CN106692965A - 一种经黏膜使用的hsv‑2 dna疫苗及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种经黏膜使用的HSV‑2 DNA疫苗，该疫苗包括pgD，pCCL28和免疫介质，pgD为包含HSV‑2 gD包膜糖蛋白核苷酸序列的pcDNA3.1(+)质粒，pCCL28为包含CCL28核苷酸序列的pcDNA3.1(+)质粒，该疫苗经黏膜免疫或使用。本发明还提供了一种上述疫苗的制备方法；本发明另外提供了一种上述疫苗在预防和治疗单纯疱疹病毒感染上以及治疗单纯疱疹病毒相关疾病上的应用。本发明DNA疫苗兼具理想的免疫保护作用以及HSV‑2控制和疾病治疗效果，便于推广使用，质量易于控制，易大规模生产、保存和运输，成本低，操作简单，具有良好的市场应用前景。

Description

一种经黏膜使用的HSV-2 DNA疫苗及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于基因工程和免疫学领域，具体涉及一种HSV-2 DNA疫苗，更具体地说，涉及一种用于黏膜免疫的HSV-2 DNA疫苗，该疫苗的制备方法以及该疫苗的预防性和治疗性应用。
背景技术
单纯疱疹病毒2型(HSV-2)作为生殖器疱疹的主要病原体，至今尚未有安全、有效的预防性疫苗问世。流行病学及病原学调查资料表明，生殖器疱疹全球每年的发病人数约为2300万，HSV-2感染能够增加至少3倍的HIV-1感染几率，并能够加速艾滋病的进程。更为严重的是，HSV-2感染后会导致终生潜伏感染和再发感染，造成了较重的经济负担和广泛的社会心理影响。经过科学家20多年的基础研究及临床实验，理想的HSV-2疫苗应能够清除通过黏膜部位进入机体的病毒而不产生新的感染，或者清除潜伏的病毒，这为HSV-2预防性疫苗的研发指明了研究方向。
HSV-2是通过侵染生殖道浅表的黏膜部位及入侵深层黏膜组织来实现感染的，因此，对于HSV-2的预防，除了黏膜局部中和抗体的中和病毒的作用，细胞免疫对病毒的防御起了更重要的作用。动物实验证明，T细胞免疫及其长期记忆性是研制HSV-2疫苗的关键，也是疫苗研究急需解决的科学难题。虽然HSV-2的gD是中和抗体和T细胞的靶蛋白，但是，gD的DNA疫苗及蛋白苗的免疫原性低，有不能建立长期免疫的缺点，需要借助理想的佐剂和适当的免疫途径来增强其免疫原性或改变免疫反应的类型，更有助于建立理想的免疫。但前期疫苗的III期临床试验证明，疫苗的有效性仅达38％，大部分佐剂仅对体液免疫有明显的增强效果。
近年来，趋化因子作为分子佐剂得到了广泛的重视。趋化因子是动物体内正常存在的分子，副反应小，作为分子佐剂可以诱导改变免疫反应的强度和类型，目前已发现多种趋化因子具有佐剂效应，但其详尽的作用机制尚不是十分清楚。趋化因子CCL28与受体分子CCR10结合，在天然免疫和适应性免疫中都发挥了重要的作用，其主要功能是招募淋巴细胞定向迁移到淋巴组织和促进IgA抗体在大肠及乳汁中分泌，利用这一功能可以将CCL28作为分子佐剂促进疫苗的细胞免疫及黏膜免疫。目前，对CCL28佐剂效应的研究主要集中在其增强抗原特异性免疫反应和记忆性免疫方面，Hu Kai等研究发现，CCL28更倾向于将响应B细胞迁移至脾脏及肠系膜淋巴结(MLNs)，作为分子佐剂不仅在黏膜局部增强免疫应答，还可增强全身性的体液免疫及细胞免疫应答(Hu，K.，Luo，S.，Tong，L.，Huang，X.，Jin，W.，Huang，W.，Du，T.，Yan，Y.，He，S.，Griffin，G.E.，Shattock，R.J.，Hu，Q..CCL19andCCL28Augment Mucosal and Systemic Immune Responses to HIV-1gp140by MobilizingResponsive Immunocytes into Secondary Lymph Nodes and Mucosal Tissue[J].theJournal of Immunology，2013，191(4)：1935-47.)。Nagakubo D等研究发现，CCL28能够协助更多的记忆性CD4+T细胞在鼻腔的黏膜部位定居，有助于建立长期的免疫记忆(Nagakubo，D.，Yoshie，O.，Hirata，T..Upregulated CCL28expression in the nasalmucosa in experimental allergic rhinitis：Implication for CD4+memory T cellrecruitment[J].Cellular immunology，2016，S0008-8749(16)：20008-9.)。
发明专利CN 103864902 B公开一种包含HSV-2 gD或gB包膜蛋白核苷酸序列以及佐剂CCL19或CCL28核苷酸序列的双价DNA疫苗，其免疫途径为肌肉注射，应用过程中不但需要媒介来介导DNA质粒注射肌肉后转染至细胞，可能需要借助特殊的设备，操作繁琐，使用不方便，因此针对该种疫苗在临床上目前尚没有理想的推广办法，在一定程度上限制了HSV-2型DNA疫苗的应用。此外，该种肌肉注射型DNA疫苗未充分利用HSV-2感染途径的特殊性即黏膜感染，其在体液免疫，尤其是细胞免疫以及黏膜免疫的调动能力和免疫效果上还需要进一步增强和提高。
