RU2491093C2 - Бакуловирусные векторы с двойным промотором, включающим в себя промотор позвоночного и промотор бакуловируса, контролирующим иммуногенный слитый ген - Google Patents
Бакуловирусные векторы с двойным промотором, включающим в себя промотор позвоночного и промотор бакуловируса, контролирующим иммуногенный слитый ген Download PDFInfo
- Publication number
- RU2491093C2 RU2491093C2 RU2010108248/10A RU2010108248A RU2491093C2 RU 2491093 C2 RU2491093 C2 RU 2491093C2 RU 2010108248/10 A RU2010108248/10 A RU 2010108248/10A RU 2010108248 A RU2010108248 A RU 2010108248A RU 2491093 C2 RU2491093 C2 RU 2491093C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- acnpv
- cap
- pfcsp
- gene
- amino acid
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 312
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 title description 219
- 239000013598 vector Substances 0.000 title description 92
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 title description 56
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 title description 35
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 74
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 59
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 54
- 101710141347 Major envelope glycoprotein Proteins 0.000 claims abstract description 25
- 241000223960 Plasmodium falciparum Species 0.000 claims abstract description 10
- 241000701366 unidentified nuclear polyhedrosis viruses Species 0.000 claims abstract description 5
- 230000000078 anti-malarial effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 239000003430 antimalarial agent Substances 0.000 claims abstract description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract 28
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 87
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 56
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 30
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 27
- 101710182846 Polyhedrin Proteins 0.000 claims description 8
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 7
- 241001203868 Autographa californica Species 0.000 claims 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 claims 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 abstract description 51
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 30
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 26
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 17
- 101710117490 Circumsporozoite protein Proteins 0.000 abstract description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 136
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 110
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 88
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 86
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 85
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 85
- 241000711975 Vesicular stomatitis virus Species 0.000 description 81
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 80
- 238000000034 method Methods 0.000 description 60
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 58
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 46
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 43
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 41
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 40
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 38
- 201000004792 malaria Diseases 0.000 description 38
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 36
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 36
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 28
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 27
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 26
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 25
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 25
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 25
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 25
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 24
- 101150045064 gp64 gene Proteins 0.000 description 21
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 19
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 18
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 18
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 18
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 17
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 16
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 16
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 15
- 239000000047 product Substances 0.000 description 15
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 15
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 14
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 14
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 14
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 14
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 14
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 13
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 13
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 12
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 12
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 12
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 11
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 11
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 11
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 11
- 108090000765 processed proteins & peptides Chemical group 0.000 description 11
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 11
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 10
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 10
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 10
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 10
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 10
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 9
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 9
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 9
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 9
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 9
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 9
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 9
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 9
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 9
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 9
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 8
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 8
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 8
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 8
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 8
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 7
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 7
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 7
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 7
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 7
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 7
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 7
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 7
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 7
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 7
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 6
- 101150101299 gene 4 gene Proteins 0.000 description 6
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 6
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 5
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 5
- 241001505483 Plasmodium falciparum 3D7 Species 0.000 description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 5
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 5
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 5
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 4
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 4
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 4
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 4
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 4
- 210000003936 merozoite Anatomy 0.000 description 4
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 4
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 4
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 4
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000272517 Anseriformes Species 0.000 description 3
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 3
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 3
- 101710088341 Dermatopontin Proteins 0.000 description 3
- 102100025800 E3 SUMO-protein ligase ZBED1 Human genes 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 3
- 241000712431 Influenza A virus Species 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 241001646725 Mycobacterium tuberculosis H37Rv Species 0.000 description 3
- 241000286209 Phasianidae Species 0.000 description 3
- 101000983333 Plasmodium falciparum (isolate NF54) 25 kDa ookinete surface antigen Proteins 0.000 description 3
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 3
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 3
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 3
- 101150078331 ama-1 gene Proteins 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 3
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 208000037797 influenza A Diseases 0.000 description 3
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 3
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 3
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 3
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 3
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 3
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 3
- 210000003046 sporozoite Anatomy 0.000 description 3
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 3
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 2
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 2
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 2
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- 241000409811 Bombyx mori nucleopolyhedrovirus Species 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 241000272201 Columbiformes Species 0.000 description 2
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 2
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 2
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 101150039660 HA gene Proteins 0.000 description 2
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 2
- 101001077660 Homo sapiens Serine protease inhibitor Kazal-type 1 Proteins 0.000 description 2
- 229940124873 Influenza virus vaccine Drugs 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 241000272458 Numididae Species 0.000 description 2
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000224017 Plasmodium berghei Species 0.000 description 2
- 241000287530 Psittaciformes Species 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 102100025144 Serine protease inhibitor Kazal-type 1 Human genes 0.000 description 2
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 2
- 101710137302 Surface antigen S Proteins 0.000 description 2
- 208000035896 Twin-reversed arterial perfusion sequence Diseases 0.000 description 2
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 2
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 2
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 210000004958 brain cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 2
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- UKMSUNONTOPOIO-UHFFFAOYSA-N docosanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O UKMSUNONTOPOIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006196 drop Substances 0.000 description 2
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 2
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N hexadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 2
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000005265 lung cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 2
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 2
- 229940043274 prophylactic drug Drugs 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 2
- 210000003708 urethra Anatomy 0.000 description 2
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 1
- WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N (E)-8-Octadecenoic acid Natural products CCCCCCCCCC=CCCCCCCC(O)=O WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TWJNQYPJQDRXPH-UHFFFAOYSA-N 2-cyanobenzohydrazide Chemical compound NNC(=O)C1=CC=CC=C1C#N TWJNQYPJQDRXPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 20:1omega9c fatty acid Natural products CCCCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KQPKMEYBZUPZGK-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-azido-2-nitroanilino)methyl]-5-(hydroxymethyl)-2-methylpyridin-3-ol Chemical compound CC1=NC=C(CO)C(CNC=2C(=CC(=CC=2)N=[N+]=[N-])[N+]([O-])=O)=C1O KQPKMEYBZUPZGK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 9-Heptadecensaeure Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010042708 Acetylmuramyl-Alanyl-Isoglutamine Proteins 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 241000201370 Autographa californica nucleopolyhedrovirus Species 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 241000701412 Baculoviridae Species 0.000 description 1
- 235000021357 Behenic acid Nutrition 0.000 description 1
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 241000938605 Crocodylia Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 description 1
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 102100031262 Deleted in malignant brain tumors 1 protein Human genes 0.000 description 1
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 1
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 206010015150 Erythema Diseases 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 101000834253 Gallus gallus Actin, cytoplasmic 1 Proteins 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 108060003393 Granulin Proteins 0.000 description 1
- 241000702620 H-1 parvovirus Species 0.000 description 1
- 206010019233 Headaches Diseases 0.000 description 1
- 102100021519 Hemoglobin subunit beta Human genes 0.000 description 1
- 108091005904 Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 1
- 101001111984 Homo sapiens N-acylneuraminate-9-phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 101900159346 Influenza A virus Hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 241000721696 Lymantria Species 0.000 description 1
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- 208000000112 Myalgia Diseases 0.000 description 1
- 235000021360 Myristic acid Nutrition 0.000 description 1
- TUNFSRHWOTWDNC-UHFFFAOYSA-N Myristic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCC(O)=O TUNFSRHWOTWDNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100023906 N-acylneuraminate-9-phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 1
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 1
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 1
- 102000011931 Nucleoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010061100 Nucleoproteins Proteins 0.000 description 1
- 239000005642 Oleic acid Substances 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N Oleic acid Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 241000701437 Orgyia pseudotsugata single capsid nuclopolyhedrovirus Species 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 description 1
- 235000021314 Palmitic acid Nutrition 0.000 description 1
- 102000002508 Peptide Elongation Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010068204 Peptide Elongation Factors Proteins 0.000 description 1
- 241000223821 Plasmodium malariae Species 0.000 description 1
- 241001505293 Plasmodium ovale Species 0.000 description 1
- 241000223810 Plasmodium vivax Species 0.000 description 1
- RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N Poloxamer Chemical compound C1CO1.CC1CO1 RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000725643 Respiratory syncytial virus Species 0.000 description 1
- 241000608282 Sagiyama virus Species 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N Succinic acid Natural products OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010046722 Thrombospondin 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100036034 Thrombospondin-1 Human genes 0.000 description 1
- 108010078233 Thymalfasin Proteins 0.000 description 1
- 102400000800 Thymosin alpha-1 Human genes 0.000 description 1
- 241000255993 Trichoplusia ni Species 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 229940008309 acetone / ethanol Drugs 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 1
- 239000000910 agglutinin Substances 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000002924 anti-infective effect Effects 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 206010064097 avian influenza Diseases 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 229940116226 behenic acid Drugs 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N butanedioic acid Chemical compound O[14C](=O)CC[14C](O)=O KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 229920006317 cationic polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000034303 cell budding Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 101150026451 csp gene Proteins 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 1
- 239000005546 dideoxynucleotide Substances 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 231100000321 erythema Toxicity 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NBVXSUQYWXRMNV-UHFFFAOYSA-N fluoromethane Chemical compound FC NBVXSUQYWXRMNV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 1
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 101150086609 groEL2 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 229940093915 gynecological organic acid Drugs 0.000 description 1
- 231100000869 headache Toxicity 0.000 description 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N isooleic acid Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCCC(O)=O QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N muramyl dipeptide Chemical compound OC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](C)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H](O)[C@@H]1NC(C)=O BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N 0.000 description 1
- 208000013465 muscle pain Diseases 0.000 description 1
- WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N n-Pentadecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)=O WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007923 nasal drop Substances 0.000 description 1
- 229940100662 nasal drops Drugs 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 1
- 235000021313 oleic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004006 olive oil Substances 0.000 description 1
- 235000008390 olive oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 150000002895 organic esters Chemical class 0.000 description 1
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000004526 pharmaceutical effect Effects 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 1
- 239000008196 pharmacological composition Substances 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- -1 phosphate triester Chemical class 0.000 description 1
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 1
- 229940118768 plasmodium malariae Drugs 0.000 description 1
- 229960000502 poloxamer Drugs 0.000 description 1
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 1
- 229920000724 poly(L-arginine) polymer Polymers 0.000 description 1
- 108010011110 polyarginine Proteins 0.000 description 1
- 229950008882 polysorbate Drugs 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 210000003240 portal vein Anatomy 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 208000028172 protozoa infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 244000195895 saibo Species 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- NZVYCXVTEHPMHE-ZSUJOUNUSA-N thymalfasin Chemical compound CC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O NZVYCXVTEHPMHE-ZSUJOUNUSA-N 0.000 description 1
- 229960004231 thymalfasin Drugs 0.000 description 1
- 230000005758 transcription activity Effects 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 150000005691 triesters Chemical class 0.000 description 1
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 229940126580 vector vaccine Drugs 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
- C07K16/1018—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/002—Protozoa antigens
- A61K39/015—Hemosporidia antigens, e.g. Plasmodium antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P33/00—Antiparasitic agents
- A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
- A61P33/06—Antimalarials
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/44—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from protozoa
- C07K14/445—Plasmodium
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/20—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans from protozoa
- C07K16/205—Plasmodium
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/735—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a domain for self-assembly, e.g. a viral coat protein (includes phage display)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/14011—Baculoviridae
- C12N2710/14111—Nucleopolyhedrovirus, e.g. autographa californica nucleopolyhedrovirus
- C12N2710/14122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/14011—Baculoviridae
- C12N2710/14111—Nucleopolyhedrovirus, e.g. autographa californica nucleopolyhedrovirus
- C12N2710/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/15—Vector systems having a special element relevant for transcription chimeric enhancer/promoter combination
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/60—Vector systems having a special element relevant for transcription from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/80—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates
- C12N2830/85—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates mammalian
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Virology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Mycology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии и вирусологии. Предложена фармацевтическая композиция, являющаяся противомалярийной вакциной. Композиция содержит рекомбинантный вирус ядерного полиэдроза, который содержит слитый ген. Слитый ген состоит из гена, кодирующего частичную аминокислотную последовательность белка циркумпорозоита Plasmodium falciparum и гена, кодирующего частичную аминокислотную последовательность белка вирусных частиц gp64. Изобретение может быть использовано в медицине. 8 ил., 6 пр.
Description
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Настоящее изобретение относится к новому вектору для переноса, рекомбинантному бакуловирусу, полученному гомологичной рекомбинацией вектора для переноса и бакуловирусной ДНК, и к способам их получения.
Настоящее изобретение, кроме того, относится к фармацевтическим препаратам (например, вакцинам и профилактическим или терапевтическим лекарственным средствам для лечения инфекционных болезней, таких как малярия и грипп), содержащим рекомбинантный бакуловирус в качестве активного ингредиента.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Бакуловирус применяли в качестве вектора в способах промышленного получения требуемого белка с использованием клеток насекомых. В последние годы было обнаружено, что бакуловирус может вводить чужеродный ген не только в клетки насекомых, но также в клетки млекопитающих, и была выявлена возможность его применения в качестве вектора для введения терапевтического гена. В патентном документе 1 описан рекомбинантный бакуловирусный экспрессирующий вектор, содержащий множество независимых промоторов, включая промотор, полученный из раннего гена бакуловируса, который имеет область ДНК, содержащую ген, кодирующий неструктурный белок вируса, и промотор, полученный из позднего гена бакуловируса, который имеет область ДНК, содержащую ген, кодирующий структурный белок вируса.
В патентном документе 2 раскрыт способ, включающий в себя введение в клетки млекопитающих вирусного вектора, содержащего ДНК организма, отличного от млекопитающего, который содержал множество независимых промоторов, регулируемых так, чтобы экспрессировать требуемый чужеродный ген, связанный с промоторами; и экспрессию чужеродного гена в клетках млекопитающих.
Кроме того, в патентном документе 3 раскрыт способ получения белка способом на основе рекомбинации генов с использованием бакуловируса. Такой способ включает в себя экспрессию слитого гена, полученного связыванием гена gp64 бакуловируса с геном, кодирующим требуемый белок, чтобы получить требуемый белок в слитой с вирусными частицами форме, сбор вирусных частиц, слитых с требуемым белком, и отщепление требуемого белка от вирусных частиц, чтобы собрать белок.
Что касается бакуловирусной системы экспрессии, то в патентом документе 4 описан рекомбинантный бакуловирусный экспрессирующий вектор, имеющий несколько независимых промоторов, содержащий первую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую регистрируемый маркер, который связан в способной к функционированию форме с первым промотором, который является активным в клетках-хозяевах и неактивным в не соответствующих клетках, и вторую последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую чужеродную последовательность нуклеиновой кислоты, которая связана в способной к функционированию форме со вторым промотором, который является активным в не соответствующих клетках.
В патентном документе 5 описано, что рекомбинантный бакуловирусный вектор, экспрессирующий антиген гемагглютинин (HA) вируса гриппа, связанный с промотором CAG, полученным из β-актина цыпленка, оказывает профилактический эффект в отношении инфекции вирусом гриппа и поэтому применим в качестве вакцинного препарата.
В патентном документе 6 раскрыт способ получения бакуловирусного вектора, включающий в себя стадию котрансфекции в клетки насекомых плазмиды, содержащей бакуловирусный промотор и промотор, полученный из клеток млекопитающих, с которым связан ген, кодирующий белок, экспрессируемый на клеточной поверхности, или плазмиды, содержащей два бакуловирусных промотора, с которыми связан ген, кодирующий белок, экспрессируемый на клеточной поверхности.
В патентном документе 7 описано исследование активности против вируса гриппа, т.е. активности, направленной против инфекции вирусом гриппа, рекомбинантного бакуловируса, содержащего кДНК HA вируса гриппа, введенную в промотор CAG, и указано, что не только рекомбинантный бакуловирус, но также бакуловирус дикого типа обладает активностью против вируса гриппа.
Как указано выше, в последние годы разработаны различные рекомбинантные бакуловирусные векторы, и были предприняты многочисленные попытки разработать фармацевтические средства для млекопитающих, содержащие такой рекомбинантный бакуловирусный вектор в качестве активного ингредиента.
В данной области техники требуется разработка фармацевтических препаратов, особенно препаратов вакцин, содержащих в качестве активного ингредиента новый рекомбинантный бакуловирус, который представляет собой рекомбинантный бакуловирусный вектор, имеющий новую структуру и эффективный против малярии, гриппа, туберкулеза и подобных инфекционных болезней, или таких заболеваний, как злокачественная опухоль.
Патентный документ 1: патент Японии No. 3366328. Multiple Promoter Baculovirus Expression System and Defect Particle Products.
Патентный документ 2: WO98/011243, Non-mammalian DNA Virus Having Modified Coating Protein.
Патентный документ 3: JP No. 2002-235236-A, Methods of Producing Proteins.
Патентный документ 4: JP No. 2003-284557-A, Novel Baculovirus-Transfecting Vector and Recombinant Baculovirus for Expression of Foreign Gene.
Патентный документ 5: WO 02/062381, Baculovirus Vector Vaccine.
Патентный документ 6: WO 04/029259, Baculovirus Vector, Method of Producing Baculovirus Vector, and Method of Introducing Gene.
Патентный документ 7: JP No. 2005-15346-A, Baculovirus-containing Anti-viral Agent.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фиг.1 показывает результаты тестирования экспрессии антигенов вакцины рекомбинантными бакуловирусами согласно настоящему изобретению в клетках насекомых, как описано в примере 3.
Выявление с использованием моноклонального антитела против gp64 (AcV5)
Дорожка 1: AcNPV-WT
Дорожка 2: AcNPV-CAP-PfCSP
Дорожка 3: AcNPV-CAP-HA1/Anhui
Дорожка 4: AcNPV-CAP-HA1/Vietnam.
На фиг.2 (A) показан основанный на Вестерн-блоттинге анализ, показывающий экспрессию гена CSP (PfCSP) малярии человека в вирусных частицах рекомбинантных бакуловирусов, полученных из рекомбинантных векторов для переноса.
Выявление с использованием моноклонального антитела против PfCSP (2A10)
Дорожка 1: AcNPV-CAP-PfCSP
Дорожка 2: AcNPV-CAP-PfCSP/272
Дорожка 3: AcNPV-CAP-PfCSP/467.
На фиг.2 (B) показан основанный на Вестерн-блоттинге анализ, показывающий экспрессию гена H5N1/HA1 в вирусных частицах рекомбинантных бакуловирусов, полученных из рекомбинантных векторов для переноса.
Выявление с использованием поликлонального антитела против H5N1/Vietnam (IT-003-005)
Дорожка 1: AcNPV-WT (лизат клеток)
Дорожка 2: AcNPV-CAP-HA1/Anhui (лизат клеток)
Дорожка 3: AcNPV-CAP-HA1/Vietnam (лизат клеток)
Дорожка 4: AcNPV-WT (вирион)
Дорожка 5: AcNPV-CAP-HA1/Vietnam (вирион)
Дорожка 6: Очищенный антиген H5N1/Anhui (IT-003-0053p).
На фиг.3 показаны клетки HepG2, окрашенные флуоресцентно меченым антителом, и показано, что антиген экспрессировался рекомбинантным бакуловирусом, содержащим слитый ген, состоящий из гена PfMSP1 и гена PfCSP, в клетках HepG2. Результаты, представленные на фиг.3 (A) подтвердили экспрессию антигена PfCSP. Результаты, представленные на фиг.3 (B) подтвердили экспрессию антигена PfMSP-119.
На фиг.4 показаны результаты измерения титров антител, полученных в примере 6.
На фиг.5 показаны векторы для переноса согласно настоящему изобретению.
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
ПРОБЛЕМЫ, РЕШАЕМЫЕ ИЗОБРЕТЕНИЕМ
Целью настоящего изобретения является получение нового рекомбинантного вектора для переноса, рекомбинантного бакуловируса, полученного в результате гомологичной рекомбинации между рекомбинантным вектором для переноса и бакуловирусной ДНК, и способы его получения. Другой целью настоящего изобретения является получение фармацевтического препарата, в частности, вакцинного препарата, содержащего рекомбинантный бакуловирус в качестве активного ингредиента.
СПОСОБЫ РЕШЕНИЯ ПРОБЛЕМ
Авторы настоящего изобретения получили вектор для переноса, имеющий новую структуру, способный экспрессировать слитый белок, состоящий из белка, имеющего требуемую иммуногенность, или части такого белка и структурного белка вируса, в клетках насекомых и в клетках позвоночных (в частности, в клетках млекопитающих и птиц); и рекомбинантный бакуловирус, полученный в результате гомологичной рекомбинации вектора для переноса и бакуловирусной ДНК. Используя полученный рекомбинантный бакуловирус, авторы настоящего изобретения осуществили всестороннее исследование фармацевтических препаратов, содержащих в качестве активного ингредиента рекомбинантный бакуловирус, обладающий профилактическим и терапевтическим действием против инфекционных заболеваний. В результате авторы изобретения обнаружили, что полученный рекомбинантный бакуловирус обладает требуемым фармацевтическим действием.
Таким образом, авторы настоящего изобретения получили рекомбинантный вектор для переноса, имеющий новую структуру, рекомбинантный бакуловирус, полученный в результате гомологичной рекомбинации вектора для переноса и бакуловирусной ДНК, и предложили способы их получения, и установили, что рекомбинантный бакуловирус как таковой применим в качестве фармацевтического препарата, обеспечивающего возможность экспрессии белка, обладающего требуемой иммуногенностью, в клетках-мишенях, и в качестве фармацевтического препарата для профилактики инфекционных заболеваний, таких как малярия и грипп.Настоящее изобретение осуществлено на основе указанных открытий.
Настоящее изобретение относится к объектам изобретения, указанным в следующих пунктах 1-22:
Пункт 1. Вектор для переноса, который представляет собой любой из векторов pCAP-PfCSP, pCAP-PfCSP/272, pCAP-PfCSP/467, pCAP-PfCSP(A361E), pCAP-PfCSP(A361E)/272, pCAP-PfCSP(A361E)/467, pCAP-PfCSP-76, pCAP-PfCSP-76/467, pCAP-PfCSP+209, pCAP-PfCSP+209/467, pCAP-PfCSP+76/209, pCAP-PfCSP+76/209/467, pCAP-HA1/Anhui, pCAP-HA1/Anhui/272, pCAP-HA1/Anhui/467, pCAP-HA1/Vietnam, pCAP-HA1/Vietnam/51, pCAP-HA1/Vietnam/101, pCAP-HA1/Vietnam/154, pCAP-HA1/Vietnam/201, pCAP-HA1/Vietnam/272, pCAP-HA1/Vietnam/467, pCAP-AH/345, pCAP-AH/345/467, pCAP-AH/410, pCAP-AH/410/467, pCAP-AH/473, pCAP-AH/473/467, pCAP-AH/520, pCAP-AH/520/467, pCAP-VN/346, pCAP-VN/346/467, pCAP-VN/410, pCAP-VN/410/467, pCAP-VN/473, pCAP-VN/473/467, pCAP-VN/520, pCAP-VN/520/467, pCAP-CO/full, pCAP-CO/full/467, pCAP-CO/19, pCAP-CO/19/467, pCAP-CO/76, pCAP-CO/76/467, pCAP-CO/205, pCAP-CO/205/467, pCA39-HA1/Anhui, pCA64-HA1/Anhui, pCA39-PfCSP(A361E), pCA64-PfCSP(A361E), pCAP-CO/full/VSV, pCAP-CO/19/VSV, pCAP-CO/76/VSV, pCAP-CO/205/VSV, pDual-Pfs25-PfCSP-gp64 и pDual-PfMSP1-PfCSP-gp64.
Пункт 2. Рекомбинантный бакуловирус, который представляет собой любой из бакуловирусов AcNPV-CAP-PfCSP, AcNPV-CAP-PfCSP/272, AcNPV-CAP-PfCSP/467, AcNPV-CAP-PfCSP(A361E), AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)/272, AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)/467, AcNPV-CAP-PfCSP-76, AcNPV-CAP-PfCSP-76/467, AcNPV-CAP-PfCSP+209, AcNPV-CAP-PfCSP+209/467, AcNPV-CAP-PfCSP+76/209, AcNPV-CAP-PfCSP+76/209/467, AcNPV-CAP-HA1/Anhui, AcNPV-CAP-HA1/Anhui/272, AcNPV-CAP-HA1/Anhui/467, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/51, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/101, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/154, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/201, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/272, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/467, AcNPV-CAP-AH/345, AcNPV-CAP-AH/345/467, AcNPV-CAP-AH/410, AcNPV-CAP-AH/410/467, AcNPV-CAP-AH/473, AcNPV-CAP-AH/473/467, AcNPV-CAP-AH/520, AcNPV-CAP-AH/520/467, AcNPV-CAP-VN/346, AcNPV-CAP-VN/346/467, AcNPV-CAP-VN/410, AcNPV-CAP-VN/410/467, AcNPV-CAP-VN/473, AcNPV-CAP-VN/473/467, AcNPV-CAP-VN/520, AcNPV-CAP-VN/520/467, AcNPV-CAP-CO/full, AcNPV-CAP-CO/full/467, AcNPV-CAP-CO/19, AcNPV-CAP-CO/19/467, AcNPV-CAP-CO/76, AcNPV-CAP-CO/76/467, AcNPV-CAP-CO/205, AcNPV-CAP-CO/205/467, AcNPV-CA39-HA1/Anhui, AcNPV-CA64-HA1/Anhui, AcNPV-CA39-PfCSP(A361E), AcNPV-CA64-PfCSP(A361E), AcNPV-CAP-CO/full/VSV, AcNPV-CAP-CO/19/VSV, AcNPV-CAP-CO/76/VSV, AcNPV-CAP-CO/205/VSV, AcNPV-Dual-Pfs25-PfCSP-gp64 и AcNPV-Dual-PfMSP1-PfCSP-gp64.
