CN101384714A - 新的病毒载体 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了在双启动子控制之下能够表达与病毒基因融合的外源基因的重组转移载体和重组杆状病毒,及其生产方法,以及含有重组杆状病毒作为活性成分的药物。
Description
技术领域
本发明提供了新的转移载体、通过转移载体和杆状病毒DNA的同源重组获得的重组的杆状病毒、以及它们的生产方法。
本发明还涉及了含有重组杆状病毒作为活性成分的药物(例如疫苗、用于传染病例如疟疾和流感的预防性或治疗性药物)。
技术背景
杆状病毒在使用昆虫细胞对目标蛋白进行工业化生产的方法中已经被用作载体。近年来,已经发现杆状病毒不仅可以将外源基因导入昆虫细胞,而且可以导入到哺乳动物细胞中,并且已经发现了在载体中导入用于治疗的基因的可能性。在专利文件1中,公开了具有多个独立的启动子的重组的杆状病毒表达载体,该载体由含有在来自杆状病毒早期基因的启动子中编码病毒的非结构蛋白的基因的DNA区域、以及含有在来自晚期基因的启动子中编码病毒结构蛋白的基因的DNA区域构成。
在专利文件2中,公开了将非哺乳动物DNA病毒导入细胞以及外源基因在哺乳动物细胞中表达的方法,其中该DNA病毒含有受控制的启动子以便外源基因能够从其中所需的外源基因已经连接了多个独立启动子的载体得到表达。
此外,在专利文件3中,已经公开了使用杆状病毒通过基因重组技术生产蛋白的方法,并公开了如下生产蛋白的方法:将杆状病毒的gp64基因与编码所需蛋白的基因相连获得的融合基因进行表达、以其中所需的蛋白已经与病毒粒子融合的形式生产所需的蛋白、收集与所需蛋白融合的病毒粒子、将所需的蛋白从病毒粒子上切下来收集所需的蛋白。
在专利文件4中,对于杆状病毒表达载体系统,公开了重组杆状病毒表达载体具有多个独立的启动子,包含编码检测标记物的第一个核酸序列,所述标记物以能够使宿主细胞中具有活性而在不接受的细胞中不具有活性的第一个启动子起作用的方式连接,以及包含外源核酸序列的第二个核酸序列,所述外源核酸序列以能够使在不接受的细胞中具有活性的第二个启动子起作用的方式连接。
在专利文件5中,已经公开了与来自鸡β-肌动蛋白的CAG启动子相连的表达流感病毒血凝素(HA)抗原的重组杆状病毒载体可以用作疫苗制剂,因为该载体对流感病毒的感染具有预防效果。
在专利文件6中,公开了包含共转染步骤的杆状病毒载体的生产方法,其中编码可以在细胞表面表达的蛋白的基因被分别连接到杆状病毒启动子和来自哺乳动物细胞的启动子的质粒、以及其中编码可以在细胞表面表达的蛋白的基因被分别连接到两个杆状病毒启动子的质粒,被共转染到昆虫细胞中。
在专利文件7中,公开了使用其中来自流感病毒HA的cDNA已经被整合到CAG启动子中的重组杆状病毒,对流感病毒的感染的抗流感病毒活性的研究,并且公开了不仅重组杆状病毒而且野生型杆状病毒也具有活性。
这样,近年来,已经开发了各种不同的重组杆状病毒,并且利用重组杆状病毒作为活性成分,已经研究了使用它们开发用于哺乳动物的药物。
在相关技术领域中,对于具有新结构的重组杆状病毒载体、以及使用重组杆状病毒作为活性成分开发对于传染病例如疟疾和流感或疾病例如癌症有效的药物制剂、特别是疫苗制剂,存在着需求。
专利文件1:日本专利No.3366328,多启动子杆状病毒表达系统和缺陷颗粒产品(Multiple promoter baculovirus expression system anddefect particle products)。
专利文件2:WO98/011243,具有修饰的外膜蛋白的非哺乳动物DNA病毒(Non-mammalian DNA virus having modified coating protein)。
专利文件3:JP No.2002-235236-A,生产蛋白的方法(Methods ofproducing proteins)。
专利文件4:JP No.2003-284557-A,用于外源基因表达的新的杆状病毒转染载体和重组杆状病毒(novel baculovirus-transfecting vectorand recombinant baculovirus for expression of foreign gene)。
专利文件5:WO02/062381,杆状病毒载体疫苗(Baculovirus vectorvaccine)
专利文件6:WO04/029259,杆状病毒载体、生产杆状病毒载体的方法以及导入基因的方法(Baculovirus vector,method of producingbaculovirus vector and method of introducing gene)。
专利文件7:JP No.2005-15346-A,含有杆状病毒的抗病毒剂(Baculovirus-containing anti-viral agent)。
发明公开内容
本发明所要解决的问题
本发明的目的是提供新的转移载体、通过重组转移载体和杆状病毒DNA的同源重组获得的重组杆状病毒、以及它们的生产方法。本发明的另一个目的是提供使用重组杆状病毒作为活性成分的药物,特别是疫苗制剂。
解决问题的方法
本发明发现了具有新颖结构的转移载体,能够在昆虫细胞和昆虫细胞之外的脊椎动物(特别是哺乳动物、鸟和鱼)细胞中表达具有所需免疫原性的蛋白、或具有免疫原性的部分蛋白或蛋白与细胞因子的融合蛋白,并发现了通过转移载体与杆状病毒DNA的同源重组获得的重组杆状病毒。通过提供重组杆状病毒,对含有重组杆状病毒作为活性成分、对传染病具有有效的预防性和/或治疗性效果的药物进行了广泛的研究。结果,本发明人新发现了重组杆状病毒具有作为所需药物的效果。
并且,按照本发明,具有新结构的重组转移载体、通过转移载体与杆状病毒DNA的同源重组获得的重组杆状病毒、以及生产它们的方法被证实,并且证实了重组杆状病毒本身可以在靶细胞中用作能够表达具有所需免疫原性的蛋白的药物,并且可用作传染病例如疟疾和流感的预防性药物,因此完成了本发明。
本发明提供了在下面的[1]到[31]中显示的发明:
[1]生产包含其中整合了双启动子和融合基因结构的转移载体的方法,特征在于包含至少一个编码能够成为病毒粒子的成分的蛋白的基因和至少一个免疫原性外源基因的融合基因,被连接到连有一个脊椎动物启动子和另一个杆状病毒启动子的双启动子的下游。
[2][1]中的方法,其中脊椎动物启动子是哺乳动物启动子。
[3][1]或[2]中的方法,其特征为编码至少一种能够成为病毒粒子的成分的蛋白的基因是杆状病毒gp64基因、疱疹性口腔炎病毒糖蛋白基因、I型人类免疫缺陷病毒糖蛋白基因、人类呼吸道合胞病毒膜糖蛋白基因、A型流感病毒血凝素蛋白基因、B型流感病毒血凝素蛋白基因、单纯疱疹病毒糖蛋白基因和鼠肝炎病毒S蛋白基因中的任何一个。
[4][1]或[2]中的方法,其中脊椎动物启动子选自细胞肥大病毒启动子、SV40启动子、反转录病毒启动子、金属硫蛋白启动子、热休克蛋白启动子、CAG启动子、延伸因子1α启动子、肌动蛋白启动子、泛素启动子、白蛋白启动子和II类MHC启动子的任何一个。
[5][1]到[4]任何一个中的方法,其中杆状病毒启动子选自多角体蛋白启动子、p10启动子、IE1启动子、IE2启动子、p35启动子、p39启动子以及gp64启动子。
[6][1]到[5]任何一个中的方法,其中免疫原性外源基因选自单独的疟疾抗原、流感抗原、结核分枝杆菌(M.tuberculosis)抗原、SARS病毒抗原、西尼罗河热病毒抗原、登革热病毒抗原、HIV抗原、HCV抗原、利什曼原虫抗原、锥虫抗原、住白细胞原虫抗原中的任何一个,或是从这些抗原基因组选择的至少一个与细胞因子的融合抗原。
[7][1]到[6]任何一个中的方法,其中转移载体是pDual-Hsp65-gp64、pDual-PbCSP-gp64、pDual-H1N1/HA1-gp64、pDual-PbTRAMP-gp64、pDual-PbAMA1D123-gp64、pDual-PbMSP129-gp64、pDual-PfCSP-gp64、pDual-PfAMA1-gp64、pDual-Pfs25-gp64、pDual-H5N1/HA1-gp64、pDual-SARS/S-gp64、pCP-H1N1/HA1-gp64、pCAP-H1N1/HA1-gp64、pCU-H1N1/HA1-gp64、pDual-H1N1/NP-gp64、pDual-H1N1/M2-gp64、pDual-H1N1/NAe-gp64、pDual-M2e-gp64、pCP-HA1/NC99-gp64、pCP-H1N1/HA0-gp64、pCP-H1N1/HA2-gp64、pCP-H1N1/HA1-vp39和pCP-H1N1/NP-vp39中的任何一个。
[8]生产重组杆状病毒的方法,包括生产含有其中已经整合了双启动子和融合基因结构的转移载体的步骤,其特征为含有至少一个编码能够成为病毒粒子成分的蛋白的基因和至少一个免疫原性外源基因的融合基因被连接到连有一个脊椎动物启动子和另一个杆状病毒启动子的双启动子的下游;将转移载体和杆状病毒DNA共转染到昆虫的宿主细胞中的步骤;以及分离重组杆状病毒的步骤。
[9][8]中的方法,其特征为编码至少一种能够成为病毒粒子成分的蛋白的基因是杆状病毒gp64基因、疱疹性口腔炎病毒糖蛋白基因、I型人类免疫缺陷病毒糖蛋白基因、人类呼吸道合胞病毒膜糖蛋白基因、A型流感病毒血凝素蛋白基因、B型流感病毒血凝素蛋白基因、单纯疱疹病毒糖蛋白基因和鼠肝炎病毒S蛋白基因中的任何一个。
[10][9]中的方法,其中脊椎动物启动子选自细胞肥大病毒启动子、SV40启动子、反转录病毒启动子、金属硫蛋白启动子、热休克蛋白启动子、CAG启动子、延伸因子1α启动子、肌动蛋白启动子、泛素启动子、白蛋白启动子和II类MHC启动子的任何一个。
[11][8]到[10]任何一个中的方法,其中杆状病毒启动子选自多角体蛋白启动子、p10启动子、IE1启动子、p35启动子、p39启动子以及gp64启动子。
[12][8]到[11]任何一个中的方法,其中免疫原性外源基因选自单独的疟疾抗原、流感抗原、结核分枝杆菌抗原、SARS病毒抗原、西尼罗河热病毒抗原、登革热病毒抗原、HIV抗原、HCV抗原、利什曼原虫抗原、锥虫抗原、住白细胞原虫抗原中的任何一个,或从这些抗原基因组选择的一个与细胞因子的融合抗原。
[13][8]到[12]任何一个中的方法,其中的重组杆状病毒是AcNPV-Dual-Hsp65、AcNPV-Dual-PbCSP、AcNPV-Dual-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-PbTRAMP、AcNPV-Dual-PbAMA1D123、AcNPV-Dual-PbMSP129、AcNPV-Dual-PfCSP、AcNPV-Dual-PfAMA1、AcNPV-Dual-Pfs25、AcNPV-Dual-H5N1/HA1、AcNPV-Dual-SARS/S、AcNPV-H1N1/HA1、AcNPV-CAP-H1N1/HA1、AcNPV-CU-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-H1N1/NP、AcNPV-Dual-H1N1/M2、AcNPV-Dual-H1N1/NAe、AcNPV-Dual-M2e、AcNPV-CP-HA1/NC99、AcNPV-CP-H1N1/HA0、AcNPV-CP-H1N1/HA2、AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39和AcNPV-CP-H1N1/NP-vp39中的任何一个。
[14]一种转移载体,包含整合的结构,在该结构中含有至少一个编码能够成为病毒粒子成分的蛋白的基因和至少一个免疫原性外源基因的融合基因被连接到连有一个脊椎动物启动子和另一个杆状病毒启动子的双启动子的下游。
[15][14]中的转移载体,其包含的整合的结构中含有编码至少一种能够成为病毒粒子成分的蛋白的基因和至少一个免疫原性外源基因的融合基因被连接到连有一个脊椎动物启动子和另一个杆状病毒启动子的双启动子的下游。
[16][14]或[15]中的转移载体,其特征为编码至少一种能够成为病毒粒子成分的蛋白的基因是杆状病毒gp64基因、疱疹性口腔炎病毒糖蛋白基因、I型人类免疫缺陷病毒糖蛋白基因、人类呼吸道合胞病毒膜糖蛋白基因、A型流感病毒血凝素蛋白基因、B型流感病毒血凝素蛋白基因、单纯疱疹病毒糖蛋白基因和鼠肝炎病毒S蛋白基因中的任何一个。
[17][15]中的转移载体,其中脊椎动物启动子选自细胞肥大病毒启动子、SV40启动子、反转录病毒启动子、金属硫蛋白启动子、热休克蛋白启动子、CAG启动子、延伸因子1α启动子、肌动蛋白启动子、泛素启动子、白蛋白启动子和II类MHC启动子的任何一个。
[18][15]到[17]任何一个中的转移载体,其中杆状病毒启动子选自多角体蛋白启动子、p10启动子、IE1启动子、IE2启动子、p35启动子、p39启动子以及gp64启动子。,
[19][15]到[18]任何一个中的转移载体,其中免疫原性外源基因选自单独的疟疾抗原、流感抗原、结核分枝杆菌抗原、SARS病毒抗原、西尼罗河热病毒抗原、登革热病毒抗原、HIV抗原、HCV抗原、利什曼原虫抗原、锥虫抗原、住白细胞原虫抗原中的任何一个,或从这些抗原基因组选择的一个与细胞因子的融合抗原。
[20][15]到[19]任何一个中的转移载体,其是pDual-Hsp65-gp64、pDual-PbCSP-gp64、pDual-H1N1/HA1-gp64、pDual-PbTRAMP-gp64、pDual-PbAMA1D123-gp64、pDual-PbMSP129、pDual-PfCSP-gp64、pDual-PfAMA1-gp64、pDual-Pfs25-gp64、pDual-H5N1/HA1-gp64、pDual-SARS/S-gp64、pCP-H1N1/HA1-gp64、pCAP-H1N1/HA1-gp64、pCU-H1N1/HA1-gp64、pDual-H1N1/NP-gp64、pDual-H1N1/M2-gp64、pDual-H1N1/NAe-gp64、pDual-M2e-gp64、pCP-HA1/NC99-gp64、pCP-H1N1/HA0-gp64、pCP-H1N1/HA2-gp64、pCP-H1N1/HA1-vp39和pCP-H1N1/NP-vp39中的任何一个。
[21]一种重组杆状病毒,其通过[8]到[13]任何一个中的生产重组杆状病毒的方法生产。
[22][21]中的重组杆状病毒,其是AcNPV-Dual-Hsp65、AcNPV-Dual-PbCSP、AcNPV-Dual-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-PbTRAMP、AcNPV-Dual-PbAMA1D123、AcNPV-Dual-PbMSP129、AcNPV-Dual-PfCSP、AcNPV-Dual-PfAMA1、AcNPV-Dual-Pfs25、AcNPV-Dual-H5N1/HA1、AcNPV-Dual-SARS/S、AcNPV-H1N1/HA1、AcNPV-CAP-H1N1/HA1、AcNPV-CU-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-H1N1/NP、AcNPV-Dual-H1N1/M2、AcNPV-Dual-H1N1/NAe、AcNPV-Dual-M2e、AcNPV-CP-HA1/NC99、AcNPV-CP-H1N1/HA0、AcNPV-CP-H1N1/HA2、AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39和AcNPV-CP-H1N1/NP-vp39中的任何一个。
[23]一种药物组合物,其包含[21]或[22]中的重组杆状病毒。
[24][23]中的药物组合物,其包含AcNPV-Dual-H1N1/HA1、AcNPV-H1N1/HA1、AcNPV-CAP-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-PfCSP、AcNPV-Dual-PfAMA1、AcNPV-Dual-Pfs25、AcNPV-CU-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-H1N1/NP、AcNPV-Dual-H1N1/M2、AcNPV-Dual-H1N1/NAe、AcNPV-Dual-M2e、AcNPV-CP-HA1/NC99、AcNPV-CP-H1N1/HA0、AcNPV-CP-H1N1/HA2、AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39和AcNPV-CP-H1N1/NP-vp39中的任何一个。
[25]包含[21]或[22]中的重组杆状病毒的药物组合物,其中所述组合物通过肌肉内、鼻内或吸入给药。
[26]一种疫苗,其包含AcNPV-Dual-H1N1/HA1、AcNPV-H1N1/HA1、AcNPV-CAP-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-PfCSP、AcNPV-Dual-PfAMA1、AcNPV-Dual-Pfs25、AcNPV-CU-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-H1N1/NP、AcNPV-Dual-H1N1/M2、AcNPV-Dual-H1N1/NAe、AcNPV-Dual-M2e、AcNPV-CP-HA1/NC99、AcNPV-CP-H1N1/HA0、AcNPV-CP-H1N1/HA2、AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39和AcNPV-CP-H1N1/NP-vp39中的任何一个作为活性成分。
[27][26]中的疫苗,其中所述疫苗通过肌肉内、鼻内或吸入给药。
[28]一种用于流感病毒感染的治疗性或预防性药剂,其包含AcNPV-Dual-H1N1/HA1、AcNPV-H1N1/HA1、AcNPV-CAP-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-PfCSP、AcNPV-Dual-PfAMA1、AcNPV-Dual-Pfs25、AcNPV-CU-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-H1N1/NP、AcNPV-Dual-H1N1/M2、AcNPV-Dual-H1N1/NAe、AcNPV-Dual-M2e、AcNPV-CP-HA1/NC99、AcNPV-CP-H1N1/HA0、AcNPV-CP-H1N1/HA2、AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39、AcNPV-CP-H1N1/NP-vp39作为活性成分。
[29][28]中的用于流感病毒感染的治疗性或预防性药剂,其中所述药剂通过肌肉内、鼻内或吸入给药。
