JP4856939B2 - 感染症予防ワクチン - Google Patents
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Description
また、本発明のMVCワクチンの接種回数は、過去に当該ワクチンの接種歴がある母犬または抗MVC中和抗体を保有する母犬に対しては、分娩前の1回接種でよく、それによって、生まれてくる新生犬にMVC感染症を予防するのに十分な免疫を賦与することができる。
また、過去に当該ワクチンの接種歴がある母犬または抗MVC中和抗体を保有する母犬に対しては、本発明の1価または多価のワクチンは、分娩前に1回接種することができる。
1.不活化MVCワクチンの調製法
5%の牛胎子血清(FCS)を含有する100 mlのイーグル基礎培地(Eagle’s minimum essential medium、EMEM、Invitrogen社製)を用いて約1 x 108個の細胞数に調整したMDCK細胞にMVC(MVC HM-6株)をM.O.I.(multiplicity of infection;感染価)0.1で感染させ、5%の炭酸ガス存在下、37℃で培養した。4〜7日間培養し、ウイルス増殖極期にMVCを含む培養上清を回収し、それに終濃度4 mMのBEIを加え、37℃で3日間感作してMVCを不活化した。次に、この不活化したウイルス液をEMEM倍地で適宜希釈した後、水中油型アジュバント(Seppic社製)と9:1の割合で混合し、不活化MVCワクチンを調製した。
MVCのウイルス力価は以下に示す方法で測定した。すなわち、5%のFCSを含有するEMEMを用いて1 mlあたり3 x 105個の細胞数に調整したMDCK細胞の懸濁液0.2 mlと5%のFCSを含有するEMEMで10倍ずつ階段希釈したウイルス液0.1 mlとを混和後、8ウェルの螢光抗体法用組織培養用スライドガラス(Lab-Tek Chamber Slide、Nalge Nunc International社製)の各ウェル上に滴下し、5%の炭酸ガス存在下、37℃で培養した。5日後、培養上清を吸引除去し、リン酸緩衝食塩水(phosphate-buffered saline、PBS、pH 7.3)で細胞を洗浄した後、冷却アセトンで10分間細胞を固定した。続いて、アセトンを除去し、さらに風乾した後、細胞とPBSで100倍希釈したウサギ抗MVC血清とを37℃で30分間反応させた。次いで、細胞をPBSで3回洗浄し、PBSで1,000倍希釈したFITC標識抗ウサギIgGヤギIgG画分と37℃で30分間反応させたのち、細胞をPBSで洗浄し、螢光顕微鏡下で螢光標識されたMCV感染細胞を検出し、細胞が螢光標識された最大のウイルス希釈倍数をもってMVCのウイルス力価とした。
(1)ウイルス遺伝子検出による抗MVC効果の判定
<ワクチン接種、ウイルス攻撃、採材>
MVC抗体が陰性の妊娠5週の犬1頭に、不活化前ウイルス量として1 x 105 TCID50のMVCを含有する不活化MVCワクチン1mlを頚背部皮下に接種し、この初回接種から3週後に同ワクチン1mlを同様に追加接種した。陰性対照として、MVC抗体が陰性の妊娠5週の犬1頭にPBSを上記同様に注射した。
採材した直腸スワブは、2mlのPBS中で攪拌・懸濁し、さらに滅菌精製水で100倍希釈した後、MVC遺伝子断片を増幅するための、すなわちウイルス粒子を検出してウイルス排泄の有無を判断するためのPCR (ポリメラーゼ連鎖反応)の試料(鋳型DNA)とした。PCRは以下のように実施した。すなわち、市販のPCRキット(Takara社製TaKaRa Taq TM)を使用し、(94℃、15秒)〜(55℃、30秒)〜(72℃、1分)を1サイクルとするDNA増幅工程を30回繰り返して、目的とするMVC遺伝子断片を増幅した。なお、センス・プライマーとしてpr226 (5'-cgggatccggatgcgacataggcagagttccatc-3')、およびアンチセンス・プライマーとしてpr227 (5'-gcgaattcgtggtatgcacctatatacaacggac-3')を合成し、本PCRに使用した。また、増幅した遺伝子断片はアガロースゲル電気泳動で検出した。
陰性対照群の新生犬(個体番号1〜3)においてウイルス攻撃後3〜5日にMVC遺伝子断片が検出され、攻撃ウイルスの排泄が認められた。一方、ワクチン群の新生犬(個体番号4〜6)においてはMVC遺伝子断片は検出されなかった(表1)。
上述の(1)ウイルス遺伝子検出による抗MVC効果の判定における<ワクチン接種、ウイルス攻撃、採材>に記載されているようにしてウイルス攻撃を行った場合において、以下に示したように抗MVC中和抗体価を測定し、MVCワクチンの抗MVC効果を判定した。以下にその詳細を説明する。
