で維持した。寄生虫感染および非感染の単
層培養物を、５％ＣＯ2下で３７℃で、２５または７５ｃｍ2のフラスコ中で維持
した。培養培地は、毎週３回交換した。樹立された寄生虫培養物を、７０−９０
％の細胞が感染したときに、非感染単層に継代した。寄生虫を継代するためには
、感染単層をフラスコからかき取って培地に移し、２５ゲージの注射針を３回通
過させて細胞を破壊した。続いて、この細胞懸濁物を、新しい完全培地で１：２
から１：８に稀釈し、コンフルエントな非感染単層に添加した。
【００８０】 原虫感染を組織学的に確認した後、様々な期間４℃で抗生物質添加食塩水中に
保存していた胎児脳組織を、in vitro培養のために処理した。In vitroで単離物
が得られた全ての事例で、組織シストはウシ胎児脳の組織切片で観察された。約
２５ｍＬの抗生物質添加食塩水中で胎児脳の半分を乳棒と乳鉢ですりつぶし、滅
菌ガーゼで濾過した。脳ホモジネートの２ｍＬアリコートを、１０ｍＬの０．０
５％（ｖ／ｖ）トリプシンに入れ、３７℃で１時間インキュベートした。トリプ
シン処理後、この材料を６００ｇで１０分間遠心してペレット化した。上清を廃
棄し、ペレットをＤＭＥＭ−ＨＳまたはＤＭＥＭ−ＦＢＳの１−３ｍＬに再懸濁
させた。胎児６６からの脳は、送致から４８時間後に培養のために調製し、１ｍ
Ｌのトリプシン処理脳懸濁物を２５ｃｍ2フラスコのウシ８７−３栄養膜細胞に
分配した。胎児９３からの脳は、送致より１０日後に処理し、このとき、トリプ
シン処理脳の半分を２５ｃｍ2フラスコの８７−３栄養膜細胞に加え、残りを７
５ｃｍ2フラスコの内皮細胞に加えた。一晩インキュベートした後、両胎児から
の脳懸濁物をフラスコから除去し、５−１０ｍＬの新しい培地を添加する前に単
層を適切な培地で３回洗浄した。上記のように培養物を維持し、倒立顕微鏡で寄
生虫の存在を調べた。
【００８１】 in vitroでのタキゾイトの免疫組織化学： 流産ウシ胎児由来の２つのin vitro単離物の抗原反応性を、Ｔ．ゴンディーお
よびＮ．カニナムのコントロール培養物からのタキゾイトの反応性と比較した。
各単離物のタキゾイトを、対数増殖期に、感染ＣＰＡＥ単層を２５ｃｍ2の組織
培養フラスコからかき取ることによって回収した。単層細胞を、２５ゲージ注射
針を繰り返し通過させることによって破壊した。懸濁物を５μｍフィルターに通
して細胞破片を除去し、１５００ｇで１０分間遠心してペレット化した。上清分
画を除去した後、各単離物のペレット化したタキゾイトをＤＭＥＭ−ＨＳに再懸
濁し、４室を有する２つの組織培養スライド（Lab-Tek, Nunc, Naperville, IL,
USA）上の各ウェルに接種した。これらスライド上の４室の各々には、寄生虫接
種の２４−４８時間前にＣＰＡＥ細胞を播き、その結果、単層は感染時には６０
−８０％コンフルエントであった。適切なスライドに先ず、増殖の遅いウシ胎児
単離物を接種し、寄生虫を４８時間増殖させ、一方、Ｔ．ゴンディーおよびＮ．
カニナムの単離物は、免疫組織化学評価用に処理する２４時間前にスライド上で
培養した。
【００８２】 免疫組織化学検査のために寄生虫培養物を調製するために、培養上清を除去し
、単層はスライドグラスに付着させて残した。これらのスライドを、１００％メ
タノール（４℃）で１０分間固定し、完全に風乾してから、生理学的緩衝食塩水
（ＰＢＳ：ｐＨ７．２）中で５分ずつ３回洗浄し、メタノール中の過酸化水素（
３％、ｖ／ｖ）で１０分間インキュベートし、再度５分ずつ３回ＰＢＳで洗浄し
、２０％ヤギ血清で３０分間インキュベートして非特異的抗体結合部位をブロッ
クした。続いて、各スライドの３つのウェルには異なる一次抗血清、別の１つの
ウェルには陰性コントロールとして感染前ウサギ血清を加え、1時間インキュベ
ートした。同種培養物由来抗原に対して強力な陽性反応を得るが、非特異的なバ
ックグラウンド染色は殆ど認識されないように、最適な抗血清稀釈を選択した。
In vitroで寄生虫を染色するために用いられる抗血清の稀釈は、Ｎ．カニナムで
は１：３０００、Ｔｇ１では１：８００、Ｔｇ２では１：４０、Ｔｇ３では１：
１、Ｔｇ４では１：２０００で、Ｈ．ハンモンディでは１：５０であった。スラ
イドは、ＰＢＳ中で各５分間３回洗浄し、二次抗体および複合体は上記のように
組織切片に適用したが、但し、スライドは手動で処理し、色素原は２分間だけ用
いた。
【００８３】 結果： 第一の寄生虫単離物（ＢＰＡ１）は胎児６６から得られ、この胎児は妊娠約４
ヶ月と推定され、剖検時の死後状態は比較的良好であった。目立つ大きな病巣は
心外膜の巣状点状出血に限られていた。組織学的検査では、稀に不揃いなグリオ
ーシスの小病巣があり、胎児脳切片に５個の原虫シストが認められた。組織シス
トは直径が８から１０μｍの範囲で、少なくとも２５−４０個の密に詰まったブ
ラディゾイトを取り囲む明瞭な薄い壁（＜１μｍ）を有していた。更に、単核炎
症細胞の心臓、肝門脈および腎皮質全体への浸潤物が散在していた。肺では、マ
クロファージおよび好中球が肺胞隔壁内、細気管支の近傍に存在し、更に細気管
支および肺胞の管腔内に浮遊していた。大腸菌およびプロテウス亜種が、この胎
児の肺、肝、脾および第四胃の内容物から単離された。
【００８４】 第二の単離物（ＢＰＡ２）は、胎児９３から得られ、この胎児は、妊娠月齢が
ほぼ６ヶ月と推定され、中等度に自己溶解が進んでいた。組織学的検査では、脳
内のグリオーシスの少数の不ぞろいの病巣が明瞭であった。この病巣の近傍では
、毛細血管が顕著に肥厚した内皮を有していた。単核細胞による中等度のびまん
性髄膜浸潤も認められた。単核細胞は主としてリンパ球から成り、まれにプラズ
マ細胞が含まれていた。４つのランダムに位置する原虫の組織シストが脳中で認
められ、１つはグリオーシスの病巣の近傍に位置していた。シストは直径が８−
１３μｍで、少なくとも２５−５０個のブラディゾイトを含んでいた。シストの
うちの２個は、厚い（１−２μｍ）壁を有していた。巣状の混合単核炎症性細胞
の浸潤物も、骨格筋および腎皮質に認められた。
【００８５】 表１は、種々のポリクローナル抗血清による胎児６６および胎児９３の脳中の
原虫組織シストの免疫反応性の概要を示し、Ｎ．カニナム、Ｔ．ゴンディー、Ｈ
．ハンモンディおよびＳ．クルジの組織シストに対する抗原反応性が比較されて
いる。胎児６６および９３中の原虫シストは、Ｎ．カニナム抗血清と最も強く反
応し、Ｈ．ハンモンディ抗血清とは弱く反応した。両血清を用いると、シスト壁
が主に染色され、シスト内のスポロゾイトがいくらか染色された。全体として、
２頭のウシ胎児中のシストの反応性は、Ｔ．ゴンディーのタキゾイトもしくはシ
スト、Ｈ．ハンモンディのシストまたはＳ．クルジのシストの反応性よりも、Ｎ
．カニナムのタキゾイトの反応性に、より類似していた。
【００８６】
【表１】
【００８７】 約１４ヶ月間に、特に原虫性流産の疑いでカリフォルニアの酪農場から１００
頭を越える胎児が送られた。寄生虫の単離は、４９頭の胎児からの脳を用いて試
みられ、免疫組織化学検査によって同定されたネオスポラ様原虫を有していた。
これらの培養物中の寄生虫増殖の第一の証拠は、胎児６６からの脳組織の接種か
ら３４日後に、８７−３細胞系で検出された（単離物ＢＰＡ１）。次のIn vitro
単離物の成功は、胎児９３からの脳組織の接種から１５日後に、８７−３細胞系
およびＣＰＡＥ培養物でタキゾイトが最初に観察されたときであった（単離物Ｂ
ＰＡ２）。両方の単離物の培養で、寄生虫は最初、対を形成するかまたは不ぞろ
いの群として小さなクラスターの細胞内タキゾイトとして出現した。細胞外タキ
ゾイトはウシの細胞単層から離れ、培養培地中を滑走し、ねじれながら移動して
いるのが見られた。感染された単層のギムザ染色（塗抹標本上）では、細胞外タ
キゾイトは、核では幅が１．５−２．５μｍで長さが６−８μｍであった。タキ
ゾイトクラスターの数および各クラスター中のタキゾイトの数は、持続的な寄生
虫増殖として樹立されるにつれ、培養物中で徐々に増加していった。一般に、寄
生虫のクラスターは、約１０−１００個のタキゾイトを含んでいた。両単離物の
増殖は、８７−３、ＣＰＡＥ、またはＭ６１７の培養物中で維持された。しかし
ながら、最も良好な増殖は、８７−３およびＣＰＡＥ培養物で観察された。樹立
させてから２−３ヶ月以内に、ウシ単層細胞の約８０−９５％がタキゾイトに感
染したときはいつでも毎週継代した。ルーチンには、ＢＰＡ１およびＢＰＡ２樹
立培養物は、注射針を通過させた単層を新しい培養液に１：８稀釈したものを、
