CN103266090B

CN103266090B - Asia1型口蹄疫重组病毒及其制备方法和应用

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Publication number: CN103266090B
Application number: CN201310175323.XA
Authority: CN
Inventors: 郑海学; 杨帆; 刘湘涛; 靳野; 郭建宏; 曹伟军; 何继军; 张克山; 才学鹏
Original assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2012-07-30
Filing date: 2013-05-14
Publication date: 2014-10-29
Anticipated expiration: 2033-05-14
Also published as: CN102757942A; CN103266090A; CN103266091A; CN103266091B

Abstract

本发明涉及一种对宿主无致病性的Asia1型口蹄疫重组病毒及其制备方法和应用，拯救系统为基因工程构建的能够表达精确口蹄疫病毒基因组RNA的高效真核质粒，借此能够构建和制备口蹄疫重组病毒，使用上述质粒可以制备出高滴度和抗原匹配性好的疫苗株，既可以做为活疫苗，也可以制备成灭活苗，免疫猪和牛后可有效刺激机体产生免疫应答，并提供猪和牛体免疫保护作用，能够有效保护GV和GII流行毒株，免疫保护率能达100%，半数保护剂量（PD₅₀）在6.34～13.59，具有效价高、与流行毒株的抗原匹配性高、抗原谱广、免疫保护率高、对宿主猪和牛无致病力，且不形成血毒症，不排毒的优点，可用于我国及其周边国家Asia1型口蹄疫病毒的预防和控制。

Description

Asia1型口蹄疫重组病毒及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种用基因重组技术构建效价高、抗原匹配性好、对宿主猪和牛无致病性、在宿主机体免疫应答增强、免疫保护率高等为特征的Asia1型口蹄疫重组病毒及其制备方法，以及用该口蹄疫重组病毒开发Asia1型口蹄疫疫苗的方法，属于生物技术和生物制品领域。

背景技术

口蹄疫(Foot-and-mouth disease，FMD)是由FMD病毒(Foot-and-mouth disease virus，FMDV)引起的猪、牛和羊等偶蹄动物感染的一种急性、热性、高度接触性传染病。FMDV是一种单股正链RNA病毒，属小RNA病毒科(Picornaviridae)，口蹄疫病毒属(Aphthovirus)。该病毒分为7个血清型(A、O、C、Asia1、SAT1、SAT2、和SAT3型)。Asia1型口蹄疫病毒在西亚和东南亚以及我国流行较为广泛，尤其是2005年后，Asia1毒株在我国及周边国家广泛大流行，对畜产品经济造成了巨大的损失。目前，周边国家仍在流行Asia1口蹄疫，给我国带来巨大的潜在风险。

预防口蹄疫最有效、最经济的办法就是免疫接种。从流行毒中筛选新的疫苗种毒是最常见、快速的的一种方法，但不是每个流行毒都能驯化成为理想的疫苗种毒，往往是免疫原性或生产性能(收毒时间、产毒量和病毒稳定性)达不到生产所用疫苗株的要求，反向遗传技术改良是另一种理想的选择。而且用来生产疫苗筛选的毒株往往都是强毒，疫苗生产要制备大量的病毒用来作抗原，这种病毒对宿主具有很强的毒力和致病性，在生产过程中带来很大的生物安全威胁。如2007年英国Pirbright和梅里亚散毒事件、1970-1980欧洲和1977-1994年阿根廷暴发的口蹄疫都属于散毒事件，均造成难以估量的损失。要想从根本上解除生物安全威胁，必须对疫苗毒株进行改造。

动物疫苗制品关键技术涉及疫苗毒种、抗原生产工艺、浓缩纯化、佐剂以及生产过程中的质量检验等。其中疫苗种毒决定疫苗研制是否成功的核心技术，没有好的疫苗种毒不可能生产出高品质的疫苗。国际通行的疫苗种毒筛选原则(问题)是：一是抗原谱对号，可对当前流行毒株有效保护；二是免疫原性强，可诱导动物产生足够强的免疫应答反应，产生坚强的免疫力；三是生产性能好，疫苗候选毒株具有病变时间短、滴度高和病变稳定等较好的生产性能，可用于工业化生产。从流行毒株筛选疫苗种毒是最常见和最能快速见效的一种方法，直接解决了抗原谱对号的问题。但对另外两个问题，免疫原性和生产性能问题，仍然要试验来证明。而现实情况是，并不是每一个流行毒株都能驯化成理想的疫苗种毒，往往是因为流行毒株自然属性的原因，导致免疫原性或生产性能不符合要求，前功尽弃。如2007年的O型变异毒株和2009年A型口蹄疫武汉流行毒株，实验表明该毒株细胞病变时间不稳定、滴度低，达不到生产要求，一时无高效疫苗可用。这对灭活苗种毒的筛选与改良提出了新的研究课题，必须建立疫苗种毒分子改造(良)技术以解决这种困局。创新疫苗种毒筛选和改造技术平台，建立疫苗种毒制备和更新的长效机制十分急迫。病毒反向遗传技术的成熟为我们提供了解决疫苗种毒制备的新方法。通过反向遗传技术实现对病毒基因的改造和修饰，能够人工获得预期生物特性的毒株，可以获得改良疫苗种毒的生产性能、抗原匹配性、免疫应答能力等特征，并可以与周边或其他国家流行而我国未流行的毒株迅速配型，也可以尽量减少和避免流行毒株驯化环节带来负面影响。不仅改变了疫苗毒筛选驯化技术受病毒自然属性制约大、费时费力、成功率低的缺陷，可以实现更为主动有效的疫苗毒株构造和改良，实现了口蹄疫灭活疫苗毒种制备工艺的革新，对整体提升疫苗品质和效力具有重大意义。

疫苗种毒改良不仅能够满足上述要求，还可以从根本上降低或消除生物安全性威胁。传统疫苗种毒对宿主具有很强的毒力和致病性，在生产过程中带来很大的生物安全威胁。尽管目前我国生产口蹄疫疫苗需要生物安全级别的GMP车间，具有较好的硬件设施保障安全生产，但并不能从根本上排除生物安全风险，且全球出现过多起散毒事件，带来巨大的经济损失和声誉影响。要想从根本上解除生物安全威胁，必须对疫苗毒株进行改造，获得毒力降低或者没有毒力的疫苗毒株，利用这样毒株生产大大降低或消除生物安全风险。

Asia1型口蹄疫可以分为七个群，其中，我国流行GV和GII毒株，通过免疫交叉攻毒实验表明，GV毒株能够有效保护GV和GII流行毒株，而GII毒株疫苗对GII流行毒株很好保护，而对GV不能有效保护。因此，利用筛选的GV毒株作为抗原骨架进行致病性改造，从疫苗毒种源头技术入手，以提供一种提高病毒效价、消除对猪和牛致病力、提高其抗原匹配性、抗体应答和交叉免疫保护率高等特征的疫苗株，并用该毒株生产Asia1型口蹄疫疫苗。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的不足而提供一种Asia1型口蹄疫重组病毒及其制备方法和应用，该病毒对BHK-21的效价是7.50～8.77TCID₅₀/mL，对牛和猪大剂量(5×10⁷TCID₅₀)肌肉注射和喷雾攻毒，猪和牛都无临床症状，没有形成血毒症。用该毒株免疫猪和牛，能够诱导早期免疫应答，在第三天抗体水平能够达1∶45以上，细胞免疫和天然免疫能够有效应答，交叉攻毒实验表明，利用该毒株制备的疫苗对GV和GII流行毒株能够交叉保护，全剂量100％保护，半数保护剂量(PD50)在6.34～13.59。该疫苗种毒是一种生物安全性更高的疫苗毒株，用该毒株制备的疫苗可用于我国及其周边国家Asia1型口蹄疫病毒的预防和控制。

本发明的上述目的是通过如下技术方案予以实现的：

一种Asia1型口蹄疫重组病毒，其特征在于：该Asia1型口蹄疫重组病毒在BHK-21细胞上具有高滴度、与流行病毒的抗原匹配性高，对猪和牛均没有致病性，并且不形成血毒症，能够产生较强的体液免疫应答和细胞免疫应答，具有免疫交叉保护性，该Asia1型口蹄疫重组病毒的抗原核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示。

