CN109701008A - 针对单纯疱疹病毒的治疗性dc复合疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了针对单纯疱疹病毒的治疗性DC复合疫苗及其制备方法，包含三种负载HSV‑2病毒特异性免疫抗原基因片段修饰的树突状细胞，所述三种负载HSV‑2病毒特异性免疫抗原基因片段分别为gC+US10、DC‑UL47、gD+ICP4。本发明采用粒细胞‑巨噬细胞簇因子受体信号肽引导抗原的表达，能够提高抗原的表达效率，增强其免疫效应，产生更强的抗HSV特异性的免疫反应。

Description

针对单纯疱疹病毒的治疗性DC复合疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及疫苗技术领域，尤其涉及针对单纯疱疹病毒的治疗性DC复合疫苗及其制备方法。

背景技术

单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus，HSV)感染是人类常见的感染性疾病，该病毒分为HSV-1和HSV-2两种血清型。其中，HSV-2感染是最常见的性传播疾病之一，是生殖器疱疹和溃疡最主要病原，在全球范围内已感染5亿多人，估计每年新感染人数为2300万。目前临床上对生殖器疱疹的治疗主要通过使用抗病毒药物来缓解症状，但是并不能彻底清除HSV-2病毒，无法有效的控制疾病复发。

HSV的基因组包含约85个开放阅读框，使得HSV可以产生至少85种独特蛋白。主要包括4大类蛋白质：包膜蛋白、衣壳蛋白、被膜蛋白以及负责复制和感染的蛋白质。包膜蛋白如gD、gB、gH、gL作为抗原的HSV-2疫苗都能引发HSV特异性中和抗体，其中，gD诱导产生中和抗体的能力最强，但是对于有效的HSV-2疫苗，用gD刺激是不够的，用包膜免疫不足以产生有效的HSV-2疫苗。提高重组HSV-2疫苗的功效，诱导强有力的特异性细胞免疫反应，是目前的主要研究方向。gD/gB等亚单位疫苗治疗可使复发病灶的持续时间和严重程度略有降低，提示免疫治疗疫苗是可行的。这些临床试验的结果表明需要改进保护、改变给药方案、优化佐剂以及添加其他能够诱导抗原特异性CD4+和CD8+T细胞群的抗原靶点是非常重要的。

因此，开发一种新针对单纯疱疹病毒的治疗性DC复合疫苗，不但具有迫切的研究价值，也具有良好的经济效益和医用潜力，这正是本发明得以完成的动力所在和基础。

发明内容

为了克服上述所指出的现有技术的缺陷，本发明人对此进行了深入研究，在付出了大量创造性劳动后，从而完成了本发明。

具体而言，本发明所要解决的技术问题是：提供针对单纯疱疹病毒的治疗性DC复合疫苗及其制备方法，以提高抗原的表达效率，增强其免疫效应，产生更强的抗HSV特异性的免疫反应。

第一方面，本发明提供了针对单纯疱疹病毒的治疗性DC复合疫苗，其包含三种负载HSV-2病毒特异性免疫抗原基因片段修饰的树突状细胞，所述三种负载HSV-2病毒特异性免疫抗原基因片段分别为gC+US10、DC-UL47、gD+ICP4。

本发明中，作为优选的技术方案，所述三种负载HSV-2病毒特异性免疫抗原基因片段均由粒细胞-巨噬细胞簇因子受体信号肽引导编码段。

本发明中，作为优选的技术方案，所述粒细胞-巨噬细胞簇因子受体信号肽为序列表SEQ ID NO.1所示的GM-CSF核苷酸序列。

本发明中，作为优选的技术方案，所述gC+US10为序列表SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

本发明中，作为优选的技术方案，所述UL47为序列表SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

本发明中，作为优选的技术方案，所述gD+ICP4为序列表SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。

本发明中，作为优选的技术方案，所述针对单纯疱疹病毒的治疗性DC复合疫苗中还含有增强DC疫苗免疫效果的免疫佐剂。

本发明中，作为优选的技术方案，所述免疫佐剂为C型CpG免疫刺激序列。

本发明中，作为优选的技术方案，所述CpG为序列表SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列。

第二方面，本发明提供了针对单纯疱疹病毒的治疗性DC复合疫苗的制备方法，包括如下步骤：

S1、将抗原基因片段GM-CSF-gC+US10、GM-CSF-gD+ICP4、GM-CSF-UL47分别插入慢病毒表达载体pLent-C-GFP，并制备得到相应的三种质粒；

S2、将三种质粒分别进行慢病毒包装，得到包装成携带GM-CSF-gC+US10、GM-CSF-gD+ICP4、GM-CSF-UL47编码基因的慢病毒病毒液；

S3、将单纯疱疹病毒患者的体外周血单个核细胞诱导成imDC；

S4、将携带GM-CSF-gC+US10、GM-CSF-gD+ICP4、GM-CSF-UL47抗原编码基因的慢病毒感染所述imDC，并将感染后的imDC经成熟因子诱导，得到成熟DC疫苗；