[30]一种用于流感病毒感染的疫苗,其包含AcNPV-Dual-H1N1/HA1、AcNPV-H1N1/HA1、AcNPV-CAP-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-PfCSP、AcNPV-Dual-PfAMA1、AcNPV-Dual-Pfs25、AcNPV-CU-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-H1N1/NP、AcNPV-Dual-H1N1/M2、AcNPV-Dual-H1N1/NAe、AcNPV-Dual-M2e、AcNPV-CP-HA1/NC99、AcNPV-CP-H1N1/HA0、AcNPV-CP-H1N1/HA2、AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39和AcNPV-CP-H1N1/NP-vp39中的任何一个作为活性成分。
[31][30]中的用于流感病毒感染的疫苗,其中所述药剂通过肌肉内、鼻内或吸入给药。
本发明的效果
根据本发明,提供了新的转移载体、通过转移载体和杆状病毒DNA的同源重组获得的重组杆状病毒、以及它们的生产方法。含有本发明的重组杆状病毒作为活性成分的药物可以用作传染病例如疟疾、流感、结核和肝炎、以及癌症和自身免疫疾病的治疗性或预防性药物,或者用作细胞药物和疫苗制剂。
附图简述
图1是显示了重组杆状病毒AcNPV-Dual-H1N1/HA1对流感病毒感染的预防性效果(病毒感染性滴度)的图。
图2是显示了重组杆状病毒AcNPV-Dual-H1N1/HA1对流感病毒感染的预防性效果(存活期)的图。
图3是显示了在重组杆状病毒感染的昆虫细胞中,从转化载体生产的流感病毒HA基因(H1N1/HA1)、结核分枝杆菌Hsp65基因(Hsp65)或疟原虫CSP基因(PbCSP)的融合产物的表达的Western印迹分析的图。
第1道:AcNPV-WT
第2道:AcNPV-Dual-H1N1/HA1
第3道:AcNPV-WT
第4道:AcNPV-Dual-Hsp65
第5道:AcNPV-WT
第6道:AcNPV-Dual-PbCSP
图4是荧光标记染色图,其中从脊椎动物细胞中重组转移载体产生的重组杆状病毒已经表达了结核病HSP65基因和gp64基因的融合产物。
(A):用AcNPV-Dual-Hsp65转导的HepG2细胞;
(B):用AcNPV-WT转导的HepG2细胞。
图5是通过免疫沉淀进行鉴定的图,其中从哺乳动物细胞中重组转移载体产生的重组杆状病毒已经表达了由流感病毒HA抗原基因和gp64基因编码的融合蛋白。用重组杆状病毒导入的HepG2细胞的免疫沉淀。HepG2细胞用AcNPV-WT(第1道)、AcNPV-CMV-HA full(第2道)或AcNPV-Dual-HA1N(第3道)转导。在转导后3小时,细胞用[35S]甲硫氨酸放射性标记12小时。细胞裂解物用来自H1N1流感病毒感染的小鼠的血清进行免疫沉淀。
图6是Western印迹分析图,显示了疟原虫CSP基因与gp64基因从昆虫细胞中的重组转移载体产生的重组杆状病毒的病毒粒子中的融合表达。
第1道:AcNPV-WT
第2道:AcNPV-CMV-PbCSP
第3道:AcNPV-PbCSPsurf
第4道:AcNPV-Dual-PbCSP。
图7是显示了RT-PCR结果的图,鉴定了通过与脊椎动物启动子交换获得的HA1抗原重组杆状病毒在HeLa细胞中表达了HA1和gp64的融合产物。
图8是显示了在用重组杆状病毒接种的小鼠的血清中,特异性针对PbCSP抗原的IgG抗体产生的图。
图9是显示了在用重组杆状病毒接种的小鼠的脾脏细胞中,对PbCSP的CTL表位具有反应性的IFN-γ产生细胞的数量的图。
图10是显示了重组杆状病毒AcNPV-Dual-M2e对流感病毒感染的预防性效果(病毒感染性滴度)的图。
图11是显示了重组杆状病毒AcNPV-Dual-HA1/NC99对流感病毒感染的预防性效果(病毒感染性滴度)的图。
图12是显示了通过四种不同的途径给药重组杆状病毒AcNPV-Dual-H1N1/HA1诱导,在血液中特异性针对流感病毒的IgG抗体的产生的图。
图13是显示了通过四种不同的途径给药重组杆状病毒AcNPV-Dual-H1N1/HA1诱导,在鼻洗出液和肺泡洗出液中特异性针对流感病毒的IgG抗体和IgA抗体的产生的图。
图14是显示了通过四种不同的途径给药重组杆状病毒AcNPV-Dual-H1N1/HA1,对鼻腔中流感病毒的预防性效果(病毒感染性滴度)的图。
图15是显示了通过四种不同的途径给药重组杆状病毒AcNPV-Dual-H1N1/HA1,对肺内流感病毒的预防性效果(病毒感染性滴度)的图。
本发明的最佳实施方式
本文中表示的氨基酸、肽、碱基序列和核酸的缩写与Eur.J.Biochem.,138:9(1984)中IUPAC-IUB确定的IUPAC-IUB生物命名通报、“制定含有碱基序列和氨基酸序列的说明书指南(Guideline forpreparing specifications comprising base sequences and amino acidsequences)”(专利局)以及本技术领域中常用的符号相一致。
本文中的DNA分子不仅包含了双链DNA,而且包含了单链DNA、包括构成它们的有义链和反义链,不受其长度的限制。因此,除非另有指出,编码本发明的免疫原性外源基因的多核苷酸(DNA分子)包括了包括基因组DNA的双链DNA和包括cDNA的单链DNA(有义链)和具有与有义链互补的序列的单链DNA(反义链),以及它们的合成的DNA片段。
本文的多核苷酸或DNA分子不由功能性区域来限定,并可以包括表达抑制区、编码区、前导序列、外显子和内含子中的至少一个。
多核苷酸也包括RNA和DNA。由某些氨基酸序列构成的多肽和由某些DNA序列构成的多核苷酸包括其片段、同源物、衍生物和突变体。
多核苷酸的突变体、例如突变的DNA,包括天然存在的等位基因突变体、非天然存在的突变体、以及具有缺失、取代、添加和插入的突变体。但是,这些突变体编码的多肽具有与突变前多核苷酸编码的多肽的功能基本上相同的功能。
在本发明中,转移载体是指用于产生重组杆状病毒的质粒,其含有的结构中将至少一个编码能够成为病毒粒子的成分的蛋白的基因与至少一个免疫原性的外源基因相连的融合基因已经被整合到连接了两个启动子的双启动子的下游,这两个启动子中一个是脊椎动物启动子(哺乳动物启动子、鸟启动子、鱼启动子),另一个是杆状病毒启动子。
在本发明的一个优选实施方案中,优选免疫原性外源基因位于双启动子的下游和编码能够成为病毒粒子的成分的蛋白的基因的上游。
本发明的重组杆状病毒作为药物或疫苗的活性成分用于脊椎动物。对于脊椎动物来说,可以例举包括人类的哺乳动物,例如马、猪、绵羊、山羊、猴、小鼠、狗和猫,鸟类例如鸡、鹌鹑、鹅、水禽、鸽子、火鸡、珠鸡和鹦鹉,鱼类例如金枪鱼、成年金枪鱼、海鲷、琥珀鱼、竹荚鱼、黄带鲹、三线矶鲈、鲑鱼、红大麻哈鱼、鲤鱼、鲫鱼、虹鳟鱼、河鳟和amago鳟鱼。
在一个实施方案中,本发明提供了含有新结构的转移载体,其中含有编码能够在昆虫细胞中表达的病毒膜蛋白的基因和一个免疫原性外源基因的融合基因,已经被整合到双启动子的控制之下,在双启动子中一个脊椎动物启动子与另一个杆状病毒启动子相连。通过将该转移载体与杆状病毒DNA一起共转染到昆虫细胞中诱导同源重组,有可能获得整合了融合基因的重组杆状病毒,该融合基因在杆状病毒启动子的控制之下、在昆虫细胞中表达,并且能够产生可以成为出芽的病毒粒子的成分的融合蛋白。
在本发明中,当将重组杆状病毒施用于脊椎动物时,能够成为出芽病毒粒子的成分的蛋白与免疫原性蛋白的融合蛋白可能起到组分疫苗的作用。施用于脊椎动物的重组杆状病毒侵入脊椎动物细胞,在脊椎动物细胞中产生了与来自病毒基因组的目标免疫原性外源抗原的融合抗原,并起到了DNA疫苗的作用。
因此,在哺乳动物的情况下,通过对哺乳动物施用本发明的重组杆状病毒,能够成为病毒粒子的成分的蛋白与免疫原性蛋白的融合蛋白作为抗原被呈递,能够成为病毒粒子的成分的蛋白与免疫原性蛋白的融合蛋白在哺乳动物细胞中被产生,并由于其免疫强化作用被认为可以起到用于病毒、原生动物和细菌感染的预防性或治疗性药剂的作用。
与转化载体共转染的杆状病毒DNA可以是任何野生型、突变体和重组杆状病毒DNA。被共转染的宿主细胞包括,例如,来自昆虫例如草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)的细胞。
在本发明中,编码免疫原性蛋白的氨基酸序列的基因,被称为免疫原性外源基因,所述免疫原性蛋白是预防或治疗传染病例如疟疾、流感和结核病、以及自身免疫疾病和癌症的的免疫疗法包括疫苗疗法的免疫原,例如,编码蛋白例如疟疾抗原、流感病毒抗原和结核分枝杆菌抗原的氨基酸序列。
这里,“外源”基因是指从外部导入的基因,即便细胞中存在有同样的基因,其也相应于“外源基因”。
在本发明中,编码作为上述免疫原的蛋白的氨基酸序列的基因没有特别被限制为编码抗原性蛋白的氨基酸序列的基因,只要该基因是编码对引起疾病例如传染病、癌症和自身免疫疾病的物质具有免疫原性的抗原性蛋白的氨基酸序列的基因就行。这些编码具有免疫原性的抗原性蛋白的氨基酸序列的基因的例子包括下面的基因。
作为编码疟疾抗原的氨基酸序列的基因,可以例举编码下述的氨基酸序列的基因:蛋白例如疟原虫的子孢子体表面的表面抗原CSP(环子孢子蛋白)、裂殖孢子表面的膜蛋白MSP1(裂殖孢子表面蛋白1)、从疟疾感染的红细胞分泌的疟疾S抗原、在疟疾感染的红细胞的瘤节中存在的PfEMP1蛋白、SERA蛋白、TRAMP蛋白和AMA1蛋白。
作为编码流感病毒抗原的氨基酸序列的基因,可以例举编码蛋白例如HA抗原(血凝素抗原)、NA抗原(神经氨酸酶抗原)、M2抗原(基质蛋白抗原)和NP抗原(核蛋白抗原)的氨基酸序列的基因。
作为编码结核病的抗原性蛋白的氨基酸序列的基因,为编码蛋白例如HSP65(65-kDa热休克蛋白)、α-抗原(抗原85A、抗原85B、抗原85C)、Mtb72f、MDP-1、ESAT-6、MPB51m、Mtb8.8、Mtb9.9、Mtb32、Mtb39和Mtb11的氨基酸序列的基因。
对于脊椎动物基因来说,作为哺乳动物基因,可以举例的是在人类、牛、马、猪、绵羊、猴、小鼠、狗和猫中编码传染病的抗原性蛋白的氨基酸序列的基因。作为鸟类基因,可以举例的是在鸡、水禽、鸽子、火鸡、珠鸡和鹦鹉中传染病的抗原基因(例如禽流感S抗原)。作为鱼类基因,包括了在金枪鱼、成年金枪鱼、海鲷、琥珀鱼、竹荚鱼、黄带参、三线矶鲈、鲑鱼、红大麻哈鱼、鲤鱼、鲫鱼、虹鳟鱼、河鳟和amago鳟鱼中传染病的抗原基因。
在上述的哺乳动物、鸟类和鱼类中,与传染病的关联已经被报道的病原基因可以容易地从储存了登记病原基因的公共数据例如GenBank的研究机构获得。
在本发明中,对于免疫原性外源基因来说,除了上述存在于人体外部的免疫抗原之外,例如存在于人体内部的细胞因子基因,例如IL-12基因、IL-6基因、IL-6受体基因、IL-2基因、IL-18基因、IFN-γ基因以及M-CSF基因,或通过将具有免疫原性的给定抗原与上述的抗原性蛋白通过基因重组技术融合而获得的融合基因,在本发明中也被定义为免疫原性外源基因,只要它们是从外部导入的就行。
在本发明中,提供具有这些免疫原性外源基因的转移载体和通过其同源重组获得的重组杆状病毒,以及提供含有所述具有免疫原性外源基因的重组杆状病毒作为活性成分的药物组合物和由药物组合物构成的疫苗制剂,是可能的。
用于本发明的杆状病毒是在昆虫中引起感染的昆虫病原病毒,并且是一组具有环状双链DNA作为基因的DNA病毒(杆状病毒科)。
特别是,一组被称为核多角体病毒(NPV)的病毒在感染的后期在被感染的细胞中产生被称为多角体的包含体。即使待表达的外源基因被插入替换了多角体基因,病毒感染、生长和产生大量的所需外源基因产物都没有问题。因此,在近年来它被实践用于生产所需的蛋白。
作为用于本发明的杆状病毒来说,可以举例的是苜蓿丫纹夜蛾(Autographa Californica)核多角体病毒:AcNPV、家蚕(Bombyx mori)核多角体病毒:BmNPV、黄杉毒蛾(Orgyia pseudotsugata)核多角体病毒:OpNPV和舞毒蛾(Lymantria disper)核多角体病毒:LdNPV。
杆状病毒DNA可以是任何能够与本发明的转移载体进行同源重组的DNA。具体来说,能够与本发明的转移载体进行同源重组的杆状病毒DNA的病毒基因有130kbp,它是巨大的,可以插入15kbp或以上的免疫原性外源基因。杆状病毒基因本身很少在脊椎动物细胞中表达。因此,几乎不需要考虑它的细胞毒性,因此,认为没有诱导有害的免疫反应。
(1)本发明的转移载体和转移载体的生产
免疫原性外源基因DNA的生产
能够与病毒基因融合、作为杆状病毒转移载体的一个组分的免疫原性外源基因DNA,通过基于编码具有本文公开的目的免疫原性的抗原性蛋白的氨基酸序列的多核苷酸的核酸序列信息进行合成,可以容易地生产和获得,或者基于免疫原性外源基因的核酸序列信息直接合成(化学DNA合成方法)对应于免疫原性外源基因编码区的核酸序列的DNA。通用的基因工程技术可以应用于这种生产(例如参见《分子克隆第二版》Molecular Cloning 2d Ed,Cold Spring Harbor Lab.Press(1989);日本生物化学学会主编的Zoku Seikagaku Jikken Kouza,"Idenshi Kenkyuho I,II,III",1986)。
作为DNA的合成方法,可以举例的是化学合成方法例如磷酸三酯方法和磷酰亚胺(phosphate amidite)方法(J.Am.Chem.Soc.,89,4801(1967);同上,91,3350(1969);Science,150,178(1968);TetrahedronLett.,22,1859(1981);同上,24,245(1983))以及这些方法的组合。更具体来说,DNA也可以通过亚磷酰胺方法和三酯方法化学合成,并可以使用可商购的自动化寡聚核苷酸合成仪来合成。双链片段可以通过合成互补链并将互补链与化学合成的单链在适当条件下退火、或使用DNA聚合酶在化学合成的单链中加入具有适当的引物序列的互补链来获得。
作为在本发明中生产的免疫原性外源基因DNA,可以举例的是由编码结核分枝杆菌抗原蛋白的氨基酸序列的DNA序列、编码疟疾抗原蛋白的氨基酸序列的DNA序列或编码流感病毒抗原蛋白的氨基酸序列的DNA序列构成的DNA。
在本发明中使用的DNA不限于具有免疫原性的抗原性蛋白的多肽的氨基酸序列的编码DNA序列的全长DNA序列,可以是编码部分序列的DNA序列,只要DNA序列所编码的氨基酸序列的蛋白具有免疫原性就行。
在本发明中使用的DNA可以是通过将具有抗原性的抗原性蛋白的氨基酸序列的编码DNA序列与人体内存在的细胞因子基因进行融合而获得的DNA序列,所述细胞因子基因例如IL-12基因、IL-1基因、IL-6基因、IL-6受体基因、IL-2基因、IL-8基因、IFN-α基因、IFN-β基因、IFN-γ基因、TNF基因、TGF-β基因、GM-CSF基因和M-CSF基因。
融合的DNA序列不限于具有抗原性的抗原性蛋白的多肽的氨基酸序列的编码DNA序列和细胞因子基因的DNA序列的全长编码区,可以是部分DNA序列。
用于本发明的免疫原性外源基因的DNA不限于具有这样的特定DNA序列的DNA分子,也可以具有通过合并和选择每个氨基酸残基的任选密码子而获得的DNA序列。密码子的选择可以按照标准方法来进行。在这种情况下,例如,可以考虑在使用的宿主中密码子的使用频率(Nucleic Acids Res.,9,43(1981))。
通过基因工程技术生产用于本发明的免疫原性外源基因的DNA的方法,可以更具体地通过按照标准方法从表达免疫原性外源基因的DNA的适合的来源制备cDNA文库、并使用适合的探针或针对免疫原性外源基因固有的表达产物的抗体从文库中筛选所需的克隆来进行(参见Proc.Natl.Acad.Sci.,USA.,78,6613(1981);Science,222,778(1983))。
在上述情况下,作为基因组DNA的来源,可以举例的是从中表达免疫原性外源基因的DNA的各种不同的细胞、组织和培养的细胞。具体来说,优选使用疟原虫感染的红细胞的提取物、流感病毒感染的细胞的提取物或结核分枝杆菌的提取物作为来源。从来源提取和分离总DNA和RNA,mRNA的分离和纯化以及cDNA的获取和克隆,可以按照标准的方法来进行。
除了使用通过使用提取物作为来源,从免疫原性组织或细胞通过mRNA的提取、分离和纯化获得的每个免疫原的cDNA文库来获得之外,生产免疫原性外源基因的DNA也可以通过提取每个免疫原的mRNA、在RNA上加上多聚A、收集添加了多聚A的RNA、使用反转录酶生产cDNA、在cDNA的两端加上限制性酶位点、和使用通过将cDNA整合到噬菌体中制备的噬菌体文库来进行。
从cDNA文库中筛选免疫原性外源基因的DNA的方法没有特别的限制,可以按照常规的方法来进行。作为具体的方法,可以举例的是例如使用特异性针对cDNA产生的蛋白的抗体(例如抗疟疾抗体、抗流感病毒抗体、抗结核分枝杆菌抗体)通过免疫筛选来选择相应的cDNA克隆的方法;使用与目的DNA序列选择性结合的探针的噬斑杂交方法;菌落杂交方法;以及这些方法的组合。
作为在杂交方法中使用的探针,常用的是基于免疫原性外源基因的DNA序列的信息化学合成的DNA片段。已经获得的免疫原性外源基因及其片段的DNA序列可以被有利地用作上述的探针。此外,根据免疫原性外源基因的DNA序列信息设计的有义引物和反义引物也可以用作上述筛选的探针。
用作探针的DNA(核苷酸)是对应于免疫原性外源基因的DNA序列的部分DNA(核苷酸),其具有至少15个连续的DNA、优选至少20个连续的DNA、更优选至少30个连续的DNA。产生上述DNA的阳性克隆本身也可以用作探针。
当获得了免疫原性外源基因的DNA时,可以适当地使用通过PCR的DNA/RNA扩增方法(Science,230,1350(1985))。具体来说,当全长cDNA很难从文库中获得时,可以适当地使用RACE方法[cDNA末端的快速扩增(Rapid amplification of cDNA ends);Jikken Igaku 12(6),35(1994)],具体来说是5′-RACE方法[M.A.Frohman,等Proc.Natl.Acad.Sci.,USA.,8,8998(1988)]。
用于PCR的引物可以根据免疫原性外源基因的DNA序列信息设计,并依照标准方法来合成。作为该引物,正如在后面描述的实施例中所示,也可以使用添加到其中已经整合了免疫原性外源基因的DNA的载体质粒的两端的DNA部分(SP6启动子引物和T7终止子引物)。
以PCR扩增的DNA/RNA片段的分离/纯化可以按照标准方法、例如凝胶电泳来进行。
对于上面获得的免疫原性外源基因的DNA或各种不同的DNA片段来说,它们的DNA序列可以按照标准方法来确定,例如双脱氧方法(Proc.Natl.Acad.Sci.,USA.,74,5463(1977))或Maxam-Gilbert方法(Methods in Enzymology,65,499(1980)),或者简单地使用可商购的测序试剂盒。
能够成为病毒粒子的成分的蛋白的氨基酸的编码基因可以是任何的基因,只要它是在昆虫细胞中能够表达为能够成为病毒粒子的成分的蛋白、以及在目的细胞中表达为与免疫原性外源基因融合的融合蛋白的蛋白的编码基因就行。
