KR20100040947A - 면역성 융합 유전자를 조절하는 척추동물 및 배큘로바이러스 이중 프로모터를 포함하는 배큘로바이러스 벡터 - Google Patents

면역성 융합 유전자를 조절하는 척추동물 및 배큘로바이러스 이중 프로모터를 포함하는 배큘로바이러스 벡터 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신규한 전달 벡터와 재조합 배큘로바이러스; 이의 제조 방법; 및 말라리아 및 인플루엔자와 같은 감염성 질환 예방 및 치료제로서 유용한, 상기 재조합 배콜로바이러스를 유효성분으로 포함하는 약제를 제공한다. 더 구체적으로, 본 발명은 두 개의 프로모터 조절하에서 바이러스 유전자와 융합된 외래 유전자를 발현할 수 있는 재조합 전달 벡터; 이의 제조 방법; 및 상기 재조합 배큘로바이러스를 유효성분으로 포함한 약제를 제공한다.

Description

면역성 융합 유전자를 조절하는 척추동물 및 배큘로바이러스 이중 프로모터를 포함하는 배큘로바이러스 벡터{Baculoviral vectors with a dual vertebrate and baculovirus promoter controlling an immunogenic fusion gene}
본 발명은 신규한 전달 벡터(transfer vector), 상기 전달벡터와 배큘로바이러스(baculovirus) DNA의 상동 재조합(homologous recombination)에 의해 획득한 재조합 배큘로바이러스, 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 배큘로바이러스를 유효성분으로 포함하는 약제(예를 들어, 말라리아 및 인플루엔자 등과 같은 감염성 질환의 백신, 및 예방 또는 치료용 약물)에 관한 것이다.
배큘로바이러스(baculovirus)는 곤충세포를 이용한 목적 단백질을 산업적으로 생산하는 방법을 위한 벡터로 사용되고 있다. 최근에는, 상기 배큘로바이러스가 곤충 세포들뿐만 아니라 포유류 세포들에 외래 유전자를 도입할 수 있음이 발견되었고, 상기 벡터가 치료용 유전자를 도입할 수 있는 가능성이 발견되었다. 특허 문헌 1에서는 배큘로바이러스의 초기 유전자(early gene)에서 파생된 프로모터에서 바이러스의 비-구조 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 DNA 부위, 및 후기 유전자(late gene)에서 파생된 프로모터에서 바이러스의 구조 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 DNA 부위로 구성된 다중 독립적 프로모터들을 가지는 재조합 배큘로바이러스 발현 벡터가 개시되었다.
또한, 특허 문헌 2에서는 프로모터와 연계되어 원하는 외래 유전자의 발현을 조절하는 다중 독립적 프로모터를 포함하는 비-포유류 DNA 바이러스 벡터의 포유류 세포 내로 도입하는 방법, 및 외래 유전자를 포유류 세포에서 발현하는 방법이 개시되었다.
또한, 특허 문헌 3에서는 배큘로바이러스를 이용한 유전자 재조합 기술로 단백질을 생산하는 방법이 개시되었다. 이는 원하는 단백질을 암호화하는 유전자에 배큘로바이러스의 gp64 유전자를 연결하여 획득한 융합 유전자를 발현시키고, 원하는 단백질을 바이러스 입자에 융합시킨 형태로 생산하고, 원하는 단백질이 융합된 바이러스 입자를 수득하고, 원하는 단백질을 수득하기 위해 바이러스 입자로부터 원하는 단백질을 절단함으로써 단백질을 생산하는 방법이 개시되었다.
또한, 특허 문헌 4에서는 배큘로바이러스 발현 시스템, 숙주세포(host cell)에서 활성이고 비-수용성 세포(non-acceptable cell)에서 비활성인 첫 번째 프로모터에 작동가능한 형태로 연결된 검출 마커를 암호화하는 첫번째 핵산 서열, 및 비-수용성 세포에서 활성인 두번째 프로모터에 작동가능한 형태로 연결된 외래 핵산 서열을 포함하는 두 번째 핵산 서열을 포함하는 다중 독립적 프로모터를 가지는 재조합 배큘로바이러스 발현 벡터가 개시되었다.
또한, 특허 문헌 5에서는 닭 β 액틴(chicken β actin) 유래 CAG 프로모터에 연결된 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(hemagglutinin; HA) 항원-발현 재조합 배큘로바이러스 벡터를 인플루엔자 바이러스의 감염에 대한 예방 효과를 가짐으로 인한 백신 제형으로의 이용이 개시되었다.
또한, 특허 문헌 6에서는 세포 표면에 발현가능한 단백질들을 암호화하는 유전자가 배큘로바이러스 프로모터에 연결되고 상기 프로모터는 포유류 세포로부터 유래된 플라스미드, 및 세포 표면에 발현가능한 단백질들을 암호화하는 유전자가 2개의 배큘로바이러스 프로모터에 연결되고 상기 프로모터 각각은 곤충 세포내에 공동-형질도입된 플라스미드 내에 공동-형질도입 단계를 포함하는 배큘로바이러스 벡터를 제조하는 방법이 개시되었다.
또한, 특허 문헌 7에서는 인플루엔자 바이러스 HA 유래 cDNA가 CAG 프로모터내에 통합된 재조합 배큘로바이러스를 이용한 인플루엔자 바이러스로의 감염에 대한 항-인플루엔자 바이러스 활성에 관한 연구를 규명하였고, 이는 재조합 배큘로바이러스뿐만 아니라 야생형 배큘로바이러스가 활성을 가지는 것이 개시되었다.
상기에서 보는 바와 같이, 최근에는 다양한 재조합 배큘로바이러스가 개발되었고, 그러한 재조합 배큘로바이러스 벡터를 유효성분으로 함유하는 포유류용 약제를 개발하기 위한 많은 시도가 있었다.
본 기술 분야에서는, 신규한 구조를 가지는 재조합 배큘로바이러스 벡터, 및 말라리아 및 인플루엔자 등과 같은 감염성 질환, 또는 암 등과 같은 질환에 효과가 있는 재조합 배큘로바이러스를 유효성분으로 이용하는 약제형, 특히 백신 제형의 개발이 요구되어지고 있다.
특허문헌 1: 일본 등록특허 제 3366328호, 다중 프로모터 배큘로바이러스 발현 시스템 및 결손 입자 산물.
특허문헌 2: WO98/011243, 변형된 암호화 단백질을 가지는 비-포유류 DNA 바이러스.
특허문헌 3: 일본 특허공개 제 2002-235236-A호, 단백질을 생산하는 방법.
특허문헌 4: 일본 특허공개 제 2003-284557-A호, 신규한 배큘로바이러스-형질도입 벡터 및 외래 유전자의 발현을 위한 재조합 배큘로바이러스.
특허문헌 5: WO02/062381, 배큘로바이러스 벡터 백신.
특허문헌 6: WO04/029259, 배큘로바이러스 벡터, 배큘로바이러스 벡터의 제조 방법 및 유전자 도입 방법.
특허문헌 7: 일본 특허공개 제 2005-15346-A호, 배큘로바이러스-포함 항-바이러스제.
본 발명의 목적은 신규한 재조합 전달 벡터, 상기 재조합 전달 벡터와 배큘로바이러스 DNA의 상동 재조합에 의해 획득된 재조합 배큘로바이러스, 및 이의 제조 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 배큘로바이러스를 유효성분으로 이용하는 약제, 특히 백신 제형을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 곤충 세포 및 척추동물(특히, 포유류 및 조류)세포 내에서 원하는 면역원성(immunogenicity)을 가지는 단백질의 융합 단백질, 또는 바이러스의 구조 단백질을 가지는 부분 단백질을 발현할 수 있는 신규한 구조를 가진 전달 벡터; 및 상기 전달벡터와 배큘로바이러스 DNA의 상동 재조합에 의해 획득된 재조합 배큘로바이러스를 규명하였다. 상기 재조합 배큘로바이러스를 제공함으로써, 감염성 질환에 대한 유효한 예방 또는 치료 효과를 가지는 상기 재조합 배큘로바이러스를 유효성분으로 포함하는 약제에 대한 광범위한 연구가 수행되었다. 그 결과, 본 발명자들은 상기 재조합 배큘로바이러스가 원하는 약제로서 효과를 가지는 것을 규명하였다.
이와 같이, 본 발명자들은, 신규한 구조를 가지는 재조합 전달벡터, 상기 전달벡터와 배큘로바이러스 DNA의 상동 재조합에 의해 획득된 재조합 배큘로바이러스, 및 이의 제조 방법이 확인되었고, 상기 재조합 배큘로바이러스 자체가 표적 세포들에서 면역원성을 가지는 단백질을 발현할 수 있는 약제로서 유용하고, 말라리아 및 인플루엔자 등과 같은 감염성 질환에 대한 예방용 약제로서 유용하다는 것을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 하기 [1] 내지 [22]에서 보여주는 발명을 제공한다:
[1] pCAP-PfCSP, pCAP-PfCSP/272, pCAP-PfCSP/467, pCAP-PfCSP(A361E), pCAP-PfCSP(A361E)/272, pCAP-PfCSP(A361E)/467, pCAP-PfCSP-76, pCAP-PfCSP-76/467, pCAP-PfCSP+209, pCAP-PfCSP+209/467, pCAP-PfCSP+76/209, pCAP-PfCSP+76/209/467, pCAP-HA1/Anhui, pCAP-HA1/Anhui/272, pCAP-HA1/Anhui/467, pCAP-HA1/Vietnam, pCAP-HA1/Vietnam/51, pCAP-HA1/Vietnam/101, pCAP-HA1/Vietnam/154, pCAP-HA1/Vietnam/201, pCAP-HA1/Vietnam/272, pCAP-HA1/Vietnam/467, pCAP-AH/345, pCAP-AH/345/467, pCAP-AH/410, pCAP-AH/410/467, pCAP-AH/473, pCAP-AH/473/467, pCAP-AH/520, pCAP-AH/520/467, pCAP-VN/346, pCAP-VN/346/467, pCAP-VN/410, pCAP-VN/410/467, pCAP-VN/473, pCAP-VN/473/467, pCAP-VN/520, pCAP-VN/520/467, pCAP-CO/full, pCAP-CO/full/467, pCAP-CO/19, pCAP-CO/19/467, pCAP-CO/76, pCAP-CO/76/467, pCAP-CO/205, pCAP-CO/205/467, pCA39-HA1/Anhui, pCA64-HA1/Anhui, pCA39-PfCSP(A361E), pCA64-PfCSP(A361E), pCAP-CO/full/VSV, pCAP-CO/19/VSV, pCAP-CO/76/VSV, pCAP-CO/205/VSV, pDual-Pfs25-PfCSP-gp64 및 pDual-PfMSP1-PfCSP-gp64로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 전달 벡터.
[2] AcNPV-CAP-PfCSP, AcNPV-CAP-PfCSP/272, AcNPV-CAP-PfCSP/467, AcNPV-CAP-PfCSP(A361E), AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)/272, AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)/467, AcNPV-CAP-PfCSP-76, AcNPV-CAP-PfCSP-76/467, AcNPV-CAP-PfCSP+209, AcNPV-CAP-PfCSP+209/467, AcNPV-CAP-PfCSP+76/209, AcNPV-CAP-PfCSP+76/209/467, AcNPV-CAP-HA1/Anhui, AcNPV-CAP-HA1/Anhui/272, AcNPV-CAP-HA1/Anhui/467, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/51, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/101, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/154, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/201, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/272, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/467, AcNPV-CAP-AH/345, AcNPV-CAP-AH/345/467, AcNPV-CAP-AH/410, AcNPV-CAP-AH/410/467, AcNPV-CAP-AH/473, AcNPV-CAP-AH/473/467, AcNPV-CAP-AH/520, AcNPV-CAP-AH/520/467, AcNPV-CAP-VN/346, AcNPV-CAP-VN/346/467, AcNPV-CAP-VN/410, AcNPV-CAP-VN/410/467, AcNPV-CAP-VN/473, AcNPV-CAP-VN/473/467, AcNPV-CAP-VN/520, AcNPV-CAP-VN/520/467, AcNPV-CAP-CO/full, AcNPV-CAP-CO/full/467, AcNPV-CAP-CO/19, AcNPV-CAP-CO/19/467, AcNPV-CAP-CO/76, AcNPV-CAP-CO/76/467, AcNPV-CAP-CO/205, AcNPV-CAP-CO/205/467, AcNPV-CA39-HA1/Anhui, AcNPV-CA64-HA1/Anhui, AcNPV-CA39-PfCSP(A361E), AcNPV-CA64-PfCSP(A361E), AcNPV-CAP-CO/full/VSV, AcNPV-CAP-CO/19/VSV, AcNPV-CAP-CO/76/VSV, AcNPV-CAP-CO/205/VSV, AcNPV-Dual-Pfs25-PfCSP-gp64 및 AcNPV-Dual-PfMSP1-PfCSP-gp64로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 재조합 배큘로바이러스.
[3] [2]의 재조합 배큘로바이러스를 유효성분으로 포함하는 감염성 질환용 조성물.
[4] 근육 내(intramuscular), 호흡기 내(respiratory), 또는 비강 내(nasal) 경로에 의해 투여되는 것을 특징으로 하는 [2]의 재조합 배큘로바이러스를 유효성분으로 포함하는 감염성 질환용 조성물.
[5] [2]의 재조합 배큘로바이러스를 유효성분으로 포함하는 백신.
[6] 근육 내(intramuscular), 호흡기 내(respiratory), 또는 비강 내(nasal) 경로에 의해 투여되는 것을 특징으로 하는 [3]의 재조합 배큘로바이러스를 유효성분으로 포함하는 백신.
[7] AcNPV-CAP-HA1/Anhui, AcNPV-CAP-HA1/Anhui/272, AcNPV-CAP-HA1/Anhui/467, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/51, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/101, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/154, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/201, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/272, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/467, AcNPV-CAP-AH/345, AcNPV-CAP-AH/345/467, AcNPV-CAP-AH/410, AcNPV-CAP-AH/410/467, AcNPV-CAP-AH/473, AcNPV-CAP-AH/473/467, AcNPV-CAP-AH/520, AcNPV-CAP-AH/520/467, AcNPV-CAP-VN/346, AcNPV-CAP-VN/346/467, AcNPV-CAP-VN/410, AcNPV-CAP-VN/410/467, AcNPV-CAP-VN/473, AcNPV-CAP-VN/473/467, AcNPV-CAP-VN/520, AcNPV-CAP-VN/520/467, AcNPV-CA39-HA1/Anhui 및 AcNPV-CA64-HA1/Anhui로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나를 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염 예방 또는 치료제.
[8] [7]에 있어서, 근육 내(intramuscular), 호흡기 내(respiratory), 또는 비강 내(nasal) 경로에 의해 투여되는 것을 특징으로 하는 인플루엔자 바이러스 감염 예방 또는 치료제.
[9] AcNPV-CAP-HA1/Anhui, AcNPV-CAP-HA1/Anhui/272, AcNPV-CAP-HA1/Anhui/467, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/51, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/101, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/154, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/201, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/272, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/467, AcNPV-CAP-AH/345, AcNPV-CAP-AH/345/467, AcNPV-CAP-AH/410, AcNPV-CAP-AH/410/467, AcNPV-CAP-AH/473, AcNPV-CAP-AH/473/467, AcNPV-CAP-AH/520, AcNPV-CAP-AH/520/467, AcNPV-CAP-VN/346, AcNPV-CAP-VN/346/467, AcNPV-CAP-VN/410, AcNPV-CAP-VN/410/467, AcNPV-CAP-VN/473, AcNPV-CAP-VN/473/467, AcNPV-CAP-VN/520, AcNPV-CAP-VN/520/467, AcNPV-CA39-HA1/Anhui 및 AcNPV-CA64-HA1/Anhui로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나를 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염 백신.
[10] [9]에 있어서, 근육 내(intramuscular), 호흡기 내(respiratory), 또는 비강 내(nasal) 경로에 의해 투여되는 것을 특징으로 하는 인플루엔자 바이러스 감염 백신.
[11] AcNPV-CAP-PfCSP, AcNPV-CAP-PfCSP/272, AcNPV-CAP-PfCSP/467, AcNPV-CAP-PfCSP(A361E), AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)/272, AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)/467, AcNPV-CAP-PfCSP-76, AcNPV-CAP-PfCSP-76/467, AcNPV-CAP-PfCSP+209, AcNPV-CAP-PfCSP+209/467, AcNPV-CAP-PfCSP+76/209, AcNPV-CAP-PfCSP+76/209/467, AcNPV-CAP-CO/full, AcNPV-CAP-CO/full/467, AcNPV-CAP-CO/19, AcNPV-CAP-CO/19/467, AcNPV-CAP-CO/76, AcNPV-CAP-CO/76/467, AcNPV-CAP-CO/205, AcNPV-CAP-CO/205/467, AcNPV-CA39-PfCSP(A361E), AcNPV-CA64-PfCSP(A361E), AcNPV-CAP-CO/full/VSV, AcNPV-CAP-CO/19/VSV, AcNPV-CAP-CO/76/VSV, AcNPV-CAP-CO/205/VSV, AcNPV-Dual-Pfs25-PfCSP-gp64 및 AcNPV-Dual-PfMSP1-PfCSP-gp64로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나를 유효성분으로 포함하는 인간 말라리아 감염 예방 또는 치료제.
[12] [11]에 있어서, 근육 내(intramuscular), 호흡기 내(respiratory), 또는 비강 내(nasal) 경로에 의해 투여되는 것을 특징으로 하는 인간 말라리아 감염 예방 또는 치료제.
[13] AcNPV-CAP-PfCSP, AcNPV-CAP-PfCSP/272, AcNPV-CAP-PfCSP/467, AcNPV-CAP-PfCSP(A361E), AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)/272, AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)/467, AcNPV-CAP-PfCSP-76, AcNPV-CAP-PfCSP-76/467, AcNPV-CAP-PfCSP+209, AcNPV-CAP-PfCSP+209/467, AcNPV-CAP-PfCSP+76/209, AcNPV-CAP-PfCSP+76/209/467, AcNPV-CAP-CO/full, AcNPV-CAP-CO/full/467, AcNPV-CAP-CO/19, AcNPV-CAP-CO/19/467, AcNPV-CAP-CO/76, AcNPV-CAP-CO/76/467, AcNPV-CAP-CO/205, AcNPV-CAP-CO/205/467, AcNPV-CA39-PfCSP(A361E), AcNPV-CA64-PfCSP(A361E), AcNPV-CAP-CO/full/VSV, AcNPV-CAP-CO/19/VSV, AcNPV-CAP-CO/76/VSV, AcNPV-CAP-CO/205/VSV, AcNPV-Dual-Pfs25-PfCSP-gp64 및 AcNPV-Dual-PfMSP1-PfCSP-gp64로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나를 유효성분으로 포함하는 인간 말라리아 감염 예방 또는 치료제.
[14] [13]에 있어서, 상기 약제는 근육 내(intramuscular), 호흡기 내(respiratory), 또는 비강 내(nasal) 경로에 의해 투여되는 것을 특징으로 하는 인간 말라리아 감염 예방 또는 치료제.
[15] 유효한 양의 [2]의 재조합 배큘로바이러스, [3] 또는 [4]의 감염성 질환용 조성물, 또는 [5], [6], [9], [10], [13] 또는 [14]의 백신을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 말라리아 또는 인플루엔자 감염 예방 또는 말라리아 또는 인플루엔자 치료 방법.
[16] [15]에 있어서, 상기 재조합 배큘로바이러스, 조성물, 또는 백신은 리포솜 제형으로 개체에 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
[17] [15]에 있어서, 상기 재조합 배큘로바이러스, 조성물, 또는 백신은 근육 내(intramuscular), 호흡기 내(respiratory), 또는 비강 내(nasal) 경로에 의해 개체에 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
[18] [16]에 있어서, 상기 재조합 배큘로바이러스, 조성물, 또는 백신은 근육 내(intramuscular), 호흡기 내(respiratory), 또는 비강 내(nasal) 경로에 의해 개체에 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
[19] 유효한 양의 [2]의 재조합 배큘로바이러스, [3] 또는 [4]의 감염성 질환용 조성물, 또는 [5], [6], [9], [10], [13] 또는 [14]의 백신을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 면역자극방법.
[20] [19]에 있어서, 상기 재조합 배큘로바이러스, 조성물, 또는 백신은 리포솜 제형으로 개체에 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
[21] [19]에 있어서, 상기 재조합 배큘로바이러스, 조성물, 또는 백신은 근육 내(intramuscular), 호흡기 내(respiratory), 또는 비강 내(nasal) 경로에 의해 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
[22] [20]에 있어서, 상기 재조합 배큘로바이러스, 조성물, 또는 백신은 근육 내(intramuscular), 호흡기 내(respiratory), 또는 비강 내(nasal) 경로에 의해 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
본 발명은, 신규한 재조합 전달 벡터, 재조합 전달 벡터와 배큘로바이러스 DNA의 상동 재조합에 의해 제조된 재조합 배큘로바이러스, 및 이의 제조방법을 제공한다. 본 발명의 재조합 배큘로바이러스를 활성 성분으로 포함한 약제는 말라리아와 인플루엔자와 같은 감염성 질환의 치료 또는 예방제 또는 세포 치료제와 백신 제제로 유용하다.
도 1은 실시예 3에서 곤충 세포에서 본 발명의 재조합 배큘로바이러스들로부터 백신 항원 발현 실험의 결과를 보여주는 그림이다.
gp64 단일클론 항체(AcV5)에 의해 확인되었다.
레인(lane) 1: AcNPV-WT;
레인 2: AcNPV-CAP-PfCSP;
레인 3: AcNPV-CAP-HA1/Anhui; 및
레인 4: AcNPV-CAP-HA1/Vietnam.
도 2 (A)는 재조합 전달 벡터로부터 생산된 재조합 배큘로바이러스의 바이러스 파티클에서 사람 말라리아의 CSP 유전자(PfCSP)의 발현을 보여주는 웨스턴 블랏 분석(Western blotting analysis) 결과를 보여주는 그림이다.
항-PfCSP 단일클론 항체(2A10)에 의해 확인되었다.
레인 1: AcNPV-CAP-PfCSP;
레인 2: AcNPV-CAP-PfCSP/272; 및
레인 3: AcNPV-CAP-PfCSP/467
도 2 (B)는 재조합 전달 벡터로부터 생산된 재조합 배큘로바이러스의 바이러스 파티클에서 H5N1/HA1 유전자의 발현을 보여주는 웨스턴 블랏 분석(Western blotting analysis) 결과를 보여주는 그림이다.
H5N1/베트남 토끼 다중클론 항체(IT-003-005)에 의해 확인되었다.
레인 1: AcNPV-WT(세포 용해물);
레인 2: AcNPV-CAP-HA1/Anhui(세포 용해물);
레인 3: AcNPV-CAP-HA1/Vietnam(세포 용해물);
레인 4: AcNPV-WT(비리온);
레인 5: AcNPV-CAP-HA1/Vietnam(비리온); 및
레인 6: 정제된 H5N1/Anhui 항원(IT-003-0053p)
도 3은 HepG2 세포에서 PfMSP1 유전자와 PfCSP 유전자의 융합 유전자를 포함한 재조합 배큘로바이러스에 의해 발현된 항원을 표시할 수 있는 형광-표지 항체로 HepG2 세포를 염색하여 보여준 사진이다. 도 3 (A)의 결과에서 PfCSP 항원이 발현되었음을 확인하였다. 도 3 (B)의 결과에서 PfMSP-119 항원이 발현되었음을 확인하였다.
도 4는 실시예 6에서 제조된 항체의 역가를 측정한 결과를 보여주는 그림이다.
도 5는 본 발명의 전달 벡터를 보여주는 그림이다.
본 발명에 있어서, 아미노산, 펩티드, 염기 서열 및 핵산의 약어는 IUPAC-IUB에 의해 정의된 Biological Nomenclature, Eur. J. Biochem., 138: 9(1984)에서 IUPAC-IUB 정보인 "염기 서열 및 아미노산 서열을 포함하는 명세서 작성 가이드라인"(특허 사무소) 및 당업계에 공통적으로 사용되는 기록에 준수한다. 본 발명에 있어서, DNA 분자는 이중 가닥 DNA뿐만 아니라, 상기 이중 가닥 DNA를 구성하는 센스 사슬 및 안티센스 사슬을 포함하는 단일 가닥 DNA를 포함하며, 이의 길이는 한정되지 않는다. 따라서, 본 발명의 면역성 외래 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드(DNA 분자)는 별도의 언급이 없으면 게놈 DNA를 포함하는 이중 가닥 DNA, 및 cDNA를 포함하는 단일 가닥 DNA(센스 사슬), 상기 센스 사슬에 상보적인 서열을 가지는 단일 가닥 DNA(안티센스 사슬) 및 이들의 합성 DNA 단편을 포함한다.
본 발명에 있어서, 폴리뉴클레오티드 또는 DNA 분자는 기능적 부위로 한정되지 않으며, 발현 억제 부위, 암호화 부위, 리더 서열, 엑손 및 인트론 중 적어도 어느 하나를 포함할 수 있다.
또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 RNA 및 DNA를 포함한다. 특정 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드 및 특정 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드는 이의 단편(fragments), 상동체(homologs), 유도체(derivatives) 및 돌연변이(mutants)를 포함한다.
상기 폴리뉴클레오티드의 돌연변이, 예를 들어 돌연변이 DNA는 자연적으로 발생하는 대립형질 돌연변이, 비-자연적으로 발생하는 돌연변이, 및 결핍, 치환, 추가 및 삽입을 가지는 돌연변이를 포함한다. 그러나, 이들 돌연변이들은 돌연변이 전 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드의 기능과 실질적으로 동일한 기능을 가지는 폴리펩티드를 암호화한다.
본 발명에 있어서, 전달 벡터는 하나의 척추동물 프로모터(말라리아 프로모터, 조류 프로모터) 및 다른 하나의 배큘로바이러스 프로모터를 연결한 이중 프로모터의 다운스트림(downstream)에 적어도 하나의 바이러스 입자의 성분이 될 수 있는 단백질을 암호화하는 유전자 및 적어도 하나의 면역성 외래 유전자를 포함하는 융합 유전자를 연결한 것을 특징으로 하는 재조합 배큘로바이러스를 생산하는 플라스미드를 의미한다.
본 발명의 바람직한 실시예에 있어서, 상기 면역성 외래 유전자는 상기 이중 프로모터의 다운스트림(downstream) 및 바이러스 입자의 성분이 될 수 있는 단백질을 암호화하는 유전자의 업스트림(upstream)에 위치되는 것이 바람직하다. 본 발명의 재조합 배큘로바이러스는 약제 또는 백신의 유효성분으로 척추동물에 사용될 수 있다. 상기 척추동물로는 소, 말, 돼지, 양, 염소, 원숭이, 쥐, 개 및 고양이 등 인간을 포함한 포유류, 닭, 메추라기, 거위, 야생 오리, 비둘기, 칠면조, 기니 닭 및 앵무새 등과 같은 조류를 예로 들 수 있다.
하나의 실시예에 있어서, 본 발명은 하나의 척추동물 프로모터가 다른 하나의 배큘로바이러스 프로모터에 연결된 이중 프로모터의 조절하에 곤충세포 내에서 발현이 가능한 바이러스 막 단백질을 암호화하는 유전자와 면역성 외래 유전자를 포함하는 융합 유전자가 통합된 신규한 구조를 포함하는 전달벡터를 제공한다. 상기 전달벡터와 배큘로바이러스 DNA를 곤충세포내로 공동-형질도입하여 상동 재조합을 유도함으로써, 곤충세포 내에서 배큘로바이러스 프로모터의 조절하에 발현되고, 바이러스 입자의 성분이 될 수 있는 융합 단백질을 생산할 수 있는 융합 유전자가 통합되어 있는 재조합 배큘로바이러스를 획득한다.