综上，需要寻找更为理想的HSV-2疫苗来充分调动细胞免疫及黏膜免疫来预防和治疗HSV-2病原体的感染。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种经黏膜使用的HSV-2 DNA疫苗，该疫苗包括pgD，pCCL2和免疫介质；所述pgD为包含HSV-2 gD包膜糖蛋白核苷酸序列的pcDNA3.1(+)质粒，所述pCCL28为包含CCL28核苷酸序列的pcDNA3.1(+)质粒；上述核苷酸序列均位于所述质粒的CMV启动子下游；所述疫苗经黏膜免疫或使用。
作为优选，所述经黏膜免疫或使用包括但不限于：滴鼻免疫和经生殖道黏膜施药。
作为优选，所述免疫介质为1％壳聚糖和转染试剂。
作为优选，所述HSV-2 gD包膜糖蛋白核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述CCL28核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明的另一目的在于提供一种上述经黏膜使用的HSV-2 DNA疫苗的制备方法，具体步骤如下：
(1)采用PCR法分别扩增HSV-2 gD包膜糖蛋白基因和CCL28基因，并引入酶切位点；
(2)酶切所述HSV-2 gD包膜糖蛋白基因和所述CCL28基因，分别连入真核表达载体质粒；
(3)将步骤(2)所得连接产物分别转化入E.coli DH5α感受态菌株，挑取单菌落扩大培养，提取质粒后用双酶切验证，经测序验证序列正确后即得所述pgD和所述pCCL28的质粒溶液；
(4)将步骤(3)所得质粒溶液与免疫介质预混，制备得到所述经黏膜使用的HSV-2DNA疫苗。
作为优选，扩增所述HSV-2 gD包膜糖蛋白基因的上游引物序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物序列如SEQ ID NO.4所示；扩增所述CCL28基因的上游引物序列如SEQ ID NO.5所示，扩增所述CCL28基因的上游引物序列如SEQ ID NO.6所示。
作为优选，步骤(2)所述真核表达载体质粒为pcDNA3.1(+)。
本发明的第个三目的在于提供一种上述经黏膜使用的HSV-2 DNA疫苗在预防单纯疱疹病毒感染上的应用，免疫程序如下：将所述pgD的质粒溶液用1％壳聚糖稀释后，与所述pCCL28的质粒溶液和所述转染试剂的混合液混合后，进行首次鼻黏膜免疫，免疫两周后，重复以上操作，进行二次鼻黏膜免疫。优选地，所述鼻黏膜免疫的剂量为1μg pgD抗原和3μgpCCL28，免疫总体积为15μL，两次所述鼻黏膜免疫的剂量相同。
本发明的第四个目的在于提供一种上述经黏膜使用的HSV-2 DNA疫苗在治疗单纯疱疹病毒感染和相关疾病上的应用，施药方法如下：将所述pgD的质粒溶液用所述1％壳聚糖稀释后，与所述pCCL28的质粒溶液和所述转染试剂的混合液混合，进行生殖道黏膜施药，所述pgD和所述pCCL28的剂量比为1∶3，隔天给药，每次给药剂量相同。优选地，所述pgD和所述pCCL28的剂量分别为1μg和3μg，每次给药总体积为15μL。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明旨在突破现有HSV-2 DNA疫苗的技术瓶颈，充分考虑和利用HSV-2感染途径的特殊性，革新性地将黏膜免疫途径和黏膜免疫佐剂相结合，通过pgD和pCCL28质粒的构建制成DNA疫苗基本成分，与免疫介质预混，并配套特殊的经黏膜使用(滴鼻或生殖道黏膜施药)以及特定施用程序，以感染HSV-2的BALB/c小鼠模型为基础比较研究CCL28介导的免疫应答抗生殖道黏膜HSV-2感染的效果，在免疫诱导部位和免疫效应部位两个层面，从分子、细胞、组织及整体水平评价本发明疫苗调节免疫细胞的定性迁移及免疫应答能力，以及介导响应性免疫细胞在各层黏膜部位的定居及黏膜免疫微环境的改变，申请人意外发现：与肌肉注射型疫苗相比，本发明黏膜免疫型DNA疫苗具有遗传稳定性和可重复性，能够更迅速地诱发机体产生更强的IgA体液免疫、Th1/Th2型细胞免疫和黏膜免疫反应，产生的抗血清具有更强的中和能力，同时在分子佐剂CCL28作用下，实现了定向地将HSV-2包膜糖蛋白提呈给成熟的B细胞、T细胞或树突状细胞(DC)，增强了疫苗性免疫反应和记忆性免疫反应，可以迅速激活黏膜免疫相关的免疫应答，更好地协调天然免疫和适应性免疫应答，同时在分子佐剂CCL28作用下，实现了定向地将HSV-2包膜糖蛋白提呈给成熟的B细胞、T细胞或树突状细胞(DC)，增强了疫苗性免疫反应和记忆性免疫反应，对小鼠表现出更为理想的保护效果，在免疫效果上具有明显的优势。
此外，申请人还发现：本发明HSV-2 DNA疫苗经黏膜施药后能明显降低HSV-2病毒感染性损伤程度，显著降低疾病死亡率，对阻断HSV-2传播和缩短病毒感染病程表现出一定促进作用，证明本发明疫苗经黏膜施药后具有较为理想的感染控制和疾病治疗效果，提示其可作为治疗性疫苗用于阻断或减少HSV-2病毒的传播或复发，控制HSV-2相关病症的进程，减少HSV-2在生殖道黏膜的检出频率及病毒载量，减少病毒感染性损伤的发生几率。
综上，本发明经黏膜使用DNA疫苗比普通肌肉注射型疫苗便于推广使用，质量易于控制，易大规模生产、保存和运输，成本低，操作简单，对操作者没有特殊要求，兼具预防性和治疗性双重作用，将为HSV-2疫苗的研发和应用提供新理论，为防治黏膜来源的病原体感染提供新思路。
附图说明
图1为HSV-2免疫、攻毒及采样的时间轴示意图。
图2为血清中和阴道样品中IgG和IgA的抗体滴度比较示意图。
图3为血清中和阴道样品中中和抗体的滴度比较示意图。
