CN105209620A - 微小rna病毒蛋白的增强表达 - Google Patents

Abstract

公开内容提供了含有与免疫原性多肽融合的N-端信号肽的融合蛋白。免疫原性多肽可以来自病毒、细菌或真菌。公开内容还提供了使用N-端信号肽升高的免疫原性多肽表达。N-端信号肽增强蛋白质合成，特别是在蛋白质既不是分泌性肽又不是跨膜肽的情况下。可以使用融合蛋白来诊断疾病并且诱导免疫应答。

Description

微小RNA病毒蛋白的增强表达

对相关申请的交叉引用

本申请要求2013年3月15日提交的美国临时申请流水号61/790,114的优先权。其内容在此完整并入用于所有目的。

对序列表的交叉引用

本申请通过提及并入2013年3月14日创建的名称为“NOVV_52_SeqList.txt”的24kb序列表的内容。

发明背景

人和动物患有由病原体(如细菌、真菌和病毒)引起的疾病和病症。使用疫苗来诱导针对病原体感染的免疫是本领域中公知的。在历史上已经使用多种方法来制备疫苗，包括杀死的病毒和活减毒疫苗。然而，杀死的病毒和活减毒病毒可以与不利效应有关，在一些情况中，杀死的病毒不是有效的或者实际上可以恶化疾病。

疫苗生产的效率也可以是商业生存能力的障碍。在一些情况中，如生产疫苗前需要的长订购前置时间(leadtime)以及在其它情况中在灭活前制备活病毒可以导致疾病和病症。例如，口蹄疫病毒(FMDV)是细小RNA病毒科(Picornaviridae)内的原型口蹄疫病毒属(aphthovirus)。口蹄疫爆发的经济损失是所有家畜疾病的最高者之一，并且广泛的疫苗接种是疾病控制的优选方法。目前的疫苗是杀死的全病毒疫苗，其具有公认的限制，如通过在灭菌前培养活病毒、一些毒株的不良生长、和贮存后免疫原性降低造成的那些。参见Porta等,”Efficientproductionoffoot-and-mouthdiseasevirusemptycapsidsininsectcellsfollowingdownregulationof3Cproteaseactivity,”JVirolMethods.2013Feb；187(2):406-12.)。

在最近几年中，使用重组技术来生成亚基疫苗已经特别有吸引力。然而，虽然重组方法克服了关于生产活疫苗的问题并且提供了快速合成的潜力，但是生产合适量的免疫原出于多种原因可以是挑战性的。

发明概述

本公开内容提供了含有与多肽融合的N-端信号肽的融合蛋白。本公开内容还提供了通过使用N-端信号肽增强多肽生产的方法，特别是在蛋白质既不是分泌性蛋白质又不是跨膜蛋白质的情况下。可以使用融合蛋白来诊断疾病并且诱导免疫应答。在一些方面，多肽是免疫原性的。免疫原性多肽可以来自病毒、细菌或真菌。

附图简述

图1显示了含有FMDVP1蛋白(显示为“vp1-4”)(其是未切割的前体多蛋白，其按次序具有vp0-vp3-vp1，vp0含有vp4和vp2)的BV1168(编码SEQIDNO:4)和BV1169(编码SEQIDNO:1)的质粒图。序列是相同的，只是BV1169含有来自甲型/印尼/5/05流感病毒的血凝素信号肽。

图2A-2D显示了与在缺乏信号肽的情况下表达的相同多肽相比在使用HA信号肽时获得的增强的表达。制备质粒，如图1中描绘。BV1168含有具有六组氨酸标签(His6)的FMDVP1蛋白。BV1169含有FMDVP1蛋白，其具有六组氨酸标签(His6)以及还有来自甲型/印尼/5/05HA的N-端信号肽(SEQIDNO:3)。在Sf9细胞中表达质粒，并且通过SDS-PAGE和Western印迹分析。各道如下：M-标志物。第1-3道显示了自BV1168表达的FMDVP1蛋白，具有六组氨酸标签，没有信号肽。第4-6道显示了自BV1169表达的FMDVP1蛋白，具有六组氨酸标签和信号肽。第7道显示了BV266对照，并且第8道显示了BV1064S300Fxn。根据SDS-PAGE中的总蛋白质染色，图2A在第4-6道中显示了增强的表达。图2B-D在第4-6道中显示了通过抗组氨酸抗体(图2B；“抗HISMab”)，抗FMDVvp2抗体(图2C；“F1412SAMab”)及通过抗FMDVvp1抗体(图2D；“12FE9.2.1AMab”)检测的增强的表达。

图3显示了个别非分泌性蛋白质的增强的表达，其通过在有信号肽的情况下表达它们而实现。用表达具有和没有信号肽的重组蛋白的杆状病毒感染Sf9细胞。在感染后70小时收获细胞。通过使用对重组蛋白特异性的单克隆抗体的Western印迹分析收获的粗制材料(即细胞和培养基)。图面(a)，左图面显示了FMDVvp0的表达。图面(b)，右图面显示了FMDVvp1蛋白的表达。“+”重组蛋白含有信号肽，“-”重组蛋白没有信号肽。

图4A-4D显示了本文中公开的序列。图4A显示了由BV1169质粒编码的核苷酸序列。表达的蛋白质是FMDVP1前体多蛋白，其含有蛋白vp1至vp4(即vp0-vp3-vp1；vp0含有vp2和vp4二者)，以及在N端的HA信号肽和在C端的His6标签。图4B显示了由BV1169表达的肽序列。表达的蛋白质是FMDVP1蛋白，其含有蛋白vp1至vp4，以及在N端的HA信号肽和C端的His6-标签。信号肽(MEKIVLLLAIVSLVK；SEQIDNO:3)来自IndoH5N1HA。图4C和4D分别显示了由BV1168质粒编码的核苷酸和肽序列。编码的序列与BV1169相同，只是BV1168缺乏HA信号肽。