S5、将成熟DC疫苗制备成疫苗悬液。

本发明中，作为优选的技术方案，步骤S1中，将gC+US10核酸人工序列、gD+ICP4核酸人工序列、UL47核酸人工序列的两端分别加NotI和AsiSI位点酶切位点，合成完整的表达框，酶切处理后分别插入慢病毒pLent-C-GFP载体(Invitrogen)NotI-AsiSI位点，转化到E.coli(Top10)，经核酸测序鉴定正确后，使用无内毒素质粒纯化试剂盒提取并纯化质粒，获得重组表达载体质粒。

本发明中，作为优选的技术方案，步骤S2中，将慢病毒包装细胞系293T接种于含有DMEM+10％FBS10cm培养皿中培养；配制反应体系，混匀后，室温放置20min后，均匀滴加到含有293T细胞培养皿中，后置于CO2培养箱中培养；转染后培养，得到携带GM-CSF-gC+US10、GM-CSF-gD+ICP4、GM-CSF-UL47编码基因的慢病毒病毒液。

本发明中，作为优选的技术方案，步骤S3中，采集单纯疱疹病毒病人外周静脉血，分离外周血单个核细胞，留取贴壁细胞，并加入细胞因子诱导单个核细胞分化成DC，培养得到imDC。

本发明中，作为优选的技术方案，步骤S4中，将imDC以1×106个细胞/孔的量接种在12孔培养板中，以MOI＝10的重组慢病毒独立感染上述imDC，感染8-12h后，用PBS洗涤细胞2-3次，加入成熟因子TNF-α继续培养诱导得到成熟的DC细胞(即为分别负载GM-CSF-gC+US10、GM-CSF-gD+ICP4、GM-CSF-UL47的DC疫苗)。

本发明中，作为优选的技术方案，步骤S5中，将含CpG基序的寡脱氧核苷酸按比例溶于无菌NaCl注射液中，制成佐剂悬液(浓度60nmol/ml)，取100ulCpG佐剂悬液分别与1×106个分别负载GM-CSF-gC+US10、GM-CSF-gD+ICP4、GM-CSF-UL47的DC疫苗充分混合均匀，获得针对单纯疱疹病毒的治疗性DC复合疫苗。

本发明为HSV-2感染性治疗提供了一种新的方法和策略。我们将病毒特异性免疫抗原和免疫刺激剂引入DC细胞，制备一种针对单纯疱疹病毒的治疗性DC复合疫苗，再注入受试者体内，诱导机体先天和适应性免疫反应，用于治疗和预防HSV-2感染。

采用了上述技术方案后，本发明的有益效果是：

本发明首次将抗原gC+US10、UL47、gD+ICP4分别利用慢病毒载体将抗原基因稳定整合至DC细胞基因组中并长期表达，形成三种负载HSV病毒特异性免疫抗原的DC细胞，是一种针对单纯疱疹病毒的治疗性DC复合疫苗。DC是人体内抗原递呈能力最强的细胞，DC将抗原直接呈递给T细胞，活化特异性细胞启动免疫应答，打破免疫系统对HSV病毒的免疫耐受，并发挥长期监视和杀伤病毒的作用。通过三种负载不同病毒特异性免疫抗原DC细胞的联合疗法，能够彻底预防和治疗HSV-2的感染。

本发明将被膜蛋白UL47作为HSV抗原，UL47是连接蛋白的中间复合物，并且在疱疹病毒复制的晚期产生，可以产生强大的T细胞应答，减少病变，保护HSV攻击模型。因此，它可用于HSV感染的预防性和治疗性疫苗。此外，转录调节因子ICP4在病毒感染的情况下起到增加病毒基因转录和表达，ICP4作为抗原可以诱发机体CD8+T细胞的产生，可以在HSV感染期间引发强烈的细胞免疫反应。

本发明制备的针对HSV-2治疗性DC疫苗中加入了C型CpG免疫佐剂，CpG可以直接激活DC细胞和B细胞并产生共刺激分子CD80和CD86及MHC II类等表达；同时增强T细胞的活化，诱导机体抗原特异性CD8+T细胞比例增加，激活免疫细胞分泌IL-12、TNF-α等多种细胞因子。CpG用作疫苗佐剂，可以改善抗原呈递细胞的功能并促进体液和细胞疫苗特异性免疫应答的产生。

本发明采用粒细胞-巨噬细胞簇因子受体信号肽引导抗原的表达，能够提高抗原的表达效率，增强其免疫效应，产生更强的抗HSV特异性的免疫反应。

附图说明

图1免疫佐剂CpG促进HSV-2特异性DC分泌因子IL-12和IL-10图；

图2HSV-2特异性DC复合疫苗免疫时间间隔和对应DC的流程图；

图3ELISPOT法检测治疗一组、治疗二组、对照一组、对照二组的小鼠特异性T细胞免疫反应对比图；

图4实时定量PCR检测治疗一组、治疗二组、对照一组、对照二组的小鼠中HSV-2病毒含量图。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明进一步说明。但这些例举性实施方式的用途和目的仅用来例举本发明，并非对本发明的实际保护范围构成任何形式的任何限定，更非将本发明的保护范围局限于此。