图4为免疫后第14天直肠黏膜部位IgA阳性细胞数比较示意图。
图5为免疫后脾脏细胞CCR10+细胞比例比较示意图。
图6为攻毒后第5天和第9天血清中细胞因子含量比较示意图。
图7为攻毒后小鼠疾病严重程度差异比较示意图。
图8为攻毒后小鼠神经根内病毒携带情况比较示意图。
具体实施方式
下面结合附图，详细说明本发明的一个具体实施例，但不对本发明的权利要求做任何限定。
如无特殊说明，以下实施例所涉及分子生物学试剂均为市售商品。
制备实施例1
1.目的基因的扩增：
在pcDNA3.1(+)(购自Invitrogen公司，下同)质粒载体上先后构建HSV-2 gD(HSV-2实验株为HG52株，购自英国皇家实验室LGC药物杂质标准品公司)(GenBank：Z86099.2)包膜糖蛋白基因和佐剂基因CCL28(Kai Hu.JOURNAL OF IMMUNOLOGY，Aug.2013，p.1935-1947)，其分子式分别为：pcDNA3.1(+)-Xba I-gD-Pme I，pcDNA3.1(+)-HindIII-CCL28-KpnI，分别命名为pgD(为含有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的pcDNA3.1(+)质粒)和pCCL28(为含有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的pcDNA3.1(+)质粒)，扩增目的片段的引物序列见表1。
表1构建pgD和pCCL28的引物序列表
2.质粒的构建
(1)酶切反应
将以上扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收PCR产物，回收的各DNA片段与pcDNA3.1(+)质粒载体分别用相应的限制性内切酶(购自NEB公司)进行双酶切，目的片段(质粒载体)酶切反应体系为：目的片段36μL(质粒载体2μL)，限制性内切酶1及限制性内切酶2各2μL，10×内切酶缓冲液5μL，BSA0.5μL，加水至总体积50μL；反应条件：37℃水浴3小时，酶切产物经1％的琼脂糖凝胶电泳分离。
(2)连接反应
切胶回收酶切的DNA片段，然后先后将目的片段按照步骤1所示分子式与载体pcDNA3.1(+)进行连接反应，反应体系为：目的片段15μL、载体2μL、10×连接酶缓冲液2μL、T4连接酶1μL(购自NEB公司)；反应条件：16℃水浴16小时。
(3)转化与验证：连接产物转化至E.co1i DH5α感受态菌株，转化条件：ddH2O 45μL、1M CaCl2 2.5μL、0.6M MgCl2 2.5μL、连接产物10μL；反应条件：冰浴40分钟、42℃热击1.5分钟、冰浴2分钟。转化产物涂布在氨苄青霉素抗性的LB平板上，挑取单菌落增菌培养、提取质粒后双酶切验证，经测序验证序列正确的质粒即为本发明滴鼻型DNA疫苗基本成分，即包含pgD(含有SEQ ID NO.1所示)和pCCL28(含有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列)。
应用实施例1滴鼻型HSV-2 DNA疫苗免疫效果研究与分析
1.质粒的扩大培养
将以上制备得到的DNA质粒pgD和pCCL28以及pcDNA3.1(+)空载体均重新转化E.coli DH5α，划线涂布在含有氨苄青霉素抗性的琼脂糖平板上，37℃培养16小时，挑取单菌落加入5mL的液体LB培养基，37℃、200rmp震摇培养16小时，然后按1∶100加入500mL预先配好已灭菌的有氨苄青霉素的2×YT液体培养基，37℃200rmp震摇培养20小时，用去内毒素质粒大量提取试剂盒(购自MACHEREY-NAGEL公司)提取质粒，最终溶解于不含内毒素的去离子水中，用紫外分光光度计测定DNA浓度，根据质粒的分子量分别计算出1mol抗原所需的质粒量，免疫前质粒用无菌生理盐水进行稀释，涡旋混匀，临用时配制。
2.免疫策略
滴鼻免疫按1μg/10μL pgD和3μg/15μL pCCL28的剂量滴鼻于SPF级6周龄BALB/c小鼠(购自北京华埠康公司)。滴鼻免疫小鼠每次操作均预先用无巴比妥麻醉，滴鼻质粒pgD用1％壳聚糖(购自Sigma)稀释预先滴鼻免疫小鼠，滴鼻3天后，佐剂质粒pCCL28与转染试剂(购自Polyplus-transfection)混合，再次滴鼻免疫小鼠，首次黏膜免疫结束，免疫两周后，重复以上操作，进行二次黏膜免疫。
同时设立肌肉注射对照组。肌肉注射免疫小鼠按(1μg pgD+3μg pCCL28)/40μL的剂量注射于SPF级6周龄BALB/c小鼠一条后腿的股四头肌中，并以100V、50ms电击3次，电极反向后再电击3次，促进质粒形式的DNA疫苗转染入肌肉细胞。以prime-boost的原则初次免疫注射两周后再加强免疫一次，两次免疫方法及剂量相同。
3.攻毒实验
1)攻毒前准备：于小鼠免疫后第49d攻毒，攻毒前5～7d皮下多点注射黄体酮(2mg/只)，攻毒时先用1％戊巴比妥钠(约20g体重的小鼠用1mg)麻醉，然后阴道感染的HSV-2实验株(同上)。
2)在未免疫小鼠上摸索攻毒剂量，最终选择100LD50的HSV-2病毒剂量进行疫苗研究。
4.实验分组设计
A.滴鼻(i.n.)实验组：(1μg pgD+3μg pCCL28)/15μL
B.肌肉注射(i.m.)对照组：(1μg pgD+3μg pCCL28)/40μL
C.阴性对照组：1μg/40μL pcDNA3.1(+)(i.m.)