一种所述的Asia1型口蹄疫重组病毒的制备方法，其特征在于：

(1)、Asia1型口蹄疫重组病毒感染性克隆的构建，以O型口蹄疫病毒的拯救系统为骨架，通过AflII和ClaI限制性内切酶，将含有部分L和P12A基因的序列用Asia1/HN/06毒株相应基因SEQ ID NO：2替换，得到prAsia1-FMDV的重组质粒；所用Asia1/HN/06毒株是2006年4月分离于河南周口，经BHK-21传代培养10代，保藏于农业部兽医局指定保存单位：国家口蹄疫参考实验室；使用RNAeasy Mini Kit提取Asia1/HN/06毒株的总RNA，用引物oligNot I反转录合成病毒第一链cDNA，以合成的第一链cDNA为模板，用引物Asia1P12A-F和Asia1P12A-R扩增获得Asia1/HN/06毒株部分L和P12A的基因片段，上述三条针对ASIA1/HN/06株的特异性引物分别是：

oligNot I：5′-ttttctagagcggccgct₃₈-3′

Asia1P12A-F：5′-ttttccttaagggacaagaacatgctgtgtttgcctgtgt-3′

Asia1P12A-R：5′-actcacatcgatgtcaaagtgaaacctcc-3′，

在以上的特异性引物中，扩增Asia1/HN/06毒株部分L和P12A基因，基因序列为SEQ ID NO：2，所用上游引物Asia1P12A-F中含AflII限制性酶切位点；下游引物Asia1P12A-R中含下划线部分的ClaI限制性酶切位点，用上述特异性引物进行扩增，得到Asia1/HN/06毒株部分L和P12A基因片段，大小为3582bp，构建50μL反应体系，扩增条件为：94℃5min，94℃30s，57℃30s，72℃3min30s，go to 2，35个循环，72℃10min，PCR扩增产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳核实后进行纯化回收并送交测序，获得上述基因片段的DNA；prO/CHA/99是本实验室前期构建的含有O/CHA/99毒株全长cDNA的质粒，其中，O/CHA/99毒株是O型口蹄疫毒株，1999年分离于中国香港，现保存于国家口蹄疫参考实验室，prO/CHA/99质粒组成是在病毒基因组5′端上游含人巨细胞病毒RNA聚合酶II启动子及编码牛生长素多聚苷酸化信号的修饰剪切序列，在其两者间含鼠源RNA聚合酶I启动子；在病毒基因组3′端下游含鼠源聚合酶终止子I和聚合酶终止子II序列；及嵌合在O型口蹄疫病毒O/CHA/99全长cDNA基因组两端的榔头锤酶和丁型肝炎酶的核心序列，其中丁型肝炎酶共有88个核糖核酸，自我剪切修饰位点在5′末端G处；榔头锤酶核心序列共有58个核糖核酸，自我剪切修饰位点在3′末端C处，将含O型口蹄疫病毒O/CHA/99基因组的感染性克隆转染至受体细胞中，通过RNA聚合酶II启动子和RNA聚合酶I启动子调控元件分别转录包装出病毒RNA前体，再经HamRz和HdvRz的修饰剪切产生具有感染性的病毒RNA，将O型口蹄疫病毒O/CHA/99株拯救系统的质粒prO/CHA/99与上述得到的Asia1/HN/06毒株部分L和P12A片段，分别用AflII和ClaI双酶切后，连接转化至JM109感受态细胞中，测序鉴定阳性克隆，获得含Asia1/HN/06毒株部分前导蛋白L和结构蛋白P12A的重组质粒，将重组质粒命名为prAsia1-FMDV；

对猪和牛无致病性的Asia1型口蹄疫重组病毒的感染性克隆构建方法，

①Asia1型口蹄疫重组病毒自然受体识别位点RGD突变成RSD，其感染性克隆构建过程是：将用引物Asia1P12A-F和Asia1P12A-R扩增获得Asia1/HN/06毒株部分L和P12A的基因片段，基因序列为SEQ ID NO：2，与pMD20-T载体4℃连接过夜，连接产物转化JM109感受态细胞，测序鉴定阳性克隆，获得重组质粒命名为pMD20-Asia1P12A；以鉴定正确的重组质粒pMD20-Asia1P12A为模板，用磷酸化突变引物S-P和RSD-P进行PCR扩增，上述5′磷酸化的点突变引物分别是：

S-P：5′-cacgcagagtgagcaaccggctgcc-3′

RSD-P：5′-cgagggcggcaagatcgctacgccgcgagg-3′，

在以上的磷酸化的点突变引物中，将Asia1/HN/06毒株部分L和P12A基因序列中受体结合位点RGD点突变为RSD，用该引物进行平末端扩增，纯化回收PCR产物，经室温连接5min后，转化大肠杆菌JM109，测序鉴定点突变后的阳性克隆，将得到的定点突变重组质粒命名为pMD20-Asia1P12A-RSD；

将O型口蹄疫病毒O/CHA/99株拯救系统的质粒prO/CHA/99与上述得到的Asia1/HN/06毒株部分L和P12A片段上受体结合位点经过点突变后的pMD20-Asia1P12A-RSD，分别用AflII和ClaI双酶切，基因序列为SEQ ID NO：1，连接转化至JM109感受态细胞中，测序鉴定阳性克隆，获得含Asia1/HN/06毒株受体结合位点突变为RSD后的部分L和P12A的重组质粒，将重组质粒命名为prAsia1-RSD-FMDV；

②Asia1型口蹄疫重组病毒L基因SAP区域(SAF-A/B，Acinus，and PIAS)突变，其感染性克隆构建过程是：将表达质粒pCDNA3.1(+)用特异性引物进行扩增，得到含有PacI和AflII酶切位点的基因片段，上述引物分别是：

pCD-AflII-ApaI-F：5′-ttttccttaaggggcccgtttaaacccgctgat-3′

pCD-PacI-NheI-R：5′-cttacttaattaagctagccagcttgggtctcccta-3′

同时将O型口蹄疫病毒O/CHA/99株拯救系统的质粒prO/CHA/99，经PacI和AflII双酶切后，与上述得到的含有PacI和AflII酶切位点的pCDNA基因片段连接转化至JM109感受态细胞中，测序鉴定阳性克隆，获得含O/CHA/99株5’UTR和部分L基因的重组质粒，将重组质粒命名为pCD-OL；以鉴定正确的重组质粒pCD-OL为模板，用磷酸化突变引物F-P和SAP-P进行PCR扩增，上述5′磷酸化的点突变引物分别是：

F-P：5′-gacctcacagggcttgaactgcacga-3′

SAP-P：5′-ctccgcctgcttggcggctgcaagcgtg-3′，

在以上的磷酸化的点突变引物中，将O/CHA/99株L基因中SAP区域进行突变，用此对引物进行平末端扩增，纯化回收PCR产物，经室温连接5min后，转化大肠杆菌JM109，测序鉴定点突变后的阳性克隆，将得到的定点突变重组质粒命名为pCD-OL-SAP；

将已获得含Asia1/HN/06毒株受体结合位点突变为RSD的重组质粒prAsia1-RSD-FMDV与上述得到的O/CHA/99株L基因中SAP区域进行突变后的重组质粒pCD-OL-SAP，分别用PacI和AflII双酶切后，连接转化至JM109感受态细胞中，测序鉴定阳性克隆，获得含Asia1/HN/06毒株受体结合位点突变为RSD并且L基因中SAP区域突变的重组质粒，将重组质粒命名为prAsia-RSD-SAP-FMDV；

(2)、Asia1型口蹄疫重组质粒转染敏感细胞，具体为BHK-21细胞或IBRS-2细胞，拯救获得所述Asia1型口蹄疫重组病毒。

Asia1型口蹄疫重组病毒是用所述重组质粒prAsia1-FMDV，直接转染口蹄疫病毒敏感的细胞，BHK-21细胞或IBRS-2细胞，得到与流行毒株抗原匹配的Asia1型口蹄疫重组病毒。

(1)、把Asia1型口蹄疫病毒P12A基因上的自然受体识别位点RGD突变成RSD，将重组质粒prAsia1-RSD-FMDV直接转染口蹄疫病毒敏感的细胞，BHK-21细胞或IBRS-2细胞，得到的重组毒株rAsia1-RSD-FMDV对猪没有致病性；

(2)、在重组质粒prAsia1-RSD-FMDV的基础上，进一步对L基因的SAP进行突变，将重组质粒prAsia-RSD-SAP-FMDV直接转染口蹄疫病毒敏感的细胞，BHK-21细胞或IBRS-2细胞，得到重组病毒rAsia-RSD-SAP-FMDV对猪和牛都没有致病性，并且不形成血毒症，不排毒，能够产生较强免疫应答。

一种利用所述的Asia1型口蹄疫病毒来制备消除致病性的Asia1型口蹄疫重组病毒的疫苗，其特征在于：

培养的Asia1型口蹄疫重组病毒用二乙烯亚胺(Binary ethy1enimine，BEI)灭活，浓缩纯化后与ISA206佐剂以1∶1体积比混合制备疫苗，免疫猪和牛后可有效刺激机体产生强抗体应答，产生早期免疫应答，并提供猪和牛体免疫保护作用，能够有效保护GV和GII流行毒株，免疫保护率能达100％，半数保护剂量(PD50)在6.34～13.59。

本发明具有如下积极效果：

本发明借助已经建立的高效反向遗传操作方法，通过相关基因的改造，来构建病变时间短、病毒滴度高、抗原匹配性高、对宿主猪和牛的致病力消除的毒株，解决筛选疫苗种毒的生产和驯化以及疫苗生产使用过程中生物安全性的问题，以此为疫苗毒株框架，为构建高效疫苗种毒奠定基础。