非感染ウシ単層培養物に添加することによって継代した。比較すると、当研究室
では、Ｔ．ゴンディー培養物（ＲＨ単離物）は、ルーチンには１：２００稀釈で
継代され、Ｎ．カニナム培養物（ＮＣ−１単離物）は、１：１０稀釈で２−３日
毎に継代された。1992年5月中旬の時点で、ＢＰＡ１およびＢＰＡ２単離物の培
養物は、それぞれ１０ヶ月および６ヶ月間持続的増殖を維持している。 ＢＰＡ１およびＢＰＡ２のin vitro培養タキゾイトと、培養されたＮ．カニナ
ムおよびＴ．ゴンディーのタキゾイトの抗原性比較の結果は、表２に示されてい
る。種々の抗血清に対するウシ胎児単離物の反応は、Ｎ．カニナムによって示さ
れる反応に類似し、Ｔ．ゴンディーのタキゾイトで観察される反応性とは明らか
に異なっていた（表２）。
【００８８】
【表２】
【００８９】 透過型電子顕微鏡によれば、単離物ＢＰＡ１およびＢＰＡ２のin vitroタキゾ
イトは、形態学的に類似していた。従って、以下の超微細構造は両単離物に当て
はまる。多数のタキゾイトのうちの個々のタキゾイトまたはクラスターは、通常
は、ウシの単層細胞の細胞質中の寄生虫小胞内に存在していた。タキゾイトは、
細胞膜下の２枚の内膜から成る薄膜、タキゾイトの中央または後部に存在する隆
起した核、１から３個の長い管状稜状のミトコンドリア、ゴルジ装置、粗面およ
び滑面小胞体、単層または多層膜小胞、および多数の遊離リボソームを有した。
アピコンプレキサ門の寄生虫に特徴的な先端の超微細構造が、両単離物のタキゾ
イトで見られた。この特徴には、２２本の縦軸方向に伸びる薄膜下微小管を生じ
る極環、前記極環内の円筒形または円錐形の円錐小体および多数の電子密度の高
いロプトリー(rhoptry)が含まれる。個々のタキゾイトで認められるロプトリー
の数は大きく変動し、切断面にある程度依存した。最大２４個のロプトリーが、
横に切断したタキゾイトの先端部で数えられた。ロプトリーは、タキゾイトの核
から後方では認められなかった。縦軸切片では、ロプトリーは、伸長した棍棒形
の構造物で、円錐小体の中に伸びる細くて密度の高いネックを有した。１４−３
２個の電子密度の高い小体が、主として核の後方に観察された。これら密度の高
い小体のうち少数が、核の前方に認められた。ロプトリーとは異なり、密度の高
い小体は一般に、縦軸方向の切片では球形または卵形であった。多くの短系がタ
キゾイトの前端部に見られ、核の後方に認められるのは極めて稀であった。短系
は、極めてしばしば、統制された隊列またはシートとして配置されていた。この
配置は、タキゾイトの薄膜または縦軸に平行であった。その数は個々のタキゾイ
トで大きく変化したが、選択したタキゾイトの長軸または斜めの切片では６０−
１００個もの短系を数えた。更に、ただ１つの微小孔（核の前方に位置する）が
、幾つかのタキゾイトで認められた。寄生虫は母細胞内二細胞発育によって増殖
し、多くのものが１つのタキゾイト中に２個の娘虫体を形成する過程にあった。
稀に、完全な核を有する４個の娘虫体が分割中であるのが観察されたが、これら
は後部末端でなお互いに結合していた。
【００９０】 検査後、ウシからネオスポラ様の原虫性寄生虫をin vitro単離する努力を重ね
て、これら寄生虫はカリフォルニアの酪農場のウシにおいて診断を下された流産
の主要な原因であることが判明した。組織学的には、これら２頭のウシ胎児（単
離物は、1991年にそれから初めて得られた）は、多巣状非化膿性脳炎および、原
虫の組織シストを含む該当する病巣を有しており、これらの病巣は、ネオスポラ
様原虫の他の自然感染でウシ胎児に見られる病巣と類似していた。胎児６６およ
び胎児９３の脳内の組織シストの免疫学的反応性も、自然感染胎児のシストの多
くで観察されるものと類似しており、Ｎ．カニナムおよびＨ．ハンモンディ抗血
清と強く反応し、時にＴ．ゴンディー抗血清の幾つかと反応した。
【００９１】 流産ウシ胎児からのこれらネオスポラ様原虫性寄生虫の単離は、胎児が一般に
流産時に中等度または重度に自己溶解し、原虫の組織シストが比較的低い率で感
染胎児に存在するために、困難であった。以前の超微細構造実験によって、これ
ら胎児組織中の原虫シストのほとんどが自己溶解の影響を受け、おそらく生存可
能性を有しないと思われた（Barr et al., Vet. Path. 28:110-16(1991)）。単
離物が得られた２頭の胎児は、死後の状態が比較的良好であった。この事実と、
これら胎児に存在していたシストの数が比較的多かったことが、原虫性寄生虫の
単離が成功したことの重要な要因であった。更に、この単離方法を改変した。特
に、培養用脳材料の調製の際にトリプシン処理をより長時間行うこと、単層上で
脳ホモジネートを一晩インキュベートすること、および最初の寄生虫単離物のた
めに８７−３ウシ栄養膜細胞系を使用することが、これらの方法における改変で
あり、これらの改変は、ＢＰＡ１およびＢＰＡ２単離物を得るために特に役立っ
たようである。寄生虫の増殖は、８７−３およびＣＰＡＥ単層細胞中で最も良好
に維持された。これは、Ｎ．カニナムおよびハンモンディア・ヘイドルニ（Hamm ondia heydorni）と対照的で、これらはウシ単球細胞中でより良好に増殖すると
報告されている（Speer et al., Infect. and Immun. 50:566-71(1988)）。 これらのウシ原虫単離物を、マウス脳で再単離したＴ．ゴンディーおよびＮ．
カニナムの単離物と比較したとき、ウシ原虫単離物は、単離時および持続増殖樹
立後よりもゆっくりと増殖することが見い出された。このことは、この生物体の
毒性の相違を反映しているのか、または培養に対する馴化の相違であるのか未だ
明らかではない。
【００９２】 光学顕微鏡によれば、ウシ単離物のタキゾイトは、Ｔ．ゴンディーおよびＮ．
カニナムのin vitroタキゾイトと形態学的に類似していた。ウシ単離物の培養タ
キゾイトは、Ｎ．カニナムのタキゾイトと類似の免疫組織化学反応を示し、Ｎ．
カニナム抗血清とは強く、血清Ｔｇ１とは弱く反応した（血清Ｔｇ１は、Ｔ．ゴ
ンディーのタキゾイト溶解物でウサギを免疫して得られたものである）。これら
の抗原反応は、Ｔ．ゴンディーの培養物由来タキゾイトで見られた反応と明らか
に異なっていた。供給源の胎児の組織シストの抗原反応性と比較したとき、培養
されたＢＰＡ１およびＢＰＡ２タキゾイトの抗原反応性における相違は、抗血清
を作製するために用いた方法における異なる寄生虫および変異種の発育期特異的
抗原発現（すなわちシスト、オオシストまたはタキゾイト溶解物による免疫）に
よって説明できた。例えば、Ｈ．ハンモンディに対する抗血清と反応する組織シ
ストの壁の抗原は、in vitroのウシ単離物のタキゾイト上には欠落しているよう
に見えた。残念ながら、タキゾイトは２頭のウシ胎児の脳では同定されず、真の
シストはＢＰＡ１またはＢＰＡ２培養物では観察されなかったので、異なる寄生
虫発育期の直接的な比較は、常に可能というわけではなかった。同様に、Ｎ．カ
ニナムの組織シストおよび培養物由来Ｈ．ハンモンディのタキゾイトは、比較の
ために入手可能ではなかった。抗原発現における相違は、宿主特異的因子によっ
ても影響を受け得る。この可能性を調べるために、Ｎ．カニナムまたはウシ単離
物を実験的に感染させたウシ、イヌ、ラット、ネコ、およびマウスから材料を得
て、同じ宿主種中の寄生虫の抗原反応性を直接比較する試みが為されている。
【００９３】 これまでのところ、２頭の流産ウシ胎児からのin vitro単離物の特徴付けによ
り、これらの寄生虫は、抗原的におよび／または超微細構造的に、Ｔ．ゴンディ
ー、Ｈ．ハンモンディ、Ｓ．クルジ、ベスノイチア（Besnoitia）亜種、および
フレンケリア（Frenkelia）亜種とは区別されることが示された。これらの単離
物は、米国およびスカンジナビアで最も広く研究されてきたＮ．カニナム寄生虫
と極めて類似する。これらの寄生虫間の類似性は、ＢＰＡ１およびＢＰＡ２単離
物がネオスポラ属に属することを示している。現在のところ、イヌまたはウシ中
でのこれらネオスポラ寄生虫の生活環（固有宿主を含む）については、殆ど分か
っていない。これら寄生虫の生物学のより深い理解が、互いの及び他のアピコン
プレキサ門寄生虫との分類学的関係を決定するために必須である。
【００９４】 実施例２ 本実施例では、ネオスポラ寄生虫に自然感染した又は実験的に感染させたウシ
における、寄生虫特異的抗体反応を検出するための間接蛍光抗体（ＩＦＡ）検査
について述べる。ここで用いた方法は、一般に、Conrad et al（J. Vet. Diagn.
