CN106581672A - 一种rhIL‑12用于治疗非活动性乙肝的药物组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种包含重组人白细胞介素‑12（rhIL‑12）的组合药物，包含重组人白细胞介素‑12和重组HBsAg蛋白疫苗两种组分。该组合药物可以应用于治疗慢性乙肝非活动性HBsAg携带者药物中，可以使患者外周血HBsAg血清学转换，即出现抗‑HBs阳转，HBsAg阴转，达到慢性乙肝功能性治愈。

Description

一种rhIL-12用于治疗非活动性乙肝的药物组合物
技术领域：本发明涉及一种组合药物，以及该组合药物在制备治疗慢性乙肝非活动性HBsAg携带者药物中的用途。
背景技术：
目前慢性乙型肝炎的治疗多应用核苷类似物、IFN-α及聚乙二醇干扰素等药物进行单一或联合用药，这种治疗方法可以明显的抑制HBVDNA的复制，使其从血清中降低及消失，HBeAg也在血清中逐渐降低、阴转。而且可以使受损的肝功能恢复正常。但这些疗法最后都无法彻底清除血清中的HBsAg，也不能产生抗-HBs。其根本原因在于感染者的免疫功能受到了HBsAg的抑制并存在细胞和体液免疫应答的缺陷。在先天固有免疫功能方面，TLR3、TLR7的功能被抑制，而在获得性免疫方面，由于HBV持续存在，在CD4+、CD8+T细胞出现PD1/PDL-1抑制性受体高表达，导致效应性T细胞转变为耗竭T细胞(T cell exhausted)，即无功能T细胞，使其不能很好地清除HBV，更不能形成免疫记忆，从而不能监控HBsAg的产生，导致HBsAg的持续存在及血清中持续阳性。在目前的治疗方法下，HBsAg不能完全清除。而HBsAg的持续表达与cccDNA的存在呈正相关，后者是慢性乙肝导致肝硬化、肝癌的重要原因。因此，目前亟需寻找促使HBsAg血清学转换的药物和方法。
有鉴于此，提出本发明。
发明内容：
本发明的技术方案如下：
重组人白细胞介素-12(rhIL-12)联合HBsAg疫苗，两种药物组合可以促进CD8+T细胞产生大量的内源性IFN-γ，这种内源性IFN-γ进入肝细胞等感染了乙肝病毒的细胞内阻止HBV的复制和再生产过程，形成细胞内非溶细胞性病毒清除模式，清除细胞内的HBVDNA及HBsAg。同时，IL-12通过激活TFH细胞产生IL-21，进一步活化B细胞产生特异性抗体，从而中和HBsAg，是最近新发现和必须重视的促使HBsAg血清学转换的重要机制。
本发明提供一种组合药物，包含重组人白细胞介素-12和重组HBsAg蛋白疫苗两种组分，其特征在于：重组人白细胞介素-12的使用剂量为0.05μg-0.75μg/公斤，皮下注射，每周1-2次。重组HBsAg蛋白疫苗的使用剂量10μg-60μg/次，肌肉注射，每1-2周1次。
优选的，重组人白细胞介素-12的使用剂量为0.25μg-0.75μg/公斤。
优选的，重组人白细胞介素-12的使用剂量为0.05μg-0.50μg/公斤。
该组合药物中，重组人白细胞介素-12和重组HBsAg蛋白疫苗两种组分可以同时施用，也可以间隔施用。
本发明的主要目的是提供一种上述组合药物在制备治疗慢性乙肝非活动性HBsAg携带者(外周血HBsAg滴度在1000IU/ml以下)药物中的应用。
进一步地，上述组合药物可以促使患者外周血HBsAg血清学转换，即出现抗-HBs阳转，HBsAg阴转，达到慢性乙肝功能性治愈。
以上所述的患者外周血HBsAg血清学转换，其大部分过程是首先产生抗-HBs，中和HBsAg，然后HBsAg阴转。
抗-HBs在HBsAg阴转前2-5周出现，且其滴度须达到60mIU/ml以上，才能中和HBsAg，促使HBsAg阴转。
本发明还提供一种药物组合物，组合药物中含有rhIL-12 10～20μg，重组HBsAg蛋白疫苗10～60μg，母牛分枝杆菌5～20μg制剂和余量的水溶液。
上述组合药物能够促使持慢性乙肝非活动性HBsAg携带者HBsAg血清学转换，其主要作用机制是rhIL-12激活和增加滤泡型CD4+辅助性T细胞(Tfh)的频率，产生IL-21，活化B细胞，产生特异性抗-HBs，继而中和HBsAg。
本发明的技术效果：本发明中所述的组合药物能够促使持慢性乙肝非活动性HBsAg携带者HBsAg血清学转换，达到慢性乙肝功能性治愈的效果。同时，rhIL-12是一种既可以激活人体先天固有免疫(如TLR3、TLR7和NK细胞)，恢复或逆转耗竭的T细胞功能，且可以下调PD1和激活TFh细胞产生IL-21，促进B细胞产生特异性抗体的一种细胞因子。它与HBsAg疫苗联用，可以提高宿主对HBV的特异性细胞免疫和特异性体液免疫反应，增强抗-HBs的产生，中和HBsAg，最终达到HBsAg血清学转换。rhIL-12促进CD8+T细胞产生大量的内源性IFN-γ，可以进入感染HBV的肝细胞内阻止HBV的复制和再生产过程，形成肝细胞内非溶细胞性病毒清除模式，清除细胞内的HBVDNA及HBsAg，此外最近尚发现IL-12能够激活滤泡型辅助性T细胞(Tfh)产生IL-21，促使B细胞产生特异性抗体，从而中和HBsAg，通过以上几个方面的协同作用，这对于促使HBsAg血清学转换达到慢性乙肝功能性治愈成为可能。
