JP4171930B2 - 新規ウイルスベクター - Google Patents

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Description

本発明は、新規なトランスファーベクター、該トランスファーベクターとバキュロウイルスDNAとが相同組換えされた組換えバキュロウイルス及びそれらの製造方法が提供される。
また、本発明は上記組換えバキュロウイルスを有効成分とする医薬(例えばワクチン、マラリア、インフルエンザウイルス感染症の予防または治療薬)に関する。
バキュロウイルスのベクターとしての使用は昆虫細胞を用いた目的タンパク質の工業的生産方法に利用されていた。近年、バキュロウイルスが昆虫細胞のみならず、哺乳動物において外来遺伝子を導入できることが分かり、治療用遺伝子導入ベクターの可能性が見出され特許文献1には、バキュロウイルスの初期遺伝子由来プロモーターにウイルス非構造タンパク質をコードする遺伝子を含むDNA領域と後期遺伝子由来のプロモーターにウイルスの構造タンパク質をコードする遺伝子を含むDNA領域からなる複数の独立したプロモーターを有する組換えバキュロウイルス発現ベクターが開示されている。
また、特許文献2には、複数の独立したプロモーターにそれぞれ所望の外来遺伝子が結合したベクターの外因性遺伝子が発現されるように制御されたプロモーターを含む非哺乳動物ＤＮＡウイルスを細胞に導入し、哺乳動物細胞内で外来遺伝子を発現させる方法が開示されている。
さらに、特許文献3には、バキュロウイルスを用いた遺伝子組換え技術によるタンパク質の生産方法について開示されており、バキュロウイルスのgp64遺伝子と所望のタンパク質をコードする遺伝子とが結合した融合遺伝子を発現させて、所望のタンパク質をウイルス粒子に融合させた形で生産し、所望のタンパク質が融合されたウイルス粒子を回収し、さらに該ウイルス粒子から所望のタンパク質を切断して回収するタンパク質の生産方法が開示されている。
特許文献4には、バキュロウイルス発現系について、宿主細胞において活性であり、かつ、非許容細胞において不活性である第1のプロモーターに機能しうる形で連結された検出マーカーをコードする 第1の核酸配列、および非許容細胞において活性である第２のプロモーターに機能しうる形で連結された外来核酸配列を含む第2の核酸配列を含んでなる、複数の独立したプロモーターを有する組換えバキュロウイルス発現ベクターが開示されている。
また、特許文献5には、チキンβアクチン由来のCAGプロモーターに連結されたインフルエンザウイルス・ヘマグルチニン(HA)抗原発現組換えバキュロウイルスベクターがインフルエンザウイルス感染予防効果を有することからワクチン製剤として有用であることが開示されている。
さらに特許文献6には、バキュロウイルスプロモーターと哺乳動物細胞由来のプロモーターのそれぞれに細胞表面に発現可能なタンパク質をコードする遺伝子を連結させたプラスミド、または二組のバキュロウイルスプロモーターのそれぞれに細胞表面に発現可能なタンパク質をコードする遺伝子を連結させたプラスミドとを昆虫細胞にコトランスフェクトするコトランスフェクション工程を含むバキュロウイルスベクターの製造方法が開示されている。
そして、特許文献7にはCAGプロモーターにインフルエンザウイルスHAのcDNAが組み込まれた組換えバキュロウイルスを用いたインフルエンザウイルス感染に対する抗インフルエンザウイルス活性の検討を開示しており、組換えバキュロウイルスだけでなく、野生型バキュロウイルスにも該活性を有することが開示されている。
このように近年、様々な組換えバキュロウイルスベクターが開発され、それらを用いた当該組換えバキュロウイルスを有効成分として、哺乳動物に対する医薬開発が検討されている。
当業界では、新規な構造を有する組換えバキュロウイルスベクターであって、インフルエンザウイルス、マラリア、結核などの感染症、或いは癌などの疾患に対して有効な新規な組換えバキュロウイルスを有効成分とする医薬製剤、特にワクチン製剤の開発が所望されている。
特許第3366328号：多重プロモーターバキュロウイルス発現系及び欠陥粒子産物 WO98/011243号：改変されたコートタンパク質を有する非哺乳動物DNAウイルス 特開2002-253263号：タンパク質の生産方法 特開2003-284557号:新規バキュロウイルス移入ベクターおよび外来遺伝子発現用の組換えバキュロウイルス WO02/062381号：バキュロウイルスベクターワクチン WO04/029259号：バキュロウイルスベクター・バキュロウイルスベクター製造方法及び遺伝子導入方法 特開2005-15346号:バキュロウイルス含有抗ウイルス剤
本発明の目的は、新規な組換えトランスファーベクター、当該組換えトランスファーベクターとバキュロウイルスDNAとが相同組換えされた組換えバキュロウイルス及びそれらの製造方法を提供することにある。また、本発明の他の目的は上記組換えバキュロウイルスを有効成分とする医薬、特にワクチン製剤を提供することにある。
本発明者らは、昆虫細胞中および脊椎動物(特に、哺乳類、鳥類、魚類など)細胞中の両者において所望の免疫原性を有するタンパク質、或いは部分タンパク質または免疫原性を有するタンパク質とサイトカインなどとの融合タンパク質を発現可能な新規な構造を有するトランスファーベクター、当該組換えトランスファーベクターとバキュロウイルスDNAとが相同組換えされた組換えバキュロウイルスを見出した。当該組換え体バキュロウイルスの提供により、効果的に疾患の感染予防、および／または治療効果を有する組換えバキュロウイルスを有効成分とする医薬について、鋭意研究を重ねた結果、当該組換えバキュロウイルスが、所望の医薬として効果を有することを新たに見出した。
そして、本発明によれば、新規な構造を有する組換えトランスファーベクター、当該組換えトランスファーベクターとバキュロウイルスDNAとが相同組換えされた組換えバキュロウイルスとそれらの製造方法、そして組換えバキュロウイルス自身が標的細胞中において所望の免疫原性を有するタンパク質を発現可能な医薬として、マラリア、インフルエンザウイルスなどの感染症の予防医薬として有効であることを確認しここに発明を完成した。
本発明は、下記項1−31に示される発明を提供する。
項1． 一方が脊椎動物プロモーターで、他方がバキュロウイルスのプロモーターである連結したデュアル・プロモーターの下流に、少なくとも一つのウイルス粒子の構成成分になり得るタンパク質をコードする遺伝子と、少なくとも一つの免疫原性外来遺伝子とを含む融合遺伝子を連結することを特徴とする、デュアル・プロモーターと融合遺伝子が組み込まれた構造体を含むトランスファーベクターの製造方法。
項2． 前記脊椎動物プロモーターが哺乳動物プロモーターである、項１に記載の方法。
項3． 少なくとも一つのウイルス粒子の構成成分になり得るタンパク質をコードする遺伝子が、バキュロウイルスgp64遺伝子、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質遺伝子、1型ヒト免疫不全ウイルス糖タンパク質遺伝子、ヒト呼吸器合胞体ウイルス膜糖タンパク質遺伝子、A型インフルエンザウイルスヘマグルチニンタンパク質遺伝子、B型インフルエンザウイルスヘマグルチニンタンパク質遺伝子、単純ヘルペスウイルス糖タンパク質遺伝子、マウス肝炎ウイルスSタンパク質遺伝子のいずれかであることを特徴とする項１または２に記載の方法。
項4． 脊椎動物プロモーターがサイトメガロウイルスプロモーター、SV40プロモーター、レトロウイルスプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロテインプロモーター、ＣＡＧプロモーター、エロンゲーションファクター1αプロモーター、アクチンプロモーター、ユビキチンプロモーター、アルブミンプロモーター、MHCクラスIIプロモーターのいずれかから選択される項２に記載の方法。
項5． バキュロウイルスのプロモーターがポリヘドリンプロモーター、ｐ10プロモーター、IE1プロモーター、IE2プロモーター、p35プロモーター、p39プロモーター、gp64プロモーターのいずれかから選択される項１から４のいずれかに記載の方法。
項6． 免疫原性外来遺伝子がマラリア抗原、インフルエンザウイルス抗原、結核菌抗原、SARSウイルス抗原、西ナイル熱ウイルス抗原、デング熱ウイルス抗原、HIV抗原、HCV抗原、リューシマニア抗原、トリパノソーマ抗原、ロイコチトゾーン抗原単独、もしくはこれらの抗原遺伝子群から選ばれる少なくとも1種とサイトカインとの融合抗原のいずれかから選択される項１から５のいずれかに記載の方法。
項7． トランスファーベクターが、pDual-Hsp65-gp64、pDual-PbCSP-gp64、pDual-H1N1/HA1-gp64、pDual-PbTRAMP-gp64、pDual-PbAMA1D123-gp64、pDual-PbMSP129-gp64 、pDual-PfCSP-gp64、pDual-PfAMA1-gp64、pDual-Pfs25-gp64、pDual-H5N1/HA1-gp64、pDual-SARS/S-gp64、pCP-H1N1/HA1-gp64、pCAP-H1N1/HA1-gp64、pCU-H1N1/HA1-gp64、pDual-H1N1/NP-gp64、pDual-H1N1/M2-gp64、pDual-H1N1/NAe-gp64、pDual-M2e-gp64、pCP-HA1/NC99-gp64、pCP-H1N1/HA0-gp64、pCP-H1N1/HA2-gp64、pCP-H1N1/HA1-vp39、pCP-H1N1/NP-vp39のいずれかである項１から６のいずれかに記載の方法。
項８． 一方が脊椎動物プロモーターで、他方がバキュロウイルスのプロモーターである連結したデュアル・プロモーターの下流に連結された、少なくとも一つのウイルス粒子の構成成分になり得るタンパク質をコードする遺伝子と少なくとも一つの免疫原性外来遺伝子とを含む融合遺伝子が組み込まれた構造体を含むトランスファーベクターを製造する工程、該トランスファーベクターとバキュロウイルスDNAとを昆虫の宿主細胞にコトランスフェクションする工程、組換えバキュロウイルスを分離する工程を含む、組換えバキュロウイルスの製造方法。
項９． 少なくとも一つのウイルス粒子の構成成分になり得るタンパク質をコードする遺伝子が、バキュロウイルスgp64遺伝子、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質遺伝子、1型ヒト免疫不全ウイルス糖タンパク質遺伝子、ヒト呼吸器合胞体ウイルス膜糖タンパク質遺伝子、A型インフルエンザウイルスヘマグルチニンタンパク質遺伝子、B型インフルエンザウイルスヘマグルチニンタンパク質遺伝子、単純ヘルペスウイルス糖タンパク質遺伝子、マウス肝炎ウイルスSタンパク質遺伝子のいずれかであることを特徴とする項８に記載の方法。
項10． 脊椎動物プロモーターがサイトメガロウイルスプロモーター、SV40プロモーター、レトロウイルスプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロテインプロモーター、ＣＡＧプロモーター、エロンゲーションファクター1αプロモーター、アクチンプロモーター、ユビキチンプロモーター、アルブミンプロモーター、MHCクラスIIプロモーターのいずれかから選択される項９に記載の方法。
項11． バキュロウイルスのプロモーターがポリヘドリンプロモーター、ｐ10プロモーター、IE1プロモーター、p35プロモーター、p39プロモーター、gp64プロモーターのいずれかから選択される項８から10のいずれかに記載の方法。
項12． 免疫原性外来遺伝子がマラリア抗原、インフルエンザウイルス抗原、結核菌抗原、SARSウイルス抗原、西ナイル熱ウイルス抗原、デング熱ウイルス抗原、HIV抗原、HCV抗原、リューシマニア抗原、トリパノソーマ抗原、ロイコチトゾーン抗原単独、もしくはこれらの抗原遺伝子群から選ばれる少なくとも1種とサイトカインとの融合抗原のいずれかから選択される項８から11のいずれかに記載の方法。
項13． 組換えバキュロウイルスが、AcNPV-Dual-Hsp65、AcNPV-Dual-PbCSP、AcNPV-Dual-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-PbTRAMP、AcNPV-Dual-PbAMA1D123、AcNPV-Dual-PbMSP129、AcNPV-Dual-PfCSP、AcNPV-Dual-PfAMA1、AcNPV-Dual-Pfs25、AcNPV-Dual-H5N1/HA1、AcNPV-Dual-SARS/S、AcNPV-H1N1/HA1、AcNPV-CAP-H1N1/HA1、AcNPV-CU-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-H1N1/NP、AcNPV-Dual-H1N1/M2、AcNPV-Dual-H1N1/NAe、AcNPV-Dual-M2e、AcNPV-CP-HA1/NC99、AcNPV-CP-H1N1/HA0、AcNPV-CP-H1N1/HA2、AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39、AcNPV-CP-H1N1/NP-vp39のいずれかである項８から12のいずれかに記載の方法。
項14． 一方が脊椎動物プロモーターで、他方がバキュロウイルスのプロモーターである連結したデュアル・プロモーターの下流に連結された、少なくとも一つのウイルス粒子の構成成分になり得るタンパク質をコードする遺伝子と少なくとも一つの免疫原性外来遺伝子とを含む融合遺伝子が組み込まれた構造体を含むトランスファーベクター。
項15． 一方が脊椎動物プロモーターで他方がバキュロウイルスのプロモーターである連結したデュアル・プロモーターの下流に連結された少なくとも一つのウイルス粒子の構成成分になり得るタンパク質をコードする遺伝子と、少なくとも一つの免疫原性外来遺伝子とを含む融合遺伝子が組み込まれた構造体を含む項14に記載のトランスファーベクター。
項16． 少なくとも一つのウイルス粒子の構成成分になり得るタンパク質をコードする遺伝子が、バキュロウイルスgp64遺伝子、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質遺伝子、1型ヒト免疫不全ウイルス糖タンパク質遺伝子、ヒト呼吸器合胞体ウイルス膜糖タンパク質遺伝子、A型インフルエンザウイルスヘマグルチニンタンパク質遺伝子、B型インフルエンザウイルスヘマグルチニンタンパク質遺伝子、単純ヘルペスウイルス糖タンパク質遺伝子、マウス肝炎ウイルスSタンパク質遺伝子のいずれかであることを特徴とする項14または15に記載のトランスファーベクター。
項17． 脊椎動物プロモーターがサイトメガロウイルスプロモーター、SV40プロモーター、レトロウイルスプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロテインプロモーター、ＣＡＧプロモーター、エロンゲーションファクター1αプロモーター、アクチンプロモーター、ユビキチンプロモーター、アルブミンプロモーター、MHCクラスIIプロモーターのいずれかから選択される項15に記載のトランスファーベクター。
項18． バキュロウイルスのプロモーターがポリヘドリンプロモーター、ｐ10プロモーター、IE1プロモーター、IE2プロモーター、p35プロモーター、p39プロモーター、gp64プロモーターのいずれかから選択される項15から17のいずれかに記載のトランスファーベクター。
項19． 免疫原性外来遺伝子がマラリア抗原、インフルエンザウイルス抗原、結核菌抗原、SARSウイルス抗原、西ナイル熱ウイルス抗原、デング熱ウイルス抗原、HIV抗原、HCV抗原、リューシマニア抗原、トリパノソーマ抗原、ロイコチトゾーン抗原単独、もしくはこれらの抗原遺伝子群から選ばれる少なくとも1種とサイトカインとの融合抗原のいずれかから選択される項14から18のいずれかに記載のトランスファーベクター。
項20． pDual-Hsp65-gp64、pDual-PbCSP-gp64、pDual-H1N1/HA1-gp64、pDual-PbTRAMP-gp64、pDual-PbAMA1D123-gp64、pDual- PbMSP129、pDual-PfCSP-gp64、pDual-PfAMA1-gp64、pDual-Pfs25-gp64、pDual-H5N1/HA1-gp64、pDual-SARS/S-gp64、pCP-H1N1/HA1-gp64、pCAP-H1N1/HA1-gp64、pCU-H1N1/HA1-gp64、pDual-H1N1/NP-gp64、pDual-H1N1/M2-gp64、pDual-H1N1/NAe-gp64、pDual-M2e-gp64、pCP-HA1/NC99-gp64、pCP-H1N1/HA0-gp64、pCP-H1N1/HA2-gp64、pCP-H1N1/HA1-vp39、pCP-H1N1/NP-vp39のいずれかである項14から19のいずれかに記載のトランスファーベクター。
項21． 項8から13のいずれかに記載の組換えバキュロウイルスの製造法により製造された組換えバキュロウイルス。

項22. AcNPV-Dual-Hsp65、AcNPV-Dual-PbCSP、AcNPV-Dual-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-PbTRAMP、AcNPV-Dual-PbAMA1D123、AcNPV-Dual- PbMSP129、AcNPV-Dual-PfCSP、AcNPV-Dual-PfAMA1、AcNPV-Dual-Pfs25、AcNPV-Dual-H5N1/HA1、AcNPV-Dual-SARS/S、AcNPV-H1N1/HA1、AcNPV-CAP-H1N1/HA1、AcNPV-CU-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-H1N1/NP、AcNPV-Dual-H1N1/M2、AcNPV-Dual-H1N1/NAe、AcNPV-Dual-M2e、AcNPV-CP-HA1/NC99、AcNPV-CP-H1N1/HA0、AcNPV-CP-H1N1/HA2、AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39、AcNPV-CP-H1N1/NP-vp39のいずれかである項21に記載の組換えバキュロウイルス。

項23. 項2１または22の組換えバキュロウイルスを有効成分とする医薬組成物。

項24. AcNPV-Dual-H1N1/HA1、AcNPV-H1N1/HA1、AcNPV-CAP-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-PfCSP、AcNPV-Dual-PfAMA1、AcNPV-Dual-Pfs25、AcNPV-CU-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-H1N1/NP、AcNPV-Dual-H1N1/M2、AcNPV-Dual-H1N1/NAe、AcNPV-Dual-M2e、AcNPV-CP-HA1/NC99、AcNPV-CP-H1N1/HA0、AcNPV-CP-H1N1/HA2、AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39、AcNPV-CP-H1N1/NP-vp39のいずれかを有効成分とする医薬組成物。

項25. 筋肉内、経気道または経鼻的のいずれかのルートで投与されることを特徴とする請求項21または22の組換えバキュロウイルスを有効成分とする医薬組成物。

項26. AcNPV-Dual-H1N1/HA1、AcNPV-H1N1/HA1、AcNPV-CAP-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-PfCSP、AcNPV-Dual-PfAMA1、AcNPV-Dual-Pfs25、AcNPV-CU-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-H1N1/NP、AcNPV-Dual-H1N1/M2、AcNPV-Dual-H1N1/NAe、AcNPV-Dual-M2e、AcNPV-CP-HA1/NC99、AcNPV-CP-H1N1/HA0、AcNPV-CP-H1N1/HA2、AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39、AcNPV-CP-H1N1/NP-vp39のいずれかを有効成分とするワクチン。

項27. 筋肉内、経気道または経鼻的のいずれかのルートで投与されることを特徴とする請求項26のワクチン。

項28. AcNPV-Dual-H1N1/HA1、AcNPV-H1N1/HA1、AcNPV-CAP-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-PfCSP、AcNPV-Dual-PfAMA1、AcNPV-Dual-Pfs25、AcNPV-CU-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-H1N1/NP、AcNPV-Dual-H1N1/M2、AcNPV-Dual-H1N1/NAe、AcNPV-Dual-M2e、AcNPV-CP-HA1/NC99、AcNPV-CP-H1N1/HA0、AcNPV-CP-H1N1/HA2、AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39、AcNPV-CP-H1N1/NP-vp39を有効成分とするインフルエンザウイルス感染症治療または予防剤。

項29. 筋肉内、経気道または経鼻的のいずれかのルートで投与されることを特徴とする請求項28のインフルエンザウイルス感染症治療または予防剤。

