TWI435934B - 新穎的病毒載體 - Google Patents
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Description
本發明提供一種新穎的轉移載體(transfer vector)、一種藉由該轉移載體與一桿狀病毒DNA(baculovirus DNA)的同源性重組(homologous recombination)而被獲得的重組型桿狀病毒(recombinant baculovirus)，以及用於產生它們的方法。
本發明進一步提供含有該重組型桿狀病毒作為一活性成份的藥品(pharmaceuticals){例如：用於傳染病(infectious diseases)[諸如瘧疾(malaria)以及流行性感冒(influenza)]的疫苗，以及預防或治療藥物}。
桿狀病毒(Baculovirus)在工業上使用昆蟲細胞來生成一所欲蛋白質的方法中已被用來作為一載體。近年來，已被發現：桿狀病毒可將一外來基因(foreign gene)導入不僅昆蟲細胞內，還有哺乳動物細胞內，並且它們作為一種用於導入一治療性基因(therapeutic gene)之載體的用途的可能性已被發現。專利文件1揭露一種含有多重獨立啟動子(multiple independent promoters)的重組型桿狀病毒表現載體(recombinant baculovirus expression vector)，該等多重獨立啟動子包含有一衍生自桿狀病毒的一早期基因(early gene)的啟動子(它具有一含有一編碼一病毒非結構蛋白的
基因的DNA區域)，以及一衍生自桿狀病毒的一晚期基因(late gene)的啟動子(它具有一含有一編碼一病毒結構蛋白的基因的DNA區域)。
專利文件2揭露一種方法，其包含有：將一含有多重獨立啟動子的非哺乳動物DNA病毒載體(non－mammalian DNA viral vector)導入哺乳動物細胞內，該等多重獨立啟動子受到控制以表現一被連接至該等啟動子之所欲的外來基因；以及在該等哺乳動物細胞中表現該外來基因。
再者，專利文件3揭露一種以使用一桿狀病毒的基因重組技術(gene recombination technology)來生成一蛋白質的方法。該方法包含有表現一藉由將桿狀病毒的gp64基因連接至一編碼一所欲蛋白質的基因而被獲得的融合基因(fusion gene)俾以生成該呈一種被融合以病毒顆粒(viral particles)的形式的所欲蛋白質，收集該等被融合以該所欲蛋白質的病毒顆粒，以及將該所欲蛋白質從該等病毒顆粒切開以收集該蛋白質。
有關一桿狀病毒表現系統(baculovirus expression system)，專利文件4揭露一種具有多重獨立啟動子的重組型桿狀病毒表現載體(recombinant baculovirus expression vector)，其含有一編碼一偵測標記(detection marker)的第一核酸序列[它是呈一種能夠起作用(functioning)的形式而被連接至一在宿主細胞中是活化的並且在非－可接受的細胞(non－acceptable cells)中是不活化的第一啟動子]，以及一含有一外來核酸序列的第二核酸序列(它是呈一種能夠起作
用的形式而被連接至一在非－可接受的細胞中是活化的第二啟動子)。
專利文件5揭露：一種被連接至一衍生自雞β肌動蛋白(chicken β actin)的CAG啟動子之流行性感冒病毒血球凝集素抗原－表現重組型桿狀病毒載體[influenza virus hemagglutinin(HA)antigen－expressing recombinant baculovirus vector]具有流行性感冒病毒感染－預防效用並且因而可用作為一疫苗配方(vaccine formulation)。
專利文件6揭露一種產生一桿狀病毒載體的方法，其包含有將一含有一個桿狀病毒啟動子以及一個哺乳動物細胞－衍生的啟動子(mammalian cell－derived promoter)的質體(具有一編碼一在細胞表面上可表現之蛋白質的基因被連接於其上)，或者一含有兩個桿狀病毒啟動子的質體(具有一編碼一在細胞表面上可表現之蛋白質的基因已被連接於其上)共轉染至昆蟲細胞中的步驟。
專利文件7描述有關一種重組型桿狀病毒(具有被併入至一CAG啟動子內的流行性感冒病毒HA之cDNA)的抗－流行性感冒病毒活性(亦即，對抗流行性感冒病毒感染的活性)的研究，並且揭露了：不僅是該重組型桿狀病毒還有野生型桿狀病毒都具有抗－流行性感冒病毒活性。
如上所顯示的，近年來各種不同的重組型桿狀病毒載體已被發展，並且許多嘗試已被作出以發展出用於哺乳動物之含有該一重組型桿狀病毒載體作為一活性成份的藥品。
在此技術領域中，發展出含有一種新穎的重組型桿狀病毒[它是一種具有一新穎結構並且對抗瘧疾(malaria)、流行性感冒(influenza)、結核病(tuberculosis)以及類似的傳染病，或者疾病(諸如癌症)是為有效的重組型桿狀病毒載體]作為一活性成份的藥學配方(特別地疫苗配方)已是所欲的。
專利文件1：日本專利第3366328號，多重啟動子桿狀病毒表現系統以及缺陷顆粒產物(Defect Particle Products)。
專利文件2：WO98/011243，具有經修飾之包覆蛋白(Modified Coating Protein)的非哺乳動物DNA病毒。
專利文件3：JP第2002－235236－A號，生成蛋白質的方法。
專利文件4：JP第2003－284557－A號，用於表現外來基因之新穎的桿狀病毒－轉染載體以及重組型桿狀病毒。
專利文件5：WO02/062381，桿狀病毒載體疫苗。
專利文件6：WO04/029259，桿狀病毒載體、產生桿狀病毒載體的方法，以及導入基因的方法。
專利文件7：JP第2005－15346－A號，含有桿狀病毒的抗病毒劑(Anti－viral Agent)。
本發明的一個目的是要提供一種新穎的重組型轉移載體、一種藉由該重組型轉移載體與一桿狀病毒DNA的同源性重組而被獲得的重組型桿狀病毒，以及用於產生它們的方法。本發明的另一個目的是要提供一種藥學製劑
(pharmaceutical preparation)，特別是一種含有該重組型桿狀病毒作為一活性成份的疫苗配方(vaccine formulation)。
本案發明人發現一種具有一在昆蟲細胞中以及在脊椎動物[特別是哺乳動物和鳥類(avian)]細胞中能夠表現一融合蛋白質的新穎結構的轉移載體，該融合蛋白質含有一具有一所欲的免疫原性(immunogenicity)之蛋白質或它的一部分蛋白質(partial protein)與一病毒結構蛋白；以及一種藉由該轉移載體與一桿狀病毒DNA的同源性重組而被獲得的重組型桿狀病毒。使用所得到的重組型桿狀病毒，本案發明人對於具有傳染病－預防和治療效用之含有一重組型桿狀病毒作為一活性成份的藥品進行廣泛的研究。結果，發明人發現：所得到的重組型桿狀病毒具有所欲的藥學效用(pharmaceutical effects)。
因此，本發明的發明人發現一種具有一新穎結構的重組型轉移載體、一種藉由該轉移載體與一桿狀病毒DNA的同源性重組而被獲得的重組型桿狀病毒，以及用於產生它們的方法，並且確認：該重組型桿狀病毒本身可用作為一種在標的細胞(target cells)中能夠表現一具有所欲的免疫原性之蛋白質的藥品，以及作為一種用於預防傳染病(諸如瘧疾和流行性感冒)的藥品。本發明已根據此等發現而被完成。
本發明提供被顯示在下列項目1至22中的發明：
項目1：一種轉移載體，它是下列的任一者：pCAP－PfCSP、
pCAP－PfCSP/272、pCAP－PfCSP/467、pCAP－PfCSP(A361E)、pCAP－PfCSP(A361E)/272、pCAP－PfCSP(A361E)/467、pCAP－PfCSP－76、pCAP－PfCSP－76/467、pCAP－PfCSP＋209、pCAP－PfCSP＋209/467、pCAP－PfCSP＋76/209、pCAP－PfCSP＋76/209/467、pCAP－HA1/Anhui、pCAP－HA1/Anhui/272、pCAP－HA1/Anhui/467、pCAP－HA1/Vietnam、pCAP－HA1/Vietnam/51、pCAP－HA1/Vietnam/101、pCAP－HA1/Vietnam/154、pCAP－HA1/Vietnam/201、pCAP－HA1/Vietnam/272、pCAP－HA1/Vietnam/467、pCAP－AH/345、pCAP－AH/345/467、pCAP－AH/410、pCAP－AH/410/467、pCAP－AH/473、pCAP－AH/473/467、pCAP－AH/520、pCAP－AH/520/467、pCAP－VN/346、pCAP－VN/346/467、pCAP－VN/410、pCAP－VN/410/467、pCAP－VN/473、pCAP－VN/473/467、pCAP－VN/520、pCAP－VN/520/467、pCAP－CO/full、pCAP－CO/full/467、pCAP－CO/19、pCAP－CO/19/467、pCAP－CO/76、pCAP－CO/76/467、pCAP－CO/205、pCAP－CO/205/467、pCA39－HA1/Anhui、pCA64－HA1/Anhui、pCA39－PfCSP(A361E)、pCA64－PfCSP(A361E)、pCAP－CO/full/VSV、pCAP－CO/19/VSV、pCAP－CO/76/VSV、pCAP－CO/205/VSV、pDual－Pfs25－PfCSP－gp64以及pDual－PfMSP1－PfCSP－gp64。
項目2：一種重組型桿狀病毒，它是下列的任一者：AcNPV－CAP－PfCSP、AcNPV－CAP－PfCSP/272、AcNPV－CAP－PfCSP/467、AcNPV－CAP－PfCSP(A361E)、AcNPV－CAP－PfCSP(A361E)/272、AcNPV－CAP－PfCSP(A361E)/467、AcNPV－CAP－PfCSP－76、AcNPV－CAP－PfCSP－76/467、AcNPV－CAP－PfCSP＋209、AcNPV－CAP－PfCSP＋209/467、AcNPV－CAP－PfCSP＋76/209、AcNPV－CAP－PfCSP＋76/209/467、AcNPV－CAP－HA1/Anhui、AcNPV－CAP－HA1/Anhui/272、AcNPV－CAP－HA1/Anhui/467、AcNPV－CAP－HA1/Vietnam、AcNPV－CAP－HA1/Vietnam/51、AcNPV－CAP－HA1/Vietnam/101、AcNPV－CAP－HA1/Vietnam/154、AcNPV－CAP－HA1/Vietnam/201、AcNPV－CAP－HA1/Vietnam/272、AcNPV－CAP－HA1/Vietnam/467、AcNPV－CAP－AH/345、AcNPV－CAP－AH/345/467、AcNPV－CAP－AH/410、AcNPV－CAP－AH/410/467、AcNPV－CAP－AH/473、AcNPV－CAP－AH/473/467、AcNPV－CAP－AH/520、AcNPV－CAP－AH/520/467、AcNPV－CAP－VN/346、AcNPV－CAP－VN/346/467、AcNPV－CAP－VN/410、AcNPV－CAP－VN/410/467、AcNPV－CAP－VN/473、AcNPV－CAP－VN/473/467、AcNPV－CAP－VN/520、AcNPV－CAP－VN/520/467、AcNPV－CAP－CO/full、
AcNPV－CAP－CO/full/467、AcNPV－CAP－CO/19、AcNPV－CAP－CO/19/467、AcNPV－CAP－CO/76、AcNPV－CAP－CO/76/467、AcNPV－CAP－CO/205、AcNPV－CAP－CO/205/467、AcNPV－CA39－HA1/Anhui、AcNPV－CA64－HA1/Anhui、AcNPV－CA39－PfCSP(A361E)、AcNPV－CA64－PfCSP(A361E)、AcNPV－CAP－CO/full/VSV、AcNPV－CAP－CO/19/VSV、AcNPV－CAP－CO/76/VSV、AcNPV－CAP－CO/205/VSV、AcNPV－Dual－Pfs25－PfCSP－gp64以及AcNPV－Dual－PfMSP1－PfCSP－gp64。
項目3：一種用於傳染病的組成物，其包含有如項目2的重組型桿狀病毒作為一活性成份。
項目4：一種用於傳染病的組成物，其包含有如項目2的重組型桿狀病毒作為一活性成份，該組成物是藉由肌肉內的(intramuscular)、呼吸的(respiratory)或經鼻的(nasal)途徑而被投藥。
項目5：一種疫苗，其包含有如項目2的重組型桿狀病毒作為一活性成份。
項目6：一種疫苗，其包含有如項目3的重組型桿狀病毒作為一活性成份，該組成物是藉由肌肉內的、呼吸的或經鼻的途徑而被投藥。
項目7：一種用於流行性感冒病毒感染的治療或預防劑，其包含有下列的任一者作為一活性成份：AcNPV－CAP－HA1/Anhui、AcNPV－CAP－HA1/Anhui/272、AcNPV－CAP－HA1/Anhui/467、AcNPV－CAP－HA1/Vietnam、
AcNPV－CAP－HA1/Vietnam/51、AcNPV－CAP－HA1/Vietnam/101、AcNPV－CAP－HA1/Vietnam/154、AcNPV－CAP－HA1/Vietnam/201、AcNPV－CAP－HA1/Vietnam/272、AcNPV－CAP－HA1/Vietnam/467、AcNPV－CAP－AH/345、AcNPV－CAP－AH/345/467、AcNPV－CAP－AH/410、AcNPV－CAP－AH/410/467、AcNPV－CAP－AH/473、AcNPV－CAP－AH/473/467、AcNPV－CAP－AH/520、AcNPV－CAP－AH/520/467、AcNPV－CAP－VN/346、AcNPV－CAP－VN/346/467、AcNPV－CAP－VN/410、AcNPV－CAP－VN/410/467、AcNPV－CAP－VN/473、AcNPV－CAP－VN/473/467、AcNPV－CAP－VN/520、AcNPV－CAP－VN/520/467、AcNPV－CA39－HA1/Anhui以及AcNPV－CA64－HA1/Anhui。
項目8：如項目7的用於流行性感冒病毒感染的治療或預防劑，其是藉由肌肉內的、呼吸的或經鼻的途徑而被投藥。
項目9：一種對抗流行性感冒病毒感染的疫苗，其包含有下列的任一者作為一活性成份：AcNPV－CAP－HA1/Anhui、AcNPV－CAP－HA1/Anhui/272、AcNPV－CAP－HA1/Anhui/467、AcNPV－CAP－HA1/Vietnam、AcNPV－CAP－HA1/Vietnam/51、AcNPV－CAP－HA1/Vietnam/101、AcNPV－CAP－HA1/Vietnam/154、
AcNPV－CAP－HA1/Vietnam/201、AcNPV－CAP－HA1/Vietnam/272、AcNPV－CAP－HA1/Vietnam/467、AcNPV－CAP－AH/345、AcNPV－CAP－AH/345/467、AcNPV－CAP－AH/410、AcNPV－CAP－AH/410/467、AcNPV－CAP－AH/473、AcNPV－CAP－AH/473/467、AcNPV－CAP－AH/520、AcNPV－CAP－AH/520/467、AcNPV－CAP－VN/346、AcNPV－CAP－VN/346/467、AcNPV－CAP－VN/410、AcNPV－CAP－VN/410/467、AcNPV－CAP－VN/473、AcNPV－CAP－VN/473/467、AcNPV－CAP－VN/520、AcNPV－CAP－VN/520/467、AcNPV－CA39－HA1/Anhui以及AcNPV－CA64－HA1/Anhui。
項目10：如項目7的對抗流行性感冒病毒感染的疫苗，其是藉由肌肉內的、呼吸的或經鼻的途徑而被投藥。
項目11：一種用於人類瘧疾感染的治療或預防劑，其包含有下列的任一者作為一活性成份：AcNPV－CAP－PfCSP、AcNPV－CAP－PfCSP/272、AcNPV－CAP－PfCSP/467、AcNPV－CAP－PfCSP(A361E)、AcNPV－CAP－PfCSP(A361E)/272、AcNPV－CAP－PfCSP(A361E)/467、AcNPV－CAP－PfCSP－76、AcNPV－CAP－PfCSP－76/467、AcNPV－CAP－PfCSP＋209、AcNPV－CAP－PfCSP＋209/467、AcNPV－CAP－PfCSP＋76/209、AcNPV－CAP－PfCSP＋76/209/467、AcNPV－CAP－CO/full、AcNPV－CAP－CO/full/467、AcNPV－CAP－CO/19、
AcNPV－CAP－CO/19/467、AcNPV－CAP－CO/76、AcNPV－CAP－CO/76/467、AcNPV－CAP－CO/205、AcNPV－CAP－CO/205/467、AcNPV－CA39－PfCSP(A361E)、AcNPV－CA64－PfCSP(A361E)、AcNPV－CAP－CO/full/VSV、AcNPV－CAP－CO/19/VSV、AcNPV－CAP－CO/76/VSV、AcNPV－CAP－CO/205/VSV、AcNPV－Dual－Pfs25－PfCSP－gp64以及AcNPV－Dual－PfMSP1－PfCSP－gp64。
項目12：如項目11的用於人類瘧疾感染的治療或預防劑，其是藉由肌肉內的、呼吸的或經鼻的途徑而被投藥。
項目13：一種用於人類瘧疾感染的治療或預防劑，其包含有下列的任一者作為一活性成份：AcNPV－CAP－PfCSP、AcNPV－CAP－PfCSP/272、AcNPV－CAP－PfCSP/467、AcNPV－CAP－PfCSP(A361E)、AcNPV－CAP－PfCSP(A361E)/272、AcNPV－CAP－PfCSP(A361E)/467、AcNPV－CAP－PfCSP－76、AcNPV－CAP－PfCSP－76/467、AcNPV－CAP－PfCSP＋209、AcNPV－CAP－PfCSP＋209/467、AcNPV－CAP－PfCSP＋76/209、AcNPV－CAP－PfCSP＋76/209/467、AcNPV－CAP－CO/full、AcNPV－CAP－CO/full/467、AcNPV－CAP－CO/19、AcNPV－CAP－CO/19/467、AcNPV－CAP－CO/76、AcNPV－CAP－CO/76/467、AcNPV－CAP－CO/205、AcNPV－CAP－CO/205/467、AcNPV－CA39－PfCSP(A361E)、AcNPV－CA64－PfCSP(A361E)、AcNPV－CAP－CO/full/VSV、AcNPV－CAP－CO/19/VSV、AcNPV－CAP－CO/76/VSV、
AcNPV－CAP－CO/205/VSV、AcNPV－Dual－Pfs25－PfCSP－gp64以及AcNPV－Dual－PfMSP1－PfCSP－gp64。
項目14：如項目13的用於人類瘧疾感染的治療或預防劑，其是藉由肌肉內的、呼吸的或經鼻的途經而被投藥。
項目15：一種預防瘧疾或流行性感冒感染或者治療瘧疾或流行性感冒的方法，其包含有對一個體投藥一有效數量之如項目2的重組型桿狀病毒、如項目3或4的用於傳染病的組成物，或者如項目5、6、9、10、13或14的疫苗。
項目16：如項目15的方法，其中該重組型桿狀病毒、組成物或疫苗有如一脂質體配方(liposomal formulation)而被投藥給該個體。
項目17：如項目15的方法，其中該重組型桿狀病毒、組成物或疫苗是藉由肌肉內的、呼吸的或經鼻的途徑而被投藥給該個體。
項目18：如項目16的方法，其中該重組型桿狀病毒、組成物或疫苗是藉由肌肉內的、呼吸的或經鼻的途徑而被投藥給該個體。
項目19：一種免疫刺激(immunostimulation)的方法，其包含有對一個體投藥一有效數量之如項目2的重組型桿狀病毒、如項目3或4的用於傳染病的組成物，或者如項目5、6、9、10、13或14的疫苗。
項目20：如項目19的方法，其中該重組型桿狀病毒、組成物或疫苗有如一脂質體配方而被投藥給該個體。
項目21：如項目19的方法，其中該重組型桿狀病毒、組成
物或疫苗是藉由肌肉內的、呼吸的或經鼻的途徑而被投藥給該個體。
項目22：如項目20的方法，其中該重組型桿狀病毒、組成物或疫苗是藉由肌肉內的、呼吸的或經鼻的途徑而被投藥給該個體。
依據本發明，一種新穎的重組型轉移載體、一種藉由該重組型轉移載體與一桿狀病毒DNA的同源性重組而被獲得的重組型桿狀病毒，以及用於產生它們的方法被提供。含有本發明的重組型桿狀病毒作為一活性成份的藥品可用作為用於傳染病(諸如瘧疾和流行性感冒)的治療或預防藥物，或者作為細胞藥物(cellular medicine)以及疫苗配方。
在本說明書中被用於胺基酸、肽(peptides)、鹼基序列(base sequences)以及核酸的縮寫是根據在IUPAC-IUB Communication on Biochemical Nomenclature,Eur.J.Biochem.,138：9(1984)以及“Guideline for Preparing Specifications Including Base Sequences and Amino Acid Sequences”[專利局(Patent Office)]中所指定的縮寫，以及那些在此技術領域中所經常使用者。在本說明書中，DNA分子可包括不僅雙股DNA還有單股DNA[亦即構成該雙股DNA的一訊息鏈(sense chain)以及一反訊息鏈(antisense chain)]，並且不限於它們的一個全長(full length)。除非另有描述，編碼本發明之免疫原性外來基因(immunogenic foreign gene)的聚核苷酸(DNA分子)含括含有基因體DNA的雙股DNA、含有cDNA的單股DNA(訊息鏈)和具有一序列是互補於該訊息鏈的單股DNA(反訊息鏈)、合成的DNA(synthetic DNA)，以及它們的片段。
此處所使用的聚核苷酸或DNA分子不限於在功能性區
域(functional region)中，並且可以包括下列的至少一者：一表現抑制區域(expression suppression region)、一編碼區域、一引導序列(leader sequence)、一外顯子(exon)以及一插入子(intron)。
再者，聚核苷酸的實例包括RNA以及DNA。含有一特定胺基酸序列的多肽以及含有一特定DNA序列的聚核苷酸包括該聚核苷酸的片段、同源物(homologs)、衍生物(derivatives)以及突變體(mutants)。
該聚核苷酸的突變體(諸如突變的DNA)的實例包括天然存在的對偶基因型突變體(naturally occurring allelic mutants)；人工突變體(artificial mutants)；以及具有刪除(deletion)、取代(substitution)、加入(addition)和/或插入(insertion)的突變體。然而，應被瞭解的是：該等突變體編碼具有與由原始無突變的聚核苷酸所編碼之多肽實質上相同功能的多肽。
在本發明中，轉移載體(transfer vector)意指一種用於產生一具有一結構之重組型桿狀病毒的質體，在該結構中一藉由將至少一基因(編碼一能夠是病毒顆粒之一組份的蛋白質)連接到至少一免疫原性外來基因而被形成的融合基因被併入至一包含有兩個被連接之啟動子[亦即，一個脊椎動物啟動子(例如，一個哺乳動物啟動子或一個鳥類啟動子)以及一個桿狀病毒啟動子]的雙重啟動子(dual promoter)的下游處。
在本發明的一個較佳具體例中，該免疫原性外來基因