图5A-C显示了单一蛋白质和串联的蛋白质的表达。用表达具有(+)或没有(-)信号肽的蛋白质1、2、3、和/或4的重组杆状病毒(BV)感染Sf9细胞，并且在感染后约65小时收获。收获粗制样品(即细胞和培养基)，并且通过SDS-PAGE和Western印迹分析。表达的重组蛋白以点标示。BV1表达FMDVvp1。BV2表达FMDVvp0vp3。BV3表达FMDVvp1、vp0和vp3。BV4表达FMDVP1多蛋白(即vp0-vp3-vp1)。图5A显示了总蛋白质染色。图5B和5C分别显示了vp1和vp2抗体的结合。注意vp0蛋白含有vp2蛋白和vp4蛋白。BV2与vp1抗体的反应是由于与vp0的交叉反应。还获得了用FMDV蛋白酶3C的增强表达(未显示)。“+”重组蛋白含有信号肽，“-”重组蛋白没有信号肽。

发明详述

定义

如本文中使用，术语“杆状病毒”又称为杆状病毒科(baculoviridae)，指节肢动物的有包膜DNA病毒科，其成员可以用作表达载体以在昆虫细胞培养物中生成重组蛋白。病毒粒含有一个或多个杆形状的核壳，其含有环状超螺旋双链DNA的分子(Mw54×10⁶-154×10⁶)。用作载体的病毒一般是苜蓿银纹夜蛾(Autographacalifornica)核多角体病毒(NVP)。导入的基因的表达通常在强启动子的控制下，所述强启动子通常调节大核内包含体的多面体蛋白组分的表达，其中病毒包埋于受感染的细胞中。

如本文中使用，术语“源自”指蛋白质、核酸或其它分子的起源或来源。蛋白质、核酸和其它分子可以从如本文所述的来源改变。在一些方面，改变包括删除全长序列的残基或核苷酸。在其它方面，改变包括从野生型序列的保守突变。

如本文中使用，术语“疫苗”指含有用于诱导针对免疫原的免疫应答以提供保护性免疫应答(即，降低由病原体引起的疾病或病症的严重性的免疫应答)的免疫原的制备物。保护性免疫应答可以包括抗体形成和/或细胞介导的应答。优选地，疫苗诱导中和性抗体的生成。根据上下文，术语“疫苗”也可以指对受试者施用以产生保护性免疫的免疫原的悬浮液或溶液。

如本文中使用，术语“VLP”意指病毒样颗粒。

如本文中使用，术语“约”意指指示数值的±10％。

如本文中使用，术语“佐剂”指与针对在没有佐剂的情况下施用的免疫原的免疫应答相比，在与免疫原组合使用时修饰针对免疫原诱导的免疫应答的化合物。

如本文中使用，“有效剂量”指足以诱导免疫应答的免疫原的量，所述免疫应答降低由细菌毒素诱导的疾病或病症的至少一种症状，从而施用的剂量在治疗或管理细菌性感染中提供治疗益处。有效剂量可以例如通过测量中和性分泌性和/或血清抗体的量来测定，例如通过斑中和、补体固定、酶联免疫吸附(ELISA)、或者微量中和测定法。

如本文中使用，术语“实质性保护性抗体应答”指包括阻断细菌毒素进入细胞的抗体(例如中和性抗体)生成的免疫应答。

如本文中使用，术语“免疫原”或“抗原”指能够引发免疫应答的物质，如蛋白质和肽。例如，在一些方面，免疫原是免疫原性多肽。

如本文中使用，术语“分离的”指不在受试者中的物质，如核酸、蛋白质、VLP等。

如本文中使用，术语“受试者”或“患者”指脊索动物亚门(subphylumcordata)的任何成员，包括但不限于人和其它灵长类，包括非人灵长类，如黑猩猩和其它猿和猴物种。在一些方面，受试者是哺乳动物。合适的哺乳动物包括牲畜(如牛、绵羊、猪、山羊和马)和家畜(如犬和猫)。在其它方面，受试者是实验室动物啮齿类，如小鼠、大鼠和豚鼠。其它受试者包括禽类。禽类可以是家禽、野生禽类或游戏禽类。例如，鸡、火鸡和其它鹑鸡类禽、鸭、鹅。该术语涵盖成年和新生个体。

如本文中使用，术语“禽流感病毒”指那些主要在禽类中找到，但是也可以感染人或其它动物的流感病毒。在一些情况中，禽流感病毒可以从一个人传播或扩散到另一个。感染人的禽流感病毒具有引起流感大流行(即在人类中的发病率和/或死亡率)的潜力。当出现新流感病毒毒株(人没有天然免疫力的病毒)时发生大流行，扩散出个别的地区，可能在全球，并且一次性感染许多人。

如本文中使用，术语“季节性流感病毒”指基于全世界的国立流感中心(NationalInfluenzaCenters)进行的流行病学调查，已经确定在人群内传播给定流感季节的流感病毒株。这些会议导致三种病毒(甲型流感病毒的两种亚型和一种乙型流感病毒)的选择以进入用于接下去的秋季和冬季的流感疫苗中。在二月(对于北半球)和九月(对于南半球)发生选择。通常，疫苗中的三种病毒株中的一种或两种每年变化。甲型流感病毒基于病毒表面上的两种蛋白质而分成亚型：血凝素(H)和神经氨酸酶(N)。存在有17种不同血凝素亚型和10种不同神经氨酸酶亚型。甲型流感病毒可以进一步分解成不同毒株。乙型流感病毒不分成亚型，但是可以分解成不同毒株。参见“Arevisionofthesystemofnomenclatureforinfluenzaviruses:aWHOmemorandum,”(1980)BulletinoftheWorldHealthOrganization,58(4):585-591。

