CN104721839A - 一种预防单纯疱疹病毒ii型的疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种预防单纯疱疹病毒II型的疫苗。本发明通过分子生物学手段，将单纯疱疹病毒II型的糖蛋白D基因组合到含卡那抗性的真核表达载体pKan中，构建包括含全长的糖蛋白D基因的真核表达质粒pgD和含如SEQ ID NO.1所示的基因序列的重组质粒的DNA疫苗。这种DNA疫苗免疫机体可产生有效的体液免疫和细胞免疫，预防和治疗单纯疱疹病毒II型感染的疾病如生殖器疱疹等疾病。

Description

一种预防单纯疱疹病毒II型的疫苗

技术领域

本发明属于一种生物制品，具体涉及一种预防单纯疱疹病毒II型（HSV-2）的疫苗。

背景技术

生殖器疱疹是目前世界上及我国沿海地区较为常见且发病率有逐渐增高趋势的一种性传播疾病，是由人类单纯疱疹病毒（HSV）通过性传播感染泌尿生殖器及肛门部位皮肤黏膜而引起的。单纯疱疹病毒可分为l、2型，大多数生殖器疱疹是由HSV-2感染所致，主要传染源是生殖器疱疹患者和无症状病毒携带者。HSV-2的感染是终身的，该病毒具有嗜神经潜伏性，病毒可在人的骶尾神经节内建立终生潜伏。HSV-2潜伏性感染可因各种非特异性刺激活化而导致相关临床症状的复发，如典型的生殖器疱疹性损伤，或无症状排毒，从而重新具有传染性。研究者们发现HSV-2可以增加感染HIV的几率。HSV-2可通过破损生殖器上皮为HIV-1募集活化的靶细胞和破坏黏膜朗格汉斯细胞功能。HIV患者感染HSV-2可以增加其生殖道HIV的释放和加速HIV疾病的进程。相反，感染HIV可以增加HSV-2的释放频率和数量。目前临床试验表明抗病毒药物治疗不能减少由HSV-2引起的感染HIV的风险或传播HIV的风险，也不能完全抑制HSV-2的释放。

鉴于目前抗病毒药物无法控制HSV-2的潜伏和复发以及由其导致的感染HIV和传播HIV的风险，研究者大多寄希望于疫苗。在过去的几十年里，研究者们在研发HSV-2疫苗方面做了大量的工作，然而收获甚微。近几十年来世界各国HSV疫苗的研究结果表明，传统的灭活疫苗和亚单位疫苗免疫原性弱，仅能诱导体液免疫应答，细胞免疫诱导效果较差；减毒活病毒疫苗虽然可以诱导机体的免疫应答但是有逆转的风险。单纯疱疹病毒的免疫应答过程中，细胞免疫和粘膜免疫发挥着更大的作用，但上述几类疫苗均不能有效诱导细胞免疫和粘膜免疫应答，因此，到目前为止，尚无可以在临床上应用的疫苗上市，单纯疱疹病毒疫苗基本上都处于临床前或临床研究阶段。

新型DNA疫苗使外源基因在活体内表达，产生的抗原能够激活机体的免疫系统，诱导特异性的体液免疫和细胞免疫应答，在抗感染性疾病和抗肿瘤方面发挥重要作用。DNA疫苗既具有减毒疫苗的优点，同时又无逆转的危险，还可以通过各种免疫佐剂加强免疫效果。DNA疫苗在免疫应答中能诱导机体产生体液免疫和细胞免疫，并应用在小鼠、绵羊、鸡、猴和黑猩猩等多种动物身上均获得成功，但是它在诱导免疫应答中的效率相对较低，影响了它的实际应用，因此寻找能够提高核酸疫苗免疫效率的分子是亟需解决的问题。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种预防单纯疱疹病毒II型的疫苗。

上述发明目的通过以下技术方案实现的：一种预防单纯疱疹病毒II型的疫苗，包括真核表达质粒和重组质粒，真核表达质粒和重组质粒以2:1的质量比混合；所述真核表达质粒为含全长的糖蛋白D基因的pcDNA3-Kan质粒，所述重组质粒为含如SEQ ID NO.1所示的基因序列的pcDNA3-Kan质粒。