依据口蹄疫分子流行病学，利用反向遗传学进行FMD疫苗株多种表型改善和提高。

1)、在病毒整体水平上提高了FMD疫苗株的生产性能(如病毒滴度和病变时间)，本发明制备的毒株能够提高滴度，降低了抗原制备成本。将流行毒株Asia1/HN/06部分L和P12A基因进行替换并拯救出重组病毒rAsia1-FMDV，测定病毒生物学特征，结果表明，该重组病毒rAsia1-FMDV具有病变时间短、滴度高的特点，重组病毒rAsia1-FMDV在第6代，病变时间降为12h，从第6代至第10代完全病变时间稳定在11h左右。rAsia1-FMDV的病毒滴度(TCID50)从第6代至第10代病毒滴度稳定在7.5以上。

2)、实现提高疫苗毒株抗原匹配性和免疫应答性，本发明构建的疫苗毒株的结构蛋白与流行毒株一致，抗原匹配性完全匹配，提高了疫苗株与流行毒株的针对性。

3)、实现提高疫苗毒株抗原谱广的特点，通过免疫交叉攻毒实验表明，GV毒株能够有效保护GV和GII流行毒株，而GII毒株疫苗对GII流行毒株很好保护，却对GV不能有效保护。因此，本研究利用筛选的GV毒株作为抗原骨架进行重组，保障了该重组疫苗株的抗原广谱性。

4)、与流行毒株制备的疫苗相比，得到重组毒株rAsia1-RSD-SAP-FMDV对猪和牛都没有致病性，而且不形成血毒症，不排毒，能够产生较强的免疫应答和天然免疫应答。

5)、本发明的重组毒株rAsia1-RSD-SAP-FMDV直接免疫猪和牛，都能够产生强免疫应答和天然免疫应答，并能够产生较早的免疫保护，保护率达100％。也有望产生较长的免疫持续期，增强疫苗田间防控效果。

6)、按照灭活疫苗规程制备的灭活疫苗，也能够产生较早的免疫应答，保护率达100％。

7)、并且根据周边国家疫情，借助本发明技术，可以建立有针对性的疫苗战略储备库，实现无需流行毒株(不动活毒)的疫苗毒株构建方式。

8)、本发明技术不仅改变了疫苗毒筛选驯化技术受病毒自然属性制约大、费时费力、成功率低的缺陷，可以实现更为主动有效的疫苗毒株构建，实现了口蹄疫灭活疫苗毒种制备工艺的革新，降低或消除了生物安全性威胁，具有重大应用价值，提升疫苗毒种技术工艺，属于国际领先水平。

附图说明

图1为实例1中口蹄疫病毒Asia1/HN/06株部分L和P12A基因片段的电泳图。

图2为实例2中口蹄疫病毒拯救系统prO/CHA/99。

图3为实例2中Asia1型口蹄疫病毒重组质粒prAsia1-FMDV的构建策略。

图4为实例3中拯救重组病毒rAsia1-FMDV、rAsia1-RSD-FMDV、rAsia1-RSD-SAP-FMDV感染BHK-21细胞后引起的CPE。

具体实施方式

本发明结合国家口蹄疫参考实验室近年来的毒株积累和对其全基因组序列的分析研究，将我国Asia1型口蹄疫毒株Asia1/HN/06的部分L和P12A基因，通过限制性内切酶位点与由建立的O型口蹄疫病毒O/CHA/99株的拯救系统中相应核苷酸序列进行替换，得到一种Asia1型口蹄疫病毒重组质粒prAsia1-FMDV，所述特异性核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。在该重组质粒的基础上，将其自然的受体结合位点RGD突变成RSD，其基因序列为SEQ ID NO：1，同时将L基因的SAP区域进行点突变，得到了重组质粒prAsia1-RSD-SAP-FMDV，经拯救得到重组病毒rAsia1-RSD-SAP-FMDV，该Asia1型口蹄疫重组病毒具有滴度高、与流行病毒的抗原匹配性高，对猪和牛均没有致病性，并且不形成血毒症，能够产生较强的体液免疫应答和细胞免疫应答，具有免疫交叉保护性，其抗原核苷酸序列为SEQ IDNO：1所示。

一种Asia1型口蹄疫重组病毒的制备方法，具体如下：

1、制备Asia1型口蹄疫重组毒株的反向遗传操作系统，该系统包含：(1)真核转录质粒，该转录质粒能够表达所述重组Asia1型口蹄疫病毒全长基因cDNA序列，质粒在病毒全长cDNA两侧嵌有核酶(hammerhead ribozyme(HamRz)和hepatitis delta ribozyme(HdvRz))，在其外侧的5′端添加有聚合酶(polymerase，pol)I和pol II转录启动子，在3′端有终止子；

(2)Asia1型口蹄疫重组质粒prAsia1-FMDV转染敏感细胞，优选BHK-21细胞或IBRS-2细胞。所述Asia1型口蹄疫重组病毒是用上述拯救系统拯救获得的，该质粒可以在适应细胞、乳鼠和猪体内拯救出相应病毒。

Asia1型口蹄疫重组病毒的感染性克隆，是以O型口蹄疫病毒疫苗株的拯救系统为骨架，通过AflII和ClaI限制性内切酶，把含有部分L和P12A基因的序列用Asia1/HN/06毒株的相应基因进行替换，得到prAsia1-FMDV的重组质粒。

2、使用所述重组质粒，直接转染口蹄疫病毒敏感的细胞，优选BHK-21细胞或IBRS-2细胞，得到与流行毒株抗原匹配的Asia1型口蹄疫重组病毒，该方法制备的Asia1型口蹄疫重组病毒，命名为rAsia1-FMDV。

3、上述Asia1型口蹄疫病毒重组质粒prAsia1-FMDV的构建方法，是采用特异性引物对Asia1型口蹄疫毒株Asia1/HN/06的基因组进行扩增，得到部分前导蛋白L和结构蛋白P12A基因，利用特异的AflII和ClaI酶切位点对O型口蹄疫病毒的质粒prO/CHA/99进行基因替换，构建得到Asia1型口蹄疫病毒重组质粒命名为prAsia1-FMDV，转染BHK-21细胞第2代48h出现致细胞病变(CPE)，连续传代后经RT-PCR、间接免疫荧光、反向间接血凝和乳鼠致病力实验等均检测到了拯救的FMDV。经生物学特性测定后，与流行毒相比重组病毒rAsia1-FMDV具有病变时间短，病毒滴度高的特点。

4、一种Asia1型口蹄疫重组病毒消除致病性的重组质粒制备方法，(1)利用磷酸化的特异性引物将Asia1型口蹄疫病毒株的P12A基因上自然的受体结合位点RGD突变成RSD，利用特异的AflII和ClaI酶切位点对O型口蹄疫病毒的质粒prO/CHA/99进行基因替换，构建得到受体结合位点为RSD的Asia1型口蹄疫病毒重组质粒，命名为prAsia1-RSD-FMDV。转染BHK-21细胞第2代48h出现致细胞病变(CPE)，连续传代后经RT-PCR、间接免疫荧光、反向间接血凝和乳鼠致病力实验等均检测到了拯救的FMDV。经生物学特性测定后，与流行毒相比重组病毒rAsia1-RSD-FMDV具有病变时间短，病毒滴度高，对猪无致病性的特点。(2)利用特异性的磷酸化引物对O型口蹄疫病毒的骨架质粒prO/CHA/99上L基因的SAP区域进行点突变，利用PacI和AflII酶切位点替换已构建的含有受体结合位点突变为RSD的重组质粒prAsia1-RSD-FMDV的相应基因，构建得到SAP区域突变并且受体结合位点为RSD的Asia1型口蹄疫病毒重组质粒，命名为prAsia1-RSD-SAP-FMDV。转染BHK-21细胞第4代48h出现致细胞病变(CPE)，连续传代后经RT-PCR、间接免疫荧光、反向间接血凝和乳鼠致病力实验等均检测到了拯救的FMDV。经生物学特性测定后，与流行毒相比重组病毒rAsia1-RSD-FMDV具有对宿主猪和牛均无致病性的特点。

下面结合具体实施实例对本发明做进一步地描述，但具体实施并不对本发明做任何限定。

下列实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规条件，如《精编分子生物学实验指南》(F.M.奥斯伯，R.E.金斯顿，J.G.赛德曼等主编，马学军，舒跃龙译，北京：科学出版社，2004)中所述的方法进行。