作为能够成为病毒粒子的成分的蛋白的氨基酸的编码基因,可以举例的是例如gp64蛋白的基因(GenBank登记号L22858)、疱疹性口腔炎病毒糖蛋白基因(GenBank登记号M21416)、单纯疱疹病毒糖蛋白基因(KOS;GenBank登记号K01760)、I型人类免疫缺陷病毒gp120基因(GenBank登记号U47783)、人类呼吸道合胞病毒膜糖蛋白基因(GenBank登记号M86651)、A型流感病毒血凝素蛋白基因(GenBank登记号U38242)、或与杆状病毒密切相关的病毒的外膜蛋白的基因。在本发明中,优选的例子是在后面描述的实施例中显示的gp64基因。
能够成为病毒粒子的成分的蛋白的氨基酸的编码基因的DNA,可以容易地生产和获得,通过基于下述多核苷酸的核酸序列信息进行合成,所述多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列的基因编码能够成为病毒粒子的成分的目标蛋白的氨基酸,或基于能够成为病毒粒子的成分的蛋白的氨基酸的编码基因的氨基酸序列信息,直接合成氨基酸序列的编码核苷酸序列的对应DNA(化学DNA合成方法),与生产免疫原性外源基因的DNA的情况一样。
与能够成为病毒粒子的成分的蛋白的氨基酸的编码核酸序列相对应的DNA序列不限于编码区的全长,可以是由部分DNA序列构成的DNA。
与生产免疫原性外源基因的DNA分子的情况一样,能够成为病毒粒子的成分的蛋白的氨基酸的编码DNA可以通过普遍的基因工程技术来生产(例如参见分子克隆第二版》Molecular Cloning 2d Ed,ColdSpring Harbor Lab.Press(1989);日本生物化学学会主编的ZokuSeikagaku Jikken Kouza,"Idenshi Kenkyuho I,II,III",1986)。
在本发明中,也可以使用可商购的载体质粒,其中控制下面描述的免疫原性外源基因的表达的启动子的一部分已经被整合,并且能够成为病毒粒子的成分的蛋白的氨基酸的编码基因(部分)已经在事先被导入。
脊椎动物启动子
作为用于本发明的转移载体的成分之一的脊椎动物启动子(能够在脊椎动物中起作用),可以举例的启动子是例如哺乳动物启动子、鸟类启动子和鱼类启动子。
哺乳动物启动子
作为用于本发明的转移载体的成分之一的哺乳动物启动子(能够在哺乳动物中起作用),可以举例的是细胞肥大病毒启动子、SV40启动子、反转录病毒启动子、金属硫蛋白启动子、热休克蛋白启动子、CAG启动子、延伸因子1α启动子、肌动蛋白启动子、泛素启动子、白蛋白启动子和II类MHC启动子。
鸟类启动子
作为鸟类启动子,可以举例的是肌动蛋白启动子、热休克蛋白启动子、延伸因子启动子、泛素启动子和白蛋白启动子。
鱼类启动子
作为鱼类启动子,可以举例的是肌动蛋白启动子、热休克蛋白启动子和延伸因子启动子。
杆状病毒启动子
作为用于本发明的杆状病毒转移载体的成分之一的杆状病毒启动子,可以举例的是多角体蛋白启动子、p10启动子、IE1启动子、p35启动子、p39启动子以及gp64启动子。
重组转移载体的生产
本发明涉及了具有能够在昆虫细胞和脊椎动物细胞、特别是哺乳动物细胞中将目的免疫原性外源基因表达为抗原性蛋白的结构的新转移载体。在本发明中,产生的新转移载体的结构特征在于所需免疫原性蛋白的氨基酸序列的编码DNA序列和能够成为病毒粒子的成分的蛋白的氨基酸序列的编码DNA序列被连接在相连的启动子的下游,相连的启动子一个是脊椎动物启动子、特别是哺乳动物启动子,另一个是杆状病毒启动子。含有一个脊椎动物启动子特别是哺乳动物启动子和另一个杆状病毒启动子的两个启动子的DNA序列的DNA区域可以直接相连,或者在两个启动子的DNA序列之间存在插入的DNA序列(但是,在这种情况下,对应的启动子必需在昆虫细胞和脊椎动物细胞、特别是哺乳动物细胞中具有活性)。被连接的脊椎动物启动子、特别是哺乳动物启动子或杆状病毒启动子可以与在它们的启动子区表达的基因更接近地放置。在后面描述的实施例中,与哺乳动物启动子相比,杆状病毒被放置得与被表达的基因更近。
在结构中,对于含有能够成为病毒粒子的成分的蛋白的编码基因和所需的免疫原性外源基因的融合基因来说,这两个基因可以直接相连,或者在它们之间可以存在插入的DNA序列(但是DNA的放置必需不引起移码)。优选具有所需免疫原性的由外源基因编码的蛋白的抗原呈递区与能够成为病毒粒子的成分的蛋白融合。因此,它必需以融合的形式使用,而不从能够成为病毒粒子的成分的蛋白上切下具有所需免疫原性的由外源基因编码的蛋白。
含有这两个基因的融合基因可以预先形成,并可以将其整合到载体中。或者,先将任何一个基因整合到载体中,然后将另一个基因整合到载体中,以在载体中形成融合基因。
对于上述的操作来说,可以使用可商购的表达载体,其中已经具有了上述脊椎动物启动子特别是哺乳动物启动子和杆状病毒启动子的启动子区,以及能够成为病毒粒子的成分的氨基酸序列的编码基因区,它们是本发明的转移载体所需的组成部分。利用它们,所需成分的插入可以通过将其中所需的免疫原性外源基因已经与能够成为病毒粒子的成分的蛋白的编码氨基酸序列的基因相融合的DNA序列,通过任选用限制性酶切除来插入到载体的克隆区中,或整合到另一个载体中,或者将所需的免疫原性外源基因插入到整合在质粒中的能够成为病毒粒子的成分的蛋白的氨基酸序列的编码基因的DNA区N末端一侧中。
对于蛋白的检测来说,可以在DNA序列C末端一侧的多聚A尾将所需免疫原性外源基因与能够成为病毒粒子的成分的蛋白的氨基酸序列的编码基因融合之前,加上His-tag或HVS-tag。或者,为了重组融合蛋白的表达、纯化和检测,由8个氨基酸构成的FLAG序列的编码DNA序列可以作为肽标签插入到启动子区和其中所需免疫原性外源基因已经与为能够成为病毒粒子的成分的蛋白的氨基酸序列的编码基因融合的区域之间。在本发明中,具有能够在昆虫细胞和脊椎动物细胞特别是哺乳动物细胞中将所需的免疫原性外源基因表达为抗原性蛋白的结构的质粒载体,可以通过使用已经具有其令人满意的部分的结构的可商购的质粒来产生。在脊椎动物细胞中,可以插入肽的氨基酸序列以便使用酶来切割融合蛋白。在本发明的转移载体中,用于在脊椎动物细胞特别是哺乳动物细胞中增加转录活性的增强子可以被置于两个启动子的上游,或者便于宿主中表达蛋白细胞外分泌的信号肽的氨基酸序列的编码DNA序列可以与被融合和表达的基因相连。可以设置脊椎动物终止子区,例如在脊椎动物细胞中有效的兔β球蛋白终止子,用于在被融合和表达的基因下游终止转录。
如上所述,可以产生能够表达在杆状病毒粒子中能够表现出所需免疫原性的免疫原性外源基因和能够成为病毒粒子的成分的蛋白的氨基酸序列的编码基因的融合基因的转移载体。
对于在后面描述的实施例中显示的转移载体及其生产方法的具体例子来说,转移载体由整合的结构构成,其中作为脊椎动物启动子特别是哺乳动物启动子的细胞肥大病毒(CMV)启动子、从CMV启动子修改而来的CAG启动子和与CMV增强子融合的泛素(UBB)启动子、以及作为杆状病毒启动子的多角体(Polh)启动子已经被连接,其中作为外源基因的流感病毒抗原基因、疟疾抗原基因和结核分枝杆菌抗原基因以及作为能够成为病毒粒子的成分的蛋白的氨基酸序列的编码基因的gp64抗原基因被融合,这样的转移载体可以例举pDual-Hsp65-gp64、pDual-PbCSP-gp64、pDual-H1N1/HA1-gp64、pDual-PbTRAMP-gp64、pDual-PbAMA1D123-gp64、pDual-PbMSP129-gp64、pDual-PfCSP-gp64、pDual-PfAMA1-gp64、pDual-Pfs25-gp64、pDual-H5N1/HA1-gp64和pDual-SARS/S-gp64、pCP-H1N1/HA1-gp64、pCAP-H1N1/HA1-gp64、pCU-H1N1/HA1-gp64、pDual-H1N1/NP-gp64、pDual-H1N1/M2-gp64、pDual-H1N1/NAe-gp64、pDual-M2e-gp64、pCP-HA1/NC99-gp64、pCP-H1N1/HA0-gp64、pCP-H1N1/HA2-gp64、pCP-H1N1/HA1-vp39、pCP-H1N1/NP-vp39。
(2)重组杆状病毒的生产
本发明提供了生产重组杆状病毒的方法,包括生产由下述结构构成的转移载体的步骤,在该结构中已经整合了含有能够成为病毒粒子的成分的蛋白的至少一个编码基因和至少一个免疫原性外源基因的融合基因,融合基因连接在连有一个脊椎动物启动子和另一个杆状病毒启动子的双启动子的下游;将转移载体和杆状病毒DNA共转染到宿主细胞中的步骤和分离重组杆状病毒的步骤。
在上述的生产重组杆状病毒的方法中,将所需的重组DNA(转移载体)导入宿主的方法和用其进行转化的方法没有特别的限制,各种熟知的和常用的方法都可以使用,例如可以按照常规的基因重组技术(例如Science,224,1431(1984);Biochem.Biophys.Res.Comm.,130,692(1985);Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80,5990(1983))来进行。重组DNA(转化载体)可以参考Ohno等的"(Tanpaku Jikken Protocol 1Functional analysis,Saibo Kogaku Bessatu Jikken Protocol SeriesTanpaku Jikken功能分析1方案,Saibo Kogaku Bessatu Jikken方案系列),1997,Shujunsha"来表达和生产。对于操作昆虫细胞、基因重组和共转染的一般性技术来说,可以使用与熟知的在昆虫细胞中制造重组病毒的相同技术(Zenji Matsuura,Proteins,Nucleic acids and Enzymes(蛋白质,核酸和酶),37:211-222,1992;Zenji Matsuura,Saibo33(2):30-34,2001)。
获得的重组杆状病毒可以按照标准的方法进行培养。通过培养,其中免疫原性外源基因的DNA和能够成为本发明的病毒粒子的成分的蛋白的氨基酸序列的编码DNA已经按照所需设计被融合的融合产物(表达产物)在细胞内、外或细胞膜上得到了表达、生产(积累)和分泌。
作为用于培养的培养基,可以根据使用的宿主适当地选择和使用各种常用的培养基,培养可以在适合宿主细胞生长的条件下进行。
生产重组杆状病毒的方法更具体来说包括了制备杆状病毒DNA用于与上面生产的转移载体进行同源重组的步骤和将转移载体和杆状病毒DNA共转染到作为宿主细胞的昆虫细胞中的步骤,所述昆虫细胞例如来自草地贪夜蛾的Sf-9细胞、Sf-21细胞,来自粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)的Tn5细胞(Invitrogen提供的High Five细胞)。
上面生产的用于与转移载体进行同源重组的杆状病毒DNA可以是任何野生型、突变体或重组的杆状病毒DNA。
除了其中融合了双启动子区的DNA、免疫原性外源基因和能够成为病毒粒子的成分的蛋白的编码基因的融合基因中夹有源自杆状病毒的DNA之外,杆状病毒DNA可以增加同源重组的可能性,只要它与来自杆状病毒DNA的DNA具有同源的DNA结构以便与本发明的转移载体产生同源重组就行,所述杆状病毒DNA位于用于转移载体的双启动子的上游。
为了诱导同源重组,最好将转移载体和杆状病毒DNA以大约1:1到10:1的重量比混合。
在通过共转染步骤同时导入昆虫细胞中和培养细胞之后,从培养上清液制造病毒的噬斑,然后悬浮在培养基中,然后通过涡旋振荡将病毒从琼脂上洗脱,产生含有重组病毒的溶液。
在上面所述中,可以使用可商购的杆状病毒DNA,例如,可以使用其中的多角体基因已经从AcNPV中移除的BacVector-1000 DNA和BacVector-2000 DNA(由Novagen提供)。
将上面获得的转移载体的杆状病毒DNA共转染到昆虫细胞中同源重组,可以使用上面描述的可商购的载体转染试剂盒(Novagen提供的BacVector转染试剂盒)按照载体转染试剂盒随附的说明书来进行。如上所述,上面产生的转移载体可以与杆状病毒DNA一起共转染到昆虫细胞例如Sf-9细胞中,以产生重组杆状病毒。
在本发明中,按照上述的生产重组杆状病毒的方法,可以使用转移载体例如pDual-Hsp65-gp64、pDual-PbCSP-gp64、pDual-H1N1/HA1-gp64、pDual-PbTRAMP-gp64、pDual-PbAMA1D123-gp64、pDual-PbMSP129-gp64、pDual-PfCSP-gp64、pDual-PfAMA1-gp64、pDual-Pfs25-gp64、pDual-H5N1/HA1-gp64、pDual-SARS/S-gp64、pCP-H1N1/HA1-gp64、pCAP-H1N1/HA1-gp64、pCU-H1N1/HA1-gp64、pDual-H1N1/NP-gp64、pDual-H1N1/M2-gp64、pDual-H1N1/NAe-gp64、pDual-M2e-gp64、pCP-HA1/NC99-gp64、pCP-H1N1/HA0-gp64、pCP-H1N1/HA2-gp64、pCP-H1N1/HA1-vp39、pCP-H1N1/NP-vp39以及杆状病毒DNA,并共转染到Sf-9昆虫细胞中以产生重组的杆状病毒,例如AcNPV-Dual-Hsp65、AcNPV-Dual-PbCSP、AcNPV-Dual-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-PbTRAMP、AcNPV-Dual-PbAMA1D123、AcNPV-Dual-PbMSP129、AcNPV-Dual-PfCSP、AcNPV-Dual-PfAMA1、AcNPV-Dual-Pfs25、AcNPV-H1N1/HA1、AcNPV-CAP-H1N1/HA1、AcNPV-CU-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-H1N1/NP、AcNPV-Dual-H1N1/M2、AcNPV-Dual-H1N1/NAe、AcNPV-Dual-M2e、AcNPV-CP-HA1/NC99、AcNPV-CP-H1N1/HA0、AcNPV-CP-H1N1/HA2、AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39、AcNPV-CP-H1N1/NP-vp39。
此外,重组的杆状病毒例如AcNPV-Dual-H5N1/HA1和AcNPV-Dual-SARS/S也可以获得。
除了上述的生产重组杆状病毒的方法之外,作为另一种生产重组杆状病毒的方法,可以使用通过对其中整合了整个杆状病毒基因组的噬粒(杆粒)使用转座子在大肠杆菌中有效插入外源基因的方法。按照这种方法,可以仅仅通过从微生物细胞中提取带有病毒基因的杆粒并将其转染到昆虫细胞中来容易地生产和收集重组杆状病毒。
通过上述的生产重组杆状病毒的方法获得的本发明的重组杆状病毒的纯化,可以使用众所周知的病毒纯化方法来进行。
为了纯化重组杆状病毒,将例如0.5到1.0mL通过上述的生产重组杆状病毒的方法获得的储存病毒(通常为1 x 107-8pfu/mL)接种到昆虫细胞(1 x 107cells/10cm平皿)例如Sf-9细胞中,在感染后几天(4天)收集培养上清液,将通过离心获得的病毒沉淀悬浮在缓冲液例如PBS中。获得的悬浮液加到10到60%的蔗糖梯度中,然后离心(25,000rpm,60分钟,4℃)以收集病毒带。收集到的病毒进一步悬浮在PBS中,然后离心(条件同上),将获得的纯化的重组病毒沉淀储存在4℃的缓冲液例如PBS中。
上述获得的纯化的重组病毒的感染性滴度可以通过使用昆虫细胞例如Sf-9细胞基因的噬斑分析(Fields VIROLOGY 4th Edition(病毒学领域第四版)p29-322001)来测量。
在本发明例举的重组病毒中,杆状病毒蛋白gp64的N末端暴露在粒子外部,它的C末端暴露在粒子内部。因此,如果所需的免疫原性外源基因编码的蛋白被融合到gp64的N末端,则其作为病毒粒子的成分的实体在昆虫细胞中将暴露在病毒蛋白粒子的外部,因此抗原更容易被呈递,这适合于本发明的疫苗制剂的目的。
(3)本发明的药物组合物(含有本发明的重组杆状病毒作为活性成分的药物)
在本发明的药物组合物中作为活性成分的本发明的重组杆状病毒可以通过在上面的(2)中显示的基因工程技术来获得。
对于本发明的药物组合物来说,重要的是含有通过杆状病毒DNA和构建的转移载体的同源重组获得的重组杆状病毒作为活性成分,从而融合了本发明的免疫原性外源基因和能够成为病毒粒子的成分的蛋白的氨基酸序列的编码基因的融合蛋白能够在昆虫细胞和脊椎动物细胞、特别是来自哺乳动物包括人类的细胞中表达。
具体来说,本发明提供了含有任何特定的重组杆状病毒作为活性成分的药物组合物,所述重组杆状病毒例如AcNPV-Dual-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-Hsp65、AcNPV-Dual-PfCSP、AcNPV-Dual-PfAMA1、AcNPV-Dual-Pfs25、AcNPV-Dual-H5N1/HA1、AcNPV-Dual-SARS/S、AcNPV-H1N1/HA1、AcNPV-CAP-H1N1/HA1、AcNPV-CU-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-H1N1/NP、AcNPV-Dual-H1N1/M2、AcNPV-Dual-H1N1/NAe、AcNPV-Dual-M2e、AcNPV-CP-HA1/NC99、AcNPV-CP-H1N1/HA0、AcNPV-CP-H1N1/HA2、AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39或AcNPV-CP-H1N1/NP-vp39。
在本发明的药物组合物中作为活性成分的本发明的重组杆状病毒,例如AcNPV-Dual-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-Hsp65、AcNPV-Dual-PfCSP、AcNPV-Dual-PfAMA1、AcNPV-Dual-Pfs25、AcNPV-Dual-H5N1/HA1、AcNPV-Dual-SARS/S、AcNPV-H1N1/HA1、AcNPV-CAP-H1N1/HA1、AcNPV-CU-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-H1N1/NP、AcNPV-Dual-H1N1/M2、AcNPV-Dual-H1N1/NAe、AcNPV-Dual-M2e、AcNPV-CP-HA1/NC99、AcNPV-CP-H1N1/HA0、AcNPV-CP-H1N1/HA2、AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39和AcNPV-CP-H1N1/NP-vp39,具有增强对传染性抗原的预防感染效果和降低感染性滴度的作用,这种作用或活性可以用于与靶细胞或组织的感染有关的疾病的步骤中。这样的受感染影响的靶细胞包括例如血细胞,以及其它靶细胞包括肝细胞、肾细胞、脑细胞、肺细胞、上皮细胞和肌肉细胞。包含这些细胞的组织包括肺、肝、肾、动脉和静脉、胃、肠、尿道、皮肤和肌肉。