본 발명에 있어서, 재조합 배큘로바이러스가 척추동물에 투여되었을 때, 분리되는 바이러스 입자의 성분이 될 수 있는 단백질과 면역성 단백질의 융합 단백질이 백신 성분으로 기능할 수 있다. 또한, 상기 척추동물에 투여된 재조합 배큘로바이러스는 척추동물 세포 내에 침입하고, 원하는 면역성 외래 항원을 가진 융합 항원이 척추동물 세포의 바이러스 게놈으로부터 생산되며, DNA 백신으로서 기능한다.
그러므로, 예를 들어, 본 발명의 재조합 배큘로바이러스를 포유류에 투여하게 되면, 면역성 단백질을 가진 바이러스 입자의 성분이 될 수 있는 단백질의 융합 단백질이 바이러스 입자의 표면에 항원으로서 존재하고, 상기 면역성 단백질을 가진 바이러스 입자의 성분이 될 수 있는 단백질의 융합 단백질이 포유류 세포에서 생산되어, 이의 면역잠재적 활성으로 인하여, 바이러스, 원생동물 및 박테리아와 같은 감염성 질병의 예방 및 치료제로 기능할 것으로 사료된다.
전달벡터와 함께 공동-형질도입되는 배큘로바이러스 DNA는 야생형, 돌연변이 및 재조합 배큘로바이러스 DNA 중 어느 하나가 될 수 있다. 상기 공동-형질도입이 가능한 숙주세포로는 예를 들어 밤나방(Spodoptera frugiperda)과 같은 곤충 세포를 포함한다.
본 발명에 있어서, 면역성 외래 유전자는 말라리아 및 인플루엔자와 같은 감염성 질환의 예방 및 치료를 위한 백신 치료를 포함하는 면역치료의 면역원으로서 이용되는 항원성 단백질의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자를 가리키고, 특정 예들은 말라리아 항원 및 인플루엔자 바이러스 항원의 단백질의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자를 포함한다.
본 발명에서 사용되는 상기 "외래" 유전자는 외부로부터 도입된 유전자를 의미하고, 동일한 유전자가 세포내에 존재할지라도, 외부로부터 도입된 유전자는 "외래" 유전자"로 나타낸다.
본 발명에 있어서, 면역원으로 사용되는 단백질의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자는 감염성 질환과 같은 질환을 유발하는 원인 물질에 대한 면역성을 가지는 항원성 단백질의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자라면 특별히 제한하지 않는다. 이런 면역성을 가지는 항원성 단백질의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자의 예는 하기를 포함한다.
상기 말라리아 항원의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자는 말라리아 기생충의 종충(sporozoite) 표면 항원 CSP(Circumsporozoite Protein), 낭충(merozoite) 표면의 막 단백질의 MSP1(merozoite surface protein 1), 말라리아로 감염된 적혈구로부터 분비된 말라리아 S 항원, 말라리아로 감염된 적혈구 덩이에 존재하는 PfEMP1 단백질, SERA 단백질, TRAMP 단백질 및 AMA1 단백질 등을 예로 들 수 있다.
상기 인플루엔자 바이러스 항원의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자는 HA 항원(hemagglutinin antigen), NA 항원(neuraminidase antigen), M2 항원(matrix protein antigen) 및 NP 항원(nucleoprotein antigen) 등과 같은 단백질의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자를 예로 들 수 있다.
척추동물 유전자와 관련하여, 포유류 유전자는 인간, 소, 말, 돼지, 양, 원숭이, 쥐, 개 및 고양이 등에서의 감염성 질환에 대한 항원성 단백질의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자를 예로 들 수 있다. 조류 유전자는 닭(chickens), 야생 오리(wild ducks), 비둘기(pigeons), 칠면조(turkeys), 기니 닭(guinea fowls) 및 앵무새(parrots) 등에서의 감염성 질환에 대한 항원성 유전자(예를 들어, 조류 인플루엔자 HA 항원)를 예로 들 수 있다.
상기 포유류 및 조류에서의 감염성 질환과 관련성이 보고된 병원성 유전자는 GenBank와 같은 병원성 유전자 등의 등록된 공용 데이타가 저장된 기관으로부터 용이하게 이용가능하다.
본 발명은 면역성 외래 유전자를 가지는 전달벡터, 및 이의 상동 재조합에 의해 획득된 재조합 배큘로바이러스를 제공할 뿐만 아니라, 면역성 외래 유전자를 가지는 상기 재조합 배큘로바이러스를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물 및 상기 약학적 조성물로 구성되는 백신 제형을 제공한다.
본 발명에 사용되는 배큘로바이러스는 곤충에서 감염을 유발하는 곤충 병원성 바이러스이고, 유전자로서 환식 이중 가닥(cyclic double strand) DNA를 가지는 DNA 바이러스군(Baculoviridae)이다. 상기 바이러스 군은 감염의 후기 단계에서 감염된 세포내 핵에서 폴리히드린(polyhedrin)이라 불리는, 세포 함유물을 생산함으로 인해 핵 다면체 바이러스(nuclear polyhedorosis virus; NPV)라고 불린다. 상기 바이러스는 외래 유전자가 폴리히드린(polyhedrin) 유전자 대신 삽입되어 발현됨에도, 바이러스가 감염되어 원하는 외래 유전자 산물을 많은 양이 생산되기까지 충분히 성장한다. 따라서, 최근에 상기 바이러스는 원하는 단백질의 생산에 이용되고 있다.
본 발명에 사용된 배큘로바이러스의 예로는, 오토그라파 캘리포니카 핵다각체병 바이러스(Autographa Californica Nuclear Polyhedorosis Virus: AcNPV), 봄빅스 모리 핵다각체병 바이러스(Bombyx mori Nuclear Polyhedorosis Virus: BmNPV), 오르기아 슈도츄가타 핵다각체병 바이러스(Orgyia pseudotsugata Nuclear Polyhedorosis Virus: OpNPV) 및 리만트리아 디스퍼 핵다각체병 바이러스(Lymantria disper Nuclear Polyhedorosis Virus: LdNPV)가 될 수 있다.
상기 배큘로바이러스 DNA는 본 발명의 전달벡터와 상동 재조합을 수행할 수 있는 DNA일 수 있다. 특히, 본 발명의 전달벡터와 상동 재조합을 수행할 수 있는 상기 배큘로바이러스 DNA의 바이러스 유전자는 130 kbp의 큰 크기이고, 15 kbp 또는 그 이상의 면역성 외래 유전자가 삽입될 수 있다. 배큘로바이러스 유전자 자체는 척추동물 세포에서 거의 발현되지 않기 때문에, 그 세포독성은 고려될 필요가 거의 없다. 따라서, 이는 해로운 면역반응이 유도되지 않는 것으로 생각된다.
(1) 본 발명의 전달벡터 및 전달벡터의 제조
면역성 외래 유전자 DNA 의 제조
배큘로바이러스 전달 벡터의 성분 중 하나인, 바이러스 유전자에 융합될 수 있는 면역성 외래 유전자는 본 발명의 목적의 면역성을 가지는 항원 단백질의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 핵산 서열 정보를 기초로 합성하거나, 면역성 외래 유전자의 핵산 서열 정보를 기초로 한 면역성 외래 유전자의 암호화 부위의 핵산 서열에 대응하는 DNA를 직접 합성(화학적 DNA 합성 방법)함으로써 용이하게 제조 및 획득될 수 있다. 일반적인 유전자 공학 기술이 상기 제조에 적용될 수 있다(예를 들어, Molecular Cloning 2d Ed, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989; Zoku Seikagaku Jikken Kouza, "Idenshi Kenkyuho I, II, III" edited by the Japanese Biochemistry Society, 1986).
상기 DNA의 합성 방법으로서, 화학적 합성은 포스페이트 트리에스테르 방법(phosphate triester method), 포스페이트 아미디트 방법(phosphate amidite method)(J. Am . Chem . Soc ., 89, 4801, 1967; ibid., 91, 3350, 1969; Science , 150, 178, 1968; Tetrahedron Lett ., 22, 1859, 1981; ibid ., 24, 245, 1983) 및 이의 조합 방법 등이 예시될 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 DNA는 포스페이트 아미디트 방법 또는 포스페이트 트리에스테르 방법에 의해 화학적으로 합성될 수 있고, 상업적으로 이용가능한 자동 올리고뉴클레오티드 합성자(synthesizer)를 이용하여 합성될 수 있다. 이중 가닥 단편은 상보적인 사슬이 합성되고, 적절한 조건 하에서 화학적으로 합성된 단일 가닥으로 상보적인 사슬을 풀고, DNA 폴리머라제를 이용하여 화학적으로 합성된 단일 가닥에 적절한 프라이머 서열로 상보적인 사슬을 추가함으로써 획득될 수 있다.
본 발명에서 제조된 면역성 외래 유전자 DNA의 구체적인 양상으로서, 말라리아 항원 단백질의 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 서열 및 인플루엔자 바이러스 항원 단백질의 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 서열로 구성된 DNA가 예시될 수 있다.
본 발명에서 이용되는 DNA는 면역성을 가지는 항원 단백질의 폴리펩티드의 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 서열의 전장 DNA 서열에 한정되지 않고, DNA 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열의 단백질이 면역성을 가지는 한 부분적인 서열을 암호화하는 DNA 서열이 될 수 있다.
본 발명에 사용된 면역성 외래 유전자의 DNA는 상기 특정한 DNA 서열을 가지는 DNA 분자에 한정되지 않고, 각 아미노산 잔기에 대해 적절하게 선택된 코돈에 의해 제조된 DNA 서열을 가질 수 있다. 상기 코돈의 선별은 표준 방법에 따라서 수행될 수 있다. 예를 들어, 이때 이용되는 숙주세포에서 코돈의 이용빈도가 고려될 수 있다(Nucleic Acids Res., 9, 43, 1981).
본 발명에 사용된 유전자 공학 기술에 의해 면역성 외래 유전자의 DNA를 제조하는 방법은 구체적으로, 표준 방법들에 따라 면역성 외래 유전자의 DNA를 발현하는 적절한 기원으로부터 cDNA 라이브러리를 제조하고, 상기 면역성 외래 유전자에 대한 본래의 발현 산물에 대항하는 적절한 프로브 또는 항체를 이용하여 상기 라이브러리로부터 원하는 클론을 선별함으로써 수행될 수 있다(예를 들어, Proc . Natl. Acad . Sci ., USA., 78, 6613, 1981; Science , 222, 778, 1983 참조).
상기 게놈 DNA의 기원으로서, 면역성 외래 유전자의 DNA를 발현하는 다양한 세포들, 조직들 및 이들로부터 유래된 배양된 세포들이 예시될 수 있다. 특히, 상기 기원으로서 말라리아 기생충으로 감염된 적혈구의 추출물 및 인플루엔자 바이러스로 감염된 세포의 추출물이 사용되는 것이 바람직하다. 상기 기원으로부터 총 DNA 및 RNA의 추출 및 분리, mRNA의 분리 및 정제, 및 cDNA의 획득 및 클로닝은 표준 방법에 따라 수행될 수 있다.
아울러 상기 기원으로서 추출물에 의해 준비된 각 면역성 조직 또는 세포로부터 mRNA의 추출, 분리 및 정제에 의해 획득된 각 면역원의 cDNA 라이브러리를 이용하여 획득함으로써 수행될 수 있다. 면역성 외래 유전자의 DNA의 제조는 각 면역원의 mRNA을 추출하고, 상기 RNA에 폴리 A(poly A)를 첨가하고, 폴리 A-결합된 RNA를 수집하고, 역전사효소를 이용하여 cDNA를 제조하고, 상기 cDNA의 양쪽 말단에 제한효소 부위를 첨가하고, 각 파지(phage)내로 cDNA를 도입하여 제조된 파지 라이브러리를 이용하여 제조할 수 있다.
상기 cDNA 라이브러리 유래 면역성 외래 유전자의 DNA를 스크리닝하는 방법은 특별히 한정되지 않으며, 일반적인 방법들에 따라 수행될 수 있다. 상기 특별한 방법으로서, 예를 들어 상기 cDNA에 의해 생산되는 단백질에 대한 특이적인 항체(항-말라리아 항체, 항-인플루엔자 항체 등)를 이용하여 면역학적 스크리닝에 의해 대응하는 cDNA 클론을 선별하는 방법; 목적 DNA 서열에 선택적으로 결합하는 프로브를 이용하는 프라크 잡종방법(plaque hybridization method); 콜로니 잡종방법(colony hybridization method); 및 이들의 조합이 예시될 수 있다.
상기 잡종 방법에 이용된 프로브로서, 면역성 외래 유전자의 DNA 서열에 대한 정보를 기초로 화학적으로 합성된 DNA 단편들이 일반적이다. 이미 획득된 면역성 외래 유전자 및 이의 단편의 DNA 서열은 상기 프로브로서 유용하게 이용될 수 있다. 또한, 면역성 외래 유전자의 DNA 서열 정보를 기초로 고안된 센스 프라이머 및 안티센스 프라이머는 상기 스크리닝을 위한 프로브로서 이용될 수 있다.
상기 프로브로 사용되는 DNA(뉴클레오티드들)은 면역성 외래 유전자의 DNA 서열에 대응하는 부분적인 DNA(뉴클레오티드들)이고, 적어도 15개의 연속적인 DNA를 가지는, 바람직하게는 적어도 20개의 연속적인 DNA를 가지는, 더 바람직하게는 적어도 30개의 연속적인 DNA를 가지는 것이다. 또한, 상기 DNA를 생산하는 양성 클론(positive clone)은 상기 프로브로 사용될 수 있다.
면역성 외래 유전자의 DNA가 획득되었을 때, PCR에 의한 DNA/RNA 증폭 방법(Science , 230, 1350, 1985)은 적절하게 이용될 수 있다. 특히, 전장 cDNA가 라이브러리로부터 일부 획득되었을 때, RACE 방법(cDNA 말단의 급속한 증폭; Jikken Igaku 12(6), 35, 1994), 특히 5'-RACE 방법(M. A. Frohman, et al., Proc . Natl. Acad . Sci ., USA., 8, 8998, 1988)이 적절하게 적용된다.
상기 PCR에 사용된 프라이머는 면역성 외래 유전자의 DNA 서열 정보를 기초로 고안될 수 있고, 표준 방법에 따라 합성될 수 있다. 이런 프라이머로서, 실시예에서 보여주는 바와 같이, 면역성 외래 유전자의 DNA가 내부에 통합될 수 있는 벡터의 양쪽 말단에 첨가되는 DNA 일부(SP6 프로모터/프라이머 및 T7 터미네이터/ 프라이머)가 이용될 수 있다.
PCR에 의해 증폭되는 DNA/RNA 단편의 분리/정제는 예를 들어 젤 전기영동 등의 표준 방법에 따라 수행될 수 있다.
상기와 같이 획득한 면역성 외래 유전자의 DNA 또는 다양한 DNA 단편에 대해서, 이들의 DNA 서열들은 예를 들어, 디디옥시 방법(dideoxy method)(Proc . Natl . Acad . Sci., USA., 74, 5463, 1977) 또는 맥삼-길버트 방법(Maxam-Gilbert method)(Methods in Enzymology, 65, 499, 1980), 또는 상업적으로 이용가능한 서열 키트 등의 표준 방법에 따라 결정될 수 있다.
바이러스 입자의 성분이 될 수 있는 단백질의 아미노산을 암호화할 수 있는 유전자는 곤충세포에서 바이러스 입자의 성분이 될 수 있는 단백질로서 발현될 수 있고, 목적 세포에서 면역성 외래 유전자를 융합함으로써 융합 단백질로서 발현될 수 있는 단백질을 암호화하는 유전자이면 어떤 것도 될 수 있다.
상기 바이러스 입자의 성분이 될 수 있는 단백질의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자로서, 예를 들어 gp64 단백질(GenBank Accession No. L22858), 수포성 구내염 바이러스 당단백질(Vesicular stomatitis virus glycoprotein)(GenBank Accession No. M21416), 허피스 심플렉스 바이러스 당단백질(herpes simplex virus glycoprotein)(KOS; GenBank Accession No. K01760), 제 1 유형 인간 면역결핍 바이러스 gp120(type I human immunodeficiency virus gp120)(GenBank Accession No. U47783), 인간 호흡기 세포융합 막 바이러스 당단백질(human respiratory syncytial virus membrane glycoprotein)(GenBank Accession No. M86651), 제 A 유형 인플루엔자 바이러스 헤마토글루티닌 단백질(type A influenza virus hemagglutinin protein)(GenBank Accession No. U38242), 또는 배큘로바이러스와 밀접하게 관련된 바이러스의 막 단백질의 유전자가 예시될 수 있다. 본 발명에 있어서, 실시예에서 보는 바와 같이 gp64 유전자가 바람직한 예시가 될 수 있다.
상기 바이러스 입자의 성분이 될 수 있는 단백질의 아미노산 서열을 암호화하는 DNA는 바이러스 입자의 성분이 될 수 있는 목적 단백질의 아미노산을 암호화하는 유전자의 폴리펩티드의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 핵산 서열 정보를 기초로 합성하거나, 면역성 외래 유전자의 DNA의 생산을 병행하는 경우로서 바이러스 입자의 성분이 될 수 있는 단백질의 아미노산을 암호화하는 유전자의 아미노산 서열 정보를 기초로 한 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 대응하는 DNA을 직접 합성(화학적 DNA 합성)함으로써 용이하게 제조 및 획득될 수 있다.
바이러스 입자의 성분이 될 수 있는 단백질의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산에 대응하는 DNA 서열은 암호화 부위의 전장에 한정되지 않으며, 부분적인 DNA 서열로 구성되는 DNA일 수 있다.
면역성 외래 유전자의 DNA 분자의 제조 하는 경우와 마찬가지로, 바이러스 입자의 성분이 될 수 있는 단백질의 아미노산을 암호화하는 유전자의 DNA는 일반적인 유전자 공학 기술(예를 들어, Molecular Cloning 2d Ed, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989; Zoku Seikagaku Jikken Kouza, "Idenshi Kenkyuho I, II, III" edited by the Japanese Biochemistry Society, 1986)에 의해 제조될 수 있다.
본 발명에 있어서, 면역성 외래 유전자의 발현을 조절하는 프로모터 부위가 통합되어 있고, 바이러스 입자의 아미노산을 암호화하는 유전자(부분)가 미리 도입된, 상업적으로 이용가능한 벡터 플라스미드가 이용될 수 있다.
척추동물 프로모터
본 발명에 이용된 전달벡터의 성분 중 하나인 척추동물 프로모터(척추동물에서 작용할 수 있는)로서, 포유류 프로모터 및 조류 프로모터 등의 프로모터들이 예시될 수 있다.
포유류 프로모터
본 발명에 이용된 전달벡터의 성분 중 하나인 포유류 프로모터(포유류 세포에서 작용할 수 있는)로서, 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus) 프로모터, SV40 프로모터, 레트로바이러스(retrovirus) 프로모터, 메탈로치오네인(metallothionein) 프로모터, 열충격 단백질(heat shock protein) 프로모터, CAG 프로모터, 연장인자 1α(elongation factor 1α) 프로모터, 액틴(actin) 프로모터, 유비퀴틴(ubiquitin) 프로모터, 알부민(albumin) 프로모터 및 MHC 클래스 Ⅱ(MHC class Ⅱ) 프로모터가 예시될 수 있다.
조류 프로모터
조류 프로모터로서, β 액틴(actin) 프로모터, 열충격 단백질(heat shock protein) 프로모터, 연장인자(elongation factor) 프로모터, 유비퀴틴(ubiquitin) 프로모터 및 알부민(albumin) 프로모터가 예시될 수 있다.
배큘로바이러스 프로모터
본 발명에 이용되는 배큘로바이러스 전달벡터의 성분 중 하나인 배큘로바이러스 프로모터로서, 다각체 단백질(polyhedrin) 프로모터, p10 프로모터, IE1 프로모터, p35 프로모터, p39 프로모터 및 gp64 프로모터가 예시될 수 있다.
재조합 전달벡터의 제조
본 발명은 곤충세포 및 척추동물 세포, 특히 포유류 세포 모두에서 항원 단백질로서 목적 면역성 외래 유전자를 발현할 수 있는 구조를 가지는 신규 전달벡터에 관한 것이다. 본 발명의 제조된 신규 전달벡터의 구조는 원하는 면역성 단백질의 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 서열 및 바이러스 입자의 성분이 될 수 있는 단백질의 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 서열은 하나의 척추동물 프로모터, 특히 포유류 프로모터 및 또 하나의 배큘로바이러스 프로모터가 연결된 프로모터의 다운스트림에 연결되어 있다. 하나의 척추동물 프로모터, 특히 포유류 프로모터 및 또 다른 배큘로바이러스 프로모터인 두 개의 프로모터의 DNA 서열을 포함하는 DNA 부위들은 직접적으로 연결되거나, 간섭(intervening) DNA 서열이 상기 두 프로모터의 DNA 서열 사이에 존재할 수 있다(그러나, 이런 경우에, 각 프로모터는 곤충세포 및 척추동물 세포, 특히 포유류 세포에서 프로모터 활성을 가지는 것이 필수적이다). 척추동물 프로모터, 특히 포유류 프로모터 또는 연결되는 배큘로바이러스 프로모터 중 어느 하나는 그들의 프로모터 부위에서 발현되는 유전자에 더 밀접하게 배열될 수 있다. 본 발명의 실시예에서, 배큘로바이러스 프로모터는 포유류 프로모터 보다 발현되는 유전자에 더 밀접하게 배열되어 있다.
상기 구조에 있어서, 바이러스 입자의 성분이 될 수 있는 단백질을 암호화하는 유전자 및 원하는 면역성 외래 유전자를 포함하는 융합 유전자의 DNA 서열에 있어서, 이들 두 유전자는 직접적으로 연결되거나, 간섭 DNA 서열이 그 들 사이에 존재할 수 있다(그러나, 이는 다운스트림 유전자와 업스트림 유전자의 프레임쉬프트(frameshift)가 유발하지 않게 DNA를 배열하는 것이 필수적이다). 원하는 면역성을 가지는 외래 유전자의 단백질의 항원 제시 부위(antigen presenting region)는 바이러스 입자의 성분이 될 수 있는 단백질에 융합되는 것이 바람직하다. 따라서, 바이러스 입자의 성분이 될 수 있는 단백질로부터 유래하는 원하는 면역성을 가지는 외래 유전자에 의해 암호화되는 단백질을 절단없이 융합된 형태로 이용되는 것이 필수적이다.
이런 두 유전자들을 포함하는 융합 유전자는 미리 형성된 후 벡터 내로 통합될 수 있다. 대안적으로, 하나의 유전자가 미리 벡터 내에 통합된 후, 연속적으로 다른 유전자가 벡터내 융합 유전자를 형성하기 위해 벡터 내로 통합될 수 있다.
상기 전달 벡터의 제조를 위해서, 본 발명의 전달벡터의 특정한 필수 성분을 이미 포함하는 상업적으로 이용가능한 발현 벡터(즉, 척추동물 프로모터를 포함한 프로모터 부위, 특히 포유류 프로모터, 배큘로바이러스 프로모터 및 바이러스 입자의 성분으로 작용할 수 있는 단백질의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자 부위)가 이용될 수 있고, 그 필수적인 성분들은 상업적으로 이용가능한 발현 벡터를 제한 효소로 절단하거나, 벡터의 클로닝 부위에 바이러스 입자의 성분이 될 수 있는 단백질의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자와 원하는 면역원성을 가진 외래 유전자의 융합된 DNA 서열이 삽입된 다른 프로모터를 통합하거나, 또는 바이러스 입자의 성분이 될 수 있는 단백질의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자의 DNA 부위의 N 말단 부위에 원하는 면역원성을 가진 외래 유전자의 삽입을 통해 선택적으로 삽입될 수 있고, 이미 플라스미드 안에 통합되어 있을 수도 있다.
본 발명에 있어서, 곤충세포 및 척추동물 세포, 특히 포유류 세포 모두에서 항원 단백질로서 원하는 면역성을 가진 외래 유전자를 발현할 수 있는 구조를 가지는 플라스미드 벡터는 이미 이의 일부 구조를 가지고 있는 상업적으로 이용가능한 플라스미드를 이용함으로써 제조될 수 있다. 상기 펩티드의 아미노산 서열은 척추동물 세포내에서 효소로 융합 단백질을 절단하기 위해 사이에 삽입될 수 있다. 본 발명의 전달벡터로, 척추동물 세포, 특히 포유류 세포에서 전사 활성을 증가하기 위한 인핸서(enhancer)는 상기 두 프로모터 업스트림(upstream)에 배열되거나, 숙주에서 발현되는 단백질의 세포외 분비를 촉진하는 신호 단백질의 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 서열이 융합 및 발현되는 유전자에 결합될 수 있다. 전사를 종료하기 위해, 척추동물 세포에서 효과적인 래빗 베타 글로불린 터미네이터(rabbit β globulin terminator)와 같은 척추동물 터미네이터 부위를 융합 및 발현되는 유전자의 다운스트림에 처리할 수 있다.
상기와 같이, 배큘로바이러스 입자 내에서 원하는 면역성을 발현할 수 있는 면역성 외래 유전자 및 바이러스 입자의 성분이 될 수 있는 단백질의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자의 융합 유전자를 발현할 수 있는 전달벡터가 제조될 수 있다.
본 발명에 따른 전달 벡터와 이의 제조 방법에 대한 구체적인 예시는 하기 설명되는 예들로 표시된다. 구체적으로, 실시예에서 보는 바와 같이, 척추동물 프로모터, 특히 포유류 프로모터로서 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus; CMV) 프로모터로부터 변형된 CAG 프로모터 및 배큘로바이러스 프로모터로서 다각체(polyhedrin; Polh) 프로모터, vp39 프로모터 및 gp64 프로모터가 연결되고, 외래 유전자로서 인플루엔자 바이러스 항원 유전자 및 말라리아 항원 유전자와 바이러스 입자의 성분이 될 수 있는 단백질의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자로서 gp64 항원 유전자가 융합된 DNA 서열이 통합된 구조로 구성되는 전달벡터는 pCAP-PfCSP, pCAP-PfCSP/272, pCAP-PfCSP/467, pCAP-PfCSP(A361E), pCAP-PfCSP(A361E)/272, pCAP-PfCSP(A361E)/467, pCAP-PfCSP-76, pCAP-PfCSP-76/467, pCAP-PfCSP+209, pCAP-PfCSP+209/467, pCAP-PfCSP+76/209, pCAP-PfCSP+76/209/467, pCAP-HA1/Anhui, pCAP-HA1/Anhui/272, pCAP-HA1/Anhui/467, pCAP-HA1/Vietnam, pCAP-HA1/Vietnam/51, pCAP-HA1/Vietnam/101, pCAP-HA1/Vietnam/154, pCAP-HA1/Vietnam/201, pCAP-HA1/Vietnam/272, pCAP-HA1/Vietnam/467, pCAP-AH/345, pCAP-AH/345/467, pCAP-AH/410, pCAP-AH/410/467, pCAP-AH/473, pCAP-AH/473/467, pCAP-AH/520, pCAP-AH/520/467, pCAP-VN/346, pCAP-VN/346/467, pCAP-VN/410, pCAP-VN/410/467, pCAP-VN/473, pCAP-VN/473/467, pCAP-VN/520, pCAP-VN/520/467, pCAP-CO/full, pCAP-CO/full/467, pCAP-CO/19, pCAP-CO/19/467, pCAP-CO/76, pCAP-CO/76/467, pCAP-CO/205, pCAP-CO/205/467, pCA39-HA1/Anhui, pCA64-HA1/Anhui, pCA39-PfCSP(A361E), pCA64-PfCSP(A361E), pCAP-CO/full/VSV, pCAP-CO/19/VSV, pCAP-CO/76/VSV, pCAP-CO/205/VSV, pDual-Pfs25-PfCSP-gp64 및 pDual-PfMSP1-PfCSP-gp64가 예시될 수 있다.