如本文中使用，术语“免疫原性多肽”指在来自对受试者施用时诱导免疫应答的病原体的蛋白质的部分或全部。合适的病原体包括病毒、真菌和细菌。

宿主细胞中增强的蛋白质表达

宿主细胞中的蛋白质的重组生成可以受到低表达水平阻碍。本公开内容提供了通过使用信号肽提高表达比目前的技术更有效生成多肽的方法。信号肽(有时称为信号序列、前导序列或前导肽)是注定朝向分泌途径的大多数新合成蛋白质的N端的短肽。信号肽的核心含有疏水性氨基酸的长区段，其具有形成单一α-螺旋的趋势。在信号肽的末端，通常有被信号肽酶识别并切割的氨基酸区段。

与表达没有信号肽的蛋白质相比，通过使用信号肽获得升高的蛋白质表达。用于表达的多肽优选源自非分泌性的蛋白质和那些非跨膜的蛋白质。

在具体的方面，本公开内容提供了融合蛋白和含有融合蛋白的组合物，用于诱导针对病原体的免疫应答。还提供了编码融合蛋白的核酸。含有核酸的载体、和含有载体的宿主细胞。使用N-端信号肽提供了期望多肽的升高的表达，从而实现足够的产量以提供商业可行量的多肽。

在具体的方面，多肽是源自一种或多种病原体的免疫原性多肽，其可以用于诱导保护性免疫应答。病原体衍生的多肽也具有作为例如在诊断FMDV感染中的诊断试剂的用途。参见Grubman和Baxt,“Foot-and-mouthdisease,”ClinMicrobiolRev.2004Apr；17(2):465-93。

具有N-端信号肽的融合蛋白

多肽通常以融合蛋白表达。如本文中使用，术语“融合蛋白”指翻译为单一多肽的蛋白质，所述单一多肽含有经由酰胺键连接的来自至少两种不同蛋白质的多肽序列。通常使用经典分子生物学方法制备融合蛋白，所述经典分子生物学方法用于制备并表达含有至少两种不同蛋白的部分的融合蛋白。在某些方面，融合蛋白含有N端信号序列和C端免疫原性多肽。

在一些方面，信号肽源自甲型流感病毒株/印尼/5/05的HA蛋白。例如，信号肽可以由MEKIVLLLAIVSLVK(SEQIDNO:3)组成。在其它方面，信号肽包含MEKIVLLLAIVSLVK。可以使用HA蛋白(SEQIDNO:6)中的K残基的C端额外氨基酸。在一些方面，信号肽含有HA蛋白的额外的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30个氨基酸。

在一些方面，免疫原性多肽含有两种以上的蛋白质，它们串联排列，从而几个蛋白质形成连续的可读框。在某些方面，串联蛋白质称为“多蛋白”，反映其在正常感染期间的生成。在一些方面，将串联多肽中的蛋白质从宿主中纯化为单一多肽。在其它方面，在合成期间切割串联多肽；例如通过内源蛋白酶。

在一些方面，融合蛋白含有源自一种病原体的免疫原性多肽。在其它方面，免疫原性多肽可以是包含2、3、4、5、6种病原体蛋白质的部分或全部的多蛋白。在一些方面，多蛋白可以含有源自超过一种病原体的蛋白质。如此，例如，融合蛋白可以含有源自两种病原体、三种病原体、四种病原体或五种病原体的蛋白质。病原体可以来自同一物种或者来自不同物种；例如，融合蛋白可以含有来自病毒、细菌和真菌的蛋白质。在具体的方面，病原体是同一病原体物种的不同株；例如，融合蛋白可以含有来自不同HIV株的相同蛋白质的各部分，如此在作为疫苗施用时提供针对多个株的免疫力。

免疫原性多肽可以含有全长蛋白质的片段。全长蛋白质的各种大小的片段是可接受的。片段可以具有全长蛋白质的至少10个氨基酸、至少25个氨基酸、至少50个氨基酸、至少75个氨基酸、至少100个氨基酸、至少125个氨基酸、至少150个氨基酸、至少200个氨基酸、至少250个氨基酸、至少275个氨基酸、至少300个氨基酸、至少350个氨基酸、至少375个氨基酸、或至少400个氨基酸。

在其它方面，免疫原性多肽与天然的多肽共享同一性。可以使用ClustalW(Version2；ch.embnet.org/software/ClustalW.html)使用下述参数测量同一性：得分矩阵：BLOSUM；打开缺口罚分：10；延长缺口罚分：10；终止缺口罚分：0.05；分离缺口罚分：0.05。与天然蛋白质序列相比，免疫原性多肽可以共享至少70％同一性，至少80％同一性，至少85％同一性，至少90％同一性，至少95％同一性，至少97％同一性，至少98％同一性，至少99％同一性，其中在多肽的长度里测量同一性。

在具体的方面，免疫原性多肽来自病毒。合适的病毒包括细小RNA病毒科(如脊髓灰质炎(polio)、HFMD、柯萨奇病毒(Coxsackievirus)、肠道病毒(enterovirus))、黄病毒科(Flaviviruses)(如丙肝、西尼罗河(WestNile)和登革热)和披膜病毒科(如甲病毒(alphaviruses)和风疹)。也可以使用本文中公开的融合蛋白方法以更大的水平表达来自人乳头瘤病毒(HPV)的蛋白质。