Invest. 5:572-578(1993)）に記載される通りである。
【００９５】 材料および方法 寄生虫および抗原スライドの調製： 抗原スライドは、上記で述べたＢＰＡ１のタキゾイトを用いて調製した。培養
培地は、以下を補足したダルベッコ最少必須培地（ＤＭＥＭ）から成った：１０
％（ｖ／ｖ）熱不活化成熟ウマ血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、５０Ｕ／ｍＬの
ペニシリン、および５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（ＤＭＥＭ−ＨＳ）。
トキソプラズマ・ゴンディー（ＲＨ単離物；Dr. J. Boothroyd提供）のタキゾイ
トを、同じ培地（但し、１０％(ｖ／ｖ)熱不活化ウシ胎児血清をウマ血清の代わ
りに用いた）で増殖させたＣＰＡＥ単層から得た。寄生虫感染培養物を、５％Ｃ
Ｏ2雰囲気下で３７℃でインキュベートした２５または７５ｃｍ2フラスコ内で維
持した。
【００９６】 培養フラスコ内のＣＰＡＥ細胞の約８０％がタキゾイトのクラスターで感染さ
れたとき、寄生虫を抗原調製のために回収した。感染された単層を、培養培地中
にかき取ってフラスコから取り出し、続いて２５ゲージ注射針に３回通して細胞
を破壊した。懸濁液を、５μｍフィルターに通して細胞破片を除去し、１３００
×ｇで１０分間遠心してタキゾイトをペレット化した。上清を除去した後、ペレ
ットを滅菌燐酸緩衝食塩水（ＰＢＳ；ｐＨ７．２）で２回洗浄し、続いて改変Ｐ
ＢＳ食塩水（１３７ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＫＣｌ、３ｍＭのＮａ3Ｃ6Ｈ5Ｏ7 ．２Ｈ2Ｏ、０．４ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4．Ｈ2Ｏ、１２ｍＭのＮａＨＣＯ3、６ｍ
Ｍのグルコース）に再懸濁して、最終濃度を約２０００個のタキゾイト／μＬと
した。タキゾイト懸濁液のアリコート（１０μＬ）を、１２ウェルの重テフロン
（登録商標）被覆（ＨＴＣ）抗原スライド上の各４ｍｍのウェルに分配した。ス
ライドを室温で風乾し、−７０℃で保存した。
【００９７】 ウシ： 検査用血清は、ネオスポラ感染胎児を流産した自然感染した乳牛、および先天
的に感染させた仔牛から得た。更に、ＣＰＡＥ培養物由来のＢＰＡ１単離物のタ
キゾイトで、妊娠約１２０日に実験的に感染させた２頭の妊娠中の未経産雌牛か
ら血清を得た。タキゾイトは、抗原調製のためのタキゾイト回収で述べた方法を
用いて培養物から得たが、但し、寄生虫はＰＢＳ中で洗浄せず、各未経産雌牛に
静脈内投与する接種分のみ濾過して細胞破片を除いた。遠心後、タキゾイトをＤ
ＭＥＭに再懸濁し、３×１０6個のタキゾイトが静脈内に、５×１０6個のタキゾ
イトが筋肉内に投与されるよう各未経産雌牛に接種した。同じ群れの同じ妊娠期
間のコントロール未経産雌牛には、等量の非感染ＣＰＡＥ細胞培養材料を接種し
た。非感染材料は、感染された未経産雌牛について実施したものと同じ手順で調
製し投与した。自然感染または実験的感染は、ネオスポラタキゾイトおよび／ま
たは組織シストを、免疫ペルオキシダーゼ検査法（Anderson et al., J. Am. Ve
t. Med. Assoc. 198:241-44(1991)およびBarr et al., Vet. Path. 28:110-116(
1991)）を用いて胎児組織または孔牛組織で同定して確認した。
【００９８】 ネオスポラ感染牛からのサンプルの血清学的比較のために、更に別の以下の供
給源から血清を得た：１）ネオスポラ感染に典型的な病巣または寄生虫をもたな
い胎児を流産した乳牛、２）ネオスポラ感染が疑われたが、死後の組織病理学的
検査で病巣または寄生虫が確認されなかった虚弱仔牛、３）ネブラスカ州トッド
郡の屋内飼育肉牛群から乳離れ仔牛として購入され、Agricultural Research De
velopment Center, University of Nebraska-Lincoln(Mead, Nebraska)で放牧状
態で厳密に隔離して維持した２０頭の未経産雌牛、４）カリフォルニアの牧草地
で維持された２０頭の妊娠した未経産雌牛、および５)最初は放牧され、その後
で実験的に感染された未経産雌牛と同じ飼育用地で維持された２１頭の肉牛用成
熟雄牛または乳牛。
【００９９】 血清採取および検査： 検査用血清およびコントロール血清は、抗凝固剤を使用せず、静脈穿刺によっ
て真空試験管中に回収した血液サンプルから得た。４℃で２−1２時間保存した
後、血液を５００×ｇで1０分遠心して血清を取り出した。血清は、４℃で＜４
８時間保存するか、または検査まで−７０℃で凍結した。 抗原スライドは、使用直前に室温で解凍した。血清は最初、１：４０から１：
４０，９６０まで２倍稀釈で滴定して最終力価を求めた。１０μＬの稀釈された
検査用血清またはコントロール血清を、抗原スライド上の別々のウェルに入れた
。スライドを湿潤チャンバー中で３７℃で1時間インキュベートし、ＰＢＳ中で
各５分間３回洗浄し、次に軽くたたいて余剰のＰＢＳを除去した。蛍光標識した
アフィニティー精製ウサギ抗ウシＩｇＧ（ＰＢＳで１：５００に稀釈）を、各ウ
ェルに１０μＬアリコートで加えた。スライドを３７℃で３０分インキュベート
し、各回５分間３回ＰＢＳで洗浄し、軽くたたいて余剰のＰＢＳを除き、緩衝グ
リセロール（トリス−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）中２５％（ｗ／ｖ）グリセリン）を
用いてカバースリップで覆いながら、蛍光顕微鏡により２００倍で調べた。最終
力価は、明瞭で完全な寄生虫蛍光を示す最終血清稀釈であった。
【０１００】 結果 自然感染： ６４頭の雌牛から流産時に回収した血清を、ＩＦＡ検査法を用いてネオスポラ
抗原(単離物ＢＰＡ−1)に対する血清学的反応性について調べた。これらの乳牛
のうち５５頭からの流産胎児は、非化膿性脳炎および／または心筋炎を示し、そ
れは原虫感染と一致した。更に、ネオスポラのタキゾイト期および／またはシス
ト期が、これら５５頭の胎児組織で免疫組織化学的に同定された(表３)。残りの
９胎児では、脳炎および／または心筋炎の徴候はなく、原虫性寄生虫も確認され
なかった。ネオスポラ感染胎児を流産した雌牛の全てが、ネオスポラ抗原に対し
て３２０から５１２０の力価を示した(表３)。ネオスポラ寄生虫が検出されない
胎児を流産した雌牛のうち、８頭は♯１６０の力価を示し、１頭は３２０の力価
を示した。
【０１０１】
【表３】
【０１０２】 ネオスポラ感染胎児を流産した雌牛のうち６頭は、４つの元の酪農場で維持さ
れ、その結果、これらの雌牛はネオスポラ力価の変化を調べるために、６から１
２ヶ月間にわたり繰り返し検査することができた。全ての雌牛で、流産後最初の
２０日以内に６４０から２５６０の最高力価が認められた（図１および２）。そ
の後、雌牛のうち４頭の力価は６４０に低下し（図１、雌牛９、９７０および５
２２；図２、雌牛５７８）、一方、雌牛３（図１）および雌牛１３２８（図２）
の力価は、流産後１５０日以内に１６０に低下した。雌牛５７８および１３２８
は再交配され、ネオスポラ感染胎児を流産してから約５０から７０日以内に再び
妊娠した。雌牛が約４から５ヶ月の妊娠期間にあるとき、それらのネオスポラ力
価は最初の最高レベル（１２８０）に増加し、妊娠期間満了の仔牛を出産するま
でこのレベルが維持された(図２)。雌牛１３２８から生まれた仔牛の牛ネオスポ
ラ単離物に対する初乳前の力価は２０４８０で、雌牛５７８から生まれた双子の
仔牛の初乳前の力価は共に１０２４０であった。２から６日齢の死後剖検では、
これらの仔牛は、中等度の非化膿性脳脊髄炎または脳実質内の巣状単核細胞浸潤
を示した。ネオスポラ組織シストは、３頭の仔牛全てで炎症病巣に付随して認め
られた。安楽死前に各仔牛から採取した初乳後血清の力価は、その初乳前力価と
同じであった。
【０１０３】 更に別の４頭の仔牛についても血清力価を測定して、ＢＰＡ１牛ネオスポラ単
離物に対する抗血清と免疫組織化学的に反応する、脳および／または脊髄中の特
徴的なシスト段階の存在に基づき、先天性ネオスポラ感染と診断された。ネオス
ポラを、仔牛１−３の脳および／または脊髄から単離し、寄生虫を、先に記載し
た流産ウシ胎児からネオスポラを単離する方法を用いて持続的にin vitroで増殖
させた。死後剖検時に、仔牛１および２の力価は２０４８０で、仔牛３の力価は
１０２４０で、仔牛４の力価は５１２０であった。仔牛４の母牛から出産時に採
取した血清のネオスポラ力価は２５６０であった。初乳前の仔牛血清および仔牛
１−３の母牛の血清は、検査用には入手できなかった。
【０１０４】 ネオスポラ感染が確認された７頭の先天的に感染した仔牛で見られた力価は、
ネオスポラ感染が疑われたが死後検査で特徴的な病巣または寄生虫の組織病理学
的証明が得られなかった、４週と１−５日齢の仔牛の血清で得られた力価よりも
顕著に高かった。これらの非感染仔牛のうち１頭の牛ネオスポラ抗原に対する力
価は１６０で、一方、他のものの力価は＜８０であった。これらの仔牛が初乳を
与えられたか否かは不明である。
【０１０５】 実験的感染： ４３日目の実験的接種の前に３頭の妊娠した未経産雌牛から繰り返し採取した
血清サンプルの、ネオスポラＢＰＡ１抗原に対する力価は＜８０であった。ＢＰ
Ａ１ウシ単離物の培養物由来タキゾイトで感染させた２頭の未経産雌牛は、寄生
虫接種後９日までに６４０のネオスポラ力価を、１８日までに１２８０の力価を
生じた(図３)。非感染細胞培養材料を接種された未経産雌牛は、実験を通して、
ネオスポラ抗原に対し＜８０の力価を示した。この雌牛を接種後３２日で安楽死
させ、胎児を取り出した。この胎児はこの時点で生存可能であり、組織学的に正
常で感染しておらず、ネオスポラに対する力価は検出されなかった。感染した未
経産雌牛の両方で、最高の力価が寄生虫接種後３２日に検出され、この時点で、
未経産雌牛４１３の胎児を帝王切開で取り出した。組織学的に、この胎児は、中
枢神経系に炎症性病巣および多くのネオスポラタキゾイトを示した。更に、ネオ
スポラタキゾイトが胎児組織から単離され、細胞培養中で持続的に増殖された。
胎児から採取した血清は、ネオスポラ抗原に対して６４０の力価を示した。この