针对单纯疱疹病毒的治疗性DC复合疫苗，其包含三种负载HSV-2病毒特异性免疫抗原基因片段修饰的树突状细胞，所述三种负载HSV-2病毒特异性免疫抗原基因片段分别为gC+US10、DC-UL47、gD+ICP4，所述三种负载HSV-2病毒特异性免疫抗原基因片段均由粒细胞-巨噬细胞簇因子受体信号肽引导编码段，所述粒细胞-巨噬细胞簇因子受体信号肽为序列表SEQ ID NO.1所示的GM-CSF核苷酸序列，所述gC+US10为序列表SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，所述UL47为序列表SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，所述gD+ICP4为序列表SEQID NO.4所示的核苷酸序列。

所述针对单纯疱疹病毒的治疗性DC复合疫苗中还含有增强DC疫苗免疫效果的免疫佐剂。所述免疫佐剂为C型CpG免疫刺激序列，所述CpG为序列表SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列。

实施例1

将抗原基因片段GM-CSF-gC+US10、GM-CSF-gD+ICP4、GM-CSF-UL47分别插入慢病毒表达载体pLent-C-GFP，并制备得到相应的三种质粒，将gC+US10核酸人工序列、gD+ICP4核酸人工序列、UL47核酸人工序列的两端分别加NotI和AsiSI位点酶切位点，合成完整的表达框，酶切处理后分别插入慢病毒pLent-C-GFP载体(Invitrogen)NotI-AsiSI位点，转化到E.coli(Top10)，经核酸测序鉴定正确后，使用无内毒素质粒纯化试剂盒提取并纯化质粒，获得重组表达载体质粒

更详细的说，本实施例采用如下步骤：

将抗原基因片段GM-CSF-gC+US10、GM-CSF-gD+ICP4、GM-CSF-UL47分别插入慢病毒表达载体pLent-C-GFP(SEQ ID NO.1GM-CSF核酸人工序列；SEQ ID NO.2gC+US10核酸人工序列；SEQ ID NO.3UL47核酸人工序列；SEQ ID NO.4gD+ICP4核酸人工序列)；

将gC+US10核酸人工序列、gD+ICP4核酸人工序列、UL47核酸人工序列的两端分别加NotI和AsiSI位点酶切位点，委托生工生物工程有限公司合成完整的表达框，酶切处理后分别插入慢病毒pLent-C-GFP载体(Invitrogen)NotI-AsiSI位点，转化到E.coli(Top10)，经核酸测序鉴定正确后，使用Solarbio公司的无内毒素质粒纯化试剂盒提取并纯化质粒，获得重组表达载体质粒。

采用无内毒素质粒提取纯化试剂盒(购自Solarbio公司)提取质粒，具体步骤如下：(1)取10ul含有慢病毒质粒pLent-CII-CTLA4的E.coli Top10菌液置于5ml含有AMP+抗性的LB培养基中，250rpm摇床中过夜培养14-18h。(2)取扩增培养的2ml菌液室温12000rpm离心1min。(3)去上清，加200μl溶液P1(含RNase A)，涡漩振荡器震荡至菌体完全悬浮。(4)加入200μl溶液P2，温和颠倒离心管6～8次使菌体充分裂解。(5)加200μl溶液P3，立即温和上下颠倒6～8次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀，室温12000rpm离心10min，用以移液器小心地将上清转移到另一个干净的离心管中，尽量不要吸出沉淀。(6)加入上清1/5体积的冰上预冷的内毒素清除剂，振荡混匀，溶液变浑浊，冰浴2min至溶液变清亮。(7)37℃冰浴5min，不时振荡溶液又变浑浊。12000rpm离心5min，溶液应分为两相，上层水相含质粒DNA，下层油相含内毒素。(8)将含质粒DNA的上层水相转移至新管，弃下层油相，注意不要吸到油相，重复步骤(6)～(8)三次。(9)加入600μl溶液P4，充分混匀后加入吸附柱中，室温放置2min，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。(10)向吸附柱中加入600μl漂洗液(使用前请检查是否加入无水乙醇)，12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管中；重复本步骤一次。(11)12000rpm离心2min，将吸附柱敞口置于室温或者50℃温箱放置数分钟，去除残余的漂洗液。(12)将吸收柱放入干净离心管中，向吸附膜中央滴加50-200μl经65℃水浴预热的洗脱液，室温静置2min，12000rpm离心1min，收集质粒DNA。(13)采用nanodrop核酸浓度测定最终得出所提慢病毒质粒浓度pLent-gC+US10(385ng/μl)、pLent-gC+US10(365ng/μl)、pLent-UL47(362ng/μl)，置于-20℃冰箱备用。

实施例2

将慢病毒包装细胞系293T接种于含有DMEM+10％FBS10cm培养皿中培养；配制反应体系，混匀后，室温放置20min后，均匀滴加到含有293T细胞培养皿中，后置于CO2培养箱中培养；转染后培养，得到携带GM-CSF-gC+US10、GM-CSF-gD+ICP4、GM-CSF-UL47编码基因的慢病毒病毒液。