(2) 재조합 배큘로바이러스의 제조
본 발명은 하나의 척추동물 프로모터(vertebrate promoter) 및 다른 하나의 배큘로바이러스 프로모터(baculovirus promoter)를 연결한 이중 프로모터의 다운스트림(downstream)에 적어도 하나의 바이러스 입자의 성분이 될 수 있는 단백질을 암호화하는 유전자 및 적어도 하나의 면역성 외래 유전자를 포함하는 융합 유전자를 연결한 것을 특징으로 하는, 이중 프로모터와 융합 유전자가 통합된 구조를 포함하는 전달벡터를 제조하는 단계; 상기 전달벡터 및 배큘로바이러스 DNA가 숙주 세포내로 공동-형질도입하는 단계; 및 상기 재조합 배큘로바이러스를 분리하는 단계를 포함하는 재조합 배큘로바이러스의 제조 방법을 제공한다.
상기 재조합 배큘로바이러스의 제조 방법에 있어서, 숙주내로 원하는 재조합 DNA(전이 벡터)를 도입하는 방법 및 그 외 형질전환 방법은 잘 알려지고 일반적으로 사용되는 다양한 방법, 예를 들어 일반적인 유전자 재조합 기술(예를 들면, Science , 224, 1431, 1984; Biochem . Biophys . Res . Comm ., 130, 692, 1985; Proc. Natl . Acad . Sci . USA, 80, 5990, 1983)에 따라 수행될 수 있으나, 특별히 이에 한정되지 않는다. 재조합 DNA(전이 벡터)는 Ohno 등, "Tanpaku Jikken Protocol 1 Functional analysis, Saibo Kogaku Bessatu Jikken Protocol Series, 1997, Shujunsha"의 문헌을 참고하여 발현 및 제조될 수 있다. 곤충 세포 조작, 유전자 재조합 및 공동-형질도입의 일반적인 기술에 관하여, 곤충 세포에서 재조합 바이러스를 만드는 잘 알려진 방법과 동일한 방법이 이용될 수 있다(배큘로바이러스 발현 벡터: 실험 메뉴얼, Oxford University Press, 1994).
결과물인 재조합 배큘로바이러스는 표준 방법에 따라 배양될 수 있다. 배양함으로써 요구된 바와 같이 고안된 본 발명의 면역성 외래 유전자의 DNA 및 바이러스 입자의 성분이 될 수 있는 단백질의 아미노산 서열을 암호화하는 DNA가 융합된 융합 산물(발현된 산물)이 세포 내, 세포 밖 또는 세포막에 발현, 생산(축적) 및 분비된다.
배양을 위해 사용된 배지로서, 일반적으로 사용되는 다양한 배지가 적절하게 선택될 수 있고 적용되는 숙주 세포에 따라 선택적으로 사용되며, 상기 배양은 숙주 세포의 성장에 적절한 조건하에서 수행될 수 있다.
상기 재조합 배큘로바이러스 제조 방법은 보다 바람직하게 상기 제조된 전달벡터로 상동 재조합을 수행하기 위해 배큘로바이러스 DNA를 제조하는 단계, 및 숙주 세포로서 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)로부터 파생된 Sf-9 세포와 Sf-21 세포 및 트리코플러시아 니(Trichoplusia ni)로부터 파생된 Tn5 세포[Invitrogen에서 공급받은 하이 파이브 세포(high five cell)] 등의 곤충 세포내로 상기 전달벡터 및 배큘로바이러스 DNA를 공동-형질도입하는 단계를 포함한다.
전달벡터와 상동 재조합을 수행하기 위해 제조된 배큘로바이러스 DNA는 야생형, 돌연변이 또는 재조합 배큘로바이러스 DNA 중 어느 하나일 수 있다. 배큘로바이러스 DNA는 이중 프로모터 부위와 면역성 외래 유전자 및 바이러스 입자의 성분이 될 수 있는 단백질을 암호화하는 유전자의 융합에 의해 획득된 융합 유전자의 DNA를 포함한 배큘로바이러스 유래 DNA와 상동한 DNA 구조를 가지는 한 상동 재조합의 가능성을 높일 수 있다.
상동 재조합을 유도하기 위해, 전달벡터 및 배큘로바이러스 DNA는 1: 1 내지 10:1의 중량비에서 혼합되는 것이 바람직하다.
곤충 세포 내로 동시에 도입되는 공동-형질도입 단계 후, 상기 세포를 배양하고, 바이러스의 플라크(plaque)를 배양 상등액으로부터 획득한 후, 배지에 현탁한다. 상기 바이러스는 볼텍스(vortex)에 의해 아가로부터 융출되고, 재조합 바이러스를 포함하는 용액을 얻기 위해 원심분리한다.
상기 과정에서, 상업적으로 이용가능한 배큘로바이러스 DNA가 이용될 수 있고, 이는 예를 들어 AcNPV로부터 다각체 유전자가 제거된 BacVector-1000 DNA 및 BacVector-2000 DNA(Novagen으로부터 공급받음)을 사용할 수 있다.
상동 재조합을 위해 곤충 세포 내로 상기 획득한 전달벡터 및 배큘로바이러스 DNA의 공동-형질도입은 상기 기재된 상업적으로 이용가능한 벡터 형질도입 키트(Novagen으로부터 공급받은 BacVector Transfection Kits)를 이용하여 상기 벡터 형질도입 키트에 첨부된 지시에 따라 수행될 수 있다. 상기 과정에서, 제조된 전달벡터는 재조합 배큘로바이러스를 얻기 위해 Sf-9 세포 등의 곤충 세포에 배큘로바이러스 DNA와 함께 공동-형질도입할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 배큘로바이러스를 제조하는 방법에 있어서, pCAP-PfCSP, pCAP-PfCSP/272, pCAP-PfCSP/467, pCAP-PfCSP(A361E), pCAP-PfCSP(A361E)/272, pCAP-PfCSP(A361E)/467, pCAP-PfCSP-76, pCAP-PfCSP-76/467, pCAP-PfCSP+209, pCAP-PfCSP+209/467, pCAP-PfCSP+76/209, pCAP-PfCSP+76/209/467, pCAP-HA1/Anhui, pCAP-HA1/Anhui/272, pCAP-HA1/Anhui/467, pCAP-HA1/Vietnam, pCAP-HA1/Vietnam/51, pCAP-HA1/Vietnam/101, pCAP-HA1/Vietnam/154, pCAP-HA1/Vietnam/201, pCAP-HA1/Vietnam/272, pCAP-HA1/Vietnam/467, pCAP-AH/345, pCAP-AH/345/467, pCAP-AH/410, pCAP-AH/410/467, pCAP-AH/473, pCAP-AH/473/467, pCAP-AH/520, pCAP-AH/520/467, pCAP-VN/346, pCAP-VN/346/467, pCAP-VN/410, pCAP-VN/410/467, pCAP-VN/473, pCAP-VN/473/467, pCAP-VN/520, pCAP-VN/520/467, pCAP-CO/full, pCAP-CO/full/467, pCAP-CO/19, pCAP-CO/19/467, pCAP-CO/76, pCAP-CO/76/467, pCAP-CO/205, pCAP-CO/205/467, pCA39-HA1/Anhui, pCA64-HA1/Anhui, pCA39-PfCSP(A361E), pCA64-PfCSP(A361E), pCAP-CO/full/VSV, pCAP-CO/19/VSV, pCAP-CO/76/VSV, pCAP-CO/205/VSV, pDual-Pfs25-PfCSP-gp64 및 pDual-PfMSP1-PfCSP-gp64 등의 전달벡터가 이용되고, 이들은 AcNPV-CAP-PfCSP, AcNPV-CAP-PfCSP/272, AcNPV-CAP-PfCSP/467, AcNPV-CAP-PfCSP(A361E), AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)/272, AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)/467, AcNPV-CAP-PfCSP-76, AcNPV-CAP-PfCSP-76/467, AcNPV-CAP-PfCSP+209, AcNPV-CAP-PfCSP+209/467, AcNPV-CAP-PfCSP+76/209, AcNPV-CAP-PfCSP+76/209/467, AcNPV-CAP-HA1/Anhui, AcNPV-CAP-HA1/Anhui/272, AcNPV-CAP-HA1/Anhui/467, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/51, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/101, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/154, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/201, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/272, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/467, AcNPV-CAP-AH/345, AcNPV-CAP-AH/345/467, AcNPV-CAP-AH/410, AcNPV-CAP-AH/410/467, AcNPV-CAP-AH/473, AcNPV-CAP-AH/473/467, AcNPV-CAP-AH/520, AcNPV-CAP-AH/520/467, AcNPV-CAP-VN/346, AcNPV-CAP-VN/346/467, AcNPV-CAP-VN/410, AcNPV-CAP-VN/410/467, AcNPV-CAP-VN/473, AcNPV-CAP-VN/473/467, AcNPV-CAP-VN/520, AcNPV-CAP-VN/520/467, AcNPV-CAP-CO/full, AcNPV-CAP-CO/full/467, AcNPV-CAP-CO/19, AcNPV-CAP-CO/19/467, AcNPV-CAP-CO/76, AcNPV-CAP-CO/76/467, AcNPV-CAP-CO/205, AcNPV-CAP-CO/205/467, AcNPV-CA39-HA1/Anhui, AcNPV-CA64-HA1/Anhui, AcNPV-CA39-PfCSP(A361E), AcNPV-CA64-PfCSP(A361E), AcNPV-CAP-CO/full/VSV, AcNPV-CAP-CO/19/VSV, AcNPV-CAP-CO/76/VSV, AcNPV-CAP-CO/205/VSV, AcNPV-Dual-Pfs25-PfCSP-gp64 및 AcNPV-Dual-PfMSP1-PfCSP-gp64 등의 재조합 배큘로바이러스를 얻기 위해 배큘로바이러스 DNA와 함께, Sf-9 곤충 세포 내에 공동-형질도입된다.
상기 재조합 배큘로바이러스를 제조하는 방법에 추가적으로, 재조합 배큘로바이러스를 제조하는 다른 방법으로서, 전체 배큘로바이러스 게놈이 통합된 파지미드[phagemid(bacmid)]에 대한 트랜스포손(transposon)을 이용하여 대장균(Escherichia coli)에서 효율적으로 외래 유전자를 삽입하는 방법이 사용 가능하다.
상기 방법에 따라, 재조합 배큘로바이러스는 미생물 세포로부터 유래한 바이러스 유전자를 낳는 파지미드를 추출하고, 이를 곤충 세포 내에 형질도입함으로써 용이하게 제조 및 수집될 수 있다.
재조합 배큘로바이러스를 제조하는 상기 방법에 의해 획득된 본 발명의 재조합 배큘로바이러스의 정제는 공공연하게 알려진 바이러스 정제 방법을 이용하여 수행될 수 있다.
재조합 배큘로바이러스의 정제를 위해, 예를 들어, 재조합 배큘로바이러스를 제조하는 방법에 의해 획득된 저장 바이러스의 0.5 내지 1.0 mL를 Sf-9 세포 등의 곤충 세포(1 x 107 cells/10 cm dish)에 접종하고, 배양 상등액을 상기 감염 후 몇일 후에 수집하고, 원심분리에 의해 획득된 바이러스 펠릿(pellet)을 PBS 등의 완충용액에서 현탁한다. 상기 결과물인 현탁액은 바이러스 밴드를 수집하기 위해 원심분리(25,000 rpm, 60분, 4℃)될 때, 10 내지 60%의 슈크로즈 구배(sucrose gradient)로 적용되었다. 상기 수집된 바이러스를 추가적으로 PBS에 현탁하고, 이어서 원심분리(25,000 rpm, 60분, 4℃)하여, 결과물인 정제된 재조합 바이러스 펠릿을 4℃에서 PBS 등의 완충용액에 저장하였다.
상기 결과물인 정제된 재조합 바이러스의 감염도 적정농도(infectivity titer)는 Sf-9 세포 등의 곤충 세포를 이용하여 플라크 분석(Baculovirus Expression vectors; A LABORATORY MANUAL, Oxford University Press, 1994)에 의해 측정될 수 있다.
본 발명에 예시된 재조합 바이러스에 있어서, 배큘로바이러스 단백질 gp64의 N 말단은 상기 바이러스 입자 외부에 노출되고, 이의 C 말단은 상기 바이러스 입자 내부에 노출된다. 따라서, 원하는 면역성 외래 유전자에 의해 암호화되는 단백질이 gp64의 N 말단에 융합된다면, 상기 바이러스 입자의 성분으로서 존재는 곤충 세포에서 바이러스 단백질 입자 외부에 노출되고, 따라서 본 발명의 백신 제형의 목적을 위해 적절한 항원이 더 용이하게 존재될 수 있다.
(3) 본 발명의 약학적 조성물
(본 발명의 재조합 배큘로바이러스를 유효성분으로 포함하는 약제)
본 발명의 약학적 조성물에서 유효성분인 본 발명의 재조합 배큘로바이러스는 상기 (2)에서 보여주는 유전자 공학 기술에 의해 획득될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 근본적으로 배큘로바이러스 DNA, 및 바이러스 입자의 성분이 될 수 있는 단백질의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자에 본 발명의 면역성 외래 유전자를 융합한 융합 유전자가 곤충 세포 및 척추동물 세포, 특히 인간을 포함한 포유류 유래 세포에서 발현될 수 있기 위해 제조된 전달벡터의 상동 재조합에 의해 획득된 재조합 배큘로바이러스를 유효성분으로 포함한다.
특히, 본 발명은 AcNPV-CAP-PfCSP, AcNPV-CAP-PfCSP/272, AcNPV-CAP-PfCSP/467, AcNPV-CAP-PfCSP(A361E), AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)/272, AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)/467, AcNPV-CAP-PfCSP-76, AcNPV-CAP-PfCSP-76/467, AcNPV-CAP-PfCSP+209, AcNPV-CAP-PfCSP+209/467, AcNPV-CAP-PfCSP+76/209, AcNPV-CAP-PfCSP+76/209/467, AcNPV-CAP-HA1/Anhui, AcNPV-CAP-HA1/Anhui/272, AcNPV-CAP-HA1/Anhui/467, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/51, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/101, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/154, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/201, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/272, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/467, AcNPV-CAP-AH/345, AcNPV-CAP-AH/345/467, AcNPV-CAP-AH/410, AcNPV-CAP-AH/410/467, AcNPV-CAP-AH/473, AcNPV-CAP-AH/473/467, AcNPV-CAP-AH/520, AcNPV-CAP-AH/520/467, AcNPV-CAP-VN/346, AcNPV-CAP-VN/346/467, AcNPV-CAP-VN/410, AcNPV-CAP-VN/410/467, AcNPV-CAP-VN/473, AcNPV-CAP-VN/473/467, AcNPV-CAP-VN/520, AcNPV-CAP-VN/520/467, AcNPV-CAP-CO/full, AcNPV-CAP-CO/full/467, AcNPV-CAP-CO/19, AcNPV-CAP-CO/19/467, AcNPV-CAP-CO/76, AcNPV-CAP-CO/76/467, AcNPV-CAP-CO/205, AcNPV-CAP-CO/205/467, AcNPV-CA39-HA1/Anhui, AcNPV-CA64-HA1/Anhui, AcNPV-CA39-PfCSP(A361E), AcNPV-CA64-PfCSP(A361E), AcNPV-CAP-CO/full/VSV, AcNPV-CAP-CO/19/VSV, AcNPV-CAP-CO/76/VSV, AcNPV-CAP-CO/205/VSV, AcNPV-Dual-Pfs25-PfCSP-gp64 및 AcNPV-Dual-PfMSP1-PfCSP-gp64중 어느 하나의 재조합 배큘로바이러스를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학적 조성물에 있어서 유효성분으로 이용되는 AcNPV-CAP-PfCSP, AcNPV-CAP-PfCSP/272, AcNPV-CAP-PfCSP/467, AcNPV-CAP-PfCSP(A361E), AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)/272, AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)/467, AcNPV-CAP-PfCSP-76, AcNPV-CAP-PfCSP-76/467, AcNPV-CAP-PfCSP+209, AcNPV-CAP-PfCSP+209/467, AcNPV-CAP-PfCSP+76/209, AcNPV-CAP-PfCSP+76/209/467, AcNPV-CAP-HA1/Anhui, AcNPV-CAP-HA1/Anhui/272, AcNPV-CAP-HA1/Anhui/467, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/51, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/101, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/154, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/201, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/272, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/467, AcNPV-CAP-AH/345, AcNPV-CAP-AH/345/467, AcNPV-CAP-AH/410, AcNPV-CAP-AH/410/467, AcNPV-CAP-AH/473, AcNPV-CAP-AH/473/467, AcNPV-CAP-AH/520, AcNPV-CAP-AH/520/467, AcNPV-CAP-VN/346, AcNPV-CAP-VN/346/467, AcNPV-CAP-VN/410, AcNPV-CAP-VN/410/467, AcNPV-CAP-VN/473, AcNPV-CAP-VN/473/467, AcNPV-CAP-VN/520, AcNPV-CAP-VN/520/467, AcNPV-CAP-CO/full, AcNPV-CAP-CO/full/467, AcNPV-CAP-CO/19, AcNPV-CAP-CO/19/467, AcNPV-CAP-CO/76, AcNPV-CAP-CO/76/467, AcNPV-CAP-CO/205, AcNPV-CAP-CO/205/467, AcNPV-CA39-HA1/Anhui, AcNPV-CA64-HA1/Anhui, AcNPV-CA39-PfCSP(A361E), AcNPV-CA64-PfCSP(A361E), AcNPV-CAP-CO/full/VSV, AcNPV-CAP-CO/19/VSV, AcNPV-CAP-CO/76/VSV, AcNPV-CAP-CO/205/VSV, AcNPV-Dual-Pfs25-PfCSP-gp64 및 AcNPV-Dual-PfMSP1-PfCSP-gp64중 어느 하나의 본 발명의 재조합 배큘로바이러스는 감염성 항원에 대한 감염 예방 효과를 증가시키고 감염성 적정농도를 줄이는 활성을 가지고, 이런 작용 또는 활성은 표적 세포 또는 조직의 감염과 관련된 질환의 치료를 위해 이용될 수 있다. 상기 감염에 의해 영향을 받은 표적 세포는, 예를 들어 혈구(blood cell)를 포함하고, 그 외 표적 세포는 간장 세포(hepatic cell), 신장 세포(renal cell), 뇌 세포(brain cell), 폐 세포(lung cell), 상피 세포(epithelial cell) 및 근육 세포(muscular cell)를 포함한다. 상기 세포를 포함하는 조직은 폐(lung), 간(liver), 신장(kidney), 뇌(brain), 동맥 및 정맥(arteries and veins), 위(stomach), 소장(intestine), 요도(urethra), 피부(skin) 및 근육(muscle)을 포함한다.
상기 약학적 조성물은 예를 들어, 말라리아 기생충의 종충(sporozoite) 표면 항원(CSP 및 TRAP), 낭충(merozoite) 표면의 막 단백질의 MSP1, 말라리아로 감염된 적혈구로부터 분비된 말라리아 S 항원, 말라리아로 감염된 적혈구의 덩이(knob)에 존재하는 PfEMP1 단백질, SERA 단백질, TRAMP 단백질, AMA1 단백질 및 전달-차단 항원으로 알려진 Pfs25등의 말라리아 항원뿐만 아니라 예를 들어, HA 항원, NA 항원, M2 항원 및 NP 항원 등의 인플루엔자 항원의 감염 예방 효과를 증가시키고, 감염성 적정농도(예를 들어, 바이러스 감염성 적정농도)를 줄인다. 따라서, 상기 약학적 조성물로 투여된 인간을 포함한 포유류의 생존기간 및 생존율은 본 발명의 약학적 조성물이 투여되지 않은 개체들에 비해 증가된다. 그러므로, 본 발명의 약학적 조성물은 특히 말라리아 및 인플루엔자 바이러스 감염에 대한 예방 또는 치료제로 유용하다.
본 발명의 약학적 조성물은 감염성 항원에 대한 감염-예방 효과를 증가시키고, 감염성 적정농도를 줄이는 활성을 가짐으로써, 인플루엔자 바이러스 및 말라리아와 같은 병원균에 의해 유발되는 감염성 질환, 및 이들의 합병증에 대한 예방 또는 치료제로서 유용하다.
본 발명의 약학적 조성물의 유효성분이 되는 재조합 배큘로바이러스를 획득하기 위한 전달벡터 내에 인간을 제외한 척추동물에 대한 면역성 외래 유전자를 사용함으로써, 예를 들어, 감염성 항원에 대한 감염-예방 효과를 증가시키고, 감염성 적정농도를 줄이는 활성을 가지는 조류 인플루엔자 백신(chicken influenza vaccine)을 제조할 수 있고, 그 활성과 효능을 활용함으로써, 본 발명의 약학적 조성물은 표적 세포 및 조직의 감염과 관련된 질환의 치료제로 이용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 본 발명의 재조합 배큘로바이러스의 약학적으로 유효한 양 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물로 제조될 수 있다.
척추동물, 특히 인간을 포함한 포유류 또는 포유류 세포에서 본 발명의 재조합 배큘로바이러스의 감염-예방 효과에 관하여, 예를 들어 본 발명의 재조합 배큘로바이러스 및 약학적 투여를 위해 추가될 수 있는 조성물에 의해 제조된 약학적 조성물은 척추동물, 특히 인간을 포함한 포유류에서 근육 내(intramuscular), 피하(subcutaneous), 피부(intracutaneous), 복강(intraperitoneal), 비강 내(nasal), 또는 호흡기 내(respiratory) 경로로 투여되고, 본 발명의 재조합 배큘로바이러스를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물로 여러 번 면역된다. 본 발명의 약학적 조성물은 특히 호흡기 흡입으로 투여되는 것이 바람직하다.
감염 예방 효과는 본 발명의 약학적 조성물로 여러 번 면역시키고, 병원체에 감염된 척추동물, 특히 인간을 포함한 포유류의 생존율과 약학적 조성물이 투여되지 않은 개체들의 생존율을 비교함으로써 평가될 수 있다.
(4) 본 발명의 백신
본 발명의 약학적 조성물의 유효성분인AcNPV-CAP-PfCSP, AcNPV-CAP-PfCSP/272, AcNPV-CAP-PfCSP/467, AcNPV-CAP-PfCSP(A361E), AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)/272, AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)/467, AcNPV-CAP-PfCSP-76, AcNPV-CAP-PfCSP-76/467, AcNPV-CAP-PfCSP+209, AcNPV-CAP-PfCSP+209/467, AcNPV-CAP-PfCSP+76/209, AcNPV-CAP-PfCSP+76/209/467, AcNPV-CAP-HA1/Anhui, AcNPV-CAP-HA1/Anhui/272, AcNPV-CAP-HA1/Anhui/467, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/51, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/101, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/154, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/201, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/272, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/467, AcNPV-CAP-AH/345, AcNPV-CAP-AH/345/467, AcNPV-CAP-AH/410, AcNPV-CAP-AH/410/467, AcNPV-CAP-AH/473, AcNPV-CAP-AH/473/467, AcNPV-CAP-AH/520, AcNPV-CAP-AH/520/467, AcNPV-CAP-VN/346, AcNPV-CAP-VN/346/467, AcNPV-CAP-VN/410, AcNPV-CAP-VN/410/467, AcNPV-CAP-VN/473, AcNPV-CAP-VN/473/467, AcNPV-CAP-VN/520, AcNPV-CAP-VN/520/467, AcNPV-CAP-CO/full, AcNPV-CAP-CO/full/467, AcNPV-CAP-CO/19, AcNPV-CAP-CO/19/467, AcNPV-CAP-CO/76, AcNPV-CAP-CO/76/467, AcNPV-CAP-CO/205, AcNPV-CAP-CO/205/467, AcNPV-CA39-HA1/Anhui, AcNPV-CA64-HA1/Anhui, AcNPV-CA39-PfCSP(A361E), AcNPV-CA64-PfCSP(A361E), AcNPV-CAP-CO/full/VSV, AcNPV-CAP-CO/19/VSV, AcNPV-CAP-CO/76/VSV, AcNPV-CAP-CO/205/VSV, AcNPV-Dual-Pfs25-PfCSP-gp64 및 AcNPV-Dual-PfMSP1-PfCSP-gp64중 어느 하나의 재조합 배큘로바이러스는 병원체 감염에 대한 예방적 효과를 증가시키고, 곤충 세포로부터 유래되는 돌출된 바이러스 입자로서 생산되는 감염성 적정농도를 줄이는 활성을 나타내는 원하는 면역성을 가지는 본 발명의 면역성 외래 유전자에 바이러스 입자의 성분이 될 수 있는 단백질의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자를 융합시킨 DNA 서열의 융합 산물을 발현한다. 그때, 바이러스 입자의 성분이 되는 외래 항원 단백질은 척추동물, 특히 인간을 포함한 포유류에 바이러스 입자의 형태로 약학적 조성물을 투여함으로써 획득한 면역성(체액성 면역 및 세포성 면역)을 촉진하고, 융합 DNA 서열의 발현 산물인 항원 단백질은 척추동물 세포, 특히 인간을 포함한 포유류 세포에서 획득한 면역성(체액성 면역 및 세포성 면역)을 추가로 촉진하는 것으로 생각된다. 따라서, 본 발명의 재조합 바이러스는 백신으로 유용하다.
특히, 본 발명은 AcNPV-CAP-PfCSP, AcNPV-CAP-PfCSP/272, AcNPV-CAP-PfCSP/467, AcNPV-CAP-PfCSP(A361E), AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)/272, AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)/467, AcNPV-CAP-PfCSP-76, AcNPV-CAP-PfCSP-76/467, AcNPV-CAP-PfCSP+209, AcNPV-CAP-PfCSP+209/467, AcNPV-CAP-PfCSP+76/209, AcNPV-CAP-PfCSP+76/209/467, AcNPV-CAP-HA1/Anhui, AcNPV-CAP-HA1/Anhui/272, AcNPV-CAP-HA1/Anhui/467, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/51, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/101, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/154, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/201, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/272, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/467, AcNPV-CAP-AH/345, AcNPV-CAP-AH/345/467, AcNPV-CAP-AH/410, AcNPV-CAP-AH/410/467, AcNPV-CAP-AH/473, AcNPV-CAP-AH/473/467, AcNPV-CAP-AH/520, AcNPV-CAP-AH/520/467, AcNPV-CAP-VN/346, AcNPV-CAP-VN/346/467, AcNPV-CAP-VN/410, AcNPV-CAP-VN/410/467, AcNPV-CAP-VN/473, AcNPV-CAP-VN/473/467, AcNPV-CAP-VN/520, AcNPV-CAP-VN/520/467, AcNPV-CAP-CO/full, AcNPV-CAP-CO/full/467, AcNPV-CAP-CO/19, AcNPV-CAP-CO/19/467, AcNPV-CAP-CO/76, AcNPV-CAP-CO/76/467, AcNPV-CAP-CO/205, AcNPV-CAP-CO/205/467, AcNPV-CA39-HA1/Anhui, AcNPV-CA64-HA1/Anhui, AcNPV-CA39-PfCSP(A361E), AcNPV-CA64-PfCSP(A361E), AcNPV-CAP-CO/full/VSV, AcNPV-CAP-CO/19/VSV, AcNPV-CAP-CO/76/VSV, AcNPV-CAP-CO/205/VSV, AcNPV-Dual-Pfs25-PfCSP-gp64 및 AcNPV-Dual-PfMSP1-PfCSP-gp64중 어느 하나의 재조합 배큘로바이러스를 유효성분으로 포함하는 백신을 제공한다.