項30. AcNPV-Dual-H1N1/HA1、AcNPV-H1N1/HA1、AcNPV-CAP-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-PfCSP、AcNPV-Dual-PfAMA1、AcNPV-Dual-Pfs25、AcNPV-CU-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-H1N1/NP、AcNPV-Dual-H1N1/M2、AcNPV-Dual-H1N1/NAe、AcNPV-Dual-M2e、AcNPV-CP-HA1/NC99、AcNPV-CP-H1N1/HA0、AcNPV-CP-H1N1/HA2、AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39、AcNPV-CP-H1N1/NP-vp39を有効成分とするインフルエンザウイルス感染症用ワクチン。

項31. 筋肉内、経気道または経鼻的のいずれかのルートで投与されることを特徴とする項30のインフルエンザウイルス感染症用ワクチン。
本発明によれば、新規な組換えトランスファーベクター、当該組換えトランスファーベクターとバキュロウイルスDNAとが相同組換えされた組換えバキュロウイルス及びそれらの製造方法が提供される。本発明の組換えバキュロウイルスを有効成分とする医薬は、マラリア、インフルエンザウイルス、結核、肝炎などの感染症や癌、自己免疫疾患等の治療及び／又は予防薬として、或いは細胞医療やワクチン製剤として有用である。
組換え体バキュロウイルスAcNPV-Dual-H1N1/HA1によるインフルエンザウイルス感染予防効果（ウイルス感染価）を示す図面である。 組換えバキュロウイルスAcNPV-Dual-H1N1/HA1によるインフルエンザウイルス感染予防効果（生存期間）を示す図面である。 組換えトランスファーベクターから製造された組換えバキュロウイルス感染細胞内でのインフルエンザウイルス抗原遺伝子(H1N1/HA1) 、結核菌抗原遺伝子(Hsp65) およびマラリア原虫のスポロゾイト表面の表面抗原遺伝子(PbCSP)の融合物のそれぞれの発現を示すウェスタンブロッティング分析の図面である。レーン1: AcNPV-WTレーン2: AcNPV-Dual-HA1Nレーン3: AcNPV- WTレーン4: AcNPV-Dual-Hsp65レーン5: AcNPV- WTレーン6: AcNPV-Dual-PbCSP 脊椎動物細胞における組換えトランスファーベクターから製造された組換えバキュロウイルスが結核抗原遺伝子（HSP65）とgp64遺伝子との融合発現を示す蛍光標識染色の図面である。(A): AcNPV-Dual-Hsp65を導入したHepG2細胞 (B): AcNPV-WTを導入したHepG2細胞 脊椎動物細胞における組換えトランスファーベクターから製造された組換えバキュロウイルスがインフルエンザウイルスHA抗原遺伝子とgp64遺伝子と融合タンパク質を発現していることを免疫沈降法で確認した図面である。組換えバキュロウイルスを導入されたHepG2細胞の免疫沈降。HepG2細胞はAcNPV-WT (レーン1)、 AcNPV-CMV-HA full (レーン 2) 又はAcNPV-Dual-HA1N (レーン3)を導入された。形質導入の3時間後、細胞は[35S]メチオニンで12時間放射標識された。細胞ライゼートをH1N1インフルエンザウイルスを感染したマウスからの血清で免疫沈降した。 昆虫細胞における組換えトランスファーベクターから製造された組換えバキュロウイルスのウイルス粒子中へのマラリア原虫CSP遺伝子とgp64遺伝子の融合発現物の発現を示すウェスタンブロッティング分析の図面である。レーン1：AcNPV-WT；レーン2：AcNPV-CMV-PbCSP；レーン3：AcNPV-PbCSPsurf；レーン4：AcNPV-Dual-PbCSP； 脊椎動物プロモーターを変換したHA1抗原組換えバキュロウイルスがそれぞれHeLa細胞でHA1とgp64の融合遺伝子の発現していることを確認するRT-PCRの結果を示す図面である。 組換えバキュロウイルスを接種したマウスの血清中でのPbCSP抗原特異なIgG抗体の産生を示した図面である。 組換えバキュロウイルスを接種したマウスの脾臓細胞でPbCSPのCTLエピトープに反応性のIFN-γ産生細胞数を示した図面である。 組換え体バキュロウイルスAcNPV-Dual-M2eによるインフルエンザウイルス感染予防効果（ウイルス感染価）を示す図面である。 組換え体バキュロウイルスAcNPV-Dual-HA1/NC99によるインフルエンザウイルス感染予防効果（ウイルス感染価）を示す図面である。 異なる4つの投与経路により投与された組換え体バキュロウイルスAcNPV-Dual-H1N1/HA1が血中に誘導するインフルエンザウイルス特異的なIgG抗体の産生を示した図面である。 異なる4つの投与経路により投与された組換え体バキュロウイルスAcNPV-Dual-H1N1/HA1が鼻洗浄液及び肺胞洗浄液中に誘導するインフルエンザウイルス特異的なIgG抗体及びIgA抗体の産生を示した図面である。 異なる4つの投与経路により投与された組換え体バキュロウイルスAcNPV-Dual-H1N1/HA1による鼻腔内インフルエンザウイルスの予防効果（ウイルス感染価）を示す図面である。 異なる4つの投与経路により投与された組換え体バキュロウイルスAcNPV-Dual-H1N1/HA1による肺内インフルエンザウイルスの予防効果（ウイルス感染価）を示す図面である。
本明細書におけるアミノ酸、ペプチド、塩基配列、核酸などの略号による表示は、IUPAC-IUBの規定[IUPAC-IUB Communication on Biological Nomenclature、 Eur. J. Biochem.、 138: 9(1984)]、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」(特許庁編)および当該分野における慣用記号に従うものとする。
本明細書において、DNA分子とは、2本鎖DNAのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖という各1本鎖DNAを包含する趣旨であり、またその長さに制限されるものではない。従って、本発明免疫原性外来遺伝子をコードするポリヌクレオチド(DNA分子)には、特に言及しない限り、ゲノムDNAを含む2本鎖DNAおよびcDNAを含む1本鎖DNA(センス鎖)並びに該センス鎖と相補的な配列を有する1本鎖DNA(アンチセンス鎖)および合成DNA、それらの断片のいずれもが含まれる。
また、本明細書において、ポリヌクレオチド、DNA分子は、機能領域の別を問うものではなく、発現抑制領域、コード領域、リーダー配列、エキソンおよびイントロンのいずれか少なくともひとつを含むことができる。
また、ポリヌクレオチドには、RNAおよびDNAが含まれる。特定アミノ酸配列からなるポリペプチドおよび特定DNA配列からなるポリヌクレオチドには、それらの断片、同族体、誘導体および変異体が含まれる。
ポリヌクレオチドの変異体、例えば変異体DNAには、天然に存在するアレル変異体；天然に存在しない変異体；欠失、置換、付加および挿入がなされた変異体などが含まれる。但し、これらの変異体は、変異前のポリヌクレオチドがコードするポリペプチドの機能と実質的に同じ機能を有するポリペプチドをコードするものとする。
本発明において、トランスファーベクターとは一方が脊椎動物プロモーター（哺乳動物プロモーター、鳥類のプロモーター、魚類のプロモーター）と他方がバキュロウイルスのプロモーターである２つのプロモーターが連結したデュアル・プロモーターの下流に、少なくとも一つのウイルス粒子の構成成分になり得るタンパク質をコードする遺伝子と、少なくとも一つの免疫原性外来遺伝子とが連結した融合遺伝子が組み込まれた構造体を含む組換えバキュロウイルスを製造するためのプラスミドをいう。
本発明の好ましい一つの実施形態においては、免疫原性外来遺伝子がデュアル・プロモーターの下流であって、ウイルス粒子の構成成分になり得るタンパク質をコードする遺伝子の上流側に位置するのがよい。また、本発明の組換えバキュロウイルスは医薬、あるいはワクチンの有効成分として、脊椎動物に用いられる。該脊椎動物としては、ヒトを含む哺乳動物、例えばウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、サル、マウス、イヌ、ネコなどを例示でき、鳥類としては、ニワトリ、ウズラ、ガチョウ、カモ、ハト、七面鳥、ホロホロチョウ、オウムなどを例示できる。魚類としては、ハマチ、ブリ、タイ、カンパチ、アジ、シマアジ、イサキ、サケ、ベニザケ、コイ、フナ、ニジマス、ヤマメ、アマゴなどを例示できる。
1つの実施形態において、本発明は、一方が脊椎動物プロモーターで他方がバキュロウイルスのプロモーターである連結したデュアル・プロモーターの制御下に、昆虫細胞で発現可能なウイルス膜タンパク質をコードする遺伝子と、一つの免疫原性外来遺伝子とを含む融合遺伝子が組み込まれた新規な構造体を含むトランスファーベクターを提供する。このトランスファーベクターを、昆虫細胞中でバキュロウイルスDNAとコトランスフェクトすることにより、相同組換えを誘発し、バキュロウイルスのプロモーターの制御下にあり、昆虫細胞で発現し、発芽したウイルス粒子の構成成分となり得る融合タンパク質を産生することが可能な前記融合遺伝子をバキュロウイルスに組み込んだ組換えバキュロウイルスを得ることができる。
本発明において恐らくは組換えバキュロウイルスを脊椎動物に投与すると発芽したウイルス粒子の構成成分となり得るタンパク質と免疫原性タンパク質との融合タンパク質がコンポーネントワクチンとして機能する。さらに、脊椎動物に投与された組換えバキュロウイルスが脊椎動物細胞に侵入し、ウイルスゲノムから脊椎動物細胞内で目的免疫原性外来抗原との融合抗原が産生され、DNAワクチンとして機能する。
従って、例えば哺乳動物の場合、本発明の組換えバキュロウイルスを哺乳動物に投与することにより、ウイルス粒子の構成成分となり得るタンパク質と免疫原性タンパク質との融合タンパク質が抗原として提示され、ウイルス粒子の構成成分となり得るタンパク質と免疫原性タンパク質との融合タンパク質が哺乳動物の細胞内で産生され、その免疫賦活作用により、ウイルス感染症、原虫感染症、細菌感染症などの予防ないし治療剤として機能すると考えられる。
トランスファーベクターとコトランスフェクトされるバキュロウイルスDNAは、野生型、変異型、及び組換えバキュロウイルスDNAのいずれであってもよい。コトランスフェクトされる宿主細胞として、例えばヨトウガ細胞(Spodoptera frugiperda)などの昆虫細胞が挙げられる。
なお、本発明においては、マラリア、インフルエンザウイルス、結核などの感染症、自己免疫疾患、癌などの予防・治療のためのワクチン療法を含めた免疫療法の免疫原となる抗原タンパク質のアミノ酸配列をコードする遺伝子、例えばマラリア抗原、インフルエンザウイルス抗原、結核菌抗原などのタンパク質のアミノ酸配列をコードする遺伝子を免疫原性外来遺伝子という。
ここで、「外来」遺伝子とは、外部から導入した遺伝子を意味し、同一の遺伝子が細胞内にあったとしても、「外来」遺伝子に該当する。
本発明において、上記免疫原となるタンパク質のアミノ酸配列をコードする遺伝子は感染症、癌、自己免疫疾患などの疾患起因物質に対する免疫原性を有する抗原タンパク質のアミノ酸配列をコードする遺伝子である限り、抗原タンパク質のアミノ酸配列をコートずる遺伝子としては特に限定されない。これら免疫原性を有する抗原タンパク質のアミノ酸配列をコードする遺伝子の一例としては、以下が挙げられる。
マラリア抗原のアミノ酸配列をコードする遺伝子としては、マラリア原虫のスポロゾイト表面の表面抗原CSP（Circumsporozoite Protein）、メトロゾイト表面の膜タンパク質のMSP1(Merozoite Surface Protein 1)、マラリア感染赤血球から分泌されるマラリアＳ抗原、マラリア感染赤血球のノブに存在するPfEMP1タンパク質、SERAタンパク質、TRAMPタンパク質、AMA1タンパク質などのタンパク質のアミノ酸配列をコードする遺伝子を例示できる。
インフルエンザウイルス抗原のアミノ酸配列をコードする遺伝子としては、HA抗原(ヘマグルチニン抗原)、NA抗原(ノイラミニダーゼ抗原)、M2抗原（マトリックスプロテイン抗原）、NP抗原（ヌクレオプロテイン抗原）などのタンパク質のアミノ酸配列をコードする遺伝子が例示できる。
結核に対する抗原タンパク質のアミノ酸配列をコードする遺伝子としては、HSP65(65-kDa heat shock protein)、α抗原(Antigen85A、Antigen85B、Antigen85C)、Mtb72f、MDP-1、ESAT-6、MPB51、Mtb8.8、Mtb9.9、Mtb32、Mtb39及びMtb11などのタンパク質のアミノ酸配列をコードする遺伝子を例示できる。
脊椎動物の遺伝子のうち、哺乳動物遺伝子としては、ヒト、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、サル、マウス、イヌ、ネコなどの感染症の抗原タンパク質をコードする遺伝子が例示でき、鳥類遺伝子としては、ニワトリ、カモ、ハト、七面鳥、ホロホロチョウ、オウムなどの感染症の抗原遺伝子(例えばトリインフルエンザＳ抗原）が例示でき、魚類遺伝子としては、ハマチ、ブリ、タイ、カンパチ、アジ、シマアジ、イサキ、サケ、ベニザケ、コイ、フナ、ニジマス、ヤマメ、アマゴなどの感染症の抗原遺伝子が挙げられる。
前記の哺乳動物、鳥類、魚類の感染症との関連が報告されている病原体遺伝子はGenbankなどの病原体遺伝子が登録されている公共のデータを保存している機関から容易に入手できる。
また、本発明において、免疫原性外来遺伝子は、上記のようなヒト生体外に存在する免疫抗原のほか、ヒト生体内に存在するサイトカイン遺伝子、例えばIL-12遺伝子、IL-6遺伝子、IL-6レセプター遺伝子、IL-2遺伝子、IL-18遺伝子、IFN−γ遺伝子、M-CSF遺伝子などのサイトカイン遺伝子、或いは免疫原性を有する任意の抗原と上記抗原タンパク質の遺伝子とが遺伝子組換え技術を用いて融合した融合遺伝子も、外部から導入する限り本発明においては、免疫原性外来遺伝子として取り扱うものとする。
本発明では、これら免疫原性外来遺伝子を有するトランスファーベクター、並びにその相同組換された組換えバキュロウイルスを提供でき、該免疫原性外来遺伝子を含有する組換えバキュロウイルスを有効成分とする医薬組成物、前記医薬組成物からなるワクチン製剤を提供することが出来る。
本発明に用いるバキュロウイルスは、昆虫に感染を起す昆虫病原ウイルスで環状の二本鎖DNAを遺伝子として保有するDNAウイルスの一群(バキュロウイルス科)である。その中で、核多角体病ウイルス(Nuclear Polyhedorosis Virus: NPV)といわれる一群のウイルスは感染後期には感染細胞の核内に多角体と呼ばれる封入体を作る。多角体遺伝子の代わりに発現したい外来遺伝子を挿入してもウイルスは問題なく感染、増殖し、所望の外来遺伝子産物を大量に産生することから、近年所望のタンパク質の製造に応用されている。
前記本発明に用いられるバキュロウイルスとしては、オートグラファ核多角体病ウイルス(Autographa Californica Nuclear Polyhedorosis Virus: AcNPV)、およびカイコガ核多角体病ウイルス(Bombyx mori Nuclear Polyhedorosis Virus: BmNPV)、オルギア・シュードツガタ核多角体病ウイルス（Orgyia pseudotsugata Nuclear Polyhedorosis Virus: OpNPV）、マイマイガ核多角大病ウイルス(Lymantria disper Nuclear Polyhedorosis Virus: LdNPV)を例示できる。
バキュロウイルスDNAは、本発明のトランスファーベクターとの相同組換えを起こすことができるものであればよい。具体的には、本発明のトランスファーベクターとの相同組換えを起こすことができるバキュロウイルスDNAのウイルス遺伝子は130kbpと巨大であり、15kbp以上の免疫原性外来遺伝子を挿入できる。また、バキュロウイルス遺伝子自体は脊椎動物細胞では、殆ど発現しないため、細胞傷害性を殆ど考慮することなく、従って、有害な免疫応答の誘導もないと考えられる。
(1) 本発明のトランスファーベクターおよびトランスファーベクターの製造
免疫原性外来遺伝子ＤＮＡの製造
バキュロウイルストランスファーベクターの構成成分の一つであるウイルス遺伝子に融合可能な免疫原性外来遺伝子ＤＮＡの製造法は、本明細書に開示された目的とする免疫原性を有する抗原タンパク質のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの核酸配列情報に基づいて合成するか、或いは免疫原性外来遺伝子の核酸配列情報に基づいて該免疫原性外来遺伝子のコード領域の核酸配列に相当するDNAをそのまま合成することにより(化学的DNA合成法)、容易に製造、取得することができる。この製造には、一般的遺伝子工学的手法が適用できる[例えば、Molecular Cloning 2d Ed、 Cold Spring Harbor Lab. Press(1989)；続生化学実験講座「遺伝子研究法I、II、III」、日本生化学会編(1986)など参照]。
また、該DNAの合成方法としては、リン酸トリエステル法、リン酸アミダイト法などの化学合成手段[J. Am. Chem. Soc.、 89、 4801(1967)；同91、 3350(1969)；Science、 150、 178(1968)；Tetrahedron Lett.、 22、 1859(1981)；同24、 245(1983)]およびそれらの組合せ方法が例示できる。より具体的には、該DNAは、ホスホルアミダイト法またはトリエステル法によって化学合成することもでき、市販されている自動オリゴヌクレオチド合成装置を利用して合成することもできる。二本鎖断片は、相補鎖を合成し、適当な条件下で該相補鎖を化学合成した一本鎖とアニーリングさせるか、または適当なプライマー配列と共にDNAポリメラーゼを用いて該相補鎖を化学合成した一本鎖に付加することによって得ることができる。
本発明において製造される免疫原性外来遺伝子DNAの具体的一態様としては、結核菌抗原タンパク質のアミノ酸配列をコードするDNA配列、マラリア抗原タンパク質のアミノ酸配列をコードするDNA配列、またはインフルエンザウイルス抗原タンパク質のアミノ酸配列をコードするDNA配列からなるDNAを例示できる。
なお、本発明において利用されるDNAは、前記免疫原性を有する抗原タンパク質のポリペプチドのアミノ酸配列をコードするDNA配列の全長DNA配列に限定されず、DNA配列によってコードされるアミノ酸配列のタンパク質が抗原性を有する限り、部分配列をコードするDNA配列であってもかまわない。
また、本発明において利用されるDNAは、前記免疫原性を有する抗原タンパク質のアミノ酸配列をコードするDNA配列とヒト生体内に存在するサイトカイン遺伝子、例えばIL-12遺伝子、IL-1遺伝子、IL-6遺伝子、IL-6レセプター遺伝子、IL-2遺伝子、IL-18遺伝子、IFN−α遺伝子、IFN−β遺伝子、IFN−γ遺伝子、TNF遺伝子、TGF-β遺伝子、GM-CSF遺伝子、M-CSF遺伝子のコード領域のDNA配列とが融合したDNA配列であってもよい。
該融合DNA配列は、免疫原性を有する抗原タンパク質のポリペプチドのアミノ酸配列をコードするDNA配列と融合するサイトカイン遺伝子のDNA配列はコード領域の全長に限定されず、部分的DNA配列であってもよい。
本発明に用いられる免疫原性外来遺伝子のDNAは、かかる特定のDNA配列を有するDNA分子に限らず、各アミノ酸残基に対して任意のコドンを組合せ、選択したDNA配列を有することも可能である。コドンの選択は、常法に従うことができる。その際には例えば利用する宿主のコドン使用頻度などを考慮することができる[Nucleic Acids Res.、 9、 43(1981)]。
遺伝子工学的手法による本発明に用いられる免疫原性外来遺伝子のDNAの製造は、より具体的には、免疫原性外来遺伝子のDNAが発現される適当な起源より、常法に従ってcDNAライブラリーを調製し、該ライブラリーから免疫原性外来遺伝子のDNAに特有の適当なプローブや発現物に対する抗体を用いて所望クローンを選択することにより実施できる[Proc. Natl. Acad. Sci.、 USA.、 78、 6613(1981)；Science、 222、 778(1983)など参照]。
上記において、ゲノムDNAの起源としては、免疫原性外来遺伝子のDNAを発現する各種細胞、組織、これらに由来する培養細胞などを例示することができる。特に、マラリア原虫が感染した感染赤血球抽出物やインフルエンザウイルス感染細胞抽出物や結核菌抽出物などを起源とするのが望ましい。該起源からの全DNAやRNAの抽出および分離、mRNAの分離および精製、cDNAの取得およびそのクローニングなどは、いずれも常法に従って実施することができる。
免疫原性外来遺伝子のDNAの製造は、上述したとおり、前記抽出物を起源として、免疫原組織・細胞のmRNAを抽出・分離・精製して得られる各免疫原のcDNAライブラリーを用いて実施する他にも、例えば上記各免疫原のmRNAを抽出後、当該RNAにポリAを付加した後、当該ポリA付加RNAを集め、逆転写酵素を用いてcDNAを製造し、当該cDNAの両端に制限酵素部位を付加後、ファージに組み込んで調製したファージライブラリーを用いても実施することができる。
免疫原性外来遺伝子のDNAをcDNAのライブラリーからスクリーニングする方法も、特に制限されず、通常の方法に従うことができる。具体的方法としては、例えばcDNAによって産生されるタンパク質に対する特異抗体(例えば、抗マラリア抗体、抗インフルエンザウイルス抗体、抗結核菌抗体)を使用した免疫的スクリーニングによって対応するcDNAクローンを選択する方法；目的のDNA配列に選択的に結合するプローブを用いるプラークハイブリダイゼーション法；コロニーハイブリダイゼーション法など；およびこれらの組合せを例示することができる。
上記各ハイブリダイゼーション法において用いられるプローブとしては、免疫原性外来遺伝子のDNA配列に関する情報を基にして化学合成されたDNA断片などが一般的である。また、既に取得された免疫原性外来遺伝子およびその断片のDNA配列も上記プローブとして有利に利用できる。更に、免疫原性外来遺伝子のDNA配列情報に基づき設定したセンス・プライマーおよびアンチセンス・プライマーを、上記スクリーニング用プローブとして用いることもできる。