Пункт 3. Композиция для лечения инфекционных болезней, содержащая рекомбинантный бакуловирус по п.2 в качестве активного ингредиента.
Пункт 4. Композиция для лечения инфекционных болезней, содержащая рекомбинантный бакуловирус по п.2 в качестве активного ингредиента, при этом композицию вводят внутримышечным, респираторным или назальным путем.
Пункт 5. Вакцина, содержащая рекомбинантный бакуловирус по п.2 в качестве активного ингредиента.
Пункт 6. Вакцина, содержащая рекомбинантный бакуловирус по п.3 в качестве активного ингредиента, при этом композицию вводят внутримышечным, респираторным или назальным путем.
Пункт 7. Терапевтическое или профилактическое средство против инфекции вирусом гриппа, содержащее в качестве активного ингредиента любой из AcNPV-CAP-HA1/Anhui, AcNPV-CAP-HA1/Anhui/272, AcNPV-CAP-HA1/Anhui/467, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/51, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/101, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/154, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/201, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/272, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/467, AcNPV-CAP-AH/345, AcNPV-CAP-AH/345/467, AcNPV-CAP-AH/410, AcNPV-CAP-AH/410/467, AcNPV-CAP-AH/473, AcNPV-CAP-AH/473/467, AcNPV-CAP-AH/520, AcNPV-CAP-AH/520/467, AcNPV-CAP-VN/346, AcNPV-CAP-VN/346/467, AcNPV-CAP-VN/410, AcNPV-CAP-VN/410/467, AcNPV-CAP-VN/473, AcNPV-CAP-VN/473/467, AcNPV-CAP-VN/520, AcNPV-CAP-VN/520/467, AcNPV-CA39-HA1/Anhui и AcNPV-CA64-HA1/Anhui.
Пункт 8. Терапевтическое или профилактическое средство против инфекции вирусом гриппа по п.7, которое вводят внутримышечным, респираторным или назальным путем.
Пункт 9. Вакцина против инфекции вирусом гриппа, содержащая в качестве активного ингредиента любой из AcNPV-CAP-HA1/Anhui, AcNPV-CAP-HA1/Anhui/272, AcNPV-CAP-HA1/Anhui/467, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/51, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/101, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/154, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/201, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/272, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/467, AcNPV-CAP-AH/345, AcNPV-CAP-AH/345/467, AcNPV-CAP-AH/410, AcNPV-CAP-AH/410/467, AcNPV-CAP-AH/473, AcNPV-CAP-AH/473/467, AcNPV-CAP-AH/520, AcNPV-CAP-AH/520/467, AcNPV-CAP-VN/346, AcNPV-CAP-VN/346/467, AcNPV-CAP-VN/410, AcNPV-CAP-VN/410/467, AcNPV-CAP-VN/473, AcNPV-CAP-VN/473/467, AcNPV-CAP-VN/520, AcNPV-CAP-VN/520/467, AcNPV-CA39-HA1/Anhui и AcNPV-CA64-HA1/Anhui.
Пункт 10. Вакцина против инфекции вирусом гриппа по п.7, которую вводят внутримышечным, респираторным или назальным путем.
Пункт 11. Терапевтическое или профилактическое средство против малярийной инфекции человека, содержащее в качестве активного ингредиента любой из AcNPV-CAP-PfCSP, AcNPV-CAP-PfCSP/272, AcNPV-CAP-PfCSP/467, AcNPV-CAP-PfCSP(A361E), AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)/272, AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)/467, AcNPV-CAP-PfCSP-76, AcNPV-CAP-PfCSP-76/467, AcNPV-CAP-PfCSP+209, AcNPV-CAP-PfCSP+209/467, AcNPV-CAP-PfCSP+76/209, AcNPV-CAP-PfCSP+76/209/467, AcNPV-CAP-CO/full, AcNPV-CAP-CO/full/467, AcNPV-CAP-CO/19, AcNPV-CAP-CO/19/467, AcNPV-CAP-CO/76, AcNPV-CAP-CO/76/467, AcNPV-CAP-CO/205, AcNPV-CAP-CO/205/467, AcNPV-CA39-PfCSP(A361E), AcNPV-CA64-PfCSP(A361E), AcNPV-CAP-CO/full/VSV, AcNPV-CAP-CO/19/VSV, AcNPV-CAP-CO/76/VSV, AcNPV-CAP-CO/205/VSV, AcNPV-Dual-Pfs25-PfCSP-gp64 и AcNPV-Dual-PfMSP1-PfCSP-gp64.
Пункт 12. Терапевтическое или профилактическое средство против малярийной инфекции человека по п.11, которое вводят внутримышечным, респираторным или назальным путем.
Пункт 13. Терапевтическое или профилактическое средство против малярийной инфекции человека, содержащее в качестве активного ингредиента любой из AcNPV-CAP-PfCSP, AcNPV-CAP-PfCSP/272, AcNPV-CAP-PfCSP/467, AcNPV-CAP-PfCSP(A361E), AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)/272, AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)/467, AcNPV-CAP-PfCSP-76, AcNPV-CAP-PfCSP-76/467, AcNPV-CAP-PfCSP+209, AcNPV-CAP-PfCSP+209/467, AcNPV-CAP-PfCSP+76/209, AcNPV-CAP-PfCSP+76/209/467, AcNPV-CAP-CO/full, AcNPV-CAP-CO/full/467, AcNPV-CAP-CO/19, AcNPV-CAP-CO/19/467, AcNPV-CAP-CO/76, AcNPV-CAP-CO/76/467, AcNPV-CAP-CO/205, AcNPV-CAP-CO/205/467, AcNPV-CA39-PfCSP(A361E), AcNPV-CA64-PfCSP(A361E), AcNPV-CAP-CO/full/VSV, AcNPV-CAP-CO/19/VSV, AcNPV-CAP-CO/76/VSV, AcNPV-CAP-CO/205/VSV, AcNPV-Dual-Pfs25-PfCSP-gp64 и AcNPV-Dual-PfMSP1-PfCSP-gp64.
Пункт 14. Терапевтическое или профилактическое средство против малярийной инфекции человека по п.13, которое вводят внутримышечным, респираторным или назальным путем.
Пункт 15. Способ профилактики малярийной инфекции или инфекции гриппа или лечения малярии или гриппа, включающий в себя введение субъекту эффективного количества рекомбинантного бакуловируса по п.2, композиции для лечения инфекционных болезней по п.3 или 4, или вакцины по п.5, 6, 9, 10, 13 или 14.
Пункт 16. Способ по п.15, в котором рекомбинантный бакуловирус, композицию или вакцину вводят субъекту в качестве липосомного препарата.
Пункт 17. Способ по п.15, в котором рекомбинантный бакуловирус, композицию или вакцину вводят субъекту внутримышечным, респираторным или назальным путем.
Пункт 18. Способ по п.16, в котором рекомбинантный бакуловирус, композицию или вакцину вводят субъекту внутримышечным, респираторным или назальным путем.
Пункт 19. Способ иммуностимуляции, включающий в себя введение субъекту эффективного количества рекомбинантного бакуловируса по п.2, композиции для лечения инфекционных болезней по п.3 или 4, или вакцины по п.5, 6, 9, 10, 13 или 14.
Пункт 20. Способ по п.19, в котором рекомбинантный бакуловирус, композицию или вакцину вводят субъекту в виде липосомного препарата.
Пункт 21. Способ по п.19, в котором рекомбинантный бакуловирус, композицию или вакцину вводят субъекту внутримышечным, респираторным или назальным путем.
Пункт 22. Способ по п.20, в котором рекомбинантный бакуловирус, композицию или вакцину вводят субъекту внутримышечным, респираторным или назальным путем.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Согласно настоящему изобретению предлагается новый рекомбинантный вектор для переноса, рекомбинантный бакуловирус, полученный в результате гомологичной рекомбинации рекомбинантного вектора для переноса и бакуловирусной ДНК, и способы его получения. Фармацевтические препараты, содержащие рекомбинантный бакуловирус согласно настоящему изобретению в качестве активного ингредиента, применимы в качестве терапевтических или профилактических лекарственных средств для лечения инфекционных болезней, таких как малярия и грипп, или в качестве клеточных лекарственных средств и препаратов вакцин.
НАИЛУЧШИЙ СПОСОБ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Сокращенные названия, используемые в настоящем описании для обозначения аминокислот, пептидов, последовательностей оснований, основаны на сокращениях, принятых комиссией ИЮПАК-ИЮБ по биохимической номенклатуре, Eur. J. Biochem., 138: 9 (1984) и «Guideline for Preparing Specifications Including Base Sequences and Amino Acid Sequences» (патентное ведомство), и сокращениях, обычно используемых в данной области техники. В настоящем описании молекула ДНК может включать не только двунитевую ДНК, но также однонитевую ДНК, т.е., смысловую цепь и антисмысловую цепь, составляющие двунитевую ДНК, и не ограничена полной длиной. Полинуклеотид (молекула ДНК), кодирующая иммуногенный чужеродный ген согласно настоящему изобретению, охватывает двунитевую ДНК, содержащую геномную ДНК, однонитевую ДНК (смысловую нить), содержащую кДНК, и однонитевую ДНК (антисмысловую нить), имеющую последовательность, комплементарную смысловой нити, синтетическую ДНК и их фрагменты, если не оговорено особо.
Термины «полинуклеотид» или «молекула ДНК», используемые в настоящем описании, не ограничены функциональной областью и могут включать в себя, по меньшей мере, одну область подавления экспрессии, кодирующую область, лидерную последовательность, экзон и интрон.
Кроме того, примерами полинуклеотида являются РНК и ДНК. Полипептид, содержащий конкретную аминокислотную последовательность, и полинуклеотид, содержащий конкретную последовательность ДНК, включают фрагменты, гомологи, производные и мутанты полинуклеотида.
Примерами мутантов полинуклеотида, например, мутантной ДНК, являются встречающиеся в природе аллельные мутанты; искусственные мутантны; и мутанты, имеющие делецию, замену, присоединение и/или инсерцию. Однако следует понимать, что такие мутанты кодируют полипептиды, обладающие по существу такой же функцией, как и полипептид, кодируемый исходным немутантным полинуклеотидом.
В настоящем изобретении термин «вектор для переноса» относится к плазмиде для получения рекомбинантного бакуловируса, имеющего структуру, в которую включен слитый ген, образованный связыванием, по меньшей мере, одного гена, кодирующего белок, способный быть компонентом вирусных частиц, по меньшей мере, с одним иммуногенным чужеродным геном, ниже двойного промотора, содержащего два связанных промотора, т.е. один промотор позвоночного (например, промотор млекопитающего или промотор птицы) и один бакуловирус промотор.
В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения иммуногенный чужеродный ген расположен ниже двойного промотора и выше гена, кодирующего белок, способный быть компонентом вирусных частиц. Рекомбинантный бакуловирус согласно настоящему изобретению применяют в качестве активного ингредиента фармацевтических препаратов или вакцин для позвоночных. Примерами позвоночных являются млекопитающие, такие как человек, крупный рогатый скот, лошади, свиньи, овцы, козы, обезьяны, мыши, собаки и кошки. Примерами птиц являются куры, перепела, гуси, дикие утки, голуби, индейки, цесарки и попугаи.
В одном варианте настоящее изобретение относится к вектору для переноса, содержащему новую структуру, имеющую в своем составе слитый ген из одного иммуногенного чужеродного гена и гена, кодирующего мембранный белок вируса, который может быть экспрессирован в клетках насекомых под контролем двойного промотора, содержащего один промотор позвоночных и один промотор бакуловируса, связанные друг с другом. Совместная трансфекция такого вектора для переноса с бакуловирусной ДНК в клетки насекомых индуцирует гомологичную рекомбинацию и, таким образом, приводит к получению рекомбинантного бакуловируса с включенным в него слитым геном, который экспрессируется под контролем бакуловирусного промотора в клетках насекомых и который может продуцировать слитый белок, способный быть компонентом отпочкованных вирусных частиц.
В настоящем изобретении при введении рекомбинантного бакуловируса позвоночным слитый белок, состоящий из белка, способного быть компонентом отпочкованных вирусных частиц, и иммуногенного белка, по-видимому, функционирует как многокомпонентная вакцина. Кроме того, рекомбинантный бакуловирус, введенный позвоночному, проникает в клетку позвоночного, и в клетке позвоночного с вирусного генома продуцируется слитый антиген с требуемым иммуногенным чужеродным антигеном и функционирует как ДНК-вакцина.
Таким образом, например, в том случае, когда рекомбинантный бакуловирус согласно настоящему изобретению вводят млекопитающему, слитый белок, состоящий из белка, способного быть компонентом вирусных частиц, и иммуногенного белка, презентируется в виде антигена на поверхности вирусных частиц, и слитый белок, состоящий из белка, способного быть компонентом вирусных частиц, и иммуногенного белка, продуцируется в клетке млекопитающего и, по-видимому, функционирует в качестве профилактического или терапевтического средства против инфекционных болезней, таких как вирусная, протозойная и бактериальная инфекция, благодаря своему иммуностимулирующему действию.
Бакуловирусная ДНК, трансфицируемая совместно с вектором для переноса, может представлять собой бакуловирусную ДНК дикого типа, мутантную или рекомбинантную бакуловирусную ДНК. Примерами клеток-хозяев, подвергаемых котрансфекции, являются клетки насекомых, такие как клетки Spodoptera frugiperda.
В настоящем изобретении термин «иммуногенный чужеродный ген» относится к гену, кодирующему аминокислотную последовательность антигенного белка, используемого в качестве иммуногена в иммунотерапии, такой как вакцинная терапия, для профилактики и лечения инфекционных болезней, таких как малярия и грипп.Конкретными примерами являются гены, кодирующие аминокислотные последовательности белков, таких как малярийный антиген и антиген вируса гриппа.
«Чужеродный» ген в используемом в настоящем описании смысле относится к гену, вводимому извне. Даже если такой же ген присутствует в клетке, ген, вводимый извне, называют «чужеродным» геном.
В настоящем изобретении ген, кодирующий аминокислотную последовательность белка, используемого в качестве иммуногена, особым образом не ограничен, при условии, что ген способен кодировать аминокислотную последовательность антигенного белка, обладающего иммуногенностью, направленной против вещества, которое вызывает заболевания, такие как инфекционные болезни. Примеры генов, кодирующих аминокислотную последовательность антигенного белка, обладающего иммуногенностью, приведены ниже.
Примеры генов, кодирующих аминокислотную последовательность малярийного антигена, включают гены, кодирующие аминокислотные последовательности поверхностного антигена спорозоита CSP (белок циркумспорозоита) малярийных паразитов, поверхностного мембранного белка мерозоита MSP1 (поверхностный белок мерозоита 1), малярийного S-антигена, секретируемого из эритроцитов, инфицированных возбудителем малярии, белка PfEMP1, присутствующего в выростах эритроцитов, инфицированных возбудителем малярии, белка SERA, белка TRAMP, белка AMA1 и подобных белков.
Примерами генов, кодирующих аминокислотные последовательности антигенов вируса гриппа, являются гены, кодирующие аминокислотные последовательности антигена HA (антиген гемагглютинина) антигена NA (антиген нейраминидазы), антигена M2 (антиген белка матрикса), антигена NP (нуклеопротеидный антиген) и подобных белков.
Среди генов позвоночных примерами генов млекопитающих являются гены, кодирующие аминокислотные последовательности антигенных белков инфекционных болезней человека, крупного рогатого скота, лошадей, свиней, овец, обезьян, мышей, собак и кошек. Примерами генов птиц являются гены антигенов (например, антигена HA гриппа птиц) инфекционных болезней кур, диких уток, голубей, индеек, цесарок и попугаев.
Гены патогенов, об ассоциации которых с инфекционными болезнями млекопитающих и птиц, которые указаны выше, сообщалось ранее, легко доступны от организаций, в которых хранятся зарегистрированные опубликованные данные о генах патогенов, таких как Genbank.
В настоящем изобретении предлагается вектор для переноса, содержащий такой иммуногенный чужеродный ген, и рекомбинантный бакуловирус, полученный в результате гомологичной рекомбинации вектора для переноса. Кроме того, в настоящем изобретении предлагается фармацевтическая композиция, содержащая в качестве активного ингредиента рекомбинантный бакуловирус, имеющий иммуногенный чужеродный ген, и вакцинный препарат, содержащий фармацевтическую композицию.
Бакуловирус, используемый в настоящем изобретении, относится к патогенным вирусам насекомых, которые вызывают инфекцию насекомых и которые составляют одну группу (Baculoviridae) ДНК-вирусов, имеющих циклическую двунитевую ДНК в качестве гена. Среди таких вирусов одна группа вирусов, называемых вирусами ядерного полиэдроза (NPV), продуцируют тело включения, называемое полиэдром, в ядре инфекционных клеток в поздней фазе инфекции. Даже если чужеродный ген, который необходимо экспрессировать, встроен на участке гена полиэдрина, вирусная инфекция и рост осуществляются в достаточной степени для получения большого количества требуемого продукта чужеродного гена. Поэтому в последние годы такой вирус использовали для получения требуемых белков.
Примерами бакуловирусов, используемых в настоящем изобретении, являются вирус ядерного полиэдроза Autographa californica: AcNPV, вирус ядерного полиэдроза Bombyx mori: BmNPV, вирус ядерного полиэдроза Orgyia pseudotsugata: OpNPV, и вирус ядерного полиэдроза Lymantria disper: LdNPV.
Бакуловирусная ДНК может представлять собой любую ДНК, которая может подвергаться гомологичной рекомбинации с вектором для переноса согласно настоящему изобретению. Более конкретно вирусный ген в бакуловирусной ДНК, который может подвергаться гомологичной рекомбинации с вектором для переноса согласно настоящему изобретению, имеет размер до 130 т.п.н., и в него может быть встроен иммуногенный чужеродный ген длиной 15 т.п.н. или более. Поскольку бакуловирусный ген сам по себе вряд ли экспрессируется в клетках позвоночных, то едва ли существует необходимость учитывать его цитотоксичность. Таким образом, полагают, что он не индуцирует опасного иммунного ответа.
(1) Вектор для переноса и получение вектора для переноса согласно настоящему изобретению
Получение ДНК иммуногенного чужеродного гена
ДНК иммуногенного чужеродного гена, которую можно сливать с вирусным геном, являющимся одним из компонентов бакуловирусного вектора для переноса, легко можно продуцировать или получить в результате синтеза на основании информации о последовательности нуклеиновой кислоты полинуклеотида, кодирующего аминокислотную последовательность антигенного белка, имеющего требуемую иммуногенность, описанного в настоящей публикации, или в результате непосредственного синтеза ДНК, соответствующей последовательности нуклеиновой кислоты кодирующей области иммуногенного чужеродного гена, на основании информации о последовательности нуклеиновой кислоты иммуногенного чужеродного гена (способ химического синтеза ДНК). Для такого получения можно использовать общие способы конструирования гена (смотри, например, «Molecular Cloning» 2d Ed, Cold Spring Harbor Lab. Press (1989); Zoku Seikagaku Jikken Kouza, «Idenshi Kenkyuho I, II, III», edited by Japanese Biochemistry Society, 1986).
Примерами способов синтеза ДНК являются способы химического синтеза, такие как фосфаттриэфирный способ и фосфатамидитный способ (J. Am. Chem. Soc., 89, 4801 (1967); там же, 91, 3350 (1969); Science, 150, 178 (1968); Tetrahedron Lett., 22, 1859 (1981); там же, 24, 245 (1983)) и способы на основе их сочетания. ДНК также может быть химически синтезирована фосфорамидитным способом или триэфирным способом или синтезирована с использованием коммерчески доступного автоматического синтезатора олигонуклеотидов. Двунитевой фрагмент может быть получен в результате синтеза комплементарной нити и отжига комплементарной нити с химически синтезированной первой нитью в подходящих условиях, или при добавлении комплементарной нити с подходящими последовательностями праймеров к химически синтезированной первой нити с использованием ДНК-полимеразы.
Конкретными примерами ДНК иммуногенного чужеродного гена, получаемой в настоящем изобретении, являются ДНК, содержащие последовательность ДНК, кодирующую аминокислотную последовательность антигенного белка возбудителя малярии, и последовательность ДНК, кодирующую аминокислотную последовательность антигенного белка вируса гриппа.
ДНК, применяемая в настоящем изобретении, не ограничена полноразмерной последовательностью ДНК, кодирующей аминокислотную последовательность полипептида антигенного белка, обладающего иммуногенностью, и может представлять собой последовательность ДНК, кодирующую его частичную последовательность, при условии, что белок с аминокислотной последовательностью, кодируемой такой последовательностью ДНК, обладает иммуногенностью.
ДНК иммуногенного чужеродного гена, используемая в настоящем изобретении, не ограничена молекулами ДНК, имеющими такую конкретную последовательность ДНК, и может представлять собой молекулы ДНК, имеющие последовательность ДНК, получаемую посредством соответствующей селекции кодонов для каждого аминокислотного остатка. Выбор кодонов можно осуществлять стандартным способом, например, учитывая частоту использования кодонов у хозяина (Nucleic Acids Res., 9, 43 (1981)).
ДНК иммуногенного чужеродного гена, используемая в настоящем изобретении, может быть получена способами генной инженерии, более конкретно с помощью получения библиотеки кДНК из подходящего источника, который экспрессирует ДНК иммуногенного чужеродного гена, стандартным способом, и отбора требуемого клона из библиотеки с использованием соответствующего зонда или антитела против экспрессируемого продукта, которое специфично по отношению к иммуногенному чужеродному гену (смотри, например, Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 78, 6613 (1981); Science, 222, 778 (1983)).
Примерами источника геномной ДНК являются различные клетки, ткани и полученные из них культивируемые клетки, которые экспрессируют ДНК иммуногенного чужеродного гена. Особенно предпочтительны экстракты эритроцитов, инфицированных малярийными паразитами, и экстракты клеток, инфицированных вирусами гриппа. Экстракцию и разделение суммарной ДНК и РНК из источника, разделение и очистку мРНК и получение и клонирование кДНК можно осуществлять стандартными способами.
Как описано выше, ДНК иммуногенного чужеродного гена может быть получена с использованием библиотеки кДНК для каждого иммуногена, полученной в результате экстракции, разделения и очистки мРНК иммуногенной ткани или клеток из указанного выше экстракта. ДНК иммуногенного чужеродного гена также может быть получена с использованием фаговой библиотеки, получаемой экстракцией мРНК каждого иммуногена, добавлением поли-A к РНК, сбором поли A-РНК, получением кДНК с использованием обратной транскриптазы, добавлением сайтов для ферментов рестрикции к обоим концам кДНК и включением кДНК в фаг.
Способ скрининга ДНК иммуногенного чужеродного гена из библиотеки кДНК особым образом не ограничен и может быть осуществлен обычным способом. Конкретными примерами таких способов являются: способ отбора соответствующего клона кДНК в результате иммунологического скрининга с использованием специфичного антигена (например, противомалярийное антитело, антитело против вируса гриппа и т.д.) против белка, продуцируемого кДНК; способ гибридизации на бляшках с использованием зонда, избирательно связывающегося с последовательностью ДНК-мишенью; способ гибридизации колоний; и их сочетания.
Зонд, используемый в таких способах гибридизации, обычно представляет собой фрагмент ДНК, химически синтезированный на основании информации о последовательности ДНК иммуногенного чужеродного гена. Уже полученные последовательности ДНК иммуногенного чужеродного гена или их фрагменты также успешно можно использовать в качестве зонда. Смысловой праймер и антисмысловой праймер, сконструированные на основе информации о последовательности ДНК иммуногенного чужеродного гена, также могут быть использованы в качестве зонда для скрининга.