或者1μg/10 μL pcDNA3.1(+)(i.n.)
D、阳性对照组：(1μg pgD+3μg pcDNA3.1(+))/40μL(i.m.)
(1μg pgD+3μg pcDNA3.1(+))/15μL(i.n.)
5.样品采集
于最后一次免疫后第14天采集血液、阴道样、脾脏、直结肠组织和神经根组织，分别用下述实验方法检测机体针对抗原产生的体液免疫、细胞免疫和黏膜免疫应答反应。
血清及阴道样：从小鼠眼外角处采集约250μL血液，于37℃放置1小时至血液凝集，6000rpm离心15分钟，于6小时内分装血清；用含蛋白酶抑制剂(购自Roche公司)的无菌PBS采集阴道灌洗液(100μL/只)，13000rpm离心5分钟，吸取上清留存，均保存于-80℃冰箱，备用，用于后续的ELISA实验、体外中和实验及流式细胞术。其中，血清样品于免疫后第14d采集，攻毒后第5d、9d及11d采集，详见图1。
脾细胞和肠系膜淋巴结细胞：小鼠第2次免疫14天颈部脱臼处死后，浸泡于75％的酒精中，约5分钟后，无菌采集小鼠的脾脏和肠系膜淋巴结，组织经Falcon 70μm滤网(购自BD Biosciences公司)研磨后收集脾细胞和肠系膜淋巴结细胞，用小鼠淋巴细胞分离液(购自北京达科为生物公司)分离及回收淋巴细胞(方法参见说明书)，最终用0.8mL含10％FBS和双抗的完全RPMI-1640培养基重悬、计数，用于后续的趋化实验及流式细胞术。
神经根：阴性对照组小鼠于死亡当天解剖并剪取骶骨神经根，存活小鼠于攻毒后第30天剪取神经根，用于实时荧光定量PCR检测HSV-2潜伏感染的情况。
6.研究方法
(1)间接ELISA实验
A、包被抗原：用PBS将原核表达并纯化的HSV-2 gD蛋白抗原稀释至浓度为2.0μg/mL包被ELISA 96孔板，每孔50μL，4℃放置14-16小时。
B、洗板：甩去抗原蛋白，用PBST清洗ELISA板3次，每次在吸水纸上拍干。
C、封闭：每孔加入300μL 1％BSA封闭液，37℃封闭1小时。
D、洗板：弃封闭液，洗板步骤B。
E、加待测样本(抗体)：加入3倍梯度倍比稀释的血清或阴道灌洗液(血清的起始稀释比例为1∶5000，阴道灌洗液的起始稀释比例为1∶10)，每孔50μL，37℃孵育1小时。
F、洗板：甩去待测样品，洗板同步骤B。
G、孵一抗：加入HRP标记的山羊抗小鼠IgG(H+L)抗体或生物素标记的山羊抗小鼠IgA，抗体用抗体稀释液稀释(1∶5000)，每孔50μL，37℃孵育1小时。每板设置不加样本的阴性对照。
H、洗板：甩去一抗，用PBST清洗ELISA板5次，每次在吸水纸上拍干。(再孵HRP标记的链霉素：测IgA时用此项，用抗体稀释液按1∶5000稀释，每孔50μL，37℃孵育0.5小时。洗板同步骤H。
I、显色及检测：加入TMB显色底物，每孔50μL，室温避光显色5分钟，加入终止液(2MH2SO4)，每孔50μL。立即使用酶标仪读取OD450及OD570(参比波长)的值。
J、分析数据：用Excel和GraphPad Software计算出抗体的终点滴度(End-pointtiter)。
K、抗体亚类的检测：除了检测血清中的IgG及阴道灌洗液的IgA抗体，按照SouthernBiotechnology公司和Invitrogen提供的抗体分型试剂盒说明书检测血清中的IgM、IgG1、IgG2a、IgG2b及IgG3抗体。
(2)体外中和实验
A、铺细胞：于检测前1天将Vero细胞以每毫升2～3×105个细胞接种于96孔细胞培养板，37℃、5％CO2孵育12～14h。
B、样本处理：血清样品置于56℃水浴60分钟以灭活补体，gD抗原的实验组血清初始浓度按照1∶20用无血清的DMEM稀释，后续以3倍梯度倍比稀释，共6个梯度，每个梯度做4个重复，每孔50μL。
C、稀释病毒：将待中和的HSV-2病毒用无血清的DMEM稀释至100TCID50/50μL，备用。
D、中和作用：稀释的HSV-2病毒与血清/阴道灌洗液的稀释液按1∶1混合，37℃、5％CO2孵育1小时。
E、加入细胞：将样本-病毒混合液100μL加入单层Vero细胞，补加100μL含2％FBS的DMEM，于37℃、5％CO2孵育与测定TCID50相同的时间，结束观察。
F、设立对照：同批实验设置未加病毒的阳性对照和0.1、1、10、100倍TCID50 HSV-2的阴性对照(每个稀释度4孔)，如实验结束时阳性对照孔和0.1、1倍TCID50的对照孔应未发生病变，而100TCID50孔必须发生细胞病变，实验成立，同时每批实验设置pcDNA3.1(+)实验组的免疫血清对照。
G、结果判定：样品的中和能力表示为抑制病毒复制活性。
(3)免疫组织化学分析
A、烤片：将切片置于75℃烤箱，烘烤约30min。
B、脱蜡及水化：将切片依次浸泡于100％二甲苯I、100％二甲苯II、无水乙醇、95％乙醇和70％乙醇中，各5min。
C、洗涤：切片用PBS浸泡洗涤3次，5min/次。
D、抗原修复：采用R&D Systems公司的Antigen retrieval agent-Basic(10×)抗原修复液稀释后浸泡切片，沸水浴30min，冷却切片。
E、洗涤：同步骤C。