实施例1.Asia1型口蹄疫病毒Asia1/HN/06毒株部分L和P12A基因序列的获得。

本发明人所用Asia1/HN/06毒株由农业部兽医局指定国家口蹄疫参考实验室保藏，公众可通过农业部兽医局批示的委托函获得。使用RNAeasy Mini Kit(Qiagen公司)提取Asia1/HN/06毒株的总RNA，用引物oligNot I反转录合成病毒第一链cDNA，以合成的第一链cDNA为模板，用引物Asia1P12A-F和Asia1P12A-R扩增获得Asia1/HN/06毒株的基因序列。上述三条针对Asia1/HN/06株的特异性引物分别是oligNot I(5’-ttttctagagcggccgct38-3’)、Asia1P12A-F(5′-ttttccttaagggacaagaacatgctgtgtttgcctgtgt-3′)和Asia1P12A-R(5′-actcacatcgatgtcaaagtgaaacctcc-3′)。在以上的特异性引物中，扩增Asia1/HN/06毒株部分L和P12A基因序列所用上游引物Asia1P12A-F中含AflII限制性酶切位点；下游引物Asia1P12A-R中含ClaI限制性酶切位点(下划线部分)。用上述特异性引物进行扩增，得到Asia1/HN/06毒株部分L和P12A基因片段，大小为3582bp(图1)，与预期大小相符。扩增所用适合长片段扩增、性能优良的Premix LA 2.0(TaKaRa公司)DNA聚合酶，按照产品说明书构建50μL反应体系，扩增条件为：94℃5min，94℃30s，57℃30s，72℃3min30s，go to 2，35个循环，72℃10min，PCR扩增产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳核实后进行纯化回收并送交测序，获得上述基因片段的DNA；扩增产物的电泳结果如图1所示。

实施例2.Asia1型口蹄疫重组病毒感染性克隆的构建。

在已建立的O型口蹄疫病毒O/CHA/99株拯救系统prO/CHA/99的框架基础上，O型口蹄疫毒株拯救系统prO/CHA/99如图2所示：在病毒基因组5`端上游含人巨细胞病毒RNA聚合酶II启动子(Human cytomegalovirus RNA polymerase II promoter，PII)及编码牛生长素多聚苷酸化信号的修饰剪切序列，在其两者间含鼠源RNA聚合酶I启动子(Mouse RNA polymerase I promoter，PI)；在病毒基因组3`端下游含鼠源聚合酶终止子I(Murine terminator I，T_I)和聚合酶终止子II(Murine terminator II，TII)序列；及嵌合在O型口蹄疫病毒O/CHA/99全长cDNA基因组两端的榔头锤酶(Hammerhead ribozyme，HamRz)和丁型肝炎酶(Hepatitis delta ribozyme，HdvRz)的核心序列，其中丁型肝炎酶共有88个核糖核酸，自我剪切修饰位点在5`末端G处；榔头锤酶核心序列共有58个核糖核酸，自我剪切修饰位点在3`末端C处。将含O型口蹄疫病毒O/CHA/99基因组的感染性克隆转染至受体细胞中，通过RNA聚合酶II启动子和RNA聚合酶I启动子调控元件分别转录包装出病毒RNA前体，再经HamRz和HdvRz的修饰剪切产生具有感染性的病毒RNA。

将O型口蹄疫病毒O/CHA/99株拯救系统的质粒prO/CHA/99与实例1得到的部分L和P12A片段分别用AflII和ClaI双酶切后，连接转化至JM109感受态细胞中，测序鉴定阳性克隆，获得含Asia1/HN/06毒株部分前导蛋白L和结构蛋白P12A的重组质粒，将重组质粒命名为prAsia1-FMDV(图3)。

实施例3.Asia1型口蹄疫重组病毒消除致病性的重组质粒制备方法。

(1)利用磷酸化的特异性引物将Asia1型口蹄疫病毒株的P12A基因上自然的受体结合位点RGD突变成RSD。将用引物Asia1P12A-F和Asia1P12A-R扩增获得Asia1/HN/06毒株部分L和P12A的基因片段与pMD20-T载体4℃连接过夜，连接产物转化JM109感受态细胞，测序鉴定阳性克隆，获得重组质粒命名为pMD20-Asia1P12A。以鉴定正确的重组质粒pMD20-Asia1P12A为模板，用磷酸化突变引物S-P和RSD-P进行PCR扩增，上述5′磷酸化的点突变引物分别是：S-P(5′-cacgcagagtgagcaaccggctgcc-3′)和RSD-P(5′-cgagggcggcaagatcgctacgccgcgagg-3′)，在以上的磷酸化的点突变引物中，将Asia1/HN/06毒株部分L和P12A基因序列中受体结合位点RGD点突变为RSD，用该引物进行平末端扩增，纯化回收PCR产物，经室温连接5min后，转化大肠杆菌JM109，测序鉴定点突变后的阳性克隆，将得到的定点突变重组质粒命名为pMD20-Asia1P12A-RSD。

将O型口蹄疫病毒O/CHA/99株拯救系统的质粒prO/CHA/99与上述得到的Asia1/HN/06毒株部分L和P12A片段上受体结合位点经过点突变后的pMD20-Asia1P12A-RSD，分别用AflII和ClaI双酶切后，连接转化至JM109感受态细胞中，测序鉴定阳性克隆，获得含Asia1/HN/06毒株受体结合位点突变为RSD后的部分L和P12A的重组质粒，将重组质粒命名为prAsia1-RSD-FMDV。

(2)利用特异性的磷酸化引物对O型口蹄疫病毒的骨架质粒prO/CHA/99上L基因的SAP区域进行点突变，将表达质粒pCDNA3.1(+)用特异性引物进行扩增，得到含有PacI和AflII酶切位点的基因片段，上述引物分别是：pCD-AflII-ApaI-F(5′-ttttccttaaggggcccgtttaaacccgctgat-3′)和pCD-PacI-NheI-R(5′-cttacttaattaagctagccagcttgggtctcccta-3′)，同时将O型口蹄疫病毒O/CHA/99株拯救系统的质粒prO/CHA/99，经PacI和AflII双酶切后，与上述得到的含有PacI和AflII酶切位点的 pCDNA基因片段连接转化至JM109感受态细胞中，测序鉴定阳性克隆，获得含O/CHA/99株5’UTR和部分L基因的重组质粒，将重组质粒命名为pCD-OL。以鉴定正确的重组质粒pCD-OL为模板，用磷酸化突变引物F-P和SAP-P进行PCR扩增，上述5′磷酸化的点突变引物分别是：F-P(5′-gacctcacagggcttgaactgcacga-3′)和SAP-P(5′-ctccgcctgcttggcggctgcaagcgtg-3′)，在以上的磷酸化的点突变引物中，将O/CHA/99株L基因中SAP区域进行突变，用此对引物进行平末端扩增，纯化回收PCR产物，经室温连接5min后，转化大肠杆菌JM109，测序鉴定点突变后的阳性克隆，将得到的定点突变重组质粒命名为pCD-OL-SAP。

将已获得含Asia1/HN/06毒株受体结合位点突变为RSD的重组质粒prAsia1-RSD-FMDV与上述得到的O/CHA/99株L基因中SAP区域进行突变后的重组质粒pCD-OL-SAP，分别用PacI和AflII双酶切后，连接转化至JM109感受态细胞中，测序鉴定阳性克隆，获得含Asia1/HN/06毒株受体结合位点突变为RSD并且L基因中SAP区域突变的重组质粒，将重组质粒命名为prAsia1-RSD-SAP-FMDV。

实施例4.Asia1型口蹄疫重组病毒拯救。

用QIAGEN公司生产的 Plus Maxi Kit纯化制备由实例2和3得到的含Asia1型口蹄疫重组病毒全基因组cDNA的重组质粒prAsia1-FMDV，及受体位点突为RSD和L基因SAP区域进行点突变后的重组质粒prAsia1-RSD-FMDV，prAsia1-RSD-SAP-FMDV。待BHK-21单层生长至80％～90％时用于转染。用OPTI-MEMI培养基清洗细胞，在脂质体LipofectamineTM2000(Invitrogen公司)的介导下将4μg的重组质粒分别转染BHK-21细胞，将其在含有5％CO2的37℃培养箱中培养，同时设立脂质体对照和正常细胞对照。转染后4～6h吸去细胞上清，加入MEM培养基，继续培养，观察细胞病变的出现情况；待细胞出现90％左右病变时收获病毒。反复冻融3次后再次接种BHK-21细胞，直到病毒能稳定地产生CPE，出现细胞变圆，成葡萄状分布，最终细胞崩解成碎片。将Asia1型口蹄疫重组病毒命名为rAsia1-FMDV；将Asia1型口蹄疫病毒受体结合位点由RGD突变为RSD的重组病毒命名为rAsia1-RSD-FMDV；将Asia1型口蹄疫病毒受体结合位点由RGD突变为RSD并且L基因SAP区域突变的重组病毒命名为rAsia1-RSD-SAP-FMDV。在图4中，A：为拯救重组病毒rAsia1-FMDV感染BHK-21细胞出现的CPE的图片；B：为拯救重组病毒rAsia1-RSD-FMDV感染BHK-21细胞出现的CPE的图片；C：为拯救重组病毒rAsia1-RSD-SAP-FMDV感染BHK-21细胞出现的CPE的图片；D：为正常对照BHK-21细胞图片。

实施例5.拯救Asia1型口蹄疫重组病毒的鉴定。

5.1间接免疫荧光检测病毒抗原。

分别将转染后盲传至第2代的BHK-21细胞，-70℃反复冻融三次后，按一定比例接种至底部放置了载玻片的生长有BHK-21细胞的六孔板里(单层细胞生长至60％～70％)，置于含5％CO2的37℃培养箱中，24h后按常规方法做间接免疫荧光，一抗为Asia1型FMDV兔阳性血清，二抗为标记FITC羊抗兔IgG(Sigma公司)，同时设正常细胞对照。接种第2代细胞液的BHK-21细胞中可见绿色特异性荧光，而正常细胞对照无可见荧光产生，表明重组病毒感染的BHK-21细胞中有FMDV蛋白的表达。