ДНК (нуклеотиды), используемая в качестве зонда, представляет собой часть ДНК (нуклеотидов), соответствующей последовательности ДНК иммуногенного чужеродного гена. ДНК (нуклеотиды) имеет, по меньшей мере, 15 последовательных нуклеотидов ДНК, предпочтительно, по меньшей мере, 20 последовательных нуклеотидов ДНК и более предпочтительно, по меньшей мере, 30 последовательных нуклеотидов последовательности ДНК. Позитивный клон для получения ДНК, который описан выше, как таковой также может быть использован в качестве зонда.
Чтобы получить ДНК иммуногенного чужеродного гена, предпочтительно используют способ ДНК/РНК-амплификации с помощью ПЦР (Science, 230, 1350 (1985)). В частности, когда из библиотеки трудно получить полноразмерную кДНК, предпочтительно используют способ RACE (быструю амплификацию концов кДНК; Jikken Igaku 12(6), 35(1994)), в частности, способ 5'-RACE (M. A. Frohman, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 8, 8998(1988)).
Праймеры, используемые для ПЦР, могут быть сконструированы на основе информации о последовательности ДНК иммуногенного чужеродного гена и синтезированы стандартными способами. В качестве праймеров также можно использовать части ДНК (промотор/праймер SP6 и терминатор/праймер T7), добавляемые к обоим концам плазмидного вектора, содержащего ДНК иммуногенного чужеродного гена, включенную в такой вектор, как описано в примерах ниже.
Выделение/очистку фрагмента ДНК/РНК, амплифицированного в ПЦР, можно осуществить стандартными способами, например, гель-электрофорезом.
Последовательность ДНК иммуногенного чужеродного гена, полученная таким образом, или различных фрагментов такой ДНК, может быть определена стандартными способами, например, способом с использованием дидезоксинуклеотидов (Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 74, 5463(1977)) или способом Максама-Гильерта (Methods in Enzymology, 65, 499(1980)), или просто с использованием коммерчески доступного набора для секвенирования.
Ген, кодирующий аминокислоты белка, который может быть компонентом вирусных частиц, может представлять собой любой ген, который может кодировать белок, который образует слитый белок с белком иммуногенного чужеродного гена, как описано выше, в клетках-мишенях, и может быть экспрессирован в виде белка, который может быть компонентом вирусных частиц в клетках насекомых.
Примерами гена, кодирующего аминокислоты белка, который может быть компонентом вирусных частиц, являются гены белка gp64 (GenBank, номер доступа L22858), гликопротеина G вируса везикулярного стоматита (VSVG: GenBank, номер доступа J02428), гликопротеина вируса простого герпеса (KOS: GenBank, номер доступа K01760), gp120 вируса иммунодефицита человека типа I (GenBank, номер доступа U47783), мембранного гликопротеина респираторно-синцитиального вируса человека (GenBank, номер доступа M86651), белка гемагглютинина вируса гриппа A (GenBank, номер доступа U38242) и гены белков оболочки вирусов, близкородственных бакуловирусу. В настоящем изобретении предпочтительно можно использовать ген gp64, описанный в примерах ниже.
ДНК гена, кодирующего аминокислоты белка, который может быть компонентом вирусных частиц, может быть легко продуцирован или получен в результате синтеза на основании информации о последовательности нуклеиновой кислоты полинуклеотида, кодирующего аминокислотную последовательность полипептида гена, кодирующего аминокислоты белка-мишени, который может быть компонентом вирусных частиц; или в результате непосредственного синтеза ДНК, соответствующей нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность, на основании информации об аминокислотной последовательности полипептида гена, кодирующего аминокислоты белка, который может быть компонентом вирусных частиц (химический синтез ДНК), как и в случае получения ДНК иммуногенного чужеродного гена.
Последовательность ДНК, соответствующая последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислоты белка, который может быть компонентом вирусных частиц, не ограничена полноразмерной кодирующей областью и может представлять собой ДНК, содержащую часть такой последовательности ДНК.
Как и в случае получения молекулы ДНК иммуногенного чужеродного гена, ДНК гена, кодирующего аминокислоты белка, который может быть компонентом вирусных частиц, может быть получена обычными способами генной инженерии (смотри, например, Molecular Cloning 2d Ed, Cold Spring Harbor Lab. Press (1989); Zoku Seikagaku Jikken Kouza, “Idenshi Kenkyuho I, II, III”, edited by the Japanese Biochemistry Society, 1986).
В настоящем изобретении также можно использовать коммерчески доступные плазмидные векторы, в которые была введена часть промотора, который контролирует экспрессию иммуногенного чужеродного гена, описанного далее, и был введен (частичный) ген, кодирующий аминокислоты белка, который может быть компонентом вирусных частиц.
Промоторы позвоночных
Примерами промотора позвоночных (промотора, способного функционировать в клетках позвоночных), который является одним из компонентов вектора для переноса, используемого в настоящем изобретении, являются промоторы млекопитающих и промоторы птиц.
Промоторы млекопитающих
Примерами промотора млекопитающих (промотора, способного функционировать в клетках млекопитающих), который является одним из компонентов вектора для переноса, используемого в настоящем изобретении, являются промоторы цитомегаловируса, промоторы SV40, промоторы ретровируса, промоторы металлотионеина, промоторы белков теплового шока, промоторы CAG, промоторы фактора элонгации 1α, промоторы актина, промоторы убиквитина, промоторы альбумина и промоторы MHC.
Промоторы птиц
Примерами промотора птиц являются промоторы β-актина, промоторы белков теплового шока, промоторы факторов элонгации, промоторы убиквитина и промоторы альбумина.
Бакуловирусные промоторы
Примерами бакуловирусного промотора, который является одним из компонентов бакуловирусного вектора для переноса, используемого в настоящем изобретении, являются промотор полиэдрина, промотор p10, промотор ie1, промотор p35, промотор vp39 и промотор gp64.
Получение рекомбинантного вектора для переноса
Настоящее изобретение относится к новому вектору для переноса, имеющему структуру, способную экспрессировать требуемый иммуногенный чужеродный ген в виде антигенного белка как в клетках насекомых, так и в клетках позвоночных, в частности, в клетках млекопитающих. Новый вектор для переноса, полученный согласно настоящему изобретению, имеет структуру, в которой последовательность ДНК, кодирующая аминокислотную последовательность требуемого иммуногенного белка, и последовательность ДНК, кодирующая аминокислотную последовательность белка, который может быть компонентом вирусных частиц, связаны ниже по ходу транскрипции от связанных промоторов, состоящих из одного промотора позвоночного, в частности промотора млекопитающего, и одного бакуловирусного промотора. Области ДНК, содержащие последовательности ДНК двух промоторов, т.е. одного промотора позвоночных, в частности промотора млекопитающих, и одного бакуловирусного промотора, могут быть непосредственно связаны друг с другом или между последовательностями ДНК двух промоторов присутствует промежуточная последовательность ДНК (однако при условии, что два промотора должны обладать промоторной активностью в клетках насекомых и в клетках позвоночных, и в частности, в клетках млекопитающих). Область промотора имеет такую структуру, что любой из промоторов, либо промотор позвоночных, в частности промотор млекопитающих, либо бакуловирусный промотор, связанные друг с другом, может более близко располагаться к экспрессируемому гену. В описанных ниже примерах бакуловирусный промотор располагается более близко к экспрессируемому гену, чем промотор млекопитающих.
В описанной выше структуре последовательность ДНК слитого гена, состоящего из гена, кодирующего белок, который может быть компонентом вирусных частиц, и требуемого иммуногенного чужеродного гена, может быть такой, что два указанных гена непосредственно связаны друг с другом, или между генами присутствует промежуточная последовательность ДНК (однако при условии, что она не вызывает сдвиг рамки расположенного ниже гена и расположенного выше гена). Предпочтительно антигенпрезентирующий домен белка чужеродного гена, обладающего требуемой иммуногенностью, сливают с белком, который может быть компонентом вирусных частиц. Поэтому белок чужеродного гена, обладающий требуемой иммуногенностью, не нужно отщеплять от белка, который может быть компонентом вирусных частиц, а следует использовать в слитой с ним форме.
Слитый ген, содержащий два таких гена, может быть получен заранее и затем включен в вектор. Альтернативно один из генов сначала может быть включен в вектор, а затем другой может быть включен в вектор с образованием слитого гена в векторе.
Чтобы получить такой вектор для переноса можно использовать коммерчески доступные экспрессирующие векторы, уже имеющие некоторые необходимые компоненты вектора для переноса согласно настоящему изобретению, т.е., область промотора, включающую в себя промотор позвоночных, в частности, промотор млекопитающих, и бакуловирусный промотор, и область гена, кодирующего аминокислотную последовательность белка, который может быть компонентом вирусных частиц, и требуемые компоненты могут быть встроены в результате необязательного расщепления такого коммерчески доступного экспрессирующего вектора ферментами рестрикции и введения другого промотора, чтобы встроить слитую последовательность ДНК чужеродного гена, обладающего требуемой иммуногенностью, и гена, кодирующего аминокислотную последовательность белка, который может быть компонентом вирусных частиц, в область клонирования вектора, или в результате встраивания чужеродного гена, обладающего требуемой иммуногенностью, с N-концевой стороны от области ДНК гена, кодирующего аминокислотную последовательность белка, который может быть компонентом вирусных частиц, уже включенного в плазмиду.
В настоящем изобретении плазмидный вектор, имеющий структуру, способную экспрессировать чужеродный белок, обладающий требуемой иммуногенностью, в качестве антигенного белка как в клетках насекомых, так и в клетках позвоночных, в частности в клетках млекопитающих, может быть получен с использованием коммерчески доступной плазмиды, уже имеющей часть его структуры. Может быть встроена промежуточная аминокислотная последовательность пептида для расщепления слитого белка ферментами в клетках позвоночных. В векторе для переноса согласно настоящему изобретению энхансер для увеличения активности транскрипции в клетках позвоночных, в частности в клетках млекопитающих, может быть помещен выше двух промоторов, или последовательность ДНК, кодирующая аминокислотную последовательность сигнального пептида для облегчения внеклеточной секреции экспрессированного белка из клеток-хозяев может быть связана с геном, который сливают и экспрессируют. Для терминации транскрипции область терминатора позвоночных, такая как терминатор β-глобина кролика, которая является эффективной в клетках позвоночных, может быть помещена ниже гена, который сливают и экспрессируют.
Таким образом может быть получен вектор для переноса, способный экспрессировать слитый ген, состоящий из иммуногенного чужеродного гена, способного экспрессировать требуемую иммуногенность в бакуловирусных частицах, и гена, кодирующего аминокислотную последовательность белка, который может быть компонентом вирусных частиц.
Конкретные примеры вектора для переноса и способа его получения согласно настоящему изобретению показаны в описанных ниже примерах. Более конкретно, примерами векторов для переноса, имеющих структуру, в которой промотор CAG, полученный в результате модификации промотора цитомегаловируса (CMV), в качестве промотора позвоночных, в частности промотора млекопитающих, и промотор полиэдрина (polh), промотор vp39 или промотор gp64 в качестве бакуловирусного промотора связаны друг с другом, и встроена слитая последовательность ДНК, состоящая из гена антигена вируса гриппа или гена малярийного антигена в качестве чужеродного гена и гена антигена gp64 в качестве гена, кодирующего аминокислотную последовательность белка, который может быть компонентом вирусной частицы, являются следующие векторы pCAP-PfCSP, pCAP-PfCSP/272, pCAP-PfCSP/467, pCAP-PfCSP(A361E), pCAP-PfCSP(A361E)/272, pCAP-PfCSP(A361E)/467, pCAP-PfCSP-76, pCAP-PfCSP-76/467, pCAP-PfCSP+209, pCAP-PfCSP+209/467, pCAP-PfCSP+76/209, pCAP-PfCSP+76/209/467, pCAP-HA1/Anhui, pCAP-HA1/Anhui/272, pCAP-HA1/Anhui/467, pCAP-HA1/Vietnam, pCAP-HA1/Vietnam/51, pCAP-HA1/Vietnam/101, pCAP-HA1/Vietnam/154, pCAP-HA1/Vietnam/201, pCAP-HA1/Vietnam/272, pCAP-HA1/Vietnam/467, pCAP-AH/345, pCAP-AH/345/467, pCAP-AH/410, pCAP-AH/410/467, pCAP-AH/473, pCAP-AH/473/467, pCAP-AH/520, pCAP-AH/520/467, pCAP-VN/346, pCAP-VN/346/467, pCAP-VN/410, pCAP-VN/410/467, pCAP-VN/473, pCAP-VN/473/467, pCAP-VN/520, pCAP-VN/520/467, pCAP-CO/full, pCAP-CO/full/467, pCAP-CO/19, pCAP-CO/19/467, pCAP-CO/76, pCAP-CO/76/467, pCAP-CO/205, pCAP-CO/205/467, pCA39-HA1/Anhui, pCA64-HA1/Anhui, pCA39-PfCSP(A361E), pCA64-PfCSP(A361E), pCAP-CO/full/VSV, pCAP-CO/19/VSV, pCAP-CO/76/VSV, pCAP-CO/205/VSV, pDual-Pfs25-PfCSP-gp64 и pDual-PfMSP1-PfCSP-gp64.
(2) Получение рекомбинантного бакуловируса
Настоящее изобретение относится к способу получения рекомбинантного бакуловируса, включающему в себя стадию получения вектора для переноса, имеющего структуру, в которой слитый ген, состоящий, по меньшей мере, из одного гена, кодирующего белок, способный быть компонентом вирусной частицы, и по меньшей мере один иммуногенный чужеродный ген, встроен ниже двойного промотора, состоящего из двух связанных промоторов, т.е. одного промотора позвоночных и одного бакуловирусного промотора, и стадию котрансфекции вектора для переноса и бакуловирусной ДНК в клетку-хозяина и выделения рекомбинантного бакуловируса.
В указанном выше способе получения рекомбинантного бакуловируса способ введения требуемой рекомбинантной ДНК (вектора для переноса) в клетку-хозяина и способ трансформации специально не ограничен. Можно использовать различные способы, которые хорошо известны и обычно используются в данной области. Например, можно использовать обычные способы генетической рекомбинации (например, Science, 224, 1431 (1984); Biochem. Biophys. Res. Comm., 130, 692 (1985); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 5990 (1983), чтобы получить рекомбинантный бакуловирус. Рекомбинантная ДНК (вектор для переноса) может быть экспрессирована и получена, как описано в Ohno et al., «Tanpaku Jikken Protocol 1 Functional Analysis, Saibo Kogaku Bessatsu, Jikken Protocol Series, 1997, Shujun-sha». Общие способы, используемые для работы с клетками насекомых, рекомбинации генов и котрансфекции могут быть такими же как хорошо известные способы получения рекомбинантного вируса в клетках насекомых (Baculovirus expression vectors: A laboratory manual, Oxford University Press, 1994).
Полученный рекомбинантный бакуловирус можно культивировать стандартными способами. Слитый продукт (экспрессированный продукт), состоящий из ДНК чужеродного гена, кодирующего требуемую иммуногенность, с ДНК, кодирующей аминокислотную последовательность белка, который может быть компонентом вирусных частиц согласно настоящему изобретению, экспрессируется и продуцируется (накапливается и секретируется) внутри, снаружи или на клеточной мембране клеток насекомых при культивировании бакуловируса.
В качестве среды для культивирования могут быть использованы различные обычно применяемые среды по выбору в соответствии с используемой клеткой-хозяином. Культивирование можно осуществлять в условиях, подходящих для роста клетки-хозяина.
Более конкретно способ получения рекомбинантного бакуловируса включает в себя стадию получения бакуловирусной ДНК, которую необходимо подвергнуть гомологичной рекомбинации с вектором для переноса, получаемым как описано выше, и стадию котрансфекции вектора для переноса и бакуловирусной ДНК в клетки насекомых, такие как клетки Sf9 и клетки Sf21, полученные из Spodoptera frugiperda, и клетки Tn5 (клетки High Five), полученные из Trichoplusia ni, в качестве клеток-хозяев.
Полученная таким образом бакуловирусная ДНК, которую необходимо подвергнуть гомологичной рекомбинации с вектором для переноса, может представлять собой бакуловирусную ДНК дикого типа, мутантную или рекомбинантную бакуловирусную ДНК. Бакуловирусная ДНК может повысить вероятность гомологичной рекомбинации с вектором для переноса согласно настоящему изобретению при условии, что она имеет структуру ДНК, гомологичную полученной из бакуловируса ДНК, содержащей ДНК области двойного промотора, и ДНК слитого гена, полученного слиянием иммуногенного чужеродного гена и гена, кодирующего белок, который может быть компонентом вирусных частиц.
Чтобы индуцировать гомологичную рекомбинацию соотношение в смеси вектора для переноса и бакуловирусной ДНК по массе предпочтительно составляет примерно от 1:1 до 10:1.
После стадии котрансфекции для одновременного введения в клетки насекомых клетки культивируют и получают вирусы из надосадка культуры и затем суспендируют в среде. Вирус элюируют с агара при встряхивании и центрифугируют, получая раствор, содержащий рекомбинантный вирус.
В описанном выше способе можно использовать коммерчески доступные продукты в качестве бакуловирусной ДНК. Например, можно использовать ДНК BacVector-1000 и ДНК BacVector-2000 (поставляемые Novagen), в которых ген полиэдрина был удален из AcNPV.
Котрансфекция для гомологичной рекомбинации полученного вектора для переноса и бакуловирусной ДНК в клетки насекомых может быть осуществлена с использованием коммерчески доступного набора для трансфекции векторов (наборы для трансфекции BacVector, поставляемые Novagen) как описано выше в соответствии с инструкциями, прилагаемыми к набору для трансфекции векторов. Таким образом, полученный вектор для переноса можно котрансфицировать вместе с бакуловирусной ДНК в клетки насекомых, такие как клетки Sf9, чтобы получить рекомбинантный бакуловирус.
В настоящем изобретении согласно описанному выше способу получения рекомбинантного бакуловируса вектор для переноса, который представляет собой любой из векторов pCAP-PfCSP, pCAP-PfCSP/272, pCAP-PfCSP/467, pCAP-PfCSP(A361E), pCAP-PfCSP(A361E)/272, pCAP-PfCSP(A361E)/467, pCAP-PfCSP-76, pCAP-PfCSP-76/467, pCAP-PfCSP+209, pCAP-PfCSP+209/467, pCAP-PfCSP+76/209, pCAP-PfCSP+76/209/467, pCAP-HA1/Anhui, pCAP-HA1/Anhui/272, pCAP-HA1/Anhui/467, pCAP-HA1/Vietnam, pCAP-HA1/Vietnam/51, pCAP-HA1/Vietnam/101, pCAP-HA1/Vietnam/154, pCAP-HA1/Vietnam/201, pCAP-HA1/Vietnam/272, pCAP-HA1/Vietnam/467, pCAP-AH/345, pCAP-AH/345/467, pCAP-AH/410, pCAP-AH/410/467, pCAP-AH/473, pCAP-AH/473/467, pCAP-AH/520, pCAP-AH/520/467, pCAP-VN/346, pCAP-VN/346/467, pCAP-VN/410, pCAP-VN/410/467, pCAP-VN/473, pCAP-VN/473/467, pCAP-VN/520, pCAP-VN/520/467, pCAP-CO/full, pCAP-CO/full/467, pCAP-CO/19, pCAP-CO/19/467, pCAP-CO/76, pCAP-CO/76/467, pCAP-CO/205, pCAP-CO/205/467, pCA39-HA1/Anhui, pCA64-HA1/Anhui, pCA39-PfCSP(A361E), pCA64-PfCSP(A361E), pCAP-CO/full/VSV, pCAP-CO/19/VSV, pCAP-CO/76/VSV, pCAP-CO/205/VSV, pDual-Pfs25-PfCSP-gp64 и pDual-PfMSP1-PfCSP-gp64, и бакуловирусная ДНК могут быть котрансфицированы в клетки насекомых Sf9 с получением любого из рекомбинантных бакуловирусов AcNPV-CAP-PfCSP, AcNPV-CAP-PfCSP/272, AcNPV-CAP-PfCSP/467, AcNPV-CAP-PfCSP(A361E), AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)/272, AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)/467, AcNPV-CAP-PfCSP-76, AcNPV-CAP-PfCSP-76/467, AcNPV-CAP-PfCSP+209, AcNPV-CAP-PfCSP+209/467, AcNPV-CAP-PfCSP+76/209, AcNPV-CAP-PfCSP+76/209/467, AcNPV-CAP-HA1/Anhui, AcNPV-CAP-HA1/Anhui/272, AcNPV-CAP-HA1/Anhui/467, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/51, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/101, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/154, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/201, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/272, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/467, AcNPV-CAP-AH/345, AcNPV-CAP-AH/345/467, AcNPV-CAP-AH/410, AcNPV-CAP-AH/410/467, AcNPV-CAP-AH/473, AcNPV-CAP-AH/473/467, AcNPV-CAP-AH/520, AcNPV-CAP-AH/520/467, AcNPV-CAP-VN/346, AcNPV-CAP-VN/346/467, AcNPV-CAP-VN/410, AcNPV-CAP-VN/410/467, AcNPV-CAP-VN/473, AcNPV-CAP-VN/473/467, AcNPV-CAP-VN/520, AcNPV-CAP-VN/520/467, AcNPV-CAP-CO/full, AcNPV-CAP-CO/full/467, AcNPV-CAP-CO/19, AcNPV-CAP-CO/19/467, AcNPV-CAP-CO/76, AcNPV-CAP-CO/76/467, AcNPV-CAP-CO/205, AcNPV-CAP-CO/205/467, AcNPV-CA39-HA1/Anhui, AcNPV-CA64-HA1/Anhui, AcNPV-CA39-PfCSP(A361E), AcNPV-CA64-PfCSP(A361E), AcNPV-CAP-CO/full/VSV, AcNPV-CAP-CO/19/VSV, AcNPV-CAP-CO/76/VSV, AcNPV-CAP-CO/205/VSV, AcNPV-Dual-Pfs25-PfCSP-gp64 и AcNPV-Dual-PfMSP1-PfCSP-gp64.
Кроме описанного выше способа получения рекомбинантного бакуловируса другие способы получения рекомбинантного бакуловируса включают, например, способ, основанный на использовании транспозона в виде фагмиды (бакмиды), содержащей включенный в нее полный геном бакуловируса, чтобы эффективно встроить чужеродный ген в Escherichia coli.
Согласно указанному способу бакмиду, несущую вирусный ген, экстрагируют из бактериальных клеток и трансфицируют в клетки насекомых, таким образом легко получая и собирая рекомбинантный бакуловирус.
Очистка рекомбинантного бакуловируса согласно настоящему изобретению, полученного описанным выше способом получения рекомбинантного бакуловируса, может быть осуществлена с использованием известных способов очистки вирусов.
Для очистки рекомбинантного бакуловируса, например, от 0,5 до 1,0 мл исходной культуры вируса, полученного описанным выше способом получения рекомбинантного бакуловируса, инокулируют в клетки насекомых (1×107 клеток/чашку диаметром 10 см), такие как клетки Sf9, надосадок культуры собирают через несколько дней после инфекции и осадок вирусов, полученный центрифугированием, суспендируют в буфере, таком как PBS. Полученную суспензию наносят на градиент сахарозы от 10 до 60% и затем центрифугируют (25000 об./мин, 60 минут, 4°C) и собирают полосу, соответствующую вирусу. Затем собранные вирусы суспендируют в PBS, затем центрифугируют (в таких же условиях, как описано выше), и полученный осадок очищенных рекомбинантных вирусов хранят при 4°C в буфере, таком как PBS.
Титр инфекционности полученного очищенного рекомбинантного вируса, описанного выше, можно измерить в анализе бляшек (Baculovirus expression vectors: A laboratory manual, Oxford University Press, 1994), используя клетки насекомых, такие как клетки Sf9.
В рекомбинантных вирусах, описанных в примерах, N-конец бакуловирусного белка gp64 находится с внешней стороны частицы, тогда как его C-конец находится внутри частицы. Поэтому если белок, кодируемый чужеродным геном, обладающим требуемой иммуногенностью, слит с N-концом gp64, то он экспонируется в виде компонента вирусной частицы снаружи вирусной белковой частицы в клетках насекомых, и следовательно антиген более доступно презентирован, что подходит для применения в качестве вакцинного препарата согласно настоящему изобретению.
(3) Фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению (фармацевтический препарат, содержащий рекомбинантный бакуловирус согласно настоящему изобретению в качестве активного ингредиента)
Рекомбинантный бакуловирус согласно настоящему изобретению, который является активным ингредиентом фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению, может быть получен способами генетической инженерии, указанными выше в пункте (2).
Фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению в основном содержит в качестве активного ингредиента рекомбинантный бакуловирус, полученный в результате гомологичной рекомбинации бакуловирусной ДНК и вектора для переноса, сконструированного так, что слитый ген, полученный в результате слияния иммуногенного чужеродного гена согласно настоящему изобретению с геном, кодирующим аминокислотную последовательность белка, который может быть компонентом вирусной частицы, может быть экспрессирован в клетках насекомых и клетках позвоночных, в частности, в клетках млекопитающих, включая человека.
Настоящее изобретение в частности относится к фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного ингредиента специальный рекомбинантный бакуловирус, который представляет собой любой из бакуловирусов AcNPV-CAP-PfCSP, AcNPV-CAP-PfCSP/272, AcNPV-CAP-PfCSP/467, AcNPV-CAP-PfCSP(A361E), AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)/272, AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)/467, AcNPV-CAP-PfCSP-76, AcNPV-CAP-PfCSP-76/467, AcNPV-CAP-PfCSP+209, AcNPV-CAP-PfCSP+209/467, AcNPV-CAP-PfCSP+76/209, AcNPV-CAP-PfCSP+76/209/467, AcNPV-CAP-HA1/Anhui, AcNPV-CAP-HA1/Anhui/272, AcNPV-CAP-HA1/Anhui/467, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/51, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/101, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/154, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/201, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/272, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/467, AcNPV-CAP-AH/345, AcNPV-CAP-AH/345/467, AcNPV-CAP-AH/410, AcNPV-CAP-AH/410/467, AcNPV-CAP-AH/473, AcNPV-CAP-AH/473/467, AcNPV-CAP-AH/520, AcNPV-CAP-AH/520/467, AcNPV-CAP-VN/346, AcNPV-CAP-VN/346/467, AcNPV-CAP-VN/410, AcNPV-CAP-VN/410/467, AcNPV-CAP-VN/473, AcNPV-CAP-VN/473/467, AcNPV-CAP-VN/520, AcNPV-CAP-VN/520/467, AcNPV-CAP-CO/full, AcNPV-CAP-CO/full/467, AcNPV-CAP-CO/19, AcNPV-CAP-CO/19/467, AcNPV-CAP-CO/76, AcNPV-CAP-CO/76/467, AcNPV-CAP-CO/205, AcNPV-CAP-CO/205/467, AcNPV-CA39-HA1/Anhui, AcNPV-CA64-HA1/Anhui, AcNPV-CA39-PfCSP(A361E), AcNPV-CA64-PfCSP(A361E), AcNPV-CAP-CO/full/VSV, AcNPV-CAP-CO/19/VSV, AcNPV-CAP-CO/76/VSV, AcNPV-CAP-CO/205/VSV, AcNPV-Dual-Pfs25-PfCSP-gp64 и AcNPV-Dual-PfMSP1-PfCSP-gp64.
Рекомбинантный бакуловирус согласно настоящему изобретению, который представляет собой любой из бакуловирусов AcNPV-CAP-PfCSP, AcNPV-CAP-PfCSP/272, AcNPV-CAP-PfCSP/467, AcNPV-CAP-PfCSP(A361E), AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)/272, AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)/467, AcNPV-CAP-PfCSP-76, AcNPV-CAP-PfCSP-76/467, AcNPV-CAP-PfCSP+209, AcNPV-CAP-PfCSP+209/467, AcNPV-CAP-PfCSP+76/209, AcNPV-CAP-PfCSP+76/209/467, AcNPV-CAP-HA1/Anhui, AcNPV-CAP-HA1/Anhui/272, AcNPV-CAP-HA1/Anhui/467, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/51, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/101, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/154, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/201, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/272, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/467, AcNPV-CAP-AH/345, AcNPV-CAP-AH/345/467, AcNPV-CAP-AH/410, AcNPV-CAP-AH/410/467, AcNPV-CAP-AH/473, AcNPV-CAP-AH/473/467, AcNPV-CAP-AH/520, AcNPV-CAP-AH/520/467, AcNPV-CAP-VN/346, AcNPV-CAP-VN/346/467, AcNPV-CAP-VN/410, AcNPV-CAP-VN/410/467, AcNPV-CAP-VN/473, AcNPV-CAP-VN/473/467, AcNPV-CAP-VN/520, AcNPV-CAP-VN/520/467, AcNPV-CAP-CO/full, AcNPV-CAP-CO/full/467, AcNPV-CAP-CO/19, AcNPV-CAP-CO/19/467, AcNPV-CAP-CO/76, AcNPV-CAP-CO/76/467, AcNPV-CAP-CO/205, AcNPV-CAP-CO/205/467, AcNPV-CA39-HA1/Anhui, AcNPV-CA64-HA1/Anhui, AcNPV-CA39-PfCSP(A361E), AcNPV-CA64-PfCSP(A361E), AcNPV-CAP-CO/full/VSV, AcNPV-CAP-CO/19/VSV, AcNPV-CAP-CO/76/VSV, AcNPV-CAP-CO/205/VSV, AcNPV-Dual-Pfs25-PfCSP-gp64 и AcNPV-Dual-PfMSP1-PfCSP-gp64, используемый в качестве активного ингредиента фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению, оказывает действие, усиливающее эффекты предотвращения инфекции, направленные против инфекционного антигена, и уменьшающее титр инфекционности. Благодаря использованию такого действия и активности рекомбинантный бакуловирус можно применять для лечения болезней, ассоциированных с инфекцией клеток-мишеней и тканей. Примеры клеток-мишеней, поражаемых такой инфекцией, включают клетки крови, клетки печени, клетки почек, клетки головного мозга, клетки легких, эпителиальные клетки и мышечные клетки. Примеры тканей, содержащих такие клетки, включают легкие, печень, почки, головной мозг, артерии и вены, желудок, кишечник, уретру, кожу и мышцы.
Фармацевтическая композиция усиливает эффекты предотвращения инфекции, направленные против инфекционных антигенов, например, малярийных антигенов, таких как поверхностные антигены спорозоита (CSP и TRAP) малярийных паразитов, белок поверхностной мембраны мерозоита MSP1, малярийный S-антиген, секретируемый из эритроцитов, инфицированных малярийным паразитом, белок PfEMP1, присутствующий в выростах эритроцитов, инфицированных возбудителем малярии, белок SERA, белок TRAMP, белок AMA1 и Pfs25, известный как антиген, блокирующий трансмиссию; и антигенов гриппа, таких как антиген HA, антиген NA, антиген M2 и антиген NP, и уменьшает титр инфекционности (например, титр инфекционности вируса), таким образом увеличивая период жизнеспособности и коэффициент выживаемости млекопитающих, включая человека, по сравнению с группой, в которой не вводили фармацевтическую композицию согласно настоящему изобретению. Следовательно, фармацевтическая композиция особенно применима в качестве профилактического или терапевтического средства против малярии и инфекции вирусом гриппа.
Фармацевтическая композиция согласно изобретению обладает действием, усиливающим эффекты предотвращения инфекции, направленные против инфекционных антигенов, и уменьшающие титры инфекционности, и поэтому применима в качестве профилактического или терапевтического средства для лечения инфекционных болезней, вызванных такими патогенами, как вирусы гриппа и малярия, и их осложнений.
При использовании гена, который является иммуногенным по отношению к позвоночным, отличным от человека, в качестве иммуногенного чужеродного гена в векторе для переноса, чтобы получить рекомбинантный бакуловирус, используемый в качестве активного ингредиента фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению, может быть получена, например, вакцина против гриппа кур, которая обладает действием, усиливающим эффекты предотвращения инфекции, направленные против инфекционного антигена, и уменьшающим титр инфекционности. Благодаря использованию такого действия и активности фармацевтическую композицию можно применять для лечения болезней, ассоциированных с инфекцией клеток-мишеней и тканей.
Фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению может быть получена в виде композиции, содержащей фармацевтически эффективное количество рекомбинантного бакуловируса согласно изобретению и фармацевтически приемлемый носитель.
Эффект предотвращения инфекции, которым обладает рекомбинантный бакуловирус согласно настоящему изобретению, у позвоночных, в частности у млекопитающих, включая человека, или в клетках млекопитающих может быть получен, например, в результате введения фармацевтической композиции, содержащей рекомбинантный бакуловирус согласно настоящему изобретению и добавки, используемые для фармацевтического введения позвоночным, в частности млекопитающим, включая человека, внутримышечным, подкожным, внутрикожным, внутрибрюшинным, назальным или респираторным путем, и затем иммунизации позвоночных фармацевтической композицией, содержащей рекомбинантный бакуловирус согласно настоящему изобретению в качестве активного ингредиента, несколько раз. Респираторное введение фармацевтической композиции согласно изобретению является особенно предпочтительным.
Эффект предотвращения инфекции можно оценить посредством сравнения коэффициента выживаемости позвоночных, в частности млекопитающих, включая человека, которые были иммунизированы фармацевтической композицией согласно изобретению несколько раз и затем инфицированы патогеном-мишенью, с коэффициентом выживаемости позвоночных, которым не вводили фармацевтическую композицию.
(4) Вакцина согласно настоящему изобретению
Рекомбинантный бакуловирус, который представляет собой любой из бакуловирусов AcNPV-CAP-PfCSP, AcNPV-CAP-PfCSP/272, AcNPV-CAP-PfCSP/467, AcNPV-CAP-PfCSP(A361E), AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)/272, AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)/467, AcNPV-CAP-PfCSP-76, AcNPV-CAP-PfCSP-76/467, AcNPV-CAP-PfCSP+209, AcNPV-CAP-PfCSP+209/467, AcNPV-CAP-PfCSP+76/209, AcNPV-CAP-PfCSP+76/209/467, AcNPV-CAP-HA1/Anhui, AcNPV-CAP-HA1/Anhui/272, AcNPV-CAP-HA1/Anhui/467, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/51, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/101, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/154, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/201, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/272, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/467, AcNPV-CAP-AH/345, AcNPV-CAP-AH/345/467, AcNPV-CAP-AH/410, AcNPV-CAP-AH/410/467, AcNPV-CAP-AH/473, AcNPV-CAP-AH/473/467, AcNPV-CAP-AH/520, AcNPV-CAP-AH/520/467, AcNPV-CAP-VN/346, AcNPV-CAP-VN/346/467, AcNPV-CAP-VN/410, AcNPV-CAP-VN/410/467, AcNPV-CAP-VN/473, AcNPV-CAP-VN/473/467, AcNPV-CAP-VN/520, AcNPV-CAP-VN/520/467, AcNPV-CAP-CO/full, AcNPV-CAP-CO/full/467, AcNPV-CAP-CO/19, AcNPV-CAP-CO/19/467, AcNPV-CAP-CO/76, AcNPV-CAP-CO/76/467, AcNPV-CAP-CO/205, AcNPV-CAP-CO/205/467, AcNPV-CA39-HA1/Anhui, AcNPV-CA64-HA1/Anhui, AcNPV-CA39-PfCSP(A361E), AcNPV-CA64-PfCSP(A361E), AcNPV-CAP-CO/full/VSV, AcNPV-CAP-CO/19/VSV, AcNPV-CAP-CO/76/VSV, AcNPV-CAP-CO/205/VSV, AcNPV-Dual-Pfs25-PfCSP-gp64 и AcNPV-Dual-PfMSP1-PfCSP-gp64, используемый в качестве активного ингредиента фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению, может усиливать эффекты предотвращения инфекции патогеном, как описано в примерах ниже, и экспрессированный слитый продукт последовательности ДНК, полученной слиянием гена, кодирующего аминокислотную последовательность белка, который может быть компонентом вирусных частиц, и чужеродного гена с требуемой иммуногенностью согласно настоящему изобретению, способный уменьшать титр инфекционности, получают в виде вирусных частиц после баддинга (отделения) от клеток насекомых. Когда фармацевтическую композицию согласно изобретению вводят в форме вирусных частиц позвоночным, в частности млекопитающим, включая человека, чужеродный антигенный белок, являющийся компонентом вирусных частиц, стимулирует искусственный иммунитет (гуморальный иммунитет и клеточный иммунитет), и кроме того, антигенный белок в виде экспрессированного продукта слитой последовательности ДНК, по-видимому, стимулирует искусственный иммунитет (гуморальный иммунитет и клеточный иммунитет) в клетках позвоночных, в частности в клетках млекопитающих, включая человека. Таким образом, рекомбинантный бакуловирус согласно настоящему изобретению применим в качестве вакцины.
Настоящее изобретение, в частности, относится к вакцине, содержащей в качестве активного ингредиента специальный рекомбинантный бакуловирус, который представляет собой любой из бакуловирусов AcNPV-CAP-PfCSP, AcNPV-CAP-PfCSP/272, AcNPV-CAP-PfCSP/467, AcNPV-CAP-PfCSP(A361E), AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)/272, AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)/467, AcNPV-CAP-PfCSP-76, AcNPV-CAP-PfCSP-76/467, AcNPV-CAP-PfCSP+209, AcNPV-CAP-PfCSP+209/467, AcNPV-CAP-PfCSP+76/209, AcNPV-CAP-PfCSP+76/209/467, AcNPV-CAP-HA1/Anhui, AcNPV-CAP-HA1/Anhui/272, AcNPV-CAP-HA1/Anhui/467, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/51, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/101, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/154, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/201, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/272, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/467, AcNPV-CAP-AH/345, AcNPV-CAP-AH/345/467, AcNPV-CAP-AH/410, AcNPV-CAP-AH/410/467, AcNPV-CAP-AH/473, AcNPV-CAP-AH/473/467, AcNPV-CAP-AH/520, AcNPV-CAP-AH/520/467, AcNPV-CAP-VN/346, AcNPV-CAP-VN/346/467, AcNPV-CAP-VN/410, AcNPV-CAP-VN/410/467, AcNPV-CAP-VN/473, AcNPV-CAP-VN/473/467, AcNPV-CAP-VN/520, AcNPV-CAP-VN/520/467, AcNPV-CAP-CO/full, AcNPV-CAP-CO/full/467, AcNPV-CAP-CO/19, AcNPV-CAP-CO/19/467, AcNPV-CAP-CO/76, AcNPV-CAP-CO/76/467, AcNPV-CAP-CO/205, AcNPV-CAP-CO/205/467, AcNPV-CA39-HA1/Anhui, AcNPV-CA64-HA1/Anhui, AcNPV-CA39-PfCSP(A361E), AcNPV-CA64-PfCSP(A361E), AcNPV-CAP-CO/full/VSV, AcNPV-CAP-CO/19/VSV, AcNPV-CAP-CO/76/VSV, AcNPV-CAP-CO/205/VSV, AcNPV-Dual-Pfs25-PfCSP-gp64 и AcNPV-Dual-PfMSP1-PfCSP-gp64.
Как и фармацевтическая композиция, описанная выше в пункте (3), вакцина усиливает эффекты предотвращения инфекции, направленные против инфекционных антигенов, например, малярийных антигенов, таких как поверхностные антигены спорозоита (CSP и TRAP) малярийного паразита, белок поверхностной мембраны мерозоита MSP1, малярийный S-антиген, секретируемый из эритроцитов, инфицированных малярийным паразитом, белок PfEMP1, присутствующий в выростах эритроцитов, инфицированных возбудителем малярии, белок SERA, белок TRAMP и белок AMA1; и антигенов гриппа, таких как антиген вируса гриппа HA, антиген вируса гриппа NA, антиген вируса гриппа M2 и антиген вируса гриппа NP; вакцина также уменьшает титр инфекционности (например, титр инфекционности вируса), таким образом увеличивая период жизнеспособности и коэффициент выживаемости млекопитающих, включая человека, по сравнению с группой, в которой не вводили фармацевтическую композицию согласно настоящему изобретению. Следовательно, вакцина особенно применима в качестве профилактического или терапевтического средства против малярии и инфекции вирусом гриппа.
Вакцина согласно изобретению усиливает эффекты предотвращения инфекции, направленные против инфекционных антигенов, и уменьшает титр инфекционности, и поэтому применима в качестве профилактического или терапевтического средства для лечения инфекционных болезней, вызванных патогенами, такими как вирусы гриппа и малярия, и их осложнений.
При использовании гена, который является иммуногенным по отношению к позвоночным, отличным от человека, в качестве иммуногенного чужеродного гена в векторе для переноса, чтобы получить рекомбинантный бакуловирус, используемый в качестве активного ингредиента фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению, может быть получена, например, вакцина против гриппа кур, которая может усиливать эффекты предотвращения инфекции, направленные против инфекционного антигена, и уменьшать титр инфекционности. Благодаря использованию такой активности вакцину можно применять для лечения болезней, ассоциированных с инфекцией клеток-мишеней и тканей.
Рекомбинантный бакуловирус, который представляет собой любой из бакуловирусов AcNPV-CAP-PfCSP, AcNPV-CAP-PfCSP/272, AcNPV-CAP-PfCSP/467, AcNPV-CAP-PfCSP(A361E), AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)/272, AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)/467, AcNPV-CAP-PfCSP-76, AcNPV-CAP-PfCSP-76/467, AcNPV-CAP-PfCSP+209, AcNPV-CAP-PfCSP+209/467, AcNPV-CAP-PfCSP+76/209, AcNPV-CAP-PfCSP+76/209/467, AcNPV-CAP-HA1/Anhui, AcNPV-CAP-HA1/Anhui/272, AcNPV-CAP-HA1/Anhui/467, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/51, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/101, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/154, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/201, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/272, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/467, AcNPV-CAP-AH/345, AcNPV-CAP-AH/345/467, AcNPV-CAP-AH/410, AcNPV-CAP-AH/410/467, AcNPV-CAP-AH/473, AcNPV-CAP-AH/473/467, AcNPV-CAP-AH/520, AcNPV-CAP-AH/520/467, AcNPV-CAP-VN/346, AcNPV-CAP-VN/346/467, AcNPV-CAP-VN/410, AcNPV-CAP-VN/410/467, AcNPV-CAP-VN/473, AcNPV-CAP-VN/473/467, AcNPV-CAP-VN/520, AcNPV-CAP-VN/520/467, AcNPV-CAP-CO/full, AcNPV-CAP-CO/full/467, AcNPV-CAP-CO/19, AcNPV-CAP-CO/19/467, AcNPV-CAP-CO/76, AcNPV-CAP-CO/76/467, AcNPV-CAP-CO/205, AcNPV-CAP-CO/205/467, AcNPV-CA39-HA1/Anhui, AcNPV-CA64-HA1/Anhui, AcNPV-CA39-PfCSP(A361E), AcNPV-CA64-PfCSP(A361E), AcNPV-CAP-CO/full/VSV, AcNPV-CAP-CO/19/VSV, AcNPV-CAP-CO/76/VSV, AcNPV-CAP-CO/205/VSV, AcNPV-Dual-Pfs25-PfCSP-gp64 и AcNPV-Dual-PfMSP1-PfCSP-gp64, используемый в качестве активного ингредиента вакцины согласно настоящему изобретению, может усиливать эффекты предотвращения инфекции, направленные против инфекционного антигена, и уменьшать титр инфекционности. Благодаря использованию такой активности рекомбинантный бакуловирус можно применять для лечения болезней, ассоциированных с инфекцией клеток-мишеней и тканей.
Примеры клеток-мишеней, поражаемых такой инфекцией, включают клетки крови, клетки печени, клетки почек, клетки головного мозга, клетки легких, эпителиальные клетки и мышечные клетки. Примеры тканей, содержащих такие клетки, включают легкие, печень, почки, головной мозг, артерии и вены, желудок, кишечник, уретру, кожу и мышцы.
Вакцина согласно настоящему изобретению может быть получена в виде фармацевтической композиции, описанной выше в пункте (3), содержащей фармацевтически эффективное количество рекомбинантного бакуловируса согласно изобретению (любого из бакуловирусов AcNPV-CAP-PfCSP, AcNPV-CAP-PfCSP/272, AcNPV-CAP-PfCSP/467, AcNPV-CAP-PfCSP(A361E), AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)/272, AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)/467, AcNPV-CAP-PfCSP-76, AcNPV-CAP-PfCSP-76/467, AcNPV-CAP-PfCSP+209, AcNPV-CAP-PfCSP+209/467, AcNPV-CAP-PfCSP+76/209, AcNPV-CAP-PfCSP+76/209/467, AcNPV-CAP-HA1/Anhui, AcNPV-CAP-HA1/Anhui/272, AcNPV-CAP-HA1/Anhui/467, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/51, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/101, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/154, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/201, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/272, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/467, AcNPV-CAP-AH/345, AcNPV-CAP-AH/345/467, AcNPV-CAP-AH/410, AcNPV-CAP-AH/410/467, AcNPV-CAP-AH/473, AcNPV-CAP-AH/473/467, AcNPV-CAP-AH/520,AcNPV-CAP-AH/520/467, AcNPV-CAP-VN/346, AcNPV-CAP-VN/346/467, AcNPV-CAP-VN/410, AcNPV-CAP-VN/410/467, AcNPV-CAP-VN/473, AcNPV-CAP-VN/473/467, AcNPV-CAP-VN/520, AcNPV-CAP-VN/520/467, AcNPV-CAP-CO/full, AcNPV-CAP-CO/full/467, AcNPV-CAP-CO/19, AcNPV-CAP-CO/19/467, AcNPV-CAP-CO/76, AcNPV-CAP-CO/76/467, AcNPV-CAP-CO/205, AcNPV-CAP-CO/205/467, AcNPV-CA39-HA1/Anhui, AcNPV-CA64-HA1/Anhui, AcNPV-CA39-PfCSP(A361E), AcNPV-CA64-PfCSP(A361E), AcNPV-CAP-CO/full/VSV, AcNPV-CAP-CO/19/VSV, AcNPV-CAP-CO/76/VSV, AcNPV-CAP-CO/205/VSV, AcNPV-Dual-Pfs25-PfCSP-gp64 и AcNPV-Dual-PfMSP1-PfCSP-gp64) и фармацевтически приемлемый носитель.
Вакцина может быть получена в форме фармацевтической композиции с использованием фармацевтически приемлемого носителя, который применяют в фармацевтической композиции, описанной выше в пункте (3), согласно стандартному способу. Примерами носителей являются физиологически приемлемые растворы, такие как физиологический раствор соли и стерильный забуференный раствор соли.
Вакцина («препарат» далее означает тоже самое, что и в случае фармацевтической композиции) может быть получена в виде липосомного препарата, содержащего в качестве активного ингредиента рекомбинантный бакуловирус согласно изобретению (любой из бакуловирусов AcNPV-CAP-PfCSP, AcNPV-CAP-PfCSP/272, AcNPV-CAP-PfCSP/467, AcNPV-CAP-PfCSP(A361E), AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)/272, AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)/467, AcNPV-CAP-PfCSP-76, AcNPV-CAP-PfCSP-76/467, AcNPV-CAP-PfCSP+209, AcNPV-CAP-PfCSP+209/467, AcNPV-CAP-PfCSP+76/209, AcNPV-CAP-PfCSP+76/209/467, AcNPV-CAP-HA1/Anhui, AcNPV-CAP-HA1/Anhui/272, AcNPV-CAP-HA1/Anhui/467, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/51, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/101, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/154, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/201, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/272, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/467, AcNPV-CAP-AH/345, AcNPV-CAP-AH/345/467, AcNPV-CAP-AH/410, AcNPV-CAP-AH/410/467, AcNPV-CAP-AH/473, AcNPV-CAP-AH/473/467, AcNPV-CAP-AH/520, AcNPV-CAP-AH/520/467, AcNPV-CAP-VN/346, AcNPV-CAP-VN/346/467, AcNPV-CAP-VN/410, AcNPV-CAP-VN/410/467, AcNPV-CAP-VN/473, AcNPV-CAP-VN/473/467, AcNPV-CAP-VN/520, AcNPV-CAP-VN/520/467, AcNPV-CAP-CO/full, AcNPV-CAP-CO/full/467, AcNPV-CAP-CO/19, AcNPV-CAP-CO/19/467, AcNPV-CAP-CO/76, AcNPV-CAP-CO/76/467, AcNPV-CAP-CO/205, AcNPV-CAP-CO/205/467, AcNPV-CA39-HA1/Anhui, AcNPV-CA64-HA1/Anhui, AcNPV-CA39-PfCSP(A361E), AcNPV-CA64-PfCSP(A361E), AcNPV-CAP-CO/full/VSV, AcNPV-CAP-CO/19/VSV, AcNPV-CAP-CO/76/VSV, AcNPV-CAP-CO/205/VSV, AcNPV-Dual-Pfs25-PfCSP-gp64 и AcNPV-Dual-PfMSP1-PfCSP-gp64) и может быть использована в сочетании с адъювантом.