F、灭活内源性过氧化物酶：用油性组化笔在组织周围画一防水圈。滴加3％H2O2溶液，室温放置10min。
G、洗涤：同步骤C。
H、加一抗：滴加山羊抗小鼠IgA抗体(1∶200稀释)覆盖组织，用含2％BSA、0.02％Tween20的PBS稀释，37℃孵育2h。
I、加二抗：选用美国GBI公司提供的山羊超敏二步法免疫组化检测试剂，按照试剂盒说明书操作。
J、洗涤：切片用含0.02％Tween20的PBS浸泡洗涤3次，5min/次。
K、显色：滴加DAB溶液避光显色，约10min，可在显微镜下观察显色程度。
L、终止反应：将切片直接浸泡于自来水容器中。
M、复染：滴加苏木素(购自中杉金桥公司)，2min后甩去染液，将切片浸泡于盐酸酒精的混合液(含1份盐酸，70％酒精100份)中分化。
N、脱水、透明：将染后的切片依次浸泡于70％乙醇、95％乙醇、无水乙醇、100％二甲苯II和100％二甲苯I中，各5min。
O、封片和镜检：于干燥后的组织切片上滴加中性树胶(购自上海标本模型厂)，加盖盖玻片，用40×100的放大倍数进行镜检及照相。
P、计数：在显微镜下对直结肠黏膜表面染成棕色的IgA+细胞进行计数，随机选取5个高倍视野进行计数，结果表示为均数±平均标准误(SEM)。
(4)趋化实验
新鲜分离的脾细胞经计数后，用2×106/500μL加于0.3μm孔径的Transwell 12孔板(购自Coming公司，货号：3402)的上室，用含有及不含有小鼠500ng/mL的CCL28蛋白(购自R&D Systems公司)的1.5mL RPMI-1640完全培养基加于Transwell的下室，每份样品做2个重复，将培养板置于37℃及含5％CO2的培养箱孵育2小时。取出Transwell的上室，吹打混匀下室中的细胞，用细胞计数板对迁移的细胞进行计数。迁移率＝实验组平均迁移的细胞/对照组平均迁移的细胞(实验组为含有CCL28蛋白；对照组为不含有CCL28蛋白)。
(5)细胞免疫的量效分析
于最后一次免疫后第14d采集小鼠的脾脏(n＝5只/组)，分离纯化后取等量的脾脏细胞(1×106个/组)，用CCR10(CCL28受体)的抗体标记，进行流式细胞术分析。计数各免疫组小鼠10000个脾细胞中CCR10+淋巴细胞数，实验结果来自于3次重复实验中的1次。
(6)攻毒后抗原特异性的Th1/Th2细胞免疫应答反应
A、采集标本：攻毒后第5天和第9天采集小鼠眼底血液，离心取上清。
B、操作步骤：用BD Biosciences公司的CBA试剂盒检测(货号：551287)，检测小鼠抗原特异的Th1/Th2细胞因子(含IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-5和TNF)，操作方法详见试剂盒说明书。
C、上机检测及分析：使用试剂盒自带的标准品，同时设立阴性对照。首先完成标准品及阴性对照的检测，然后依次进行样本的检测，检测数据使用BD公司提供的FCAPArrayv1.0分析软件进行处理，自动绘制标准曲线及计算出各细胞因子的含量。
(7)攻毒验证
免疫49天后对小鼠进行阴道感染HSV-2(HG52株)攻毒(毒株购自英国皇家实验室LGC药物杂质标准品公司)，攻毒前5天皮下多点注射黄体酮(2mg/只)，攻毒时先用1％戊巴比妥钠(如约20g体重的鼠用1mg)麻醉，然后阴道感染150LD50的HSV-2实验株10μL(PFU/mL＝2.2×107)。在攻毒后第5天采血，检测血清抗体反应情况(操作方法见5中的抗体分型分析)。另外15天内对小鼠的疾病症状进行评分(Natalie V，et al.JOURNAL OFVIROLOGY，May2011，p.5036-5047)：1级，无明显症状；1级，轻度发红；2级，可见红肿；3级，严重红肿；4级，溃烂和/或脱毛；5级，严重发病(任何小鼠疾病严重程度达到5级将进行安乐死)，比较实验组与其他组的疾病严重程度差异。
(8)荧光定量PCR
神经根用研磨棒组织混匀器于1.5mL Epp管内充分研磨，用QIAGEN公司的Blood DNA提取试剂盒提取病毒DNA，设计病毒DNA检测引物gG-F-356：5′-GCCTGCCGTCAGCCCATCCTCCT-3′，gG-R-508∶5′-TCGGCACCAGCAGGGAAGCATTT-3′，Taqmanprobe：5′-(FAM)CCTTCGGCAGTATGGAGGGTGTCGC(TAMRA)-3′，用TaKaRa公司的Premix Ex(Probe qPCR)进行扩增，反应体系参见说明书，用480II型实时荧光定量PCR仪进行荧光定量检测。
7.结果统计与分析
本研究依照重复、对照及随机的实验原则，数据以均数±标准差表示，用SPSS13.0软件分析数据，用GraphPad Prism 5.0软件进行绘图，采用单因素方差分析与Spearman等级相关分析，两两比较用LSD-t检验，以p＝0.05为显著水准。图中*表示p＜0.05、**表示p＜0.01、***表示p＜0.001，表示两组间统计学差异显著；NS表示两组间统计学差异不显著。
以下结果如未特别说明，均为最后一次免疫后第14天采集的样本的检测结果。
(1)抗体检测