更详细的说，本实施例采用如下的具体步骤：

采用Lentiviral Packaging Kit慢病毒包装试剂盒，具体方法如下：将慢病毒包装细胞系293T接种于含有DMEM+10％FBS10cm培养皿中，37℃，5％的CO2条件下培养，贴壁率为70％-80％时准备转染。取无菌的1.5ml EP管或15ml离心管，按下列组分配制反应体系：无血清DMEM：4ml；pLent-gC+US10、pLent-gC+US10、pLent-UL47质粒：10μg；GM easyTMLentiviral Mix：10μl(10μg)；HG TransgeneTM Reagent：60μl。混匀后，室温放置20min后，均匀滴加到含有293T细胞培养皿中，后置于CO2培养箱中培养。转染24h后，小心吸掉细胞培养液弃于盛有消毒液的废液杯中，然后加15ml含有10％血清新鲜的培养基继续培养。换液48h后，吸取细胞上清液于50ml离心管，4℃，500g离心5min，上清液用0.45μm滤器过滤后转移到新的离心管中。此时上清液中的病毒颗粒可以直接去检测滴度。取上述100μl病毒液采用慢病毒载体快速检测卡测定滴度，结果表明，重组pLent-gC+US10慢病毒的滴度1.78×107TU/ml，重组pLent-gC+US10慢病毒的滴度1.72×107TU/ml，重组pLent-UL47慢病毒的滴度1.76×107TU/ml。

实施例3

采集单纯疱疹病毒病人外周静脉血，分离外周血单个核细胞，留取贴壁细胞，并加入细胞因子诱导单个核细胞分化成DC，培养得到imDC。

更详细的说，本实施例采用如下的具体步骤：

采集单纯疱疹病毒病人外周静脉血50ml，用TBD样本密度分离液(购自天津灏洋华科生物)，分离外周血单个核细胞，培养于10ml培养基(购自TaKaRa公司，GT-T551)中，37℃，5％的CO2条件下培养3-4小时后，倒掉悬浮T细胞，留取贴壁细胞，并加入细胞因子rhIL-4(终浓度：50ng/ml)，rhGM-GSF(终浓度100ng/ml)，诱导单个核细胞分化成DC，每隔48小时更换新培养基，培养第5天得到imDC。

实施例4

将携带GM-CSF-gC+US10、GM-CSF-gD+ICP4、GM-CSF-UL47抗原编码基因的慢病毒感染所述imDC，并将感染后的imDC经成熟因子诱导，得到成熟DC疫苗。

更详细的说，本实施例采用如下的具体步骤：

将imDC以1×106个细胞/孔的量接种在12孔培养板中，以MOI＝10的重组慢病毒感染上述imDC，感染8-12h后，用PBS洗涤细胞2-3次，加入成熟因子TNF-α继续培养诱导得到成熟的DC细胞(mDC)，通过倒置显微镜观察DC成熟后细胞形态；流式细胞仪分析DC细胞成熟标志的表达情况。重组慢病毒感染DC前体细胞后，带有CD86、CD80及CD11c成熟标记的阳性细胞率平均为90.5％、89.8％和86.6％，利用流式细胞技术对其进行分析，结果表明，分别负载GM-CSF-gC+US10、GM-CSF-gD+ICP4、GM-CSF-UL47的DC中表达相应HSV-2抗原的细胞占总细胞比率均在87.3％以上

实施例5将成熟DC疫苗制备成疫苗悬液

将含CpG基序的寡脱氧核苷酸按比例溶于无菌NaCl注射液中，制成佐剂悬液(浓度60nmol/ml)，取100ulCpG佐剂悬液分别与1×106个分别负载GM-CSF-gC+US10、GM-CSF-gD+ICP4、GM-CSF-UL47的DC疫苗充分混合均匀，获得用作预防和治疗HSV-2的疫苗(针对单纯疱疹病毒的治疗性DC复合疫苗)。

实施例6免疫佐剂CpG刺激DC及淋巴细胞分泌细胞因子能力

将实施例2得到的mDC(HSV-2特异性DC)以1×106个细胞/孔的量接种在12孔培养板中与自体T淋巴细胞以1：20比例共培养，加入100ul CpG佐剂悬液为实验组，以未加CpG佐剂悬液的mDC与T淋巴细胞共培养为对照组，37℃，5％的CO2条件下培养72小时，流式细胞术检测CD8+T细胞的增殖。结果表明，加入CpG佐剂悬液实验组的CD8+T细胞阳性率为(50.42±2.39)％明显高于未加入CpG佐剂悬液的CD8+T细胞阳性率(22.15±2.16)％。说明CpG佐剂悬液对T淋巴细胞增殖具有促进作用。

收集mDC与T淋巴细胞共培养上清，ELISA试剂盒检测培养上清中细胞因子IL-12、因子IL-10因子分泌情况。从图1中可以看出，与未加入CpG佐剂悬液的对照组相比，HSV-2特异性DC具有分泌高水平促炎因子IL-12和低水平抑制型因子IL-10的能力。综上说明，CpG用作疫苗佐剂，可以改善抗原呈递细胞的功能并促进特异性免疫应答的产生。

实施例7HSV-2特异性DC疫苗的免疫疗法

HSV-2特异性DC疫苗包含三种负载HSV病毒特异性免疫抗原的DC细胞，分别是VC1：DC-gC+US10，VC2：DC-UL47，VC3：DC-gD+ICP4；分别以2×105个细胞/个细胞/次混合CpG免疫佐剂进行肌肉注射，总共免疫6次；免疫时间间隔和每次免疫DC疫苗如图2所示，一轮免疫为在第0、2、4周免疫VC1、VC2、VC3，然后间隔四周后，进行二轮免疫，分别在第8、10、12周再次免疫VC1、VC2、VC3。

