CN107375902A - sCD100蛋白在制备慢性HBV感染治疗药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了sCD100蛋白在制备治疗慢性HBV感染药物中的应用，并进一步提供了一种治疗慢性HBV感染的药物，其活性成分包括sCD100蛋白。本发明采用HBV慢性复制小鼠模型、以及体外给予sCD100和HBV特异性多肽处理CHB患者的PBMCs来对sCD100蛋白抗病毒免疫调控作用进行了验证，该发现在临床应用上有重要意义。

Description

sCD100蛋白在制备慢性HBV感染治疗药物中的应用
技术领域
本发明涉及免疫学和医学技术领域，特别涉及一种sCD100蛋白在制备慢性HBV感染治疗药物中的应用，所述sCD100蛋白在慢性HBV感染特异性免疫治疗中具有抗病毒免疫调控作用。
背景技术
乙型肝炎病毒感染是全球性的公共卫生问题，慢性HBV感染在我国尤为严重。目前临床抗病毒治疗药物主要为两大类：①干扰素α(如PEG-IFNα，即聚乙二醇化干扰素)，但仅在约30％患者体内诱导持续的抗病毒应答，且副作用较大；②核苷(酸)类似物(如拉米夫定、恩替卡韦等)，可有效抑制病毒复制，但无直接的免疫调节作用，难以彻底清除HBV，需长期甚至终生用药，且存在病毒耐药变异及停药后病毒血症反弹等问题1-2。因此，探寻更有效的CHB免疫治疗策略具有重要意义。
细胞毒性T淋巴细胞在清除HBV感染的肝细胞中发挥关键作用3。在适应性细胞免疫应答中，CD8+T细胞活化有赖于双信号：①CD8+T细胞的T细胞受体识别抗原提呈细胞表面MHC I类分子提呈的抗原肽，通过第一信号；②APC与T细胞表面共刺激分子相互作用提供共刺激信号(第二信号)。活化的CD8+T细胞经历克隆扩增而分化为效应性CTL和记忆性T细胞4。已有研究显示，病毒感染会引起肝内APC细胞功能分化成熟从而诱导效应性CD8+T细胞的生成，但是这一过程并不依赖于经典的共刺激分子(如CD80/CD86等)的调控，提示肝内T细胞免疫存在新的共刺激分子调控机制5。目前，仍不清楚在急性自限性HBV感染过程中HBV特异性CD8+T细胞是通过何种机制打破肝内免疫耐受而发挥其抗病毒活性的。
以上涉及的文献包括：1.Locarnini,S.,Mason,W.S.Cellular and virologicalmechanisms of HBV drug resistance.J Hepatol 44,422-431(2006).
2.Zoulim,F.,Locarnini,S.Hepatitis B virus resistance to nucleos(t)ideanalogues.Gastroenterology 137,1593-1608e1591-1592(2009).
3.Liu,J.,Kosinska,A.,Lu,M.,Roggendorf,M.New therapeutic vaccinationstrategies for the treatment of chronic hepatitis B.Virol Sin 29,10-16(2014).
4.Schuch,A.,Hoh,A.,Thimme,R.The role of natural killer cells and CD8(+)T cells in hepatitis B virus infection.Front Immunol 5,258(2014).
5.Thomson,A.W.,Knolle,P.A.Antigen-presenting cell function in thetolerogenic liver environment.Nat Rev Immunol 10,753-766(2010)
发明内容
有鉴于此，本发明提供了具有免疫活性sCD100蛋白在慢性HBV感染特异性免疫治疗中的应用，sCD100蛋白可以促进肝内HBV特异性T细胞活化发挥免疫治疗作用。
本发明第一方面提供了sCD100蛋白在制备治疗慢性HBV感染药物中的应用。
具体的，所述药物中sCD100蛋白具有增强肝内HBV特异性CD8+T细胞免疫应答进而促进HBV病毒清除的作用。
在本发明的实施例中，采用HBV慢性复制小鼠模型、以及体外给予sCD100和HBV特异性多肽处理CHB患者的PBMCs来对sCD100蛋白的作用进行了验证。具体的，采用6-8周龄的雄性C57/BL小鼠，用质粒pAAV/HBV 1.2经尾静脉高压水注射建立HBV慢性复制小鼠模型，定期采集外周血液样本检测血清HBsAg、HBeAg；小鼠慢性HBV复制模型体内给予sCD100蛋白治疗，检测血清HBsAg、HBeAg水平变化发现sCD100蛋白可导致病毒清除加速。体外给予sCD100和HBV特异性多肽处理CHB患者的PBMCs，通过流式细胞术检测发现可增强部分CHB患者HBV特异性CD8+T细胞免疫应答。
本发明第二方面提供了治疗慢性HBV感染的药物，其活性成分包括sCD100蛋白。
具体的，所述治疗慢性HBV感染的药物成分还可包括药学上可接受的药用赋形剂或药用辅料。
所述治疗慢性HBV感染的药物的给药方式可以是多样化的，包括但不限于口服给药、静脉注射给药等方式，对应的，该药物的剂型也可以是多样化的，如胶囊剂等适合口服给药的剂型、及注射剂等剂型。