血清和阴道灌洗液样品中gD特异性抗体的终点滴度的结果见表2、表3，滴鼻免疫的阴道样中IgA比阳性对照组高(p＜0.001)。因此，HSV-2滴鼻型DNA疫苗可以刺激机体产生高效率的黏膜免疫(IgA)，认为滴鼻实验组与阳性对照组间阴道样的IgA抗体滴度有显著性差异。其血清和阴道样中抗原特异性IgG及IgA的滴度比较见图2，i.m.代表肌肉注射，i.n.代表滴鼻。
另外检测中还发现滴鼻免疫小鼠在最后一次免疫后第5天产生的IgG和IgM的滴度比其他组高，并且抗体效价可以维持更长的时间，在第五天时滴鼻免疫小鼠产生的IgG和IgM分别为256401.25±66.51和467.98±11.02，肌肉注射的IgG和IgM分别为：197873.66±101.21和331.52土15.61。
表2免疫小鼠抗血清中抗原特异性抗体IgG和IgA的终点滴度
表3免疫小鼠抗阴道样中抗原特异性抗体IgG和IgA的终点滴度
(2)中和抗体效价的检测
由表4、5数据可知，与阳性对照组比较，滴鼻组阴道样品的中和抗体明显高于其他组(p＜0.001)，可得知滴鼻实验组DNA疫苗产生的抗血清及阴道样具有更强的中和能力。血清和阴道样品抗体中和能力的比较见图3。
表4HSV-2 gD组血清抗体的中和能力(％)
表5HSV-2 gD组阴道样抗体的中和能力(％)
(3)黏膜部位的IgA+浆细胞检测
如表6、图4所示，与阳性对照组(pgD+pcDNA3.1(+))相比，滴鼻组DNA疫苗能够明显地增加直肠黏膜部位的IgA+细胞(p＜0.001)，增高的比例与阴道黏膜部位样品中增加的IgA的抗体滴度相近，并且滴鼻组与肌肉注射组比较在增强黏膜免疫中表现出明显的差异(p＜0.001)。增加的IgA+细胞有利于增强黏膜免疫水平，黏膜免疫对HSV-2这类性传播疾病的预防更为重要。
表6直肠黏膜部位IgA阳性细胞数
(4)淋巴细胞免疫CCR10+细胞比例比较
趋化实验结果反映了次级淋巴组织中趋化因子受体阳性细胞百分比的情况，注射分子佐剂pCCL28使小鼠次级淋巴组织及器官内的CCR10+的免疫细胞增多。如表7、图5所示，向小鼠滴鼻和肌肉注射含趋化因子的DNA疫苗，其脾脏内趋化因子CCL28受体阳性的淋巴细胞比例增多，在某种程度上说明佐剂pCCL28增强了细胞免疫。
表7免疫后脾脏细胞CCR10+细胞比例比较
(5)抗原特异性的Th1/Th2细胞免疫应答反应
IFN-γ、TNF、IL-2是Th1细胞分泌的细胞因子，IL-4及IL5是Th2细胞分泌的细胞因子，前者的量表现了Th1细胞的功能，后者的量表现了Th2细胞的功能；Th1细胞主要调节细胞免疫反应，Th2细胞主要调节体液免疫反应。如表8、表9所示，实验组小鼠脾细胞产生的细胞因子比对照组有不同程度的增加，HSV-2滴鼻型DNA疫苗实验组在第5天即产生了相对较高的Th1/Th2免疫反应(p＜0.001)。攻毒后第5天和第9天抗原特异性的Th1/Th2细胞免疫应答比较见图6。
表8攻毒后第5天血清中抗原特异性细胞因子
表9攻毒后第9天血清中抗原特异性细胞因子
(6)攻毒后疾病严重程度分析
经过攻毒观察，滴鼻实验组和肌肉注射组小鼠在攻毒早期不会出现红肿反应，而阴性对照组小鼠早期的红肿率均较高，晚期脱毛率也较高(结果见表10)。攻毒后15天内小鼠疾病严重程度评分见图7。
表10攻毒后1-15天小鼠疾病严重程度评级
(7)神经根内携带病毒分析
用实时荧光定量PCR法检测骶神经根样品中的HSV-2，结果如图8所示，进入神经组织的HSV-2的病毒载量以pcDNA3.1组最高，其次是pgD+pcDNA3.1(+)组，滴鼻和肌肉注射的pgD+pCCL28组小鼠携带的病毒量显著比pgD+pcDNA3.1(+)组少(p＜0.001)，说明使用当前剂量佐剂pCCL28的gD DNA疫苗，可以在一定程度上有效地阻断HSV-2进入神经组织而建立潜伏感染，或者完全有效地清除了感染的病毒。
应用实施例2生殖道黏膜给药(i.vag.)型HSV-2 DNA疫苗治疗效果研究与分析
1.实验分组设计
A.阴性对照组：未免疫小鼠10只，攻毒后1μg/10μL pcDNA3.1(+)(i.vag.)给药，阴道攻毒方法同前
B.阳性对照组：未免疫小鼠10只，攻毒后第三天用(1μg pgD+3μg pcDNA3.1(+))/15μL(i.vag.)给药，阴道攻毒方法同前
C.实验组：未免疫小鼠10只，攻毒后第三天用(1μg pgD+3μg pCCL28)/15μL(i.vag.)给药，隔天使用一次，共使用5次(即第3、5、7、9、11天)，阴道攻毒方法同前
2.结果统计与分析
阴性对照组小鼠在第三天出现明显红肿，随后几天小鼠皮肤明显溃烂，至神经麻痹，攻毒后第13天死亡率100％；阳性对照组小鼠死亡率为50％；实验组小鼠于第三天开始用药，部分小鼠出现红肿消退，症状明显较阳性对照组轻，小鼠死亡率仅为30％，疾病严重程度也较阳性对照组好，因此该剂型的疫苗表现出了一定的保护效果。小鼠的疾病严重程度评价方法同上，结果见表11。
表11治疗后1～15天小鼠疾病严重程度评级