被験血液から調製した血清をEMEMで2倍階段希釈し、その50μlと200 TCID50/50μlに調製したMVCウイルス液50μlとを混合した後、37℃で1時間、中和反応を行った。次いで、5%のFCSを含むEMEMを用いて1 mlあたり3x 105個の細胞数に調整したMDCK細胞懸濁液0.2 mlを分注した8ウェルの螢光抗体法用組織培養スライドガラス(Lab-Tek Chamber Slide、Nalge Nunc International社製)の各ウェル上に上記の中和反応液を滴下した後、5%の炭酸ガス存在下、37℃で培養した。5日後、上記同様に、一次抗体として100倍希釈したウサギ抗MVC血清を、また、二次抗体として1,000倍希釈したFITC標識抗ウサギIgGヤギIgG画分を用いた間接螢光抗体法を実施し、MVCに対する特異螢光が認められなかった最大の血清希釈倍数を求め、その希釈倍数をMVC中和抗体価とした。なお、MVCに対する中和抗体価の測定における陰性対照として、ワクチン未接種の2頭の母犬から調製した血清を用いた。
全試験期間を通して、ワクチンを接種した母犬において発熱や元気消失といった一般的な臨床観察上の異常および胎子死、死産、流産や萎小胎子などの胎子異常は認められなかった。また、ワクチン接種した母犬から生まれた新生犬においても一般的な臨床観察上の異常は認められなかった。以上の結果より、本発明で作製したワクチンの安全性が示された。
1.不活化MVCおよび不活化CHVを抗原とした2価ワクチンの調製法
MVCのウイルス液および不活化は上記の方法で実施した。一方、CHV(CHV D004株)については、以下に示す操作で不活化した。すなわち、5%のFCSを含有する100 mlのEMEMを用いて5%の炭酸ガス存在下、37℃で培養して増殖させた約1 x 108個のMDCK細胞にCHVをM.O.I. 0.03〜0.01で感染させ、5%の炭酸ガス存在下、2%のFCSを含有する100 mlのEMEMを用いて34℃で培養した。4〜7日間培養し、ウイルス増殖極期にCHVを含む培養上清を回収し、それに終濃度4mMのBEIを加え、37℃で2日間感作してCHVを不活化した。以上のようにして得られた不活化MVCと不活化CHVとをワクチン1回投与量(1ml)中に含まれるMVCとCHVの不活化前ウイルス力価がそれぞれ1 x 105 TCID50となるようにPBSで希釈し、それらの希釈ウイルス液を水中油型アジュバント(Seppic社製)と混合して、MVCとCHVとを抗原とする2価のワクチンを調製した。なお、不活化MVC液と不活化CHV液とアジュバントは9:9:2の割合で混合した。
CHVのウイルス力価は以下のように測定した。CHVのウイルス力価は、CHVがMDCK細胞に対して示す細胞変性効果(cytopathic effect、CPE)で測定した。すなわち、CHVのウイルス液をEMEMで10倍ずつ階段希釈し、その希釈ウイルス液を1 x 104個のMDCK細胞に加え、96ウェルの組織培養プレートを用い、2%のFCSを含有するEMEM中、5%の炭酸ガス存在下、37℃で培養した。7日後、組織培養プレートの各ウェル中の細胞を顕微鏡下で観察し、CHVによるMDCK細胞のCPEが認められた最大のウイルス希釈倍数を求め、CHVのウイルス力価とした。
(1)ウイルス遺伝子検出による抗CHV効果の判定
<ワクチン接種、ウイルス攻撃、採材>
MVC抗体およびCHV抗体が陰性の妊娠5週の犬1頭(母犬1)について、上述のように調製した、不活化前ウイルス量としてそれぞれ1 x 105 TCID50のMVCおよびCHVを含有する不活化MVC/CHVワクチン1mlを頚背部皮下に接種し、この初回接種から3週後に同ワクチン1mlを同様に追加接種した。陰性対照として、MVC抗体およびCHV抗体が陰性の妊娠5週の犬2頭(母犬2および3)にPBSを上記同様に注射した。
採材した口腔スワブを2mlのPBS中で攪拌・懸濁し、さらに滅菌精製水で10倍希釈した後、CHV遺伝子断片を増幅するための、すなわちウイルス粒子を検出してウイルス排泄の有無を判断するためのPCR の試料(鋳型DNA)とした。PCRは以下のように、第1段階のPCRで増幅した遺伝子断片をさらに第2段階のPCRで増幅する、いわゆるネステッドPCRを実施した。すなわち、市販のPCRキット(Takara社製 TaKaRa Taq TM)を使用し、(93℃、45秒)〜(56℃、30秒)〜(71℃、1分)を1サイクルとするDNA増幅工程を30回繰り返して、目的とするCHV遺伝子断片を増幅した。なお、この第1段階のPCRには、センス・プライマーとしてIE-1 (5'-gataattcagcttctagcgatg-3')、およびアンチセンス・プライマーとしてIE-2 (5'-gatctcacatctatagtttggag-3')を合成して使用した。