일반적으로 상기 (3)의 약학적 조성물로서, 백신은 감염-예방 효과를 증가시키고, 예를 들어 말라리아 기생충의 종충(sporozoite) 표면의 항원(CSP 및 TRAP), 낭충(merozoite) 표면의 막 단백질의 MSP1, 말라리아로 감염된 적혈구로부터 분비된 말라리아 S 항원, 말라리아로 감염된 적혈구의 덩이(knob)에 존재하는 PfEMP1 단백질, SERA 단백질, TRAMP 단백질 및 AMA1 단백질 등의 말라리아 항원, 및 인플루엔자 바이러스 HA 항원, 인플루엔자 바이러스 NA 항원, 인플루엔자 바이러스 M2 항원 및 인플루엔자 바이러스 NP 항원 등의 인플루엔자 항원과 같은 병원성 유기체에 대한 감염성 적정농도(예를 들어, 바이러스 감염성 적정농도)를 줄인다. 따라서, 감염된 인간을 포함한 포유류에서 생존기간 및 생존율을 본 발명의 약학적 조성물이 투여되지 안은 개체들과 비교함으로써, 상기 백신이 말라리아 및 인플루엔자 바이러스 감염에 대한 예방 또는 치료제로서 특히 유용하다.
본 발명의 백신은 감염성 항원에 대한 감염-예방 효과를 증가시키고 감염성 적정농도를 줄임으로써, 인플루엔자 바이러스, 말라리아 및 그로 인한 합병증과 같이 병원체에 의해 유발되는 감염성 질환에 대한 예방 및 치료제로 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 유효성분이 되는 재조합 배큘로바이러스를 획득하기 위한 전달벡터 내에 인간을 제외한 척추동물에 대한 면역성 외래 유전자를 사용함으로써, 예를 들어, 감염성 항원에 대한 감염-예방 효과를 증가시키고, 감염성 적정농도를 줄일 수 있는 조류 인플루엔자 백신(chicken influenza vaccine)을 제조할 수 있고, 그 효능을 활용함으로써, 본 발명의 백신은 표적 세포 및 조직의 감염과 관련된 질환의 치료제로 이용될 수 있다.
본 발명의 백신의 유효성분인 AcNPV-CAP-PfCSP, AcNPV-CAP-PfCSP/272, AcNPV-CAP-PfCSP/467, AcNPV-CAP-PfCSP(A361E), AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)/272, AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)/467, AcNPV-CAP-PfCSP-76, AcNPV-CAP-PfCSP-76/467, AcNPV-CAP-PfCSP+209, AcNPV-CAP-PfCSP+209/467, AcNPV-CAP-PfCSP+76/209, AcNPV-CAP-PfCSP+76/209/467, AcNPV-CAP-HA1/Anhui, AcNPV-CAP-HA1/Anhui/272, AcNPV-CAP-HA1/Anhui/467, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/51, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/101, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/154, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/201, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/272, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/467, AcNPV-CAP-AH/345, AcNPV-CAP-AH/345/467, AcNPV-CAP-AH/410, AcNPV-CAP-AH/410/467, AcNPV-CAP-AH/473, AcNPV-CAP-AH/473/467, AcNPV-CAP-AH/520, AcNPV-CAP-AH/520/467, AcNPV-CAP-VN/346, AcNPV-CAP-VN/346/467, AcNPV-CAP-VN/410, AcNPV-CAP-VN/410/467, AcNPV-CAP-VN/473, AcNPV-CAP-VN/473/467, AcNPV-CAP-VN/520, AcNPV-CAP-VN/520/467, AcNPV-CAP-CO/full, AcNPV-CAP-CO/full/467, AcNPV-CAP-CO/19, AcNPV-CAP-CO/19/467, AcNPV-CAP-CO/76, AcNPV-CAP-CO/76/467, AcNPV-CAP-CO/205, AcNPV-CAP-CO/205/467, AcNPV-CA39-HA1/Anhui, AcNPV-CA64-HA1/Anhui, AcNPV-CA39-PfCSP(A361E), AcNPV-CA64-PfCSP(A361E), AcNPV-CAP-CO/full/VSV, AcNPV-CAP-CO/19/VSV, AcNPV-CAP-CO/76/VSV, AcNPV-CAP-CO/205/VSV, AcNPV-Dual-Pfs25-PfCSP-gp64, 및 AcNPV-Dual-PfMSP1-PfCSP-gp64중 어느 하나의 재조합 배큘로바이러스는 감염성 항원에 대한 감염-예방 효과를 증가시키고 감염성 적정농도를 감소시키는 활성을 가지고, 상기 활성을 이용하여, 표적 세포 또는 조직의 감염과 관련된 질환의 경과에 이용될 수 있다.
상기 감염에 의해 영향을 받은 표적 세포는 예를 들어, 혈구(blood cell)를 포함하고, 그 외 표적 세포는 간장 세포(hepatic cell), 신장 세포(renal cell), 뇌 세포(brain cell), 폐 세포(lung cell), 상피 세포(epithelial cell) 및 근육 세포(muscular cell)를 포함한다. 상기 세포를 포함하는 조직은 폐(lung), 간(liver), 신장(kidney), 뇌(brain), 동맥 및 정맥(arterial and venous vein), 위(stomach), 소장(intestine), 요도(urethra), 피부(skin) 및 근육(muscle)을 포함한다.
상기 (3)의 약학적 조성물로서 본 발명의 백신은 약학적으로 유효한 양의 본 발명의 재조합 배큘로바이러스(AcNPV-CAP-PfCSP, AcNPV-CAP-PfCSP/272, AcNPV-CAP-PfCSP/467, AcNPV-CAP-PfCSP(A361E), AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)/272, AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)/467, AcNPV-CAP-PfCSP-76, AcNPV-CAP-PfCSP-76/467, AcNPV-CAP-PfCSP+209, AcNPV-CAP-PfCSP+209/467, AcNPV-CAP-PfCSP+76/209, AcNPV-CAP-PfCSP+76/209/467, AcNPV-CAP-HA1/Anhui, AcNPV-CAP-HA1/Anhui/272, AcNPV-CAP-HA1/Anhui/467, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/51, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/101, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/154, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/201, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/272, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/467, AcNPV-CAP-AH/345, AcNPV-CAP-AH/345/467, AcNPV-CAP-AH/410, AcNPV-CAP-AH/410/467, AcNPV-CAP-AH/473, AcNPV-CAP-AH/473/467, AcNPV-CAP-AH/520,AcNPV-CAP-AH/520/467, AcNPV-CAP-VN/346, AcNPV-CAP-VN/346/467, AcNPV-CAP-VN/410, AcNPV-CAP-VN/410/467, AcNPV-CAP-VN/473, AcNPV-CAP-VN/473/467, AcNPV-CAP-VN/520, AcNPV-CAP-VN/520/467, AcNPV-CAP-CO/full, AcNPV-CAP-CO/full/467, AcNPV-CAP-CO/19, AcNPV-CAP-CO/19/467, AcNPV-CAP-CO/76, AcNPV-CAP-CO/76/467, AcNPV-CAP-CO/205, AcNPV-CAP-CO/205/467, AcNPV-CA39-HA1/Anhui, AcNPV-CA64-HA1/Anhui, AcNPV-CA39-PfCSP(A361E), AcNPV-CA64-PfCSP(A361E), AcNPV-CAP-CO/full/VSV, AcNPV-CAP-CO/19/VSV, AcNPV-CAP-CO/76/VSV, AcNPV-CAP-CO/205/VSV, AcNPV-Dual-Pfs25-PfCSP-gp64 및 AcNPV-Dual-PfMSP1-PfCSP-gp64)의 양, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물로 제조될 수 있다.
상기 백신은 표준 방법에 따라 상기 (3)의 약학적 조성물과 같이 약학적으로 허용가능한 약학적 조성물 형태로 제조될 수 있다. 상기 담체는 예를 들어, 멸균 생리식염수 및 멸균 완충 생리식염수 등의 생리학적으로 허용가능한 용액을 포함할 수 있다.
상기 백신(이하, 제형은 약학적 조성물에서와 같다)은 본 발명의 재조합 배큘로바이러스(AcNPV-CAP-PfCSP, AcNPV-CAP-PfCSP/272, AcNPV-CAP-PfCSP/467, AcNPV-CAP-PfCSP(A361E), AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)/272, AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)/467, AcNPV-CAP-PfCSP-76, AcNPV-CAP-PfCSP-76/467, AcNPV-CAP-PfCSP+209, AcNPV-CAP-PfCSP+209/467, AcNPV-CAP-PfCSP+76/209, AcNPV-CAP-PfCSP+76/209/467, AcNPV-CAP-HA1/Anhui, AcNPV-CAP-HA1/Anhui/272, AcNPV-CAP-HA1/Anhui/467, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/51, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/101, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/154, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/201, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/272, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/467, AcNPV-CAP-AH/345, AcNPV-CAP-AH/345/467, AcNPV-CAP-AH/410, AcNPV-CAP-AH/410/467, AcNPV-CAP-AH/473, AcNPV-CAP-AH/473/467, AcNPV-CAP-AH/520, AcNPV-CAP-AH/520/467, AcNPV-CAP-VN/346, AcNPV-CAP-VN/346/467, AcNPV-CAP-VN/410, AcNPV-CAP-VN/410/467, AcNPV-CAP-VN/473, AcNPV-CAP-VN/473/467, AcNPV-CAP-VN/520, AcNPV-CAP-VN/520/467, AcNPV-CAP-CO/full, AcNPV-CAP-CO/full/467, AcNPV-CAP-CO/19, AcNPV-CAP-CO/19/467, AcNPV-CAP-CO/76, AcNPV-CAP-CO/76/467, AcNPV-CAP-CO/205, AcNPV-CAP-CO/205/467, AcNPV-CA39-HA1/Anhui, AcNPV-CA64-HA1/Anhui, AcNPV-CA39-PfCSP(A361E), AcNPV-CA64-PfCSP(A361E), AcNPV-CAP-CO/full/VSV, AcNPV-CAP-CO/19/VSV, AcNPV-CAP-CO/76/VSV, AcNPV-CAP-CO/205/VSV, AcNPV-Dual-Pfs25-PfCSP-gp64, 및 AcNPV-Dual-PfMSP1-PfCSP-gp64)를 유효성분으로 포함하는 리포솜 제형으로 제조될 수 있고, 보조제와 결합될 수 있다.
본 발명의 백신(약학적 조성물)의 특별한 예시는 리포솜 제형을 포함한다. 상기 리포솜 제형은 본 발명의 재조합 배큘로바이러스가 막 성분으로서 산성 인지질을 포함하거나 막 성분으로서 중성 인지질 및 산성 인지질을 포함한 리포솜에 보유되는 제형이 될 수 있다.
상기 막 성분에 사용되는 중성 인지질 및 산성 인지질은 특별히 한정되지 않고, 리포솜 제형으로 일반적으로 사용되는 다양한 지질이 단독으로, 또는 둘 이상의 혼합물이 될 수 있다.
리포솜 막은 산성 인지질 단독, 또는 중성 인지질과 산성 인지질을 혼합한 것을 이용한 표준 방법에 따라 형성된다. 중성 인지질을 혼합한 것의 경우, 혼합되는 산성 인지질의 비율은 리포솜 막 성분에 있어서 약 0.1 내지 100 mol%, 바람직하게는 1 내지 90 mol%, 더 바람직하게는 10 내지 50 mol%가 될 수 있다.
상기 리포솜이 제조될 때, 예를 들면, 콜레스테롤 등이 첨가될 수 있다. 이는 인지질의 유동성을 조절할 수 있고 더 용이하게 리포솜을 제조할 수 있다. 상기 콜레스테롤은 일반적으로 상기 인지질의 양과 동일하거나 더 적은 양으로 첨가되고, 상기 인지질의 양과 동일한 양에 대해 0.5배 첨가되는 것이 더 바람직하다.
리포솜 제형에서 유효성분을 위한 산성 인지질의 혼합 비율은 유효성분에 대해 상대적으로 약 0.5 내지 100 당량, 바람직하게는 약 1 내지 60 당량 및 더 바람직하게는 약 1.5 내지 20 당량이 될 수 있다.
본 발명의 재조합 배큘로바이러스의 유효성분으로 이용되는 양은 지질의 전체 양을 기본으로 하여, 몇 mol% 내지 몇십 mol%, 바람직하게 약 5 내지 10 mol%, 및 일반적으로 약 5 mol%이 될 수 있다.
상기 리포솜 제형의 제조, 농도 및 입자 직경 조절은 표준 방법에 따라 수행될 수 있다. 또한, 상기 기재된 다양한 첨가물은 요구되면 상기 리포솜 제형과 결합될 수 있다.
또한, 상기 리포솜 제형을 제조하기 위해, 유효한 양의 본 발명의 재조합 배큘로바이러스는 지방산[예를 들어, 베헤닌산(behenic acid), 스테아르산(stearic acid), 팔미트산(palmitic acid), 미리스트산(myristic acid), 올레인산(oleic acid)], 알킬기(alkyl group) 및 콜레스테릴기(cholesteryl group)등이 결합된 형태로 이용될 수 있다. 또한, 이들의 혼합에 의해 제조된 리포솜 제형은 표준 방법(Long Circulating Liposomes: old drugs, New therapeutics., M. C. Woodle, G. Storm, Eds: Springer-Verlag Berlin, 1998)에 따라 제조될 수 있다.
본 발명의 백신(약학적 조성물)은 바람직하게 백신 조성물로 이용될 수 있다. 상기 백신을 사용할 때, 이는 항-감염(항-말라리아 또는 항-인플루엔자) 효과를 증진시키기 위해 약학적으로 유효한 양의 보조제와 함께 이용되는 것이 바람직하다.
상기 보조제로서, 백신 유형에 일반적으로 사용되는 것은 제한 없이 사용될 수 있다. 이의 예로서, 프로인트 완전 보조제(Freund's complete adjuvant), 무라밀 디펩티드(muramyl dipeptide), 알루미늄 하이드록사이드(aluminium hydroxide), BCG, IL-12, N-아세틸무라민-L-알라닐-D-이소글루타민(N-acetylmuramine-L-alanyl-D-isoglutamine, MDP), 티모신 알파1(thymosin α1) 및 QS-21가 예시될 수 있다. 상기 첨가되는 보조제의 양은 이러한 형태의 백신을 투여 후 인간 또는 동물에서의 면역 반응의 일종으로서 나타나는 피부의 연화증(softening), 통증(pain), 홍진(erythema), 열(fever), 두통(headache) 및 근육통(muscular pain)과 같은 증상의 정도에 따라 적절하게 선택할 수 있다.
본 발명의 백신(약학적 조성물)은 면역 반응-촉진 펩타이드 및 항박테리아제(합성 항박테리아제) 등과 같은 공공연히 알려진 약학적 물질과 함께 이용될 수 있다.
상기 백신(약학적 조성물)은 다른 선택된 약제 및 보조제가 추가적으로 포함될 수 있다. 이의 예로서, 본 발명의 제조합 배큘로바이러스의 세포내 흡수를 돕는 칼슘 이온과 같은 약제가 예시될 수 있다. 리포솜 등의 약제 및 보조제, 및 형질도입을 용이하게 하는 플루오르카본 유화제(fluorocarbon emulsifier), 코클레이트(cochleate), 세관(tubule), 금 입자(golden particle), 생물분해성이 있는 마이크로스피어(biodegradable microsphere) 및 양이온성 중합체(cationic polymer) 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 백신(약학적 조성물)(제형)에 포함된 유효성분의 양은 특별히 제한되지 않고, 약학적으로 유효한 양이라면 넓은 범위로부터 선택될 수 있다. 백신(약학적 조성물)의 투여량은 특별히 제한되지 않고, 원하는 치료효과, 투여방법(투여경로), 치료기간, 환자의 나이 및 성별, 및 기타 조건에 의존하여 넓은 범위로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 백신(약학적 조성물)의 유효성분인 재조합 배큘로바이러스가 인간에 투여될 때, 재조합 바이러스의 PFU를 계산함에 있어, 환자당 102 내지 1014 PFU, 바람직하게는 105 내지 1012 PFU 및 더 바람직하게는 106 내지 1010 PFU의 재조합 배큘로바이러스가 투여된다.
본 발명의 백신(약학적 조성물)의 유효성분인 재조합 배큘로바이러스(AcNPV-CAP-PfCSP, AcNPV-CAP-PfCSP/272, AcNPV-CAP-PfCSP/467, AcNPV-CAP-PfCSP(A361E), AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)/272, AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)/467, AcNPV-CAP-PfCSP-76, AcNPV-CAP-PfCSP-76/467, AcNPV-CAP-PfCSP+209, AcNPV-CAP-PfCSP+209/467, AcNPV-CAP-PfCSP+76/209, AcNPV-CAP-PfCSP+76/209/467, AcNPV-CAP-HA1/Anhui, AcNPV-CAP-HA1/Anhui/272, AcNPV-CAP-HA1/Anhui/467, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/51, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/101, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/154, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/201, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/272, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/467, AcNPV-CAP-AH/345, AcNPV-CAP-AH/345/467, AcNPV-CAP-AH/410, AcNPV-CAP-AH/410/467, AcNPV-CAP-AH/473, AcNPV-CAP-AH/473/467, AcNPV-CAP-AH/520, AcNPV-CAP-AH/520/467, AcNPV-CAP-VN/346, AcNPV-CAP-VN/346/467, AcNPV-CAP-VN/410, AcNPV-CAP-VN/410/467, AcNPV-CAP-VN/473, AcNPV-CAP-VN/473/467, AcNPV-CAP-VN/520, AcNPV-CAP-VN/520/467, AcNPV-CAP-CO/full, AcNPV-CAP-CO/full/467, AcNPV-CAP-CO/19, AcNPV-CAP-CO/19/467, AcNPV-CAP-CO/76, AcNPV-CAP-CO/76/467, AcNPV-CAP-CO/205, AcNPV-CAP-CO/205/467, AcNPV-CA39-HA1/Anhui, AcNPV-CA64-HA1/Anhui, AcNPV-CA39-PfCSP(A361E), AcNPV-CA64-PfCSP(A361E), AcNPV-CAP-CO/full/VSV, AcNPV-CAP-CO/19/VSV, AcNPV-CAP-CO/76/VSV, AcNPV-CAP-CO/205/VSV, AcNPV-Dual-Pfs25-PfCSP-gp64 및 AcNPV-Dual-PfMSP1-PfCSP-gp64)의 투여량은 백신 숙주내로 도입되는 발현가능한 DNA의 양 또는 전사된 RNA의 양으로서 넓은 범위로부터 선택될 수 있다. 또한, 그 투여양은 본 발명의 전달 벡터에서 사용되는 전사 및 번역 프로모터의 길이에 따라 달라진다.
본 발명의 백신(약학적 조성물)은 국소 부위(예를 들어, 폐 조직 내, 간 내, 근육 내 및 뇌 내) 내로 PBS(인산 완충 식염수) 또는 식염수에 현탁된 재조합 배큘로바이러스 현탁액을 직접 주사, 코 또는 공기를 통해 흡입, 혈관[예를 들어, 동맥 내(intra-arterial), 정맥(intravenous) 및 문맥(portal vein)], 피하(subcutaneous), 피부(intracutaneous), 복강(intraperitoneal) 투여함으로써 투여될 수 있다. 본 발명의 백신은 특히 호흡기 흡입으로 투여되는 것이 바람직하다.
본 발명의 백신(약학적 조성물)은 여러 번 투여되는 것이 바람직하다. 초기 투여 및 추가적인 백신 투여 후 상태를 관찰함으로써 한 번 내지 여러 번 투여되는 것이 바람직하다. 이는 원하는 효과를 증가시킬 수 있다. 상기 백신(약학적 조성물)을 투여한 후 본 발명의 재조합 배큘로바이러스(AcNPV-CAP-PfCSP, AcNPV-CAP-PfCSP/272, AcNPV-CAP-PfCSP/467, AcNPV-CAP-PfCSP(A361E), AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)/272, AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)/467, AcNPV-CAP-PfCSP-76, AcNPV-CAP-PfCSP-76/467, AcNPV-CAP-PfCSP+209, AcNPV-CAP-PfCSP+209/467, AcNPV-CAP-PfCSP+76/209, AcNPV-CAP-PfCSP+76/209/467, AcNPV-CAP-HA1/Anhui, AcNPV-CAP-HA1/Anhui/272, AcNPV-CAP-HA1/Anhui/467, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/51, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/101, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/154, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/201, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/272, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/467, AcNPV-CAP-AH/345, AcNPV-CAP-AH/345/467, AcNPV-CAP-AH/410, AcNPV-CAP-AH/410/467, AcNPV-CAP-AH/473, AcNPV-CAP-AH/473/467, AcNPV-CAP-AH/520, AcNPV-CAP-AH/520/467, AcNPV-CAP-VN/346, AcNPV-CAP-VN/346/467, AcNPV-CAP-VN/410, AcNPV-CAP-VN/410/467, AcNPV-CAP-VN/473, AcNPV-CAP-VN/473/467, AcNPV-CAP-VN/520, AcNPV-CAP-VN/520/467, AcNPV-CAP-CO/full, AcNPV-CAP-CO/full/467, AcNPV-CAP-CO/19, AcNPV-CAP-CO/19/467, AcNPV-CAP-CO/76, AcNPV-CAP-CO/76/467, AcNPV-CAP-CO/205, AcNPV-CAP-CO/205/467, AcNPV-CA39-HA1/Anhui, AcNPV-CA64-HA1/Anhui, AcNPV-CA39-PfCSP(A361E), AcNPV-CA64-PfCSP(A361E), AcNPV-CAP-CO/full/VSV, AcNPV-CAP-CO/19/VSV, AcNPV-CAP-CO/76/VSV, AcNPV-CAP-CO/205/VSV, AcNPV-Dual-Pfs25-PfCSP-gp64 및 AcNPV-Dual-PfMSP1-PfCSP-gp64)로 구성된 약학적 조성물로 추가적으로 면역시키는 것이 가능하다. 또한, 상기 언급된 본 발명의 백신과 다양한 약제의 조합은 백신(약학적 조성물)의 투여에 의한 치료적 효과를 증가시킬 수 있다.
본 발명의 백신(약학적 조성물)의 실시예에 있어서, 본 발명의 백신(약학적 조성물)의 유효성분 중 하나인 재조합 배큘로바이러스는 일반적으로 원하는 면역성을 가진 외래 유전자와 바이러스 입자의 성분이 될 수 있는 단백질을 암호화하는 유전자를 융합시킴으로써 획득된 융합 유전자가 도입된 전달 벡터와 베큘로바이러스 DNA의 상동 재조합에 의해 제조된다. 상기 재조합 바이러스는 제형을 만들기 위하여, 약학적으로 허용가능한 담체(투여되는 투여량 및 농도가 인간을 포함한 척추동물에 대해 비-독성이고, 제형에서 다른 성분과 양립할 수 있는)의 주사 제형[용액(solution), 현탁액(suspension), 또는 유제(emulsion)]과 혼합된다. 상기 제형은 재조합 배큘로바이러스에 대해 해로운 것으로 공공연히 알려진 항산화 및 기타 화합물을 포함하지 않는 것이 바람직하다.
상기 담체는 동일 성질 및 화학적 안정성을 증가시키는 물질 등과 같은 보조제를 적은 양으로 포함한다. 상기 보조제는 사용되는 투여량 및 농도에 있어서 인간을 포함한 포유류에 대한 비-독성을 가지고, 이는 인산(phosphoric acid), 시트르산(citric acid), 숙신산(succinic acid), 아세트산(acetic acid) 및 기타 유기산 등의 완충용액 또는 이의 염, 및 아스코르브산(ascorbic acid) 등의 항산화제, 저분자량(예를 들어, 약 10개 이하의 잔기) 폴리펩타이드[예를 들어, 폴리알기닌(polyarginine) 또는 트리펩타이드(tripeptide)], 단백질[예를 들어, 혈청 알부민(serum albumin), 젤라틴(gelatin) 또는 면역글로불린(immunoglobulin)], 아미노산[예를 들어, 글라이신(glycine), 글루탐산(glutamic acid), 아스팔르트산(aspartic acid) 또는 알기닌(arginine)], 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물[셀룰로즈(cellulose) 또는 이의 유도체, 글루코즈, 만노오스(mannose) 또는 덱스트린(dextrin)를 포함], 킬레이트제(chelating agent)(예를 들어, EDTA), 당알콜(sugar alcohol)[예를 들어, 만니톨(mannitol) 또는 솔비톨(sorbitol)], 반대이온(counterion)(예를 들어, 나트륨), 및/또는 비이온성 계면활성제(nonionic surfactant)[예를 들어, 폴리소르베이트(polysorbate), 폴록사머(poloxamer)] 및 폴리에틸렌 글리콜(Polyethylene Glycol, PEG)를 포함할 수 있다.
재조합 배큘로바이러스를 포함하는 약학적 백신(조성물)은 일반적으로 수용액(aqueous solution) 또는 친액성물(lyophilized product)의 상태로 봉인된 앰풀(ampoule) 또는 물약병(vial)과 같은 다양한 약 용기에 저장될 수 있다.
또한, 본 발명은 피험자에게 본 발명의 재조합 배큘로바이러스, 백신, 제형 및 약제학적 조성물을 말라리아 또는 인플루엔자 감염 예방제 및 말라리아 또는 인플루엔자의 치료제로서 효과적인 양으로 투여하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 피험자에게 본 발명의 재조합 배큘로바이러스, 백신, 제형 및 약제학적 조성물을 면역증강활성제로서 효과적인 양으로 투여하는 방법을 제공한다. 상기 피험자로는 말라리아 기생충 또는 인플루엔자 바이러스가 감염되었을 가능성이 있는 인간 또는 다른 동물(포유류, 조류, 파충류, 물고기 및 양서류) 및 말라리아 기생충 또는 독감 바이러스에 감염된 인간 또는 다른 동물을 포함한다. 상기 피험자의 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 A 바이러스(influenza A virus)임이 바람직하고, 인플루엔자 A 아형 H1 바이러스(influenza A subtype H1 virus) 또는 인플루엔자 A 아형 H3 바이러스(influenza A subtype H3 virus)임이 더 바람직하다. 말라리아 기생충은 열대열 원충(Plasmodium falciparum), 삼일열 원충(Plasmodium vivax), 사일열 원충(Plasmodium malariae)및 난형열 원충(Plasmodium ovale)을 포함한다.
본 발명의 재조합 배큘로바이러스는 백신, 제형 및 약제학적 조성물에 약제학적으로 수용가능한 담체를 단독 또는 혼합하여 만들어지고, 약의 형태로 투여된다.
상기 투여 경로는 상기 언급한 어떠한 투여경로를 사용해도 된다. 본 발명에서 사용되는 약제학적으로 수용가능한 담체는 약제학적 조성물의 형태에 따라, 당 기술분야에서 일반적으로 사용되는 담체로부터 적절한 것이 선택될 수 있다.