胎児を取り出した後、未経産雌牛４１３のネオスポラ力価は、感染後１９３日ま
で１２８０と５１２０の間を上下し、その後、力価は６４０に低下した(図３)。
未経産雌牛４１６は、寄生虫接種から１５８日後に出産し、この時点で母牛のネ
オスポラ力価は１２８０であった（図３）。この仔牛の初乳前ネオスポラ力価は
１０２４０で、この値は、母牛の初乳を摂取後２日して採取したサンプルの力価
と同じであった。臨床的に、２日齢で安楽死させる前に調べたとき、四肢全てに
おいて意識的固有受容能が低下していた点を除き、この仔牛は外見上正常であっ
た。中枢神経系には巣状グリオーシスから成る極めて小さな組織学的病巣があっ
たが、寄生虫は胎児組織中に検出されなかった。
【０１０６】 非感染ウシ： ネオスポラ感染歴のない６１頭の被検成熟ウシのうち５３頭（８７％）が力価
♯８０を示し、１頭を除く残りの全てが、ネオスポラとトキソプラズマ抗原の両
方に対して力価♯１６０を示した(表４)。移送された後に飼育用地で維持された
放牧牛は、牧草地で維持された牛よりも、牛ネオスポラまたはトキソプラズマ・
ゴンディーのタキゾイトに対する血清学的力価は高くなかった。感染牛または非
感染牛から得た全サンプルの最終力価測定は、常に全タキゾイト蛍光を基準にし
た。しかしながら、見かけ上非感染の動物を調べたとき、雌牛のうち３頭および
雄牛のうち７頭（これらはカリフォルニア大学、デーヴィス校の飼育用地（ＵＣ
Ｄ肥育場）に収容されていた）からのサンプルは、寄生虫の先端部分に限定され
る寄生虫蛍光を示した。この反応は７頭の雄牛の血清で特に目立ち、これらの血
清はネオスポラとトキソプラズマの両方に対して１６０から３２０の先端部蛍光
力価を示す一方、全寄生虫蛍光力価は♯８０であった。
【０１０７】
【表４】
【０１０８】 図４は、６１頭の非感染成熟牛プラス９頭の乳牛（ネオスポラ感染の証拠のな
い胎児を流産した）の血清学的力価を、ネオスポラ感染された乳牛の流産時また
は出産時の力価と比較している。感染ウシの大半は、ネオスポラに対して＄１２
８０の力価を有し、感染の証拠のないウシの大半は、力価が♯１８０であったが
、力価が１６０から６４０の範囲にある群では幾らかのオーバーラップが見られ
た(図４)。
【０１０９】 実施例３ 本実施例は、ｎｓｓ−ｒＲＮＡをコードするＤＮＡ（配列番号１）の単離につ
いて述べる。 寄生虫： ＤＮＡ単離には、牛ネオスポラ単離物ＢＰＡ−１、ＢＰＡ−２、ＢＰＡ−３、
ＢＰＡ−４、ＢＰＡ−５を用いた。寄生虫は、＞８０％のＣＰＡＥ細胞が大きな
クラスターのタキゾイトに感染したとき、ＤＮＡ調製のために回収した。感染さ
れた単層を、フラスコからかき取って出した。組織培養培地中のタキゾイトを、
室温で１３００×ｇで１０分間遠心してペレット化した。上清を除去し、ペレッ
トを１０ｍＬの滅菌緩衝生理食塩水（ＰＢＳ：ｐＨ７．４）に再懸濁し、２５ゲ
ージ注射針に３回通してＣＰＡＥ細胞を破壊し、続いて、５μｍの円盤フィルタ
ー（Gelman Science, Acrodisc）に通して細胞破片を除去した。この濾過された
物質を1３００×ｇで１０分間遠心してペレット化し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中
で洗浄した。上清を除去し、タキゾイトのペレットは使用するまで−７０℃で保
存した。非感染ＣＰＡＥ単層を同じ方法で処理し、コントロールとして使用した
。
【０１１０】 ２つの方法を用いて、タキゾイトおよびコントロールＣＰＡＥ細胞からＤＮＡ
を調製した。先ず、ＤＮＡを以下のように調製した。簡単に述べると、寄生虫ま
たはコントロールの細胞ペレットを、０．５％ＳＤＳを含む１．０ｍＬのＳＴＥ
に懸濁し、プロテイナーゼＫ（１００μｇ／ｍＬ）およびＲＮＡase（１００μ
ｇ／ｍＬ）で処理し、続いて、フェノールで２回、フェノール−クロロホルム−
イソアミルアルコールで１回、更にクロロホルム−イソアミルアルコールで１回
抽出した。その後、ＤＮＡをエタノールで沈殿させ、乾燥させて、ＴＥ緩衝液に
再懸濁した。他のＤＮＡサンプルは、イソクイック（Isoquick）ＤＮＡ抽出キッ
ト（Microprobe, Corp., Garden Grove, Calif.）を用いて、製造元の指示に従
い調製した。
【０１１１】 ＤＮＡ調製物は、０．５Ｍトリス／ホウ酸／ＥＤＴＡ（ＴＢＥ）緩衝液（８９
ｍＭのトリス、８９ｍＭのホウ酸、２ｍＭのＥＤＴＡ）中の０．８％（ｗ／ｖ）
アガロース（FMC Bioproducts）ゲル中で電気泳動し、臭化エチジウム（０．５
μｇ／ｍｌ）でゲル染色し、紫外（ＵＶ）光下で調べた。
【０１１２】 rRNA遺伝子配列の増幅： DNA配列は、プログラミング可能な温度サイクラー（Perkin-Elmer）を用いて
、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって増幅した。反応は、５０から１００μＬ
容量のサンプルで実施した。前記サンプルは、以下を含む：約５０−１００ｎｇ
のＤＮＡ鋳型、５０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ８．３）、１．０ｍＭのＭｇＣｌ 2 、各々２００ｍＭの４種のデオキシヌクレオシド三燐酸、０．５ＵのＴａｑポ
リメラーゼ（Promega）、および１００ｐＭの普遍プライマーＡ（５’ＣＣＧＡ
ＡＴＴＣＧＴＣＧＡＣＡＣＣＴＧＧＴＴＧＡＴＣＣＣＣＧＡＣＧＡＣＣＧＴＧＧ
ＴＣＴＧＡＡＣＧＧＧＡＧ’（配列番号２）および、プライマーＣ（５’ＧＧＧ
ＣＣＣＴＡＧＧＴＧＧＣＧＣＣＧＡＣＧＡＣＣＧＴＧＧＴＣＴＧＡＡＣＧＧＧＡ
Ｇ３’(配列番号３)。ＰＣＲサイクルパラメーターは、９４℃で３分のシングル
ステップ、続いて、９４℃で1分の変性、５５℃で１分のアニーリング、および
７２℃で２分の伸長(最終伸長工程は７分)の３０サイクルから成った。ＰＣＲ増
幅産物は、ｎｓｓ−ｒＲＮＡ遺伝子の５’末端から約５５０−ｂｐ配列であった
。ｎｓｓ−ｒＲＮＡ遺伝子のより長い１．８ｋｂ配列を、普遍プライマーＡおよ
びプライマーＢ（５’ＣＣＣＧＧＧＡＴＣＣＡＡＧＣＴＴＧＡＴＣＣＴＴＣＴＧ
ＣＡＧＧＴＴＣＡＣＣＴＡＣ３’（配列番号４））を用いて、ＢＰＡ１ ＤＮＡ
から増幅させた。
【０１１３】 これらの反応は、５０μＬの反応サンプルを用いて実施した。前記反応サンプ
ルは、以下を含んでいた：１００ｐＭの各プライマー、１ｍＭのＭｇＣｌ2、５
０−１００ｎｇの鋳型ＤＮＡ、５０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ８．３）、１．０
ｍＭのＭｇＣｌ2、各々２００ｍＭの４種のデオキシヌクレオシド三燐酸（ｄＡ
ＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）、および０．５ＵのＴａｑポリメラ
ーゼ（Promega）。増幅サイクルは、以下のように実施した：９４℃で３分の最
初の変性ステップ、続いて、９４℃で１分の変性、５５℃で１分のアニーリング
、および７２℃で４分の伸長(最後の伸長工程は７分)を４５サイクル。両方の増
幅反応のために、定常ＣＰＡＥ細胞ＤＮＡを陰性鋳型コントロールとして用いた
。滅菌水を、ＰＣＲ反応条件コントロールに用いた。各ＰＣＲ産物のアリコート
は、３％（ｗ／ｖ）ヌシーブ（NuSieve）、１％（ｗ／ｖ）シーケム（SeaKem）
アガロースゲル（FMC BioProducts, Rockland ME）による電気泳動、臭化エチジ
ウムによる染色、およびＵＶ光下での可視化後に、ＤＮＡ標準物（Bioventures,
INC. TN）と比較してサイズ決定した。
【０１１４】 ３から５つの反応から得た増幅産物を、精製前にプールし、新規に合成された
相補鎖の伸長ステップの間にＴａｑポリメラーゼによる任意のヌクレオチド誤取
込みによるエラーの可能性を排除した。ＰＣＲ増幅産物を、ゲル電気溶出または
スピンカラムのいずれかによって精製した。２つの異なるスピンカラムを、別々
の時期に用いた。最初に、マジックＰＣＲプレップＤＮＡ（Magic PCR Prep DNA
）精製システム（Promega Corp.）を、製造元の指示に従って使用した。簡単に
述べると、生成物を低温溶融アガロース（Low Melt Agarose, FMC BioProducts
）で電気泳動した。このＤＮＡを臭化エチジウム染色によってゲル内で可視化し
、ＤＮＡバンドをエッペンドルフ試験管中に切り出した。アガロースとＤＮＡを
加熱（７０℃）して、アガロースを溶融させた。カラムおよびキットとして提供
された試薬を用いて、ＤＮＡをアガロースから分離した。後には、より簡単で時
間を要しない集約的方法を用いた。この方法は、電気泳動および低温溶融アガロ
ース中の生成物の切り出しを必要としないＰＣＲセレクトＩＩ（5 Primer-3 Pri
me, Inc）カラムを用いて、ＰＣＲ産物を精製するものである。
【０１１５】 精製ＰＣＲ産物のＤＮＡ配列決定は、ＰＣＲサイクル配列決定システム（BRL
dsDNA Cycle Sequencing System）に関する製造元の指示に従って実施した。サ
イクルパラメーターは、９５℃で３分の完全な変性後に、２工程プログラムから
成った。最初のプログラム工程では、変性３０秒、アニーリング３０秒、および
伸長１分を含む、２０サイクルを用いてＤＮＡを増幅させた。第二のプログラム
工程では、変性（９５℃）および伸長（７２℃）のみを交互に入れ替えた。最初
に、普遍プライマー（Ａ、CまたはＢ）を用いて、その情報から内部プライマー
を構築し得る第一のヌクレオチド配列データを得、これを用いて内部配列を増幅
した。全ての配列決定用プライマーを、アデノシン５’［γ32Ｐ］三燐酸（Amer
sham）で５’標識した。反応物を、６％（ｗ／ｖ）または８％（ｗ／ｖ）のいず
れかのポリアクリルアミド、８Ｍ尿素（厚さ０．４ｍｍ）非濃度勾配ゲルにロー
ドする前に、９５℃で５分間加熱した（モデルＳ２シークェンシングゲル装置（
GIBCO BRL. Gaithersburg, MD）を用いる）。配列決定用ゲルは、１０％酢酸お
よび１０％メタノールで固定し、ゲル中の配列決定用生成物をろ紙に移す前に尿
素を除去した。ゲル乾燥装置（Biorad Gel Drier, X）を用いて、ゲルを７０−
８０℃で１−２時間乾燥させた。メンブレンフィルターは、コダックＸ−ＯＭＡ