在具体的方面，病毒是微小RNA病毒。微小RNA病毒复制起始自单一可读框的翻译，其生成单一多蛋白，该单一多蛋白被病毒编码的宿主细胞蛋白酶在多个位置处切割以产生约十几个结构和非结构蛋白。表达为单一P1肽的结构蛋白(vp1、vp3、vp0)被切割成vp0、vp3和vp1，并且自身装配成掺入病毒基因组的无包膜的二十面体壳体。

在一些方面，微小RNA病毒可以是口蹄疫病毒(FMDV)。FMDV结构蛋白在细胞中的生成已经是困难的，这是由于仅通过Western印迹可检出的低表达水平。(Oem等,“Characterizationofrecombinantfoot-and-mouthdiseaseviruspentamer-likestructuresexpressedbybaculovirusandtheiruseasdiagnosticantigensinablockingELISA,”Vaccine.2007May16；25(20):4112-21；Porta等,”Efficientproductionoffoot-and-mouthdiseasevirusemptycapsidsininsectcellsfollowingdownregulationof3Cproteaseactivity,”JVirolMethods.2013Feb；187(2):406-12.)。

通过将来自甲型/印尼/5/05HA蛋白的信号肽序列添加到FMDVP1结构蛋白前体基因的N端，杆状病毒-昆虫细胞表达系统中的P1多肽表达水平显著增强。比较图2A-2D，第1-3道(其缺乏肽)与第4-6道(其表达肽)。信号肽仅在分泌和跨膜蛋白上找到，并且由于FMDV蛋白既不是分泌性蛋白质也不是跨膜蛋白质，升高的表达水平是特别令人惊讶的。因此，本文中公开的信号肽方法特别适合于提高非分泌性蛋白质和非跨膜蛋白质的表达。

在一些方面，可以在蛋白质纯化过程中除去蛋白质的部分。在一些方面，通过蛋白酶切割。蛋白酶可以在宿主细胞内表达，并且可以是内源蛋白酶或者过表达的蛋白酶。在其它方面，融合蛋白在从宿主细胞分离后被切割。

在具体的方面，可以除去HA信号肽。在又一些方面，可以在对受试者施用前将作为多蛋白表达的融合蛋白切割成两个以上的个别蛋白质。作为一个例示性例子，就FMDV多蛋白P1而言，施用的蛋白质可以是SEQIDNO:4，其中除去了六组氨酸标签并且除去了HA信号肽(SEQIDNO:3)。在其它方面，在对受试者施用前将多蛋白P1切割成个别的蛋白质vp1、vp2、vp3和vp4。

在一些方面，可以通过表位标签促进公开的融合蛋白的纯化。本领域中已知的合适的标签包括FLAG-标签、六组氨酸标签(又称为六组氨酸或6His)、Glu-Glu标签、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)标签、和麦芽糖结合蛋白(MBP)标签。包含表位标签的本文中公开的任何序列也应当认为公开没有标签的情况。表位标签可以位于纯化所需要的任何地方。例如，表位标签可以在N端或C端。在一些方面，表位标签可以包含在融合蛋白内。此类情况可以例如在N或C端的部分在融合蛋白的生成过程中被除去时发生。在某些方面，表位标签可以在蛋白质合成期间或之后被除去。

在一些方面，融合蛋白可以具有附加到免疫原性多肽的C端的跨膜C端(TM/CT)域。合适的C端域记载于美国专利申请公开号2010-0184192，2010年7月22日公开。在一些方面，TM/CT域可以源自流感HA。例如，合适的TM/CT域可以源自禽、大流行和/或季节性流感病毒。TM/CT域可以源自下组中的HA蛋白：H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15和H16。

可以在多种配制剂中施用免疫原(例如融合蛋白)。例如，融合蛋白可以在胶束中，作为纯化的蛋白质或病毒样颗粒(VLP)施用。胶束、药用和疫苗配制剂也在本公开内容的各方面的范围内。

核酸的克隆和操纵

本公开内容的方面涉及编码蛋白质的核酸。制备编码蛋白质的核酸的方法是本领域中已知的。例如，从自细胞提取的多聚腺苷酸化mRNA通过RT-PCR分离编码特定蛋白质的基因。在一些方面，可以将所得的产物基因作为核酸插入物克隆到载体中。术语“载体”指核酸可以藉此增殖和/或在生物体、细胞或细胞组分之间转移的手段。载体包括质粒、病毒、噬菌体、原病毒、噬菌粒、转座子、人工染色体。在一些方面，载体可以自主复制。载体也可以整合到宿主细胞的染色体中。在其它方面，载体可以是裸RNA多核苷酸、裸DNA多核苷酸、由同一条链内的DNA和RNA两者构成的多核苷酸、缀合有多赖氨酸的DNA或RNA、缀合有肽的DNA或RNA、缀合有脂质体的DNA等，其不自主复制。在许多但非所有常见的实施方案中，本公开内容的载体是质粒或杆粒(bacmids)。

描述可适用于本公开内容的分子生物技术(如克隆、突变、细胞培养等)的通用教科书包括Berger和Kimmel,GuidetoMolecularCloningTechniques,MethodsinEnzymologyvolume152AcademicPress,Inc.,SanDiego,Calif.(Berger)；Sambrook等,MolecularCloning--ALaboratoryManual(第3版),Vol.1-3,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,N.Y.,2000("Sambrook")及CurrentProtocolsinMolecularBiology,F.M.Ausubel等编,CurrentProtocols,GreenePublishingAssociates,Inc.和JohnWiley&Sons,Inc.之间的联合体(jointventure),("Ausubel")。

