BR102019016286A2 - Método imunodiagnóstico da neosporose pela associação de proteínas recombinantes de neospora caninum - Google Patents

Abstract

A presente invenção refere-se à utilização da associação das proteínas antigênicas NcSRS2 e NcSAG1 produzidas de forma recombinante, ambas do patógeno Neospora caninum, em um ensaio no formato ELISA indireto para o diagnóstico da neosporose bovina e ovina. Tal invenção objetiva sanar a problemática vinculada às reações cruzadas com outros protozoários do filo Apicomplexa, presentes no teste padrão hoje utilizado, além de fornecer uma opção de menor custo, proporcionando facilidade de automação e realização da análise em grande escala. A associação das proteínas rNcSRS2 e rNcSAG1 em um teste ELISA indireto, geraram melhores resultados quando comparada a utilização das mesmas proteínas recombinantes de forma isolada. Obtendo-se um teste com sensibilidade de 98,1% e especificidade de 99,1% para os bovinos, e sensibilidade de 100% e especificidade de 97,2% para ovinos. Os resultados demonstram que esta associação de proteínas recombinantes utilizadas no imunoensaio desenvolvido é uma alternativa viável para o diagnóstico da neosporose bovina e ovina. Setor técnico: A61K 39/00, A61K 39/002 e A61K 39/012.

Description

MÉTODO IMUNODIAGNÓSTICO DA NEOSPOROSE PELA ASSOCIAÇÃO DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES DE NEOSPORA CANINUM RELATÓRIO DESCRITIVO FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se à utilização da associação das proteínas recombinantes antigênicas NcSRS2 e NcSAG1, ambas do patógeno Neospora caninum, em um ensaio no formato ELISA indireto para o diagnóstico da neosporose. Está enquadrada dentro da classificação internacional de patentes nos campos de invenção A61K 39/00, A61K 39/002 e A61K 39/012.

Descrição do estado da técnica

[002] Neospora caninum é um parasito heteroxênico, pertencente ao filo Apicomplexa, que foi isolado pela primeira vez em 1988, de tecidos de cães com paralisia cerebral. É o agente causador da doença conhecida por neosporose, sendo esta uma das principais causas de abortos em bovinos no mundo, tanto na bovinocultura de leite quanto na de corte. N. caninum é um parasito intracelular obrigatório, sendo os canídeos os hospedeiros definitivos, e os hospedeiros intermediários podendo ser uma ampla variedade de animais, destacando-se os bovinos e os ovinos como sendo os hospedeiros mais estudados. A neosporose canina se caracteriza por paralisia muscular, enquanto a neosporose bovina apresenta abortos e mortalidade neonatal. Já a nesporose ovina ocorre com menor frequência, e está associada a infecções congênitas e nascimentos de cordeiros fracos (DUBEY J. P., HATTEL A. L., LINDSAY D. S. TOPPER M. J. Neonatal Neospora caninum infection in dogs: isolation of the causative agent and experimental transmission, American Veterinary Medical Association, v. 193, p. 1259-1263, 1988; COBADIOVA A., VICHOVA B., MAJLATHOVA V., REITEROVA K. First molecular detection of Neospora caninum in European brown bear (Ursus arctos), Veterinary Parasitology, v. 197, p. 346-349, 2013; HOWE L., COLLETT M.G., PATTISON R.S., MARSHALL J., WEST D.M., POMROY W.E. Potential involvement of Neospora caninum in naturally occurring ovine abortions in New Zealand, Veterinary Parasitology, v.185, p.64-71, 2012; DUBEY J. P., LINDSAY D. S. A review of Neospora caninum and neosporosis, Veterinary Parasitology, v. 67, p. 159, 1996).

[003] O ciclo de vida desse protozoário envolve um hospedeiro definitivo onde ocorre a reprodução sexuada, e hospedeiros intermediários apresentando a reprodução assexuada. Até o momento são conhecidos como hospedeiros definitivos os canídeos, como por exemplo, cães domésticos e selvagens, coiotes, lobos cinzentos e dingos. Dentre os principais hospedeiros intermediários destacam-se: bovinos e ovinos. Esse parasito se apresenta em 3 formas infectantes conhecidas: os oocistos, os taquizoítos e os bradizoítos. Os oocistos são liberados nas fezes do hospedeiro definitivo e estes se tornam esporulados no ambiente, contendo dois esporocistos com quatro esporozoítos cada, que ao serem ingeridos infectam os hospedeiros intermediários. Os esporozoítos são liberados e invadem as células do trato intestinal, transformando-se em taquizoítos, que se reproduzem de forma rápida, representando a fase aguda da doença e são encontrados principalmente em macrófagos, fibroblastos e no sistema nervoso, mais especificamente, no cérebro. No interior das células permanecem de forma latente dando origem aos bradizoítos, formando cistos teciduais. Os hospedeiros definitivos adquirem a infecção ingerindo tecidos de animais infectados. (DONAHOE S. L., LINDSAY S. A., KROCKENBERGER M., PHALEN D., SLAPETA, J. A review of neosporosis and pathologic findings of Neospora caninum infection in wildlife, Int J Parasitol Parasites Wildl, v. 4, p. 216 - 238, 2015; REICHEL M. P., ELLIS J. T., DUBEY J. P. Neosporosis and hammondiosis in dogs, Journal of Small Animal Practice, v.48, p. 308-312, 2007; HADDAD J. P. A., DOHOO I. R., VANLEEWEN J. A. A review of Neospora caninum in dairy and beef cattle - a Canadian perspective, The Canadian Veterinary Journal, v. 46, p. 230, 2005; PETERS M., LUTKEFES E., HECKEROTH A. R., SCHARES G. Immunohistochemical and ultrastructural evidence for Neospora caninum tissue cysts in skeletal muscles of naturally infected dogs and cattle, Int. J. Parasitol., v.31, p . 1144-1148, 2001) .

[004] Em bovinos a transmissão vertical é responsável por até 95% das infecções. Não obstante, este tipo de transmissão não confere infecção em 100% dos casos, sendo necessária a transmissão horizontal para que o parasito se mantenha no rebanho (CABRAL A. D., CAMARGO C. N., GALLETI N. T., OKUDA, L. H., PITUCO E. M., FAVA C. D. Diagnosis of Neospora caninum in bovine fetuses by histology, immunohistochemistry, and nested-PCR, Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária, v. 18, p. 14-19, 2009; SANTOLARIA P., ALMERIA S., MARTINEZ-BELLO D., NOGAREDA C., MEZO M., GONZALEZ-WARLETA M., CASTRO-HERMIDA J. A., PABON M., YANIZ J. L., LOPEZ-GATIUS F. Different humoral mechanisms against Neospora caninum infection in purebreed and crossbreed beef/dairy cattle pregnancies, Veterinary Parasitology, v. 178, p. 70-76, 2011).