附图说明
图1为三个剂量IL-12对小鼠乙肝模型HBsAg表达的动态影响；
图2为三个剂量IL-12对HBV-DNA转基因小鼠HBsAg表达的动态影响；
图3为治疗后抗-HBs阳转与HBsAg阴转出现的时间差；
图4为rhIL-12对健康人PBMCs诱生IFN-γ的影响(*与阴性对照组比较,P<0.05；***P<0.001；#与rhIL-12 0.01ng/m1组比较,P<0.05；###P<0.001)；
图5为rhIL-12对免疫耐受期患者PBMCs诱生IFN-γ的影响(*与阴性对照组比较,P<0.05；**,P<0.05；##,与0.01ng/m1组比较,P<0.01)；
图6为rhIL-12对免疫清除期患者PBMCs诱生IFN-γ的影响(*与阴性对照组比较,P<0.05；***P<0.001；##,与rhIL-12 0.01ng/m1组比较,P<0.01；###,P<0.001)；
图7为rhIL-12对非活动性HBsAg携带者PBMCs诱生IFN-γ的影响(**与阴性对照组比较,P<0.01；##,与rhIL-12 0.01ng/m1组比较,P<0.01；###,P<0.001)。
具体实施方式：
实施例1
1.水动力法建立小鼠乙肝模型
1.1小鼠乙肝模型的建立
应用PAAV-1.2-HBV-A质粒(台湾陈培哲教授惠赠)，选用体重20-25克C57BL/6小鼠，将PAAV质粒15μg溶于小鼠体重10％的生理盐水中。于5-8秒内经鼠尾静脉注射(高速、高压)，然后通过心脏转染在肝细胞内，建立乙型肝炎感染模型。其后每周检测HBV-DNA、HBeAg、HBsAg动态变化，确定为HBV转染模型后，于注射第6周时，筛选小鼠血清HBsAg阳性者作为实验小鼠。第6周时，HBsAg阳性鼠(HBsAg滴度＞0.04IU/ml)约占实验鼠60-80％，其中HBsAg呈现不同滴度分布。可分为高滴度(＞250IU/ml)、中滴度(20.0-249.01U/ml)、低滴度(0.04-19.9IL/ml)。以上三种不同HBsAg滴度的模型鼠，从第6周至14周每周检测HBsAg以及抗-HBs产生的动态变化。以观察其自然恢复过程。见表1～表3。
表1模型鼠转染第6周及第14周HBsAg变化比较(滴度单位：IU/ml)
表2模型鼠转染第6周及第14周抗-HBs产生比较(滴度单位：mIU/mL)
表3模型鼠低滴度组第14周时HBsAg、抗-HBs相互关系
*抗-HBs阳转&HBsAg阴转组的抗-HBs滴度显著高于HBsAg未转阴组，P＜0.01
1.2分析和讨论
1.2.1水动力法建立的C57BL/6小鼠乙肝模型，在转染第6周，HBsAg可呈现不同的滴度分布。我们将其分为三种层次，＞250IU/ml以上，占全部HBsAg阳性模型鼠中24.0％，其后至转染第14周时，HBsAg滴度逐渐下降，平均滴度已下降为73.7±38.0，在此期间，抗-HBs的产生(指抗-HBs阳性)的例数为0，说明尚未产生保护性抗体；在HBsAg中滴度的模型鼠，第6周时HBsAg平均滴度为91.9±20.0，至第14周时已下降至30.2±12.0，在49例中也未发现自然HBsAg阴转例数，抗-HBs仅出现1例阳转。相反，低HBsAg滴度的27只模型鼠中，至第14周时，已有11只(25.9％)自然转为HBsAg阴性，平均HBsAg滴度下降至3.7±5.8IU/ml，而且抗-HBs阳转率高达63.0％，抗-HBs滴度平均上升至394.1±220.5mIU/ml，提示在转染第6周时，HBsAg在20.0IU/ml以下的模型鼠，由于其在第14周内HBsAg自然阴转率很高，故不适宜作为研究HBsAg血清学转换的模型鼠。
1.2.2水动力法建立的C57BL/6乙肝模型鼠，于转染第6周时，HBsAg滴度在20.0IU/ml以上者，可作为研究筛选HBsAg血清学转换药物的模型鼠，但应该注意的是，慢性乙肝病程可分为免疫耐受期、免疫清除期和非活动性HBsAg携带期。从本次实验结果来看，我们建立的C57BL/6小鼠乙肝模型，它不属于慢性乙肝免疫耐受期和免疫清除期，而比较符合慢性乙肝非活动性HBsAg的分期依据。从理论上分析，人类慢性乙肝的标准其病程要超过6个月以上，从模型鼠考虑，由于小鼠的平均寿命和人类差异很大，要筛选达到6个月以上的HBsAg持续阳性模型鼠，不仅数量很少，而且鼠龄逐渐老化，不一定能等同于人类的6个月以上的慢性乙肝模型，我们认为，在应用水动力法乙肝模型鼠时，只要淘汰或弃用在实验期(共14周内)可能自然阴转，指HBsAg滴度在20.0IU/ml以下的模型鼠，也即选择大于20.0IU/ml以上者，对于研究HBsAg血清学转换的药物是比较合适和可行的。美国著名肝病研究专家Chisary，于2003年报道水动力法建立的鼠模型确定为急性乙型肝炎模型，但其观察时间仅二周，我们建立的乙肝鼠模型长达14周，已经观察到单项HBsAg持续阳性的状况，故比较适合于筛选非活动性HBsAg携带者治疗药物的研究。
实施例2