在一些方面，可以将编码蛋白质(包括嵌合分子)的核苷酸克隆到表达载体中。“表达载体”是能够促进其中掺入的核酸的表达以及复制的载体，经常是质粒。通常，要表达的核酸“可操作连接”于启动子和/或增强子，并且受到启动子和/或增强子的转录调节控制。在另一个实施方案中，载体可以进一步包含编码另外蛋白质的核苷酸。

适合于载体的启动子包括AcMNPV多角体蛋白启动子(或其它杆状病毒)、噬菌体lambdaPL启动子、大肠杆菌(E.coli)lac、phoA和tac启动子、SV40早期和晚期启动子、和逆转录病毒LTR的启动子。其它合适的启动子是本领域中已知的。载体可以进一步含有转录起始、终止的位点，及在转录区中用于翻译的核糖体结合位点。由构建体表达的转录物的编码部分可以包含在要翻译的多肽的开始处的翻译起始密码子和大致位于末端的终止密码子。

载体可以包含一种或多种合适的标志物。此类标志物包含二氢叶酸还原酶、G418或新霉素抗性(对于真核细胞培养物)和四环素、卡那霉素或氨苄青霉素抗性基因(对于在大肠杆菌和其它细菌中的培养)。载体的例子包括病毒载体，如杆状病毒、痘病毒(例如痘苗病毒、禽痘病毒、金丝雀痘病毒、鸡痘病毒、浣熊痘病毒、猪痘病毒等)、腺病毒(例如犬腺病毒)、疱疹病毒和逆转录病毒。可以使用的其它载体包括细菌载体，如pQE70、pQE60和pQE-9、pBluescript载体、Phagescript载体、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A、ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、和pRIT5。优选的真核载体是pFastBaclpWINEO、pSV2CAT、p0044、pXTI、pSG、pSVK3、pBPV、pMSG、和pSVL。其它合适的载体会是熟练技术人员容易显而易见的。

可以使用各种类型的诱变来改变氨基酸或核苷酸序列。它们包括但不限于定点、随机点诱变、同源重组(DNA改组)、使用含有尿嘧啶的模板的诱变、寡核苷酸定向的诱变、硫代磷酸酯修饰的DNA诱变、使用有缺口的双链体DNA的诱变等。其他方法包括点错配修复、使用修复缺陷宿主菌株的诱变、限制-选择和限制-纯化、缺失诱变、通过总基因合成的诱变、双链断裂修复等。在一个实施方案中，可以通过天然存在的分子或改变的或突变的天然存在的分子的已知信息，例如序列、序列比较、物理特性、晶体结构等指导诱变。

在一些方面，核苷酸序列可以含有沉默突变；例如以优化特定宿主的密码子表达(将人mRNA中的密码子改变成那些由昆虫细胞如Sf9细胞优选的)。参见例如美国专利公开文本2005/0118191。

真核宿主细胞包括酵母、昆虫、禽类、植物、秀丽隐杆线虫(C.elegans)(或线虫)和哺乳动物宿主细胞。昆虫细胞的合适的例子是草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)(Sf)细胞，例如SD、Sf21、粉纹夜蛾(Trichoplusiani)细胞，例如HighFive细胞，和果蝇S2细胞。真菌(包括酵母)宿主细胞的例子是酿酒酵母(S.cerevisiae)、乳酸乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactislactis)、念珠菌属(Candida)的菌种，包括白色念珠菌(C.albicans)和光滑念珠菌(C.glabrata)、构巢曲霉(Aspergillusnidulans)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe,S.pombe)、巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)和解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)。哺乳动物细胞的例子是COS细胞、幼仓鼠肾细胞、小鼠L细胞、LNCaP细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人胚肾(HEK)细胞、和非洲绿猴细胞、CV1细胞、HeLa细胞、MDCK细胞、Vero和Hep-2细胞。也可以使用光滑爪蟾(Xenopuslaevis)卵母细胞，或两栖类起源的其它细胞。原核宿主细胞的例子包括细菌细胞，例如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphi)和分枝杆菌。

病毒样颗粒

多种VLP是本领域中已知的。在一些方面，将本公开内容的融合蛋白掺入VLP中。在其它方面，可以通过使用本公开内容的融合蛋白增强VLP生成以增强装配成VLP的蛋白质的表达。在一些方面，VLP可以是流感VLP。可以制备流感VLP，如记载于Robinson的美国专利号7,763,450，Smith的8,080,255，Galarza的U.S.7,556,940，和专利申请公开号2010/0129401。仅表达流感M1足以装配VLP。因而，除了本文中描述的一种以上的融合蛋白外，流感VLP可以仅包含流感M1蛋白。在其它方面，可以包含一种以上的另外的流感蛋白。例如，另外的蛋白质可以包含其它流感蛋白，如M2、HA或NA。

HA和NA蛋白可以源自不同亚型和/或不同毒株。例如，HA可以选自下组：H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15和H16。NA可以选自下组：N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8和N9。HA可以展现出血凝素活性。NA可以展现出神经氨酸酶活性。

流感蛋白(例如M1、M2、HA或NA)可以源自各种来源。例如，流感蛋白可以源自感染如下的流感：人和其它灵长类，包括非人灵长类，如黑猩猩和其它猿和猴物种；牲畜(如牛、绵羊、猪、山羊和马)和家畜(如犬和猫)；实验室动物，包括啮齿类，如小鼠、大鼠和豚鼠；禽类，包括家禽、野生禽类和游戏禽类，如鸡、火鸡、鸭和鹅。在具体的方面，流感是禽流感；例如H9N2亚型(例如毒株甲型/香港/1073/99)或H5N1亚型(例如毒株甲型/印尼/5/05)。在其它具体的方面，流感是H1N1亚型或H3N2亚型。