[005] N. caninum possui grande importância econômica nos rebanhos bovinos, pois causa problemas reprodutivos, gastos com o estabelecimento de uma nova gestação, reposição dos animais abatidos, possíveis perdas na produção de leite, aumento dos gastos com profissionais para o diagnóstico, sendo também considerada uma das principais causas de abortos em bovinos, acarretando no abate das fêmeas adultas que abortaram. Um estudo realizado em dez países, onde foi avaliado o impacto dos abortos causados por N. caninum, mostrou uma prevalência variando de 10 a 60%, com uma estimativa média de perda econômica global de 1 bilhão de dólares, variando em 2,4 bilhões por ano (REICHEL M. P., AYANEGUI- ALCERRECA A. M., GONDIM L. F., ELLIS J. T. What is the global economic impact of Neospora caninum in cattle - the billion dollar question, Int. J. Parasitol., v.43, p.133-142, 2013).

[006] Em ovinos naturalmente infectados, a doença não está sempre associada a abortos, apesar das evidências que mostram o papel abortivo do organismo em infecções experimentais. Em um estudo recente, os autores demonstraram que o estágio da gestação tem papel fundamental no curso da neosporose em ovelhas prenhas. Nesse trabalho, a infecção no primeiro e segundo terço da gestação causou uma taxa de aborto em 100% dos animais infectados, enquanto que durante o último terço da gestação, resultou no parto prematuro de cordeiros infectados, fracos ou clinicamente saudáveis. Os ovinos são altamente suscetíveis à infecção por N. caninum, e apresentam sintomatologia semelhante à de bovinos, por isso consistem em um ótimo modelo animal experimental, possuindo vantagens sobre os bovinos, incluindo o tamanho, duração da gestação e o custo. Mais estudos são necessários para elucidar completamente a patogênese da infecção em ovinos. Embora não se tenha o conhecimento do real impacto econômico da enfermidade nessa população, imagina-se que as perdas sejam significativas (ARRANZ-SOLÍS D., BENAVIDES J., REGIDOR-CERRILLO J., UERTES M., FERRE I., DEL FERRERAS M., COLLANTES-FERNÁNDEZ E., HEMPHILL A., PEREZ V., ORTEGA-MORA L. M. Influence of the gestational stage on the clinical course, lesional develop ment and parasite distribution in experimental ovine neosporosis, Vet. Res., v. 46, p. 1-13, 2015; FTHENAKIS G. C., MAVROGIANNI V.S., GALLIDIS E., PAPADOPOULOS E. Interactions between parasitic infections and reproductive efficiency in sheep. Vet Parasitol, v. 28, p. 56-66, 2015)

[007] Existem vários fatores não esclarecidos acerca da resposta imune induzida frente à infecção por N. Caninum. No entanto a resposta imune inata é a primeira linha de defesa contra agentes infecciosos, a qual é responsável por fazer com que, no início de uma infecção, os patógenos invasores sejam capturados por células apresentadoras de antígenos, as quais liberam citocinas, como as interleucinas 12 (IL-12), que são indutoras da citotoxicidade de células natural killer (NK), e estas células, durante a infecção causada por patógenos intracelulares, produzem interferon gama (IFN-γ). O IFN-γ é uma citocina pró-inflamatória de extrema importância para a defesa do hospedeiro, sendo conhecida por limitar a multiplicação do parasito (Klevar S., Kulberg S., Boysen P., Storset A.K., Moldal T., Bjorkman C., Olsen I. Natural killer cells act as early responders in an experimental infection with Neospora caninum in calves, International journal for parasitology, v. 37, p. 329339, 2007).

[008] Como resultado da expressão de IFN-γ, os níveis na produção de IgG2 são aumentados e estes anticorpos são essenciais na resposta imune contra patógenos, indicando uma predominância da resposta Th1. Os níveis de anticorpos de classe IgM específicos para neosporose podem ser detectados após duas semanas de infecção, caracterizando a infecção aguda. Porém, diminuem consideravelmente até quatro semanas, sendo difícil a detecção destes anticorpos após este período. Os níveis de anticorpos IgG (IgG1 e IgG2), são baixos nos primeiros dias da infecção, aumentando durante as primeiras semanas, indicando a fase crônica da doença. Os bovinos, de forma geral, apresentam soroconversão rápida com altos títulos de anticorpos IgG2 e tendem a manter esses títulos durante um longo período (ALMERIA S., NOGAREDA C., SANTOLARIA P., GARCIA-ISPIERTO I., YANIZ J. L., LOPEZ-GATIUS, F. Specific anti-Neospora caninum IgG1 and IgG2 antibody responses during gestation in naturally infected cattle and their relationship with gamma interferon production, Veterinary immunology and immunopathology, v. 130, p. 35-42, 2009; DION S., GERMON S., GUITON R., DUCOURNAUC., DIMIER-POISSON I. Functional activation of T cells by dendritic cells and macrophages exposed to the intracellular parasite Neospora caninum, Int J Parasitol, v. 41, p. 685-95, 2011;

[009] A inibição da multiplicação de parasitos através de citocinas pró-inflamatórias e o bloqueio da infecção do parasito por meio de anticorpos, são os principais eventos imunológicos capazes de controlar a infecção e de evitar a transformação de taquizoítos para bradizoítos. A recrudescência de bradizoítos, para a forma ativa de taquizoítos ocorre quando as respotas imunes mediadas por células T e IFN-γ são prejudicadas, o que acontece em indivíduos imunosuprimidos (INNES E. A. The host- parasite relationship in pregnant cattle infected with Neospora caninum, Parasitology, v. 134, p. 1903-1910, 2007).

[010] Anticorpos resultantes da infecção desempenham um papel auxiliar em infecções posteriores participando da neutralização e destruição de taquizoítos extracelulares. Estudos sugerem que a imunidade protetora pode ser alcançada devido a uma infecção anterior, e pode ser mantida através de mecanismos não elucidados, pois animais com evidências de exposição prévias têm menor probabilidade de aborto do que animais com infecção primária (INNES E. A. The host-parasite relationship in pregnant cattle infected with Neospora caninum, Parasitology, v. 134, p. 1903-1910, 2007; Mcallister M. M., Bjorkman C., Anderson-Sprecher R., Rogers D. G. Evidence of point-source exposure to Neospora caninum and protective immunity in a herd of beef cows, Journal of the American Veterinary Medical Association, v. 217, p.881-887, 2000).