5.2反向间接血凝鉴定试验

分别收集1ml在BHK-21细胞上传代出现CPE的时间趋于稳定的第9代拯救病毒，58℃40min灭活，将灭活后的病毒按1∶2做连续稀释(同时设空白对照和流行毒Asia1/HN/06的阳性对照)，每个稀释度取50μL加入96孔板中，再加入25μL FMDV抗体致敏化的绵羊红细胞，置微量混合器上振荡1～2min，加盖，室温放置2h后观察结果。当贴附于血细胞上的FMDV抗体与游离的抗原相遇时，形成抗原抗体凝集网络，绵羊红细胞也随之凝集，出现肉眼可见的血细胞凝集现象，从而根据细胞沉积情况判定结果。

结果显示，按1∶32稀释的rAsia1-FMDV，rAsia1-RSD-FMDV，rAsia1-RSD-SAP-FMD感染BHK-21细胞时均发生红细胞凝集，而未出现红细胞沉积；1∶32稀释的流行毒75％出现红细胞凝集，阴性对照样品出现红细胞完全沉积；反向间接血凝试验结果表明：引起BHK-21细胞病变的是FMDV。

实施例6.拯救Asia1型口蹄疫重组病毒的致病力试验。

6.1对乳鼠致病力试验。

将在BHK-21细胞分别传至第9代的拯救病毒rAsia1-FMDV，rAsia1-RSD-FMDV，rAsia1-RSD-SAP-FMDV和流行毒分别用PBS缓冲液10倍倍比稀释，各取10-5～10-9倍比稀释的病毒液经皮下接种2～4日龄乳鼠，每个稀释度各接种4只，接种剂量为200μL/只，连续观察8d。空白对照组4只乳鼠接种PBS缓冲液200μL/只，观察并记录乳鼠的死亡情况，用Karber法计算LD50。接种拯救病毒和流行毒的乳鼠在接种20h后，部分表现出呼吸困难、后肢麻痹和用镊子夹尾声音嘶哑等症状。48h后接种流行毒和拯救重组病毒的乳鼠陆续死亡，对照组乳鼠正常。最后根据统计结果，计算出拯救病毒rAsia1-FMDV的乳鼠LD50为10^-6.5～10^-7.33/0.2mL，rAsia1-RSD-FMDV的乳鼠LD₅₀为10^-8.77//0.2mL，rAsia1-RSD-SAP-FMDV的乳鼠LD₅₀为10^-6.67～10^-7.5/0.2mL，流行毒株Asia1/HN/06的乳鼠LD50为10^-7.0～10^-7.50/0.2mL。

6.2在BHK-21细胞上的致病力试验。

按照常规方法对BHK-21细胞进行消化，加入含10％胎牛血清的MEM细胞培养基，分装于28个2mL细胞培养瓶中，于37℃含有5％CO2的培养箱中培养，待细胞单层长到90％时备用。用MEM以10倍倍比稀释病毒液，将各稀释度(10^-3.0～10^-9.0)的病毒液分别加入2mL细胞培养瓶，每个稀释度4瓶，按10％接毒后37℃感作1h，用不含血清的MEM清洗细胞2～3次，加入不含血清的MEM，放入37℃含有5％CO2的培养箱中进行培养，观察3天，用Read-Muench氏法测定对BHK-21细胞的半数感染量(TCID50)。按照该法测定拯救病毒rAsia1-FMDV，rAsia1-RSD-FMDV，rAsia1-RSD-SAP-FMDV和亲本毒的滴度，最后计算出拯救病毒rAsia1-FMDV的TCID₅₀为10^-7.5/mL，rAsia1-RSD-FMDV的TCID₅₀为10^-8.77/mL，rAsia1-RSD-SAP-FMDV的TCID₅₀为10^-7.5/mL。流行毒株Asia1/HN/06的TCID₅₀为10^-7.33/mL。

6.3对猪和牛的致病力试验。

将BHK-21用含10％胎牛血清的MEM培养传代。按常规转瓶单层BHK-21传代细胞培养法制备拯救重组病毒rAsia1-FMDV，rAsia1-RSD-FMDV，rAsia1-RSD-SAP-FMDV，收获的病毒液即为病毒培养物，置于-40℃保存，重组毒分别采用喷雾和注射途径进行攻毒，攻毒剂量为107TCID50，猪肌肉注射2ml/头，牛舌部皮下注射2ml/头，同时设立流行毒株Asia1/HN/06对照组，连续观察10天，测量体温变化并观察记录发病情况。上述实验用猪和牛均购自非疫区，并经国家口蹄疫参考实验室生产的FMD液相阻断ELISA(LPB-ELISA)检测AsiaI型抗体均＜1∶4。FMD非结构蛋白3ABC-ELISA抗体检测为阴性。攻毒结果显示，rAsia1-FMDV经喷雾和注射途径攻毒后猪和牛最早从第2天开始出现临床症状；rAsia1-RSD-FMDV经喷雾和注射途径攻毒的猪不表现临床症状，而牛有一头未出现临床症状，并且致病性有所降低；rAsia1-RSD-SAP-FMDV通过不同途径攻毒后猪和牛均未出现临床症状，即对猪和牛均没有致病性，见表1。

表1重组毒株和流行毒株Asia1/HN/06致病力试验临床症状

-表示无临床症状

6.4重组病毒rAsia1-RSD-SAP-FMDV对猪和牛产生早期的免疫应答。

按照上述方法制备rAsia1-RSD-SAP-FMDV重组病毒，分别对猪进行肌肉注射2ml/头(5×10⁷TCID₅₀)，对牛进行舌部皮下注射2ml/头(5×10⁷TCID₅₀)，并于接种后每天采集分离血清，用FMD液相阻断ELISA(LPB-ELISA)检测AsiaI型抗体，在第3天时抗体水平均大于1∶45，结果见表2。

表2rAsia1-RSD-SAP-FMDV重组病毒对猪牛攻毒后抗体水平变化表

实施例7.拯救的Asia1型口蹄疫重组病毒疫苗的制备及安检。

将BHK-21用含10％胎牛血清的DMEM培养传代。按常规转瓶单层BHK-21传代细胞培养法制备rAsia1-RSD-SAP-FMDV病毒液，收获的病毒液即为病毒培养物，置于-40℃保存。将病毒培养物灭活用3mmol/l二乙烯亚胺(Binary ethylenimine，BEI)(Sigma公司)26℃灭活，24h后再加入一次BEI，再灭活24h。灭活后安检，用抗原浓缩纯化，将抗原收获物与ISA206佐剂(法国SEPPIC)以1∶1比例混合制备疫苗。具体按照《中华人民共和国药典》中兽用生物制品的口蹄疫灭活疫苗规程制备。安检牛舌部皮下注射灭活病毒2ml/头，连续逐日观察6日，观察期牛健康良好，蹄部和嘴鼻均无异常。

上述实验用牛为购自非疫区，并经国家口蹄疫参考实验室生产的FMD液相阻断ELISA(LPB-ELISA)检测O型和AsiaI型抗体均＜1∶4。FMD非结构蛋白3ABC-ELISA抗体检测为阴性。

实施例8.疫苗免疫动物效果评价。

8.1疫苗免疫攻毒保护试验

将上述实施例7中所得到的安检合格的Asia1型口蹄疫重组病毒疫苗分别免疫16头牛，16头猪，同时各设2头非免疫对照(要求被免疫的猪牛的口蹄疫抗体滴度不小于1∶6，感染抗体为阴性)，测定其免疫效力。攻毒方法及结果判定方法均按照《Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals》(2009年版，世界动物卫生组织(OIE))中所述。

免疫猪21天后，用10000倍SID₅₀毒剂量进行攻毒实验，连续观察10天，结果表明，免疫的动物没有临床症状且不形成血毒症，100％保护(表3)。

表3Asia1型口蹄疫重组病毒疫苗免疫猪攻毒后临床症状和保护情况统计表

免疫牛28天后，用10000倍BID₅₀毒剂量进行攻毒实验，连续观察10天，结果表明：用该Asia1型口蹄疫重组病毒作为疫苗株，在培养的BHK-21细胞上增殖后灭活，与ISA206佐剂(法国SEPPIC)乳化制成疫苗，免疫牛，能有效保护中国当前Asia1型口蹄疫流行毒的攻击。结果如表4。

表4Asia1型口蹄疫重组病毒疫苗免疫牛攻毒后临床症状和保护情况

8.2交叉攻毒及其疫苗免疫效力实验(PD₅₀)