Ｔ Ｘ線フィルムを用いてオートラジオグラフィーに供した。
【０１１６】 ＤＮＡ配列分析： ＤＮＡ配列は、少なくとも３つの別個の反応物から構築し、得られたヌクレオ
チド配列データの精度を確実にした。配列決定用生成物のオートラジオグラフは
、ヒビオマックＤＮＡＳＩＳ ＤＮＡおよびタンパク質配列分析システム（Hibi
o MacDNASIS DNA and Protein Sequence Analysis System, Hitachi Software E
ngineering Co.）を用いて解読した。このプログラムおよびＶＭＳシステムによ
るＧＣＧプログラム（SEQED, Fragment Assembly, Lineup, and Pretty）(Unive
rsity of Wisconsin Genetics Computer Group)は、ＤＮＡ配列の構築を促進し
た。
【０１１７】 実施例４ 本実施例は、ネオスポラＤＮＡ検出のためのプライマーおよびプローブのデザ
インについて述べる。 オリゴヌクレオチドＰＣＲプライマー： （１）牛ネオスポラ前進プライマー （５’−ＡＡＧＴＡＴＡＡＧＣＴＴＴＴＡＴＡＣＧＧＣＴ−３’（配列番号５）
） （２）牛ネオスポラ逆進プライマー （５’−ＣＡＣＴＧＣＣＡＣＧＧＴＡＧＴＣＣＡＡＴＡＣ−３’（配列番号６）
） ＤＮＡ増幅は、総容積５０μＬ中で実施した。反応混合物は、以下を含んでい
た：１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、５０ｍＭの塩化カリウム、０．１
％トリトンＸ−１００、１．０ｍＭの塩化マグネシウム、各々２００ｍＭのデオ
キシヌクレオシド三燐酸、０．４２μＭの牛ネオスポラ前進プライマーおよび０
．３８４μＭの牛ネオスポラ逆進プライマー。非特異的増幅を減少させるために
９４℃で４分のプレサイクル変性後、２．５ＵのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Pr
omega Corp., Madison, WI）を添加し、混合物を５０μＬの鉱物油で覆った。増
幅は、ＤＮＡサーマルサイクラー（Perkin Elmer Cetus Corp., Norwalk, CT）
中で、以下のように３１サイクルで実施した：９４℃で１分の変性、５４℃で１
分のアニーリング、および７２℃で２分の伸長。最終サイクルでは、伸長は７分
間に延長された。増幅後、各々５μＬのサンプルまたはバイオマーカーロー（Bi
oMarker Low, Bio Ventures, Inc., Murfreeboro, TN）ＤＮＡサイズ標準物を、
１μＬの６×ローディング染料と混合し、３％ヌシーブとアガロースゲル（FMC
Bioproducts）（３：１）上で電気泳動した。このゲルを、０．５μｇ／ｍＬの
臭化エチジウム溶液中で３０分間染色し、紫外光下で増幅産物の存在について観
察した。
【０１１８】 オリゴヌクレオチドＤＮＡプローブ： ３）ＢＰＡ／ネオスポラ内部プローブ配列 （５’−ＡＧＴＣＡＡＡＣＧＣＧ−３’（配列番号７）） ４）トキソプラズマ内部プローブ配列 （５’−ＡＡＧＴＣＡＡＣＧＣＧ−３’(配列番号８)） 増幅産物をゲル内で変性させ、サザンブロッティング法により、ナイロン膜（
Hybond-N;Amersham Corp., Arlington Heights, IL）に移した。ストラタリンカ
ー（Stratalinker）ＵＶ架橋剤（Stratagene, La Jolla, CA）を用いて、ＤＮＡ
をナイロン膜に架橋させた。予備ハイブリダイゼーション、標識内部プローブの
調製、およびハイブリダイゼーションは、増強化学発光３’−オリゴ標識検出シ
ステム（Amersham）に関する製造元の推奨に従って実施した。標識内部プローブ
は、ハイブリダイゼーション溶液に対して１０ｎｇ／ｍＬの最終濃度で添加し、
穏やかに攪拌しながら一晩インキュベートした。ハイブリダイゼーション後、膜
を５×ＳＳＣおよび０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ中で室温で２回（各５分）洗浄し
、続いて０．５×ＳＳＣおよび０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳで室温で２回（各５分
）洗浄した。膜ブロッキング、抗体インキュベーション、シグナル発生および検
出は、製造元の指示に従って実施した。膜を、コダックＸ−ＯＭＡＴフィルムに
３−１０分間曝露した。
【０１１９】 結果： ネオスポラ特異的プライマーを用いて、２９４ｂｐのＰＣＲ産物をＢＰＡ−１
およびトキソプラズマ（ＲＨおよびＢＴ単離物）のＤＮＡから増幅させた。更に
、３５０ｂｐの産物をサルコシスティス・クルジＤＮＡから増幅させた。様々な
細菌、ＣＰＡＥ細胞、およびウシ胸腺細胞からのＤＮＡを用いては、いずれの産
物も得られなかった。ネオスポラ特異的プローブのみが、ネオスポラ増幅産物に
ハイブリダイズした。同様に、トキソプラズマ特異的プローブは、トキソプラズ
マ増幅産物にのみハイブリダイズした。
【０１２０】 実施例５ 本実施例は、培養物由来ネオスポラタキゾイトによる妊娠雌牛の実験的感染に
ついて述べる。 ３頭の雌牛に、ＢＰＡ１ネオスポラ単離物の８×１０6個のタキゾイト（３×
１０6個のタキゾイトをＩＶで、５×１０6個のタキゾイトをＩＭで）を接種した
。これらの雌牛は、妊娠期間９５日(雌牛＃４１２)、妊娠期間１００日(雌牛＃
４１６)、および妊娠期間１０５日(雌牛＃４１３)目に接種された。それぞれの
事例で、ネオスポラ胎児感染が確認された（雌牛＃４１２は、ミイラ化した感染
胎児を排出し、雌牛＃４１６は露出子宮内にある仔牛を出産し、雌牛＃４１６か
らは外科的に感染胎児が取り出された）。２頭のコントロール雌牛には、非感染
細胞培養物が接種され、非感染の生存可能な仔牛を生んだ。 これらの雌牛を維持し、いかなる介入もすることなく再交配を実施した。３頭
の実験雌牛は全て、血清学的に陰性で臨床的に正常な仔牛を出産した（仔牛の死
後組織が全て、今日まで調べられたわけではない）。
【０１２１】 雌牛を維持し、更にもう１度再交配させた。先に感染させた雌牛＃４１２、４
１６、４１３に続いて、同じ接種物をそれぞれ８９、８３、および８３日目の妊
娠期間に投与することによって再チャレンジ（８×１０6個のタキゾイトを、分
割してＩＶおよびＩＭで投与）した。コントロールの雌牛を再交配させ、観察し
た。２頭の感染雌牛（４１３および４１６）は生存仔牛を出産し、これらは臨床
的に正常で、ネオスポラ抗原に対して血清学的に陰性であった。第三の雌牛（＃
４１２）は、接種後２７日で流産した。胎児を回収した。ネオスポラ感染を示唆
する中程度の病巣が見出されたが、今日までのところネオスポラ感染は確認され
なかった（ホルマリン固定パラフィン包埋組織は免疫組織化学的に陰性であった
）。この雌牛を再交配し、胎児を再回収した。この雌牛を再度交配させたところ
、妊娠９７日で再び流産した。この第二の胎児は回収しなかった。これまでのと
ころ、２頭の臨床的に正常な仔牛の組織病理学的検査または組織は、それらがネ
オスポラ寄生虫の経胎盤感染を受けなかったことを示している。 これは、ＢＰＡ−１ネオスポラ単離物の培養物由来タキゾイトによる免疫によ
って、ウシをネオスポラ流産から防御できることを示した初めての実験である。
【０１２２】 実施例６ 本実施例は、ネオスポラｃＤＮＡライブラリーからの２つのクローンの同定に
ついて述べる。これらのｃＤＮＡは、ワクチンおよび免疫学的診断に有用である
組換え免疫優性タンパク質を産生するのに用いることができる。 方法および材料 in vitro培養： ネオスポラタキゾイト(ＢＰＡ−１単離物)およびトキソプラズマ・ゴンディー
(ＲＨ株)タキゾイトを、文献（Conrad, Parasitology, 106:239-249(1993)）に
記載されるように組織培養で培養した。簡単に述べると、ＢＰＡ−１タキゾイト
を、ＢＡＥ（ウシ大動脈内皮）細胞のコンフルエント細胞層で増殖させて回収し
、５μｍの円盤フィルターにより濾過して細胞破片を除去し、燐酸緩衝食塩水（
ＰＢＳ）で２回洗浄し、使用のためにペレット化した。ｃＤＮＡライブラリー構
築のためのｍＲＮＡ後、次にＢＰＡ−１およびトキソプラズマタキゾイトをベロ
（Vero）細胞中で増殖させた。
【０１２３】 核酸の単離： ペレット化した組織培養細胞から、ＴＲＩＳＯＬＶ９試薬（Biofecx Laborato
ries, Houston, Texas）を用いてトータルＲＮＡを単離した。ポリＡ+ＲＮＡを
、オリゴ（ｄＴ）−セルロースクロマトグラフィーによって選別した（Avis et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:1408-1412(1972)）。ＲＮＡの完全性は、
標準的な方法によるホルムアミドゲルでの電気泳動によってモニターし、臭化エ
チジウムにより可視化した。 ＤＮＡは、イソクィックＤＮＡ抽出キット（Microprobe Corp., Garden Grove
, California）を用いて調製した。
【０１２４】 ｌｇｔｌ１中の牛ネオスポラｃＤＮＡライブラリーの構築： ベクターλｇｔｌ１中でのネオスポラｃＤＮＡ発現ライブラリーの構築は、本
質的にｃＤＮＡ合成キット（Stratagene, La Jolla, California）の製造元のプ
ロトコルに従って、実施した。簡単に述べると、第一鎖のｃＤＮＡを、ストラタ
スクリプト（StrataScript）ＲＮＡase Ｈ逆転写酵素を用いてタキゾイトのポリ
（Ａ）ＲＮＡ５μｇから合成し、第二鎖は大腸菌のＤＮＡポリメラーゼを用いて
合成した。続いて、二本鎖ｃＤＮＡをクレノウフラグメントを用いて平滑末端に
し、両端にＥｃｏＲ１アダプターを連結し、Ｔ４ポリヌクレオチドでキナーゼ処
理し、セファクリルＳ−４００スピンカラムでサイズ分画した。続いて、最終的
なｃＤＮＡ生成物を、ＥｃｏＲ１で消化し脱燐酸したλｇｔｌ１ベクターに連結
し、ギガパックIIIゴールドパッケージングエキストラクト（Stratagene, La Jo
lla, CA）を用いてパッケージ化した。このライブラリーは、７×１０6個のファ
ージを含み、うち約９７％が組換え体であった。続いて、１ラウンドのライブラ