是位在該雙重啟動子的下游以及該編碼一能夠是病毒顆粒的一組份之蛋白質的基因的上游。本發明的重組型桿狀病毒被用來作為用於脊椎動物之藥品或疫苗的一活性成份。脊椎動物的實例包括哺乳動物，諸如人類、牛、馬、豬、綿羊(sheep)、山羊(goats)、猴子、小鼠、狗以及貓。鳥類(birds)的實例包括雞(chickens)、鵪鶉(quail)、鵝(geese)、野鴨(wild ducks)、鴿(pigeons)、火雞(turkeys)、珠雞(guinea fowls)以及鸚鵡(parrots)。
在一個具體例中，本發明提供一種含有一新穎結構的轉移載體，該結構具有一在一雙重啟動子(包含有一脊椎動物啟動子以及一桿狀病毒啟動子彼此相互連接)的控制下於昆蟲細胞中可以被表現的融合基因(含有一免疫原性外來基因與一編碼一病毒膜蛋白的基因)被併入於其中。此轉移載體與一桿狀病毒DNA一起共轉染至昆蟲細胞中會誘發一同源性重組，並且因而產生一種具有該融合基因被併入於其中的重組型桿狀病毒，該融合基因在一桿狀病毒啟動子的控制下於昆蟲細胞中被表現並且可以產生一能夠是出芽病毒顆粒(budded viral particles)之一組份的融合蛋白質。
在本發明中，當該重組型桿狀病毒被投藥給一脊椎動物時，一融合蛋白質(含有一能夠是出芽病毒顆粒之一組份的蛋白質與一免疫原性蛋白質)似乎可作為一組份疫苗(component vaccine)。再者，被投藥給該脊椎動物的重組型桿狀病毒會進入脊椎動物細胞中，並且一帶有所欲的免疫原性外來抗原之融合抗原會從在該脊椎動物細胞中的病毒
基因體中被生成，並且作為一DNA疫苗。
因此，例如，當本發明的重組型桿狀病毒被投藥給一哺乳動物時，一種含有一能夠是病毒顆粒之一組份的蛋白質與一免疫原性蛋白質的融合蛋白質有如一抗原被呈現在病毒顆粒的表面上，以及一種含有一能夠是病毒顆粒之一組份的蛋白質與一免疫原性蛋白質的融合蛋白質在哺乳動物細胞中被生成，並且由於它的免疫增強作用(immunopotentiative action)而似乎作用有如一種用於傳染病[諸如病毒(viral)、原蟲(protozoan)以及細菌(bacterial)感染]的預防或治療劑。
要與該轉移載體被共轉染的桿狀病毒DNA可以是一野生型、突變體或重組型桿狀病毒DNA。要被共轉染之宿主細胞的實例包括昆蟲細胞，諸如秋行軍蟲(Spodoptera frugiperda
)的細胞。
在本發明中，免疫原性外來基因意指一編碼出一種在用於預防和治療傳染病(諸如瘧疾以及流行性感冒)的免疫治療(immunotherapy)[諸如疫苗治療(vaccine therapy)]中被用來作為一免疫原(immunogen)之抗原蛋白(antigenic protein)的胺基酸序列的基因。它的特定實例包括編碼蛋白質(諸如瘧疾抗原以及流行性感冒病毒抗原)之胺基酸序列的基因。
如此處所用的“外來(foreign)”基因意指一從外部(outside)被導入的基因。即使相同的基因存在於細胞中，該從外部被導入的基因被意指為“外來”基因。
在本發明中，編碼一被用來作為免疫原之蛋白質的胺基酸序列的基因未被特別地限制，只要該基因能夠編碼一具有對抗一會造成疾病(諸如傳染病)之物質的免疫原性之抗原蛋白的胺基酸序列。編碼一具有免疫原性之抗原蛋白的胺基酸序列的基因之實例是如下列。
編碼一瘧疾抗原之胺基酸序列的基因的實例包括編碼下列蛋白質之胺基酸序列的基因：瘧疾寄生蟲(malaria parasites)的孢子體表面抗原CSP(sporozoite surface antigen CSP)[環子孢子蛋白(Circumsporozoite Protein)]、裂殖子表面膜蛋白MSP1(merozoite surface membrane protein MSP1)[裂殖子表面蛋白(Merozoite Surface Protein 1)]、被分泌自經感染以瘧疾之紅血球(erythrocytes)的瘧疾S抗原(malaria S antigen)、存在於經感染以瘧疾之紅血球的節(knobs)中的PfEMP1蛋白、SERA蛋白、TRAMP蛋白、AMA1蛋白，以及類似的蛋白質。
編碼流行性感冒病毒抗原之胺基酸序列的基因的實例包括編碼下列蛋白質之胺基酸序列的基因：HA抗原[血球凝集素抗原(hemagglutinin antigen)]、NA抗原[神經胺糖酸酶抗原(neuraminidase antigen)]、M2抗原[基質蛋白抗原(matrix protein antigen)]、NP抗原[核蛋白抗原(nucleoprotein antigen)]，以及類似的蛋白質。
在脊椎動物基因當中，哺乳動物基因的實例包括編碼在人類、牛、馬、豬、綿羊、猴子、小鼠、狗以及貓中的傳染病的抗原蛋白之胺基酸序列的基因。鳥類基因的實例
包括在雞、野鴨、鴿、火雞、珠雞以及鸚鵡中的傳染病的抗原基因(例如，鳥類流行性感冒HA抗原)。
病原基因(pathogen genes)(它們在如上所述之哺乳動物以及鳥類中與傳染病的關聯性已被報導)是容易地可得自於儲存關於病原基因的經註冊之公開數據的機構，諸如Genbank。
本發明可提供一種具有該一免疫原性外來基因的轉移載體，以及一種藉由該轉移載體的同源性重組而被獲得的重組型桿狀病毒。再者，本發明可提供一種含有該具有免疫原性外來基因之重組型桿狀病毒作為一活性成份的藥學組成物，以及該藥學組成物的一種疫苗配方。
被使用在本發明中的桿狀病毒意指在昆蟲體內會造成感染的昆蟲病原病毒(insect pathogen viruses)，它們是具有一環狀雙股DNA作為一基因的DNA病毒的一群[桿狀病毒科(Baculoviridae
)]。在此等病毒當中，一群被意指為核多角體病毒(nucleopolyhedrosis virus,NPV)的病毒於感染的晚期在被感染的細胞的細胞核中生成一包涵體(inclusion body)[被意指為一多面體(polyhedron)]。即使一要被表現的外來基因被插入至多角體蛋白基因(polyhedrin gene)的位置中，病毒感染與生長充分地發生俾以生成大量的所欲外來基因產物。因此，此病毒在近年來已經被用於生成所欲的蛋白質。
被使用在本發明中的桿狀病毒的實例包括苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒(Autographa californica nucleopolyhedrosis
virus：AcNPV)、家蠶核多角體病毒(Bombyx mor
inucleopolyhedrosis
virus：BmNPV)、黃杉毒蛾核多角體病毒(Orgyia pseudotsugata nucleopolyhedrosis
virus：OpNPV)，以及舞毒蛾核多角體病毒(Lymantria dlisper nucleopolyhedrosis
virus：LdNPV)。
桿狀病毒DNA可以是任一種可被同源地重組以本發明之轉移載體的DNA。更特別地，可被同源地重組以本發明之轉移載體的桿狀病毒DNA的病毒基因在大小上是有如130 kbp巨大，並且一為15 kbp或更大的免疫原性外來基因可被插入在該桿狀病毒DNA中。因為該桿狀病毒基因本身在脊椎動物細胞中幾乎不被表現，幾乎沒有需要去考慮它的細胞毒性(cytotoxicity)。因此，被認為沒有有害的免疫反應被誘發。
免疫原性外來基因DNA的產生(Production of Immunogenic Foreign Gene DNA)
能夠被融合至病毒基因的免疫原性外來基因DNA(它是桿狀病毒轉移載體的組份之一)可藉由根據編碼一具有被揭露於此說明書之所欲的免疫原性的抗原蛋白之胺基酸序列的聚核苷酸的核酸序列資訊的合成，或者根據該免疫原性外來基因的核酸序列資訊來直接地合成對應於該免疫原性外來基因之編碼區域的核酸序列的DNA(化學DNA合成法)而被容易地產生或被獲得。一般的基因工程技術可被用於此產生(參見，例如，“Molecular Cloning”2d Ed,Cold
Spring Harbor Lab.Press(1989)；Zoku Seikagaku Jikken Kouza,“Idenshi Kenkyuho I,II,III”,edited by the Japanese Biochemistry Society,1986)。
用於合成DNA的方法的實例包括化學合成方法，諸如磷酸三酯法(phosphate triester method)和磷酸醯胺法(phosphate amidite method)(J.Am.Chem.Soc.,89,4801(1967)；ibid.,91,3350(1969)；Science,150,178(1968)；Tetrahedron Lett.,22,1859(1981)；ibid.,24,245(1983))以及它們的組合方法。該DNA亦可藉由亞磷醯胺法(phosphoramidite method)或三酯法(triester method)而被化學地合成，或者藉由使用一商業上可獲得的自動寡核苷酸合成儀(automatic oligonucleotide synthesizer)而被合成。一雙股片段可藉由合成一互補股(complementary strand)並且在適當的條件下將該互補股與一化學地合成的單股黏合，或者使用一DNA聚合酶將該互補股與適當的引子序列添加至一經化學地合成的單股而被獲得。
在本發明中所產生的免疫原性外來基因DNA的特定實例包括：包含有一編碼一瘧疾抗原蛋白之胺基酸序列的DNA序列，以及一編碼一流行性感冒病毒抗原蛋白之胺基酸序列的DNA序列的DNA。
被使用在本發明中的DNA不被限制於一編碼一具有免疫原性的抗原蛋白之多肽的胺基酸序列的全長DNA序列，並且可以是一編碼它的一部分序列的DNA序列，只要由該DNA序列所編碼之胺基酸序列的蛋白質具有免疫原性。
被使用在本發明中的免疫原性外來基因的DNA不被限制於具有該一特定DNA序列的DNA分子，並且可以是具有一藉由適當地選擇用於各個胺基酸殘基的密碼子而被產生之DNA序列的DNA分子。密碼子的選擇可依據一標準方法(例如，藉由考慮在所使用的宿主中之密碼子使用的頻率)而被作出(Nucleic Acids Res.,9,43(1981))。
被使用在本發明中的免疫原性外來基因的DNA可藉由基因工程技術(gene engineering techniques)而被產生，更特別地是藉由依據一標準方法而從一表現一免疫原性外來基因的DNA的適合來源來製備一cDNA存庫(cDNA library)，並且使用一針對被表現之產物的適合探針或抗體(它對該免疫原性外來基因有專一性)而從該存庫選出一所欲的選殖株[參見，例如，Proc.Natl.Acad.Sci.,USA.,78,6613(1981)；Science,222,778(1983)]。
基因體DNA來源的實例包括各種不同的細胞、組織以及衍生自它們的經培養的細胞，它們表現該免疫原性外來基因的DNA。被感染以瘧疾寄生蟲之紅血球的萃取物，以及被感染以流行性感冒病毒之細胞的萃取物是特別較佳的。來自於該來源的總DNA和RNA的萃取與分離、mRNA的分離與純化，以及cDNA的產生和選殖可依據標準方法而被執行。
如上所述，該免疫原性外來基因的DNA可藉由使用各個免疫原的cDNA存庫(藉由萃取、分離以及純化來自於上面所描述之萃取物的免疫原性組織或細胞的mRNA而被製
備)而被產生。該免疫原性外來基因的DNA亦可藉由使用一噬菌體存庫[藉由萃取各個免疫原的mRNA、將聚A(poly A)添加至該RNA、收集經添加聚A的RNA(poly A－added RNA)、使用一反轉錄酶(reverse transcriptase)來產生cDNA、將限制酶位址添加至該cDNA的兩端，以及將該cDNA併入至一噬菌體內而被製備]而被產生。
從該cDNA存庫篩選免疫原性外來基因DNA的方法未被特別地限制，並且可依據一通常的方法而被執行。該等方法的特定實例包括一種藉由使用一針對由該cDNA所生成之蛋白質的專一性抗體(例如，抗－瘧疾抗體、抗－流行性感冒病毒抗體等)的免疫篩選(immunological screening)來選出一對應的cDNA選殖株的方法；一種使用一選擇性地結合至標的DNA序列之探針的溶菌斑雜交法(plaque hybridization method)；一種菌落雜交法(colony hybridization method)；以及它們的組合。
被使用在該等雜交法中的探針通常是一種根據關於免疫原性外來基因的DNA序列的資訊而被化學地合成的DNA片段。已被獲得之免疫原性外來基因的DNA序列或它的片段亦可有利地被用來作為探針。根據關於免疫原性外來基因的DNA序列資訊而被設計的一訊息引子以及一反訊息引子亦可被用來作為用於篩選的探針。
被用來作為探針的DNA(核苷酸)是一對應於一免疫原性外來基因的DNA序列的部分DNA(核苷酸)。該DNA(核苷酸)具有一至少15個連續的DNA，較佳地至少20個連續的
DNA，以及更佳地至少30個連續的DNA序列。一用於產生如上所描述之DNA的陽性選殖株(positive clone)本身亦可被用來作為探針。
為了獲得免疫原性外來基因的DNA，一藉由PCR的DNA/RNA擴增法(Science,230,1350(1985))被較佳地使用。特別地，當一全長cDNA很難從存庫被獲得時，RACE法[cDNA末端的快速擴增(Rapid amplification of cDNA ends)；Jikken Igaku 12(6),35(1994)][特別是5’－RACE法(M.A.Frohman,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA.,8,8998(1988))]被較佳地使用。
被用於PCR的引子可根據免疫原性外來基因的DNA序列資訊而被設計，並且依據標準方法而被合成。作為該等引子，被添加至一載體質體(具有免疫原性外來基因的DNA被併入在其中)的兩端的DNA部分(SP6啟動子/引子以及T7終止子/引子)亦可被使用，如同在下面的實施例中所描述的。
藉由PCR而被擴增之DNA/RNA片段的分離/純化可依據標準方法(例如，藉由凝膠電泳)而被執行。
由此所得到的免疫原性外來基因的DNA或它的各種不同的DNA片段之DNA序列可依據標準方法[例如，藉由雙脫氧法(dideoxy method)(Proc.Natl.Acad.Sci.,USA.,74,5463(1977))或馬克薩姆－吉爾伯特法(Maxam－Gilbert method)(Methods in Enzymology,65,499(1980))]，或者藉由簡單地使用一商業上可獲得的定序套組而被決定。
編碼一種能夠是病毒顆粒之一組份的蛋白質之胺基酸的基因可以是任一種在標的細胞中可與一如上所述之免疫原性外來基因一起編碼一被形成為一融合蛋白質的蛋白質並且在昆蟲細胞中可被表現有如一能夠是病毒顆粒之一組份的蛋白質的基因。
編碼一能夠是病毒顆粒之一組份的蛋白質之胺基酸的基因的實例包括gp64蛋白[GenBank寄存編號(GenBank Accession No.)L22858]、水泡性口炎病毒糖蛋白G(vesicular stomatitis virus glycoprotein G)(VSVG：GenBank寄存編號J02428)、疱疹單純型病毒糖蛋白(herpes simplex virus glycoprotein)(KOS：GenBank寄存編號K01760)、第I型人類免疫缺乏病毒gp120(human immunodeficiency virus type gp120)(GenBank寄存編號U47783)、人類呼吸道融合性病毒膜糖蛋白(human respiratory syncytial virus membrane glycoprotein)(GenBank寄存編號M86651)、A型流行性感冒病毒血球凝集素蛋白(influenza A virus hemagglutinin protein)(GenBank寄存編號U38242)的基因，以及與桿狀病毒緊密地有關的病毒之外套蛋白(envelope proteins)的基因。在本發明中，被描述於下面實施例中的gp64基因可被較佳地使用。
編碼一能夠是病毒顆粒之一組份的蛋白質之胺基酸的基因的DNA可藉由根據編碼該基因(編碼能夠是病毒顆粒之一組份的標的蛋白質的胺基酸)之多肽的胺基酸序列之聚核苷酸的核酸序列資訊的合成；或者如同在產生該免疫
原性外來基因的DNA的情況，藉由根據該基因(編碼能夠是病毒顆粒之一組份的蛋白質之胺基酸)的胺基酸序列資訊來直接地合成對應於編碼該胺基酸序列之核苷酸序列的DNA(化學性DNA合成)而被容易地產生或獲得。
對應於編碼一能夠是病毒顆粒之一組份的蛋白質之胺基酸的核酸序列的DNA序列不限於一全長編碼區域，並且可以是含有它的一部分DNA序列的DNA。
如同在產生免疫原性外來基因的DNA分子的情況，編碼一能夠是病毒顆粒之一組份的蛋白質之胺基酸的基因的DNA可藉由一般的基因工程技術[參見，例如，Molecular Cloning 2d Ed,Cold Spring Harbor Lab.Press(1989)；Zoku Seikagaku Jikken Kouza,“Idenshi Kenkyuho I,II,III”,edited by the Japanese Biochemistry Society,1986]而被產生。
在本發明中，商業上可獲得的載體質體[控制隨後所描述的免疫原性外來基因之表現的啟動子的一部分已被併入於其中，並且一編碼一能夠是病毒顆粒之一組份的蛋白質之胺基酸的(部分)基因已被導入]亦可被使用。
脊椎動物啟動子(Vertebrate Promoters)
被使用在本發明中之脊椎動物啟動子(在脊椎動物細胞中能夠起作用的啟動子)(它是轉移載體的組份之一)的實例包括哺乳動物啟動子(Mammalian Promoters)以及鳥類啟動子(avian promoters)。
哺乳動物啟動子
被使用在本發明中之哺乳動物啟動子(在哺乳動物細胞中能夠起作用的啟動子)(它是轉移載體的組份之一)的實例包括細胞巨大病毒啟動子(cytomegalovirus promoters)、SV40啟動子、反轉錄病毒啟動子(retrovirus promoters)、金屬硫蛋白啟動子(metallothionein promoters)、熱休克蛋白啟動子(heat shock protein promoters)、CAG啟動子、延長因子1α啟動子(elongation factor 1α promoters)、肌動蛋白啟動子(actin promoters)、泛素啟動子(ubiquitin promoters)、白蛋白啟動子(albumin promoters)，以及MHC啟動子。
鳥類啟動子
鳥類啟動子的實例包括β肌動蛋白啟動子(β actin promoters)、熱休克蛋白啟動子、延長因子啟動子、泛素啟動子，以及白蛋白啟動子。
桿狀病毒啟動子
被使用在本發明中之桿狀病毒啟動子(它是桿狀病毒轉移載體的組份之一)的實例包括多角體蛋白啟動子(polyhedrin promoter)、p10啟動子、ie1啟動子、p35啟動子、vp39啟動子，以及gp64啟動子。
重組型轉移載體的產生
本發明是有關於一種具有一結構[在昆蟲細胞以及脊椎動物細胞(特別是哺乳動物細胞)這兩者中能夠表現所欲的免疫原性外來基因作為一抗原蛋白]的新穎轉移載體。在本發明中所產生的新穎轉移載體具有一結構，在該結構中一編碼所欲免疫原性蛋白質之胺基酸序列的DNA序列以及
一編碼一能夠是病毒顆粒之一組份的蛋白質之胺基酸序列的DNA序列被連接在經連接之啟動子[包含有一個脊椎動物啟動子(特別是一個哺乳動物啟動子)以及一個桿狀病毒啟動子]的下游處。含有該二啟動子[亦即，一個脊椎動物啟動子(特別是一個哺乳動物啟動子)以及一個桿狀病毒啟動子]之DNA序列的DNA區域可直接地被彼此相互連接，或者一插入DNA序列(intervening DNA sequence)可存在於該二啟動子的DNA序列之間[然而，設若該二啟動子在昆蟲細胞中以及在脊椎動物細胞(並且特別是哺乳動物細胞)中應該具有啟動子活性]。該啟動子區域具有一結構，藉此彼此相互連接的一脊椎動物啟動子(特別是一哺乳動物啟動子)以及一桿狀病毒啟動子這兩者之中的任一者可被設置更接近於要被表現的基因。在隨後所描述的實施例中，一桿狀病毒啟動子要比一哺乳動物啟動子被設置更接近於要被表現的基因。
在上面的結構中，該融合基因(含有一編碼一能夠是病毒顆粒之一組份的蛋白質之基因以及一所欲的免疫原性外來基因)的DNA序列可以是這兩個基因被直接地彼此相互連接，或者一插入DNA序列是存在於該等基因之間[然而，設若必須不會造成下游基因以及上游基因的一個架構位移(frameshift)]。較佳地，一具有所欲的免疫原性之外來基因的蛋白質的抗原－呈現領域(antigen－presenting domain)被融合至一能夠是病毒顆粒之一組份的蛋白質。因此，一具有所欲的免疫原性之外來基因的蛋白質不應該從該能夠是病
毒顆粒之一組份的蛋白質中被切除，而應該呈一與其融合的形式來被使用。
一含有這兩個基因的融合基因可被事先製備，並且接著被併入至該載體內。另擇地，該等基因中的一者首先可被併入至該載體內並且接著另一者可被併入至該載體內，俾以在該載體中形成一融合基因。
為了產生該一轉移載體，已具有本發明之轉移載體的某些必要組份(essential components)[亦即，一含有一脊椎動物啟動子(特別是一哺乳動物啟動子)以及一桿狀病毒啟動子的啟動子區域，以及一編碼一能夠是病毒顆粒之一組份的蛋白質之胺基酸序列的基因區域]之商業上可獲得的表現載體可被使用，並且被需要的組份可藉由下列方式而被插入：藉由以限制酶來選擇性地切割此一商業上可獲得的表現載體並且併入其他啟動子，俾以將一經融合的DNA序列(含有一具有所欲的免疫原性之外來基因以及一編碼一能夠是病毒顆粒之一組份的蛋白質之胺基酸序列的基因)插入至該載體的選殖區域中，或者藉由將一具有所欲的免疫原性之外來基因插入至一編碼一能夠是病毒顆粒之一組份的蛋白質之胺基酸序列的基因(已被併入在一質體中)的DNA區域的N端側(N terminus side)。
在本發明中，具有一種在昆蟲細胞以及脊椎動物細胞(特別是哺乳動物細胞)這兩者中能夠表現一具有所欲免疫原性之外來蛋白質作為一抗原蛋白的結構的質體載體可藉由使用一種商業上可獲得的質體(已具有它的一部分結構)
而被產生。一個在脊椎動物細胞中用於以酵素來切割融合蛋白質之肽的胺基酸序列可插入。在本發明的轉移載體中，一用於在脊椎動物細胞(特別是哺乳動物細胞)中增加轉錄活性(transcription activity)的增強子(enhancer)可被設置在該二啟動子的上游處，或者一編碼一用於促進被表現之蛋白質出自於宿主細胞的細胞外分泌(extracellular secretion)的訊號肽(signal peptide)之胺基酸序列的DNA序列可被結合至要被融合以及被表現的基因。為了終止轉錄，一脊椎動物終止子區域(terminator region)(它在脊椎動物細胞中是有效的)，諸如一兔子β球蛋白終止子，可被設置在要被融合以及被表現之基因的下游處。
一種能夠表現一融合基因(含有一在桿狀病毒顆粒中能夠表現所欲之免疫原性的免疫原性外來基因以及一編碼一能夠是病毒顆粒之一組份的蛋白質之胺基酸序列的基因)的轉移載體可藉此而被產生。
依據本發明的轉移載體以及用於產生它的方法的特定實例是如隨後所描述的實施例中所顯示的。更特別地，具有一結構[其中一由一細胞巨大病毒(CMV)啟動子被修飾而來作為一脊椎動物啟動子(特別是一哺乳動物啟動子)的CAG啟動子，以及一作為一桿狀病毒啟動子的多角體蛋白(polh)啟動子、vp39啟動子或gp64啟動子被彼此相互連接，並且一含有一流行性感冒病毒抗原基因或瘧疾抗原基因作為一外來基因以及一gp64抗原基因作為一編碼一能夠是病毒顆粒之一組份的蛋白質之胺基酸序列的基因之經融合的