试验用牛购自非疫区，并经国家口蹄疫参考实验室生产的FMD液相阻断ELISA(LPB-ELISA)检测Asia1型抗体均＜1∶4。FMD非结构蛋白3ABC-ELISA抗体检测为阴性。本试验所用动物均严格在ABSL-3实验室圈养。90头实验用牛分为5组，实验组的3组是免疫重组毒株rAsia1-RSD-SAP-FMDV后进行攻毒，对照组则是免疫流行毒Asia1/HN/06后进行攻毒，攻毒剂量为10000倍BID₅₀。攻毒方式为舌面皮内分多点注射毒液。连续观察30日，根据牛舌面、齿龈、蹄出现水泡、溃疡等口蹄疫症状判定病毒液致牛发病情况，从而判定细胞毒液对牛的毒力情况。免疫效力测定结果表明，重组毒株的PD50在6.34～13.59，而流行毒株制备的疫苗PD₅₀在6.34～9.0(表5)。

表5重组毒株与流行毒株PD50实验比较表

实施例9.疫苗免疫动物带毒检测。

利用病毒核酸实时定量PCR方法进行监测，核酸实时定量采用TaqMan PCR方法技术，根据口蹄疫病毒5′-UTR区内部核糖体进入位点保守序列设计合成引物和探针用于快速、敏感、特异性检测免疫攻毒后32天的血液、鼻拭子的带毒排毒情况。结果显示发病动物能够监测到病毒核酸，而免疫保护动物不能够监测到核酸(表6)

表6病毒核酸实时定量PCR检测结果

-表示阴性样品；数字表示免疫攻毒后的天数，括号内的数字表示ct值(ct值小于35为阳性样品)

以上所述的实施例仅表述了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可做出其它改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

本发明涉及一种Asia1型口蹄疫病毒拯救系统及重组毒制备方法。所述拯救系统为人工构建的能够表达精确口蹄疫病毒基因组RNA的高效真核质粒，借此能够构建口蹄疫重组病毒。使用上述重组质粒可以制备出高滴度的疫苗毒株，制备成灭活苗，免疫猪和牛后可有效刺激机体产生免疫应答，并提供猪和牛体免疫保护作用，能够有效保护GV和GII流行毒株，免疫保护率能达100％，半数保护剂量(PD50)在6.34～13.59。该疫苗可用于我国及其周边国家Asia1型口蹄疫病毒的预防和控制。