本发明的有益效果：较之DNA疫苗免疫效率低的特点，本发明引入SEQ ID NO.1所示的基因序列的重组质粒辅佐HSV-2 gD DNA疫苗，有效的诱导机体产生特异性的体液免疫应答，构建机体抵抗HSV-2感染的第一道防线，降低发病率；激发细胞免疫应答，构建机体的第二道防线，可以更好的清除感染病毒。

附图说明：

图1小鼠血清抗gD IgG抗体水平结果图。

图2小鼠淋巴细胞增殖能力结果图。

图3小鼠外周血CD4+和CD8+T细胞百分率结果图。

图4小鼠血清中趋化因子RANTES含量结果图。

图5小鼠外周血分泌IFN-γ和IL-4 T细胞百分率结果图。

图6致死量HSV-2病毒感染后小鼠的存活率结果图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。

实施例1：真核表达质粒的获得

利用分子生物学技术PCR法、酶切、连接及克隆筛选将载体pcDNA3上原有抗性氨苄霉素（Amp）替换成卡那抗性（Kan）后，构建真核表达质粒载体pcDNA3-Kan。PCR法扩增HSV-2 sav株糖蛋白D全基因序列（gD），克隆重组后获得含gD的重组质粒pcDNA-Kan/gD，该重组质粒pcDNA-Kan/gD及其具体的制备方法已与“何方等中国卫生检验杂志, 2008, 18(6): 997-999”中公开。

实施例2：重组质粒的获得

取活化的T细胞，用Rneasy Mini Kit（QIAGEN）提取总RNA，以Oligod(T)n为引物，逆转录合成第一链cDNA。参照NCBI核酸数据库收录的编号为BC119225.1序列，设计一对引物，以合成的cDNA为模板，扩增获得SEQ ID NO.1。上游引物序列为5^，-GCCGAATTCATGATAGAAACATACAGCCAACCT-3^，, 下游引物序列为5^，-GACCTCGAGTCAGAGTTTGAGTAAGCCAAAAGA-3^，。

将SEQ ID NO.1所示的基因序列和pcDNA3-Kan用EcoRI和Xho I双酶切后切胶纯化回收。回收所得片段，以l:5摩尔浓度在T4连接酶作用下进行连接。将连接产物转化入DH5α的感受态菌株中，次日挑取中等大小的白色菌落接种于含Kan抗性的LB培养液中摇振过夜，抽提后得到重组质粒。

上述用于构建卡那霉素抗性的pcDNA3质粒购自Invitrogen公司，序列和物理图谱见该公司的产品目录。HSV-2型病毒是HSV-2 sav株。

实施例3：将实施例1和2获得的质粒用于免疫小鼠

1.实验材料：

1）将实施例1和2获得的质粒分别在E.coli中扩增，用QIAGEN纯化试剂盒纯化。用紫外分光光度法测定质粒的浓度和纯度，DNA的浓度和纯度通过OD260和OD280确定，选取OD260/OD280比值在1.8~2.0的质粒DNA去免疫小鼠。两种质粒分别于-20℃低温冻存，免疫小鼠前解冻并根据质量比2:1将两种质粒混合。

2）冻存HSV-2病毒sav3反复冻融三次。离心后取上清加入到单层Vero细胞上，37℃孵育1h。去掉病毒液体，加入4%FBS DMEM完全培养基，35℃培养24-48h。贴壁细胞用细胞刮板刮下，加入1ml/bottle DMEM不完全培养液重悬后，-80℃冻存。倍比稀释的HSV-2病毒悬液腹腔感染小鼠200μL/只，每天记录小鼠死亡数，观察两周，计算半数致死量（median lethal dose，LD50）。

3）选取48只18-22g清洁级BALB/c雌性小鼠，随机分4组。分别为pcDNA3-Kan（A组）、pcDNA3-Kan+实施例1获得的质粒（B组）、将实施例1和2获得的质粒按照质量比2：1混合（C组）和实施例1获得的质粒（D组）。