1.三种不同剂量重组鼠白细胞介素-12(rmIL-12)对小鼠慢性乙肝模型表达HBsAg的影响。
水动力法建立的C57BL/6小鼠乙肝模型，于注射PAAV DNA质粒6周后，筛选外周血HBsAg滴度在20.0IU/ml～83.6IU/ml间的HBsAg阳性小鼠24只，分为4组，每组各6只。生理盐水组皮下注射，每只0.2ml，每周2次。rmIL-12治疗组分别为150ng/只组、100ng/只组，50ng/只，皮下注射，每周2次。治疗前及治疗后每周检测HBsAg1次(眼球刺破取血)，共治疗8周，于第8周时，rmIL-12三个治疗组小鼠虽然HBsAg显著下降并稳定维持在较低水平，因尚未HBsAg转阴，故增加注射HBsAg疫苗(0.5μg/只)，每周1次，共3周，期间仍每周检测HBsAg滴度1次，直至第12周。结果见图1。
说明：C57小鼠乙肝模型第6周时，HBsAg呈中等水平表达，给予三个剂量IL-12(每周2次)分别注射后，150ng组、100ng组、50ng组于给药第1周内HBsAg显著下降，与生理盐水组相比，P＜0.05。其后在第8周内，HBsAg仍保持更低水平表达状态，但不能转阴。当第8周开始加用HBsAg疫苗0.5μg。部分实验鼠外周血HBsAg出现转阴。并出现抗-HBs。
2.分析
生理盐水对照组于观察期间，HBsAg平均值基本稳定在53.2±IU/ml至39.5IU/ml间，而三个剂量的rmIL-12组均于注射后出现HBsAg滴度下降，与生理盐水组对照差异非常显著，其后第2-8周三个rmIL-12治疗组的HBsAg平均值均低于生理盐水组，这三个剂量组的小鼠HBsAg表达虽然较治疗前明显降低，但HBsAg滴度仍未能转为阴性(＞0.03IU/ml)。三个rmIL-12治疗组分别于第9周时，每只小鼠注射HBsAg疫苗0.5μg/周/次共三周，三个剂量组中均各有1只小鼠HBsAg滴度转为阴性，其余小鼠HBsAg滴度继续下降，以上结果提示，rmIL-12的治疗对C57BL/6小鼠乙肝模型有显著下调HBsAg表达作用，但连续治疗8周，尚未达到HBsAg阴性水平，经加用HBsAg疫苗后，可出现HBsAg阴转或抗-HBs阳转。
3.初步结论：rmIL-12能显著降低C57BL/6模型鼠HBsAg的表达，当后期加用乙肝疫苗0.5μg/只，1/周×3后，能够促使HBsAg血清学转换。上述实验结果相当于rmIL-12治疗作用的预备试验，为rmIL-12联合乙肝疫苗的治疗促进HBsAg血清学转换提供实验依据。
实施例3
1.目的：探索rmIL-12、乙肝疫苗或rmIL-12联合乙肝疫苗对模型鼠HBsAg表达的影响
2.方法：水动力法建立的C57BL/6小鼠乙肝模型。于转染第6周时筛选HBsAg滴度20.0～＞250IU/ml共60只，其中HBsAG滴度＞250IU/ml 12只(高滴度)；20.0～249.0IU/ml48只(中滴度)，20IU/ml以下模型鼠不纳入实验。按HBsAg不同的滴度平均分为6组，每组12只。治疗方法：rmIL-12组每周皮下注射rmIL-12150ng次/只；乙肝疫苗分别为三个剂量组，即2ug组、0.5ug组、0.05ug组，均为肌肉注射，每周1次；rmIL-12 150ng联合乙肝疫苗0.5ug组均按rmIL-12及乙肝疫苗0.5ug组方法注射；另设生理盐水对照组，0.2ml，皮下注射，每周2次。以上6个组治疗均为8周，期间每周检测外周血HBsAg、抗-HBs各1次，HBsAg＜0.03IU/ml为阴性，抗-HBs＞10m IU/ml为阳性(或称阳转)。
3.结果
3.1治疗后HBsAg阴转例数及抗-HBs阳转例数见表4、表5.
表4治疗后HBsAg阴转数及HBsAg滴度变化比较(滴度单位：IU/ml，n＝12)
*：rmIL-12 150ng联合乙肝疫苗0.5ug组与生理盐水组比较P＜0.05
**：rmIL-12 150ng联合乙肝疫苗0.5ug组与生理盐水组比较P＜0.01
表5治疗后抗-HBs阳转例数和滴度变化(滴度单位：mIU/ml，n＝12)
*：与生理盐水组比较：P＜0.05
**：与生理盐水组比较：P＜0.01
表6各治疗组治疗后8周抗-HBs阳转与抗-HBs滴度关系
*抗-HBs阳转&HBsAg阴转组的抗-HBs滴度显著高于HBsAg未转阴组，P＜0.01。
3.2抗-HBs阳转与HBsAg阴转的相关性
在5个治疗组中(60例)，总共有12例出现HBsAg阴转，其中有10例(83.3％)提早2-5周优先出现抗-HBs阳转，随着抗-HBs滴度的增高，HBsAg呈现阴转，抗-HBs阳转与HBsAg阴转的相互关系见表7及图2。
表7抗-HBs阳转与HBsAg阴转的相互关系
说明：5个治疗组中，在治疗观察1-8周，抗-HBs阳转从第1周开始出现，每周依次为2、5、9、11、13、14、22、22例；HBsAg阴转于治疗后第4周开始出现，接着每周依次为4、6、7、10、12。抗-HBs阳转时间早于HBsAg阴转时间2～5周。
4.分析：
治疗8周后rmIL-12联合乙肝疫苗0.5μg组HBsAg阴转率显著高于生理盐水对照组P＜0.05，且HBsAg平均滴度也显著低于生理盐水组及单用乙肝疫苗组，P＜0.05。提示rmIL-12联合乙肝疫苗的治疗对模型鼠HBsAg表达有下调及促进阴转作用。