DNA序列被插入]的轉移載體可被描述如下作為實例：pCAP－PfCSP、pCAP－PfCSP/272、pCAP－PfCSP/467、pCAP－PfCSP(A361E)、pCAP－PfCSP(A361E)/272、pCAP－PfCSP(A361E)/467、pCAP－PfCSP－76、pCAP－PfCSP－76/467、pCAP－PfCSP＋209、pCAP－PfCSP＋209/467、pCAP－PfCSP＋76/209、pCAP－PfCSP＋76/209/467、pCAP－HA1/Anhui、pCAP－HA1/Anhui/272、pCAP－HA1/Anhui/467、pCAP－HA1/Vietnam、pCAP－HA1/Vietnam/51、pCAP－HA1/Vietnam/101、pCAP－HA1/Vietnam/154、pCAP－HA1/Vietnam/201、pCAP－HA1/Vietnam/272、pCAP－HA1/Vietnam/467、pCAP－AH/345、pCAP－AH/345/467、pCAP－AH/410、pCAP－AH/410/467、pCAP－AH/473、pCAP－AH/473/467、pCAP－AH/520、pCAP－AH/520/467、pCAP－VN/346、pCAP－VN/346/467、pCAP－VN/410、pCAP－VN/410/467、pCAP－VN/473、pCAP－VN/473/467、pCAP－VN/520、pCAP－VN/520/467、pCAP－CO/full、pCAP－CO/full/467、pCAP－CO/19、pCAP－CO/19/467、pCAP－CO/76、pCAP－CO/76/467、pCAP－CO/205、pCAP－CO/205/467、pCA39－HA1/Anhui、pCA64－HA1/Anhui、pCA39－PfCSP(A361E)、pCA64－PfCSP(A361E)、pCAP－CO/full/VSV、pCAP－CO/19/VSV、pCAP－CO/76/VSV、pCAP－CO/205/VSV、pDual－Pfs25－PfCSP－gp64以及
pDual－PfMSP1－PfCSP－gp64。
本發明提供一種產生一重組型桿狀病毒的方法，其包含有產生一具有一結構[其中一含有至少一編碼一能夠是病毒顆粒之一組份的蛋白質之基因，以及至少一免疫原性外來基因的融合基因被併入至一由兩個被連接之啟動子(亦即，一個脊椎動物啟動子以及一個桿狀病毒啟動子)所構成的雙重啟動子的下游處]之轉移載體的步驟，以及將該轉移載體和一桿狀病毒DNA共轉染至一宿主細胞中並且分離該重組型桿狀病毒的步驟。
在上面產生該重組型桿狀病毒的過程中，將所欲的重組型DNA(轉移載體)導入至宿主細胞內的方法以及因此轉型的方法未被特別地限制。在此領域中是為熟知的並且經常被使用中的各種方法可被使用。例如，一般的遺傳重組技術[例如，Science,224,1431(1984)；Biochem.Biophys.Res.Comm.,130,692(1985)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80,5990(1983)]可被用來製備該重組型桿狀病毒。重組型DNA(轉移載體)可參照Ohno et al.,“Tanpaku Jikken Protocol 1 Functional Analysis,Saibo Kogaku Bessatsu,Jikken Protocol Series,1997,Shujun－sha”而被表現以及被產生。被用於昆蟲細胞的處理(handling)、基因重組以及共轉染的一般性方法可以是相同於在昆蟲細胞中產生一重組型病毒所熟知的方法(BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS：A LABORATORY MANUAL,Oxford University Press,1994)。
所形成的重組型桿狀病毒可依據標準方法而被培養。本發明之一外來基因的DNA(具有所欲的免疫原性)以及一編碼能夠是病毒顆粒之一組份的蛋白質之胺基酸序列的DNA的一融合產物(被表現的產物)是藉由培養該桿狀病毒而被表現以及被生成[被累積(accumulated)以及被分泌(secreted)]在昆蟲細胞的細胞膜內側、細胞膜外側或細胞膜上。
作為一被用於培養的培養基，一般所使用的各種培養基可依據所使用的宿主細胞而被選擇性地使用。培養可在適合宿主細胞生長的條件下被執行。
更特別地，產生重組型桿狀病毒的方法包含有製備一要與一上面所產生的轉移載體一起被進行同源性重組之桿狀病毒DNA的步驟，以及將該轉移載體和該桿狀病毒DNA共轉染至作為宿主細胞的昆蟲細胞[諸如衍生自秋行軍蟲(Spodoptera frugiperda
)的Sf9細胞和Sf21細胞，以及衍生自粉斑夜蛾(Trichoplusia ni
)的Tn5細胞(High Five細胞)]中的步驟。
由此所產生之要與該轉移載體被進行的同源性重組之桿狀病毒DNA可以是一野生型、突變體或重組型桿狀病毒DNA。該桿狀病毒DNA可提高它與本發明之轉移載體的同源性重組的機率，只要它具有一DNA結構是同源於桿狀病毒－衍生的DNA(含有雙重啟動子區域的DNA，以及一藉由一免疫原性外來基因與一編碼一能夠是病毒顆粒之一組份的蛋白質之基因的融合而被獲得的融合基因的DNA)。
為了誘發同源性重組，轉移載體相對於桿狀病毒DNA的混合比例(以重量計)較佳地是大約1：1至大約10：1。
在同時導入昆蟲細胞內的共轉染步驟之後，該等細胞被培養，並且病毒溶菌斑是從培養物上清液(culture supernatant)而被獲得以及接著被散浮在一培養基中。病毒是藉由渦動(vortex)而從瓊脂被洗提出並且被離心以生成一含有重組型病毒的溶液。
在上面的過程中，商業上可獲得的產品可被用來作為桿狀病毒DNA。例如，BacVector－1000 DNA以及BacVeetor－2000 DNA(由Novagen所提供)[其中多角體蛋白基因已從AcNPV被移除]可被使用。
針對同源性重組，將所得到的轉移載體以及桿狀病毒DNA的共轉染至昆蟲細胞中可使用一如上所述之商業上可獲得的載體轉染套組(BacVector Transfection Kits，由Novagen所提供)依據與該載體轉染套組一起被包裝的操作指南(instructions)而被執行。因此，所得到的轉移載體可與該桿狀病毒DNA一起被共轉染至昆蟲細胞(諸如Sf9細胞)中以生成一重組型桿狀病毒。
在本發明中，依據上面產生一重組型桿狀病毒的方法，一轉移載體(它是下列的任一者：pCAP－PfCSP、pCAP－PfCSP/272、pCAP－PfCSP/467、pCAP－PfCSP(A361E)、pCAP－PfCSP(A361E)/272、pCAP－PfCSP(A361E)/467、pCAP－PfCSP－76、pCAP－PfCSP－76/467、pCAP－PfCSP＋209、
pCAP－PfCSP＋209/467、pCAP－PfCSP＋76/209、pCAP－PfCSP＋76/209/467、pCAP－HA1/Anhui、pCAP－HA1/Anhui/272、pCAP－HA1/Anhui/467、pCAP－HA1/Vietnam、pCAP－HA1/Vietnam/51、pCAP－HA1/Vietnam/101、pCAP－HA1/Vietnam/154、pCAP－HA1/Vietnam/201、pCAP－HA1/Vietnam/272、pCAP－HA1/Vietnam/467、pCAP－AH/345、pCAP－AH/345/467、pCAP－AH/410、pCAP－AH/410/467、pCAP－AH/473、pCAP－AH/473/467、pCAP－AH/520、pCAP－AH/520/467、pCAP－VN/346、pCAP－VN/346/467、pCAP－VN/410、pCAP－VN/410/467、pCAP－VN/473、pCAP－VN/473/467、pCAP－VN/520、pCAP－VN/520/467、pCAP－CO/full、pCAP－CO/full/467、pCAP－CO/19、pCAP－CO/19/467、pCAP－CO/76、pCAP－CO/76/467、pCAP－CO/205、pCAP－CO/205/467、pCA39－HA1/Anhui、pCA64－HA1/Anhui、pCA39－PfCSP(A361E)、pCA64－PfCSP(A361E)、pCAP－CO/full/VSV、pCAP－CO/19/VSV、pCAP－CO/76/VSV、pCAP－CO/205/VSV、pDual－Pfs25－PfCSP－gp64以及pDual－PfMSP1－PfCSP－gp64)，以及一桿狀病毒DNA可被共轉染至Sf9昆蟲細胞中以生成一為下列任一者的重組型桿狀病毒：AcNPV－CAP－PfCSP、AcNPV－CAP－PfCSP/272、AcNPV－CAP－PfCSP/467、AcNPV－CAP－PfCSP(A361E)、AcNPV－CAP－PfCSP(A361E)/272、
AcNPV－CAP－PfCSP(A361E)/467、AcNPV－CAP－PfCSP－76、AcNPV－CAP－PfCSP－76/467、AcNPV－CAP－PfCSP＋209、AcNPV－CAP－PfCSP＋209/467、AcNPV－CAP－PfCSP＋76/209、AcNPV－CAP－PfCSP＋76/209/467、AcNPV－CAP－HA1/Anhui、AcNPV－CAP－HA1/Anhui/272、AcNPV－CAP－HA1/Anhui/467、AcNPV－CAP－HA1/Vietnam、AcNPV－CAP－HA1/Vietnam/51、AcNPV－CAP－HA1/Vietnam/101、AcNPV－CAP－HA1/Vietnam/154、AcNPV－CAP－HA1/Vietnam/201、AcNPV－CAP－HA1/Vietnam/272、AcNPV－CAP－HA1/Vietnam/467、AcNPV－CAP－AH/345、AcNPV－CAP－AH/345/467、AcNPV－CAP－AH/410、AcNPV－CAP－AH/410/467、AcNPV－CAP－AH/473、AcNPV－CAP－AH/473/467、AcNPV－CAP－AH/520、AcNPV－CAP－AH/520/467、AcNPV－CAP－VN/346、AcNPV－CAP－VN/346/467、AcNPV－CAP－VN/410、AcNPV－CAP－VN/410/467、AcNPV－CAP－VN/473、AcNPV－CAP－VN/473/467、AcNPV－CAP－VN/520、AcNPV－CAP－VN/520/467、AcNPV－CAP－CO/full、AcNPV－CAP－CO/full/467、AcNPV－CAP－CO/19、AcNPV－CAP－CO/19/467、AcNPV－CAP－CO/76、AcNPV－CAP－CO/76/467、AcNPV－CAP－CO/205、AcNPV－CAP－CO/205/467、AcNPV－CA39－HA1/Anhui、
AcNPV－CA64－HA1/Anhui、AcNPV－CA39－PfCSP(A361E)、AcNPV－CA64－PfCSP(A361E)、AcNPV－CAP－CO/full/VSV、AcNPV－CAP－CO/19/VSV、AcNPV－CAP－CO/76/VSV、AcNPV－CAP－CO/205/VSV、AcNPV－Dual－Pfs25－PfCSP－gp64以及AcNPV－Dual－PfMSP1－PfCSP－gp64。
除了上面產生一重組型桿狀病毒的方法之外，其他產生一重組型桿狀病毒的方法包括，例如，一種使用一轉位子(transposon)作為一噬粒(phagemid)[桿粒(bacmid)](具有完整的桿狀病毒基因體被併入在其中)以有效率地將一外來基因插入至大腸桿菌(Escherichia coli
)中的方法。
依據此方法，一帶有一病毒基因的桿粒(bacmid)從細菌細胞被萃取出並且被轉染至昆蟲細胞內以藉此容易地產生並且收集一重組型桿狀病毒。
藉由上面產生一重組型桿狀病毒的方法而被獲得的本發明之重組型桿狀病毒的純化可藉由使用已知的病毒純化方法而被執行。
關於重組型桿狀病毒的純化，例如，藉由上面產生一重組型桿狀病毒的方法而被獲得的0.5至1.0 mL的一原液病毒(stock virus)被接種至昆蟲細胞(諸如Sf9細胞)(1×107
細胞/10公分碟)中，培養物上清液是在感染之後的數天被收集，並且一藉由離心而被獲得的病毒沉澱丸(virus pellet)被散浮在一緩衝液(諸如PBS)中。所形成的懸浮液被進行一為10至60%的蔗糖梯度(sucrose gradient)，並且接著被離心(25,000 rpm，60分鐘，4℃)俾以收集一病毒帶(virus band)。
所收集到的病毒被進一步散浮在PBS中，隨後地被離心(在如上的相同條件下)，並且所形成的經純化的重組型病毒沉澱丸在4℃下被儲存在一緩衝液(諸如PBS)中。
上面所形成的經純化的重組型病毒的感染效價(infectivity titer)可藉由使用昆蟲細胞(諸如Sf9細胞)的溶菌斑分析(BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS：A LABORATORY MANUAL,Oxford University Press,1994)而被測量。
在實施例中所描述的重組型病毒中，桿狀病毒蛋白gp64的N端被曝露在顆粒的外側，而它的C端是在顆粒的內側。因此，若由一外來基因所編碼之具有所欲的免疫原性的蛋白質被融合至gp64的N端，它的整體被暴露於在昆蟲細胞中的病毒蛋白顆粒的外側而有如該病毒顆粒的一組份，並且因此抗原被更容易地呈現(該抗原適合用來作為本發明的疫苗配方)。
本發明的重組型桿狀病毒(它是本發明的藥學組成物的一活性成份)可藉由被顯示於上面(2)中的遺傳工程技術而被獲得。
本發明的藥學組成物基本上含有一重組型桿狀病毒(藉由一桿狀病毒DNA和一被建構之轉移載體的同源性重組而被獲得)作為活性成份，藉此一融合基因(藉由將本發明的一免疫原性外來基因融合至一編碼一能夠是病毒顆粒之
一組份的蛋白質之胺基酸序列的基因而被獲得)可在昆蟲細胞以及脊椎動物細胞[特別是哺乳動物(包括人類)的細胞]中被表現。
本發明特別地提供一種包含有一特定重組型桿狀病毒作為一活性成份的藥學組成物，該重組型桿狀病毒是下列的任一者：AcNPV－CAP－PfCSP、AcNPV－CAP－PfCSP/272、AcNPV－CAP－PfCSP/467、AcNPV－CAP－PfCSP(A361E)、AcNPV－CAP－PfCSP(A361E)/272、AcNPV－CAP－PfCSP(A361E)/467、AcNPV－CAP－PfCSP－76、AcNPV－CAP－PfCSP－76/467、AcNPV－CAP－PfCSP＋209、AcNPV－CAP－PfCSP＋209/467、AcNPV－CAP－PfCSP＋76/209、AcNPV－CAP－PfCSP＋76/209/467、AcNPV－CAP－HA1/Anhui、AcNPV－CAP－HA1/Anhui/272、AcNPV－CAP－HA1/Anhui/467、AcNPV－CAP－HA1/Vietnam、AcNPV－CAP－HA1/Vietnam/51、AcNPV－CAP－HA1/Vietnam/101、AcNPV－CAP－HA1/Vietnam/154、AcNPV－CAP－HA1/Vietnam/201、AcNPV－CAP－HA1/Vietnam/272、AcNPV－CAP－HA1/Vietnam/467、AcNPV－CAP－AH/345、AcNPV－CAP－AH/345/467、AcNPV－CAP－AH/410、AcNPV－CAP－AH/410/467、AcNPV－CAP－AH/473、AcNPV－CAP－AH/473/467、AcNPV－CAP－AH/520、AcNPV－CAP－AH/520/467、AcNPV－CAP－VN/346、
AcNPV－CAP－VN/346/467、AcNPV－CAP－VN/410、AcNPV－CAP－VN/410/467、AcNPV－CAP－VN/473、AcNPV－CAP－VN/473/467、AcNPV－CAP－VN/520、AcNPV－CAP－VN/520/467、AcNPV－CAP－CO/full、AcNPV－CAP－CO/full/467、AcNPV－CAP－CO/19、AcNPV－CAP－CO/19/467、AcNPV－CAP－CO/76、AcNPV－CAP－CO/76/467、AcNPV－CAP－CO/205、AcNPV－CAP－CO/205/467、AcNPV－CA39－HA1/Anhui、AcNPV－CA64－HA1/Anhui、AcNPV－CA39－PfCSP(A361E)、AcNPV－CA64－PfCSP(A361E)、AcNPV－CAP－CO/full/VSV、AcNPV－CAP－CO/19/VSV、AcNPV－CAP－CO/76/VSV、AcNPV－CAP－CO/205/VSV、AcNPV－Dual－PfS25－PfCSP－gp64以及AcNPV－Dual－PfMSP1－PfCSP－gp64。
被用來作為本發明之藥學組成物的一活性成份之本發明的重組型桿狀病毒[它是下列的任一者：AcNPV－CAP－PfCSP、AcNPV－CAP－PfCSP/272、AcNPV－CAP－PfCSP/467、AcNPV－CAP－PfCSP(A361E)、AcNPV－CAP－PfCSP(A361E)/272、AcNPV－CAP－PfCSP(A361E)/467、AcNPV－CAP－PfCSP－76、AcNPV－CAP－PfCSP－76/467、AcNPV－CAP－PfCSP＋209、AcNPV－CAP－PfCSP＋209/467、AcNPV－CAP－PfCSP＋76/209、AcNPV－CAP－PfCSP＋76/209/467、AcNPV－CAP－HA1/Anhui、AcNPV－CAP－HA1/Anhui/272、AcNPV－CAP－HA1/Anhui/467、AcNPV－CAP－HA1/Vietnam、
AcNPV－CAP－HA1/Vietnam/51、AcNPV－CAP－HA1/Vietnam/101、AcNPV－CAP－HA1/Vietnam/154、AcNPV－CAP－HA1/Vietnam/201、AcNPV－CAP－HA1/Vietnam/272、AcNPV－CAP－HA1/Vietnam/467、AcNPV－CAP－AH/345、AcNPV－CAP－AH/345/467、AcNPV－CAP－AH/410、AcNPV－CAP－AH/410/467、AcNPV－CAP－AH/473、AcNPV－CAP－AH/473/467、AcNPV－CAP－AH/520、AcNPV－CAP－AH/520/467、AcNPV－CAP－VN/346、AcNPV－CAP－VN/346/467、AcNPV－CAP－VN/410、AcNPV－CAP－VN/410/467、AcNPV－CAP－VN/473、AcNPV－CAP－VN/473/467、AcNPV－CAP－VN/520、AcNPV－CAP－VN/520/467、AcNPV－CAP－CO/full、AcNPV－CAP－CO/full/467、AcNPV－CAP－CO/19、AcNPV－CAP－CO/19/467、AcNPV－CAP－CO/76、AcNPV－CAP－CO/76/467、AcNPV－CAP－CO/205、AcNPV－CAP－CO/205/467、AcNPV－CA39－HA1/Anhui、AcNPV－CA64－HA1/Anhui、AcNPV－CA39－PfCSP(A361E)、AcNPV－CA64－PfCSP(A361E)、AcNPV－CAP－CO/full/VSV、AcNPV－CAP－CO/19/VSV、AcNPV－CAP－CO/76/VSV、AcNPV－CAP－CO/205/VSV、AcNPV－Dual－Pfs25－PfCSP－gp64以及AcNPV－Dual－PfMSP1－PfCSP－gp64]具有提高對抗一感染性抗原的感染－預防效用(infection－preventing effects)以
及降低感染效價的作用。利用此作用與活性，該重組型桿狀病毒可被用於治療與標的細胞以及組織的感染有關聯的疾病。受到該感染所影響之標的細胞的實例包括血球(blood cells)、肝細胞、腎細胞、腦細胞、肺細胞、上皮細胞以及肌肉細胞。包含有該等細胞之組織的實例包括肺臟、肝臟、腎臟、腦、動脈和靜脈、胃、腸、尿道(urethra)、皮膚以及肌肉。
該藥學組成物提高對抗感染性抗原(infectious antigens)的感染－預防效用，例如，瘧疾抗原[諸如瘧疾寄生蟲的孢子體表面抗原(CSP以及TRAP)、裂殖子表面膜蛋白MSP1、被分泌自經感染以瘧疾之紅血球的瘧疾S抗原、存在於經感染以瘧疾的紅血球的節中之PfEMP1蛋白、SERA蛋白、TRAMP蛋白、AMA1蛋白，以及已知作為一傳導－阻斷抗原(transmission－blocking antigen)的Pfs25]；以及流行性感冒抗原[諸如HA抗原、NA抗原、M2抗原以及NP抗原]，並且減低感染效價(例如，病毒感染效價)，藉此相較於未被投藥本發明之藥學組成物的群組會增加哺乳動物(包括人類)的存活期(survival period)以及存活率(survival rate)。因此，該藥學組成物特別地可用於作為一種用於瘧疾以及流行性感冒病毒感染的預防或治療劑。
本發明的藥學組成物具有提高對抗感染性抗原之感染－預防效用以及減低感染效價的作用，並且因而可用於作為一種用於傳染病[由病原(諸如流行性感冒病毒和瘧疾)所造成]以及它們的併發症(complications)的預防或治療劑。
藉由使用一種對於非人類脊椎動物有免疫原性的基因作為轉移載體的一免疫原性外來基因，俾以獲得一被用來作為本發明之藥學組成物的一活性成份的重組型桿狀病毒(例如，一雞流行性感冒疫苗可被製備)，其具有提高對抗感染性抗原的感染－預防效用(infection－preventing effect)以及減低感染效價的作用。藉由利用此作用和活性，該藥學組成物可被用於治療與標的細胞以及組織的感染有關聯的疾病。
本發明的藥學組成物可被製備有如一種含有一藥學有效數量(pharmaceutically effective amount)之本發明的重組型桿狀病毒以及一藥學上可接受之載劑的組成物。
本發明的重組型桿狀病毒在脊椎動物[特別是哺乳動物(包括人類)，或哺乳動物細胞]中的感染－預防效用可被提供，例如，藉由對脊椎動物[特別是哺乳動物(包括人類)]投藥[藉由肌肉內的(intramuscular)、皮下的(subcutaneous)、皮內的(intracutaneous)、腹膜內的(intraperitoneal)、經鼻的或呼吸的途徑]含有本發明之重組型桿狀病毒以及用於藥學投藥之添加物的藥學組成物，並且接著以該含有本發明之重組型桿狀病毒作為一活性成份的藥學組成物來免疫(immunizing)該等脊椎動物數次。本發明之藥學組成物的呼吸投藥(respiratory administration)是特別較佳的。
該感染－預防效用可藉由比較已被免疫以本發明之藥學組成物數次並且接著被感染以一標的病原的脊椎動物[特別是哺乳動物(包括人類)]的存活率與那些未被投藥以
該藥學組成物所具有者而被評估。
被用來作為本發明之藥學組成物的活性成份的重組型桿狀病毒[它是下列的任一者：AcNPV－CAP－PfCSP、AcNPV－CAP－PfCSP/272、AcNPV－CAP－PfCSP/467、AcNPV－CAP－PfCSP(A361E)、AcNPV－CAP－PfCSP(A361E)/272、AcNPV－CAP－PfCSP(A361E)/467、AcNPV－CAP－PfCSP－76、AcNPV－CAP－PfCSP－76/467、AcNPV－CAP－PfCSP＋209、AcNPV－CAP－PfCSP＋209/467、AcNPV－CAP－PfCSP＋76/209、AcNPV－CAP－PfCSP＋76/209/467、AcNPV－CAP－HA1/Anhui、AcNPV－CAP－HA1/Anhui/272、AcNPV－CAP－HA1/Anhui/467、AcNPV－CAP－HA1/Vietnam、AcNPV－CAP－HA1/Vietnam/51、AcNPV－CAP－HA1/Vietnam/101、AcNPV－CAP－HA1/Vietnam/154、AcNPV－CAP－HA1/Vietnam/201、AcNPV－CAP－HA1/Vietnam/272、AcNPV－CAP－HA1/Vietnam/467、AcNPV－CAP－AH/345、AcNPV－CAP－AH/345/467、AcNPV－CAP－AH/410、AcNPV－CAP－AH/410/467、AcNPV－CAP－AH/473、AcNPV－CAP－AH/473/467、AcNPV－CAP－AH/520、AcNPV－CAP－AH/520/467、AcNPV－CAP－VN/346、AcNPV－CAP－VN/346/467、AcNPV－CAP－VN/410、