リー増幅を大腸菌Ｙ１０８８中で完了した。
【０１２５】 ｃＤＮＡライブラリーの免疫スクリーニング： ライブラリーを大腸菌Ｙ１０９０ｒ−上にプレートし、デュプリケートのニト
ロセルロースプレートリフトを、自然感染雌牛Ｄ９１−４６９６および実験的に
感染させた（Conrad et al., J. Vet. Diagn. Invest. 5:572-578(1993)に記載
される）雌牛＃４１６からの高力価血清でスクリーニングした。血清は、最初Ｙ
１０９０ｒ−細菌溶解物で予備吸収し、続いて、５％ウマ血清含有ＴＢＳ−Ｔ（
１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％ツィー
ン２０）で１：３００に稀釈し、スクリーニングに用いた。結合抗体は、アルカ
リホスファターゼ複合体化ヤギ抗ウシＩｇＧ（ＴＢＳ−Ｔ，５％ＨＳで１：５０
００に稀釈）で可視化した。免疫スクリーニングの方法は、本質的には下記の免
疫ブロットアッセイについて述べる通りであるが、但し、５％脱脂粉乳は５％ウ
マ血清で置き換えた。
【０１２６】 ＤＮＡ配列決定： ベクターのＥｃｏＲ１制限部位にフランキングする普遍λｇｔｌ１プライマー
（Promega, Madison, WI）を用いて生成したＰＣＲ産物を、配列決定のための鋳
型として用いた。サイクル条件は、文献（Obar et al., Methods in Cell Biolo
gy 37:361-406(1993)）に記載される通りであった。配列決定のための２組の鋳
型を各クローンについて作製し、両方とも前進方向および逆進方向に配列決定し
た。
【０１２７】 自動化ＤＮＡ配列決定は、ＡＢＩ３７３ＤＮＡシークェンサーおよびＤＮＡ配
列決定用キット（アムフィタック（AmphiTaq）ポリメラーゼＦＳ（Perkin-Elmer
Corp., Foster City, CA）と共に）を用いて行なった。サイクル配列決定と合
わせて、色素ターミネーター化学反応を用いた。
【０１２８】 サザンブロットおよびノーザンブロット分析： サザンブロッティングのために、４μｇのゲノムＤＮＡを制限酵素で消化し、
標準的手順に従って、０．８％アガロースゲルで分離した。ゲルを２５０ｍＭの
ＨＣｌで１０分間脱プリン化し、１．５ＭのＮａＣｌ、０．５Ｍトリス−ＨＣｌ
（ｐＨ７．５）で３０分間変性させた後、核酸をハイボンド−Ｎナイロン膜（Am
ersham Corp., Arlington Heights, IL）に一晩かけて移し、UＶ架橋剤（Strata
gene, La Jolla, CA）で膜に架橋させた。プローブ用に、組換えクローンからの
ＥｃｏＲ１挿入物を、ＥＣＩダイレクト核酸標識検出システム（Amersham Corp.
）を用いて標識した。ブロットを、ＥＣＬゴールドハイブリダイゼーション緩衝
液（５％のブロッキング剤および０．５ＭのＮａＣｌ（Amersham Corp.）を含む
）で１時間予備ハイブリダイズし、更にプローブと一晩４２℃でハイブリダイズ
させた。６Ｍ尿素、０．４％ＳＤＳ、０．５×ＳＳＣ中で４２℃でブロットを洗
浄し（２×２０分）、オートラジオグラフィー前に２０×ＳＳＣで洗い流した。
【０１２９】 ノーザンブロッティングのためには、本質的に上記のサザンブロット手順に従
ったが、但し、０．４μｇのｍＲＮＡ（クローンＮ５４）または５μｇのトータ
ルＲＮＡ（クローンＮ５７）を１％ホルムアミドゲルで泳動し、ゲルの広範な処
理は、膜に移す前には必要とされなかった。また、クローンＮ５４のＥｃｏＲ１
挿入物をプローブとして用いたとき、洗浄プロトコルは、４５ＥＣで０．４％Ｓ
ＤＳ、０．５×ＳＳＣ（２×２０分）に調整した。
【０１３０】 組換えタンパク質の発現および精製： 発現ベクターを構築するために、クローン挿入物のＰＣＲ産物をＥｃｏＲ１で
消化し、ゲル精製した。このＤＮＡを、ＥｃｏＲ１消化した脱燐酸化ｐＲＳＥＴ
Ｂベクター（Kroll et al., DNA and Cell Biology, 12:441-453(1993)）に連
結し、得られたプラスミドでＢＬ２１ＤＥ３ ｐＬｙｓＳ大腸菌（Studier et a
l., Methods Enzymol. 185:60-89(1990)）を形質転換した。このプラスミドから
発現した融合タンパク質は、ヒスチジンの六量体を含み、これにより変性条件下
でのＮｉ2+アフィニティーカラムによる精製を可能にした。
【０１３１】 高い発現レベルの単一コロニーを、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むル
リアブロスに接種し、３７℃で０．６のＯ.Ｄ.600まで増殖させた。融合タンパ
ク質の過剰発現は、イソプロピル−β，Ｄ−チオガラクトピラノシド（最終濃度
０．４ｍＭ）の添加によって開始させ、３時間振とうした。変性条件下でのニッ
ケル−ＮＴＡ−アガロース親和性（Qiagen, Chetsworth, CA）によるアフィニテ
ィーカラム精製は、文献（Kroll et al., DNA and Cell Biology 12:441-453(19
93)）に記載される通りに完了した。サンプルを、セントリコン−１０（Amicon,
Beverly, MA）で濃縮し、更に標準的方法を用いて、８Ｍ尿素、０．１ＭのＮａ + ホスフェート、０．０１Ｍトリス（ｐＨ４．５）で平衡化させたセファデック
スＧ−１５０スーパーファイン（Pharmacia, Uppsala, Sweden）でサイズクロマ
トグラフィーによって精製した。最終タンパク質中の変性剤を、ＰＢＳ（ｐＨ７
．４）最終緩衝液に対して、ゆっくりと１Ｍ尿素の段階的透析によって除去した
。サンプルを再度、セントリコン−１０（Amicon, Beverly, MA）を用いて濃縮
し、ＢＣＡタンパク質アッセイ(Pierce, Rockford, IL)で定量した。
【０１３２】 ポリクローナル抗体の産生： 雌のニュージーランド白ウサギの皮下に、フロイント完全アジュバント５０％
乳濁液中の４００μｇの組換えタンパク質を投与して免疫し、その後フロイント
不完全アジュバント中の該タンパク質２００μｇ、更に１００μｇで４週間の間
隔をあけて２回ブースター投与した。第三回目の免疫から２週間後に血清を採取
し、免疫ブロットに用いた。
【０１３３】 免疫ブロット： タンパク質は、１２％のポリアクリルアミドゲルまたは４−２０％の勾配スラ
ブゲル（Anderson et al., J. Am. Vet. Med. Assoc., 207:1206-1210(1995)）
で分析した。寄生虫抗原は、上記のように組織培養物から回収し、ＰＢＳで２回
洗浄し、水で溶解させ、３回凍結解凍し、更に超音波で処理した。組換え抗原お
よび寄生虫抗原の両方を、ＢＣＡタンパク質アッセイ（Pierce）で定量し、レム
リー（Laemmli）のサンプル緩衝液中で変性させ、電気泳動前に５分間煮沸した
。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットを、標準的条件下で実施した。
【０１３４】 組換え抗原、ネオスポラ（ＢＰＡ１）（Conrad, Parasitology 106:239-249(1
993)）、およびトキソプラズマ・ゴンディーに対するウサギ抗血清（Conrad, Pa
rasitology 106:239-249(1993)）を、ＴＢＳ−ツィーン、５％ブロット（Blotto
）で１：３００に稀釈し、室温で５時間インキュベートした。二次抗体、ＨＲＰ
−ヤギ抗ウサギ抗体（Jackson Laboratories）を同じ緩衝液で１：１０００に稀
釈し、室温で２時間インキュベートした。４−クロロナフトールおよびＨ2Ｏ2で
、ブロットを展開した。
【０１３５】 結果 １ラウンドの増幅後、５．３×１０10ｐｆｕ／ｍＬを含む牛ネオスポラλｇｔ
ｌ１ｃＤＮＡライブラリーが生成された。雌牛Ｄ９１−４６９６および雌牛４１
６からの血清（これらは、ネオスポラ抗原に対し高力価を示した）を選び、前記
ライブラリーをスクリーニングした。これらの血清とともにインキュベートした
ウェスタンブロット間には、バンド形成パターンの有意な差異は認められなかっ
た(結果は示されていない)。テストされた自然感染雌牛Ｄ９１−４６９６および
実験的に感染させた雌牛４１６の両方とも、トキソプラズマ・ゴンディーについ
て陰性であった。実験的感染雌牛４１６は、先のネオスポラ流産実験の被験体で
あった（Conrad et al., J. Vet. Diagn. Invest. 5:572-578(1993)）。 上記血清を用いた２０００００ ｃＤＮＡクローンの一次スクリーニングによ
り、６１の二重陽性クローンが同定された。２つのクローンの性状を更に調べ、
Ｎ５４およびＮ５７と命名した。アガロースゲル電気泳動に基づき、λｇｔｌ１
ＥｃｏＲ１挿入物はそれぞれ、４３０塩基対および６３０塩基対であることが判
明した。
【０１３６】 クローンＮ５４の配列分析によって、ｃＤＮＡ挿入物は、オープンリーディン
グフレーム内の４０７塩基であることが判明した。このクローンは、５’−メチ
オニン開始部位が存在しないこと、並びに、３’終止コドンおよびポリＡテール
が存在しないことで示される通り、完全長ではなかった（配列番号９）。この配
列を対応するアミノ酸に翻訳することによって、このタンパク質配列は極めてプ
ロリンに富み（３２％）、幾つかの繰り返しユニット(配列番号１０)を含むこと
が明らかとなった。とりわけ興味深いのは、図５Ａ中に太字で示した配列、ＳＰ
ＰＱＳ（Ｓ／Ｙ）ＰＰＥＰであり、これは２回出現し、高い表面確率（Emini平
均インデックス＝３．０２５）および中等度の抗原性インデックス（Jameson-Wo
lf平均インデックス＝１．２４）を有する。この領域内の他のユニークな繰り返
しは、テトラペプチド、ＨＰ（Ｈ／Ｐ）ＰおよびＳＰＰ（Ｅ／Ｑ）（これらは１
３５アミノ酸配列内で、それぞれ４回出現する）、並びに配列ＳＹ（Ａ／Ｐ）Ｐ
（Ｄ／Ｅ）ＰＳＰ（これは保存置換を含む）である。
【０１３７】 クローンＮ５４と異なり、クローンＮ５７は、３’終止コドンおよび長いポリ
Ａテールを有していた（配列番号１１）。しかしながら、反復非コーディング領
域の配列決定の困難さにより、コーディング領域のみが示されている（配列番号
１２）。この部分的クローンは、ＤＮＡレベルで調べたとき、その７６アミノ酸