[011] Como não existem até o momento vacinas e nem tratamentos eficientes disponíveis, o controle da disseminação da doença nos rebanhos é a melhor estratégia a ser adotada. Dessa forma, o diagnóstico torna-se uma ferramenta de extrema importância. Dentre os métodos utilizados, destacam-se os exames histológicos, imunohistoquímica (IHC), Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), Imunofluorescência Indireta (IFI) e os ensaios imunoenzimáticos, como o ensaio de imunoabsorção enzimática -ELISA (Enzyme-linked-immunosorbent assay) (SINNOTT F. A. , MONTE L. G., COLLARES T. F., SILVEIRA R. M., BORSUK S. Review on the immunological and molecular diagnosis of neosporosis (years 2011-2016), Veterinary Parasitology, v. 239, p. 10-25, 2017; DUBEY J. P., SCHARES G. Neosporosis in animals-The last five years, Vet. Parasitol., v. 180, p. 90-108, 2011).

[012] Os exames histológicos podem confirmar a neosporose em fetos abortados pela visualização das lesões características causadas pelo protozoário, como encefalite não supurativa, miocardite, hepatites, etc. Porém, esta técnica necessita sempre da confirmação da presença do parasito já que outros protozoários poderiam causar lesões similares e a ausência de outros patógenos (DUBEY J. P., SCHARES G. Neosporosis in animals--the last five years, Vet Parasitol, v. 180, p. 90-108, 2011).

[013] A técnica de imunohistoquímica (IHC) já é um método mais eficaz comparado com os exames histológicos, e é comumente utilizada para a detecção do parasito em fetos abortados, pois geralmente a quantidade de N. caninum nos tecidos é pequena, dificultando a visualização pela técnica de coloração hematoxilina e eosina (HE) utilizada pelos ensaios histopatológicos. Contudo, a eficiência da IHC é prejudicada por amostras de tecidos de abortos autolisados (CABRAL A. D., CAMARGO C. N., GALLETI N. T., OKUDA L. H., PITUCO E. M., FAVA C. D. Diagnosis of Neospora caninum in bovine fetuses by histology, immunohistochemistry, and nested-PCR, Rev Bras Parasitol Vet, v. 18, p. 14-9, 2009; KHODAKARAM-TAFTI A., MANSOURIAN M., NAMAVARI M., HOSSEINI, A. Immunohistochemical and polymerase chain reaction studies in Neospora caninum experimentally infected broiler chicken embryonated eggs, Vet Parasitol, v. 188, p. 10-3, 2012).

[014] A técnica de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) é uma ferramenta muito importante para detecção de N. caninum, tendo como vantagens ser uma técnica rápida e possuir alta sensibilidade e especificidade. Porém, ainda é uma técnica de valor elevado. A PCR pode ser aplicada para o diagnóstico, para o sequenciamento, quantificação de DNA do protozoário e identificação de novos hospedeiros do parasito. Vários formatos de PCRs vêm sendo aplicados para o diagnóstico da neosporose, tais como o PCR em Tempo Real, Nested PCR e Multiplex PCR, os quais podem utilizar tecidos de fetos abortados, líquido amniótico, líquido cefalorraquidiano, sangue, fezes, leite, sêmen, etc. (AL-QASSAB S., REICHEL M. P., ELLIS J. A second generation multiplex PCR for typing strains of Neospora caninum using six DNA targets, Mol Cell Probes., v. 24, p. 20-6, 2010; . PEREIRA, G. R., VOGEL, F. S., BOHRER, R. C., DA NOBREGA, J. E. J., ILHA, G. F., DA ROSA, P. R., GLANZNER W. G., CAMILLO G., BRAUNIG P., DE OLIVEIRA J. F., GONÇALVES P. B. Neospora caninum DNA detection by TaqMan real-time PCR assay in experimentally infected pregnant heifers, Vet Parasitol, v. 199, p. 129-35, 2014; REISBERG K., SELIM A. M., GAEDE W. Simultaneous detection of Chlamydia spp., Coxiella burnetii, and Neospora caninum in abortion material of ruminants by multiplex real-time polymerase chain reaction, J Vet Diagn Invest, v. 25, p. 614-9, 2013).

[015] A infecção por N. caninum estimula a resposta imune humoral do hospedeiro, conforme descrito anteriormente, sendo possível a detecção de anticorpos contra antígenos imunodominantes presentes nas formas de taquizoítos ou bradizoítos, estabelecendo-se assim o estágio agudo ou crônico da infecção. Devido a esta resposta imunológica, pode-se detectar a doença através de testes sorológicos, onde os diagnósticos indiretos possuem grandes vantagens, como serem utilizados no antemortem dos animais e também por fornecerem informações quanto ao estágio da doença (DUBEY J. P. , LINDSAY, D. S. Neosporosis, toxoplasmosis, and sarcocystosis in ruminants, Vet Clin North Am Food Anim Pract, v. 22, p. 645-71, 2006; HIASA J., KOHARA J., NISHIMURA M., XUAN X., TOKIMITSU H., NISHIKAWA Y. ELISAs based on rNcGRA7 and rNcSAG1 antigens as an indicator of Neospora caninum activation, Vet Parasitol, v. 187, p. 379-85, 2012; TEMBUE A. A., RAMOS R. A., DE SOUSA T. R., ALBUQUERQUE A. R., DA COSTA A. J., MEUNIER I. M., MEUNIER I. M., FAUSTINO M. A. Serological survey of Neospora caninum in small ruminants from Pernambuco State, Brazil, Rev Bras Parasitol Vet, v. 20, p. 246-8, 2011).

[016] A técnica sorológica padrão para o diagnóstico da neosporose é a Imunofluorescência Indireta (IFI), sendo o primeiro ensaio sorológico descrito para o diagnóstico da doença. No entanto, para sua execução se faz necessário à manutenção de linhagens celulares infectadas com taquizoítos, o que representa um alto custo no diagnóstico. Além disso, a subjetividade do resultado é diretamente dependente da experiência do executor do teste, e sua especificidade pode ser prejudicada devido à reação de anticorpos presentes em amostras positivas contra outros protozoários do mesmo filo, além do fato de que na fase crônica (cistos teciduais contendo bradizoítos) outros antígenos estimulam, de forma muito mais eficiente, a produção de anticorpos específicos, e a detecção de anticorpos anti-taquizoítos (forma evolutiva utilizada na IFI) pode ser comprometida (PIAGENTINI M., MOYA-ARAUJO C. F., PRESTES N. C., SARTOR I. F. Neospora caninum infection dynamics in dairy cattle, Parasitol Res, v. 111, p. 17-21, 2012; DUBEY J. P., 63, 1988; DUBEY J. P., SCHARES G. Diagnosis of bovine neosporosis, Vet Parasitol, v, 140, p. 1-34, 2006). HATTEL A. L., LINDSAY D. S., TOPPER M. J. Neonatal Neospora caninum infection in dogs: isolation of the causative agent and experimental transmission, J Am Vet Med Assoc, v. 193, p.1259-