药物或疫苗配制和施用

通过本文中公开的方法生成的蛋白质可以配制为依照本领域中的已知方法对受试者施用的药物组合物。

药物组合物可以含有药学可接受载体、稀释剂或赋形剂。如本文中使用，术语“药学可接受”意指得到联邦或州政府的管理机构批准，或者在美国药典、欧洲药典或其它公认的药典中列出用于哺乳动物，且更具体用于人。这些组合物可以用作疫苗和/或抗原性组合物，以在脊椎动物中诱导保护性免疫应答。

在一些方面，配制剂可以包含药学可接受载体或赋形剂。药学可接受载体包括但不限于盐水、缓冲盐水、右旋糖、水、甘油、无菌等张水性缓冲液、及其组合。药学可接受载体、稀释剂和其它赋形剂的彻底讨论呈现于Remington'sPharmaceuticalSciences(MackPub.Co.N.J.目前版本)。可以改编配制剂以适合施用模式。在一个例示性的实施方案中，配制剂适合于对人施用，是无菌的，非颗粒和/或非致热原的。

组合物还可以含有湿润剂、或乳化剂、或pH缓冲剂、或其混合物。组合物可以是固体形式，如适合于重建(例如用水或盐水)的冻干粉末、液体溶液、悬浮液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊、持续释放配制剂、或粉末。口服配制剂可以包含标准的载体，如药用级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠(sodiumsaccharine)、纤维素、碳酸镁等。

在一些方面，提供了包含一个以上容器的药用包装或试剂盒，所述容器填充有配制剂的一种以上组分。在一个具体的方面，试剂盒可以包含两个容器，第一容器含有毒素受体结合蛋白融合蛋白、包含毒素受体结合蛋白融合蛋白的胶束、或包含毒素受体结合蛋白融合蛋白的VLP，并且第二容器含有佐剂。与此类容器结合的可以是由管理药物或生物产品的制造、使用或出售的政府机构规定的形式的告知，该告知反映该机构批准制造、使用或出售用于人施用。配制剂也可以包装在指示组合物数量的气密密封容器，如安瓿或小药囊(sachette)中。

施用和剂量给药

施用可以是任何合适的路径。合适的路径包括胃肠外施用(例如皮内、肌肉内、静脉内和皮下)、硬膜外和粘膜(例如鼻内和口服或肺路径或者通过栓剂)、经皮或皮内。施用可以通过输注或推注，通过吸收过表皮或皮肤粘膜衬里(例如口服、粘液、结肠、结膜、鼻咽、口咽、阴道、尿道、膀胱和肠粘膜等)，并且可以与其它生物学活性剂一起施用。在一些方面，鼻内或其它粘膜施用路径可以导致抗体或其它免疫应答，其基本上高于其它施用路径。施用可以是系统性或局部的。

在一些方面，可以使用针和注射器通过注射，通过无针注射装置来施用。在其它方面，通过滴剂，大颗粒气雾剂(大于约10微米)，或者通过喷雾到上呼吸道中施用。

在一些方面，施用可以是靶向的。例如，免疫原可以以如下的方式施用，使得靶向粘膜组织，从而在免疫部位处引发免疫应答。可以通过使用口服施用组合物使粘膜组织(如肠关联淋巴样组织(GALT))靶向免疫，所述组合物含有具有特定粘膜靶向特性的佐剂。也可以靶向另外的粘膜组织，诸如鼻咽淋巴样组织(NALT)和支气管关联淋巴样组织(BALT)。

在一些方面，可以使用多种免疫原。在施用超过一种免疫原的情况下，可以对受试者的同一位置同时共施用免疫原；例如，通过从含有多种免疫原的容器注射材料。在其它方面，在共施用超过一种免疫原时，可以在短的时间空间内在不同部位处序贯共施用它们；例如，一次施用可以在股中，并且第二次施用可以在臂中，两次施用在短时段(例如多至30分钟)内发生。

施用可以按剂量日程表发生，例如，最初施用组合物，随后是加强剂施用。在具体的实施方案中，在初次施用后2周至1年，优选约1、约2、约3、约4、约5或约6个月施用第二剂组合物。另外，可以在第二剂后并且在初次施用后约3个月至约2年，或甚至更长，优选约4、约5、或约6个月，或约7个月，或约1年施用第三剂。任选地，在第二剂后在受试者的血清和/或尿液或粘膜分泌物中检不出特定免疫球蛋白或检出低水平特定免疫球蛋白时施用第三剂。在一个优选的实施方案中，第二剂在第一次施用后约1个月施用，并且第三剂在第一次施用后约6个月施用。在另一个实施方案中，第二剂在第一次施用后约6个月施用。在另一个实施方案中，本公开内容的组合物可以作为组合疗法的一部分施用。例如，组合物可以与其它免疫原性组合物、抗病毒剂和/或抗生素一起配制。

熟练技术人员可以容易地确定药物组合物剂量，例如通过首先鉴定有效引发预防或治疗免疫应答的剂量，例如通过测量病毒特异性免疫球蛋白的血清滴度，或者通过测量血清样品或尿液样品、或者粘膜分泌物中的抗体的抑制比。可以从动物研究确定剂量。用于研究疫苗效力的动物的非限制性列表包括豚鼠、仓鼠、白鼬、毛丝鼠(chinchilla)、小鼠和棉鼠。

大多数动物不是传染物的天然宿主，但是仍然可以用于疾病的各个方面的研究。例如，可以用疫苗候选物对任何上述动物给药以部分表征诱导的免疫应答，和/或以确定是否已经生成了任何中和性抗体。例如，已经在小鼠模型中进行了许多研究，因为小鼠尺寸小，并且其低成本容许研究人员进行较大规模的研究。