AcNPV－CAP－VN/410/467、AcNPV－CAP－VN/473、AcNPV－CAP－VN/473/467、AcNPV－CAP－VN/520、AcNPV－CAP－VN/520/467、AcNPV－CAP－CO/full、AcNPV－CAP－CO/full/467、AcNPV－CAP－CO/19、AcNPV－CAP－CO/19/467、AcNPV－CAP－CO/76、AcNPV－CAP－CO/76/467、AcNPV－CAP－CO/205、AcNPV－CAP－CO/205/467、AcNPV－CA39－HA1/Anhui、AcNPV－CA64－HA1/Anhui、AcNPV－CA39－PfCSP(A361E)、AcNPV－CA64－PfCSP(A361E)、AcNPV－CAP－CO/full/VSV、AcNPV－CAP－CO/19/VSV、AcNPV－CAP－CO/76/VSV、AcNPV－CAP－CO/205/VSV、AcNPV－Dual－Pfs25－PfCSP－gp64以及AcNPV－Dual－PfMSP1－PfCSP－gp64]可提高病原感染－預防效用(如在下面實施例中所描述的)，並且藉由將一編碼一能夠是病毒顆粒之一組份的蛋白質之胺基酸序列的基因以及一具有本發明之所欲的免疫原性而能夠減低感染效價的外來基因融合而被獲得的DNA序列的一被表現的融合產物被生成有如從昆蟲細胞中被出芽的病毒顆粒。當本發明的藥學組成物以病毒顆粒的形式被投藥給脊椎動物[特別是哺乳動物(包括人類)]時，所含有之一作為病毒顆粒之一組份的外來抗原蛋白會提升後天性免疫力(acquired immunity)[體液性免疫力(humoral immunity)以及細胞性免疫力(cellular immunity)]，並且再者，作為融合DNA序列之一被表現的產物的抗原蛋白似乎會提升在脊椎動物細胞[特別是哺乳動物(包括人類)的細胞]中的後天性免疫力(體
液性免疫力以及細胞性免疫力)。因此，本發明的重組型桿狀病毒可用作為一種疫苗。
本發明特別地提供一種含有一特定重組型桿狀病毒作為一活性成份的疫苗，該重組型桿狀病毒是下列的任一者：AcNPV－CAP－PfCSP、AcNPV－CAP－PfCSP/272、AcNPV－CAP－PfCSP/467、AcNPV－CAP－PfCSP(A361E)、AcNPV－CAP－PfCSP(A361E)/272、AcNPV－CAP－PfCSP(A361E)/467、AcNPV－CAP－PfCSP－76、AcNPV－CAP－PfCSP－76/467、AcNPV－CAP－PfCSP＋209、AcNPV－CAP－PfCSP＋209/467、AcNPV－CAP－PfCSP＋76/209、AcNPV－CAP－PfCSP＋76/209/467、AcNPV－CAP－HA1/Anhui、AcNPV－CAP－HA1/Anhui/272、AcNPV－CAP－HA1/Anhui/467、AcNPV－CAP－HA1/Vietnam、AcNPV－CAP－HA1/Vietnam/51、AcNPV－CAP－HA1/Vietnam/101、AcNPV－CAP－HA1/Vietnam/154、AcNPV－CAP－HA1/Vietnam/201、AcNPV－CAP－HA1/Vietnam/272、AcNPV－CAP－HA1/Vietnam/467、AcNPV－CAP－AH/345、AcNPV－CAP－AH/345/467、AcNPV－CAP－AH/410、AcNPV－CAP－AH/410/467、AcNPV－CAP－AH/473、AcNPV－CAP－AH/473/467、AcNPV－CAP－AH/520、AcNPV－CAP－AH/520/467、AcNPV－CAP－VN/346、AcNPV－CAP－VN/346/467、AcNPV－CAP－VN/410、
AcNPV－CAP－VN/410/467、AcNPV－CAP－VN/473、AcNPV－CAP－VN/473/467、AcNPV－CAP－VN/520、AcNPV－CAP－VN/520/467、AcNPV－CAP－CO/full、AcNPV－CAP－CO/full/467、AcNPV－CAP－CO/19、AcNPV－CAP－CO/19/467、AcNPV－CAP－CO/76、AcNPV－CAP－CO/76/467、AcNPV－CAP－CO/205、AcNPV－CAP－CO/205/467、AcNPV－CA39－HA1/Anhui、AcNPV－CA64－HA1/Anhui、AcNPV－CA39－PfCSP(A361E)、AcNPV－CA64－PfCSP(A361E)、AcNPV－CAP－CO/full/VSV、AcNPV－CAP－CO/19/VSV、AcNPV－CAP－CO/76/VSV、AcNPV－CAP－CO/205/VSV、AcNPV－Dual－Pfs25－PfCSP－gp64，以及AcNPV－Dual－PfMSP1－PfCSP－gp64。
有如在上面(3)的藥學組成物中，該疫苗提高對抗感染性病原，諸如瘧疾病原[諸如瘧疾寄生蟲的孢子體表面抗原(CSP以及TRAP)、裂殖子表面膜蛋白MSP1、被分泌自經感染以瘧疾之紅血球的瘧疾S抗原、存在於經感染以瘧疾之紅血球的節中的PfEMP1蛋白、SERA蛋白、TRAMP蛋白以及AMA1蛋白]；以及流行性感冒抗原(諸如流行性感冒病毒HA抗原、流行性感冒病毒NA抗原、流行性感冒病毒M2抗原以及流行性感冒病毒NP抗原)]的感染－預防效用；該疫苗亦減低感染效價(例如，病毒感染效價)，藉此相較於未被投藥以本發明的藥學組成物的群組會增加哺乳動物(包括人類)的存活期和存活率。因此，該疫苗特別地可用作為一種
用於瘧疾以及流行性感冒病毒感染的預防或治療劑。
本發明的疫苗提高對抗感染性抗原的感染－預防效用以及減低感染效價，並且因而可用作為一種用於由病原(諸如流行性感冒病毒以及瘧疾)所造成之傳染病或它們的併發症的預防或治療劑。
藉由使用一種對於非人類脊椎動物有免疫原性的基因作為轉移載體的一免疫原性外來基因以獲得一重組型桿狀病毒(被用來作為本發明之藥學組成物的一活性成份)，例如，一種可提高對抗感染性抗原的感染－預防效用並且減低感染效價的雞流行性感冒疫苗可被製備。藉由利用此活性，該疫苗可被用於治療與標的細胞和組織的感染有關聯的疾病。
被用來作為本發明的疫苗之一活性成份的重組型桿狀病毒[它是下列的任一者：AcNPV－CAP－PfCSP、AcNPV－CAP－PfCSP/272、AcNPV－CAP－PfCSP/467、AcNPV－CAP－PfCSP(A361E)、AcNPV－CAP－PfCSP(A361E)/272、AcNPV－CAP－PfCSP(A361E)/467、AcNPV－CAP－PfCSP－76、AcNPV－CAP－PfCSP－76/467、AcNPV－CAP－PfCSP＋209、AcNPV－CAP－PfCSP＋209/467、AcNPV－CAP－PfCSP＋76/209、AcNPV－CAP－PfCSP＋76/209/467、AcNPV－CAP－HA1/Anhui、AcNPV－CAP－HA1/Anhui/272、AcNPV－CAP－HA1/Anhui/467、AcNPV－CAP－HA1/Vietnam、AcNPV－CAP－HA1/Vietnam/51、
AcNPV－CAP－HA1/Vietnam/101、AcNPV－CAP－HA1/Vietnam/154、AcNPV－CAP－HA1/Vietnam/201、AcNPV－CAP－HA1/Vietnam/272、AcNPV－CAP－HA1/Vietnam/467、AcNPV－CAP－AH/345、AcNPV－CAP－AH/345/467、AcNPV－CAP－AH/410、AcNPV－CAP－AH/410/467、AcNPV－CAP－AH/473、AcNPV－CAP－AH/473/467、AcNPV－CAP－AH/520、AcNPV－CAP－AH/520/467、AcNPV－CAP－VN/346、AcNPV－CAP－VN/346/467、AcNPV－CAP－VN/410、AcNPV－CAP－VN/410/467、AcNPV－CAP－VN/473、AcNPV－CAP－VN/473/467、AcNPV－CAP－VN/520、AcNPV－CAP－VN/520/467、AcNPV－CAP－CO/full、AcNPV－CAP－CO/full/467、AcNPV－CAP－CO/19、AcNPV－CAP－CO/19/467、AcNPV－CAP－CO/76、AcNPV－CAP－CO/76/467、AcNPV－CAP－CO/205、AcNPV－CAP－CO/205/467、AcNPV－CA39－HA1/Anhui、AcNPV－CA64－HA1/Anhui、AcNPV－CA39－PfCSP(A361E)、AcNPV－CA64－PfCSP(A361E)、AcNPV－CAP－CO/full/VSV、AcNPV－CAP－CO/19/VSV、AcNPV－CAP－CO/76/VSV、AcNPV－CAP－CO/205/VSV、AcNPV－Dual－Pfs25－PfCSP－gp64以及AcNPV－Dual－PfMSP1－PfCSP－gp64]可提高對抗一感染性抗原的感染－預防效用並且減低感染效價。藉由利用此活性，該重組型桿狀病毒可被用於治療與標的細胞和組織的
感染有關聯的疾病。
受到該感染所影響之標的細胞的實例包括：血球、肝細胞、腎細胞、腦細胞、肺細胞、上皮細胞以及肌肉細胞。含有該等細胞之組織的實例包括：肺臟、肝臟、腎臟、腦、動脈和靜脈、胃、腸、尿道、皮膚以及肌肉組織。
本發明的疫苗可被製備有如一種有如上面(3)的藥學組成物，其含有一藥學有效數量之本發明的重組型桿狀病毒[下列的任一者：AcNPV－CAP－PfCSP、AcNPV－CAP－PfCSP/272、AcNPV－CAP－PfCSP/467、AcNPV－CAP－PfCSP(A361E)、AcNPV－CAP－PfCSP(A361E)/272、AcNPV－CAP－PfCSP(A361E)/467、AcNPV－CAP－PfCSP－76、AcNPV－CAP－PfCSP－76/467、AcNPV－CAP－PfCSP＋209、AcNPV－CAP－PfCSP＋209/467、AcNPV－CAP－PfCSP＋76/209、AcNPV－CAP－PfCSP＋76/209/467、AcNPV－CAP－HA1/Anhui、AcNPV－CAP－HA1/Anhui/272、AcNPV－CAP－HA1/Anhui/467、AcNPV－CAP－HA1/Vietnam、AcNPV－CAP－HA1/Vietnam/51、AcNPV－CAP－HA1/Vietnam/101、AcNPV－CAP－HA1/Vietnam/154、AcNPV－CAP－HA1/Vietnam/201、AcNPV－CAP－HA1/Vietnam/272、AcNPV－CAP－HA1/Vietnam/467、AcNPV－CAP－AH/345、AcNPV－CAP－AH/345/467、AcNPV－CAP－AH/410、
AcNPV－CAP－AH/410/467、AcNPV－CAP－AH/473、AcNPV－CAP－AH/473/467、AcNPV－CAP－AH/520、AcNPV－CAP－AH/520/467、AcNPV－CAP－VN/346、AcNPV－CAP－VN/346/467、AcNPV－CAP－VN/410、AcNPV－CAP－VN/410/467、AcNPV－CAP－VN/473、AcNPV－CAP－VN/473/467、AcNPV－CAP－VN/520、AcNPV－CAP－VN/520/467、AcNPV－CAP－CO/full、AcNPV－CAP－CO/full/467、AcNPV－CAP－CO/19、AcNPV－CAP－CO/19/467、AcNPV－CAP－CO/76、AcNPV－CAP－CO/76/467、AcNPV－CAP－CO/205、AcNPV－CAP－CO/205/467、AcNPV－CA39－HA1/Anhui、AcNPV－CA64－HA1/Anhui、AcNPV－CA39－PfCSP(A361E)、AcNPV－CA64－PfCSP(A361E)、AcNPV－CAP－CO/full/VSV、AcNPV－CAP－CO/19/VSV、AcNPV－CAP－CO/76/VSV、AcNPV－CAP－CO/205/VSV、AcNPV－Dual－PfS25－PfCSP－gp64以及AcNPV－Dual－PfMSP1－PfCSP－gp64]，以及一藥學上可接受之載劑。
該疫苗可依據一標準方法，藉由使用一種有如被使用在上面(3)的藥學組成物中之藥學上可接受的載劑而呈一藥學組成物的形式來被製備。載劑的實例包括生理學上可接受的溶液，諸如滅菌鹽水(sterile saline)以及滅菌緩衝的鹽水(sterile buffered saline)。
該疫苗(該配方在下文中是相同於在該藥學組成物中)可被製備有如一種含有本發明的重組型桿狀病毒[下列的
任一者：AcNPV－CAP－PfCSP、AcNPV－CAP－PfCSP/272、AcNPV－CAP－PfCSP/467、AcNPV－CAP－PfCSP(A361E)、AcNPV－CAP－PfCSP(A361E)/272、AcNPV－CAP－PfCSP(A361E)/467、AcNPV－CAP－PfCSP－76、AcNPV－CAP－PfCSP－76/467、AcNPV－CAP－PfCSP＋209、AcNPV－CAP－PfCSP＋209/467、AcNPV－CAP－PfCSP＋76/209、AcNPV－CAP－PfCSP＋76/209/467、AcNPV－CAP－HA1/Anhui、AcNPV－CAP－HA1/Anhui/272、AcNPV－CAP－HA1/Anhui/467、AcNPV－CAP－HA1/Vietnam、AcNPV－CAP－HA1/Vietnam/51、AcNPV－CAP－HA1/Vietnam/101、AcNPV－CAP－HA1/Vietnam/154、AcNPV－CAP－HA1/Vietnam/201、AcNPV－CAP－HA1/Vietnam/272、AcNPV－CAP－HA1/Vietnam/467、AcNPV－CAP－AH/345、AcNPV－CAP－AH/345/467、AcNPV－CAP－AH/410、AcNPV－CAP－AH/410/467、AcNPV－CAP－AH/473、AcNPV－CAP－AH/473/467、AcNPV－CAP－AH/520、AcNPV－CAP－AH/520/467、AcNPV－CAP－VN/346、AcNPV－CAP－VN/346/467、AcNPV－CAP－VN/410、AcNPV－CAP－VN/410/467、AcNPV－CAP－VN/473、AcNPV－CAP－VN/473/467、AcNPV－CAP－VN/520、AcNPV－CAP－VN/520/467、AcNPV－CAP－CO/full、AcNPV－CAP－CO/full/467、AcNPV－CAP－CO/19、
AcNPV－CAP－CO/19/467、AcNPV－CAP－CO/76、AcNPV－CAP－CO/76/467、AcNPV－CAP－CO/205、AcNPV－CAP－CO/205/467、AcNPV－CA39－HA1/Anhui、AcNPV－CA64－HA1/Anhui、AcNPV－CA39－PfCSP(A361E)、AcNPV－CA64－PfCSP(A361E)、AcNPV－CAP－CO/full/VSV、AcNPV－CAP－CO/19/VSV、AcNPV－CAP－CO/76/VSV、AcNPV－CAP－CO/205/VSV、AcNPV－Dual－Pfs25－PfCSP－gp64以及AcNPV－Dual－PfMSP1－PfCSP－gp64]作為一活性成份的脂質體配方，並且可組合以一佐劑(adjuvant)而被使用。
本發明之疫苗(藥學組成物)的特定實例包括脂質體配方。該脂質體配方可能是一種有本發明的重組型桿狀病毒被留存在一含有一酸性磷脂質作為一膜組份或者含有一中性磷脂質以及一酸性磷脂質作為膜組份的脂質體中者。
被用來作為膜組份的酸性磷脂質以及中性磷脂質未被特別地限制，並且一般被用於脂質體配方的各種脂質可單獨的或以一為二或多個的組合而被使用。
脂質體膜(liposome membrane)是依據一標準方法藉由使用單獨的一酸性磷脂質或者與一中性磷脂質一起而被生成。當一酸性磷脂質與一中性磷脂質一起被使用時，該酸性磷脂質在脂質體膜組份中的比例較佳地是大約0.1至大約100 mol%，更佳地1至90 mol%，以及又更佳地大約10至大約50 mol%。
為了製備脂質體，例如，膽固醇或類似物可被添加。此可控制磷脂質的流動性(fluidity)並且有助於脂質體製
備。一般而言，相對於磷脂質，膽固醇較佳地呈一相等的數量或較少的數量(以重量計)，並且較佳地呈一為0.5倍的數量至一相等的數量而被添加。
在該脂質體配方中酸性磷脂質相對於活性成份的混合比例是大約0.5至大約100當量(equivalents)，較佳地大約1至大約60當量，以及更佳地大約1.5至大約20當量。
以脂質的總數量為基礎，本發明的重組型桿狀病毒(作為一活性成份)呈一為數個mol%至數十個mol%的數量，較佳地大約5至大約10 mol%，並且通常在5 mol%左右而被使用。
脂質體配方的產生、濃度以及粒徑控制可依據標準方法而被執行。如為所欲的，如上所述的各種不同添加物亦可被併入至該脂質體配方內。
為了產生該脂質體配方，作為一活性成份之本發明的重組型桿狀病毒可呈被結合至一脂肪酸[例如，萮樹酸(behenic acid)、硬脂酸(stearic acid)、棕櫚酸(palmitic acid)、肉荳蔻酸(myristic acid)以及油酸(oleic acid)]、一烷基基團、一膽固醇基基團(cholesteryl group)或類似物的形式而被使用。含有該等被結合之組份的脂質體配方亦可依據一標準方法[參見，例如，Long Circulating Liposomes：Old Drugs,New Therapeutics.,M.C.Woodle,G.Storm,Eds：Springer－Verlag Berlin(1998)]而被產生。
本發明的疫苗(藥學組成物)較佳地可被用來作為一疫苗組成物。該疫苗較佳地是組合以一藥學有效數量的一佐
劑而被使用，俾以提高抗－感染(抗－瘧疾或抗－流行性感冒)效用。
任一種經常被使用於此類型疫苗的佐劑可被用來作為佐劑。該等佐劑的實例包括：弗倫氏完全佐劑(Freund’s complete adjuvant)、胞壁醯二肽(muramyl dipeptide)、氫氧化鋁(aluminium hydroxide)、BCG、IL－12、N－乙醯隱掌葉防己鹼－L－丙胺醯基－D－異麩胺酸[N－acetylmuramine－L－alanyl－D－isoglutamine(MDP)]、胸腺素α1(thymosin α1)以及QS－21。所使用的佐劑的數量可依據症狀[諸如皮膚的軟化(softening)、疼痛、紅斑(erythema)、發燒、頭痛以及肌肉痛，它們可能是在此類型疫苗的投藥之後在人類或動物體內被表現為免疫反應的部份]的程度而被適當地選擇。
本發明的疫苗(藥學組成物)可組合以其他公知的藥學產品[諸如免疫反應－促進肽(immune response－promoting peptides)以及抗菌劑(antibacterial agents)(合成的抗菌劑)]而被使用。
該疫苗(藥學組成物)可進一步含有其他的藥物以及添加物。它們的實例包括幫助本發明的重組型桿狀病毒之細胞內攝取(intracellular uptake)的藥物，諸如鈣離子。脂質體以及其他促進轉染的藥物和添加物[諸如氟碳化物乳化劑(fluorocarbon emulsifiers)、螺旋物(cochleates)、小管(tubules)、金粒子(golden particles)、生物可分解的微球體(biodegradable microspheres)以及陽離子聚合物(cationic
polymers)]亦可被使用。
在本發明的疫苗(藥學組成物)(藥物)中所含有的活性成份的數量未被特別地限制並且可從一廣泛的範圍中被選擇，只要它是一藥學有效數量。該疫苗(藥學組成物)的劑量未被特別地限制，並且可依據所欲的治療效果、投藥方法(投藥途徑)、治療期間、病患的年齡、性別以及其他條件等而從一廣泛的範圍中被適當地選擇。
當重組型桿狀病毒作為本發明的疫苗(藥學組成物)之一活性成份而被投藥給一人類時，該重組型桿狀病毒是呈每位病患一對應於102
至1014
PFU的數量(被計算為該重組型病毒的PFU)，較佳地105
至1012
PFU，以及更佳地106
至1010
PFU而被投藥。
被用來作為本發明的疫苗(藥學組成物)之一活性成份的重組型桿狀病毒[下列的任一者：AcNPV－CAP－PfCSP、AcNPV－CAP－PfCSP/272、AcNPV－CAP－PfCSP/467、AcNPV－CAP－PfCSP(A361E)、AcNPV－CAP－PfCSP(A361E)/272、AcNPV－CAP－PfCSP(A361E)/467、AcNPV－CAP－PfCSP－76、AcNPV－CAP－PfCSP－76/467、AcNPV－CAP－PfCSP＋209、AcNPV－CAP－PfCSP＋209/467、AcNPV－CAP－PfCSP＋76/209、AcNPV－CAP－PfCSP＋76/209/467、AcNPV－CAP－HA1/Anhui、AcNPV－CAP－HA1/Anhui/272、AcNPV－CAP－HA1/Anhui/467、AcNPV－CAP－HA1/Vietnam、AcNPV－CAP－HA1/Vietnam/51、
AcNPV－CAP－HA1/Vietnam/101、AcNPV－CAP－HA1/Vietnam/154、AcNPV－CAP－HA1/Vietnam/201、AcNPV－CAP－HA1/Vietnam/272、AcNPV－CAP－HA1/Vietnam/467、AcNPV－CAP－AH/345、AcNPV－CAP－AH/345/467、AcNPV－CAP－AH/410、AcNPV－CAP－AH/410/467、AcNPV－CAP－AH/473、AcNPV－CAP－AH/473/467、AcNPV－CAP－AH/520、AcNPV－CAP－AH/520/467、AcNPV－CAP－VN/346、AcNPV－CAP－VN/346/467、AcNPV－CAP－VN/410、AcNPV－CAP－VN/410/467、AcNPV－CAP－VN/473、AcNPV－CAP－VN/473/467、AcNPV－CAP－VN/520、AcNPV－CAP－VN/520/467、AcNPV－CAP－CO/full、AcNPV－CAP－CO/full/467、AcNPV－CAP－CO/19、AcNPV－CAP－CO/19/467、AcNPV－CAP－CO/76、AcNPV－CAP－CO/76/467、AcNPV－CAP－CO/205、AcNPV－CAP－CO/205/467、AcNPV－CA39－HA1/Anhui、AcNPV－CA64－HA1/Anhui、AcNPV－CA39－PfCSP(A361E)、AcNPV－CA64－PfCSP(A361E)、AcNPV－CAP－CO/full/VSV、AcNPV－CAP－CO/19/VSV、AcNPV－CAP－CO/76/VSV、AcNPV－CAP－CO/205/VSV、AcNPV－Dual－PfS25－PfCSP－gp64以及AcNPV－Dual－PfMSP1－PfCSP－gp64]的劑量可就被導入至疫苗宿主內之可表現的DNA的數量或者被轉錄的RNA的數量而從一非常廣泛的範圍中被選擇。此等數量亦視被使
用在本發明的轉移載體中之轉錄和轉譯啟動子的強度而定。