rmIL-12联合乙肝疫苗治疗组在促进抗-HBs阳转及提高抗-HBs平均滴度方面均显著优于生理盐水组、P＜0.05或P＜0.01。其中促使HBsAg阴转例数中有83.3％提早2-5周呈现抗-HBs阳转，提示抗-HBs的产生及持续阳性在促使模型鼠HBsAg阴转方面具有重要意义，也可能作为预测HBsAg阴转的信号。
实施例4
三种不同剂量重组鼠白细胞介素-12(rmIL-12)对HBV转基因鼠模型表达HBV的影响。
1.HBV转基因鼠模型来源：
解放军第458医院全军肝病中心于1999年应用转基因显微注射技术建立并培养高表达复制型1.3拷贝HBV全基因转基因小鼠Tg(HBV 1.3genome)swb。乙型肝炎病毒全基因D型，转基因Balb/C鼠，至今已稳定传近50代，血清HBsAg表达在16470±2704IU/ml，终身表达，可用常规Elisa试剂盒检测。
90％阳性转基因血清HBV DNA达到104-106copy/ml；肝组织免疫组化有HBsAg(胞浆型)、HBcAg(核型)表达。该鼠模型HBsAg呈HBsAg长期高滴度表达，比水动力法建立的鼠模型HBsAg表达量增高几十倍至几百倍，与临床上CHB免疫耐受型患者比较类似。为了比较和了解rmIL-12对此类免疫耐受型的HBsAg表达是否产生影响，我们采用三种不同剂量rmIL-12进行试验。方法：rmIL-12分为三个剂量组，150ng/只组、100ng/只组、50ng/只组，每周皮下注射2次，共治疗8周，每周检测HBsAg1次。另设生理盐水对照组，每只小鼠0.2ml/只，每周皮下注射2次，共治疗8周，以上4组每组均为12只，结果见图3。
说明：三个剂量rmIL-12组与生理盐水组治疗8周后，每组检测HBsAg 1次，比较三个rmIL-12剂量组与生理盐水对照组的HBsAg动态变化，HBsAg滴度均稳定波动在16000IU/ml-18000IU/ml间，各组间无显著差异。
分析：HBV转基因鼠模型其外周血HBsAg滴度属高度表达，rmIL-12 150ng组、100ng组、50ng组经治疗8周，对其HBsAg高表达均无显著影响，提示HBV转基因鼠模型因属免疫耐受型，因此对于免疫治疗均无应答。这一数据表明，IL-12并不能使所有种类的乙肝患者HBsAg表达降低，甚至转阴。同时也说明，实施例3中可以使HBsAg转阴的技术效果是显著的，意料不到的。
实施例5
IL-12促进外周血CD4+CXCR5+滤泡辅助性T细胞的表达和IL-21产生，促进C57BL/6乙肝模型鼠HBsAg血清学转换
1.研究目的
滤泡辅助性T细胞(follicular helper T cells，Tfh)是一种新发现的辅助性T细胞亚群，存在于淋巴结滤泡，表达CXCR5、PD-1、ICOS、Bcl-6、IL-21等表面分子。Tfh在B细胞分化过程中起着重要作用，具有辅助B细胞成熟、增殖的功能，直接辅助抗体反应，调节体液免疫反应。外周血CD4+CXCR5+Tfh细胞被认为是外周记忆性Tfh细胞，具有与Tfh细胞相似的功能特性。Tfh细胞及其分泌的IL-21参与HBV感染后的免疫应答，在病程中发挥重要作用。本实施例建立小鼠乙肝模型，应用IL-12联合乙肝疫苗促进HBsAg阴转及抗-HBs产生，探讨Tfh细胞表达及产生IL-21与HBsAg的关系。
2对象和方法
2.1对象
在实施例3中。5个治疗组经过8周治疗后发生HBsAg阴转者共12例，而生理盐水组无1例阴转。将上述已HBsAg阴转及生理盐水对照组未阴转各12例，于第8周时，取其外周血PBMC及脾脏分离的脾细胞分别进行CD4+CXCR5T细胞比例检测。同时检测血清IL-21水平。
2.2方法
2.2.1ELISA检测血浆中IL-21水平使用商品化的ELISA试剂盒对血浆中IL-21的水平进行检测，严格按照试剂盒说明书进行操作，标准品及所有标本均设置复孔。用自动读板仪读取吸光度(A)值，按照说明书中提供的方法拟合标准曲线，计算出IL-21的浓度。
2.2.2流式细胞术检测PBMC和脾细胞中CD4+CXCR5T细胞的频率，计数后将细胞转移至流式管中，保持细胞浓度为1×105/管。使用Alexa647标记的CXCR5、Alexa488标记的CXCR5、FITC标记的ICOS、PerCP标记的CD4、PE标记的PD-1和APC标记的CD40L等流式细胞术抗体及与之对应的同型对照抗体，严格按照说明进行PBMC染色。使用BDFACSCalibur流式细胞仪对处理好的标本进行检测，每份标本至少获取50 000个细胞进行分析。用Flow Jo 7.6软件(Tree Star Inc.)对获得的数据进行分析。
3.统计学分析结果以表示。数据采用SPSS 17.0(SPSS Inc.)软件进行分析。各组间均数的比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)；相关性分析采用Pearson相关检验。以双侧P<0.05为差异有统计学意义。
4结果：见表8。