另外，熟练技术人员可以进行人临床研究以确定人优选的有效剂量。此类临床研究是本领域中常规且公知的。要采用的精确剂量也会取决于施用路径。可以从源自体外或动物测试系统的剂量-响应曲线外推有效剂量。可以基于例如年龄、身体状况(physicalcondition)、体重、性别、饮食、施用次数、和其它临床因素调节剂量。

虽然用单剂刺激免疫力是可能的，但是可以通过相同或不同路径施用额外的剂量，以实现期望的效果。在新生儿和婴儿中，例如，可以需要多次施用以引发足够的免疫力水平。在必要时，施用可以贯穿整个童年以时间间隔继续，以维持足够的针对感染的保护水平。类似地，特别易于重复感染或严重感染的成人(如例如健康护理工作人员、日间护理工作人员、幼年儿童的家庭成员、老年人和具有受损心肺功能的个体)可以需要多次免疫以建立和/或维持保护性免疫应答。可以监测诱导的免疫力的水平，例如通过测量中和性分泌性和血清抗体的量，并且在必要时调节剂量或重复疫苗接种以引发并维持期望的保护水平。

在一些方面，可以以液体供应组合物。可以在气密密封容器中以至少约50μg/ml，更优选至少约100μg/ml，至少约200μg/ml，至少500μg/ml，或至少1mg/ml供应组合物的液体形式。

佐剂

可以通过使用称为佐剂的免疫应答的非特异性刺激物增强特定组合物的免疫原性。已经通过实验使用佐剂来促进针对抗原的免疫力的全身性升高(例如美国专利号4,877,611)。免疫方案已经使用佐剂来刺激应答达多年，因而，佐剂是本领域普通技术人员已知的。一些佐剂影响呈递抗原的方式。例如，在蛋白质抗原被明矾沉淀时，免疫应答升高。抗原的乳化也延长抗原呈递的持续时间。记载于Vogel等,"ACompendiumofVaccineAdjuvantsandExcipients(第2版)"(其通过提及完整并入本文用于所有目的)的任何佐剂的纳入涵盖在本公开内容的范围内。

例示性的佐剂包括完全弗氏佐剂(含有杀死的结核分枝杆菌的免疫应答的非特异性刺激物)、不完全弗氏佐剂和氢氧化铝佐剂。其它佐剂包含GMCSP、BCG、MDP化合物，如thur-MDP和nor-MDP、CGP(MTP-PE)、脂质A和单磷酰脂质A(MPL)、MF-59、RIBI(其含有自细菌提取的三种组分)、MPL、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)和2％鲨烯/80乳剂中的细胞壁骨架(CWS)。

在一些方面，佐剂可以是少层脂质囊泡，其具有约2-10个双层，其排列为实质性球体壳的形式，以在无脂质双层的大无定形中心腔周围的水性层分开。少层脂质囊泡可以起作用，从而以几种方式刺激免疫应答，作为非特异性刺激物，作为抗原的载体，作为另外佐剂的载体，及其组合。在例如通过混合抗原与预先形成的囊泡使得抗原仍然在囊泡的胞外来制备疫苗时，少层脂质囊泡充当非特异性免疫刺激物。通过在囊泡的中心腔内包囊抗原，囊泡既起免疫刺激物又起抗原载体的作用。在另一个实施方案中，囊泡主要由非磷脂囊泡制成。在其它实施方案中，囊泡是是少层非磷脂囊泡，范围为约100nm至约500nm。它们包含Brij72、胆固醇、油酸和鲨烯。已经显示了Novasomes是一种用于流感抗原的有效佐剂(参见美国专利号5,629,021、6,387,373和4,911,928)。

本公开内容的组合物也可以用“免疫刺激物”配制。这些是身体自身的化学信使(细胞因子)以提高免疫系统的应答。免疫刺激物包括但不限于具有免疫刺激、免疫加强、和促炎性活性的各种细胞因子、淋巴因子和趋化因子，如白介素(例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-12、IL-13)；生长因子(例如粒细胞-巨噬细胞(GM)-集落刺激因子(CM)；和其它免疫刺激分子，如巨噬细胞炎性因子、Flt3配体、B7.1；B7.2等。免疫刺激分子可以与本公开内容的组合物在相同的配制剂中施用，或者可以分开施用。可以施用蛋白质或编码蛋白质的表达载体以产生免疫刺激效应。因此，在一个实施方案中，被公开内容包括抗原性和疫苗组合物，其包含佐剂和/或免疫刺激物。本公开内容涵盖用细菌毒素对人和其它动物接种疫苗以提供针对随后疾病的实质性免疫力，所述疾病是由于毒素生成生物体感染或者作为对身体导入毒素的任何事件的结果而引入人或其它动物的毒素诱导。

公开内容的方面通过下述实施例进一步例示，所述实施例不应解释为限制性的。贯穿本申请引用的所有参考文献、登录号序列、专利和公布的专利申请的内容，及其中的图和序列表通过提述并入本文用于所有目的。

实施例1

FMDV多蛋白的制备和表达

将FMDVP1多蛋白克隆到两种载体BV1168和BV1169中(图1)。载体是相同的，只是BV1169含有N端的甲型/印尼/5/05信号肽序列(SEQIDNO:3；MEKIVLLLAIVSLVK)。在这两种情况中，P1多蛋白含有N端His6标签。BV1168编码的蛋白质和核苷酸序列分别显示于图4C和4D。由BV1169编码的蛋白质和核苷酸序列分别显示于图4A和4B。