实施例8HSV-2特异性DC疫苗的免疫原性

6-8周龄的雌性BALB/C小鼠(购自广州中医药大学，雌性，属SPF(III)级动物)分为4组，每组10只，分别为预防一组(HSV-2特异性DC疫苗)、预防二组(HSV-2特异性DC疫苗无CpG免疫佐剂)、对照一组(普通DC)、对照二组(PBS)。具体实施方式如实施例4所述，分别以2×105个细胞/次(混合100ulCpG免疫佐剂)进行肌肉注射小鼠，总共免疫6次；一轮免疫为在第0、2、4周免疫VC1、VC2、VC3，然后间隔四周后，进行二轮免疫，分别在第8、10、12周再次免疫VC1、VC2、VC3；对照一组小鼠用同等剂量的未转染的普通DC细胞免疫，对照二组小鼠用同等剂量的生理盐水。

完成免疫后4周，无菌取免疫小鼠脾细胞，采用IFNγ-ELISPOT(品牌：Millipore，购自达科为生物科技有限公司试剂盒)检测4组小鼠体内淋巴细胞的特异性细胞免疫水平，结果如图3。结果表明，与对照组相比，预防一组和预防二组具有较好的免疫原性，能够诱导小鼠产生抗原特异性细胞免疫应答，HSV-2特异性DC疫苗可诱发小鼠产生较强的特异性细胞免疫反应，针对抗原的特异性细胞免疫应答显著增强。

实施例9HSV-2特异性DC疫苗治疗单纯疱疹病毒的效果

HSV-2感染模型的建立，4-6周龄BALB/c小鼠(购自广州中医药大学，雌性，属SPF(III)级动物)，将100ul HSV-2病毒悬液(病毒株购于中国药品生物制品检定所)吸入明胶海绵小块，塞入小鼠阴道内，直抵子宫，在感染后4周建立稳定的HSV感染模型。通过该模型，我们验证HSV-2特异性DC疫苗治疗单纯疱疹病毒的能力。

将感染HSV-2的模式小鼠分为四组，每组10只；分别为治疗一组(HSV-2特异性DC疫苗)、治疗二组(HSV-2特异性DC疫苗无CpG免疫佐剂)、对照一组(普通DC)、对照二组(PBS)。具体实施方式如实施例4所述，分别以2×105个细胞/次混合100ulCpG免疫佐剂进行肌肉注射小鼠，总共免疫6次；一轮免疫为在第0、2、4周免疫VC1、VC2、VC3，然后间隔四周后，进行二轮免疫，分别在第8、10、12周再次免疫VC1、VC2、VC3；对照一组小鼠用同等剂量的未转染的普通DC细胞免疫，对照二组小鼠用同等剂量的生理盐水。在完成二轮免疫后每周取小鼠尾部静脉血，并分离血清，连续14周。

以小鼠血清作为样本，采用实时定量PCR来检测小鼠HSV-2的病毒动态水平，HSV-2gG基因特异性引物委托生工生物工程有限公司合成，引物和探针分别为FP:5′CCCCTGTTCTGGTTCCTAACG3′，RP:5′GTGGATGGTGGTGCTGATGATA3′，FAM:5′CCTGCTCTAGATATCCT3′。按照说明书进行实时定量PCR反应，检测HSV-2的病毒水平，结果如图4所示，与对照一组、对照二组相比，HSV-2特异性DC疫苗治疗一组和治疗二组在免疫治疗后，病毒HSV-2的含量逐渐降低，几乎接近零，且治疗一组效果优于治疗二组。

以上结果综合说明本发明所制备的DC疫苗能够诱导小鼠产生抗原特异性细胞免疫应答，并促进其杀伤作用；HSV-2特异性DC疫苗小鼠中产生的免疫反应具有能够完全清除小鼠体内HSV-2病毒的能力，因此本发明所制备的HSV-2特异性DC疫苗具有很好的预防和治疗效果。

应当理解，这些实施例的用途仅用于说明本发明而非意欲限制本发明的保护范围。此外，也应理解，在阅读了本发明的技术内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动、修改和/或变型，所有的这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的保护范围之内。

序列表

<110> 山东兴瑞生物科技有限公司

<120> 针对单纯疱疹病毒的治疗性DC复合疫苗及其制备方法

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 75

<212> DNA

<213> 人种(Homo sapiens)

<400> 1

atgctgctgc tggtgaccag cctgctgctg tgcgagctgc cccaccccgc ctttctgctg 60

atccccgaca tccag 75

<210> 2

<211> 2550

<212> DNA

<213> 人种(Homo sapiens)