[017] Vários testes sorológicos para detecção de anticorpos contra N. caninum estão disponíveis comercialmente, sendo a grande maioria no formado de ensaios imunoenzimáticos (ELISA) indiretos, os quais utilizam, quase que na totalidade, um lisado de taquizoítos ou antígenos nativos purificados para sensibilização das placas de poliestireno. O uso de antígenos nativos ou totais diminui a especificidade do teste devido às reações cruzadas com outros coccídeos. Portanto, a busca por alvos proteicos específicos, exclusivos de N. caninum, parece ser promissora para o desenvolvimento de ensaios de diagnóstico sensíveis e específicos (WAPENAAR W., BARKEMA H. W., VANLEEUWEN J. A., MCCLURE J. T., O ’ HANDLEY R. M., KWOK O. C., THULLIEZ P., DUBEY J. P., JENKINS M. C. Comparison of serological methods for the diagnosis of Neospora caninum infection in cattle, Vet Parasitol, v. 143, p. 166-73, 2007; YBANEZ R. H., TERKAWI M. A., KAMEYAMA K., XUAN X., NISHIKAWA Y. Identification of a highly antigenic region of subtilisin-like serine protease 1 for serodiagnosis of Neospora caninum infection, Clin Vaccine Immunol, v. 20, p. 1617-22, 2013).

[018] Uma variedade de antígenos de N. caninum vem sendo descrita, muitos dos quais são possíveis alvos vacinais e de diagnóstico. Entre os antígenos utilizados para o diagnóstico da neosporose, as proteínas de superfície celular ganham destaque por serem necessárias à sobrevivência do patógeno, uma vez que iniciam as interações com moléculas da superfície da célula do hospedeiro, além de ativarem o sistema imune do mesmo. Os antígenos de superfície pertencem a uma superfamília de proteínas estruturalmente relacionadas ao principal antígeno de superfície (SAG1 (Surface Antigen Glycoprotein)) conhecidas como proteínas SRS (SAG 1 - Related Sequences) ancoradas por glicosilfosfatidilinositol (GPI), que é uma estrutura glicolipídica que se liga covalentemente às proteínas como uma modificação pós-traducional, levando à ancoragem da proteína a parte externa da membrana plasmática, possibilitando a mediação de diversas funções biológicas (Bargieri D., Lagal V., Andenmatten N., Tardieux I., Meissner M., Ménard R. Host cell invasion by apicomplexan parasites: the junction conundrum, PLoS Pathog, v. 18, 2014; Soltani M., Sadrebazzaz A., Nassiri M., Tahmoorespoor M. Cloning, Nucleotide Sequencing and Bioinformatics Study of NcSRS2 Gene, an Immunogen from Iranian Isolate of Neospora caninum, Iranian J Parasitol, v. 8, p. 114128, 2013).

[019] Os principais antígenos imunodominantes de superfície celular de N. caninum, já definidos e caracterizados, são de 29 (Nc-p29) e 35 (Nc-p35) kilodaltons (kDa), que demonstraram ser respectivamente idênticos aos antígenos Nc-p36 (36kDa) e Nc-p43 (43kDa). Tais diferenças de pesos moleculares foram atribuídas a diferentes condições por eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE). Análises de similaridade revelaram que Nc-p29/Nc-p36 apresentam aproximadamente 53% de homologia com a proteína SAG1 de Toxoplasma gondii, e Nc-p35/Nc-p43 indicam aproximadamente 44% de identidade com o antígeno SRS2 de T. gondii. Baseado nessas homologias, foi proposto que Nc-p29/Nc-p36 fossem designadas NcSAG1 e Nc-p35/Nc-p43 nomeadas de NcSRS2, utilizando a nomenclatura similar proposta para T. gondii, além de unificar as nomenclaturas das proteínas de N. caninum (HEMPHILL A., GOTTSTEIN B. Identification of a major surface protein on Neospora caninum tachyzoites, Parasitol Res., v.82, p. 497-504, 1996; HOWE D. K.; CRAWFORD A. C.; LINDSAY D.; SIBLEY L. D. The p29 and p35 immunodominant antigens of Neospora caninum tachyzoites are homologous to the family of surface antigens of Toxoplasma gondii, Infection and Immunity, v. 66, p.5322-5328, 1998; Hemphill A., Fuchs N., Sonda S., Hehl A. The antigenic composition of Neospora caninum, Int J Parasitol, v. 29, p. 1175-1188, 1999).

[020] A proteína NcSRS2 é um antígeno comprovadamente envolvido de maneira funcional no processo de adesão e invasão na célula hospedeira. Ela está presente tanto em taquizoítos quanto em bradizoítos, no entanto têm sua expressão de forma diferenciada dependendo do estágio da doença. Estudos in vitro demonstram que o bloqueio desta proteína limita a capacidade de adesão e penetração de células hospedeiras pelo parasito, salientando a importância desta proteína nestes processos. A proteína NcSAG1, também possui grande importância no reconhecimento e invasão da célula, além de ser considerada uma das proteínas mais imunogênicas de N. caninum. Porém, está presente somente nos taquizoítos, tornando-se uma alternativa para o diagnóstico da fase aguda da neosporose. Um estudo experimental mostrou que anticorpos contra este antígeno são detectados em altos níveis no começo da infeção, no entanto diminuem drasticamente após 30 dias do aborto em vacas (HOWE D. K.; CRAWFORD A. C.; LINDSAY D.; SIBLEY L. D. The p29 and p35 immunodominant antigens of Neospora caninum tachyzoites are homologous to the family of surface antigens of Toxoplasma gondii, Infection and Immunity, v. 66, p.5322-5328, 1998; DUBEY, J.P., SCHARES, G. Neosporosis in animals-The last five years, Vet. Parasitol, v. 180, p. 90-108, 2011; NISHIKAWA Y., TRAGOOLPUA K., MAKALA L., XUAN X., NAGASAWA H. Neospora caninum NcSRS2 is a transmembrane protein that contains a glycosylphosphatidylinositol anchor in insect cells, Veterinary Parasitology, v. 109, p.191-201, 2011).