2.实验方法

（1）免疫及攻毒方案

免疫剂量：小鼠后腿肌内注射100μL/只，隔3周加强免疫1次，共免疫两次，剂量相同。加强免疫后第3周，每组随机选取4只小鼠进行攻毒实验。腹腔感染200μL/只20×LD50 HSV-2病毒悬液，每天观察并记录小鼠体重、发病数和死亡数，观察2周，确定保护效果。

（2）免疫小鼠样本的收集

每次免疫后第2周收集小鼠尾静脉血200μL并分离血清，所有样本于-20℃保存。加强免疫后第3周每组剖杀8只小鼠，眼眶取血后分离血清；无菌取小鼠脾脏，经200目尼龙纱布网滤过后制备单个细胞悬液备用。

（3）用酶联免疫吸附实验（ELISA）测特异性IgG抗体

pH9.6的碳酸缓冲液稀释Vero细胞培养HSV-2，以每孔100μL的量加至96孔板中，4℃过夜。次日用含2％BSA的PBS封闭，每孔加入150μL，37℃作用2h。PBS清洗一次。每孔加入100μL1:20稀释血清 (含10％FBS的PBST)，同时设定复孔2个，阴性参照、阳性参照和空白孔。37℃孵育30min。用PBST 洗板5 次。每孔加入l:4000稀释的辣根过氧化物酶（HRP）标记羊抗鼠IgG100μL，37℃孵育30min。用PBST洗板5次后每孔加入100μLTMB显色液，避光放置10-15min，每孔加入50uL 2M H₂S0₄，终止显色反应。用酶标仪测吸光度A450值。所测样本的A450/阴性对照A450≧2.1 为阳性，否则为阴性。

（4）MTS比色法检测小鼠脾脏T淋巴细胞增殖能力

加强免疫后第3周，4组BALB/c小鼠随机取8只小鼠按常规方法制备脾脏细胞悬液，在96孔细胞培养板上加入细胞5×10⁵个/孔。将细胞培养板分为3部分：分别为特异性抗原刺激孔，50μg/ml灭活单纯疱疹病毒；非特异性抗原刺激孔，10μg/ml ConA；对照孔，RPMI 1640完全培养液。将细胞培养板置于37℃，5％CO₂，细胞培养箱中培养68h，加MTS40μL/孔继续培养4h，酶标仪测A值。计算刺激指数SI=（实验组A值-空白组A值）/（阴性对照组A值-空白组A值）。

（5）流式细胞仪检测外周血中CD4+和CD8+T细胞百分率

加强免疫第3周，4组BALB/c小鼠随机取8只小鼠眼眶取血，肝素钠抗凝处理收集的血液，分别加入FITC标记的单抗CD4 +和PE标记的单抗CD8 +，避光孵育30 min，PBS洗涤3次后，流式细胞仪分析。

（6） ELISA法检测BALB/c小鼠血清中趋化因子RANTES（调节活化正常T细胞表达与分泌的趋化因子，regulated upon activation normal T cell expressed and secreted factor）；按Mouse RANTES ELISA试剂盒（eBioscience公司）说明检测加强免疫后第3周小鼠血清RANTES的含量。

（7） 流式细胞仪检测外周血分泌IFN-γ和IL-4的T细胞百分率

加强免疫后第3周，4组BALB/c小鼠随机取8只小鼠眼眶取血，肝素钠抗凝处理收集的血液，加入RPMIl640完全培养液(含20ng/ml佛波酯、1μmol/L离子霉素和0.7μl/ml莫能霉素)刺激培养4h；加入红细胞裂解液室温裂解l0min；染色缓冲液洗涤后加固定透化液室温避光孵育20min，BD缓冲液洗涤后加入流式抗体IFN-γ和IL-4；室温避光染色30min，BD缓冲液洗涤后加PBS500μl/管重悬细胞，流式细胞仪分析。

3. 免疫结果及分析

（1）实施例1和2获得的质粒的共同免疫提高了特异性IgG抗体水平。

用ELISA法分别检测初免后第2周和初次免疫后第5周小鼠血清中的抗gD IgG抗体，血清以1:20稀释。我们发现与未加实施例2所得质粒的其它三组相比，实施例1和2获得的质粒的共同免疫明显提高了抗gD IgG抗体产生（图1），差异有统计学意义(P<0.05)。