<400> 2

atgggggcgg gggtgccgtg gacgggtata aaggccaggg gggcaggcgg gcccatcact 60

gttagggtgt taggttggga ggtggcacaa aaagcgacac acccgtgttg tagttgtccg 120

cgggaggcgg tggtttccgg caaccctcct cgctgcgccg ggcgcgccca ccggtccttc 180

gcgggggccg gggctcttct ggtcatggcc cttggacggg tgggcctagc cgtgggcctg 240

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gcgacggacg ccgagatcgg aacggcgcct agcttagagg aggtgatggt aaacgtgtcg 660

gccccgcccg ggggccaact ggtgtatgac agcgccccca accgaacggg cccgcacgtg 720

atctgggcgg agggcgccgg cccgggcgcc agcccgcggc tgtactcggt cgtcgggccg 780

ctgccgaccc agcggctcat catcgaagag ctgaccctgg agacccaggg catgtactac 840

tgggtgtggg gccggatgga ccgcccgtcc gcgtacggga cctgggtgcg cgttcgcgtg 900

ttccgccctc cgtcgctgac catccacccc cacgcggtgc tggagggcca gccgtttaag 960

gcgacgtgca cggccgccac ctactacccg ggcaaccgcg cggagttcgt ctggttcgag 1020

gacggtcgcc gggtgttcga tccggcccag atacacacgc agacgcagga gaaccccgac 1080

ggcttttcca ccgtctccac cgtgacctcc gcggccgtcg gcggccaggg ccccccgcgc 1140

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agcggcacgg catcggtgct gccgcggcca accatcacca tggagtttac gggcgaccat 1260

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gactcctcgc cggcggagaa ggtggccgtc gcgtcccaga catcgtgcgg gcgccccggc 1380

accgccacga tccgctccac cctgccggtc tcgtacgagc agaccgagta catctgccgg 1440

ctggcgggat acccggacgg aattccggtc ctagagcacc acggcagcca ccagcccccg 1500

ccgcgggacc ccaccgagcg gcaggtgatc cgggcggtgg agggggcggg gatcggagtg 1560

gctgtccttg tcgcggtggt tctggccggg accgcggtag tgtacctcac ccacgcctcc 1620

tcggtgcgct atcgtcggct gcggatgatc cggcggcggg gaaacgtgga gattcgggtc 1680

tactacgagt ctgtgcggcc ctctcgatcc cgaagccatc tgaagccgtc cgaccatcaa 1740

gaattcccag ggcaccacgt gtccccaggg agccccgggt tccccgagag cccagggaac 1800

cgcgagttcc acgatctccc agagaaccca gggtcccgcg catacccagg gacccgcgac 1860

ccccacgacc cccacgggtg cccagggagc ctagaccccc acgggaaccc cgcgcaaccc 1920

gcgggcttgc ctagcccggt cccctacgcc cccctcggca gcccggaccc ctcatcgccg 1980

cgccaacgca cgtacgttct gccccgcgtc ggtatccgta acgcgcccgc gtccgacacc 2040

cgggccccaa agcgtgccca ctcgcggcac cgcgcggacc ggcccccgga gtcccccggc 2100

tccgagttgt accctctcaa cgcccaggcc ctggcgcacc tgcagatgct gcccgcggac 2160

caccgggcct tttttcggac ggtgatcgag gtgtcccgcc tgtgtgctct caacacccac 2220

gacccaccgc ccccgctggc gggagccagg gtcggacagg aggcgcagct ggttcatacc 2280

caatggcttc gggccaacag ggagtcctcg ccgctgtggc cctggcggac ggccgccatg 2340

aattttatcg ccgcggctgc gccctgcgtc caaacacatc gccatatgca cgacctgctg 2400

atggcatgcg ccttctggtg ctgtttggcg cacgcgtcga cgtgttccta cgcggggtta 2460

tattcggcac actgccagca tttgtttcgt gcgtttgggt gcggaccccc ggtcctgacc 2520

acgtcccggg gacagggtgg ttggtgtaat 2550

<210> 3

<211> 2088

<212> DNA

<213> 人种(Homo sapiens)