プローブとして用いられるDNA(ヌクレオチド)は、免疫原性外来遺伝子のDNA配列に対応する部分DNA(ヌクレオチド)であって、少なくとも15個の連続したDNA、好ましくは少なくとも20個の連続したDNA、より好ましくは少なくとも30個の連続したDNAを有するものである。前記したDNAの製造のための陽性クローン自体もプローブとして用いることができる。
免疫原性外来遺伝子のDNAの取得に際しては、PCR法[Science、 230、 1350(1985)]によるDNA/RNA増幅法が好適に利用できる。殊に、ライブラリーから全長のcDNAが得難い場合には、RACE法[Rapid amplification of cDNA ends；実験医学、12(6)、 35(1994)]、特に5'-RACE法[M. A. Frohman、 et al.、 Proc. Natl. Acad. Sci.、 USA.、 8、 8998(1988)]などの採用が好適である。
PCR法に用いられるプライマーは、免疫原性外来遺伝子のDNA配列情報に基づいて適宜設定し、常法に従って合成することができる。尚、このプライマーとしては、後記実施例に示すように、免疫原性外来遺伝子のDNAが組み込まれたベクタープラスミドの該DNAの両端に付加したDNA部分(SP6 プロモーター・プライマーおよびT7ターミネーター・プライマー)も使用することができる。
尚、PCR法で増幅させたDNA/RNA断片の単離精製は、常法に従い例えばゲル電気泳動法などによって実施することができる。
上記の如くして得られる免疫原性外来遺伝子のDNA或いは各種DNA断片は、常法、例えばジデオキシ法[Proc. Natl. Acad. Sci.、 USA.、 74、 5463(1977)]、マキサム-ギルバート法[Methods in Enzymology、 65、 499(1980)]などに従って、また簡便には市販のシークエンスキットなどを用いて、そのDNA配列を決定することができる。
ウイルス粒子の構成成分になり得るタンパク質のアミノ酸をコードする遺伝子としては、目的の細胞で上記免疫原性外来遺伝子と融合して融合タンパク質として、昆虫細胞においてウイルス粒子の構成成分になり得るタンパク質として発現可能なタンパク質をコードする遺伝子であれば、何れでもよい。
前記ウイルス粒子の構成成分になり得るタンパク質のアミノ酸をコードする遺伝子としては、例えば、gp64タンパク質(GenBank Accession No. L22858)、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質Ｇ(VSVG：GenBank Accession No. M21416 )、単純ヘルペスウイルス糖タンパク質(KOS：GenBank Accession No. K01760)、1型ヒト免疫不全ウイルスgp120 (GenBank Accession No. U47783)、ヒト呼吸器合胞体ウイルス膜糖タンパク質(GenBank Accession No. M86651)、A型インフルエンザウイルスヘマグルチニンタンパク質(GenBank Accession No. U38242)などの遺伝子、或いはバキュロウイルスに近縁のウイルスエンベロープタンパク質などの遺伝子を例示できる。本発明においては、後記実施例に示されるgp64遺伝子を好ましく例示できる。
上記ウイルス粒子の構成成分になり得るタンパク質のアミノ酸をコードする遺伝子のＤＮＡの製造は、前記免疫原性外来遺伝子のDNAの製造と同様に、目的とするウイルス粒子の構成成分になり得るタンパク質のアミノ酸をコードする遺伝子のポリペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの核酸配列情報に基づいて、合成するか、或いはウイルス粒子の構成成分になり得るタンパク質のアミノ酸をコードする遺伝子のアミノ酸配列情報に基づいて該アミノ酸配列をコードする核酸配列に相当するDNAをそのまま合成することにより(化学的DNA合成法)、容易に製造、取得することができる。
また、ウイルス粒子の構成成分になり得るタンパク質のアミノ酸をコードする核酸配列に相当するDNA配列はコード領域の全長に限定されず、部分的DNA配列からなるDNAであってもよい。
または、前記した免疫原性外来遺伝子のDNA分子の製造の場合と同様、一般的遺伝子工学的手法を用いて、ウイルス粒子の構成成分になり得るタンパク質のアミノ酸をコードする遺伝子のＤＮＡを製造することが出来る。[例えば、Molecular Cloning 2d Ed、 Cold Spring Harbor Lab. Press(1989)；続生化学実験講座「遺伝子研究法I、II、III」、日本生化学会編(1986)など参照]。
本発明においては、後記する免疫原性外来遺伝子の発現を制御するプロモーターの一部が既に組み込まれ、ウイルス粒子の構成成分になり得るタンパク質のアミノ酸をコードする遺伝子(の一部)が予め導入された市販のベクタープラスミドを用いることもできる。
脊椎動物プロモーター
本発明に用いられるトランスファーベクターの構成成分の一つである脊椎動物プロモーター(脊椎動物細胞で機能し得るプロモーター)としては、哺乳動物プロモーター、鳥類のプロモーター、魚類のプロモーターなどのプロモーターを例示できる。
哺乳動物プロモーター
また、本発明に用いられるトランスファーベクターの構成成分の一つである哺乳動物プロモーター(哺乳動物細胞で機能し得るプロモーター)としては、サイトメガロウイルスプロモーター、SV40プロモーター、レトロウイルスプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロテインプロモーター、ＣＡＧプロモーター、エロンゲーションファクター1αプロモーター、アクチンプロモーター、ユビキチンプロモーター、アルブミンプロモーター、MHCクラスIIプロモーターなどを例示できる。
鳥類のプロモーター
鳥類のプロモーターとしては、アクチンプロモーター、ヒートショックプロテインプロモーター、エロンゲーションファクタープロモーター、ユビキチンプロモーター、アルブミンプロモーターを例示できる。
魚類のプロモーター
魚類のプロモーターとしては、アクチンプロモーター、ヒートショックプロテインプロモーター、エロンゲーションファクタープロモーターを例示できる。
バキュロウイルスプロモーター
本発明に用いられるバキュロウイルストランスファーベクターの構成成分の一つであるバキュロウイルスプロモーターとしては、ポリヘドリンプロモーター、ｐ10プロモーター、IE1プロモーター、p35プロモーター、p39プロモーター、gp64プロモーター等を例示できる。
組換えトランスファーベクターの製造
本発明は、昆虫細胞と脊椎動物細胞、特に哺乳動物細胞の両者の細胞において目的とする免疫原性外来遺伝子を抗原タンパク質として発現可能な新規な構造を有する新規なトランスファーベクターに関する。本発明において、作製される新規なトランスファーベクターの構造は、一方が脊椎動物のプロモーター、特に哺乳動物プロモーターで、他方がバキュロウイルスのプロモーターであり、これらが連結された下流に所望の免疫原性タンパク質のアミノ酸配列をコードするDNA配列とウイルス粒子の構成成分になり得るタンパク質のアミノ酸配列をコードするDNA配列とが連結した構造を有することを特徴とする。連結される脊椎動物のプロモーター、特に哺乳動物プロモーターとバキュロウイルスプロモーターの２つのプロモーターのDNA配列を含むDNA領域は、直接連結してもよいし、互いのプロモーターのDNA配列の間に介在DNA配列が存在してもよい（ただし、この場合には互いのプロモーターが昆虫細胞と脊椎動物のプロモーター、特に哺乳動物細胞においてプロモーター活性を有する必要がある）。また、連結される脊椎動物のプロモーター、特に哺乳動物プロモーターとバキュロウイルスプロモーターは、プロモーター領域においていずれが発現させる遺伝子に近い方に配置されてもよい、後記実施例においては、バキュロウイルスプロモーターが哺乳動物プロモーターよりも発現させる遺伝子に近い方に位置する構造で作製されている。
該構造においてウイルス粒子の構成成分になり得る遺伝子のタンパク質をコードする遺伝子と、所望の免疫原性外来遺伝子とを含む融合遺伝子のDNA配列は、これらの２つの遺伝子を直接連結したDNA配列からなるものであってもよいし、これらの間に介在DNA配列が存在していてもよい（ただし、この場合には下流側の遺伝子と上流側の遺伝子がフレームシフトを起こさないように配置される必要がある）。所望の免疫原性を有する外来遺伝子のタンパク質の抗原提示領域が、ウイルス粒子の構成成分になり得るタンパク質と融合されることが好ましいことから、所望の免疫原性を有する外来遺伝子のタンパク質をウイルス粒子の構成成分になり得るタンパク質から切り離すことなく該タンパク質と融合された形態で用いることが必要である。
また、これらの２つの遺伝子を含む融合遺伝子を予め形成し、これをベクターに組み込んでも良いし、先にいずれか一方の遺伝子をベクターに組み込み、次いで、他の遺伝子をベクターに組み込んでベクター内で融合遺伝子を形成してもよい。
上記操作は、本発明のトランスファーベクターとしての必要とする構成の一部である上記した脊椎動物のプロモーター、特に哺乳動物プロモーターやバキュロウイルスプロモーター等のプロモーター領域やウイルス粒子の構成成分になり得るタンパク質のアミノ酸配列をコードする遺伝子領域を既に有する市販の発現ベクターをそれぞれ使用し、任意に制限酵素で切り出し、別のプロモーターを組み込むなどして、該ベクターのクローニング領域に所望の免疫原性外来遺伝子とウイルス粒子の構成成分になり得るタンパク質のアミノ酸配列をコードする遺伝子とが融合したDNA配列を挿入するか、或いは所望の免疫原性外来遺伝子を既にプラスミドに組み込まれているウイルス粒子の構成成分になり得るタンパク質のアミノ酸配列をコードする遺伝子のDNA領域のＮ末端側に挿入するなどして、必要な構成要素を挿入することができる。
前記所望の免疫原性外来遺伝子とウイルス粒子の構成成分になり得るタンパク質のアミノ酸配列をコードする遺伝子とが融合したDNA配列のC末端側のポリＡテイルの前には、タンパク質の検出用としてHis・Tag、HVS・Tagなどが付加させたものであってもよいし、或いは前記プロモーター領域と所望の免疫原性外来遺伝子とウイルス粒子の構成成分になり得るタンパク質のアミノ酸配列をコードする遺伝子とが融合した領域との間に、融合した組換えタンパク質の発現、精製、検出用として、８アミノ酸配列からなるFLAG配列をコードするDNA配列をペプチドTagとして挿入してもよい。本発明においては、本発明の昆虫細胞と脊椎動物細胞、特に哺乳動物細胞の両者の細胞において所望の免疫原性外来遺伝子を抗原タンパク質として発現可能な構造を有するプラスミドベクターの、これら一部を既に満足する構成を有する市販のプラスミドを用いて製造してもよい。脊椎動物細胞内で酵素により融合タンパク質を開裂させるためのペプチドのアミノ酸配列を介在させてもよい。また、本発明のトランスファーベクターは、二つのプロモーター領域の上流には、脊椎動物、特に哺乳動物細胞における転写活性を上昇させるためのエンハンサーを配置しても良く、また発現したタンパク質の宿主外分泌を促すためのシグナル・ペプチドのアミノ酸配列をコードするDNA配列を融合発現させる遺伝子に結合させてもよい。また、融合発現させる遺伝子の下流には、例えば脊椎動物細胞において有効なラビツトβグロブリンターミネーターのような脊椎動物ターミネーター領域を転写終了のために有するものであってもよい。
かくして所望の免疫原性をバキュロウイルス粒子中に発現可能な免疫原性外来遺伝子とウイルス粒子の構成成分になり得るタンパク質のアミノ酸配列をコードする遺伝子が融合した形態で、発現可能なトランスファーベクターを製造することができる。
本発明のトランスファーベクター及びその製造方法の具体的な一例は、後記実施例に示されるように、脊椎動物のプロモーター、特に哺乳動物プロモーターとしてサイトメガロウイルス(CMV)のプロモーターやCMVプロモーターが改良されたCAGプロモーターやCMVエンハンサーにユビキチン（UBB）のプロモーターが接合したプロモーターなどと、バキュロウイルスプロモーターとしてポリヘドリン(Polh)のプロモーターが連結され、外来遺伝子として、インフルエンザウイルス抗原遺伝子、マラリア抗原遺伝子、結核抗原遺伝子とウイルス粒子の構成成分になり得るタンパク質のアミノ酸配列をコードする遺伝子としてgp64抗原遺伝子とのDNA配列が融合したDNA配列が挿入された構造からなるトランスファーベクターがpDual-Hsp65-gp64、pDual-PbCSP-gp64、pDual-H1N1/HA1-gp64、pDual-PbTRAMP-gp64、pDual-PbAMA1D123-gp64、pDual-PbMSP129-gp64、 pDual-PfCSP-gp64、pDual-PfAMA1-gp64、pDual-Pfs25-gp64、pDual-H5N1/HA1-gp64、pDual-SARS/S-gp64、pCP-H1N1/HA1-gp64、pCAP-H1N1/HA1-gp64、pCU-H1N1/HA1-gp64、pDual-H1N1/NP-gp64、pDual-H1N1/M2-gp64、pDual-H1N1/NAe-gp64、pDual-M2e-gp64、pCP-HA1/NC99-gp64、pCP-H1N1/HA0-gp64、pCP-H1N1/HA2-gp64、pCP-H1N1/HA1-vp39、pCP-H1N1/NP-vp39として例示できる。
(2)組換えバキュロウイルスの製造
また本発明は、一方が脊椎動物のプロモーター、特に哺乳動物プロモーターで、他方がバキュロウイルスのプロモーターである連結したデュアル・プロモーターの下流に連結された、少なくとも一つのウイルス粒子の構成成分になり得るタンパク質のアミノ酸配列をコードする遺伝子と、少なくとも一つの免疫原性外来遺伝子とを含む融合遺伝子が組み込まれた構造体からなるトランスファーベクターを製造する工程、該トランスファーベクターとバキュロウイルスDNAとを宿主細胞にコトランスフェクションする工程からなる、組換えバキュロウイルスを分離する工程を含む、組換えバキュロウイルスの製造方法を提供する。
上記組換えバキュロウイルスの製造方法において、所望の組換えDNA(トランスファーベクター)の宿主細胞への導入法およびこれによる形質転換法としては、特に限定されず一般的なこの分野で周知慣用技術となっている各種方法を採用することができ、例えば通常の遺伝子組換え技術(例えば、 Science、 224、1431 (1984); Biochem. Biophys. Res. Comm.、130、692(1985); Proc. Natl. Acad. Sci. USA、 80、5990 (1983))に従って調製することができる。組換えDNA(トランスファーベクター)の発現方法は、大野らの「タンパク実験プロトコール１機能解析編、細胞工学別冊、実験プロトコールシリーズ、1997年、秀潤社」を参考に製造することができる。また、昆虫細胞の取扱い方、遺伝子組換え、コトランスフェクションの一般的手法は、周知の昆虫細胞の組換えウイルス作製法と同様の手法を用いることができる(松浦善治、タンパク核酸酵素、37、211-222 (1992)、松浦善治、細胞、33 (2) 30-34 (2001))。
得られる組換えバキュロウイルスは、常法に従い培養でき、該培養により所望のように設計した本発明における免疫原性外来遺伝子のDNAとウイルス粒子の構成成分になり得るタンパク質のアミノ酸配列をコードするDNAとが融合した融合物（発現物）が、昆虫細胞の細胞内、細胞外または細胞膜上に発現、生産(蓄積、分泌)される。
培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択利用でき、培養も宿主細胞の生育に適した条件下で実施できる。
組換えバキュロウイルスの製造方法は、より詳しくは、上記で製造されたトランスファーベクターと相同組換えを行うためのバキュロウイルスDNAを準備する工程と該トランスファーベクターとバキュロウイルスDNAとをSpodoptera frugiperda由来の Sf-9細胞、Sf-21細胞、イラクサギンウワバ(Trichoplusia ni)由来のTn5細胞(High Five細胞：Invitrogen社製)などの昆虫細胞を宿主細胞とする細胞中にコトランスフェクションする工程からなる。
上記で製造されたトランスファーベクターと相同組換えを行うためのバキュロウイルスDNAは、野生型、変異型、或いは組換えバキュロウイルスDNAの何れでもよい。バキュロウイルスDNAは、本発明のトランスファーベクターとの相同組換えを起こすことができるように、デュアル・プロモーター領域のDNAと免疫原性外来遺伝子とウイルス粒子の構成成分になり得るタンパク質のアミノ酸配列をコードする遺伝子とが融合した融合遺伝子のDNAを挟んだバキュロウイルス由来DNAと相同であるDNA構造を有する限り、相同組換えの確率を高めることができる。
相同組換えを起こすためには、トランスファーベクターとバキュロウイルスDNAとの重量比は、例えば1：1〜10：1程度で混合するのがよい。
コトランスフェクション工程により昆虫細胞に同時に導入後、培養した後、前記培養上清からウイルスのプラークを作製した後、培養液に浮遊させ、ボルテックスして寒天よりウイルスを溶出させ、遠心分離し、組換えウイルスを含む溶液を得る。
上記においてバキュロウイルスDNAは、市販品を用いてもよく、例えば、AcNPVよりポリへドリン遺伝子が除かれているBacVector-1000 DNAやBacVector-2000 DNA(Novagen社製)などを使用できる。
これら上記で得られたトランスファーベクターとバキュロウイルスDNAを昆虫細胞において相同組換えのためのコトランスフェクションは、上記したように市販のベクタートランスフェクションキット(BacVector Transfection Kits: Novagen社製)を用いて、該ベクタートランスフェクションキットに付属の取扱書に従い実施することができる。かくして、上記で製造されたトランスファーベクターはバキュロウイルスDNAと共にSf-9細胞などの昆虫細胞にコトランスフェクトされた組換えバキュロウイルスを得ることができる。
本発明においては、上記組換えバキュロウイルスの製造方法に従い、pDual-Hsp65-gp64、pDual-PbCSP-gp64、pDual-H1N1/HA1-gp64、pDual-PbTRAMP-gp64、pDual-PbAMA1D123-gp64、pDual-PbMSP129-gp64、 pDual-PfCSP-gp64、pDual-PfAMA1-gp64、pDual-Pfs25-gp64、pDual-H5N1/HA1-gp64、pDual-SARS/S-gp64、pCP-H1N1/HA1-gp64、pCAP-H1N1/HA1-gp64、pCU-H1N1/HA1-gp64、pDual-H1N1/NP-gp64、pDual-H1N1/M2-gp64、pDual-H1N1/NAe-gp64、pDual-M2e-gp64、pCP-HA1/NC99-gp64、pCP-H1N1/HA0-gp64、pCP-H1N1/HA2-gp64、pCP-H1N1/HA1-vp39、pCP-H1N1/NP-vp39のトランスファーベクターとバキュロウイルスDNAとを用いてSf-9昆虫細胞においてコトランスフェクションし、AcNPV-Dual-Hsp65、AcNPV-Dual-PbCSP、AcNPV-Dual-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-PbTRAMP、AcNPV-Dual-PbAMA1D123、AcNPV-Dual-PbMSP129、AcNPV-Dual-PfCSP、AcNPV-Dual-PfAMA1、AcNPV-Dual-Pfs25、AcNPV-H1N1/HA1、AcNPV-CAP-H1N1/HA1、AcNPV-CU-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-H1N1/NP、AcNPV-Dual-H1N1/M2、AcNPV-Dual-H1N1/NAe、AcNPV-Dual-M2e、AcNPV-CP-HA1/NC99、AcNPV-CP-H1N1/HA0、AcNPV-CP-H1N1/HA2、AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39、AcNPV-CP-H1N1/NP-vp39の組換えバキュロウイルスを得た。
また、AcNPV-Dual-H5N1/HA1、AcNPV-Dual-SARS/Sの組換えバキュロウイルスを得ることができる。
上記の組換えバキュロウイルスの製造法のほか、他の組換えバキュロウイルスの作製方法としては、全バキュロウイルスゲノムを組み込んだファージミド（バクミド）にトランスポゾンを利用して、大腸菌体内で効率よく外来遺伝子を挿入できる方法も使用できる。
当該方法によればウイルス遺伝子を持ったバクミドを菌体から抽出し、昆虫細胞にトランスフェクトするだけで容易に組換えバキュロウイルス製造し、回収することができる。
上記組換えバキュロウイルスの製造方法で得られた本発明の組換えバキュロウイルス精製は、公知のウイルス精製法を用いて行うことができる。
組換えバキュロウイルスの精製は、例えば、Sf-9細胞などの昆虫細胞(1 x 10７個/10cm皿)に上記組換えバキュロウイルスの製造方法で得られたストックウイルス(通常1 x 10７-8pfu/ml)を0.5〜1.0ml接種し、感染数日(4日)後に培養上清を回収した後、遠心分離して得られたウイルスペレットをPBSなどの緩衝液に懸濁する。得られた懸濁液を10〜60%のショ糖密度勾配にかけた後、更に遠心分離(25000rpm、60分間、4℃の条件)してウイルスバンドで回収する。回収物を更にPBSに懸濁後、続いて遠心分離(同上)し、得られた精製組換え体ウイルスのペレットをPBS等の緩衝液中に4℃で保存する。
なお、上記で得られた精製組換え体ウイルスの感染価は、Sf-9細胞などの昆虫細胞を用いて、プラークアッセイにて測定（Fields VIROLOGY 4th Edition p29-32 2001）できる。