Конкретными примерами вакцины (фармацевтической композиции) согласно настоящему изобретению являются липосомные препараты. Липосомный препарат может представлять собой препарат, в котором рекомбинантный бакуловирус согласно настоящему изобретению находится в липосоме, содержащей кислый фосфолипид в качестве мембранного компонента или содержащей нейтральный фосфолипид и кислый фосфолипид в качестве мембранных компонентов.
Кислый фосфолипид и нейтральный фосфолипид, используемые в качестве мембранных компонентов, особым образом не ограничены, и можно использовать различные липиды, обычно применяемые для липосомных препаратов, отдельно или в сочетании двух или более фосфолипидов.
Мембрану липосом получают стандартным способом, используя кислый фосфолипид отдельно или вместе с нейтральным фосфолипидом. Когда кислый фосфолипид используют вместе с нейтральным фосфолипидом, доля кислых фосфолипидов среди компонентов мембраны липосом предпочтительно составляет примерно от 0,1 до 100% моль, более предпочтительно от 1 до 90% моль и еще более предпочтительно примерно от 10 до 50% моль.
Чтобы получить липосому можно добавить, например, холестерин или тому подобное. Таким образом, можно регулировать текучесть фосфолипидов и облегчить получение липосом. В общем, холестерин предпочтительно добавляют в эквивалентном количестве или меньше, и предпочтительно от 0,5-кратного количества до эквивалентного количества по массе по отношению к фосфолипиду.
В липосомном препарате отношение в смеси кислого фосфолипида к активному ингредиенту составляет примерно от 0,5 до 100 эквивалентов, предпочтительно примерно от 1 до 60 эквивалентов и более предпочтительно примерно от 1,5 до примерно 20 эквивалентов.
Рекомбинантный бакуловирус согласно настоящему изобретению в качестве активного ингредиента используют в количестве от нескольких % моль до нескольких десятков % моль, предпочтительно примерно от 5 до примерно 10% моль, и обычно около 5% моль, в расчете на общее количество липидов.
Контроль получения, концентрации и диаметра частиц препарата липосом можно осуществлять стандартными способами. При необходимости в липосомный препарат также можно включать различные добавки, которые описаны выше.
Чтобы получить липосомный препарат, рекомбинантный бакуловирус согласно изобретению в качестве активного ингредиента может быть использован в форме, связанной с жирной кислотой (например, бегеновой кислотой, стеариновой кислотой, пальмитиновой кислотой, миристиновой кислотой и олеиновой кислотой), алкильной группой, группой холестерила или тому подобной. Липосомный препарат, содержащий такие связанные компоненты, также может быть получен стандартным способом (смотри, например, Long Circulating Liposomes: Old Drugs, New Therapeutics., M. C. Woodle, G. Storm, Eds: Springer-Verlag Berlin (1998)).
Вакцина (фармацевтическая композиция) согласно настоящему изобретению предпочтительно может быть использована в виде вакцинной композиции. Вакцину предпочтительно используют в сочетании с фармацевтически эффективным количеством адъюванта, чтобы усилить противоинфекционное (противомалярийное или противогриппозное) действие.
В качестве адъюванта можно использовать любой адъювант, обычно используемый для такого типа вакцины. Примерами таких адъювантов являются полный адъювант Фрейнда, мурамилдипептид, гидроксид алюминия, BCG, IL-12, N-ацетилмурамин-L-аланил-D-изоглутамин (MDP), тимозин α1 и QS-21. Количество используемого адъюванта может быть соответственно выбрано в зависимости от степени проявления симптомов, таких как размягчение кожи, боль, эритема, повышенная температура, головная боль и мышечная боль, которые могут проявляться как часть иммунного ответа у человека или животных после введения вакцины такого типа.
Вакцину (фармацевтическую композицию) согласно настоящему изобретению можно использовать в сочетании с другими общеизвестными фармацевтическими продуктами, такими как пептиды, стимулирующие иммунный ответ, и антибактериальные средства (синтетические антибактериальные средства).
Вакцина (фармацевтическая композиция) может дополнительно содержать другие лекарственные средства и добавки. Примерами являются лекарственные средства, которые способствуют захвату рекомбинантного бакуловируса согласно настоящему изобретению внутрь клетки, такие как ионы кальция. Также можно использовать липосому и другие лекарственные средства и добавки, которые облегчают трансфекцию, такие как фторуглеродные эмульгаторы, спиралевидные липидные системы (кохлеаты), трубочки, частицы золота, биоразрушаемые микросферы и катионные полимеры.
Количество активного ингредиента, входящего в состав вакцины (фармацевтической композиции) (лекарственного средства) согласно настоящему изобретению особым образом не ограничено и может быть выбрано из широкого диапазона, при условии, что такое количество является фармацевтически эффективным количеством. Доза вакцины (фармацевтической композиции) особым образом не ограничена и может быть соответствующим образом выбрана из широкого диапазона в соответствии с требуемым терапевтическим эффектом, способом введения (путем введения), продолжительностью терапии, возрастом пациента, полом и другими условиями, и т.д.
Когда рекомбинантный бакуловирус в качестве активного ингредиента вакцины (фармацевтической композиции) согласно настоящему изобретению вводят человеку, рекомбинантный бакуловирус вводят в количестве, соответствующем 102-1014 БОЕ, предпочтительно от 105 до 1012 БОЕ и более предпочтительно от 106 до 1010 БОЕ на пациента, при расчете в виде БОЕ рекомбинантного вируса.
Доза рекомбинантного бакуловируса (любого из бакуловирусов AcNPV-CAP-PfCSP, AcNPV-CAP-PfCSP/272, AcNPV-CAP-PfCSP/467, AcNPV-CAP-PfCSP(A361E), AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)/272, AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)/467, AcNPV-CAP-PfCSP-76, AcNPV-CAP-PfCSP-76/467, AcNPV-CAP-PfCSP+209, AcNPV-CAP-PfCSP+209/467, AcNPV-CAP-PfCSP+76/209, AcNPV-CAP-PfCSP+76/209/467, AcNPV-CAP-HA1/Anhui, AcNPV-CAP-HA1/Anhui/272, AcNPV-CAP-HA1/Anhui/467, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/51, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/101, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/154, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/201, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/272, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/467, AcNPV-CAP-AH/345, AcNPV-CAP-AH/345/467, AcNPV-CAP-AH/410, AcNPV-CAP-AH/410/467, AcNPV-CAP-AH/473, AcNPV-CAP-AH/473/467, AcNPV-CAP-AH/520, AcNPV-CAP-AH/520/467, AcNPV-CAP-VN/346, AcNPV-CAP-VN/346/467, AcNPV-CAP-VN/410, AcNPV-CAP-VN/410/467, AcNPV-CAP-VN/473, AcNPV-CAP-VN/473/467, AcNPV-CAP-VN/520, AcNPV-CAP-VN/520/467, AcNPV-CAP-CO/full, AcNPV-CAP-CO/full/467, AcNPV-CAP-CO/19, AcNPV-CAP-CO/19/467, AcNPV-CAP-CO/76, AcNPV-CAP-CO/76/467, AcNPV-CAP-CO/205, AcNPV-CAP-CO/205/467, AcNPV-CA39-HA1/Anhui, AcNPV-CA64-HA1/Anhui, AcNPV-CA39-PfCSP(A361E), AcNPV-CA64-PfCSP(A361E), AcNPV-CAP-CO/full/VSV, AcNPV-CAP-CO/19/VSV, AcNPV-CAP-CO/76/VSV, AcNPV-CAP-CO/205/VSV, AcNPV-Dual-Pfs25-PfCSP-gp64 и AcNPV-Dual-PfMSP1-PfCSP-gp64), используемого в качестве активного ингредиента вакцины (фармацевтической композиции) согласно настоящему изобретению, может быть выбрана из широкого диапазона в единицах количества экспрессируемой ДНК, вводимой хозяину, или количества транскрибируемой РНК. Такие количества также зависят от силы промоторов транскрипции и трансляции, используемых в векторах для переноса согласно изобретению.
Вакцину (фармацевтическую композиция) согласно настоящему изобретению вводят с помощью прямой инъекции суспензии рекомбинантных бакуловирусов, полученной в результате суспендирования рекомбинантных бакуловирусов в PBS (фосфатно-солевом буфере) или физиологическом растворе, в локальное место (например в ткань легкого, печень, мышцу или головной мозг), или посредством назальной или респираторной ингаляции или посредством внутрисосудистого (например, внутриартериального, внутривенного введения и введения в воротную вену), подкожного, внутрикожного или внутрибрюшинного введения. Вакцину согласно изобретению предпочтительно вводят с помощью респираторной ингаляции.
Вакцину (фармацевтическую композицию) согласно настоящему изобретению предпочтительно вводят более одного раза. Более конкретно, после начального введения предпочтительно осуществляют дополнительные вакцинации от одного до нескольких раз, наблюдая при этом за состоянием. Это может усилить требуемый эффект. После введения вакцины (фармацевтической композиции) может быть осуществлена бустер-иммунизация фармацевтической композицией, содержащей рекомбинантный бакуловирус согласно настоящему изобретению (любой из бакуловирусов AcNPV-CAP-PfCSP, AcNPV-CAP-PfCSP/272, AcNPV-CAP-PfCSP/467, AcNPV-CAP-PfCSP(A361E), AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)/272, AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)/467, AcNPV-CAP-PfCSP-76, AcNPV-CAP-PfCSP-76/467, AcNPV-CAP-PfCSP+209, AcNPV-CAP-PfCSP+209/467, AcNPV-CAP-PfCSP+76/209, AcNPV-CAP-PfCSP+76/209/467, AcNPV-CAP-HA1/Anhui, AcNPV-CAP-HA1/Anhui/272, AcNPV-CAP-HA1/Anhui/467, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/51, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/101, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/154, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/201, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/272, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/467, AcNPV-CAP-AH/345, AcNPV-CAP-AH/345/467, AcNPV-CAP-AH/410, AcNPV-CAP-AH/410/467, AcNPV-CAP-AH/473, AcNPV-CAP-AH/473/467, AcNPV-CAP-AH/520, AcNPV-CAP-AH/520/467, AcNPV-CAP-VN/346, AcNPV-CAP-VN/346/467, AcNPV-CAP-VN/410, AcNPV-CAP-VN/410/467, AcNPV-CAP-VN/473, AcNPV-CAP-VN/473/467, AcNPV-CAP-VN/520, AcNPV-CAP-VN/520/467, AcNPV-CAP-CO/full, AcNPV-CAP-CO/full/467, AcNPV-CAP-CO/19, AcNPV-CAP-CO/19/467, AcNPV-CAP-CO/76, AcNPV-CAP-CO/76/467, AcNPV-CAP-CO/205, AcNPV-CAP-CO/205/467, AcNPV-CA39-HA1/Anhui, AcNPV-CA64-HA1/Anhui, AcNPV-CA39-PfCSP(A361E), AcNPV-CA64-PfCSP(A361E), AcNPV-CAP-CO/full/VSV, AcNPV-CAP-CO/19/VSV, AcNPV-CAP-CO/76/VSV, AcNPV-CAP-CO/205/VSV, AcNPV-Dual-Pfs25-PfCSP-gp64 и AcNPV-Dual-PfMSP1-PfCSP-gp64). Кроме того, использование различных других лекарственных средств вместе с вакциной согласно изобретению, как указано выше, может усиливать терапевтический эффект, достигаемый при введении вакцины (фармацевтической композиции).
В одном варианте вакцины (фармацевтической композиции) согласно настоящему изобретению, рекомбинантный бакуловирус, используемый в качестве одного из активных ингредиентов вакцины (фармацевтической композиции) согласно изобретению, обычно получают в результате гомологичной рекомбинации бакуловирусной ДНК и вектора для переноса, в который был введен слитый ген, полученный слиянием чужеродного гена, обладающего требуемой иммуногенностью, и гена, кодирующего белок, который может быть компонентом вирусных частиц. Рекомбинантный бакуловирус смешивают в инъецированной дозированной форме (раствор, суспензия или эмульсия) с фармацевтически приемлемым носителем (т.е., нетоксичным для человека и других позвоночных в используемой дозе и концентрации и совместимым с другими ингредиентами в препарате), получая препарат. Предпочтительно полученный таким образом препарат не содержит окислителей или любого другого соединения, которые, как известно, являются опасными для рекомбинантного бакуловируса.
Носитель может содержать следовые количества добавок, таких как вещества, которые обеспечивают изотоничность и повышают химическую стабильность. Такие добавки являются нетоксичными для млекопитающих, включая человека, в применяемой дозе и концентрации, и примерами добавок являются буферы, такие как фосфорная кислота, лимонная кислота, янтарная кислота, уксусная кислота и другие органические кислоты и их соли; антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота; полипептиды с низкой молекулярной массой (например, менее чем примерно 10 остатков) (например, полиаргинин и трипептид) белки (например, сывороточный альбумин, желатин и иммуноглобулин); аминокислоты (например, глицин, глутаминовая кислота, аспарагиновая кислота и аргинин); моносахариды, дисахариды и другие углеводы (например, целлюлоза и ее производные, глюкоза, манноза и декстрин), хелатирующие агенты (например, EDTA); сахарные спирты (например, маннит и сорбит); противоионы (например, натрий); неионогенные поверхностно-активные вещества (например, полисорбат и полоксамер); и ПЭГ.
Фармацевтическую вакцину (композицию), содержащую рекомбинантный бакуловирус обычно можно хранить в виде водного раствора или лиофилизованного продукта в емкости для одной единичной дозы или множества доз, такой как запаянная ампула или флакон.
Настоящее изобретение, кроме того, относится к способу профилактики малярийной инфекции или инфекции гриппа или к способу лечения малярии или гриппа, включающему в себя введение субъекту эффективного количества рекомбинантного бакуловируса, вакцины, препарата и фармацевтической композиции согласно изобретению. Настоящее изобретение, кроме того, относится к способу иммуностимуляции, включающему в себя введение субъекту эффективного количества рекомбинантного бакуловируса, вакцины, препарата и фармацевтической композиции согласно изобретению. Примерами субъектов являются такие субъекты, которые могут быть инфицированы малярийными паразитами или вирусами гриппа, такие как человек и другие животные (такие как млекопитающие, птицы, рептилии, рыбы и земноводные), и субъекты, инфицированные малярийными паразитами или вирусами гриппа. Вирусом гриппа, которым инфицирован субъект, предпочтительно является вирус гриппа A и более предпочтительно вирус гриппа A подтипа H1, или вирус гриппа A подтипа H3. Примерами малярийных паразитов являются Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium malariae и Plasmodium ovale.
Рекомбинантный бакуловирус согласно настоящему изобретению отдельно или вместе с фармацевтически приемлемым носителем готовят в виде вакцины, препарата или фармацевтической композиции и вводят субъекту.
Путь введения может представлять собой, например, любой путь введения, указанный выше. Фармацевтически приемлемый носитель для применения в настоящем изобретении может быть соответствующим образом выбран из носителей, обычно используемых в данной области техники, в соответствии с формой получаемой фармацевтической композиции.
Например, когда фармакологическую композицию получают в водном растворе, в качестве носителя можно использовать очищенную воду (стерильную воду) или физиологический буферный раствор. Когда фармацевтическую композицию получают в виде других подходящих растворов, в качестве носителя можно использовать сложные органические эфиры, которые могут быть инъецированы, такие как гликоль, глицерин и оливковое масло. Композиция может содержать стабилизаторы, эксципиенты и тому подобные компоненты, обычно используемые в данной области техники, и в частности, в области приготовления вакцин.
Количество рекомбинантного бакуловируса в вакцине, препарате или фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению особым образом не ограничено и может быть соответствующим образом выбрано из широкого диапазона. В общем, количество рекомбинантного бакуловируса в композиции предпочтительно составляет примерно от 0,0002 до примерно 0,2 (% масс./об.) и более предпочтительно от 0,001 до 0,1 (% масс./об.). Способ введения рекомбинантного бакуловируса, вакцины, препарата или фармацевтической композиции согласно изобретению особым образом не ограничен и может быть соответствующим образом выбран в зависимости от формы дозирования, возраста, пола и состояния пациента, тяжести заболевания и т.д. Предпочтительной дозированной формой является форма для парентерального введении, такая как инъекции, капли, назальные капли и средства для ингаляции. Когда композицию готовят в виде инъекционного препарата или капель, инъекционный препарат можно вводить внутривенно в смеси с замещающей жидкостью, такой как раствор глюкозы или раствор аминокислот, которая необходима, или можно вводить внутримышечно, внутрикожно, подкожно или внутрибрюшинно.
Суточная доза рекомбинантного бакуловируса, вакцины, препарата или фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению может варьировать в зависимости от состояния субъекта, массы тела, возраста, пола и т.д., и поэтому не может быть точно указана. Однако обычно доза такова, чтобы обеспечить введение рекомбинантного бакуловируса в количестве от 0,001 до 100 мг на кг массы тела в сутки. Вакцину, препарат или композицию согласно изобретению можно вводить один раз в сутки или несколько раз в сутки.
Когда рекомбинантный бакуловирус вводят в качестве активного ингредиента вакцины (препарата или фармацевтической композиции) согласно настоящему изобретению, рекомбинантный бакуловирус вводят в количестве, соответствующем 102-1014 БОЕ, предпочтительно 105-1012 БОЕ и более предпочтительно 106-1010 БОЕ на пациента в единицах БОЕ рекомбинантного вируса.
Вакцину (композицию) согласно настоящему изобретению вводят согласно надлежащей медицинской практике, учитывая клиническое состояние (например, состояние, подвергаемое профилактике или лечению) каждого пациента, место доставки вакцины (композиции), содержащей рекомбинантный бакуловирус, ткань-мишень, способ введения, схему дозирования и другие факторы, общеизвестные специалистам в данной области. Поэтому, точную дозу вакцины (композиции) в данном случае определяют, учитывая указанные выше факторы.
ПРИМЕРЫ
Настоящее изобретение будет описано ниже более подробно со ссылкой на примеры. Приведенные примеры являются только иллюстрациями настоящего изобретения и не ограничивают настоящее изобретение.
Пример 1: Плазмидный вектор для переноса и способ его получения согласно настоящему изобретению
(1) Конструирование плазмидных векторов для переноса pCAP-PfCSP, pCAP-PfCSP/272 и pCAP-PfCSP/467 согласно настоящему изобретению
(1.1) Конструирование плазмиды pBACsurf-Hsp65
Ген Hsp65 получали посредством экстракции геномной ДНК из штамма M. tuberculosis H37Rv с использованием набора QIAamp DNA Midi (Qiagen) и клонирования с помощью ПЦР. Более конкретно, геномную ДНК, экстрагированную из штамма M. tuberculosis H37Rv, амплифицировали в ПЦР, используя праймеры phsp65-F1 (5'-AATAATAGATCTAATGGCCAAGACAATTGCGTACGACGAAGA-3' (SEQ ID NO: 1); сайт BglII подчеркнут) и phsp65-R1 (5'-AATCCAATGCGGCCGCGGGAATTCGATTCCTGCAGGTCAGAAATCCATGCCACCCATGTCGCC-3' (SEQ ID NO: 2); сайт NotI подчеркнут). Продукт ПЦР очищали, расщепляли ферментами рестрикции BglII и NotI, лигировали в pcDNA3.1(+) (Invitrogen), расщепленную BamHI и NotI. Полученная плазмида названа pcDNA-hsp65. ПЦР осуществляли, используя pcDNA-hsp65 в качестве матрицы и используя праймеры phsp65-F2 (5'-CACCCCTGCAGGACTACAAGGACGACGATGACAAGGAATTCATGGCCAAGACAATTGCGTACGACGAAGAGGCC-3' (SEQ ID NO: 3); сайты Sse8387I и EcoRI подчеркнуты, и последовательность FLAG показана курсивом), и phsp65-R2 (5'-CCCGGGCGAAATCCATGCCACCCATGTCGCCGCCACC-3' (SEQ ID NO: 4); сайт Cfr9I подчеркнут). Полученный фрагмент ДНК гена Hsp65 клонировали в pENTR/D-TOPO (из Invitrogen), затем расщепляли Sse8387I/Cfr9I и встраивали в PstI/Cfr9I-сайт pBACsurf-CSP (Yoshida et al., Virology 316: 161-70, 2003). Сконструированная таким образом плазмида названа pBACsurf-Hsp65.
(1.2) Конструирование плазмиды pENTR-gp64
ПЦР осуществляли, используя pBACsurf-1 (из Novagen) в качестве матрицы и используя праймеры pPolh-F2 (5'-CACCCGGACCGGATAATTAAAATGATAACCATCTCGCAAATAAATAAG-3' (SEQ ID NO: 5); сайт RsrII подчеркнут), и pgp64-R2 (5'-GGTACCATATTGTCTATTACGGTTTCTAATCATAC-3' (SEQ ID NO: 6); сайт KpnI подчеркнут). Полученный фрагмент ДНК гена gp64 встраивали в pENTR/D-TOPO, получая плазмиду pENTR-gp64. Сконструированная таким образом плазмида названа pENTR-gp64.
(1.3) Конструирование вектора для переноса pDual-Hsp65-gp64 согласно настоящему изобретению
pBACsurf-Hsp65 расщепляли PstI/Cfr9I и фрагмент ДНК гена hsp65 встраивали в PstI/Cfr9I-сайт pENTR-gp64, получая плазмиду pENTR-Hsp65-gp64. pENTR-Hsp65-gp64 расщепляли RsrII/KpnI и фрагмент ДНК, состоящий из промотора полиэдрина и гена hsp65-gp64, встраивали в pTriEx-3.1 (Novagen), расщепленный RsrII и KpnI, получая плазмидный вектор для переноса pDual-Hsp65-gp64, способный экспрессировать слитый белок, состоящий из антигена Hsp65 и белка gp64, в клетках млекопитающих и насекомых под контролем требуемого двойного промотора, состоящего из промотора CMA промотор и промотора полиэдрина.
(1.4) Конструирование вектора для переноса pDual-H1N1/HA1-gp64 согласно настоящему изобретению
РНК экстрагировали из надосадка культуры клеток MDCK, инфицированных штаммом вируса гриппа PR/8/34, используя набор QIAamp MinElute Virus Spin (из Qiagen), и амплифицировали в ОТ-ПЦР, используя праймеры HA-f (5'-CCTGCAGGTATGAAGGCAAACCTACTGGTC-3' (SEQ ID NO: 7); сайт SbfI подчеркнут) и HA-r (5'-GCCCGGGCGATGCATATTCTGCA-3' (SEQ ID NO: 8); сайт SbfI подчеркнут). Полученный фрагмент гена HA вируса гриппа клонировали в pCR-Blunt II-TOPO (из Invitrogen). Полученная плазмида названа pCR-Blunt-HA. ПЦР осуществляли, используя pCR-Blunt-HA в качестве матрицы и используя праймеры pHA-F1 (5'-CACCGAATTCGACACAATATGTATAGGCTACCATGCG-3' (SEQ ID NO: 9); сайт EcoRI подчеркнут) и pHA-R1 (5'-CCCGGGCACCTCTGGATTGGATGGACGGAATG-3' (SEQ ID NO: 10); сайт Cfr9I подчеркнут). Полученный фрагмент ДНК гена H1N1/HA1 клонировали в pENTR/D-TOPO, затем расщепляли EcoRI/Cfr9I и встраивали в EcoRI/Cfr9I-сайт pDual-Hsp65-gp64, конструируя таким образом плазмиду pDual-H1N1/HA1-gp64.
(1.5) Конструирование плазмиды pBACsurf-HA1
pDual-H1N1/HA1-gp64 расщепляли EcoRI/CfrI и Фрагмент ДНК гена H1N1/HA1 встраивали в pBACsurf-Hsp65, расщепленный EcoRI и CfrI, конструируя таким образом плазмиду pBACsurf-HA1.
(1.6) Конструирование плазмиды pCP-H1N1/HA1-gp64
ПЦР осуществляли, используя pBACsurf-HA1 в качестве матрицы и используя Polh-f RsrII (5'-GGGCGGACCGGATAATTAAAATGATAACCATCTCG -3' (SEQ ID NO: 11); сайт RsrII подчеркнут) и GP64-r DraIII (5'- GGGCACTTAGTGATATTGTCTATTACGGTTTCTAATC-3' (SEQ ID NO: 12); сайт DraIII подчеркнут). Полученный фрагмент ДНК встраивали в pDual-H1N1/HA1-gp64, расщепленный RsrII и DraIII, получая pCP-H1N1/HA1-gp64.