药物组合物增强了对传染性抗原例如疟疾抗原如疟原虫的子孢子体表面的表面抗原CSP、裂殖孢子表面的膜蛋白MSP1、从疟疾感染的红细胞分泌的疟疾S抗原、在疟疾感染的红细胞的瘤节中存在的PfEMP1蛋白、SERA蛋白、TRAMP蛋白和AMA1蛋白以及流感抗原例如HA抗原、NA抗原、M2抗原和NP抗原的预防感染效果,并降低了感染性滴度(例如病毒感染性滴度)。因此,施用了本发明的药物组合物的哺乳动物包括人类的存活期和存活率与没有给药相比增加了。因此,本发明的药物组合物可以用作特别是疟疾和流感病毒感染的预防性或治疗性药剂。
本发明的药物组合物通过利用其增强对传染性抗原的预防感染效果和降低感染性滴度的作用,可用作由病原体引起的传染病以及它们的并发症的预防性和治疗性药剂,例如由流感病毒、乳头状瘤病毒、疱疹病毒、AIDS病毒、丙型肝炎病毒、SARS病毒、西尼罗河热病毒和登革热病毒引起的病毒性疾病,由疟原虫、锥虫和利什曼原虫引起的寄生虫疾病,以及由细菌引起的细菌性疾病,例如痢疾、肠伤寒、霍乱、肺炎球菌、MRSA、VRE、奈瑟氏淋病双球菌(Neisseriagonorrhoeae)和衣原体(Chlamydia)、梅毒和结核病。
对于人类之外的脊椎动物来说,通过在转移载体中使用免疫原性外源基因以获得作为本发明药物组合物的活性成分的重组杆状病毒,通过利用其增强对传染性抗原的预防感染效果和降低感染性滴度的作用,有可能将本发明的药物组合物用于与靶细胞和组织的感染有关的疾病的过程,例如禽流感疫苗、牛锥虫疫苗和日本鳟鱼冷水病疫苗。
本发明的药物组合物可以制备成含有药物有效量的重组杆状病毒和可药用的载体的组合物。
对于本发明的重组杆状病毒在脊椎动物特别是哺乳动物包括人类或哺乳动物细胞中的预防感染效果来说,例如用本发明的重组杆状病毒和能够加入用于给药的组分生产的药物组合物,可以通过肌肉内、鼻内或吸入在脊椎动物特别是哺乳动物包括人类中给药,然后用含有本发明的重组杆状病毒作为活性成分的药物组合物对其进行多次免疫。具体来说,本发明的药物组合物通过吸入给药。
并且,可以通过用本发明的药物组合物多次免疫后,给脊椎动物特别是哺乳动物包括人类施用所针对的病原体,然后在经过一段时间后,对施用了作为本发明的药物组合物的活性成分的重组杆状病毒的和未施用它的脊椎动物特别是哺乳动物包括人类的存活率进行比较,来评估对感染的预防性效果。
(4)本发明的疫苗
作为本发明的药物组合物的活性成分的重组杆状病毒,例如AcNPV-Dual-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-Hsp65、AcNPV-Dual-PfCSP、AcNPV-Dual-PfAMA1、AcNPV-Dual-Pfs25、AcNPV-Dual-H5N1/HA1、AcNPV-Dual-SARS/S、AcNPV-H1N1/HA1、AcNPV-CAP-H1N1/HA1、AcNPV-CU-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-H1N1/NP、AcNPV-Dual-H1N1/M2、AcNPV-Dual-H1N1/NAe、AcNPV-Dual-M2e、AcNPV-CP-HA1/NC99、AcNPV-CP-H1N1/HA0、AcNPV-CP-H1N1/HA2、AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39或AcNPV-CP-H1N1/NP-vp39,作为出芽的病毒粒子从含有融合的DNA序列的表达产物的昆虫细胞中被纯化,该融合的DNA序列融合了能够成为病毒粒子的成分的蛋白的氨基酸序列的编码基因和具有所需免疫原性的本发明的免疫原性外源基因,以增强对病原体感染的预防效果,并表现出减少感染性滴度的作用。然后,据认为通过以病毒粒子的形式给脊椎动物特别是哺乳动物包括人类施用药物组合物,成为病毒粒子的成分的外源抗原蛋白有利于获得性免疫(体液免疫和细胞免疫),此外作为融合DNA序列的表达产物的抗原性蛋白在脊椎动物特别是哺乳动物包括人类中也有利于获得性免疫(体液免疫和细胞免疫)。因此,本发明的重组杆状病毒可用作疫苗。
具体来说,本发明提供了含有任何特定的重组杆状病毒作为活性成分的疫苗,这些特定的重组杆状病毒是例如AcNPV-Dual-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-Hsp65、AcNPV-Dual-PfCSP、AcNPV-Dual-PfAMA1、AcNPV-Dual-Pfs25、AcNPV-Dual-H5N1/HA1、AcNPV-Dual-SARS/S、AcNPV-H1N1/HA1、AcNPV-CAP-H1N1/HA1、AcNPV-CU-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-H1N1/NP、AcNPV-Dual-H1N1/M2、AcNPV-Dual-H1N1/NAe、AcNPV-Dual-M2e、AcNPV-CP-HA1/NC99、AcNPV-CP-H1N1/HA0、AcNPV-CP-H1N1/HA2、AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39、AcNPV-CP-H1N1/NP-vp39。
与上述(3)中的药物组合物的情况相同,所述疫苗增强了对病原生物体例如疟疾抗原如疟原虫的子孢子体表面的表面抗原(CSP)、裂殖孢子表面的膜蛋白MSP1、从疟疾感染的红细胞分泌的疟疾S抗原、在疟疾感染的红细胞的瘤节中存在的PfEMP1蛋白、SERA蛋白、TRAMP蛋白和AMA1蛋白或流感病毒HA抗原、流感病毒NA抗原、流感病毒M2抗原和流感病毒NP抗原的预防感染效果,并降低了感染性滴度(例如病毒感染性滴度)。因此,通过将被感染的哺乳动物包括人类与未施用本发明的药物组合物者的存活期和存活率进行比较,所述疫苗尤其可以用作疟疾和流感病毒感染的预防性或治疗性药剂。
通过利用其增强对传染性抗原的预防感染效果和降低感染性滴度的作用,本发明的疫苗可用作由病原体引起的传染病以及它们的并发症的预防性和治疗性药剂,例如由流感病毒、乳头状瘤病毒、疱疹病毒、AIDS病毒、丙型肝炎病毒、SARS病毒、西尼罗河热病毒和登革热病毒引起的病毒性疾病,由疟原虫、锥虫和利什曼原虫引起的寄生虫疾病,以及由痢疾、肠伤寒、霍乱、肺炎球菌、MRSA、VRE、奈瑟氏淋病双球菌和衣原体、梅毒和结核病的细菌引起的细菌性疾病。
对于人类之外的脊椎动物来说,通过在转移载体中使用免疫原性外源基因以获得作为本发明疫苗的活性成分的重组杆状病毒,通过利用其增强对传染性抗原的预防感染效果和降低感染性滴度的作用,有可能将本发明的药物组合物用于与靶细胞和组织的感染有关的疾病的过程,例如禽流感疫苗、牛锥虫疫苗和日本鳟鱼冷水病疫苗。
在本发明的疫苗中作为活性成分的本发明的重组杆状病毒,例如AcNPV-Dual-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-Hsp65、AcNPV-Dual-PtCSP、AcNPV-Dual-PfAMA1、AcNPV-Dual-Pfs25、AcNPV-Dual-H5N1/HA1、AcNPV-Dual-SARS/S、AcNPV-H1N1/HA1、AcNPV-CAP-H1N1/HA1、AcNPV-CU-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-H1N1/NP、AcNPV-Dual-H1N1/M2、AcNPV-Dual-H1N1/NAe、AcNPV-Dual-M2e、AcNPV-CP-HA1/NC99、AcNPV-CP-H1N1/HA0、AcNPV-CP-H1N1/HA2、AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39和AcNPV-CP-H1N1/NP-vp39,具有增强对传染性抗原的预防感染效果和降低感染性滴度的作用,这种作用或活性可以用于与靶细胞或组织的感染有关的疾病的程序中。这样的受感染影响的靶细胞包括例如血细胞,以及其它靶细胞包括肝细胞、肾细胞、脑细胞、肺细胞、上皮细胞和肌肉细胞。包含这些细胞的组织包括肺、肝、肾、动脉和静脉、胃、肠、尿道、皮肤和肌肉。
本发明的疫苗与上面(3)中的药物组合物一样,可以制备成含有药物有效量的重组杆状病毒(AcNPV-Dual-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-Hsp65、AcNPV-Dual-PfCSP、AcNPV-Dual-PfAMA1、AcNPV-Dual-Pfs25、AcNPV-Dual-H5N1/HA1、AcNPV-Dual-SARS/S、AcNPV-H1N1/HA1、AcNPV-CAP-H1N1/HA1、AcNPV-CU-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-H1N1/NP、AcNPV-Dual-H1N1/M2、AcNPV-Dual-H1N1/NAe、AcNPV-Dual-M2e、AcNPV-CP-HA1/NC99、AcNPV-CP-H1N1/HA0、AcNPV-CP-H1N1/HA2、AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39、AcNPV-CP-H1N1/NP-vp39)和可药用的载体的组合物。
可以按照标准方法将疫苗制备成与上述(3)中的药物制剂相同的药物合格性的药物组合物形式。载体可以包括,例如,生理可接受的溶液例如无菌盐水和无菌缓冲盐水。
疫苗(在后文中,配方与药物组合物中的相同)可以制备成含有重组杆状病毒(AcNPV-Dual-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-Hsp65、AcNPV-Dual-PtCSP、AcNPV-Dual-PfAMA1、AcNPV-Dual-Pfs25、AcNPV-Dual-H5N1/HA1、AcNPV-Dual-SARS/S、AcNPV-H1N1/HA1、AcNPV-CAP-H1N1/HA1、AcNPV-CU-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-H1N1/NP、AcNPV-Dual-H1N1/M2、AcNPV-Dual-H1N1/NAe、AcNPV-Dual-M2e、AcNPV-CP-HA1/NC99、AcNPV-CP-H1N1/HA0、AcNPV-CP-H1N1/HA2、AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39、AcNPV-CP-H1N1/NP-vp39)作为活性成分的脂质体制剂,并可以与佐剂组合。本发明的疫苗(药物组合物)的具体例子可以包括脂质体制剂。脂质体制剂可以是其中本发明的重组杆状病毒已经被保留在使用酸性磷脂作为膜成分或使用中性磷脂和酸性磷脂作为膜成分的脂质体中的脂质体制剂。
用作膜成分的中性磷脂和酸性磷脂没有具体的限制,各种通常用于脂质体制剂的脂质都可以单独使用或以两种或多种的混合物的形式使用。
脂质体膜按照标准的方法单独使用酸性磷脂或组合使用中性磷脂和酸性磷脂来形成。在与中性磷脂组合的情况下,被组合的酸性磷脂的比率可以为脂质体膜成分的大约0.1到100mol%,优选1到90mol%,更优选为大约10到50mol%。
在制备上述的脂质体时,例如,可以加入胆固醇。这可以控制磷脂的流动性,使脂质体的制备更容易。胆固醇添加的量一般与磷脂的量相当,优选它优选以磷脂的量的0.5倍当量的量来添加和混合。
对于脂质体制剂中活性成分和酸性磷脂的比例来说,酸性磷脂的量相当于活性成分的量的大约0.5到100当量,优选大约1到60当量,更优选大约1.5到20当量。
作为活性成分的本发明的重组杆状病毒的使用量可以是几mol%到几十mol%,优选大约5到10mol%,典型约5mol%。
上述脂质体制剂的生产、浓度和颗粒直径控制可以按照标准方法来进行。如果需要,上面描述的各种添加剂也可以与脂质体制剂混合。脂肪酸(例如二十二烷酸、硬脂酸、棕榈酸、豆蔻酸、油酸)、烷基基团、胆甾醇基团等也可以混合到其中并使用。通过混合它们制备的脂质体制剂的生产也可以按照标准方法来进行(参见《长期循环的脂质体:老药物,新疗法》Long Circulating Liposomes:old drugs,Newtherapeutics.,M.C.Woodle,G.Storm,主编,Springer-VerlagBerlin(1998))。
本发明的疫苗(药物组合物)可以优选用作疫苗组合物。当使用它时,为了增加抗感染(抗疟疾或抗流感)效果,优选将它以药物有效量与佐剂混合。
作为佐剂,任何常用于这种类型的疫苗的佐剂都可以不受限制地使用。作为其例子,可以举例的是弗氏完全佐剂、胞壁酰二肽、氢氧化铝、BCG、IL-12、N-乙酰胞壁质-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺、胸腺素α1和QS-21。被混合的佐剂的量可以根据皮肤的软化、红斑、发热、头痛和肌肉痛来适当地确定,这些可能是人类或动物在给药后表现出的免疫反应的一部分。本发明的疫苗(药物组合物)可以与其它公众知道的药物制品例如促进免疫响应的肽和抗细菌剂(合成的抗细菌剂)相组合。
疫苗(药物组合物)中还可以包含任选的药物和添加剂。作为其例子,可以举例的药物是例如帮助本发明的重组杆状病毒的细胞内摄入的钙离子。可以使用药物和添加剂例如脂质体以及例如氟碳乳化剂、螺旋形、小管、金颗粒、生物可降解微球和能够使转染更容易的阳离子聚合物。
在本发明的疫苗(药物组合物)(制剂)中包含的活性成分的量没有特别的限制,可以从广泛的范围内选择,只要它是药物有效量就行。疫苗(药物组合物)的剂量没有特别的限制,并可以根据所需的治疗效果、给药方法(给药途径)、治疗持续时间、患者的年龄和性别以及其它情况在广泛的范围内进行适当的选择。
当作为本发明的疫苗(组合物)的活性成分的重组杆状病毒施用于人类时,对于重组病毒的PFU来说,每个病人施用相当于102到1012PFU、优选105到1010PFU、更优选106到109PFU的重组杆状病毒。
作为本发明的疫苗(药物组合物)的活性成分的重组杆状病毒(AcNPV-Dual-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-Hsp65、AcNPV-Dual-PfCSP、AcNPV-Dual-PfAMA1、AcNPV-Dual-Pfs25、AcNPV-Dual-H5N1/HA1、AcNPV-Dual-SARS/S、AcNPV-H1N1/HA1、AcNPV-CAP-H1N1/HA1、AcNPV-CU-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-H1N1/NP、AcNPV-Dual-H1N1/M2、AcNPV-Dual-H1N1/NAe、AcNPV-Dual-M2e、AcNPV-CP-HA1/NC99、AcNPV-CP-H1N1/HA0、AcNPV-CP-H1N1/HA2、AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39、AcNPV-CP-H1N1/NP-vp39)的剂量与导入到疫苗宿主中的可表达的DNA量或转录的RNA量一样,可以在非常广泛的范围内选择。它们的量也依赖于用于转移载体的转录和翻译启动子的强度。
本发明的疫苗(药物组合物)通过将其中载体已经悬浮在PBS(磷酸盐缓冲盐水)或盐水中的重组杆状病毒悬浮液直接注射到局部位点中(例如肺组织、肝脏、肌肉和脑中)、通过鼻或气道吸入、或给药到血管中(例如动脉内、静脉内和门静脉内)来进行给药。本发明的疫苗优选通过吸入给药。
可优选本发明的疫苗(药物组合物)不是一次给药,而是通过观察初次给药后的状态和施用附加的疫苗来进行一次到多次给药。这使得增强所需的效果成为可能。在施用疫苗(药物组合物)后,用本发明的重组杆状病毒(AcNPV-Dual-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-Hsp65、AcNPV-Dual-PfCSP、AcNPV-Dual-PfAMA1、AcNPV-Dual-Pfs25、AcNPV-Dual-H5N1/HA1、AcNPV-Dual-SARS/S、AcNPV-H1N1/HA1、AcNPV-CAP-H1N1/HA1、AcNPV-CU-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-H1N1/NP、AcNPV-Dual-H1N1/M2、AcNPV-Dual-H1N1/NAe、AcNPV-Dual-M2e、AcNPV-CP-HA1/NC99、AcNPV-CP-H1N1/HA0、AcNPV-CP-H1N1/HA2、AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39、AcNPV-CP-H1N1/NP-vp39)构成的药物组合物进行额外的免疫接种是可能的。上述各种待混合的药物的组合也具有通过施用疫苗(药物组合物)而增加治疗效果的可能性。
在本发明的疫苗(药物组合物)的一个实施方案中,作为本发明的疫苗(药物组合物)的一种活性成分的重组杆状病毒,可以通过将转移载体与杆状病毒DNA进行同源重组而获得的重组杆状病毒以能够注射的单位剂量的形式(溶液、悬浮液或乳浊液)与可药用的载体(即对于脊椎动物包括人类来说,在待施用的剂量和浓度下没有毒性,并且与制剂中的其它成分相容)相混合来配制,转移载体中已经导入了通过将所需的免疫原性外源基因和能够成为病毒粒子的成分的蛋白的编码基因进行融合而获得的融合基因。例如,制剂中优选不含有抗氧化剂并且没有其它众所周知的对重组杆状病毒有害的化合物。
载体适当地含有少量的添加剂,例如增加等渗性质和化学稳定性的物质。这样的物质在所施用的剂量和浓度下对于哺乳动物包括人类来说是无毒性的,并可以包括缓冲液例如磷酸、柠檬酸、琥珀酸、乙酸和其它有机酸或其盐,抗氧化剂例如抗坏血酸,低分子量(例如小于10个残基)的多肽(例如聚精氨酸或三肽),蛋白(例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白),氨基酸(例如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸或精氨酸)、单糖、二糖和其它碳水化合物(包括纤维素或其衍生物、葡萄糖、甘露糖或糊精),螯合剂(例如EDTA),糖醇(例如甘露糖醇或山梨糖醇),反离子(例如钠)和/或非离子型表面活性剂(例如多聚山梨酸酯、泊洛沙姆)。
典型情况下,含有重组杆状病毒的药物疫苗(组合物)可以作为水溶液或冷冻干燥产品储存在单位或多剂容器中,例如密封的安瓿或小管中。