本実施例で例示した組換えウイルスでは、バキュロウイルスタンパク質gp64は、Ｎ末端が粒子の外側に露出し、Ｃ末端が粒子の内側に露出するので、所望の免疫原性外来遺伝子のタンパク質をgp64のＮ末端側に融合させれば、昆虫細胞においてウイルス粒子の構成成分としてウイルスタンパク質粒子の外側にその全体が露出することになり、より抗原提示し易くなり本発明のワクチン製剤としての目的に適うものといえる。
(3)本発明医薬組成物（本発明組換えバキュロウイルスを有効成分とする医薬）
本発明医薬組成物において有効成分とする本発明組換えバキュロウイルスは、前記(2)に示す遺伝子工学的手法により得ることができる。
本発明医薬組成物は、本発明免疫原性外来遺伝子とウイルス粒子の構成成分になり得るタンパク質のアミノ酸配列をコードする遺伝子とが融合した融合物を昆虫細胞及び脊椎動物、特にヒトを含む哺乳動物細胞において発現できるように構築されたトランスファーベクターとバキュロウイルスDNAを相同組換えさせて得られる組換えバキュロウイルスをその有効成分として含有することが重要である。
特に本発明医薬組成物は、特定のAcNPV-Dual-H1N1/HA1 、AcNPV-Dual-Hsp65、AcNPV-Dual-PfCSP、AcNPV-Dual-PfAMA1、AcNPV-Dual-Pfs25、AcNPV-Dual-H5N1/HA1、AcNPV-Dual-SARS/S、AcNPV-H1N1/HA1、AcNPV-CAP-H1N1/HA1、AcNPV-CU-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-H1N1/NP、AcNPV-Dual-H1N1/M2、AcNPV-Dual-H1N1/NAe、AcNPV-Dual-M2e、AcNPV-CP-HA1/NC99、AcNPV-CP-H1N1/HA0、AcNPV-CP-H1N1/HA2、AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39、AcNPV-CP-H1N1/NP-vp39のいずれかの組換えバキュロウイルスのいずれかを有効成分とする医薬組成物を提供する。
本発明医薬組成物において有効成分とする本発明AcNPV-Dual-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-Hsp65、AcNPV-Dual-PfCSP、AcNPV-Dual-PfAMA1、AcNPV-Dual-Pfs25、AcNPV-Dual-H5N1/HA1、AcNPV-Dual-SARS/S、AcNPV-H1N1/HA1、AcNPV-CAP-H1N1/HA1、AcNPV-CU-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-H1N1/NP、AcNPV-Dual-H1N1/M2、AcNPV-Dual-H1N1/NAe、AcNPV-Dual-M2e、AcNPV-CP-HA1/NC99、AcNPV-CP-H1N1/HA0、AcNPV-CP-H1N1/HA2、AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39、AcNPV-CP-H1N1/NP-vp39の組換えバキュロウイルスは、感染性抗原に対する感染予防効果を高め、感染価を低下させる作用を有しており、この作用乃至活性を利用して、標的細胞乃至組織の感染に関連する疾患の処置に利用することができる。かかる感染の影響を受ける標的細胞としては、例えば血液細胞、他の標的細胞は肝細胞、腎細胞、脳細胞、肺細胞、上皮細胞、筋肉細胞などを挙げることができる。これらの細胞を含む組織としては、肺、肝臓、腎臓、脳、動静脈血管、胃・腸、尿道、皮膚、筋肉などを挙げることができる。
該医薬組成物は、例えばマラリア原虫のスポロゾイト表面の表面抗原CSP、メトロゾイト表面の膜タンパク質のMSP1、マラリア感染赤血球から分泌されるマラリアＳ抗原、マラリア感染赤血球のノブに存在するPfEMP1タンパク質、SERAタンパク質、TRAMPタンパク質、AMA1タンパク質などのマラリア抗原に対して、またはHA抗原、NA抗原、M2抗原、NP抗原などのインフルエンザウイルス抗原に対して、これら感染性抗原に対する感染予防効果を高め、感染価(例えば、ウイルス感染価)を低下させることにより、感染したヒトを含む哺乳動物に対する生存期間の延長や生存率を本発明医薬組成物が投与されなかった群との比較において、特にマラリアやインフルエンザウイルス感染の予防または治療剤として有用である。
本発明医薬組成物は、感染性抗原に対する感染予防効果を高め、感染価を低下させる作用を利用して、インフルエンザウイルス、パピローマウイルス、ヘルペスウイルス、エイズウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ＳＡＲＳウイルス、西ナイル熱ウイルス、デング熱ウイルスなどのウイルス性疾患やマラリア、トリパノゾーマ、リューシマニアなどの原虫性疾患、赤痢、腸チフス、コレラ、肺炎球菌、MRSA、VRE、淋菌、クラミジア、梅毒、結核などの細菌性疾患など、病原体による感染が発症の原因となる感染性疾患や合併症の治療または予防剤として有用である。
また、本発明医薬組成物において有効成分とする組換えバキュロウイルスを得るためのトランスファーベクターの免疫原性外来遺伝子を、ヒト以外の脊椎動物に対する免疫原性遺伝子を用いることにより、例えばニワトリインフルエンザワクチン、ウシトリパノソーマ症ワクチン、アユ冷水病ワクチンとして、それら疾患の感染性抗原に対する感染予防効果を高め、感染価を低下させる作用を有しており、この作用乃至活性を利用して、標的細胞乃至組織の感染に関連する疾患の処置に利用することができる。
本発明の医薬組成物は、薬学的有効量の本発明の組換えバキュロウイルスと薬学的に許容される担体を含む組成物として調製することができる。
本発明組換えバキュロウイルスの脊椎動物、特にヒトを含む哺乳動物または哺乳動物細胞における感染防御効果は、例えば本発明組換えバキュロウイルスと医薬品投与用に添加可能な組成物とによって製造された医薬組成物を予め対象とする脊椎動物、特にヒトを含む哺乳動物に筋肉内、経鼻的、または経気道的に投与した後、複数回、本発明組換えバキュロウイルスを有効成分とする医薬組成物により免疫する。本発明の医薬組成物の投与は特に経気道的に投与することが好ましく例示できる。
そして、本発明医薬組成物の複数回の免疫後、対象とする病原体を脊椎動物、特にヒトを含む哺乳動物に投与して感染させた場合における一定期間経過後の本発明の医薬組成物の有効成分である組換えバキュロウイルスが投与された脊椎動物、特にヒトを含む哺乳動物における生存率の比較によって、感染予防効果を測定することができる。
(4) 本発明ワクチン
本発明の医薬組成物のその有効成分であるAcNPV-Dual-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-Hsp65、AcNPV-Dual-PfCSP、AcNPV-Dual-PfAMA1、AcNPV-Dual-Pfs25、AcNPV-Dual-H5N1/HA1、AcNPV-Dual-SARS/S、AcNPV-H1N1/HA1、AcNPV-CAP-H1N1/HA1、AcNPV-CU-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-H1N1/NP、AcNPV-Dual-H1N1/M2、AcNPV-Dual-H1N1/NAe、AcNPV-Dual-M2e、AcNPV-CP-HA1/NC99、AcNPV-CP-H1N1/HA0、AcNPV-CP-H1N1/HA2、AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39、AcNPV-CP-H1N1/NP-vp39の組換えバキュロウイルスは、後記実施例に示されるように病原体に対する感染予防効果を高め、感染価を低下させる作用を示す所望の免疫原性を有する本発明免疫原性外来遺伝子とウイルス粒子の構成成分になり得るタンパク質のアミノ酸配列をコードする遺伝子の融合したDNA配列の融合発現物が、昆虫細胞より出芽したウイルス粒子として、精製される。次いで、本発明の医薬組成物をウイルス粒子の形態で脊椎動物、特にヒトを含む哺乳動物に投与されることにより、ウイルス粒子の構成成分となった外来抗原タンパク質が獲得免疫（液性免疫及び細胞性免疫）を促進し、さらに脊椎動物、特にヒトを含む哺乳動物細胞内において前記融合DNA配列の発現物である抗原タンパク質がさらに獲得免疫（液性免疫及び細胞性免疫）を促進すると考えられ、かくしてワクチンとしても有用である。
特に本発明ワクチンは、特定のAcNPV-Dual-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-Hsp65、AcNPV-Dual-PfCSP、AcNPV-Dual-PfAMA1、AcNPV-Dual-Pfs25、AcNPV-Dual-H5N1/HA1、AcNPV-Dual-SARS/S、AcNPV-H1N1/HA1、AcNPV-CAP-H1N1/HA1、AcNPV-CU-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-H1N1/NP、AcNPV-Dual-H1N1/M2、AcNPV-Dual-H1N1/NAe、AcNPV-Dual-M2e、AcNPV-CP-HA1/NC99、AcNPV-CP-H1N1/HA0、AcNPV-CP-H1N1/HA2、AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39、AcNPV-CP-H1N1/NP-vp39の組換えバキュロウイルスのいずれかを有効成分とするワクチンを提供する。
該ワクチンは、上記(3)の医薬組成物と同様に、例えばマラリア原虫のスポロゾイト表面の表面抗原（CSP）、メトロゾイト表面の膜タンパク質のMSP1、マラリア感染赤血球から分泌されるマラリアＳ抗原、マラリア感染赤血球のノブに存在するPfEMP1タンパク質、SERAタンパク質、TRAMPタンパク質、AMA1タンパク質などのマラリア抗原に対して、またはインフルエンザウイルスHA抗原、インフルエンザウイルスNA抗原、インフルエンザウイルスM2抗原、インフルエンザウイルスNP抗原などのインフルエンザ抗原に対して、これら病原生物に対する感染予防効果を高め、感染価(例えば、ウイルス感染価)を低下させることにより、感染したヒトを含む哺乳動物に対する生存期間の延長や生存率を本発明医薬組成物が投与されなかった群との比較において、特にマラリアやインフルエンザウイルス感染の予防または治療剤として有用である。
本発明のワクチンは、感染性抗原に対する感染予防効果を高め、感染価を低下させる作用を利用して、インフルエンザウイルス、パピローマウイルス、ヘルペスウイルス、エイズウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ＳＡＲＳウイルス、西ナイル熱ウイルス、デング熱ウイルスなどのウイルス性疾患やマラリア、トリパノゾーマ、リューシマニアなどの原虫性疾患、赤痢、腸チフス、コレラ、肺炎球菌、MRSA、VRE、淋菌、クラミジア、梅毒、結核などの細菌性疾患など、病原体による感染が発症の原因となる感染性疾患や合併症の治療または予防剤として有用である。
また、本発明のワクチンにおいて有効成分とする組換えバキュロウイルスを得るためのトランスファーベクターの免疫原性外来遺伝子を、ヒト以外の脊椎動物に対する免疫原性遺伝子を用いることにより、例えばニワトリインフルエンザワクチン、ウシトリパノソーマ症ワクチン、魚のアユ冷水病ワクチンとして、それら疾患の感染性抗原に対する感染予防効果を高め、感染価を低下させる作用を有しており、この作用乃至活性を利用して、標的細胞乃至組織の感染に関連する疾患の処置に利用することができる。
特に、本発明ワクチンにおいて有効成分とする本発明AcNPV-Dual-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-Hsp65、AcNPV-Dual-PfCSP、AcNPV-Dual-PfAMA1、AcNPV-Dual-Pfs25、AcNPV-Dual-H5N1/HA1、AcNPV-Dual-SARS/S、AcNPV-H1N1/HA1、AcNPV-CAP-H1N1/HA1、AcNPV-CU-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-H1N1/NP、AcNPV-Dual-H1N1/M2、AcNPV-Dual-H1N1/NAe、AcNPV-Dual-M2e、AcNPV-CP-HA1/NC99、AcNPV-CP-H1N1/HA0、AcNPV-CP-H1N1/HA2、AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39、AcNPV-CP-H1N1/NP-vp39の組換えバキュロウイルスは、感染性抗原に対する感染予防効果を高め、感染価を低下させる作用を有しており、この作用乃至活性を利用して、標的細胞乃至組織のウイルス感染に関連する疾患の処置に利用することができる。
かかる感染の影響を受ける標的細胞としては、例えば血液細胞、他の標的細胞は肝細胞、腎細胞、脳細胞、肺細胞、上皮細胞、筋肉細胞などを挙げることができる。これらの細胞を含む組織としては、肺、肝臓、腎臓、脳、動静脈血管、胃・腸、尿道、皮膚、筋肉などを挙げることができる。
本発明のワクチンは、上記(3)の医薬組成物として、薬学的有効量の本発明の組換えバキュロウイルス(AcNPV-Dual-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-Hsp65、AcNPV-Dual-PfCSP、AcNPV-Dual-PfAMA1、AcNPV-Dual-Pfs25、AcNPV-Dual-H5N1/HA1、AcNPV-Dual-SARS/S、AcNPV-H1N1/HA1、AcNPV-CAP-H1N1/HA1、AcNPV-CU-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-H1N1/NP、AcNPV-Dual-H1N1/M2、AcNPV-Dual-H1N1/NAe、AcNPV-Dual-M2e、AcNPV-CP-HA1/NC99、AcNPV-CP-H1N1/HA0、AcNPV-CP-H1N1/HA2、AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39、AcNPV-CP-H1N1/NP-vp39)と薬学的に許容される担体を含む組成物として調製することができる。
ワクチンは、上記(3)の医薬組成物と同様の医薬として許容される担体を利用して常法に従い医薬組成物形態に調製することができる。該担体としては、例えば、滅菌生理食塩水、滅菌緩衝化生理食塩水などの生理的に許容できる溶液を挙げることができる。
また、ワクチン(以下、製剤について医薬組成物と同様とする)は、前記した本発明組換えバキュロウイルス(AcNPV-Dual-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-Hsp65、AcNPV-Dual-PfCSP、AcNPV-Dual-PfAMA1、AcNPV-Dual-Pfs25、AcNPV-Dual-H5N1/HA1、AcNPV-Dual-SARS/S、AcNPV-H1N1/HA1、AcNPV-CAP-H1N1/HA1、AcNPV-CU-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-H1N1/NP、AcNPV-Dual-H1N1/M2、AcNPV-Dual-H1N1/NAe、AcNPV-Dual-M2e、AcNPV-CP-HA1/NC99、AcNPV-CP-H1N1/HA0、AcNPV-CP-H1N1/HA2、AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39、AcNPV-CP-H1N1/NP-vp39)を有効成分とするリポソーム製剤として調製することができ、アジュバントなどと併用することもできる。
本発明のワクチン(医薬組成物)の一具体例としては、リポソーム製剤を挙げることができる。リポソーム製剤は、酸性リン脂質を膜構成成分とするかあるいは中性リン脂質と酸性リン脂質とを膜構成成分とするリポソームに、本発明組換えバキュロウイルスを保持させたものであることができる。
膜構成成分としての酸性リン脂質および中性リン脂質としては、特に制限はなく、この種のリポソーム製剤に慣用される各種脂質の一種を単独で、または二種以上を混合して使用することができる。
リポソーム膜は、酸性リン脂質を単独で用いるかまたは中性リン脂質と酸性リン脂質とを併用して、常法に従い形成される。中性リン脂質と併用される場合、酸性リン脂質の併用割合は、リポソーム膜構成成分中に0.1〜100モル％程度、好ましくは1〜90モル％、より好ましくは10〜50モル％程度とするのがよい。
上記リポソームの調製に当たっては、例えばコレステロールなどを添加することができる。これによりリン脂質の流動性を調製して、リポソームの調製をより簡便なものとすることができる。該コレステロールは、通常リン脂質に対して等量まで、好ましくは0.5倍重量から等重量の量で添加配合されるのが好ましい。
リポソーム製剤中の有効成分と酸性リン脂質との配合割合は、有効成分に対して酸性リン脂質が0.5〜100当量程度、好ましくは1〜60当量程度、より好ましくは1.5〜20当量程度とされるのがよい。
有効成分とする本発明組換えバキュロウイルスの全脂質に対する使用モル％は、数モル％から数十モル％程度、好ましくは5〜10モル％程度、通常5モル％前後であることができる。
尚、上記リポソーム製剤の製造、濃縮、粒径コントロールなどは、常法に従い実施できる。またリポソーム製剤には、所望により前記した各種の添加剤などを配合することもできる。
上記リポソーム製剤の製造において、有効成分とする本発明組換えバキュロウイルスは、これに脂肪酸（例えばベヘン酸、ステアリン酸、パルミチン酸、ミリスチン酸、オレイン酸など）、アルキル基、コレステリル基などを結合させて用いることもできる。これらを結合させて調製するリポソーム製剤の製造もまた常法に従うことができる（Long Circulating Liposomes: old drugs、New therapeutics.、 M. C. Woodle、 G. Storm、 Eds: Springer-Verlag Berlin(1998) など参照）。
本発明のワクチン(医薬組成物)は、好ましくはワクチン組成物として使用できる。その使用に際しては、薬学的有効量のアジュバントと併用されるのが抗感染(抗マラリアまたは抗インフルエンザウイルス)効果を高めるためにより好ましい。
アジュバントとしては、この種ワクチンに慣用されるものをいずれも制限なく使用できる。その例としては、例えばフロイント完全アジュバント、ムラミルジペプチド、水酸化アルミニウム、BCG、IL-12、N-アセチルムラミン-L-アラニル-D-イソグルタミン（MDP）、サイモシンα1、QS-21などを例示することができる。併用されるアジュバントの量は、その投与後、ヒトまたは動物に対する免疫反応の一部として表出するおそれのある皮膚の軟化、痛み、紅斑、発熱、頭痛、筋肉痛などの症状の程度に応じて適宜決定することができる。
本発明のワクチン(医薬組成物)は、例えば免疫応答促進ペプチド、抗菌剤（合成抗菌剤）などの他の公知の医薬品などと併用することもできる。
更に、ワクチン(医薬組成物)には、任意の薬剤、添加物などを含ませることもできる。その例としては、例えばカルシウムイオンなどの本発明組換えバキュロウイルスの細胞内取込みの助けとなる薬剤を例示することができる。また、前記リポソームおよび例えばフルオロカーボン乳剤、コクリエート（cochleate）、チューブル （tubule）、金粒子、生分解性マイクロスフェア、カチオン性ポリマーなどのトランスフェクションを容易にする薬剤乃至添加物をも使用することができる。
本発明のワクチン(医薬組成物)（製剤）中に含まれる有効成分の量は、 薬学的有効量である限り特に制限されず広範囲から選択することができる。上記ワクチン(医薬組成物)の投与量も、特に限定されず、所望の治療効果、投与方法（投与経路）、治療期間、患者の年齢、性別その他の条件などに応じて広範囲から適宜選択することができる。
また、ヒトに本発明のワクチン(組成物)の有効成分である組換えバキュロウイルスを投与する場合、組み換えウイルスのPFUで換算し、１患者あたり、102〜1012PFU相当の、好ましくは105〜1010PFU相当の、より好ましくは106〜109PFU相当の組換えバキュロウイルスが投与される。
本発明のワクチン(医薬組成物)の有効成分である組換えバキュロウイルス(AcNPV-Dual-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-Hsp65、AcNPV-Dual-PfCSP、AcNPV-Dual-PfAMA1、AcNPV-Dual-Pfs25、AcNPV-Dual-H5N1/HA1、AcNPV-Dual-SARS/S、AcNPV-H1N1/HA1、AcNPV-CAP-H1N1/HA1、AcNPV-CU-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-H1N1/NP、AcNPV-Dual-H1N1/M2、AcNPV-Dual-H1N1/NAe、AcNPV-Dual-M2e、AcNPV-CP-HA1/NC99、AcNPV-CP-H1N1/HA0、AcNPV-CP-H1N1/HA2、AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39、AcNPV-CP-H1N1/NP-vp39)の投与量は、ワクチン宿主に導入される発現可能なＤＮＡとして、または転写されたＲＮＡの量としては、非常に広い範囲から選択される。それらの量は、例えば本発明のトランスファーベクターに使用される転写および翻訳プロモーターの強さにも依存する。
本発明のワクチン(医薬組成物)の投与は、ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）または生理食塩水などに懸濁した組換えバキュロウイルス懸濁液の局所（例えば、肺組織内、肝臓内、筋肉内および脳内など）への直接注入か、経鼻的・経気道的に吸入か、または血管内（例えば、動脈内、 静脈内および門脈内）への投与によりなされる。本発明のワクチンの投与は特に経気道的に投与することが好ましく例示できる。