[021] Ainda que se tenha conhecimento dos principais alvos para o desenvolvimento de testes mais precisos, a utilização do antígeno bruto, ou até mesmo purificado do patógeno, é comumente utilizado, e pode conferir desvantagens às técnicas, como a possibilidade de reações cruzadas e custos mais elevados, por ser necessária a manutenção de linhagens celulares "in vitro". As técnicas moleculares surgem para proporcionar aos testes de diagnóstico, resultados mais eficientes, através da utilização de vetores contendo características singulares, além da utilização de sistemas de expressão de proteínas hetorólogas com custos mais baixos, a possibilidade de se utilizar os genes de interesse de forma truncada, mantendo-se somente a sequência do DNA específica do organismo de interesse. Neste contexto, a utilização de proteínas recombinantes para o diagnóstico da neosporose torna-se uma alternativa para se chegar a resultados mais sensíveis e específicos. Analisando o estado da técnica para neoporose nos últimos 10 anos, é possível afirmar que a maior parte dos trabalhos desenvolvidos, fizeram uso de proteínas recombinantes, destacando-se a utilização dos antígenos NcSRS2 e NcSAGl como as mais utilizadas na confecção de imunodiagnósticos (ANDREOTTI R., MATOS M. F., GONCALVES K. N., OSHIRO L. M., LIMA-JUNIOR M. S., PAIVA F., LEITE F. L. Comparison of indirect ELISA based on recombinant protein NcSRS2 and IFAT for detection of Neospora caninum antibodies in sheep, Rev Bras Parasitol Vet, v.18, p.19-22, 2009; BORSUK S., ANDREOTTI R., LEITE F. P., PINTO L. S., SIMIONATTO S., HARTLEBEN C. P., GOETZE M., OSHIRO L. M., MATOS M. F, BERNE M. E. Development of an indirect ELISA-NcSRS2 for detection of Neospora caninum antibodies in cattle, Vet Parasitol, v.177, p. 33-38, 2011; DONG J., OTSUKI T., KATO T., PARK E. Y. Tracking Neospora caninum parasites using chimera monoclonal antibodies against its surface antigen-related sequences (rNcSRS2), J Biosci Bioeng, v. 117, p. 351-7, 2014; HIASA J., KOHARA J., NISHIMURA M., XUAN X., TOKIMITSU H., NISHIKAWA Y. ELISAs based on rNcGRA7 and rNcSAG1 antigens as an indicator of Neospora caninum activation, Vet Parasitol, v. 187, p. 379-85, 2012; MORAVEJI M., HOSSEINI A., MOGHADDAR N., NAMAVARI M. M., ESKANDARI M. H. Development of latex agglutination test with recombinant NcSAG1 for the rapid detection of antibodies to Neospora caninum in cattle. Vet Parasitol, v. 189, p. 211-7, 2012; SA, G. L., PACHECO D. B., MONTE L. G., SINNOTT F. A., XAVIER M. A., RIZZI C., BORSUK S., BERNE M. E., ANDREOTTI R., HARTLEBEN C. P. Diagnostic potential of anti-rNcp-43 polyclonal antibodies for the detection of Neospora caninum, Curr Microbiol, v. 68, p. 472-6, 2014; TAKASHIMA, Y., TAKASU, M., YANAGIMOTO, I., HATTORI, N., BATANOVA, T., NISHIKAWA, Y., KITOH K. Prevalence and dynamics of antibodies against NcSAG1 and NcGRA7 antigens of Neospora caninum in cattle during the gestation period, J Vet Med Sci, v. 75, p. 1413-8, 2013; SINNOTT F. A., MONTE L. G., COLLARES T. F., DE MATOS B. M., PACHECO D. B., BORSUK S., ANDREOTTI R., HARTLEBEN C. P. Blocking elisa using recombinant NcSRS2 protein for diagnosing bovine neosporosis, Curr. Microbiol, v. 70, p. 429-432, 2015; ZHOU M., CAO S., SEVINC F., SEVINC M., CEYLAN O., LIU M. , WANG G., MOUMOUNI P. F., JIRAPATTHARASATE C., SUZUKI H., NISHIKAWA Y., XUAN X. Enzyme-linked immunosorbent assays using recombinant TgSAG2 and NcSAG1 to detect Toxoplasma gondii and Neospora caninum-specific antibodies in domestic animals in Turkey, J Vet Med Sci, v. 78, p. 1877-1881, 2017).

[022] Como foi abordado, inúmeros trabalhos vêm sendo desenvolvidos para se aperfeiçoar o diagnóstico da neosporose. Porém, as estratégias utilizadas até o momento possuem alguma deficiência, ou necessitam de mais conhecimento para sua utilização. Este fato, associado à falta de um diagnóstico no que tange a sensibilidade e especificidade na detecção da infecção, tanto na sua fase inicial, quanto crônica, ressaltam a necessidade do desenvolvimento de técnicas mais eficientes e que auxiliem no controle dessa doença.

[023] Nos bancos de dados de depósitos de patentes podemos obter um panorama da produção científica e tecnológica relacionado ao estado da arte sobre o diagnóstico para a Neospora caninum, e pode-se observar que até o momento, nenhum depósito foi feito utilizando as proteínas NcSRS2 e NcSAG1 combinadas, para um diagnóstico mais eficaz da neosporose em ruminantes.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[024] A presente invenção refere-se à expressão da sequência gênica de Neospora caninum que codifica para o antígeno de superfície NcSAG1, sequência disponível no Genbank (acesso AAD25091.1), em vetor pAE, com promotor induzível por IPTG, e cepa de expressão de E. coli BL21-CodonPlus (DE3)-RP, tendo sido testada outras cepas de E. coli neste estudo, no entanto só a RP foi capaz de expressar a proteína. A rNcSAG1 gerada também possui uma cauda contendo 6 histidinas na região amino-terminal, visando facilitar o processo de purificação. Mais especificamente, a invenção compreende a associação da rNcSAG1 com a proteína recombinante NcSRS2, para a produção de um imunoensaio eficaz no diagnóstico da infecção por N. caninum.

[025] Além disso, a presente estratégia apresenta inúmeras vantagens quando comparada a outros produtos, uma vez que esta associação proteica foi escolhida visando unir pontos satisfatórios no que se diz respeito a toda pesquisa já realizada para o controle da neosporose.

[026] Neste contexto, a associação de antígenos imunogênicos tenderia a melhorar os resultados obtidos nos diagnósticos já descritos anteriormente, além de não apresentarem os resultados falso-positivos, provenientes das reações cruzadas entre outros protozoários aplicomplexos, uma vez que esta invenção se trata de um diagnóstico composto por antígenos recombinantes truncados.

[027] A figura 1 corresponde a eletroforese em gel de agarose, confirmando a ligação do vetor pAE ao gene sagl. Em (1) Marcador 1 Kb plus; (2) pAE circular (≈ 2822 pb); 3: pAE após ser digerido pelas enzimas EcoRI e BamHI; 4: pAE/NcSAG1 circular (≈ 3763 pb); 5: pAE/NcSAG1 digerido com as enzimas de restrição EcoRI e BamHI (NcSAGl ≈ 941 pb).