含有本发明的疫苗(组合物)的药物组合物的给药,以切合医疗实践规范的模式,参考了个体患者的临床病症(例如要预防或治疗的病症)、含有重组杆状病毒的疫苗(组合物)的投送位点、靶组织、给药方法、用药方案和其它本领域的专业技术人员所共知的因素后进行。因此,本文的疫苗(组合物)的适合的剂量通过考虑上述因素来确定。
实施例
下面将参考实施例对本发明进行更详细的描述。这些实施例仅仅是示例性的,不对本发明构成限制。
[实施例1]本发明的转移载体质粒及其生产方法
(1)本发明的转移载体质粒pTriEx-Hsp65-gp64的构建
(1.1)质粒pBACsurf-CSP的构建
通过按照Yoshida等的方法(Yoshida,S.,等B.B.R.C.,271,107-115(2000))获得了NheI-NotI片段,其含有融合了柏氏疟原虫(Plasmodium berghei)ANKA株的基因组DNA、鼠Igk分泌的信号序列和FLAG序列的序列,并将NheI-NotI片段插入到pcDNA3.1(Invitrogen提供)的NheI-NotI位点中,从而制成质粒pcDNA-CS87。
从疟原虫柏氏疟原虫ANKA感染的BALB/c小鼠收集血液样品,使用QIAamp DNA Midi试剂盒(Qiagen提供)提取柏氏疟原虫基因组DNA。然后使用引物pbCSP1:5’-GGAGGGCTAGCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACGCGGATCCACTGCAG GGATATGGACAAAATAAAGCATCCAAGCCC-3(SEQIDN:1)(新制备的NheI位点用下划线表示,鼠Igk分泌的信号序列用斜体表示,FLAG序列用双下划线表示)和PbCSP-R1:
GGAGGGCGGCCGCATCCCGGGTTTTCTTATTTGAACCTTTTCGTTTTCTAACTCTTATACCAGAACC-3’(SEQIDN:2)(新制备的NotI位点用下划线表示),通过PCR扩增柏氏疟原虫ANKA基因组DNA。PCR使用PfuDNA聚合酶(Stratagene提供)进行30个循环(94℃变性30秒,55℃退火1分钟,72℃延伸2分钟)。PCR产物不具有糖基化磷酯酰肌醇(GPI)锚,并且编码与鼠Igk分泌信号序列融合的PbCSP代替其原有的信号序列。
将PCR产物纯化,用限制性酶NheI/NotI切割,然后插入到pcDNA3.1(Invitrogen提供)的NheI/NotI位点中,获得的质粒命名为pcDNA-CS87。pcDNA-CS87质粒含有CMV启动子、鼠Igk分泌的信号序列、PbCSP基因编码的蛋白(对应于21到299位氨基酸)、来自牛生长激素基因的poyA信号和poyA序列。
来自PbCSP的肽的21到306位氨基酸序列的编码基因片段通过用限制性酶PstI和SmaI切开pcDNA-CS87而获得,将该DNA片段插入到pBACsurf(Novagen提供)的PstI和SmaI位点中,构建的质粒被命名为pBACsurf-CSP。
(1.2)质粒pBACsurf-Hsp65的构建
使用QIAampDNAMidi试剂盒(Qiagen提供)从结核分枝杆菌H37Rv菌株提取基因组DNA,并通过PCR克隆而获得Hsp65基因。也就是说,使用引物phsp65-F1:5′-AATAATAGATCTAATGGCCAAGACAATTGCGTACGACGAAGA-3(SEQ ID NO:3)(BglII位点用下划线表示)和phsp65-R1:AATCCAATGCGGCCGCGGGAATTCGATTCCTGCAGGTCAGAAATCCATGCCACCCATGTCGCC-3(SEQ ID NO:4)(NotI位点用下划线表示)通过PCR扩增了从结核分枝杆菌H37Rv菌株提取的基因组DNA。
将PCR产物纯化,用限制性酶BglII/NotI切割,连接到pcDNA3.1(Invitrogen提供)的BamHI/NotI位点中,获得的质粒命名为pcDNA-hsp65。
pcDNA-hsp65质粒是其中鼠Igk分泌的信号序列与hsp65基因融合的构建体。
以pcDNA-hsp65作为模板,使用引物phsp65-F2:5-CACCCCTGCAGGACTACAAGGACGACGATGACAAGGAATTCATGGCCAAGACAATTGCGTACGACGAAGAGGCC-3’(SEQ ID NO:5)(Sse8387I、EcoRI位点用下划线表示,FLAG序列用斜体表示)和phsp65-R2:
5’-CCCGGGCGAAATCCATGCCACCCATGTCGCCGCCACC-3’(SEQIDNO:6)(Cfr9I位点用下划线表示)进行了PCR。得到的Hsp65基因的DNA片段(大约1660bp)被克隆到pENTR/D-TOPO(Invitrogen提供)中,然后用Sse8387I/Cfr9I切开,插入到上面获得的pBACsurf-CSP的PstI/Cfr9I位点中(Yoshida等Virology 316:161-70,2003)。
上述构建的质粒被命名为pBACsurf-Hsp65。
(1.3)质粒pENTR-gp64的构建
以pBACgus-1(Novagen提供)作为模板,使用引物pPolh-F2:5’-CACCCGGACCGGATAATTAAAATGATAACCATCTCGCAAATAAATAAG-3’(SEQ ID NO:7)(RsrII位点用下划线表示)和pgp64-R2:5’-GGTACCATATTGTCTATTACGGTTTCTAATCATAC-3’(SEQ IDNO:8)(KpnI位点用下划线表示)进行了PCR。得到的gp64基因的DNA片段(大约1700bp)被插入到pENTR/D-TOPO中以构建质粒pENTR-gp64。
按照上述构建的质粒被命名为pENTR-gp64。
(1.4)本发明的转移载体pDual-Hsp65-gp64的构建
将pDual-Hsp65-gp64用PstI/Cfr9I切开,并将hsp65基因的DNA片段(大约1660bp)插入到pENTR-gp64的PstI/Cfr9I位点中,以构建质粒pENTR-Hsp65-gp64。
此外,将pENTR-hsp65-gp64用RsrII/KpnI切开,将多角体启动子和hsp65gp64基因构成的DNA片段(大约3360bp)插入到TriEx-3(Novagen提供)的RsrII/KpnI中,以构建了其中表达受所需的双启动子控制的转移载体质粒pDual-Hsp65-gp64。
(2)本发明的转移载体pDual-PbCSP-gp64的构建
将在(1.1.1)中获得的质粒pBACsurf-CSP用PstI/Cfr9I切开,将PbCSP基因的DNA片段(大约890bp)插入到pDual-Hsp65-gp64的PstI/Cfr9I位点中,以构建质粒pDual-PbCSP-gp64。
(3)本发明的转移载体pDual-H1N1/HA1-gp64的构建
使用QIAamp MiniElute Virus Spin试剂盒(QIAGEN),从流感病毒PR8/34株感染的MDCK细胞的培养上清液中提取RNA,并使用引物HA-f:5’-CCTGCAGGTATGAAGGCAAACCTACTGGTC-3’(SEQID NO:9)(SbfI位点用下划线表示)和HA-r:5’-GCCCGGGCGATGCATATTCTGCA-3(SEQ ID NO:10)(SbfI位点用下划线表示),通过RT-PCR扩增。得到的全长1700bp的流感病毒HA基因片段被克隆到pCR-Blunt II-TOPO(Invitrogen提供)中。
得到的质粒被命名为pCR-Blunt-HA。以pCR-Blunt-HA作为模板,使用引物pHA-F1:5’-CACCGAATTCGACACAATATGTATAGGCTACCATGCG-3’(SEQID NO:11)(EcoRI位点用下划线表示)和pHA-R1:5′-CCCGGGCACCTCTGGATTGGATGGACGGAATG-3’(SEQ IDNO:12)(Cfr9I位点用下划线表示),进行了PCR。得到的H1N1/HA1基因的DNA片段(大约1000bp)被克隆到pENTR/D-TOPO(Invitrogen提供)中,然后用EcoRI/Cfr9I切开,之后将其插入到pDual-Hsp65-gp64的EcoRI/Cfr9I位点中,从而构建质粒pDual-H1N1/HA1-gp64。
(4)本发明的转移载体pDual-PbTRAMP-gp64的构建
从疟原虫柏氏疟原虫ANKA感染的BALB/c小鼠收集血液样品,使用QIAamp DNA Midi试剂盒(Qiagen提供)提取柏氏鼠疟原虫的基因组DNA。
使用该基因组DNA作为模板,按照下面的方法通过PCR克隆了PbTRAMP基因。即,使用引物pTRAMP-F1:5′-CACCGAATTCAAAATTGATACGAAAAAAAATGAAG-3’(SEQ IDNO:13)(EcoRI位点用下划线表示)和pTRAMP-R1:CCCGGGCTTTTAATTTTGAGGAGTCTTTATTTTC-3’(SEQ IDNO:14)(Cfr9I位点用下划线表示),进行了PCR。得到的PbTRAMPDNA片段(800bp)被克隆到pENTR/D-TOPO(Invitrogen提供)中,然后用EcoRI/Cfr9I切开,之后将其插入到pBACsurf-Hsp65的EcoRI/Cfr9I位点中。构建的质粒被命名为pBACsurf-PbTRAMP。
然后,将pBACsurf-PbTRAMP用EcoRI/Cfr9I切开,将PbTRAMP基因的DNA片段(大约860bp)插入到pDual-Hsp65-gp64的EcoRI/Cfr9I位点中,以构建质粒pDual-PbTRAMP-gp64。
(5)本发明的转移载体pDual-PbAMA1D123-gp64的构建
从疟原虫柏氏疟原虫ANKA感染的BALB/c小鼠收集血液样品,使用QIAamp DNA Midi试剂盒(Qiagen提供)提取柏氏疟原虫的基因组DNA。
使用该基因组DNA作为模板按照下面的方法通过PCR克隆了PbAMA1基因结构域123(D123)基因。即,使用引物pAMA-F1:5’-CACCGAATTCAATCCATGGGAAAAGTATACGGAAAAATAT-3’(SEQ ID NO:15)(EcoRI位点用下划线表示)和pAMA-R1:5’-CCCGGGCTTCTCTGGTTTGATGGGCTTTCATATGCAC-3’(SEQID NO:16)(Cfr9I位点用下划线表示)进行PCR。得到的PbAMA1D123 DNA片段(大约1280bp)被克隆到pENTR/D-TOPO(Invitrogen提供)中,然后用EcoRI/Cfr9I切开,然后将其插入到pBACsurf-Hsp65的EcoRI/Cfr9I位点中。构建的质粒被命名为pBACsurf-PbAMA1D123。
然后,将pBACsurf-PbAMA1D123用EcoRI/Cfr9I切开,并将PbAMA1D123基因的DNA片段(大约1280bp)插入到在上面的(1.4)中获得的pDual-Hsp65-gp64的EcoRI/Cfr9I位点中,以构建质粒pDual-PbAMA1D123-gp64。
(6)本发明的转移载体pDual-PbMSP119-gp64的构建
从疟原虫柏氏疟原虫ANKA感染的BALB/c小鼠收集血液样品,使用QIAamp DNA Midi试剂盒(Qiagen提供)提取了柏氏疟原虫的基因组DNA。
使用该基因组DNA作为模板,按照下面的方法通过PCR克隆PbMSP119基因。即,使用引物pMsp1-F1:5′-CACCCTGCAGGACTACAAGGACGACGATGACAAGCACATAGCCTCAATAGCTTTAAATAACTTAAATAAATCTGG-3’(SEQ IDNO:17)(PstI位点用下划线表示)和pMsp1-R1:5’-CCCGGGTTCCCATAAAGCTGGAAGAGCTACAGAATACACC-3’(SEQ ID NO:18)(Cfr9I位点用下划线表示),进行PCR。得到的PbMSP119DNA片段(大约450bp)被克隆到pENTR/D-TOPO(Invitrogen提供)中,然后用PstI/Cfr9I切开,然后将其插入到pBACsurf-Hsp65的PstI/Cfr9I位点中。构建的质粒被命名为pBACsurf-PbMSP119。
然后,将pBACsurf-PbMSP119用PstI/Cfr9I切开,将PbMSP-119基因的DNA片段(大约450bp)插入到pDual-Hsp65-gp64的PstI/Cfr9I位点中,以构建质粒pDual-PbMSP-119-gp64。
(7)本发明的转移载体pDual-PfCSP-gp64的构建
从疟原虫恶性疟原虫(P.falciparum)3D7株感染的人类红细胞中,使用QIAamp DNA Midi试剂盒(Qiagen)提取了疟原虫恶性疟原虫的基因组DNA。使用该基因组DNA作为模板,按照下面的方法通过PCR克隆PfCSP基因。即,使用引物pPfCSP-F1:5’-CACCGAATTCTTATTCCAGGAATACCAGTGCTATGGAAGT-3’(SEQ ID NO:19)(EcoRI位点用下划线表示)和pPfCSP-R1:5’-CCCGGGCTTTTTCCATTTTACAAATTTTTTTTTC-3’(SEQ IDNO:20)(Cfr9I位点用下划线表示),进行了PCR。得到的PfCSP DNA片段(大约1100bp)被克隆到pENTR/D-TOPO(Invitrogen提供)中,然后用EcoRI/Cfr9I切开,然后将其插入到pDual-PbAMA1D123-gp64的EcoRI/Cfr9I位点中。构建的质粒被命名为pDual-PfCSP-gp64。
(8)本发明的转移载体pDual-PfAMA1-gp64的构建
从恶性疟原虫3D7株感染的人类红细胞中,使用QIAamp DNAMidi试剂盒(Qiagen)提取了疟原虫恶性疟原虫的基因组DNA。使用该基因组DNA作为模板,按照下面的方法通过PCR克隆了PfAMA1基因。即,使用引物pPfAMA1-F1:5’-CACCCTGCAGGACTACAAGGACGACGATGACAAGCAGAATTATTGGGAACATCCATATCAAAATAGTGATGTG-3’(SEQ ID NO:21)(PstI位点用下划线表示,FLAG序列用斜体表示)和pPfAMA1-R1:5’-CCCGGGCTTTCATTTTATCATAAGTTGGTTTATG-3’(SEQ IDNO:22)(Cfr9I位点用下划线表示),进行了PCR。得到的PfAMA1DNA片段(大约3500bp)被克隆到pENTR/D-TOPO(Invitrogen提供)中,然后用PstI/Cfr9I切开。然后将其插入到PbAMA1D123-gp64的PstI/Cfr9I位点中。构建的质粒被命名为pDual-PfAMA1-gp64。
(9)本发明的转移载体pDual-Pfs25-gp64的构建
从恶性疟原虫3D7株感染的人类红细胞中,使用QIAamp DNAMidi试剂盒(Qiagen)提取了疟原虫恶性疟原虫的基因组DNA。使用该基因组DNA作为模板,按照下面的方法通过PCR克隆Pfs25基因。即,使用引物pPfs25-F1:5’-CACCGAATTCAAAGTTACCGTGGATACTGTATGCAAAAGAGGA-3’(SEQ ID NO:22)(EcoRI位点用下划线表示)和pPfs25-R1:5’-CCCGGGCAGTACATATAGAGCTTTCATTATCTAT-3’(SEQ IDNO:24)(Cfr9I位点用下划线表示),进行PCR。得到的Pfs25DNA片段(大约530bp)被克隆到pENTR/D-TOPO(从Invitrogen提供)中,然后用EcoRI/Cfr9I切开,然后将其插入到PbAMA1D123-gp64的EcoRI/Cfr9I位点中。构建的质粒被命名为pDual-Pfs25-gp64。
(10)本发明的转移载体pDual-H5N1/HA1-gp64的构建
从禽流感病毒H5N1合成了HA1基因,插入到pDual-Hsp65-gp64的EcoRI/Cfr9I位点中,构建了质粒pDual-H5N1/HA1-gp64。
(11)本发明的转移载体pDual-SARS/S-gp64的构建
合成了SARS病毒的S基因,插入到pDual-Hsp65-gp64的EcoRI/Cfr9I位点中,构建了质粒pDual-SARS/S-gp64。
(12)本发明的转移载体pCP-H1N1/HA1-gp64的构建
以pCR-Blunt-HA作为模板,使用引物Polh-f RsrII(5’-GGGCGGACCGGATAATTAAAATGATAACCATCTCG-3’:SEQID NO:25)(RsrII位点用下划线表示)和GP64-r DraIII(5’-GGGCACTTAGTGATATTGTCTATTACGGTTTCTAATC-3’:SEQID NO:26)(DraIII位点用下划线表示),进行PCR。将得到的2700bp的DNA片段连接到用限制性酶RsrII和DraIII消化pDual-H1N1/HA1-gp64获得的载体中,构建了pCP-H1N1/HA1-gp64。
(13)本发明的转移载体pCAP-H1N1/HA1-gp64的构建
将用限制性酶RsrII和DraIII切开pCP-H1N1/HA1-gp64获得的HA1与gp64基因片段插入到用限制性酶RsrII和DraIII切开pTriEx-1.1(Novagen提供)得到的载体中,构建了质粒pCAP-H1N1/HA1-gp64。
(14)本发明的转移载体pCU-H1N1/HA1-gp64的构建
以pTriEx3.1作为模板,使用CMVenh-fFseI(5’-GGGGGCCGGCCCTAGTTATTAATAGTAATCAATTAC-3’:SEQID NO:27)(FseI位点用下划线表示)和CMVenh-r KpnI(5’-GGGGGTACCCATGGTAATAGCGATGACTAATACG-3’:SEQID NO:28)(KpnI位点用下划线表示)进行PCR,扩增CMV增强子区域。此外,以人类基因组DNA为模板,使用UBBp-f KpnI(5’-GGGGGTACCTCGAGGAAGGTTTCTTCAACTC-3’:SEQ IDNO:29)(KpnI位点用下划线表示)和UBBp-rRsrII(5’-GGGCGGTCCGGACCTAGTTTAAAAGTAAAACATAAG-3’:SEQID NO:30)(RsrII位点用下划线表示)进行PCR,扩增UBB启动子区域。将得到的两个片段连接到用限制性酶FseI和RsrII消化的pCP-H1N1/HA1-gp64获得的载体中,构建了pCU-H1N1/HA1-gp64。
(15)本发明的转移载体pDual-H1N1/NP-gp64的构建
以来自流感病毒PR8/34株的基因组RNA作为模板,使用NP-fEcoRI(5’-ACGGAATTCCATTCAATTCAAACTGGA-3’:SEQ IDNO:31)(EcoRI位点用下划线表示)和NP-r Cfr9I(5’-GATCCCGGGCCTTGTCAATGCTGAATGGCAA-3’:SEQ IDNO:32)(Cfr9I位点用下划线表示)进行RT-PCR。将得到的片段用限制性酶EcoRI和Cfr9I消化,插入到用限制性酶EcoRI和Cfr9I消化的pCP-H1N1/HA1-gp64中,制造了pDual-H1N1/NAe-gp64。