用BV1168和BV1169的三个克隆以MOI为0.5ffu/细胞感染Sf9细胞，并且在27℃、150rpm温育～70小时。粗制收获物(细胞和培养基)通过SDS-PAGE和Western印迹分析，如图2中显示。各道如下：M-标志物。第1-3道显示了自BV1168表达的FMDVP1蛋白，具有六组氨酸标签，没有信号肽。第4-6道显示了自BV1169表达的FMDVP1蛋白，具有六组氨酸标签和信号肽。第7道显示了BV266对照，并且第8道显示了BV1064S300Fxn。根据SDS-PAGE中的总蛋白质染色，图2A在第4-6道中显示了增强的表达。图2B-D在第4-6道中显示了通过抗组氨酸抗体(图2B；“抗HISMab”)，抗FMDVvp2抗体(图2C；“F1412SAMab”)及通过抗FMDVvp1抗体(图2D；“12FE9.2.1AMab”)检测的增强的表达。

数据证明了FMDV多蛋白P1蛋白在过表达为含有N-端信号肽的融合蛋白时是实质性升高的。P1蛋白以未切割的形式生成，并且可通过抗FMDV单克隆抗体检测。

实施例2

单一FMDV多肽的增强的表达

在与信号肽融合时，个别的非分泌性蛋白质的表达是增强的。用表达各自具有和没有信号肽的FMDVvp0或FMDVvp1蛋白的杆状病毒感染Sf9细胞。在感染后70小时收获细胞。通过SDS-PAGE及通过对重组蛋白特异性的单克隆抗体的Western印迹分析收获的粗制材料(即细胞和培养基)。图3，图面(a)，左图面显示了FMDVvp0的表达。图3，图面(b)，右图面显示了FMDVvp1蛋白的表达。在每种情况下，“+”重组蛋白含有信号肽，“-”重组蛋白没有信号肽。箭头指示表达的vp1蛋白。

实施例3

含有单一和多种蛋白质的FMDV多肽的表达

信号肽提高单一蛋白质和串联的蛋白质的表达。图5显示了用多种不同构建体提高的表达。用表达具有(+)或没有(-)信号肽的蛋白质1、2、3、和/或4的重组杆状病毒(BV)感染Sf9细胞，并且在感染后～65小时收获。收获粗制样品(即细胞和培养基)，并且通过SDS-PAGE和Western印迹分析。表达的重组蛋白以点指示。BV1表达FMDVvp1。BV2表达FMDVvp0vp3。BV3表达FMDVvp1、vp0和vp3。BV4表达FMDVP1多蛋白(即vp0-vp3-vp1)。图5A显示了总蛋白质染色。图5B和5C分别显示了vp1和vp2抗体的结合。注意vp0蛋白含有vp2蛋白。在每种情况中，获得升高的蛋白质表达。

Claims (23)

1.一种融合蛋白，其包含：

(a)N-端信号肽，

其中所述N-端信号肽由SEQIDNO:3组成；和

(b)免疫原性多肽。

2.权利要求1的融合蛋白，其中所述免疫原性多肽包含选自下组的蛋白质：病毒蛋白、细菌蛋白和真菌蛋白。

3.权利要求2的融合蛋白，其中所述免疫原性多肽包含病毒蛋白。

4.权利要求1的融合蛋白，其中所述免疫原性多肽是包含2、3、4、5或6个蛋白质的多蛋白。

5.权利要求3的融合蛋白，其中所述病毒选自下组：微小RNA病毒、黄病毒(flavirus)、披膜病毒(togavirus)和人乳头瘤病毒。

6.权利要求3的融合蛋白，其中所述病毒蛋白包含口蹄疫病毒(FMDV)蛋白。

7.权利要求4的融合蛋白，其中所述多蛋白包含至少两个选自下组蛋白质的蛋白质：FMDVvp1蛋白、FMDVvp2蛋白、FMDVvp3蛋白和FMDVvp4蛋白。

8.权利要求1的融合蛋白，其进一步包含表位标签。

9.权利要求8的融合蛋白，其中所述表位标签选自下组：六组氨酸标签、FLAG标签、Glu-Glu标签、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)标签、和麦芽糖结合蛋白(MBP)标签。

10.权利要求6的融合蛋白，其中所述表位标签位于所述信号肽的N端。

11.权利要求6的融合蛋白，其中所述表位标签位于所述免疫原性肽的C端。

12.权利要求1的融合蛋白，其中所述免疫原性肽是FMDV蛋白酶。

13.一种多核苷酸，其编码权利要求1的融合蛋白。

14.一种宿主细胞，其包含权利要求13的多核苷酸。

15.一种免疫原性组合物，其包含：

(i)权利要求1的融合蛋白和

(ii)佐剂。

16.权利要求15的免疫原性组合物，其中所述佐剂选自下组：少层(paucilamellar)非磷脂囊泡、氢氧化铝、GMCSP、BCG、thur-MDP、nor-MDP、MTP-PE、单磷酰脂质A(MPL)、MF-59、和RIBI。

17.权利要求15的组合物，其进一步包含药学可接受载体或稀释剂。

18.一种提高免疫原性多肽的产量的方法，其包括在宿主细胞中以融合蛋白表达所述免疫原性多肽，其中所述融合蛋白包含：

(a)N-端信号肽，

其中所述N-端信号肽由SEQIDNO:3组成；和

(b)所述免疫原性多肽，

其中与在没有所述N-端信号肽的宿主细胞中表达所述免疫原性多肽相比，产量是增加的。

19.权利要求18的方法，其中所述宿主细胞是杆状病毒细胞。

20.一种在受试者中诱导保护性免疫应答的方法，其包括对所述受试者施用权利要求15的组合物。

21.权利要求20的方法，其中所述受试者是人。

22.权利要求20的方法，其中所述保护性免疫应答包含抗体介导的免疫应答和细胞介导的免疫应答中的至少一种。

23.权利要求22的方法，其中所述抗体介导的免疫应答包含中和性抗体。