本発明ワクチン(医薬組成物)は、一度のみの投与によるのではなく、初回投与後の状態をみながら、1から複数回の追加ワクチン投与を行うことにより投与されるのが好ましい。これによって、所望の効果をより高めることが可能となる。また、ワクチン(医薬組成物)投与後、前記した本発明組換えバキュロウイルス(AcNPV-Dual-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-Hsp65、AcNPV-Dual-PfCSP、AcNPV-Dual-PfAMA1、AcNPV-Dual-Pfs25、AcNPV-Dual-H5N1/HA1、AcNPV-Dual-SARS/S、AcNPV-H1N1/HA1、AcNPV-CAP-H1N1/HA1、AcNPV-CU-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-H1N1/NP、AcNPV-Dual-H1N1/M2、AcNPV-Dual-H1N1/NAe、AcNPV-Dual-M2e、AcNPV-CP-HA1/NC99、AcNPV-CP-H1N1/HA0、AcNPV-CP-H1N1/HA2、AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39、AcNPV-CP-H1N1/NP-vp39)からなる医薬組成物で追加免疫することも可能である。更に、前記した各種併用薬の併用もワクチン(医薬組成物)投与による治療効果を高める可能性がある。
本発明のワクチン(医薬組成物)の１つの実施態様において、本発明のワクチン(医薬組成物)の有効成分のひとつである組換えバキュロウイルスは、一般には、この所望の免疫原性外来遺伝子とウイルス粒子の構成成分となり得るタンパク質をコードする遺伝子が融合した遺伝子を導入したトランスファーベクターとバキュロウイルスDNAとを相同組換えして得られた組換えバキュロウイルスを単位用量注入可能な形態（溶液、懸濁液または乳濁液）で、薬学的に受容可能なキャリア（すなわち、使用された投薬量および濃度においてヒトを含む脊椎動物に対して非毒性であり、そして処方物の他の成分と適合性であるもの）とを混合することによって処方され得る。例えば、処方物は、好ましくは、酸化剤および組換えバキュロウイルスにとって有害であることが公知である他の化合物を含まない。
キャリアは、等張性および化学的安定性を増強する物質のような微量の添加物を適宜含む。このような物質は、使用された投薬量および濃度において脊椎動物、特にヒトを含む哺乳動物に対して非毒性であり、そしてリン酸、クエン酸、コハク酸、酢酸、および他の有機酸またはそれらの塩のような緩衝剤；アスコルビン酸のような抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満の）ポリペプチド（例えば、ポリアルギニンまたはトリペプチド）；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチン、またはイムノグロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、またはアルギニン）；単糖、二糖および他の炭水化物（セルロースまたはその誘導体、 グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む）；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）；対イオン（例えば、ナトリウム）；および／または非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート、ポロキサマー）、またはＰＥＧを含み得る。
組換えバキュロウイルスを含む薬学的ワクチン(組成物)は、代表的には、単位または多用量容器、例えば、密封アンプルまたはバイアルにおいて、水溶液若しくは凍結乾燥品として貯蔵され得る。
本発明のワクチン(組成物)を含む薬学的組成物は医療実施基準（Goodmedical Practice）に一致した様式で、個々の患者の臨床状態（例えば、予防または処置されるべき状態）、組換えバキュロウイルスを含むワクチン(組成物)の送達部位、標的組織、投与方法、投与計画および当業者に公知の他の因子を考慮しつつ投与される。従って、本明細書のワクチン(組成物)の適切な投与量は、上記を考慮し決定される。
以下、本発明を更に詳しく説明するため実施例を挙げる。これらの実施例は、単なる例示であり、本発明を限定するものではない。
実施例1：本発明トランスファーベクタープラスミドおよびその製造法
（１） 本発明トランスファーベクタープラスミドpTriEx-Hsp65-gp64の構築
(1.1) プラスミドpBACsurf-CSPの構築
pcDNA-CS87は、吉田らの方法に従い(Yoshida、 S.、 et al.、 B.B.R.C.、 271、 107-115(2000))、Plasmodium berghei ANKA株のゲノムDNAとマウスIgk分泌シグナル配列およびFLAG配列とが融合した配列を含むNheI−NotI断片を得、該NheI−NotI断片をpcDNA3.1(インビトロジェン: Invitrogen社製)のNheI−NotIサイトに挿入して作製した。
マウスマラリア原虫P. berghei ANKA株が感染したBALB/cマウスより採血を行い、QIAamp DNA Midi Kit (キアゲン社)を用いてP. bergheiゲノムDNAを抽出した。
次いで、抽出されたP. berghei ANKA株のゲノムDNAをプライマーPbCSP-F1 (
Figure 0004171930
新しく作製したNheIサイトは下線、マウスIgκ分泌シグナル配列はイタリックで、FLAG配列は二重下線で表示) とPbCSP-R1 (5’- GGAGGGCGGCCGCATCCCGGGTTTTCTTATTTGAACCTTTTCGTTTTCTAACTCTTATACCAGAACC-3’ (配列番号2):新しく作製したNot Iサイトは下線で表示) を用いてPCRを行った。ＰＣＲはPfuDNAポリメラーゼ(Stratagene社製)を用いて、30サイクル(94℃で30秒変性、55℃で1分間アニールし、72℃で2分間伸長)行った。当該PCR産物は、C末端のグリコシルフォスファチジルイノシトール(GPI)アンカーがなく、その本来のシグナル配列に代わってマウスIgκ分泌シグナル配列に融合したPbCSPをコードする産物である。
PCR産物を精製した後、制限酵素NheI／NotIで切断し、pcDNA3.1 (+) (Invitrogen社製)のNheI／NotIサイトの中に挿入し、得られたプラスミドをpcDNA-CS87と名付けた。
当該pcDNA-CS87プラスミドは、ＣＭＶプロモーター、マウスIgk分泌シグナル配列、PbCSP遺伝子のタンパク質(21-299アミノ酸位置に対応)、 ウシ成長ホルモン遺伝子由来のポリAシグナル、ポリＡ配列を含んでいる。
前記pcDNA-CS87を制限酵素PstIとSmaIで切断することによってPbCSPのペプチドの21-306のアミノ酸配列をコードする遺伝子断片を得、該DNA断片をpBACsurf (Novagen社製)のPstIとSmaIサイトの中に挿入し、構築したプラスミドをpBACsurf-CSPと名付けた。
(1.2) プラスミドpBACsurf-Hsp65の構築
Hsp65遺伝子は、結核菌(M.tuberculosis) H37Rv株よりQIAamp DNA Midi Kit (キアゲン社)を用いて、結核菌H37RvのゲノムDNAを抽出し、PCRにてクローニングした。すなわち、抽出された結核菌H37RvのゲノムDNAをプライマーphsp65-F1 (primer (5'-AATAATAGATCTAATGGCCAAGACAATTGCGTACGACGAAGA-3'(配列番号3): BglII サイトは下線で表示) とphsp65-R1 ((5'- AATCCAATGCGGCCGCGGGAATTCGATTCCTGCAGGTCAGAAATCCATGCCACCCATGTCGCC -3'(配列番号4); NotIは下線で表示) を用いてPCRを行った。
PCR産物を精製した後、制限酵素BglII／NotIで切断し、pcDNA3.1(+) (Invitrogen社製)のBamHI／NotIサイトの中にライゲーションし、得られたプラスミドをpcDNA-hsp65と名付けた。
当該pcDNA-hsp65プラスミドは、マウスIgk分泌シグナル配列とhsp65遺伝子が融合した構築物である。
pcDNA-hsp65を鋳型としてプライマーphsp65-F2(
Figure 0004171930
: Sse8387I、 EcoRI サイトは下線、FLAG配列はイタリックで表示) とphsp65-R2 (5’- CCCGGGCGAAATCCATGCCACCCATGTCGCCGCCACC-3’ (配列番号6): Cfr9I サイト は下線で表示) を用いてPCRを行い、得られたHsp65遺伝子DNA断片（約1660 bp）をpENTR/D-TOPO (Invitrogen社製)にクローニングした後、Sse8387I/Cfr9Iで切断し、上記で得られたpBACsurf-CSP (Yoshida et al.Virology 316: 161-70、 2003)のPstI/Cfr9Iサイトに挿入した。
かくして構築したプラスミドをpBACsurf-Hsp65と名付けた。
(1.3) プラスミドpENTR-gp64の構築
pBACgus-1(Novagen社製)を鋳型としてプライマー pPolh-F2(5’- CACCCGGACCGGATAATTAAAATGATAACCATCTCGCAAATAAATAAG-3’ (配列番号7): RsrIIサイトは下線表示) とpgp64-R2 (5’- GGTACCATATTGTCTATTACGGTTTCTAATCATAC-3’ (配列番号8): KpnI サイト は下線で表示) を用いてPCRを行い、得られたgp64遺伝子DNA断片（約1700 bp）をpENTR/D-TOPOに挿入し、プラスミドpENTR-gp64を構築した。
かくして構築したプラスミドをpENTR-gp64と名付けた。
(1.4) 本発明のトランスファーベクターpDual-Hsp65-gp64の構築
pBACsurf-Hsp65をPstI/Cfr9Iで切断し、hsp65遺伝子断片（約1660 bp）をpENTR-gp64のPstI/Cfr9Iサイトに挿入し、プラスミドpENTR-Hsp65-gp64を構築した。
さらにpENTR-hsp65-gp64をRsrII/KpnIで切断し、ポリヘドリンプロモーターとhsp65-gp64遺伝子よりなるDNA断片（約3360 bp）をTriEx-3 (Novagen社製)のRsrII/KpnIサイトに挿入し、所望のデュアル・プロモーターによって発現が制御されるトランスファーベクタープラスミドpDual-Hsp65-gp64を構築した。
(2) 本発明のトランスファーベクターpDual-PbCSP-gp64の構築
(1.1.1) で得られたプラスミドpBACsurf-CSPをPstI/Cfr9Iで切断し、PbCSP遺伝子DNA断片（約890 bp）をpDual-Hsp65-gp64のPstI/Cfr9Iサイトに挿入し、プラスミドpDual-PbCSP-gp64を構築した。
(3) 本発明のトランスファーベクターpDual-H1N1/HA1-gp64の構築
インフルエンザウイルスPR8/34株が感染したMDCK細胞上清よりQIAamp MiniElute Virus Spin Kit (QIAGEN)を用いてRNAを抽出し、プライマーHA-f(5’- CCTGCAGGTATGAAGGCAAACCTACTGGTC -3’ (配列番号9): SbfI サイトは下線で表示)とHA-r(5’- GCCCGGGCGATGCATATTCTGCA-3’ (配列番号10): SbfI サイトは下線で表示)と用いてRT-PCRを行い、全長約1700 bpのインフルエンザウイルスHA遺伝子断片をpCR-Blunt II-TOPO(Invitrogen社)にクローニングした。
得られたプラスミドをpCR-Blunt-HAと名付けた。pCR-Blunt-HAを鋳型としてプライマーpHA-F1 (5’- CACCGAATTCGACACAATATGTATAGGCTACCATGCG-3’ (配列番号11): EcoRI サイトは下線で表示) とpHA-R1 (5’-CCCGGGCACCTCTGGATTGGATGGACGGAATG-3’ (配列番号12): Cfr9I サイト は下線で表示)を用いてPCRを行い、得られたH1N1/HA1遺伝子DNA断片（約1000 bp）をpENTR/D-TOPO (Invitrogen社製)にクローニングした後、EcoRI/Cfr9Iで切断し、上記(1.4)で得られたpDual-Hsp65-gp64のEcoRI/Cfr9Iサイトに挿入し、プラスミドpDual-H1N1/HA1-gp64を構築した。
(4) 本発明のトランスファーベクターpDual-PbTRAMP-gp64の構築
マウスマラリア原虫P. berghei ANKA株が感染したBALB/cマウスより採血を行い、QIAamp DNA Midi Kit (キアゲン社)を用いてP. bergheiゲノムDNAを抽出した。
このゲノムDNAを鋳型としてPCRによりPbTRAMP遺伝子を下記の方法でクローニングした。即ち、プライマーpTRAMP-F1 (5’- CACCGAATTCAAAATTGATACGAAAAAAAATGAAG -3’ (配列番号13): EcoRI サイトは下線で表示) とpTRAMP-R1 (5’- CCCGGGCTTTTAATTTTGAGGAGTCTTTATTTTC-3’ (配列番号14): Cfr9I サイト は下線で表示) を用いてPCRを行い、得られたPbTRAMP DNA断片（約860 bp）をpENTR/D-TOPO (Invitrogen社製)にクローニングした後、EcoRI/Cfr9Iで切断し、pBACsurf-Hsp65のEcoRI/Cfr9Iサイトに挿入した。構築したプラスミドをpBACsurf-PbTRAMPと名付けた。
次いでpBACsurf-PbTRAMPをEcoRI/Cfr9Iで切断し、PbTRAMP遺伝子DNA断片（約860 bp）をpDual-Hsp65-gp64のEcoRI/Cfr9Iサイトに挿入し、プラスミドpDual-PbTRAMP-gp64を構築した。
(5) 本発明のトランスファーベクターpDual-PbAMA1D123-gp64の構築
マウスマラリア原虫P. berghei ANKA株が感染したBALB/cマウスより採血を行い、QIAamp DNA Midi Kit (キアゲン社)を用いてP. bergheiゲノムDNAを抽出した。
このゲノムDNAを鋳型としてPCRによりPbAMA1遺伝子domain 123 (D123)を下記の方法でクローニングした。即ち、プライマーpAMA-F1 (5’- CACCGAATTCAATCCATGGGAAAAGTATACGGAAAAATAT -3’ (配列番号15): EcoRI サイトは下線で表示) とpAMA1-R1 (5’- CCCGGGCTTCTCTGGTTTGATGGGCTTTCATATGCAC-3’ (配列番号16): Cfr9I サイト は下線で表示) を用いてPCRを行い、得られたPbAMA1D123 DNA断片（約1280 bp）をpENTR/D-TOPO (Invitrogen社製)にクローニングした後、EcoRI/Cfr9Iで切断し、pBACsurf-Hsp65のEcoRI/Cfr9Iサイトに挿入した。構築したプラスミドをpBACsurf-PbAMA1D123と名付けた。
次いでpBACsurf-PbAMA1D123をEcoRI/Cfr9Iで切断し、PbAMA1D123遺伝子DNA断片（約1280 bp）を上記(1.4)で得られたpDual-Hsp65-gp64のEcoRI/Cfr9Iサイトに挿入し、プラスミドpDual-PbAMA1D123-gp64を構築した。
(6) 本発明のトランスファーベクターpDual-PbMSP119-gp64の構築
マウスマラリア原虫P. berghei ANKA株が感染したBALB/cマウスより採血を行い、QIAamp DNA Midi Kit (キアゲン社)を用いてP. bergheiゲノムDNAを抽出した。
このゲノムDNAを鋳型としてPCRによりPbMSP119遺伝子を下記の方法でクローニングした。即ち、プライマーpMsp1-F1 (5’- CACCCTGCAGGACTACAAGGACGACGATGACAAGCACATAGCCTCAATAGCTTTAAATAACTTAAATAAATCTGG -3’ (配列番号17): PstI サイトは下線で表示) とpMsp1-R1 (5’- CCCGGGTTCCCATAAAGCTGGAAGAGCTACAGAATACACC-3’ (配列番号18): Cfr9I サイト は下線で表示) を用いてPCRを行い、得られたPbMSP119 DNA断片（約450 bp）をpENTR/D-TOPO (Invitrogen社製)にクローニングした後、PstI/Cfr9Iで切断し、pBACsurf-Hsp65のPstI/Cfr9Iサイトに挿入した。構築したプラスミドをpBACsurf-PbMSP119と名付けた。
次いで、pBACsurf-PbMSP-119をPstI/Cfr9Iで切断し、PbMSP-119遺伝子DNA断片（約450 bp）をpDual-Hsp65-gp64のPstI/Cfr9Iサイトに挿入し、プラスミドpDual-PbMSP-119-gp64を構築した。
(7) 本発明のトランスファーベクターpDual-PfCSP-gp64の構築
熱帯熱マラリア原虫P. falciparum 3D7株が感染したヒト赤血球より、QIAamp DNA Midi Kit (キアゲン社)を用いてP. falciparumゲノムDNAを抽出した。このゲノムDNAを鋳型としてPCRによりPfCSP遺伝子を下記の方法でクローニングした。即ち、プライマーpPfCSP-F1 (5’- CACCGAATTCTTATTCCAGGAATACCAGTGCTATGGAAGT -3’ (配列番号19): EcoRI サイトは下線で表示) とpPfCSP-R1 (5’- CCCGGGCTTTTTCCATTTTACAAATTTTTTTTTC-3’ (配列番号20): Cfr9I サイト は下線で表示) を用いてPCRを行い、得られたPfCSP DNA断片（約1100 bp）をpENTR/D-TOPO (Invitrogen社製)にクローニングした後、EcoRI/Cfr9Iで切断し、pDual -PbAMA1D123-gp64のEcoRI/Cfr9Iサイトに挿入した。構築したプラスミドをpDual-PfCSP-gp64と名付けた。
(8) 本発明のトランスファーベクターpDual -PfAMA1-gp64の構築
熱帯熱マラリア原虫P. falciparum 3D7株が感染したヒト赤血球より、QIAamp DNA Midi Kit (キアゲン社)を用いてP. falciparumゲノムDNAを抽出した。このゲノムDNAを鋳型としてPCRによりPfAMA1遺伝子を下記の方法でクローニングした。即ち、プライマーpPfAMA1-F1(
Figure 0004171930
PstI サイトは下線、FLAG配列はイタリックで表示) とpPfAMA1-R1 (5’- CCCGGGCTTTCATTTTATCATAAGTTGGTTTATG-3’ (配列番号22): Cfr9I サイト は下線で表示) を用いてPCRを行い、得られたPfAMA1 DNA断片（約3500 bp）をpENTR/D-TOPO (Invitrogen社製)にクローニングした後、PstI/Cfr9Iで切断し、pDual -PbAMA1D123-gp64のPstI/Cfr9Iサイトに挿入した。構築したプラスミドをpDual-PfAMA1-gp64と名付けた。
(9)本発明のトランスファーベクターpDual -Pfs25-gp64の構築
熱帯熱マラリア原虫P. falciparum 3D7株が感染したヒト赤血球より、QIAamp DNA Midi Kit (キアゲン社)を用いてP. falciparumゲノムDNAを抽出した。このゲノムDNAを鋳型としてPCRによりPfs25遺伝子を下記の方法でクローニングした。即ち、プライマーpPfs25-F1 (5’- CACCGAATTCAAAGTTACCGTGGATACTGTATGCAAAAGAGGA -3’ (配列番号23) : EcoRI サイトは下線で表示) とpPfs25-R1 (5’- CCCGGGCAGTACATATAGAGCTTTCATTATCTAT -3’ (配列番号24): Cfr9I サイト は下線で表示) を用いてPCRを行い、得られたPfs25 DNA断片（約530 bp）をpENTR/D-TOPO (Invitrogen社製)にクローニングした後、EcoRI/Cfr9Iで切断し、pDual -PbAMA1D123-gp64のEcoRI/Cfr9Iサイトに挿入した。構築したプラスミドをpDual-Pfs25-gp64と名付けた。
(10) 本発明のトランスファーベクターpDual -H5N1/HA1-gp64の構築
トリインフルエンザウイルスH5N1からのHA1遺伝子を合成し、pDual-Hsp65-gp64のEcoRI/Cfr9Iサイトに挿入し、プラスミドpDual-H5N1/HA1-gp64を構築する。
(11)本発明のトランスファーベクターpDual -SARS/S-gp64の構築
SARSウイルスのS遺伝子を合成し、pDual-Hsp65-gp64のEcoRI/Cfr9Iサイトに挿入し、プラスミドpDual-SARS/S-gp64を構築する。
(12) 本発明のトランスファーベクターpCP-H1N1/HA1-gp64の構築
pCR-Blunt-HAを鋳型にPolh-f RsrII(5’- GGGCGGACCGGATAATTAAAATGATAACCATCTCG-3’ (配列番号25): RsrIIサイトは下線表示)とGP64-r DraIII(5’- GGGCACTTAGTGATATTGTCTATTACGGTTTCTAATC-3’ (配列番号26): DraIIIサイトは下線表示)を用いてPCRを行なった。得られた2700bpのDNA断片をpDual-H1N1/HA1-gp64を制限酵素RsrIIとDraIIIで消化したベクターと結合し、pCP-H1N1/HA1-gp64を構築した。