（2）实施例1和2获得的质粒的共同免疫提高了小鼠T细胞增殖能力。

C组刺激指数高于其它各组，差异有统计学意义(P<0.05)；灭活单纯疱疹病毒刺激指数高于ConA，差异有统计学意义(P<0.05) （图2）。

（3）C组小鼠外周血的CD4+T细胞百分率和CD8+T细胞百分率最高，与其它三组均有显著性差异（P<0.05）。各组间CD4+/CD8+比值变化并不明显（图3）。

（4）实施例1和2获得的质粒的共同免疫提高了小鼠血清与细胞免疫相关的趋化因子RANTES水平。

ELISA 法分析加强免疫后第3周小鼠血清中RANTES水平。结果显示经2次免疫后，C组的RANTES含量最高，含量达到了676.633 pg/mL，明显高于其它三组，各组间有显著性差异(P<0.05)（图4）。

（5）实施例1和2获得的质粒的共同免疫提高了小鼠外周血分泌IFN-γ Th1细胞百分率。

C组外周血分泌IFN-γTh1细胞百分率最高，显著高于pKan+pgD组和pgD组（P<0.05），极显著高于pKan组（P<0.01）。各组的所产生的IL-4浓度从高到低为A组、B组、D组、C组，且各组间有明显差异（P<0.05）（图5）。

（6）实施例1和2获得的质粒的共同免疫提高了小鼠抗致死量HSV-2的攻击。

小鼠用致死量HSV-2攻击，攻击后第2周统计死亡小鼠数量，以此确定疫苗的保护率。结果显示C组存活3只，保护率为75％；B组和pgD组都各自存活2只，保护率为50%；A组保护率为0。其中A组小鼠攻毒后第7天开始出现死亡情况，第9天后全部死亡；其它三组小鼠的死亡时间集中在第8天和第9天，B组存活率最高达75%，B组和D组为50%（图6）。以上结果说明，含有SEQ ID NO.1所示的基因序列的重组质粒与pcDNA-Kan/gD的结合，能够提高小鼠抗致死量HSV-2的攻击。

            SEQUENCE LISTING

 

<110>  浙江省医学科学院

 

<120>  一种预防单纯疱疹病毒II型的疫苗

 

 

<160>  1    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  723

<212>  DNA

<213>  人工合成

 

<400>  1

atgaagattt ttatgtattt acttactgtt ttccttatca cccaaatgat tggatctgtg     60

 

ctttttgctg tgtatcttca tagaagattg gataaggtcg aagaggaagt aaaccttcat    120

 

gaagattttg tattcataaa aaagctaaag agatgcaaca aaggagaagg atctttatcc    180

 

ttgctgaact gtgaggagat gagaaggcaa tttgaagacc ttgtcaagga tataacgtta    240

 

aacaaagaag agaaaaaaga aaacagcttt gaaatgcaaa gaggtgatga ggatcctcaa    300

 

attgcagcac acgttgtaag cgaagccaac agtaatgcag catccgttct acagtgggcc    360

 

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acggttaaaa gagaaggact ctattatgtc tacactcaag tcaccttctg ctctaatcgg    480

 

gagccttcga gtcaacgccc attcatcgtc ggcctctggc tgaagcccag cagtggatct    540

 

gagagaatct tactcaaggc ggcaaatacc cacagttcct cccagctttg cgagcagcag    600

 

tctgttcact tgggcggagt gtttgaatta caagctggtg cttctgtgtt tgtcaacgtg    660

 

actgaagcaa gccaagtgat ccacagagtt ggcttctcat cttttggctt actcaaactc    720

 

tga                                                    723

 

Claims (1)

1.一种预防单纯疱疹病毒II型的疫苗，其特征在于，包括真核表达质粒和重组质粒，真核表达质粒和重组质粒以2:1的质量比混合；所述真核表达质粒为含全长的糖蛋白D基因的pcDNA3-Kan质粒，所述重组质粒为含如SEQ ID NO.1所示的基因序列的pcDNA3-Kan质粒。