本發明的疫苗(藥學組成物)是藉由將一重組型桿狀病毒懸浮液[藉由將重組型桿狀病毒散浮於磷酸緩衝的鹽水溶液(phosphate buffered saline,PBS)或鹽水中而被製備]直接地注射至一局部部位中(例如，至肺組織、肝臟、肌肉或腦中)，或者藉由經鼻的或呼吸的吸入，或者藉由血管內的(intravascular)[例如，動脈內的(intra－arterial)、靜脈內的(intravenous)以及肝門靜脈的(portal venous)]、皮下的、皮內的或腹膜內的投藥而被投藥。本發明的疫苗較佳地是藉由呼吸的吸入而被投藥。
本發明的疫苗(藥學組成物)較佳地被投藥多於一次。更特別地，在起始的投藥之後，額外的疫苗接種(additional vaccinations)較佳地是當病況被觀察到時被執行一次至數次。此可提高所欲的效用。在該疫苗(藥學組成物)的投藥之後，使用一種含有本發明之重組型桿狀病毒[下列的任一者：AcNPV－CAP－PfCSP、AcNPV－CAP－PfCSP/272、AcNPV－CAP－PfCSP/467、AcNPV－CAP－PfCSP(A361E)、AcNPV－CAP－PfCSP(A361E)/272、AcNPV－CAP－PfCSP(A361E)/467、AcNPV－CAP－PfCSP－76、AcNPV－CAP－PfCSP－76/467、AcNPV－CAP－PfCSP＋209、AcNPV－CAP－PfCSP＋209/467、AcNPV－CAP－PfCSP＋76/209、AcNPV－CAP－PfCSP＋76/209/467、AcNPV－CAP－HA1/Anhui、AcNPV－CAP－HA1/Anhui/272、
AcNPV－CAP－HA1/Anhui/467、AcNPV－CAP－HA1/Vietnam、AcNPV－CAP－HA1/Vietnam/51、AcNPV－CAP－HA1/Vietnam/101、AcNPV－CAP－HA1/Vietnam/154、AcNPV－CAP－HA1/Vietnam/201、AcNPV－CAP－HA1/Vietnam/272、AcNPV－CAP－HA1/Vietnam/467、AcNPV－CAP－AH/345、AcNPV－CAP－AH/345/467、AcNPV－CAP－AH/410、AcNPV－CAP－AH/410/467、AcNPV－CAP－AH/473、AcNPV－CAP－AH/473/467、AcNPV－CAP－AH/520、AcNPV－CAP－AH/520/467、AcNPV－CAP－VN/346、AcNPV－CAP－VN/346/467、AcNPV－CAP－VN/410、AcNPV－CAP－VN/410/467、AcNPV－CAP－VN/473、AcNPV－CAP－VN/473/467、AcNPV－CAP－VN/520、AcNPV－CAP－VN/520/467、AcNPV－CAP－CO/full、AcNPV－CAP－CO/full/467、AcNPV－CAP－CO/19、AcNPV－CAP－CO/19/467、AcNPV－CAP－CO/76、AcNPV－CAP－CO/76/467、AcNPV－CAP－CO/205、AcNPV－CAP－CO/205/467、AcNPV－CA39－HA1/Anhui、AcNPV－CA64－HA1/Anhui、AcNPV－CA39－PfCSP(A361E)、AcNPV－CA64－PfCSP(A361E)、AcNPV－CAP－CO/full/VSV、AcNPV－CAP－CO/19/VSV、AcNPV－CAP－CO/76/VSV、AcNPV－CAP－CO/205/VSV、AcNPV－Dual－Pfs25－PfCSP－gp64以及AcNPV－Dual－PfMSP1－PfCSP－gp64]的藥學組成物的追
加免疫接種(booster immunization)可被執行。再者，各種不同的其他藥物與本發明之疫苗的使用，如上所描述的，可藉由該疫苗(藥學組成物)的投藥而提高所達至的治療效用。
在本發明的疫苗(藥學組成物)的一個具體例中，該重組型桿狀病毒[被用來作為本發明之疫苗(藥學組成物)的活性成份之一]通常是藉由一桿狀病毒DNA與一轉移載體(其中一藉由一具有所欲的免疫原性之外來基因以及一編碼一能夠是病毒顆粒之一組份的蛋白質之基因的融合而被獲得的融合基因已被導入)的同源性重組而被製備。該重組型桿狀病毒以一可注射的劑型(一溶液、懸浮液或乳劑)而被混合以一藥學上可接受的載劑(亦即在所使用的劑量與濃度中對於人類和其他脊椎動物是無毒性的，並且與配方中的其他成份相容)俾以產生一配方。較佳地，由此所得到的配方不含有氧化劑或任一種公知對於重組型桿狀病毒是有害的其他化合物。
該載劑可含有一微量的添加物，諸如會提高等張性(isotonicity)以及化學安定性(chemical stability)的物質。該等添加物在所使用的劑量和濃度中對於哺乳動物(包括人類)是無毒性的，並且它們的實例包括：緩衝劑，諸如磷酸(phosphoric acid)、檸檬酸(citric acid)、琥珀酸(succinic acid)、醋酸(acetic acid)以及其他的有機酸，以及它們的鹽類；抗氧化劑，諸如抗壞血酸(ascorbic acid)；低分子量(例如，少於大約10個殘基)多肽[例如，聚精胺酸(polyarginine)以及三肽(tripeptide)]、蛋白質[例如，血清白蛋白、明膠
(gelatin)以及免疫球蛋白]；胺基酸(例如，甘胺酸、麩胺酸、天冬胺酸以及精胺酸)；單醣、雙醣以及其他的碳水化合物[例如，纖維素及其衍生物、葡萄糖、甘露糖(mannose)以及糊精(dextrin)]、螯合劑(chelating agents)(例如，EDTA)；糖醇(sugar alcohols)[例如，甘露糖醇(mannitol)以及山梨糖醇(sorbitol)]；相對離子(counterions)(例如，鈉)；非離子性界面活性劑(nonionic surfactants)[例如，聚山梨醇酯(polysorbate)以及泊洛沙姆(poloxamer)]；以及PEG。
含有該重組型桿狀病毒的藥學疫苗(組成物)典型地可有如一水性溶液或一凍乾產物(lyophilized product)而被儲存於一單位或多重劑量容器(unit or multiple dose container)[諸如一被密封的安瓿(ampoule)或一小瓶(vial)]中。
本發明進一步提供一種預防瘧疾或流行性感冒感染的方法，或者一種治療瘧疾或流行性感冒的方法，其包含有對一個體投藥一有效數量之本發明的重組型桿狀病毒、疫苗、配方以及藥學組成物。本發明進一步提供一種免疫刺激的方法，其包含有對一個體投藥一有效數量之本發明的重組型桿狀病毒、疫苗、配方以及藥學組成物。所使用之個體的實例包括那些可能被感染以瘧疾寄生蟲或流行性感冒病毒者，諸如人類以及其他的動物[諸如哺乳動物、鳥類、爬蟲類(reptiles)、魚(fish)以及兩棲類(amphibians)]，以及那些被感染以瘧疾寄生蟲或流行性感冒病毒者。該個體所感染的流行性感冒病毒較佳地是一A型流行性感冒病
毒，以及更佳地一A型H1亞型流行性感冒病毒或者一A型H3亞型流行性感冒病毒。瘧疾寄生蟲的實例包括惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum
)、間日瘧原蟲(Plasmodium vivax
)、三日瘧原蟲(Plasmodium malariae
)以及卵形瘧原蟲(Plasmodium ovale
)。
本發明的重組型桿狀病毒是單獨地或者與一藥學上可接受的載劑一起被形成為一疫苗、配方或藥學組成物，並且被投藥給該個體。
該投藥途徑可以是，例如，上面所描述的任一種投藥途徑。供使用於本發明中的藥學上可接受之載劑可依據要被製造的藥學組成物的形式，而從此技術領域中所經常使用的載劑被適當地選擇。
例如，當該藥理學組成物(pharmacological composition)被形成為一水性溶液時，純化水(purified water)(滅菌水)或者一生理緩衝溶液(physiological buffer solution)可被用來作為載劑。當該藥學組成物被形成為其他適合的溶液時，能夠被注射的有機酯[諸如乙二醇(glycol)、甘油以及橄欖油]可被用來作為載劑。該組成物可含有安定劑(stabilizers)、賦形劑(excipients)以及在此技術領域(並且特別是在疫苗配方的領域中)中所經常使用的類似物。
該重組型桿狀病毒在本發明的疫苗、配方或藥學組成物中的數量未被特別地限制，並且可從一廣泛的範圍中被適當地選擇。一般而言，重組型桿狀病毒在組成物中的數量較佳地是大約0.0002至大約0.2(w/v%)，以及更佳地
0.001至0.1(w/v%)。本發明的重組型桿狀病毒、疫苗、配方或藥學組成物的投藥方法未被特別地限制，並且可依據劑型、病患的年齡、性別以及其他的條件、疾病的嚴重性(severity)等而被適當地選擇。它們的一較佳劑型是一用於非經腸道投藥的形式，諸如注射劑(injections)、滴劑(drops)、經鼻的滴劑(nasal drops)以及吸入劑(inhalants)。當該組成物被形成為一注射劑或滴劑時，該注射劑如為所需的可有如被混合以一補充液(replacement fluid)(諸如一葡萄糖溶液或一胺基酸溶液)而被靜脈內地投藥，或者可肌肉內地、皮內地、皮下地或腹膜內地被投藥。
本發明的重組型桿狀病毒、疫苗、配方或藥學組成物的每日劑量(daily dosage)可視個體的病況、體重、年齡、性別等而變化，並且因此不可被完全地指定。然而，該劑量通常是使得重組型桿狀病毒呈每日每kg體重一為0.001至100 mg的數量而被投藥。本發明的疫苗、配方或組成物可以每日一或多次投藥而被投藥。
當作為本發明的疫苗(配方或藥學組成物)之一活性成份的重組型桿狀病毒被投藥時，該重組型桿狀病毒是呈每位病患一對應於102
至1014
PFU的數量(被計算為該重組型病毒的PFU)，較佳地105
至1012
PFU，以及更佳地106
至1010
PFU而被投藥。
本發明的疫苗(組成物)是依據優良醫療規範(Good Medical Practice)，考慮各個病患的臨床病況(例如，要被預防或被治療的病況)、含有該重組型桿狀病毒的疫苗(組成物)
的投遞部位、標的組織、投藥方法、劑量攝生法(dosage regimen)以及其他對於那些熟習該技藝者而言為公知的因素而被投藥。因此，此處之疫苗(組成物)的適當劑量是考慮到上面而被決定。
本發明將參照實施例而在下面被詳細地描述。此等實施例僅為本發明的實例，而不是限制本發明。
(1)本發明的轉移載體質體pCAP－PfCSP、pCAP－PfCSP/272以及pCAP－PfCSP/467的建構
(1.1)質體pBACsurf－Hsp65的建構
一Hsp65基因是藉由使用一QIAamp DNA Midi Kit (Qiagen)而從結核分枝桿菌H37Rv株(M.tuberculosis
H37Rv strain)萃取出基因體DNA，並藉由PCR的選殖而被獲得。更特別地，從該結核分枝桿菌H37Rv株所萃取出的基因體DNA是藉由使用引子phsp65－F1[5’－AATAATAGATCCT
AATGGCCAAGACAATTGCGTACGACGAAGA－3’(序列辨識編號：1)；BglII位址被劃底線]以及phsp65－R1[5’－AATCCAATGCGGCCGC
GGGAATTCGATTCCTGCAGGTCAGAAATCCATGCCACCCATGTCGCC－3’(序列辨識編號：2)；NotI位址被劃底線]的PCR而被擴增。PCR產物被純
化，以限制酶BglII和NotI予以切割，被接合至以BamHI和NotI予以分解的pcDNA3.1(＋)(來自Invitrogen)。所形成的質體被命名為pcDNA－hsp65。PCR是以pcDNA－hsp65作為一模版，使用引子phsp65－F2[5’－CACCCCTGCAGG ACTACAAGGACGACGATGACAAG GAATTC
ATGGCCAAGACAATTGCGTACGACGAAGAGGCC－3’(序列辨識編號：3)；Sse8387I和EcoRI位址被劃底線，而FLAG序列是以斜體印刷]，以及phsp65－R2[5’－CCCGGG
CGAAATCCATGCCACCCATGTCGCCGCCACC－3’(序列辨識編號：4)；Cfr9I位址被劃底線]而被執行。所形成的Hsp65基因DNA片段被選殖至pENTR/D－TOPO(來自Invitrogen)中，接著以Sse8387I/Cfr9I予以切割並且被插入至pBACsurf－CSP的PstI/Cfr9I位址中(Yoshida et al.,Virology 316：161－70,2003)。由此所建構的質體被設計pBACsurf－Hsp65。
(1.2)質體pENTR－gp64的建構
PCR是以pBACsurf－1(來自Novagen)作為一模版，使用引子pPolh－F2[5’－CACCCGGACC
GGATAATTAAAATGATAACCATCTCGCAAATAAATAAG－3’(序列辨識編號：5)；RsrII位址被劃底線]，以及pgp64－R2[5’－GGTACC
ATATTGTCTATTACGGTTTCTAATCATAC－3’(序列辨識編號：6)；KpnI位址被劃底線]而被執行。所形成的gp64基因DNA片段被插入至pENTR/D－TOPO中以建構一
質體pENTR－gp64。由此所建構的質體被命名pENTR－gp64。
(1.3)本發明的轉移載體pDual－Hsp65－gp64的建構
pBACsurf－Hsp65是以PstI/Cfr9I予以切割，並且該hsp65基因DNA片段被插入至pENTR－gp64的PstI/Cfr9I位址中以建構一質體pENTR－Hsp65－gp64。該pENTR－Hsp65－gp64以RsrII/KpnI予以切割，並且一個由一多角體蛋白啟動子(polyhedrin promoter)以及hsp65－gp64基因構成的DNA片段被插入至以RsrII和KpnI予以切割的pTriEx－3.1(Novagen)中，俾以建構一種在所欲的雙重啟動子(由CMA啟動子以及多角體蛋白啟動子構成)的控制下，在哺乳動物以及昆蟲細胞中能夠表現一含有Hsp65抗原以及gp64蛋白的融合蛋白質之轉移載體質體pDual－Hsp65－gp64。
(1.4)本發明的轉移載體pDual－H1N1/HA1－gp64的建構
RNA是使用一QIAamp MinElute Virus Spin Kit(來自Qiagen)而從被感染以流行性感冒病毒PR/8/34株的MDCK細胞之一培養物上清液(culture supernatant)被萃取出，並且藉由使用引子HA－f[5’－CCTGCAGG
TATGAAGGCAAACCTACTGGTC－3’(序列辨識編號：7)；SbfI位址被劃底線]以及HA－r[5’－GCCCGGG
CGATGCATATTCTGCA－3(序列辨識編號：8)；SbfI位址被劃底線]的RT－PCR而被擴增。所形成的流行性感冒病毒HA基因片段被選殖至pCR－Blunt II－TOPO(來自Invitrogen)中。所形成的質體被命名為pCR－Blunt－HA。PCR是以該pCR－Blunt－HA作為一模版，使用引子pHA－F1
[5’－CACCGAATTC
GACACAATATGTATAGGCTACCATGCG－3’(序列辨識編號：9)；EcoRI位址被劃底線]以及pHA－R1[5’－CCCGGG
CACCTCTGGATTGGATGGACGGAATG－3’(序列辨識編號：10)；Cfr9I位址被劃底線]而被執行。所形成的H1N1/HA1基因DNA片段被選殖至pENTR/D－TOPO中，接著以EcoRI/Cfr9I予以切割並且被插入至該pDual－Hsp65－gp64的EcoRI/Cfr9I位址中，俾以建構一質體pDual－H1N1/HA1－gp64。
(1.5)質體pBACsurf－HA1的建構
pDual－H1N1/HA1－gp64是以EcoRI/CfrI予以切割，並且該H1N1/HA1基因的DNA片段被插入至以EcoRI和CfrI予以分解的pBACsurf－Hsp65中，俾以建構一質體pBACsurf－HA1。
(1.6)質體pCP－H1N1/HA1－gp64的建構
PCR是以pBACsurf－HA1作為一模版，使用Polh－f RsrII[5’－GGGCGGACCG
GATAATTAAAATGATAACCATCTCG－3’(序列辨識編號：11)；RsrII位址被劃底線]以及GP64－r DraIII[5’－GGGCACTTAGTG
ATATTGTCTATTACGGTTTCTAATC－3’(序列辨識編號：12)；DraIII位址被劃底線]而被執行。所形成的DNA片段被插入至以RsrII和DraIII予以消化的pDual－H1N1/HA1－gp64中，俾以生成pCP－H1N1/HA1－gp64。
(1.7)質體pCAP－H1N1/HA1－gp64的建構
pCP－H1N1/HA1－gp64是以限制酶RsrII和DraIII予以切
割以製備HA1以及gp64基因片段。該等片段被插入至一藉由以限制酶RsrII和DraIII來分解pTriEx－1.1(來自Novagen)而被製備的載體中，俾以生成一種在所欲的雙重啟動子(由CAG啟動子以及多角體蛋白啟動子構成)的控制下，在哺乳動物以及昆蟲細胞中能夠表現一含有HA1抗原以及gp64蛋白的融合蛋白質的轉移載體質體pCAP－H1N1/HA1－gp64。
(1.8)質體pCAP－H1N1/NP－gp64的建構
RT－PCR是以流行性感冒病毒PR/8/34株的基因體RNA作為一模版，使用NP－f EcoRI[5’－ACGGAATTC
CATTCAATTCAAACTGGA－3’(序列辨識編號：13)；EcoRI位址被劃底線]以及NP－r Cfr9I[5’－GATCCCGGG
CCTTGTCAATGCTGAATGGCAA－3’(序列辨識編號：14)；Cfr9I位址被劃底線]而被執行。所得到的片段是以限制酶EcoRI和Cfr9I予以分解，並且被插入至以限制酶EcoRI和Cfr9I予以分解的pCAP－H1N1/HA1－gp64中，俾以生成pCAP－H1N1/NP－gp64。
(1.9)質體pCAP－H1N1/NP/272以及pCAP－H1N1/NP/467的建構
PCR是使用gp64(272)－f[5’－GACTCCCCGGG
TCGAGCACCGAGTCAAGAAG－3’(序列辨識編號：15)；XmaI位址被劃底線]、gp64(467)－f[5’－GACTCC CCGGG
ACATCACTTCCATGGCTGAA－3’(序列辨識編號：16)；XmaI位址被劃底線]，以及pCAP－H1N1/HA1－gp64的GP64－r DraIII
[5’－GGGCACTTAGTG
ATATTGTCTATTACGGTTTCTAATC－3’(序列辨識編號：12)；DraIII位址被劃底線]而被執行。所得到的片段是以限制酶XmaI和DraIII予以分解，並且被插入至以XmaI和DraIII予以分解的pCAP－H1N1/NP－gp64中，俾以生成pCAP－H1N1/NP/272以及pCAP－H1N1/NP/467。
(1.10)本發明的轉移載體pCAP－PfCSP、cCAP－PfCSP/272以及pCAP－PfCSP/467的建構
惡性瘧原蟲(P.falciparum
)基因體DNA是使用一QIAamp DNA Midi Kit(來自Qiagen)而從被感染以惡性瘧原蟲3D7株(Plasmodium falciparum
3D7 strain)的人類紅血球被萃取出。一PfCSP基因是依據下列方法藉由以此基因體DNA作為一模版的PCR而被選殖出。該PCR是使用引子PfCSP－f(19)[5’－GACTCTGCAG
TTATTCCAGGAATACCAGTGCTATGGAAG－3’(序列辨識編號：17)；PstI位址被劃底線]以及PfCSP－r(373)[5’－CGATCCCGGG
CTTTTTCCATTTTACAAATTTTTTTTTCAATATC－3’(序列辨識編號：18)；XmaI位址被劃底線]而被執行。所形成的DNA片段被插入至pCAP－H1N1/NP－gp64、pCAP－H1N1/NP/272以及pCAP－H1N1/NP/467(各者是以PstI和XmaI予以分解)中。所建構的質體被命名pCAP－PfCSP、pCAP－PfCSP/272以及pCAP－PfCSP/467。
惡性瘧原蟲3D7環子孢子蛋白[circumporozoite(CS)
protein]的胺基酸序列的GenBank寄存編號為XP_001351122。
(2)本發明的轉移載體pDual－Pfs25－PfCSP－gp64的建構
(2.1)質體pDual－PbAMA1D123－gp64的建構
一血液樣品被收集自一被感染以瘧疾寄生蟲齧齒瘧蟲ANKA株(P. berghei
ANKA strain)的BALB/c小鼠，並且齧齒瘧蟲(P.berghei
)基因體DNA是使用一QIAamp DNA Midi Kit(Qiagen)而被萃取。一PbAMA1基因領域123(Domain 123,D123)是依據下列方法藉由以此基因體DNA作為一模版的PCR而被選殖出。PCR是使用引子pAMA－F1[5’－CACCGAATTC
AATCCATGGGAAAAGTATACGGAAAAATAT－3’(序列辨識編號：19)；EcoRI位址被劃底線]以及pAMA1－R1[5’－CCCGGG
CTTCTCTGGTTTGATGGGCTTTCATATGCAC－3’(序列辨識編號：20)；Cfr9I位址被劃底線]而被執行。所形成的PbAMA1D123 DNA片段被選殖至pENTR/D－TOPO中，接著以EcoRI/Cfr9I予以切割並且被插入至以EcoRI和Cfr9I予以分解的pBACsurf－Hsp65中。所建構的質體被命名pBACsurf－PbAMA1D123。
隨後，該pBACsurf－PbAMA1D123是以EcoRI/Cfr9I予以切割，並且該PbAMA1D123基因DNA片段被插入至以EcoRI和Cfr9I予以分解的pDual－Hsp65－gp64中，俾以生成一質體pDual－PbAMA1D123－gp64。
(2.2)質體pDual－PfCSP－gp64的建構
一PfCSP基因是依據下列方法藉由以惡性瘧原蟲基因體DNA作為一模版的PCR而被選殖出。該PCR是使用引子pPfCSP－F1[5’－CACCGAATTC
TTATTCCAGGAATACCAGTGCTATGGAAGT－3’(序列辨識編號：21)；EcoRI位址被劃底線]以及pPfCSP－R1[5’－CCCGGG
CTTTTTCCATTTTACAAATTTTTTTTTC－3’(序列辨識編號：22)；Cfr9I位址被劃底線]而被執行。所形成的PfCSP DNA片段被選殖至pENTR/D－TOPO中，接著以EcoRI/Cfr9I予以切割並且被插入至以EcoRI和Cfr9I予以分解的pDual－PbAMA1D123－gp64中。所建構的質體被命名pDual－PfCSP－gp64。
(2.3)本發明的轉移載體pDual－Pfs25－PfCSP－gp64的建構
一Pfs25基因是依據下列方法藉由以惡性瘧原蟲基因體DNA作為一模版的PCR而被選殖出。該PCR是使用引子pPfS25－F1[5’－CACCGAATTC
AAAGTTACCGTGGATACTGTATGCAAAAGAGGA－3’(序列辨識編號：23)；EcoRI位址被劃底線]以及pPfs25－R2[5’－CAATTG
AGATCCGCCGCCACCGCCACCAGTACATATAGAGCTTTCATTATCTATTATAAATCCATC－3’(序列辨識編號：24)；MunI位址被劃底線]而被執行。所形成的Pfs25 DNA片段被選殖至pENTR/D－TOPO中，接著以EcoRI/MunI予以切割，並且被插入至以EcoRI予以分解的
pDual－PfCSP－gp64中。所建構的質體被命名pDual－Pfs25－PfCSP－gp64。
(3)本發明的轉移質體pDual－PfMSP1－PfCSP－gp64的建構
一PfMSP1基因是依據下列方法藉由以惡性瘧原蟲基因體DNA作為一模版的PCR而被選殖出。該PCR是使用引子pPfMSP119－F1[5’－CACCGAATTC