Breve Descrição dos Desenhos

[028] A figura 2 corresponde ao western blotting demonstrando a banda reativa da proteína rNcSAGl, expressa em E. coli cepa BL21-CodonPlus (DE3)-RP, utilizando anticorpo monoclonal anti- 6xhistidina. Em (1) E. coli BL21 Star (DE3) transformada com o plasmídeo pAE/NcSAG1; (2) BL21 pLysE (DE3) transformada com o plasmídeo pAE/NcSAG1; (3) BL21 pLysS (DE3) transformada com o plasmídeo pAE/NcSAG1; (4) BL21 Roseta (DE3) transformada com o plasmídeo pAE/NcSAG1; (5) BL21-CodonPlus (DE3)-RP transformada com o plasmídeo pAE/NcSAG1 e (6) proteína rNcSRS2 como controle (≈ 30 KDa).

[029] A figura 3 corresponde ao Western blotting demonstrando a antigenicidade das proteínas rNcSRS2 e rNcSAGl, quando confrontadas com soros de animais naturalmente infectados. Em (MP) Marcador de peso molecular Rainbow™ (GE Healthcare); (1) Proteína rNcSRS2 e soro bovino positivo para toxoplasmose; (2) Proteína rNcSAGl e soro bovino positivo para toxoplasmose; (3) Proteína rNcSRS2 e pool de soros bovino positivo para neosporose; (4) Proteína rNcSRS2 e pool de soros ovino positivo para neosporose; (5) Proteína rNcSAGl e pool de soros bovino positivo para neosporose e (6) Proteína rNcSAGl e pool de soros ovino positivo para neosporose;

[030] A figura 4 representa a análise do ELISA indireto realizado com as proteínas recombinantes (rNcSAGl e rNcSRS2), de forma individual e em associação, como antígenos, testadas com 106 soros bovinos positivos e 110 soros bovinos negativos para Neospora caninum, obtida através do Receiver Operating Characteristic (ROC). Em (A) ELISA-rNcSRS2, (B) ELISA-rNcSAG1 e (C) ELISA rNcSRS2/NcSAG1.

[031] A figura 5 representa a análise do ELISA indireto realizado com as proteínas recombinantes (rNcSAG1 e rNcSRS2), de forma individual e em associação, como antígenos, testadas com 48 soros ovinos positivos e 106 soros ovinos negativos para Neospora caninum, obtida através do Receiver Operating Characteristic (ROC). Em (A) ELISA-rNcSRS2, (B) ELISA-rNcSAG1 e (C) ELISA rNcSRS2/NcSAG1.

[032] A figura 6 apresenta a Análise ROC (Receiver operating characteristics) para o ELISA com as proteínas rNcSRS2 e rNcSAGl, de forma individual e em associação, com os soros bovinos. Em (A) curva ROC para o ELISA com rNcSRS2 demonstando uma área sob a curva de 0,930 (0,887-0,960 com 95% de intervalo de confiança) , (B) curva ROC para o ELISA com rNcSAG1 demonstando uma área sob a curva de 0, 901 (0, 853-0, 937 com 95% de intervalo de confiança) e (C) curva ROC para o ELISA com rNcSRS2/rNcSAG1 demonstando uma área sob a curva de 0,981 (0,953-0,995 com 95% de intervalo de confiança).

[033] A figura 7 apresenta a Análise ROC (Receiver operating characteristics) para o ELISA com as proteínas rNcSRS2 e rNcSAG1, de forma individual e em associação, com os soros ovinos. Em (A) curva ROC para o ELISA com rNcSRS2 demonstando uma área sob a curva de 0,916 (0,861-0,954 com 95% de intervalo de confiança) , (B) curva ROC para o ELISA com rNcSAG1 demonstando uma área sob a curva de 0, 897 (0, 838-0, 940 com 95% de intervalo de confiança) e (C) curva ROC para o ELISA com rNcSRS2/rNcSAG1 demonstando uma área sob a curva de 0,999 (0,975-1,000 com 95% de intervalo de confiança).

[034] A figura 8 corresponde aos valores preditivos positivos (losango) e negativos (quadrados) para o ELISA com as proteínas em associação, em níveis de prevalência variáveis de neosporose bovina e ovina. Os valores foram determinados pela análise ROC, baseando-se na sensibilidade e especificidade do imunoensaio. (A) : ELISA rNcSRS2/rNcSAG1 - Bovinos e (B) : ELISA rNcSRS2/rNcSAG1 - Ovinos.

Descrição detalhada da invenção

[035] Visando propor um diagnóstico satisfatório contra a neosporose bovina e ovina, a presente invenção propõe a associação das proteínas recombinantes rNcSAG1 e rNcSRS2.

[036] A presente invenção é descrita em mais detalhes como a seguir: A invenção se utiliza de cepas Escherichia coli TOP10, BL21 STAR e BL21-CodonPlus (DE3)-RP. Para as culturas em meio sólido, 1,5% de ágar bacteriológico é adicionado ao meio de cultura. As cepas de E. coli são cultivadas em meio Luria Bertani (LB) ou LB contendo 1,5% de ágar bacteriológico por 16 h a 37 °C. Quando necessário o meio LB deve ser acrescido com 100 μg/mL de ampicilina (TOP10 e BL21 STAR) ou cloranfenicol (BL21-CodonPlus (DE3)-RP).

[037] Para a expressão das proteínas recombinantes a invenção utiliza da amplificação do gene NcSRS2 (SEQ ID NO:5)que é realizada utilizando os primers Foward e Reverse conforme descritos na SEQ ID NO:6 e SEQ ID NO:7; E através de sequência disponível no Genbank (acesso AAD25091.1) um gene sintético (SEQ ID NO:3) contendo códons preferenciais para expressão da proteína NcSAG1 foi sintetizada.

[038] O domínio antigênico de NcSRS2, é clonado no vetor pETlOO/D-TOPO. O plasmídeo recombinante (pET100/D-TOPO/NcSRS2), contendo a CDS correspondente a proteína rNcSRS2 (SEQ ID NO:8) foi usado para a transformação de Escherichia coli BL21 Star. A seguir, as células de E. coli em fase exponencial de crescimento foram tratadas com 1 mM/mL de isopropil ~-D-thiogalactoside (IPTG) por 3 h a 37 °C para induzir a expressão da NcSRS2 recombinante. A expressão da proteína recombinante NcSRS2 foi confirmada por eletroforese em SDS-PAGE e Western blotting usando anticorpo monoclonal anti6xhistidina conjugado com a enzima peroxidase. As bandas foram reveladas usando solução substrato cromógena contendo 6 mg de 3,3'diaminobenzidine, 0,03 % de sulfato de níquel, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0 e 0,03 % de peróxido de hidrogênio. NcSRS2 recombinante foi solubilizada em tampão contendo O, 2 % de N-lauroyl sarcosine por 72 h a 4 °C.