表8治疗后8周HBsAg阴转模型鼠外周血、脾细胞中Tfh细胞比例及血清IL-12水平
▲5个治疗组总例数60例，其中rmIL-12 150ng联合乙肝疫苗0.5μg组HBsAg阴转例数为5/12；rmIL-12 150ng组、乙肝疫苗2μg组、0.5μg组均为2/12，0.05μg组为1/12。
*：与生理盐水组比较P＜0.05。
**：与生理盐水比较P＜0.01。
5.初步结论
rmIL-12及HBsAg疫苗在增加外周血PBMC及脾细胞中CD4+CXCR5+Tfh的表达和血清IL-21的增高在促使HBsAg血清学转换及阐明其作用机理方面具有关键的作用。
6.讨论
HBV感染人体后，宿主发病与否以及病情的严重程度常常与机体免疫力有关，无论天然免疫应答还是特异性免疫应答都不同程度的参与机体对HBV的清除，细胞毒性T淋巴细胞是负责清除HBV的主要承担者，通过破坏受感染肝细胞而清除细胞内病毒。然而B细胞介导的特异性体液免疫反应也发挥着重要的作用，通过分泌大量的免疫球蛋白，以中和作用的方式清除循环血液中的HBV病毒。
本研究中，IL-12治疗组与生理盐水相比HBsAg显著下降，可能通过细胞免疫和体液免疫两方面实现。在细胞免疫方面，IL-12可以促进大量的内源性IFN-γ的产生，并进入肝细胞等感染了乙肝病毒的细胞内阻止HBV的复制和再生产过程，形成细胞内非溶细胞性病毒清除模式，清除细胞内的HBV DNA及HBsAg；再者，IL-12下调PD1，解除免疫抑制状态，恢复CD8+T细胞的功能。在体液免疫方面，活化的CD4+T细胞分泌IL-4、IFN-γ，表达上调CXCR5；CXCR5是介导T细胞进入淋巴滤泡的重要分子，但对于大多数T细胞，CXCR5的表达只是一过性的；之后，部分CD4+CXCR5+T细胞细胞通过具有高亲和力的TCR与B细胞相互作用而获得一个额外信号，维持CXCR5的持续性表达，促进细胞进入淋巴滤泡GC，最终分化为Tfh；分化成熟的Tfh通过表达CD40L、Ices与GC内B细胞上的CD40、ICOSL相互结合，促进B细胞分化，成熟的B细胞部分继续留在GC形成记忆性B细胞，部分离开GC而分化为浆细胞，分泌产生大量的抗体；此外，IL-12通过记忆性CD4+T细胞调节，增强IL-21的分泌，而IL-21分泌辅助B淋巴细胞产生抗体，调节特异性体液免疫反应。特别是中和HBsAg促使HBsAg血清学转换。
综上所述，白细胞介素-12可有效地启动特异性和非特异性免疫反应，增强Tfh，大量增加IL-21分泌促进特异性体液免疫，下调PD-1，增强T细胞功能，有助于CHB患者出现病毒学应答，有利于宿主清除HBV。
实施例6
本实施例用以确定rhIL-12联合乙肝病毒表面抗原(HBsAg)增强CHB患者PBMCs对HBV抗原产生特异性细胞免疫应答的影响。
1.实验材料和方法
1.1病人选择
根据2005年中国《慢性乙型肝炎防治指南》的乙肝诊断标准，连续收集2008年3月至2008年11月间解放军第458医院肝病中心门诊的慢性乙肝患者15例，年龄17-49岁，平均31.17岁。所有患者排除甲型肝炎病毒(HAV)、丙型肝炎病毒(HCV)、丁型肝炎病毒(HDV)、戊型肝炎病毒(HEV)感染和其他原因(药物、酒精、中毒)等造成的急慢性肝损害。9名健康志愿者作为对照，对照组全部接种过重组HBsAg疫苗，血清中除了HBsAb阳性外，其余HBV血清学指标均为阴性。
1.2药物与试剂
rhIL-12由广州市恺泰生物科技有限公司生产(批号：20121201)，rHBsAg(深圳康泰生物科技有限公司)，注射用母牛分枝杆菌(安徽智飞龙科马生物制药有限公司)，人IFN-γELISA试剂盒均购自BD公司。
1.3仪器
SW-CJ-2F型洁净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)，二氧化碳培养箱(SANYO，日本)，LXJ-Ⅱ型离心机(上海医用分析仪器厂)，Multiskan MK3酶标仪、Well wash 4MK2洗板机(上海热电仪器有限公司)，XW-80A旋涡混合器(上海精科实业有限公司)。
1.4实验方法
1.4.1常规法分离和培养淋巴细胞
1.4.2ELISA检测法(按说明书操作)
1.5药物作用观察
依据预试验结果选用rHBsAg(0.5μg/ml)，注射用母牛分枝杆菌(0.225μg/ml)，rhIL-12最佳剂量(1ng/ml)。分组如下：
(1)阴性对照：培养液；
(2)rHBsAg(0.5μg/ml)；
(3)母牛分枝杆菌(0.225μg/ml)
(4)rhIL-12(1ng/ml)；
(5)rHBsAg(0.5μg/ml)联合rhIL-12(1ng/ml)；
(6)母牛分枝杆菌(0.225μg/ml)联合rhIL-12(1ng/ml)；
(7)rHBsAg(0.5μg/ml)、母牛分枝杆菌(0.225μg/ml)联合rhIL-12(1ng/ml)；
(8)阳性对照：0.2μg/ml抗人CD3单抗。
96孔细胞培养板每孔中含细胞悬液及相应浓度刺激物各100μl，各刺激物浓度均设3个复孔，置37℃、5％CO2培养箱培养72h，ELISA测定培养上清中IFN-γ的浓度。