AACATTTCACAACACCAATGCGTAAAAAAAC－3’：(序列辨識編號：25)；EcoRI位址被劃底線]以及pPfMSP119－R2[5’－CAATG
AGATCCGCCGCCACCGCCACCGTTAGAGGAACTGCAGAAAATACCATCGAAAAGTGGA－3’(序列辨識編號：26)，MunI位址被劃底線]而被執行。所形成的PfMSP119 DNA片段被選殖至pENTR/D－TOPO中，接著以EcoRI和MunI予以切割，並且被插入至以EcoRI予以分解的pDual－PbCSP－gp64中。所建構的質體被命名pDual－PfMSP1－PfCSP－gp64。
(4)本發明的轉移載體質體pCAP－PfCSP(A361E)、pCAP－PfCSP(A361E)/272以及pCAP－PfCSP(A361E)/467的建構
PCR是以pCAP－PfCSP使用PfCSP－f(19)[5’－GACTCTGCAG
TTATTCCAGGAATACCAGTGCTATGGAAG－3’：(序列辨識編號：17)；PstI位址被劃底線]以及PfCSP－r(373 A361E)[5’－CGATCCCGGG
CTTTTTCCATTTTACAAATTTTTTTTT
CAATATCATTTTC－3’：(序列辨識編號：27)；XmaI位址被劃底線]而被執行。所得到的DNA片段以PstI和XmaI予以切割，並且被插入至pCAP－H1N1/NP－gp64、pCAP－H1N1/NP/272以及pCAP－H1N1/NP/467(各者是以PstI和XmaI予以分解)中。所建構的質體被命名pCAP－PfCSP(A361E)、pCAP－PfCSP(A361E)/272以及pCAP－PfCSP(A361E)/467。
(5)本發明的轉移質體pCAP－PfCSP－76以及pCAP－PfCSP－76/467的建構
PCR是以pCAP－PfCSP(A361E)使用PfCSP－f(76)[5’－GACTCTGCAG
GATGATGGAAATAACGAAGACAACG－3：(序列辨識編號：28)；PstI位址被劃底線]以及PfCSP－r(373 A361E)[5’－CGATCCCGGG
CTTTTTCCATTTTACAAATTTTTTTTTCAATATCATTTTC－3’：(序列辨識編號：27)；XmaI位址被劃底線]而被執行。所形成的DNA片段以PstI和XmaI予以切割，並且接著被插入至pCAP－H1N1/NP－gp64以及pCAP－H1N1/NP/467(各者是以PstI和XmaI予以切割)中。所建構的質體被命名pCAP－PfCSP－76以及pCAP－PfCSP－76/467。
(6)轉移質體pCAP－PfCSP＋209以及pCAP－PfCSP＋209/467的建構
一人工基因序列(artificial gene sequence)(PfCSP＋：序列辨識編號：29)是使用在Sf9以及人類細胞中所經常使用的
密碼子(codon)而從惡性瘧原蟲3D7株的PfCSP的胺基酸序列(然而，其中在361位置處的A被E所取代)被製備。使用所得到的人工基因序列作為一模版，PCR是使用PfCSP－f(＋209)[5’－GACTCTGCAG
AACGCTAATCCAAACGCTAATCCCAACGCTAATCCCAATGCC－3’(序列辨識編號：30)；PstI位址被劃底線]以及PfCSP－r(＋A361E)[5’－CGATCCCGGG
CTTTTTCCATTTTGCAAATTTTTTT－3’(序列辨識編號：31)；XmaI位址被劃底線]而被執行。所形成的DNA片段以PstI和XmaII予以切割，並且接著被插入至以PstI和XmaII予以分解的pCAP－H1N1/NP－gp64以及pCAP－H1N1/NP/467中。所建構的質體被命名pCAP－PfCSP＋209以及pCAP－PfCSP＋209/467。
(7)本發明的轉移質體pCAP－PfCSP＋76/209以及pCAP－PfCSP＋76/209/467的建構
使用該人工基因序列(PfCSP＋：序列辨識編號：29)作為一模版，PCR是使用PfCSP－f(＋76)[5’－GACTCTGCAG
GACGACGGCAACAACGAAGACAACG－3’(序列辨識編號：32)；PstI位址被劃底線]、PfCSP－r(＋128)[5’－CGTTAGGATCC
ACATTTGGGTTGGCATTTGGG－3’(序列辨識編號：33)；BamH I位址被劃底線]、PfCSP－f(＋209)BamHl[5’－GACTGGATCC
TAACGCTAATCCAAACGCTAATCCC－3’：(序列辨識編號：34)；BamH I位址被劃底線]以及PfCSP－r(＋A361E)
[5’－CGATCCCGGG
CTTTTTCCATTTTGCAAATTTTTTT－3’(序列辨識編號：31)；XmaI位址被劃底線]而從所得到的該人工基因序列被執行。所形成的DNA片段分別地以PstI/BamHl和BamHl/XmaI予以切割，並且接著被插入至pCAP－H1N1/NP－gp64以及pCAP－H1N1/NP/467(各者以PstI和XmaI予以分解)中。所建構的質體被命名pCAP－PfCSP＋76/209以及pCAP－PfCSP＋76/209/467。
(8)轉移質體pCAP－HA1/Anhui、pCAP－HA1/Anhui/272以及pCAP－HA1/Anhui/467的建構
一人工基因序列(序列辨識編號：35)是使用在Sf9以及人類細胞中所經常使用的密碼子(codon)而從流行性感冒病毒H5N1/Anhui/1/05的血球凝集素HA1區域(hemagglutinin HA1 region)的胺基酸序列被製備。使用所得到的人工基因序列作為一模版，PCR是使用AH－F1[5’－CAGTCTGCAGGAC
CAGATTTGCATC－3’：(序列辨識編號：36)；PstI位址被劃底線]以及AH－R4[5’－CAGTCCCGGG
CTCTCTTGCGCCTGC－3’：(序列辨識編號：37)；XmaI位址被劃底線]而被執行。所得到的DNA片段以PstI和XmaI予以切割，並且接著被插入至pCAP－H1N1/NP－gp64、pCAP－H1N1/NP/272以及pCAP－H1N1/NP/467(各者以PstI和XmaI予以分解)中。所建構的質體被命名pCAP－HA1/Anhui、pCAP－HA1/Anhui/272以及pCAP－HA1/Anhui/467。
流行性感冒病毒A/H5N1/Anhui/1/05的血球凝集素的
胺基酸序列的GenBank寄存編號為ABD28180。
(9)本發明的轉移載體質體pCAP－HA1/Vietnam、pCAP－HA1/Vietnam/51、pCAP－HA1/Vietnam/101、pCAP－HA1/Vietnam/154、pCAP－HA1/Vietnam/201、pCAP－HA1/Vietnam/272以及pCAP－HA1/Vietnam/467的建構
一人工基因序列(序列辨識編號：38)是使用在Sf9以及人類細胞中所經常使用的密碼子而從流行性感冒病毒H5N1/Vietnam/1203/4的血球凝集素之HA1區域的胺基酸序列被製備。使用所得到的人工基因序列作為一模版，PCR是使用VN－F1[5’－CAGTCTGCAG
GACCAGATCTGTATC－3’：(序列辨識編號：39)；PstI位址被劃底線]以及VN－R4[5’－CAGTCCCGGG
CTCTCTTCTTCCTGC－3’：(序列辨識編號：40)；XmaI位址被劃底線]而被執行。所得到的DNA片段以PstI和XmaI予以切割，並且被插入至pCAP－H1N1/NP－gp64、pCAP－H1N1/NP/272以及pCAP－H1N1/NP/467(各者以PstI和XmaI予以分解)中。所建構的質體被命名為pCAP－HA1/Vietnam、pCAP－HA1/Vietnam/272以及pCAP－HA1/Vietnam/467。
再者，使用pCAP－HA1/Vietnam作為一模版，PCR是使用gp64(51)－f[5’－GACTCCCCGGG
TGGAAATCACCATCGTGGAGACG－3’：(序列辨識編號：41)；XmaI位址被劃底線]或gp64(101)－f
[5’－GACTCCCCGGG
ATTTGCTTATGTGGAGCATCAGG－3’：(序列辨識編號：42)；XmaI位址被劃底線]或gp64(154)－f[5’－GACTCCCCGGG
CGCACCACACGTGCAACAAATCG－3’：(序列辨識編號：43)；XmaI位址被劃底線]或者gp64(201)－f[5’－GACTCCCCGGG
ACACTGTGCTTCATCGAGACGGC－3’：(序列辨識編號：44)；XmaI位址被劃底線]，以及GP64－rDraIII[5’－GGGCACTTAGTG
ATATTGTCTATTACGGTTTCTAATC－3’(序列辨識編號：12)；Dralll位址被劃底線]而被執行。所得到的DNA片段以XmaI和DraIII予以切割，並且被插入至以XmaI和DraIII予以分解的pCAP－HA1/Vietnam中。所建構的質體被命名為pCAP－HA1/Vietnam/51、pCAP－HA1/Vietnam/101、pCAP－HA1/Vietnam/154以及pCAP－HA1/Vietnam/201。
流行性感冒病毒A/H5N1/Vietnam/1203/2004的血球凝集素之胺基酸序列的GenBank寄存編號為AAW80717。
(10)本發明的轉移載體質體pCAP－AH/345、pCAP－AH/345/467、pCAP－AH/410、pCAP－AH/410/467、pCAP－AH/473、pCAP－AH/473/467、pCAP－AH/520、pCAP－AH/520/467的建構
一人工基因序列(序列辨識編號：45)是藉由使用Gene Designer(可得自於DNA2.0,Inc)的密碼子最佳化(codon optimization)而從流行性感冒病毒A/H5N1/Anhui/1/05的血
球凝集素之HA區域的胺基酸序列被製備。使用此人工序列作為一模版，PCR是使用AH17－F[5’－GACTCTGCAG
GATCAGATCTGTATTGGGTACC－3’：(序列辨識編號：46)；PstI位址被劃底線]，以及AH345－R[5’－CGATCCCGGG
CTCTCTTTCTCCTCCGCTCGC－3’：(序列辨識編號：47)；XmaI位址被劃底線]或AH410－R[5’－CGATCCCGGG
CGGCCTCGAACTGGGTGTTCATT－3’：(序列辨識編號：48)；XmaI位址被劃底線]或AH473－R[5’－CGATCCCGGG
CGTCTCTGAGTTGAAGGCGCAC－3’：(序列辨識編號：49)；XmaI位址被劃底線]或AH520－R[5’－CGATCCCGGG
CACCACTAATTTCCTCTCGCTTC－3’：(序列辨識編號：50)；XmaI位址被劃底線]而被執行。所得到的DNA片段以PstI和XmaI予以切割，並且被插入至以PstI和XmaI予以消化的pCAP－HA1/Anhui或pCAP－HA1/Anhui/467中。所建構的質體被命名pCAP－AH/345、pCAP－AH/345/467、pCAP－AH/410、pCAP－AH/410/467、pCAP－AH/473、pCAP－AH/473/467、pCAP－AH/520以及pCAP－AH/520/467。
(11)本發明的轉移載體質體pCAP－VN/346、pCAP－VN/346/467、pCAP－VN/410、pCAP－VN/410/467、pCAP－VN/473、pCAP－VN/473/467、pCAP－VN/520以及pCAP－VN/520/467的建構
一人工基因序列(序列辨識編號：51)是藉由使用Gene
Designer(可得自於DNA2.0,Inc)的密碼子最佳化而從流行性感冒病毒A/H5N1/Vietnam/1203/2004的血球凝集素之HA區域的胺基酸序列被製備。使用此人工序列作為一模版，PCR是使用VN17－F[5’－GACTCTGCAG
GATCAGATCTGTATCGGATATC－3’：(序列辨識編號：52)；PstI位址被劃底線]，以及VN346－R[5’－CGATCCCGGG
CCCGCTTTTTCCTCCTCCGTTCG－3’：(序列辨識編號：53)；XmaI位址被劃底線]或VN410－R[5’－CGATCCCGGG
CCTCAAACTGCGTATTCATTTTG－3’：(序列辨識編號：54)；XmaI位址被劃底線]或VN473－R[5’－CGATCCCGGG
CTCTAAGCTGGAGCCTGACTTTGTC－3’：(序列辨識編號：55)；XmaI位址被劃底線]或VN520－R[5’－CGATCCCGGG
CACTAATCTCCTCTCTTTTAAGTC－3’：(序列辨識編號：56)；XmaI位址被劃底線]而被執行。所得到的DNA片段以PstI和XmaI予以切割，並且被插入至以PstI和XmaI予以分解的pCAP－HA1/Anhui或pCAP－HA1/Anhui/467中。所建構的質體被命名pCAP－VN/346、pCAP－VN/346/467、pCAP－VN/410、pCAP－VN/410/467、pCAP－VN/473、pCAP－VN/473/467、pCAP－VN/520以及pCAP－VN/520/467。
(12)本發明的轉移載體質體pCAP－CO/full、pCAP－CO/full/467、pCAP－CO/19、pCAP－CO/19/467、pCAP－CO/76、pCAP－CO/76/467、pCAP－CO/205以及pCAP－CO/205/467的建構
一人工基因序列(序列辨識編號：57)是藉由使用Gene Designer(可得自於DNA2.0,Inc)的密碼子最佳化而從惡性瘧原蟲3D7株(Plasmodium falciparum
3D7 strain)的CSP的胺基酸序列被製備。使用此人工序列作為一模版，PCR是使用由下列所構成的一對引子而被執行：PfCSP_opt－f[5’－GACTCTGCAG
ATGATGCGAAAATTGGCCATACTG－3’：(序列辨識編號：58)；PstI位址被劃底線]和PfCSP_opt－r(397)[5’－CGATCCCGGG
CATTGAGGAACAGAAAGGAAAGAACCATG－3’：(序列辨識編號：59)；XmaI位址被劃底線]；PfCSP_opt－f(19)[5’－GACTCTGCAG
CTGTTTCAGGAATACCAGTGCTATGG－3’：(序列辨識編號：60)；PstI位址被劃底線]和PfCSP_opt－r(373)[5’－CGATCCCGGG
CCTTCTCCATCTTACAAATTTTCTTTTCAATATCATTAGC－3’：(序列辨識編號：61)；XmaI位址被劃底線]；PfCSP_opt－f(76)[5’－GACTCTGCAG
GACGACGGAAATAATGAGGACAACG－3’：(序列辨識編號：62)；PstI位址被劃底線]和PfCSP_opt－r(373)[5’－CGATCCCGGG
CCTTCTCCATCTTACAAATTTTCTTTTCAATATCATTAGC－3’：(序列辨識編號：61)；XmaI位址被劃底線]；以及PfCSP_opt－f(205)[5’－GACTCTGCAG
AATGCAAACCCAAATGCCAATCCAA
ACGC－3’：(序列辨識編號：63)；PstI位址被劃底線]和PfCSP_opt－r(373)[5’－CGATCCCGGG
CCTTCTCCATCTTACAAATTTTCTTTTCAATATCATTAGC－3’：(序列辨識編號：61)；XmaI位址被劃底線]。所得到的DNA片段以PstI和XmaI予以切割，並且被插入至以PstI和XmaI予以切割的pCAP－HA1/Anhui或pCAP－HA1/Anhui/467中。所建構的質體被命名pCAP－CO/full、pCAP－CO/full/467、pCAP－CO/19、pCAP－CO/19/467、pCAP－CO/76、pCAP－CO/76/467、pCAP－CO/205以及pCAP－CO/205/467。
(13)本發明的轉移載體質體pCA64－HA1/Anhui以及pCA64－PfCSP(A361E)的建構
使用BacVector－2000 DNA的Triple Cut DNA(來自Novagen)，PCR是使用gp64－p－f[5’－GACTCGGACCG
GCCAGATAAAAATAATCTTATCAATTAAG－3’：(序列辨識編號：64)；RsrII位址被劃底線]以及gp64－p－r[5’－CGATACTAGT
AGCACTGAGGCTTCTTATATACCCG－3’：(序列辨識編號：65)；SpeI位址被劃底線]而被執行。所得到的DNA片段以RsrII和SpeI予以切割，並且被插入至以RsrII和SpeI予以分解的pCAP－HA1/Anhui或pCAP－PfCSP(A361E)中，俾以建構在所欲的雙重啟動子(由CAG啟動子以及gp64啟動子構成)的控制下，在哺乳動物以及昆蟲細胞中能夠表現一含有HA1抗原或PfCSP抗原以及
gp64蛋白的融合蛋白質之轉移載體質體pCA64－HA1/Anhui以及pCA64－PfCSP(A361E)。
(14)本發明的轉移載體質體pCA39－HA1/Anhui以及pCA39－PfCSP(A361E)的建構
使用BacVector－2000 DNA的Triple Cut DNA(來自Novagen)，PCR是使用vp39－p－f[5’－GACTCGGACCG
CGTCGTACAAATCGAAATATTGTTGTG－3’：(序列辨識編號：66)；RsrII位址被劃底線]以及vp39－p－r[5’－CGATACTAGT
GTGATTGAGAAAGAAATCTCTTATTC－3’：(序列辨識編號：67)；SpeI位址被劃底線]而被執行。所得到的DNA片段以RsrII和SpeI予以切割，並且被插入至以RsrII和SpeI予以消化的pCAP－HA1/Anhui或pCAP－PfCSP(A361E)中，俾以建構在所欲的雙重啟動子(由CAG啟動子以及vp39啟動子構成)的控制下，在哺乳動物以及昆蟲細胞中能夠表現一含有HA1抗原或PfCSP抗原以及gp64蛋白的融合蛋白質的轉移載體質體pCA39－HA1/Anhui以及pCA39－PfCSP(A361E)。
(15)本發明的pCAP－CO/full/VSV、pCAP－CO/19/VSV、pCAP－CO/76/VSV以及pCAP－CO/205/VSV
使用pVSV－G(來自Clonetech)作為一模版，PCR是使用VSV－G－f[5’－GACTCCCCGGG
CGTTCGAACATCCTCACATTCAAG－3’(序列辨識編號：68)；XmaI位址被劃底線]、VSV－G－r
[5’－GACTCACTTAGTG
CTTTCCAAGTCGGTTCATCTC－3’：(序列辨識編號：69)；DraIII位址被劃底線]而被執行。所得到的DNA片段被插入至pCAP－CO/full、pCAP－CO/19、pCAP－CO/76以及pCAP－CO/205(各者以XmaI和DraIII予以分解)中。所建構的質體被命名pCAP－Co/full/VSV、pCAP－CO/19/VSV、pCAP－CO/76/VSV以及pCAP－CO/205/VSV。
(1)重組型桿狀病毒是使用一種用於產生重組型桿狀病毒的套組(來自Novagen的BacVector－2000 Transfection Kit)，藉由將BacVector－2000 DNA與下列在實施例1中所建構的轉移載體的各個一起共轉染至Sf9細胞中而被產生：pCAP－PfCSP、pCAP－PfCSP/272、pCAP－PfCSP/467、pCAP－PfCSP(A361E)、pCAP－PfCSP(A361E)/272、pCAP－PfCSP(A361E)/467、pCAP－PfCSP－76、pCAP－PfCSP－76/467、pCAP－PfCSP＋209、pCAP－PfCSP＋209/467、pCAP－PfCSP＋76/209、pCAP－PfCSP＋76/209/467、pCAP－HA1/Anhui、pCAP－HA1/Anhui/272、pCAP－HA1/Anhui/467、pCAP－HA1/Vietnam、pCAP－HA1/Vietnam/51、pCAP－HA1/Vietnam/101、pCAP－HA1/Vietnam/154、pCAP－HA1/Vietnam/201、pCAP－HA1/Vietnam/272、
pCAP－HA1/Vietnam/467、pCAP－AH/345、pCAP－AH/345/467、pCAP－AH/410、pCAP－AH/410/467、pCAP－AH/473、pCAP－AH/473/467、pCAP－AH/520、pCAP－AH/520/467、pCAP－VN/346、pCAP－VN/346/467、pCAP－VN/410、pCAP－VN/410/467、pCAP－VN/473、pCAP－VN/473/467、pCAP－VN/520、pCAP－VN/520/467、pCAP－CO/full、pCAP－CO/full/467、pCAP－CO/19、pCAP－CO/19/467、pCAP－CO/76、pCAP－CO/76/467、pCAP－CO/205、pCAP－CO/205/467、pCA39－HA1/Anhui、pCA64－HA1/Anhui、pCA39－PfCSP(A361E)、pCA64－PfCSP(A361E)、pCAP－CO/full/VSV、pCAP－CO/19/VSV、pCAP－CO/76/VSV、pCAP－CO/205/VSV、pDual－Pfs25－PfCSP－gp64、pDual－PfMSP1－PfCSP－gp64。所形成的重組型桿狀病毒被命名為AcNPV－CAP－PfCSP、AcNPV－CAP－PfCSP/272、AcNPV－CAP－PfCSP/467、AcNPV－CAP－PfCSP(A361E)、AcNPV－CAP－PfCSP(A361E)/272、AcNPV－CAP－PfCSP(A361E)/467、AcNPV－CAP－PfCSP－76、AcNPV－CAP－PfCSP－76/467、AcNPV－CAP－PfCSP＋209、AcNPV－CAP－PfCSP＋209/467、AcNPV－CAP－PfCSP＋76/209、AcNPV－CAP－PfCSP＋76/209/467、AcNPV－CAP－HA1/Anhui、AcNPV－CAP－HA1/Anhui/272、AcNPV－CAP－HA1/Anhui/467、AcNPV－CAP－HA1/Vietnam、AcNPV－CAP－HA1/Vietnam/51、
AcNPV－CAP－HA1/Vietnam/101、AcNPV－CAP－HA1/Vietnam/154、AcNPV－CAP－HA1/Vietnam/201、AcNPV－CAP－HA1/Vietnam/272、AcNPV－CAP－HA1/Vietnam/467、AcNPV－CAP－AH/345、AcNPV－CAP－AH/345/467、AcNPV－CAP－AH/410、AcNPV－CAP－AH/410/467、AcNPV－CAP－AH/473、AcNPV－CAP－AH/473/467、AcNPV－CAP－AH/520、AcNPV－CAP－AH/520/467、AcNPV－CAP－VN/346、AcNPV－CAP－VN/346/467、AcNPV－CAP－VN/410、AcNPV－CAP－VN/410/467、AcNPV－CAP－VN/473、AcNPV－CAP－VN/473/467、AcNPV－CAP－VN/520、AcNPV－CAP－VN/520/467、AcNPV－CAP－CO/full、AcNPV－CAP－CO/full/467、AcNPV－CAP－CO/19、AcNPV－CAP－CO/19/467、AcNPV－CAP－CO/76、AcNPV－CAP－CO/76/467、AcNPV－CAP－CO/205、AcNPV－CAP－CO/205/467、AcNPV－CA39－HA1/Anhui、AcNPV－CA64－HA1/Anhui、AcNPV－CA39－PfCSP(A361E)、AcNPV－CA64－PfCSP(A361E)、AcNPV－CAP－CO/full/VSV、AcNPV－CAP－CO/19/VSV、AcNPV－CAP－CO/76/VSV、AcNPV－CAP－CO/205/VSV、AcNPV－Dual－Pfs25－PfCSP－gp64以及AcNPV－Dual－PfMSP1－PfCSP－gp64。