(16)本发明的转移载体pDual-H1N1/M2-gp64的构建
以来自流感病毒PR8/34株的基因组RNA作为模板,使用M2-fEcoRI(5’-CGGAATTCATGAGTCTTCTAACCGAGG-3’:SEQ IDNO:33)(EcoRI位点用下划线表示)和M2-r Cfr9I(5’-GATCCCGGGCCTCCAGCTCTATGCTGAC-3’:SEQ ID NO:34)(Cfr9I位点用下划线表示)进行了RT-PCR。将得到的片段用限制性酶EcoRI和Cfr9I消化,插入到用限制性酶EcoRI和Cfr9I消化的pCP-H1N1/HA1-gp64中,制造了pDual-H1N1/M2-gp64。
(17)本发明的转移载体pDual-H1N1/NAe-gp64的构建
以来自流感病毒PR8/34株的基因组RNA作为模板,使用NAe-fEcoRI(5’-ACGGAATTCCATTCAATTCAAACTGGA-3’:SEQ IDNO:35)(EcoRI位点用下划线表示)和NAe-r Cfr9I(5’-GATCCCGGGCCTTGTCAATGCTGAATGGCAA-3’:SEQ IDNO:36)(Cfr9I位点用下划线表示)进行了RT-PCR。将得到的片段用限制性酶EcoRI和Cfr9I消化,插入到用限制性酶EcoRI和Cfr9I消化的pCP-H1N1/HA1-gp64中,制造了pDual-H1N1/NAe-gp64。
(18)本发明的转移载体pDual-M2e-gp64的构建
以pDual-H1N1/M2-gp64作为模板,使用M2-f EcoRI(5’-CGGAATTCATGAGTCTTCTAACCGAGG-3’:SEQ ID NO:37)(EcoRI位点用下划线表示)和M2e-r Cfr9I(5’-GATCCCGGGCATCACTTGAACCGTTGCA-3’:SEQ ID NO:38)(Cfr9I位点用下划线表示)进行PCR。将得到的片段用限制性酶EcoRI和Cfr9I消化,插入到用限制性酶EcoRI和Cfr9I消化的pCP-H1N1/HA1-gp64中,制造了pDual-M2e-gp64。
(19)本发明的转移载体pCP-HA1/NC99-gp64的构建
从冷冻保存的流感病毒NewCaledonia99/20(NC99)中使用QIAamp MiniElute Virus Spin试剂盒(QIAGEN)提取了RNA,使用引物 HA1-f EcoRI(5’-GATGAATTCGACACAATATGTATAGGCTACC-3’:SEQ IDNO:39)(EcoRI位点用下划线表示)和HA1-r CFr9I(NC99)(5’-GATCCCGGGCTCTGGATTGAATGGATGGGATG-3’:SEQ IDNO:40)(Cfr9I位点用下划线表示)进行了RT-PCR,以扩增HA1基因片段。将得到的片段和pCP-H1N1/HA1-gp64用限制性酶EcoRI和Cfr9I处理,用来将来自NC99的HA1基因片段新插入到pCP-H1N1/HA1-gp64的HA1导入区中。得到的质粒被命名为pCP-HA1/NC99-gp64。
(20)本发明的转移载体pCP-H1N1/HA0-gp64的构建
以pCR-Blunt-HA为模板,使用HA0-f EcoRI(5’-GGGGAATTCATGAAGGCAAACCTACTGG-3’:SEQ ID NO:41)(EcoRI位点用下划线表示)和HA2-r Cfr9I(5’-GATCCCGGGCGATGCATATTCTGCA-3’:SEQ ID NO:42)(Cfr9I位点用下划线表示)进行PCR,以扩增全长HA基因。将得到的片段与pCP-H1N1/HA1-gp64用限制性酶EcoRI和Cfr9I处理,用于将HA0基因片段新插入到pCP-H1N1/HA1-gp64的HA1导入区中。得到的质粒被命名为pCP-H1N1/HA0-gp64。
(21)本发明的转移载体pCP-H1N1/HA2-gp64的构建
以pCR-Blunt-HA为模板,使用HA2-f EcoRI(5’-GATGAATTCATATTTGGAGCCATTGCCG-3’:SEQ ID NO:43)(EcoRI位点用下划线表示)和HA2-r Cfr9I(5’-GATCCCGGGCGATGCATATTCTGCA-3’:SEQ ID NO:44)(Cfr9I位点用下划线表示)进行PCR,以扩增全长HA基因。将得到的片段与pCP-H1N1/HA1-gp64用限制性酶EcoRI和Cfr9I处理,用于将HA2基因片段新插入到pCP-H1N1/HA1-gp64的HA1导入区中。得到的质粒被命名为pCP-H1N1/HA2-gp64。
(22)本发明的转移载体pCP-H1N1/HA1-vp39的构建
以Bac Vector-2000转染试剂盒(Novagen)随附的杆状病毒DNA作为模板,使用vp39-f(5’-CTTACTAGTATGGACTACAAGGACGACGATGACAAG GGCGGCGGCGGCTCGGCGCTAGTGCCCGTGGGT-3’:SEQ IDNO:45)(SpeI位点用下划线表示,EcoRI位点用双下划线表示)和vp39-r(5’-CTTCACTTAGTGATGGTGATGATGGTGGTGGCTTTAAAGCTTGACGGCTATTCCTCCACC-3’:SEQ ID NO:46)(DraIII位点用下划线表示,SmaI位点用双下划线表示)进行PCR,以扩增vp39基因区。将扩增的片段和pDual-H1N1/HA1-gp64用限制性酶SpeI和DraIII切开,互相连接以构建pDual-vp39。此外,以pDual-H1N1/HA1-gp64为模板,使用Polh-S1(5’GCTAACCATGTTCATGCC-3’:SEQ ID NO:47)和HA1-r EcoRI(5’-GGGGAATTCACCTCTGGATTGGATGGAC-3’:SEQ ID NO:48)(EcoRI位点用下划线表示)进行PCR。将得到的片段用EcoRI消化,制备了HA1基因。将得到的片段插入到用EcoRI消化的pDual-vp39中,构建了pCP-H1N1/HA1-vp39。
(23)本发明的转移载体pCP-H1N1/NP-vp39的构建
以pDual-H1N1/NP-gp64为模板,使用NP-f 5EcoRI(5’-ACGGAATTCATGGCGTCCCAAGGCACC-3’:SEQ ID NO:49)(EcoRI位点用下划线表示)和NP-r EcoRI(5’-ACGGAATTCATTGTCGTACTCCTCTGCATTG-3’:SEQ IDNO:50)(EcoRI位点用下划线表示),进行PCR。将得到的片段用EcoRI消化。将得到的片段插入到用EcoRI消化的pDual-vp39中,构建了pCP1-H1N1/NP-vp39。
[参比实施例1]pBACgus-CMV-PbCSP的构建
(1.1)pcDNA-GL3(luc)的构建
将pGL3-增强子(Promega)用限制性酶HindIII/XbaI切开,将荧光素酶基因DNA片段(大约1690bp)连接到pcDNA3.1(Invitrogen提供)的HindIII/XbaI位点中,得到的质粒被命名为pcDNA-GL3(luc)。
(1.2)pBACgus-CMV-IgHsp65的构建
将在上面的实施例1(1.2)中获得的pcDNA-hsp65用限制性酶BamHI/NotI切开,插入到BamHI/NotI位点中产生pcDNA-Ighsp65。得到的质粒被命名为pcDNA-IgHsp65。
然后,将pcDNA-IgHsp65用BglII/SphI切开,将CMV启动子、带有鼠Igk信号序列的Hsp65基因以及来自牛生长激素的poly A信号构成的基因盒(大约2850bp)插入到pBACgus-1(Novagen)的BglII/SphI位点中。构建的质粒被命名为pBACgus-CMV-Hsp65。
(1.3)pBACgus-CMV-GL3的构建
将上面获得的质粒pcDNA-GL3(luc)用限制性酶NheI/XbaI切开,将荧光素酶基因DNA片段(大约1690bp)插入到质粒pBACgus-CMV-Hsp65的NheI/XbaI位点中,得到的质粒被命名为pBACgus-CMV-GL3。
(1.4)pBACgus-CMV-PbCSP的构建
用限制性酶PstI和SmaI切开质粒pBACsurf-CSP,产生了对应PbCSP肽的21到306位氨基酸序列的编码基因的片段,将该DNA片段(大约858bp)插入到上面获得的pBACgus-CMV-GL3的PstI和SmaI位点中,得到的质粒被命名为pBACgus-CMV-PbCSP。
(1.5)pBACgus-CMV-HA-full的构建
将pCR-Blunt-HA用BamHI/Sse8387I切开,将HA基因的DNA片段(大约1750bp)插入到pBluescript II(KS-)的BamHI/PstI位点中,构建了质粒pBluescript-HA。
此外,将pBluescript-HA用HindIII/XbaI切开,将HA基因的DNA片段(大约1800bp)插入到在(1.3)中获得的pBACgus-CMV-GL3的HindIII/XbaI位点中,构建了质粒pBACgus-CMV-HA-full。
[实施例2]本发明的重组杆状病毒及其生产方法
(1)使用制备重组杆状病毒的试剂盒(Novagen的BacVector-2000转染试剂盒),通过将BacVector-2000 DNA与上述实施例1中构建的每种转移载体:pDual-Hsp65-gp64、pDual-PbCSP-gp64、pDual-H1N1/HA1-gp64、pDual-PbTRAMP-gp64、pDual-PbAMA1D123-gp64、pDual-PbMSP-119-gp64、pDual-PfCSP-gp64、pDual-PfAMA1-gp64、pDual-Pfs25-gp64、pCP-H1N1/HA1-gp64、pCAP-H1N1/HA1-gp64、pCU-H1N1/HA1-gp64、pDual-H1N1/NP-gp64、pDual-H1N1/M2-gp64、pDual-H1N1/NAe-gp64、pDual-M2e-gp64、pCP-HA1/NC99-gp64、pCP-H1N1/HA0-gp64、pCP-H1N1/HA2-gp64、pCP-H1N1/HA1-vp39、pCP-H1N1/NP-vp39以及在参比实施例1中获得的质粒pBACgus-CMV-PbCSP和pBACgus-CMV-HA-full共转染到Sf-9细胞中,制备了重组杆状病毒。
制备的重组杆状病毒被分别命名为AcNPV-Dual-Hsp65、AcNPV-Dual-PbCSP、AcNPV-Dual-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-PbTRAMP、AcNPV-Dual-PbAMA1D123、AcNPV-Dual-PbMSP-119、AcNPV-CMV-PbCSP、AcNPV-CMV-HA-tull、AcNPV-H1N1/HA1、AcNPV-CAP-H1N1/HA1、AcNPV-CU-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-H1N1/NP、AcNPV-Dual-H1N1/M2、AcNPV-Dual-H1N1/NAe、AcNPV-Dual-M2e、AcNPV-CP-HA1/NC99、AcNPV-CP-H1N1/HA0、AcNPV-CP-H1N1/HA2、AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39和AcNPV-CP-H1N1/NP-vp39。
培养Sf-9细胞,使得每个150mm培养平板(Akita SumitomoBakelite Co.,Ltd.提供的sumilon)为2 x 107个细胞,每种上述的杆状病毒以大约5的感染复数进行感染。在5到6天后,将培养基在4℃以10,000xg离心25分钟以收集上清液,使用Beckman超速离心机(SW28摇摆转头)将其在4℃以25,000rpm继续离心90分钟以获得病毒粒子。
(2)使用制备重组杆状病毒的试剂盒(Novagen提供的Bac Vector-2000转染试剂盒),通过将BacVector-2000 DNA与上述实施例1中构建的每种转移载体:pDual-H5N1/HA1-gp64和pDual-SARS/S-gp64共转染到Sf-9细胞中,制备了重组杆状病毒。制备的重组杆状病毒分别被命名为AcNPV-H5N1/HA1和AcNPV-Dual-SARS/S。
培养Sf-9细胞,使得每个150mm培养平板(Akita SumitomoBakelite Co.,Ltd.提供的sumilon)为2 x 107个细胞,每种上述的杆状病毒以大约5的感染复数进行感染。在5到6天后,将培养基在4℃以10,000xg离心25分钟以收集上清液,使用Beckman超速离心机(SW28摇摆转头)将其在4℃以25,000rpm继续离心90分钟以获得病毒粒子。
[实施例3]本发明的重组杆状病毒的药理作用
(作为疟疾疫苗的药理作用)
(疟疾感染预防测试)
3.实验方法
3.1疫苗接种
用作疫苗的重组病毒溶液以三周的间期接种BALB/c雌性小鼠三次。在注射到大腿肌肉内的情况下,用量为0.2mL/只,病毒溶液被制备成病毒量为5 x 106pfu/只。
3.2用疟疾感染小鼠
在第三次疫苗接种后3周,对每个组的小鼠用麻醉小鼠的溶液进行麻醉,用感染了柏氏疟原虫ANKA 2.34克隆的斯氏按蚊(Anophelesstephensi)SDA 500种系叮咬小鼠使其感染疟疾。
3.3每个组中小鼠存活率的计算
在感染疟疾后,计数每个组中的死亡病例,并计算出每个组中小鼠的存活率。
3.4对于本发明的药物组合物作为疫苗的疟疾感染预防效果来说,药理作用测试的结果显示在表1中。每个组中的存活率显示在表1右边的列中。
如表1所示,所有在外周血中鉴定到了疟疾感染的红细胞的小鼠,在感染后38天之内都死亡了。在其中插入了子孢子体期的抗原(CSP)基因的重组病毒中,在其中通过肌肉内接种了在实施例2中获得的含有转移载体AcNPV-Dual-PbCSP的重组杆状病毒(实施例1(2))的组(4号组)中,观察到了100%的感染预防效果。
在野生型杆状病毒(2号组)中,没有观察到与对照组(1号组)的差别。在包含了实施例2中使用哺乳动物启动子获得的重组杆状病毒(AcNPV-CMV-PbCSP,包含了参比实施例1中的载体)的组(3号组)中,与对照组相比观察到了略高的存活率,表明了尽管弱但仍表现出了病毒接种的效果的可能性。
表1
每个组中小鼠的存活率
组号 | 存活/例数 | 存活率(%) |
1无 | 5/20 | 25 |
2AcNPV-WT | 6/20 | 30 |
3AcNPV-CMV-PbCSP | 5/10 | 50 |
4AcNPV-Dual-PbCSP | 10/10 | 100 |
[实施例4]本发明的重组杆状病毒的药理作用测试
(作为流感疫苗的药理作用测试)
(流感病毒感染预防测试)
4.实验方法
4.1 疫苗
用作疫苗的病毒溶液以2周的间隔接种两次。疫苗病毒以106.5PFU/小鼠用注射胰岛素的26G注射器注射到大腿肌肉中。
4.2 用于攻击的病毒溶液的制备
在用流感病毒感染的当天,将流感病毒A/PR/8/34株的储存病毒溶液在室温自然融化。将融化的储存病毒溶液用含有10%的无菌牛血清白蛋白BSA的Dulbecco’s磷酸盐缓冲盐水(D-PBS)稀释到1000TCID50/0.05mL用于下呼吸道感染的激惹病毒溶液和稀释到1000TCID50/0.005mL用于上呼吸道感染,以制备攻击用病毒溶液。
4.3 病毒溶液的鼻内接种
在第二次疫苗接种后2周,通过肌肉给药0.05mL用于小鼠的麻醉溶液将小鼠麻醉。在4.2中制作的流感病毒溶液接种到小鼠的鼻子中,上呼吸道感染使用0.005mL,下呼吸道感染使用0.05mL。
4.4. 肺部取样
接种病毒后3天,对每个组的4只小鼠每只小鼠肌肉内给药用于小鼠的麻醉溶液0.1mL,在麻醉情况下通过从腹主动脉放血进行安乐死。然后将小鼠解剖,无菌取出肺脏。
4.5 接种流感病毒后小鼠的存活率记录
直到接种流感病毒后11天,每天证实并记录一次小鼠的存活率。
4.6 肺脏匀浆液和稀释溶液的制备
通过加入3mL 0.1% BSA、10mM HEPES、含有抗生素的最低基本培养基(MEM,GIBCO)并使用polytron匀浆器进行匀浆,获得了肺脏匀浆液。将肺脏匀浆液分配到冷冻管中,储存在超低温冰箱中。
使用其中加入了上述的抗生素和胰蛋白酶(SIGMA,T-4549,2mg/mL)的MEM培养基,制备了一系列10倍或100.5倍的稀释液。
4.7 用于细胞生长的培养基的制备
通过在500mL MEM中加入50mL胎牛血清FBS,制备了用于细胞生长的培养基(MEM+10%FBS),并储存在冰箱中直到使用。
4.8 来自犬肾的MDCK(Madin-Darby犬肾)的培养
将冷冻保存的MDCK细胞在温水中快速融化,然后悬浮在10mL用于细胞生长的培养基中,通过离心(1000rpm,5分钟,4℃)除去上清液。将通过离心收集的细胞沉淀悬浮在用于细胞生长的培养基中。将细胞接种到培养瓶中,在温箱中在5%CO2和37℃条件下培养。在培养开始后,在显微镜下观察细胞的形态和生长,就在MDCK细胞恰要变为汇合之前,将细胞用D-PBS(-)清洗,用胰蛋白酶处理使细胞分散,然后将细胞悬浮在用于细胞生长的培养基中。将细胞悬浮液接种到培养瓶中,加入用于细胞生长的新鲜培养基,使细胞传代。
4.9 用于病毒生长的培养基(维持培养基)的制备
在500mL MEM(加入了10mM HEPES缓冲液)中加入0.1% BSA的培养基被用作病毒生长的培养基(MEM+0.1% BSA),并在制备后储存在冰箱中直到使用。抗生素在使用时加入。
4.10 病毒感染性滴度的测量(细胞病理学效应,CPE方法)
恰在培养瓶中的MDCK细胞变得要汇合之前,对细胞进行胰蛋白酶处理以分散细胞,对细胞的数量进行计数,使用维持培养基制备6 x105细胞/mL的MDCK细胞悬浮液。将0.05mL该悬浮液分配到96孔板的每个孔中,在CO2培养箱中在5% CO2和37℃下培养过夜。
在第二天,证实了细胞的吸附,将以前制备的每种肺脏匀浆稀释液分配到96孔板的6个孔的每个孔中0.05mL,然后在CO2培养箱中在5% CO2和37℃下培养3天。
在培养的第三天,证实了孔中的细胞已经变性,然后将含有30%福尔马林的结晶紫溶液分配到96孔板的每个孔中0.05mL以固定和染色细胞,并通过Reed-Münch方法计算肺脏中病毒的感染性滴度。
4.11 每个疫苗组对小鼠体内病毒感染性滴度的影响
比较了对照组(用AcNPV接种)和测试组(用重组杆状病毒[包含了在实施例1(3)中获得的转移载体AcNPV-Dual-H1N1/HA1]和重组杆状病毒[包含了在参比实施例1中获得的载体AcNPV-CMV-H1N1/HAfull]接种)中鼠肺脏匀浆液中的感染性滴度。将每个病毒感染性滴度转换成对数。通过Tukey测试(Release 8.1,SAS Institute Japan Ltd)考虑其感染复数分析组间的治疗效果。