ワクチン未接種の母犬2および3から生まれた8頭の新生犬(子犬5〜12)については、ウイルス攻撃後1週の時点においてCHV遺伝子断片が検出された(表3)。一方、ワクチン接種した母犬1から生まれた3頭の新生犬(子犬1〜3)からは、いずれの時点においてもCHV遺伝子断片は検出されなかった。また、ワクチン接種した母犬1から生まれた新生犬のうち、ウイルス攻撃しなかった1頭(子犬4)についても、いずれの時点においてもCHV遺伝子断片は検出されなかった。
上述の(1)ウイルス遺伝子検出による抗CHV効果の判定における<ワクチン接種、ウイルス攻撃、採材>に記載されているようにしてウイルス攻撃を行った場合において、以下に示したように抗MVC中和抗体価と抗CHV中和抗体価とを測定し、MVC/CHVワクチンの抗MVC効果および抗CHV効果を判定した。以下にその詳細を説明する。
上記のスケジュールで採取した血液から血清を調製し、EMEMで2倍階段希釈した後、以下の操作の被験血清とした。各倍数の希釈血清、0.2 mlあたり400 PFU(plaque forming unit、プラーク形成単位)のウイルス力価のCHVウイルス液、およびEMEMで終濃度15%としたモルモット補体(Sigma社製)のそれぞれを0.4 ml、0.2 mlおよび0.2 mlの割合で混和し、37℃で60分間インキュベーションした後、6ウェルの組織培養プレートの各ウェル中で予め増殖させた4〜6 x 105個のMDCK細胞に添加した。次いで、5%の炭酸ガス存在下、37℃で60分間インキュベーションした後、混和液を吸引除去し、1%(v/v)の寒天(Difco Noble agar、Difco社製)、および2%(v/v)のFCSを含有するEMEMからなるソフト寒天(overlay agar)を各ウェルに2mlずつ重層した。続いて、5%の炭酸ガス存在下、37℃で5日間培養した後、1%(v/v)の寒天、ならびに2%(v/v)のFCSおよび0.01%(w/v)のニュートラルレッドを含有するEMEMからなるソフト寒天を各ウェルに2 mlずつ重層した。次に、5%の炭酸ガス存在下、37℃で1日間培養した後、血清処理していないCHVを感染させたMDCK細胞培養系に出現したプラーク数と比較して、プラーク数が50%以上減少した被験血清の最大希釈倍数を求め、CHVの中和抗体価とした。
表4から明らかなように、ワクチン接種した母犬1において、抗CHV中和抗体価は、試験開始前(ワクチン接種前)には検出限界以下(<2)であったが、ワクチン接種によって上昇し、分娩後3日の時点で128倍であった。このようなCHVに対する中和抗体は、対照としたワクチン未接種の母犬2および3では検出されなかった(<2)。一方、ワクチン接種した母犬1から生まれた4頭の新生犬(子犬1〜4)では、ウイルス攻撃時(生後3日)に32倍〜128倍の抗CHV中和抗体が検出された。これに反して、ワクチン未接種の母犬2および3から生まれた新生犬(子犬5〜12)は、ウイルス攻撃時には抗CHV中和抗体は検出されず(<2)、攻撃後2週には、CHV感染症を呈して死亡した子犬6および9を除いて、攻撃したCHVに由来する抗体の上昇(抗体価:32〜64倍)が認められた(表5)。
表6から明らかなように、ワクチン接種した母犬1については、試験開始時(ワクチン接種前)の血中抗MVC抗体価は検出限界以下(<2)であったが、ワクチン接種によって上昇し、分娩後3日の時点では256倍以上であった。このようなMVCに対する中和抗体は、対照としたワクチン未接種の母犬2および3では検出されなかった(<2)。一方、分娩後3日において、ワクチン接種した母犬1から生まれた4頭の新生犬(子犬1〜4)では256倍以上の中和抗体価の抗MVC抗体が検出されたが、ワクチン未接種の母犬2および3から生まれた新生犬(子犬5〜12)では抗MVC中和抗体は検出されなかった(<2)(表7)。
Claims (4)
- 犬微小ウイルス菌株HM−6を抗原として含有する犬微小ウイルス感染症予防ワクチン。
- 抗犬微小ウイルス中和抗体が母犬から新生犬に移行する母犬接種用の請求項1に記載のワクチン。
- 犬ヘルペスウイルス菌株D004(ATCC受託番号:VR−552)を抗原としてさらに含む、請求項1または2に記載のワクチン。
- 犬パルボウイルス2型、犬アデノウイルス1型、犬アデノウイルス2型、犬ジステンパーウイルス、犬コロナウイルス、犬パラインフルエンザウイルス、ボルデテラ ブロンキサプティカ、各種レプトスピラ、犬インフルエンザウイルス、各種バベシアおよび各種ジアルジアからなる群より選択される1種以上の各種病原微生物を抗原としてさらに含有し、中和抗体が母犬から新生犬に移行する、請求項3に記載のワクチン。
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