配列内にいかなる識別可能なペプチド繰返しも有しなかったが、複数単位のヌク
レオチド繰返しは同定された。特に、７４％の相同性を有する長い縦列の繰返し
が、３’末端に存在していた（図５Ｂ）。これらの繰返しは、ヌクレオチドレベ
ルでは類似していたが、繰返し内部の複数の欠失はフレームシフトを生じ、これ
は１０アミノ酸のうち２つだけが類似するペプチド配列に翻訳された。エミニ（
Emini）分析によって、これら２つの領域は表面に露出され易いように見え、表
面露出と抗原性との間に関連性が見られた。第二の繰返しはまた、５０位のアス
パラギンで、潜在的なグリコシル化能を有するように見えた。更に、この遺伝子
配列の３’末端の１０５塩基領域内には、クラスター化した９回という高頻度の
ＧＧＡ（Ａ／Ｇ）繰返しがあった。
【０１３８】 クローンＮ５４およびＮ５７は、ネオスポラ（ＢＰＡ−１）ＤＮＡのサザンブ
ロット上で異なる分子量のバンドとハイブリダイズし、このことは、これらクロ
ーンが別のネオスポラ遺伝子に由来することを示している。クローンＮ５４は、
トキソプラズマ・ゴンディーＤＮＡのより大きな分子量バンドとある程度のハイ
ブリダイゼーションを示したが、クローンＮ５７は、トキソプラズマＤＮＡにも
ベロＤＮＡにも結合しなかった。 同じプローブを用いたノーザンブロットでも、両クローンは異なる分子量のＲ
ＮＡ転写物を認識し、従って、別個のネオスポラタンパク質をコードすることを
示した。クローンＮ５４は、４．２ｋｂのネオスポラ転写物に結合し、他方、ク
ローンＮ５７は、より短い１．４ｋｂの転写物に結合した。いずれのクローンも
、トキソプラズマ・ゴンデイーＲＮＡまたはベロＲＮＡにはハイブリダイズしな
かった。
【０１３９】 クローンＮ５４およびＮ５７が、ｐＲＳＥＴベクターからヒスチジン融合タン
パク質として発現されたとき、得られたクローンＮ５４のタンパク生成物は２９
．３ｋＤであったが、クローンＮ５７のタンパク生成物は２０．１ｋＤであった
。ウェスタンブロット分析では、両タンパク質ともＢＰＡ１に対するウサギ抗血
清によって認識され、ウサギのトキソプラズマ・ゴンディーに対する抗血清では
認識されなかった（結果は示されていない）。このことは、組換え抗原が、ウサ
ギのトキソプラズマ・ゴンディー抗血清に対して或る程度の反応性を有した全溶
解物よりも、診断的により有用であることを示唆する。
【０１４０】 更に、クローンＮ５４およびＮ５７に対するポリクローナルのモノ特異性抗血
清のみが、還元および非還元ウェスタンブロット上でネオスポラ抗原に結合した
。ウサギ抗Ｎ５４は、分子量９７．２ｋＤ、８７．９ｋＤ、７７．１ｋＤ、６７
．４ｋＤ、６４．３ｋＤ、６０．１ｋＤ、５５．３ｋＤおよび２８．３−２８の
ネオスポラバンドを認識し（還元ウェスタンブロット）、また分子量１２６．７
ｋＤ、８９．４ｋＤ、６８．７ｋＤ、５８．４ｋＤ、５５．２ｋＤ、５４．５ｋ
Ｄ、５２．７ｋＤ、４９．７ｋＤ、４６．７ｋＤおよび２６．５−２７．９のネ
オスポラバンドを認識した（非還元ウェスタンブロット）。ウサギ抗Ｎ５７は、
分子量３３．６ｋＤ、３１．４ｋＤ、２７．５ｋＤおよび２２．４ｋＤのネオス
ポラバンドを認識し（還元ウェスタンブロット）、また分子量３２．８ｋＤ、３
０．６ｋＤ、２８．４ｋＤ、２６．３ｋＤおよび２１．０ｋＤのネオスポラバン
ドを認識した（非還元ウェスタンブロット）。いずれのポリクローナル抗血清も
、トキソプラズマ・ゴンディー抗原またはベロ細胞抗原に結合せず、これら２つ
の組換え抗原を、高度に特異的なＥＬＩＳＡ用の有望な候補にさせる。
【０１４１】 結論 現在のＥＬＩＳＡプロトコルは、被覆抗原にネオスポラタキゾイトのin vitro
培養物を使用する必要がある（Pare et al., J. Vet. Diag. Invest. 7:352-9(1
995); Bjorkiman et al., Parasite Immunology 16:643-8）。そのような粗雑な
抗原混合物を用いる場合、近縁寄生虫由来タンパク質間の交差反応性によって擬
陽性を生じるリスクを負う。ＥＬＩＳＡにおいて１つまたは２つのネオスポラ特
異的組換え抗原を用いることにより、潜在的に交差反応性の抗原が排除される。
更に、寄生虫全体の使用は時間を消費し、高価な組織培養法を必要とする。
【０１４２】 実施例７ 本実施例は、Ｎ５４フラグメントを含む完全長ｃＤＮＡ（ＮＣ−ｐ６５として
公知）のクローニングを開示する。 ネオスポラ（ＢＰＡ−１単離物）タキゾイトを、先に記載したように組織培養
で増殖させた（但し、タキゾイトはベロ細胞上で増殖させた（Conrad et al., P
arasitology 106:239(1993)）。簡単に述べると、寄生虫を精製するために、タ
キゾイトおよびベロ細胞を組織培養フラスコからかき取り、遠心して３ｍＬの燐
酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁し、２２ゲージ注射針に３回通してフィーダー
細胞からタキゾイトを遊離させ、ＰＢＳで平衡化させたセファデックスＧ２５Ｍ
（Pharmacia）を充填したＰＤ−１０カラムに通した。溶出タキゾイトを回収し
て遠心し、ペレットとして−７０℃で保存した。陰性コントロール物質として使
用する非感染ベロ細胞もまたかき取って、遠心し、ペレットとして−７０℃で保
存した。
【０１４３】 ペレット化した組織培養寄生虫から、ＴＲＩＳＯＬＶ試薬（Biotecx Laborato
ries, Inc.）を用いて、トータルＲＮＡを単離した。ポリ（Ａ）ＲＮＡを、オリ
ゴ（ｄＴ）−セルロースクロマトグラフィーで選別した（Avis & Leder, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 69:1408(1972)）。マラソンアダプター連結された末端を
用いたｃＤＮＡライブラリーの構築は、マラソンＴＭｃＤＮＡ増幅キット（Mara
thonTM cDNA Amplification Kit, Clonetech Laboratories, Inc.）を用いて完
結した。ｃＤＮＡ末端の５’−および３’−迅速増幅（ＲＡＣＥ）は、このライ
ブラリーを用いて実施し、完全長のＮＣ−ｐ６５ ｃＤＮＡの配列を得た。５’
−ＲＡＣＥおよび３’−ＲＡＣＥのための遺伝子特異的プライマーのデザインは
、ＮＣ−ｐ６５ ｃＤＮＡの内部に位置するＮ５４の配列に基づいた（Louie et
al., Clin. Diagn. Lab. Immunol. 4:692(1997)）。５’−ＲＡＣＥのための３
’遺伝子特異的プライマーは、以下の塩基組成を有する２７量体であった：５’
−ＧＡＧＧＣＧＡＡＧＧＧＡＣＴＣＴＣＧＧＡＧＡＡＧＡＡＣ−３’（配列番号
２０）。３’−ＲＡＣＥのための５’遺伝子特異的プライマーは、以下の塩基組
成を有する２６量体であった：５’−ＧＡＡＣＣＴＴＣＡＣＣＡＴＣＧＡＡＧＣ
ＣＧＴＣＴＣＣ−３’（配列番号２１）。３’遺伝子特異的プライマーおよびマ
ラソンアダプタープライマー（Clonetech Laboratories, Inc.）を用いた５’−
ＲＡＣＥ、および５’遺伝子特異的プライマーおよびマラソンアダプタープライ
マーを用いた３’−ＲＡＣＥの後で、ＮＣ−ｐ６５ ｃＤＮＡの完全な５’末端
および完全な３’末端を示す２つのオーバーラップしたＰＣＲ産物が生成された
。これらの産物のヌクレオチド配列決定を完了した。
【０１４４】 この配列情報から、前進プライマー、５’−ＴＣＡＧＣＴＣＧＡＧＣＡＡＣＡ
ＣＧＧＴＣＡＣＧＧＧＡＡＣＡＡＴＧＡＧ−３’(配列番号２２)、および逆進プ
ライマー、５’−ＴＧＡＣＧＡＡＴＴＣＣＣＡＧＡＴＧＴＧＡＣＧＧＧＧＡＣＡ
ＴＣＡＣＹＡＣ−３’(配列番号２３)をデザインし、ＮＣ−ｐ６５ ｃＤＮＡの
全コーディング領域を示す連続的クローンをＰＣＲするために用いた。反応混合
物は、以下を含んでいた：１．５ｎｇのアダプター連結ｃＤＮＡライブラリー、
０．４ｍＭの各プライマー、０．２ｍＭのｄＮＴＰ、１×クレンタック（KlenTa
q）緩衝液、および１×アドバンテージクレンタックポリメラーゼミックス（Clo
ntech Laboratories, Inc.）。“タッチダウン”ＰＣＲサイクル条件は、９４℃
で１分；９４℃で３０秒および７２℃で４分を５サイクル；９４℃で３０秒およ
び７０℃で４分を５サイクル；９４℃で３０秒および６８℃で４分を２５サイク
ルであった。
【０１４５】 ５’−および３’−ＲＡＣＥ ＰＣＲ産物を、プラスミドベクターｐＣＲＩＩ
にＴＡクローニングキット（Invitrogen Corporation）を用いて挿入し、配列決
定のための鋳型として用いた。前進および逆進の両方向について、蛍光色素ター
ミネーション温度サイクリングによって配列決定し、先に記載（Louie et al.,
Clin. Diagn. Lab. Immunol. 4:692(1997)）したように、ＡＢＩ３７７自動シー
クェンサー（Advanced Biosystems）で分析した。完全長の配列は、配列番号１
８に示す通りである。タンパク質の配列分析は、ジェネティクスコンピュータグ
ループ（ＧＣＧ）プログラム、ＢＬＡＳＴＰ、ＦＡＳＴＡ、Ｍｏｔｉｆｓ、Ｂｅ
ｓｔｆｉｔ、およびＧａｐを用いて行なった。推定アミノ酸配列を、配列番号1
９に示す。
【０１４６】 ＮＣ−ｐ６５は、寄生虫の短系小器官に位置するセリンプロテアーゼであり、
目に見える宿主細胞侵入期間中に培養上清中に放出される。他の全てのアピコン
プレキサ門の短系タンパク質と異なり、ＮＣ−ｐ６５は、宿主細胞付着以外の活
性を有することが明示された最初の短系タンパク質である。それはまた、タンパ
ク質分解活性を有することが実証された最初のもので、短系小器官のタンパク質
の新規な代替的機能を例示するものである。分泌小器官および上清中に位置する
ことから、また酵素活性が証明されていることから、ＮＣ−ｐ６５は、宿主細胞
侵入を支援するのに関与しているらしい。
【０１４７】 実施例８ 寄生虫の発育における、ＮＣ−ｐ６５の役割および重要性の解明に向けた将来
的な研究によって、ネオスポラ感染のより有効な制御方法についての洞察を得る
であろう。このような実験には、”ノックアウト”寄生虫および基質結合研究が
含まれ得る。 ＮＣ−ｐ６5遺伝子を“ノックアウトする”ことによって、タンパク質分解活
性が増殖に必須であるか否かを決定できる。その基質を研究することによって、