(1.7) Конструирование плазмиды pCAP-H1N1/HA1-gp64
pCP-H1N1/HA1-gp64 расщепляли ферментами рестрикции RsrII и DraIII, получая фрагменты гена HA1 и gp64. Фрагменты встраивали в вектор, полученный расщеплением pTriEx-1.1 (из Novagen) ферментами рестрикции RsrII и DraIII, получая плазмидный вектор для переноса pCAP-H1N1/HA1-gp64, способный экспрессировать слитый белок, состоящий из антигена HA1 и белка gp64, в клетках млекопитающих и насекомых под контролем требуемого двойного промотора, состоящего из промотора CAG и промотора полиэдрина.
(1.8) Конструирование плазмиды pCAP-H1N1/NP-gp64
ОТ-ПЦР осуществляли, используя геномную РНК вируса гриппа штамма PR/8/34 в качестве матрицы и используя NP-f EcoRI (5'-ACGGAATTCCATTCAATTCAAACTGGA-3' (SEQ ID NO: 13); сайт EcoRI подчеркнут) и NP-r Cfr9I (5'-GATCCCGGGCCTTGTCAATGCTGAATGGCAA-3' (SEQ ID NO: 14); сайт Cfr9I подчеркнут). Полученные фрагменты расщепляли ферментами рестрикции EcoRI и Cfr9I и встраивали в pCAP-H1N1/HA1-gp64, расщепленный ферментами рестрикции EcoRI и Cfr9I, получая pCAP-H1N1/NP-gp64.
(1.9) Конструирование плазмид pCAP-H1N1/NP/272 и pCAP-H1N1/NP/467
ПЦР осуществляли, используя gp64(272)-f (5'-GACTCCCCGGGTCGAGCACCGAGTCAAGAAG-3' (SEQ ID NO: 15); сайт XmaI подчеркнут), gp64(467)-f (5'-GACTCCCCGGGACATCACTTCCATGGCTGAA-3' (SEQ ID NO: 16); сайт XmaI подчеркнут), и GP64-r DraIII (5'-GGGCACTTAGTGATATTGTCTATTACGGTTTCTAATC-3' (SEQ ID NO: 12); сайт DraIII подчеркнут) pCAP-H1N1/HA1-gp64. Полученные фрагменты расщепляли ферментами рестрикции XmaI и DraIII и встраивали в pCAP-H1N1/NP-gp64, расщепленный XmaI и DraIII, получая pCAP-H1N1/NP/272 и pCAP-H1N1/NP/467.
(1.10) Конструкция векторов для переноса pCAP-PfCSP, cCAP-PfCSP/272 и pCAP-PfCSP/467 согласно настоящему изобретению
Геномную ДНК P. falciparum экстрагировали их эритроцитов человека, инфицированных штаммом Plasmodium falciparum 3D7, используя набор QIAamp DNA Midi (из Qiagen). Ген PfCSP клонировали с помощью ПЦР, используя указанную геномную ДНК в качестве матрицы, согласно следующему способу. ПЦР осуществляли, используя праймеры PfCSP-f(19)(5'-GACTCTGCAGTTATTCCAGGAATACCAGTGCTATGGAAG-3' (SEQ ID NO: 17); сайт PstI подчеркнут) и PfCSP-r(373)(5'-CGATCCCGGGCTTTTTCCATTTTACAAATTTTTTTTTCAATATC-3' (SEQ ID NO: 18); сайт XmaI подчеркнут). Полученный фрагмент ДНК встраивали в pCAP-H1N1/NP-gp64, pCAP-H1N1/NP/272 и pCAP-H1N1/NP/467, каждая из которых была расщеплена PstI и XmaI. Сконструированные плазмиды названы pCAP-PfCSP, pCAP-PfCSP/272 и pCAP-PfCSP/467.
Аминокислотная последовательность белка циркумпорозоита (CS) Plasmodium falciparum 3D7 имеет номер доступа в GenBank XP_001351122.
(2) Конструирование вектора для переноса pDual-Pfs25-PfCSP-gp64 согласно настоящему изобретению
(2.1) Конструирование плазмиды pDual-PbAMA1D123-gp64
Образец крови брали у мыши BALB/c, инфицированной малярийным паразитом P. berghei штамма ANKA, и геномную ДНК P. berghei экстрагировали, используя набор QIAamp DNA Midi (Qiagen). Домен 123 (D123) гена PbAMA1 клонировали в ПЦР, используя полученную геномную ДНК в качестве матрицы, согласно следующему способу. ПЦР осуществляли, используя праймеры pAMA-F1 (5'-CACCGAATTCAATCCATGGGAAAAGTATACGGAAAAATAT-3' (SEQ ID NO: 19); сайт EcoRI подчеркнут) и pAMA1-R1 (5'-CCCGGGCTTCTCTGGTTTGATGGGCTTTCATATGCAC-3' (SEQ ID NO: 20); сайт Cfr9I подчеркнут). Полученный фрагмент ДНК PbAMA1D123 клонировали в pENTR/D-TOPO, затем расщепляли EcoRI/Cfr9I и встраивали в pBACsurf-Hsp65, расщепленную EcoRI и Cfr9I. Сконструированная плазмида названа pBACsurf-PbAMA1D123.
Затем pBACsurf-PbAMA1D123 расщепляли EcoRI/Cfr9I и фрагмент ДНК гена PbAMA1D123 встраивали в pDual-Hsp65-gp64, расщепленную EcoRI и Cfr9I, получая плазмиду pDual-PbAMA1D123-gp64.
(2.2) Конструирование плазмиды pDual-PfCSP-gp64
Ген PfCSP клонировали с помощью ПЦР, используя геномную ДНК P. falciparum в качестве матрицы, согласно следующему способу. ПЦР осуществляли, используя праймеры pPfCSP-F1 (5'-CACCGAATTCTTATTCCAGGAATACCAGTGCTATGGAAGT-3' (SEQ ID NO: 21); сайт EcoRI подчеркнут) и pPfCSP-R1 (5'-CCCGGGCTTTTTCCATTTTACAAATTTTTTTTTC-3' (SEQ ID NO: 22); сайт Cfr9I подчеркнут). Полученный фрагмент ДНК PfCSP клонировали в pENTR/D-TOPO, затем расщепляли EcoRI/Cfr9I и встраивали в pDual-PbAMA1D123-gp64, расщепленную EcoRI и Cfr9I. Сконструированная плазмида названа pDual-PfCSP-gp64.
(2.3) Конструирование вектора для переноса pDual-Pfs25-PfCSP-gp64 согласно настоящему изобретению
Ген Pfs25 клонировали с помощью ПЦР, используя геномную ДНК P. falciparum в качестве матрицы согласно следующему способу. ПЦР осуществляли, используя праймеры pPfs25-F1 (5'-CACCGAATTCAAAGTTACCGTGGATACTGTATGCAAAAGAGGA-3' (SEQ ID NO: 23); сайт EcoRI подчеркнут) и pPfs25-R2 (5'-CAATTGAGATCCGCCGCCACCGCCACCAGTACATATAGAGCTTTCATTATCTATTATAAATCCATC-3' (SEQ ID NO: 24); сайт MunI подчеркнут). Полученный фрагмент ДНК Pfs25 клонировали в pENTR/D-TOPO, затем расщепляли EcoRI/MunI и встраивали в pDual-PfCSP-gp64, расщепленный EcoRI. Сконструированная плазмида названа pDual-Pfs25-PfCSP-gp64.
(3) Конструирование плазмиды для переноса pDual-PfMSP1-PfCSP-gp64 согласно настоящему изобретению
Ген PfMSP1 клонировали в ПЦР, используя геномную ДНК P. falciparum в качестве матрицы согласно следующему способу. ПЦР осуществляли, используя праймеры pPfMSP119-F1 (5'-CACCGAATTCAACATTTCACAACACCAATGCGTAAAAAAAC-3': (SEQ ID NO: 25); сайт EcoRI подчеркнут) и pPfMSP119-R2 (5'-CAATTGAGATCCGCCGCCACCGCCACCGTTAGAGGAACTGCAGAAAATACCATCGAAAAGTGGA-3' (SEQ ID NO: 26); сайт MunI подчеркнут). Полученный фрагмент ДНК PfMSP119 клонировали в pENTR/D-TOPO, затем расщепляли EcoRI и MunI и встраивали в pDual-PbCSP-gp64, расщепленную EcoRI. Сконструированная плазмида названа pDual-PfMSP1-PfCSP-gp64.
(4) Конструирование плазмидных векторов для переноса pCAP-PfCSP(A361E), pCAP-PfCSP(A361E)/272 и pCAP-PfCSP(A361E)/467 согласно настоящему изобретению
ПЦР осуществляли с использованием pCAP-PfCSP и PfCSP-f(19)(5'-GACTCTGCAGTTATTCCAGGAATACCAGTGCTATGGAAG-3': (SEQ ID NO: 17); сайт PstI подчеркнут) и PfCSP-r(373 A361E) (5'-CGATCCCGGGCTTTTTCCATTTTACAAATTTTTTTTTCAATATCATTTTC-3': (SEQ ID NO: 27); сайт XmaI подчеркнут). Полученный фрагмент ДНК расщепляли PstI и XmaI и встраивали в pCAP-H1N1/NP-gp64, pCAP-H1N1/NP/272 и pCAP-H1N1/NP/467, каждая из которых была расщеплена PstI и XmaI. Сконструированные плазмиды названы pCAP-PfCSP(A361E), pCAP-PfCSP(A361E)/272 и pCAP-PfCSP(A361E)/467.
(5) Конструирование плазмид для переноса pCAP-PfCSP-76 и pCAP-PfCSP-76/467 согласно настоящему изобретению
ПЦР осуществляли с использованием pCAP-PfCSP(A361E) и PfCSP-f(76) (5'-GACTCTGCAGGATGATGGAAATAACGAAGACAACG-3': (SEQ ID NO: 28); сайт PstI подчеркнут) и PfCSP-r(373 A361E) (5'-CGATCCCGGGCTTTTTCCATTTTACAAATTTTTTTTTCAATATCATTTTC-3': (SEQ ID NO: 27); сайт XmaI подчеркнут). Полученный фрагмент ДНК расщепляли PstI и XmaI и затем встраивали в pCAP-H1N1/NP-gp64 и pCAP-H1N1/NP/467, каждая из которых была расщеплена PstI и XmaI. Сконструированные плазмиды были названы pCAP-PfCSP-76 и pCAP-PfCSP-76/467.
(6) Конструирование плазмид для переноса pCAP-PfCSP+209 и pCAP-PfCSP+209/467
Искусственную последовательность гена (PfCSP+: SEQ ID NO: 29) получали на основе аминокислотной последовательности PfCSP P. falciparum штамма 3D7 (в которой однако A в положении 361 была заменена на E), используя кодоны, часто используемые в клетках Sf9 и в клетках человека. Используя полученную искусственную последовательность гена в качестве матрицы, осуществляли ПЦР, используя PfCSP-f(+209) (5'-GACTCTGCAGAACGCTAATCCAAACGCTAATCCCAACGCTAATCCCAATGCC-3' (SEQ ID NO: 30); сайт PstI подчеркнут) и PfCSP-r(+A361E) (5'-CGATCCCGGGCTTTTTCCATTTTGCAAATTTTTTT-3' (SEQ ID NO: 31); сайт XmaI подчеркнут). Полученный фрагменты ДНК расщепляли PstI и XmaII и затем встраивали в pCAP-H1N1/NP-gp64 и pCAP-H1N1/NP/467, расщепленные PstI и XmaII. Сконструированные плазмиды были названы pCAP-PfCSP+209 и pCAP-PfCSP+209/467.
(7) Конструирование плазмид для переноса pCAP-PfCSP+76/209 и pCAP-PfCSP+76/209/467 согласно настоящему изобретению
Используя искусственную последовательность гена (PfCSP+: SEQ ID NO: 29) в качестве матрицы, осуществляли ПЦР с использованием PfCSP-f(+76) (5'-GACTCTGCAGGACGACGGCAACAACGAAGACAACG-3' (SEQ ID NO: 32); сайт PstI подчеркнут), PfCSP-r(+128) (5'-CGTTAGGATCCACATTTGGGTTGGCATTTGGG-3' (SEQ ID NO: 33); сайт BamHI подчеркнут), PfCSP-f (+209) BamHI (5'-GACTGGATCCTAACGCTAATCCAAACGCTAATCCC-3':(SEQ ID NO: 34); сайт BamHI подчеркнут), и PfCSP-r(+A361E) (5'-CGATCCCGGGCTTTTTCCATTTTGCAAATTTTTTT-3' (SEQ ID NO: 31); сайт XmaI подчеркнут) с полученной искусственной последовательности гена. Полученные фрагменты ДНК расщепляли PstI/BamHI и BamHI/XmaI, соответственно и затем встраивали в pCAP-H1N1/NP-gp64 и pCAP-H1N1/NP/467, каждая из которых была расщеплена PstI и XmaI. Сконструированные плазмиды были названы pCAP-PfCSP+76/209 и pCAP-PfCSP+76/209/467.
(8) Конструирование плазмид для переноса pCAP-HA1/Anhui, pCAP-HA1/Anhui/272 и pCAP-HA1/Anhui/467
Искусственную последовательность гена (SEQ ID NO: 35) получали на основе аминокислотной последовательности области гемагглютинина HA1 вируса гриппа H5N1/Anhui/1/05, используя кодоны, часто используемые в клетках Sf9 и в клетках человека. Используя полученную искусственную последовательность гена в качестве матрицы, осуществляли ПЦР с использованием AH-F1 (5'-CAGTCTGCAGGACCAGATTTGCATC-3': (SEQ ID NO: 36); сайт PstI подчеркнут) и AH-R4 (5'-CAGTCCCGGGCTCTCTTGCGCCTGC-3': (SEQ ID NO: 37); сайт XmaI подчеркнут). Полученный фрагмент ДНК расщепляли PstI и XmaI и затем встраивали в pCAP-H1N1/NP-gp64, pCAP-H1N1/NP/272 и pCAP-H1N1/NP/467, каждая из которых была расщеплена PstI и XmaI. Сконструированные плазмиды были названы pCAP-HA1/Anhui, pCAP-HA1/Anhui/272 и pCAP-HA1/Anhui/467.
Аминокислотная последовательность гемагглютинина вируса гриппа A/H5N1/Anhui/1/05 имеет номер доступа в GenBank ABD28180.
(9) Конструирование плазмидных векторов для переноса pCAP-HA1/Vietnam, pCAP-HA1/Vietnam/51, pCAP-HA1/Vietnam/101, pCAP-HA1/Vietnam/154, pCAP-HA1/Vietnam/201, pCAP-HA1/Vietnam/272 и pCAP-HA1/Vietnam /467 согласно настоящему изобретению
Искусственную последовательность гена (SEQ ID NO: 38) получали на основе аминокислотной последовательности области HA1 гемагглютинина вируса гриппа H5N1/Vietnam/1203/4, используя кодоны, часто используемые в клетках Sf9 и в клетках человека. Используя полученную искусственную последовательность гена в качестве матрицы, осуществляли ПЦР с использованием VN-F1 (5'-CAGTCTGCAGGACCAGATCTGTATC-3': (SEQ ID NO: 39); сайт PstI подчеркнут) и VN-R4 (5'-CAGTCCCGGGCTCTCTTCTTCCTGC-3': (SEQ ID NO: 40); сайт XmaI подчеркнут). Полученный фрагмент ДНК расщепляли PstI и XmaI и встраивали в pCAP-H1N1/NP-gp64, pCAP-H1N1/NP/272 и pCAP-H1N1/NP/467, каждая из которых была расщеплена PstI и XmaI. Сконструированные плазмиды были названы pCAP-HA1/Vietnam, pCAP-HA1/Vietnam/272 и pCAP-HA1/Vietnam/467.
Кроме того, используя pCAP-HA1/Vietnam в качестве матрицы, осуществляли ПЦР с использованием gp64(51)-f (5'-GACTCCCCGGGTGGAAATCACCATCGTGGAGACG-3': (SEQ ID NO: 41); сайт XmaI подчеркнут) или gp64(101)-f (5'-GACTCCCCGGGATTTGCTTATGTGGAGCATCAGG-3': (SEQ ID NO: 42); сайт XmaI подчеркнут) или gp64(154)-f (5'-GACTCCCCGGGCGCACCACACGTGCAACAAATCG-3': (SEQ ID NO: 43); сайт XmaI подчеркнут), или gp64(201)-f (5'-GACTCCCCGGGACACTGTGCTTCATCGAGACGGC-3': (SEQ ID NO: 44); сайт XmaI подчеркнут) и GP64-r DraIII (5'-GGGCACTTAGTGATATTGTCTATTACGGTTTCTAATC-3' (SEQ ID NO: 12); сайт DraIII подчеркнут). Полученный фрагменты ДНК расщепляли XmaI и DraIII и встраивали в pCAP-HA1/Vietnam, расщепленную XmaI и DraIII. Сконструированные плазмиды были названы pCAP-HA1/Vietnam/51, pCAP-HA1/Vietnam/101, pCAP-HA1/Vietnam/154 и pCAP-HA1/Vietnam/201.
Аминокислотная последовательность гемагглютинина вируса гриппа A/H5N1/Vietnam/1203/2004 имеет номер доступа в GenBank AAW80717.
(10) Конструирование плазмидных векторов для переноса pCAP-AH/345, pCAP-AH/345/467, pCAP-AH/410, pCAP-AH/410/467, pCAP-AH/473, pCAP-AH/473/467, pCAP-AH/520, pCAP-AH/520/467 согласно настоящему изобретению
Искусственную последовательность гена (SEQ ID NO: 45) получали на основе аминокислотной последовательности область гемагглютинина HA вируса гриппа A/H5N1/Anhui/1/05, оптимизируя кодоны с использованием программы Gene Designer, доступной из DNA2.0, Inc. Используя такую искусственную последовательность в качестве матрицы, осуществляли ПЦР с использованием AH17-F (5'-GACTCTGCAGGATCAGATCTGTATTGGGTACC-3':(SEQ ID NO: 46); сайт PstI подчеркнут, и AH345-R (5'-CGATCCCGGGCTCTCTTTCTCCTCCGCTCGC-3': (SEQ ID NO: 47); сайт XmaI подчеркнут), или AH410-R (5'-CGATCCCGGGCGGCCTCGAACTGGGTGTTCATT-3': (SEQ ID NO: 48); сайт XmaI подчеркнут), или AH473-R (5'-CGATCCCGGGCGTCTCTGAGTTGAAGGCGCAC-3':(SEQ ID NO: 49); сайт XmaI подчеркнут, или AH520-R (5'-CGATCCCGGGCACCACTAATTTCCTCTCGCTTC-3':(SEQ ID NO: 50); сайт XmaI подчеркнут). Полученный фрагмент ДНК расщепляли PstI и XmaI и встраивали в pCAP-HA1/Anhui или pCAP-HA1/Anhui/467, расщепленные PstI и XmaI. Сконструированные плазмиды были названы pCAP-AH/345, pCAP-AH/345/467, pCAP-AH/410, pCAP-AH/410/467, pCAP-AH/473, pCAP-AH/473/467, pCAP-AH/520 и pCAP-AH/520/467.
(11) Конструирование плазмидных векторов для переноса pCAP-VN/346, pCAP-VN/346/467, pCAP-VN/410, pCAP-VN/410/467, pCAP-VN/473, pCAP-VN/473/467, pCAP-VN/520 и pCAP-VN/520/467 согласно настоящему изобретению
Искусственную последовательность гена (SEQ ID NO: 51) получали на основе аминокислотной последовательности области гемагглютинина HA вируса гриппа A/H5N1/Vietnam/1203/2004, оптимизируя кодоны с использованием программы Gene Designer, доступной из DNA2.0, Inc. Используя такую искусственную последовательность в качестве матрицы, осуществляли ПЦР с использованием VN17-F (5'-GACTCTGCAGGATCAGATCTGTATCGGATATC-3': (SEQ ID NO: 52); сайт PstI подчеркнут) и VN346-R (5'-CGATCCCGGGCCCGCTTTTTCCTCCTCCGTTCG-3': (SEQ ID NO: 53); сайт XmaI подчеркнут), или VN410-R (5'-CGATCCCGGGCCTCAAACTGCGTATTCATTTTG-3': (SEQ ID NO: 54); сайт XmaI подчеркнут), или VN473-R (5'-CGATCCCGGGCTCTAAGCTGGAGCCTGACTTTGTC-3': (SEQ ID NO: 55); сайт XmaI подчеркнут), или VN520-R (5'-CGATCCCGGGCACTAATCTCCTCTCTTTTAAGTC-3': (SEQ ID NO: 56); сайт XmaI подчеркнут). Полученный фрагмент ДНК расщепляли PstI и XmaI и встраивали в pCAP-HA1/Anhui или pCAP-HA1/Anhui/467, расщепленные PstI и XmaI. Сконструированные плазмиды были названы pCAP-VN/346, pCAP-VN/346/467, pCAP-VN/410, pCAP-VN/410/467, pCAP-VN/473, pCAP-VN/473/467, pCAP-VN/520 и pCAP-VN/520/467.
(12) Конструирование плазмидных векторов для переноса pCAP-CO/full, pCAP-CO/full/467, pCAP-CO/19, pCAP-CO/19/467, pCAP-CO/76, pCAP-CO/76/467, pCAP-CO/205 и pCAP-CO/205/467 согласно настоящему изобретению
Искусственную последовательность гена (SEQ ID NO: 57) получали на основе аминокислотной последовательности CSP штамма Plasmodium falciparum 3D7, оптимизируя кодоны с использованием программы Gene Designer, доступной из DNA2.0, Inc. Используя такую искусственную последовательность в качестве матрицы, осуществляли ПЦР с использованием пары праймеров, состоящей из PfCSP_opt-f (5'-GACTCTGCAGATGATGCGAAAATTGGCCATACTG-3': (SEQ ID NO: 58); сайт PstI подчеркнут) и PfCSP_opt-r (397) (5'-CGATCCCGGGCATTGAGGAACAGAAAGGAAAGAACCATG-3': (SEQ ID NO: 59); сайт XmaI подчеркнут); PfCSP_opt-f (19) (5'-GACTCTGCAGCTGTTTCAGGAATACCAGTGCTATGG-3': (SEQ ID NO: 60); (сайт PstI подчеркнут) и PfCSP_opt-r (373) (5'-CGATCCCGGGCCTTCTCCATCTTACAAATTTTCTTTTCAATATCATTAGC-3': (SEQ ID NO: 61); сайт XmaI подчеркнут); PfCSP_opt-f (76) (5'-GACTCTGCAGGACGACGGAAATAATGAGGACAACG-3': (SEQ ID NO: 62); сайт PstI подчеркнут) и PfCSP_opt-r (373) (5'-CGATCCCGGGCCTTCTCCATCTTACAAATTTTCTTTTCAATATCATTAGC-3': (SEQ ID NO: 61); сайт XmaI подчеркнут); и PfCSP_opt-f (205) (5'-GACTCTGCAGAATGCAAACCCAAATGCCAATCCAAACGC-3': (SEQ ID NO: 63); сайт PstI подчеркнут) и PfCSP_opt-r (373) (5'-CGATCCCGGGCCTTCTCCATCTTACAAATTTTCTTTTCAATATCATTAGC-3': (SEQ ID NO: 61); сайт XmaI подчеркнут). Полученные фрагменты ДНК расщепляли PstI и XmaI и встраивали в pCAP-HA1/Anhui или pCAP-HA1/Anhui/467, расщепленные PstI и XmaI. Сконструированные плазмиды были названы pCAP-CO/full, pCAP-CO/full/467, pCAP-CO/19, pCAP-CO/19/467, pCAP-CO/76, pCAP-CO/76/467, pCAP-CO/205 и pCAP-CO/205/467.
(13) Конструирование плазмидных векторов для переноса pCA64-HA1/Anhui и pCA64-PfCSP(A361E) согласно настоящему изобретению
Используя ДНК Triple Cut BacVector-2000 (из Novagen), осуществляли ПЦР с использованием gp64-p-f (5'-GACTCGGACCGGCCAGATAAAAATAATCTTATCAATTAAG-3': (SEQ ID NO: 64); сайт RsrII подчеркнут) и gp64-p-r (5'-CGATACTAGTAGCACTGAGGCTTCTTATATACCCG-3': (SEQ ID NO: 65); сайт SpeI подчеркнут). Полученный фрагмент ДНК расщепляли RsrII и SpeI и встраивали в pCAP-HA1/Anhui или pCAP-PfCSP(A361E), расщепленные RsrII и SpeI, конструируя таким образом плазмидные векторы для переноса pCA64-HA1/Anhui и pCA64-PfCSP(A361E), способные экспрессировать слитый белок, состоящий из антигена HA1 или антигена PfCSP и белка gp64, в клетках млекопитающих и насекомых под контролем требуемого двойного промотора, состоящего из промотора CAG и промотора gp64.