(13) 本発明のトランスファーベクターpCAP-H1N1/HA1-gp64の構築
pCP- H1N1/HA1-gp64を制限酵素RsrIIとDraIIIで切断して得られたHA1とgp64の遺伝子断片をpTriEx-1.1(Novagen社製)を 制限酵素RsrIIとDraIIIで切断したベクターに挿入し、プラスミドpCAP-H1N1/HA1-gp64を構築した。
(14) 本発明のトランスファーベクターpCU-H1N1/HA1-gp64の構築
pTriEx3.1を鋳型にCMVenh-f FseI (5’- GGGGGCCGGCCCTAGTTATTAATAGTAATCAATTAC-3’ (配列番号27): FseIサイトは下線表示)とCMVenh-r KpnI (5’- GGGGGTACCCATGGTAATAGCGATGACTAATACG -3’ (配列番号28): KpnIサイトは下線表示)を用いてPCRを行ない、CMV enhancer領域を増幅した。さらにヒトゲノムDNAを鋳型にUBBp-f KpnI (5’- GGGGGTACCTCGAGGAAGGTTTCTTCAACTC -3’ (配列番号29): KpnIサイトは下線表示)とUBBp-r RsrII (5’- GGGCGGTCCGGACCTAGTTTAAAAGTAAAACATAAG -3’ (配列番号30): RsrIIサイトは下線表示)を用いてPCRを行ない、UBBプロモーター領域を増幅した。得られた2つの断片をpCP- H1N1/HA1-gp64を制限酵素FseIとRsrIIで消化したベクターと結合し、pCU-H1N1/HA1-gp64を構築した。
(15) 本発明のトランスファーベクターpDual-H1N1/NP-gp64の構築
インフルエンザウイルスPR8/34株のゲノムRNAを鋳型にNP-f EcoRI(5’- ACGGAATTCCATTCAATTCAAACTGGA-3’(配列番号31): EcoRIサイトは下線表示)とNP-r Cfr9I(5’- GATCCCGGGCCTTGTCAATGCTGAATGGCAA-3’(配列番号32): Cfr9Iサイトは下線表示)を用いてRT-PCRを行ない、得られた断片を制限酵素EcoRIとCfr9Iで処理し、同様に制限酵素EcoRIとCfr9Iで処理したpCP-H1N1/HA1-gp64に挿入することで、pDual-H1N1/NAe-gp64を作製した。
(16) 本発明のトランスファーベクターpDual-H1N1/M2-gp64の構築
インフルエンザウイルスPR8/34株のゲノムRNAを鋳型にM2-f EcoRI(5’- CGGAATTCATGAGTCTTCTAACCGAGG -3’(配列番号33): EcoRIサイトは下線表示)とM2-r Cfr9I(5’- GATCCCGGGCCTCCAGCTCTATGCTGAC -3’(配列番号34): Cfr9Iサイトは下線表示)を用いてRT-PCRを行ない、得られた断片を制限酵素EcoRIとCfr9Iで処理し、同様に制限酵素EcoRIとCfr9Iで処理したpCP-H1N1/HA1-gp64に挿入することで、pDual-H1N1/M2-gp64を作製した。
(17) 本発明のトランスファーベクターpDual-H1N1/NAe-gp64の構築
インフルエンザウイルスPR8/34株のゲノムRNAを鋳型にNAe-f EcoRI(5’- ACGGAATTCCATTCAATTCAAACTGGA-3’(配列番号35): EcoRIサイトは下線表示)とNAe-r Cfr9I(5’- GATCCCGGGCCTTGTCAATGCTGAATGGCAA-3’(配列番号36): Cfr9Iサイトは下線表示)を用いてRT-PCRを行ない、得られた断片を制限酵素EcoRIとCfr9Iで処理し、同様に制限酵素EcoRIとCfr9Iで処理したpCP-H1N1/HA1-gp64に挿入することで、pDual-H1N1/NAe-gp64を作製した。
(18) 本発明のトランスファーベクターpDual-M2e-gp64の構築
pDual-H1N1/M2-gp64を鋳型にM2-f EcoRI(5’- CGGAATTCATGAGTCTTCTAACCGAGG -3’(配列番号37): EcoRIサイトは下線表示)とM2e-r Cfr9I(5’- GATCCCGGGCATCACTTGAACCGTTGCA -3’(配列番号38): Cfr9Iサイトは下線表示)を用いてPCRを行ない、得られた断片を制限酵素EcoRIとCfr9Iで処理し、同様に制限酵素EcoRIとCfr9Iで処理したpCP-H1N1/HA1-gp64に挿入することで、pDual-M2e-gp64を作製した。
(19) 本発明のトランスファーベクターpCP-HA1/NC99-gp64の構築
インフルエンザウイルスNewCaledonia99/20（NC99）の凍結保存液よりQIAamp MiniElute Virus Spin Kit (QIAGEN)を用いてRNAを抽出し、プライマーHA1-f EcoRI(5’- GATGAATTCGACACAATATGTATAGGCTACC -3’ (配列番号39): EcoRI サイトは下線で表示)とHA1-r CFr9I(NC99)(5’- GATCCCGGGCTCTGGATTGAATGGATGGGATG -3’ (配列番号40): CFr9I サイトは下線で表示)を用いてRT-PCRを行ない、HA1遺伝子断片を増幅した。得られた断片とpCP-H1N1/HA1-gp64を制限酵素EcoRIとCFr9Iで処理し、pCP-H1N1/HA1-gp64のHA1導入領域に新たにNC99由来のHA1遺伝子断片を挿入した。得られたプラスミドをpCP-HA1/NC99-gp64とした。
(20) 本発明のトランスファーベクターpCP-H1N1/HA0-gp64の構築
pCR-Blunt-HAを鋳型にHA0-f EcoRI(5’- GGGGAATTCATGAAGGCAAACCTACTGG -3’(配列番号41): EcoRIサイトは下線表示)とHA2-r Cfr9I(5’- GATCCCGGGCGATGCATATTCTGCA -3’(配列番号42): Cfr9Iサイトは下線表示)を用いてPCRを行ない、HA遺伝子全長を増幅した。得られた断片とpCP- H1N1/HA1-gp64をそれぞれ制限酵素EcoRIとCfr9Iで処理し、pCP-H1N1/HA1-gp64のHA1導入領域に新たにHA0遺伝子断片を挿入した。得られたプラスミドをpCP-H1N1/HA0-gp64とした。
(21) 本発明のトランスファーベクターpCP-H1N1/HA2-gp64の構築
pCR-Blunt-HAを鋳型にHA2-f EcoRI(5’- GATGAATTCATATTTGGAGCCATTGCCG -3’(配列番号43): EcoRIサイトは下線表示)とHA2-r Cfr9I(5’- GATCCCGGGCGATGCATATTCTGCA -3’(配列番号44): Cfr9Iサイトは下線表示)を用いてPCRを行ない、HA遺伝子全長を増幅した。得られた断片とpCP- H1N1/HA1-gp64をそれぞれ制限酵素EcoRIとCfr9Iで処理し、pCP-H1N1/HA1-gp64のHA1導入領域に新たにHA2遺伝子断片を挿入した。得られたプラスミドをpCP-H1N1/HA2-gp64とした。
(22) 本発明のトランスファーベクターpCP-H1N1/HA1-vp39の構築
BacVector-2000 Transfection Kit（Novagen）に付属しているバキュロウイルスDNAを鋳型にvp39-f（
Figure 0004171930
SpeIサイトは下線表示、EcoRIは2重下線表示））とvp39-r（
Figure 0004171930
Dralllサイトは下線表示、SmaIは2重下線表示））を用いてPCRを行ない、vp39遺伝子領域を増幅した。増幅した断片とpDual-H1N1/HA1-gp64を制限酵素SpeIとDraIIIで切断し、それぞれをつなぎ合わせることでpDual-vp39を構築した。さらに、pDual-H1N1/HA1-gp64を鋳型にPolh-S1 (5’- GCTAACCATGTTCATGCC -3’ (配列番号47))とHA1-r EcoRI (5’- GGGGAATTCACCTCTGGATTGGATGGAC -3’ (配列番号48): EcoRIサイトは下線表示)を用いてPCRを行ない、得られた断片をEcoRIで消化し、HA1遺伝子断片を調整した。得られた断片を制限酵素EcoRIで消化したpDual-vp39に挿入し、pCP-H1N1/HA1-vp39を構築した。
(23) 本発明のトランスファーベクターpCP-H1N1/NP-vp39の構築
pDual-H1N1/NP-gp64を鋳型にNP-f 5 EcoRI (5’- ACGGAATTCATGGCGTCCCAAGGCACC-3’(配列番号49): EcoRIサイトは下線表示)とNP-r EcoRI(5’- ACGGAATTCATTGTCGTACTCCTCTGCATTG-3’(配列番号50): EcoRIサイトは下線表示)を用いてPCRを行ない、得られた断片をEcoRIで消化した。得られた断片を制限酵素EcoRIで消化したpDual-vp39に挿入し、pCP1-H1N1/NP-vp39を構築した。
参考例1：pBACgus-CMV-PbCSPの構築
(1.1) pcDNA-GL3(luc) の構築
pGL3-Enhancer (プロメガ社)を制限酵素 HindIII/XbaIで切断し、Luciferase遺伝子DNA断片（約1690 bp）をpcDNA3.1(Invitrogen社製)のHindIII/XbaIサイトの中にライゲーションし、得られたプラスミドをpcDNA-GL3(luc)と名付けた。
(1.2) pBACgus-CMV-IgHsp65の構築
上記実施例１の(1.2)で得られたpcDNA-hsp65を制限酵素BglII／NotIで切断し、pcDNA-Ighsp65を産生するためにpcDNA-CS87のBamHI／NotIサイトの中に挿入し、得られたプラスミドをpcDNA-IgHsp65と名付けた。
次いでpcDNA-IgHsp65をBglII/SphIで切断し、CMVプロモーター、マウスIgkシグナル配列を持ったHsp65遺伝子、ウシ成長ホルモン遺伝子由来のポリAシグナルからなる遺伝子カセット（約2850 bp）をpBACgus-1 (ノバジェン社)のBglII/SphIサイトに挿入した。
構築したプラスミドをpBACgus-CMV-Hsp65と名付けた。
(1.3) pBACgus-CMV-GL3の構築
上記で得られたプラスミドpcDNA-GL3(luc)を制限酵素NheI／XbaIで切断し、ルシフェラーゼ遺伝子DNA断片(約1690bp)をプラスミドpBACgus-CMV-Hsp65のNheI／XbaIサイトの中に挿入し、得られたプラスミドをpBACgus-CMV-GL3と名付けた。
(1.4) pBACgus-CMV-PbCSPの構築
上記 実施例1の(1.1)で得られた プラスミドpBACsurf-CSPを制限酵素PstIとSmaIで切断することによってPbCSPのペプチドの21-306のアミノ酸配列をコードする遺伝子断片を得、該DNA断片（約858 bp）を上記で得られたpBACgus-CMV-GL3のPstIとSmaIサイトの中に挿入し、得られたプラスミドをpBACgus-CMV-PbCSPと名付けた。
(1.5) pBACgus-CMV-HA-fullの構築
pCR-Blunt-HAをBamHI/Sse8387Iで切断し、HA遺伝子DNA断片（約1750 bp）をpBluescript II (KS-)のBamHI/PstIサイトに挿入し、プラスミドpBluescript-HAを構築した。
さらにpBluescript-HAをHindIII/XbaI切断し、HA遺伝子DNA断片（約1800 bp）を(1.3)で得られたpBACgus-CMV-GL3のHindIII/XbaIサイトに挿入し、プラスミドpBACgus-CMV-HA-fullを構築した。
実施例2：本発明組換えバキュロウイルスおよびその製造法
(1)組換えバキュロウイルスは、組換えバキュロウイルス作製キット (BacVector-2000 Transfection Kit、ノバジェン社)を用い、上記実施例１で構築されたのトランスファーベクター：
pDual-Hsp65-gp64、pDual-PbCSP-gp64、pDual-H1N1/HA1-gp64、pDual-PbTRAMP-gp64、pDual-PbAMA1D123-gp64、pDual-PbMSP-119-gp64、pDual-PfCSP-gp64、pDual-PfAMA1-gp64、pDual-Pfs25-gp64、pCP-H1N1/HA1-gp64、pCAP-H1N1/HA1-gp64、pCU-H1N1/HA1-gp64、pDual-H1N1/NP-gp64、pDual-H1N1/M2-gp64、pDual-H1N1/NAe-gp64、pDual-M2e-gp64、pCP-HA1/NC99-gp64、pCP-H1N1/HA0-gp64、pCP-H1N1/HA2-gp64、pCP-H1N1/HA1-vp39、pCP-H1N1/NP-vp39および参考例１で得られたプラスミドpBACgus-CMV-PbCSP、pBACgus-CMV-HA-fullの各々とBacVector-2000 DNAをSf9細胞にコトランスフェクト(co-transfection)することにより作製した。
作製した組換えバキュロウイルスは各々、AcNPV-Dual-Hsp65、AcNPV-Dual-PbCSP、AcNPV-Dual-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-PbTRAMP、AcNPV-Dual-PbAMA1D123、 AcNPV-Dual-PbMSP-119、AcNPV- CMV-PbCSP、AcNPV-CMV-H1N1/HAfull、AcNPV-H1N1/HA1、AcNPV-CAP-H1N1/HA1、AcNPV-CU-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-H1N1/NP、AcNPV-Dual-H1N1/M2、AcNPV-Dual-H1N1/NAe、AcNPV-Dual-M2e、AcNPV-CP-HA1/NC99、AcNPV-CP-H1N1/HA0、AcNPV-CP-H1N1/HA2、AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39、AcNPV-CP-H1N1/NP-vp39と名付けた。
Sf9細胞を150 mm細胞培養用プレート (スミロン：秋田住友ベーク社製) あたり2 ｘ 107 cellsになるように培養し、上述のバキュロウイルス各々を感染重複度約5で感染させた。5-6日後、培養液を10、000 ｘg、 4°Cで25分間遠心して回収し、さらにベックマン超遠心機 (SW28スウィングローター)で25、000 rpm、4°C で90分遠心してウイルス粒子を得た。
(2) 組換えバキュロウイルスは、組換えバキュロウイルス作製キット (BacVector-2000 Transfection Kit、ノバジェン社)を用い、上記実施例１で構築されるトランスファーベクターpDual-H5N1/HA1-gp64とpDual-SARS/S-gp64をBacVector-2000 DNAをSf9細胞にコトランスフェクトすることにより作製することができる。作製される組換えバキュロウイルス各々AcNPV-H5N1/HA1およびAcNPV-Dual-SARS/Sと名付けられる。
Sf9細胞を150 mm細胞培養用プレート (スミロン：秋田住友ベーク社製) あたり2 ｘ 107 cellsになるように培養し、上述のバキュロウイルス各々を感染重複度約5で感染させた。5-6日後、培養液を10、000 ｘg、 4°Cで25分間遠心して回収し、さらにベックマン超遠心機 (SW28スウィングローター)で25、000 rpm、4°C で90分遠心してウイルス粒子を得ることができる。
実施例3：本発明組換えバキュロウイルスの薬理効果試験
（マラリアワクチンとしての薬理効果試験）
（マラリア感染予防実験）
3.実験方法
3.1 ワクチン接種
BALB/c雌マウスに、ワクチン用組換えウイルス液を3週間間隔で3回接種した。接種液量は、大腿筋筋肉内注射の場合は0.2 mL/bodyとし、5 ｘ 106pfu/bodyのウイルス量となるようにウイルス液を調製した。
3.2 マウスへのマラリア感染
各群マウスを、3回目のワクチン接種の3週間後にマウス用麻酔液で麻酔し、マウスマラリア（Plasmodium berghei ANKA 2.34 clone）に感染した蚊（Anopheles stephensi SDA 500 strain）に刺咬させることによりマラリアを感染させた。
3.3 各群マウスの生存率の算出
マラリア感染後の各群マウスの死亡例を計数し、各群マウスの生存率を算出した。
3.4 本発明医薬組成物のワクチンとしてのマラリア感染防御効果についての薬理効果試験結果を表１に示す。各群マウスの生存率を表１右端中に示した。
表１に示されるように末梢血液中にマラリア感染赤血球が確認されたマウスは、感染38日目までに全例死亡した。スポロゾイト期の抗原（CSP）遺伝子を挿入した組換えウイルスのうち、実施例２で得られた組換えバキュロウイルス(実施例１(2)のトランスファーベクターを包含：AcNPV-Dual-PbCSP)を筋肉内接種した群（群番号４）で100%の感染防御効果が認められた。
野生型バキュロウイルス（群番号２）では、コントロール群（群番号１）とは差が認められず、哺乳動物ウイルスプロモーターを用いた実施例２で得られた組換えバキュロウイルス(参考例１のベクターを包含：AcNPV-CMV-PbCSP)群（群番号３）では、コントロール群に比べて若干高い生存率が認められ、弱いながら組換えウイルス接種による効果が現れている可能性が示唆された。
Figure 0004171930
実施例4：本発明組換えバキュロウイルスの薬理効果試験
（インフルエンザウイルスワクチンとしての薬理試験）
（インフルエンザウイルス感染予防試験）
4. 実験方法
4.1 ワクチン
ワクチン用ウイルス液の接種は2週間間隔で2回行なった。ワクチンウイルスは大腿筋筋肉内に29Gのインシュリン注射用シリンジを用いてマウス一匹あたり106.5PFUを接種した。
4.2 チャレンジ(Challenge)用ウイルス液の調製
インフルエンザウイルス感染の当日に、インフルエンザウイルス(Influenza virus )A/PR/8/34株の保存ウイルス液を室温にて自然融解した。融解した保存ウイルス液を滅菌0.1% ウシ血清アルブミン(BSA:Bovine Serum Albumin含ダルベッコのリン酸緩衝液(Dulbecco’s Phosphate Buffer Saline:（D-PBS）を用いて下気道感染用には1000TCID50/0.05mL、上気道感染用には1000TCID50/0.005mLになるように希釈し、チャレンジ用ウイルス液とした。
4.3. ウイルス液の鼻腔内接種
2回目のワクチン接種から2週間後に、マウス用麻酔液をマウス当り0.05mL、筋肉内投与して麻酔した。 4.2で作製したインフルエンザウイルス液を、マイクロピペッターを用い、麻酔したマウスの鼻腔内に上気道感染系には0.005mL 、下気道感染系には0.05 mL接種した。
4.4 肺の採取
ウイルス接種から3日後に、各群から4匹のマウスにマウス用麻酔液をマウスあたり0.1 mLを筋肉内投与し、麻酔下で腹部下大静脈から放血させることで安楽死させた後、各群のマウスを解剖し、無菌的に肺を摘出した。
4.5 インフルエンザウイルス接種後のマウス生存率の記録
ウイルス接種11日後まで、1日1回マウスの生存を確認し、記録した。
4.6 肺ホモジネ−ト作製および希釈液の調製
肺ホモジネ−トは、摘出した1匹の肺当たり3 mLの0.1%BSA、10mM HEPES緩衝液 、抗生物質添加ミニマム エッセンシャル メディウム：Minimum Essential Medium （MEM、GIBCO）を加え、ポリトロンホモジナイザーを用いてすりつぶし作製した。肺ホモジネ−トはクライオチューブに分注し、超低温冷凍庫に保存した。
前記抗生物質およびトリプシン（SIGMA、 T-4549、 2mg/mL）を添加したMEM培地を用いて、10倍希釈、または10 0.5 倍希釈系列を作製した。
4.7細胞増殖用培地の作製
MEM500 mLに対しウシ胎児血清( Fetal Bovine Serum:FBS) 50 mLを添加した細胞増殖用培地（MEM＋10% FBS）を調製し、使用時まで冷蔵保存した。
4.8 MDCK（Madin-Darby Canine Kidney）イヌ腎臓由来細胞の培養
凍結保存されたMDCK細胞を温水中で急速融解後、10 mLの細胞増殖用培地に懸濁し、遠心（1000 r.p.m.、5分、4℃）により上清を除去した。遠心して回収した細胞沈渣を細胞増殖用培地に懸濁浮遊した。培養フラスコに播種し37℃、5％ CO2設定インキュベ−ター内で培養した。培養開始後、顕微鏡にて細胞の形態及び増殖状態を観察し、MDCK細胞がコンフルエントになる直前に、細胞をD-PBS(-) で洗浄後、トリプシン-EDTA処理して細胞を分散し、細胞増殖用培地に懸濁した。細胞懸濁液を、培養フラスコに播種し、新鮮な細胞増殖用培地を入れ継代培養した。
4.9 ウイルス増殖用培地（維持培地）の作製
MEM 500 mL（10mM HEPES 緩衝液添加）に対しBSAを0.1%になるように添加した培地をウイルス増殖用培地（MEM＋0.1% BSA）とし、調製後使用時まで冷蔵保存した。使用時に抗生物質を添加した。
4.10ウイルス感染価の測定（Cytopathic Effect、CPE法）
培養フラスコのMDCK細胞がコンフルエントになる直前に、トリプシン-EDTA処理にて細胞を分散し、細胞数を数え、維持培地を用いて、60万細胞/mLのMDCK細胞懸濁液を調整した。これを0.05mLずつ96穴プレートに分注し、一晩、5%CO2、37°Cに設定したCO2インキュベーター内で培養した。
翌日、細胞が付着していることを確認し、作製した各肺ホモジネート希釈液を96ウェルプレートの6ウェルに1ウェルあたり0.05mLずつ分注した。肺ホモジネート希釈液を分注した96ウェルプレートを、5%CO2、37°Cに設定したCO2インキュベーター内で3日間培養した。