1.6数据处理
本文检测数据用表示,采用SPSS13.0软件处理进行重复测量方差分析,显著性检验标准为P＜0.05。
1.7实验结果
实验结果(如表9)显示，用0.5μg/ml HBsAg、0.225μg/ml母牛分枝杆菌单独刺激慢性乙肝患者或健康人的PBMCs时，发现仅有少量IFN-γ产生。单独应用rhIL-12(1ng/ml)刺激，产生的IFN-γ与阴性对照组比较有统计学差异(P＜0.05)，但IFN-γ处于较低水平。
用HBsAg(0.5μg/ml)或母牛分枝杆菌(0.225μg/ml)联合rhIL-12(1ng/ml)刺激慢性乙肝患者和健康人PBMCs，发现联合组与单独组比较，IFN-γ水平都有明显上升，差异有统计学意义(P＜0.01)。
用HBsAg(0.5μg/ml)和母牛分枝杆菌(0.225μg/ml)联合rhIL-12(1ng/ml)刺激慢性乙肝患者和健康人PBMCs，发现三种刺激物联合组与HBsAg(0.5μg/ml)或母牛分枝杆菌(0.225μg/ml)联合rhIL-12(1ng/ml)两种刺激物联合组比较，IFN-γ水平都有明显上升，差异有统计学意义(P＜0.01)
表9健康人与乙肝患者PBMCs经刺激后产生IFN比较
实施例7
本实施例目的为研究诱生IFN-γ的来源。
1.1实验材料与方法
1.1.1研究样本
招募健康志愿者8例，均曾接种过乙肝疫苗，HBV血清学指标如下：HBsAg(-)、抗HBs(+)、HBeAg(-)、抗Be(-)、抗HBc(-)。无菌采静脉血10ml。
1.1.2药物与试剂
rhIL-12由广州市恺泰生物技术公司生产(批号：20121201)，RPMI 1640基础培养液、FBS购自GIBCO公司(USA),Ficoll淋巴细胞分离液(上海华精),CD3PE、CD8FITC、CD4PreCP、CD1aPE、CD14PE、IFN-γAPC、PD-1 APC、TLR3 Alexa flour 647、TLR7 Alexaflour 488均购自美国BD公司。
1.1.3仪器
流式细胞仪(FACS Calibur,BD公司,美国)。
1.1.4实验方法
(1)分离PBMCs细胞
(2)将浓度为2×106/ml的细胞分别加入2管15ml细胞离心管中,每管1ml，分两个组，其中一组加入rHBsAg(0.5μg/ml)、母牛分枝杆菌(0.225μg/ml)联合rhIL-12(1ng/ml)，另一组做阴性对照，混匀，37℃，5％CO2温育6h。
(3)温育至最后2h加蛋白转运抑制剂(BFA)10μl/ml，混匀。
(4)细胞用PBS洗2次(1000转、5分钟)，用纸吸干后加固定液，每管各加4％PFA(多聚甲醛)2ml，混匀，室温8分钟。
(5)用PBS洗2次(2000转、10分钟)，用纸吸干，各加破膜剂(buffer 3)400μl，4℃过夜。
(6)染色：每管四个组合，每组100μl细胞。第一组加入PE标记的CD3抗体、PreCP标记的CD4抗体、FITC标记的CD8抗体、APC标记的IFN-γ抗体；第二组加入PE标记的CD3抗体、PreCP标记的CD4抗体、FITC标记的CD8抗体、APC标记的PD-1抗体；第三组加入Alexa flour488标记的TLR7抗体、PE标记的CD1a抗体、Alexa flour 647标记的TLR3抗体；第四组加入Alexa flour 488标记的TLR7抗体、PE标记的CD14抗体、Alexa flour 647标记的TLR3抗体。每种抗体加入量均为5μl。4℃，避光30分钟。
(7)用破膜剂(buffer 3)洗2次。
(8)每管各加含0.1％BSA的PBS 300μl，重悬细胞，上机分析。以淋巴细胞设门分析T细胞亚群IFN-γ和PD-1的表达，分别以单核细胞和DC细胞设门分析TLR的表达。
1.2数据处理
数据用表示,采用SPSS13.0统计软件进行重复测量方差分析分析,显著性检验标准为P<0.05。
1.3实验结果
健康志愿者PBMCs经抗原联合rhIL-12孵育后，CD3+CD4+、CD3+CD8+细胞内分泌IFN-γ的细胞百分数与阴性对照组比较有显著差异(P＜0.05)；CD3+CD4+、CD3+CD8+细胞PD-1的表达与阴性对照组比较有显著差异(P＜0.01)；CD14+细胞TLR3、TLR7的表达与阴性对照组比较有显著差异(P＜0.01)；CD1a+细胞TLR3、TLR7的表达与阴性对照组比较有显著差异(P＜0.01)；(详见表10、11、12)
表10健康人PBMCs经抗原联合rhIL-12孵育6h后T细胞亚群IFN-γ及PD-1的表达(％)(n＝8,)
注：*，与阴性对照组比较，P＜0.05；**，P＜0.01
表11健康人PBMCs经抗原联合rhIL-12孵育6h后单核细胞TLR的表达(％)(n＝8,)
注：*，与阴性对照组比较，P＜0.05；**，P＜0.01
表12健康人PBMCs经抗原联合rhIL-12孵育6h后DC细胞TLR的表达(％)(n＝8,)
注：*，与阴性对照组比较，P＜0.05；**，P＜0.01
实施例8.