該酵素が、いつ、どこで、なぜ作用するかを当業者は学ぶであろう。
【０１４８】 欠損遺伝子を有する“ノックアウト”寄生虫を作製する技術は、アピコンプレ
キサ門の寄生虫について利用可能であり、マラリアおよびトキソプラズマ寄生虫
の幾つかの“ノックアウト物”が既に作製されている。ネオスポラ・カニナム中
のＮＣ−ｐ６５の“ノックアウト物”の作製では、ＮＣ−ｐ６５の上流および下
流配列が（配列決定のためのプライマーまたはハイブリダイゼーション用のプロ
ーブに加えて）、相同組換えのための部位として使用するために同定されている
。特異的な相同組換えのための構築物が作製され、ＮＣ−ｐ６５遺伝子のレポー
ター遺伝子（例えば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡ
Ｔ））による遺伝子置換物を創出できる。遺伝子工学的に作製された寄生虫は、
クロラムフェニコール選択によって単離され、サザンブロットおよびウェスタン
ブロットにより、成功した相同組換えについて検査される。
【０１４９】 ＮＣ−ｐ６５が重要な機能を果たしている場合は、ＮＣ−ｐ６５の遺伝子的“
ノックアウト”は、生存可能性のない組換え寄生虫を生じ易い。ＮＣ−ｐ６５は
、薬剤発見研究のための主要な標的となり、新規なクラスの薬剤の開発への道を
導くであろう。これらの新規な化学物質は、ＮＣ−ｐ６５のタンパク分解活性を
阻害し、寄生虫の発育を停止させるその能力によって同定できる。
【０１５０】 このプロテアーゼの基質を同定するために、天然の活性なＮＣ−ｐ６５を、ネ
オスポラタキゾイト溶解物または上清から精製する。一旦、精製酵素が入手され
ると、基質を同定することができる。最も直接的には、酵素を樹脂に結合させ、
アフィニティー樹脂として用いてリガンド／基質を精製できる。或いは、宿主細
胞または寄生虫起源の基質を放射性標識し、精製ＮＣ−ｐ６５で処理してもよい
。前処理および後処理されたサンプルを電気泳動して比較することによって、タ
ンパク質パターンの変化が明らかになり、少なくとも基質の源が明らかになるで
あろう。 基質研究によって得られた知識に基づき、これらの薬剤候補を化学的に改変し
て酵素への結合力を増加させると、これら薬剤候補は、天然の基質を有する効果
的な競合物質になる。 上記の実施例は、本発明を例示するために提供され、その範囲を制限するもの
ではない。本発明の他の変形例は当業者に明らかであり、添付の請求の範囲に包
含される。本明細書に引用した全ての刊行物、特許および特許出願は、本明細書
中に参考として援用される。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 ネオスポラ感染胎児を流産した４頭の雌牛からの連続的サンプル
の間接蛍光抗体（ＩＦＡ）力価を示す。
【図２】 ネオスポラ感染胎児を流産し、その後、先天的に感染した仔牛を
出産した２頭の雌牛からの連続的サンプルのＩＦＡ検査力価を示す。
【図３】 実験的にネオスポラに感染させた未経産雌牛のセロコンバージョ
ンを示す。
【図４】 感染の証拠がないウシと、ネオスポラ感染胎児または仔牛を生ん
だ母牛とを比較したＩＦＡ検査力価を示す。
【図5Ａ】 ネオスポラから単離した２つの免疫優性なｃＤＮＡクローン中
の配列モチーフを示す。
【図５Ｂ】 ネオスポラから単離した２つの免疫優性なｃＤＮＡクローン中
の配列モチーフを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 48/00 Ｃ０７Ｋ 14/44 Ａ６１Ｐ 33/00 １７１ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ０７Ｋ 14/44 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｍ Ｃ１２Ｑ 1/68 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/53 33/569 Ａ 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/569 Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者 キットランド、 ルイ アメリカ合衆国 94121 カリフォルニア 州 サンフランシスコ 733−26 アベニ ュー Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA13 BA31 CA09 DA02 HA14 4B063 QA19 QQ02 QQ43 QQ79 QR08 QR32 QR48 QR56 QR62 QS25 QS33 QS34 QX01 4C084 AA02 AA06 AA13 BA01 BA08 BA21 CA53 DC50 NA14 ZB382 ZC612 4C085 AA02 AA13 AA14 BA51 BB11 CC04 DD22 DD86 GG03 GG04 4H045 AA11 AA30 BA10 BA60 BA70 CA20 DA86 EA29 EA52 FA74

Claims (27)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 免疫優性なネオスポラ抗原をコードする核酸を含む単離され
    た組換え核酸構築物。
  2. 【請求項２】 前記構築物が０．２×ＳＳＣ中で配列番号：９と６５℃で１
    ５分間ハイブリダイズを維持する、請求項１に記載の核酸構築物。
  3. 【請求項３】 前記構築物が０．２×ＳＳＣ中で配列番号：１８と６５℃で
    １５分間ハイブリダイズを維持する、請求項２に記載の核酸構築物。
  4. 【請求項４】 前記構築物が配列番号１８と実質的に同一である、請求項３
    に記載の核酸構築物。
  5. 【請求項５】 前記構築物が０．２×ＳＳＣ中で配列番号：１１と６５℃で
    １５分間ハイブリダイズを維持する、請求項１に記載の核酸構築物。
  6. 【請求項６】 配列番号：１０に示すアミノ酸配列と実質的に同一であるア
    ミノ酸配列を有するタンパク質。
  7. 【請求項７】 前記アミノ酸配列が配列番号：１９に示すアミノ酸配列と実
    質的に同一である、請求項６に記載のタンパク質。
  8. 【請求項８】 配列番号：１１に示すアミノ酸配列と実質的に同一であるア
    ミノ酸配列を有するタンパク質。
  9. 【請求項９】 生物学的サンプル中で牛ネオスポラ抗原と特異的に免疫反応
    する抗体の存在を検出する方法であって、単離した免疫優性な組換えネオスポラ
    抗原に該サンプルを接触させ、それにより抗原／抗体複合体を形成させ、該複合
    体の存在または不存在を検出することを包含する、方法。
  10. 【請求項１０】 前記ネオスポラ抗原が配列番号：１０に示すアミノ酸配列
    を有する、請求項９に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 前記生物学的サンプルがウシ血清である、請求項９に記載
    の方法。
  12. 【請求項１２】 前記抗原が固体表面上に固定されている、請求項９に記載
    の方法。
  13. 【請求項１３】 前記複合体が標識抗ウシ抗体を用いて検出される、請求項
    ９に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 前記抗ウシ抗体が蛍光標識されている、請求項１３に記載
    の方法。
  15. 【請求項１５】 生物学的サンプル中でネオスポラ特異的核酸の存在を検出
    する方法であって、標的であるネオスポラ特異的ポリヌクレオチド配列と特異的
    にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブを該サンプルに接触させ、そ
    れによりハイブリダイゼーション複合体を形成させ、前記複合体の存在または不
    存在を検出することを包含する、方法。
  16. 【請求項１６】 標的であるネオスポラ特異的ポリヌクレオチド配列を増幅
    することを更に包含する、請求項１５に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 前記標的ネオスポラ特異的ポリヌクレオチド配列が固体表
    面上に固定されている、請求項１６に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 前記オリゴヌクレオチドプローブが標識されている、請求
    項１５に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 前記標的核酸が、配列番号：１、配列番号：２、配列番号
    ：９、配列番号：１１および配列番号：１８からなる群から選択される、請求項
    １５に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 医薬的に許容し得る担体および免疫原的有効量の牛ネオス
    ポラ抗原を含む医薬組成物。
  21. 【請求項２１】 前記牛ネオスポラ抗原が単離された牛ネオスポラポリペプ
    チドである、請求項２０に記載の組成物。
  22. 【請求項２２】 前記ポリペプチドが遺伝子組換えにより産生されたもので
    ある、請求項２１に記載の組成物。
  23. 【請求項２３】 前記牛ネオスポラ抗原が組換えウイルスによって発現され
    たものである、請求項２２に記載の組成物。
  24. 【請求項２４】 牛ネオスポラ感染からウシを防御する方法であって、医薬
    的に許容し得る担体および免疫原的有効量の牛ネオスポラ抗原を含む医薬組成物
    を投与することを包含する、方法。
  25. 【請求項２５】 前記ウシが乳牛または未経産雌牛である、請求項２４に記
    載の方法。
  26. 【請求項２６】 前記医薬組成物がウシを交配する時に投与される、請求項
    ２４に記載の方法。
  27. 【請求項２７】 前記医薬組成物が非経口的に投与される、請求項２４に記
    載の方法。
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