综上所述，本发明HSV-2 DNA疫苗经滴鼻免疫后能够诱发机体产生比肌肉注射型疫苗更强的IgA体液免疫、Th1/Th2型细胞免疫和黏膜免疫反应，产生的抗血清具有更强的中和能力，HSV-2滴鼻型DNA疫苗疫苗的免疫性反应和记忆性免疫反应均能更迅速地产生较高免疫反应，对小鼠表现出更为理想的保护效果。
此外，本发明HSV-2 DNA疫苗经黏膜施药后能明显降低HSV-2病毒感染性损伤程度，显著降低疾病死亡率，对阻断HSV-2传播和缩短病毒感染病程表现出一定促进作用，证明本发明疫苗经黏膜施药后具有较为理想的感染控制和疾病治疗效果。
可以理解的是，以上关于本发明的具体描述，仅用于说明本发明而并非受限于本发明实施例所描述的技术方案。本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换，以达到相同的技术效果；只要满足使用需要，都在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 无锡市第五人民医院
<120> 一种经黏膜使用的HSV-2 DNA疫苗及其制备方法和应用
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1182
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atggggcgtt tgacctccgg cgtcgggacg gcggccctgc tagttgtcgc ggtgggactc 60
cgcgtcgtct gcgccaaata cgccttagca gacccctcgc ttaagatggc cgatcccaat 120
cgatttcgcg ggaagaacct tccggttttg gaccagctga ccgacccccc cggggtgaag 180
cgtgtttacc acattcagcc gagcctggag gacccgttcc agccccccag catcccgatc 240
actgtgtact acgcagtgct ggaacgtgcc tgccgcagcg tgctcctaca tgccccatcg 300
gaggcccccc agatcgtgcg cggggcttcg gacgaggccc gaaagcacac gtacaacctg 360
accatcgcct ggtatcgcat gggagacaat tgcgctatcc ccatcacggt tatggaatac 420
accgagtgcc cctacaacaa gtcgttgggg gtctgcccca tccgaacgca gccccgctgg 480
agctactatg acagctttag cgccgtcagc gaggataacc tgggattcct gatgcacgcc 540
cccgccttcg agaccgcggg tacgtacctg cggctagtga agataaacga ctggacggag 600
atcacacaat ttatcctgga gcaccgggcc cgcgcctcct gcaagtacgc tctccccctg 660
cgcatccccc cggcagcgtg cctcacctcg aaggcctacc aacagggcgt gacggtcgac 720
agcatcggga tgttaccccg ctttatcccc gaaaaccagc gcaccgtcgc cctatacagc 780
ttaaaaatcg ccgggtggca cggccccaag cccccgtaca ccagcaccct gctgccgccg 840
gagctgtccg acaccaccaa cgccacgcaa cccgaactcg ttccggaaga ccccgaggac 900
tcggccctct tagaggatcc cgccgggacg gtgtcttcgc agatcccccc aaactggcac 960
atcccgtcga tccaggacgt cgcgccgcac cacgcccccg ccgcccccag caacccgggc 1020
ctgatcatcg gcgcgctggc cggcagtacc ctggcggcgc tggtcatcgg cggtattgcg 1080
ttttgggtac gccgccgcgc tcagatggcc cccaagcgcc tacgtctccc ccacatccgg 1140
gatgacgacg cgcccccctc gcaccagcca ttgttttact ag 1182
<210> 2
<211> 393
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atgcagcaag cagggctcac actcatggct gtggctgtgt gtgtggcttt tcaaacctca 60
gaagccatac ttcccatggc ctccagctgt tgcactgagg tgtctcatca tgtttccgga 120
agacttctgg aaagagtgag ttcatgcagc atccagagag ctgacgggga ctgcgacctg 180