예를 들어, 약리학적 조성물을 만들 때는 수용액(aqueous solution), 정제된 물(멸균 물) 또는 생리적 완충 용액이 담체로 사용되어 질 수 있다. 또한, 약제학적 조성물을 만들 때는 다른 적당한 용액, 글리콜(glycol), 글리세롤(glycerol) 및 올리브 기름(olive oil)과 같이 주입될 수 있는 유기 에스테르가 담체로 사용되어 질 수 있다. 상기 조성물은 당 기술 분야에서 일반적으로 사용되고, 특히 백신 제형 분야에서 사용되는 안정제 및 첨가제가 포함될 수 있다.
본 발명의 백신, 제형 및 약제학적 조성물에서 재조합 배큘로바이러스의 양은 특정하게 제한되지 않으며, 넓은 범위로부터 적절히 선택될 수 있다. 일반적으로, 상기 조성물에서 재조합 배큘로바이러스의 양은 약 0.0002 내지 약 0.2 (w/v %)임이 바람직하고, 0.001 내지 0.1 (w/v %)임이 더 바람직하다. 본 발명의 재조합 배큘로바이러스, 백신, 제형 및 약제학적 조성물의 투여 방법은 특별히 제한되지 않고, 약의 형태, 환자의 나이, 성별 및 기타 조건, 질병의 심각도에 따라 적절하게 선택되어 질 수 있다. 그에 바람직한 투여 형태는 주사제, 점적제, 비강 점적제 및 흡입제와 같은 비경구 투여의 형태이다. 주사제 및 점적제의 형태의 조성물을 만들 때, 주사제는 글루코스 용액 또는 아미노산 용액과 같은 대체 유제와 혼합되어 정맥(intravenous)으로 투여될 수 있고, 또는 근육 내(intramuscular), 피부(intracutaneous), 피하(subcutaneous) 또는 복강(intraperitoneal)으로 투여될 수 있다.
본 발명의 재조합 배큘로바이러스, 백신, 제형 또는 약제학적 조성물의 일일 투여량은 피험자의 상태, 몸무게, 나이 및 성별 등에 매우 의존적이고, 따라서 정확히 특정할 수 없다. 그러나, 재조합 배큘로바이러스의 일반적인 투여량은 일일당 약 0.001 내지 100 mg/몸무게(kg)으로 투여된다. 본 발명의 백신, 제형 또는 조성물은 일일당 한 번 또는 여러 번 투여될 수 있다.
본 발명의 백신(제형 및 약학적 조성물)의 유효성분인 재조합 배큘로바이러스가 투여될 때, 재조합 바이러스의 PFU에 대해서, 환자당 102 내지 1014 PFU 투여되고, 바람직하게는 105 내지 1012 PFU 투여되고, 더 바람직하게는 106 내지 1010 PFU의 재조합 바이러스가 투여된다.
본 발명의 백신(조성물)은 각 환자의 임상 조건(예를 들어, 예방 및 치료에 대한 조건), 재조합 배큘로바이러스, 표적 조직, 투여 방법, 적정 용량 및 그 분야에서 공식적으로 전문적인 다른 인자를 포함한 백신(조성물)의 전달 위치를 고려하여, Good Medical Practice(GMC)에 따라 투여된다. 따라서, 본 발명의 백신(조성물)의 적정한 투여량은 상기를 고려하여 결정되었다.
이하, 본 발명은 실시예를 참고로 하여 보다 상세하게 설명한다.
하기 실시예들은 단지 예시일뿐이며, 본 발명을 한정하지 않는다.
실시예 1: 본 발명의 전달벡터 플라스미드 및 이의 제조 방법
(1) 본 발명의 전달벡터 플라스미드 pCAP-PfCSP, pCAP-PfCSP/272 및 pCAP-PfCSP/467의 제조
(1.1) 플라스미드 pBACsurf-Hsp65의 제조
Hsp65 유전자는 M. tuberculosis H37Rv 균주로부터 QIAamp DNA Midi Kit(Qiagen으로부터 공급받음)를 이용하여 게놈 DNA를 추출하고, 중합효소연쇄반응을 이용하여 클로닝하였다. 구체적으로, M. tuberculosis H37Rv 균주로부터 추출된 게놈 DNA를 프라이머 phsp65-F1: 5'- AATAATAGATCTAATGGCCAAGACAATTGCGTACGACGAAGA-3')(서열번호: 1); BglII 부위는 밑줄로 나타내었다)과 phsp65-R1: 5'-AATCCAATGCGGCCGCGGGAATTCGATTCCTGCAGGTCAGAAATCCATGCCACCCATGTCGCC-3')(서열번호: 2); NotI 부위는 밑줄로 나타내었다)로 PCR로 증폭하였다. 상기 PCR 산물을 정제한 후, 제한효소 BglII/NotI으로 절단한 다음, pCDNA3.1(+)(Invitrogen으로부터 공급받음)의 BamHI/NotI 부위에 삽입함으로써, 그 상기 pcDNA-hsp65를 주형으로 하여 프라이머 phsp65-F2 (5'-CACCCCTGCAGG ACTACAAGGACGACGATGACAAG GAATTCATGGCCAAGACAATTGCGTACGACGAAGAGGCC-3'(서열번호: 3); Sse8387I 와 EcoRI 부위는 밑줄로 나타내었고, FLAG 서열은 이탤릭체로 나타내었다)와 phsp65-R2 (5'-CCCGGGCGAAATCCATGCCACCCATGTCGCCGCCACC-3'(서열번호: 4); Cfr9I 부위는 밑줄로 나타내었다)를 이용하여 PCR을 수행하였다.
상기 결과물인 Hsp65 유전자 DNA 단편을 pENTR/D-TOPO(Invitrogen으로부터 공급받음)내로 클론시킨 후, Sse8387I/Cfr9I로 절단한 다음, pBACsurf-CSP(Yoshida et al., Virology 316: 161-70, 2003)의 PStI/Cfr9I 부위 내로 삽입하여, pBACsurf-Hsp65로 고안된 플라스미드를 제조하였다.
(1.2) 플라스미드 pENTR-gp64의 제조
상기 pBACsurf-1(Invitrogen으로부터 공급받음)을 주형으로 하여 프라이머 pPolh-F2(5'-CACCCGGACCGGATAATTAAAATGATAACCATCTCGCAAATAAATAAG-3'(서열번호: 5); RsrII 부위는 밑줄로 나타내었다)와 pgp64-R2(5'-GGTACCATATTGTCTATTACGGTTTCTAATCATAC-3'(서열번호: 6); KpnI 부위는 밑줄로 나타내었다)를 이용하여 PCR을 수행하였다. 상기 결과물인 gp64 유전자 DNA 단편을 플라스미드 pENTR-gp64를 제조하기 위해 pENTR/D-TOPO내로 삽입하였다. 그 결과, pENTR-gp64로 고안된 플라스미드를 제조하였다.
(1.3) 본 발명의 전달 벡터인 pDual-Hsp65-gp64의 제조
pBACsurf-Hsp65를 PstI/Cfr9I로 절단한 후, hsp65 유전자 DNA 단편을 pENTR-gp64의 PstI/Cfr9I 부위 내로 삽입하여, 플라스미드 pENTR-Hsp65-gp64를 제조하였다. pENTR-Hsp65-gp64는 RsrII/KpnI으로 절단하고, 폴리헤드린(polyhedrin) 프로모터와 hsp65-gp64 유전자를 포함한 DNA 단편을 RsrII/KpnI으로 절단된 pTriEx-3.1(Novagen으로부터 공급받음)dp 삽입하여, CMA 프로모터와 폴리헤드린 프로로모터로 구성된 원하는 이중 프로모터의 조절에 의해 포유류와 곤충세포에서 p65 항원과 sp64 단백질의 융합 단백질을 발현할 수 있는 전달 벡터 플라스미드 pDUal-HSp65-gp64를 제조하였다.
(1.4) 본 발명의 전달 벡터인 pDual-H1N1/HA1-gp64의 제조
QIAamp MiniElute Virus Spin Kit(QIAGEN)를 이용하여 인플루엔자 바이러스 PR/8/34 종으로 감염된 MDCK 세포의 배양 상층액으로부터 RNA를 추출한 후, 상기 RNA를 프라이머 HA-f: 5'-CCTGCAGGTATGAAGGCAAACCTACTGGTC-3'(서열번호: 7)(SbfI 부위는 밑줄로 나타내었다) 및 HA-r: 5'-GCCCGGGCGATGCATATTCTGCA-3'(서열번호: 8)(SbfI 부위는 밑줄로 나타내었다)를 이용한 RT-PCR로 증폭하였다. 상기 결과물인 전장 인플루엔자 바이러스 HA 유전자 단편을 pCR-Blunt II-TOPO(Invitrogen으로부터 공급받음) 내로 클론시켰다. 상기 결과, pCR-Blunt-HA로 고안된 플라스미드를 제조하였다. 상기 PCR은 주형으로서 pCR-Blunt-HA를, 프라이머로서 pHA-F1: 5'-CACCGAATTCGACACAATATGTATAGGCTACCATGCG-3'(서열번호: 9)(EcoRI 부위는 밑줄로 나타내었다) 및 pHA-R1: 5'-CCCGGGCACCTCTGGATTGGATGGACGGAATG-3'(서열번호: 10)(Cfr9I 부위는 밑줄로 나타내었다)를 이용하여 수행하였다. 상기 결과물인 H1N1/HA1 유전자 DNA 단편을 pENTR/D-TOPO내로 클론시킨 후, EcoRI/Cfr9I으로 절단하여 pDual-Hsp65-gp64의 EcoRI/Cfr9I 부위 내로 삽입하여, 플라스미드 pDual-H1N1/HA1-gp64를 제조하였다.
(1.5) 플라스미드 pBACsurf-HA1의 제조
pDual-H1N1/HA1-gp64 을 EcoRI/CfrI로 절단하고, H1N1/HA1 유전자의 DNA 단편을 EcoRI/CfrI로 절단된 pBACsurf-Hsp65에 삽입하여, 플라스미드 pBACsufr-HA1을 제조하였다.
(1.6) 플라스미드 pCP-H1N1/HA1-gp64의 제조
pBACsurf-HA1을 주형으로 Polh-f RsrII: 5'-GGGCGGACCGGATAATTAAAATGATAACCATCTCG-3'(서열번호: 11)(RsrII 부위는 밑줄로 나타내었다)와 GP64-r DraIII: 5'-GGGCACTTAGTGATATTGTCTATTACGGTTTCTAATC-3'(서열번호: 12)(DraIII 부위는 밑줄로 나타내었다)로 PCR을 수행하였다. 그 결과물인 DNA 단편을 RsrII와 DraIII로 절단된 pDual-H1N1/HA1-gp64에 삽입함으로써, pCP-H1N1/HA1-gp64를 제조하였다.
(1.7) 플라스미드 pCAP-H1N1/HA1-gp64의 제조
pCP-H1N1/HA1-gp64를 RsrII/DraIII로 절단하여 HA1과 gp64 유전자 단편을 준비한다. 상기 단편을 RsrII/DraIII로 절단된 pTriEx-1.1(Novagen으로부터 공급받음)에 삽입하여, CAG 프로모터와 폴리헤드린 프로로모터로 구성된 원하는 이중 프로모터의 조절에 의해 포유류와 곤충세포에서 HA1 항원과 gp64 단백질의 융합 단백질을 발현할 수 있는 전달 벡터 플라스미드 pCAP-H1N1/HA1-gp64를 제조하였다.
(1.8) 플라스미드 pCAP-H1N1/NP-gp64의 제조
인플루엔자 바이러스 PF/8/34의 게놈 RNA를 주형으로 하여, NP-f EcoRI: 5'- ACGGAATTCCATTCAATTCAAACTGGA-3'(서열번호: 13)(EcoRI 부위는 밑줄로 나타내었다)와 NP-r Cfr9I: 5'-GATCCCGGGCCTTGTCAATGCTGAATGGCAA-3'(서열번호: 14)(Cfr9I 부위는 밑줄로 나타내었다)로 RT-PCR을 수행하였다. 획득된 단편들은 제한 효소 EcoRI과 Cfr9I로 절단하고 제한 효소 EcoRI/Cfr9I으로 절단된 pCAP-H1N1/HA1-gp64에 삽입하여, pCAP-H1N1/NP-gp64를 제조하였다.
(1.9) 플라스미드 pCAP-H1N1/NP/272와 pCAP-H1N1/NP/467의 제조
상기 (1.1.8)에서 획득된 pCAP-H1N1/HA1-gp64에 gp64(272)-f: 5'- GACTCCCCGGGTCGAGCACCGAGTCAAGAAG-3'(서열번호: 15)(XmaI 부위는 밑줄로 나타내었다), gp64(467)-f: 5'-GACTCCCCGGGACATCACTTCCATGGCTGAA-3'(서열번호: 16)(XmaI 부위는 밑줄로 나타내었다), 및 GP64-r DraIII: 5'-GGGCACTTAGTGATATTGTCTATTACGGTTTCTAATC-3'(서열번호: 12)(DraIII 부위는 밑줄로 나타내었다)로 PCR을 수행하였다. 획득된 단편은 제한효소 XmaI/DraIII로 절단하였고, XmaI/DraIII로 절단된 pCAP-H1N1/NP-gp64에 삽입하여, pCAP-H1N1/NP/272p와 CAP-H1N1/NP/467를 제조하였다.
(1.10) 본 발명의 전달 벡터인 pCAP-PfCSP, cCAP-PfCSP/272 및 pCAP-PfCSP/467의 제조
QIAamp DNA Midi Kit(Qiagen)을 이용하여 Plasmodium falciparum 3D7 종으로 감염된 인간 적혈구(erythrocyte)로부터 P. falciparum 게놈 DNA를 추출하였다. PfCSP 유전자는 하기의 방법에 따라 상기 게놈 DNA를 주형으로 하여 PCR을 통해 클론되었다. PCR은 프라이머 PfCSP-f(19): 5'-GACTCTGCAGTTATTCCAGGAATACCAGTGCTATGGAAG-3'(서열번호: 17)(PstI 부위는 밑줄로 나타내었다)와 PfCSP-r(373): 5'-CGATCCCGGGCTTTTTCCATTTTACAAATTTTTTTTTCAATATC-3'(서열번호: 18)(XmaI 부위는 밑줄로 나타내었다)로 수행되었다. 상기 결과물인 DNA 단편은 각각 PstI과 XmaI으로 절단된 pCAP-H1N1/NP-gp64, pCAP-H1N1/NP/272 및 pCAP-H1N1/NP/467에 삽입되었고, 제조된 플라스미드는 pCAP-PfCSP, pCAP-PfCSP/272 및 pCAP-PfCSP/467라 명명하였다. Plasmodium falciparum 3D7 circumporozoite (CS) 단백질의 아미노산 서열의 GenBank 등록번호(accession number)는 XP_001351122이다.
(2) 본 발명의 전달벡터인 pDual-Pfs25-PfCSP-gp64의 제조
(2.1) 플라스미드 pDual-PbAMA1D123-gp64의 제조
말라리아 기생충 P. berghei ANKA 종으로 감염된 BALB/c 마우스로부터 혈액 샘플을 획득하고, QIAamp DNA Midi Kit (Qiagen)를 이용하여 P. berghei의 게놈 DNA를 추출하였다. PbAMA1 유전자 도메인 123 (D123)은 하기의 방법에 따라 상기 게놈 DNA를 주형으로 PCR을 수행하여 클론되었다. PCR은 프라이머 pAMA-F1: 5'-CACCGAATTCAATCCATGGGAAAAGTATACGGAAAAATAT-3'(서열번호: 19)(EcoRI부위는 밑줄로 나타내었다)와 pAMA1-R1: 5'-CCCGGGCTTCTCTGGTTTGATGGGCTTTCATATGCAC-3'(서열번호: 20)(Cfr9I 부위는 밑줄로 나타내었다)로 수행되었다. 상기 결과물인 PbAMA1D123 DNA 단편은 pENTR/D-TOPO로 클론되었고, 이후 EcoRI/Cfr9I으로 절단되어, EcoRI과 Cfr9I으로 절단된 pBACsurf-Hsp65에 삽입되었고, 이를 통해 제조된 플라스미드를 pBACsurf-PbAMA1D123라 명명하였다.
이후, pBACsurf-PbAMA1D123를 EcoRI/Cfr9I으로 절단하고, PbAMA1D123 유전자 DNA 단편은 EcoRI과 Cfr9I으로 절단된 pDual-Hsp65-gp64에 삽입하였고, 플라스미드 pDual-PbAMA1D123-gp64를 제조하였다.
(2.2) 플라스미드 pDual-PfCSP-gp64의 제조
PfCSP 유전자는 하기의 방법에 따라 P. falciparum의 게놈 DNA를 주형으로 하여 PCR에 의해 클론되었다. PCR은 프라이머 pPfCSP-F1: 5'-CACCGAATTCTTATTCCAGGAATACCAGTGCTATGGAAGT-3'(서열번호: 21)(EcoRI 부위는 밑줄로 나타내었다)와 pPfCSP-R1: 5'-CCCGGGCTTTTTCCATTTTACAAATTTTTTTTTC-3'(서열번호: 22)(Cfr9I 부위는 밑줄로 나타내었다)로 수행되었다. 상기 결과물인 PfCSP DNA 단편을 pENTR/D-TOPO에 클론한 후, EcoRI/Cfr9I으로 절단하고, EcoRI과 Cfr9I으로 절단된 pDual-PbAMA1D123-gp64에 삽입하였고, 이를 통해 제조된 플라스미드를 pDual-PfCSP-gp64라 명명하였다.
(2.3) 본 발명의 전달벡터인 pDual-Pfs25-PfCSP-gp64의 제조
Pfs25 유전자는 하기의 방법에 따라 P. falciparum의 게놈 DNA를 주형으로 하여 PCR에 의해 클론되었다. PCR은 프라이머 pPfs25-F1: 5'-CACCGAATTCAAAGTTACCGTGGATACTGTATGCAAAAGAGGA-3'(서열번호: 23)(EcoRI 부위는 밑줄로 나타내었다)와 pPfs25-R2: 5'-CCCGGGCTTTTTCCATTTTACAAATTTTTTTTTC-3'(서열번호: 24)(MunI 부위는 밑줄로 나타내었다)로 수행되었다. 상기 결과물인 Pfs25 DNA 단편을 pENTR/D-TOPO에 클론한 후, EcoRI/MunI으로 절단하고, EcoRI으로 절단된 pDual-PfCSP-gp64에 삽입하였고, 이를 통해 제조된 플라스미드를 pDual-Pfs25-PfCSP-gp64라 명명하였다.
(3) 본 발명의 전달벡터인 pDual-PfMSP1-PfCSP-gp64의 제조
PfMSP1 유전자는 하기의 방법에 따라 P. falciparum의 게놈 DNA를 주형으로 하여 PCR에 의해 클론되었다. PCR은 프라이머 pPfMSP119-F1: 5'-CACCGAATTCAACATTTCACAACACCAATGCGTAAAAAAAC-3'(서열번호: 25)(EcoRI 부위는 밑줄로 나타내었다)와 pPfMSP119-R2: 5'-CAATTGAGATCCGCCGCCACCGCCACCGTTAGAGGAACTGCAGAAAATACCATCGAAAAGTGGA-3'(서열번호: 26)(MunI 부위는 밑줄로 나타내었다)로 수행되었다. 상기 결과물인 PfMSP119 DNA 단편을 pENTR/D-TOPO에 클론한 후, EcoRI/MunI으로 절단하고, EcoRI으로 절단된 pDual-PbCSP-gp64에 삽입하였다. 이를 통해 제조된 플라스미드를 pDual-PfMSP1-PfCSP-gp64라 명명하였다.
(4) 본 발명의 전달벡터인 pCAP-PfCSP(A361E), pCAP-PfCSP(A361E)/272 및 pCAP-PfCSP(A361E)/467의 제조
PCR은 pCAP-PfCSP을 주형으로 하여 프라미어 PfCSP-f(19): 5'-GACTCTGCAGTTATTCCAGGAATACCAGTGCTATGGAAG-3'(서열번호: 17)(PstI 부위는 밑줄로 나타내었다)와 PfCSP-r(373 A361E): 5'-CGATCCCGGGCTTTTTCCATTTTACAAATTTTTTTTTCAATATCATTTTC-3'(서열번호: 27)(XmaI 부위는 밑줄로 나타내었다)로 수행되었다. 상기 얻어진 DNA 단편은 각각 PstI/XmaI으로 절단하고, PstI/XmaI으로 절단된 pCAP-H1N1/NP-gp64, pCAP-H1N1/NP/272 및 pCAP-H1N1/NP/467에 삽입하였고, 이를 통해 제조된 플라스미드를 pCAP-PfCSP(A361E), pCAP-PfCSP(A361E)/272, 및 pCAP-PfCSP(A361E)/467라 명명하였다.
(5) 본 발명의 전달벡터인 pCAP-PfCSP-76 및 pCAP-PfCSP-76/467의 제조
PCR은 pCAP-PfCSP(A361E)을 주형으로 하여 프라미어 PfCSP-f(76): 5'-GACTCTGCAGGATGATGGAAATAACGAAGACAACG-3'(서열번호: 28)(PstI 부위는 밑줄로 나타내었다)와 PfCSP-r(373 A361E): 5'-CGATCCCGGGCTTTTTCCATTTTACAAATTTTTTTTTCAATATCATTTTC-3'(서열번호: 27)(XmaI 부위는 밑줄로 나타내었다)로 수행되었다. 상기 얻어진 DNA 단편은 PstI/XmaI으로 절단하고, 각각 PstI/XmaI으로 절단된 pCAP-H1N1/NP-gp64 및 pCAP-H1N1/NP/467에 삽입하였고, 이를 통해 제조된 플라스미드를 pCAP-PfCSP-76 및 pCAP-PfCSP-76/467라 명명하였다.
(6) 전달벡터 pCAP-PfCSP+209 및 pCAP-PfCSP+209/467의 제조
합성 유전자 서열(PfCSP+: 서열번호: 29)은 주로 Sf9 세포 및 인간 세포에서 주로 사용되는 코돈을 사용하는 P. falciparum 3D7종의 PfCSP의 아미노산 서열로부터 준비되었다(하지만, 361 위치의 A는 E로 대체되었다). 얻어진 합성 유전자 서열을 주형으로 하여, PfCSP-f(+209): 5'-GACTCTGCAGAACGCTAATCCAAACGCTAATCCCAACGCTAATCCCAATGCC-3'(서열번호: 30)(PstI 부위는 밑줄로 나타내었다)와 PfCSP-r(+A361E): 5'-CGATCCCGGGCTTTTTCCATTTTGCAAATTTTTTT-3'(서열번호: 31)(XmaI 부위는 밑줄로 나타내었다)로 PCR을 수행하였다. 상기 결과물인 DNA 단편은 PstI/XmaII으로 절단하고, PstI/XmaII으로 절단된 pCAP-H1N1/NP-gp64 및 pCAP-H1N1/NP/467로 삽입하였고, 이를 통해 제조된 플라스미드를 pCAP-PfCSP+209 및 pCAP-PfCSP+209/467라 명명하였다.
(7) 본 발명의 전달벡터인 pCAP-PfCSP+76/209 및 pCAP-PfCSP+76/209/467의 제조
합성 유전자 서열(PfCSP+: 서열번호: 29)을 주형으로 하여, PfCSP-f(+76): 5'-GACTCTGCAGGACGACGGCAACAACGAAGACAACG-3'(서열번호: 32)(PstI 부위는 밑줄로 나타내었다), PfCSP-r(+128): 5'-CGTTAGGATCCACATTTGGGTTGGCATTTGGG-3'(서열번호: 33)(BamHI 부위는 밑줄로 나타내었다), PfCSP-f (+209) BamHl: 5'-GACTGGATCCTAACGCTAATCCAAACGCTAATCCC-3'(서열번호: 34)(BamHI 부위는 밑줄로 나타내었다) 및 PfCSP-r(+A361E): 5'-CGATCCCGGGCTTTTTCCATTTTGCAAATTTTTTT-3'(서열번호: 31)(XmaI 부위는 밑줄로 나타내었다)로 PCR을 수행하였다. 상기 결과물인 DNA 단편은 각각 PstI/BamHl 및 BamHl/XmaI로 절단하고, PstI과 XmaI으로 절단된 pCAP-H1N1/NP-gp64 및 pCAP-H1N1/NP/467에 삽입하였고, 이를 통해 얻어진 플라스미드를 pCAP-PfCSP+76/209 및 pCAP-PfCSP+76/209/467라 명명하였다.
(8) 본 발명의 전달벡터인 pCAP-HA1/Anhui, pCAP-HA1/Anhui/272 및 pCAP-HA1/Anhui/467의 제조
합성 유전자 서열(서열번호: 35)은 주로 Sf9 세포 및 인간 세포에서 주로 사용되는 코돈을 사용하는 인플루엔자 바이러스 H5N1/Anhui/1/05의 헤마글루티닌 HA1(hemagglutinin HA1)의 아미노산 서열로부터 준비되었다. 상기 획득된 합성 유전자 서열을 주형으로 하여, AH-F1: 5'-CAGTCTGCAGGACCAGATTTGCATC-3'(서열번호: 36)(PstI 부위는 밑줄로 나타내었다)과 AH-R4 5'-CAGTCCCGGGCTCTCTTGCGCCTGC-3'(서열번호: 37)(XmaI 부위는 밑줄로 나타내었다)로 PCR을 수행하였다. 얻어진 DNA 단편dmf PstI과 XmaI으로 절단하고, 각각 PstI과 XmaI으로 절단된 pCAP-H1N1/NP-gp64, pCAP-H1N1/NP/272 및 pCAP-H1N1/NP/467에 삽입하였고, 이를 통해 제조된 플라스미드를 pCAP-HA1/Anhui, pCAP-HA1/Anhui/272 및 pCAP-HA1/Anhui/467라 명명하였다.
인플루엔자 바이러스 A/H5N1/Anhui/1/05의 헤마글루티닌(hemagglutinin)의 아미노산 서열의 GenBank 등록번호는 ABD28180이다.
(9) 본 발명의 전달벡터인 pCAP-HA1/Vietnam, pCAP-HA1/Vietnam/51, pCAP-HA1/Vietnam/101, pCAP-HA1/Vietnam/154, pCAP-HA1/Vietnam/201, pCAP-HA1/Vietnam/272, and pCAP-HA1/Vietnam /467 의 제조
합성 유전자 서열(서열번호: 38)은 주로 Sf9 세포 및 인간 세포에서 주로 사용되는 코돈을 사용하는 인플루엔자 바이러스 H5N1/Vietnam/1203/4의 헤마글루티닌 HA1(hemagglutinin HA1)의 아미노산 서열로부터 준비되었다. 상기 획득된 합성 유전자 서열을 주형으로 하여, VN-F1: 5'-CAGTCTGCAGGACCAGATCTGTATC-3'(서열번호: 39)(PstI 부위는 밑줄로 나타내었다)과 VN-R4 5'-CAGTCCCGGGCTCTCTTCTTCCTGC-3'(서열번호: 40)(XmaI 부위는 밑줄로 나타내었다)로 PCR을 수행하였다. 얻어진 DNA 단편을 PstI과 XmaI으로 절단하고, 각각 PstI과 XmaI으로 절단된 pCAP-H1N1/NP-gp64, pCAP-H1N1/NP/272 및 pCAP-H1N1/NP/467에 삽입하였고, 이를 통해 제조된 플라스미드를 pCAP-HA1/Vietnam, pCAP-HA1/Vietnam/272 및 pCAP-HA1/Vietnam/467라 명명하였다.