[039] A sequência do gene NcSAG1 (SEQ ID NO:1) é utilizada para se desenhar um gene sintético (SEQ ID NO:3), e este é clonado nos sítios EcoRI e BamHI do vetor de expressão pAE. Para isso, pAE e NcSAGl são digeridos com as enzimas de restrição EcoRI e BamHI (FERMENTAS), conforme recomendação do fabricante e posteriormente, ligados com auxílio da enzima T4 DNA ligase (FERMENTAS), gerando como produtos os plasmídeos recombinantes pAE/NcSAG1 (Figura 1), contendo a CDS correspondente a proteína rNcSAG1 (SEQ ID NO:2). Os produtos da ligação são transformados por eletroporação em células de E. coli TOP 10 competentes, e cultivados em meio LB com 100 μg/mL de ampilicina por 16 h a 37 °C. Uma triagem rápida por lise de colônia com fenol clorofórmio (v/v), seguida de digestão com enzimas de restrição é realizada para caracterização dos clones recombinantes.

[040] Ainda, para a expressão da proteína recombinante NcSAG1, bactérias E. coli, de diferentes cepas foram utilizadas (E. coli BL21 Star (DE3), BL21 pLysE (DE3), BL21 pLysS (DE3), BL21 Roseta (DE3) e BL21-CodonPlus (DE3)-RP) e transformadas por choque térmico para inserção do vetor recombinante pAE/NcSAG1. A indução da expressão se dá pela adição de 1 mM de IPTG ao cultivo mantido sob agitação orbital a 37 °C por 3 h. A expressão da proteína recombinante é confirmada através da técnica de Western blotting (somente a cepa BL21-CodonPlus (DE3)-RP foi capaz de expressar a proteína) (SAMBROOK J., RUSSEL D.W. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 2001) utilizando anticorpo monoclonal anti-6xhistag conjugado com peroxidase (Sigma Aldrich). Para isso, as amostras contendo rNcSAGl são misturadas com tampão (100-mM Tris-HCl pH 6.8, 100-mM 2- mercaptoethanol, 4% SDS, 0.2% bromophenol blue, 20% glycerol) sob condições redutoras, aquecidas a 100 °C durante 10 min e, submetidas a eletroforese em gel SDS-PAGE 12%. Posteriormente é realizada a transferência para membrana de nitrocelulose (GE Healthcare) , que após 2 h, é bloqueada com PBS contendo 5% de leite desnatado durante 1 h a 37 °C. Em seguida, adiciona-se anti-6Xhistag (Sigma Aldrich) à membrana na diluição de 1:4000 a 37 °C durante 1 h. As membranas são lavadas com PBS tween 0,05% (PBS-T), e incubadas com anti-IgG de camundongo conjugado com peroxidase diluído (Sigma Aldrich) a 1:4000 em PBS-T a 37 °C durante 1 h. A banda reativa é revelada utilizando 3,3'-diaminobenzidina (DAB) e H2O2. A identidade da proteína de superfície rNcSAG1 (SEQ ID NO:4) recombinante, pode ser confirmada, conforme visualizado na Figura 2 através da banda reativa com peso molecular aproximados de 30 kDa.

[041] A purificação das proteínas NcSRS2 e NcSAG1 é realizada por cromatografia de afinidade em coluna de sepharose (HisTrap™; GE Healthcare), carregada com níquel, uma vez que as proteínas possuem em sua extremidade amino terminal uma sequência de 6 aminoácidos histidina. A pureza das mesmas é determinada através de um SDS-PAGE 12% e a concentração determinada pelo kit BCA (Pierce).

[042] As proteínas recombinantes rNcSRS2 e rNcSAG1 foram consideradas antigênicas, uma vez que os anticorpos presentes nos soros dos animais positivos para neosporose através de IFI (bovinos e ovinos) foram capazes de reconhecer as proteínas através de western blotting (Figura 3). Foi utilizado um pool de soros bovinos positivos para T. gondii, e não apresentou reação frente às duas proteínas, podendo-se concluir que ambas, nas suas formas truncadas, são específicas do protozoário N. caninum.

[043] A presente invenção poderá ser mais bem compreendida através do exemplo que se segue, porém esta não é limitada ao referido exemplo.

EXEMPLO - IMUNOENSAIO DE ELISA INDIRETO UTILIZANDO PROTEÍNAS RECOMBINANTES PARA DIAGNÓSTICO DE NEOSPOROSE

[044] Este exemplo ilustra a análise de imunorreatividade das proteínas recombinantes rNcSRS2 e rNcSAG1, de forma individual ou em associação, aos soros de animais infectados com Neospora caninum e seu potencial na utilização em imunodiagnósticos.

[045] Neste exemplo foi utilizado um total de 370 amostras de soros, disponíveis no banco de soros do Laboratório de Biotecnologia infecto-parasitária, da Universidade Federal de Pelotas. Desses, 216 soros eram de bovinos (106 amostras positivas e 110 amostras negativas) e 154 soros de ovinos (48 amostras positivas e 106 amostras negativas). Todos os soros utilizados foram coletados de rebanhos que apresentavam algum tipo de problemas reprodutivos. A soro-positividade ou negatividade das amostras foi previamente confirmadas pela técnica de IFI, sendo considerados positivos os soros que apresentaram títulos superiores a 100 em ovinos, e 200 em bovinos (Pare et al., 1995). Também utilizamos soro de terneiro recém-nascido e soro de cordeiro recém-nascido, de rebanhos que não apresentavam problemas reprodutivos, sendo denominados de soro normal de terneiro (SNT) e soro normal de cordeiro (SNC). Os soros das progenitoras foram analisados por IFI, conforme citado no parágrafo anterior, sendo a negatividade para neosporose, o critério para coleta do soro do terneiro e do cordeiro.