<400> 3

atgtccgcgc gcgggcatgc cgtacgccgg aggcgcgcct ccacccggtc ccatgccccg 60

tccgcgcatc gcgccgactc gcccgtggag gacgagcccg agggcggtgg agtcgggtta 120

atggggtacc tgcgggcggt gtttaacgtg gacgacgaca gcgaggtcga ggccgcgggg 180

gagatggcga gcgaagagcc gccctcgcgc cgtcgccggg aggcccgcgg tcaccccggg 240

tcccgacgcg cgtccgaggc ccgggcggcg gcgccccccc gccgggcgtc ctttccgcgc 300

cccaggtccg ttacggccag gagccagtcc gttcgcggac gccgggacag cgccatcacg 360

cgggccccgc ggggaggcta cctgggcccg atggacccac gcgacgtttt ggggcgggtg 420

ggcggttcgc gggtggtgcc ctcgccgctg ttcctggacg agctcaacta cgaggaggac 480

gactaccccg ccgccgtcgc gcacgatgac ggcgccgggg cgcggcctcc cgcgacggtc 540

gagattctcg cgggccgcgt gtcgggcccg gagctgcagg cggcattccc cctggaccgc 600

ctgacccccc gagtcgccgc gtgggacgag tccgtgcgct cggccctggc cctgggacat 660

ccggccgggt tctacccgtg tccggatagc gcgttcgggc tgtcgcgcgt gggggtcatg 720

cactttgcct ccccggccga cccaaaggtg tttttccgcc agacgctgca gcagggcgag 780

gcgctggcct ggtacgtcac gggcgacgcg atcctcgacc tgacggatcg gcgggcaaaa 840

accagcccct cccgcgcgat gggctttctg gtggacgcca tcgtgcgggt ggcgatcaac 900

gggtgggtct gcgggacgcg cctgcacacg gaggggcgcg gctcggagct cgacgacagg 960

gcggccgagc tccgacggca gttcgcgagc ctcacggcgt tgcggcccgt gggggccgcc 1020

gccgtgccgc tgcttagcgc gggaggggcc gcgccccccc accccggccc cgacgccgcg 1080

gtctttcgca gttcgctggg gtccctgctg tactggcccg gggtgcgcgc gctcctgggg 1140

cgcgactgtc gcgtggccgc ccgctacgcg gggcgcatga cgtacatcgc caccggggct 1200

ctgctcgccc gcttcaaccc cggcgccgtc aaatgcgtgc tcccgcggga ggccgcgttt 1260

gcggggcgcg tcctggacgt gctggcggtc ctggcggagc agacggtcca gtggctctcg 1320

gtggtcgtgg gggcgcgcct gcacccgcac tccgcccacc ccgcgtttgc ggacgtggag 1380

caggaggcgc tgtttcgcgc cctgcccctg ggcagccccg gggtcgtggc ggccgagcac 1440

gaggcgctgg gcgacaccgc ggcgcgccgc ctgctcgcca ccagcgggct gaacgccgtg 1500

ctgggcgcgg ccgtgtacgc gctgcacacg gccctggcga ccgttaccct gaaatacgcc 1560

ctggcctgcg gggacgcgcg ccggcgcagg gacgacgcgg ccgccgcgcg cgccgtgctg 1620

gcgacggggc tcatcctgca gcggctgctg ggcctggccg acacggtggt cgcgtgcgtg 1680

gccctggccg cgtttgacgg cgggtcgacg gcccccgagg tgggcacgta cacccccctg 1740

cgctacgcgt gcgtcctccg cgcgacccag cccctgtacg cgcggaccac ccccgccaaa 1800

ttttgggcgg acgtgcgcgc cgccgcggaa cacgtggacc ttcgccccgc gtcctcggcg 1860

ccccgggcgc ccgtgagcgg gacggcagac cccgccttcc tgctcgaaga cctggcggcc 1920

ttcccccccg cccccctgaa tagcgagtcc gtgctggggc cgcgggtccg cgtcgtggac 1980

atcatggcgc agtttcggaa actgctcatg ggcgacgagg agaccgccgc cctccgggcg 2040

cacgtgtccg ggaggcgcgc gaccgggctg ggcggcccgc cacgccca 2088

<210> 4

<211> 2421

<212> DNA

<213> 人种(Homo sapiens)