结果显示在图1中。
每种疫苗对感染流感病毒后的存活期的影响。
使用对数级测试比较了对照组(用AcNPV接种)和疫苗组(用AcNPV-Dual-H1N1/HA1或AcNPV-CMV-H1N1/HA full接种)的存活期,结果显示在图2中。
使用SAS系统(SAS Institute Japan,R.8.1)进行统计学分析。显著性水平是5%。
4.12 肺脏中病毒的感染性滴度
与对照组(用AcNPV接种)相比,在肌肉内接种AcNPV-Dual-H1N1/HA1的组中,在感染后第6天肺脏中病毒的感染性滴度被明显抑制(p=0.0009)。同时,与接种了AcNPV-CMV-H1N1/HAfull的组相比,在肌肉内接种AcNPV-Dual-H1N1/HA1的组中,感染后第6天肺脏中病毒的感染性滴度被明显抑制(p=0.0094)。
4.13 存活期
与对照组(用AcNPV接种)相比,在肌肉内接种AcNPV-Dual-H1N1/HA1的组中,存活期明显延长(p=0.0031)。同时,在接种了AcNPV-CMV-H1N1/HA full的组中,存活期与对照组(用AcNPV接种)中的存活期没有显著的差别(p=0.7851)。与接种了AcNPV-CMV-H1N1/HA full的组相比,在肌肉内接种了AcNPV-Dual-H1N1/HA1的组中的存活期被显著延长了(p=0.0031)。
在该评估体系中,小鼠发生了流感病毒性肺炎并死亡。因此,可以推断,通过肌肉内接种AcNPV-Dual-H1N1/HA1抑制了肺脏中病毒的生长,从而减少了死于肺炎的小鼠。
[实施例5]来自本发明的重组杆状病毒的疫苗抗原在昆虫细胞中的表达试验
将Sf-9细胞以每个孔3 x 106个细胞培养在12孔板中,在实施例2中获得的杆状病毒粒子AcNPV-Dual-PbCSP、AcNPV-Dual-HSP65或AcNPV-Dual-H1N1/HA1或作为对照的野生型杆状病毒AcNPV-WT以大约5的感染复数进行感染。3到4天后,去除培养上清液,将板用PBS洗3次,然后在每个孔中加入0.2mL含有2%2-巯基乙醇的Leamuli溶液(Tris-盐酸pH6.8,2%SDS,10%甘油,0.1%溴酚蓝)以完全裂解细胞。将样品在95℃煮沸5分钟,在SDS-PAGE上电泳。电泳后,将蛋白转移到PVDF膜上(Millipore提供的Immobilon-P),通过将膜浸泡在block ace(Dai Nippon Pharmaceutical Co.,Ltd.提供)中在4℃阻断12小时。通过下列程序进行Western印迹。将转移有来自每种杆状病毒感染的Sf-9细胞的蛋白的膜,与作为第一抗体的小鼠抗FLAG单克隆抗体(Sigma提供)进行孵育,然后与作为第二抗体的生物素标记的山羊抗小鼠IgG(H+L)抗体(Vector提供)一起孵育。然后,加入亲和素标记的碱性磷酸酶(GIBCO-BRL提供),使用NBT/BCIP(GIBCO-BRL提供)显色以检测蛋白的条带。
结果显示在图3中。
图3显示了Western印迹分析,显示了重组杆状病毒中来自重组转移载体的流感病毒HA基因、结核分枝杆菌的Hsp65基因和疟原虫的CSP基因的融合抗原在昆虫细胞中的表达。在图中,第1道显示了来自野生型杆状病毒(AcNPV-WT)的条带,第2道显示了流感病毒HA基因被插入到本发明的双启动子之下的重组杆状病毒(AcNPV-Dual-H1N1/HA1)的条带,第3道显示了来自野生型杆状病毒(AcNPV-WT)的条带,第4道显示了结核分枝杆菌Hsp65基因被插入到本发明的双启动子之下的重组杆状病毒(AcNPV-Dual-Hsp65)的条带,第5道显示了来自野生型杆状病毒(AcNPV-WT)的条带,第6道显示了疟原虫CSP基因被插入到本发明的双启动子之下的重组杆状病毒(AcNPV-Dual-PbCSP)的条带。
正如在图中的第2、4和6道中显示的那样,在每个抗原基因与gp64基因融合并在本发明的双启动子之下表达的重组杆状病毒中,观察到了对应于免疫原性外源抗原基因与gp64基因的融合表达产物的条带。
因此,鉴定了免疫原性外源抗原基因与gp64基因可以融合并在昆虫细胞中表达。
[实施例6]来自本发明的重组杆状病毒的疫苗抗原在哺乳动物中的表达测试
以大约1的感染复数将HepG2细胞用AcNPV-Dual-Hsp65或作为对照的AcNPV-WT进行感染。24小时后,除去培养上清液,将板用PBS洗3次,然后加入在-20℃冷却的丙酮乙醇溶液(7:3),将细胞在-20℃固定5分钟。加入5%正常山羊血清(Sigma提供)在室温进行阻断。然后,加入作为第一抗体的小鼠抗Hsp65抗体(Yoshida等,Vaccine 2005),然后加入FITC标记的山羊抗小鼠IgG(H+L)抗体并孵育。反应过的细胞在荧光显微镜下检测。
HepG2细胞也培养为每个细胞培养用的100mm平板1 x 107个细胞,以大约5的感染复数用杆状病毒粒子AcNPV-Dual-H1N1/HA1或AcNPV-CMV-H1N1/HA full或作为对照的AcNPV-WT进行感染。2小时后,除去培养上清液,将板用PBS洗3次,然后将细胞在不含甲硫氨酸和半胱氨酸的培养基(培养基在Dulbecco′s修饰的Eagle培养基中(Invitrogen)加入了用PBS透析的10%FBS)中培养3小时。加入同位素标记的甲硫氨酸和半胱氨酸溶液(TRANS35S-LABEL MPBiomedicals,Inc.)至终浓度为5μCi/mL。12小时后,除去培养上清液,将板用PBS洗3次,然后将细胞用0.5mL RIPA缓冲液(1%脱氧胆酸钠,1%Triton X-100,0.1% SDS,10mM Tris-HCl[pH7.5])裂解以制备样品。将样品加到事先已经吸附了来自流感病毒感染的小鼠的血清的蛋白A-Sepharose CL-4B(Pharmacia)载体上,在冰上孵育2小时。载体用RIPA缓冲液洗5次,加入含有2%2-巯基乙醇的Leamuli溶液,将样品在95℃煮沸5分钟,在6%的SDS-PAGE上进行电泳。电泳后,将凝胶干燥,通过放射自显影检测与抗体反应的蛋白。
结果显示在图4和5中。
图4(A)显示了用荧光标记的抗体染色的细胞,显示出重组杆状病毒中结核分枝杆菌Hsp65基因在HepG2细胞中的表达。
图4(B)显示了野生型杆状病毒被加入到HepG2细胞中的情况。
正如在图(A)中显示的那样,发现使用带有本发明双启动子的转移载体的重组杆状病毒能够在哺乳动物细胞中表达目的抗原。
这表明当施用于哺乳动物包括人类时,从本发明的重组转移载体产生的重组杆状病毒侵入了哺乳动物细胞,运转哺乳动物的启动子,目的外源抗原基因与gp64基因在哺乳动物细胞中融合,以诱导获得性免疫。
图5显示了流感病毒HA抗原基因被整合到双启动子之下的重组杆状病毒中融合抗原在哺乳动物中的表达的免疫沉淀分析。在图中,第1道显示了野生型杆状病毒(AcNPV-WT),第2道显示了流感病毒HA抗原基因被整合到CMV启动子之下的重组杆状病毒(AcNPV-CMV-H1N1/HA full),第3道显示了流感病毒HA抗原基因被整合以便与gp64基因融合并在双启动子之下表达的重组杆状病毒(AcNPV-Dual-H1N1/HA1)。
在流感病毒HA抗原基因整合到CMV启动子之下的重组杆状病毒(AcNPV-CMV-H1N1/HA full)和流感病毒HA抗原基因被整合以便与gp64基因融合并在双启动子之下表达的重组杆状病毒(AcNPV-Dual-H1N1/HA1)中,显然与流感病毒感染的血清特异性反应的蛋白、即包括HA抗原的蛋白在HepG2细胞中是新合成的。
因此,据认为本发明的重组杆状病毒即使是在哺乳动物中也表达了所需的免疫原性外源抗原基因编码的抗原蛋白,并且当重组病毒被施用于哺乳动物包括人类时,随着融合抗原在人类细胞中的表达,诱导了特异性针对抗原的获得性免疫。
[实施例7]在本发明的重组杆状病毒的病毒粒子(毒粒)上呈递的疫苗抗原中融合抗原的鉴定试验
在通过超速离心收集的每种杆状病毒粒子AcNPV-WT、AcNPV-CMV-PbCSP、AcNPV-PbCSPsurf或AcNPV-Dual-PbCSP的病毒浓缩溶液0.005mL中,加入0.005mL Leamuli溶液(2x),然后在95℃煮沸5分钟,在6%的SDS-PAGE上进行电泳。电泳后,将蛋白转移到PVDF膜上(Millipore提供的Immobilon-P),通过将膜浸泡在block ace(Dai Nippon Pharmaceutical Co.,Ltd提供)中在4℃下阻断12小时。通过下面的程序进行Western印迹。将转移有病毒粒子蛋白的膜,与作为第一抗体的小鼠抗FLAG单克隆抗体(Sigma提供)进行孵育,然后与作为第二抗体的生物素标记的山羊抗小鼠IgG(H+L)抗体(从Vector提供)一起孵育。然后,加入亲和素标记的碱性磷酸酶(GIBCO-BRL提供),使用NBT/BCIP(GIBCO-BRL提供)显色以检测蛋白的条带。
结果显示在图6中。
图6显示了Western印迹分析,显示了从重组转移载体制造的重组杆状病毒的病毒粒子中疟疾CSP基因(PbCSP)的表达。在图中,第1道显示了野生型杆状病毒,第2道显示了从PbCSP抗原基因被插入到哺乳动物启动子控制之下的转移载体制造的重组杆状病毒,第3道显示了从PbCSP抗原基因被插入以与gp64融合并在杆状病毒多角体启动子控制之下表达的转移载体制造的重组杆状病毒,第4道显示了从PbCSP抗原基因被插入以与gp64融合并在双启动子控制之下表达的转移载体制造的重组杆状病毒。杆状病毒被电泳,融合的PbCSP基因和gp64基因的表达产物被鉴定。
正如在第3和4道中显示的那样,对于AcNPV-PbCSPsurf和AcNPV-Dual-PbCSP来说,在重组病毒离子中鉴定到了表明融合抗原存在的强条带。
因此,从实施例7中,发现了在从本发明的重组转移载体产生的重组杆状病毒中,融合了gp64基因和所需的免疫原性外源基因的表达产物可以存在于重组病毒粒子中。
实施例8:通过替换启动子的持续基因表达
1)通过替换启动子的持续的基因表达
为了鉴定重组病毒是否能在培养细胞中持续表达抗原,用AcNPV-CP-H1N1/HA1、AcNPV-CAP-H1N1/HA1或AcNPV-CU-H1N1/HA1感染HeLa细胞,并鉴定抗原的表达。将细胞以1.0 x 104细胞/孔接种到24孔板中,然后以MOI=10、20、100用病毒进行感染,粘附进行1小时。然后从细胞培养上清液中除去病毒,将细胞在培养箱中培养。按照时间收集细胞并提取RNA。以提取的RNA作为模板,使用引物HA1_F01(5’-GAGCTGAGGGAGCAATTGAG-3’)(序列:SEQ ID NO:51)和引物HA1_R01(5’-GGGTGATGAATACCCCACAG-3’)(序列:SEQID NO:52)进行RT-PCR。扩增的DNA在电泳上分析。
结果,在所有3种类型中都鉴定到了表达,证实了CMV启动子对于本发明的重组杆状病毒来说可以被转变为另一个真核启动子。
图7显示了在HeLa细胞中通过RT-PCR检测基因表达的结果。M表示电泳的DNA标记物。样品如下:
1.野生型病毒以MOI=10感染的细胞的RNA;
2.野生型病毒以MOI=20感染的细胞的RNA;
3.野生型病毒以MOI=100感染的细胞的RNA;
4.AcNPV-CP-H1N1/HA1以MOI=10感染的细胞的RNA;
5.AcNPV-CP-H1N1/HA1以MOI=20感染的细胞的RNA;
6.AcNPV-CP-H1N1/HA1以MOI=100感染的细胞的RNA;
7.AcNPV-CU-H1N1/HA1以MOI=10感染的细胞的RNA;
8.AcNPV-CU-H1N1/HA1以MOI=20感染的细胞的RNA;
9.AcNPV-CU-H1N1/HA1以MOI=100感染的细胞的RNA;
10.AcNPV-CAP-H1N1/HA1以MOI=10感染的细胞的RNA;
11.AcNPV-CAP-H1N1/HA1以MOI=20感染的细胞的RNA;以及
12.AcNPV-CAP-H1N1/HA1以MOI=100感染的细胞的RNA.
在感染后0时、1天、4天和7天时收集样品,通过RT-PCR扩增,扩增的DNA进行电泳。
实施例9:PbCSP抗原重组病毒诱导的抗体滴度和细胞免疫
1.疫苗接种
用于免疫接种的重组病毒溶液以三周的间隔接种BALB/c雌性小鼠三次。在肌肉内注射到大腿肌肉的情况下,接种剂量准备为0.2mL/只,相当于1 x 108pfu/只的病毒量。野生型病毒(AcNPV-WT)、AcNPV-PbCSPsurf(Yoshida等,Virology 316:161-70,2003)或AcNPV-Dual-PbCSP作为疫苗被注射。
2.小鼠的解剖
最后一次接种后3周,将小鼠安乐死,从小鼠中取出血清和脾脏。血清用于测量特异性抗体滴度,脾脏用于ELISPOT分析。
3.抗体滴度的测量
使用固定了在大肠杆菌中强制表达并纯化/回收的PbCSP重组蛋白的板,通过ELISA测量了抗体的滴度。ELISA按照标准方法进行。结果,尽管在没有接种病毒或接种了野生型病毒的组中没有鉴定到抗体滴度的增加,但是在接种了AcNPV-PbCSPsurf的组和接种了AcNPV-Dual-PbCSP的组中鉴定到了特异性抗体滴度的增加。
在图8中,显示了在没有接种的组、野生型病毒接种组、AcNPV-PbCSPsurf接种组和AcNPV-Dual-PbCSP接种组中特异性针对PbCSP的IgG抗体的滴度。
4.使用ELISPOT分析评估细胞免疫
使用来自免疫的动物的脾细胞进行ELISPOT分析。制备来自小鼠的脾细胞,将适当数量的细胞加到MultiScreen-IP(Millipore)中。在其中加入已知是PbCSP的CD8表位的肽(氨基酸序列:SYIPSAEKI SEQID NO:53),然后培养过夜。然后使用ELISPOT小鼠IFN-γELISPOT套装(BD Sciences)进行反应,使用AEC底物套装(BD Sciences)显色。通过测量有色的斑点鉴定对抗原有特异性反应的细胞数量。结果,在没有接种病毒、接种了野生型病毒或AcNPV-PbCSPsurf的组中没有鉴定到抗原特异性的细胞,但是在接种了AcNPV-Dual-PbCSP的组中鉴定到了每106个脾细胞中大约350个反应细胞。这证实了AcNPV-Dual-PbCSP能够比AcNPV-PbCSPsurf更显著地诱导细胞免疫。
在图9中显示了在没有接种组、野生型病毒接种组、AcNPV-PbCSPsurf接种组和AcNPV-Dual-PbCSP接种组中特异性针对PbCSP的CTL表位的IFN-γ-产生细胞的数量。
实施例10、证实含有重组杆状病毒作为活性成分的疫苗的抗病毒效果的试验
(证实M2e重组杆状病毒效果的试验)
以2周的时间间隔在大腿肌肉给每只小鼠两次接种3.4 x 108PFU的量的M2e重组杆状病毒(AcNPV-Dual-M2e)。在最后一次疫苗接种后2周,将小鼠用流感病毒A/PR8/34进行感染,感染通过鼻内接种0.005mL含有1000 TCID50的病毒的溶液来进行。在感染后6天,将小鼠安乐死,取出肺脏,使用MDCK细胞检测肺脏中的病毒量。结果,在所有用AcNPV-Dual-M2e接种的小鼠中没有检测到流感病毒。同时,在大腿肌肉中接种了HA1重组杆状病毒疫苗(AcNPV-Dual-H1N1/HA1)(每只小鼠1.0 x 107PFU)的组中效果也相同。
在图10中,显示了PBS组、AcNPV-Dual-M2e接种组和AcNPV-Dual-H1N1/HA1接种组在流感病毒感染6天后肺内的病毒量。
实施例11、鉴定含有HA1/NC99重组杆状病毒作为活性成分的药物的预防效果的研究
以两周的间隔,将HA1/NC99重组杆状病毒(AcNPV-Dual-HA1/NC99)以每只小鼠1.0 x 108PFU接种到大腿肌肉中两次。最后一次接种后2周,用流感病毒A/NewCaledonia/20/99感染小鼠,感染通过鼻腔内接种0.05mL含有1000TCID50的病毒的溶液来进行。在感染后3天,将小鼠安乐死,取出肺脏,使用MDCK细胞检测肺脏中的病毒量。结果,在用AcNPV-Dual-H1N1/NC99接种的4只小鼠中有3只没有检测到流感病毒。
在图11中,显示了在PBS组、野生型病毒(AcNPV-WT)接种组和AcNPV-Dual-HA1/NC99接种组在流感病毒感染3天后肺内的病毒量。
SEQ ID NOS:25和26表示了用于鉴定AcNPV-CP-H1N1/HA1、AcNPV-CAP-H1N1/HA1和AcNPV-CU-H1N1/HA1的表达的引物。
SEQ ID NO:27表示已知作为PbCSP的CD8表位的肽。
实施例12、鉴定依赖于含有重组杆状病毒作为活性成分的药物组合物的给药途径的特异性抗体的研究
以两周的间隔将HA1重组杆状病毒(AcNPV-Dual-H1N1/HA1)以每只小鼠2.0 x 107PFU接种两次,通过在双侧鼻中(滴鼻)接种0.005mL病毒溶液,从鼻(鼻粘膜接种)接种0.05mL病毒溶液,从呼吸道(通过呼吸道)接种0.05mL病毒溶液,和在大腿肌肉中(肌肉注射)接种0.05mL病毒溶液。最后一次接种后2周,收集洗鼻液、肺泡清洗液和血清,鉴定了特异性针对流感病毒的抗体的表达。使用固定了流感病毒A/PR/8/341感染的MDCK细胞提取物的板,通过ELISA测量抗体的滴度。ELISA按照标准方法进行。结果,在来自鼻粘膜接种组、气管内接种组和肌肉内接种组的血液中鉴定到了特异性IgG抗体。具体来说,在气管内接种组中鉴定到了强烈诱导的抗体。同样,在洗鼻液和肺泡清洗液中也鉴定到了抗原特异性IgG抗体,具体来说,在气管内接种组中抗体被强烈诱导。此外,在气管内接种组中,在肺泡清洗液中还鉴定到了抗原特异性IgA抗体的产生。
在图12中,显示了在滴鼻组、鼻粘膜接种组、气管内接种组和肌肉内接种组中的血液中测量特异性针对流感病毒的IgG抗体的ELISA结果。
在图13中,显示了在滴鼻组、鼻粘膜接种组、气管内接种组和肌肉内接种组中,洗鼻液和肺泡清洗液中测量特异性针对流感病毒的IgG和IgA抗体的ELISA结果。
实施例13、鉴定依赖于含有重组杆状病毒作为活性成分的药物组合物的给药途径的效果的研究
以两周的间隔,将HA1重组杆状病毒(AcNPV-Dual-H1N1/HA1)以每只小鼠1.0 x 107PFU通过滴鼻、鼻粘膜接种、通过呼吸道或肌肉注射的给药途径接种两次。最后一次接种后2周,用流感病毒A/PR/8/34感染小鼠,感染通过鼻腔内接种0.005mL含有1000TCID50的病毒的溶液来进行。在感染后3天,收集洗鼻液,在感染后6天,取出肺脏,使用MDCK细胞检测肺脏中的病毒量。结果,在鼻粘膜接种组和气管内接种组中,感染后3天鼻腔中的病毒量显著减少了。此外,在气管内接种组中与肌肉内接种的组中一样,在感染后6天肺脏中病毒的量降低到了检测限或以下。
在图14中,显示了在滴鼻组、鼻粘膜接种组、气管内接种组和肌肉内接种组中用流感病毒感染后3天洗鼻液中的病毒量。
在图15中,显示了在滴鼻组、鼻粘膜接种组、气管内接种组和肌肉内接种组中在用流感病毒感染后6天肺脏中的病毒量。
序列表自由文本