本实施例目的为探讨抗原联合rmIL-12经皮下注射(给药两次)对BALB/c小鼠体内产生IFN-γ的生物学效应。
1.1实验材料
1.1.1实验动物
清洁级BALB/c小鼠40只，雄性20只，雌性20只，体重20g，购自南方医科大学实验动物中心。
1.1.2实验试剂
rmIL-12(Peprotech，美国)，RPMI-1640和胎牛血清(GIBCO,美国)，Ficoll淋巴细胞分离液(上海华精)。
1.1.3仪器
SW-CJ-2F型洁净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)，二氧化碳培养箱(SANYO，日本)，LXJ-Ⅱ型离心机(上海医用分析仪器厂)，Multiskan MK3酶标仪、Well wash 4MK2洗板机(上海热电)，XW-80A旋涡混合器(上海精科实业有限公司)。
1.2实验方法
1.2.1分组、给药和采血方案
40只小鼠随机分入生理盐水组(生理盐水150μl/只)及rHBsAg组(10μg/只)、母牛分枝杆菌组(10μg/只)、rhIL-12组(0.3μg/只)、rHBsAg(10μg/只)+母牛分枝杆菌(10μg/只)+rhIL-12(0.3μg/只)组，共五组，每组8只，雌雄各半。给药两次，第一次给药72h后再给药一次。注射部位为小鼠颈背部皮下。分别于给药前，第一次给药后24、72h以及第二次给药后24h眼眶采血，分离血清检测IFN-γ浓度。
1.2.2数据处理
数据用表示,采用SPSS13.0统计软件进行重复测量方差分析和单因素ONEWAY分析，显著性检验标准为P＜0.05。
1.3实验结果
给药后小鼠血清中IFN-γ的浓度在24h达到高峰，rmIL-12组和rHBsAg(10μg/只)+母牛分枝杆菌(10μg/只)+rhIL-12(0.3μg/只)组与生理盐水组比较明显升高，呈现剂量依赖性(P<0.001)。至72h时血清中的IFN-γ恢复接近给药前水平。此时再给药一次，24h时血清中的IFN-γrmIL-12组和rHBsAg(10μg/只)+母牛分枝杆菌(10μg/只)+rhIL-12(0.3μg/只)组与生理盐水组比较明显升高，呈现剂量依赖性(P<0.001)(见表13)。
表13rmIL-12对BALB/c小鼠血清中产生IFN-γ影响
注：***，与给药前(0h)和NS组比较，P＜0.001；#，与0.3μg/只rmIL-12组比较，P＜0.05；###，P＜0.001。
实施例9
本实施例目的在于探索rhIL-12对健康人及慢性乙型肝炎患者(包括免疫耐受期、免疫清除期、非活动性HBsAg携带期)PBMCs诱生IFN-γ和IL-4的情况，了解rhIL-12对增强慢性乙型肝炎患者Th1优势表达，调整Th1/Th2细胞平衡的作用。同时，本实施例也对确定rhIL-12在人体中的使用剂量有着指示作用。
1.1实验材料
1.1.1受试者选择
筛选健康人20例，CHB患者62例(其中免疫耐受期21例、免疫清除期22例、非活动性HBsAg携带期19例，以下均以分期简称)。
健康人选择标准：HBsAg阴性，HBsAb阳性。
所有乙肝患者均不合并丙型肝炎感染，所有受试者年龄为15-55岁，性别不限。
1.1.2药品与试剂、仪器
1.1.2.1药品及试剂
实验用药：rhIL-12批号：20121201(广州市恺泰生物科技有限公司)。
人IFN-γELISA试剂盒购自BD/Pharmingen公司(Becton Dickinson/Phar MingenUSA)。RPMI-1640培养液、谷氨酰胺和Hanks液购自GIBCO公司(USA)。葡聚糖泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)购自上海华精生物科技公司。胎牛血清购自GIBCO。
1.1.2.1仪器
SW-CJ-2F型洁净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)，二氧化碳培养箱(SANYO，日本)，LXJ-Ⅱ型离心机(上海医用分析仪器厂)，Multiskan MK3酶标仪、Well wash 4MK2洗板机(上海热电仪器有限公司)，XW-80A旋涡混合器(上海精科实业有限公司)。
1.2实验方法
1.2.1淋巴细胞的分离和培养
取外周静脉血5ml，肝素20U/ml抗凝，经RPMI-1640培养基1：1稀释后，使用Ficoll淋巴细胞分离液按常规方法分离单个核细胞，继用RPMI-1640基础培养液洗两次，最终用1ml含10％灭活胎牛血清(FBS)的RPMI-1640悬浮细胞，计数细胞，调整细胞浓度为2×106/ml。取配置好的100μl细胞悬液入96孔培养板，再加100μl RPMI-1640(10％FBS，室温)稀释好的刺激物，并设RPMI-1640基础培养液空白对照孔和抗人CD3单抗(eBioscience公司)阳性对照孔，同一浓度刺激孔均设复孔，置37℃、5％CO2培养箱孵育一定时间后，在无菌条件下收集无细胞上清液，ELISA方法测定IFN-γ含量。
1.2.2ELISA检测法
操作步骤参照试剂盒说明书。简述如下：①鼠抗人IFN-γ单克隆抗体包被ELISA板，4℃放置过夜，用含0.05％Tween20的PBS溶液洗涤后加入含10％FBS的PBS溶液，室温静置1h；②洗涤后每孔加入不同稀释度的人IFN-γ标准品及培养上清液，室温静置2h；③洗涤后加入生物素标记的鼠抗人IFN-γ单克隆抗体及亲合素标记的辣根过氧化物酶，室温静置1h；④洗涤后加TMB显色剂，室温避光放置30min，加10％硫酸终止反应；⑤酶标仪检测培养上清液中IFN-γ的含量。IFN-γ试剂盒检测灵敏度为4.7pg/ml。
1.2.3药物作用观察
将不同浓度rhIL-12分别加入受试者的PBMCs，培养72h。1640培养液组为阴性对照组，0.2μg/ml抗人CD3单抗为阳性对照组。
1.3数据处理
数据用表示,采用SPSS13.0统计软件进行重复测量方差分析。满足方差齐性条件，用ONE-WAY ANOVA；不满足参数条件，采用Kruskal–Wallis检验,显著性检验标准为P<0.05。
1.4实验结果
1.4.1rhIL-12对健康人PBMCs诱生IFN-γ和IL-4的影响
如表14、图4显示，rhIL-12 0.01ng/m1、0.1ng/m1和1ng/m1三个剂量与健康人PBMCs孵育72h后产生的IFN-γ水平，具有剂量依赖关系，0.1ng/m1和1ng/m1 rhIL-12组与阴性对照组相比均有显著差异(P＜0.05，P＜0.001)，与0.01ng/m1 rhIL-12组比较也有显著差异(P＜0.05，P＜0.001)。各rhIL-12浓度对PBMCs诱生IL-4无明显差异。