(14) Конструирование плазмидных векторов для переноса pCA39-HA1/Anhui и pCA39-PfCSP(A361E) согласно настоящему изобретению
Используя ДНК Triple Cut BacVector-2000 (из Novagen), осуществляли ПЦР с использованием vp39-p-f (5'-GACTCGGACCGCGTCGTACAAATCGAAATATTGTTGTG-3':(SEQ ID NO: 66); сайт RsrII подчеркнут) и vp39-p-r (5'-CGATACTAGTGTGATTGAGAAAGAAATCTCTTATTC-3': (SEQ ID NO: 67); сайт SpeI подчеркнут). Полученный фрагмент ДНК расщепляли RsrII и SpeI и встраивали в pCAP-HA1/Anhui или pCAP-PfCSP(A361E), расщепленные RsrII и SpeI, конструируя таким образом плазмидные векторы для переноса pCA39-HA1/Anhui и pCA39-PfCSP(A361E), способные экспрессировать слитый белок, состоящий из антигена HA1 или антигена PfCSP и белка gp64, в клетках млекопитающих и насекомых под контролем требуемого двойного промотора, состоящего из промотора CAG и промотора vp39.
(15) pCAP-CO/full/VSV, pCAP-CO/19/VSV, pCAP-CO/76/VSV и pCAP-CO/205/VSV согласно настоящему изобретению
Используя pVSV-G (из Clonetech) в качестве матрицы, осуществляли ПЦР с использованием VSV-G-f (5'-GACTCCCCGGGCGTTCGAACATCCTCACATTCAAG-3' (SEQ ID NO: 68); сайт XmaI подчеркнут), VSV-G-r (5'-GACTCACTTAGTGCTTTCCAAGTCGGTTCATCTC-3': (SEQ ID NO: 69); сайт DraIII подчеркнут). Полученный фрагмент ДНК встраивали в pCAP-CO/full, pCAP-CO/19, pCAP-CO/76 и pCAP-CO/205, каждая из которых была расщеплена XmaI и DraIII. Сконструированные плазмиды были названы pCAP-CO/full/VSV, pCAP-CO/19/VSV, pCAP-CO/76/VSV и pCAP-CO/205/VSV.
Пример 2: Рекомбинантные бакуловирусы согласно настоящему изобретению и способ их получения
(1) Рекомбинантные бакуловирусы получали, используя набор для получения рекомбинантных бакуловирусов (набор для трансфекции BacVector-2000 из Novagen), посредством котрансфекции в клетки Sf9 ДНК BacVector-2000 с каждым из следующих векторов для переноса, сконструированных, как описано в примере 1: pCAP-PfCSP, pCAP-PfCSP/272, pCAP-PfCSP/467, pCAP-PfCSP(A361E), pCAP-PfCSP(A361E)/272, pCAP-PfCSP(A361E)/467, pCAP-PfCSP-76, pCAP-PfCSP-76/467, pCAP-PfCSP+209, pCAP-PfCSP+209/467, pCAP-PfCSP+76/209, pCAP-PfCSP+76/209/467, pCAP-HA1/Anhui, pCAP-HA1/Anhui/272, pCAP-HA1/Anhui/467, pCAP-HA1/Vietnam, pCAP-HA1/Vietnam/51, pCAP-HA1/Vietnam/101, pCAP-HA1/Vietnam/154, pCAP-HA1/Vietnam/201, pCAP-HA1/Vietnam/272, pCAP-HA1/Vietnam/467, pCAP-AH/345, pCAP-AH/345/467, pCAP-AH/410, pCAP-AH/410/467, pCAP-AH/473, pCAP-AH/473/467, pCAP-AH/520, pCAP-AH/520/467, pCAP-VN/346, pCAP-VN/346/467, pCAP-VN/410, pCAP-VN/410/467, pCAP-VN/473, pCAP-VN/473/467, pCAP-VN/520, pCAP-VN/520/467, pCAP-CO/full, pCAP-CO/full/467, pCAP-CO/19, pCAP-CO/19/467, pCAP-CO/76, pCAP-CO/76/467, pCAP-CO/205, pCAP-CO/205/467, pCA39-HA1/Anhui, pCA64-HA1/Anhui, pCA39-PfCSP(A361E), pCA64-PfCSP(A361E), pCAP-CO/full/VSV, pCAP-CO/19/VSV, pCAP-CO/76/VSV, pCAP-CO/205/VSV, pDual-Pfs25-PfCSP-gp64, pDual-PfMSP1-PfCSP-gp64. Полученные рекомбинантные бакуловирусы были названы AcNPV-CAP-PfCSP, AcNPV-CAP-PfCSP/272, AcNPV-CAP-PfCSP/467, AcNPV-CAP-PfCSP(A361E), AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)/272, AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)/467, AcNPV-CAP-PfCSP-76, AcNPV-CAP-PfCSP-76/467, AcNPV-CAP-PfCSP+209, AcNPV-CAP-PfCSP+209/467, AcNPV-CAP-PfCSP+76/209, AcNPV-CAP-PfCSP+76/209/467, AcNPV-CAP-HA1/Anhui, AcNPV-CAP-HA1/Anhui/272, AcNPV-CAP-HA1/Anhui/467, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/51, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/101, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/154, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/201, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/272, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/467, AcNPV-CAP-AH/345, AcNPV-CAP-AH/345/467, AcNPV-CAP-AH/410, AcNPV-CAP-AH/410/467, AcNPV-CAP-AH/473, AcNPV-CAP-AH/473/467, AcNPV-CAP-AH/520, AcNPV-CAP-AH/520/467, AcNPV-CAP-VN/346, AcNPV-CAP-VN/346/467, AcNPV-CAP-VN/410, AcNPV-CAP-VN/410/467, AcNPV-CAP-VN/473, AcNPV-CAP-VN/473/467, AcNPV-CAP-VN/520, AcNPV-CAP-VN/520/467, AcNPV-CAP-CO/full, AcNPV-CAP-CO/full/467, AcNPV-CAP-CO/19, AcNPV-CAP-CO/19/467, AcNPV-CAP-CO/76, AcNPV-CAP-CO/76/467, AcNPV-CAP-CO/205, AcNPV-CAP-CO/205/467, AcNPV-CA39-HA1/Anhui, AcNPV-CA64-HA1/Anhui, AcNPV-CA39-PfCSP(A361E), AcNPV-CA64-PfCSP(A361E), AcNPV-CAP-CO/full/VSV, AcNPV-CAP-CO/19/VSV, AcNPV-CAP-CO/76/VSV, AcNPV-CAP-CO/205/VSV, AcNPV-Dual-Pfs25-PfCSP-gp64 и AcNPV-Dual-PfMSP1-PfCSP-gp64.
Пример 3: Тестирование экспрессии антигена вакцины с рекомбинантного бакуловируса согласно настоящему изобретению в клетках насекомых
Клетки Sf9 культивировали в концентрации 1×105 клеток на лунку в 48-луночном планшете (Corning) и инфицировали бакуловирусами AcNPV-CAP-PfCSP, AcNPV-CAP-HA1/Anhui и AcNPV-CAP-HA1/Vietnam, полученными, как описано в примере 2, или бакуловирусом дикого типа AcNPV-WT в качестве контроля при значении множественности инфекции примерно 0,1. Через 5 дней надосадок культуры удаляли из каждой лунки и затем добавляли раствор буфера для образцов (+2ME, x2) (Wako) в количестве 0,05 мл на лунку для полного лизиса клеток. Лизат клеток нагревали при 100°C в течение 5 минут и подвергали электрофорезу в 7,5% SDS-ПААГ. После электрофореза белок переносили на PVDF-мембрану (Immobilon-P, Millipore) и блокирование осуществляли при 4°C в течение ночи, погружая мембрану в 2,5% обезжиренное молоко/SuperBlock (Pierce). Мембрану, на которую был перенесен белок из клеток Sf9, инфицированных каждым из бакуловирусов, инкубировали с анти-gp64-антителом (AcV5 из eBioScience) в качестве первого антитела и затем инкубировали с меченым HRP антителом козы против IgG (H+L) мыши (из BioRad) в качестве второго антитела. Окраску проявляли, используя набор для регистрации при Вестерн-блоттинге ECLplus (из GE Healthcare), чтобы выявить полосу белка. Результаты показаны на фиг.1.
На фиг.1 показан анализ с использованием Вестерн-блоттинга, показывающий экспрессию слитых антигенов в клетках насекомых с рекомбинантных бакуловирусов, содержащих ген PfCSP малярии человека, ген HA1 вируса гриппа штамма H5N1/Anhui/1/05 и ген HA1 штамма H5N1/Vietnam/1203/04. На фиг.1, на дорожке 1 показана полоса бакуловируса дикого типа (AcNPV-WT); на дорожке 2 показана полоса рекомбинантного бакуловируса (AcNPV-CAP-PfCSP), содержащего ген PfCSP и полноразмерный ген gp64, встроенные ниже двойного промотора согласно настоящему изобретению; на дорожке 3 показана полоса рекомбинантного бакуловируса (AcNPV-CAP-HA1/Anhui), содержащего ген HA1 вируса гриппа штамма H5N1/Anhui/1/05 и полноразмерный ген gp64, встроенные ниже двойного промотора согласно настоящему изобретению; и на дорожке 4 показана полоса рекомбинантного бакуловируса ((AcNPV-CAP-HA1/Vietnam), содержащего ген HA1 вируса гриппа штамма H5N1/Vietnam/1203/04 и полноразмерный ген gp64, встроенные ниже двойного промотора согласно настоящему изобретению.
Как показано на дорожках 2, 3 и 4 на фиг.1, полосу, соответствующую экспрессированному слитому продукту гена иммуногенного чужеродного антигена и гена gp64, наблюдали в случае рекомбинантных бакуловирусов, имеющих ген антигена и ген gp64, слитые и экспрессируемые ниже двойного промотора согласно настоящему изобретению.
Описанные выше результаты подтвердили, что в случае применения рекомбинантного вируса согласно настоящему изобретению ген иммуногенного чужеродного антигена и ген gp64 могут быть слиты и экспрессированы в виде слитого продукта в клетках насекомых.
Пример 4: Тестирование для идентификации слитого антигена в антигене вакцины, презентированном на вирусной частице (вирионе) рекомбинантного бакуловируса согласно настоящему изобретению
Клетки Sf9 культивировали до концентрации 1×107 клеток на чашку для культивирования клеток диаметром 150 мм (Sumilon) и инфицировали каждым из указанных выше бакуловирусов при значении множественности инфекции примерно 0,1. Через 7 дней среду дважды центрифугировали при 3000 g при 4°C по 15 минут и раствор, содержащий вирус, наслаивали на 25% раствор сахарозы и центрифугировали, используя ультрацентрифугу, при 25000 об/мин при 4°C в течение 90 минут, получая вирусные частицы. 0,05 мл раствора буфера для образцов (+2ME, x2) (Wako) добавляли к 0,05 мл каждого из вирусных концентратов (1×108 БОЕ/мл) AcNPV-CAP-PfCSP, AcNPV-CAP-PfCSP/272, AcNPV-CAP-PfCSP/467, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam и AcNPV-WT, собранных ультрацентрифугированием. Полученные смеси нагревали при 100°C в течение 5 минут и подвергали электрофорезу в 7,5% SDS-ПААГ. После электрофореза полученные белки переносили на PVDF-мембраны (Immobilon-P, Millipore) и погружали в 2,5% обезжиренное молоко/SuperBlock (Pierce), чтобы осуществить блокирование, при 4°C в течение ночи. Мембраны, на которые переносили растворы, содержащие вирусы AcNPV-CAP-PfCSP, AcNPV-CAP-PfCSP/272 и AcNPV-CAP-PfCSP/467, инкубировали с анти-PfCSP-антителом (2A10, MR-4) в качестве первого антитела и затем инкубировали с меченым HRP антителом козы против IgG (H+L) мыши (BioRad) в качестве второго антитела. Мембрану, на которую переносили раствор, содержащий вирус AcNPV-CAP-HA1/Vietnam, инкубировали с анти-H5N1-антителом (IT-003-005 из Immune Technology) в качестве первого антитела и затем инкубировали с меченым HRP антителом козы против IgG кролика (из GE Healthcare) в качестве второго антитела. Окраску проявляли, используя набор для регистрации при Вестерн-блоттинге ECLplus (GE Healthcare), чтобы выявить полосы белков. Результаты показаны на фиг.2.
На фиг.2 (A) показан анализ, проведенный с помощью Вестерн-блоттинга, показывающий экспрессию гена CSP (PfCSP) возбудителя малярии человека в вирусных частицах рекомбинантных бакуловирусов, полученных с использованием рекомбинантных векторов для переноса. На дорожке 1, изображенной слева на фиг.2 (A), показана полоса рекомбинантного бакуловируса (AcNPV-CAP-PfCSP), содержащего ген PfCSP и полноразмерный ген gp64, встроенные ниже двойного промотора согласно изобретению; на дорожке 2 показана полоса рекомбинантного бакуловируса (AcNPV-CAP-PfCSP/272), содержащего ген PfCSP и ген gp64 неполной длины (241 аминокислотный остаток от C-конца), встроенные ниже двойного промотора согласно изобретению; на дорожке 3 показана полоса рекомбинантного бакуловируса (AcNPV-CAP-PfCSP/467), содержащего ген PfCSP и ген gp64 неполной длины (46 аминокислотных остатков от C-конца), встроенные ниже двойного промотора согласно изобретению. Бакуловирусы подвергали электрофорезу и проверяли наличие экспрессированного слитого продукта гена PfCSP и гена gp64. Интенсивную полосу, показывающую присутствие слитого антигена гена PfCSP и гена gp64 в рекомбинантных вирусных частицах, выявляли на всех дорожках, представленных на фиг.2 (A).
На фиг.2 (B) показан анализ, проведенный с помощью Вестерн-блоттинга, показывающий экспрессию гена H5N1/HA1 в вирусных частицах рекомбинантных бакуловирусов, полученных с использованием рекомбинантных векторов для переноса. На дорожке 1, левая дорожка на фиг.2 (B), показаны результаты, полученные с использованием лизата клеток, инфицированных AcNPV-WT, полученного как описано в примере 3; на дорожке 2 показаны результаты, полученные с использованием лизата клеток, инфицированных AcNPV-CAP-HA1/Anhui, полученного как описано в примере 3; на дорожке 3 показаны результаты, полученные с использованием лизата клеток, инфицированных AcNPV-CAP-HA1/Vietnam, полученного как описано в примере 3; и на дорожке 4 показаны результаты, полученные с использованием вирусных частиц бакуловируса дикого типа (AcNPV-WT); на дорожке 5 показаны результаты, полученные с использованием вирусных частиц рекомбинантного бакуловируса (AcNPV-CAP-HA1/Vietnam), содержащего ген HA1 вируса гриппа штамма H5N1/Vietnam/1203/04 и полноразмерный ген gp64, встроенные ниже двойного промотора согласно настоящему изобретению; и на дорожке 6 показаны результаты для очищенного антигена HA H5N1 (IT-003-0053p из Immune Technology). Бакуловирусы подвергали электрофорезу и проверяли наличие экспрессированного слитого продукта гена PfCSP и гена gp64. Интенсивную полосу, показывающую присутствие слитого антигена гена HA1 H5N1/Vietnam/1203/04 и гена gp64 в рекомбинантных вирусных частицах, выявили на дорожке 5, показанной на фиг.2(B).
Описанные выше результаты, полученные согласно примеру 4, показывают, что чужеродный ген, обладающий требуемой иммуногенностью, и ген gp64 могут быть слиты и экспрессированы в рекомбинантных вирусных частицах рекомбинантного бакуловируса согласно настоящему изобретению, полученного с использованием рекомбинантного вектора для переноса согласно настоящему изобретению.
Пример 5: Тестирование экспрессии антигена вакцины с рекомбинантного бакуловируса согласно настоящему изобретению у млекопитающих
Клетки HepG2 инфицировали AcNPV-Dual-PfMSP1-PfCSP при значении множественности инфекции 1. Через 48 часов надосадок культуры удаляли и чашку три раза промывали PBS. Добавляли раствор, содержащий смесь ацетон/этанол (соотношение в смеси 7:3), охлажденный до -20°C, чтобы иммобилизовать клетки при -20°C в течение 5 минут. Добавляли 5% нормальную сыворотку козы (Sigma), осуществляя блокирование при комнатной температуре в течение 1 часа. Чтобы выявить экспрессию PfCSP добавляли анти-PfCSP-антитело (2A10, MR-4), меченое Alexa Flour 594; и для выявления экспрессии PfMSP-119 добавляли анти-PfMSP-119-антитело (5.2, MR-4), и затем добавляли антитело против Ig мыши, меченое ФИТЦ. После инкубации клетки, которые взаимодействовали с антителами, выявляли с помощью флуоресцентного микроскопа.
Результаты показаны на фиг.3.
На фиг.3 показаны клетки HepG2, окрашенные флуоресцентно меченым антителом, которое указывает, что антиген был экспрессирован с рекомбинантного бакуловируса, содержащего слитый ген, состоящий из гена PfMSP1 и гена PfCSP, в клетках HepG2. Результаты, показанные на фиг.3 (A) подтвердили, что был экспрессирован антиген PfCSP. Результаты, показанные на фиг.3 (B), подтвердили, что был экспрессирован антиген PfMSP-119. Таким образом, было подтверждено, что слитые антигены могут быть экспрессированы в клетках млекопитающих. Результаты, приведенные на фиг.3 (A) и (B) ясно показывают, что рекомбинантный бакуловирус, полученный с использованием вектора для переноса, содержащего двойной промотор согласно настоящему изобретению, может экспрессировать требуемый антиген в клетках млекопитающих.
Результаты свидетельствуют, что в том случае, когда рекомбинантный бакуловирус, полученный с использованием рекомбинантного вектора для переноса согласно настоящему изобретению, вводят человеку и другим млекопитающим, вирусные частицы проникают в клетки млекопитающих и промотор млекопитающих функционирует, продуцируя слитый продукт требуемого гена чужеродного антигена и гена gp64 в клетках млекопитающих, таким образом индуцируя приобретенный иммунитет.
Пример 6: Индукция антитела рекомбинантным вирусом, продуцирующим антиген PfCSP, и рекомбинантным вирусом, продуцирующим антиген H5N1/HA1
1. Инокуляция раствора, содержащего вирусы
Растворы, содержащие вирусы AcNPV-WT, AcNPV-CAP-PfCSP, AcNPV-CAP-PfCSP/467, AcNPV-CAP-HA1/Anhui и AcNPV-CAP-HA1/Vietnam, концентрированные с помощью ультрацентрифугирования, инокулировали в бедренные мышцы самок мышей BALB/c в количестве 1×108 БОЕ два раза с двухнедельными интервалами.
2. Измерение титров антител
Мышей подвергали эвтаназии через две недели после конечной иммунизации и собирали сыворотку мышей и использовали ее для измерения титров специфичных для антигена антител. Индукцию титров специфичных для антигена PfCSP антител при использовании AcNPV-CAP-PfCSP и AcNPV-CAP-PfCSP/467 измеряли в ELISA, используя планшет, на котором иммобилизовали пептид (NANP)4NVDPC (Sigma), т.е., B-клеточный эпитоп PfCSP. Индукцию титров специфичных для антигена H5N1/HA антител при использовании AcNPV-CAP-HA1/Anhui и AcNPV-CAP-HA1/Vietnam измеряли в ELISA, используя планшет, на котором иммобилизовали очищенный антиген HA вируса H5N1 (IT-003-005p, Immune Technology). Оптическую плотность при OD450 нм измеряли, используя MaxiSorp (NUNC) в качестве планшета для ELISA, меченое HRP антитело козы против IgG мыши (H&L) (American Qualex) в качестве второго антитела и TMB (Calbiochem) для цветной реакции.
Результаты показаны на фиг.4.
На фиг.4 (A) приведен график средней оптической плотности для каждой группы при OD450 нм, полученный в том случае, когда сыворотки мышей подвергали двукратному серийному разведению от 800-кратного до 102400-кратного разведения. В группах, которым инокулировали PBS и AcNPV-WT, сыворотки которых не содержали антитела к антигену, оптическая плотность даже при 800-кратном разведении имела значение 0,1 или меньше, что свидетельствует о низкой реактивности. Напротив, в группах, которым инокулировали AcNPV-CAP-PfCSP и AcNPV-CAP-PfCSP/467, оптическая плотность при 800-кратных разведениях составляла 1,138 и 1,878, соответственно, свидетельствуя о высокой реактивности и ясно показывая, что были индуцированы специфичные для антигена антитела. Фиг.4 (B) представляет собой график средней оптической плотности для каждой группы при OD450 нм, полученный для случая, когда сыворотки мышей подвергали двукратному серийному разведению от 400-кратного до 25600-кратного разведения. В группах, которым инокулировали PBS и AcNPV-WT, сыворотки которых не содержали антитела к антигену, оптическая плотность при 800-кратных разведениях составляла 0,1 или меньше, что свидетельствует о низкой реактивности. Напротив, в группах, в которых инокулировали AcNPV-CAP-HA1/Anhui и AcNPV-CAP-HA1/Vietnam, оптическая плотность при 3200-кратном разведении составляла 1,551 и 2,503, соответственно, что свидетельствует о высокой реактивности и ясно показывает, что были индуцированы специфичные для антигена антитела. Фиг.4 ясно показывает, что рекомбинантный бакуловирус, полученный с использованием вектора для переноса, содержащего двойной промотор согласно настоящему изобретению, может индуцировать антитело к требуемому антигену у млекопитающих.
3. Измерение значения нейтрализации
Тест ингибирования гемагглютинации (HI) осуществляли, используя сыворотку мышей, которым инокулировали AcNPV-CAP-HA1/Anhui. Более конкретно, тест проводили согласно способу, описанному в инструкциях, прилагаемых к реагенту «Seiken» для гриппа HI (Denka Seiken Co., Ltd.), используя очищенный антиген HA вируса H5N1 (IT-003-0053p из Immune Technology). Абсорбцию неспецифичных агглютининов осуществляли, используя эритроциты, а удаление неспецифичных ингибиторов агглютинации осуществляли, используя RDE (II) «Seiken» (Denka Seiken Co., Ltd.). Тестирование HI осуществляли следующим образом. 0,025 мл 10-кратно разведенной антисыворотки в 96-луночном планшете подвергали 2-кратному серийному разведению, используя разбавитель. В каждую лунку 96-луночного планшета, содержащего разбавленную антисыворотку, добавляли 0,025 мл антигена HA вируса H5N1, разбавленного так, чтобы получить титр HA 4 на 0,025 мл. Планшет оставляли при комнатной температуре на 30 минут. Добавляли 0,05 мл суспензии эритроцитов для взаимодействия и тщательно перемешивали. Смесь оставляли при комнатной температуре на 60 минут. Последнее разведение тестируемого образца, при котором гемагглютинация была полностью ингибирована, определяли как титр HI-антитела.
Результаты показывают, что в сыворотках в случае инокуляции PBS и AcNPV-WT титры HI-антитела составляли 10 или меньше, тогда как в сыворотке при инокуляции AcNPV-CAP-HA1/Anhui титр HI-антитела составлял 40.
Результаты по-видимому указывают, что при введении человеку и другим млекопитающим рекомбинантный бакуловирус, полученный на основе рекомбинантного вектора для переноса согласно настоящему изобретению, может индуцировать антитела, эффективные по отношению к требуемому гену чужеродного антигена, таким образом обеспечивая эффект вакцины.
Список последовательностей в свободной форме
SEQ ID NO: 1 и 2 представляют собой последовательности праймеров phsp65-F1 и phsp65-R1 для ПЦР геномной ДНК M. tuberculosis H37Rv.
SEQ ID NO: 3 и 4 представляют собой последовательности праймеров phsp65-F2 и phsp65-R2 для ПЦР с использованием pcDNA-hps65 в качестве матрицы.
SEQ ID NO: 5 и 6 представляют собой последовательности праймеров pPolh-F2 и pgp64-R2 для ПЦР с использованием pBACsurf-1 в качестве матрицы для получения фрагмента ДНК гена gp64.
SEQ ID NO: 7 и 8 представляют собой последовательности праймеров HA-f и HA-r в ПЦР для получения фрагмента гена HA вируса гриппа.
SEQ ID NO: 9 и 10 представляют собой последовательности праймеров pHA-F1 и pHA-R1 для ПЦР с использованием pCR-Blunt-HA в качестве матрицы.
SEQ ID NO: 11 и 12 представляют собой последовательности праймеров Polh-f RsrII и GP64-r DraIII для ПЦР с использованием pBACsurf-HA1 в качестве матрицы.