SEQ ID NO:1和2是对伯氏疟原虫ANKA株基因组DNA进行PCR的引物PbCSP-F和PbCSP-R1的序列;
SEQ ID NO:3和4是对结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA进行PCR的引物phsp65-F1和phsp65-R1的序列;
SEQ ID NO:5和6是以pcDNA为模板进行PCR的引物phsp65-F2和phsp65-R2的序列;
SEQ ID NO:7和8是以pBACgus-1(Novagen提供)为模板用于获得gp64基因DNA片段的PCR的引物pPolh-F2和pgp64-R2的序列;
SEQ ID NO:9和10是对产生流感病毒HA基因片段进行PCR的引物HA-f和HA-r的序列;以及
SEQ ID NO:11和12是以pCR-Blunt-HA作为模板进行PCR的引物pHA-F1和pHA-R1的序列。
SEQ ID NO:13和14是对PbTRAMP基因的PCR进行引物pTRAMP-F1和pTRAMP-R1的序列。
SEQ ID NO:15和16是对PbAMA1基因结构域123(D123)进行PCR的引物pAMA-F1和pAMA-R1的引物的序列。
SEQ ID NO:17和18是对PbMSP119基因进行PCR的引物pMsp-F1和pMsp-R1的序列。
SEQ ID NO:19和20是对PfCSP基因进行PCR的引物pPfCSP-F1和pPfCSP-R1的序列。
SEQ ID NOS:21和22是对疟原虫恶性疟原虫3D7株的PfCSP基因进行PCR的引物pPfAMA1-F1和pPfAMA1-R1的序列。
SEQ ID NO:23和24是对疟原虫恶性疟原虫3D7的PfCSP基因进行PCR的引物pPfs25-F1和pPfs25-R1的序列。
SEQ ID NO:25和26是以pCR-Blunt-HA为模板进行的PCR的引物Polh-f RsrII和GP64-r DraIII的序列。
SEQ ID NO:27和28是对CMV增强子区进行PCR的引物CMVenh-f FseI和CMVenh-r KpnI的序列。
SEQ ID NO:29和30是对UBB启动子区进行PCR的引物UBBp-fKpnI和UBBp-r RsrII的序列。
SEQ ID NO:31和32是对流感病毒PR8/34株的基因组RNA进行RT-PCR的引物NP-f EcoRI和NP-r Cfr9I的序列。
SEQ ID NO:33和34是对流感病毒PR8/34株的基因组RNA进行RT-PCR的引物M2-f EcoRI和M2-r Cfr9I的序列。
SEQ ID NO:35和36是对流感病毒PR8/34株的基因组RNA进行RT-PCR的引物NAe-f EcoRI和NAe-r Cfr9I的序列;
SEQ ID NO:37和38是以pDual-H1N1/M2-gp64为模板进行PCR的引物M2-f EcoRI和M2e-r Cfr9I的序列;
SEQ ID NO:39和40是对NewCaledonia99/20(NC99)的基因组RNA进行RT-PCR的引物HA1-f EcoRI和HA1-r CFr9I(NC99)的序列;
SEQ ID NO:41和42是以pCR-Blunt-HA为模板进行PCR的引物HA0-f EcoRI和HA2-r Cfr9I的序列;
SEQ ID NO:43和44是以pCR-Blunt-HA为模板进行PCR的引物HA2-f EcoRI和HA2-r Cfr9I的序列;
SEQ ID NO:45和46是对vp39基因区进行PCR的引物vp39-f和vp39-r的序列;
SEQ ID NO:47和48是对HA1基因片段进行PCR的引物Polh-S1和HA1-r的序列;
SEQ ID NO:49和50是以pDual-H1N1/NP-gp64为引物进行PCR的引物NP-f5 EcoRI和NP-r EcoRI的序列;
SEQ ID NO:51和52是检测AcNPV-CP-H1N1/HA1、AcNPV-CAP-H1N1/HA1和AcNPV-CU-H1N1/HA1的表达的引物的序列。
SEQ ID NO:53是已知的PbCSP的CD8表位的多肽。
序列表
<110>学校法人自治医科大学
大塚制药株式会社
<120>新的病毒载体
<130>SCT083018-00
<140>PCT/JP2007/052195
<141>2007-02-08
<150>JP 2006-032863
<151>2006-02-09
<160>53
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>140
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<212>PRT
<213>Artificial Sequence
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Claims (31)
1.一种生产转移载体的方法,所述转移载体含有其中整合了双启动子和融合基因的结构,其特征在于含有能够成为病毒粒子的成分的蛋白的至少一个编码基因和至少一个免疫原性外源基因的融合基因被连接到连有一个脊椎动物启动子和另一个杆状病毒启动子的双启动子的下游。
2.权利要求1中的方法,其中所述脊椎动物启动子是哺乳动物启动子。
3.权利要求1中的方法,其特征在于能够成为病毒粒子的成分的至少一种蛋白的编码基因是杆状病毒gp64基因、疱疹性口腔炎病毒糖蛋白基因、I型人类免疫缺陷病毒糖蛋白基因、人类呼吸道合胞病毒膜糖蛋白基因、A型流感病毒血凝素蛋白基因、B型流感病毒血凝素蛋白基因、单纯疱疹病毒糖蛋白基因和鼠肝炎病毒S蛋白基因中的任何一个。
4.权利要求1中的方法,其中所述脊椎动物启动子选自细胞肥大病毒启动子、SV40启动子、反转录病毒启动子、金属硫蛋白启动子、热休克蛋白启动子、CAG启动子、延伸因子1α启动子、肌动蛋白启动子、泛素启动子、白蛋白启动子和II类MHC启动子的任何一个。
5.权利要求1中的方法,其中所述杆状病毒启动子选自多角体蛋白启动子、p10启动子、IE1启动子、IE2启动子、p35启动子、p39启动子以及gp64启动子。
6.权利要求1中的方法,其中所述免疫原性外源基因选自单独的疟疾抗原、流感抗原、结核分枝杆菌(M.tuberculosis)抗原、SARS病毒抗原、西尼罗河热病毒抗原、登革热病毒抗原、HIV抗原、HCV抗原、利什曼原虫抗原、锥虫抗原、住白细胞原虫抗原中的任何一个,或选自这些抗原基因中的至少一个与细胞因子的融合抗原。
7.权利要求1中的方法,其中所述转移载体是pDual-Hsp65-gp64、pDual-PbCSP-gp64、pDual-H1N1/HA1-gp64、pDual-PbTRAMP-gp64、pDual-PbAMA1D123-gp64、pDual-PbMSP129-gp64、pDual-PfCSP-gp64、pDual-PfAMA1-gp64、pDual-Pfs25-gp64、pDual-H5N1/HA1-gp64、pDual-SARS/S-gp64、pCP-H1N1/HA1-gp64、pCAP-H1N1/HA1-gp64、pCU-H1N1/HA1-gp64、pDual-H1N1/NP-gp64、pDual-H1N1/M2-gp64、pDual-H1N1/NAe-gp64、pDual-M2e-gp64、pCP-HA1/NC99-gp64、pCP-H1N1/HA0-gp64、pCP-H1N1/HA2-gp64、pCP-H1N1/HA1-vp39和pCP-H1N1/NP-vp39中的任何一个。
8.生产重组杆状病毒的方法,包括生产含有已经整合了双启动子和融合基因的结构的转移载体的步骤,其特征在于含有能够成为病毒粒子的成分的蛋白的至少一个编码基因和至少一个免疫原性外源基因的融合基因被连接到连有一个脊椎动物启动子和另一个杆状病毒启动子的双启动子的下游;将转移载体和杆状病毒DNA共转染到昆虫的宿主细胞中的步骤;以及分离重组杆状病毒的步骤。
9.权利要求8中的方法,其特征在于能够成为病毒粒子的成分的至少一种蛋白的编码基因是杆状病毒gp64基因、疱疹性口腔炎病毒糖蛋白基因、I型人类免疫缺陷病毒糖蛋白基因、人类呼吸道合胞病毒膜糖蛋白基因、A型流感病毒血凝素蛋白基因、B型流感病毒血凝素蛋白基因、单纯疱疹病毒糖蛋白基因和鼠肝炎病毒S蛋白基因中的任何一个。
10.权利要求9中的方法,其中所述脊椎动物启动子选自细胞肥大病毒启动子、SV40启动子、反转录病毒启动子、金属硫蛋白启动子、热休克蛋白启动子、CAG启动子、延伸因子1α启动子、肌动蛋白启动子、泛素启动子、白蛋白启动子和II类MHC启动子的任何一个。
11.权利要求8中的方法,其中所述杆状病毒启动子选自多角体蛋白启动子、p10启动子、IE1启动子、p35启动子、p39启动子以及gp64启动子。
12.权利要求8中的方法,其中所述免疫原性外源基因选自单独的疟疾抗原、流感抗原、结核分枝杆菌抗原、SARS病毒抗原、西尼罗河热病毒抗原、登革热病毒抗原、HIV抗原、HCV抗原、利什曼原虫抗原、锥虫抗原、住白细胞原虫抗原中的任何一个,或选自这些抗原基因中的一个与细胞因子的融合抗原。
13.权利要求8中的方法,其中所述重组杆状病毒是AcNPV-Dual-Hsp65、AcNPV-Dual-PbCSP、AcNPV-Dual-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-PbTRAMP、AcNPV-Dual-PbAMA1D123、AcNPV-Dual-PbMSP129、AcNPV-Dual-PfCSP、AcNPV-Dual-PfAMA1、AcNPV-Dual-Pfs25、AcNPV-Dual-H5N1/HA1、AcNPV-Dual-SARS/S、AcNPV-H1N1/HA1、AcNPV-CAP-H1N1/HA1、AcNPV-CU-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-H1N1/NP、AcNPV-Dual-H1N1/M2、AcNPV-Dual-H1N1/NAe、AcNPV-Dual-M2e、AcNPV-CP-HA1/NC99、AcNPV-CP-H1N1/HA0、AcNPV-CP-H1N1/HA2、AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39和AcNPV-CP-H1N1/NP-vp39中的任何一个。
14.一种转移载体,其含有整合的结构,在所述结构中含有能够成为病毒粒子的成分的蛋白的至少一个编码基因和至少一个免疫原性外源基因的融合基因被连接到连有一个脊椎动物启动子和另一个杆状病毒启动子的双启动子的下游。
15.权利要求14中的转移载体,其含有整合的结构,所述结构中含有能够成为病毒粒子的成分的至少一种蛋白的编码基因和至少一个免疫原性外源基因的融合基因被连接到连有一个脊椎动物启动子和另一个杆状病毒启动子的双启动子的下游。
16.权利要求14中的转移载体,其特征在于能够成为病毒粒子的成分的至少一种蛋白的编码基因是杆状病毒gp64基因、疱疹性口腔炎病毒糖蛋白基因、I型人类免疫缺陷病毒糖蛋白基因、人类呼吸道合胞病毒膜糖蛋白基因、A型流感病毒血凝素蛋白基因、B型流感病毒血凝素蛋白基因、单纯疱疹病毒糖蛋白基因和鼠肝炎病毒S蛋白基因中的任何一个。
17.权利要求15中的转移载体,其中所述脊椎动物启动子选自细胞肥大病毒启动子、SV40启动子、反转录病毒启动子、金属硫蛋白启动子、热休克蛋白启动子、CAG启动子、延伸因子1α启动子、肌动蛋白启动子、泛素启动子、白蛋白启动子和II类MHC启动子的任何一个。
18.权利要求15中的转移载体,其中所述杆状病毒启动子选自多角体蛋白启动子、p10启动子、IE1启动子、IE2启动子、p35启动子、p39启动子以及gp64启动子。
19.权利要求15的转移载体,其中所述免疫原性外源基因选自单独的疟疾抗原、流感抗原、结核分枝杆菌抗原、SARS病毒抗原、西尼罗河热病毒抗原、登革热病毒抗原、HIV抗原、HCV抗原、利什曼原虫抗原、锥虫抗原、住白细胞原虫抗原中的任何一个,或选自这些抗原基因中的一个与细胞因子的融合抗原。
20.权利要求15的转移载体,其是pDual-Hsp65-gp64、pDual-PbCSP-gp64、pDual-H1N1/HA1-gp64、pDual-PbTRAMP-gp64、pDual-PbAMA1D123-gp64、pDual-PbMSP129、pDual-PfCSP-gp64、pDual-PfAMA1-gp64、pDual-Pfs25-gp64、pDual-H5N1/HA1-gp64、pDual-SARS/S-gp64、pCP-H1N1/HA1-gp64、pCAP-H1N1/HA1-gp64、pCU-H1N1/HA1-gp64、pDual-H1N1/NP-gp64、pDual-H1N1/M2-gp64、pDual-H1N1/NAe-gp64、pDual-M2e-gp64、pCP-HA1/NC99-gp64、pCP-H1N1/HA0-gp64、pCP-H1N1/HA2-gp64、pCP-H1N1/HA1-vp39和pCP-H1N1/NP-vp39的任何一个。
21.一种重组杆状病毒,通过权利要求8到13任何一个中的生产重组杆状病毒的方法生产。
22.权利要求21中的重组杆状病毒,其是AcNPV-Dual-Hsp65、AcNPV-Dual-PbCSP、AcNPV-Dual-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-PbTRAMP、AcNPV-Dual-PbAMA1D123、AcNPV-Dual-PbMSP129、AcNPV-Dual-PfCSP、AcNPV-Dual-PfAMA1、AcNPV-Dual-Pfs25、AcNPV-Dual-H5N1/HA1、AcNPV-Dual-SARS/S、AcNPV-H1N1/HA1、AcNPV-CAP-H1N1/HA1、AcNPV-CU-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-H1N1/NP、AcNPV-Dual-H1N1/M2、AcNPV-Dual-H1N1/NAe、AcNPV-Dual-M2e、AcNPV-CP-HA1/NC99、AcNPV-CP-H1N1/HA0、AcNPV-CP-H1N1/HA2、AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39和AcNPV-CP-H1N1/NP-vp39中的任何一个。
23.一种药物组合物,其含有权利要求21或22中的重组杆状病毒。
24.权利要求23中的药物组合物,含有AcNPV-Dual-H1N1/HA1、AcNPV-H1N1/HA1、AcNPV-CAP-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-PfCSP、AcNPV-Dual-PfAMA1、AcNPV-Dual-Pfs25、AcNPV-CU-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-H1N1/NP、AcNPV-Dual-H1N1/M2、AcNPV-Dual-H1N1/NAe、AcNPV-Dual-M2e、AcNPV-CP-HA1/NC99、AcNPV-CP-H1N1/HA0、AcNPV-CP-H1N1/HA2、AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39和AcNPV-CP-H1N1/NP-vp39中的任何一个。
25.一种含有权利要求21或22中的重组杆状病毒的药物组合物,其中所述组合物通过肌肉内、鼻内或吸入给药。
26.一种疫苗,其含有AcNPV-Dual-H1N1/HA1、AcNPV-H1N1/HA1、AcNPV-CAP-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-PfCSP、AcNPV-Dual-PfAMA1、AcNPV-Dual-Pfs25、AcNPV-CU-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-H1N1/NP、AcNPV-Dual-H1N1/M2、AcNPV-Dual-H1N1/NAe、AcNPV-Dual-M2e、AcNPV-CP-HA1/NC99、AcNPV-CP-H1N1/HA0、AcNPV-CP-H1N1/HA2、AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39和AcNPV-CP-H1N1/NP-vp39中的任何一个作为活性成分。
27.权利要求26中的疫苗,其中所述疫苗通过肌肉内、鼻内或吸入给药。
28.一种用于流感病毒感染的治疗性或预防性药剂,其含有AcNPV-Dual-H1N1/HA1、AcNPV-H1N1/HA1、AcNPV-CAP-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-PfCSP、AcNPV-Dual-PfAMA1、AcNPV-Dual-Pfs25、AcNPV-CU-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-H1N1/NP、AcNPV-Dual-H1N1/M2、AcNPV-Dual-H1N1/NAe、AcNPV-Dual-M2e、AcNPV-CP-HA1/NC99、AcNPV-CP-H1N1/HA0、AcNPV-CP-H1N1/HA2、AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39、AcNPV-CP-H1N1/NP-vp39作为活性成分。
29.权利要求28中的用于流感病毒感染的治疗性或预防性药剂,其中所述药剂通过肌肉内、鼻内或吸入给药。
30.一种用于流感病毒感染的疫苗,其含有AcNPV-Dual-H1N1/HA1、AcNPV-H1N1/HA1、AcNPV-CAP-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-PfCSP、AcNPV-Dual-PfAMA1、AcNPV-Dual-Pfs25、AcNPV-CU-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-H1N1/NP、AcNPV-Dual-H1N1/M2、AcNPV-Dual-H1N1/NAe、AcNPV-Dual-M2e、AcNPV-CP-HA1/NC99、AcNPV-CP-H1N1/HA0、AcNPV-CP-H1N1/HA2、AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39和AcNPV-CP-H1N1/NP-vp39中的任何一个作为活性成分。
31.权利要求30中的用于流感病毒感染的疫苗,其中所述药剂通过肌肉内、鼻内或吸入给药。
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