Sf9細胞以每井一為1 x 105
個細胞的濃度被培養在一個48－井平盤(來自Corning)中，並且以一為大約0.1的感染倍數(infection multiplicity)被感染以在實施例2中所得到的桿狀病毒AcNPV－CAP－PfCSP、AcNPV－CAP－HA1/Anhui以及AcNPV－CAP－HA1/Vietnam，或者一野生型桿狀病毒AcNPV－WT作為一對照組。在5天之後，培養物上清液從各個井被移除，並且接著樣品緩衝溶液(Sample Buffer Solution)(＋2ME,x2)(來自Wako)以每井一為0.05 mL的數量被添加以完全地溶解該等細胞。細胞溶胞產物(cell lysate)在100℃下被加熱歷時5分鐘，並且在7.5% SDS－PAGE上被進行電泳(electrophoresed)。在電泳之後，蛋白質被轉移至一PVDF膜(來自Millipore的Immobilon－P)，並且阻斷(blocking)是藉由將該膜浸於2.5%的脫脂乳(Skim Milk)/SuperBlock(來自Pierce)中而在4℃下被執行過夜。該膜(被感染以各個桿狀病毒的Sf9細胞的蛋白質已被轉移至該膜上)被培育以一抗－gp64抗體(來自eBioScience的AcV5)作為一次抗體(primary antibody)，並且接著被培育以一HRP－標記的山羊抗－小鼠IgG(H＋L)抗體(來自BioRad)作為二次抗體(second antibody)。顏色以一ECLplus西方墨點法偵測套組(ECLplus Western Blotting Detection kit)(來自GE Healthcare)予以顯像俾以偵測蛋白質帶(protein band)。第1圖顯示該等結果。
第1圖顯示顯示出融合抗原(來自含有人類瘧疾的PfCSP基因、流行性感冒病毒H5N1/Anhui/1/05株的HA1基因，以及H5N1/Vietnam/1203/04株的HA1基因的重組型桿狀病毒)在昆蟲細胞中的表現的西方墨點分析。在第1圖中，徑1顯示一野生型桿狀病毒(AcNPV－WT)的帶(band)；徑2顯示本發明之一重組型桿狀病毒(AcNPV－CAP－PfCSP)[含有被插入在雙重啟動子的下游處的PfCSP基因以及全長gp64基因]的帶；徑3顯示本發明之一重組型桿狀病毒(AcNPV－CAP－HA1/Anhui)(含有被插入在雙重啟動子的下游處的流行性感冒病毒H5N1/Anhui/1/05株的HA1基因以及全長gp64基因的帶；以及徑4顯示本發明之一重組型桿狀病毒(AcNPV－CAP－HA1/Vietnam)(含有被插入在雙重啟動子的下游處的流行性感冒病毒H5N1/Vietnam/1203/04株的HA1基因以及全長gp64基因)的帶。
如在第1圖的徑2、3和4中所顯示的，一對應於一免疫原性外來抗原基因以及gp64基因之被表現的融合產物的帶在本發明的重組型桿狀病毒(具有被融合並且被表現在雙重啟動子的下游處之一抗原基因以及gp64基因)中被觀察到。
上面的結果證實：當使用本發明的重組型病毒時，一免疫原性外來抗原基因以及gp64基因可被融合並且在昆蟲細胞中被表現有如一被表現的融合產物。
Sf9細胞被培養至每個150 mm細胞培養平盤(來自Sumilon)一為1 x 107
細胞的濃度，並且以一為大約0.1的感染倍數被感染以上面所描述的桿狀病毒的各個。在7天之後，培養基在4℃下以3,000 xg被離心歷時15分鐘2次，並且病毒溶液被層覆在一個25%蔗糖溶液上且使用一超速離心機(ultracentrifuge)在4℃下以25,000 rpm被離心歷時90分鐘以生成病毒顆粒。0.05 mL的樣品緩衝溶液(＋2ME,x2)(來自Wako)被添加至0.05 mL的下列的病毒濃縮物(virus concentrate)[藉由超速離心(ultracentrifugation)而被收集](1 x 108
PFU/mL)的各個：AcNPV－CAP－PfCSP、AcNPV－CAP－PfCSP/272、AcNPV－CAP－PfCSP/467、AcNPV－CAP－HA1/Vietnam以及AcNPV－WT。所形成的混合物在100℃下被加熱歷時5分鐘，並且在7.5% SDS－PAGE上被進行電泳。在電泳之後，所得到的蛋白質被轉移至PVDF膜(來自Millipore的Immobilon－P)，並且被浸於2.5%的脫脂乳(Skim Milk)/SuperBlock(來自Pierce)中以在4℃下執行阻斷(blocking)過夜。該膜(AcNPV－CAP－PfCSP、AcNPV－CAP－PfCSP/272以及AcNPV－CAP－PfCSP/467的病毒溶液已被轉移至該膜上)被培育以一抗－PfCSP抗體(2A10,MR－4)作為一次抗體，並且接著被培育以一HRP－標記的山
羊抗－小鼠IgG(H＋L)抗體(來自BioRad)作為二次抗體。該膜(AcNPV－CAP－HA1/Vietnam的病毒溶液已被轉移至該膜上)被培育以一抗－H5N1抗體(來自Immune Technology的IT－003－005)作為一次抗體，並且接著被培育以一HRP－標記的山羊抗－兔子IgG抗體(來自GE Healthcare)作為二次抗體。顏色以一ECLplus西方墨點法偵測套組(來自GE Healthcare)予以顯像俾以偵測蛋白質的帶。第2圖顯示該等結果。
第2(A)圖顯示顯示出人類瘧疾的CSP基因(PfCSP)在重組型桿狀病毒的病毒顆粒(使用重組型轉移載體而被製備)中之表現的西方墨點分析。徑1，第2(A)圖的左側徑，顯示本發明之一重組型桿狀病毒(AcNPV－CAP－PfCSP)(含有被插入在雙重啟動子的下游處的PfCSP基因以及全長gp64基因)的帶；徑2顯示本發明之一重組型桿狀病毒(AcNPV－CAP－PfCSP/272)[含有被插入在雙重啟動子的下游處的PfCSP基因以及部分長度gp64基因(從C端起的241個胺基酸殘基)]的帶；徑3顯示本發明之一重組型桿狀病毒(AcNPV－CAP－PfCSP/467)[含有被插入在雙重啟動子的下游處的PfCSP基因以及部分長度gp64基因(從C端起的46個胺基酸殘基)]的帶。該等桿狀病毒被進行電泳，並且PfCSP基因以及gp64基因的一被表現的融合產物的存在被確認。一強的帶(它指出在重組型病毒顆粒中PfCSP基因以及gp64基因的融合抗原的存在)在第2(A)圖的所有徑中被偵測到。
第2(B)圖顯示顯示出H5N1/HA1基因在重組型桿狀病
毒的病毒穎粒(使用重組型轉移載體而被製備)中之表現的西方墨點分析。徑1，第2(B)圖的左側徑，顯示使用在實施例3中所製備之經感染的AcNPV－WT細胞溶胞產物(infected AcNPV－WT cell lysate)所得到的結果；徑2顯示使用在實施例3中所製備之經AcNPV－CAP－HA1/Anhui感染的細胞溶胞產物(AcNPV－CAP－HA1/Anhui－infected cell lysate)所得到的結果；徑3顯示使用在實施例3中所製備之經AcNPV－CAP－HA1/Vietnam感染的細胞溶胞產物所得到的結果；以及徑4顯示一野生型桿狀病毒(AcNPV－WT)的病毒顆粒的結果；徑5顯示本發明之一重組型桿狀病毒(AcNPV－CAP－HA1/Vietnam)(含有被插入在雙重啟動子的下游處的流行性感冒病毒H5N1/Vietnam/1203/04株的HA1基因以及全長gp64基因)的病毒顆粒的結果；以及徑6顯示H5N1的經純化之HA抗原(來自Immune Technology的IT－003－0053p)的結果。該等桿狀病毒被進行電泳，並且PfCSP基因以及gp64基因的一被表現的融合產物的存在被確認。一強的帶[它指出在該重組型病毒顆粒中H5N1/Vietnam/1203/04的HA1基因以及gp64基因的一融合抗原的存在]在第2(B)圖的徑5中被偵測到。
上面實施例4的結果顯示：一具有所欲的免疫原性(immunogenicity)的外來基因以及gp64基因可被融合並且在本發明的重組型桿狀病毒(它是藉由使用本發明的重組型轉移載體而被產生)的重組型病毒顆粒中被表現。
HepG2細胞以一為1的感染倍數被感染以AcNPV－Dual－PfMSP1－PfCSP。在48小時之後，培養物上清液被移除，並且該平盤以PBS予以濕潤3次。一被冷卻至－20℃的丙酮/乙醇溶液(一為7：3的混合比例)被添加俾以在－20℃下固定細胞歷時5分鐘。一為5%的正常山羊血清(來自Sigma)被添加入以在室溫下執行阻斷歷時1小時。為了偵測PfCSP的表現，一被標記以Alexa Flour 594的抗－PfCSP抗體(2A10,MR－4)被加入；而為了偵測PfMSP－119
的表現，一抗－PfMSP－119
抗體(5.2,MR－4)以及接著一被標記以FITC的抗－小鼠抗體被加入。在培育之後，經反應的細胞在一螢光顯微鏡下被偵測。
第3圖顯示該等結果。
第3圖顯示被染色以一螢光－標記的抗體(fluorescence－labeled antibody)的HepG2細胞，該抗體指出：在HepG2細胞中，一抗原已從一重組型桿狀病毒(含有一具有PfMSP1基因以及PfCSP基因的融合基因)被表現。第3(A)圖的結果確認：一PfCSP抗原已經被表現。第3(B)圖的結果確認：一PfMSP－119
抗原已經被表現。因此被確認：融合抗原可在哺乳動物細胞中被表現。第3(A)和(B)圖的結果清楚地顯示：藉由使用本發明的轉移載體(含有雙重啟動子)而被產生的重組型桿狀病毒可在哺乳動物細胞中表現所欲
的抗原。
這暗示：當使用本發明的重組型轉移載體而被產生的重組型桿狀病毒被投藥給人類以及其他哺乳動物時，該等病毒顆粒進入哺乳動物細胞，並且一哺乳動物啟動子操作俾以在哺乳動物細胞中生成所欲的外來抗原基因以及gp64基因的一融合產物，因此誘發後天性免疫力。
1.病毒溶液的接種(Inoculation of Virus Solution)
藉由超速離心而被濃縮之AcNPV－WT、AcNPV－CAP－PfCSP、AcNPV－CAP－PfCSP/467、AcNPV－CAP－HA1/Anhui以及AcNPV－CAP－HA1/Vietnam的病毒溶液是以2週－間隔(two week－intervals)呈一為1 x 108
PUF的數量被接種至BALB/c雌性小鼠的大腿肌肉(thigh muscles)中2次。
2.抗體效價的測量(Measurement of Antibody Titers)
小鼠是在最後的免疫接種(final immunization)之後2週被安樂死(euthanized)，而血清是從該等小鼠被收集並且被用於測量抗原－專一性抗體效價。藉由AcNPV－CAP－PfCSP以及AcNPV－CAP－PfCSP/467誘發的PfCSP抗原－專一性抗體的效價是藉由使用一平盤[(NANP)4
NVDPC肽(來自Sigma)(亦即PfCSP的B細胞抗原決定位)已被固定在該平盤
上]的ELISA而被測量。藉由AcNPV－CAP－HA1/Anhui以及AcNPV－CAP－HA1/Vietnam誘發的H5N1/HA抗原－專一性抗體效價是藉由使用一平盤[H5N1病毒的經純化之HA抗原(來自Immune Technology的IT－003－005p)已被固定在該平盤上]的ELISA而被測量。在OD450 nm下的吸光值是使用MaxiSorp(來自NUNC)作為ELISA平盤、HRP－標記的山羊抗－小鼠IgG(H&L)抗體(來自American Qualex)作為二次抗體，以及TMB(來自Calbiochem)用於呈色反應(color reaction)予以測量。
第4圖顯示該等結果。
第4(A)圖是一繪製當小鼠血清被進行從800倍至102,400倍稀釋度的2倍連續稀釋時，各群組在OD450 nm下所得到的平均吸光值的圖形。在被接種以PBS以及AcNPV－WT的群組(它們的血清不含有針對抗原的抗體)中，即使800倍稀釋度的吸光值為0.1或更低，指出低的反應性。相對地，在被接種以AcNPV－CAP－PfCSP以及AcNPV－CAP－PfCSP/467的群組中，800倍稀釋度的吸光值分別為1.138以及1.878，指出強的反應性並且清楚地顯示抗原－專一性抗體被誘發。第4(B)圖是一繪製當小鼠血清被進行從400倍至25,600倍稀釋度的2倍連續稀釋時，各群組在OD450 nm下所得到的平均吸光值的圖形。在被接種以PBS以及AcNPV－WT的群組(它們的血清不含有針對該抗原的抗體)中，800倍稀釋度的吸光值為0.1或更低，指出低的反應性。相對地，在被接種以AcNPV－CAP－HA1/Anhui以及
AcNPV－CAP－HA1/Vietnam的群組中，3,200倍稀釋度的吸光值分別為1.551以及2.503，指出強的反應性並且清楚地顯示抗原－專一性抗體被誘發。第4圖清楚地顯示：使用本發明的轉移載體(含有雙重啟動子)而被產生的重組型桿狀病毒可在哺乳動物體內誘發一針對所欲抗原的抗體。
3.中和值的測量(Measurement of Neutralization Value)
一血球凝集抑制試驗[hemagglutination inhibition(HI)test]是使用一被接種以AcNPV－CAP－HA1/Anhui的小鼠血清而被執行。更特別地，該試驗是依據在與一流行性感冒HI試劑“Seiken”(來自Denka Seiken Co.,Ltd.)一起被包裝的操作指南(instructions)中所描述的方法，使用H5N1病毒的經純化之HA抗原(來自Immune Technology的IT－003－0053p)而被執行。非專一性凝集素(non－specific agglutinins)的吸收是使用紅血球而被執行，以及非專一性凝集抑制劑(non－specific agglutination inhibitors)的移除是使用“Seiken”的RDE(II)(來自Denka Seiken Co.,Ltd.)而被執行。該HI試驗以下列方式被執行。在一個96－井平盤中，0.025 mL的經10倍稀釋的抗血清是使用一稀釋劑(diluent)而被進行2倍連續稀釋。對於含有經稀釋之抗血清的96－井平盤的各個井，0.025 mL的H5N1病毒的HA抗原(被稀釋以得到每其0.025 mL一為4的HA效價)被添加。該平盤被容許靜置在室溫下歷時30分鐘。用於反應的0.05 mL之一紅血球懸浮液(erythrocyte suspension)被加入並且被充分地攪拌。該混合物被容許靜置在室溫下歷時60分鐘。在血球凝集被完全地
抑制之下的該試驗樣品的最終稀釋度被定義為HI抗體效價(HI antibody titer)。
該等結果顯示：經接種以PBS以及AcNPV－WT的血清具有10或者更低的HI抗體效價，而經接種以AcNPV－CAP－HA1/Anhui的血清具有一為40的HI抗體效價。
這些結果似乎指出：當被投藥給人類以及其他哺乳動物時，從本發明的重組型轉移載體被產生之重組型桿狀病毒可誘發一對所欲的外來抗原基因是為有效的抗體，因此提供疫苗效用。
序列辨識編號：1和2是用於結核分枝桿菌H37Rv(M.tubercu/osis
H37Rv)的基因體DNA之PCR的引子phsp65－F1以及phsp65－R1的序列。
序列辨識編號：3和4是用於以pcDNA－hps65作為一模版之PCR的引子phsp65－F2以及phsp65－R2的序列。
序列辨識編號：5和6是用於PCR(以pBACsurf－1作為一模版)以產生一gp64基因DNA片段的引子pPolh－F2以及pgp64－R2的序列。
序列辨識編號：7和8是用於PCR以產生一流行性感冒病毒HA基因片段的引子HA－f以及HA－r的序列。
序列辨識編號：9和10是用於以pCR－Blunt－HA作為一模版之PCR的引子pHA－F1以及pHA－R1的序列。
序列辨識編號：11和12是用於以pBACsurf－HA1作為一模版之PCR的引子Polh－f RsrII以及GP64－r DraIII的序列。
序列辨識編號：13和14是用於流行性感冒病毒PR/8/34株的基因體RNA之RT－PCR的引子NP－f EcoRI以及NP－r Cfr9I的序列。
序列辨識編號15、16和12是用於pCAP－H1N1/HA1－gp64之PCR的引子gp64(272)－f、gp64(467)－f以及GP64－r DraIII的序列。
序列辨識編號：17和18是用於以惡性瘧原蟲(P.falciparum
)基因體DNA作為一模版之PCR的引子PfCSP－f(19)以及PfCSP－r(373)的序列。
序列辨識編號：19和20是用於以齧齒瘧蟲(P.berghei
)基因體DNA作為一模版之PCR的引子pAMA－F1以及pAMA1－R1的序列。
序列辨識編號：21和22是用於以惡性瘧原蟲基因體DNA作為一模版之PCR的引子pPfCSP－F1以及pPfCSP－R1的序列。
序列辨識編號：23和24是用於以惡性瘧原蟲基因體DNA作為一模版之PCR的引子pPfs25－F1以及pPfS25－R2的序列。
序列辨識編號：25和26是用於以惡性瘧原蟲基因體DNA作為一模版之PCR的引子pPfMSP119－F1以及pPfMSP119－R2的序列。
序列辨識編號：17和27是用於以pCAP－PfCSP作為一模版之PCR的引子PfCSP－f(19)以及PfCSP－r(373 A361E)的序列。
序列辨識編號：28和27是用於以pCAP－PfCSP作為一模版之PCR的引子PfCSP－f(76)以及PfCSP－r(373 A361E)的序列。
序列辨識編號：29是使用在Sf9以及人類細胞中所經常使用的密碼子而從惡性瘧原蟲3D7株(P.falciparum
3D7 strain)的PfCSP之胺基酸序列被產生的一人工基因(PfCSP＋)的序列(然而，其中在361位置處的A被E所取代)。
序列辨識編號：30和31是用於以PfCSP＋作為一模版之PCR的引子PfCSP－f(＋209)以及PfCSP－r(＋A361E)的序列。
序列辨識編號：32、33、34和31是用於以PfCSP＋作為一模版之PCR的引子PfCSP－f(＋76)、PfCSP－r(＋128)、PfCSP－f(＋209)BamHI以及PfCSP－r(＋A361E)的序列。
序列辨識編號：35是使用在Sf9以及人類細胞中所經常使用的密碼子而從流行性感冒病毒H5N1/Anhui/1/05的血球凝集素之HA1區域的胺基酸序列被產生的一人工基因的序列。
序列辨識編號：36和37是用於以該具有序列辨識編號：35之人工基因序列作為一模版之PCR的引子AH－F1[5’－CAGTCTGCAG
GACCAGATTTGCATC－3’：(序列辨識編號：36)；PstI位址被劃底線]以及AH－R4[5’－CAGTCCCGGG
CTCTCTTGCGCCTGC－3’：(序列辨識編號：37)；XmaI位址被劃底線]的序列。
序列辨識編號：38是使用在Sf9以及人類細胞中所經常使用的密碼子而從流行性感冒病毒H5N1/Vietnam/1203/04
的血球凝集素之HA1區域的胺基酸序列被產生的一人工基因的序列。
序列辨識編號：39和40是用於以該具有序列辨識編號：38之人工基因序列作為一模版之PCR的引子VN－F1[5’－CAGTCTGCAG
GACCAGATCTGTATC－3’：(序列辨識編號：39)；PstI位址被劃底線]以及VN－R4[5’－CAGTCCCGGG
CTCTCTTCTTCCTGC－3’：(序列辨識編號：40)；XmaI位址被劃底線]的序列。
序列辨識編號：41、42、43、44和12是引子gp64(51)－f[5’－GACTCCCCGGG
TGGAAATCACCATCGTGGAGACG－3’：(序列辨識編號：41)；XmaI位址被劃底線]、gp64(101)－f[5’－GACTCCCCGGG
ATTTGCTTATGTGGAGCATCAGG－3’：(序列辨識編號：42)；XmaI位址被劃底線]、gp64(154)－f[5’－GACTCCCCGGG
CGCACCACACGTGCAACAAATCG－3’：(序列辨識編號：43)；XmaI位址被劃底線]、gp64(201)－f[5’－GACTCCCCGGG
ACACTGTGCTTCATCGAGACGGC－3’：(序列辨識編號：44)；XmaI位址被劃底線]以及GP64－r DraIII[5’－GGGCACTTAGTG
ATATTGTCTATTACGGTTTCTAATC－3’(序列辨識編號：12)；Dralll位址被劃底線]的序列。
序列辨識編號：45是藉由使用Gene Designer(可得自於DNA2.0,Inc)的密碼子最佳化(codon optimization)而從流行性感冒病毒H5N1/Anhui/1/05的血球凝集素之HA1區域的胺基酸序列被產生的一人工基因的序列。
序列辨識編號：46、47、48、49和50是下列用於以該具有序列辨識編號：45之人工基因序列作為一模版之PCR的序列：AH17－F[5’－GACTCTGCAG
GATCAGATCTGTATTGGGTACC－3’：(序列辨識編號：46)；PstI位址被劃底線]，以及AH345－R[5’－CGATCCCGGG
CTCTCTTTCTCCTCCGCTCGC－3’：(序列辨識編號：47)；XmaI位址被劃底線]、AH410－R[5’－CGATCCCGGG
CGGCCTCGAACTGGGTGTTCATT－3’：(序列辨識編號：48)；XmaI位址被劃底線]、AH473－R[5’－CGATCCCGGG
CGTCTCTGAGTTGAAGGCGCAC－3’：(序列辨識編號：49)；XmaI位址被劃底線]以及AH520－R[5’－CGATCCCGGG
CACCACTAATTTCCTCTCGCTTC－3’：(序列辨識編號：50)；XmaI位址被劃底線]。
序列辨識編號：51是藉由使用Gene Designer(可得自於DNA2.0,Inc)的密碼子最佳化而從流行性感冒病毒H5N1/Vietnam/1203/04的血球凝集素之HA1區域的胺基酸序列被產生之一人工基因的序列。
序列辨識編號：52、53、54、55和56是下列用於以該具有序列辨識編號：51之人工基因序列作為一模版之PCR的引子的序列：VN17－F[5’－GACTCTGCAG
GATCAGATCTGTATCGGATATC－3’：(序列辨識編號：52)；PstI位址被劃底線]，以及VN346－R[5’－CGATCCCGGG
CCCGCTTTTTCCTCCTCCGTTCG－3’：(序列辨識編號：53)；XmaI位址被劃底線]、VN410－R
[5’－CGATCCCGGG
CCTCAAACTGCGTATTCATTTTG－3’：(序列辨識編號：54)；XmaI位址被劃底線]、VN473－R[5’－CGATCCCGGG
CTCTAAGCTGGAGCCTGACTTTGTC－3’：(序列辨識編號：55)；XmaI位址被劃底線]以及VN520－R[5’－CGATCCCGGG
CACTAATCTCCTCTCTTTTAAGTC－3’：(序列辨識編號：56)；XmaI位址被劃底線]。
序列辨識編號：57是藉由使用Gene Designer(可得自於DNA2.0,Inc)的密碼子最佳化而從惡性瘧原蟲3D7株的CSP的胺基酸序列被產生之一人工基因的序列。
序列辨識編號58、59、60、61以及62是下列用於以該具有序列辨識編號：57之人工基因序列作為一模版之PCR的引子的序列：PfCSP_opt－f[5’－GACTCTGCAG
ATGATGCGAAAATTGGCCATACTG－3’：(序列辨識編號：58)；PstI位址被劃底線]、PfCSP_opt－r(397)[5’－CGATCCCGGG
CATTGAGGAACAGAAAGGAAAGAACCATG－3’：(序列辨識編號：59)；XmaI位址被劃底線]、PfCSP_opt－f(19)[5’－GACTCTGCAG
CTGTTTCAGGAATACCAGTGCTATGG－3’：(序列辨識編號：60)；PstI位址被劃底線]、PfCSP_opt－r(373)[5’－CGATCCCGGG