더불어, pCAP-HA1/Vietnam를 주형으로 하여, gp64(51)-f: 5'-GACTCCCCGGGTGGAAATCACCATCGTGGAGACG-3'(서열번호: 41)(XmaI 부위는 밑줄로 나타내었다), 또는 gp64(101)-f: 5'-GACTCCCCGGGATTTGCTTATGTGGAGCATCAGG-3'(서열번호: 42)(XmaI 부위는 밑줄로 나타내었다), 또는 gp64(154)-f: 5'-GACTCCCCGGGCGCACCACACGTGCAACAAATCG-3'(서열번호: 43)(XmaI 부위는 밑줄로 나타내었다), 또는 gp64(201)-f: 5'-GACTCCCCGGGACACTGTGCTTCATCGAGACGGC-3'(서열번호: 44)(XmaI 부위는 밑줄로 나타내었다)과 GP64-r DraIII: 5'-GGGCACTTAGTGATATTGTCTATTACGGTTTCTAATC-3'(서열번호: 12)(Dralll 부위는 밑줄로 나타내었다)로 PCR을 수행하였다. 얻어진 DNA 단편을 XmaI과 DraIII로 절단하여, XmaI과 DraIII로 절단된 pCAP-HA1/Vietnam에 삽입하였고, 이를 통해 제조된 플라스미드를 pCAP-HA1/Vietnam/51, pCAP-HA1/Vietnam/101, pCAP-HA1/Vietnam/154 및 pCAP-HA1/Vietnam/201라 명명하였다.
인플루엔자 바이러스 A/H5N1/Vietnam/1203/2004의 헤마글루티닌(hemagglutinin)의 아미노산 서열의 GenBank 등록번호는 AAW80717이다.
(10) 본 발명의 전달벡터인 pCAP-AH/345, pCAP-AH/345/467, pCAP-AH/410, pCAP-AH/410/467, pCAP-AH/473, pCAP-AH/473/467, pCAP-AH/520 및 pCAP-AH/520/467의 제조
합성 유전자 서열(서열번호: 45)은 Gene Designer(DNA2.0, Inc)를 사용한 코돈 최적화에 의한 인플루엔자 바이러스 A/H5N1/Anhui/1/05의 헤마글루티닌의 HA 부분의 아미노산 서열을 통해 준비되었다. 상기 합성 유전자를 주형으로 하여, AH17-F: 5'-GACTCTGCAGGATCAGATCTGTATTGGGTACC-3'(서열번호: 46)(PstI 부위는 밑줄로 나타내었다)과 AH345-R: 5'-CGATCCCGGGCTCTCTTTCTCCTCCGCTCGC-3'(서열번호: 47)(XmaI 부위는 밑줄로 나타내었다), 또는 AH410-R: 5'-CGATCCCGGGCGGCCTCGAACTGGGTGTTCATT-3'(서열번호: 48)(XmaI 부위는 밑줄로 나타내었다), 또는 AH473-R: 5'-CGATCCCGGGCGTCTCTGAGTTGAAGGCGCAC-3'(서열번호: 49)(XmaI 부위는 밑줄로 나타내었다), 또는 AH520-R: 5'-CGATCCCGGGCACCACTAATTTCCTCTCGCTTC-3'(서열번호: 50)(XmaI 부위는 밑줄로 나타내었다)로 PCR을 수행하였다. 얻어진 DNA 단편은 PstI과 XmaI으로 절단하고, PstI과 XmaI으로 절단된 pCAP-HA1/Anhui 또는 pCAP-HA1/Anhui/467에 삽입하였고, 이를 통해 얻어진 플라스미드를 pCAP-AH/345, pCAP-AH/345/467, pCAP-AH/410, pCAP-AH/410/467, pCAP-AH/473, pCAP-AH/473/467, pCAP-AH/520 및 pCAP-AH/520/467라 명명하였다.
(11) 본 발명의 전달벡터인 pCAP-VN/346, pCAP-VN/346/467, pCAP-VN/410, pCAP-VN/410/467, pCAP-VN/473, pCAP-VN/473/467, pCAP-VN/520 및 pCAP-VN/520/467의 제조
합성 유전자 서열(서열번호: 51)은 Gene Designer(DNA2.0, Inc)를 사용한 코돈 최적화에 의한 인플루엔자 바이러스 A/H5N1/Vietnam/1203/2004의 헤마글루티닌의 HA 부분의 아미노산 서열을 통해 준비되었다. 상기 합성 유전자를 주형으로 하여, VN17-F: 5'-GACTCTGCAGGATCAGATCTGTATCGGATATC-3'(서열번호: 52)(PstI 부위는 밑줄로 나타내었다)과 VN346-R: 5'-CGATCCCGGGCCCGCTTTTTCCTCCTCCGTTCG-3'(서열번호: 53)(XmaI 부위는 밑줄로 나타내었다), 또는 VN410-R: 5'-CGATCCCGGGCCTCAAACTGCGTATTCATTTTG-3'(서열번호: 54)(XmaI 부위는 밑줄로 나타내었다), 또는 VN473-R: 5'-CGATCCCGGGCTCTAAGCTGGAGCCTGACTTTGTC-3'(서열번호: 55)(XmaI 부위는 밑줄로 나타내었다), 또는 VN520-R: 5'-CGATCCCGGGCACTAATCTCCTCTCTTTTAAGTC-3'(서열번호: 56)(XmaI 부위는 밑줄로 나타내었다)로 PCR을 수행하였다. 얻어진 DNA 단편은 PstI과 XmaI으로 절단하고, PstI과 XmaI으로 절단된 pCAP-HA1/Anhui 또는 pCAP-HA1/Anhui/467에 삽입하였고, 이를 통해 얻어진 플라스미드를 pCAP-VN/346, pCAP-VN/346/467, pCAP-VN/410, pCAP-VN/410/467, pCAP-VN/473, pCAP-VN/473/467, pCAP-VN/520 및 pCAP-VN/520/467라 명명하였다.
(12) 본 발명의 전달벡터인 pCAP-CO/full, pCAP-CO/full/467, pCAP-CO/19, pCAP-CO/19/467, pCAP-CO/76, pCAP-CO/76/467, pCAP-CO/205 및 pCAP-CO/205/467의 제조
합성 유전자 서열(서열번호: 57)은 Gene Designer(DNA2.0, Inc)를 사용한 코돈 최적화에 의한 Plasmodium falciparum 3D7 종의 CSP의 아미노산 서열을 통해 준비되었다. 상기 합성 유전자를 주형으로 하여, PfCSP_opt-f: 5'-GACTCTGCAGATGATGCGAAAATTGGCCATACTG-3'(서열번호: 58)(PstI 부위는 밑줄로 나타내었다) 및 PfCSP_opt-r (397): 5'-CGATCCCGGGCATTGAGGAACAGAAAGGAAAGAACCATG-3' (서열번호: 59)(XmaI 부위는 밑줄로 나타내었다); PfCSP_opt-f (19): 5'-GACTCTGCAGCTGTTTCAGGAATACCAGTGCTATGG-3'(서열번호: 60)(PstI 부위는 밑줄로 나타내었다)과 PfCSP_opt-r (373): 5'-CGATCCCGGGCCTTCTCCATCTTACAAATTTTCTTTTCAATATCATTAGC-3'(서열번호: 61)(XmaI 부위는 밑줄로 나타내었다); PfCSP_opt-f (76): 5'-GACTCTGCAGGACGACGGAAATAATGAGGACAACG-3'(서열번호: 62)(PstI 부위는 밑줄루 나타내었다)과 PfCSP_opt-r (373): 5'-CGATCCCGGGCCTTCTCCATCTTACAAATTTTCTTTTCAATATCATTAGC-3'(서열번호: 61)(XmaI 부위는 밑줄로 나타내었다); 및 PfCSP_opt-f (205): 5'-GACTCTGCAGAATGCAAACCCAAATGCCAATCCAAACGC-3'(서열번호: 63)(PstI 부위는 밑줄로 나타내었다)과 PfCSP_opt-r (373): 5'-CGATCCCGGGCCTTCTCCATCTTACAAATTTTCTTTTCAATATCATTAGC-3'(서열번호: 61)(XmaI 부위는 밑줄로 나타내었다)로 구성된 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하였다. 얻어진 DNA 단편은 PstI과 XmaI으로 절단하고, PstI과 XmaI으로 절단된 pCAP-HA1/Anhui 또는 pCAP-HA1/Anhui/467에 삽입하였고, 이를 통해 얻어진 플라스미드를 pCAP-CO/full, pCAP-CO/full/467, pCAP-CO/19, pCAP-CO/19/467, pCAP-CO/76, pCAP-CO/76/467, pCAP-CO/205 및 pCAP-CO/205/467라 명명하였다.
(13) 본 발명의 전달벡터인 pCA64-HA1/Anhui 및 pCA64-PfCSP(A361E)의 제조
BacVector-2000 DNA(Novagen으로부터 공급받음)의 삼중 절단 DNA를 사용하여, gp64-p-f: 5'-GACTCGGACCGGCCAGATAAAAATAATCTTATCAATTAAG-3'(서열번호: 64)(RsrII 부위는 밑줄로 나타내었다)와 gp64-p-r: 5'-CGATACTAGTAGCACTGAGGCTTCTTATATACCCG-3'(서열번호: 65)(SpeI 부위는 밑줄로 나타내었다)로 PCR을 수행하였다. 얻어진 DNA 단편은 RsrII 와 SpeI으로 절단하고, RsrII과 SpeI으로 절단된 pCAP-HA1/Anhui 또는 pCAP-PfCSP(A361E)에 삽입하여, CAG 프로모터와 gp64 프로모터로 구성된 원하는 이중 프로모터의 조절하에서 포유류와 곤충 세포에서 HA1 항원 또는 PfCSP 항원과 gp64 단백질의 융합 단백질을 발현할 수 있는 전달벡터 플라스미드 pCA64-HA1/Anhui 및 pCA64-PfCSP(A361E)를 제조하였다.
(14) 본 발명의 전달벡터인 pCA39-HA1/Anhui 및 pCA39-PfCSP(A361E)의 제조
BacVector-2000 DNA(Novagen으로부터 공급받음)의 삼중 절단 DNA를 사용하여, vp39-p-f: 5'-GACTCGGACCGCGTCGTACAAATCGAAATATTGTTGTG-3'(서열번호: 66)(RsrII 부위는 밑줄로 나타내었다)와 vp39-p-r: 5'-CGATACTAGTGTGATTGAGAAAGAAATCTCTTATTC-3'(서열번호: 67)(SpeI 부위는 밑줄로 나타내었다)로 PCR을 수행하였다. 얻어진 DNA 단편은 RsrII 와 SpeI으로 절단하고, RsrII과 SpeI으로 절단된 pCAP-HA1/Anhui 또는 pCAP-PfCSP(A361E)에 삽입하여, CAG 프로모터와 vp39 프로모터로 구성된 원하는 이중 프로모터의 조절하에서 포유류와 곤충 세포에서 HA1 항원 또는 PfCSP 항원과 gp64 단백질의 융합 단백질을 발현할 수 있는 전달벡터 플라스미드 pCA39-HA1/Anhui 및 pCA39-PfCSP(A361E)를 제조하였다.
(15) 본 발명의 pCAP-CO/full/VSV, pCAP-CO/19/VSV, pCAP-CO/76/VSV 및 pCAP-CO/205/VSV의 제조
pVSV-G(Clontech으로부터 공급받음)을 주형으로 하여, VSV-G-f: 5'-GACTCCCCGGGCGTTCGAACATCCTCACATTCAAG-3'(서열번호: 68)(XmaI 부위는 밑줄로 나타내었다)와 VSV-G-r: 5'-GACTCACTTAGTGCTTTCCAAGTCGGTTCATCTC-3'(서열번호: 69)(DraIII 부위는 밑줄로 나타내었다)로 PCR을 수행하였다. 얻어진 DNA 단편은 각각 XmaI과 DraIII로 절단된 pCAP-CO/full, pCAP-CO/19, pCAP-CO/76 및 pCAP-CO/205에 삽입하였고, 이를 통해 제조된 플라스미드는 pCAP-CO/full/VSV, pCAP-CO/19/VSV, pCAP-CO/76/VSV 및 pCAP-CO/205/VSV라 명명하였다.
실시예 2: 본 발명의 재조합 배큘로바이러스 및 이의 제조 방법
(1) 재조합 배큘로바이러스 제조용 키트(Novagen으로부터 공급받은 BacVector-2000 Transfection Kit)를 이용하여 상기 <실시예 1>에서 제조한 pCAP-PfCSP, pCAP-PfCSP/272, pCAP-PfCSP/467, pCAP-PfCSP(A361E), pCAP-PfCSP(A361E)/272, pCAP-PfCSP(A361E)/467, pCAP-PfCSP-76, pCAP-PfCSP-76/467, pCAP-PfCSP+209, pCAP-PfCSP+209/467, pCAP-PfCSP+76/209, pCAP-PfCSP+76/209/467, pCAP-HA1/Anhui, pCAP-HA1/Anhui/272, pCAP-HA1/Anhui/467, pCAP-HA1/Vietnam, pCAP-HA1/Vietnam/51, pCAP-HA1/Vietnam/101, pCAP-HA1/Vietnam/154, pCAP-HA1/Vietnam/201, pCAP-HA1/Vietnam/272, pCAP-HA1/Vietnam/467, pCAP-AH/345, pCAP-AH/345/467, pCAP-AH/410, pCAP-AH/410/467, pCAP-AH/473, pCAP-AH/473/467, pCAP-AH/520, pCAP-AH/520/467, pCAP-VN/346, pCAP-VN/346/467, pCAP-VN/410, pCAP-VN/410/467, pCAP-VN/473, pCAP-VN/473/467, pCAP-VN/520, pCAP-VN/520/467, pCAP-CO/full, pCAP-CO/full/467, pCAP-CO/19, pCAP-CO/19/467, pCAP-CO/76, pCAP-CO/76/467, pCAP-CO/205, pCAP-CO/205/467, pCA39-HA1/Anhui, pCA64-HA1/Anhui, pCA39-PfCSP(A361E), pCA64-PfCSP(A361E), pCAP-CO/full/VSV, pCAP-CO/19/VSV, pCAP-CO/76/VSV, pCAP-CO/205/VSV, pDual-Pfs25-PfCSP-gp64 및 pDual-PfMSP1-PfCSP-gp64의 각각의 전달벡터를 Sf-9 세포들 내로 공동-형질도입함으로써 재조합 배큘로바이러스를 제조하였다.
상기 제조된 재조합 배큘로바이러스는 각각 AcNPV-CAP-PfCSP, AcNPV-CAP-PfCSP/272, AcNPV-CAP-PfCSP/467, AcNPV-CAP-PfCSP(A361E), AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)/272, AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)/467, AcNPV-CAP-PfCSP-76, AcNPV-CAP-PfCSP-76/467, AcNPV-CAP-PfCSP+209, AcNPV-CAP-PfCSP+209/467, AcNPV-CAP-PfCSP+76/209, AcNPV-CAP-PfCSP+76/209/467, AcNPV-CAP-HA1/Anhui, AcNPV-CAP-HA1/Anhui/272, AcNPV-CAP-HA1/Anhui/467, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/51, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/101, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/154, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/201, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/272, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/467, AcNPV-CAP-AH/345, AcNPV-CAP-AH/345/467, AcNPV-CAP-AH/410, AcNPV-CAP-AH/410/467, AcNPV-CAP-AH/473, AcNPV-CAP-AH/473/467, AcNPV-CAP-AH/520, AcNPV-CAP-AH/520/467, AcNPV-CAP-VN/346, AcNPV-CAP-VN/346/467, AcNPV-CAP-VN/410, AcNPV-CAP-VN/410/467, AcNPV-CAP-VN/473, AcNPV-CAP-VN/473/467, AcNPV-CAP-VN/520, AcNPV-CAP-VN/520/467, AcNPV-CAP-CO/full, AcNPV-CAP-CO/full/467, AcNPV-CAP-CO/19, AcNPV-CAP-CO/19/467, AcNPV-CAP-CO/76, AcNPV-CAP-CO/76/467, AcNPV-CAP-CO/205, AcNPV-CAP-CO/205/467, AcNPV-CA39-HA1/Anhui, AcNPV-CA64-HA1/Anhui, AcNPV-CA39-PfCSP(A361E), AcNPV-CA64-PfCSP(A361E), AcNPV-CAP-CO/full/VSV, AcNPV-CAP-CO/19/VSV, AcNPV-CAP-CO/76/VSV, AcNPV-CAP-CO/205/VSV, AcNPV-Dual-Pfs25-PfCSP-gp64 및 AcNPV-Dual-PfMSP1-PfCSP-gp64로 명명되었다.
실시예 3: 곤충 세포에서 본 발명의 재조합 배큘로바이러스로부터 백신 항원의 발현 확인 실험
Sf-9 세포들을 배양용 48웰 플레이트(Corning로부터 공급받음)의 웰당 1 x 105 세포가 되도록 배양하였고, 상기 제조된 <실시예 2>의 배큘로바이러스 AcNPV-CAP-PfCSP, AcNPV-CAP-HA1/Anhui 및 AcNPV-CAP-HA1/Vietnam 또는 대조군으로 야생형 배큘로바이러스(AcNPV-WT)를 약 0.1 정도의 감염다중도(infection multiplicity)로 감염시켰다. 5일 후에, 배양 상등액을 각각의 웰에서 제거한 후, 세포를 완전히 용해하기 위해 샘플 완충 용액(+2ME, x2) (Wako로부터 공급받음)을 웰 당 약 0.05ml씩 첨가였다. 세포 파쇄액은 100℃에서 5분간 열을 가하고, 7.5% SDS-PAGE에서 전기영동하였다. 전기영동 후, 단백질은 PVDF 막(Millipore로부터 공급받은 Immobilon-P)에 이동시키고, 블라킹은 2.5% 탈지분유/슈퍼블락(Piece에서 공급받음)에 막을 담그고, 4℃에서 밤새 수행하였다. 각 배큘로바이러스로 감염된 Sf9 세포 유래 단백질이 이동된 막을 1차 항체로 항-gp64 항체(eBioSciencef로부터 공급받은 AcV5)와 함께 배양한 후, 2차 항체로 HRP(Horse Radish Peroxidase)로 표지된 염소 항-마우스 IgG(H+L) 항체(Biorad로부터 공급받음)와 함께 배양하였다. 단백질의 밴드를 검출하기 위해, ECLplus 웨스턴 블랏팅 검출 키트(GE healthcare에서 공급받음)로 색을 현상하였다. 상기 결과는 도 1에서 보여준다.
도 1은 인간 말리리아 PfCSP 유전자, 인플루엔자 바이러스 H5N1/Anhui/1/05 종의 HA1 유전자 및 H5N1/Vietnam/1203/04 종의 HA1 유전자를 포함한 재조합 배큘로바이러스로부터 곤충 세포에서 융합 항원의 발현을 나타내는 웨스턴 블랏팅 분석(Western blotting analysis)을 보여준다. 상기 도면에서, 1번 레인(lane)은 야생형 배큐로바이러스(AcNPV-WT) 유래 밴드를 나타내고, 2번 레인은 본 발명의 이중 프로모터의 다운스트림(downstream)에 삽입되어 있는 PfCSP 유전자와 전장의 gp64 유전자가 포함된 재조합 배큘로바이러스(AcNPV-CAP-PfCSP) 유래 밴드를 나타내고, 3번 레인은 본 발명의 이중 프로모터의 다운스트림에 삽입되어 있는 인플루엔자 바이러스 H5N1/Anhui/1/05종의 HA1 유전자와 전장의 gp64 유전자를 포함한 재조합 배큘로바이러스(AcNPV-CAP-HA1/Anhui) 유래 밴드를 나타내고, 4번 레인은 본 발명의 이중 프로모터의 다운스트림에 삽입되어 있는 인플루엔자 바이러스 H5N1/Vietnam/1203/04종의 HA1 유전자와 전장의 gp64 유전자를 포함한 재조합 배큘로바이러스 유래 밴드를 나타낸다.
상기 도 1의 레인 2,3 및 4에서 보는 바와 같이, 면역성 외래 항원 유전자와 gp64 유전자의 발현 융합 산물에 대응하는 밴드가 본 발명의 이중 프로모터의 다운스트림에서 항원 유전자와 gp64 유전자가 융합되어 발현되는 재조합 배큘로바이러스에서 관찰되었다.
상기 결과로부터 본 발명의 재조합 바이러스 이용할 때, 면역원 외래 항원 유전자와 gp64 유전자가 곤충 세포에서 발현 융합 산물로써, 융합되고 발현될 수 있음을 확인하였다.
실시예 4: 본 발명의 재조합 배큘로바이러스의 바이러스 입자[비리온(virion)]에 존재하는 백신 항원 내 융합 항원의 동정 실험
Sf9 세포를 150 mm 세포 배양 플레이트(Sumilon으로부터 공급받음)에 1 x 107 세포/웰로 배양하였고, 상기 제조된 <실시예 2>의 각 배큘로바이러스를 약 0.1 정도의 감염 다중도로 감염시켰다. 7일 후에, 배지를 3,000xg의 속도로 4℃에서 15분 동안 2번의 원심분리를 수행한 후, 바이러스 용액에 25% 수크로즈(sucrose) 용액을 더하고, 4℃에서 90분간 25,000 rpm의 속도의 초원심분리기를 이용하여 원심분리한 후, 바이러스 입자를 얻었다. 0.05 ml의 샘플 완충 용액(2-mercaptoethanol첨가, x2)(Wako로부터 공급받음)에 초원심분리를 통해 채취된 각 AcNPV-CAP-PfCSP, AcNPV-CAP-PfCSP/272, AcNPV-CAP-PfCSP/467, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam 및 AcNPV-WT의 바이러스 농도(1 x 108 PFU/mL)의 0.05ml을 첨가한다. 그 결과로 얻어진 혼합물은 100℃에서 5분간 열을 가하고, 7.5% SDS-PAGE에서 전기영동하였다. 전기영동 후, 얻어진 단백질은 PVDF 막(Millipore로부터 공급받은 Immobilon-P)에 이동시키고, 블라킹은 2.5% 탈지분유/슈퍼블락(Piece에서 공급받음)에서, 4℃에서 밤새 수행하였다. AcNPV-CAP-PfCSP, AcNPV-CAP-PfCSP/272 및 AcNPV-CAP-PfCSP/467의 바이러스 용액이 이동된 막을 1차 항체로 항-PfCSP 항체(MR-4로부터 공급받은 2A10)와 함께 배양한 후, 2차 항체로 HRP(Horse Radish Peroxidase)로 표지된 염소 항-마우스 IgG(H+L) 항체(Biorad로부터 공급받음)와 함께 배양하였다. AcNPV-CAP-HA1/Vietnam의 바이러스 용액이 이동된 막을 1차 항체로 항-H5N1 항체(Immune technology로부터 공급받은 IT-003-005)와 함께 배양한 후, 2차 항체로 HRP(Horse Radish Peroxidase)로 표지된 염소 항-래빗 IgG 항체(GE Healthcare로부터 공급받음)와 함께 배양하였다. 단백질의 밴드를 검출하기 위해, ECLplus 웨스턴 블랏팅 검출 키트(GE healthcare에서 공급받음)로 색을 현상하였다. 상기 결과는 도 2에서 보여준다.
도 2의 (A)는 재조합 전달 벡터를 이용해 만들어진 재조합 배큘로바이러스의 바이러스 입자에서 인간 말라리아의 CSP(PfCSP) 유전자의 발현을 보여주는 웨스턴 블랏팅 분석(Western blotting analysis)을 보여준다. 상기 도면에서, 도 2의 (A)의 좌측으로부터 레인 1은 본 발명의 이중 프로모터의 다운스트림에 삽입되어 있는 PfCSP 유전자와 전장의 gp64 유전자를 포함한 재조합 배큘로바이러스(AcNPV-CAP-PfCSP) 유래 밴드를 나타내고, 레인 2는 본 발명의 이중 프로모터의 다운스트림에 삽입되어 있는 PfCSP 유전자와 부분 길이의 gp64(C 말단의 241 아미노산 잔기)을 포함한 재조합 배큘로바이러스(AcNPV-CAP-PfCSP/272) 유래 밴드를 나타내고, 레인 3은 본 발명의 이중 프로모터의 다운스트림에 삽입되어 있는 PfCSP 유전자와 부분 길이의 gp64 유전자(C 말단의 46 아미노산 잔기)가 포함되어 있는 재조합 배큘로바이러스(AcNPV-CAP-PfCSP/467) 유래 밴드를 나타낸다. 전기영동된 배큘로바이러스와 PfCSP 유전자와 gp64 유전자의 발현된 융합 산물의 존재를 대조하였다. 재조합 바이러스 입자의 PfCSP 유전자와 gp64 유전자의 융합 항원의 존재를 나타내는 진한 밴드가 상기 도 2의 (A)의 모든 레인에서 확인되었다.
도 2의 (B)는 재조합 전달 벡터에서 만들어진 재조합 배큘로바이러스의 바이러스 입자에서 H5N1/HA1 유전자의 발현을 보여주는 웨스턴 블랏팅 분석(Western blotting analysis)을 보여준다. 상기 도면에서, 도 2의 (B)의 좌측으로부터 레인 1은 <실시예 3>에서 제조된 AcNPV-WT에 감염된 세포의 파쇄액을 이용한 결과를 나타내고, 레인 2는 <실시예 3>에서 제조된 AcNPV-CAP-HA1/Anhui에 감염된 세포의 파쇄액을 이용한 결과를 나타내고, 레인 3은 <실시예 3>에서 제조된 AcNPV-CAP-HA1/Vietnam에 감염된 세포의 파쇄액을 이용한 결과를 나타내고, 레인 4는 야생형 배큘로바이러스(AcNPV-WT)의 바이러스 입자의 결과를 나타내고, 레인 5는 본 발명의 이중 프로모터의 다운스트림에 삽입된 인플루엔자 바이러스 H5N1/Vietnam/1203/04종의 HA1 유전자와 전장 gp64 유전자가 포함된 재조합 배큘로바이러스(AcNPV-CAP-HA1/Vietnam)의 바이러스 입자의 결과를 나타내고, 레인 6은 H5N1(Immune technology로부터 공급받은 IT-003-005)의 정제된 HA 항원의 결과를 나타낸다. 전기영동된 배큘로바이러스와 PfCSP 유전자와 gp64 유전자의 발현된 융합 산물의 존재를 대조하였다. 재조합 바이러스 입자의 H5N1/Vietnam/1203/04의 HA1 유전자와 gp64 유전자의 융합 항원의 존재를 나타내는 진한 밴드가 도 2의 (B)의 레인 5에서 확인되었다.
상기 <실시예 4>의 결과들은 원하는 면역성을 지닌 외래 유전자와 gp64 유전자가 본 발명의 재조합 전달 벡터를 이용하여 만들어진 본 발명의 재조합 배큘로바이러스의 재조합 바이러스 입자에서 융합되어 발현된다는 것을 나타낸다.
실시예 5: 포유류에서 본 발명의 재조합 배큘로바이러스 유래 백신 항원의 발현 실험
본 발명자들은 HepG2 세포를 약 1의 감염 다중도에서 AcNPV-Dual-PfMSP1-PfCSP로 감염시켰다. 48시간 후, 배양 상등액을 제거하였고, 플레이트를 PBS로 세 번 세척하였으며, -20℃에서 냉각시킨 아세톤 에탄올 용액(7:3)을 첨가하여 5분 동안 -20℃에서 세포를 고정시켰다. 블라킹은 실내온도에서 5% 정상 염소 혈청(Sigma로부터 공급받음)을 추가함으로써 수행되었다. PfCSP의 발현을 확인하기 위하여, 알렉사 플러(Alexa Flour) 594가 표지된 항-PfCSP 항체(2A10, MR-4)를 첨가하고, PfMSP-119의 발현을 확인하기 위하여, 항-PfMSP-119 항체(5.2, MR-4)와 그 다음 FITC-표지된 항-마우스 IgG(H+L)를 첨가한 후 배양하하였고, 반응된 세포를 현광 현미경으로 검출하였다.