<400> 4

atggggcgtt tgacctccgg cgtcgggacg gcggccctgc tagttgtcgc ggtgggactc 60

cgcgtcgtct gcgccaaata cgccttagca gacccctcgc ttaagatggc cgatcccaat 120

cgatttcgcg ggaagaacct tccggttttg gaccagctga ccgacccccc cggggtgaag 180

cgtgtttacc acattcagcc gagcctggag gacccgttcc agccccccag catcccgatc 240

actgtgtact acgcagtgct ggaacgtgcc tgccgcagcg tgctcctaca tgccccatcg 300

gaggcccccc agatcgtgcg cggggcttcg gacgaggccc gaaagcacac gtacaacctg 360

accatcgcct ggtatcgcat gggagacaat tgcgctatcc ccatcacggt tatggaatac 420

accgagtgcc cctacaacaa gtcgttgggg gtctgcccca tccgaacgca gccccgctgg 480

agctactatg acagctttag cgccgtcagc gaggataacc tgggattcct gatgcacgcc 540

cccgccttcg agaccgcggg tacgtacctg cggctagtga agataaacga ctggacggag 600

atcacacaat ttatcctgga gcaccgggcc cgcgcctcct gcaagtacgc tctccccctg 660

cgcatccccc cggcagcgtg cctcacctcg aaggcctacc aacagggcgt gacggtcgac 720

agcatcggga tgctaccccg ctttatcccc gaaaaccagc gcaccgtcgc cctatacagc 780

ttaaaaatcg ccgggtggca cggccccaag cccccgtaca ccagcaccct gctgccgccg 840

gagctgtccg acaccaccaa cgccacgcaa cccgaactcg ttccggaaga ccccgaggac 900

tcggccctct tagaggagcc cgccgggacg gtgtcttcgc agatcccccc aaactggcac 960

atcccgtcga tccaggacgt cgcgccgcac cacgcccccg ccgcccccag caacccgggc 1020

ctgatcatcg gcgcgctggc cggcagtacc ctggcggtgc tggtcatcgg cggtattgcg 1080

ttttgggtac gccgccgcgc tcagatggcc cccaagcgcc tacgtctccc ccacatccgg 1140

gatgacgacg cgcccccctc gcaccagcca ttgttttaca tgttcgaccc gcgcgcgctg 1200

gcctcgctgg ccgcgcgctg cgccgccccg ccccccggcg gcgcgcccgc cgccttcggc 1260

ccgctgcgcg cctcgggccc gctgcgccgc gcggcggcct ggatgcgcca ggtgcccgac 1320

ccggaggacg tgcgcgtggt gatcctctac tcgccgctgc cgggcgagga cctggccgcg 1380

ggccgcgccg ggggcgggcc ccccccggag tggtccgccg agcgcggcgg gctgtcctgc 1440

ctgctggcgg ccctgggcaa ccggctctgc gggcccgcca cggccgcctg ggcgggcaac 1500

tggaccggcg cccccgacgt ctcggcgctg ggcgcgcagg gcgtgctgct gctgtccacg 1560

cgggacctgg ccttcgccgg cgccgtggag ttcctggggc tgctggccgg cgcctgcgac 1620

cgccgcctca tcgtcgtcaa cgccgtgcgc gccgcggact ggcccgccga cgggcccgtg 1680

gtctcgcggc agcacgccta cctggcctgc gaggtgctgc ccgccgtgca gtgcgccgtg 1740

cgctggccgg cggcgcggga cctgcgccgc accgtgctgg cctccggccg cgtgttcggg 1800

ccgggggtct tcgcgcgcgt ggaggccgcg cacgcgcgcc tgtaccccga cgcgccgccg 1860

ctgcgcctct gccgcggggc caacgtgcgg taccgcgtgc gcacgcgctt cggccccgac 1920

acgctggtgc ccatgtcccc gcgcgagtac cgccgcgccg tgctcccggc gctggacggc 1980

cgggccgccg cctcgggcgc gggcgacgcc atggcgcccg gcgcgccgga cttctgcgag 2040

gacgaggcgc actcgcaccg cgcctgcgcg cgctggggcc tgggcgcgcc gctgcggccc 2100

gtctacgtgg cgctggggcg cgacgccgtg cgcggcggcc cggcggagct gcgcgggccg 2160

cggcgggagt tctgcgcgcg ggcgctgctc gagcccgacg gcgacgcgcc cccgctggtg 2220

ctgcgcgacg acgcggacgc gggcccgccc ccgcagatac gctgggcgtc ggccgcgggc 2280

cgcgcgggga cggtgctggc cgcggcgggc ggcggcgtgg aggtggtggg gaccgccgcg 2340

gggctggcca cgccgccgag gcgcgagccc gtggacatgg acgcggagct ggaggacgac 2400

gacgacggac tgtttgggga g 2421

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人种(Homo sapiens)

<400> 5

tcgtcgttcg aacgacgttg at 22

Claims (10)

1.针对单纯疱疹病毒的治疗性DC复合疫苗，其特征在于：包含三种负载HSV-2病毒特异性免疫抗原基因片段修饰的树突状细胞，所述三种负载HSV-2病毒特异性免疫抗原基因片段分别为gC+US10、DC-UL47、gD+ICP4。

2.如权利要求1所述的针对单纯疱疹病毒的治疗性DC复合疫苗，其特征在于：所述三种负载HSV-2病毒特异性免疫抗原基因片段均由粒细胞-巨噬细胞簇因子受体信号肽引导编码段。

3.如权利要求2所述的针对单纯疱疹病毒的治疗性DC复合疫苗，其特征在于：所述粒细胞-巨噬细胞簇因子受体信号肽为序列表SEQ ID NO.1所示的GM-CSF核苷酸序列。

4.如权利要求3所述的针对单纯疱疹病毒的治疗性DC复合疫苗，其特征在于：所述gC+US10为序列表SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

5.如权利要求4所述的针对单纯疱疹病毒的治疗性DC复合疫苗，其特征在于：所述UL47为序列表SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

6.如权利要求5所述的针对单纯疱疹病毒的治疗性DC复合疫苗，其特征在于：所述gD+ICP4为序列表SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。

7.如权利要求1所述的针对单纯疱疹病毒的治疗性DC复合疫苗，其特征在于：所述针对单纯疱疹病毒的治疗性DC复合疫苗中还含有增强DC疫苗免疫效果的免疫佐剂。

8.如权利要求7所述的针对单纯疱疹病毒的治疗性DC复合疫苗，其特征在于：所述免疫佐剂为C型CpG免疫刺激序列。

9.如权利要求8所述的针对单纯疱疹病毒的治疗性DC复合疫苗，其特征在于：所述CpG为序列表SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列。

10.针对单纯疱疹病毒的治疗性DC复合疫苗的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

S1、将抗原基因片段GM-CSF-gC+US10、GM-CSF-gD+ICP4、GM-CSF-UL47分别插入慢病毒表达载体pLent-C-GFP，并制备得到相应的三种质粒；

S2、将三种质粒分别进行慢病毒包装，得到包装成携带GM-CSF-gC+US10、GM-CSF-gD+ICP4、GM-CSF-UL47编码基因的慢病毒病毒液；

S3、将单纯疱疹病毒患者的体外周血单个核细胞诱导成imDC；

S4、将携带GM-CSF-gC+US10、GM-CSF-gD+ICP4、GM-CSF-UL47抗原编码基因的慢病毒感染所述imDC，并将感染后的imDC经成熟因子诱导，得到成熟DC疫苗；

S5、将成熟DC疫苗制备成疫苗悬液。