培養3日目にウェルの細胞変性を確認し、30%ホルマリン含クリスタルバイオレット溶液を96ウェルプレートの各ウェルに0.05mLずつ分注し、固定染色し、Reed-Munch法による肺内ウイルス感染価の算出により、感染価を算出した。
4.11各ワクチン群のマウス体内のウイルス感染価に対する効果
コントロール群であるAcNPV接種群とワクチン群の実施例2の組換えバキュロウイルス(実施例1(3)で得られたトランスファーベクターを包含：AcNPV-Dual-H1N1/HA1)と組換えバキュロウイルス(参考例 1で得られたベクターを包含：AcNPV-CMV-H1N1/HA full)接種群のマウス肺ホモジネート液中ウイルス感染価を用い、それぞれのウイルス感染価を対数変換し、各接種群間の治療効果を、多重性を考慮した一元配置分散分析Tukey test（Release 8.1、SAS Institute Japan Ltd)で解析した。
その結果を第1図に示した。
各ワクチン群のインフルエンザウイルス感染後の生存期間に対する効果
コントロール群であるAcNPV接種群とワクチン群のAcNPV-Dual-H1N1/HA1とAcNPV-CMV-H1N1/HA full接種群の生存期間について、ログランク検定を用いて比較し、図２に示した。
統計解析は、SASシステム（SAS Institute Japan、R.8.1）を用いて検討した。有意水準は5％とした。
4.12肺内ウイルス感染価
AcNPV-Dual-H1N1/HA1筋肉内接種群はAcNPV接種群と比較して有意（p値：0.0009）に感染6日目の肺内ウイルス感染価を抑制した。一方、AcNPV-Dual-H1N1/HA1筋肉内接種群は、感染6日目の肺内ウイルス感染価をAcNPV-CMV-H1N1/HA full接種群と比較して有意（p値：0.0094）に抑制した。
4.13生存期間
AcNPV-Dual-H1N1/HA1筋肉内接種群はAcNPV接種群と比較して有意（p値：0.0031）に生存期間が延長した。一方、AcNPV-CMV-H1N1/HA full接種群の生存期間はAcNPV接種群と差はなかった（p値：0.7851）。
また、AcNPV-Dual-H1N1/HA1筋肉内接種群の生存期間はAcNPV-CMV-H1N1/HA full接種群と比較して有意（p値：0.0031）に延長した。
この評価系ではマウスはインフルエンザウイルス肺炎をおこし、死亡することからAcNPV-Dual-H1N1/HA1を筋肉内に接種することにより、肺内ウイルスの増殖を抑制し、肺炎によるマウスの死亡を抑制できたと推察できる。
実施例5：昆虫細胞における本発明組換えバキュロウイルスからのワクチン抗原の発現試験
Sf9細胞を12穴プレート1ウェルあたり3 x 106cellsになるように培養し、実施例2で得たバキュロウイルス粒子AcNPV-Dual-PbCSP、AcNPV-Dual-Hsp65、 AcNPV-Dual-H1N1/HA1、およびコントロールとして野生型バキュロウイルスAcNPV-WTを感染重複度約5で感染させた。3-4日後、培養上清を除き、PBSで3回リンスした後、2% 2-メルカプトエタニールを含むラムリ(Leamuli)液（50mM トリス−塩酸[pH6.8]、2% SDS、10% グリセロール(glycerol)、0.1% ブロモフェノール・ブルー(bromophenol blue)）を1ウェルあたり0.2mL加えて細胞を完全に溶解した。95℃で5分間boilした後、6% SDS-PAGEで電気泳動を行った。泳動後、タンパクをPVDFメンブレン (Immobilon-P、ミリポア社製)に転写し、ブロックエース（大日本製薬社製）に浸して4℃で12時間ブロッキングを行った。以下の手順でウェスタンブロッティングを行った。各バキュロウイルス感染Sf9細胞タンパクを転写したメンブレンは、一次抗体としてマウス抗FLAGモノクローナル抗体 （SIGMA社製）、二次抗体としてヤギ抗マウスIgG (H+L)ビオチンラベル（Vector社製）を加えてインキュベーションし、さらにアビジン アルカリホスファターゼラベル（GIBCO-BRL社製）加え、NBT/BCIP（GIBCO-BRL社製）で発色させて反応するタンパクのバンドを検出した。その結果を図3に示す。
図３中、組換えトランスファーベクターからのインフルエンザウイルスHA抗原遺伝子、結核菌Hsp65遺伝子およびマラリア原虫CSP遺伝子の組換えバキュロウイルスの昆虫細胞内での融合抗原の発現を示すウェスタンブロッティング分析の図面であり、図中左レーンのレーン１は野生型バキュロウイルス(AcNPV-WT)を、レーン２は、本発明のデュアル・プロモーター下にインフルエンザウイルスHA抗原遺伝子が挿入された組換えバキュロウイルス(AcNPV-Dual-H1N1/HA1)のバンドを、図中、中央レーンのレーン３は野生型バキュロウイルス(AcNPV-WT)を、レーン４は、本発明のデュアル・プロモーター下に結核菌Hsp65遺伝子が挿入された組換えバキュロウイルス(AcNPV-Dual-Hsp65)のバンドを、図中右レーンのレーン５は野生型バキュロウイルス(AcNPV-WT)を、レーン６は、本発明のデュアル・プロモーター下にマラリア原虫CSP遺伝子が挿入された組換えバキュロウイルス(AcNPV-Dual-PbCSP)をそれぞれ示す。
該図のレーン２、４および６に示されるように本発明のデュアル・プロモーター下に各種抗原をgp64遺伝子と融合発現させた組換えバキュロウイルスでは免疫原性外来抗原遺伝子とgp64遺伝子との融合発現産物のバンドが観察される。
このことから、昆虫細胞で免疫原性外来抗原遺伝子とgp64遺伝子との融合発現産物が発現できることが確認された。
実施例6：哺乳動物における本発明組換えバキュロウイルスからのワクチン抗原の発現試験
HepG2細胞にAcNPV-Dual-Hsp65、コントロールとしてAcNPV-WTを各々感染重複度約１で感染させた。24時間後、培養上清を除き、PBSで3回リンスした後、-20℃に冷したアセトン・エタノール液 (7:3混合)を加え、-20℃で5分間細胞の固定を行った。5%正常ヤギ血清液（SIGMA社製）を加え室温で1時間ブロッキングを行った。次に、一次抗体としてマウス抗Hsp65抗体 （Yoshida et al.、 Vaccine 2005）、二次抗体としてヤギ抗マウスIgG (H+L)FITCラベル（BIOSOURCE社製）を加えてインキュベーションし、蛍光顕微鏡で反応する細胞を検出した。
また、HepG2細胞を直径100 mm細胞培養用プレートあたり1 x 107cellsになるように培養し、実施例2で得たバキュロウイルス粒子AcNPV-Dual-H1N1/HA1、AcNPV-CMV-H1N1/HA fullおよびコントロールとしてAcNPV-WTを感染重複度約5で感染させた。2時間後、培養上清を除き、PBSで3回リンスした後、メチオニンおよびシスティン不含培地（Dulbecco's Modified Eagle medium（インビトロジェン社）にPBSで透析したFBSを10%になるように加えた培地）で3時間培養し、アイソトープラベルしたメチオニンおよびシスティン溶液（TRANS35S-LABEL MP Biomedicals、 Inc.）を最終濃度が5 マイクロCi/mlになるように加えた。12時間後、培養上清を除き、PBSで3回リンスした後、RIPAバッファー（1% Sodium deoxycholate、 1% Triton X-100、 0.1% SDS、 10 mM TrisHCl[pH 7.5]）0.5mLで細胞を溶かしサンプルとした。あらかじめインフルエンザ感染血清（マウス）を吸着したProtein A-sepharose CL-4B (ファルマシア社)担体に上記の各サンプルを加え、氷上で2時間インキュベーションした。担体をRIPAバッファーで５回洗浄し、2% 2-メルカプトエタニールを含むLeamuli液を加え、95℃で5分間boilした後、6% SDS-PAGEで電気泳動を行った。泳動後、ゲルを乾燥させ、オートラジオグラフィーにて抗体と反応したタンパクを検出した。
その結果を図4と5に示す。
図4中、（Ａ）は、HepG2細胞における結核菌Hsp65遺伝子組換えバキュロウイルス発現を示す蛍光標識抗体に染まった細胞の図面を示す。
図4中、（Ｂ）は、野生型バキュロウイルスをHepG2細胞に加えた場合の図面を示す。
該図の（Ａ）から明らかなように本発明のデュアル・プロモーターのトランスファーベクターを用いた組換えバキュロウイルスは哺乳動物細胞において、目的抗原を発現せしめることが分かる。
このことから、本発明の組換えトランスファーベクターからの製造された組換えバキュロウイルスは、ヒトを含む哺乳動物に投与されたときに、ウイルス粒子が哺乳動物細胞に侵入し、哺乳動物プロモーターが作動し、哺乳動物細胞内で目的外来抗原遺伝子とgp64遺伝子の融合物を産生し、獲得免疫が誘導されることが示唆される。
図5中、デュアル・プロモーター下にインフルエンザウイルスHA抗原遺伝子を組み込んだ組み換えバキュロウイルスの哺乳動物細胞における融合抗原の発現を免疫沈降法で分析した図面である。図中左レーンのレーン１は野生型バキュロウイルス(AcNPV-WT)の、レーン2は、CMVプロモーター下にインフルエンザウイルスHA抗原遺伝子を組み込んだ組換えバキュロウイルス(AcNPV-CMV-H1N1/HA full)の、レーン3は、デュアル・プロモーター下にインフルエンザウイルスHA抗原遺伝子をgp64遺伝子と融合発現するように組み込んだ組み換えバキュロウイルス(AcNPV-Dual-H1N1/HA1)を加えたHepG2細胞抽出液を使用した。
CMVプロモーター下にインフルエンザウイルスHA抗原遺伝子を組み込んだ組換えバキュロウイルス(AcNPV-CMV-H1N1/HA full)とデュアル・プロモーター下にインフルエンザウイルスHA抗原遺伝子をgp64遺伝子と融合発現するように組み込んだ組み換えバキュロウイルス(AcNPV-Dual-H1N1/HA1)において、インフルエンザウイルス感染血清に特異的に反応するタンパク質、すなわちHA抗原をふくむタンパク質がHepG2細胞内で新規に合成されていることが明らかである。
このことから、本発明の組換えバキュロウイルスは、哺乳動物細胞内でも所望の免疫原性外来抗原遺伝子の抗原タンパクを発現させ、ヒトを含む哺乳動物に組み換えウイルスが投与されたときに、融合抗原のヒト細胞での発現に伴い、抗原特異的な獲得免疫を誘導できることが考えられる。
実施例7：本発明組換えバキュロウイルスのウイルス粒子(ビリオン)上に提示されたワクチン抗原中での融合抗原の確認試験
実施例2で得たバキュロウイルス粒子AcNPV-WT、 AcNPV-CMV-PbCSP、AcNPV-PbCSPsurf、 AcNPV-Dual-PbCSPを超遠心分離で回収したウイルス濃縮液各々0.005mLに2 x レムリ液を0.005mL加え、95℃で5分間沸騰させた後、6% SDS-PAGEで電気泳動を行った。泳動後、タンパクをPVDFメンブレン (Immobilon-P、ミリポア社製)に転写し、ブロックエース（大日本製薬社製）に浸して4℃で12時間ブロッキングを行った。以下の手順でウェスタンブロッティングを行った。各バキュロウイルス粒子タンパクを転写したメンブレンは、一次抗体としてマウス抗FLAGモノクローナル抗体 （SIGMA社製）、二次抗体としてヤギ抗マウスIgG (H+L)ビオチンラベル（Vector社製）を加えてインキュベーションし、さらにアビジン・アルカリホスファターゼラベル（GIBCO-BRL社製）加え、NBT/BCIP（GIBCO-BRL社製）で発色させて反応するタンパクのバンドを検出した。
その結果を図6に示す。
図6中、組換えトランスファーベクターから作製した組換えバキュロウイルスのウイルス粒子中でのマラリアCSP遺伝子(PbCSP)のそれぞれの発現を示すウェスタンブロッティング分析の図面であり、図中左レーンのレーン１は野生型バキュロウイルスを、レーン2は、哺乳動物プロモーター制御下にPbCSP抗原遺伝子を挿入したトランスファーベクターで作製した組換えバキュロウイルスを、レーン3は、バキュロウイルスポリへドリンプロモーター制御下にPbCSP抗原遺伝子をgp64遺伝子と融合発現するように挿入したトランスファーベクターで作製した組換えバキュロウイルスを、レーン４は、本発明のデュアル・プロモーターを用いてPbCSP抗原遺伝子とgp64遺伝子と融合発現するように挿入した組換えバキュロウイルスを電気泳動し、 PbCSP遺伝子とgp64遺伝子との融合発現物を確認した。
該図のレーン３および４に示されるように、AcNPV-PbCSPsurfとAcNPV-Dual-PbCSPでは組換えウイルス粒子に融合抗原の存在を示す強いバンドをそれぞれ確認できた。
このように実施例７から、本発明の組換えトランスファーベクターからの製造された本発明の組換えバキュロウイルスは、組換えウイルス粒子中に所望の免疫原性外来遺伝子とgp64遺伝子の融合発現産物が存在できることが分かる。
実施例8：プロモーター変換による遺伝子発現の持続性
1）プロモーター変換による遺伝子発現の持続性
組換えウイルスの培養細胞内での抗原の発現の持続性を確認するため、AcNPV-CP-H1N1/HA1、AcNPV-CAP- H1N1/HA1、AcNPV-CU- H1N1/HA1をHeLa細胞に感染し、抗原の発現を確認した。細胞はそれぞれ24wellプレートに1.0×104 cell/wellになるように播種した。その後、MOI＝10、20、100でウイルスを感染し、1時間吸着を行なった。その後、細胞培養上清からウイルスを除去し、インキュベーター内で培養を行なった。経時的に細胞を回収し、RNAの抽出を行なった。抽出したRNAを鋳型にプライマー
HA1_F01 (5’- GAGCTGAGGGAGCAATTGAG-3’(配列番号51)) とプライマーHA1_R01 (5’-GGGTGATGAATACCCCACAG-3’(配列番号52))を用いてRT-PCRを行ない、増幅したDNAを電気泳動により解析した。その結果、3種類とも発現が確認され、本発明の組換えバキュロウイルスではCMVプロモーターから他の真核生物プロモーターに変換することが可能であることが確認された。
図7はHeLa細胞での遺伝子の発現をRT-PCRにより検出した結果であり、MはDNA電気泳動マーカーを、1は野生型ウイルスをMOI＝10で感染させた細胞からのRNAを、2は野生型ウイルスをMOI＝20で感染させた細胞からのRNAを、3は野生型ウイルスをMOI＝100で感染させた細胞からのRNAを、4はAcNPV-CP-H1N1/HA1をMOI＝10で感染させた細胞からのRNAを、5はAcNPV-CP-H1N1/HA1をMOI＝20で感染させた細胞からのRNAを、6はAcNPV-CP-H1N1/HA1をMOI＝100で感染させた細胞からのRNAを、7はAcNPV-CU-H1N1/HA1をMOI＝10で感染させた細胞からのRNAを、8はAcNPV-CU-H1N1/HA1をMOI＝20で感染させた細胞からのRNAを、9はAcNPV-CU-H1N1/HA1をMOI＝100で感染させた細胞からのRNAを、10はAcNPV-CAP-H1N1/HA1をMOI＝10で感染させた細胞からのRNAを、11はAcNPV-CAP-H1N1/HA1をMOI＝20で感染させた細胞からのRNAを、12はAcNPV-CAP-H1N1/HA1をMOI＝100で感染させた細胞からのRNAを、それぞれ経時的に感染0時間後、1日後、4日後、7日後に回収し、RT-PCRを行ない、その増幅DNAをそれぞれ電気泳動した結果を示している。
実施例９：PbCSP抗原組換えウイルスによる抗体価と細胞性免疫の誘導
１．ワクチン接種
BALB/c雌マウスに、ワクチン用組換えウイルス液を3週間間隔で3回接種した。接種液量は、大腿筋筋肉内注射の場合は0.2 mL/bodyとし、1×108 pfu/bodyのウイルス量となるようにウイルス液を調製した。ワクチンは野生型ウイルス（AcNPV-WT）、AcNPV-PbCSPsurf (Yoshida et al.Virology 316: 161-70、 2003)、AcNPV-Dual-PbCSPを接種した。
２．マウスの解剖
最終免疫から3週間後に安楽死を行ない、マウスから血清と脾臓を回収した。血清は特異的抗体価の測定に使用し、脾臓はELISPOTアッセイに使用した。
３．抗体価の測定
大腸菌で強制発現させて精製回収したPbCSP組換えタンパク質を固相化したプレートを用いて、ELISA法で抗体価の測定を行なった。ELISA法は標準法に則って行なった。その結果、非接種群や野生型ウイルス接種群では抗体価の上昇は確認できなかったが、AcNPV-PbCSPsurf接種群とAcNPV-Dual-PbCSP接種群では特異的な抗体価の上昇が確認できた。
図8中、非接種群、野生型ウイルス接種群、AcNPV-PbCSPsurf接種群、AcNPV-Dual-PbCSP接種群のPbCSP特異的なIgG抗体の力価を示している。
４．ELISPOTアッセイを用いた細胞性免疫の評価
免疫を行なったマウスの脾臓細胞を用いて、ELISPOTアッセイを行なった。マウスの脾臓細胞から細胞を調整し、MultiScreen-IP（ミリポア）に適量の細胞を添加した。そこへPbCSPのCD8エピトープとして知られているペプチド（アミノ酸配列：SYIPSAEKI、配列番号53）を添加し、一晩培養を行なった。その後はELISPOT Mouse IFN-γ ELISPOT Set（BD Sciences）を用いて反応を行ない、AEC substrate set（BD Sciences）を用いて発色を行なった。発色したスポットを測定することで、抗原特異的な応答を行なう細胞数を測定した。その結果、非接種群、野生型ウイルス接種群、AcNPV-PbCSPsurf接種群では抗原特異的な細胞が確認できなかったが、AcNPV-Dual-PbCSP接種群では106個の脾臓細胞あたり約350個の反応細胞が観察された。このことから、AcNPV-Dual-PbCSPがAcNPV-PbCSPsurfよりも細胞性免疫を有意に誘導できることが明らかとなった。
図9中、非接種群、野生型ウイルス接種群、AcNPV-PbCSPsurf接種群、AcNPV-Dual-PbCSP接種群のPbCSPのCTLエピトープに特異的なIFN-γ産生細胞数を示している。
実施例１０：組換えバキュロウイルスを有効成分とするワクチンの抗ウイルスの効果確認試験
（M2e組換えバキュウロウイルスの効果確認試験）
M2e組換えバキュウロウイルス（AcNPV-Dual-M2e)を大腿筋筋肉内にマウス当たり3.4×108PFU量を2週間間隔で2回接種を行なった。最終ワクチン接種から2週間後にインフルエンザウイルス(Influenza virus)A/PR/8/34をマウス鼻腔内に1000TCID50のウイルスを0.005mLの溶液で接種し、感染した。感染6日後に安楽死を行ない、肺を摘出し、MDCK細胞を用いて肺内のウイルス量の検出を行なった。その結果、AcNPV-Dual-M2eを接種したマウスでは試験を行なったすべてのマウスでインフルエンザウイルスは検出できなかった。また、同時にこれはHA1組換えバキュウロウイルスワクチン（AcNPV-Dual-H1N1/HA1)筋肉内接種群（マウス当たり1.0×107PFU）と同様の効果であった。
図10中、PBS群、 AcNPV-Dual-M2e接種群、AcNPV-Dual-H1N1/HA1接種群のインフルエンザウイルス感染6日後の肺内ウイルス量を示している。
実施例１１：HA1/NC99組換えバキュウロウイルスを有効成分とする医薬の予防効果確認試験
HA1/NC99組換えバキュウロウイルス（AcNPV-Dual-HA1/NC99）を大腿筋筋肉内にマウス当たり1.0×108PFU量を2週間間隔で2回接種を行なった。最終ワクチン接種から2週間後にインフルエンザウイルス(Influenza virus)A/NewCaledonia/20/99をマウス鼻腔内に1000TCID50のウイルスを0.05mLの溶液で接種し、感染した。感染3日後に安楽死を行ない、肺を摘出し、MDCK細胞を用いて肺内のウイルス量の検出を行なった。その結果、AcNPV-Dual- H1N1/NC99を接種したマウスでは4例中3例のマウスでインフルエンザウイルスは検出できなかった。
図11中、PBS群、野生型ウイルス接種（AcNPV-WT）群、AcNPV-Dual- HA1/NC99接種群のインフルエンザウイルス感染3日後の肺内ウイルス量を示している。
実施例１２：組換えバキュウロウイルスを有効成分とする医薬組成物の投与経路による特異抗体の確認試験
HA1組換えバキュウロウイルス（AcNPV-Dual-H1N1/HA1)を、マウス当たり2.0×107PFU量を、それぞれ点鼻（ウイルス液を両鼻に0.005mL接種）、経鼻（ウイルス液を鼻から0.05mL接種）、経気道（ウイルス液を気道から0.05mL接種）、筋肉注射（ウイルス液を大腿筋に0.05mL接種）の投与経路で接種することで、 2週間間隔で2回接種を行なった。最終ワクチン接種から2週間後に鼻洗浄液、肺胞洗浄液、血清を採取し、インフルエンザウイルス特異的な抗体の発現を確認した。インフルエンザウイルス(Influenza virus)A/PR/8/341を感染させたMDCK細胞の抽出液を固相化したプレートを用いて、ELISA法で抗体価の測定を行なった。ELISA法は標準法に則って行なった。その結果、経鼻、経気道、筋肉注射投与群で、血中に特異的なIgG抗体が確認され、特に経気道投与で強い抗体の誘導が確認された。また、鼻洗浄液や肺胞洗浄液内でも、同様に抗原特異的なIgG抗体が確認され、特に経気道投与で強い抗体の誘導が確認された。さらに、経気道投与群においては、肺胞洗浄液中に抗原特異的なIgA抗体の産生も確認された。
図12中、点鼻接種群、経鼻接種群、経気道接種群、筋肉内接種群の血中のインフルエンザウイルス特異的なIgG抗体を測定したELISAの結果を示している。
図13中、点鼻接種群、経鼻接種群、経気道接種群、筋肉内接種群の鼻洗浄液及び肺胞洗浄液中のインフルエンザウイルス特異的なIgG及びIgA抗体を測定したELISAの結果を示している。
実施例１３：組換えバキュウロウイルスを有効成分とする医薬組成物の投与経路による効果の確認試験