gctgctgtca tccttcatgt taaacgtaga agaatctgca tcagcccgca caatcgtact 240
ttgaagcagt ggatgagagc ctcagaggta aagaagaatg gcagagaaaa cgtatgttct 300
gggaaaaaac aacccagcag gaaggacaga aaagggcaca ctacgagaaa gcacagaaca 360
cgtggaacac acaggcacga agcctctcgt tag 393
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gctgctctag aatggggcgt ttgacctc 28
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gcgtttaaac atcctctaag agggccg 27
<210> 5
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
cccaagctta tgcagcaagc agggctcac 29
<210> 6
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
cggggtacca cgagaggctt cgtgcctgt 29

Claims (10)

1.一种经黏膜使用的HSV-2 DNA疫苗，其特征在于：该疫苗包括pgD，pCCL28和免疫介质；所述pgD为包含HSV-2 gD包膜糖蛋白核苷酸序列的pcDNA3.1(+)质粒，所述pCCL28为包含CCL28核苷酸序列的pcDNA3.1(+)质粒；上述核苷酸序列均位于所述质粒的CMV启动子下游；所述疫苗经黏膜免疫或使用。
2.如权利要求1所述经黏膜使用的HSV-2 DNA疫苗，其特征在于：所述经黏膜免疫或使用包括但不限于：滴鼻免疫和经生殖道黏膜施药。
3.如权利要求1所述经黏膜使用的HSV-2 DNA疫苗，其特征在于：所述免疫介质为1％壳聚糖和转染试剂。
4.如权利要求1所述经黏膜使用的HSV-2 DNA疫苗，其特征在于：所述HSV-2 gD包膜糖蛋白核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述CCL28核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
5.权利要求1所述经黏膜使用的HSV-2 DNA疫苗的制备方法，其特征在于步骤如下：
(1)采用PCR法分别扩增HSV-2 gD包膜糖蛋白基因和CCL28基因，并引入酶切位点；
(2)酶切所述HSV-2 gD包膜糖蛋白基因和所述CCL28基因，分别连入真核表达载体质粒；
(3)将步骤(2)所得连接产物分别转化入E.coli DH5α感受态菌株，挑取单菌落扩大培养，提取质粒后用双酶切验证，经测序验证序列正确后即得所述pgD和所述pCCL28的质粒溶液；
(4)将步骤(3)所得质粒溶液与免疫介质预混，制备得到所述经黏膜使用的HSV-2 DNA疫苗。
6.如权利要求5所述经黏膜使用的HSV-2 DNA疫苗的制备方法，其特征在于：扩增所述HSV-2 gD包膜糖蛋白基因的上游引物序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物序列如SEQ IDNO.4所示；扩增所述CCL28基因的上游引物序列如SEQ ID NO.5所示，扩增所述CCL28基因的上游引物序列如SEQ D NO.6所示。
7.如权利要求5所述经黏膜使用的HSV-2DNA疫苗的制备方法，其特征在于：步骤(2)所述真核表达载体质粒为pcDNA3.1(+)。
8.权利要求1～7任一项所述经黏膜使用的HSV-2 DNA疫苗在预防单纯疱疹病毒感染上的应用，其特征在于免疫程序如下：将所述pgD的质粒溶液用1％壳聚糖稀释后，与所述pCCL28的质粒溶液和所述转染试剂的混合液混合后，进行首次鼻黏膜免疫，免疫两周后，重复以上操作，进行二次鼻黏膜免疫。
9.权利要求8所述经黏膜使用的HSV-2 DNA疫苗在预防单纯疱疹病毒感染上的应用，其特征在于：所述鼻黏膜免疫的剂量为1μg pgD抗原和3μg pCCL28，免疫总体积为15μL，两次所述鼻黏膜免疫的剂量相同。
10.权利要求1～7任一项所述经黏膜使用的HSV-2DNA疫苗在治疗单纯疱疹病毒感染和相关疾病上的应用，其特征在于施药方法如下：将所述pgD的质粒溶液用所述1％壳聚糖稀释后，与所述pCCL28的质粒溶液和所述转染试剂的混合液混合，进行生殖道黏膜施药，所述pgD和所述pCCL28的剂量比为1∶3，隔天给药，每次给药剂量相同。
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RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20170524

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