SEQ ID NO: 13 и 14 представляют собой последовательности праймеров NP-f EcoRI и NP-r Cfr9I для ОТ-ПЦР геномной РНК вируса гриппа штамма PR/8/34.
SEQ ID NO: 15, 16, и 12 представляют собой последовательности праймеров gp64(272)-f, gp64(467)-f и GP64-r DraIII для ПЦР pCAP-H1N1/HA1-gp64.
SEQ ID NO: 17 и 18 представляют собой последовательности праймеров PfCSP-f(19) и PfCSP-r(373) для ПЦР с использованием геномной ДНК P. falciparum в качестве матрицы.
SEQ ID NO: 19 и 20 представляют собой последовательности праймеров pAMA-F1 и pAMA1-R1 для ПЦР с использованием геномной ДНК P. berghei в качестве матрицы.
SEQ ID NO: 21 и 22 представляют собой последовательности праймеров pPfCSP-F1 и pPfCSP-R1 для ПЦР с использованием геномной ДНК P. falciparum в качестве матрицы.
SEQ ID NO: 23 и 24 представляют собой последовательности праймеров pPfs25-F1 и pPfs25-R2 для ПЦР с использованием геномной ДНК P. falciparum в качестве матрицы.
SEQ ID NO: 25 и 26 представляют собой последовательности праймеров pPfMSP119-F1 и pPfMSP119-R2 для ПЦР с использованием Геномной ДНК P. falciparum в качестве матрицы.
SEQ ID NO: 17 и 27 представляют собой последовательности праймеров PfCSP-f(19) и PfCSP-r(373 A361E) для ПЦР с использованием pCAP-PfCSP в качестве матрицы.
SEQ ID NO: 28 и 27 представляют собой последовательности праймеров PfCSP-f(76) и PfCSP-r(373 A361E) для ПЦР с использованием pCAP-PfCSP в качестве матрицы.
SEQ ID NO: 29 представляет собой последовательность искусственного гена (PfCSP+), полученного на основании аминокислотной последовательности PfCSP штамма P. falciparum 3D7 (однако в которой A в положении 361 был заменен на E) с использованием кодонов, часто используемых в клетках Sf9 и в клетках человека.
SEQ ID NO: 30 и 31 представляют собой последовательности праймеров PfCSP-f(+209) и PfCSP-r(+A361E) для ПЦР с использованием PfCSP+ в качестве матрицы.
SEQ ID NO: 32, 33, 34 и 31 представляют собой последовательности праймеров PfCSP-f(+76), PfCSP-r(+128), PfCSP-f(+209) BamHI и PfCSP-r(+A361E) для ПЦР с использованием PfCSP+ в качестве матрицы.
SEQ ID NO: 35 представляет собой последовательность искусственного гена, полученного на основании аминокислотной последовательности области HA1 гемагглютинина вируса гриппа H5N1/Anhui/1/05 с использованием кодонов, часто используемых в клетках Sf9 и в клетках человека.
SEQ ID NO: 36 и 37 представляют собой последовательности праймеров AH-F1 (5'-CAGTCTGCAGGACCAGATTTGCATC-3': (SEQ ID NO: 36); сайт PstI подчеркнут) и AH-R4 (5'-CAGTCCCGGGCTCTCTTGCGCCTGC-3': (SEQ ID NO: 37); сайт XmaI подчеркнут) для ПЦР с использованием искусственной последовательности гена SEQ ID NO: 35 в качестве матрицы.
SEQ ID NO: 38 представляет собой последовательность искусственного гена, полученного на основании аминокислотной последовательности области HA1 гемагглютинина вируса гриппа H5N1/Vietnam/1203/04 с использованием кодонов, часто используемых в клетках Sf9 и в клетках человека.
SEQ ID NO: 39 и 40 представляют собой последовательности праймеров VN-F1 (5'-CAGTCTGCAGGACCAGATCTGTATC-3': (SEQ ID NO: 39); сайт PstI подчеркнут) и VN-R4 (5'-CAGTCCCGGGCTCTCTTCTTCCTGC-3': (SEQ ID NO: 40); сайт XmaI подчеркнут) для ПЦР с использованием искусственной последовательности гена SEQ ID NO: 38 в качестве матрицы.
SEQ ID NO: 41, 42, 43, 44 и 12 представляют собой последовательности праймеров gp64(51)-f (5'-GACTCCCCGGGTGGAAATCACCATCGTGGAGACG-3': (SEQ ID NO: 41); сайт XmaI подчеркнут), gp64(101)-f (5'-GACTCCCCGGGATTTGCTTATGTGGAGCATCAGG-3': (SEQ ID NO: 42); сайт XmaI подчеркнут), gp64(154)-f (5'-GACTCCCCGGGCGCACCACACGTGCAACAAATCG-3': (SEQ ID NO: 43); сайт XmaI подчеркнут), gp64(201)-f (5'-GACTCCCCGGGACACTGTGCTTCATCGAGACGGC-3': (SEQ ID NO: 44); сайт XmaI подчеркнут) и GP64-r DraIII (5'-GGGCACTTAGTGATATTGTCTATTACGGTTTCTAATC-3' (SEQ ID NO: 12); сайт DraIII подчеркнут).
SEQ ID NO: 45 представляет собой последовательность искусственного гена, полученного на основании аминокислотной последовательности области HA1 гемагглютинина вируса гриппа H5N1/Anhui/1/05 при оптимизации кодонов с использованием программы Gene Designer, доступной из DNA2.0, Inc.
SEQ ID NO: 46, 47, 48, 49 и 50 представляют собой последовательности AH17-F (5'-GACTCTGCAGGATCAGATCTGTATTGGGTACC-3':(SEQ ID NO: 46); сайт PstI подчеркнут и AH345-R (5'-CGATCCCGGGCTCTCTTTCTCCTCCGCTCGC-3': (SEQ ID NO: 47); сайт XmaI подчеркнут), AH410-R (5'-CGATCCCGGGCGGCCTCGAACTGGGTGTTCATT-3': (SEQ ID NO: 48); сайт XmaI подчеркнут), AH473-R (5'-CGATCCCGGGCGTCTCTGAGTTGAAGGCGCAC-3':(SEQ ID NO: 49); сайт XmaI подчеркнут, и AH520-R (5'-CGATCCCGGGCACCACTAATTTCCTCTCGCTTC-3':(SEQ ID NO: 50); сайт XmaI подчеркнут) для ПЦР с использованием искусственной последовательности гена SEQ ID NO: 45 в качестве матрицы.
SEQ ID NO: 51 представляет собой последовательность искусственного гена, полученного на основании аминокислотной последовательности области HA1 гемагглютинина вируса гриппа H5N1/Vietnam/1203/04 при оптимизации кодонов с использованием программы Gene Designer, доступной из DNA2.0, Inc.
SEQ ID NO: 52, 53, 54, 55 и 56 представляют собой последовательности праймеров VN17-F (5'-GACTCTGCAGGATCAGATCTGTATCGGATATC-3': (SEQ ID NO: 52); сайт PstI подчеркнут) и VN346-R (5'-CGATCCCGGGCCCGCTTTTTCCTCCTCCGTTCG-3': (SEQ ID NO: 53); сайт XmaI подчеркнут), VN410-R (5'-CGATCCCGGGCCTCAAACTGCGTATTCATTTTG-3': (SEQ ID NO: 54); сайт XmaI подчеркнут), VN473-R (5'-CGATCCCGGGCTCTAAGCTGGAGCCTGACTTTGTC-3': (SEQ ID NO: 55); сайт XmaI подчеркнут), и VN520-R (5'-CGATCCCGGGCACTAATCTCCTCTCTTTTAAGTC-3': (SEQ ID NO: 56); сайт XmaI подчеркнут) для ПЦР с использованием искусственной последовательности гена SEQ ID NO: 51 в качестве матрицы.
SEQ ID NO: 57 представляет собой последовательность искусственного гена, полученного на основании аминокислотной последовательности CSP штамма Plasmodium falciparum 3D7 при оптимизации кодонов с использованием программы Gene Designer, доступной из DNA2.0, Inc.
SEQ ID NO: 58, 59, 60, 61 и 62 представляют собой последовательности праймеров PfCSP_opt-f (5'-GACTCTGCAGATGATGCGAAAATTGGCCATACTG-3':(SEQ ID NO: 58); сайт PstI подчеркнут), PfCSP_opt-r (397) (5'-CGATCCCGGGCATTGAGGAACAGAAAGGAAAGAACCATG-3': (SEQ ID NO: 59); сайт XmaI подчеркнут), PfCSP_opt-f (19) (5'-GACTCTGCAGCTGTTTCAGGAATACCAGTGCTATGG-3': (SEQ ID NO: 60); (сайт PstI подчеркнут), PfCSP_opt-r(373) (5'-CGATCCCGGGCCTTCTCCATCTTACAAATTTTCTTTTCAATATCATTAGC -3': (SEQ ID NO: 61); (сайт XmaI подчеркнут), PfCSP_opt-f (76) (5'-GACTCTGCAGGACGACGGAAATAATGAGGACAACG-3': (SEQ ID NO: 62); сайт PstI подчеркнут) и PfCSP_opt-f (205) (5'-GACTCTGCAGAATGCAAACCCAAATGCCAATCCAAACGC-3': (SEQ ID NO: 63); сайт PstI подчеркнут) для ПЦР с использованием искусственной последовательности гена SEQ ID NO: 57 в качестве матрицы.
SEQ ID NO: 64, 65, 66, и 67 представляют собой последовательности праймеров gp64-p-f (5'-GACTCGGACCGGCCAGATAAAAATAATCTTATCAATTAAG-3': (SEQ ID NO: 64); сайт RsrII подчеркнут), gp64-p-r (5'-CGATACTAGTAGCACTGAGGCTTCTTATATACCCG-3': (SEQ ID NO: 65); сайт SpeI подчеркнут), и vp39-p-f (5'-GACTCGGACCGCGTCGTACAAATCGAAATATTGTTGTG-3':(SEQ ID NO: 66); сайт RsrII подчеркнут), и vp39-p-r (5'-CGATACTAGTGTGATTGAGAAAGAAATCTCTTATTC-3': (SEQ ID NO: 67); сайт SpeI подчеркнут) для ПЦР с использованием геномной ДНК бакуловируса в качестве матрицы.
SEQ ID NO: 68 и 69 представляют собой последовательности праймеров VSV-G-f (5'-GACTCCCCGGGCGTTCGAACATCCTCACATTCAAG-3' (SEQ ID NO: 68); сайт XmaI подчеркнут) и VSV-G-r (5'-GACTCACTTAGTGCTTTCCAAGTCGGTTCATCTC-3': (SEQ ID NO: 69); сайт DraIII подчеркнут) для ПЦР с использованием pVSV-G в качестве матрицы.
Claims (1)
- Фармацевтическая композиция, являющаяся противомалярийной вакциной и содержащая в качестве активного агента рекомбинантный вирус ядерного полиэдроза Autographa californica (AcNPV) и, необязательно, фармацевтически приемлемый носитель, где рекомбинантный вирус AcNPV включает генную структуру, имеющую слитый ген из:
(А) гена, кодирующего частичную аминокислотную последовательность SEQ ID No: 70 (белок циркумпорозоита Plasmodium falciparum; PfCSP), и
(В) гена, кодирующего частичную аминокислотную последовательность, представленную в GenBank с номером доступа No. L22858 (белок вирусных частиц gp64),
под контролем двойного промотора, включающего промотор полиэдрина и промотор CAG, связанные друг с другом (CAP); и
где рекомбинантный вирус AcNPV выбран из группы, состоящей из:
(1) рекомбинантного вируса AcNPV, который содержит ген, кодирующий аминокислотную последовательность, состоящую из аминокислотных остатков 19-373 последовательности SEQ ID NO: 70 в качестве гена (А), и ген, кодирующий аминокислотную последовательность, состоящую из аминокислотных остатков 21-512 последовательности, депонированной в GenBank под номером доступа No. L22858, в качестве гена (В) (AcNPV-CAP-PfCSP),
(2) рекомбинантного вируса AcNPV, который содержит ген, кодирующий аминокислотную последовательность, состоящую из аминокислотных остатков 19-373 последовательности SEQ ID NO: 70 в качестве гена (А), и ген, кодирующий аминокислотную последовательность, состоящую из аминокислотных остатков 467-512 последовательности, депонированной в GenBank под номером доступа No. L22858, в качестве гена (В) (AcNPV-CAP-PfCSP/467),
(3) рекомбинантного вируса AcNPV, который содержит ген, кодирующий аминокислотную последовательность, состоящую из аминокислотных остатков 205-373 последовательности SEQ ID NO: 70 в качестве гена (А), и ген, кодирующий аминокислотную последовательность, состоящую из аминокислотных остатков 21-512 последовательности, депонированной в GenBank под номером доступа No. L22858, в качестве гена (В) (AcNPV-САР-СО/205),
(4) рекомбинантного вируса AcNPV, который содержит ген, кодирующий аминокислотную последовательность, состоящую из аминокислотных остатков 76-373 последовательности SEQ ID NO: 70 в качестве гена (А), и ген, кодирующий аминокислотную последовательность, состоящую из аминокислотных остатков 467-512 последовательности, депонированной в GenBank под номером доступа No.L22858, в качестве гена (В) (AcNPV-САР-СО/76/467),
(5) рекомбинантного вируса AcNPV, который содержит ген, кодирующий аминокислотную последовательность, состоящую из аминокислотных остатков 76-373 последовательности SEQ ID NO: 70 в качестве гена (А), и ген, кодирующий аминокислотную последовательность, состоящую из аминокислотных остатков 21-512 последовательности, депонированной в GenBank под номером доступа No. L22858, в качестве гена (В) (AcNPV-САР-СО/76),
(6) рекомбинантного вируса AcNPV, который содержит ген, кодирующий аминокислотную последовательность, состоящую из аминокислотных остатков 1-397 последовательности SEQ ID NO: 70 в качестве гена (А), и ген, кодирующий аминокислотную последовательность, состоящую из аминокислотных остатков 21-512 последовательности, депонированной в GenBank под номером доступа No. L22858, в качестве гена (В) (AcNPV-CAP-CO/full),
(7) рекомбинантного вируса AcNPV, который содержит ген, кодирующий аминокислотную последовательность, состоящую из аминокислотных остатков 205-373 последовательности SEQ ID NO: 70 в качестве гена (А), и ген, кодирующий аминокислотную последовательность, состоящую из аминокислотных остатков 467-512 последовательности, депонированной в GenBank под номером доступа No. L22858, в качестве гена (В) (AcNPV-САР-СО/205/467),
(8) рекомбинантного вируса AcNPV, который содержит ген, кодирующий аминокислотную последовательность, состоящую из аминокислотных остатков 19-373 последовательности SEQ ID NO: 70 в качестве гена (А), и ген, кодирующий аминокислотную последовательность, состоящую из аминокислотных остатков 467-512 последовательности, депонированной в GenBank под номером доступа No. L22858, в качестве гена (В) (AcNPV-САР-СО/19/467),
(9) рекомбинантного вируса AcNPV, который содержит ген, кодирующий аминокислотную последовательность, состоящую из аминокислотных остатков 19-373 последовательности SEQ ID NO: 70 в качестве гена (А), и ген, кодирующий аминокислотную последовательность, состоящую из аминокислотных остатков 21-512 последовательности, депонированной в GenBank под номером доступа No. L22858, в качестве гена (В) (AcNPV-САР-СО/19),
(10) рекомбинантного вируса AcNPV, который содержит ген, кодирующий аминокислотную последовательность, состоящую из аминокислотных остатков 1-397 последовательности SEQ ID NO: 70 в качестве гена (А), и ген, кодирующий аминокислотную последовательность, состоящую из аминокислотных остатков 467-512 последовательности, депонированной в GenBank под номером доступа No. L22858, в качестве гена (В) (AcNPV-CAP-CO/full/467),
(11) рекомбинантного вируса AcNPV, который содержит ген, кодирующий аминокислотную последовательность, состоящую из аминокислотных остатков 209-373 последовательности SEQ ID NO: 70 в качестве гена (А), и ген, кодирующий аминокислотную последовательность, состоящую из аминокислотных остатков 467-512 последовательности, депонированной в GenBank под номером доступа No. L22858, в качестве гена (В) (AcNPV-CAP-PfCSP+209/467), и
(12) рекомбинантного вируса AcNPV, который содержит ген, кодирующий аминокислотную последовательность, состоящую из аминокислотных остатков 76-128 и 209-373 последовательности SEQ ID NO: 70 в качестве гена (А), и ген, кодирующий аминокислотную последовательность, состоящую из аминокислотных остатков 467-512 последовательности, депонированной в GenBank под номером доступа No. L22858, в качестве гена (В) (AcNPV-CAP-PfCSP+76/209/467).
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2007205785 | 2007-08-07 | ||
JP2007-205785 | 2007-08-07 | ||
PCT/JP2008/064503 WO2009020236A2 (en) | 2007-08-07 | 2008-08-06 | Baculoviral vectors with a dual vertebrate and baculovirus promoter controlling an immunogenic fusion gene |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2010108248A RU2010108248A (ru) | 2011-09-20 |
RU2491093C2 true RU2491093C2 (ru) | 2013-08-27 |
Family
ID=40011036
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2010108248/10A RU2491093C2 (ru) | 2007-08-07 | 2008-08-06 | Бакуловирусные векторы с двойным промотором, включающим в себя промотор позвоночного и промотор бакуловируса, контролирующим иммуногенный слитый ген |
Country Status (18)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP2191002B1 (ru) |
KR (1) | KR20100040947A (ru) |
CN (1) | CN101772576B (ru) |
AP (1) | AP2010005146A0 (ru) |
AR (1) | AR067833A1 (ru) |
AU (1) | AU2008284664B2 (ru) |
BR (1) | BRPI0815034A2 (ru) |
CA (1) | CA2695894C (ru) |
DK (1) | DK2191002T3 (ru) |
HK (1) | HK1142629A1 (ru) |
IL (1) | IL203411A (ru) |
MX (1) | MX2010001499A (ru) |
MY (1) | MY155412A (ru) |
PE (1) | PE20090959A1 (ru) |
RU (1) | RU2491093C2 (ru) |
TW (1) | TWI435934B (ru) |
WO (1) | WO2009020236A2 (ru) |
ZA (1) | ZA201000422B (ru) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20110201086A1 (en) * | 2010-02-12 | 2011-08-18 | Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. | Method for producing recombinant virus |
US8513006B2 (en) | 2010-09-14 | 2013-08-20 | University of Pittsburgh—of the Commonwealth System of Higher Education | Tetravalent influenza vaccine and use thereof |
SG11201507253XA (en) * | 2013-03-15 | 2015-10-29 | Novavax Inc | Enhanced expression of picornavirus proteins |
CN109022456B (zh) * | 2018-07-24 | 2021-03-02 | 江南大学 | 一种表达卵形疟原虫ama1蛋白的病毒疫苗的制备方法 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2099420C1 (ru) * | 1989-06-29 | 1997-12-20 | Юниверсити Оф Джорджиа Рисерч Фаундейшн, Инк. | Способ получения генетически модифицированного бакуловируса, штамм вируса ядерного полиэдроза, способ борьбы с насекомыми, инсектицидная композиция |
WO2003020322A1 (de) * | 2001-09-04 | 2003-03-13 | DeveloGen Aktiengesellschaft für entwicklungsbiologische Forschung | Vektor zur induktion einer immunantwort |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1147555A (zh) * | 1995-10-09 | 1997-04-16 | 武汉大学 | 基因工程重组杆状病毒杀虫剂 |
US20040071733A1 (en) * | 2001-02-05 | 2004-04-15 | Hiroshi Takaku | Baculovirus vector vaccine |
AU2003266628A1 (en) * | 2002-09-25 | 2004-04-19 | Osaka Industrial Promotion Organization | Baculovirus vector, method of constructing baculovirus vector and gene transfer method |
US7527967B2 (en) * | 2003-11-25 | 2009-05-05 | Academia Sinica | Recombinant baculovirus and virus-like particle |
TWI477602B (zh) * | 2006-02-09 | 2015-03-21 | Educational Foundation Jichi Medical Univ | Novel viral vector |
-
2008
- 2008-08-06 MY MYPI2010000551A patent/MY155412A/en unknown
- 2008-08-06 AP AP2010005146A patent/AP2010005146A0/en unknown
- 2008-08-06 CN CN200880102191.5A patent/CN101772576B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2008-08-06 MX MX2010001499A patent/MX2010001499A/es active IP Right Grant
- 2008-08-06 AU AU2008284664A patent/AU2008284664B2/en not_active Ceased
- 2008-08-06 WO PCT/JP2008/064503 patent/WO2009020236A2/en active Application Filing
- 2008-08-06 KR KR1020107004567A patent/KR20100040947A/ko not_active Application Discontinuation
- 2008-08-06 DK DK08792433.8T patent/DK2191002T3/en active
- 2008-08-06 RU RU2010108248/10A patent/RU2491093C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2008-08-06 PE PE2008001311A patent/PE20090959A1/es not_active Application Discontinuation
- 2008-08-06 EP EP08792433.8A patent/EP2191002B1/en not_active Not-in-force
- 2008-08-06 CA CA2695894A patent/CA2695894C/en not_active Expired - Fee Related
- 2008-08-06 BR BRPI0815034 patent/BRPI0815034A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2008-08-07 AR ARP080103449A patent/AR067833A1/es unknown
- 2008-08-07 TW TW97130064A patent/TWI435934B/zh not_active IP Right Cessation
-
2010
- 2010-01-20 ZA ZA2010/00422A patent/ZA201000422B/en unknown
- 2010-01-20 IL IL203411A patent/IL203411A/en not_active IP Right Cessation
- 2010-09-24 HK HK10109135.5A patent/HK1142629A1/zh not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2099420C1 (ru) * | 1989-06-29 | 1997-12-20 | Юниверсити Оф Джорджиа Рисерч Фаундейшн, Инк. | Способ получения генетически модифицированного бакуловируса, штамм вируса ядерного полиэдроза, способ борьбы с насекомыми, инсектицидная композиция |
WO2003020322A1 (de) * | 2001-09-04 | 2003-03-13 | DeveloGen Aktiengesellschaft für entwicklungsbiologische Forschung | Vektor zur induktion einer immunantwort |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
STRAUSS ROBERT et al. Baculovirus-based vaccination vectors allow for efficient induction of immune responses against plasmodium falciparum circumsporozoite protein//MOLECULAR THERAPY: THE JOURNAL OF THE AMERICAN SOCIETY OF GENE THERAPY JAN 2007, vol. 15, no. 1, January 2007 (2007-01), pages 193-202. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN101772576A (zh) | 2010-07-07 |
MX2010001499A (es) | 2010-03-15 |
RU2010108248A (ru) | 2011-09-20 |
TWI435934B (zh) | 2014-05-01 |
AR067833A1 (es) | 2009-10-21 |
BRPI0815034A2 (pt) | 2015-03-17 |
MY155412A (en) | 2015-10-15 |
KR20100040947A (ko) | 2010-04-21 |
WO2009020236A3 (en) | 2009-04-16 |
TW200911992A (en) | 2009-03-16 |
PE20090959A1 (es) | 2009-07-20 |
CA2695894A1 (en) | 2009-02-12 |
ZA201000422B (en) | 2011-03-30 |
WO2009020236A2 (en) | 2009-02-12 |
AU2008284664B2 (en) | 2014-05-15 |
AP2010005146A0 (en) | 2010-02-28 |
IL203411A (en) | 2017-01-31 |
CN101772576B (zh) | 2016-05-04 |
JP5409605B2 (ja) | 2014-02-05 |
AU2008284664A1 (en) | 2009-02-12 |
JP2010535466A (ja) | 2010-11-25 |
CA2695894C (en) | 2016-09-20 |
IL203411A0 (en) | 2011-07-31 |
HK1142629A1 (zh) | 2010-12-10 |
DK2191002T3 (en) | 2016-06-13 |
EP2191002B1 (en) | 2016-04-13 |
EP2191002A2 (en) | 2010-06-02 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP2363463B1 (en) | Novel baculoviral vector | |
US9327018B2 (en) | Recombinant baculovirus vaccine | |
RU2491093C2 (ru) | Бакуловирусные векторы с двойным промотором, включающим в себя промотор позвоночного и промотор бакуловируса, контролирующим иммуногенный слитый ген | |
JP5409605B6 (ja) | 新規ウイルスベクター | |
RU2588464C2 (ru) | Бакуловирусный вектор и его применение | |
KR20230059897A (ko) | SARS-CoV-2의 스파이크 단백질 전부 또는 일부를 포함하는 바이러스 유사입자 및 이를 이용한 백신 | |
EP4370150A1 (en) | Overcoming antibody-interference in avians |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20170807 |