本发明的有益效果是：本发明提供了新的促进肝内HBV特异性CD8+T细胞活化共刺激因子，进而达到促进HBV病毒清除的免疫治疗策略，在慢性HBV感染过程中，给予外源性sCD100治疗可以促进病毒清除，sCD100蛋白发挥了重要的抗病毒免疫调控作用，该发现在临床应用上有重要意义。
附图说明
图1为给予外源性sCD100蛋白处理后慢性HBV复制小鼠表面抗原清除示意图；
图2为给予外源性sCD100蛋白处理后慢性HBV复制小鼠e抗原清除示意图；
图3为给予外源性sCD100处理后增强CHB患者CD8+T细胞免疫应答示意图。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明提供的sCD100蛋白在制备慢性HBV感染治疗药物中的应用予以进一步说明。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为市场购买得到。
实施例1
本实施例构建了小鼠HBV慢性复制模型，通过该模型验证sCD100蛋白在慢性HBV感染特异性免疫治疗中的抗病毒免疫调控作用。具体步骤包括：
6-8周雄性C57BL/6小鼠10只，通过高压尾静脉注射方式在5-8秒内将质粒公司制备好的质粒pAAV/HBV1.2按照6μg/只小鼠快速通过小鼠尾静脉推注进体内，构建HBV慢性复制模型，将实验小鼠分为两组，每组5只。实验组在第7天和14天通过普通尾静脉注射sCD100蛋白，每次每只小鼠注射50ug；对照组注射相应剂量的生理盐水。在处理时间第4、7、11、14、18、21、25、28天采集小鼠眼眶外周血，10000g离心10分钟收集上清，按照商业化HBsAgELISA试剂盒步骤，将血清10倍稀释后检测HBsAgOD值，结果如图1所示，从图1可以看出给予外源性sCD100蛋白处理可使慢性HBV复制小鼠表面抗原提前清除。
实施例2
本实施采用实施例1的小鼠HBV慢性复制模型，通过该模型验证sCD100蛋白在慢性HBV感染特异性免疫治疗中的抗病毒免疫调控作用。具体步骤包括：
采用如实施例1的方法处理实验小鼠，在处理时间采集小鼠眼眶外周血，10000g离心10分钟收集上清，按照商业化HBeAgELISA试剂盒步骤，将血清10倍稀释后检测HBeAgOD值，结果如图2所示，从图2可以看出给予外源性sCD100蛋白处理可使慢性HBV复制小鼠e抗原提前清除。
实施例3
随机取4例符合慢乙肝诊断标准的患者抽取肱静脉血3ml装入肝素管中，反复颠倒保证充分抗凝；淋巴细胞分离管空管在室温20℃，2000g离心1分钟，将采集的受试者全血转入淋巴细胞分离管中；在室温20℃，800g离心15分钟，离心机加减速度调节至3档；将上层PBMC层吸走转移至新的15ml离心管中；在新管中加入5ml红细胞裂解液，室温300g离心10分钟，弃入上清，轻轻刮动离心管；加入2ml PBS缓冲液将PBMC重悬。使用12孔细胞培养板，每个孔内加入以下成分：1ml PBMC(106个细胞)、1μL aCD28、2.5μL IL-2、外源性可溶性CD100蛋白(1μg/ml)置于细胞培养箱中培养10天。培养5-7天时取出细胞，每1ml细胞中再加入500μL 1640完全培养基及1.25μL IL-2。取新的96孔板，取200μL细胞加入孔内。1500rpm离心5分钟。每孔加入200μL1640完全培养基重悬细胞。1500rpm离心5分钟。于新的培养板中稀释BFA溶液至1:1000，37℃孵育2-4小时。孵育后1500rpm离心5分钟。弃去上清，使用200μL冷的PBS重悬细胞，1500rpm离心5分钟。弃去离心后的细胞上清，每孔细胞中加入100μL稀释后的FVD。4℃避光孵育15分钟。1500rpm×5分钟，弃上清。使用200μL PBS+1％FCS溶液重悬细胞。1500rpm×5分钟，弃上清。配制1:1000CD4/CD8/CD3(每孔100μL)。4℃避光孵育15分钟。1500rpm×5分钟，弃上清。使用200μL PBS+1％FCS溶液重悬细胞。1500rpm×5分钟，弃上清。使用100μl Fixation Buffer重悬细胞，4℃孵育15分钟。1500rpm×5分钟，弃上清。使用100μL Perm Buffer重悬细胞。1500rpm×5分钟，弃上清。使用Perm Buffer配制1:1000IFN-γ(每孔100μL)。使用100μl IFN-γ抗体稀释液重悬细胞，4℃孵育20分钟。1500rpm×5分钟，弃上清。使用200μLPBS重悬细胞并移入FACS管内使用流式细胞仪检测CD8+T细胞的IFN-γ的表达频率。结果如图3所示，从图3的结果可知，给予外源性sCD100处理可增强CHB患者CD8+T细胞免疫应答。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.sCD100蛋白在制备治疗慢性HBV感染药物中的应用。
2.如权利要求1所述的sCD100蛋白在制备治疗慢性HBV感染药物中的应用，其特征在于：所述药物中sCD100蛋白具有增强肝内HBV特异性CD8+T细胞免疫应答进而促进HBV病毒清除的作用。
3.一种治疗慢性HBV感染的药物，其特征在于：其活性成分包括sCD100蛋白。
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