[046] Para o desenvolvimento de um novo método de diagnóstico por ELISA indireto, cada proteína recombinante (rNcSAG1 e rNcSRS2) foi testada individualmente e em associação. De acordo com as padronizações, foram utilizadas 100 ng de cada proteína no ensaio individual e 50ng de cada proteína no ensaio em associação, e a diluição de soro 1:100 nos ensaios individuais e em associação, realizados de acordo com a distribuição abaixo:
Estratégia I: rNcSRS2
Estratégia II: rNcSAG1
Estratégia III: rNcSRS2/rNcSAG1

[047] Inicialmente as placas foram sensibilizadas com as proteínas diluídas em tampão carbonato-bicarbonato pH 9,6, 100ng de proteína/poço (Estratégia I e II) e 50ng de cada proteína/poço (Estratégia III), em um volume de 100 μL/cavidade, testados em duplicata, por 16 h, a 4 °C. Após lavagens com PBS contendo Twen 20% (PBS-T), as placas foram acondicionadas a -20 °C até a sua utilização. O bloqueio das placas foi feito com PBS-T acrescido de 1% de Soro Fetal Bovino (SFB) , por 2 h a 37 °C e posterior, as placas foram lavadas 5 vezes com PBS-T. Os soros positivos e negativos, de bovinos e ovinos, foram adicionados separadamente, diluídos 1:100 em PBS-T+1% de SFB, por 1h a 37 °C. Como controles negativos, utilizamos soro normal de terneiro (SNT) e soro normal de cordeiro (SNC). Após a incubação e posterior lavagens, foi adicionado a placa o anticorpo secundário anti-bovino conjugado com peroxidase (1:4000) (Sigma-Aldrich) e o anticorpo secundário anti-ovino conjugado com peroxidase (1:4000) (Sigma-Aldrich), respectivamente onde foi adicionado o soro relativo à espécie, diluídos em PBS-T+1% de SFB, por 1h a 37 °C. Para a reação colorimétrica uma solução contendo 0,01 g de ortofenilenodiamina [OPD, Sigma] diluído em 10 mL de tampão citrato-fosfato pH=4,0 e 50 μL de H2O2, foi adicionado a placa. Após interrupção da reação com H2SO4 4 N, a absorbância foi determinada numa faixa de comprimento de onda entre 450 e 492 nm em leitor de microplaca (Microplate reader MR-96A, Mindray).

[048] Para avaliar a especificidade e a sensibilidade do teste ELISA os dados obtidos na leitura foram submetidos à análise ROC (Receiver Operating Characteristic) utilizando o software MedCalc estatística (versão 10.3.0). A avaliação foi realizada com o teste das proteínas individuais e associadas, para as duas espécies testadas, gerando ao final 6 curvas ROC referentes ao dados analisados.

[049] A Figura 4 indica a distribuição dos resultados individuais (figuras 4A e 4B) e em associação (figura 4C) em relação aos soros bovinos, e a Figura 5 indica a distribuição dos resultados individuais (figuras 5A e 5B) e em associação (figura 5C) em relação aos soros ovinos. A área sob a curva foi usada para determinar a acurácia dos imunoensaios (Figuras 6 e 7), obtendo-se como resultados para bovinos os valores de 0,930, 0,901 e 0,981 e para ovinos os valores 0,916, 0,897 e 0,999 para a estratégia I, II e III, respectivamente para os dois testes.

[050] Os valores dos pontos de corte para bovinos foram de >0,59 para rNcSRS2, >0,64 para rNcSAG1 e >0,41 para rNcSAG1/rNcSRS2. A rNcSRS2, rNcSAG1 e rNcSAG1/rNcSRS2 mostraram 91,5%, 84,9% e 98,1% de sensibilidade e, 96,4%, 97,3% e 99,1% de especificidade, respectivamente.

[051] Os valores dos pontos de corte para ovinos foram de >0,253 para rNcSRS2, >0,23 para rNcSAG1 e >0,20 para rNcSAG1/rNcSRS2. A rNcSRS2, rNcSAG1 e rNcSAG1/rNcSRS2 mostraram 89,6%, 89,6% e 100% de sensibilidade e, 96,3%, 92,6% e 97,2% de especificidade, respectivamente.

[052] Através destes resultados podemos então inferir que a associação das proteínas recombinantes rNcSAG1 e rNcSRS2 apresentou resultados promissores, superando significativamente o valor da especificidade de 88,7% apresentado no ensaio para bovinos realizado por nosso próprio grupo de pesquisa utilizando a rNcSRS2 como único antígeno em um ELISA de bloqueio (SINNOTT F. A., MONTE L. G., COLLARES T. F., DE MATOS B. M. , PACHECO D. B., BORSUK S., ANDREOTTI R., HARTLEBEN C. P. Blocking elisa using recombinant ncsrs2 protein for diagnosing bovine neosporosis, Curr. Microbiol., v. 70, p. 429-432, 2014). Ainda para bovinos, DONG et al (2012) associaram três proteínas para o desenvolvimento de um ELISA (NcSRS2, NcGRA7 e NcSAG1). No entanto, obteveram uma sensibilidade de 91,7%, e a comparação dos resultados obtidos foram feitas através de um kit comercial no formato ELISA, e não com a técnica padrão. FERNANDES-PINHEIRO et al. (2015) descreveram um ELISA indireto para ovinos, utilizando a proteína NcRSR2, com uma especificidade de 94,5%, comparado com 97,2% obtidos no nosso trabalho com as proteínas associadas, demonstrando que a associação das proteínas torna o diagnóstico mais preciso (DONG J., OTSUKI T., KATO T., PARK E.Y. Development of a diagnostic method for neosporosis in cattle using recombinant Neospora caninum proteins, BMC Biotechnol, v. 12, 2012; FERNANDES-PINHEIRO A., BORSUK S., BERNE M. E. A., PINTO L. S., ANDREOTTI R., ROOS T., ROLOFF B. C., LEITE, F. P L. Use of ELISA based on NcSRS2 of Neospora caninum expressed in Pichia pastoris for diagnosing neosporosis in sheep and dogs, Electron. Braz. J. Vet. Parasitol. Jaboticabal, v. 24, p. 148154, 2015).

[053] Baseado na sensibilidade e na especificidade do ELISA rNcSRS2/rNcSAG1, os valores preditivos negativos e positivos do ensaio com as proteínas associadas variaram de 85,2% a 99,7% e de 92,3% a 99,8% respectivamente para bovinos (Figura 8A) , e para ovinos os valores preditivos positivos variaram de 79,8% a 99, 6%, não houve variação dos negativos, uma vez que 100% dos soros foram compatíveis com o resultado da IFI (Figura 8B) , os valores preditivos obtidos dependendem da prevalência da neosporose exibida em uma área específica.

Claims (3)

1. Método imunodiagnóstico da Neosporose caracterizado por utilizar as proteínas recombinantes rNcSAG1 (surface antigen-1) (SEQ ID NO:4), e a proteína rNcSRS2 (SAG1-related sequence 2) (SEQ ID NO:9) produzidas a partir de vetor recombinante em cepas de Escherichia coli;
2. Método imunodiagnóstico da Neosporose caracterizado por compreender a utilização das proteínas recombinantes purificadas rNcSRS2 e rNcSAG1 na concentração de 25 a 500ng de proteína por cavidade, em associação para a composição do imunoensaio;
3. Método imunodiagnóstico da Neosporose conforme reivindicações 1 e 2 caracterizado por detectar enfermidade em ruminantes e mamíferos.

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