도 3은 그 결과를 나타낸다.
도 3은 HepG2 세포를 HepG2 세포에서 PfMSP1 유전자와 PfCSP 유전자의 융합 유전자를 포함한 재조합 배큘로바이러스로부터 발현된 항원을 나타내는 형광-표지 항체로 염색한 것을 나타낸다. 도 3의 (A)의 결과는 PfCSP 항원이 발현되었음을 확인시켜 준다. 도 3의 (B)의 결과는 PfMSP-119 항원이 발현되었음을 확인시켜 준다. 상기 결과들은 융합 단백질이 포유류 세포에서 발현될 수 있음을 확인시켜 준다. 도 3의 (A)와 (B)의 결과는 본 발명의 이중 프로모터를 포함한 전달 벡터를 이용해 만들어진 재조합 배큘로바이러스가 포유류 세포에서 원하는 항원을 발현시킬 수 있음을 명확하게 보여준다.
본 발명의 재조합 전달 벡터를 이용하여 생산된 재조합 배큘로바이러스가 인간 및 다른 포유류에 투여되었을 때, 바이러스 입자가 포유류 세포에 들어가고, 포유류 세포에서 원하는 외래 항원 유전자와 gp64의 융합 산물의 생산을 조절하고, 획득된 항원에 특이적인 면역성이 유발될 수 있는 것을 나타낸다.
실시예 6: PfCSP 항원 재조합 바이러스와 H5N1/HA1 항원 재조합 바이러스 항체의 유도 실험
1. 바이러스 용액의 접종
초원심분리에 의해 농축된 AcNPV-WT, AcNPV-CAP-PfCSP, AcNPV-CAP-PfCSP/467, AcNPV-CAP-HA1/Anhui 및 AcNPV-CAP-HA1/Vietnam의 바이러스 용액을 BALB/c 암컷 마우스의 대퇴 근육에 2주 간격으로 약 1 x 108 PUF의 양으로 두 번 접종하였다.
2. 항체 적정농도(titer)의 측정
마지막 면역 후 2주째에 마우스를 안락사시켰고, 상기 마우스로부터 혈청을 얻었으며, 상기 혈청을 항원 특이적 항체 적정농도를 측정하기 위하여 사용하였다. AcNPV-CAP-PfCSP 및 AcNPV-CAP-PfCSP/467에 의한 PfCSP 항원 특이적 항체 적정농도의 결정은 (NANP)4NVDPC 펩티드(Sigma로 부터 공급받음), 즉 PfCSP의 B-셀 항원결정부위(B-cell epitope)가 고정된 플레이트에서 효소면역측정법(ELISA)에 의해 측정되었다. AcNPV-CAP-HA1/Anhui 및 AcNPV-CAP-HA1/Vietnam에 의한 H5N1/HA의 항원-특이적 항체의 적정농도의 결정은 H5N1 바이러스(Immune Technology로부터 공급받은 IT-003-005p)의 정제된 HA 항원이 고정된 플레이트를 이용한 효소면역측정법(ELISA)에 의해 측정되었다. ELISA 플레이트로써 NUNC에서 공급받은 MaxiSorp을 사용하고, 2차 항체로서 HRP가 표지된 염소 항-마우스 IgG(H & L)(American Qualex로부터 공급받은) 항체를 사용하고, 발색 반응을 위해서는 TMB(Calbiochem으로부터 공급받음)를 사용하여, OD450 nm의 흡광도에서 측정하였다.
도 4는 그 결과를 보여준다.
도 4 (A)는 마우스 혈청을 800 배부터 102,400 배까지 2배 연속 희석하여 실험을 수행하였을 때, OD450 nm에서 얻어진 각 그룹의 평균 흡광도를 그래프로 나타낸 것이다. PBS 및 AcNPV-WT을 접종한 군에서, 항원에 대한 항체를 포함한 혈청에서, 800배 희석액은 0.1 또는 그 이하의 흡광도를 나타내었고, 이는 반응성이 낮음을 나타낸다. 상기 결과와는 대조적으로, AcNPV-CAP-PfCSP 및 AcNPV-CAP-PfCSP/467을 접종한 군에서는, 800배 희석액의 흡광도가 각각 1.138 및 1.878로 나타났고, 이는 강한 반응성을 나타낼 뿐 아니라, 항원-특이적 항체가 유도되었음을 확실하게 보여주는 결과이다. 도 4 (B)는 마우스 혈청을 400 배부터 25,600 배까지 2배 연속 희석하여 실험을 수행하였을 때, OD450 nm에서 얻어진 각 그룹의 평균 흡광도를 그래프로 나타낸 것이다. PBS 및 AcNPV-WT을 접종한 군에서, 항원에 대한 항체를 포함한 혈청에서, 400배 희석액은 0.1 또는 그 이하의 흡광도를 나타내었고, 이는 반응성이 낮음을 나타낸다. 상기 결과와는 대조적으로, AcNPV-CAP-HA1/Anhui 및 AcNPV-CAP-HA1/Vietnam을 접종한 군에서는, 3,200배 희석액의 흡광도가 각각 1.551 및 2.053으로 나타났고, 이는 강한 반응성을 나타낼 뿐 아니라, 항원-특이적 항체가 유도되었음을 확실하게 보여주는 결과이다. 도 4는 본 발명의 이중 프로모터를 포함한 전달 벡터를 사용하여 제조된 재조합 배큘로바이러스가 포유류에서 원하는 항원에 대한 항체를 유도할 수 있음을 확실하게 보여주고 있다.
3. 중성화 (neutralization) 값의 측정
헤마글루티닌 저해(hemagglutination inhibition, HI) 실험은 AcNPV-CAP-HA1/Anhui에 접종된 마우스 혈청을 이용하여 수행되었다. 구체적으로, 상기 실험은 H5N1 바이러스(Immune Technology로부터 공급받은 IT-003-0053p)의 정제된 HA 항원을 사용하여, 인플루엔자 HI 시약 "세이켄(Seiken)"(Denka Seiken Co., Ltd.로부터 공급받음)에 포함되어 있는 사용 설명서에서 기재된 방법에 따라 수행되었다. 비-특이적인 응집성(agglutinins)의 흡수(absorption)는 적혈구를 이용하여 수행하었고, 비-특이적인 응집(agglutination) 저해제의 제거는 "세이켄(Seiken)"(Denka Seiken Co., Ltd.로부터 공급받음)의 RDE(II)를 이용하여 수행하였다. HI 실험은 하기의 방법에 따라 수행하였다. 96-웰 플레이트에 10배 단위로 희석된 항혈청 0.025 ml에 2배 연속 희석되도록 희석제를 첨가한다. 희석된 항혈청을 포함한 96-웰 플레이트의 각 웰에 0.025 ml당 HA 적정농도(titer)가 4가 되도록 희석된 H5N1 바이러스의 HA 항원의 0.025 ml을 첨가한다. 플레이트는 상온에서 30분간 정치시킨다. 반응을 위하여 적혈구 현탁액 0.05 ml을 첨가하고 웰에 섞는다. 혼합액은 상온에서 60분간 정치시킨다. 헤마글루티네이션(hemagglutination)이 완벽히 저해되는 실험 샘플의 마지막 희석농도가 HI 항체 적정농도(titer)로 정해진다.
그 결과는 PBS와 AcNPV-WT으로 접종된 혈청의 HI 항체 적정농도가 10 또는 그 이하인 것에 반해, AcNPV-CAP-HA1/Anhui가 접종된 혈청은 HI 항체 적정농도가 40임을 보여준다.
상기 결과들은 본 발명의 재조합 전달 벡터로부터 생산된 재조합 배큘로바이러스가 인간 및 다른 포유류에 투여되었을 때, 원하는 외래 항원 유전자가 효과적으로 항체를 유도할 수 있고, 그로 인해 백신으로의 효과를 제공할 수 있음을 나타내는 것이다.
<서열목록 프리텍스트 >
서열번호 1 및 2는 M. 튜버쿨로시스(M. tuberculosis) H37Rv 유래 게놈 DNA의 PCR용 프라이머 phsp65-F1 및 phsp65-R1의 서열이다.
서열번호 3 및 4는 pcDNA-hps65를 주형으로 하는 PCR용 프라이머 phsp65-F2 및 phsp65-R2의 서열이다.
서열번호 5 및 6은 gp64 유전자 DNA 단편을 획득하기 위한, pBACsurf-1을 주형으로 하는 PCR용 프라이머 pPolh-F2 및 pgp64-R2의 서열이다.
서열번호 7 및 8은 인플루엔자 바이러스 HA 유전자 단편을 생산하기 위한, PCR용 프라이머 HA-f 및 HA-r의 서열이다.
서열번호 9 및 10은 pCR-Blunt-HA를 주형으로 하는 PCR용 프라이머 pHA-F1 및 pHA-R1의 서열이다.
서열번호 11 및 12는 pBACsurf-HA1을 주형으로 하는 PCR용 프라이머 Polh-f RsrII 및 GP64-r DraIII의 서열이다.
서열번호 13 및 14는 인플루엔자 바이러스 PR/8/34 종 유래 게놈 RNA의 RT-PCR용 프라이머 NP-f EcoRI 및 NP-r Cfr9I의 서열이다.
서열번호 15, 16 및 12는 pCAP-H1N1/HA1-gp64의 PCR용 프라이머 gp64(272)-f, gp64(467)-f 및 GP64-r DraIII의 서열이다.
서열번호 17 및 18은 플라스모디움 팔시파룸(P. falciparum)의 게놈 DNA를 주형으로 하는 PCR용 프라이머 PfCSP-f(19) 및 PfCSP-r(373)의 서열이다.
서열번호 19 및 20은 플라스모듐 베르게이(Plasmodium berghei)의 게놈 DNA를 주형으로 하는 PCR용 프라이머 pAMA-F1 및 pAMA-R1의 서열이다.
서열번호 21 및 22는 플라스모디움 팔시파룸(P. falciparum)의 게놈 DNA를 주형으로 하는 PCR용 프라이머 pPfCSP-F1 및 pPfCSP-R1의 서열이다.
서열번호 23 및 24는 플라스모디움 팔시파룸(P. falciparum)의 게놈 DNA를 주형으로 하는 PCR용 프라이머 pPfs25-F1 및 pPfs25-R2의 서열이다.
서열번호 25 및 26은 플라스모디움 팔시파룸(P. falciparum)의 게놈 DNA를 주형으로 하는 PCR용 프라이머 pPfMSP119-F1 및 pPfMSP119-R2의 서열이다.
서열번호 17 및 27은 pCAP-PfCSP를 주형으로 하는 PCR용 프라이머 PfCSP-f(19) 및 PfCSP-r(373 A361E)의 서열이다.
서열번호 27 및 27은 pCAP-PfCSP를 주형으로 하는 프라이머 PfCSP-f(76) 및 PfCSP-r(373 A361E)의 서열이다.
서열번호 29는 Sf9 및 인간 세포주에 자주 사용되는 코돈을 사용한 플라스모디움 팔시파룸(P. falciparum) 3D7 종(361 위치의 A가 E로 대체되어 있음)의 PfCSP의 아미노산 서열로부터 제조된 합성 유전자(PfCSP+)의 서열이다.
서열번호 30 및 31은 PfCSP+를 주형으로 하는 PCR용 프라이머 PfCSP-f(+209) 및 PfCSP-r(+A361E)의 서열이다.
서열번호 32, 33, 34 및 31은 PfCSP+를 주형으로 하는 PCR용 프라이머 PfCSP-f(+76), PfCSP-r(+128), PfCSP-f(+209) BamHI 및 PfCSP-r(+A361E)의 서열이다.
서열번호 35는 Sf9 및 인간 세포주에 자주 사용되는 코돈을 사용한 인플루엔자 바이러스 H5N1/Anhui/1/05의 헤마글루티닌(hemagglutinin)의 HA1 부위의 아미노산 서열로부터 제조된 합성 유전자의 서열이다.
서열번호 36 및 37은 서열번호 35의 합성 유전자 서열을 주형으로 하는 PCR용 프라이머 AH-F1(5'-CAGTCTGCAGGACCAGATTTGCATC-3'; 서열번호 36; PstI 부위는 밑줄로 나타내었음) 및 AH-R4(5'-CAGTCCCGGGCTCTCTTGCGCCTGC-3'; 서열번호 37; XmaI 부위는 밑줄로 나타내었음)의 서열이다.
서열번호 38은 Sf9 및 인간 세포주에서 자주 사용되는 코돈을 사용한 인플루엔자 바이러스 H5N1/Vietnam/1203/04의 헤마글루티닌(hemagglutinin)의 HA1 부위의 아미노산 서열로부터 제조된 합성 유전자의 서열이다.
서열번호 39 및 40은 서열번호 38의 합성 유전자 서열을 주형으로 하는 PCR용 프라이머 VN-F1(5'-CAGTCTGCAGGACCAGATCTGTATC-3'; 서열번호 39; PstI 부위는 밑줄로 나타내었음) 및 VN-R4(5'-CAGTCCCGGGCTCTCTTCTTCCTGC-3'; 서열번호 40; XmaI 부위는 밑줄로 나타내었음)의 서열이다.
서열번호 41, 42, 43, 44 및 12는 프라이머 gp64(51)-f(5'-GACTCCCCGGGTGGAAATCACCATCGTGGAGACG-3'; 서열번호 41; XmaI 부위는 밑줄로 나타내었음), gp64(101)-f(5'-GACTCCCCGGGATTTGCTTATGTGGAGCATCAGG-3'; 서열번호 42; XmaI 부위는 밑줄로 나타내었음), gp64(154)-f(5'-GACTCCCCGGGCGCACCACACGTGCAACAAATCG-3'; 서열번호 43; XmaI 부위는 밑줄로 나타내었음), gp64(201)-f(5'-GACTCCCCGGGACACTGTGCTTCATCGAGACGGC-3'; 서열번호 44; XmaI 부위는 밑줄로 나타내었음) 및 GP64-r DraIII(5'-GGGCACTTAGTGATATTGTCTATTACGGTTTCTAATC-3'; 서열번호 12; DraIII 부위는 밑줄로 나타내었음)의 서열이다.
서열번호 45는 Gene Designer(DNA2.0, Inc)를 사용한 코돈 최적화에 의한 인플루엔자 바이러스 H5N1/Anhui/1/05의 헤마글루티닌(hemagglutinin)의 HA1 부위의 아미노산 서열로부터 제조된 합성 유전자의 서열이다.
서열번호 46, 47, 48, 49 및 50은 서열번호 45의 합성 유전자를 주형으로 하는 PCR용 프라이머 AH17-F(5'-GACTCTGCAGGATCAGATCTGTATTGGGTACC-3'; 서열번호 46; PstI 부위는 밑줄로 나타내었음), AH345-R(5'-CGATCCCGGGCTCTCTTTCTCCTCCGCTCGC-3'; 서열번호 47; XmaI 부위는 밑줄로 나타내었음), AH410-R(5'-CGATCCCGGGCGGCCTCGAACTGGGTGTTCATT-3'; 서열번호 48; XmaI 부위는 밑줄로 나타내었음), AH473-R(5'-CGATCCCGGGCGTCTCTGAGTTGAAGGCGCAC-3'; 서열번호 49; XmaI 부위는 밑줄로 나타내었음) 및 AH520-R(5'-CGATCCCGGGCACCACTAATTTCCTCTCGCTTC-3'; 서열번호 50; XmaI 부위는 밑줄로 나타내었음)의 서열이다.
서열번호 51은 Gene Designer(DNA2.0, Inc)를 사용한 코돈 최적화에 의한 인플루엔자 바이러스 H5N1/Vietnam/1203/04의 헤마글루티닌(hemagglutinin)의 HA1 부위의 아미노산 서열로부터 제조된 합성 유전자의 서열이다.
서열번호 52, 53, 54, 55 및 56은 서열번호 51의 합성 유전자를 주형으로 하는 PCR용 프라이머 VN17-F (5'-GACTCTGCAGGATCAGATCTGTATCGGATATC-3'; 서열번호 52; PstI 부위는 밑줄로 나타내었음), VN346-R(5'-CGATCCCGGGCCCGCTTTTTCCTCCTCCGTTCG-3'; 서열번호 53; XmaI 부위는 밑줄로 나타내었음), VN410-R(5'-CGATCCCGGGCCTCAAACTGCGTATTCATTTTG-3'; 서열번호 54; XmaI 부위는 밑줄로 나타내었음), VN473-R(5'-CGATCCCGGGCTCTAAGCTGGAGCCTGACTTTGTC-3'; 서열번호 55; XmaI 부위는 밑줄로 나타내었음) 및 VN520-R(5'-CGATCCCGGGCACTAATCTCCTCTCTTTTAAGTC-3'; 서열번호 56; XmaI 부위는 밑줄로 나타내었음)의 서열이다.
서열번호 57은 Gene Designer(DNA2.0, Inc)를 사용한 코돈 최적화에 의한 플라스모디움 팔시파룸(Plasmodium falciparum) 3D7 종의 CSP의 아미노산 서열로부터 제조된 합성 유전자의 서열이다.
서열번호 58, 59, 60, 61 및 62은 서열번호 57의 합성 유전자를 주형으로 하는 PCR용 프라이머 PfCSP_opt-f(5'-GACTCTGCAGATGATGCGAAAATTGGCCATACTG-3'; 서열번호 58; PstI 부위는 밑줄로 나타내었음), PfCSP_opt-f (19)(5'-GACTCTGCAGCTGTTTCAGGAATACCAGTGCTATGG-3'; 서열번호 60; PstI 부위는 밑줄로 나타내었음), PfCSP_opt-r(373)(5'-CGATCCCGGGCCTTCTCCATCTTACAAATTTTCTTTTCAATATCATTAGC-3'; 서열번호 61; XmaI 부위는 밑줄로 나타내었음), PfCSP_opt-f (76)(5'-GACTCTGCAGGACGACGGAAATAATGAGGACAACG-3'; 서열번호 62; PstI 부위는 밑줄로 나타내었음) 및 PfCSP_opt-f (205)(5'-GACTCTGCAGAATGCAAACCCAAATGCCAATCCAAACGC-3'; 서열번호 63; PstI 부위는 밑줄로 나타내었음)의 서열이다.
서열번호 64, 65, 66 및 67은 배큘로바이러스 게놈 DNA를 주형으로 하는 PCR용 프라이머 gp64-p-f(5'-GACTCGGACCGGCCAGATAAAAATAATCTTATCAATTAAG-3'; 서열번호 64; RsrII 부위는 밑줄로 나타내었음), gp64-p-r (5'-CGATACTAGTAGCACTGAGGCTTCTTATATACCCG-3'; 서열번호 65; SpeI 부위는 밑줄로 나타내었음), vp39-p-f(5'-GACTCGGACCGCGTCGTACAAATCGAAATATTGTTGTG-3'; 서열번호 66; RsrII 부위는 밑줄로 나타내었음) 및 vp39-p-r (5'-CGATACTAGTGTGATTGAGAAAGAAATCTCTTATTC-3'; 서열번호 67; SpeI 부위는 밑줄로 나타내었음)의 서열이다.
서열번호 68 및 69는 pVSV-G를 주형으로 하는 PCR용 프라이머 VSV-G-f (5'-GACTCCCCGGGCGTTCGAACATCCTCACATTCAAG-3'; 서열번호 68; XmaI 부위는 밑줄로 나타내었음) 및 VSV-G-r(5'-GACTCACTTAGTGCTTTCCAAGTCGGTTCATCTC-3'; 서열번호 69; DraIII 부위는 밑줄로 나타내었음)의 서열이다.