SEQ ID NO:1

CTTAAGGGACAAGAACATGCTGTGTTTGCCTGTGTCACCTCCAACGGGTGGTACGCGATTGATGACGAGGACTTTTACCC

CTGGACACCGGACCCGTCCGACGTCTTGGTGTTTGTTCCGTACGACCAAGAACCGCTCAACGGCGAGTGGAAAGCAAAGG

TTCAGAAGCGGCTCAAGGGAGCCGGGCAATCCAGCCCGGCGACCGGGTCGCAGAACCAGTCAGGCAACACTGGAAGCATC

ATTAACAACTACTACATGCAGCAGTACCAGAACTCCATGGACACGCAACTTGGAGATAACGCTATCAGCGGAGGCTCCAA

CGAGGGTTCCACGGACACCACATCCGCACACACAAACAACACCCAAAACAATGATTGGTTCTCACGCTTGGCCAACTCGG

CCTTTAGCGGACTGTTTGGTGCTCTTTTGGCTGACAAGAAAACGGAGGAGACAACTCTGCTTGAAGACCGCATTCTCACC

ACCAGAAATGGCCACACGACGTCGACGACACAGTCGAGTGTTGGCGTAACATATGGTTACGCTGTGGCTGAAGACGCGGT

ATCTGGGCCTAACACCTCAGGCCTGGAGACCCGCGTAACACAGGCTGAACGGTTCTTCAAGAAACACCTGTTTGACTGGA

CGCCGGATTTGTCATTTGGACACTGTCACTACTTGGAACTCCCCTCTGAACACAAGGGCGTGTTTGGCAGCCTCATGAGC

TCTTATGCTTACATGAGGAACGGGTGGGACGTTGAGGTGACCGCTGTTGGAAATCAGTTCAATGGTGGTTGTCTCCTCGT

CGCACTCGTGCCGGAGCTGAAAGAGCTCGACACGCGGCAGAAGTATCAGTTAACCCTCTTCCCACACCAGTTCATTAACC

CGCGCACTAACATGACGGCTCACATTAACGTGCCGTACGTGGGTGTCAACAGGTACGACCAGTACGAGCTCCACAAACCG

TGGACGCTTGTGGTGATGGTGGTGGCCCCGCTTACCGTCAAAACTGGTGGTTCTGAACAGATCAAGGTCTACATGAATGC

AGCGCCGACCTACGTGCACGTGGCAGGAGAACTGCCCTCGAAAGAGGGGATAGTTCCTGTGGCGTGTGTGGACGGTTACG

GCAACATGGTAACCACGGACCCGAAGACGGCTGACCCCGTCTACGGGAAAGTGTCTAACCCCCCCAGAACAAGCTTCCCT

GGGCGTTTCACAAACTTCCTTGATGTAGCGGAGGCGTGTCCGACCTTCCTCCGCTTCGGAGAAGTACCATTTGTGAAGAC

GGTGAACTCTGGTGACCGCTTGCTTGCCAAGTTTGACGTGTCCCTCGCTGCGGGGCACATGTCCAACACCTACTTGGCAG

GTTTGGCACAGTACTACACACAGTACAGCGGCACTATGAATATCCACTTCATGTTCACCGGACCCACGGATGCCAAAGCC

CGCTACATGGTGGCTTACATACCTCCTGGTATGACACCGCCAGCGGACCCGGAGCGGGCTGCACACTGCATTCATTCTGA

GTGGGACACTGGACTCAATTCTAAATTTACCTTTTCTATCCCTTACCTTTCTGCTGCAGACTATGCTTACACTGCTTCTG

ACGTGGCTGAGACCACGAGTGTGCAGGGATGGGTGTGTATTTACCAGATCACCCACGGTAAAGCTGAAGGTGACGCGCTG

GTCGTGTCCGTCAGCGCTGGCAAGGACTTTGAGTTTCGACTACCGGTGGATGCCCGCCAACAGACTACCACCACTGGCGA

GTCCGCGGACCCAGTCACCACCACGGTTGAGAACTACGGAGGAGAAACCCAGACGGCCCGACGGCTTCACACTGATGTCG

CCTTCGTTCTCGACAGGTTCGTAAAACTCACCCAGCCCAAGAGCACCCAAACCCTTGATCTCATGCAGATCCCCTCACAC

ACACTGGTCGGGGCGCTTCTCCGGTCTGCGACGTACTACTTCTCAGATCTGGAGGTTGCGCTCGTCCACACAGGACCGGT

CACGTGGGTGCCCAATGGTGCGCCTAAGACCGCCTTGAACAACCACACCAACCCGACTGCCTACCAGAAGCAGCCTATCA

CCCGCTTGGCACTCCCCTACACCGCTCCCCACCGTGTGCTGTCAACAGTGTACAACGGGAAGACAACGTACGGAGAAGAA

TCCTCGCGGCGTAGCGATCTTGCCGCCCTCGCACGCAGAGTGAGCAACCGGCTGCCCACTTCCTTCAACTACGGCGCTGT

GAAGGCCGACACCATCACGGAGCTGTTGATCCGCATGAAGCGTGCGGAAACATACTGCCCCAGGCCCTTGCTGGCTCTTG

ACACCACACAAGACCGCCGTAAACAGGAGATCATTGCACCTGAGAAACAGACTTTGAACTTTGACCTACTCAAGTTGGCA

GGAGACGTGGAGCCCAACCCTGGGCCCTTCTTCTTCTCTGATGTCAGGTCGAACTTCACCAAGCTGGTGGACACCATTAA

CCAGATGCAAGAGGACATGTCAACAAAACACGGACCCGACTTTAACCGGTTGGTGTCCGCATTTGAGGAACTGGCCACTG

GAGTGAAGGCTATCAGGACTGGTCTTGACGAGGCCAAACCCTGGTACAAACTCATCAAACTCCTGAGCCGCTTGTCATGC

ATGGCCGCTGTAGCAGCACGGTCAAAGGACCCAGTCCTTGTGGCCATCATGCTGGCTGACACCGGCCTTGAGATTCTGGA

CAGCACATTCGTCGTGAAGAAGATCTCCGACTCACTCTCCAGTCTCTTTCACGTGCCGGCCCCCGTCTTCAGTTTCGGAG

CCCCGGTTCTGTTGGCCGGGTTGGTCAAAGTCGCCTCGAGTTTCTTCCGGTCCACGCCCGAAGACCTTGAGAGAGCAGAG

AAACAGCTCAAAGCACGTGACATCAACGACATCTTCGCCATTCTCAAGAACGGCGAGTGGTTGGTCAAATTGATTCTTGC

CATCCGCGACTGGATTAAGGCATGGATCGCCTCAGAAGAAAAGTTTGTCACCATGACAGACTTGGTGCCTGGCATCCTCG

AAAAGCAACGGGACCTCAACGACCCGAGCAAGTACGAGGAAGCCAAGGAGTGGCTCGACAACGCGCGTCAAGCGTGTCTG

AAGAGCGGGAACGTCCACATTGCCAACCTGTGCAAGGTGATCGCCCCGGCACCCAGCAAGTCGAGACCCGAACCCGTGGT

CGTTTGCCTCCGAGGCAAATCCGGCCAGGGAAAGAGTTTCCTTGCGAACGTGCTCGCACAAGCAATCTCCACACACTACA

CTGGCAGAACTGATTCAGTTTGGTACTGCCCGCCTGACCCTGACCACTTCGACGGTTACAACCAACAGACCGTTGTTGTG

ATGGATGATTTGGGCCAGAACCCCGACGGCAAGGACTTTAAGTACTTCGCCCAGATGGTTTCAACCACGGGGTTCATCCC

GCCCATGGCCTCGCTCGAAGACAAAGGCAAACCTTTCAACAGCAAGGTCATCATCGCCACCACCAACCTGTACTCGGGCT

TCACCCCGAGGACCATGGTGTGCCCTGATGCACTGAACCGGAGGTTTCACTTTGACATCGAT

SEQ ID NO:2

CTTAAGGGACAAGAACATGCTGTGTTTGCCTGTGTCACCTCCAACGGGTGGTACGCGATTGATGACGAGGACTTTTACC

CCTGGACACCGGACCCGTCCGACGTCTTGGTGTTTGTTCCGTACGACCAAGAACCGCTCAACGGCGAGTGGAAAGCAAAG

GTTCAGAAGCGGCTCAAGGGAGCCGGGCAATCCAGCCCGGCGACCGGGTCGCAGAACCAGTCAGGCAACACTGGAAGCAT

CATTAACAACTACTACATGCAGCAGTACCAGAACTCCATGGACACGCAACTTGGAGATAACGCTATCAGCGGAGGCTCCA

ACGAGGGTTCCACGGACACCACATCCGCACACACAAACAACACCCAAAACAATGATTGGTTCTCACGCTTGGCCAACTCG

GCCTTTAGCGGACTGTTTGGTGCTCTTTTGGCTGACAAGAAAACGGAGGAGACAACTCTGCTTGAAGACCGCATTCTCAC

CACCAGAAATGGCCACACGACGTCGACGACACAGTCGAGTGTTGGCGTAACATATGGTTACGCTGTGGCTGAAGACGCGG

TATCTGGGCCTAACACCTCAGGCCTGGAGACCCGCGTAACACAGGCTGAACGGTTCTTCAAGAAACACCTGTTTGACTGG

ACGCCGGATTTGTCATTTGGACACTGTCACTACTTGGAACTCCCCTCTGAACACAAGGGCGTGTTTGGCAGCCTCATGAG

CTCTTATGCTTACATGAGGAACGGGTGGGACGTTGAGGTGACCGCTGTTGGAAATCAGTTCAATGGTGGTTGTCTCCTCG

TCGCACTCGTGCCGGAGCTGAAAGAGCTCGACACGCGGCAGAAGTATCAGTTAACCCTCTTCCCACACCAGTTCATTAAC

CCGCGCACTAACATGACGGCTCACATTAACGTGCCGTACGTGGGTGTCAACAGGTACGACCAGTACGAGCTCCACAAACC

GTGGACGCTTGTGGTGATGGTGGTGGCCCCGCTTACCGTCAAAACTGGTGGTTCTGAACAGATCAAGGTCTACATGAATG

CAGCGCCGACCTACGTGCACGTGGCAGGAGAACTGCCCTCGAAAGAGGGGATAGTTCCTGTGGCGTGTGTGGACGGTTAC

GGCAACATGGTAACCACGGACCCGAAGACGGCTGACCCCGTCTACGGGAAAGTGTCTAACCCCCCCAGAACAAGCTTCCC

TGGGCGTTTCACAAACTTCCTTGATGTAGCGGAGGCGTGTCCGACCTTCCTCCGCTTCGGAGAAGTACCATTTGTGAAGA

CGGTGAACTCTGGTGACCGCTTGCTTGCCAAGTTTGACGTGTCCCTCGCTGCGGGGCACATGTCCAACACCTACTTGGCA

GGTTTGGCACAGTACTACACACAGTACAGCGGCACTATGAATATCCACTTCATGTTCACCGGACCCACGGATGCCAAAGC

CCGCTACATGGTGGCTTACATACCTCCTGGTATGACACCGCCAGCGGACCCGGAGCGGGCTGCACACTGCATTCATTCTG

AGTGGGACACTGGACTCAATTCTAAATTTACCTTTTCTATCCCTTACCTTTCTGCTGCAGACTATGCTTACACTGCTTCT

GACGTGGCTGAGACCACGAGTGTGCAGGGATGGGTGTGTATTTACCAGATCACCCACGGTAAAGCTGAAGGTGACGCGCT

GGTCGTGTCCGTCAGCGCTGGCAAGGACTTTGAGTTTCGACTACCGGTGGATGCCCGCCAACAGACTACCACCACTGGCG

AGTCCGCGGACCCAGTCACCACCACGGTTGAGAACTACGGAGGAGAAACCCAGACGGCCCGACGGCTTCACACTGATGTC

GCCTTCGTTCTCGACAGGTTCGTAAAACTCACCCAGCCCAAGAGCACCCAAACCCTTGATCTCATGCAGATCCCCTCACA

CACACTGGTCGGGGCGCTTCTCCGGTCTGCGACGTACTACTTCTCAGATCTGGAGGTTGCGCTCGTCCACACAGGACCGG

TCACGTGGGTGCCCAATGGTGCGCCTAAGACCGCCTTGAACAACCACACCAACCCGACTGCCTACCAGAAGCAGCCTATC

ACCCGCTTGGCACTCCCCTACACCGCTCCCCACCGTGTGCTGTCAACAGTGTACAACGGGAAGACAACGTACGGAGAAGA

ATCCTCGCGGCGTGGTGATCTTGCCGCCCTCGCACGCAGAGTGAGCAACCGGCTGCCCACTTCCTTCAACTACGGCGCTG

TGAAGGCCGACACCATCACGGAGCTGTTGATCCGCATGAAGCGTGCGGAAACATACTGCCCCAGGCCCTTGCTGGCTCTT

GACACCACACAAGACCGCCGTAAACAGGAGATCATTGCACCTGAGAAACAGACTTTGAACTTTGACCTACTCAAGTTGGC

AGGAGACGTGGAGCCCAACCCTGGGCCCTTCTTCTTCTCTGATGTCAGGTCGAACTTCACCAAGCTGGTGGACACCATTA

ACCAGATGCAAGAGGACATGTCAACAAAACACGGACCCGACTTTAACCGGTTGGTGTCCGCATTTGAGGAACTGGCCACT

GGAGTGAAGGCTATCAGGACTGGTCTTGACGAGGCCAAACCCTGGTACAAACTCATCAAACTCCTGAGCCGCTTGTCATG

CATGGCCGCTGTAGCAGCACGGTCAAAGGACCCAGTCCTTGTGGCCATCATGCTGGCTGACACCGGCCTTGAGATTCTGG

ACAGCACATTCGTCGTGAAGAAGATCTCCGACTCACTCTCCAGTCTCTTTCACGTGCCGGCCCCCGTCTTCAGTTTCGGA

GCCCCGGTTCTGTTGGCCGGGTTGGTCAAAGTCGCCTCGAGTTTCTTCCGGTCCACGCCCGAAGACCTTGAGAGAGCAGA

GAAACAGCTCAAAGCACGTGACATCAACGACATCTTCGCCATTCTCAAGAACGGCGAGTGGTTGGTCAAATTGATTCTTG

CCATCCGCGACTGGATTAAGGCATGGATCGCCTCAGAAGAAAAGTTTGTCACCATGACAGACTTGGTGCCTGGCATCCTC

GAAAAGCAACGGGACCTCAACGACCCGAGCAAGTACGAGGAAGCCAAGGAGTGGCTCGACAACGCGCGTCAAGCGTGTCT

GAAGAGCGGGAACGTCCACATTGCCAACCTGTGCAAGGTGATCGCCCCGGCACCCAGCAAGTCGAGACCCGAACCCGTGG

TCGTTTGCCTCCGAGGCAAATCCGGCCAGGGAAAGAGTTTCCTTGCGAACGTGCTCGCACAAGCAATCTCCACACACTAC

ACTGGCAGAACTGATTCAGTTTGGTACTGCCCGCCTGACCCTGACCACTTCGACGGTTACAACCAACAGACCGTTGTTGT

GATGGATGATTTGGGCCAGAACCCCGACGGCAAGGACTTTAAGTACTTCGCCCAGATGGTTTCAACCACGGGGTTCATCC

CGCCCATGGCCTCGCTCGAAGACAAAGGCAAACCTTTCAACAGCAAGGTCATCATCGCCACCACCAACCTGTACTCGGGC

TTCACCCCGAGGACCATGGTGTGCCCTGATGCACTGAACCGGAGGTTTCACTTTGACATCGAT

Claims

1.一种Asia1型口蹄疫重组病毒的制备方法，其特征在于：

步骤1）、Asia1型口蹄疫重组病毒感染性克隆的构建：以O型口蹄疫病毒的拯救系统为骨架，通过AflII和ClaI限制性内切酶，将含有部分L和P12A基因的序列用Asia1/HN/06毒株相应基因SEQ ID NO:2替换，得到prAsia1-FMDV的重组质粒；所用Asia1/HN/06毒株是2006年4月分离于河南周口，经BHK-21传代培养10代，保藏于农业部兽医局指定保存单位：国家口蹄疫参考实验室；使用RNAeasy Mini Kit提取Asia1/HN/06毒株的总RNA，用引物oligNot I反转录合成病毒第一链cDNA，以合成的第一链cDNA为模板，用引物Asia1P12A-F和Asia1P12A-R扩增获得Asia1/HN/06毒株部分L和P12A的基因片段，上述三条针对ASIA1/HN/06株的特异性引物分别是：

oligNot I：5'-ttttctaga gcggccgc t₃₈-3'