表14rhIL-12对健康人PBMCs诱生IFN-γ和IL-4的影响(n＝20,)
分组 IFN-γ(pg/ml) IL-4(pg/ml)
阴性对照 7.9±21.2 0
rhIL-12 0.01ng/m1 53.6±66.8 0
0.1ng/m1 153.9±117.8*，# 0
1.0ng/m1 414.7±158.7***，### 0
抗人CD3单抗 13246.4±11092.8*，# 0
注：*与阴性对照组比较,P<0.05；***P<0.001；
#与rhIL-12 0.01ng/m1组比较,P<0.05；###P<0.001；
1.5.2rhIL-12对免疫耐受期患者PBMCs诱生IFN-γ和IL-4的影响
如表15、图5显示，rhIL-12 0.01ng/m1、0.1ng/m1和1ng/m1三个剂量与免疫耐受期患者的PBMCs孵育72h后产生的IFN-γ水平呈明显的量效关系，0.01ng/m1、0.1ng/m1和1ng/m1组与阴性对照组相比均有显著差异(P＜0.05，P＜0.05，P＜0.01)；rhIL-12三个浓度组之间产生的IFN-γ差异亦有统计学意义，1ng/m1与0.01ng/m1组比较均有显著差异(P＜0.01)。三种rhIL-12浓度对诱生IL-4无明显影响。
表15rhIL-12对免疫耐受期患者PBMCs诱生IFN-γ和IL-4的影响(n＝21,)
注：*与阴性对照组比较,P<0.05；**,P<0.05；##,与0.01ng/m1组比较,P<0.01。
1.5.3rhIL-12对免疫清除期患者PBMCs诱生IFN-γ和IL-4的影响
如表16、图6显示，rhIL-12 0.01ng/m1、0.1ng/m1和1ng/m1三个剂量与免疫清除期患者的PBMCs孵育72h后产生的IFN-γ水平有明显的量效关系，rhIL-12 0.01ng/m1、0.1ng/m1和1ng/m1组与阴性对照组相比均有显著差异(P＜0.05，P＜0.001，P＜0.001)；rhIL-12三个浓度组之间产生的IFN-γ差异亦有统计学意义。三种rhIL-12浓度对诱生IL-4无明显差异。
表16rhIL-12对免疫清除期患者PBMCs诱生IFN-γ和IL-4的影响(n＝22, )
分组 IFN-γ(pg/ml) IL-4(pg/ml)
阴性对照 40.3±39.3 0
rhIL-12 0.01ng/m1 310.15±363.75* 0
0.1ng/m1 798.97±624.21***，## 0
1.0ng/m1 3394.47±2877.70***，### 0
抗人CD3单抗 17928.45±12080.96*** 0
注：*与阴性对照组比较,P<0.05；***P<0.001；##,与rhIL-12 0.01ng/m1组比较,P<0.01；###,P<0.001。
1.5.4rhIL-12对非活动性HBsAg携带期PBMCs诱生IFN-γ和IL-4的影响
如表17、图7显示，rhIL-12 0.01ng/m1、0.1ng/m1和1ng/m1三个剂量与非活动性HBsAg携带者的PBMCs孵育72h后产生的IFN-γ水平呈明显的量效关系。rhIL-12 0.1ng/m1组与阴性对照组相比有显著差异(P＜0.01)；0.1ng/m1 rhIL-12与0.01ng/m1 rhIL-12之间产生的IFN-γ差异亦有统计学意义，P＜0.001。三种rhIL-12浓度对诱生IL-4无影响。
表17rhIL-12对19例非活动性HBsAg携带期PBMCs诱生IFN-γ和IL-4的影响
分组 IFN-γ(pg/ml) IL-4(pg/ml)
阴性对照 88.7±175.2 0
rhIL-12 0.01ng/m1 277.8±564.1 0
0.1ng/m1 596.1±684.3**，### 0
1.0ng/m1 4939.4±7835.5 0
抗人CD3单抗 11393.0±10746.6***，## 0
注：**与阴性对照组比较,P<0.01；##,与rhIL-12 0.01ng/m1组比较,P<0.01；###,P<0.001。
1.6结论
(1)rhIL-12 0.01、0.1和1ng/m1三个剂量对健康人和慢性乙型肝炎患者(三种临床分期)的PBMCs均可诱生的IFN-γ水平呈明显的量效关系，而未见IL-4的同步变化，提示rhIL-12可增强Th1型细胞因子的优势表达。
(2)rhIL-12对不同临床分期的慢性乙型肝炎患者PBMCs均具有增强细胞免疫功能的作用。
需要说明的是，实验中小鼠的给药量与人的给药量之间的换算，采用本领域常规换算方法。由于小鼠对药物的耐受性比人类强10倍，故应将小鼠公斤体重的剂量除以10，即称为人的公斤体重剂量。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种组合药物，包含重组人白细胞介素-12和重组HBsAg蛋白疫苗两种组分，其特征在于：重组人白细胞介素-12的使用剂量为0.05μg-0.75μg/公斤，皮下注射，每周1-2次；重组HBsAg蛋白疫苗的使用剂量10μg-60μg/次，肌肉注射，每1-2周1次。
2.根据权利要求1所述的组合药物，其特征在于：重组人白细胞介素-12的使用剂量为0.25μg-0.75μg/公斤。
3.根据权利要求1所述的组合药物，其特征在于：重组人白细胞介素-12的使用剂量为0.05μg-0.50μg/公斤。
4.根据权利要求1-3任一种所述的组合药物，其特征在于：重组人白细胞介素-12和重组HBsAg蛋白疫苗两种组分同时施用或间隔施用。
5.根据权利要求1-3任一种所述的组合药物在制备治疗慢性乙肝非活动性HBsAg携带者药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：该组合药物可以使患者外周血HBsAg血清学转换，即出现抗-HBs阳转，HBsAg阴转，达到慢性乙肝功能性治愈。
7.根据权利要求1所述的组合药物，其特征在于：组合药物中含有rhIL-12 10～20µg，重组HBsAg蛋白疫苗10～60µg，母牛分枝杆菌5～20µg制剂和余量的水溶液。
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