<110> EDUCATIONAL FOUNDATION JICHI MEDICAL UNIVERSITY OTSUKA PHARMACEUTICAL CO., LTD. <120> BACULOVIRAL VECTORS WITH A DUAL VERTEBRATE AND BACULOVIRUS PROMOTER CONTROLLING AN IMMUNOGENIC FUSION GENE <130> 10fpi-01-03 <150> JP 2007-205785 <151> 2007-08-07 <160> 79 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer phsp65-F1 <400> 1 aataatagat ctaatggcca agacaattgc gtacgacgaa ga 42 <210> 2 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer phsp65-R1 <400> 2 aatccaatgc ggccgcggga attcgattcc tgcaggtcag aaatccatgc cacccatgtc 60 gcc 63 <210> 3 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer phsp65-F2 <400> 3 cacccctgca ggactacaag gacgacgatg acaaggaatt catggccaag acaattgcgt 60 acgacgaaga ggcc 74 <210> 4 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer phsp65-R2 <400> 4 cccgggcgaa atccatgcca cccatgtcgc cgccacc 37 <210> 5 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer pPolh-F2 <400> 5 cacccggacc ggataattaa aatgataacc atctcgcaaa taaataag 48 <210> 6 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer pgp64-R2 <400> 6 ggtaccatat tgtctattac ggtttctaat catac 35 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer HA-f <400> 7 cctgcaggta tgaaggcaaa cctactggtc 30 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer HA-r <400> 8 gcccgggcga tgcatattct gca 23 <210> 9 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer HA-F1 <400> 9 caccgaattc gacacaatat gtataggcta ccatgcg 37 <210> 10 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer pHA-R1 <400> 10 cccgggcacc tctggattgg atggacggaa tg 32 <210> 11 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer Polh-f RsrII <400> 11 gggcggaccg gataattaaa atgataacca tctcg 35 <210> 12 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer GP64-r DraIII <400> 12 gggcacttag tgatattgtc tattacggtt tctaatc 37 <210> 13 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer NP-f EcoRI <400> 13 acggaattcc attcaattca aactgga 27 <210> 14 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer NP-r Cfr9I <400> 14 gatcccgggc cttgtcaatg ctgaatggca a 31 <210> 15 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer gp64(272)-f <400> 15 gactccccgg gtcgagcacc gagtcaagaa g 31 <210> 16 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer gp64(467)-f <400> 16 gactccccgg gacatcactt ccatggctga a 31 <210> 17 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer PfCSP-f(19) <400> 17 gactctgcag ttattccagg aataccagtg ctatggaag 39 <210> 18 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PfCSP-r(373) <400> 18 cgatcccggg ctttttccat tttacaaatt tttttttcaa tatc 44 <210> 19 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer pAMA-F1 <400> 19 caccgaattc aatccatggg aaaagtatac ggaaaaatat 40 <210> 20 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer pAMA1-R1 <400> 20 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cgtggacccc 600 aatgcaaatc ccaacgccaa tccaaacgct aatccaaacg ctaatcccaa cgctaatccc 660 aatgccaacc caaacgcaaa tccaaatgcc aaccccaacg ccaaccctaa cgccaaccct 720 aacgcaaacc caaacgccaa ccccaatgcc aaccctaacg ctaacccaaa cgccaatccc 780 aatgccaacc caaacgctaa ccctaacgcc aatcccaaca agaacaacca gggcaatggc 840 cagggccaca atatgccaaa tgaccccaac cgcaacgtgg acgaaaacgc caacgccaac 900 agcgccgtga aaaacaacaa caacgaagaa cccagcgaca aacacattaa agaatacctg 960 aacaaaattc agaacagcct gagcaccgaa tggagcccct gcagcgtgac ctgcggcaac 1020 ggcattcagg tgcgcattaa acccggcagc gccaacaaac ccaaagacga actggactac 1080 gaaaacgaca ttgaaaaaaa aatttgcaaa atggaaaaat gcagcagcgt gtttaacgtg 1140 gtgaacagca gcattggcct gattatggtg ctgagctttc tgtttctgaa ctag 1194 <210> 30 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer PfCSP-f(+209) <400> 30 gactctgcag aacgctaatc caaacgctaa tcccaacgct aatcccaatg cc 52 <210> 31 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer PfCSP-r(+ A361E) <400> 31 cgatcccggg ctttttccat 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gagtgcccca agtacgtgaa gtccaacaga ctggtgctgg ctaccggact gcgcaattcc 960 ccacagaggg agagacgcag gaagaagaga 990 <210> 39 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer VN-F1 <400> 39 cagtctgcag gaccagatct gtatc 25 <210> 40 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer VN-R4 <400> 40 cagtcccggg ctctcttctt cctgc 25 <210> 41 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer gp64(51)-f <400> 41 gactccccgg gtggaaatca ccatcgtgga gacg 34 <210> 42 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer gp64(101)-f <400> 42 gactccccgg gatttgctta tgtggagcat cagg 34 <210> 43 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer gp64(154)-f <400> 43 gactccccgg gcgcaccaca cgtgcaacaa atcg 34 <210> 44 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer gp64(201)-f <400> 44 gactccccgg gacactgtgc ttcatcgaga cggc 34 <210> 45 <211> 1701 <212> DNA <213> influenza virus <400> 45 atggagaaga tcgtgctgtt gctggcaata gttagtttgg tcaagtcaga 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Sequence <220> <223> primer AH17-F <400> 46 gactctgcag gatcagatct gtattgggta cc 32 <210> 47 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer AH345-R <400> 47 cgatcccggg ctctctttct cctccgctcg c 31 <210> 48 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer AH410-R <400> 48 cgatcccggg cggcctcgaa ctgggtgttc att 33 <210> 49 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer AH473-R <400> 49 cgatcccggg cgtctctgag ttgaaggcgc ac 32 <210> 50 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer AH520-R <400> 50 cgatcccggg caccactaat ttcctctcgc ttc 33 <210> 51 <211> 1704 <212> DNA <213> influenza virus <400> 51 atggagaaaa ttgtcctgct gttcgctatt gtttccctgg ttaaatccga tcagatctgt 60 atcggatatc acgcgaataa tagcacagag caagtggata ccattatgga aaagaatgtg 120 actgtgaccc acgctcagga cattctggag aaaaagcaca acggaaaatt gtgcgacctt 180 gatggggtga agccattgat tctgagagac tgctctgtgg ctggatggct gctggggaac 240 cctatgtgcg atgagttcat taatgttccc gagtggtcct acatagtcga 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gatcccaatg ccaacccaaa tgtagatcca 360 aatgcaaacc caaatgtaga tccaaatgca aacccaaatg caaacccaaa tgcaaaccca 420 aatgcaaacc caaatgcaaa cccaaatgca aacccaaatg caaacccaaa tgcaaaccca 480 aatgcaaacc caaatgcaaa cccaaatgca aacccaaatg caaacccaaa tgcaaaccca 540 aatgcaaacc ccaatgcaaa tcctaatgca aacccaaatg caaacccaaa cgtagatcct 600 aatgcaaatc caaatgcaaa cccaaacgca aaccccaatg caaatcctaa tgcaaacccc 660 aatgcaaatc ctaatgcaaa tcctaatgcc aatccaaatg caaatccaaa tgcaaaccca 720 aacgcaaacc ccaatgcaaa tcctaatgcc aatccaaatg caaatccaaa tgcaaaccca 780 aatgcaaacc caaatgcaaa ccccaatgca aatcctaata aaaacaatca aggtaatgga 840 caaggtcaca atatgccaaa tgacccaaac cgaaatgtag atgaaaatgc taatgccaac 900 agtgctgtaa aaaataataa taacgaagaa ccaagtgata agcacataaa agaatattta 960 aacaaaatac aaaattctct ttcaactgaa tggtccccat gtagtgtaac ttgtggaaat 1020 ggtattcaag ttagaataaa gcctggctct gctaataaac ctaaagacga attagattat 1080 gcaaatgata ttgaaaaaaa aatttgtaaa atggaaaaat gttccagtgt gtttaatgtc 1140 gtaaatagtt caataggatt aataatggta ttatccttct tgttccttaa ttag 1194 <210> 76 <211> 1704 <212> DNA <213> Influenza A virus (A/Anhui/1/2005(H5N1)) <400> 76 atggagaaaa tagtgcttct tcttgcaata gtcagccttg ttaaaagtga tcagatttgc 60 attggttacc atgcaaacaa ctcgacagag caggttgaca caataatgga aaagaacgtt 120 actgttacac atgcccaaga catactggaa aagacacaca acgggaagct ctgcgatcta 180 gatggagtga agcctctgat tttaagagat tgtagtgtag ctggatggct cctcggaaac 240 ccaatgtgtg acgaattcat caatgtgccg gaatggtctt acatagtgga gaaggccaac 300 ccagccaatg acctctgtta cccagggaat ttcaacgact atgaagaact gaaacaccta 360 ttgagcagaa taaaccattt tgagaaaatt cagatcatcc ccaaaagttc ttggtccgat 420 catgaagcct catcaggggt gagctcagca tgtccatacc agggaacgcc ctcctttttc 480 agaaatgtgg tatggcttat caaaaagaac aatacatacc caacaataaa gagaagctac 540 aataatacca accaggaaga tcttttgata ctgtggggga ttcatcattc taatgatgcg 600 gcagagcaga caaagctcta tcaaaaccca accacctata tttccgttgg gacatcaaca 660 ctaaaccaga gattggtacc aaaaatagct actagatcca aagtaaacgg gcaaagtgga 720 aggatggatt tcttctggac aattttaaaa ccgaatgatg caatcaactt cgagagtaat 780 ggaaatttca ttgctccaga atatgcatac aaaattgtca agaaagggga ctcagcaatt 840 gttaaaagtg aagtggaata tggtaactgc aacacaaagt gtcaaactcc aataggggcg 900 ataaactcta gtatgccatt ccacaacata caccctctca ccatcgggga atgccccaaa 960 tatgtgaaat caaacaaatt agtccttgcg actgggctca gaaatagtcc tctaagagaa 1020 agaagaagaa aaagaggact atttggagct atagcagggt ttatagaggg aggatggcag 1080 ggaatggtag atggttggta tgggtaccac catagcaatg agcaggggag tgggtacgct 1140 gcagacaaag aatccactca aaaggcaata gatggagtca ccaataaggt caactcgatc 1200 attgacaaaa tgaacactca gtttgaggcc gttggaaggg aatttaataa cttagaaagg 1260 agaatagaga atttaaacaa gaaaatggaa gacggattcc tagatgtctg gacttataat 1320 gctgaacttc tggttctcat ggaaaatgag agaactctag acttccatga ttcaaatgtc 1380 aagaaccttt acgacaaggt ccgactacag cttagggata atgcaaagga gctgggtaac 1440 ggttgtttcg agttctatca caaatgtgat aatgaatgta tggaaagtgt aagaaacgga 1500 acgtatgact acccgcagta ttcagaagaa gcaagattaa aaagagagga aataagtgga 1560 gtaaaattgg aatcaatagg aacttaccaa atactgtcaa tttattcaac agttgcgagt 1620 tctctagcac tggcaatcat ggtggctggt ctatctttgt ggatgtgctc caatgggtcg 1680 ttacaatgca gaatttgcat ttaa 1704 <210> 77 <211> 1707 <212> DNA <213> Influenza A virus (A/Viet Nam/1203/2004(H5N1)) <400> 77 atggagaaaa tagtgcttct ttttgcaata gtcagtcttg ttaaaagtga tcagatttgc 60 attggttacc atgcaaacaa ctcgacagag caggttgaca caataatgga aaagaacgtt 120 actgttacac atgcccaaga catactggaa aagaaacaca acgggaagct ctgcgatcta 180 gatggagtga agcctctaat tttgagagat tgtagcgtag ctggatggct cctcggaaac 240 ccaatgtgtg acgaattcat caatgtgccg gaatggtctt acatagtgga gaaggccaat 300 ccagtcaatg acctctgtta cccaggggat ttcaatgact atgaagaatt gaaacaccta 360 ttgagcagaa taaaccattt tgagaaaatt cagatcatcc ccaaaagttc ttggtccagt 420 catgaagcct cattaggggt gagctcagca tgtccatacc agggaaagtc ctcctttttc 480 agaaatgtgg tatggcttat caaaaagaac agtacatacc caacaataaa gaggagctac 540 aataatacca accaagaaga tcttttggta ctgtggggga ttcaccatcc taatgatgcg 600 gcagagcaga caaagctcta tcaaaaccca accacctata tttccgttgg gacatcaaca 660 ctaaaccaga gattggtacc aagaatagct actagatcca aagtaaacgg gcaaagtgga 720 aggatggagt tcttctggac aattttaaag ccgaatgatg caatcaactt cgagagtaat 780 ggaaatttca ttgctccaga atatgcatac aaaattgtca agaaagggga ctcaacaatt 840 atgaaaagtg aattggaata tggtaactgc aacaccaagt gtcaaactcc aatgggggcg 900 ataaactcta gcatgccatt ccacaatata caccctctca ccattgggga atgccccaaa 960 tatgtgaaat caaacagatt agtccttgcg actgggctca gaaatagccc tcaaagagag 1020 agaagaagaa aaaagagagg attatttgga gctatagcag gttttataga gggaggatgg 1080 cagggaatgg tagatggttg gtatgggtac caccatagca atgagcaggg gagtgggtac 1140 gctgcagaca aagaatccac tcaaaaggca atagatggag tcaccaataa ggtcaactcg 1200 atcattgaca aaatgaacac tcagtttgag gccgttggaa gggaatttaa caacttagaa 1260 aggagaatag agaatttaaa caagaagatg gaagacgggt tcctagatgt ctggacttat 1320 aatgctgaac ttctggttct catggaaaat gagagaactc tagactttca tgactcaaat 1380 gtcaagaacc tttacgacaa ggtccgacta cagcttaggg ataatgcaaa ggagctgggt 1440 aacggttgtt tcgagttcta tcataaatgt gataatgaat gtatggaaag tgtaagaaat 1500 ggaacgtatg actacccgca gtattcagaa 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gagcaaaatt aaatgatgta tgtgctaatg attattgtca aatacctttc 660 aatcttaaaa ttcgtgcaaa tgaattagac gtacttaaaa aacttgtgtt cggatataga 720 aaaccattag acaatattaa agataatgta ggaaaaatgg aagattacat taaaaaaaat 780 aaaacaacca tagcaaatat aaatgaatta attgaaggaa gtaagaaaac aattgatcaa 840 aataagaatg cagataatga agaagggaaa aaaaaattat accaagctca atatgatctt 900 tctatttaca ataaacaatt agaagaagca cataatttaa taagcgtttt agaaaaacgt 960 attgacactt taaaaaaaaa tgaaaacata aagaaattac ttgataagat aaatgaaatt 1020 aaaaatcccc caccggccaa ttctggaaat acaccaaata ctctccttga taagaacaaa 1080 aaaatcgagg aacacgaaga aaaaataaaa gaaattgcca aaactattaa atttaacatt 1140 gatagtttat ttactgatcc acttgaatta gaatattatt taagagaaaa aaataaaaaa 1200 gttgatgtaa cacctaaatc acaagatcct acgaaatctg ttcaaatacc aaaagttcct 1260 tatccaaatg gtattgtata tcctttacca ctcactgata ttcataattc attagctgca 1320 gataatgata aaaattcata tggtgattta atgaatcctc atactaaaga aaaaattaat 1380 gaaaaaatta ttacagataa taaggaaaga aaaatattca ttaataacat taaaaaaaaa 1440 attgatttag aagaaaaaaa cattaatcac acaaaagaac aaaataaaaa attacttgaa 1500 gattatgaaa agtcaaaaaa ggattatgaa gaattacttg aaaaatttta tgaaatgaaa 1560 tttaataata attttaacaa agatgtcgta gataaaatat tcagtgcaag atatacatat 1620 aatgttgaaa aacaaagata taataataaa ttttcatcct ctaataattc tgtatataat 1680 gttcaaaaat taaaaaaggc tctttcatat cttgaagatt attctttaag aaaaggaatt 1740 tctgaaaaag attttaatca ttattatact ttgaaaactg gcctcgaagc tgatataaaa 1800 aaattaacag aagaaataaa gagtagtgaa aacaaaattc tagaaaaaaa ttttaaagga 1860 ctaacacatt cagcaaatgg ttccttagaa gtatctgata ttgtaaaatt acaagtacaa 1920 aaagttttat taattaaaaa aatagaagac ttaagaaaga tagaattatt tttaaaaaat 1980 gcacaactaa aagatagtat tcatgtacca aatatttata aaccacaaaa taaaccagaa 2040 ccatattatt taattgtatt aaaaaaagaa gtagataaat taaaagaatt tataccaaaa 2100 gtaaaagaca tgttaaagaa agaacaagct gtcttatcaa gtattacaca acctttagtt 2160 gcagcaagcg aaacaactga agatgggggt cactccacac acacattatc ccaatcagga 2220 gaaacagaag taacagaaga aacagaagaa acagaagaaa cagtaggaca cacaacaacg 2280 gtaacaataa cattaccacc aacacaacca tcaccaccaa aagaagtaaa agttgttgaa 2340 aattcaatag aacataagag taatgacaat tcacaagcct tgacaaaaac agtttatcta 2400 aagaaattag atgaattttt aactaaatca tatatatgtc ataaatatat tttagtatca 2460 aactctagta tggaccaaaa attattagag gtatataatc ttactccaga agaagaaaat 2520 gaattaaaat catgtgatcc attagattta ttatttaata ttcaaaataa catacctgct 2580 atgtattcat tatatgatag tatgaacaat gatttacaac atctcttttt tgaattatat 2640 caaaaggaaa tgatttatta tttacataaa ctaaaagagg aaaatcacat caaaaaatta 2700 ttagaggagc aaaaacaaat aactggaaca tcatctacat ccagtcctgg aaatacaacc 2760 gtaaatactg ctcaatccgc aactcacagt aattcccaaa accaacaatc aaatgcatcc 2820 tctaccaata cccaaaatgg tgtagctgta tcatctggtc ctgctgtagt tgaagaaagt 2880 catgatccct taacagtatt gtctattagt aacgatttga aaggtattgt tagtctctta 2940 aatcttggaa ataaaactaa agtacctaat ccattaacca tttctacaac agagatggaa 3000 aaattttatg agaatatttt aaaaaataat gatacctatt ttaatgatga tatcaaacaa 3060 ttcgtaaaat ctaattcaaa agtaattaca ggtttgaccg aaacacaaaa aaatgcatta 3120 aatgatgaaa ttaaaaaatt aaaagatact ttacagttat catttgattt atataataaa 3180 tataaattaa aattagatag attatttaat aagaaaaaag aacttggcca agacaaaatg 3240 caaattaaaa aacttacttt attaaaagaa caattagaat caaaattgaa ttcacttaat 3300 aacccacata atgtattaca aaacttttct gttttcttta acaaaaaaaa agaagctgaa 3360 atagcagaaa ctgaaaacac attagaaaac acaaaaatat tattgaaaca ttataaagga 3420 cttgttaaat attataatgg tgaatcatct ccattaaaaa ctttaagtga agtatcaatt 3480 caaacagaag ataattatgc caatttagaa aaatttagag tattaagtaa aatagatgga 3540 aaactcaatg ataatttaca tttaggaaag aaaaaattat ctttcttatc aagtggatta 3600 catcatttaa ttactgaatt aaaagaagta ataaaaaata aaaattatac aggtaattct 3660 ccaagtgaaa ataataagaa agttaacgaa gctttaaaat cttacgaaaa ttttctccca 3720 gaagcaaaag ttacaacagt tgtaactcca cctcaaccag atgtaactcc atctccatta 3780 tctgtaaggg taagtggtag ttcaggatcc acaaaagaag aaacacaaat accaacttca 3840 ggctctttat taacagaatt acaacaagta gtacaattac aaaattatga cgaagaagat 3900 gattccttag ttgtattacc catttttgga gaatccgaag ataatgacga atatttagat 3960 caagtagtaa ctggagaagc aatatctgtc acaatggata atatcctctc aggatttgaa 4020 aatgaatatg atgttatata tttaaaacct ttagctggag tatatagaag cttaaaaaaa 4080 caaattgaaa aaaacatttt tacatttaat ttaaatttga acgatatctt aaattcacgt 4140 cttaagaaac gaaaatattt cttagatgta ttagaatctg atttaatgca atttaaacat 4200 atatcctcaa atgaatacat tattgaagat tcatttaaat tattgaattc agaacaaaaa 4260 aacacacttt taaaaagtta caaatatata aaagaatcag tagaaaatga tattaaattt 4320 gcacaggaag gtataagtta ttatgaaaag gttttagcga aatataagga tgatttagaa 4380 tcaattaaaa aagttatcaa agaagaaaag gagaagttcc catcatcacc accaacaaca 4440 cctccgtcac cagcaaaaac agacgaacaa aagaaggaaa gtaagttcct tccattttta 4500 acaaacattg agaccttata caataactta gttaataaaa ttgacgatta cttaattaac 4560 ttaaaggcaa agattaacga ttgtaatgtt gaaaaagatg aagcacatgt taaaataact 4620 aaacttagtg atttaaaagc aattgatgac aaaatagatc tttttaaaaa cccttacgac 4680 ttcgaagcaa ttaaaaaatt gataaatgat gatacgaaaa aagatatgct tggcaaatta 4740 cttagtacag gattagttca aaattttcct aatacaataa tatcaaaatt aattgaagga 4800 aaattccaag atatgttaaa catttcacaa caccaatgcg taaaaaaaca atgtccagaa 4860 aattctggat gtttcagaca tttagatgaa agagaagaat gtaaatgttt attaaattac 4920 aaacaagaag gtgataaatg tgttgaaaat ccaaatccta cttgtaacga aaataatggt 4980 ggatgtgatg cagatgccac atgtaccgaa gaagattcag gtagcagcag aaagaaaatc 5040 acatgtgaat gtactaaacc tgattcttat ccacttttcg atggtatttt ctgcagttcc 5100 tctaacttct taggaatatc attcttatta atactcatgt taatattata cagtttcatt 5160 taa 5163 <210> 79 <211> 654 <212> DNA <213> Plasmodium falciparum 3D7 <400> 79 atgaataaac tttacagttt gtttcttttc cttttcattc aacttagcat aaaatataat 60 aatgcgaaag ttaccgtgga tactgtatgc aaaagaggat ttttaattca gatgagtggt 120 catttggaat gtaaatgtga aaatgatttg gtgttagtaa atgaagaaac atgtgaagaa 180 aaagttctga aatgtgacga aaagactgta aataaaccat gtggagattt ttccaaatgt 240 attaaaatag atggaaatcc cgtttcatac gcttgtaaat gtaatcttgg atatgatatg 300 gtaaataatg tttgtatacc aaatgaatgt aagaatgtaa cttgtggtaa cggtaaatgt 360 atattagata caagcaatcc tgttaaaact ggagtttgct catgtaatat aggcaaagtt 420 cccaatgtac aagatcaaaa taaatgttca aaagatggag aaaccaaatg ctcattaaaa 480 tgcttaaaag aaaatgaaac ctgtaaagct gttgatggaa tttataaatg tgattgtaaa 540 gatggattta taatagataa tgaaagctct atatgtactg ctttttcagc atataatatt 600 ttaaatctaa gcattatgtt tatactattt tcagtatgct tttttataat gtaa 654

Claims (22)

  1. pCAP-PfCSP, pCAP-PfCSP/272, pCAP-PfCSP/467, pCAP-PfCSP(A361E), pCAP-PfCSP(A361E)/272, pCAP-PfCSP(A361E)/467, pCAP-PfCSP-76, pCAP-PfCSP-76/467, pCAP-PfCSP+209, pCAP-PfCSP+209/467, pCAP-PfCSP+76/209, pCAP-PfCSP+76/209/467, pCAP-HA1/Anhui, pCAP-HA1/Anhui/272, pCAP-HA1/Anhui/467, pCAP-HA1/Vietnam, pCAP-HA1/Vietnam/51, pCAP-HA1/Vietnam/101, pCAP-HA1/Vietnam/154, pCAP-HA1/Vietnam/201, pCAP-HA1/Vietnam/272, pCAP-HA1/Vietnam/467, pCAP-AH/345, pCAP-AH/345/467, pCAP-AH/410, pCAP-AH/410/467, pCAP-AH/473, pCAP-AH/473/467, pCAP-AH/520, pCAP-AH/520/467, pCAP-VN/346, pCAP-VN/346/467, pCAP-VN/410, pCAP-VN/410/467, pCAP-VN/473, pCAP-VN/473/467, pCAP-VN/520, pCAP-VN/520/467, pCAP-CO/full, pCAP-CO/full/467, pCAP-CO/19, pCAP-CO/19/467, pCAP-CO/76, pCAP-CO/76/467, pCAP-CO/205, pCAP-CO/205/467, pCA39-HA1/Anhui, pCA64-HA1/Anhui, pCA39-PfCSP(A361E), pCA64-PfCSP(A361E), pCAP-CO/full/VSV, pCAP-CO/19/VSV, pCAP-CO/76/VSV, pCAP-CO/205/VSV, pDual-Pfs25-PfCSP-gp64, 및 pDual-PfMSP1-PfCSP-gp64로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 전달 벡터.
  2. AcNPV-CAP-PfCSP, AcNPV-CAP-PfCSP/272, AcNPV-CAP-PfCSP/467, AcNPV-CAP-PfCSP(A361E), AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)/272, AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)/467, AcNPV-CAP-PfCSP-76, AcNPV-CAP-PfCSP-76/467, AcNPV-CAP-PfCSP+209, AcNPV-CAP-PfCSP+209/467, AcNPV-CAP-PfCSP+76/209, AcNPV-CAP-PfCSP+76/209/467, AcNPV-CAP-HA1/Anhui, AcNPV-CAP-HA1/Anhui/272, AcNPV-CAP-HA1/Anhui/467, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/51, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/101, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/154, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/201, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/272, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/467, AcNPV-CAP-AH/345, AcNPV-CAP-AH/345/467, AcNPV-CAP-AH/410, AcNPV-CAP-AH/410/467, AcNPV-CAP-AH/473, AcNPV-CAP-AH/473/467, AcNPV-CAP-AH/520, AcNPV-CAP-AH/520/467, AcNPV-CAP-VN/346, AcNPV-CAP-VN/346/467, AcNPV-CAP-VN/410, AcNPV-CAP-VN/410/467, AcNPV-CAP-VN/473, AcNPV-CAP-VN/473/467, AcNPV-CAP-VN/520, AcNPV-CAP-VN/520/467, AcNPV-CAP-CO/full, AcNPV-CAP-CO/full/467, AcNPV-CAP-CO/19, AcNPV-CAP-CO/19/467, AcNPV-CAP-CO/76, AcNPV-CAP-CO/76/467, AcNPV-CAP-CO/205, AcNPV-CAP-CO/205/467, AcNPV-CA39-HA1/Anhui, AcNPV-CA64-HA1/Anhui, AcNPV-CA39-PfCSP(A361E), AcNPV-CA64-PfCSP(A361E), AcNPV-CAP-CO/full/VSV, AcNPV-CAP-CO/19/VSV, AcNPV-CAP-CO/76/VSV, AcNPV-CAP-CO/205/VSV, AcNPV-Dual-Pfs25-PfCSP-gp64, 및 AcNPV-Dual-PfMSP1-PfCSP-gp64로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 재조합 배큘로바이러스.
  3. 제 2항의 재조합 배큘로바이러스를 유효성분으로 포함하는 감염성 질환용 조성물.
  4. 근육 내(intramuscular), 호흡기 내(respiratory), 또는 비강 내(nasal) 경로에 의해 투여되는 것을 특징으로 하는 제 2항의 재조합 배큘로바이러스를 유효성분으로 포함하는 감염성 질환용 조성물.
  5. 제 2항의 재조합 배큘로바이러스를 유효성분으로 포함하는 백신.
  6. 근육 내(intramuscular), 호흡기 내(respiratory), 또는 비강 내(nasal) 경로에 의해 투여되는 것을 특징으로 하는 제 3항의 재조합 배큘로바이러스를 유효성분으로 포함하는 백신.
  7. AcNPV-CAP-HA1/Anhui, AcNPV-CAP-HA1/Anhui/272, AcNPV-CAP-HA1/Anhui/467, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/51, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/101, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/154, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/201, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/272, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/467, AcNPV-CAP-AH/345, AcNPV-CAP-AH/345/467, AcNPV-CAP-AH/410, AcNPV-CAP-AH/410/467, AcNPV-CAP-AH/473, AcNPV-CAP-AH/473/467, AcNPV-CAP-AH/520, AcNPV-CAP-AH/520/467, AcNPV-CAP-VN/346, AcNPV-CAP-VN/346/467, AcNPV-CAP-VN/410, AcNPV-CAP-VN/410/467, AcNPV-CAP-VN/473, AcNPV-CAP-VN/473/467, AcNPV-CAP-VN/520, AcNPV-CAP-VN/520/467, AcNPV-CA39-HA1/Anhui, 및 AcNPV-CA64-HA1/Anhui로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나를 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염 예방 또는 치료제.
  8. 제 7항에 있어서, 근육 내(intramuscular), 호흡기 내(respiratory), 또는 비강 내(nasal) 경로에 의해 투여되는 것을 특징으로 하는 인플루엔자 바이러스 감염 예방 또는 치료제.
  9. AcNPV-CAP-HA1/Anhui, AcNPV-CAP-HA1/Anhui/272, AcNPV-CAP-HA1/Anhui/467, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/51, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/101, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/154, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/201, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/272, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/467, AcNPV-CAP-AH/345, AcNPV-CAP-AH/345/467, AcNPV-CAP-AH/410, AcNPV-CAP-AH/410/467, AcNPV-CAP-AH/473, AcNPV-CAP-AH/473/467, AcNPV-CAP-AH/520, AcNPV-CAP-AH/520/467, AcNPV-CAP-VN/346, AcNPV-CAP-VN/346/467, AcNPV-CAP-VN/410, AcNPV-CAP-VN/410/467, AcNPV-CAP-VN/473, AcNPV-CAP-VN/473/467, AcNPV-CAP-VN/520, AcNPV-CAP-VN/520/467, AcNPV-CA39-HA1/Anhui, 및 AcNPV-CA64-HA1/Anhui로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나를 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염 백신.
  10. 제 9항에 있어서, 근육 내(intramuscular), 호흡기 내(respiratory), 또는 비강 내(nasal) 경로에 의해 투여되는 것을 특징으로 하는 인플루엔자 바이러스 감염 백신.
  11. AcNPV-CAP-PfCSP, AcNPV-CAP-PfCSP/272, AcNPV-CAP-PfCSP/467, AcNPV-CAP-PfCSP(A361E), AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)/272, AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)/467, AcNPV-CAP-PfCSP-76, AcNPV-CAP-PfCSP-76/467, AcNPV-CAP-PfCSP+209, AcNPV-CAP-PfCSP+209/467, AcNPV-CAP-PfCSP+76/209, AcNPV-CAP-PfCSP+76/209/467, AcNPV-CAP-CO/full, AcNPV-CAP-CO/full/467, AcNPV-CAP-CO/19, AcNPV-CAP-CO/19/467, AcNPV-CAP-CO/76, AcNPV-CAP-CO/76/467, AcNPV-CAP-CO/205, AcNPV-CAP-CO/205/467, AcNPV-CA39-PfCSP(A361E), AcNPV-CA64-PfCSP(A361E), AcNPV-CAP-CO/full/VSV, AcNPV-CAP-CO/19/VSV, AcNPV-CAP-CO/76/VSV, AcNPV-CAP-CO/205/VSV, AcNPV-Dual-Pfs25-PfCSP-gp64, 및 AcNPV-Dual-PfMSP1-PfCSP-gp64로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나를 유효성분으로 포함하는 인간 말라리아 감염 예방 또는 치료제.
  12. 제 11항에 있어서, 근육 내(intramuscular), 호흡기 내(respiratory), 또는 비강 내(nasal) 경로에 의해 투여되는 것을 특징으로 하는 인간 말라리아 감염 예방 또는 치료제.
  13. AcNPV-CAP-PfCSP, AcNPV-CAP-PfCSP/272, AcNPV-CAP-PfCSP/467, AcNPV-CAP-PfCSP(A361E), AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)/272, AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)/467, AcNPV-CAP-PfCSP-76, AcNPV-CAP-PfCSP-76/467, AcNPV-CAP-PfCSP+209, AcNPV-CAP-PfCSP+209/467, AcNPV-CAP-PfCSP+76/209, AcNPV-CAP-PfCSP+76/209/467, AcNPV-CAP-CO/full, AcNPV-CAP-CO/full/467, AcNPV-CAP-CO/19, AcNPV-CAP-CO/19/467, AcNPV-CAP-CO/76, AcNPV-CAP-CO/76/467, AcNPV-CAP-CO/205, AcNPV-CAP-CO/205/467, AcNPV-CA39-PfCSP(A361E), AcNPV-CA64-PfCSP(A361E), AcNPV-CAP-CO/full/VSV, AcNPV-CAP-CO/19/VSV, AcNPV-CAP-CO/76/VSV, AcNPV-CAP-CO/205/VSV, AcNPV-Dual-Pfs25-PfCSP-gp64, 및 AcNPV-Dual-PfMSP1-PfCSP-gp64로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나를 유효성분으로 포함하는 인간 말라리아 감염 예방 또는 치료제.
  14. 제 13항에 있어서, 근육 내(intramuscular), 호흡기 내(respiratory), 또는 비강 내(nasal) 경로에 의해 투여되는 것을 특징으로 하는 인간 말라리아 감염 예방 또는 치료제.
  15. 유효한 양의 제 2항의 재조합 배큘로바이러스, 제 3항 또는 제 4항의 감염성 질환용 조성물, 또는 제 5, 6, 9, 10, 13항 또는 제 14항의 백신을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 말라리아 또는 인플루엔자 감염 예방 또는 말라리아 또는 인플루엔자 치료 방법.
  16. 제 15항에 있어서, 상기 재조합 배큘로바이러스, 조성물, 또는 백신은 리포솜 제형으로 개체에 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 15항에 있어서, 상기 재조합 배큘로바이러스, 조성물, 또는 백신은 근육 내(intramuscular), 호흡기 내(respiratory), 또는 비강 내(nasal) 경로에 의해 개체에 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 16항에 있어서, 상기 재조합 배큘로바이러스, 조성물, 또는 백신은 근육 내(intramuscular), 호흡기 내(respiratory), 또는 비강 내(nasal) 경로에 의해 개체에 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 유효한 양의 제 2항의 재조합 배큘로바이러스, 제 3항 및 제 4항의 감염성 질환용 조성물, 또는 제 5, 6, 9, 10, 13항 또는 제 14항의 백신을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 면역자극방법.
  20. 제 19항에 있어서, 상기 재조합 배큘로바이러스, 조성물, 또는 백신은 리포솜 제형으로 개체에 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 19항에 있어서, 상기 재조합 배큘로바이러스, 조성물, 또는 백신은 근육 내(intramuscular), 호흡기 내(respiratory), 또는 비강 내(nasal) 경로에 의해 개체에 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 20항에 있어서, 상기 재조합 배큘로바이러스, 조성물, 또는 백신은 근육 내(intramuscular), 호흡기 내(respiratory), 또는 비강 내(nasal) 경로에 의해 개체에 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
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