Asia1P12A-F：5'-ttttccttaagggacaagaacatgctgtgtttgcctgtgt-3'

Asia1P12A-R：5'-actcacatcgatgtcaaagtgaaacctcc-3'，

上游引物Asia1P12A-F中含AflII限制性酶切位点；下游引物Asia1P12A-R中含下划线部分的ClaI限制性酶切位点，上述特异性引物扩增Asia1/HN/06毒株部分L和P12A基因获得的基因序列为SEQ ID NO:2，大小为3582 bp，扩增反应体系为50μL，扩增条件为：94℃ 5min，94℃ 30s，57℃ 30s，72℃ 3min30s，go to 2，35个循环，72℃ 10min，PCR扩增产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳核实后进行纯化回收并送交测序，获得上述基因片段的DNA；

prO/CHA/99是含有O/CHA/99毒株全长cDNA的质粒，其中，O/CHA/99毒株是O型口蹄疫毒株，1999年分离于中国香港，现保存于国家口蹄疫参考实验室，prO/CHA/99质粒组成是在病毒基因组5'端上游含人巨细胞病毒RNA聚合酶II启动子及编码牛生长素多聚苷酸化信号的修饰剪切序列，在其两者间含鼠源RNA聚合酶I启动子；在病毒基因组3'端下游含鼠源聚合酶终止子I和聚合酶终止子II序列；及嵌合在O型口蹄疫病毒O/CHA/99全长cDNA基因组两端的榔头锤酶和丁型肝炎酶的核心序列，其中丁型肝炎酶共有88个核糖核酸，自我剪切修饰位点在5'末端G处；榔头锤酶核心序列共有58个核糖核酸，自我剪切修饰位点在3'末端C处，将含O型口蹄疫病毒O/CHA/99基因组的感染性克隆转染至受体细胞中，通过RNA聚合酶II启动子和RNA聚合酶I启动子调控元件分别转录包装出病毒RNA前体，再经HamRz 和HdvRz的修饰剪切产生具有感染性的病毒RNA，将O型口蹄疫病毒O/CHA/99株拯救系统的质粒prO/CHA/99与上述得到的Asia1/HN/06毒株部分L和P12A片段，分别用AflII和ClaI双酶切后，连接转化至JM109感受态细胞中，测序鉴定阳性克隆，获得含Asia1/HN/06毒株部分前导蛋白L和结构蛋白P12A的重组质粒，将重组质粒命名为prAsia1-FMDV；

对猪和牛无致病性的Asia1型口蹄疫重组病毒的感染性克隆的构建：

①Asia1型口蹄疫重组病毒自然受体识别位点RGD突变成RSD，其感染性克隆构建过程是：将用引物Asia1P12A-F和Asia1P12A-R扩增获得Asia1/HN/06毒株部分L和P12A的基因片段，基因序列为SEQ ID NO:2，与pMD20-T载体4℃连接过夜，连接产物转化JM109感受态细胞，测序鉴定阳性克隆，获得重组质粒命名为pMD20-Asia1P12A；以鉴定正确的重组质粒pMD20-Asia1P12A为模板，用磷酸化突变引物S-P和RSD-P进行PCR扩增，上述5'磷酸化的点突变引物分别是：

S-P：5'-cacgcagagtgagcaaccggctgcc-3'

RSD-P：5'-cgagggcggcaagatcgctacgccgcgagg-3'，

将O型口蹄疫病毒O/CHA/99株拯救系统的质粒prO/CHA/99与上述得到的Asia1/HN/06毒株部分L和P12A片段上受体结合位点经过点突变后的pMD20-Asia1P12A-RSD，分别用AflII和ClaI双酶切，基因序列为SEQ ID NO:1，连接转化至JM109感受态细胞中，测序鉴定阳性克隆，获得含Asia1/HN/06毒株受体结合位点突变为RSD后的部分L和P12A的重组质粒，将重组质粒命名为prAsia1-RSD-FMDV；

②Asia1型口蹄疫重组病毒L基因SAP区域(SAF-A/B, Acinus, and PIAS)突变，其感染性克隆构建过程是：将表达质粒pCDNA3.1(+)用特异性引物进行扩增，得到含有PacI和AflII酶切位点的基因片段，上述引物分别是：

pCD-AflII-ApaI-F：5'-ttttccttaaggggcccgtttaaacccgctgat-3'

pCD-PacI-NheI-R：5'-cttacttaattaagctagccagcttgggtctcccta-3'，

同时将O型口蹄疫病毒O/CHA/99株拯救系统的质粒prO/CHA/99，经PacI和AflII双酶切后，与上述得到的含有PacI和AflII酶切位点的pCDNA基因片段连接转化至JM109感受态细胞中，测序鉴定阳性克隆，获得含O/CHA/99株5’UTR和部分L基因的重组质粒，将重组质粒命名为pCD-OL；以鉴定正确的重组质粒pCD-OL为模板，用磷酸化突变引物F-P和SAP-P进行PCR扩增，上述5'磷酸化的点突变引物分别是：

F-P：5'-gacctcacagggcttgaactgcacga-3'

SAP-P：5'-ctccgcctgcttggcggctgcaagcgtg-3',

将已获得含Asia1/HN/06毒株受体结合位点突变为RSD的重组质粒prAsia1-RSD-FMDV与上述得到的O/CHA/99株L基因中SAP区域进行突变后的重组质粒pCD-OL-SAP，分别用PacI和AflII双酶切后，连接转化至JM109感受态细胞中，测序鉴定阳性克隆，获得含Asia1/HN/06毒株受体结合位点突变为RSD并且L基因中SAP区域突变的重组质粒，将重组质粒命名为prAsia-RSD-SAP-FMDV；

步骤2）、Asia1型口蹄疫重组质粒转染敏感细胞BHK-21细胞或IBRS-2细胞，拯救获得所述Asia1型口蹄疫重组病毒。

2.根据权利要求1所述的Asia1型口蹄疫重组病毒的制备方法，其特征在于： Asia1型口蹄疫重组病毒是用所述重组质粒prAsia1-FMDV，直接转染口蹄疫病毒敏感的细胞，具体为BHK-21细胞或IBRS-2细胞，得到与流行毒株抗原匹配的Asia1型口蹄疫重组病毒。

3.根据权利要求1所述的Asia1型口蹄疫重组病毒的制备方法，其特征在于：（1）、把Asia1型口蹄疫病毒P12A基因上的自然受体识别位点RGD突变成RSD，将重组质粒prAsia1-RSD-FMDV直接转染口蹄疫病毒敏感的细胞，BHK-21细胞或IBRS-2细胞，得到的重组毒株prAsia1-RSD-FMDV对猪没有致病性；

（2）、在重组质粒prAsia1-RSD-FMDV的基础上，进一步对L基因的SAP进行突变，将重组质粒prAsia-RSD-SAP-FMDV直接转染口蹄疫病毒敏感的细胞BHK-21细胞或IBRS-2细胞，得到重组病毒rAsia-RSD-SAP-FMDV对猪和牛都没有致病性，并且不形成血毒症，不排毒，能够产生较强免疫应答。

4.一种利用权利要求1所述的Asia1型口蹄疫重组病毒的制备方法制备的Asia1型口蹄疫重组病毒，其特征在于：该Asia1型口蹄疫重组病毒在BHK-21细胞上具有高滴度、与流行病毒的抗原匹配性高，对猪和牛均没有致病性，并且不形成血毒症，能够产生较强的体液免疫应答和细胞免疫应答，具有免疫交叉保护性，该Asia1型口蹄疫重组病毒的抗原核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示。

5.一种利用权利要求4所述的Asia1型口蹄疫病毒制备的疫苗，其特征在于：培养的Asia1型口蹄疫重组病毒用二乙烯亚胺灭活，浓缩纯化后与ISA206佐剂以1：1体积比混合制备疫苗，免疫猪和牛后可有效刺激机体产生强抗体应答，产生早期免疫应答，并提供猪和牛体免疫保护作用，能够有效保护GV和GII流行毒株，免疫保护率能达100%，半数保护剂量PD₅₀在6.34～13.59。