CCTTCTCCATCTTACAAATTTTCTTTTCAATATCATTAGC－3’：(序列辨識編號：61)；XmaI位址被劃底線]、PfCSP_opt－f(76)[5’－GACTCTGCAG
GACGACGGAAATAATGAGGACAACG[5’-GACTCTGCAG
GACGACGGAAATAATGAGGACAACG-3’：(序列辨識編號：62)；PstI位址被劃底線]以及PfCSP_opt-f(205)[5’-GACTCTGCAG
AATGCAAACCCAAATGCCAATCCAAACGC-3’：(序列辨識編號：63)；PstI位址被劃底線]。
序列辨識編號：64、65、66以及67是下列用於以桿狀病毒基因體DNA作為一模版之PCR的引子的序列：gp64-p-f[5’-GACTCGGACCG
GCCAGATAAAAATAATCTTATCAATTAAG-3’：(序列辨識編號：64)；RsrII位址被劃底線]、gp64-p-r[5’-CGATACTAGT
AGCACTGAGGCTTCTTATATACCCG-3’：(序列辨識編號：65)；SpeI位址被劃底線]，以及vp39-p-f[5’-GACTCGGACCG
CGTCGTACAAATCGAAATATTGTTGTG-3’：(序列辨識編號：66)；RsrII位址被劃底線]以及vp39-p-r[5’-CGATACTAGT
GTGATTGAGAAAGAAATCTCTTATTC-3’：(序列辨識編號：67)；SpeI位址被劃底線]。
序列辨識編號：68和69是下列用於以pVSV-G作為一模版之PCR的引子的序列：VSV-G-f[5’-GACTCCCCGGG
CGTTCGAACATCCTCACATTCAAG-3’(序列辨識編號：68)；XmaI位址被劃底線]以及VSV-G-r[5’-GACTCACTTAGTG
CTTTCCAAGTCGGTTCATCTC-3’：(序列辨識編號：69)；DraIII位址被劃底線]。
表1顯示本發明的轉移載體
第1圖顯示在實施例3中來自本發明的重組型桿狀病毒之疫苗抗原在昆蟲細胞中的表現的試驗結果。
第2(A)圖顯示一顯示出人類瘧疾的CSP基因(PfCSP)在重組型桿狀病毒(從重組型轉移載體被產生)的病毒顆粒中之表現的西方墨點分析。
第2(B)圖顯示一顯示出H5N1/HA1基因在重組型桿狀病毒(從重組型轉移載體被產生)的病毒顆粒中之表現的西方墨點分析。
第3圖顯示被染色以一螢光-標記的抗體的HepG2細胞，它指出在HepG2細胞中一抗原已藉由一重組型桿狀病毒(含有一具有PfMSP1基因以及PfCSP基因的融合基因)而被表現。第3(A)圖的結果確認：一PfCSP抗原已被表現。第3(B)圖的結果確認：一PfMSP-119
抗原已被表現。
第4圖顯示在實施例6中所得到的抗體效價之測量的結果。
<110> 大塚製藥股份有限公司 自治醫科大學<120> 新穎的病毒載體<130> 200875 <150> JP 2007－205785 <151> 2007－08－07 <160> 79 <170> Patent In version 3.4 <210> 1 <211> 42 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子phsp65－F1 <400> 1<210> 2 <211> 63 <212> DNA <213> 人工序列<220>
<223> 引子phsp65－R1 <400> 2<210> 3 <211> 74 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子phsp65－F2 <400> 3<210> 4 <211> 37 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子phsp65－R2 <400> 4<210> 5 <211> 48 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子pPolh－F2 <400> 5<210> 6 <211> 35 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子pgp64－R2 <400> 6<210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子HA－f
<400> 7<210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子HA－r <400> 8<210> 9 <211> 37 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子HA－F1 <400> 9<210> 10 <211> 32 <212> DNA
<213> 人工序列<220> <223> 引子pHA－R1 <400> 10<210> 11 <211> 35 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子Polh－f RsrII <400> 11<210> 12 <211> 37 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子GP64－r DraIII <400> 12<210> 13 <211> 27 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子NP－f EcoRI <400> 13<210> 14 <211> 31 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子NP－r Cfr9I <400> 14<210> 15 <211> 31 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子gp64(272)－f
<400> 15<210> 16 <211> 31 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子gp64(467)－f <400> 16<210> 17 <211> 39 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子PfCSP－f(19) <400> 17<210> 18 <211> 44 <212> DNA
<213> 人工序列<220> <223> PfCSP－r(373) <400> 18<210> 19 <211> 40 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子pAMA－F1 <400> 19<210> 20 <211> 37 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子pAMA1－R1 <400> 20<210> 21 <211> 40 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子pPfCSP－F1 <400> 21<210> 22 <211> 34 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子pPfCSP－R1 <400> 22<210> 23 <211> 43 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子pPfs25－F1
<400> 23<210> 24 <211> 66 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子pPfs25－R2 <400> 24<210> 25 <211> 41 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子pPfMSP119－F1 <400> 25<210> 26 <211> 64
<212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子pPfMSP119－R2 <400> 26<210> 27 <211> 50 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子PfCSP－r(373 A361E) <400> 27<210> 28 <211> 35 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子PfCSP－f(76) <400> 28<210> 29 <211> 1194 <212> DNA <213> 惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum) <400> 29 <210> 30 <211> 52 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子PfCSP－f(＋209) <400> 30<210> 31 <211> 35 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子PfCSP－r(＋A361E) <400> 31<210> 32 <211> 35
<212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子PfCSP－f(＋76) <400> 32<210> 33 <211> 32 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子PfCSP－r(＋128) <400> 33<210> 34 <211> 35 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子PfCSP－f(＋209) <400> 34<210> 35 <211> 987 <212> DNA <213> 流行性感冒病毒(Influenza virus) <400> 35<210> 36 <211> 25 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子AH－F1 <400> 36<210> 37 <211> 25 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子AH－R4 <400> 37<210> 38 <211> 990 <212> DNA <213> 流行性感冒病毒(influenza virus) <400> 38 <210> 39 <211> 25 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子VN－F1 <400> 39<210> 40 <211> 25 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子VN－R4 <400> 40<210> 41 <211> 34 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子gp64(51)－f <400> 41<210> 42 <211> 34 <212> DNA <213> 人工序列
<220> <223> 引子gp64(101)－f <400> 42<210> 43 <211> 34 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子gp64(154)－f <400> 43<210> 44 <211> 34 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子gp64(201)－f <400> 44<210> 45
<211> 1701 <212> DNA <213> 流行性感冒病毒(influenza virus) <400> 45 <210> 46 <211> 32 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子AH17－F <400> 46<210> 47 <211> 31 <212> DNA <213> 人工序列<220>
<223> 引子AH345－R <400> 47<210> 48 <211> 33 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子AH410－R <400> 48<210> 49 <211> 32 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子AH473－R <400> 49<210> 50 <211> 33
<212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子AH520－R <400> 50<210> 51 <211> 1704 <212> DNA <213> 流行性感冒病毒(influenza virus) <400> 51 <210> 52 <211> 32 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子VN17－F
<400> 52<210> 53 <211> 33 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子VN346－R <400> 53<210> 54 <211> 33 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子VN410－R <400> 54<210> 55 <211> 35 <212> DNA
<213> 人工序列<220> <223> 引子VN473－R <400> 55<210> 56 <211> 34 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子VN520－R <400> 56<210> 57 <211> 1191 <212> DNA <213> 惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum) <400> 57 <210> 58 <211> 34 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子PfCSP_opt－f <400> 58<210> 59 <211> 39 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子PfCSP_opt－r(397) <400> 59<210> 60 <211> 36 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子PfCSP_opt－f(19) <400> 60<210> 61 <211> 50 <212> DNA <213> 人工序列
<220> <223> 引子PfCSP_opt－r(373) <400> 61<210> 62 <211> 35 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子PfCSP_opt－f(76) <400> 62<210> 63 <211> 39 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子PfCSP_opt－f(205) <400> 63<210> 64
<211> 40 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子gp64－p－f <400> 64<210> 65 <211> 35 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子gp64－p－r <400> 65<210> 66 <211> 38 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子vp39－p－f <400> 66<210> 67 <211> 36 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子gp64－p－r <400> 67<210> 68 <211> 35 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 引子VSV－G－f <400> 68<210> 69 <211> 34 <212> DNA <213> 人工序列
<220> <223> 引子VSV－G－r <400> 69<210> 70 <211> 397 <212> PRT <213> PfCSP蛋白質XP_001351122 <400> 70 <210> 71 <211> 567 <212> PRT <213> HA/A/Anhui/1/2005蛋白質ABD28180 <400> 71 <210> 72 <211> 568 <212> PRT <213> HA/A/Vietnam/1203/2004蛋白質AAW80717 <400> 72 <210> 73 <211> 1720 <212> PRT <213> PfMSP1蛋白質XP_001352170 <400> 73 <210> 74 <211> 217 <212> PRT <213> Pfs25蛋白質XP_001347587 <400> 74 <210> 75
<211> 1194 <212> DNA <213> PfCSP基因XM_001351086 <400> 75<210> 76 <211> 1704 <212> DNA <213> HA/A/Anhui/1/2005基因DQ371928 <400> 76 <210> 77 <211> 1707 <212> DNA <213> HA/A/Vietnam/1203/2004基因AY818135 <400> 77 <210> 78
<211> 5163 <212> DNA <213> PfMSP1基因XM_001352134 <400> 78 <210> 79 <211> 654 <212> DNA <213> Pfs25基因XM_001347551
<400> 79
Claims (3)
- 一種藥學組成物，包含一重組苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒(AcNPV)做為一活性劑，及選擇性的，一藥學上可接受之載體，其中，該重組AcNPV含有一具有下述融合基因的基因結構：(A)一編碼序列辨識編號：70(惡性瘧原蟲環狀子孢子蛋白；PfCSP)之部分胺基酸序列之基因，及(B)一編碼gp64病毒顆粒蛋白(gp64)之部分胺基酸序列之基因，該gp64係被編碼於AcNPV基因體(GenBank登錄號：L22858)並且受控於一含有彼此連結之多角體蛋白啟動子及CAG啟動子之雙重啟動子(CAP)。
- 如請求項1之藥學組成物，其中，該重組AcNPV係選自由下列所組成之群組：(1)一重組AcNPV，其包含一編碼由序列辨識編號：70之第19-373胺基酸殘基所組成之胺基酸序列之基因來作為基因(A)，及一編碼由gp64之第21-512胺基酸所組成之胺基酸序列之基因來作為基因(B)(AcNPV-CAP-PfCSP)，該gp64係被編碼於AcNPV基因體(GenBank登錄號：L22858)；(2)一重組AcNPV，其包含一編碼由序列辨識編號：70之第19-373胺基酸殘基所組成之胺基酸序列之基因來作為基因(A)，及一編碼由gp64之第467-512胺基酸所組 成之胺基酸序列之基因來作為基因(B)(AcNPV-CAP-PfCSP/467)，該gp64係被編碼於AcNPV基因體(GenBank登錄號：L22858)；(03)一重組AcNPV，其包含一編碼由序列辨識編號：70之第205-373胺基酸殘基所組成之胺基酸序列之基因來作為基因(A)，及一編碼由gp64之第21-512胺基酸所組成之胺基酸序列之基因來作為基因(B)(AcNPV-CAP-CO/205)，該gp64係被編碼於AcNPV基因體(GenBank登錄號：L22858)；(04)一重組AcNPV，其包含一編碼由序列辨識編號：70之第76-373胺基酸殘基所組成之胺基酸序列之基因來作為基因(A)，及一編碼由gp64之第467-512胺基酸所組成之胺基酸序列之基因來作為基因(B)(AcNPV-CAP-CO/76/467)，該gp64係被編碼於AcNPV基因體(GenBank登錄號：L22858)；(05)一重組AcNPV，其包含一編碼由序列辨識編號：70之第76-373胺基酸殘基所組成之胺基酸序列之基因來作為基因(A)，及一編碼由gp64之第21-512胺基酸所組成之胺基酸序列之基因來作為基因(B)(AcNPV-CAP-CO/76)，該gp64係被編碼於AcNPV基因體(GenBank登錄號：L22858)；(06)一重組AcNPV，其包含一編碼由序列辨識編號：70之第1-397胺基酸殘基所組成之胺基酸序列之基因來作為基因(A)，及一編碼由gp64之第21-512胺基酸所組成 之胺基酸序列之基因來作為基因(B)(AcNPV-CAP-CO/full)，該gp64係被編碼於AcNPV基因體(GenBank登錄號：L22858)；(07)一重組AcNPV，其包含一編碼由序列辨識編號：70之第205-373胺基酸殘基所組成之胺基酸序列之基因來作為基因(A)，及一編碼由gp64之第467-512胺基酸所組成之胺基酸序列之基因來作為基因(B)(AcNPV-CAP-CO/205/467)，該gp64係被編碼於AcNPV基因體(GenBank登錄號：L22858)；(08)一重組AcNPV，其包含一編碼由序列辨識編號：70之第19-373胺基酸殘基所組成之胺基酸序列之基因來作為基因(A)，及一編碼由gp64之第467-512胺基酸所組成之胺基酸序列之基因來作為基因(B)(AcNPV-CAP-CO/19/467)，該gp64係被編碼於AcNPV基因體(GenBank登錄號：L22858)；(09)一重組AcNPV，其包含一編碼由序列辨識編號：70之第19-373胺基酸殘基所組成之胺基酸序列之基因來作為基因(A)，及一編碼由gp64之第21-512胺基酸所組成之胺基酸序列之基因來作為基因(B)(AcNPV-CAP-CO/19)，該gp64係被編碼於AcNPV基因體(GenBank登錄號：L22858)；(10)一重組AcNPV，其包含一編碼由序列辨識編號：70之第1-397胺基酸殘基所組成之胺基酸序列之基因來作為基因(A)，及一編碼由gp64之第467-512胺基酸所組成 之胺基酸序列之基因來作為基因(B)(AcNPV-CAP-CO/full/467)，該gp64係被編碼於AcNPV基因體(GenBank登錄號：L22858)；(11)一重組AcNPV，其包含一編碼由序列辨識編號：70之第209-373胺基酸殘基所組成之胺基酸序列之基因來作為基因(A)，及一編碼由gp64之第467-512胺基酸所組成之胺基酸序列之基因來作為基因(B)(AcNPV-CAP-PfCSP+209/467)，該gp64係被編碼於AcNPV基因體(GenBank登錄號：L22858)；及，(12)一重組AcNPV，其包含一編碼由序列辨識編號：70之第76-128及第209-373胺基酸殘基所組成之胺基酸序列之基因來作為基因(A)，及一編碼由gp64之第467-512胺基酸所組成之胺基酸序列之基因來作為基因(B)(AcNPV-CAP-PfCSP+76/209/467)，該gp64係被編碼於AcNPV基因體(GenBank登錄號：L22858)。
- 如請求項1或2之藥學組成物，其係一瘧疾疫苗。
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