HA1組換えバキュウロウイルス（AcNPV-Dual-H1N1/HA1)を、マウス当たり1.0×107PFU量を、それぞれ点鼻、経鼻、経気道、筋肉注射の投与経路で接種することで、 2週間間隔で2回接種を行なった。最終ワクチン接種から2週間後にインフルエンザウイルス(Influenza virus)A/PR/8/34をマウス鼻腔内に1000TCID50のウイルスを0.005mLの溶液で接種し、感染した。感染3日後には鼻洗浄液を採取し、感染6日後には肺を摘出し、MDCK細胞を用いて肺内のウイルス量の検出を行なった。その結果、経鼻投与群や経気道投与群では顕著に感染3日目の鼻腔内ウイルスを抑制していた。さらに、経気道投与群では、感染6日目の肺内ウイルス量を、筋肉内接種群と同様に検出限界以下にまで抑制していた。
図14中、点鼻接種群、経鼻接種群、経気道接種群、筋肉内接種群のインフルエンザウイルス感染3日後の鼻洗浄液中ウイルス量を示している。
図15中、点鼻接種群、経鼻接種群、経気道接種群、筋肉内接種群のインフルエンザウイルス感染6日後の肺内ウイルス量を示している。
配列番号：1、2は、P. berghei ANKA株のゲノムDNAのPCR用プライマーPbCSP-F1とPbCSP-R1のプライマー配列である。
配列番号：3、4は、結核菌H37RvのゲノムDNAのPCR用プライマーphsp65-F1と phsp65-R1のプライマー配列である。
配列番号：5、6は 、pcDNA-hsp65を鋳型としたPCR用プライマーphsp65-F2とphsp65-R2のプライマー配列である。
配列番号：7、8は、pBACgus-1(Novagen社製)を鋳型とした、gp64遺伝子DNA断片を得るPCR用プライマーpPolh-F2とpgp64-R2のプライマー配列である。
配列番号：9、10はインフルエンザウイルスHA遺伝子断片製造のPCR用プライマーHA-fとHA-rのプライマー配列である。
配列番号：11、12は、pCR-Blunt-HAを鋳型としたPCR用プライマーpHA-F1とpHA-R1のプライマー配列である。
配列番号：13、14は、PbTRAMP遺伝子のPCR用プライマーpTRAMP-F1とpTRAMP-R1のプライマー配列である。
配列番号：15、16は、PbAMA1遺伝子domain 123 (D123)のPCR用プライマーpAMA-F1 とpAMA1-R1のプライマー配列である。
配列番号：17、18は、PbMSP119遺伝子のPCR用プライマーpMsp1-F1とpMsp1-R1のプライマー配列である。
配列番号：19、20は、PfCSP遺伝子のPCR用プライマーpPfCSP-F1とpPfCSP-R1のプライマー配列である。
配列番号：21、22は、P. falciparumのPfAMA1遺伝子のPCR用プライマーpPfAMA1-F1とpPfAMA1-R1のプライマー配列である。
配列番号：23、24は、熱帯熱マラリア原虫P. falciparum 3D7株のPfPfs25遺伝子のPCR用プライマーpPfs25-F1とpPfs25-R1のプライマー配列である。
配列番号：25、26は、pCR-Blunt-HAを鋳型としたPCR用プライマーPolh-f RsrIIとGP64-r DraIIIのプライマー配列である。
配列番号：27、28は、CMV enhancer領域のPCR用プライマーCMVenh-f FseIとCMVenh-r KpnIのプライマー配列である。
配列番号：29、30は、UBBプロモーター領域のPCR用プライマーUBBp-f KpnIとUBBp-r RsrIIのプライマー配列である。
配列番号：31、32は、インフルエンザウイルスPR8/34株のゲノムRNAのRT-PCR用プライマーNP-f EcoRIとNP-r Cfr9Iのプライマー配列である。
配列番号：33、34は、インフルエンザウイルスPR8/34株のゲノムRNAのRT-PCR用プライマーM2-f EcoRIとM2-r Cfr9Iのプライマー配列である。
配列番号：35、36は、インフルエンザウイルスPR8/34株のゲノムRNAのRT-PCR用プライマーNAe-f EcoRIとNAe-r Cfr9Iのプライマー配列である。
配列番号：37、38は、pDual-H1N1/M2-gp64を鋳型としたPCR用プライマーM2-f EcoRIとM2e-r Cfr9Iのプライマー配列である。
配列番号：39、40は、NewCaledonia99/20(NC99)のゲノムRNAのRT-PCR用プライマーHA1-f EcoRIとHA1-r CFr9I(NC99)のプライマー配列である。
配列番号：41、42は、pCR-Blunt-HAを鋳型としたPCR用プライマーHA0-f EcoRIとHA2-r Cfr9Iのプライマー配列である。
配列番号：43、44は、pCR-Blunt-HAを鋳型としたPCR用プライマーHA2-f EcoRIとHA2-r Cfr9Iのプライマー配列である。
配列番号：45、46は、vp39遺伝子領域のPCR用プライマーvp39-fとvp39-rのプライマー配列である。
配列番号：47、48は、HA1遺伝子断片のPCR用プライマーPolh-S1とHA1-r EcoRIのプライマー配列である。
配列番号：49、50は、pDual-H1N1/NP-gp64を鋳型としたPCR用プライマーNP-f 5 EcoRIとNP-r EcoRIのプライマー配列である。
配列番号：51、52は、AcNPV-CP-H1N1/HA1、AcNPV-CAP- H1N1/HA1、AcNPV-CU- H1N1/HA1の発現確認用のプライマーである。
配列番号：53は、PbCSPのCD8エピトープとして知られているペプチドである。

Claims (24)

  1. 一方が脊椎動物細胞で機能し得るプロモーターで、他方がバキュロウイルスのプロモーターである連結したデュアル・プロモーターの下流に、少なくとも一つのウイルス粒子の構成成分になり得るタンパク質をコードする遺伝子と、少なくとも一つの免疫原性外来遺伝子とを含む融合遺伝子を連結すること、
    脊椎動物細胞で機能し得るプロモーターがサイトメガロウイルスプロモーター、 SV40 プロモーター、レトロウイルスプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロテインプロモーター、ＣＡＧプロモーター、エロンゲーションファクター 1 αプロモーター、アクチンプロモーター、ユビキチンプロモーター、アルブミンプロモーター及び MHC クラス II プロモーターのいずれかから選択されること、並びに
    バキュロウイルスのプロモーターがポリヘドリンプロモーター、ｐ 10 プロモーター、 IE1 プロモーター、 IE2 プロモーター、 p35 プロモーター、 p39 プロモーター及び gp64 プロモーターのいずれかから選択されることを特徴とする、デュアル・プロモーターと融合遺伝子が組み込まれた構造体を含むトランスファーベクターの製造方法。
  2. 前記脊椎動物細胞で機能し得るプロモーターが哺乳動物細胞で機能し得るプロモーターである、請求項１に記載の方法。
  3. 少なくとも一つのウイルス粒子の構成成分になり得るタンパク質をコードする遺伝子が、バキュロウイルスgp64遺伝子、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質遺伝子、1型ヒト免疫不全ウイルス糖タンパク質遺伝子、ヒト呼吸器合胞体ウイルス膜糖タンパク質遺伝子、A型インフルエンザウイルスヘマグルチニンタンパク質遺伝子、B型インフルエンザウイルスヘマグルチニンタンパク質遺伝子、単純ヘルペスウイルス糖タンパク質遺伝子、マウス肝炎ウイルスSタンパク質遺伝子のいずれかであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
  4. 免疫原性外来遺伝子がマラリア抗原、インフルエンザウイルス抗原、結核菌抗原、SARSウイルス抗原、西ナイル熱ウイルス抗原、デング熱ウイルス抗原、HIV抗原、HCV抗原、リューシマニア抗原、トリパノソーマ抗原、ロイコチトゾーン抗原単独、もしくはこれらの抗原遺伝子群から選ばれる少なくとも1種とサイトカインとの融合抗原のいずれかから選択される請求項１に記載の方法。
  5. トランスファーベクターが、pDual-Hsp65-gp64、pDual-PbCSP-gp64、pDual-H1N1/HA1-gp64、pDual-PbTRAMP-gp64、pDual-PbAMA1D123-gp64、pDual-PbMSP129-gp64 、pDual-PfCSP-gp64、pDual-PfAMA1-gp64、pDual-Pfs25-gp64、pDual-H5N1/HA1-gp64、pDual-SARS/S-gp64、pCP-H1N1/HA1-gp64、pCAP-H1N1/HA1-gp64、pCU-H1N1/HA1-gp64、pDual-H1N1/NP-gp64、pDual-H1N1/M2-gp64、pDual-H1N1/NAe-gp64、pDual-M2e-gp64、pCP-HA1/NC99-gp64、pCP-H1N1/HA0-gp64、pCP-H1N1/HA2-gp64、pCP-H1N1/HA1-vp39、pCP-H1N1/NP-vp39のいずれかである請求項１に記載の方法。
  6. 組換えバキュロウイルスの製造方法であって、一方が脊椎動物細胞で機能し得るプロモーターで、他方がバキュロウイルスのプロモーターである連結したデュアル・プロモーターの下流に連結された、少なくとも一つのウイルス粒子の構成成分になり得るタンパク質をコードする遺伝子と少なくとも一つの免疫原性外来遺伝子とを含む融合遺伝子が組み込まれた構造体を含むトランスファーベクターを製造する工程、該トランスファーベクターとバキュロウイルスDNAとを昆虫の宿主細胞にコトランスフェクションする工程、組換えバキュロウイルスを分離する工程を含み、
    脊椎動物細胞で機能し得るプロモーターがサイトメガロウイルスプロモーター、 SV40 プロモーター、レトロウイルスプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロテインプロモーター、ＣＡＧプロモーター、エロンゲーションファクター 1 αプロモーター、アクチンプロモーター、ユビキチンプロモーター、アルブミンプロモーター及び MHC クラス II プロモーターのいずれかから選択されること、並びに
    バキュロウイルスのプロモーターがポリヘドリンプロモーター、ｐ 10 プロモーター、 IE1 プロモーター、 p35 プロモーター、 p39 プロモーター及び gp64 プロモーターのいずれかから選択される、前記方法。
  7. 少なくとも一つのウイルス粒子の構成成分になり得るタンパク質をコードする遺伝子が、バキュロウイルスgp64遺伝子、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質遺伝子、1型ヒト免疫不全ウイルス糖タンパク質遺伝子、ヒト呼吸器合胞体ウイルス膜糖タンパク質遺伝子、A型インフルエンザウイルスヘマグルチニンタンパク質遺伝子、B型インフルエンザウイルスヘマグルチニンタンパク質遺伝子、単純ヘルペスウイルス糖タンパク質遺伝子、マウス肝炎ウイルスSタンパク質遺伝子のいずれかであることを特徴とする請求項６に記載の方法。
  8. 免疫原性外来遺伝子がマラリア抗原、インフルエンザウイルス抗原、結核菌抗原、SARSウイルス抗原、西ナイル熱ウイルス抗原、デング熱ウイルス抗原、HIV抗原、HCV抗原、リューシマニア抗原、トリパノソーマ抗原、ロイコチトゾーン抗原単独、もしくはこれらの抗原遺伝子群から選ばれる少なくとも1種とサイトカインとの融合抗原のいずれかから選択される請求項６に記載の方法。
  9. 組換えバキュロウイルスが、AcNPV-Dual-Hsp65、AcNPV-Dual-PbCSP、AcNPV-Dual-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-PbTRAMP、AcNPV-Dual-PbAMA1D123、AcNPV-Dual-PbMSP129、AcNPV-Dual-PfCSP、AcNPV-Dual-PfAMA1、AcNPV-Dual-Pfs25、AcNPV-Dual-H5N1/HA1、AcNPV-Dual-SARS/S、AcNPV-H1N1/HA1、AcNPV-CAP-H1N1/HA1、AcNPV-CU-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-H1N1/NP、AcNPV-Dual-H1N1/M2、AcNPV-Dual-H1N1/NAe、AcNPV-Dual-M2e、AcNPV-CP-HA1/NC99、AcNPV-CP-H1N1/HA0、AcNPV-CP-H1N1/HA2、AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39、AcNPV-CP-H1N1/NP-vp39のいずれかである請求項６に記載の方法。
  10. 一方が脊椎動物細胞で機能し得るプロモーターで、他方がバキュロウイルスのプロモーターである連結したデュアル・プロモーターの下流に連結された、少なくとも一つのウイルス粒子の構成成分になり得るタンパク質をコードする遺伝子と少なくとも一つの免疫原性外来遺伝子とを含む融合遺伝子が組み込まれた構造体を含み、
    脊椎動物細胞で機能し得るプロモーターがサイトメガロウイルスプロモーター、 SV40 プロモーター、レトロウイルスプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロテインプロモーター、ＣＡＧプロモーター、エロンゲーションファクター 1 αプロモーター、アクチンプロモーター、ユビキチンプロモーター、アルブミンプロモーター及び MHC クラス II プロモーターのいずれかから選択されること、並びに
    バキュロウイルスのプロモーターがポリヘドリンプロモーター、ｐ 10 プロモーター、 IE1 プロモーター、 p35 プロモーター、 p39 プロモーター及び gp64 プロモーターのいずれかから選択される、トランスファーベクター。
  11. 少なくとも一つのウイルス粒子の構成成分になり得るタンパク質をコードする遺伝子が、バキュロウイルスgp64遺伝子、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質遺伝子、1型ヒト免疫不全ウイルス糖タンパク質遺伝子、ヒト呼吸器合胞体ウイルス膜糖タンパク質遺伝子、A型インフルエンザウイルスヘマグルチニンタンパク質遺伝子、B型インフルエンザウイルスヘマグルチニンタンパク質遺伝子、単純ヘルペスウイルス糖タンパク質遺伝子、マウス肝炎ウイルスSタンパク質遺伝子のいずれかであることを特徴とする請求項１０に記載のトランスファーベクター。
  12. 免疫原性外来遺伝子がマラリア抗原、インフルエンザウイルス抗原、結核菌抗原、SARSウイルス抗原、西ナイル熱ウイルス抗原、デング熱ウイルス抗原、HIV抗原、HCV抗原、リューシマニア抗原、トリパノソーマ抗原、ロイコチトゾーン抗原単独、もしくはこれらの抗原遺伝子群から選ばれる少なくとも1種とサイトカインとの融合抗原のいずれかから選択される請求項１０に記載のトランスファーベクター。
  13. pDual-Hsp65-gp64、pDual-PbCSP-gp64、pDual-H1N1/HA1-gp64、pDual-PbTRAMP-gp64、pDual-PbAMA1D123-gp64、pDual- PbMSP129、pDual-PfCSP-gp64、pDual-PfAMA1-gp64、pDual-Pfs25-gp64、pDual-H5N1/HA1-gp64、pDual-SARS/S-gp64、pCP-H1N1/HA1-gp64、pCAP-H1N1/HA1-gp64、pCU-H1N1/HA1-gp64、pDual-H1N1/NP-gp64、pDual-H1N1/M2-gp64、pDual-H1N1/NAe-gp64、pDual-M2e-gp64、pCP-HA1/NC99-gp64、pCP-H1N1/HA0-gp64、pCP-H1N1/HA2-gp64、pCP-H1N1/HA1-vp39、pCP-H1N1/NP-vp39のいずれかである請求項１０に記載のトランスファーベクター。
  14. 請求項６から９のいずれかに記載の組換えバキュロウイルスの製造法により製造された組換えバキュロウイルス。
  15. AcNPV-Dual-Hsp65、AcNPV-Dual-PbCSP、AcNPV-Dual-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-PbTRAMP、AcNPV-Dual-PbAMA1D123、AcNPV-Dual- PbMSP129、AcNPV-Dual-PfCSP、AcNPV-Dual-PfAMA1、AcNPV-Dual-Pfs25、AcNPV-Dual-H5N1/HA1、AcNPV-Dual-SARS/S、AcNPV-H1N1/HA1、AcNPV-CAP-H1N1/HA1、AcNPV-CU-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-H1N1/NP、AcNPV-Dual-H1N1/M2、AcNPV-Dual-H1N1/NAe、AcNPV-Dual-M2e、AcNPV-CP-HA1/NC99、AcNPV-CP-H1N1/HA0、AcNPV-CP-H1N1/HA2、AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39、AcNPV-CP-H1N1/NP-vp39のいずれかである請求項１４に記載の組換えバキュロウイルス。
  16. 請求項１４または１５の組換えバキュロウイルスを有効成分とする医薬組成物。
  17. AcNPV-Dual-H1N1/HA1、AcNPV-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-PfCSP、AcNPV-Dual-PfAMA1、AcNPV-Dual-Pfs25、AcNPV-Dual-H5N1/HA1、AcNPV-Dual-SARS/S 、AcNPV-CAP-H1N1/HA1、AcNPV-CU-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-H1N1/NP、AcNPV-Dual-H1N1/M2、AcNPV-Dual-H1N1/NAe、AcNPV-Dual-M2e、AcNPV-CP-HA1/NC99、AcNPV-CP-H1N1/HA0、AcNPV-CP-H1N1/HA2、AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39、AcNPV-CP-H1N1/NP-vp39のいずれかを有効成分とする医薬組成物。
  18. 筋肉内、経気道または経鼻的のいずれかのルートで投与されることを特徴とする請求項１６の組換えバキュロウイルスを有効成分とする医薬組成物。
  19. AcNPV-Dual-H1N1/HA1、AcNPV-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-PfCSP、AcNPV-Dual-PfAMA1、AcNPV-Dual-Pfs25、AcNPV-Dual-H5N1/HA1、AcNPV-Dual-SARS/S 、AcNPV-CAP-H1N1/HA1、AcNPV-CU-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-H1N1/NP、AcNPV-Dual-H1N1/M2、AcNPV-Dual-H1N1/NAe、AcNPV-Dual-M2e、AcNPV-CP-HA1/NC99、AcNPV-CP-H1N1/HA0、AcNPV-CP-H1N1/HA2、AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39、AcNPV-CP-H1N1/NP-vp39のいずれかを有効成分とするワクチン。
  20. 筋肉内、経気道または経鼻的のいずれかのルートで投与されることを特徴とする請求項１９のワクチン。
  21. AcNPV-Dual-H1N1/HA1、AcNPV-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-PfCSP、AcNPV-Dual-PfAMA1、AcNPV-Dual-Pfs25、AcNPV-Dual-H5N1/HA1、AcNPV-Dual-SARS/S 、AcNPV-CAP-H1N1/HA1、AcNPV-CU-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-H1N1/NP、AcNPV-Dual-H1N1/M2、AcNPV-Dual-H1N1/NAe、AcNPV-Dual-M2e、AcNPV-CP-HA1/NC99、AcNPV-CP-H1N1/HA0、AcNPV-CP-H1N1/HA2、AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39、AcNPV-CP-H1N1/NP-vp39を有効成分とするインフルエンザウイルス感染症治療または予防剤。
  22. 筋肉内、経気道または経鼻的のいずれかのルートで投与されることを特徴とする請求項２１のインフルエンザウイルス感染症治療または予防剤。
  23. AcNPV-Dual-H1N1/HA1、AcNPV-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-PfCSP、AcNPV-Dual-PfAMA1、AcNPV-Dual-Pfs25、AcNPV-Dual-H5N1/HA1、AcNPV-Dual-SARS/S 、AcNPV-CAP-H1N1/HA1、AcNPV-CU-H1N1/HA1、AcNPV-Dual-H1N1/NP、AcNPV-Dual-H1N1/M2、AcNPV-Dual-H1N1/NAe、AcNPV-Dual-M2e、AcNPV-CP-HA1/NC99、AcNPV-CP-H1N1/HA0、AcNPV-CP-H1N1/HA2、AcNPV-CP-H1N1/HA1-vp39、AcNPV-CP-H1N1/NP-vp39を有効成分とするインフルエンザウイルス感染症用ワクチン。
  24. 筋肉内、経気道または経鼻的のいずれかのルートで投与されることを特徴とする請求項２３のインフルエンザウイルス感染症用ワクチン。
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